KR20140017486A - 나노입자-기반 종양-표적 약물 전달 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 리포좀 나노입자의 수성 분산액을 포함하는 수성 종양-표적화 리포좀 나노입자 조성물을 제공한다. 바람직하게는 나노입자는 사전-형성된 리포좀 조성물에 첨가될 수 있거나 리포좀의 형성시에 리포좀내로 혼입될 수 있는 항암 화학치료요법제를 캡슐화한다. 리포좀 나노입자는 레구마인-표적화 지질을 하나 이상의 미셀 또는 소포-형성 지질 물질과 혼합되어 수성 담체 중에 분산된 리포좀의 형태로 포함한다. 바람직한 종양-표적화 리포좀 나노입자 조성물은 (a) 레구마인-표적화 지질 성분; (b) 양쪽이온성 지질 성분; (c) 아미노-치환된 지질 성분; (d) 중성 지질 성분; 및 (e) 폴리에틸렌 글리콜-접합된 지질 성분을 포함한다. 레구마인-표적화 지질 성분은 레구마인-결합 모이어티에 공유 결합에 의해 부착된 소수성 지질 부분을 포함한다.

Description

나노입자-기반 종양-표적 약물 전달{NANOPARTICLE-BASED TUMOR-TARGETED DRUG DELIVERY}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2010년 9월 2일에 출원된 미국 가특허출원 제61/402,686호의 이익을 주장하고, 이의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
정부 지원
본 발명은 미국 국립 보건원 승인 번호 5 R01 CA134364-01A 및 미국 국립 심장, 폐 및 혈액 연구 교육원 승인 번호 T32HL007195 하에 미국 정부로부터의 정부 보조로 이루어졌다.
리간드-표적화(ligand-targeting)는 나노입자(NP) 매개된 약물 전달, 국소적 고농도와 전신적 저노출의 달성, 약물 독성의 감소와 함께 표적 세포에 최적의 용량 전달을 유지하는데 중대한 진전이 있었다. 이러한 전략에서 인테그린 및 HER-2를 포함한, 종양 혈관에 의해 과발현되는 부착 수용체 및 종양 세포 상의 엽산 세포 표면 수용체와 결합하는 항체 및 귀소성 펩타이드(homing peptide)를 이용하여 개념 증명이 확립되었다. 리간드-표적화와 연관된 문제는 고형 종양의 수용체 포화, 수용체-리간드 저친화성, 제한된 조직 침투 및 유전적 이질성을 포함한다. 레구마인은 다양한 종양 세포에 의해 과발현되는 아스파라기닐 엔도펩티다제이다. 결과적으로, 레구마인은 종양 세포에 대한 치료제를 유도하는데 용이한 표적을 제공한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 리간드-표적화와 연관된 문제를 해결하고, 한편 종양-특이적 약물 전달에 효과적인 수단을 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 항암 화학치료요법제를 임의로 캡슐화하는 리포좀 나노입자의 수성 분산액을 포함하는 수성 종양-표적화 리포좀 나노입자 조성물을 제공한다. 본 발명의 수성 종양-표적화 리포좀 나노입자 조성물은, 레구마인-표적화 지질(legumain-targeting lipid)을 하나 이상의 다른 미셀(micelle) 또는 소포-형성 지질 물질과 혼합하여 나노입자 리포좀 분산액의 형태로 포함하고, 임의로 상기 리포좀 나노입자 내에 항암 화학치료요법제를 캡슐화한다. 상기 레구마인-표적화 지질 성분은 레구마인-결합 모이어티에 공유 결합에 의해 부착된 소수성 지질 부분을 포함한다. 항암 화학치료요법제는 나노입자의 침투시 리포좀 나노입자내에 캡슐화될 수 있거나 나노입자가 실행된 후 화학치료요법제가 로딩될 수 있다. 바람직한 수성 종양-표적화 리포좀 나노입자 조성물은 (a) 레구마인-표적화 지질 성분; (b) 양쪽이온성 지질 성분; (c) 아미노-치환된 지질 성분; (d) 중성 지질 성분; 및 (e) 수성 담체(예, 약물 제형에 흔히 사용되는 다양한 생리학적으로 허용되는 부형제 및 보조제를 포함할 수 있는 생리학적으로 허용되는 완충제) 중에 나노입자 리포좀으로서 분산된 폴리에틸렌 글리콜-접합된 지질 성분을 포함한다. 레구마인-표적화 지질 성분은 레구마인-결합 모이어티에 공유 결합에 의해 부착되는 소수성 지질 부분을 포함한다. 레구마인-결합 모이어티는 레구마인과 안정한 복합체 또는 공유 결합을 선택적으로 형성하는 모든 물질일 수 있다.
바람직한 레구마인-표적화 모이어티는 레구마인의 aza-Asn 마이클 수용체-유형 억제제이다. 바람직한 레구마인-표적화 지질 성분은 인지질에 결합되는 aza-Asn 마이클 수용체 레구마인 억제제를 포함한다. 예를 들어, RR-11a로 알려진 억제제는 도 1의 페널 (a)에서 나타낸 바와 같이 적합한 지질에 결합될 수 있다.
일부 바람직한 실시형태에서, 레구마인-표적화 지질 성분은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)과 같은 1,2-디아실글리세로-포스포알칸올아민 그룹에 공유 결합에 의해 부착된 레구마인-결합 모이어티를 포함한다.
바람직한 양쪽이온성 지질 성분 (b)는 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)과 같은 1,2-디아실글리세로-포스포콜린 화합물을 포함한다.
바람직한 아미노-치환된 지질 성분 (c)는 DOPE와 같은 1,2-디아실글리세로-포스포알칸올아민 화합물을 포함한다.
바람직한 중성 지질 성분 (d)는 콜레스테롤을 포함한다.
바람직한 폴리에틸렌 글리콜-접합된 지질 성분 (e)는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)]과 같은 폴리에틸렌 글리콜-접합된 1,2-디아실글리세로-포스포알칸올아민 화합물을 포함하고, 여기서 상기 화합물의 폴리에틸렌 글리콜 부분의 평균 분자량이 약 2000 원자 질량 단위(amu)이다.
한 바람직한 실시형태에서, 성분 (a), (b), (c), (d) 및 (e)가 (a):(b):(c):(d):(e)의 몰비 약 1.1:6.7:6.7:2.2:1로 리포좀 나노입자에 존재한다.
바람직하게는, 리포좀 나노입자 조성물은 항암 화학치료요법제, 예를 들어 독소루비신, 1-[2-시아노-3-,12-디옥소올레아나-1,9(11)-디엔-28-오일]이미다졸(CDDO-Im으로도 알려져 있음)을 캡슐화하거나 임의의 다른 공지된 항암 화학치료요법제를 캡슐화한다.
본 발명의 조성물은 레구마인-발현 종양의 치료에 사용하기에 특히 적합하다. 본 발명의 방법의 한 양상은 본 발명의 조성물의 리포좀 나노입자내에 캡슐화된 항암 화학치료요법제의 유효량을 암 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
도 1은 레구마인-표적화된 나노입자(NP)의 제조 및 특성확인을 도해한다. 패널 (a)는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)에의 RR-11a의 접합을 도해한다. 패널 (b)는 종양 저산소증을 증명하는 형광 현미경 화상을 제공한다(스케일 바 100μm). 패널 (c)는 스캐챠드 분석에 의해 측정된 것으로 세포막-발현된 레구마인에 대한 항-마우스 모노클로날 항체(mAb)의 친화성을 증명하는 특이적 결합 대 항체 농도의 그래프를 제공한다. 패널(d)는 CoCl2와 함께 약 24시간(h) 동안 배양된 후 비-표적화된 나노입자(비표적화된 NP) 또는 RR-11a-표적화된 나노입자(표적화된 NP)가 첨가된 뮤린 4T1 및 4TO7 유방 암종 세포 및 CT26 결장 암종 세포에 대한 로다민-양성 세포 대 시간의 그래프를 제공한다(n = 그룹당 3개의 웰; 데이터는 평균±s.e.m.(표준 평균 오차)를 나타낸다). 패널 (e)는 로다민 B 형광으로 나타낸 바와 같이 본 발명의 표적화된 NP(윗줄) 및 비표적화된 NP(아랫줄)로 치료된 마우스로부터의 종양, 간, 비장 및 신장 세포에 대해 NP의 분포를 가시화하는 형광 현미경 화상을 제공한다(n = 그룹당 2마리의 마우스; 스케일 바, 100μm).
도 2는 레구마인-표적화가 PEG-리포좀-캡슐화된 독소루비신의 흡수를 증가시키고 원발성 유방 종양으로의 NP-매개된 약물 전달을 향상시킨다는 것을 증명한다. 패널(a)는 4T1 및 4TO7 세포를 CoCl2와 약 24시간 항온처리하고, 이어서 독소루비신이 로딩된 표적화된 나노입자 조성물(본원에 RDZ-218로 표기), 독소루비신-로딩된 비표적화된 NP(NP-Dox) 또는 유리된 독소루비신(유리된 Dox)과 지정 시간 동안 배양한 후 유세포분석에 의해 독소루비신의 평균 형광 강도(MFI)를 측정한 4T1 및 4TO7 세포에 대한 평균 형광 강도(MFI) 대 시간의 그래프를 제공한다(n = 각 시점에서 그룹당 3개의 웰; 데이터는 평균±s.e.m.을 나타낸다). 패널 (b)는 RDZ-218, NP-Dox 및 유리된 Dox-치료된 세포의 MFI를 일련의 희석된 독소루비신의 MFI와 비교하여 측정한 약물 흡수 농도의 비율(%)을 나타내는 막대 그래프를 제공한다. 패널 (c)는 4T1 및 4TO7 세포를 대조군(미치료), 유리된 Dox, NP-Dox, 유리된 RR-11a, NP-RR11a(무독소루비신) 및 RDZ-218로 치료한 후 대략 치료 24시간 경과하여 유세포분석의 전방 산란 및 측방 산란 플롯을 분석하여 결정한 것으로 4T1 및 4TO7 사멸 세포의 상대적 비율(%)을 비교한 막대 그래프를 제공한다(데이터는 미치료 세포(대조군)에 대한 상대치로서 나타낸다; n = 그룹당 3개의 웰; 데이터는 평균±s.e.m.을 나타낸다. *p<0.05, **p<0.005). 패널 (d)는 4TO7 세포를 서혜부 유방 지방 패드 내로 주사하고; 종양이 약 5일(d) 동안 약 500mm3의 크기까지 성장하도록 둔 후 마우스에 RDZ-218, NP-Dox 또는 유리된 Dox를 2회 정맥내 주사하고 마지막 주사 후 약 24시간 경과하여 마우스를 희생시키고 조직을 분리하여 즉시 형광 현미경으로 분석하여 독소루비신의 분포를 분석하고; 또한 조직 박편을 DAPI로 염색하여 세포 핵을 가시화한 것으로서 암컷 BALB/c 마우스로부터의 종양(윗줄), 간(중간줄) 및 심장(아랫줄) 세포의 형광 현미경 화상을 제공한다(n = 그룹당 2마리의 마우스; 스케일 바, 100μm).
도 3은 RDZ-218, NP-Dox, 유리된 독소루비신(유리된 Dox), 빈 상태 RR-11a-접합된 NP(NP-RR-11a) 또는 인산염-완충 염수(PBS)를 3일 간격으로 5회 정맥 주사를 이용하여 치료한 마우스에서 RDZ-218에 의한 4TO7 종양-보유 마우스의 치료학적 처치가 독성없이 원발성 유방 종양 성장을 완벽하게 억제하였음을 증명한다(데이터 포인트는 치료일을 나타낸다; n = 그룹당 5마리의 마우스). 패널 (a)는 종양 크기 대 시간의 그래프를 제공한다(데이터는 평균±s.e.m.을 나타낸다). 패널 (b)는 해부 전에 촬영된 원발성 종양의 화상을 제공한다(화상은 각 그룹을 대표한다). 패널 (c)는 각 치료 그룹의 마우스로부터의 원발성 종양의 습윤 중량을 비교한 막대 그래프를 제공한다(데이터는 평균±s.e.m.을 나타낸다; *p<0.05). 패널 (d)는 각 치료 그룹의 마우스로부터의 TUNEL-양성(아폽토시스) 종양 세포를 비교한 막대 그래프를 제공한다(n = 섹션당 5개의 필드; 데이터는 평균±s.e.m.을 나타낸다; ***p<0.0005). 패널 (e)는 각 치료 그룹 마우스의 체중 변화를 비교한 막대 그래프를 제공한다(사멸 시점에서 총 체중으로부터 원발성 종양 중량을 빼고 종양 세포 도전 전의 체중과 비교하여 체중 변화를 결정하였다; 데이터는 평균±s.e.m.을 나타낸다; 대조군은 RDZ-218 치료 그룹과 비교되었다. **p=0.029, ***p<0.001).
