KR20140015086A - 1,4-bdo 생성능이 개선된 변이 미생물 및 이를 이용한 1,4-bdo 의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
일 구체예는 자연상태에서 1,4-BDO를 생산하지 않는 균주인 Corynebacterium glutamicum을 1,4-BDO 생성을 위한 Corynebacterium glutamicum의 대사 네트워크 모델에 대한 것이다. 이러한 네트워크 모델을 기반으로 Corynebacterium glutamicum 의 대사 특성을 분석하였다. Cat1, sucD, 4hbD, cat2 및 adhE 유전자를 포함한 상태에서 결실 표적 효소 (ldhA, mqo 또는 mdh)의 효과를 예측하여 이를 제거함으로써 1,4-BDO의 생산효율화 및 동일 발효조건에서 증산됨을 확인하였다. 또한, 이렇게 제작된 형질전환 미생물은 고효율로 1,4-BDO을 생산할 수 있어, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있다.
Description
일 구체예는 1,4-BDO를 고효율로 생산할 수 있는 재조합 형질전환 미생물에 관한 것이다.
1,4-부탄디올(BDO)은 연간 약 30억 파운드(lb)의 세계 시장을 갖는 중합체 중간체 및 산업 용매이다. BDO는 현재 석유화학 전구체, 주로 아세틸렌, 말레산 무수물, 및 프로필렌 옥사이드로부터 생산된다.
상기 1,4-부탄디올은 다양한 화학물질은 고분자, 솔벤트, 정밀화학 중간물질 등으로 화학산업 전반에 걸쳐 중요하게 쓰이고 있다. 현재 대부분의 탄소수4개 화학물질은 1,4-부탄디올, 말레익 안하이드라이드 등으로부터 유래되어 합성되고 있지만, 유가가 올라감에 따라 생산비용이 증대되고 있어 화학 생산공정을 보완 및 대체하는 공정의 개발이 요구되고 있는 실정이다. 이에, 상기 화학생산공정의 대안으로 미생물을 이용한 생물학적 공정이 제시되고 있다.
그러나, 미생물은 원하는 대사 산물만을 생성하지 않으며, 특정 대사 산물을 과량 생산할 경우 오히려 성장이 억제되거나 더 이상 원하는 대사 산물을 생산하지 않거나, 원하지 않은 부산물을 생산할 수 있다. 이러한 한계를 극복하기 위하여 원하는 대사 산물만을 특이적으로 생산할 수 있는 미생물을 개발하기 위해 많은 연구가 진행되었다. 그러나, 형질전환 미생물의 많은 대사 경로를 모든 경우의 수에 맞추어 변형하여 형질전환 미생물을 제작하는 것은 많은 시간과 노력이 들어가게 된다.
이러한 문제점을 해소하기 위해, 1,4-부탄디올 (1,4-BDO) 생산을 위해 대사 특성 분석용 대사 네트워크 모델을 이용하였다. 또한, 상기 네트워크 모델을 통하여 얻은 결과를 바탕으로, 실제 미생물에서 결실시켜 배양을 통해 생산능 향상을 확인하였다.
이를 통하여 1,4-BDO를 효율적으로 생산할 수 있는 미생물을 형질전환 시킬 수 있는 있는 방법을 확인함으로 종래의 미생물 제작의 한계를 극복하였다.
일 구체예는 1,4-BDO 를 생산하지 않는 균주인 Corynebacterium glutamicum을 1,4-BDO 생성을 하도록 유전자 변형을 시킨, 1,4-BDO 를 생산하는 재조합 형질전환 Corynebacterium glutamicum을 제공한다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
일 양상은 미생물내의 반응 네트워크를 변형하여 최적의 대사 산물을 산출할 수 있는 대사 경로를 예측하고 획득하는 방법을 제공한다.
상기 대사 경로를 예측하는 방법은 구체적으로, 미생물내의 반응 네트워크에서 효소들이 관여하는 생화학적 반응에 관한 정보를 포함하는 데이터베이스에 기초하고, 미생물의 배양조건, 미생물이 생성하는 대사산물 및 미생물의 세포 조성정보 중 적어도 하나를 이용하여 미생물내의 대사 경로 및 생체량 합성 방정식을 획득하는 단계; 상기 미생물내에는 존재하지 않는 생화학 반응 경로를 도입하여, 1차 변형 대사 경로를 획득하는 단계; 1차 변형 대사경로에 관여하는 적어도 하나의 효소 반응을 변형하여, 2차 변형 대사 경로를 획득하는 단계; 2차 변형 대사 경로를 기반으로 하여 생성된 대사산물 및/또는 생체량 정보를 획득하는 단계; 획득된 대사 산물 및 생체량 정보를 기반으로 대사산물-생체량 관련식을 획득하는 단계; 2차 변형 대사 경로를 획득하는 단계 내지 대사산물-생체량 관련식을 획득하는 단계를 반복하여 최적의 대사산물-생체량 관련식을 획득하는 단계; 및 상기 최적의 대사산물-생체량 관련식의 기반이 되는 2차 변형 대사 경로를 획득하는 단계를 포함하는 최적의 대사산물을 산출할 수 있는 대사 경로 예측 방법을 제공한다.
상기 대사 경로 예측 방법은 다음과 같다.
먼저, 미생물내의 대사 네트워크에서 효소들이 관여하는 생화학적 반응에 관한 정보를 포함하는 데이터베이스에 기초하고, 미생물의 배양조건, 미생물이 생성하는 대사산물 및 미생물의 세포 조성정보 중 적어도 하나를 이용하여 미생물내의 대사 경로 및 생체량 합성방정식을 획득하는 단계를 제공한다.
상기 미생물은 자연계에 존재하는 모든 야생형 미생물, 형질전환된 미생물 등일 수 있다. 또한, 상기 미생물은 세균일 수 있으며, 대장균, 방선균 일 수 있다. 바람직하게는 Corynebacterium glutamicum일 수 있다.
용어, "대사 네트워크"는 세포내의 생리학적, 생화학적 특징을 결정하는 대사 과정 또는 물리학적 단계의 집합을 의미한다. 또한, 이러한 네트워크는 대사물의 화학적 반응 및 이러한 화학적 반응의 조절 관계 등을 포함한다. 예를 들면, 단백질-단백질 상호 작용, 효소의 작용 기작 등을 포함한다. 대사 네트워크는 화합물들의 네트워크인 동시에 효소의 네트워크 일 수 있다.
용어, "생화학적 반응에 관한 정보"는 특정 효소들이 촉매하는 반응 과정의 제반 정보를 의미한다. 이러한 정보는 효소 번호(enzyme code)로부터 수득할 수 있으며, 새롭게 발견한 효소는 실험을 통하여 획득한 정보일 수 있다.
