KR20140009172A - 종양 특이 항체 및 그 사용 - Google Patents

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Abstract

항체에 결합하는 고립된 항체 또는 그 단편 또는 유도체가 제공된다. 또한 상기 항체, 단편, 그 유도체를 포함하는 조성물 및 담체; 이들을 생산하는 세포들, 이들을 생산하는 방법, 종양 그리고/또는 이들로부터의 전이 세포 그리고/또는 종양 줄기 세포를 감지, 표적화, 그리고/또는 치료하는 데 이들을 사용되는 방법; 및 환자의 재발된 암을 예측하는 방법 또한 제공된다.

Description

종양 특이 항체 및 그 사용{Tumor specific antibodies and uses therefor}
본 명세서에 개시된 발명 주제는 종양에 존재하는 항체에 결합하는 고립된 항체 또는 그 단편 또는 유도체 및 그 사용에 대한 것이다. 몇몇 실시 예에서, 본 명세서에 개시된 발명 주제는 상피 뮤신족 구성원 MUC1에 결합하는 고립된 항체 또는 그 단편 또는 유도체 및 이를 이용하여 순환 종양 세포들(Circulating Tumor Cells:CTSs) 및 암 줄기 세포들(Cancer Stem Cells: CSCs)을 포함하지만 여기에 한정되는 것이 아닌 종양 및 종양 세포를 검출, 표적화 및 치료하는 방법에 대한 것이다.
췌장암은 폐암, 결장암 및 전립선암에 이어 남성의 암-관련 사망원인 4위이고, 폐암, 유방암, 결장암 및 난소암에 이어 여성의 암-관련 사망원인 5위이다. 환자들은 일반적으로 진전된 질환을 겪으며 이는 치료를 어렵게 한다. 수술이 유일한 치료 요법이지만, 원위장기로의 확산이 있는 또는 확산이 없는 국소 질환 재발이 환자의 80% 이상에서 나타난다. 이 같은 질환에서 성과를 향상시키기 위해서 더욱 좋은 치료법에 대한 시도가 필요하다.
종종, 종양 전환(neoplastic transformation)은 종양 세포에서 다양한 폴리펩타이드의 발현에서 변형을 야기한다. 예를 들어, 몇몇 뮤신 및 K-ras 발암유전자 폴리펩타이드의 돌연변이형은 췌장 도관의 선암(이후부터 "PDA")의 90%에서 과발현되고, 치료적 개입의 표적화 대상이 되었다. 하지만, 현재까지는 이 폴리펩타이드들을 표적화하는 백신은 임상적으로 특별히 성공적이지 못하였다. 백신은, 적어도 일부는 면역 인식 및 살생을 피하는 것을 가능하게 하는 방식으로 적응하는 종양으로 인해, 장기 면역 기억을 생성하는 데 실패했다. 아마도 종양 부위에 도달하는 약물의 양이 불충분하기 때문에 그리고/또는 약물 그 자체가 정상 세포와 결합함으로 인해 발생할 수 있는 원치않는 부작용에 관련되기 때문에, 면역 내성을 조절할 수 있는 몇몇 약물이 임상적으로 그러나 단지 보통의 응답으로 테스트 되었다.
또한 종양학에서 환자의 일차 질환을 치료하는 것뿐만 아니라 전이의 발생을 막는 것도 주요 도전 과제이다. 전이성 질환은 현재로서 종종 종양 줄기 세포 또는 암 줄기 세로포 불리는 종양 발생 세포가 일차 종양 부위로부터 침투하여 새로운 종양을 형성하는 다른 부위로 이동하는 것에 의해 발생할 수 있다고 믿어지고 있다(가령 Bonnet & Dick, 1997; Reya et al., 2001; Al-Hajj et al., 2003; Pardal et al., 2003; Dontu et al., 2004; Singh et al., 2004; Brabletz et al., 2005 참조). 그 결과, 환자에 존재한다면 이 같은 세포를 확인하고 제거할 수 있다면 좋다.
본 명세서의 개시에 인용된 인용 참증들 뿐 아니라 하기에 기재된 인용참증들은-등록특허, 출원 특허 및 공개 특허, 과학적 논문 및 데이터베이스 목록(예를 들면, GENBANK® 데이터베이스 목록 및 그의 이용할 수 있는 부가설명)을 포함하되, 이들로 한정되지는 않는-상기 인용물헌들의 목록들에서 인용참증에 의해, 본 명세서 내에 채용된, 배경을 공급하고, 설명하고, 제공하거나, 또는 방법론, 기술 그리고/또는 조성물을 가르치는 정도까지 포함된다. U.S. Patent Nos. 4,551,482; 4,816,567; 5,088,499; 5,147,631; 5,234,933; 5,326,902; 5,490,840; 5,510,103; 5,574,172; 5,651,991; 5,688,931; 5,707,605; 5,714,166; 5,738,837; 5,786,387; 5,855,900; 5,858,410; 5,865,754; 5,922,356; 5,922,545; 5,928,627; 5,994,392; 6,024,938; 6,071,890; 6,080,384; 6,083,486; 6,106,866; 6,127,339; 6,172,197; 6,221,018; 6,231,834; 6,245,318; 6,246,901; 6,248,516; 6,254,852; 6,291,158; 6,548,643; 7,183,388.
