KR20190122064A - 약물이 로딩된 인산염 미셀을 포함하는 약물전달체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 약물 및 상기 약물이 로딩된(loaded) 담체를 포함하고, 상기 담체는 인산염(phosphate) 계면활성제로 이루어진 미셀(micelle)인 것을 특징으로 하는 약물전달체에 대한 것으로서, 본 발명에 따른 약물전달체에 포함된 인산염 계면활성제로 이루어진 미셀은, 타겟 주변의 과발현된 효소에 의해 절단되어 미셀에 로딩된 약물을 해당 타겟에 선택적으로 방출하는 것이 가능하기 때문에 종래 기술에 비해 생체 내에서 약물 부작용을 현저히 감소시키면서도 치료 효과는 극대화할 수 있다.

Description

약물이 로딩된 인산염 미셀을 포함하는 약물전달체{DRUG DELIVERY SYSTEM INCLUDING DRUG-LOADED PHOSPHATE MICELLE}
본 발명은 약물전달체에 대한 것으로서, 보다 상세하게는, 생체 내의 특정 위치에서 약물을 선택적으로 방출할 수 있는 약물전달체에 관한 것이다.
약물을 생체 내 기관, 조직, 세포 또는 세포소기관과 같은 목적하는 표적에는 효과적으로 더 많이 축적시킬 수 있음과 동시에, 원하지 않는 비표적에는 축적되는 것을 줄임으로써 약효를 향상시키고, 부작용은 감소시킬 수 있는 기술을 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.
이와 관련해, 특정 종양 세포에 대한 선택성을 증가시키고 분산성을 향상시킴으로써 비암성(non-cancerous) 세포에 대한 세포 독성을 감소시키기 위해 생체 적합성 화학 물질 및 압타머, 항체, 당 및 엽산과 같은 생물학적 실체(entity)를 사용하는 것을 포함하는 나노 입자 표면 개질(surface modification) 기술이 알려져 있다.
그러나, 때로는 이러한 간단한 표면 개질을 통해서는 생체 적합성 나노 입자를 얻기에 충분하지 않기 때문에 전달 시스템(delivery system)이 상기한 문제를 푸는 열쇠가 될 수 있다.
특히, 항암 화학요법에서 약물전달체를 이용하여 약물을 투여할 경우 종양 세포의 선택적 표적화 및 약물분자의 종양 미세 환경 내에서의 방출에 의해 약물 복용량을 감소시킴으로써 전통적인 화학요법의 부작용을 줄일 수 있을 것으로 기대할 수 있다.
하지만, 표적에 대한 약물의 분배, 신진 대사 및 방출의 복잡한 방법을 고려할 때, 완벽한 전달 시스템의 설계는 복잡한 문제이다.
Gnach, A., et al., Upconverting nanoparticles: assessing the toxicity. Chemical Society Reviews, 2015. 44(6): p. 1561-1584. Sun, L., et al., Folic acid-functionalized up-conversion nanoparticles: toxicity studies in vivo and in vitro and targeted imaging applications. Nanoscale, 2014. 6(15): p. 8878-8883. Zhou, L., et al., Multihydroxy Dendritic Upconversion Nanoparticles with Enhanced Water Dispersibility and Surface Functionality for Bioimaging. ACS Applied Materials & Interfaces, 2014. 6(10): p. 7719-7727. Yang, Y., Upconversion nanophosphors for use in bioimaging, therapy, drug delivery and bioassays. Microchimica Acta, 2014. 181(3): p. 263-294.Mura, S., Nicolas, J. & Couvreur, P. Stimuli-responsive nanocarriers for drug delivery. Nat Mater 12, 991-1003, doi:10.1038/NMAT3776 (2013).
본 발명은 생체 내의 특정 위치에서 약물을 선택적으로 전립선 암세포에만 방출함으로써 약물 투여량 감소에 따른 부작용 최소화 및 치료 효과 극대화를 동시에 꾀할 수 있는 신규한 약물전달체의 제공을 그 목적으로 한다.
