KR20160092557A

KR20160092557A - 10-케토스테아린 산의 생산능이 우수한 코리네박테리움 글루타미컴 균주 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20160092557A
Application number: KR1020150012671A
Authority: KR
Inventors: 이진원; 이병훈; 이새봄; 김현수
Original assignee: 서강대학교산학협력단
Priority date: 2015-01-27
Filing date: 2015-01-27
Publication date: 2016-08-05
Also published as: KR101743105B1

Abstract

본 발명은 (a) 하이드라테이즈(hydratase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; (b) 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는 (c) 하이드라테이즈(hydratase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환된 10-케토스테아린 산(10-ketostearic acid) 생산용 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주에 관한 것이다. 야생종 코리네박테리움 글루타미컴 균주가 10-케토스테아린 산의 생산이 전혀 이루어지지 않는데 반해, 유전자 조작을 통해 재조합된 본 발명의 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주는 우수한 10-케토스테아린 산 생성능을 가지며, 10-케토스테아린 산을 탄소원으로 사용하지 않아 지속적으로 10-케토스테아린 산을 생산할 수 있다.

Description

10-케토스테아린 산의 생산능이 우수한 코리네박테리움 글루타미컴 균주 및 이의 제조방법{Corynebacterium glutamicum Strains Having Excellent Production Potential of 10-ketostearic acid and Method for Preparing Thereof}

본 발명은 10-케토스테아린 산(10-ketostearic acid) 생산용 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주, 이의 제조방법 및 상기 균주를 이용한 10-케토스테아린 산 생합성 방법에 관한 것이다.

코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)은 그람-양성 토양박테리아로서, 비병원성이며 빠른 균 생장과 주변 환경 적응에 강한 성질로 인해 현재 산업용 균주로 많이 사용되고 있다. 특히 현재 글루타메이트와 라이신 등의 아미노산 생산용 균주로써 산업현장에서 널리 사용 되고 있는 균주이다(도 1).

한편, 미생물을 이용하여 10-하이드록시스테아린 산(10-hydroxystearic acid; 10-HSA) 및 10-케토스테아린 산(10-ketostearic acid; 10-KSA)의 생산 연구가 많이 진행되어왔지만, 산업용 균주인 코리네박테리움 글루타미컴으로 생산하는 연구는 아직 진행되지 않았으며, 일반적인 10-HSA 및 10-KSA 생산 경로는 도 2와 같다.

현재 재생 가능한 지방산을 이용한 생물 전환반응에 관한 연구에 가장 널리 알려진 균주는 대장균(Escherichia coli)이다. 하지만, 대장균 같은 경우는 10-KSA를 탄소원으로 사용하기 때문에 10-KSA를 지속적으로 생산하기란 쉽지 않다.

그리하여, 본 발명자들은 10-KSA를 탄소원으로 사용하지 않고, 지속적으로 생산 가능하도록, 적응력이 강한 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)을 이용하여 10-KSA를 생산하고자 하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

대한민국 공개특허공보 제10-2014-0015086호

본 발명자들은 우수한 10-케토스테아린 산(10-ketostearic acid) 생산능을 가지며, 유전자 조작을 통해 10-케토스테아린 산 생합성 대사산물을 안정적이고, 효과적으로 생산하는 균주의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였고, 그 결과 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) 유래 OhyA 유전자 및 마이크로코쿠스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 ADH 유전자군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자를 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주를 형질전환 시킨 결과, 효과적으로 10-케토스테아린 산 생합성 경로가 과발현되고, 10-케토스테아린 산을 탄소원으로 사용하지 않아 지속적으로 10-케토스테아린 산을 생산 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 10-케토스테아린 산(10-ketostearic acid) 생산용 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 본 발명의 10-케토스테아린 산 생산용 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 본 발명의 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주를 이용하여 10-케토스테아린 산 생합성 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 하이드라테이즈(hydratase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; (b) 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는 (c) 하이드라테이즈(hydratase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환된 10-케토스테아린 산(10-ketostearic acid) 생산용 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주를 제공한다.

본 발명자들은 우수한 10-케토스테아린 산(10-ketostearic acid) 생산능을 가지며, 유전자 조작을 통해 10-케토스테아린 산 생합성 대사산물을 안정적이고, 효과적으로 생산하는 균주의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였고, 그 결과 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) 유래 OhyA 유전자 및 마이크로코쿠스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 ADH 유전자군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자를 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주를 형질전환 시킨 결과, 효과적으로 10-케토스테아린 산 생합성 경로가 과발현되고, 10-케토스테아린 산을 탄소원으로 사용하지 않아 지속적으로 10-케토스테아린 산을 생산 가능함을 확인하였다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 코리네박테리움 글루타미컴 균주는 하이드라테이즈(hydratase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 각각 포함하는 2개의 발현벡터로 공동형질전환된다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 코리네박테리움 글루타미컴 균주는 하이드라테이즈(hydratase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 모두 포함하는 1개의 발현벡터로 공동형질전환된다.

본 명세서에서,“하이드라테이즈(hydratase)”는 올레산(oleic acid)으로부터 10-하이드록시스테아린 산(10-hydroxystearic acid)을 생산하는 효소로서, OhyA 유전자가 이를 코딩하는 유전자이다.

본 발명의 발현벡터에서 발현되는 상기 하이드라테이즈는 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia)로부터 유래한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 서열목록 제1서열로 표시되는 하이드라테이즈를 발현하도록 할 수 있으며, 상기 하이드라테이즈를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 서열목록 제2서열로 표시될 수 있다.

본 명세서에서,“알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase)”는 10-하이드록시스테아린 산(10-hydroxystearic acid)으로부터 10-케토스테아린 산(10-ketostearic acid)을 생산 하는 효소로서, ADH 유전자가 이를 코딩하는 유전자이다.