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따라서 종양 및 상기 종양에서 유도된 세포를 검출, 표적화 및 치료하는 새로운 조성물 및 방법이 필요하다.
본 섹션은 본 명세서에 개시된 발명의 여러 실시 예를 나열하며, 많은 경우에 이 실시 예들의 변형 및 치환(permutation)을 열거한다. 본 섹션은 다양하고 변형된 실시 예들에 대한 단지 예일 뿐이다. 주어진 실시 예에서 하나 이상의 대표 특징에 대한 언급은 마찬가지로 예로든 것뿐이다. 그 같은 실시 예는 언급된 특징(들)을 가질 수도 있고 가지지 않을 수도 있다; 비슷하게, 그 특징들은 본 섹션에 나열되었던 그렇지 않았던 본 명세서에 개시된 발명 주제의 다른 실시 예에 적용될 수 있다. 과도한 반복을 피하기 위해서, 본 섹션은 그 같은 특징들의 가능한 모든 조합을 열거하지는 않는다.
여러 실시 예에서, 본 명세서에 개시된 발명 주제는 다음의 것을 제공한다:
상피성 종양들에 존재하는 뮤신-1(MUC1) 그리고/또는 돌연변이 K-ras 종양 유전자 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체들 및 상기 분리된 항체들의 단편 또는 유도체.
본 명세서에 개시된 발명 주제의 분리된 항체 그리고/또는 그것의 부-서열을 인코딩하는 분리된 핵산들.
췌장 종양들, 난소 종양들, 유방 종양들, 대장직장 종양들 그리고 이들로부터 유도된 전이성 병변을 포함하는 상피성 종양들 같은 종양들에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체들 같은 항체들 그리고/또는 그것의 펩타이드들, 단편들 그리고/또는 유도체.
MUC1 및 돌연변이 K-rasG12D 을 종양 연관 항원들로 나타내는 쥐 모델로부터 단백질 용해를 사용하여 생성한 MUC1(몇몇 실시 예에서 인간 MUC1) 및 돌연변이 K-rasG12D 에 특이적으로 결합하는 항체들, 상기 항체들의 단편들 및 유도체들.
효과기들(effectors) 그리고/또는 면역조절제들에 부착된 항체들 및 그 단편들 및 유도체들을 포함하는 키메라 분자들, 상기 항체들 또는 그 단편들 및 유도체들은 MUC1 폴리펩타이드 그리고/또는 돌연변이 K-ras 폴리펩타이드에 존재하는 항원결정기에 특이적으로 결합함. 몇몇 실시 예에서, 효과기들은 항원결정기 태그들, 제2 항원체들(또는 그 단편들 또는 유도체들), 라벨들, 세포독소들, 리포솜들, 방사성 핵종들, 약물들, 전구 약물들 그리고 킬레이트들(chelates)로 구성된 그룹에서 선택되며, 면역조절제는 예를 들어 표 3에 열거된 약제들(agents)로부터 선택됨.
면역조절제, 예를 들어 표 3에 열거된 면역조절제에 결합하는, 항체들, 그 단편들 또는 유도체들.
진단약에 결합하는 항체들, 그 단편들 또는 유도체들.
하나 이상의 약리학적으로 허용가능한 담체(carrier)들 그리고/또는 부형제들을 포함하는 조성물로 준비된 항체들, 그 단편들 또는 유도체들.
몇몇 실시 예에서 항체들, 그 단편들 또는 유도체들 그리고/또는 본 명세서에 개시된 조성물들을 사람(사람에 한정되는 것은 아님) 등의 대상(subject)에 투여함을 포함하는 면역 반응 유도 방법.
MUC1 폴리펩타이드 그리고/또는 돌연변이 K-ras 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 검출가능한 라벨에 결합된 항체 또는 그 단편 또는 유도체를 사람(사람에 한정되는 것은 아님) 등의 대상에 투여함을 포함하는 암세포들 검출 방법.
UC1 폴리펩타이드, 돌연변이 K-ras 폴리펩타이드 또는 이 둘 모두에 결합하는, 단일클론 항체들(여기에 한정되는 것은 아님) 등과 같은, 본 명세서에 개시된 발명 주제의 항체들, 단편들 그리고/또는 유도체들을 생성하는 혼성 세포들(hybridoma cells).
본 명세서에 개시된 발명 주제의 항체들, 단편들 그리고/또는 유도체들 그리고 하나 이상의 약리학적으로 허용된 담체들 그리고/또는 부형제들을 포함하는, 선택적으로 하나 이상의 면역조절제들를 더 포함하는 상피성 암들에 대한 백신들.