상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 약물 및 상기 약물이 로딩된(loaded) 담체를 포함하고, 상기 담체는 인산염(phosphate) 계면활성제로 이루어진 미셀(micelle)인 것을 특징으로 하는 약물전달체를 제안한다.
또한, 상기 인산염(phosphate) 계면활성제는 지방산 에스테르(fatty acid ester)를 인산화(phosphorylation)한 후, 페그화(PEGylation)시켜 형성된 것을 특징으로 하는 약물전달체를 제안한다.
또한, 상기 지방산 에스테르는 에틸렌 글리콜 스테아레이트(Ethylene glycol stearate)인 것을 특징으로 하는 약물전달체를 제안한다.
또한, 상기 인산염(phosphate) 계면활성제는 하기 화학식으로 표시되는 중합체인 것을 특징으로 하는 약물전달체를 제안한다:
[화학식]
Figure pat00001
.
또한, 상기 약물은 암 치료제인 것을 특징으로 하는 약물전달체를 제안한다.
또한, 상기 암 치료제는 전립선암 치료제인 것을 특징으로 하는 약물전달체를 제안한다.
또한, 전립선 종양 세포에 대해 상기 전립선암 치료제를 담체로부터 선택적 방출(selective release)하는 것을 특징으로 하는 약물전달체를 제안한다.
또한, 전립선 종양 세포에서 과발현된 분비형 포스포리파아제 A2(sPLA-2)에 의해 상기 인산염(phosphate) 계면활성제에 포함된 에스테르기(ester group)가 가수분해되어 상기 전립선암 치료제가 담체로부터 방출하는 것을 특징으로 하는 약물전달체를 제안한다.
그리고, 본 발명은 발명의 다른 측면에서, 상기 약물전달체를 유효성분으로 포함하는 전립선암 치료용 약학적 조성물을 제안한다.
또한, 상기 약학적 조성물은 주사제, 액제, 산제, 현탁제, 과립제, 시럽제, 캡슐제, 환제 또는 정제 형태의 제형인 것을 특징으로 하는 전립선암 치료용 약학적 조성물을 제안한다.
본 발명에 따른 약물전달체에 포함된 인산염 계면활성제로 이루어진 미셀은, 타겟 주변의 과발현된 효소에 의해 절단되어 미셀에 로딩된 약물을 해당 타겟에 선택적으로 방출하는 것이 가능하기 때문에 종래 기술에 비해 생체 내에서 약물 부작용을 현저히 감소시키면서도 치료 효과는 극대화할 수 있다.
도 1은 본원 실시예에서의 인산염 계면활성제 3단계 합성 과정을 나타낸 도면이다.
도 2(a)는 위로부터 순서대로 에틸렌 글리콜 스테아레이트(EGS), 2-(포스포노옥시)에틸 스테아레이트, 및 페그화되어 최종적으로 얻어진 인산염 계면활성제의 FT-IR 스펙트럼이며, 도 2(b)는 위로부터 순서대로 에틸렌 글리콜 스테아레이트(EGS) 및 2-(포스포노옥시)에틸 스테아레이트에 대한 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 3은 메탄올로 세척하는 시간을 1분, 5분 또는 10분으로 각각 달리할 경우에 있어서의 에틸렌 글리콜 스테아레이트의 FT-IR 스펙트럼이다.
도 4는 에틸렌 글리콜 스테아레이트의 단일 인산화(monophosphorylation) 후의 계면활성제에 대한 EDAX 분석 결과이다.
도 5는 인산염 계면활성제의 임계 미셀 농도(critical micelle concentration, CMC)를 결정하기 위해, 인산염 계면활성제 농도의 대수(logarithm)에 대한 형광 강도의 변화를 도시한 그래프이다.
도 6은 인산염 계면활성제에 sPLA-2를 첨가할 때, 소화(digestion) 후의 물리적 변화를 보여주는 사진이다.
도 7(a) 및 도 7(b)는 각각 sPLA-2 효소에 의한 소화 전 및 소화 후의 인산염 계면활성제의 질량 스펙트럼이다.
도 8은 PBS 용액 내 에스트라머스틴 인산 나트륨(estramustine phosphate sodium)의 검량선이다.