도 4는 패널 (a)에서 아자-Asn 마이클 수용체와 레구마인 시스테인 잔기의 마이클 부가 반응; 패널 (b)에서 아자-Asn-에폭사이드와 레구마인 Cys 잔기의 반응; 및 패널 (c)에서 아자-Asn-할로메틸케톤과 레구마인 Cys 잔기의 반응을 도해한다.
도 5는 RR-11a-결합된 NP의 생리화학적 특성을 보여준다. CDDO-Im이 로딩된 레구마인-표적화된 NP(a), CDDO-Im이 없이 레구마인-표적화된 NP(b), CDDO-Im이 로딩된 비표적화된 NP(c) 또는 CDDO-Im이 없이 CDDO-Im이 로딩된 비표적화된 NP(d)을 동적광산란 및 TEM으로 분석하여 입자 크기 분포(직경, nm) 및 제타 전위(mV)를 측정하였다. 스케일 바=100nm.
도 6. 웨스턴 블롯 분석으로서 캡슐화된 CDDO-Im이 뮤린 유방암 및 원발성 종양에서 STAT-3 인산화를 억제한다. (a) 4T1 뮤린 유방암 세포가 IL-6(10ng/mL) 및 다양한 농도의 CDDO-Im으로 치료되었다. (b) 4TO7 뮤린 유방암 세포가 유리된 CDDO-Im(유리된 CDDO), 빈 상태 표적화된 NP(Leg-NP), 비표적화된 NP-캡슐화된 CDDO-Im(NP-CDDO) 또는 표적화된 NP-캡슐화된 CDDO-Im(Leg-NP-CDDO)와 조합한 IL-6(10ng/mL)으로 치료되었다. (c) MMTV-Neu 원발성 종양 추출물이 PBS(레인 1), Leg-NP(레인 2) 또는 Leg-NP-CDDO(레인 3)의 8회 정맥 주사된 마우스로부터 제조되었다.
도 7. Leg-NP-CDDO로의 치료학적 처치는 4TO7 종양의 성장을 억제한다. (a) 5x103 4TO7 종양 세포로 도전되고 Leg-NP-CDDO 또는 대조군 (PBS, 무 CDDO, NP-CDDO 또는 Leg-NP)로 치료된 마우스의 치료 개략도(n = 그룹당 8마리). (b) 종양을 2일마다 촉진하고 종양 크기를 결정하였다. 데이터는 평균±s.e.m.을 나타낸다. (c) 종양 중량을 19일째에 측정하고 체중과 비교하여 종양 적하율(%)을 결정하였다. 데이터는 평균±s.e.m.을 나타낸다. *p<0.05.
도 8. Leg-NP-CDDO로 MMTV-Neu 원발성 종양의 치료학적 처치는 종양 성장을 지연시킨다. (a) 1x104 MMTV-Neu 원발성 종양 세포로 도전되고 Leg-NP-CDDO 또는 대조군 (PBS 또는 Leg-NP)로 치료된 마우스의 치료 개략도(n = 그룹당 8마리). (b) 종양을 3일마다 촉진하고 종양 크기를 결정하였다. 데이터는 평균±s.e.m.을 나타낸다. (c) 종양 중량을 46일째에 측정하고 체중과 비교하여 종양 적하율(%)을 결정하였다. 데이터는 평균±s.e.m.을 나타낸다. *p<0.05.
도 9. Leg-NP-CDDO는 생체내 종양 사이토킨 및 성장인자 발현 프로파일을 조절한다. 도 8a에 기술된 바와 같이 치료된 마우스로부터 분리된 MMTV-Neu 원발성 종양으로부터 전체 조직 추출물을 제조하였다. 웨스턴 블롯 분석(좌측 패널)을 수행하고 액틴(우측 그래프)과 상대적으로 정량하여 Th1(a) 및 Th2(b) 연관된 성장인자 및 사이토킨의 단백질 발현을 결정하였다. 추가로, 항-아폽토시스 단백질의 발현도 결정하였다 (c). 데이터는 3회의 독립적인 실험으로부터 평균±s.e.m.을 나타낸다. *p<0.05 및 **p<0.005.
도 10. Leg-NP-CDDO로의 치료학적 처치는 원발성 종양내로 면역세포의 침투를 조절한다. 마우스를 도 8a에 도시된 바와 같이 치료하였다. (a-c) 종양 세포 도전 후 46일 경과하여, 살아있는 원발성 종양 단일 세포 현탁액을 유세포분석하여 활성화된 CD8+ T 세포(a), 대식세포(b) 또는 수지상 세포(c)를 검출하였다. 데이터는 평균±s.e.m.을 나타낸다. (d) F4/80에 대한 항체(적색 염색) 및 NOS2(밝은 염색)에 대한 항체를 사용한 면역조직화학에 의해 동결된 종양 박편에서 M1 대식세포를 동정하였다. 세포핵을 DAPI(어두운 염색)로 염색하였다. 스케일 바 = 100μm.
도 11. Leg-NP-CDDO 및 pNeuTm 병용 치료요법은 항-종양 면역 감시를 증강시키고 유방암 재발을 억제한다. (a) 종양 재발 연구에 대한 치료 일정의 개략도. 마우스를 동소 도전하고(0일, 검정 파선 화살표), Leg-NP-CDDO 또는 대조군 NP(회색 실선 화살표)로 치료하며, pNeuTm 또는 p벡터(회색 파선 화살표)로 백신접종하였다. 약 500 mm3의 크기(검정 실선 화살표)에 도달한 후 원발성 종양 수술로 제거하였다. 4주 후 마우스의 대측성 유방 지방 패드에 MMTV-Neu 원발성 종양 세포로 재도전하였다(53일째, 검정 파선 화살표). 종양 치수를 측정하고 계산하여 종양 크기를 결정하였다(n = 그룹당 5마리). 데이터는 평균±s.e.m.을 나타낸다. (b) 2차 종양이 500 mm3의 부피에 도달했을 때 마우스를 희생시켰다. 최초 종양 세포 도전 후 128일 경과하여 무종양 마우스를 희생시켰다. PBS, Leg-NP 또는 Leg-NP-CDDO로 치료된 pNeuTm 백신접종 마우스의 비장 세포를 방사선조사된 MMTV-Neu 원발성 종양 세포와 배양하고 유세포분석하였다. 데이터는 평균±s.e.m.을 나타낸다. *p<0.05. (c) Leg-NP-CDDO/pNeuTM 치료된 마우스의 비장 세포를 방사능조사된 HEVc 또는 MMTV-Neu 원발성 종양 세포와 배양하고 유세포분석하였다. 웨스턴 블롯팅으로 HER-2 단백질 발현을 검증하였다. 데이터는 평균±s.e.m.을 나타낸다. ***p<0.0005.
본 발명은 레구마인, 아스파라기닐 엔도펩티다제와 결합하는 표적화된 모이어티를 이용하는 신규한 NP 표적화 전략에 관한 것이다. 본 발명은 리포좀 나노입자의 수성 분산액을 포함하는 수성 종양-표적화 리포좀 나노입자 조성물을 제공한다. 나노입자는 바람직하게는 항암 화학치료요법제를 캡슐화하고, 항암 화학치료요법제는 사전-형성된 리포좀 조성물에 첨가될 수 있거나 리포좀의 형성 동안에 리포좀내로 혼입될 수 있다. 리포좀 나노입자는 레구마인-표적화 지질을 하나 이상의 다른 미셀 또는 소포-형성 지질 물질과 혼합하여 나노입자 리포좀 분산액의 형태로 포함하며, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜-접합된 지질을 혼입한다. 바람직한 리포좀 나노입자 조성물은 (a) 레구마인-표적화 지질 성분; (b) 양쪽이온성 지질 성분; (c) 아미노-치환된 지질 성분; (d) 중성 지질 성분; 및 (e) 폴리에틸렌 글리콜-접합된 지질 성분(예, PEG-리포좀 조성물)을 포함한다. 레구마인-표적화 지질 성분은 레구마인-결합 모이어티에 공유 결합에 의해 부착된 소수성 지질 부분을 포함한다.
레구마인-결합 모이어티는 레구마인과 안정된 복합체 또는 공유 결합을 선택적으로 형성하는 임의의 물질, 예를 들면 레구마인의 비가역적 억제제일 수 있고, 이 물질은 전형적으로 레구마인에 대한 친화성을 갖는 펩타이드 스캐폴드, 예를 들면 아자-Asn-할로메틸케톤, 아자-Asn 에폭사이드 및 아자-Asn 마이클 수용체(마이클수용체로서 α,β-불포화 카르보닐 모이어티를 포함함)와 같은 반응성 작용기에 결합된 Ala-Ala-Asn[또는 Ala-Ala-X(여기서, X는 아자-Asn 잔기와 같은 변형된 Asn이다)]을 포함한다. 이러한 아자-Asn 모이어티는 레구마인 활성 부위에서 시스테인 잔기와 반응하여 억제제와 레구마인 사이에 예를 들면, 도 4에 나타낸 바와 같이 설파이드 공유 결합을 형성한다.
바람직한 표적화 모이어티는 화학식 I로 나타낸다:
[화학식 I]
Figure pct00001
상기 화학식은 레구마인 활성 부위에서 시스테인 잔기에 대한 마이클 수용체로서 작용하는 전자 결핍 이중 결합을 포함하는 변형 아자-Asn 모이어티에 부착된 2개의 알라닌 잔기를 포함하는 합성 아자-펩타이드 마이클 수용체-유형 레구마인 억제제이다. 화학식 I은 화학식 RR-11a로서 알려진 아자-Asn 마이클 수용체 레구마인 억제제의 반응성 부분을 나타낸다:
[화학식 RR-11a]
Figure pct00002
상기 화학식 RR-11a에서, RR-11a의 석신이미딜옥시 그룹은 인지질로 대체된다. 편의상, 화학식 I의 구조는 레구마인-표적화 지질 물질과 관련해서는 RR-11a로서 나타낼 것이다.
바람직한 레구마인-표적화 지질은 화학식 II의 화합물을 포함한다:
[화학식 II]
Figure pct00003
레구마인의 세포-표면 발현은 고형 종양의 특징인 저산소 스트레스에 의해 진행되고, RR-11a와 같이 레구마인-표적화 모이어티에 결합된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-피복된 리포좀은 고도의 리간드-수용체 친환성, 흡수 및 우수한 종양 침투를 보여준다. 본 발명의 RR-11a-접합된 PEG-리포좀 조성물에 의해 전달되는 항암 화학치료요법제(예, 독소루비신)는 종양 선택성의 현저한 향상, 약물 민감성의 감소 및 전신성 약물 독성의 제거를 초래하였다.