더 구체적으로, 몇몇 실시 예에서 본 명세서에 개시된 발명 주제는 단일클론 항체 TAB-004의 상보성결정영역들(CDRs)들을 포함하는, 분리된 항체들, 또는 그 단편들 또는 유도체들을 제공한다. 몇몇 실시 예에서, 분리된 항체들, 또는 그 단편들 또는 유도체들은 다중클론성 분리된 항체들, 또는 그 단편들 또는 유도체들이다. 몇몇 실시 예에서, 분리된 항체들, 또는 그 단편들 또는 유도체들은 단일클론성 분리된 항체들, 또는 그 단편들 또는 유도체들이다. 몇몇 실시 예에서, 분리된 항체들, 또는 그 단편들 또는 유도체들은 인간 항체들, 또는 그 단편들 또는 유도체들 또는 인간화 항체들, 또는 그 단편들 또는 유도체들이다. 몇몇 실시 예에서, 분리된 항체들, 또는 그 단편들 또는 유도체들은: (a) 미합중국 버지니아 2011-2209, 마나사 유니버시티 블러바드 10801 TCC(American Type Culture Collection)에 접근 번호 PTA-11550로 2010년 12월 16일 기탁된 혼성세포주 TAB-004; (b) 키메라 항체들 또는 상기 키메라 항체들의 단편들 또는 유도체들; (c) 인간화 항체들 또는 상기 인간화 항체들의 단편들 또는 유도체들; (d) 인간 항체들 또는 상기 인간 항체들의 단편들 또는 유도체들; (e) 단일 사슬 항체들 또는 상기 단일 사슬 항체들의 단편들 또는 유도체들; 그리고, (f) Fab 단편들로 구성된 그룹에서 선택되며, 상기 키메라 항체들, 상기 인간화 항체들, 상기 인간 항체들, 상기 단일 사슬 항체들, 또는 상기 Fab 단편들은 단일클론 항체 TAB-004의 CDRs를 포함한다. 분리된 항체들, 또는 그 단편들 또는 유도체들의 몇몇 실시 예에서, 상보성결정영역들은: (i) SEQ ID NO: 8을 포함하는 H 사슬 CDR1; (ii) SEQ ID NO: 9를 포함하는 H 사슬 CDR2; (iii) SEQ ID NO: 10을 포함하는 H 사슬 CDR3; (iv) SEQ ID NO: 11을 포함하는 L 사슬 CDR1; (v) SEQ ID NO: 12를 포함하는 L 사슬 CDR2; 그리고, (vi) SEQ ID NO: 13을 포함하는 L 사슬 CDR3 중 하나 이상을 포함한다. 분리된 항체들, 또는 그 단편들 또는 유도체들의 몇몇 실시 예에서, H 사슬 변이영역은 SEQ ID NO: 5를 포함하는 또는 SEQ ID NO: 4를 포함하는 핵산분자에 의해 코딩되고; 그리고/또는 L 사슬 영역은 SEQ ID NO: 7을 포함하는 또는 SEQ ID NO: 6을 포함하는 핵산분자에 의해 코딩된다.
본 명세서에 개시된 발명 주제는 또한 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체, 그리고 약리학적으로 허용가능한 담체 그리고/또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 실시 예에서, 상기 약리학적으로 허용가능한 담체 그리고/또는 부형제는 인간에의 사용이 허용된다.
본 명세서에 개시된 발명 주제는 또한 활성 약물(active agent)에 접합한(conjgated) 항체들, 또는 그 단편들 또는 유도체들을 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 실시 예에서, 상기 활성 약물은, 방사성 분자, 방사성핵종, 증감제 분자, 영상 시약(imaging reagent), 방사성 동위원소, 독소, 세포독소, 항혈관생성제, 항종양제, 화학요법제, 면역조절제, 사이토카인, 리포터 그룹(reporter group) 및 이들의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된다. 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 동위원소는 10B, 211At, 212Pb, 212Bi, 125I, 131I, 35S 및 3H 로 이루어진 그룹에서 선택된다. 몇몇 실시 예에서, 상기 면역조절제는, 인돌아민 2, 3-이산소화효소(IDO), 억제제, 선택적으로 1-메틸-DL-트립토판(1MT); EP2/EP4 수용체 길항제; 고리형 산소화효소 억제제, 선택적으로 인도메타신; 그리고, 수지상 세포 활성화제, 선택적으로 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(CpG ODN)로 이루어진 그룹에서 선택된다.
본 명세서에 개시된 발명 주제는 또한 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체를 포함하는 키트(kit)를 제공한다. 몇몇 실시 예에서, 본 명세서에 개시된 키트는 본 명세서에 개시된 항체들, 또는 그 단편들 또는 유도체들의 사용 설명서를 포함한다.
본 명세서에 개시된 발명 주제는 또한 종양 세로로 활성 약물을 표적 전달하는 데 사용하는 전달 매개체(vehicle)를 제공한다. 몇몇 실시 예에서, 이 전달 매개체는 본 명세서에 개시된 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체를 포함하는 표적화 약제(targeting agent)를 포함한다. 몇몇 실시 예에서, 상기 활성 약물은 방사성 분자, 방사성핵종, 증감제 분자, 영상 시약; 방사성 동위원소, 독소, 세포독소, 항혈관생성제, 항종양제, 화학요법제, 면역조절제, 사이토카인, 리포터 그룹 및 이들의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된다.