도 9(a) 및 도 9(b)는 각각 에스트라머스틴 인산염(estramustine phosphate)의 포집 전후의 미셀에 대한 투과전자 현미경(TEM) 이미지이다.
도 10은 활성 봉독 sPLA-2에 의한 인산염 계면 활성제 절단에 의해 유발된 estramustine의 방출 효율 측정 결과이다.
도 11(a) 및 도 11(b)는 각각 KB 세포주 및 22Rv1 세포주에 대한 에스트라머스틴(estramustine) 또는 미셀 내에 포집된 에스트라머스틴(estramustine)의 세포 독성 분석(MTT assay) 결과를 나타낸다.
본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다.
본 발명의 개념에 따른 실시예는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있으므로 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본 명세서 또는 출원에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명의 개념에 따른 실시 예를 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 설시된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하도록 한다.
본 발명에 따른 약물전달체는, 암치료체 등의 약물 및 상기 약물이 로딩된(loaded) 담체를 포함하고, 상기 담체는 인산염(phosphate) 계면활성제로 이루어진 미셀(micelle)인 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 인산염(phosphate) 계면활성제는 지방산 에스테르(fatty acid ester)를 인산화(phosphorylation)한 후, 페그화(PEGylation)시켜 형성된 것이 바람직하며, 특히, 스테아르산(SA) 및 에틸렌 글리콜(EG)과 같은 생체 친화성 양친매성 화합물로부터 합성되어 생체 적합성을 갖는 것이 보다 바람직하다.
상기 인산염 계면활성제는 생체 내 타겟 주변에 존재하는 효소(enzyme) 등에 의해 그 구조가 붕괴되어, 미셀 내부에 로딩되거나(loaded) 포집되어(entrapped) 있던 약물 입자를 해당 타겟 주변에서 선택적으로 방출하는 역할을 한다.
일례로, 전립선 암세포 주변에 다량 존재하는 분비형 포스포리파아제 A2(sPLA-2)에 의해 상기 인산염(phosphate) 계면활성제에 포함된 에스테르기(ester group)가 가수분해되어 로딩 또는 포집되어 있던 전립선암 치료제 입자가 담체로부터 선택적으로 방출되어, 전립선 암세포의 사멸을 통한 치료 효과를 발휘할 수 있다.
참고로, 상기 분비형 포스포리파아제 A2(sPLA-2)는 sn-2 위치에서 인지질(phospholipid) 가수분해의 촉매 작용을 해 지방산(fatty acid)과 리소포스포리피드(lysophospholipid)를 생성하는 효소인데, 그 과발현(overexpression)은 전립선 암세포의 증식에 기여한다고 알려져 있다.
이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예> 전립선암 치료제(Estramustine phosphate)가 로딩된 인산염 미셀 입자의 제조
(1) 인산염 중합체(phosphate polymer)의 합성
도 1에 도시한 바와 같이 인산염 계면활성제는 3단계 합성 과정을 통해 합성되었으며, 아래에 각 단계를 상세히 설명한다.
1) 제1 단계 : 에틸렌 글리콜 스테아레이트의 합성 및 정제
에틸렌 글리콜 스테아레이트의 합성은 카르복실산의 슈테글리히 에스테르화(Steglich esterification)를 통해 이루어졌다. 해당 방법은 낮은 반응 온도(0 내지 실온(RT)) 때문에 녹색 합성 경로(green synthesis route)로 여겨진다. 스테아르 산(SA) 0.005 몰(1.422g)을 디클로로메탄(DCM) 30 ml에 용해시킨 후, 에틸렌글리콜(EG) 3 당량(0.9310g)을 첨가하고 빙수 조(ice-water bath)에서 교반하여 반응 매질을 냉각시켰다. 반응을 촉진시키기 위해 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)을 촉매로 사용하였다. 반응 매질을 0 ℃로 냉각시킨 후, 20 ml DCM 내에 2.27 g의 디시클로헥실카르보디이미드(DCC)를 함유하는 미리 제조된 용액을 한 방울씩 첨가하였다. DCC를 모두 첨가한 후, 빙수 조를 제거하고 반응 매질을 실온에서 이틀 동안 교반하였다. 반응이 멈추었을 때, 디시클로헥실우레아(DCU)에 해당하는 고체가 형성된 것이 관찰되었다. 반응 매질을 정제하기 위해 먼저 여과시킨 다음 탄산나트륨 포화 용액으로 3회 세척하였다. 각각의 세척 후에, 생성된 고체를 제거하고 유기상과 수성상의 분리를 간단하게 하기 위해 생성물을 여과했다. 그 후 생성물을 희석된 염산 용액으로 2회 세척하였다. 생성물의 재결정화는 빙수 조에서 수행되었다. 얻어진 생성물에는 DCM에도 용해될 수 있는 DCU의 흔적이 남아 있었다. 메탄올에 대한 DCU의 용해도는 매우 높은 반면, 에스테르는 메탄올에 용해되지 않기 때문에 재결정된 생성물을 메탄올로 5 분 동안 세척했다.