본 발명의 발현벡터에서 발현되는 상기 알코올 디하이드로게네이즈는 마이크로코쿠스 루테우스(Micrococcus luteus)로부터 유래한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 서열목록 제3서열로 표시되는 알코올 디하이드로게네이즈를 발현하도록 할 수 있으며, 상기 알코올 디하이드로게네이즈를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 서열목록 제4서열로 표시될 수 있다.

본 발명에서 이용되는 뉴클레오티드 서열은 상기 언급된 서열 이외에 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

상기 유전자들은 발현벡터 내부에 도입되어 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)에서 발현되게 된다. 본 명세서에 있어서, 용어 “발현벡터”는 발현벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택마커, 폴리아데닐화 신호 등을 또한 포함한다. 발현벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 상기 유전자를 인코딩하는 핵산 분자는 원핵세포에서 작동하는 프로모터에 작동적으로 연결(operatively linked)된다. 본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pL^λ프로모터, pR^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pET28a, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC18K, pEKEx2 및 pCES-L10 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나, 바람직하게는 10-케토스테아린 산 생합성에 이용될 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)을 위한 특정 유전자를 미생물 생체 내로 운반하여 외부로부터 삽입된 유전자의 발현을 효과적으로 조절할 수 있도록 상기 발현벡터는 도 3의 유전자 지도를 갖는 pCES-L10이고, 상기 뉴클레오티드 서열은 pCES-L10의 MCS(multiple cloning site)에 삽입된다.

한편, 본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 발현 벡터는 프로모터서열, 발현 대상 유전자(구조 유전자)의 뉴클레오티드 서열 및 터미네이터 서열을 포함하며, 상기 서열들이 5'-3' 순서대로 연결되는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 OhyA 및/또는 ADH 의 유전자 서열이 5'-3' 순서대로 연결되어 제공되었다.

본 발명의 발현벡터에는 상기 유전자들이 효소의 과발현 기능을 포함하여 최소한의 길이를 가지도록 RBS(ribosomal bindingsite) 및 효소발현에 꼭 필요한 부분을 포함하는 염기서열만을 서열로 정하여 삽입시키는 것이 숙주세포의 대사부담(metabolic burden)을 줄이는 측면에서 바람직하다.

상기 유전자가 포함된 발현벡터는 이후 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 내부로 도입되는데, 본 발명의 벡터를 대장균 내로 운반하는 방법은 CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있으나, 형질전환체의 안정적 제조와 효율을 높이기 위해서는 전기 충격에 의한 형질전환 방법을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 10-케토스테아린 산(10-ketostearic acid) 생산용 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주의 제조방법을 제공한다: (a) (ⅰ) 하이드라테이즈(hydratase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; (ⅱ) 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는 (ⅲ) 하이드라테이즈(hydratase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터에 삽입시키는 단계; 및 (b) 상기 뉴클레오티드 서열이 삽입된 발현벡터로 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 형질전환시키는 단계.

본 발명의 10-케토스테아린 산 생산용 형질전환 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주의 제조방법은 상술한 본 발명의 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 제조하는 것이므로 상술한 내용과 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 발현시키는 단계 (b)는 전기충격 방법으로 수행된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 10-케토스테아린 산(10-ketostearic acid) 생합성 방법을 제공한다: (a) 상술한 본 발명의 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 배양하여 10-케토스테아린 산을 생합성하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 생합성된 10-케토스테아린 산을 수득하는 단계.

상기 형질전환 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주 내에서 생합성된 10-케토스테아린 산을 분리하는 단계는 당업계에 공지된 통상의 분리 또는 정제 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: B. Aurousseau et al., Journal of the American Oil Chemists' Society, 57(3):1558-9331( 1980); Frank C. Magne et al., Journal of the American Oil Chemists' Society, 34(3):127-129(1957)).

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 (a) 하이드라테이즈(hydratase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; (b) 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는 (c) 하이드라테이즈(hydratase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환된 10-케토스테아린 산(10-ketostearic acid) 생산용 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주를 제공한다.

(ⅱ) 야생종 코리네박테리움 글루타미컴 균주가 10-케토스테아린 산의 생산이 전혀 이루어지지 않는데 반해, 유전자 조작을 통해 재조합된 본 발명의 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주는 우수한 10-케토스테아린 산 생성능을 가지며, 10-케토스테아린 산을 탄소원으로 사용하지 않아 지속적으로 10-케토스테아린 산을 생산할 수 있다.

(ⅲ) 또한, 본 발명의 코리네박테리움 글루타미컴 균주는 10-케토스테아린 산 대사경로에 필수적인 유전자를 과발현 시키는 과정을 통해 10-케토스테아린 산의 생산량이 증가하였다.

도 1은 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)을 보여주는 사진이다.
도 2는 10-케토스테아린 산(10-ketostearic acid)의 생산경로를 보여준다.
도 3은 발현벡터인 pCES-L10을 보여주는 도식화이다.
도 4는 야생종 코리네박테리움 글루타미컴 ACTC13032 및 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 균주인 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13032-pCESL10::OhyA::ADH 의 GC/MS 분석 결과를 보여준다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 균주인 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13032-pCESL10::OhyA::ADH 의 GC/MS 분석 결과를 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)의 경우, 지방산으로부터 10-케토스테아린 산(10-ketostearic acid; 10-KSA)을 생산하는데 필요한 효소들인 하이드라테이즈(hydratase)를 코딩하는 OhyA 유전자와 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 ADH 유전자를 가지고 있지 않다.

따라서, 코리네박테리움 글루타미컴이 가지고 있지 않은 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) 유래 OhyA 및 마이크로코쿠스 루테우스(Micrococcus luteus) NCTC2665 유래 ADH 유전자를 발현 벡터(expression vector)인 pCES-L10를 이용하여 삽입하여 재조합 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주 (Corynebacterium glutamicum ATCC13032::pCES-L10::OhyA::ADH)를 제작하였다.