본 명세서에 개시된 발명 주제는 또한 본 명세서에 개시된 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체를 생성하는 분리된 세포를 제공한다. 몇몇 실시 예에서, 분리된 세포는 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체를 생성하는 혼성 세포이다. 몇몇 실시 예에서, 상기 혼성 세포는 부다페스트 조약에 따라 미합중국 버지니아 2011-2209, 마나사 유니버시티 블러바드 10801 ATCC(American Type Culture Collection)에 2010년 12월 16일 기탁된 혼성세포주 ATCC 접근 번호 PTA-11550이다.
본 명세서에 개시된 발명 주제는 또한 생체 시료(biological sample)에서 단일클론 항체 TAB-004에 결합하는 항원결정기의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시 예에서, 이 방법은: 상기 생체 시료를 본 명세서에 개시된 하나 이상의 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체에 접촉시키는 단계; 그리고, 상기 생체 시료에서 단일클론 항체 TAB-004에 결합하는 항원결정기의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시 예에서, 상기 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체는 뮤신(MUC1) 폴리펩타이드 그리고/또는 K-ras 폴리펩타이드, 선택적으로 변종 K-ras 폴리펩타이드에 존재하는 항원결정기에 결합한다.
본 명세서에 개시된 발명 주제는 또한 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체를 제조하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시 예에서, 이 방법은: 본 명세서에 개시된 발명 주제의 분리된 세포 또는 본 명세서에 개시된 발명 주제의 혼성 세포를 상기 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체가 발현하는 조건하에서 배양하는 단계; 그리고, 상기 세포 또는 혼성 세포 그리고/또는 상기 세포 또는 상기 혼성 세포가 성장하는 환경으로부터 상기 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체를 회수하는(recovering) 단계를 포함한다.
본 명세서에 개시된 발명 주제는 또한 대상에서 종양 그리고/또는 암세포를 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은: 대상의 또는 대상으로부터 분리된 생체 시료를 본 명세서에 개시된 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체를 포함하는 조성물에 접촉시키되, 상기 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체가 상기 생체 시료에 존재한다면 존재하는 종양 그리고/또는 암세포에 존재하는 항원결정부에 결합하기에 충분한 조건하에서 접촉시키는 단계; 그리고, 본 명세서에 개시된 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체가 상기 항원결정부에 결합한 것을 검출하는 단계를 포함하며, 검출은 대상에 종양 그리고/또는 암 세포가 존재함을 가리킨다. 몇몇 실시 예에서, 상기 종양 그리고/또는 암세포는 췌장, 유방, 난소, 결장 또는 직장의 종양 그리고/또는 상기 종양으로부터 유도되고 선택적으로 MUC1, 변종 K-ras 또는 이 둘 모두를 발현하는 전이세포이다. 몇몇 실시 예에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체는 상자성 이온, 방사성 이온 및 형광 발생 이온으로 구성된 그룹에서 선택되는 영상 시약을 포함하는 검출가능한 라벨에 접합된다. 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 영상 시약은 감마선 에미터, 양전자 에미터 및 X-선 에미터로 구성된 그룹에서 선택된다. 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 영상 시약은 43K, 52Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 77Br, 81Rb/81MKr, 87MSr, 99 MTc, 111In, 113In, 123I, 125I, 127Cs, 129Cs, 131I, 132I, 197Hg, 203Pb 및 206Bi로 이루어진 그룹에서 선택된다. 몇몇 실시 예에서, 상기 생체 시료는 혈액 시료 또는 혈액 시료에서 유도된 부분이다.
본 명세서에 개시된 발명 주제는 또한 대상의 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 활성 약물에 접합한 본 명세서에 개시된 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체를 포함하는 조성물을 대상에 투여함을 포함하고 이로써 상기 활성 약물이 종양과 접촉하여 종양을 치료한다. 몇몇 실시 예에서, 상기 활성 약물은 요법제, 선택적으로 화학요법제, 독소, 방사성요법제 또는 그 조합을 포함한다. 몇몇 실시 예에서, 상기 화학요법제는 항종양 약물, 사이토카인, 대사 길항제, 알킬화제, 호르몬, 메토트렉세이트, 독소루비신, 다우노루비신, 시토신, 아라비노사이드, 5-플루오로우라실, 멜팔란, 클로람부실, 질소머스타드, 시클로포스파미드, 시스-플라티넘, 빈데신, 빈카 알칼로이드, 미토마이신, 블레오마이신, 푸로티오닌, 마크로마이신, 1,4-벤조퀴논 유도체, 트레니몬, 스테로이드, 아미노프테린, 안트라사이클린, 데메콜신, 에토포시드, 미트라마이신, 독소루비신, 다우노마이신, 빈블라스틴, 네오카르지노스타틴, 마크로마이신, 알파-아만틴 및 그 조합으로 구성된 그룹에서 선택된다. 몇몇 실시 예에서, 상기 독소는 럿셀사독, 활성화된 인자 IX, 활성화된 인자 X, 트롬빈, 인지질분해효소, 코브라 독 인자, 리신, 리신 A 사슬, Pseudomonas 내독소, 디프테리아 독소, 소 췌장 리보핵산분해효소, 미국자리공 항바이러스 단백질, 아브린, 아브린 A 사슬, 겔로닌, 사로핀, 모데신, 비스큐민, 볼켄신 및 이들의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된다. 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성요법제는 47Sc, 67Cu, 90Y, 109Pd, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 199Au, 211At, 212Pb, 212Bi, 32P, 33P, 71Ge, 77As, 103Pb, 105Rh, 111Ag, 119Sb, 121Sn, 131Cs, 143Pr, 161Tb, 177Lu, 191Os, 193 MPt, 197Hg 로 이루어진 그룹에서 선택된다.