합성된 에틸렌 글리콜 스테아레이트의 분자 구조는 푸리에 변환 적외선 분광법(FT-IR)과 양성자 NMR(1H NMR)으로 확인하였다.
도 2(a)를 참조하면, FT-IR 스펙트럼은 1650cm-1에서 1737cm-1로 피크 이동을 나타내며, 이는 카르복실산기의 에스테르기로의 변환에 해당한다. 에틸렌 글리콜 스테아레이트의 양성자 NMR(1H NMR)은 예상되는 구조를 확인시켜준다.
도 2(b)에서, 에틸렌 글리콜 스테아레이트의 1H NMR은 1.26 내지 1.31 ppm 사이의 넓은 일중항(singlet)은 지방산으로부터의 수소를 나타내고, 0.88 ppm에서의 삼중항(triplet)은 스테아르산의 메틸기와 관련된다. 1.64 ppm에 존재하는 다중항(multiplet)은 β 탄소상의 수소와 관련이 있는 반면, α 탄소상의 수소는 2.32 ppm에서의 삼중항에 나타난다. 3.65와 4.20 ppm에서의 삼중항은 에틸렌 글리콜 부분의 메틸렌 수소와 관련 있다.
전술한 바와 같이, 디시클로헥실우레아(DCU)는 중탄산 나트륨 및 염산 희석 용액으로 세척한 후에도 생성물 중에 여전히 존재하였다. 따라서, 결정 형태로 얻어진 생성물을 메탄올로 세척하였다. DCU은 메탄올에 대해 높은 용해도를 가지지 때문에, 메탄올로 생성물을 여러 번 세척했다. 도 3은 5 분 미만으로 교반하면 DCU가 완전히 제거되지 않기 때문에 메탄올에서 5 분간 교반하는 것이 가장 적절하다는 것을 보여 주며, 5 분 이상 교반하면 역으로 생성물이 손상된다. FT-IR 스펙트럼에서 3326cm-1의 피크는 EGS의 O-H 스트레치와 중첩되는 DCU의 N-H 스트레치와 관련되어 있다.
2) 제2 단계 : 2-(포스포녹시)에틸 스테아레이트(2-(phosphonooxy)ethyl stearate)의 합성 및 정제
인산염 모노 에스테르의 합성을 위해 친핵성 염기(트리부틸아민)에 의해 촉진되는, 인산과 에틸렌 글리콜 스테아레이트의 탈수 축합을 사용했다. 해당 방법은 등몰량(equimolar) 인산과 에틸렌 글리콜 스테아레이트를 직접 응축시켜 인산 모노 에스테르를 합성하는 방법이다. 높은 반응 온도는 녹색 합성(green synthesis)에는 바람직하지 않으므로 공비 용매(DMF/EtNO2)가 선택되었다. 에틸렌 글리콜 스테아레이트(EGS) 3 mmol(1.18g)을 용매에 용해시키고 저열로 교반하여 EGS를 완전히 용해시켰다. 이후, 반응 매질에 트리부틸아민(Bu3N) 3 mmol (0.71ml) 및 디메틸아미노피리딘(DMAP) 10 mol%(0.037g)을 첨가하였다. 마지막으로, 인산(PA) 3,04 mmol(3.46ml)을 가하고 가열 환류 시켰다. Dean-Stark 장치는 물을 제거하고 결과적으로 반응 시간을 제어하는데 사용되었다. 반응 매질을 실온으로 냉각한 후, 액상의 재결정화를 수행하였다. 생성물을 에틸 아세테이트로 세척하여 미반응 2-(포스포노옥시)에틸 스테아레이트를 제거하였다.