실시예 1: 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 이용한 OhyA 및 ADH 유전자 증폭

유전자	생산 효소
OhyA	Hydratase
ADH	Alcohol dehydrogenase

상기 표 1의 OhyA 유전자를 증폭하기 위한 프라이머는 Foward - GGATCCATGTACTACAGCAGTGGCAATTACG Tm=61.61(31mer)(서열목록 제5서열) 및 Reverse CATATGTCAGTCCTCCTGCACCAG Tm=58.35(24mer)(서열목록 제6서열)를 이용하였고, 제한효소는 BamHI 및 NdeI을 이용하였다.

상기 표 1의 ADH 유전자를 증폭하기 위한 프라이머는 Foward - GGAATCAAAGTTAAATGTCCGAGTTCACCCGTTTC Tm=65.33(35mer)(서열목록 제7서열) 및 Reverse - AATTTTGAAGTTAATCAGCCGAGCGGGGTGTC Tm=65.37(32mer)(서열목록 제8서열)를 이용하였으며, 제한효소는 HpaI을 이용하였다.

상기 프라이머(primer)를 사용하여 증폭한 결과, OhyA는 1770 bp, ADH는 933 bp의 크기로 증폭되었다. 각각의 중합효소 연쇄 반응은 통상적인 반응조건(10 mM Tris-HCl(pH 9.0), 50 mM KCI, 0.1% Triton X-100, 2 mM MgSO₄, Taq DNA 중합효소(DaKaRa)) 아래에서 ADH 유전자 경우는 95℃/5분(denaturation), 65℃/1분(annealing), 72℃/1분(extension)로 1회 수행한 후, 95℃/20초(denaturation), 65℃/30초(annealing), 72℃/1분 20초(extension)로 27회 반복 수행하였다. 마지막 단계로 안정적인 신장(extension)을 위해 95℃/1분(denaturation), 65℃/1분(annealing), 72℃/10분(extension) 반응하였고, OhyA 유전자 경우는 5℃/5분(denaturation), 60℃/1분(annealing), 72℃/1분(extension)로 1회 수행한 후, 95℃/20초(denaturation), 60℃/30초(annealing), 72℃/1분 20초(extension)로 27회 반복 수행하였다. 마지막 단계로 안정적인 신장(extension)을 위해 95℃/1분(denaturation), 60℃/1분(annealing), 72℃/10분(extension) 반응하였다.

실시예 2: 재조합 플라스미드의 제조

상기 실시예 1의 중합효소 연쇄 반응 후 증폭된 DNA는 0.8% 아가로즈 젤 상에서 확인 후 정제하여 발현 벡터(expression vector)인 pCES-L10(도 3)의 다중삽입부위(multicloning site) 클로닝에 이용하였다. 조합 플라스미드인 pCESL10::OhyA::ADH를 위의 제한효소들과 37℃ 항온수조(water bath)에서 약 1시간 30분 반응하였다. 각각의 DNA 절편들을 절단한 뒤 발현 벡터(expression vector)인 pCES-L10(도 3)의 다중삽입부위(multicloning site)에 T4 라이게이즈(Dakara) 및 SLIC(sequence and ligation independent cloning) 클로닝을 기법을 이용하여 재조합 플라스미드를 완성하였다. 각 단계마다 삽입된 유전자의 삽입여부를 확인하기 위해 대장균(E. coli DH5a competent cell, RBS)에 형질 전환 시킨 후 재조합 플라스미드를 추출하여 이를 다시 원래 삽입부위의 제한효소로 처리하여 잘린 DNA 조작의 크기를 0.8% 아가로즈 젤 상에서 전기영동하여 비교하는 방법을 사용하였다.

실시예 3 : 이종 코리네박테리움 글루타미컴 형질전환체 제조

통상적으로 클로닝용으로 많이 쓰이는 균주의 경우 CaCl₂ 버퍼를 사용한 컴피턴트 세포를 만든 후 열 충격(42℃) 방법에 의해 플라스미드를 숙주세포내로 넣지만, 본 발명에서는 형질전환체의 안정적 제조와 효율을 높이기 위해 전기천공법 (electroporation)에 의한 형질전환방법을 사용하였다. 상기 전기 충격에 의한 형질전환방법을 위해 16시간동안 전 배양 된 500 uL(0.1 %)의 야생종 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum ATCC13032) 배양액을 41.5 mL의 BHI(5 g/L beef heart, 12.5 g/L calf brains, 2.5 g/L disodium hydrogen phosphate, 2 g/L D(+)-glucose, 10 g/L peptone, 5 g/L sodium chloride)에 100 mg/mL의 이소니코틴산(isonicotinic acid) 2 mL, 200 mg/mL의 글라이신 6.25 mL, 20%(v/v) 트윈 80 0.25 mL를 첨가한 배지에 접종하여 배양액의 흡광도(absorbance)가 600 nm 파장에서 0.6에 이르렀을 때, 배양액 전체에 해당하는 50 mL의 배양액을 원심 분리(12000 rpm, 10분)하여 상등액과 세포를 분리하였다. 모아진 세포는 10% 글리세롤 50 mL로 3회 세척해준 후, 다시 원심분리(12000 rpm, 1분)하여 상등액과 세포로 나누어 주었다. 세포는 10% 글리세롤 0.25 mL로 현탁하였다. 현탁 된 세포 50 uL에 재조합 플라스미드 1.5 uL를 첨가시켜주었다. 상기 플라스미드가 들어있는 분주된 51.5 uL의 액체는 전기천공법(electroporation)용 큐벳(BIO-RAD, Gene pulser cuvette)에 담아 BIO-RAD, Gene pulser Xcell로 전기 충격(2500v, 25uF, 200Ω)을 가하였다. 미리 준비해둔 1 mL BHI(5 g/L beef heart, 12.5 g/L calf brains, 2.5 g/L disodium hydrogen phosphate, 2 g/L D(+)-glucose, 10 g/L peptone, 5 g/L sodium chloride)를 첨가한 뒤 1시간 동안 200 rpm, 30℃에서 진탕 배양하였다. 배양된 형질전환체는 카나마이신(50 ug/mL)이 첨가된 BHI 아가(5 g/L beef heart, 12.5 g/L calf brains, 2.5 g/L disodium hydrogen phosphate, 2 g/L D(+)-glucose, 10 g/L peptone, 5 g/L sodium chloride, agar 20 g/L)에서 단일 균체가 생성될 때까지 30℃에서 배양하였다. 이를 통해 재조합 플라스미드를 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum ATCC13032) 균주에 형질 전환한 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13032::OhyA::ADH 재조합 균주를 개발하였다.