용어, "배양 조건"은 미생물을 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 미생물이 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 미생물이 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류 등이 포함된다. 구체적으로 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈, 갈락토오즈 등이 이용될 수 있다. 미생물이 이용할 수 있는 질소원은 유기질소화합물, 무기질소화합물 등 일 수 있다. 구체적으로 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 암모늄염 등 일 수 있다. 미생물을 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 대기중에 0.1 ~ 10 %의 산소를 포함하는 저산소 조건, 또는 산소가 없는 혐기성 조건이 있다. 대사 경로는 미생물이 실제로 이용 가능한 탄소원 및 질소원에 맞추어 수정될 수 있다.
용어, "대사산물"은 미생물의 대사반응에 의해 생성되는 모든 물질들을 의미한다. 상기 대사산물은 미생물의 대사반응의 중간 생성물일 수도 있고, 미생물의 대사반응의 최종 생성물일 수도 있다. 이러한 대사 산물의 예로는 숙신산, 젖산, 1,4-BDO (3-hydroxypropionate) 등이 있을 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 대사 산물은 1,4-BDO 일 수 있다.
미생물의 대사특성 분석용 대사 네트워크 모델은 다음과 같이 구축한다. 우선 게놈 정보 및 각 유전자 주석(annotation)에 대한 정보를 수집하고, 다음으로, 게놈 서열 정보를 바탕으로 하여 Corynebacterium glutamicum 에 존재하는 효소 반응식들을 정리하고 이 효소 반응식을 촉매하는 효소 및 이를 코딩하는 유전자의 관계, 즉 GPR 관계를 정리한다.
용어, "GPR 관계"는 유전자-단백질-반응식 관계 (Gene-Protein-Reaction Relationship)이며, 유전자와 그 산물, 그리고 그 산물이 촉매하는 효소 반응식과의 관계를 말한다.
이때, 수집한 유전자 주석 정보를 직접 분석할 수 있다. 또한, 대사 경로 관련 정보를 분석 및 정리해 놓은 대사 관련 데이터베이스의 정보를 이용한 뒤, 수집된 정보는 보정 과정에서 사용되는 기준으로 삼을 수 있다.
상기에서 정리한 GPR 관계를 바탕으로 초벌 모델(draft model)을 구축한다. 일반적으로 대사 관련 데이터베이스에는 DNA 복제, 전사(transcription), 번역(translation) 및 세포를 구성하는 각종 요소(이를테면 세포막을 구성하는 인지질, 세포벽, 세포 내 모든 단백질의 아미노산 함량 및 세포 전체적인 고분자 조성)의 합성식, 그리고 세포 전체의 생체량 합성 방정식은 정리되어 있지 않다. 그러나 이 식들은 세포의 생장을 모사하기 위한 모델 구축에 필수적이라 할 수 있으며, 이러한 식들을 만들기 위해서는 세포를 구성하는 각 성분들의 조성 비율을 알아야 한다. 이는 참고 문헌을 통하여 얻거나 실제 발효를 통하여 얻은 시료를 분석함으로써 알아낼 수 있다.
이때, 발효 조건은 실제 보정 과정에서 사용되는 발효의 조건과 동일하게 하는 것이 바람직하다. 상기에서 구축한 초벌 모델을 검토하여 보정 작업을 수행한다. 대사 관련 데이터베이스는 생물정보학적 기법을 통하여 유전자 주석 정보를 컴퓨터 프로그램으로 분석하여 데이터베이스화한 것이다. 따라서, 이러한 데이터베이스는 불완전하거나 잘못된 대사 정보를 내포할 가능성이 매우 높다. 따라서 이 단계에서는 생물정보학적 기법을 통하여 얻어낸 정보 보다는 실제로 발효를 통하여 파악된 형질을 바탕으로, 효소 반응식에서 대사 산물 계수의 오류 또는 세포의 생명 유지 활동 및 생장에 사용되는 유지 에너지 등을 고려하여야 하며 그에 따라 효소 반응식은 보정될 수 있다.
상기 대사특성 분석용 대사 네트워크 모델은 문헌에 공개된 모델을 이용하였다(Yohei Shinfuku, Natee Sorpitiporn, Masahiro Sono, Chikara Furusawa, Takashi Hirasawa and Hiroshi Shimizu,Microbial Cell Factories 209, 8:43 "Development and experimental verification of a genomescale metabolic model for Corynebacterium glutamicum" 및 Kjeld R. Kjeldsen and Jens Nielsen, Biotechnology and Bioengineering, Vol 102, No 2, February 1, 2009 "In Silico Genome-Scale Reconstruction and Validation of the Corynebacterium glutamicum Metabolic Network").
보정된 대사 네트워크를 구성하고 있는 효소 반응식들에 대하여 세포 성장 반응식의 반응속도 또는 대사흐름값은 양이 되도록 초기 조건을 설정하고 상기 효소 반응식들을 한 개씩 또는 둘 이상의 조합을 구성하여 차단시키면서 선형계획법을 적용하였을 때, 차단하지 않았을 때에 비하여 1,4-BDO 생산능을 증가시키는 경우의 차단된 효소 반응식들을 결실 표적 효소 후보(I)로 선정한다.
구축된 대사 네트워크를 수학적으로 표현하기 위하여, 구축된 대사 네트워크 모델을 구성하고 있는 모든 대사산물, 상기 대사산물의 대사경로 및 상기 대사경로에서의 화학양론 매트릭스 S (stoichiometric matrix)(Sij, j 번째 반응에서 i 번째 대사산물의 시간에 따른 화학양론 계수)를 이용하여, 대사흐름 벡터(νj, j 번째 대사반응의 대사흐름)를 계산할 수 있다.
여기서, 시간에 따른 대사산물 농도 X의 변화는 모든 대사 반응의 흐름의 합으로 나타낼 수 있다. 시간에 따른 X의 농도 변화량이 없다고 가정하면, 즉 준정상 상태의 가정 하에서, 시간에 따른 대사산물 농도의 변화량은 아래의 수학식 1로 정의될 수 있다.
<수학식 1>
(여기서, Sν : 시간에 따른 X의 변화량, X: 대사산물의 농도, t: 시간, k: 상수)
상기 구성된 화학량론 행렬에서 최적화, 즉 최대화 또는 최소화 하고자 하는 반응식을 목적함수로 설정하고 선형계획법(Linear programming)을 이용하여 세포 내의 대사흐름을 예측한다(Kim et al., Mol Biosyst. 4(2):113, 2008). 일 구체예에서는 행렬 S에서 세포의 구성성분을 나타내는 효소 반응식을 목적함수로서 설정함으로써, 세포 생장 속도를 최적화하였다.
그리고, 상기 대사흐름분석을 위한 선형계획법을 적용함에 있어서는, 실제 이 균주의 발효에서 사용된 영양분만이 공급된다는 가정 하에 실행해야 한다. 일반적으로 사용하는 복합 배지(complex medium)은 그 각각의 구성 성분을 정량적으로 파악하는 것이 매우 어려우므로, 기존에 최적화된 합성 배지(synthetic medium)를 이용하는 것이 바람직하다.