본 발명의 표적화된 리포좀 조성물의 나노입자(NP) 담체 부분은 바람직하게는 막지질, 예컨데 소포 또는 다른 막 구조(예, 독소루비신과 같은 항암 화학치료요법제를 캡슐화할 수 있는 리포좀 또는 미셀)를 포함한다. 바람직한 NP는 물질이 수성계에 분산될 때 리포좀 또는 미셀이 형성되도록 소수성 지질 부분과 친수성 부분이 배열된 물질을 포함한다. 도 1의 패널 (a)는 하나의 바람직한 막지질 물질(1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, DOPE)을 도해한다. 용어 "지질"은 지질 물질의 소수성 부분이 이중층(bilayer)을 향해 배향되고, 한편 친수성 부분은 수성 상을 향해 배향되도록 이중층 또는 미셀을 형성할 수 있는 임의의 지방산 유도체를 말한다. 친수성 특징은 본 분야에 잘 알려져 있는 포스페이트, 포스포네이트, 카르복실레이트, 설페이트, 설포네이트, 설프하이드릴, 아미노, 니트로, 하이드록실, 또는 기타 유사한 그룹의 존재로부터 유도된다. 소수성은 이들에 한정되는 것은 아니지만, 탄소수 20개 이하의 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소 그룹 및 하나 이상의 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬 및/또는 헤테로사이클릭 그룹(들)에 의해 치환된 상기 그룹을 포함하는 그룹을 포함함으로써 부여될 수 있다. 바람직한 지질은 포스포글리세라이드 및 스핑고지질이다. 포스포글리세라이드의 대표적인 예는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산, 팔미토일오레오일 포스파티딜콜린, 라이소포스파티딜콜린, 라이소포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 및 디리놀레오일포스파티딜콜린을 포함한다. 스핑고지질 및 글라이코스핑고지질 계열과 같은 인-함유 그룹이 결여된 화합물도 지질로 지정한 그룹에 속한다. 추가로, 상술된 양친매성 지질은 트리글리세라이드 및 스테롤을 포함한 다른 지질과 혼합될 수 있다.
레구마인 억제제/종양-표적화제는 부착이 종양 발현된 레구마인에 종양-표적화제의 결합을 방해하지 않는 한, 임의의 적합한 위치에서, 예를 들어 직쇄의 말단 또는 이의 중간 위치에서 리포좀 나노입자에 부착될 수 있다. 종양-표적화제는 또한 필요한 경우 나노입자와의 부착을 용이하게 하기 위해 임의의 2가 가교 그룹을 포함하거나 이러한 가교 그룹이 제공될 수 있다.
유리하게는 본 발명의 조성물은 레구마인-발현 종양에 대한 표적화 전달을 위해 임의의 항암 화학치료요법제(예, 항종양제)를 캡슐화할 수 있다. 이러한 화학치료요법제는 예를 들어 문헌[Imai and Takaoka, Nat . Rev . Cancer 6, 714-726 (2006)]에 기술되어 있으며, 상기 문헌은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다. 상기 화학치료요법제의 비제한적 예는 다음을 포함한다: 알킬화제(예, 시스플라틴; 카르보플라틴; 옥살리플라틴; 메클로르에타민; 사이클로포스파미드; 클로람부실; 이포스파미드); 퓨린 및 피리미딘 유사체 및 유도체(예, 5-플루오로우리실; 플록스우리딘; 사이토신 아라비노사이드; 메르캅토퓨린; 티오구아닌; 아자티오프린; 플루다라빈; 펜토스타틴; 클라드리빈); 토포이소머라제 억제제(예, 에토포사이드; 에토포사이드 포스페이트; 테니포사이드; 암사크린); 탁산(예, 파클리탁셀); 안티폴레이트(예, 메토트렉세이트; 트리메토프림; 피리메타민; 페메트렉세드); 혈관형성 억제제(예, 비탁신, 아네코르베이트, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 스쿠알라민, 항혈관형성 트립토파닐-t-RNA 신쎄타제 펩타이드 단편(예, T2-TrpRS)); 항종양 모노클로날 항체 (예, 베바시주맙, 티보자닙, 반데타닙, 바탈라닙, 알렘투주맙, 세툭시맙, 겜투주맙, 이브리투모맙, 판티투무맙, 리툭시맙, 토시투모맙, 트라스투주맙); 및 다른 항-신생제 또는 화학치료요법제(예, 세포독성 항체(예, 악티노마이신, 블레오마이신, 플리카마이신, 미토마이신); 안트라사이클린 항체(예, 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 발루비신, 이다루비신); 트리테르페노이드 Stat3 억제제 (예, 우르솔산; 2-시아노-3,12-디옥소올레아나-1,9-디엔-28-오익 에스테르; 2-시아노-3,12-디옥소올레아나-1,9-디엔-28-오익 아미드(예, 1-[2-시아노-3-,12-디옥소올레아나-1,9(11)-디엔-28-오일]이미다졸(CDDO-Im으로도 알려져 있음)) 등)뿐만 아니라 이들의 생리학적으로 허용되는 염 및 프로드럭.
일부 바람직한 실시형태에서, 화학치료요법제는 종양 성장에 연루된 수용체 또는 수용체 리간드의 효능제 또는 길항제인 항종양제이다.
표적화-리포좀/화학치료요법제 복합체 또는 이를 함유한 조성물의 용량 요법은 연령, 체중, 성별, 환자의 의학적 병태의 유형, 병태의 중증도, 투여 경로 및 사용된 특정 표적화 분자의 결합 활성과 같은 몇몇의 인자에 기초한다. 용량 요법은 상기 인자에 따라 다양할 수 있다. 체중 kg 당 약 0.01mg 내지 약 1000mg 범위의 용량 수준이 상기 의학적 병태를 치료하는데 유용하다. 바람직한 용량 수준은 체중 kg 당 약 0.01mg 내지 약 100mg의 범위 내이다.
주사에 의한 투여를 위해, 표적화-리포좀/화학치료요법제 복합체 또는 이를 함유하는 조성물은 물, 염수 또는 덱스트로스 수용액과 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화된다. 주사시 전형적인 1일 용량은 체중 kg 당 약 0.01mg 내지 약 100mg이고, 상기 인자에 따라 단일 용량 또는 다중 용량으로서 매일 주사한다.
하기의 비제한적인 실시예는 본 발명의 특정 양상을 추가로 설명한다.
실시예 1: 레구마인 - 표적화된 나노입자의 제형 및 특성확인
나노입자 조성. RR-11a의 합성은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들면, Ekici, O.D., et al. Aza-peptide Michael acceptors: a new class of inhibitors specific for caspases and other clan CD cysteine proteases. J Med Chem 47, 1889-1892 (2004) 또는 Ovat, A., et al . Aza-peptidyl Michael acceptor and epoxide inhibitors--potent and selective inhibitors of Schistosoma mansoni and Ixodes ricinus legumains(asparaginyl endopeptidases). J Med Chem 52, 7192-7210 (2009)를 참조한다. 모든 인지질(Avanti Polar Lipids)은 클로로포름에 용해되었다. 표적화를 달성하기 위해, 아자-펩타이드의 카르복실산 말단은 이러한 그룹을 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)로 활성화한 후 N-하이드록시석신아미드와 반응시켜 NHS-에스테르를 생성함으로써 변형시켰다. RR-11a는 WuXi AppTec Co. Ltd.에 의해 합성되었다. RR-11a-접합된 NP는 우선 RR-11a를 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)과 약 1:1 몰비로 트리에틸아민(TEA)의 존재 하에 주변 실온(RT)에서 약 24시간 동안 반응시켜 생성하였다. 이어서, 생성된 화합물을 다른 리포좀 시스템에 대해 상술한 바와 같이 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), DOPE, 콜레스테롤, 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](DOPE-PEG)와 약 1.1:6.7:6.7:2.2:1의 몰비로 혼합하였다. 문헌[Hood, J.D., et al. Tumor regression by targeted gene delivery to the neovasculature. Science 296, 2404-2407 (2002)]을 참조한다. 크기 분포는 ZETASIZER NANO® 광 산란 분석기(Malvern)를 이용한 동적 광 산란에 의해 결정하였다.
나노입자 내로의 독소루비신 로딩. 독소루비신을 다음과 같이 NP 내로 로딩하였다. 간단히 설명하면, 지질 필름을 약 1ml의 멸균 인산암모늄 완충액(300mM, pH 7.4) 중에 재수화시키고, 최소 약 1시간 동안 진탕시킨 후 초음파처리(sonication)하여 SUV를 생성하였다. NAP-10 컬럼(GE Healthcare) 상에서의 겔-여과 크로마토그래피에 의해 외부 인산암모늄 완충액을 PBS(pH 7.4)로 교환하였다. 이어서, 수 중의 독소루비신을 10mM 용액으로서 첨가하고 혼합액을 실온(RT)에서 밤새 항온처리하였다. 마지막으로, 독소루비신-혼입된 리포좀을 NAP-10 컬럼에서 PBS(pH 7.4) 완충액을 용출제로 사용하여 겔-여과 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 독소루비신이 로딩된 RR-11a-접합된 리포좀 NP 조성물을 RDZ-218로서 표기하였다.
DOPE에의 RR-11a의 접합은 아자-펩타이드의 카르복실산 말단을 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)로 활성화한 후 N-하이드록시석신아미드와 반응시켜 NHS 에스테르를 생성하고 촉매로서 트리에틸아민을 사용하여 클로로포름 중에서 DOPE의 아미노 그룹에 결합시킴으로써 아자-펩타이드의 카르복실산 말단의 1차 변형을 달성하였다(참조: 도 1 패널(a)). 종양 저산소증은 Glut-1 항체로 염색하여 검출하고 형광-접합된 2차 항체를 사용하여 가시화하였다. 세포핵은 DAPI 염색으로 가시화하였다(참조: 도 1, 패널(b), 스케일 바 100μm). 세포막-발현된 레구마인에 대한 항-마우스 레구마인 mAb의 친화성은 스캐챠드 분석으로 측정하였다(참조: 도 1 패널 (c)). 대조군 및 CoCl2 치료 세포에 대한 평균 Kd는 각각 약 1.107±0.232nM 및 약 1.208±0.107nM로 산출되었다. 대조군 및 CoCl2 치료 세포에 대한 결합 부위의 수는 각각 약 46,760 및 약 117,800 부위/세포로 산출되었다. NP는 적색 형광을 갖는 DOPE-로다민 B 지질의 존재하에 제형화되었다. 뮤린 4T1 및 4TO7 유방 및 CT26 결장 암종 세포를 약 100μM의 CoCl2와 약 24시간 배양한 후 세포에 RR-11a-(비표적화) 또는 RR-11a+(표적화) NP를 첨가하였다(참조: 도 1 패널(d)). 지정 시간 후, NP를 제거하고 즉시 형광 현미경을 이용하여 세포를 영상화한 다음 로다민 B-양성 세포의 비율(%)을 정량하였다(n = 그룹당 3개의 웰). 데이터는 평균±s.e.m.을 나타낸다. 동소(orthotopic) 4T1 유방 종양이 이식된 암컷 BALB/c 마우스에 비표적화된 NP 또는 표적화된 NP를 1회 주사하였다. 약 24시간 후, 마우스를 희생시키고 즉시 형광 현미경에 의해 기관을 분석하여 로다민 B 형광으로 표시되는 NP의 분포를 가시화하였다(n = 그룹당 2마리; 스케일바 100μm; 도 1 패널 (e) 참조).
실시예 2: 레구마인 - 표적화는 PEG - 리포좀 -캡슐화된 독소루비신의 흡수를 증진시키고 원발성 유방 종양으로의 NP - 매개된 약물 전달을 향샹시킨다 .
동물 및 세포주. 암컷 BALB/c 마우스는 The Scripps Research Institute Rodent Breeding Facility로부터 구입하였다. 모든 동물 실험은 Care and Use of Laboratory Animals에 대한 NIH 가이드에 따라 실시되었고, The Scripps Research Institute Animal Care Committee에 의해 승인되었다. 4T1 및 4TO7 뮤린 유방 암종 세포주는 Suzanne Ostrand-Rosenberg(University of Maryland, College Park, Maryland, USA)로부터 제공되었다. CT26 뮤린 결장 암종 세포는 ATCC로부터 구입하였다.