본 명세서에 개시된 발명 주제는 또한 대상에서 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 단일클론항체 TAB-004의 상보성결정영역들(CDRs)을 포함하는 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체의 유효량을 종양이 있는 대상에게 투여함을 포함한다. 몇몇 실시 예에서, 상기 종양은 췌장, 유방, 난소, 결장 또는 직장의 종양 그리고/또는 상기 종양으로부터 유도되고 선택적으로 MUC1, 변종 K-ras 또는 이 둘 모두를 발현하는 전이세포이다. 몇몇 실시 예에서, TAB-004의 상보성결정영역들(CDRs)은: SEQ ID NO: 8을 포함하는 H 사슬 CDR1; SEQ ID NO: 9를 포함하는 H 사슬 CDR2; SEQ ID NO: 10을 포함하는 H 사슬 CDR3; SEQ ID NO: 11을 포함하는 L 사슬 CDR1; SEQ ID NO: 12를 포함하는 L 사슬 CDR2; 그리고/또는, SEQ ID NO: 13을 포함하는 L 사슬 CDR3 중 하나 이상을 포함한다. 몇몇 실시 예에서, H 사슬 변이영역은 SEQ ID NO: 5를 포함하는 또는 SEQ ID NO: 4를 포함하는 핵산분자에 의해 코딩되고; 그리고/또는 L 사슬 영역은 SEQ ID NO: 7을 포함하는 또는 SEQ ID NO: 6을 포함하는 핵산분자에 의해 코딩된다.
여기에 개시된 치료 방법과 관련하여, 몇몇 실시 예에서 이 치료 방법은 상기 대상에 하나 이상의 항종양 치료를 행함을 더 포함한다. 몇몇 실시 예에서, 상기 하나 이상의 항종양 치료는 방사성요법, 화학요법, 면역요법, 항염증요법, 그리고 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된다. 몇몇 실시 예에서, 상기 항염증 용법은 상기 대상에게 고리형 산소화효소 억제제, 선택적으로 고리형 산소화효소-2-특이 억제제를 투여함을 포함한다. 몇몇 실시 예에서, 상기 하나 이상의 항종양 요법은 젬시타빈(4-아미노-1(2-데옥시 2,2-디플루오로-β-D-에리쓰로-펜토퓨라노실)피리미딘-2(1H)-온-2',2'-디플루오로-2'-데옥시시티딘) 및 쎄리콕시브(4-[5-(4-메틸페닐)-3-(트리플루오로메틸)피라졸-1-일]벤젠술폰아미드) 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염 중 하난 또는 둘 모두를 상기 대상에게 투여함을 포함한다.
본 명세서에 개시된 발명 주제는 암 줄기 세포를 정제하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시 예에서 이 방법은: 암 줄기 세포를 포함하는 것으로 의심되는 세포 집단을 제공하는 단계: 단일클론항체 TAB-004의 상보성결정영역들(CDRs)을 포함하는 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체에 결합하는 세포 부-집단을 확인하는 단계; 그리고, 상기 세포 부-집단을 정제하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시 예에서, 상기 세포 집단은 종양 그리고/또는 암을 갖는 대상으로부터 분리된 순환 세포들을 포함한다. 몇몇 실시 예에서, 상기 정제 방법은 양성 계열(lineage-positive:lin+) 세포를, 상기 확인하는 단계 이전에 그리고/또는 상기 정제하는 단계 이후에, 제거하는 단계를 더 포함한다.
본 명세서에 개시된 발명 주제는 또한 대상에서 활성 약물을 순환하는 암 줄기 세포에 표적화 하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시 예에서, 이 방법은: 상기 순환하는 암 줄기 세포를, 단일클론항체 TAB-004의 상보성결정영역들(CDRs)을 포함하는 항원 또는 상기 항원의 단편 또는 유도체, 및 활성 약물을 포함하는 조성물에 접촉시키는 단계를 포함하고, 선택적으로 상기 활성 약물은 요법제, 선택적으로 화학요법제, 독소, 방사성요법제 또는 그 조합을 포함한다. 몇몇 실시 예에서, 상기 요법제는 면역조절제를 포함하고, 상기 면역조절제는 선택적으로 인돌아민 2, 3-이산소화효소(IDO), 억제제, 선택적으로 1-메틸-DL-트립토판(1MT); EP2/EP4 수용체 길항제; 고리형 산소화효소 억제제, 선택적으로 인도메타신; 그리고, 수지상 세포 활성화제, 선택적으로 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(CpG ODN)로 이루어진 그룹에서 선택된다.