용어, "생체량 합성 방정식"은 미생물의 총괄적인 대사반응을 나타낸 것이다. 구체적으로 생체 조성물인 단백질, 핵산, 지질등의 관계와 생체량등의 관계를 나타낸 것이다. 생체량 합성 방정식은 적용되는 미생물에 따라 상이할 수 있다. 또한, 세포 성장 반응식의 반응속도 또는 대사흐름값은 양이 되도록 초기 조건을 설정할 수 있다.
미생물이 Corynebacterium glutamicum일 경우 상기 반응식은 하기의 반응식 I 일 수 있다.
[반응식 Ⅰ]
0.56 PROTEIN + 0.107 RNA + 0.007 DNA + 0.052 PHOSPHOLIPID + 0.03 COF + 0.110 CW + 0.265 CARBOHYDRATE + 70.37 ATP -> BIOMASS + 70.37 ADP + 70.37 Pi
대사물질과 생체량간의 관계를 나타내는 트레이드 오프 커브를 작성하기 위한 방법은 선행기술에 의해 제안되어 있는 알고리즘을 변형하였다(Burgard et al., Biotechnol Bioeng 84, 647-57, 2003). 우선적으로 유용산물 형성속도를 최대화 하였을 때의 값과 최소화하였을 때의 값을 구하여 허용하는 유용산물 형성속도의 범위를 구한다. 다음으로 허용 범위 내에서 비증식속도를 최대화하여 두 목적함수간의 트레이드 오프 커브를 작성하는 방식을 사용하였다. 위 참고문헌의 경우 트레이드 오프 커브를 통하여 후보 유전자를 찾는 방법이 정확히 서술되지 않은 반면 본 명세서에서는 해당 유전자가 도입된 미생물의 유용물질 생산속도와 세포성장속도간의 관계를 살펴보아 유용물질 생산 속도가 줄어듦에도 바이오매스가 감소가 크지 않는 곡선을 가지는 후보 외부 유전자들의 조합을 선택함으로써 해당하는 균주의 유용물질 생산능력을 비교하였다.
또한, 상기 미생물내에는 존재하지 않는 생화학 반응 경로를 도입하여, 1차 변형 대사 경로를 획득하는 단계를 포함할 수 있다.
용어, "생화학 반응 경로"란 특정 효소에 의해 촉매되는 생화학 반응을 의미한다. 생화학 반응 경로는 하나 이상의 효소에 의해 촉매될 수 있으며, 전효소, 조효소, 보조인자 등이 함께 이용될 수 있다.
용어, "1차 변형 대사 경로"는 미생물 내의 대사 경로에 새로운 생화학 반응 경로가 도입되어 변형된 대사 경로를 의미한다. 구체적으로 미생물내에 존재하지 않는 효소를 하나 이상 도입한 것으로, 효소는 대사반응의 중간 생성물 또는 미생물의 대사반응의 최종 생성물을 이용할 수 있다.
상기 미생물내에는 존재하지 않는 생화학 반응 경로는 1,4-BDO 경로 일 수 있다. 1,4-BDO 경로의 도입은 4hbD(서열번호 1), cat2(서열번호 2) 및 adhE(서열번호 3) 효소를 도입하여 이루어질 수 있다.
또한, 1차 변형 대사경로에 관여하는 적어도 하나의 효소 반응을 변형하여, 2차 변형 대사 경로를 획득하는 단계를 포함할 수 있다.
용어, "2차 변형 대사 경로"는 1차 변형 대사 경로에 관여하는 적어도 하나의 효소 반응식을 변형한 것을 의미한다. 효소 반응식의 변형은 효소를 도입하여 효소의 반응을 강하게 하거나, 효소를 대사 경로에서 제거하는 것일 수 있다.
대사특성 분석을 위하여 수 개 내지 수십 개의 효소 반응식이 가감될 수 있다. 상기 미생물내의 대사 경로에 관여하는 효소는 ldhA(서열번호 4) 및 mqo(서열번호 5) 일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 구축된 대사 네트워크 모델에서 효소 반응식 차단 시뮬레이션은 상기 대사흐름 벡터(ν)에서 차단시키고자 하는 효소 반응식의 해당 대사흐름을 0(= νj)으로 고정시킨 상태에서 세포 생장 속도를 목적함수로 설정하고 이를 최대화하도록 선형계획법을 실행한다.
상기 Corynebacterium glutamicum 대사 네트워크를 구성하고 있는 효소 반응식들에 대하여 세포 성장 반응식의 대사속도 또는 대사흐름값을 0으로 고정하고 상기 효소 반응식들을 한 개씩 또는 여러 개의 조합을 구성하여 차단시키면서 용매 생성식의 흐름값을 최대화하는 선형계획법을 적용하였을 때, 차단하지 않았을 때에 비해 1,4-BDO 생산능을 증가시키는 경우의 차단된 효소 반응식들을 2차 결실 표적효소 후보(II)로 선정한다. 이는 용매 생성이 안정기에서 활발히 일어난다는 기존의 실험 결과들을 모델에 반영하기 위함이다.
상기 단계에서 얻은 결과들인 결실 표적 후보(I) 및 2차 결실 표적효소(II)을 비교하여 중복되는 결실 표적 효소 후보들을 최종 결실 표적 효소군으로 선정하거나, 이를 코딩하는 유전자를 결실 표적유전자로 선정한다. 이 단계는 대사흐름분석을 통하여 전체적인 산 생성기와 용매 생성기의 대사 흐름을 살펴봄으로써 1,4-BDO 생산에 가장 적합한 결실 표적 후보군을 통합하는 단계이다. 다만, 상기에서 (1) 단계만을 수행하여 결실 표적을 수득하는 것도 가능하다.
또한, 2차 변형 대사 경로를 기반으로 하여 생성된 대사산물 및/또는 생체량 정보를 획득하는 단계를 포함할 수 있다.
이때 대사 산물은 대사 중간물 또는 대사 최종물일 수 있다. 구체적으로는 숙신산, 젖산, 1,4-BDO 일 수 있다. 바람직하게는 상기 대사 산물은 1,4-BDO 일 수 있다.
또한, 획득된 대사 산물 및 생체량 정보를 기반으로 대사산물-생체량 관련식을 획득하는 단계를 포함할 수 있다.
용어, "대사산물-생체량 관련식"은 미생물이 생산하는 대사산물과 생체량의 관계를 나타내는 식이다. 또한, 이를 그래프로 표시한 것을 트레이드-오프 커브 그래프라고 한다.
상기 대사산물-생체량 관련식 및 트레이드-오프 커브 그래프를 통하여 생체량의 증감과 대사산물의 생산량의 관계를 알 수 있다. 특히, 형질전환 Corynebacterium glutamicum에서 1,4-BDO 의 산출량과-생체량의 그래프는 형질전환된 유전자의 종류에 따라 달라짐을 확인할 수 있었다(도 1 참조).
또한, 2차 변형 대사 경로를 획득하는 단계 내지 대사산물-생체량 관련식을 획득하는 단계를 반복하여 최적의 대사산물-생체량 관련식을 획득하는 단계를 포함할 수 있다.