결합 연구 및 스캐챠드 분석. 항-마우스 레구마인 항체(약 40μg)(R&D Systems)를 약 100μg의 IODO-GEN® 시약(Pierce Chemical Co.)이 피복된 폴리스티렌 튜브 중에서 약 0.5 mCi의 125I(Amersham)와 함께 빙상에서 약 30분간 항온처리하였다. PD-10 컬럼(GE Healthcare) 상에서의 겔 여과에 의해 비혼입된 125I를 제거하였다. 4T1 세포(5x105)를 100μM CoCl2의 존재 또는 부재하에 약 24시간 동안 항온처리한 후 약 14nM 일련의 희석된 125I-표지된 항체와 약 4μC에서 약 2시간 동안 항온처리하였다. 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유한 PBS로 세포를 3회 세척하고 결합된 방사능표지의 양을 섬광 계측기로 측정하였다. 상응하는 분당 계수(CPM)를 PRISM® 소프트웨어(GraphPad)를 이용한 스캐챠드 플롯 분석에 사용하고, 이를 이용하여 레구마인 결합 부위의 수를 산출하였다.
시험관내 나노입자 흡수. 6-웰 평판에 약 0.3 x 106 세포/웰로 종양 세포를 식종하였다. NP 첨가 약 24시간 전에 세포를 100μM 코발트 클로라이드로 처리하여 저산소증을 자극하였다. 빈 상태이거나 0.2nM 독소루비신(Sigma)이 로딩된 RR-11a-접합된 NP 또는 RR-11a-유리된 NP를 세포에 첨가하고, 약 15 및 30분 또는 약 1, 2, 3, 4 및 6 시간 동안 항온처리한 후 이들 세포를 PBS로 세척하고 10% 아연 포르말린(Fisher Scientific)으로 고정한 다음 즉시 형광 현미경으로 분석하여 독소루비신 흡수를 가시화하였다. 유세포분석을 위해, NP의 제거 후 세포를 트립신처리하고 FACS 완충액 중에 재현탁한 다음 즉시 평균 형광 강도를 분석하였다.
생체분포 검정. 크기가 약 500mm3인 4TO7 동소 종양을 갖는 마우스에 로다민 B가 표지된 RR-11a-접합된 NP(RR-11a+) 또는 RR-11a-유리된 NP(RR-11a-)의 단일 용량을 정맥내 주사하였다. 대안으로, 마우스에 RDZ-218, NP-Dox, 유리된 Dox 또는 PBS를 약 48시간 간격으로 3회 주사하였다. 마지막 치료 후 약 24시간 경과하여 동물을 희생시키고 비장, 신장, 폐, 간, 심장 및 종양을 수거한 다음 OCT 화합물(Tissue-Tek)에서 동결한 후 즉시 박편화하고 형광 현미경으로 영상화하였다.
통계 분석. 실험군과 대조군 사이의 감별 소견에 대한 통계상 유의성은 PRISM® 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 양방(2-tailed) 스튜던트 t 시험으로 측정하였다. 소견은 p<0.05인 경우 유의적인 것으로 간주하였다.
인산염 구배를 사용하여 RR-11a+ NP 내로 독소루비신을 로딩하여 RDZ-218을 생성하였다. 또한, 대조군으로서 RR-11a-NP 내로 독소루비신을 로딩하였다(NP-Dox). 도 2 패널 (a)에 도해된 바와 같이, 4T1 및 4TO7 세포를 CoCl2와 약 24시간 배양한 다음 RDZ-218, NP-Dox 또는 유리된 Dox와 지정 시간 동안 항온처리한 후 유세포분석하여 독소루비신의 평균 형광 강도(MFI)를 측정하였다 (n = 각 시점에서 그룹당 3개의 웰). 데이터는 평균±s.e.m을 나타낸다. RDZ-218, NP-Dox 및 유리된 Dox-치료 세포의 MFI를 일련의 희석된 독소루비신의 MFI와 비교하여 약물 흡수 농도의 비율(%)을 측정하였다(참조: 도 2 패널(b)). RDZ-218, NP-Dox, 유리된 Dox, 유리된 RR-11a, 또는 빈 상태 RR-11a+NP(NP-RR-11a)로 처리한 후 약 24시간 경과하여 사멸된 4T1 및 4TO7 세포의 상대 비율(%)을 유세포분석의 전방 및 측방 산란 플롯을 분석하여 측정하였다(참조: 도 2 패널(c)). 데이터는 미치료 세포(대조군)에 대해 상대적으로 나타낸 것이다(n = 그룹당 3개의 웰). 데이터는 평균±s.e.m.을 나타낸다. *p<0.05, **p<0.005. 암컷 BALB/c 마우스의 서혜부 유방 지방 패드에 4TO7 세포를 주사하였다. 종양이 약 5일 동안 약 500mm3의 크기로 성장하도록 둔 후 마우스에 RDZ-218, NP-Dox 또는 유리된 Dox를 2회 정맥내 주사하였다. 마지막 주사 후 약 24시간 경과하여 마우스를 희생시키고 조직을 분리한 즉시 형광 현미경으로 분석하여 독소루비신의 분포를 검출하였다(참조: 도 2 패널(d)). 또한, 조직 박편을 DAPI로 염색하여 세포핵을 가시화하였다(n = 그룹당 2마리의 마우스; 스케일 바 100μm).
실시예 3: RDZ -218을 이용한 마우스의 치료학적 처치는 독성없이 원발성 유방 종양 성장을 완벽히 억제한다.
암컷 BALB/c 마우스의 흉부 유방 지방 패드에 약 1x105 4TO7 세포를 주사하였다. 종양 세포 도전 후 약 7일 경과하여 마우스에 RDZ-218, NP-Dox, 유리된 Dox(모두 약 1mg/kg Dox) 또는 염수를 3일 간격으로 5회 정맥내 주사하였다. 각각의 치료 당일에 마이크로캘리퍼(microcaliper)로 종양 치수를 측정하고, 이를 이용하여 종양 크기를 산출하였다. 최종 치료 후 약 24시간 경과하여 마우스를 희생시켰다. 신체 및 종양 중량 둘 다를 측정하고, 조직에 대해 조직학적 분석을 실시하였다. TUNEL(Promega) 염색을 제조사의 프로토콜에 따라 실시하였다.
암컷 BALB/c 마우스에 4TO7 종양 세포를 동소 주사하고 치료하기 전에 약 7일간 종양이 성장하도록 두었다. 마우스에 RDZ-218, NP-Dox, 유리된 독소루비신(유리된 Dox), 빈 상태 RR-11a+NP(NP-RR-11a) 또는 염수(PBS)를 3일 간격으로 5회 정맥내 주사하였다. 데이터 포인트는 치료 일수를 나타낸다(n = 그룹당 5마리의 마우스). 각각의 치료 당일에 종양 치수를 마이크로캘리퍼로 측정하고, 이를 사용하여 종양 크기를 산출하였다(참조: 도 3 패널(a)). 데이터는 평균±s.e.m을 나타낸다. 5차 주사 후 약 1일째에 마우스를 희생시키고 해부 전에 원발성 종양의 영상을 촬영하였다(참조: 3도 패널 (b)). 영상은 각 그룹의 대표적인 것이다. 또한, 원발성 종양의 습윤 중량을 측정하였다(참조: 도 3 패널(c)). 데이터는 평균±s.e.m을 나타낸다. *p<0.05. 종양 박편을 TUNEL로 염색하여 가시화하고 아폽토시스 종양 세포의 비율(%)을 정량하였다(n = 박편당 5개의 필드; 도 3 패널 (d) 참조). 데이터는 평균±s.e.m을 나타낸다. ***p<0.0005. 희생 시점에서 총 체중으로부터 원발성 종양 중량을 차감하고 종양 세포 도전 전의 체중과 비교하여 체중 변화를 측정하였다(참조: 도 3 패널 (e)). 데이터는 평균±s.e.m을 나타낸다. 대조군을 RDZ-218 치료 그룹과 비교하였다(**p=0.0029, ***p<0.001).
실시예 4: 독성 평가
약 500mm3 크기의 동소 4TO7 종양을 갖는 암컷 BALB/c 마우스에 유리된 독소루비신, NP-Dox, 또는 RDZ-218을 약 24시간 간격으로 5회 연속 정맥내 주사하였다. 모든 그룹에 대해 독소루비신의 용량은 5mg/kg이었다.
RDZ-218은 종래 기술의 유리된 및 PEG-리포좀-캡슐화된 독소루비신과 대조적으로 생체내 무독성을 나타낸다. 암컷 BALB/c 마우스에 4TO7 유방 종양 세포를 동소 주사하였다. 종양이 성장하도록 두어 치료 전에 약 500mm3의 크기에 도달하였다. 마우스에 유리된 독소루비신(유리된 Dox), 고유 NP(NP-dox) 또는 RR-11a+PEG-리포좀-캡슐화된 독소루비신(RDZ-218)을 5회 정맥내 주사하였다. 독소루비신은 모든 그룹에 대해 PBS 200μl 중에서 약 5mg/kg으로 투여하였다. 그 결과는 표 1에 나타내고, 분획은 각 치료 후 총 5마리 중에서 생존 마우스의 수를 나타낸다.
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논의
본 발명은 아자-Asn 마이클 수용체 억제제의 부류로부터 레구마인의 소분자(451 M.W.) 억제제, RR-11a에 PEG-리포좀 NP를 접합시킴으로써 리간드-표적화를 증명한다(도 1 패널 (a) 참조). RR-11a는 집단(clan) CD 특이적 서열로 설계되었고, 따라서 나노몰 범위의 IC50 값(IC50 = 31 내지 55nM)으로 비가역적으로 억제하는 레구마인과 같은 집단 CD 프로테아제에 대해 고도로 특이적이다. 중요하게도, RR-11a는 카스파제, 클로스트리파인 또는 진지파인 K를 포함한 다른 관련된 프로테아제와 상호작용하지 않으며, 생체내에서 프로테아제에 의한 절단에 대해 내성이다. RR-11a에 의한 레구마인 억제의 메커니즘은 C2에서 마이클 수용체 이중 결합에 촉매적 시스테인 잔기의 친핵성 공격과 관련되어 아스파라기닐 엔도펩티다제를 비가역적으로 억제하는 공유 결합을 형성한다(참조: 도 4 패널 (a)). 본 발명의 조성물의 사용시, RR-11a 결합된 NP는 레구마인과 공유 결합하여 결과적으로 리포좀 전체 성분이 수용체에 부착되고, 이어서 비가역적 내재화가 이루어진다. 이와 같이 제안된 메커니즘은 NMR 연구에 의해 지지되며 고 결합 친화성이 NP 표적화를 향상시키기 때문에 연관이 있다. NP의 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 성분에의 RR-11a의 결합은 재료 및 방법에 상세히 기술된 바와 같이 트리에틸아민(TEA)과의 반응에 의해 달성되었다(참조: 도 1 패널 (a)). 동적 광 산란법에 의한 RR-11a 결합된 PEG-리포좀(RR-11a+) 또는 고유 PEG-리포좀(RR-11a-) NP의 분석은 각각 약 150 및 110nm의 균일한 크기 분포를 나타냈다(데이터 제시되지 않음).
레구마인은 종간에 고도로 보존되어 있고 인간과 마우스 레구마인 단백질간에 상동성이 약 83%이며 인간 고형 종양의 대부분에서 과발현되기 때문에 종양 표적화를 위해 탁월한 재료가 된다. 따라서, 웨스턴 블롯 분석에 의해 다수의 뮤린 암세포주 및 뮤린 원발성 유방 종양에서의 레구마인 단백질 발현이 입증되었고 이것은 이전의 보고와 일치한다. 비록 세포내 레구마인은 도처에서 발현되지만 세포 표면상에서의 레구마인 발현은 미세환경-유도된 세포 스트레스(예, 혈청의 단계적 감소)에 반응하여 일어난다. 중요한 것은 레구마인의 세포 표면 발현이 Glut-1(확립된 저산소증-유도성 단백질)의 종양 발현에 의해 결정되는 것으로 유방암의 동소 마우스 모델에 존재하는 고형 종양의 특징인 저산소 스트레스에 의해 증가된다(참조: 도 1 패널 (b)). 또한, 다수의 뮤린 암종 세포주를 시험관내에서 면역조직화학 분석한 결과 저산소 스트레스가 레구마인의 세포 표면 발현을 유도한 것으로 나타났다(데이터 제시되지 않음).