생성물의 특성화는 FT-IR 및 1H NMR에 의해 수행되었다.
도 2(a)에서 1737cm-1에 나타나는 피크는 에스테르기와 연관되어 있다. 920cm-1과 1088cm-1 사이에 나타나는 다른 피크는 P-O-C 결합의 존재를 확인시켜준다. 또한, 1600 cm-1에서 1700 cm-1 사이에 위치한 피크는 O=P-OH기의 존재를 나타낸다.
도 2(b)에서, 양성자 NMR은 인산염-계면 활성제의 형성을 나타낸다. 0.75 ppm의 삼중항은 스테아르산의 메틸기와 연관되고, 1.12와 1.16 ppm 사이의 넓은 일중항은 지방산으로부터의 수소를 나타낸다. 피크는 용매가 다르기 때문에 낮은 ppm으로 천이하였다.
또한, 단일 인산화(monophosphorylation) 후 계면 활성제에 인산염 작용기가 존재 하는지를 확인하기 위해 계면 활성제의 원소 분석(EDAX)을 수행하였다. 도 4에 도시한 해당 EDAX 분석 결과는 탄소(C), 산소(O) 및 인(P)의 존재를 확인시켜준다. 또한, 계면 활성제의 구조와 관련이 있는 원자 간의 비율을 확인할 수 있다.
3) 제3 단계 : 페그화된 2-(포스포노옥시)에틸 스테아레이트(PEGylated 2- (phosphonooxy) ethyl stearate)의 합성 및 정제
슈테글리히 에스테르화(Steglich esterification)를 통해 2-(포스포노옥시)에틸 스테아레이트 중합체에서 인산염기의 페그화가 이루어졌다. 스테아린산 2-(포스포노 옥시)에틸 스테아레이트 0.1 mol(0.195g)을 디클로로메탄(DCM) 30 ml에 녹인 후 폴리에틸렌글리콜(PEG) 2 당량(0.9310g)을 넣고 빙수 조에서 교반하여 반응 매질을 냉각시켰다. 반응을 촉진시키기 위해 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP) 10 mol%를 촉매로 사용하였다. 반응 매질을 0 ℃로 냉각시킨 후, DCM 20 ml에 디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 0.227g을 함유하는, 미리 제조된 용액을 한 방울씩 첨가하였다. DCC를 모두 첨가한 후, 빙수 조를 제거하고 반응 매질을 실온에서 질소 존재 하에 2일 동안 교반하였다. 이어서, 반응 매질을 여과하고, 용매를 회전 증발기로 증발시켰다. 유성(oily) 생성물을 에틸 아세테이트로 세척하여 미량의 촉매를 제거하였다.
도 2(a)에 따르면, 성공적인 페그화가 이루어졌음을 확인할 수 있는데, 3000cm-1에서 2820cm-1 사이에 위치한 강한 피크는 지방족 탄화수소 개수의 증가를 나타낸다. 1737cm-1에서의 피크는 지방산과 에틸렌글리콜 사이의 에스테르기의 존재를 확인시켜준다. 1000cm-1과 1100cm-1 사이에 위치한 피크는 P-O-C기의 존재와 폴리에틸렌글리콜 사슬이 인(P)에 존재함을 확인시켜준다. 폴리에틸렌글리콜 사슬이 인산염의 수산기를 대체하기 때문에 1600 cm-1 내지 1700 cm-1의 범위에 위치한 피크는 낮은 파장으로 이동하고 강도가 감소한다.