미생물내의 대사 경로에 관여하는 다양한 효소의 활성을 변형하여 2차 변형 대사 경로를 획득하고, 그에 따른 최적의 대사산물-생체량 관련식을 획득하고 이를 이용하여 대사산물-생체량 관련식을 얻을 수 있다. 이때 "최적"이란 생체량이 일정량 유지 또는 증가하는 동시에 가장 많은 대사산물을 생성할 때를 의미한다.
또한, 상기 최적의 대사산물-생체량 관련식의 기반이 되는 2차 변형 대사 경로를 획득하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 최적의 대사산물-생체량 관련식을 얻을 수 있는 2차 변형 대사 경로를 획득하여, 대사산물을 가장 효율적으로 얻기 위한 반응식을 얻을 수 있다. 상기 대사 산물은 1,4-BDO 일 수 있다.
이와 같이 최적의 대사산물을 산출할 수 있는 대사 경로 예측하여, 미생물의 형질전환을 구상할 수 있다.
또 다른 양상은 최적의 대사산물을 산출할 것으로 예측되는 2차 변형 대사 경로를 포함하는 형질전환 미생물을 제공한다.
일 구체예는 Malate와 oxaloacetate 간의 전환 반응을 촉매하는 효소의 활성이 불활성화되거나 약화되어 1,4-BDO의 생산성이 향상된 미생물을 제공한다.
또한, 상기 미생물은 세균일 수 있으며, 대장균 또는 방선균 일 수 있다. 바람직하게는 상기 미생물은 Corynebacterium glutamicum 일 수 있다.
상기에서 Malate와 oxaloacetate 간의 전환 반응에 관여하는 효소는 malate를 oxaloacetate로 전환하는 반응을 촉매하는 효소와 oxaloacetate를 malate로 전환하는 반응을 촉매하는 효소가 있다. 이때, malate를 oxaloacetate로 전환하는 반응을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자인 mqo가 불활성화되거나 약화된 것일 수 있다. 또한, oxaloacetate를 malate로 전환하는 반응을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자인 mdh가 불활성화되거나 약화된 것일 수 있다. 또한, malate와 oxaloacetate 간의 전환 반응을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자인 mqo와 mdh가 동시에 불활성화되거나 약화된 것일 수 있다.
또한, pyruvate를 lactate로 전환하는 반응을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자인 ldhA가 추가적으로 불활성화되거나 약화된 것일 수 있다.
또한, 상기 미생물내의 1,4-BDO의 생성량을 Flux Balance Analysis 방법을 통해 single gene knock-out simulation을 수행하면, 저산소 배양시 1,4-BDO의 생산량을 증가시키는 반응 단계를 탐색할 수 있다. 이를 통해 C. glutamicum 에서는 TCA cycle 내에서 malate와 oxaloacetate의 전환 반응을 제거하거나 약화시키면 1,4-BDO의 생산량 증가가 예측되며, 해당 대사 경로에 관여하는 효소는 mqo 또는 mdh 일 수 있다.
상기 효소중 어느 하나만의 활성이 제거될 수 있으나, 모든 효소 모두의 활성이 제거되는 것이 바람직하다. 효소 활성의 변형방법은 상기 효소를 암호화하는 유전자의 결실, 삽입, 치환 등을 통하여 가능하다. 상기 결실 표적유전자의 결실은 상동성 재조합(homologous recombination)에 의해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 상동성 재조합은 결실된 표적유전자를 포함하는 유전자 교환벡터를 사용하여 수행할 수 있다.
또 다른 구체예는 상기 미생물에 cat1, sucD, 4hbD, 및 cat2을 추가적으로 도입한 미생물을 제공한다.
상기 유전자의 도입은 벡터에 의해 이루어 질 수 있다.
용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 벡터로는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터 등이 사용될 수 있다.
이러한 벡터를 이용해 상기 유전자는 플라스미드 상태로 상기 효소를 생산하거나, 숙주의 크로모좀상에 삽입되어 상기 효소를 생산할 수 있다. 또한, 상기 유전자는 작동가능한 프로모터와 연결될 수 있다.
구체적으로. 상술한 Malate와 oxaloacetate 간의 전환 반응에 관여하는 효소 및/또는 pyruvate를 lactate로 전환하는 반응을 촉매하는 효소의 활성이 불활성화되거나 악화된 미생물에 추가적으로 succinate를 succinyl-CoA로 전환을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자인 cat1, 및 succinyl-CoA를 succinic semialdehyde로 전환을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자인 sucD, 및 succinic semialdehyde를 4-hydroxybutyrate로 전환을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자인 4hbD, 및 4-hydroxybutyrate를 4-hydroxybutyl-CoA로 전환을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자인 cat2 및 4-hydroxybutyl-CoA를 4-hydroxybutylaldehyde로 전환을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자인 adhE 유전자를 추가적으로 포함할 수 있다.
특히 상기 cat1, sucD, 4hbD, cot2 및 adhE 유전자의 발현양이 증가된 미생물이 바람직하며, 이를 위하여는 각각의 유전자를 발현을 증가시키기 위해 강한 유전자 발현을 유발할 수 있는 프로모터를 이용할 수 있다.
이때, 상기 cat1 유전자는 서열번호 11, 상기 sucD 유전자는 서열번호 12이고, 상기 4hbD 유전자는 서열번호 13이고, 상기 cat2 유전자는 서열번호 7이고, 상기 adhE 유전자는 서열번호 8일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 형질전환 미생물을 이용한 1,4-BDO의 제조방법에 관한 것이다. 이는 상기 형질전환 미생물 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 1,4-BDO을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 미생물이 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류 등에서 배양될 수 있다. 구체적으로 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈, 갈락토오즈 또는 어느 하나 이상이 이용될 수 있다. 또한, 미생물이 이용할 수 있는 질소원은 유기질소화합물, 무기질소화합물 등 일 수 있다. 구체적으로 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 암모늄염 등 일 수 있다. 미생물을 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 대기중에 0.1 ~ 10 %의 산소를 포함하는 저산소 조건, 또는 산소가 없는 혐기성 조건일 수 있다. 또한, 상기 미생물을 호기성에서 배양 후 저산소 또는 혐기성 조건으로 전환하여 배양할 수 있다.
일 구체예에 사용된 Corynebacterium glutamicum 의 대사 네트워크 모델과 이를 이용해 얻은 1,4-BDO 생성 미생물의 대사 흐름 등 대사특성 분석 정보를 이용하여, 1,4-BDO의 생산을 증가시키기 위한 표적 효소 또는 그 유전자를 예측할 수 있었다. 이러한 스크리닝을 이용하여, 1,4-BDO를 고효율로 생산할 수 있는 형질전환 미생물을 효율적으로 얻을 수 있다.
도 1은 1,4-BDO 생산에 사용된 생합성 경로를 나타낸다. 붉은 색의 반응을 결실시킴으로써 대사 흐름(metabolite flux)이 1,4-BDO 생산 경로로 증가된다.