리간드-표적화의 효율은 표적 수용체의 풍부도에 의해 일부 좌우되며 정상 세포에 상대적으로 표적 세포에서 과발현되어 극대화된다. 따라서, 리간드-표적화의 제약 요소는 표적 세포 표면 수용체의 수이며 이것은 종양 부위에 특이적으로 결합될 수 있는 표적화 화합물의 분자수를 결정한다. 따라서, 본 발명자들은 125I-표지된 항-레구마인 항체를 이용한 결합 연구 및 스캐챠드 플롯 분석을 통해 종양 세포당 레구마인 결합 부위의 수를 정량하였다. 본 발명자들이 산정한 결과에 따르면 정상적인 산소 분압하에 레구마인 결합 부위의 수는 약 46,760 부위/세포이고 저산소 조건하에서의 수는 약 117,800 부위/세포로 증가하였다(도 1 패널 (c)). 저산소증이 종양 세포 표면 레구마인 결합 부위의 수를 약 3배 증가시켰다는 사실은 저산소증이 고형 종양 미세환경의 특징이기 때문에 생물학적으로 관련이 있고 이에 따라 표적화 시스템은 종양의 임의의 단일 유전 특징에 의존하지 않는다. 따라서, 본원에 기술된 표적화 전략은 고형 종양에서 흔히 관찰되는 유전적 이질성에 의해 제약받지 않는다.
RR-11a 결합이 시험관내에서 종양 세포에 의한 PEG-리포좀 NP의 흡수를 증가시키는 정도를 평가하기 위해, 저산소 스트레스가 적용된 뮤린 유방 암종 세포(4T1 및 4TO7) 및 결장 암종 세포(CT26)를 여러 시점에서 형광 염료 로다민 B가 표지된 RR-11a+NP 또는 RR-11a-NP와 함께 항온처리하였다. 형광현미경으로 분석한 결과, 시험된 모든 시점의 3종 세포주 모두에서 RR-11a-NP에 비해 RR-11a+NP의 흡수가 현저히 증가한 것으로 나타났다(참조: 도 1 패널 (d)). 생체내 표적화의 효능은 약 500mm3 크기의 동소 4T1 유방 종양을 갖는 암컷 BALB/c 마우스내로 동일한 입자를 정맥내 주사하여 결정하였다. 이들 동물의 종양 및 조직을 형광 현미경으로 분석한 결과 RR-11a-NP와 비교하여 RR-11a+NP는 원발성 종양으로의 귀소성이 현저히 증가하였고, 간, 비장 및 신장을 포함한 세망내피계(RES)의 기관에 비특정 축적이 감소한 것으로 나타났다(참조: 도 1 패널 (e)). 이러한 RES 기관이 간 독성의 원인이 될 수 있는 것으로 비표적화된 PEG-리포좀 NP에 대한 주된 싱크로서 분류되어 왔기 때문에, 예상 외로 간에서 관찰된 RR-11a+NP 축적의 현저한 감소는 유의적이다. 종합해보면, 이와 같은 놀라운 데이터는 PEG-리포좀 NP에 RR-11a의 결합이 저산소 스트레스하에서 종양 세포에 의한 그들의 흡수를 증가시키고 NP의 원발성 종양으로의 귀소성을 효과적으로 증가시키는 한편 RES 기관에의 축적을 감소시킨다는 것을 가리킨다.
효과적인 리간드-매개된 NP 약물 전달에 중요한 요소는 목적하는 표적 세포로 최적의 적재물을 운반할 수 있는 능력뿐만 아니라 전달 후에 그 적재물을 효과적으로 방출할 수 있는 능력이다. 이와 같은 변수를 객관적으로 평가하기 위해 유방암의 치료에 흔히 사용되는 화학치료요법 약물인 독소루비신을 상술한 바와 같이 인산암모늄 구배를 통해 NP로 로딩하였다. 이어서, 저산소 스트레스하의 뮤린 유방 종양 세포(4T1 및 4TO7)를 유리된 독소루비신(Free Dox) 또는 독소루비신-로딩된 RR-11a-(NP-Dox) 또는 RR-11a+(RDZ-218)NP와 여러 시점에서 항온처리하고 즉시 유세포분석하여 세포에 의해 내재화된 독소루비신의 평균 형광 강도(MFI)를 정량하였다. RDZ-218 치료된 세포는 NP-Dox로 치료된 세포와 비교했을 때 독소루비신의 증가된 흡수를 나타냈다(도 2 패널 (a)). 놀랍게도, RDZ-218의 치료는 NP-Dox에 비해 시간 경과에 따른 보다 더 신속한 약물 흡수를 유도했을 뿐만 아니라 RDZ-218 흡수 속도가 유리된 Dox의 흡수 속도와 유사하면서 흡수 정도를 약 16배 이상 증가시켰다(참조: 도 2 패널 (a)). 단계적으로 희석된 유리된 독소루비신으로 치료된 세포로부터 발생된 MFI를 NP 캡슐화된 독소루비신으로 치료된 세포의 MFI와 비교함으로써 본 발명자들은 놀랍게도 RDZ-218 NP의 근 100%가 처리 후 약 4시간내에 세포에 의해 흡수됨을 관찰하였다(참조: 도 2 패널 (b)). 또한, 유리된 Dox에 비해 RDZ-218의 즉각적이고 신속한 흡수는 리간드-수용체-매개된 내재화를 가리키며 비-표적화된 NP-Dox와 비교하여 우수하였다.
이어서, 유세포분석에 의해 처리 후 24시간 경과하여 사멸된 종양 세포의 비율을 비교함으로써 RDZ-218의 독소루비신 생체활성을 결정하였다(도 2 패널 (c)). RDZ-218로 치료된 세포는 대조군 또는 NP-Dox 치료 세포에 비해 3 내지 15배 증가한 사멸 세포의 비율을 보였다. 흥미로운 것은 RDZ-218의 그러한 세포독성 효과가 유리된 Dox의 세포독성 효과보다 더 양호하였다. 중요한 것은 유리된 RR-11a 또는 빈 상태 RR-11a+ NP로 치료된 세포에서 세포독성 효과가 관찰되지 않았다는 점이며, 이것은 RDZ-218에서 관찰된 세포독성 증가가 NP-매개된 독소루비신 흡수 증가에 기인하는 것이지 종양 세포에 미치는 RR-11a에 의한 레구마인 억제의 어떠한 효과에 의한 것이지 아님을 가리킨다. 총괄적으로, 이들 결과는 RDZ-218이 시험관내에서 종양 세포로 생물학적으로 유효한 약물 적재물의 전달을 증가시킴을 증명한다.
리간드-표적화된 NP 전달의 주된 치료 목적은 표적 세포에 생물학적으로 유효한 용량의 약물을 전달할 수 있으면서 RES 기관에 NP의 비특정 축적으로부터 발생하는 바람직하지 않은 전신적 약물 독성을 최소화하는데 있다. 그러나, 약물 전달을 위해 NP를 사용하는데 있어 한 가지 우려되는 점은 NP가 약물 분자보다 상대적으로 큼에 따라 혈관벽을 통과하기가 곤란하고 작은 분자 질량 약물 또는 항체에 비해 종양 세포로의 접근이 용이하지 않다는 것이다. 따라서, 치료상 세팅에서 표적 조직에 약물 적재물을 효과적으로 및 특정적으로 전달할 수 있는 RDZ-218의 능력을 검사하기 위해, 크기가 약 500mm3의 유방 종양이 계통확립 마우스에 RDZ-218, NP-Dox 또는 유리된 Dox를 약 48시간 간격으로 2회 정맥내 주사하였다. 최종 주사 후 약 24시간 경과하여 종양을 현미경으로 관찰한 결과 RDZ-218 치료된 동물의 종양에서 독소루비신 형광이 강렬하고 넓게 분포한 것으로 나타났다(도 2 패널 (d)). 대조적으로, NP-Dox 또는 유리된 Dox로 치료된 마우스의 종양에서는 독소루비신 형광이 현저히 감소하였거나 작은 반점으로 나타났다(도 2 패널 (d)). 놀랍게도, RDZ-218로 치료된 마우스만이 NP-Dox 및 유리된 Dox 치료된 마우스와 비교했을 때 간 및 심장에서 뚜렷하게 감소된 독소루비신 형광을 보였다(도 2 패널 (d)). 심장에 독소루비신 축적의 감소는 심장 독성이 독소루비신 치료요법에서 용량 제한 요인이기 때문에 특히 중요하다. 이들 결과는 RDZ-218이 종양 침투능을 나타내고 RR-11a+NP가 간 및 심장과 같은 말초 기관에 약물의 비특정 축적을 감소시키면서 생체내 고형 종양으로의 약물 적재물의 특정 전달을 달성할 수 있음을 가리킨다.
유방 종양이 계통확립 마우스에 대하여 RR-11a+NP에 의해 전달된 독소루비신 적재물의 치료 효능은 마우스에 RDZ-218, NP-Dox, 빈 상태 RR-11a+NP(NP-RR-11a), 유리된 Dox 또는 염수를 3일 간격으로 5회 정맥내 주사하여 평가하였다. 마이크로캘리퍼로 종양 크기를 결정한 결과 RDZ-218의 단독 치료가 종양 성장을 근복적으로 제거한 반면, 대조군은 염수 처리 동물에 비해 단지 종양 성장을 지연시킨 것으로 나타났다(도 3 패널 (a)). 종양 세포 도전 후 3주 경과하여, RDZ-218로 치료된 마우스의 원발성 종양을 육안검사한 결과 흔적 종양 결절만이 나타난 반면 대조군 마우스에서는 크기가 약 500mm3 이상인 거대한 종양 덩어리가 관찰되었다(도 3 패널 (c)). 일치된 결과로서, RDZ-218 치료된 마우스의 종양 박편을 TUNEL 면역조직화학 분석했을 때 대조군 동물의 종양과 비교하여 아폽토시스 세포의 비율이 9 내지 35배 증가한 것으로 나타났다(도 3 패널 (d)). 놀랍게도, RDZ-218로 치료된 마우스는 연구 기간 내내 체중 감소를 전혀 보이지 않았으며, 이 결과는 독성 감소를 가리킨다 (도 3 패널 (3)).
RDZ-218의 독성 감소를 검증하기 위하여, 종양 보유 마우스에 유리된 Dox, NP-Dox 또는 RDZ-218의 1회 용량(모든 그룹에서 약 5mg/kg 독소루비신)을 약 5일간에 걸쳐 매일 투여하여 독성 연구를 실시하였다(표 1). RDZ-218 치료 그룹에서만 5일째 최종 치료 후 모든 동물이 생존해 있었다. 대조적으로, 약 5mg/kg이 투여된 유리된 Dox는 치명적이었고 이 그룹에 속하는 모든 피검 동물은 1차 치료 후 즉시 사멸되었다. 대비되는 비표적화된 NP-Dox 치료 그룹은 모든 5회 치료가 종료된 후 1마리만 생존하였고 치사 독성은 5 마리 동물 중 4 마리에서 2차 및 3차 치료 후에 관찰되었다. 이러한 놀라운 결과들은 PEG-리포좀의 RR-11a-매개된 리간드-표적화가 비표적 기관에 독소루비신의 비특정 축적을 감소시키며 이에 따라 전신적 치사 독성을 제거한다는 것을 확증해 준다.
실시예 5: 레구마인 - 표적화 NP 캡슐화된 CDDO - Im
CDDO-Im의 물리적 특징, 즉 소수성 및 콜레스테롤과의 화학적 유사성을 이용하여 CDDO-Im이 지질 필름의 재수화시 지질 이중층내로 자발적으로 혼입되도록 함으로써 CDDO-Im을 NP내로 혼입시켰다. 6.7:6.7:2.2:1:1.1 몰비의 DOPE:DOPC:콜레스테롤:DOPE-PEG:DOPE-RR11a에 CDDO-Im 0.6 몰비의 첨가는 CDDO-Im의 효과적인 로딩을 유도하였다. NP 분쇄에 의한 방출 후 유리된 CDDO-Im 및 캡슐화된 CDDO-Im의 UV 분광분석 결과 약 45 마이크로몰/L CDDO-Im의 로딩 농도로 나타났고 이 농도는 효과적인 Stat3 억제에 필요한 100 nmol/L의 용량보다 약 450배 더 농축된 것이다. 동적광산란 및 TEM에 의한 NP의 분석은 약 100 nm의 최적 평균 NP 직경 및 0에 그사한 제타 전위를 나타냈다(참조: 도 5a 내지 도 5d).