또한, 형광 프로브로서 파이렌(pyrene)을 이용한 염료 미셀화법을 통해, 계면 활성제의 임계미셀농도(critical micelle concentration, CMC)를 측정하였다. 염료 미셀화법은 계면 활성제를 첨가한 후 염료의 형광 강도의 변화를 기반으로 한다. 인산 계면활성제 농도의 함수로서 강도비(I3/I1)를 나타낸 도 5를 참조하면, 1.737 x 10-4 M에서 미셀이 형성되었음을 보여주며, 이는 이전에 보고된 다른 계면 활성제의 CMC와 비교적 유사하다는 것을 알 수 있다.
다음으로, 상기 인산염 계면활성제에 대한 봉독 sPLA-2(bee venom sPLA-2)의 활성을 확인하기 위해 소화(digestion) 및 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석(LC/MS)을 실시하였다. 활성 봉독(bee venom) sPLA-2는 중합체의 소화에 사용되었고, 이후 절단된 단편은 액체 크로마토그래피 결합 질량 분석기(LC/MS)을 통해 확인되었다. 기질(substrate)로는 페그화된 중합체와 비교하여 더 낮은 분자량을 가지는 제2 단계의 중합체가 사용되었다.
도 6에 따르면, 인산염-계면 활성제에 효소를 첨가한 후에 용액에서 물리적 변화가 관찰되었다. 구체적으로, sPLA-2 효소를 인산염-계면 활성제를 함유하는 용액에 첨가한 후에, 튜브의 상부로 이동하는 수분에 불용성 물질의 형성이 관찰되었으며, 이는 인산염-계면 활성제의 소화 후에, 물에 불용성이고 물에 비해 상대적으로 밀도가 낮은 스테아르산이 튜브의 위쪽으로 이동함에 따른 것으로 추정된다. 또한, LC/MS에 주입하기 전에 디클로로메탄(DCM) 내에 샘플을 추출하는 동안, 처리된 샘플의 수성상이 훨씬 더 깨끗하고 투명하다는 것을 관찰하였다. 인산염-계면 활성제가 DCM에 잘 용해되는 스테아르산으로 효소에 의해 소화된 것이다.
도 7을 참조하면, 중합체만을 함유하는 용액의 질량 스펙트럼은 인산염 계면활성제에 상응하는 407.90 m/z에서 피크를 갖는다. 노이즈 피크와 비교하여 407.90 m/z에서의 피크의 강도는 매우 낮다. 이는 디클로로메탄(DCM) 이용해 추출하는 동안에 인산염-계면 활성제의 물에 대한 용해성 때문에 많은 양의 인산염-계면 활성제가 수성 상에 남아, 인산염 계면활성제의 농도가 매우 낮음을 의미한다. 반면, 주입 후 질량 스펙트럼은 407.90 m/z에서의 피크가 사라짐을 보여주며, 이는 효소에 의한 인산염-계면 활성제의 가수 분해되어, 284 m/z에서 나타나는 스테아린산을 형성함을 나타낸다.
(2) 인산염 계면 활성제로 이루어진 미셀 안으로의 약물 포집(entrapment)
PBS 용액 내에서 미셀 안으로의 에스트라머스틴 인산염(estramustine phosphate)의 포집을 수행하였다.
참고로, 에스트라머스틴 인산염은, Emcyt 및 Estracyt라는 상표명으로 판매되며 전립선암의 치료에 사용되는 이중 알킬화 항종양제(즉, 화학 요법 약물) 및 에스트로겐 유형의 호르몬 항종양제이다.
구체적으로, 인산염 계면 활성제 0.022g을 4ml의 PBS에 분산시킨 후, estramustine phosphate sodium(1400μg)을 인산염 계면 활성제 용액에 첨가하였다. 최종 용액을 37℃에서 24 시간 동안 교반하였다. 그 후, 생성물을 4000 rpm으로 20 분 동안 원심 분리하여 수집하고, 경사분리(decantation)하고, PBS 용액에서 3 회 재분산시켰다. 로딩되지 않은 estramustine phosphate을 제거하기 위해 투석(MW cutoff 3500)을 수행하였다.
그리고, 상층액(supernatant) 및 세척 용액을 수집하여, 포집된 estramustine phosphate을 215 nm에서 UV 흡광 분광법에 의해 추가로 정량화하였다.