도 2는 게놈 스케일 대사 모델링을 통해 산소 이용율(oxygen uptake rate)과 1,4-BDO 생산량에 따라 변화하는 생체량(Biomass)의 contour plot을 나타낸다. 생체량 최대(Biomass maximization) 조건 하에서는 붉은색 커브를 따라서 1,4-BDO의 생산량이 예측된다.
도 3은 Corynebacterium glutamicum에서 adhE2 유전자를 제거한 후, mqo 유전자를 추가로 제거했을 때 1,4-BDO의 생산량 증가 효과를 나타낸다(단위 : g/L).
도 4는 Corynebacterium glutamicum에서 adhE2 유전자를 제거한 후, mqo 유전자를 추가로 제거했을 때 1,4-BDO의 생산수율 증가 효과를 나타낸다 (단위 : %).
도 2는 게놈 스케일 대사 모델링을 통해 산소 이용율(oxygen uptake rate)과 1,4-BDO 생산량에 따라 변화하는 생체량(Biomass)의 contour plot을 나타낸다. 생체량 최대(Biomass maximization) 조건 하에서는 붉은색 커브를 따라서 1,4-BDO의 생산량이 예측된다.
도 3은 Corynebacterium glutamicum에서 adhE2 유전자를 제거한 후, mqo 유전자를 추가로 제거했을 때 1,4-BDO의 생산량 증가 효과를 나타낸다(단위 : g/L).
도 4는 Corynebacterium glutamicum에서 adhE2 유전자를 제거한 후, mqo 유전자를 추가로 제거했을 때 1,4-BDO의 생산수율 증가 효과를 나타낸다 (단위 : %).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. 특히, 하기 실시예에서는 Corynebacterium glutamicum를 모델 시스템으로 이용한 방법에 대하여만 예시되어 있으나, Corynebacterium glutamicum 이외의 다른 미생물의 경우에도 적용된다는 것은 본 명세서에 개시된 내용으로부터 당업자에게 자명하다.
<실시예 1>
Corynebacterium glutamicum
의 게놈 수준 대사 네트워크 (genome scale metabolic network model)를 이용한 유전자 결실 균주의 대사흐름 예측
구축해 놓은 1,4-BDO 생산이 가능한 Corynebacterium glutamicum의 대사 네트워크의 효소 반응 정보를 모든 경우에 대해서 하나씩 다 결실시켜 봄으로써 얻어졌다. 상기의 대사특성 분석용 대사 네트워크 모델은 문헌에 공개된 Corynebacterium gluamicum 전용 모델을 이용하였다(Yohei Shinfuku, Natee Sorpitiporn, Masahiro Sono, Chikara Furusawa, Takashi Hirasawa and Hiroshi Shimizu,Microbial Cell Factories 209, 8:43, 2009 "Development and experimental verification of a genomescale metabolic model for Corynebacterium glutamicum" 및 Kjeld R. Kjeldsen and Jens Nielsen, Biotechnology and Bioengineering, Vol 102, No 2, February 1, 2009 "In Silico Genome-Scale Reconstruction and Validation of the Corynebacterium glutamicum Metabolic Network"). 상기 모델 내에 정의된 물질 대사 반응에 간여하는 관련 유전자들을 하나씩 결실시키고 그 효과로 원하는 target 물질인 1,4-BDO의 증산 효과를 추정하는 시뮬레이션을 실행하였다.
그 후, 결실시킨 각 효소 반응에 대한 1,4-BDO 생산능을 알 수 있고 결실된 각 효소반응에 작용하는 결실 표적 유전자를 예측할 수 있었다.
그리고 추가적으로 한 번에 두 개, 세 개의 효소 반응을 결실시키는 등 다중 효소반응을 결실시키는 시뮬레이션도 수행할 수 있다.
그리고, 결실 유전자 스크리닝을 위한 결실 대사흐름의 시뮬레이션 조건은,
첫째, 외부 도입된 1,4-BDO 생성 효소 반응은 기존에 구축된 1,4-BDO 생성을 위하여 Corynebacterium glutamicum 에 도입된 생합성 경로 (biosynthetic pathway)에 대해 수행하였고,
둘째, 산소 조건은 낮은 산소 농도 조건과 높은 산소 농도 조건 2가지에 대해 모두 수행하였다.
다음으로, 위의 조건들을 가지고 상기 설명한 결실 유전자 스크리닝 방법을 수행할 도구로는 기존의 선형계획법을 통하여 수행하였다. 이렇게 해서 얻어진 결실대상 유전자를 모델에서 결실시키고 oxygen uptake rate을 감소시켜 가면서 <도 2>와 같이 생체량의 분포를 얻어내었고, 여기서 낮은 산소농도가 최적 조건임을 확인하였다.
그리고 이 결과 데이터 값을 기반으로 1,4-BDO를 효과적으로 생산해낼 수 있는 결실 표적 효소 반응은 TCA (tri citric acid) cycle 내의 oxaloacetate와 malate 간의 반응으로 탐색되었고, 이때 유전자는 mqo(malate quinone oxidoreductase)로서 그 서열은 다음과 같다(서열번호 10).
<실시예 2> 1,4-BDO를 과량 생산할 것으로 예측된 균주의 제작 및 1,4-BDO 생산량 확인
<2-1> 재조합 형질전환 미생물 제작
해당 유전자는 homologous recombination 방법을 통해 ldhA 또는 mqo 유전자 Corynebacterium glutamicum 의 게놈에서 제거하고 이를 PCR을 통해 결실을 검증하였다.
또한, 4hbD 유전자로 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드, cot2 유전자로 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드, 및 adhE 유전자로 서열번호 8의 폴리뉴클레오티드를 도입하여 1,4-BDO 생산 재조합 형질전환 Corynebacterium glutamicum 균주를 제작하였고, 이를 기탁하였다(KCTC 기탁 번호(균주명):KCTC 12137BP)(균주 정보 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 /△ldh-4G-pADH1).
<2-1> 재조합 형질전환 미생물의 1,4-BDO 생산량 확인
유전자 조작이 완료 된 C. glutamicum 균주에 대해 호기와 혐기조건 전환을 이용한 2단계 발효를 이용하여 1-L 발효기에서 1,4-BDO 생산에 적용하였다. LPG2 배지를 기본배지로 사용하여 글루코오스를 탄소원으로 첨가하여 사용하였으며 초기 글루코오스 농도는 50 g/L로 조절하였다.
1단계 세포성장 단계를 위하여 발효조건을 pH 7.0와 30℃로 유지하였으며 호기조건 유지를 위하여 교반과 통기조건을 각각 700 rpm과 1.5 v.v.m으로 유지하였다. 호기조건 중 세포농도가 초기정체기에 접어드는 28시간 (O.D. 65~70)에 공기 공급을 끊고 교반을 200 rpm으로 감소시켜 혐기조건을 부여하였다. 혐기발효 중, 글루코오스의 고갈을 방지하기 위해 간헐적으로 80%의 글루코오스 용액을 첨가하여 잔존 글루코오스 농도를 5 - 30 g/L로 유지하였다. 배양액의 pH를 7로 유지하기 위해 20% (v/v) NH4OH를 첨가하였다. 발효는 혐기전환 후, 80시간까지 진행하였으며 발효액 내의 성분은 샘플링하여 HPLC 를 이용하여 분석하여 <도 3>, <도 4>와 같은 생산성의 향상을 확인하였다.