실시예 6: 캡슐화된 CDDO - Im 의 생체내 평가
재료. 인증된 4TO7/4T1 뮤린 유방암 세포는 Suzanne Ostrand-Rosenberg (University of Maryland, College Park, MD)로부터 공급받았고 10% FBS, 1% HEPES, 1% 중탄산나트륨 및 1% 나트륨 피루베이트가 보충된 RPMI-1640 배지 (Gibco, Carlsban, CA, USA)에서 생장되었다. 세포주는 Balb/c 마우스에서의 생체내 성장/전이, IL-6 및 S100A8/A9의 발현 및 6-티오구아닌에 대한 내성에 의해 확증된다. 세포는 MycoALERT를 이용한 마이코플라스마 검사에서 음성으로 나타났다 (2008, Lonza, Basel, Switzerland). MMTV-Neu 원발성 종양은 Michael Karin (University of California, San Diego, CA, USA)으로부터 공급받았고 동계 FVB/NJ 마우스의 계대에 의해 생장되었다. 간단히 설명하면, MMTV-Neu 원발성 종양을 분쇄하고 2.5% FBS 및 10 mM Hepes가 보충된 RPMI-1640 배지중의 3형 콜라게나제 (Worthington, Lakewood, NJ, USA)로 멸균조건하에서 분해시켰다. 1x106 세포를 PBS중에 현탁시키고 동계 암컷 FVB/NJ 마우스의 유방 지방 패드내로 주사하였다. 원발성 종양이 약 500mm3의 크기에 도달한 후 상기 과정을 반복하였다.
웨스턴 블롯 . 단백질 추출물을 상술한 바와 같이 제조하였다. 웨스턴 블롯을 다음의 항체로 추적하였다: 토끼 항-포스포-STAT-3 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), 염소-항-β-액틴, IL-6 및 IL-10, 토끼-항-포스포-STAT-1, STAT-3, IL-2, Bcl-xL, Bcl-2 및 TGF-β, 래트-항-IL-12b, GM-CSF 및 IFN-γ 및 마우스-항-IL-15 (모두 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 및 항-ERBB2 (Abcam, Cambridge, MA, USA). ImageJ 소프트웨어를 사용하여 단백질 밴드 강도를 정량하고 β-액틴으로 표준화하였다.
생체내 종양 연구. 4TO7(5x103) 세포 또는 MMTV-Neu(1x104) 원발성 종양 세포를 각각 암컷 BALB/c 또는 FVB/NJ 마우스내로 동소 주사하였다. PBS 200μl중의 NP (약 1.36x1013개 입자)를 정맥내 투여하고 디지털 마이크로캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 측정하였다. 종양 체적은 식[(a2xb)/2](여기서, a는 2개의 교차 직경중 큰 것이다)을 이용하여 산출하였다. 재발 연구를 위해, 원발성 종양을 수술로 제거하고 마우스의 대측성 유방 지방 패드에 동소적으로 재도전하였다. pNeuTm(공급처: Wei-Zen Wei, Karmanos Cancer Center, Detroit, MI, USA) 또는 공벡터가 형질도입된 약독화 살모넬라 타이피뮤리움을 위관영양관을 통해 마우스에 1주 간격으로 3회 경구 접종하였다.
유세포분석 . 비장세포와 종양 침윤 림프구를 분리하고 마우스 CD8, CD25, CD14, CD11c, CD11b, Cd80, CD45, F4/80 (Biolegend, San Diego, CA, USA)에 대한 형광-결합된 항체(100μl 용량 중의 106 세포당 0.25μg 항체) 및/또는 그랜자임 B에 대한 형광-결합된 항체(100μl 용량 중의 106 세포당 0.125μg 항체)(eBioscience, San Diego, CA, USA)와 함께 항온처리하였다. 데이터를 디지털 LSR-II(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)에서 수집하고 FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA)로 분석하였다.
면역조직화학. 아세톤에 고정된 종양 박편을 1차 항체인 래트 항-마우스 (1:50 희석, AbD Serotec, Raleigh, NC, USA) 및 토끼 항-마우스 Nos2 (1:50 희석, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 염색하고 2차 항체인 염소 항-래트 IgG Alexa Fluor 568 또는 염소 항-토끼 IgG Alexa Fluor 488 (둘 다 1:200 희석, Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA)로 각각 검출하였다. 염색 대조를 위해 조직 박편을 2차 항체하고만 항온처리하였다. 세포핵을 DAPI-디락테이트 (Sigma, St. Louis, MO, USA)로 염색하였다.
CDDO-Im은 뮤린 유방암 세포에서 STAT-3 활성화를 억제한다. CDDO-Im이 뮤린 유방암 세포에서 IL-6-유도된 STAT-3 활성화를 억제하는 능력은 4T1 종양 세포를 IL-6 및 CDDO-Im의 증가 농도와 함께 항온처리함으로써 평가하였다. 웨스턴 블롯 분석 결과 CDDO-Im이 100nM 내지 1μM 농도에서 STAT-3 인산화를 차단하고 총 STAT-3 단백질의 발현을 억제한 것으로 나타났다(도 6a). 캡슐화된 CDDO-Im이 STAT-3 활성화를 억제하는 능력은 IL-6 자극된 4TO7 종양 세포를 빈 상태 표적화된 NP(Leg-NP), CDDO-Im이 로딩된 비표적화된(NP-CDDO) 또는 표적화된(Leg-NP-CDDO) NP 또는 유리된 CDDO-Im과 함께 항온처리함으로써 검증하였다. 웨스턴 블롯 분석은 캡슐화된 CDDO-Im뿐만 아니라 유리된 CDDO-Im이 STAT-3 인산화를 차단하였음을 나타냈다(도 6b). 중요한 것은 Leg-NP로 치료된 세포가 STAT-3 인산화의 억제를 보이지 않았다는 점이며, 이것은 억제가 단지 CDDO-Im에서 기인하는 것이며 NP의 어떠한 비특정 작용에서 기인하지 않음을 증명한다(도 6b).
마지막으로, 치료상 세팅에서 Leg-NP가 CDDO-Im 적재물을 MMTV-Neu 원발성 종양으로 전달하는 능력을 검사하였다. 이를 위해 동소 유방 종양을 갖는 마우스에 염수(PBS), Leg-NP 또는 Leg-NP-CDDO를 3일 간격으로 8회 정맥내 주사하였다. 최종 주사 후 1일 경과하여 수득한 MMTV-Neu 원발성 종양 단백질 추출물을 웨스턴 블롯 분석한 결과 Leg-NP-CDDO가 원발성 종양에서 STAT-3 인산화를 효과적으로 억제시킨 것으로 나타났다(도 6c). 종합해 보면 이들 데이터는 CDDO-Im이 뮤린 유방암 세포에서 STAT-3 인산화를 억제한다는 것을 증명한다. 추가로, 이 연구는 TME로의 표적화된 전달을 위해 리포좀 NP내로 CDDO-Im의 성공적인 캡슐화 및 생체내 STAT-3 인산화의 효과적인 치료학적 억제를 증명한다.
Leg - NP - CDDO 는 뮤린 유방 종양의 성장을 억제한다. Leg-NP-CDDO의 생체내 효과를 평가하기 위해, BALB/c 마우스에 약 5x103 4TO7 종양 세포를 동소 도전하고, 4일 후 마우스에 Leg-NP-CDDO 또는 대조군을 8회 정맥 주사하였다(도 7a). 원발성 종양 성장이 대조군과 비교했을 때 Leg-NP-CDDO에 의해 유의적으로 억제되었다(도 7b). 중요하게는, 유리된 CDDO-Im 또는 비-표적화된 입자내에 캡슐화된 CDDO-Im으로의 치료는 Leg-NP-CDDO와 비교했을 때 종양 성장을 억제시키는데 현저하게 덜 효과적이었다. 추가로, Leg-NP-CDDO로 치료된 마우스는 미치료 대조군에 비해 종양적하에서 유의적인 감소를 보였다(도 7c).
그러나, 원발성 종양 세포와 비교하여, 생체외에서 장기간 배양된 계통확립 종양 세포주 (예, 4TO7)는 치료 반응에 영향을 미칠 수 있는 유전형 및 표현형 변이를 획득할 수 있었다. 따라서, Leg-NP-CDDO의 효능을 객관적으로 평가하기 위해, MMTV-Neu 원발성 세포로부터 유래된 동소 종양을 갖는 마우스에 Leg-NP-CDDO, Leg-NP 또는 PBS를 8회 정맥 주사하였다 (도 8a). 종양 체적의 산출 결과 Leg-NP-CDDO로 치료된 마우스는 유의적으로 감소된 종양 적하 (도 8c)에도 불구하고 대조군에 비해 단지 미미하게 감소된 종양 크기를 보였다 (도 8b). 따라서, Leg-NP-CDDO는 4TO7 세포로부터 유래된 종양에 비하여 원발성 종양 세포의 생체내 성장을 억제하는데 현저하게 덜 효과적이었다.
Leg - NP - CDDO 는 원발성 종양에서 사이토킨 및 성장인자 발현을 조절한다. STAT-3 신호전달은 종양 세포 및 TME내 다른 세포(대식세포를 포함)에 의한 사이토킨 및 성장인자 발현을 조절함으로써 종양-연관된 면역억제를 매개한다. 따라서, 이들 인자의 발현 수준에 Leg-NP-CDDO가 미치는 영향을 평가하기 위해, Leg-NP-CDDO, Leg-NP 또는 PBS로 치료된 마우스의 원발성 종양으로부터 전세포 추출물을 수득하였다. 웨스턴 블롯 분석 결과 대조군에 비해 Leg-NP-CDDO로 치료된 마우스에서 pSTAT-1(715배), IL-15(37배), IL-12b(9배), IFN-γ(24배) 및 GM-CSF(6배)의 현저히 상승조절된 단백질 발현이 나타났다(도 9a). 반대로, IL-6, IL-10 및 TGF-β의 단백질 발현은 Leg-NP-CDDO 치료된 마우스의 원발성 종양에서 2 내지 5배 감소로 나타났다(도 9b). 또한, Leg-NP-CDDO 치료는 항-아폽토시스 단백질 Bcl-XL(8배) 및 Bcl-2(1.4배)의 감소조절된 발현을 유도하였다(도 9c). 흥미로운 것은 이들 결과가 Leg-NP-CDDO 치료의 결과로서 TME의 Th1 사이토카인 분극화를 가리킨다.
Leg - NP - CDDO 치료된 마우스의 원발성 종양에서 항원제시세포 및 CD8 + T 세포의 증가. 종양에 의해 동원된 면역세포는 이들이 TME로부터 Th1 또는 Th2 분극화 신화를 수신하는지 여부에 따라 다른 사이토카인 및 성장인자를 분비한다. 따라서, 사이토카인 발현에서 관찰된 Th1 이동은 종양내 면역세포 환경의 변화가 또한 뚜렷할 수 있음을 제시하였다. 이 가설을 평가하기 위해, Leg-NP-CDDO, Leg-NP 또는 PBS로 처리된 마우스로부터 원발성 종양의 생존 단일 세포 현탁액을 수득하고 유세포분석하여 활성화된 CD8+ T 세포, DC 및 대식세포를 검출하였다(도 10a 내지 도 10c). NP-Leg-CDDO로 치료된 마우스는 PBS 대조군에 비해 CD8+/CD25+ T 세포의 4.6배 증가를 보였다(도 10a). 추가로, Leg-NP-CDDO로 치료된 마우스는 대식세포 (CD45+/F4/80+)(도 10b) 및 DC (CD14+/CD11c+ 및 CD80+/CD11b+)(도 10c)에서 각각 5.6배 및 2배를 나타냈다.