포집 및 방출 효율 계산의 중요성을 감안해 검량선(Calibration Curve)을 작성하였으며, 이를 위해 estramustine phosphate의 농도가 다른 일련의 용액을 준비하고, estramustine phosphate sodium(0.001g)을 PBS(phosphate buffered saline x1) 용액 10mL에 용해시킨 후 1/2 희석 공정을 5회 실시하였다. 그리고, 용액에 대해 UV 흡수 스펙트럼을 수집하고 검량선을 작성했다(도 8).
상기 검량선과 다음 방정식을 사용하여 포집 효율(EE%)을 계산할 결과, 포집 효율은 초기 농도대비 81,432%인 것으로 나타났으며, 또한, 약물 포집 전후의 미셀에 대한 TEM 이미지는 미셀 내로 에스트라머스틴 인산염이 성공적으로 포집되었음을 보여줬다(도 9).
Figure pat00002
<실험예 1> 실시예에서 제조된 에스트라머스틴이 포집된 미셀에 대한 에스트라머스틴 인산염의 방출 효율(Release efficiency) 측정 및 분석
약물 전달 시스템의 또 다른 중요한 특성은 촉발(triggering)을 통한 포집된 약물의 방출 효율이다. 본 발명에 따른 인산 계면활성제는 sPLA-2에 의해 절단될 수 있기 때문에, 활성 봉독 물질인 sPLA-2를 촉발제(triggering agent)로 사용해 약물 방출 실험을 실시하였다.
구체적으로, 약물 방출을 자극하기 위해, 6-24 U/L의 활성 봉독 sPLA-2 및 2 mM CaCl2를 함유하는 4 ml PBS 용액에 상기 실시예에서 제조한 에스트라머스틴 인산염이 로딩된 미셀을 분산시켰다. 용액을 37 ℃에서 10 분 동안 교반 한 후, 용액을 원심 분리하여 s-PLA 및 미셀을 함유하는 펠렛으로부터 방출된 약물을 함유하는 용액을 분리 하였다. 그 후, 미셀을 sPLA-2의 용액에 다시 분산시키고 다시 20, 60, 180 분 동안 교반하였다.
sPLA-2가 있는 상태에서 에스트라머스틴 인산염가 로딩된 미셀로부터의 에스트라머스틴의 누적 방출량은 도 10에 나타냈다. 방출된 에스트라머스틴염의 누적량은 pH 7.4 및 37 ℃에서 24 시간 배양한 후 85.12%에 도달했다. 흥미롭게도, 처음의 1 시간 경과 후에 약물의 84.12%가 방출되었으며, 이는 방출 개시 후 약 1시간 동안 로딩된 에스트라머스틴 인산염의 거의 전부가 미셀로부터 방출되었음을 의미한다.
<실험예 2> 실시예에서 제조된 에스트라머스틴이 포집된 미셀 입자 및 에스트라머스틴(estramustine)의 세포 독성 분석(Cell Cytotoxicity Assay)
세포 독성은 모든 새로운 나노 물질, 특히 나노 의약에 적용되는 나노 물질에서 고려되어야 할 중요한 요소이다.
본 실험예에서는 MTT (3-[4,5- dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석을 이용하여 KB 세포주(HeLa contaminant, 암종) 및 22Rv1 (인간 전립선 암, 암종) 세포주에 대해 암세포의 세포 생존 능력(cell viability)을 확인하였다.
이를 위해, 세포를 MEM(Minimum Eagle's medium) 및 RPMI 1640 배지(ATCC modification)에서 각각 성장시켰다. 모든 배지에 37 ℃ 및 5% CO2에서 10% FBS(태아 소 혈청) 및 5 mL의 Pen/Strep (10.000 μg/mL, 10.000 units/mL)을 보충했다. 22Rv1과 KB 세포를 96-well 세포 배양 플레이트에 104/L/well로 접종하고, 5% CO2 하에서 37 ℃에서 24 시간 동안 접착시켰다.