<110> samsung advanced institute technology
<120> Mutant microorganism having improved production ability of
<130> PN096621
<160> 13
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 371
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4hbD
<400> 1
Met Gln Leu Phe Lys Leu Lys Ser Val Thr His His Phe Asp Thr Phe
1 5 10 15
Ala Glu Phe Ala Lys Glu Phe Cys Leu Gly Glu Arg Asp Leu Val Ile
20 25 30
Thr Asn Glu Phe Ile Tyr Glu Pro Tyr Met Lys Ala Cys Gln Leu Pro
35 40 45
Cys His Phe Val Met Gln Glu Lys Tyr Gly Gln Gly Glu Pro Ser Asp
50 55 60
Glu Met Met Asn Asn Ile Leu Ala Asp Ile Arg Asn Ile Gln Phe Asp
65 70 75 80
Arg Val Ile Gly Ile Gly Gly Gly Thr Val Ile Asp Ile Ser Lys Leu
85 90 95
Phe Val Leu Lys Gly Leu Asn Asp Val Leu Asp Ala Phe Asp Arg Lys
100 105 110
Ile Pro Leu Ile Lys Glu Lys Glu Leu Ile Ile Val Pro Thr Thr Cys
115 120 125
Gly Thr Gly Ser Glu Val Thr Asn Ile Ser Ile Ala Glu Ile Lys Ser
130 135 140
Arg His Thr Lys Met Gly Leu Ala Asp Asp Ala Ile Val Ala Asp His
145 150 155 160
Ala Ile Ile Ile Pro Glu Leu Leu Lys Ser Leu Pro Phe His Phe Tyr
165 170 175
Ala Cys Ser Ala Ile Asp Ala Leu Ile His Ala Ile Glu Ser Tyr Val
180 185 190
Ser Pro Lys Ala Ser Pro Tyr Ser Arg Leu Phe Ser Glu Ala Ala Trp
195 200 205
Asp Ile Ile Leu Glu Val Phe Lys Lys Ile Ala Glu His Gly Pro Glu
210 215 220
Tyr Arg Phe Glu Lys Leu Gly Glu Met Ile Met Ala Ser Asn Tyr Ala
225 230 235 240
Gly Ile Ala Phe Gly Asn Ala Gly Val Gly Ala Val His Ala Leu Ser
245 250 255
Tyr Pro Leu Gly Gly Asn Tyr His Val Pro His Gly Glu Ala Asn Tyr
260 265 270
Gln Phe Phe Thr Glu Val Phe Lys Val Tyr Gln Lys Lys Asn Pro Phe
275 280 285
Gly Tyr Ile Val Glu Leu Asn Trp Lys Leu Ser Lys Ile Leu Asn Cys
290 295 300
Gln Pro Glu Tyr Val Tyr Pro Lys Leu Asp Glu Leu Leu Gly Cys Leu
305 310 315 320
Leu Thr Lys Lys Pro Leu His Glu Tyr Gly Met Lys Asp Glu Glu Val
325 330 335
Arg Gly Phe Ala Glu Ser Val Leu Lys Thr Gln Gln Arg Leu Leu Ala
340 345 350
Asn Asn Tyr Val Glu Leu Thr Val Asp Glu Ile Glu Gly Ile Tyr Arg
355 360 365
Arg Leu Tyr
370
<210> 2
<211> 431
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cat2
<400> 2
Met Lys Asp Val Leu Ala Glu Tyr Ala Ser Arg Ile Val Ser Ala Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys His Ile Lys Asn Gly Glu Arg Val Ala Leu Ser His
20 25 30
Ala Ala Gly Val Pro Gln Ser Cys Val Asp Ala Leu Val Gln Gln Ala
35 40 45
Asp Leu Phe Gln Asn Val Glu Ile Tyr His Met Leu Cys Leu Gly Glu
50 55 60
Gly Lys Tyr Met Ala Pro Glu Met Ala Pro His Phe Arg His Ile Thr
65 70 75 80
Asn Phe Val Gly Gly Asn Ser Arg Lys Ala Val Glu Glu Asn Arg Ala
85 90 95
Asp Phe Ile Pro Val Phe Phe Tyr Glu Val Pro Ser Met Ile Arg Lys
100 105 110
Asp Ile Leu His Ile Asp Val Ala Ile Val Gln Leu Ser Met Pro Asp
115 120 125
Glu Asn Gly Tyr Cys Ser Phe Gly Val Ser Cys Asp Tyr Ser Lys Pro
130 135 140
Ala Ala Glu Ser Ala His Leu Val Ile Gly Glu Ile Asn Arg Gln Met
145 150 155 160
Pro Tyr Val His Gly Asp Asn Leu Ile His Ile Ser Lys Leu Asp Tyr
165 170 175
Ile Val Met Ala Asp Tyr Pro Ile Tyr Ser Leu Ala Lys Pro Lys Ile
180 185 190
Gly Glu Val Glu Glu Ala Ile Gly Arg Asn Cys Ala Glu Leu Ile Glu
195 200 205
Asp Gly Ala Thr Leu Gln Leu Gly Ile Gly Ala Ile Pro Asp Ala Ala
210 215 220
Leu Leu Phe Leu Lys Asp Lys Lys Asp Leu Gly Ile His Thr Glu Met
225 230 235 240
Phe Ser Asp Gly Val Val Glu Leu Val Arg Ser Gly Val Ile Thr Gly
245 250 255
Lys Lys Lys Thr Leu His Pro Gly Lys Met Val Ala Thr Phe Leu Met
260 265 270
Gly Ser Glu Asp Val Tyr His Phe Ile Asp Lys Asn Pro Asp Val Glu
275 280 285
Leu Tyr Pro Val Asp Tyr Val Asn Asp Pro Arg Val Ile Ala Gln Asn
290 295 300
Asp Asn Met Val Ser Ile Asn Ser Cys Ile Glu Ile Asp Leu Met Gly
305 310 315 320
Gln Val Val Ser Glu Cys Ile Gly Ser Lys Gln Phe Ser Gly Thr Gly
325 330 335
Gly Gln Val Asp Tyr Val Arg Gly Ala Ala Trp Ser Lys Asn Gly Lys
340 345 350
Ser Ile Met Ala Ile Pro Ser Thr Ala Lys Asn Gly Thr Ala Ser Arg
355 360 365
Ile Val Pro Ile Ile Ala Glu Gly Ala Ala Val Thr Thr Leu Arg Asn
370 375 380
Glu Val Asp Tyr Val Val Thr Glu Tyr Gly Ile Ala Gln Leu Lys Gly
385 390 395 400
Lys Ser Leu Arg Gln Arg Ala Glu Ala Leu Ile Ala Ile Ala His Pro
405 410 415
Asp Phe Arg Glu Glu Leu Thr Lys His Leu Arg Lys Arg Phe Gly
420 425 430
<210> 3
<211> 858
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> adhE2
<400> 3
Met Lys Val Thr Asn Gln Lys Glu Leu Lys Gln Lys Leu Asn Glu Leu
1 5 10 15
Arg Glu Ala Gln Lys Lys Phe Ala Thr Tyr Thr Gln Glu Gln Val Asp
20 25 30
Lys Ile Phe Lys Gln Cys Ala Ile Ala Ala Ala Lys Glu Arg Ile Asn
35 40 45
Leu Ala Lys Leu Ala Val Glu Glu Thr Gly Ile Gly Leu Val Glu Asp
50 55 60
Lys Ile Ile Lys Asn His Phe Ala Ala Glu Tyr Ile Tyr Asn Lys Tyr
65 70 75 80
Lys Asn Glu Lys Thr Cys Gly Ile Ile Asp His Asp Asp Ser Leu Gly
85 90 95