본 명세서에 개시된 발명 주제는 또한 암 치료를 받은 대상에서 암의 재발을 예지하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시 예에서 이 방법은 암이 있는 대상으로부터 순환 셀을 포함하는 생체 시료를 분리하는 단계; 상기 생체 시료를 본 명세서에 개시된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체에 접촉시키되, 상기 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체가 상기 생체 시료에 존재한다면 존재하는 종양 그리고/또는 암세포에 존재하는 항원결정부에 결합하기에 충분한 조건하에서 접촉시키는 단계; 그리고, 상기 생체 시료에서 본 명세서에 개시된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체에 결합한 하나 이상의 순환 세포를 확인하는 단계를 포함하며, 이로써 대상에서 암의 재발이 예지된다. 몇몇 실시 예에서, 상기 생체 시료는 혈액 시료, 림프 시료 또는 상기 혈액 시료 또는 림프 시료의 부분을 포함한다. 몇몇 실시 예에서 상기 암은 췌장암 또는 유방암이다. 몇몇 실시 예에서, 상기 항체, 또는 상기 항체로부터 유도된 단편은 부다페스트 조약에 따라 미합중국 버지니아 2011-2209, 마나사 유니버시티 블러바드 10801 ATCC(American Type Culture Collection)에 접근 번호 PTA-11550로 2010년 12월 16일 기탁된 혼성세포주 TAB-004에 의해 생성된 단일클론 항체; 키메라 항체 또는 상기 키메라 항체의 단편 또는 유도체; 인간화 항체 또는 상기 인간화 항체의 단편 또는 유도체; 인간 항체 또는 상기 인간 항체의 단편 또는 유도체; 단일 사슬 항체 또는 상기 단일 사슬 항체의 단편 또는 유도체; 그리고, Fab 단편으로 구성된 그룹에서 선택되며, 상기 키메라 항체, 상기 인간화 항체, 상기 인간 항체, 상기 단일 사슬 항체, 또는 상기 Fab 단편은 단일클론 항체 TAB-004의 CDRs를 포함한다. 몇몇 실시 예에서, 상기 단일클론항체 TAB-004의 CDRs는 SEQ ID NO: 8을 포함하는 H 사슬 CDR1; SEQ ID NO: 9를 포함하는 H 사슬 CDR2; SEQ ID NO: 10을 포함하는 H 사슬 CDR3; SEQ ID NO: 11을 포함하는 L 사슬 CDR1; SEQ ID NO: 12를 포함하는 L 사슬 CDR2; 그리고, SEQ ID NO: 13을 포함하는 L 사슬 CDR3을 포함한다. 몇몇 실시 예에서, 상기 H 사슬 변이영역은 SEQ ID NO: 5를 포함하는 또는 SEQ ID NO: 4를 포함하는 핵산분자에 의해 코딩되고 그리고/또는 상기 L 사슬 변이영역은 SEQ ID NO: 7을 포함하는 또는 SEQ ID NO: 6을 포함하는 핵산분자에 의해 코딩된다. 몇몇 실시 예에서, 암의 진행은 대상에서의 암의 전이를 포함한다.
본 명세서에 개시되는 발명 주제는 또한 SEQ ID ID NO: 4 및 6중 어느 것을 포함하는 그리고/또는 SEQ ID NO: 5, 7-13 중 어느 것을 인코딩하는 분리된 핵산 분자들을 제공한다. 몇몇 실시 예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 벡터, 선택적으로 발현 벡터 내에 존재한다. 몇몇 실시 예에서, 상기 분리된 핵산 분자는, 상기 발현 벡터를 적절한 숙주에 도입하면 SEQ ID NO: 5, 7~13 중 하나 이상을 포함하는 온전한 재조합 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체가 상기 숙주에 의해 발현되도록, 상기 항체 분자의 부-서열을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열에 동작상 연결된 발현 벡터 내에 존재한다.
따라서, 본 명세서에 개시된 발명 주제의 목적은 종양들에 존재하는 항원들에 결합하는 분리된 항체들 및 그 단편들 또는 유도체들을 제공한다.
본 명세서에 개시된 발명 주제의 목적이 이상에서 설명되었으며 이는 본 명세서에 개시된 조성물들 및 방법들에 의해 전부 또는 부분적으로 달성되며, 다른 목적들은 이하에서 가장 잘 설명되듯이 첨부된 도면들과 함께 발명 내용이 설명되면서 더욱 명확해 질 것이다.