대식세포는 이들의 활성화 및 분극화 방식에 따라 면역 기능 및 종양 성장에 아주 상이한 영향을 미친다. 고전적으로 활성화된 M1 대식세포는 전형적으로 항-종양 면역반응과 관련하여 NOS2의 고발현을 나타낸다. 대조적으로, 대체적으로 활성화된 M2 대식세포는 NOS2를 발현하지 않으며 전형적으로 면역억제 및 향-종양 반응과 연관이 있다. 따라서, Leg-NP-CDDO 치료된 마우스의 원발성 종양에서 대식세포가 M1 또는 M2인지에 관한 연구를 실시하였다. 이를 위해 종양을 면역조직화학 및 형광현미경 분석한 결과 Leg-NP-CDDO 치료된 마우스로부터 유래된 종양에서 F4/80+/Nos2+ 양성 세포의 현저한 증가가 나타난 반면(도 10d), 대조 종양은 주로 NOS2-인 진한 F4/80+ 염색을 나타냈다(도 10d). 이러한 발견들은 종양 침윤 대식세포의 M1 분극화가 Leg-NP-CDDO 치료의 결과임을 가리킨다.
병용 치료요법은 Her-2 DNA 백신의 항종양 효과를 향상시킨다. 본 발명의 발견은 Leg-NP-CDDO로의 치료가 TME-매개된 면역억제를 차단한다는 것을 가리킨다. 게다가, 사이토카인 발현 프로필 및 면역 작용 세포침윤을 근거로 볼때, 면역 TME는 항-종양 반응의 충분한 준비가 된 것으로 보였다. FVB/NJ 마우스에 약 1x104 MMTV-New 원발성 종양 세포를 동소 도전하고 Leg-NP-CDDO와 HER-2의 세포외 도메인에 대한 DNA 백신(pNeuTM)을 병용 치료하였다(도 11a). 다른 방법으로서, 마우스를 또한 빈 상태 표적화된 NP (Leg-NP) 또는 대조 백신(pVector)으로 치료하였다. 원발성 종양이 500 mm3의 체적에 도달했을 때 수술로 제거하고 4주의 회복 기간을 거친 후 재발 실험을 위해 마우스의 대측성 지방 패드에 약 1x104 MMTV-Neu 원발성 종양 세포를 재도전하였다. Leg-NP-CDDO/pNeuTM 병용 치료요법으로 치료된 마우스에서 대조군에 비해 종양 재발이 유의적으로 억제되었으며 마우스의 40% (2/5)에서 완벽한 종양 거부로 나타났다 (도 11a). 대조적으로, pNeuTm의 백신접종 또는 Leg-NP-CDDO로의 치료만으로는 종양 재발을 예방하지 못했다. 이들 결과는 종양 재발에 대한 병용 치료요법-매개된 예방이 Leg-NP-CDDO에서 기인한다는 것을 제시하며, Leg-NP-CDDO는 Th1을 준비시켜 면역 TME를 조성함으로써 pNeuTm 백신접종 후 항-종양 면역 반응을 증진시킨다.
Leg-NP-CDDO, Leg-NP 또는 PBS와 병합된 pNeuTm 백신접종 마우스의 비장세포를 방사능조사된 MMTV-Neu 원발성 종양 세포와 함께 배양하고 이들의 CTL 반응을 유세포분석으로 측정하였다. 그 결과 Leg-NP-CDDO로 치료된 pNeuTM 백신접종 마우스는 대조군에 비해 CD8+/그랜자임 B+ 비장세포의 비율이 2.3배 증가한 것으로 나타났다 (도 11b). 추가로, CTL 반응의 그러한 증가가 종양 세포 특이적인지를 평가하기 위해 Leg-NP-CDDO/pNeuTm 치료된 마우스의 비장세포의 CTL 반응을 HER-2고 MMTV-Neu 종양 세포 대 HER-2저 HEVc 마우스 상피 세포와 배양하여 비교하였다 (도 11c). 이들 비장세포를 유세포 분석한 결과 HER-2고 세포 대 HER-2저 세포에 반응한 CD8+/그랜자임 B+ 세포의 비율이 4배 증가한 것으로 나타났다 (도 11c). 이 결과는 병용 치료요법으로 치료된 마우스의 면역반응이 실질적으로 종양 항원 특이적임을 증명한다.
논의.
Leg-NP-CDDO 치료된 마우스의 종양에서 증가된 CD8+ T 세포는 T 세포에 대한 강력한 주화성인자인 IL-15 발현의 뚜렷한 증가와 상관성이 있다. 중요한 것은 IL-15가 시험관내에서 고유 인간 및 기억 CD8+ T 세포의 Th1 T 세포 분화 및 증식을 자극한다는 점이다. 의미가 있는 것은 이들 발견이 TMF에서의 증가된 IL-15 발현과 Leg-NP-CDDO에 의한 STAT-3 억제의 결과인 CD8+ T 세포 기능 증진의 상관성을 보이는 관찰과 일치한다는 점이다.
고형 종양에서 가장 흔한 면역 세포가운데 하나는 종양-연관된 대식세포(TAM)이다. TAM은 염증세포의 추가 동원을 촉진하는 사이토카인 방출에 의해 향-종양 염증을 매개한다 (24). 일관되게 본 발명자들은 원발성 종양에서 IL-10 및 TGF-β의 단백질 발현 감소를 발견하였다. 두 단백질은 TAM의 암 촉진 M2 표현형을 유도하는 것으로 보고되었다. 대조적으로, IFN-γ에 의해 활성화되는 대식세포는 종양 파괴와 연관된 표현형을 보유한다. 이들 M1 대식세포의 특징은 부분적으로 NOS-2의 발현에 의해 나타난다. 흥미로운 것은 원발성 종양에서 GM-CSF의 발현 증가에 상응하는 것으로서 Leg-NP-CDDO로 치료된 마우스의 원발성 종양에서 NOS-2+ 대식세포의 침윤 증가가 관찰되었다. 중요한 것은 GM-CSF가 DC 및 대식세포를 포함하여 강화된 전문적인 항원제시세포의 동원을 유도하는 것으로 제시되었다는 점이다.
본 발명의 결과는 HER-2 DNA 백신(pNeuTm)과 병용된 Leg-NP-CDDO를 이용한 면역 TME의 표적화 조작이 마우스 종양 모델에서 유방암 재발을 필수적으로 예방하였다는 것을 증명한다. 또한 병용 치료요법은 단독 치료요법만을 받은 마우스와 비교하여 CD8+ T 세포의 항-종양 CTL 반응을 유의적으로 향상시켰다. 게다가, 병용 치료요법으로 치료된 마우스는 원발성 종양 세포에 대해 특정적으로 증가된 CTL 반응을 나타냈으나 HER-2- 내피 세포에 대해서는 그렇지 않았다. 이 결과는 종양 항원 특이적 면역반응을 증명한다. 중요한 것은 병용 치료요법이 HER-2+ 원발성 종양 세포의 재도전 후 종양 성장을 지연시켰으며 마우스의 40%에서 재발을 예방하였다. 이들 결과는 면역 TME의 치료상 조치가 암면역 치료요법의 효능을 향상시킬 수 있다는 점을 명백히 증명한다.
종합해 보면 본원에 기술된 결과는 다수 사이토카인의 병용 치료요법 및 특정 표적화의 필요성이 강하게 강조된 단독 사이토카인 치료에 의한 한정된 효과를 보여주는 몇 가지 임상 I상/II상에서의 발견과 맥락을 같이한다. 의미있는 것은 본 발명에서의 발견들이 TME에서 면역 사이토카인 및 성장 인자의 주된 레퍼토리를 치료하는 새로운 표적화 치료방법을 제시한다. 중요한 것은 TME에서 특정적으로 Th1/Th2 전환을 위한 면역 조절을 표적화함으로써 많은 면역-자극 사이토카인의 면역 촉진 효과를 이용하면서도 심각한 전신적 독성을 회피할 수 있다는 점이다. Leg-NP-CDDO는 암백신 치료요법의 항종양 효과를 향상시키고 암재발을 예방함으로써 궁극적으로 암면역치료요법의 효능을 증진시켜 암환자의 수명 및 건강을 연장시킬 수 있는 잠재적으로 유용한 치료 화합물로 대표된다.
요약하면, 생체내 고형 종양으로 고도로 효율적인 약물 적재물을 전달할 수 있는 신규한 레구마인-표적화된 PEG-리포좀 NP가 개발되었다. RR-11a와의 결합은 종양 세포의 표면상에서 레구마인 결합 부위의 수가 뚜렷하게 증가함으로 인해 고형 종양의 특징인 저산소 스트레스하에서 종양 세포에 의한 NP 흡수를 유의적으로 증가시켰다. 이 현상은 레구마인에 대한 RR-11a의 고 결합 친화성과 결부되어 치료상 세팅에서 고형 종양으로의 약물 로딩된 RR-11a+ NP의 특이적 귀소성을 촉진하고, 간 및 심장에서의 비특정 축적을 감소시켜, 결과적으로 바람직하지 않은 약물 독성을 제거한다. 중요하게는, RR-11a+ NP에 의한 약물 전달은 독소루비신의 치사용량의 독성을 제거했을 뿐만 아니라 독소루비신의 저용량에 대한 종양의 민감성을 증가시켰으며, 결과적으로 유효한 항-종양 반응을 달성하는데 필요한 약물의 양을 감소시켰다.
종양 미세환경(TME)는 면역억제를 매개하고 면역 감시로부터의 종양 세포 회피 및 암 백신 무력화를 유도한다. 면역 억제는 종양 및 면역 세포에서의 신호전달을 증강시키는 STAT-3 전사 인자에 의해 매개된다. 면역 억제는 계속적으로 암 백신 효능의 주된 억제제이기 때문에 본 발명자들은 본 연구에서 HER-2 DNA 백신과 병용하여 TMEfhdml 합성 STAT-3 억제제의 치료학적 표적화 전달이 HER-2+ 유방암에 대한 면역 감시를 증가시키고 암 재발을 예방할 수 있는지를 검사하였다. 본 발명의 CDDO-Im 적재물을 캡슐화하는 리간드-표적화된 나노입자(NP)는 TME로의 특정적 전달을 유도할 수 있고 원발성 종양에서 STAT-3 활성화의 효과적인 치료학적 억제를 증명하였다. 게다가, 이들 NP로의 치료는 특징적으로 IFN-γ, pSTAT-1, GM-CSF, IL-2, IL-15 및 IL-12b 단백질의 발현 증가 및 TGF-β, IL-6 및 IL-10 단백질의 발현 감소로 나타나는 면역 TME의 점화를 유도하였다. 추가로, 활성화된 CD8+ T 세포, M1 대식세포 및 수지상세포에 의한 유의적인 종양 침윤 증가가 관찰되었다. 이러한 변화는 동소 4TO7 유방 종양의 지연된 성장과 상관성이 있으며 HER-2 DNA 백신과 병용했을 때 면역적격 마우스에서 HER-2+ 원발성 종양의 재발을 예방하였다. 게다가, 항-종양 T 세포 반응은 이와 같은 병용 치료요법으로 치료된 마우스로부터 분리된 비장세포에서 증강되었다. 종합해 보면 이들 데이터는 종양-특이적 항원에 대한 증진된 면역 감시를 통해 암 재발로부터 효과적인 방어를 입증한다.
본 발명에 따른 종양 표적 NP는 독소루비신 및 CDDO-Im을 캡슐화하는데 사용되는 RR-11a+ NP가 또한 약동학 차이를 실질적으로 해소하는 독소루비신과 택산과 같은 약물 조합을 포함한 다른 약물 화합물을 캡슐화하는데 응용될 수 있기 때문에 유의적인 임상 용도를 제공한다. 본 발명의 기술은 약물 전달 및 화학치료요법의 현재 상태보다 앞선 것으로 항-종양 효과를 위해 필요한 생물학적으로 최적의 약물 용량을 감소시킴과 동시에 바람직하지 않은 전신적 독성을 제거하는 수단을 제공하고 암환자의 건강과 삶의 질을 상당히 향상시킬 수 있다.