Ile Thr Lys Val Ala Glu Pro Ile Gly Ile Val Ala Ala Ile Val Pro
100 105 110
Thr Thr Asn Pro Thr Ser Thr Ala Ile Phe Lys Ser Leu Ile Ser Leu
115 120 125
Lys Thr Arg Asn Ala Ile Phe Phe Ser Pro His Pro Arg Ala Lys Lys
130 135 140
Ser Thr Ile Ala Ala Ala Lys Leu Ile Leu Asp Ala Ala Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Ala Pro Lys Asn Ile Ile Gly Trp Ile Asp Glu Pro Ser Ile Glu
165 170 175
Leu Ser Gln Asp Leu Met Ser Glu Ala Asp Ile Ile Leu Ala Thr Gly
180 185 190
Gly Pro Ser Met Val Lys Ala Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Pro Ala Ile
195 200 205
Gly Val Gly Ala Gly Asn Thr Pro Ala Ile Ile Asp Glu Ser Ala Asp
210 215 220
Ile Asp Met Ala Val Ser Ser Ile Ile Leu Ser Lys Thr Tyr Asp Asn
225 230 235 240
Gly Val Ile Cys Ala Ser Glu Gln Ser Ile Leu Val Met Asn Ser Ile
245 250 255
Tyr Glu Lys Val Lys Glu Glu Phe Val Lys Arg Gly Ser Tyr Ile Leu
260 265 270
Asn Gln Asn Glu Ile Ala Lys Ile Lys Glu Thr Met Phe Lys Asn Gly
275 280 285
Ala Ile Asn Ala Asp Ile Val Gly Lys Ser Ala Tyr Ile Ile Ala Lys
290 295 300
Met Ala Gly Ile Glu Val Pro Gln Thr Thr Lys Ile Leu Ile Gly Glu
305 310 315 320
Val Gln Ser Val Glu Lys Ser Glu Leu Phe Ser His Glu Lys Leu Ser
325 330 335
Pro Val Leu Ala Met Tyr Lys Val Lys Asp Phe Asp Glu Ala Leu Lys
340 345 350
Lys Ala Gln Arg Leu Ile Glu Leu Gly Gly Ser Gly His Thr Ser Ser
355 360 365
Leu Tyr Ile Asp Ser Gln Asn Asn Lys Asp Lys Val Lys Glu Phe Gly
370 375 380
Leu Ala Met Lys Thr Ser Arg Thr Phe Ile Asn Met Pro Ser Ser Gln
385 390 395 400
Gly Ala Ser Gly Asp Leu Tyr Asn Phe Ala Ile Ala Pro Ser Phe Thr
405 410 415
Leu Gly Cys Gly Thr Trp Gly Gly Asn Ser Val Ser Gln Asn Val Glu
420 425 430
Pro Lys His Leu Leu Asn Ile Lys Ser Val Ala Glu Arg Arg Glu Asn
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Phe Ile Val Thr Asp Lys Asp Leu Phe Lys Leu Gly Tyr Val Asn Lys
485 490 495
Ile Thr Lys Val Leu Asp Glu Ile Asp Ile Lys Tyr Ser Ile Phe Thr
500 505 510
Asp Ile Lys Ser Asp Pro Thr Ile Asp Ser Val Lys Lys Gly Ala Lys
515 520 525
Glu Met Leu Asn Phe Glu Pro Asp Thr Ile Ile Ser Ile Gly Gly Gly
530 535 540
Ser Pro Met Asp Ala Ala Lys Val Met His Leu Leu Tyr Glu Tyr Pro
545 550 555 560
Glu Ala Glu Ile Glu Asn Leu Ala Ile Asn Phe Met Asp Ile Arg Lys
565 570 575
Arg Ile Cys Asn Phe Pro Lys Leu Gly Thr Lys Ala Ile Ser Val Ala
580 585 590
Ile Pro Thr Thr Ala Gly Thr Gly Ser Glu Ala Thr Pro Phe Ala Val
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Ile Thr Asn Asp Glu Thr Gly Met Lys Tyr Pro Leu Thr Ser Tyr Glu
610 615 620
Leu Thr Pro Asn Met Ala Ile Ile Asp Thr Glu Leu Met Leu Asn Met
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Pro Arg Lys Leu Thr Ala Ala Thr Gly Ile Asp Ala Leu Val His Ala
645 650 655
Ile Glu Ala Tyr Val Ser Val Met Ala Thr Asp Tyr Thr Asp Glu Leu
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Ala Leu Arg Ala Ile Lys Met Ile Phe Lys Tyr Leu Pro Arg Ala Tyr
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Lys Asn Gly Thr Asn Asp Ile Glu Ala Arg Glu Lys Met Ala His Ala
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Ser Asn Ile Ala Gly Met Ala Phe Ala Asn Ala Phe Leu Gly Val Cys
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His Ser Met Ala His Lys Leu Gly Ala Met His His Val Pro His Gly
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Ile Ala Cys Ala Val Leu Ile Glu Glu Val Ile Lys Tyr Asn Ala Thr
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Thr Ser Asp Thr Glu Lys Val Thr Ala Leu Ile Glu Ala Ile Ser Lys
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Leu Lys Ile Asp Leu Ser Ile Pro Gln Asn Ile Ser Ala Ala Gly Ile
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> adhE2
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tttcctaagc ttggtacaaa agctatctct gttgcgatcc ctaccaccgc aggaaccggc 1800
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ttcaagtacc ttccacgcgc atacaagaat ggcacaaacg atattgaagc ccgagaaaag 2100
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aaccttaagg ggaccagcga cacggaaaag gtgaccgcac tgattgaagc catctccaag 2400
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<223> NCgl2810_ldhA
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tacgcatacg cactgatcaa ccagggcatg gcagatcacc ttgcgatcat cgacatcgat 120
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> NCgl1926_mqo
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atggccaaca cttgcattcg ggtgctggcg atcatttatg agatgacgcc ttgtgttggt 60
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ggcgcagatc aggttgcata catcaaggct cgctacgaag ctttgaagga tcacccactc 540
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gtcaagaacg tacacactgg cgacaccaag accatcaagg caaacttcgt gttcgtcggc 840
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cccgagttca taaaggacat aaattttttt cgcgagaaga tagtactgcg cccccaggaa 1140