실험예 1: 전세포 생물전환(Whole cell bioconversion)

① C. glutamicum ACTC13032::pCES-L10::OhyA::ADH 균주가 올레산(oleic acid)으로부터 10-KSA의 생산 가능성을 확인하기 위해 플라스크 배양 및 생물전환 반응을 진행하였다. 100 ml 플라스크 배양 및 25 ml 생물전환 조건 그리고, 배지 조성은 다음 표 2와 같으며, 플라스크 배양(flask fermentation) 실험은 500 ml 삼각 플라스크를 이용해 100 ml 부피로 진행하였고, 생물전환 실험은 250 ml 배플(baffle) 삼각 플라스크를 이용해 25 ml 부피로 진행하였다.

12시간의 배양하여 정체 성장기(stationary growth phase)까지 세포를 키운 후에 Tris-HCl(pH 7.5) 버퍼로 풀어준 후에 기질인 올레산(oleic acid) 2.5 g/l 넣어서 생물 전환 반응을 진행하였다. 실험 결과, 도 4에서 알 수 있듯이, 최대 전환수율 78.4%, 최대 생산성 2.0 g/l/h의 10-케토스테아린 산이 생산되었다. 또한, 1시간 이후에 10-케토스테아린 산이 감소하지 않고 그대로 유지되는 점에 있어서 C. glutamicum ACTC13032 ::pCES-L10::OhyA::ADH가 10-케토스테아린 산을 생산하는 균주로서 산업적 가능성이 있다고 판단된다. 한편, 대조군인 야생형의 경우 10-케토스테아린 산 생산이 전혀 이루어지지 않았다.

② 최종적으로 산업적으로 쓰이기 위해서는 올레산(oleic acid) 보다 경제력 있는 올리브오일을 기질로 하여 C. glutamicum ACTC13032 ::pCES-L10::OhyA::ADH 균주로 생물 전환 반응을 진행하였다. 올리브 오일은 올리브나무 열매에 들어있는 30-70%의 기름을 추출해 만들어지며 주성분은 불포화지방산인 올레산(oleic acid)으로, 전체 함량은 65-85% 정도다.