본 발명의 실시예들에 따르면 종양 및 상기 종양에서 유도된 세포를 검출, 표적화 및 치료하는 새로운 조성물 및 방법을 제공한다.
도 1A 및 1B는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체의 인간 및 마우스의 췌장 종양과 특이적 결합을 도시한 일련의 현미경 사진들이다. 사각형에서 짙은 무늬는 세포 내에 존재하는 세포들에 실험예의 항체의 양성 결합을 지시한다.
도 1A는 실험예의 항체 및 0단계 (음성 제어(negative control)에 따른 정상 췌장 조직) 및 2-4단계에서 인간의 종양의 결합을 도시한 일련의 현미경 사진이다.
도 1B는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체가 자연발생 종양(spontaneous tumor)과 결합한 것을 도시한 현미경 사진이며, 상기 자연발생종양은 인간 MUC1 이식유전자(transgene) 및 K-rasG12D 돌연변이를 운반하며, 6, 16, 26 및 34주(week)령 유전자 이식(transgenic) 마우스들의 췌장에 존재하는 것이다.
도 2A 내지 2C는 본 발명의 명세서에 개시된 발명 주제에 관한 일련의 현미경 사진들로서, 인접한 인접 정상 유방 조직(도 2C)이 아니라, 본 발명의 일 실시예에 따른 항체와 인간 유방 조직(도 2A 및 2B)과의 특이적 결합을 도시한 일련의 현미경 사진들이다.
도 3은 췌장을 통해 나온 Cre 재조합효소(recombinase), 돌연변이 K-ras 종양원(oncogene) 유전자, 및 인간 MUC1 폴리펩타이드에 의해 발현된 삼중의 형질 전환 마우스 라인을 생성하기 위한 방법을 보여주는 모식도(왼쪽 위의 패널)이다. 상기 마우스는 췌장 선암(adenocarcinoma)이 발생하였는데, 상기 췌장 선암의 세포들은 1차 종양 세포 라인 KCM(아래의 패널)을 만들어내는데 사용된다. KCM 세포 라인은, 단독 또는 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(oligodeoxynucleotide, CpG ODN)와 접합된 본 발명의 일 실시예에 따른 항체(도면들에서 "TAB"로 설명에서 "TAB-004" 로 나타남)의 결합을 테스트하는 데에 사용되었다. 비접합 항체 및 접합된 항체 둘 다 동일한 친화도(affinity)로 KCM 췌장 세포 라인에 결합할 수 있는지가 판명되었다.(오른쪽 위의 패널)
도 4A 및 4B는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체(TAB-004)가 자연 살해(NK) 세포들의 세포속성(cytotoxicity)을 증가시켜 표적 종양 세포를 제거하는 것을 보여주는 그래프들이다. 항체 및 CpG ODN의 접합은 이러한 효과를 더 증가시켜, 그 결과 예시적인 항체가 체내 항-종양 면역반응을 증진시킬 수 있었음을 보여준다.
도 4A는 음성 조절(TAB-004 항체 제외)에 있어서, 실험예의 TAB-004 항체가 유효 인자(effector, NK세포(NK cell)) 대(對) 표적의 다양한 비(E:T ratio)에 따라 KCM 종양 세포에 대한 특이적 용해가 증가되었음을 보여주는 직선 그래프이다.
도 4B는CpG ODN과 접합된 실험예의 TAB-004 항체가, 비접합된 항체에 비하여, 다향한 E: T 비에서 종양 세포의 특이적 용해(lysis)를 더 증가시켰음을 보여주는 막대 그래프이다.
도 5A 및 5B는 본 명세서의 실험예의 항체(TAB-004), 및 이들의 접합체에 대하여, MUC1 유전자 이식(MUC1 Tg) 마우스들에서 설정된 KCM 종양의 종양 부피 감소 성능을 시험하도록 설계된 실험결과를 나타낸다.
도 5A는 인산염완충 식염수(phosphate-buffered saline, PBS) 단독(음성 조절; 채워진 사각형), CpG ODN 단독(X표시), 비접합된 TAB-004 항체 (빈 동그라미), 또는 TAB-004-CpG ODN 접합체(채워진 동그라미)로 치료한 마우스들에서 측정된 종양 부피(디지털 캘리퍼스를 사용하여 mm로 측정됨)를 나타낸 막대 그래프이다.
도 5B는 마지막 치료가 투여된 후 19 및 27일 째에, 마우스에서 종양 부피의 변화를 보여주는 막대 그래프이다. 마지막 치료가 투여된지 19 및 27일 후 관찰 기록에 의하면, TAB-004-CpG ODN를 이용하여 치료된 마우스에서 종양 부피는, 조절 마우스(즉, PBS단독 CpG ODN 단독, 또는 TAB-004 단독)에 비하여. 증가되지 않았다. *: p< 0.5.PBS 단독(음성 조절; 백색 막대); CpG ODN 단독 (빗금친 막대); 비접합된 TAB-004 항체(흑색 막대); TAB-004-CpG ODN 접합체(반대로 빗금친 막대).