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<223> sucD_nt
<400> 12
atggagatta aagagatggt cagtcttgcg cgcaaagctc agaaggagta tcaggccacc 60
cataaccaag aagctgtgga caacatctgc cgagcagcag cgaaggttat ttacgaaaat 120
gcagcaattc tggcacgcga ggcagtggac gaaaccggca tgggtgttta cgagcacaag 180
gtggccaaga atcaaggcaa gtccaaaggt gtttggtaca acctgcataa caagaagtcg 240
attggcatcc tcaatatcga cgagcgtacc ggcatgatcg agatcgcaaa acctatcggg 300
gttgtaggcg ccgttacgcc aaccaccaac cctatcgtta ctccgatgag caacatcatc 360
tttgctctta agacctgcaa cgccatcatt atcgccccac acccgcgctc caaaaagtgc 420
tctgcccacg cagttcggct gatcaaagag gctatcgctc cgttcaacgt gcccgaaggt 480
atggttcaga tcatcgagga gcctagcatc gagaagacgc aggaattgat gggcgccgta 540
gacgtggtcg ttgctaccgg gggcatgggc atggtcaagt ctgcctactc ctcagggaag 600
ccttctttcg gtgtcggagc cggcaatgtt caggtgatag tggacagcaa catcgacttc 660
gaagcggcag cagaaaagat catcaccgga cgtgccttcg acaacggtat catctgctca 720
ggcgaacagt ccatcatcta caacgaggct gacaaggaag cagttttcac agcattccgc 780
aaccacggtg cgtacttttg cgacgaggcc gagggagatc gggctcgtgc agcgatcttc 840
gaaaatggag ccatcgcgaa agatgttgtg ggccagtccg ttgcctttat tgcaaagaag 900
gcgaacatta atatccccga gggtactcgt attctcgtgg tcgaagctcg cggagtaggc 960
gccgaagatg tcatctgtaa agaaaagatg tgtccagtca tgtgcgccct ctcctacaag 1020
cacttcgaag agggggtaga gatcgcaagg acgaacctcg caaacgaagg caatggccat 1080
acctgtgcta tccactccaa caaccaagca cacatcatct tggcaggctc ggagctgacc 1140
gtgtctcgca tcgtggtcaa cgcgccaagt gctaccacag caggcggtca catccagaac 1200
ggtcttgccg tcaccaatac tctaggctgc ggctcttggg gtaacaactc gatctccgaa 1260
aacttcactt ataaacacct gctcaacatt tcacgcatcg ccccgttgaa ctccagcatt 1320
catatcccag atgataagga aatctgggaa ctctag 1356
<210> 13
<211> 987
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mdh _nt
<400> 13
atgaattccc cgcagaacgt ctccaccaag aaggtcaccg tcaccggcgc agctggtcaa 60
atctcttatt cactgttgtg gcgcatcgcc aacggtgaag tattcggcac cgacacccct 120
gtagaactga aacttctgga gatccctcag gctcttggcg gggcagaggg tgtggctatg 180
gaacttctgg attctgcctt ccccctcctg cgaaacatca ccatcaccgc ggatgccaat 240
gaggcattcg acggcgctaa tgcggcgttt ttggtcggtg cgaagcctcg cggaaaaggc 300
gaagagcgcg cagatttgct ggctaacaac ggcaagattt tcggacctca aggtaaagct 360
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aacgcgttga ttgcttcagc tgcggcccca gatgttccag catcccgctt caacgcaatg 480
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gagatttccg atttccagcg cgcccgcatc gacgcgaatg ctcaggaatt gcaggccgag 960
cgcgaggcag tgcgcgactt gctctaa 987
Claims (13)
- Malate와 oxaloacetate 간의 전환 반응을 촉매하는 효소의 활성이 불활성화되거나 약화되어 1,4-BDO의 생산성이 향상된 재조합 형질전환 Corynebacterium glutamicum.
- 청구항 1에 있어서, malate를 oxaloacetate로 전환하는 반응을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자인 mqo가 불활성화되거나 약화된 것인 재조합 형질전환 Corynebacterium glutamicum.
- 청구항 1에 있어서, oxaloacetate를 malate로 전환하는 반응을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자인 mdh가 불활성화되거나 약화된 것인 재조합 형질전환 Corynebacterium glutamicum.
- 청구항 1에 있어서, malate와 oxaloacetate 간의 전환 반응을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자인 mqo와 mdh가 동시에 불활성화되거나 약화된 것인 재조합 형질전환 Corynebacterium glutamicum.
- 청구항 1에 있어서, pyruvate를 lactate로 전환하는 반응을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자인 ldhA가 불활성화되거나 약화된 것인 재조합 형질전환 Corynebacterium glutamicum.
- 청구항 1에 있어서, succinate를 succinyl-CoA로 전환을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자인 cat1, succinyl-CoA를 succinic semialdehyde로 전환을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자인 sucD, succinic semialdehyde를 4-hydroxybutyrate로 전환을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자인 4hbD, 4-hydroxybutyrate를 4-hydroxybutyl-CoA로 전환을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자인 cat2 및 4-hydroxybutyl-CoA를 4-hydroxybutylaldehyde로 전환을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자인 adhE 유전자를 암호화하는 핵산을 포함한 1,4-BDO 를 생산하는 재조합 형질전환 Corynebacterium glutamicum.
- 청구항 6에 있어서, 상기 cat1, sucD, 4hbD, cot2 및 adhE 유전자의 발현양이 증가된 것인 재조합 형질전환 Corynebacterium glutamicum.
- 청구항 5에 있어서, 상기 cat1 유전자는 서열번호 11, 상기 sucD 유전자는 서열번호 12이고, 상기 4hbD 유전자는 서열번호 13이고, 상기 cat2 유전자는 서열번호 7이고, 상기 adhE 유전자는 서열번호 8인 것인 재조합 형질전환 Corynebacterium glutamicum.
- 청구항 1에 있어서, 상기 재조합 형질전환 Corynebacterium glutamicum는 기탁번호 KCTC 12137BP 인 것인 재조합 형질전환 Corynebacterium glutamicum.
- 청구항 1 내지 청구항 5의 형질전환 미생물을 배양하는 단계; 및
상기 배양액으로부터 특정 대사산물을 회수하는 단계를 포함하는 1,4-BDO 를 생산하는 방법. - 청구항 10에 있어서, 상기 미생물을 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈 및 갈락토오즈 에서 선택되는 어느 하나 이상을 탄소원으로 이용하여 배양하는 것인 방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 미생물을 호기성 조건, 저산소 조건 또는 혐기성 조건 산소 조건에서 배양하는 것인 방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 미생물을 호기성에서 배양 후 저산소 또는 혐기성 조건으로 전환하여 배양하는 방법.
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