배지배양 조성 및 생물 전환 조건은 위와 동일하며, 기질만 올리브 오일을 라파아제(lipase) 처리만 하여 생물 전환 반응을 진행하였다. 실험 결과, 도 5에서 볼 수 있듯이, 6시간에 1.3 g/l 10-KSA가 생산되었으며, 최대 전환 수율 65%, 최대 생산성 0.7 g/l/h로써, 이 균주가 10-KSA 생산을 위한 균주로서 산업적 가능성이 있음을 다시 확인 할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Sogang University <120> Corynebacterium glutamicum Strains Having Excellent Production Potential of 10-ketostearic acid and Method for Preparing Thereof <130> PN150013 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1770 <212> PRT <213> Hydratase from Stenotrophomonas maltophilia <400> 1 Ala Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Gly 1 5 10 15 Gly Cys Ala Ala Thr Thr Ala Cys Gly Ala Ala Gly Cys Cys Thr Thr 20 25 30 Cys Gly Cys Gly Cys Gly Cys Cys Cys Gly Cys Gly Cys Ala Ala Gly 35 40 45 Cys Cys Cys Gly Cys Cys Gly Gly Thr Gly Thr Gly Gly Ala Thr Gly 50 55 60 Gly Cys Ala Ala Gly Cys Gly Thr Gly Cys Ala Thr Gly Gly Thr Thr 65 70 75 80 Cys Gly Thr Cys Gly Gly Thr Thr Cys Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly 85 90 95 Gly Cys Cys Thr Cys Gly Thr Thr Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Gly 100 105 110 Cys Cys Gly Cys Gly Thr Thr Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Cys Gly 115 120 125 Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Cys Ala Cys Ala Thr Gly Gly Cys Cys 130 135 140 Gly Gly Thr Gly Ala Gly Thr Gly Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala 145 150 155 160 Thr Cys Cys Thr Thr Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala 165 170 175 Gly Ala Thr Thr Cys Cys Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Cys Gly 180 185 190 Cys Thr Gly Gly Ala Cys Gly Gly Cys Cys Thr Gly Ala Ala Ala Gly 195 200 205 Thr Gly Cys Cys Gly Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Thr Thr Thr 210 215 220 Cys Gly Thr Gly Ala Thr Cys Cys Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Cys 225 230 235 240 Cys Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Gly Gly Ala Ala Gly Ala Thr Cys 245 250 255 Ala Thr Thr Thr Cys Gly Ala Gly Thr Gly Cys Cys Thr Gly Thr Gly 260 265 270 Gly Gly Ala Cys Cys Thr Gly Thr Thr Cys Cys Gly Cys Thr Cys Gly 275 280 285 Ala Thr Ala Cys Cys Gly Thr Cys Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Ala 290 295 300 Thr Cys Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Cys Cys Ala Gly Cys Gly Thr 305 310 315 320 Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Gly Ala Gly Thr Thr Cys Thr Ala Cys 325 330 335 Thr Gly Gly Thr Thr Gly Ala Ala Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Gly 340 345 350 Ala Cys Cys Cys Gly Ala Ala Cys Thr Ala Thr Thr Cys Gly Cys Thr 355 360 365 Gly Cys Ala Gly Cys Gly Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys 370 375 380 Ala Ala Thr Cys Gly Cys Gly Gly Cys Gly Ala Gly Gly Ala Thr Gly 385 390 395 400 Cys Ala Cys Ala Cys Ala Cys Cys Gly Ala Thr Gly Gly Cys Cys Thr 405 410 415 Gly Thr Thr Cys Ala Cys Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Gly Ala Gly 420 425 430 Cys Ala Gly Gly Cys Ala Cys Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Cys Ala 435 440 445 Thr Cys Gly Thr Cys Gly Cys Gly Cys Thr Gly Thr Thr Cys Cys Thr 450 455 460 Gly Gly Cys Cys Ala Cys Cys Cys Gly Thr Cys Ala Gly Gly Ala Gly 465 470 475 480 Ala Thr Gly Gly Ala Gly Ala Ala Cys Ala Ala Gly Cys Gly Cys Ala 485 490 495 Thr Cys Ala Ala Cys Gly Ala Ala Gly Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly 500 505 510 Cys Cys Gly Thr Gly Ala Thr Thr Thr Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys 515 520 525 Ala Gly Cys Ala Ala Cys Thr Thr Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Thr 530 535 540 Ala Cys Thr Gly Gly Cys Gly Ala Ala Cys Cys Ala Thr Gly Thr Thr 545 550 555 560 Cys Gly Cys Gly Thr Thr Cys Gly Ala Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly 565 570 575 Cys Ala Thr Thr Cys Gly Gly Cys Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Ala 580 585 590 Thr Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Thr Ala Cys Cys Thr Gly Cys Ala 595 600 605 Thr Cys Gly Cys Thr Thr Cys Ala Thr Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr 610 615 620 Ala Thr Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys Thr Gly Cys Cys Gly Gly 625 630 635 640 Ala Thr Thr Thr Cys Thr Cys Gly Gly Cys Gly Cys Thr Gly Ala Ala 645 650 655 Gly Thr Thr Cys Ala Cys Gly Ala Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala Cys 660 665 670 Cys Ala Gly Thr Ala Cys Gly Ala Ala Thr Cys Gly Cys Thr Gly Gly 675 680 685 Thr Gly Cys Thr Gly Cys Cys Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala 690 695 700 Gly Thr Gly Gly Thr Thr Gly Cys Ala Gly Gly Ala Cys Cys Ala Gly 705 710 715 720 Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Thr Gly Thr Thr Cys Cys Ala Gly Thr 725 730 735 Ala Cys Gly Gly Thr Ala Cys Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly Ala Cys 740 745 750 Cys Gly Ala Cys Gly Thr Cys Gly Ala Cys Thr Thr Thr Gly Ala Thr 755 760 765 Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Gly Gly Ala Cys Cys Gly Cys Ala 770 775 780 Ala Gly Cys Ala Gly Gly Cys Cys Ala Cys Gly Cys Gly Cys Ala Thr 785 790 795 800 Cys Cys Ala Thr Thr Gly Gly Ala Thr Gly Cys Ala Thr Gly Ala Cys 805 810 815 Gly Gly Thr Gly Thr Ala Gly Cys Cys Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly 820 825 830 Thr Gly Gly Ala Ala Cys Thr Cys Gly Gly Cys Gly Cys Gly Gly Ala 835 840 845 Thr Gly Ala Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Thr Thr Cys Ala Thr Gly 850 855 860 Ala Cys Cys Ala Thr Cys Gly Gly Thr Thr Cys Gly Cys Thr Gly Ala 865 870 875 880 Cys Cys Gly Ala Gly Ala Ala Cys Thr Cys Gly Gly Ala Thr Ala Ala 885 890 895 Thr Gly Gly Cys Gly Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Ala Cys Thr 900 905 910 Gly Cys Gly Gly Cys Ala Cys Gly Cys Cys Thr Gly Ala Ala Cys Gly 915 920 925 Ala Ala Gly Gly Cys Cys Cys Gly Gly Cys Gly Cys Cys Thr Gly Cys 930 935 940 Cys Thr Gly Gly Gly Ala Cys Cys Thr Gly Thr Gly Gly Cys Gly Cys 945 950 955 960 Cys Gly Cys Ala Thr Thr Gly Cys Cys Gly Cys Gly Ala Ala Gly Gly 965 970 975 Ala Thr Gly Ala Cys Gly Cys Gly Thr Thr Cys Gly Gly Gly Cys Gly 980 985 990 Thr Cys Cys Gly Gly Ala Thr Gly Thr Gly Thr Thr Cys Gly Gly Cys 995 1000 1005 Gly Cys Gly Cys Ala Cys Ala Thr Thr Cys Cys Ala Gly Ala Ala Ala 1010 1015 1020 Cys Cys Ala Ala Gly Thr Gly Gly Gly Ala Ala Thr Cys Gly Gly Cys 1025 1030 1035 1040 Ala Ala Cys Gly Gly Thr Gly Ala Cys Cys Ala Cys Gly Cys Thr Gly 1045 1050 1055 Gly Ala Thr Gly Cys Gly Cys Gly Cys Ala Thr Thr Cys Cys Gly Gly 1060 1065 1070 Cys Cys Thr Ala Cys Ala