Claims (43)

  1. 수성 종양-표적화 리포좀 나노입자 조성물로서,
    상기 조성물은 레구마인-표적화 지질(legumain-targeting lipid)을 하나 이상의 다른 미셀(micelle) 또는 소포-형성 지질 물질과 혼합되어 수성 담체 중에 분산된 리포좀 나노입자의 형태로 포함하고, 임의로 상기 리포좀 나노입자 내에 항-종양 화학치료요법제를 캡슐화하며; 상기 레구마인-표적화 지질 성분은 레구마인-결합 모이어티에 공유 결합에 의해 부착된 소수성 지질 부분을 포함하는, 수성 종양-표적화 리포좀 나노입자 조성물.
  2. 수성 종양-표적화 리포좀 나노입자 조성물로서,
    상기 조성물은 항암 화학치료요법제를 임의로 캡슐화하는 리포좀 나노입자의 수성 분산액을 포함하고, 상기 리포좀 나노입자는 (a) 레구마인-표적화 지질 성분; (b) 양쪽이온성 지질 성분; (c) 아미노-치환된 지질 성분; (d) 중성 지질 성분; 및 (e) 폴리에틸렌 글리콜-접합된 지질 성분을 포함하고; 상기 레구마인-표적화 지질 성분은 레구마인-결합 모이어티에 공유 결합에 의해 부착된 소수성 지질 부분을 포함하는, 수성 종양-표적화 리포좀 나노입자 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 레구마인-표적화 지질 성분이 1,2-디아실글리세로-포스포알칸올아민 그룹에 공유 결합에 의해 부착된 레구마인-결합 모이어티를 포함하는, 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 1,2-디아실글리세로-포스포알칸올아민이 1,2-디올레오일-sn-글리세롤-3-포스포에탄올아민(DOPE)인, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레구마인-결합 모이어티가 아자-Asn 마이클 수용체-유형 레구마인 억제제를 포함하는, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레구마인-결합 모이어티가 아자-Asn 마이클 수용체-유형 레구마인 억제제인 화학식 I로 나타내어지는 그룹을 포함하는, 조성물:
    [화학식 I]
    Figure pct00005
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레구마인-표적화 지질 성분이 화학식 II의 화합물을 포함하는, 조성물:
    [화학식 II]
    Figure pct00006
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양쪽이온성 지질 성분 (b)가 1,2-디아실글레세로-포스포콜린 화합물을 포함하는, 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 1,2-디아실글레세로-포스포콜린 화합물이 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)을 포함하는, 조성물.
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노-치환된 지질 성분 (c)가 1,2-디아실글리세로-포스포알칸올아민 화합물을 포함하는, 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 1,2-디아실글리세로-포스포알칸올아민 화합물이 DOPE를 포함하는, 조성물.
  12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중성 지질 성분 (d)가 콜레스테롤을 포함하는, 조성물.
  13. 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜-접합된 지질 성분 (e)가 폴리에틸렌 글리콜-접합된 1,2-디아실글리세로-포스포알칸올아민 화합물을 포함하는, 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜-접합된 1,2-디아실글리세로-포스포알칸올아민 화합물이 1,2-디올레오일-sn-글리세롤-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜]을 포함하고, 여기서 상기 화합물의 폴리에틸렌 글리콜 부분의 평균 분자량이 약 2000 원자 질량 단위(amu)인, 조성물.
  15. 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성분 (a), (b), (c), (d) 및 (e)가 (a):(b):(c):(d):(e)의 몰비 약 1.1:6.7:6.7:2.2:1로 리포좀 나노입자에 존재하는, 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포좀 나노입자 조성물이 항암 화학치료요법제를 캡슐화하는, 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 항암 화학치료요법제가 독소루비신 또는 1-[2-시아노-3-,12-디옥소올레아나-1,9(11)-디엔-28-오일]이미다졸(CDDO-Im)을 포함하는, 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 상기 항암 화학치료요법제가 시스플라틴; 카르보플라틴; 옥살리플라틴; 메클로르에타민; 사이클로포스파미드; 클로람부실; 이포스파미드; 5-플루오로우리실; 플록스우리딘; 사이토신 아라비노사이드; 메르캅토퓨린; 티오구아닌; 아자티오프린; 플루다라빈; 펜토스타틴; 클라드리빈; 에토포사이드; 에토포사이드 포스페이트; 테니포사이드; 암사크린; 파클리탁셀; 메토트렉세이트; 트리메토프림; 피리메타민; 페메트렉세드; 비탁신; 아네코르베이트; 안지오스타틴; 엔도스타틴; 스쿠알라민; 항혈관형성 트립토파닐-t-RNA 신쎄타제 펩타이드 단편; 베바시주맙; 티보자닙; 반데타닙; 바탈라닙; 알렘투주맙; 세툭시맙; 겜투주맙; 이브리투모맙; 판티투무맙; 리툭시맙; 토시투모맙; 트라스투주맙; 악티노마이신; 블레오마이신; 플리카마이신; 미토마이신; 독소루비신; 에피루비신; 다우노루비신; 발루비신; 이다루비신; 우르솔산; 2-시아노-3,12-디옥소올레아나-1,9-디엔-28-오익 에스테르; 2-시아노-3,12-디옥소올레아나-1,9-디엔-28-오익 아미드; 1-[2-시아노-3-,12-디옥소올레아나-1,9(11)-디엔-28-오일]이미다졸(CDDO-Im으로도 알려져 있음)뿐만 아니라 이들의 생리학적으로 허용되는 염 및 프로드럭으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는, 조성물.
  19. 제16항에 있어서, 상기 리포좀 나노입자 조성물이 항종양제를 캡슐화하는, 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 항종양제가 종양 성장에 연관된 수용체 또는 수용체 리간드의 효능제 또는 길항제인, 조성물.
  21. 제1항 내지 20항중 어느 한 항에 있어서, 종양의 치료에 사용하기 위한, 조성물.
  22. 수성 종양-표적화 리포좀 나노입자 조성물로서,
    상기 조성물은, 리포좀 나노입자 내에 항-종양 화학치료요법제를 캡슐화하는 리포좀 나노입자의 수성 분산액을 포함하고, 상기 리포좀 나노입자는 (a) 레구마인-표적화 지질 성분; (b) 양쪽이온성 지질 성분; (c) 아미노-치환된 지질 성분; (d) 중성 지질 성분; 및 (e) 폴리에틸렌 글리콜-접합된 지질 성분을 포함하고; 상기 레구마인-표적화 지질 성분은 레구마인-결합 모이어티에 공유 결합에 의해 부착된 소수성 지질 부분을 포함하는, 수성 종양-표적화 리포좀 나노입자 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 레구마인-표적화 지질 성분이 1,2-디아실글리세로-포스포알칸올아민 그룹에 공유 결합에 의해 부착된 레구마인-결합 모이어티를 포함하는, 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 1,2-디아실글리세로-포스포알칸올아민이 1,2-디올레오일-sn-글리세롤-3-포스포에탄올아민(DOPE)인, 조성물.
  25. 제22항에 있어서, 상기 레구마인-결합 모이어티가 아자-Asn 마이클 수용체-유형 레구마인 억제제를 포함하는, 조성물.
  26. 제22항에 있어서, 상기 레구마인-결합 모이어티가 아자-Asn 마이클 수용체-유형 레구마인 억제제인 화학식 I로 나타내어지는 그룹을 포함하는, 조성물:
    [화학식 I]
    Figure pct00007
  27. 제22항에 있어서, 상기 레구마인-표적화 지질 성분 (a)가 화학식 II의 화합물을 포함하는, 조성물:
    [화학식 II]
    Figure pct00008
  28. 제22항에 있어서, 상기 양쪽이온성 지질 성분 (b)가 1,2-디아실글리세로-포스포콜린 화합물을 포함하는, 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 1,2-디아실글리세로-포스포콜린 화합물이 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)을 포함하는, 조성물.
  30. 제22항에 있어서, 상기 아미노-치환된 지질 성분 (c)가 1,2-디아실글리세로-포스포알칸올아민 화합물을 포함하는, 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 1,2-디아실글리세로-포스포알칸올아민 화합물이 DOPE를 포함하는, 조성물.
  32. 제22항에 있어서, 상기 중성 지질 성분 (d)가 콜레스테롤을 포함하는, 조성물.
  33. 제22항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜-접합된 지질 성분 (e)가 폴리에틸렌 글리콜-접합된 1,2-디아실글리세로-포스포알칸올아민 화합물을 포함하는, 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜-접합된 1,2-디아실글리세로-포스포알칸올아민 화합물이 1,2-디올레오일-sn-글리세롤-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜]을 포함하고, 여기서 상기 화합물의 폴리에틸렌 글리콜 부분의 평균 분자량이 약 2000 원자 질량 단위(amu)인, 조성물.
  35. 제22항에 있어서, 상기 성분 (a), (b), (c), (d) 및 (e)가 (a):(b):(c):(d):(e)의 몰비 약 1.1:6.7:6.7:2.2:1로 리포좀 나노입자에 존재하는, 조성물.
  36. 제22항에 있어서, 상기 항암 화학치료요법제가 독소루비신 또는 1-[2-시아노-3-,12-디옥소올레아나-1,9(11)-디엔-28-오일]이미다졸(CDDO-Im)을 포함하는, 조성물.
  37. 제22항에 있어서, 상기 항암 화학치료요법제가 시스플라틴; 카르보플라틴; 옥살리플라틴; 메클로르에타민; 사이클로포스파미드; 클로람부실; 이포스파미드; 5-플루오로우리실; 플록스우리딘; 사이토신 아라비노사이드; 메르캅토퓨린; 티오구아닌; 아자티오프린; 플루다라빈; 펜토스타틴; 클라드리빈; 에토포사이드; 에토포사이드 포스페이트; 테니포사이드; 암사크린; 파클리탁셀; 메토트렉세이트; 트리메토프림; 피리메타민; 페메트렉세드; 비탁신; 아네코르베이트; 안지오스타틴; 엔도스타틴; 스쿠알라민; 항혈관형성 트립토파닐-t-RNA 신쎄타제 펩타이드 단편; 베바시주맙; 티보자닙; 반데타닙; 바탈라닙; 알렘투주맙; 세툭시맙; 겜투주맙; 이브리투모맙; 판티투무맙; 리툭시맙; 토시투모맙; 트라스투주맙; 악티노마이신; 블레오마이신; 플리카마이신; 미토마이신; 독소루비신; 에피루비신; 다우노루비신; 발루비신; 이다루비신; 우르솔산; 2-시아노-3,12-디옥소올레아나-1,9-디엔-28-오익 에스테르; 2-시아노-3,12-디옥소올레아나-1,9-디엔-28-오익 아미드; 1-[2-시아노-3-,12-디옥소올레아나-1,9(11)-디엔-28-오일]이미다졸(CDDO-Im으로도 알려져 있음) 뿐만 아니라 이들의 생리학적으로 허용되는 염 및 프로드럭으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는, 조성물.
  38. 제22항에 있어서, 상기 리포좀 나노입자 조성물이 항종양제를 캡슐화하는, 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 항종양제가 종양 성장에 연관된 수용체 또는 수용체 리간드의 효능제 또는 길항제인, 조성물.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 레구마인-발현 암 질환의 표적화 및 치료에 사용하기 위한, 조성물.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 종양-표적화 리포좀 나노입자 조성물의 나노입자 내에 캡슐화된 유효량의 항암 화학치료요법제를 레구마인-발현 종양을 가진 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 레구마인-발현 종양을 표적화하고 치료하는 방법.
  42. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 종양-표적화 리포좀 나노입자 조성물의, 레구마인-발현 종양의 치료를 위한 용도.
  43. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 종양-표적화 리포좀 나노입자 조성물의, 레구마인-발현 암 질환의 치료를 위한 용도.
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