다음으로, 실시예에서 제조한 에스트라머스틴 인산염이 포집된 미셀을 RPMI 1640(ATCC modification) 및 MEM 배지에 분산시켰다. 이와 별도로, 미셀에 포집되지 않은 에스트라머스틴 인산염만을 RPMI 1640(ATCC modification) 및 MEM 배지에 각각 분산시켰다. 이들 용액을 처리군(treatment group)의 웰에 첨가하고, 용액을 첨가하지 않은 배지를 음성 대조군으로 하였다.
그리고, 37℃, 5% CO2 하에서 24 시간 동안 세포를 배양하였다. 이어서 MTT(5mg/mL) 100μL를 96-well 분석 플레이트의 처리군 및 음성 대조군 웰 각각에 첨가하고 5% CO2하에 37 ℃에서 추가로 4 시간 동안 배양하였다. DMSO-에탄올 용액(1:1) 100 μL/well을 첨가 한 후, 분석 플레이트를 실온에서 15 분간 유지하였다. Tecan Infinite M200 단색화기(monochromator-based) 기반의 다기능 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 540 nm에서 배경 분리(background subtraction)를 통해 각 웰의 OD 570(Abs 값)을 측정했다.
도 11(a) 및 도 11(b)는 각각 KB 세포주 및 22Rv1 세포주에 대한 에스트라머스틴 또는 미셀 내에 포집된 에스트라머스틴의 세포 독성 분석(MTT assay) 결과를 나타낸다.
도 11을 참조하면, 미셀 내에 포집되지 않은 에스트라머스틴과 비교해 포집된 에스트라머스틴으로 처리된 KB 세포주의 세포 생존력이 증가했음을 확인할 수 있다.
미셀에 포집되지 않은 0.3 μg/mL의 에스트라머스틴의 경우, 22Rv1 세포주에서는 25.58%의 세포 생존도를 나타낸 반면 KB 세포주는 78.50%의 세포 생존도를 나타내 KB 세포주에 대해 독성이 더 낮음을 주목할 필요가 있다.
그러나, 에스트라머스틴 인산염이 로딩된 미셀로 처리한 KB 세포주의 세포 생존도는 95.1%로 증가해 미셀에 의한 에스트라머스틴의 포집을 확인시켜 주었다.
반면, 에스트라머스틴 인산염이 로딩된 미셀로 처리한 22Rv1 세포주는 세포 생존도에 변화를 보이지 않았다.
결론적으로, 상기 결과는 sPLA-2 효소를 과발현하는 22Rv1 세포주가 미셀의 절단을 유도하고 세포에서 에스트라머스틴 인산염추가 방출을 유도함을 확인시켜 준다.

Claims (10)

  1. 약물 및 상기 약물이 로딩된(loaded) 담체를 포함하고,
    상기 담체는 인산염(phosphate) 계면활성제로 이루어진 미셀(micelle)인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 인산염(phosphate) 계면활성제는 지방산 에스테르(fatty acid ester)를 인산화(phosphorylation)한 후, 페그화(PEGylation)시켜 형성된 것을 특징으로 하는 약물전달체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 지방산 에스테르는 에틸렌 글리콜 스테아레이트(Ethylene glycol stearate)인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 인산염(phosphate) 계면활성제는 하기 화학식으로 표시되는 중합체인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
    [화학식]
    Figure pat00003
    .
  5. 제1항에 있어서,
    상기 약물은 암 치료제인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 암 치료제는 전립선암 치료제인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
  7. 제6항에 있어서,
    전립선 종양 세포에 대해 상기 전립선암 치료제를 담체로부터 선택적 방출(selective release)하는 것을 특징으로 하는 약물전달체.
  8. 제7항에 있어서,
    전립선 종양 세포에서 과발현된 분비형 포스포리파아제 A2(sPLA-2)에 의해 상기 인산염(phosphate) 계면활성제에 포함된 에스테르기(ester group)가 가수분해되어 상기 전립선암 치료제가 담체로부터 방출하는 것을 특징으로 하는 약물전달체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 약물전달체를 유효성분으로 포함하는 전립선암 치료용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    주사제, 액제, 산제, 현탁제, 과립제, 시럽제, 캡슐제, 환제 또는 정제 형태의 제형인 것을 특징으로 하는 전립선암 치료용 약학적 조성물.
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