Thr Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Thr 1075 1080 1085 Cys Gly Cys Cys Ala Ala Gly Cys Gly Cys Gly Ala Thr Cys Cys Cys 1090 1095 1100 Thr Thr Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly 1105 1110 1115 1120 Thr Gly Ala Cys Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala Thr Cys Gly Thr 1125 1130 1135 Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Cys Gly Cys Gly Ala Cys Thr Cys Gly 1140 1145 1150 Cys Gly Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gly Cys Thr 1155 1160 1165 Gly Gly Ala Cys Gly Gly Thr Gly Ala Ala Thr Cys Gly Cys Cys Ala 1170 1175 1180 Gly Cys Cys Ala Cys Ala Thr Thr Thr Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys 1185 1190 1195 1200 Cys Ala Gly Cys Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Cys Ala Gly Ala 1205 1210 1215 Thr Cys Gly Thr Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Thr Gly Thr Ala 1220 1225 1230 Thr Thr Cys Gly Thr Thr Gly Thr Thr Cys Gly Thr Gly Gly Ala Thr 1235 1240 1245 Ala Cys Gly Cys Cys Cys Gly Gly Cys Gly Ala Cys Thr Ala Cys Gly 1250 1255 1260 Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Gly Ala Thr Gly Cys Ala 1265 1270 1275 1280 Gly Gly Ala Cys Thr Gly Cys Ala Cys Cys Gly Gly Cys Gly Ala Gly 1285 1290 1295 Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Cys Gly Cys Gly Cys Gly Ala Ala Thr 1300 1305 1310 Gly Gly Cys Thr Gly Thr Ala Thr Cys Ala Cys Cys Thr Gly Gly Gly 1315 1320 1325 Cys Gly Thr Gly Cys Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly 1330 1335 1340 Ala Thr Cys Gly Ala Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys Gly 1345 1350 1355 1360 Cys Gly Ala Cys Cys Gly Gly Cys Gly Cys Gly Ala Ala Gly Ala Cys 1365 1370 1375 Ala Gly Thr Gly Cys Cys Gly Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly 1380 1385 1390 Cys Cys Gly Thr Ala Cys Ala Thr Cys Ala Cys Gly Gly Cys Gly Thr 1395 1400 1405 Thr Cys Thr Thr Cys Ala Thr Gly Cys Cys Ala Cys Gly Cys Cys Ala 1410 1415 1420 Gly Gly Cys Ala Gly Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly Cys Cys Cys Gly 1425 1430 1435 1440 Gly Ala Cys Gly Thr Gly Gly Thr Gly Cys Cys Gly Gly Ala Ala Gly 1445 1450 1455 Gly Thr Gly Cys Gly Gly Thr Gly Ala Ala Cys Thr Thr Cys Gly Cys 1460 1465 1470 Thr Thr Thr Cys Ala Thr Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly Thr Thr Cys 1475 1480 1485 Gly Cys Cys Gly Ala Ala Thr Cys Gly Ala Ala Gly Cys Ala Gly Cys 1490 1495 1500 Gly Cys Gly Ala Cys Thr Gly Cys Ala Thr Cys Thr Thr Cys Ala Cys 1505 1510 1515 1520 Cys Ala Cys Cys Gly Ala Gly Thr Ala Cys Thr Cys Gly Gly Thr Gly 1525 1530 1535 Cys Gly Cys Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Thr Gly Gly Ala Gly Gly 1540 1545 1550 Cys Gly Gly Thr Gly Thr Ala Cys Ala Cys Cys Thr Thr Gly Cys Thr 1555 1560 1565 Gly Gly Gly Gly Ala Thr Cys Gly Ala Gly Cys Gly Thr Gly Gly Cys 1570 1575 1580 Gly Thr Gly Cys Cys Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Thr Thr Cys Ala 1585 1590 1595 1600 Ala Thr Thr Cys Cys Ala Cys Gly Thr Ala Thr Gly Ala Cys Gly Thr 1605 1610 1615 Gly Cys Gly Cys Thr Cys Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys 1620 1625 1630 Gly Cys Gly Ala Cys Cys Gly Gly Gly Cys Gly Cys Cys Thr Gly Cys 1635 1640 1645 Gly Thr Gly Ala Thr Gly Gly Cys Ala Ala Gly Gly Ala Ala Cys Thr 1650 1655 1660 Gly Gly Ala Cys Ala Thr Thr Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys Cys Ala 1665 1670 1675 1680 Gly Cys Gly Thr Thr Cys Cys Thr Gly Cys Gly Cys Ala Ala Cys Cys 1685 1690 1695 Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala Ala Gly Cys Thr 1700 1705 1710 Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala Thr Cys 1715 1720 1725 Gly Gly Thr Gly Gly Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Gly Cys Gly 1730 1735 1740 Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Cys Ala 1745 1750 1755 1760 Gly Gly Ala Gly Gly Ala Cys Thr Gly Ala 1765 1770 <210> 2 <211> 1770 <212> DNA <213> OhyA sequence coding Hydratase from Stenotrophomonas maltophilia <400> 2 atgtactaca gcagtggcaa ttacgaagcc ttcgcgcgcc cgcgcaagcc cgccggtgtg 60 gatggcaagc gtgcatggtt cgtcggttcg ggcctggcct cgttggccgg tgccgcgttc 120 ctggtgcgcg acggccacat ggccggtgag tgcatcacca tccttgagca gcagcagatt 180 ccgggcggcg cgctggacgg cctgaaagtg ccggaaaagg gtttcgtgat ccgtggtggc 240 cgcgagatgg aagatcattt cgagtgcctg tgggacctgt tccgctcgat accgtcgctg 300 gagatcgaag atgccagcgt gctggacgag ttctactggt tgaacaagga cgacccgaac 360 tattcgctgc agcgcgccac catcaatcgc ggcgaggatg cacacaccga tggcctgttc 420 acgctgaccg agcaggcaca gagggacatc gtcgcgctgt tcctggccac ccgtcaggag 480 atggagaaca agcgcatcaa cgaagtactg ggccgtgatt tcctggacag caacttctgg 540 ctgtactggc gaaccatgtt cgcgttcgaa gagtggcatt cggcgctgga gatgaagctg 600 tacctgcatc gcttcatcca ccatatcggc ggcctgccgg atttctcggc gctgaagttc 660 acgaagtaca accagtacga atcgctggtg ctgccgctgg tgaagtggtt gcaggaccag 720 ggcgtggtgt tccagtacgg taccgaggtg accgacgtcg actttgatct gcagccggac 780 cgcaagcagg ccacgcgcat ccattggatg catgacggtg tagccggtgg cgtggaactc 840 ggcgcggatg atctgctgtt catgaccatc ggttcgctga ccgagaactc ggataatggc 900 gaccaccaca ctgcggcacg cctgaacgaa ggcccggcgc ctgcctggga cctgtggcgc 960 cgcattgccg cgaaggatga cgcgttcggg cgtccggatg tgttcggcgc gcacattcca 1020 gaaaccaagt gggaatcggc aacggtgacc acgctggatg cgcgcattcc ggcctacatc 1080 cagaagatcg ccaagcgcga tcccttcagc ggcaaagtgg tgaccggcgg catcgtcagc 1140 gtgcgcgact cgcgctggct gatgagctgg acggtgaatc gccagccaca tttcaagaac 1200 cagcccaagg accagatcgt ggtctgggtg tattcgttgt tcgtggatac gcccggcgac 1260 tacgtgaaga agccgatgca ggactgcacc ggcgaggaga tcacgcgcga atggctgtat 1320 cacctgggcg tgccggtgga agagatcgat gagctggccg cgaccggcgc gaagacagtg 1380 ccggtgatga tgccgtacat cacggcgttc ttcatgccac gccaggcagg tgaccgcccg 1440 gacgtggtgc cggaaggtgc ggtgaacttc gctttcatcg gccagttcgc cgaatcgaag 1500 cagcgcgact gcatcttcac caccgagtac tcggtgcgca cgccgatgga ggcggtgtac 1560 accttgctgg ggatcgagcg tggcgtgccg gaggtgttca attccacgta tgacgtgcgc 1620 tcgctgctgg ccgcgaccgg gcgcctgcgt gatggcaagg aactggacat tcccgggcca 1680 gcgttcctgc gcaacctgct gatgaacaag ctggacaaga cccagatcgg tggtctgctg 1740 cgcgagttca agctggtgca ggaggactga 1770 <210> 3 <211> 933 <212> PRT <213> Alcohol dehydrogenase from Micrococcus luteus NCTC2665 <400> 3 Ala Thr Gly Thr Cys Cys Gly Ala Gly Thr Thr Cys Ala Cys Cys Cys 1 5 10 15 Gly Thr Thr Thr Cys Gly Ala Gly Cys Ala Gly Gly Thr Cys Gly Cys 20 25 30 Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly Gly Cys 35 40 45 Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Gly Thr Thr Cys Gly Cys Ala Gly Ala 50 55 60 Thr Cys Ala Thr Cys Ala Thr Gly Cys Ala Gly Gly Cys Gly Gly Cys 65 70 75 80 Gly Thr Ala Cys Cys Ala Cys Gly Gly Cys Ala Ala Gly Ala Ala Gly 85 90 95 Gly Thr Gly Ala Thr Gly Gly Cys Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Gly 100 105 110 Cys Cys Gly Thr Cys Cys Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Cys Thr 115 120 125 Cys Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Thr Cys Gly Ala Gly Cys Gly Cys 130 135 140 Cys Gly Cys Thr Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Thr Cys Cys 145 150 155 160 Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Cys Thr Ala Cys Gly Ala Ala Gly Cys 165 170 175 Ala Gly Ala Cys Cys Thr Cys Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Cys 180 185 190 Thr Ala Cys Gly Ala Cys Cys Cys Gly Cys Ala Gly Cys Gly Cys Thr 195 200 205 Thr Cys Gly Ala Cys Gly Ala Gly Gly Cys Cys Ala Thr Cys Gly Cys 210 215 220 Cys Cys Gly Cys Ala Thr Cys Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Cys 225 230 235 240 Thr Cys Cys Gly Ala Cys Cys Thr Cys Gly Gly Cys Gly Ala Gly Gly 245 250 255 Cys Cys Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Ala Thr Gly Cys Gly Gly Ala 260 265 270 Cys Ala Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Cys Gly Ala Gly Gly Cys Cys 275 280 285 Gly Thr Cys Cys Cys Gly Gly Ala Gly Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly 290 295 300 Ala Gly Cys Thr Cys Ala Ala Gly Cys Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr 305 310 315 320 Gly Thr Gly Gly Gly Cys Cys Cys Ala Gly Gly Thr Gly Gly Gly Cys 325 330 335 Gly Ala Gly Cys Thr Cys Gly Cys Cys Cys Cys Cys Gly Cys Cys Ala 340 345 350 Cys Gly Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Thr Cys Gly Cys Cys Ala Cys 355 360 365 Gly Ala Ala Cys Ala Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly 370 375 380 Cys Thr Gly Cys Cys Cys Thr Cys Gly Gly Ala Cys Thr Thr Cys Gly 385 390 395 400 Cys Cys Gly Ala Cys Gly Cys Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Ala 405 410 415 Thr Cys Cys Gly Gly Ala Gly Cys Gly Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly 420 425 430 Gly Cys Cys Cys Thr Gly Cys Ala Cys Thr Ala Cys Gly Cys Cys Ala 435 440 445 Ala Cys Cys Gly Cys Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Cys Gly Cys Ala 450 455 460 Gly Ala Ala Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Thr Cys 465 470 475 480 Ala Thr Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Ala 485 490 495 Cys Cys Thr Cys Gly Cys Cys Gly Gly Ala Gly Gly Cys Cys Gly Thr 500 505 510 Cys Gly Cys Gly Gly Gly Ala Gly Cys Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly 515 520 525 Thr Thr Cys Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Cys Cys Gly 530 535 540 Gly Cys Ala Thr Gly Gly Thr Cys Cys Cys Cys Gly Thr Gly Cys Ala 545 550 555 560 Cys Gly Thr Gly Cys Gly Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Thr Cys 565 570 575 Cys Cys Gly Gly Gly Cys Thr Ala Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Ala 580 585 590 Ala Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Thr Cys Ala Thr Cys Cys Cys 595 600 605 Gly Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Cys Cys Gly Gly Cys 610 615 620 Thr Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Thr Ala Cys Ala Thr Gly Cys 625 630 635 640 Ala Cys Gly Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Cys Ala Ala Cys Cys Cys 645 650 655 Gly Gly Cys Gly Gly Ala Cys Ala Thr Cys Gly Ala Cys Cys Gly Cys 660 665 670 Ala Cys Cys Thr Gly Gly Cys Gly Cys Gly Thr Gly Gly Cys Cys Ala 675 680 685 Cys Cys Gly Gly Cys Ala Ala Cys Gly Ala Gly Cys Gly Cys Gly Gly 690 695 700 Cys Cys Cys Gly Thr Thr Cys Cys Ala Gly Ala Cys Cys Thr Ala Cys 705 710 715 720 Gly Ala Cys Ala Thr Cys Gly Thr Gly Gly Gly Cys Thr Thr Cys Cys 725 730 735 Ala Cys Gly Thr Gly Gly Cys Cys Gly Cys Cys Ala Ala Cys Gly Thr 740 745 750 Cys Thr Cys Cys Cys Gly Cys Ala Ala Cys Ala Cys Gly Gly Gly Cys 755 760 765 Gly Thr Cys Gly Ala Cys Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Thr Cys Gly 770 775 780 Gly Cys Thr Thr Cys Gly Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr 785 790 795 800 Cys Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Thr Cys Gly Cys Cys 805 810 815 Gly Ala Gly Gly Gly Cys Cys Ala Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Gly 820 825 830 Thr Gly Gly Cys Thr Gly Ala Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly 835 840 845 Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys Cys Gly Cys Thr Ala Cys Gly Gly Gly 850 855 860 Cys Cys Gly Gly Ala Cys Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ala Ala Cys Cys 865 870 875 880 Thr Cys Gly Gly Cys Cys Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala 885 890 895 Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys Gly Ala Cys 900 905 910 Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys Cys Cys Cys Gly Cys Thr Cys Gly 915 920 925 Gly Cys Thr Gly Ala 930 <210> 4 <211> 933 <212> DNA <213> ADH sequence coding Alcohol dehydrogenase from Micrococcus luteus NCTC2665 <400> 4 atgtccgagt tcacccgttt cgagcaggtc gccgtgctgg gcaccggcgt gctgggttcg 60 cagatcatca tgcaggcggc gtaccacggc aagaaggtga tggcctacga cgccgtcccc 120 gccgccctcg aggggatcga gcgccgctgg gcgtggatcc gccaaggcta cgaagcagac 180 ctcggggagg gctacgaccc gcagcgcttc gacgaggcca tcgcccgcat cacgccgacc 240 tccgacctcg gcgaggccct ggcggatgcg gacatcgtga tcgaggccgt cccggagaac 300 ctggagctca agcgcaaggt gtgggcccag gtgggcgagc tcgcccccgc cacgaccctg 360 ttcgccacga acacctcctc cctgctgccc tcggacttcg ccgacgccag cggccatccg 420 gagcgcttcc tggccctgca ctacgccaac cgcatctggg cgcagaacac cgccgaggtc 480 atgggcaccg ccgccacctc gccggaggcc gtcgcgggag ccctgcagtt cgccgaggag 540 accggcatgg tccccgtgca cgtgcgcaag gagatcccgg gctacttcct caactccctg 600 ctcatcccgt ggctgcaggc cggctccaag ctgtacatgc acggagtggg caacccggcg 660 gacatcgacc gcacctggcg cgtggccacc ggcaacgagc gcggcccgtt ccagacctac 720 gacatcgtgg gcttccacgt ggccgccaac gtctcccgca acacgggcgt cgactggcag 780 ctcggcttcg ctgagctgct cgagaagagc atcgccgagg gccacagcgg cgtggctgac 840 ggccagggct tctaccgcta cgggccggac ggggagaacc tcggcccggt ggaggactgg 900 aacctgggcg acaaggacac cccgctcggc tga 933 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying OhyA gene <400> 5 ggatccatgt actacagcag tggcaattac g 31 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying OhyA gene <400> 6 catatgtcag tcctcctgca ccag 24 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying ADH gene <400> 7 ggaatcaaag ttaaatgtcc gagttcaccc gtttc 35 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying ADH gene <400> 8 aattttgaag ttaatcagcc gagcggggtg tc 32

Claims

(a) 하이드라테이즈(hydratase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; (b) 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는 (c) 하이드라테이즈(hydratase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환된 10-케토스테아린 산(10-ketostearic acid) 생산용 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 코리네박테리움 글루타미컴 균주는 하이드라테이즈(hydratase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 각각 포함하는 2개의 발현벡터로 공동형질전환된 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 코리네박테리움 글루타미컴 균주는 하이드라테이즈(hydratase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 모두 포함하는 1개의 발현벡터로 공동형질전환된 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 하이드라테이즈(hydratase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia)로부터 유래하고, 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 마이크로코쿠스 루테우스(Micrococcus luteus)로부터 유래한 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 하이드라테이즈는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 알코올 디하이드로게네이즈는 서열목록 제 3 서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 하이드라테이즈를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열목록 제 2 서열의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 알코올 디하이드로게네이즈를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열목록 제 4 서열의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 3의 유전자 지도를 갖는 pCES-L10이고, 상기 뉴클레오티드 서열은 pCES-L10의 MCS(multiple cloning site)에 삽입되는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
다음 단계를 포함하는 10-케토스테아린 산(10-ketostearic acid) 생산용 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주의 제조방법:
(a) (ⅰ) 하이드라테이즈(hydratase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; (ⅱ) 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는 (ⅲ) 하이드라테이즈(hydratase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 알코올 디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터에 삽입시키는 단계; 및
(b) 상기 뉴클레오티드 서열이 삽입된 발현벡터로 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 형질전환시키는 단계.
제 8 항에 있어서, 상기 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 발현시키는 단계 (b)는 전기충격 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
다음 단계를 포함하는 10-케토스테아린 산(10-ketostearic acid) 생합성 방법:
(a) 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 배양하여 10-케토스테아린 산을 생합성하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 생합성된 10-케토스테아린 산을 수득하는 단계.