도 6은 일 실시예에 따라 실험예 조성물 및 상기 조성물의 이용을 나타낸 모식도이다. ADCC-항체 의존 세포-매개 세포독성(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity); CDC -상호보완 의존적 세포독성(complement dependent cytotoxicity); ADEPT- 항체 유도된 효소 전구약물 요법(antibody directed enzyme prodrug therapy).
도 7A 및 도 7B는 CD133+ (도 7A) 및 CD24+/CD44+/EpCAM+ (도 7B) 세포들의 형광 활성 세포 분류법(fluorescence-activated cell sorting, FACS)의 분류 및 본 명세서에서 개시하고 있는 TAB-004항체가 이러한 집단에 결합되는 정도의 히스토그램들이다. 각각 패널에서 왼쪽 자취은 음성 조절 항체를 사용한 분류에 해당하고, 각각 패널에서 오른쪽 자취은 TAB-004 항체를 사용한 분류에 해당한다.
도 8A 내지 8D는 췌장 종양("종양1") 및 인접 정상 조직("정상")에 대한 TAB-004 항체의 결합을 나타낸 산포도인데, TAB-004항체 및 CXC 케모카인 수용체 4(CXCR4)에 대항하여 유도된 항체를 사용하였다. MUC1: TAB-004 항체; CXCR4: 항(anti)-CXCR4 항체; FL1-H: 형광 염색제 1 높이(Flourescent stain 1 height, 플루오세인- FITC (Flourescein-FITC)); FL2-H: 형광 염색제 2 높이 (Flourescent stain 2 height, 피코에리트린-PE(Phycoerythrin-PE)); SSC-H: 측면-산포 높이(side-scatter height; FSC-H: 정면-산포 높이(forward-scatter height); FL4-H: 형광 염색제 4 높이(Flourescent stain 4-height 알로피코시아닌(Allophycocyanin-APC)).
도 8A는 항체 존재 하에서 세포들의 분포를 나타내는 산포도이다. 도 8B는 동형 제어로 염색된 세포들의 분포를 나타내는 산포도이다. 도 8C TAB-004 항체 대(對) CXCR4 항체를 사용하여 염색된 정상세포의 분포를 나타낸 일련의 산포도이다. 도 8D는 TAB-004 항체 대 CXCR4 항체를 사용하여 염색된 췌장 선암(adenocarcinoma)에서 세포들의 분포를 나타내는 일련의 산포도이다.
도 9A 내지 9C는 일 실시예에 따른 TAB-004 항체가, 표준 EpCAM 항체보다, 췌장암 환자들의 순환 종양(circulating tumor) 세포를 검출하는 데에 우수하다는 것을 보여주는 일련의 FACS그래프들이다. 염색되지 않은 세포(왼쪽의 흑색 선); EpCAM-PE (0.1 mg/ml) 염색된 세포(짙은 갈색 선); TAB-004-PE(0.1 mg/ml) 염색된 세포(오른쪽 흑색 선); TAB-004-PE (0.02mg/ml) 염색된 세포(밝은 회색 선); TAB-004-PE(0.004 mg/ml) 염색된 세포(중간 회색 선). "-PE"는 항체가 분류 목적으로 피코에리트린(phycoerythrin)으로 라벨되었음을 나타낸다.
도 9A에서, PANC1 췌장암 세포 주 세포들은 TAB-004-PE 항체에 의하여 검출되었다. 도 9B 및 9C에서, 두 명의 환자들(각각, 환자 번호 1 및 환자 번호 2) 로부터 혈액 내에 존재하는 순환 종양 세포가 TAB-004-PE에 의해 검출되었으나 (도 9B에서 오른쪽 흑색 선 및 도 9C에서 밝은 회색 선을 보라), EpCAM-PE 항체에 의해서는 검출되지 않았다.(도 9B 및 9C에서 밝은 회색 선을 보라)
도 10은 플라즈마(plasma) 내 암 세포 검출을 위하여, 효소 면역측정(enzyme immunoassay, EIA)에서 TAB-004를 사용하여CA15-3항원의 항체 특이 성능을 비교한 막대 그래프이다. 백색 네모: TAB-004항체. 흑색 네모: CA15-3. 일점쇄선: TAB-004 일반 절단(cutoff); 점선: CA 15-3 일반 절단
도 11은 효소 면역측정(EIA)에서 TAB-004의 성능비교 막대 그래프인데, 단계별 췌장 환자의 플라즈마에서 제거된 MUC1 정도를 검출하기 위한 것으로, 효소 면역측정(EIA)에서 EIA에 기초한 CA15-3와 비교한다 백색 네모: TAB-004 항체. 흑색 네모: CA15-3.
[서열 리스트의 간단한 설명]
SEQ ID NO: 1은 인간 MUC1 유전자 산물의 아마노산 서열이며, GENBANK® 접근번호 AAA60019에 해당한다.
SEQ ID NO: 2는 인간 K-ras 종양원 산물의 아마노산 서열이며, GENBANK® 접근번호 NP_004976에 해당한다.
SEQ ID NO: 3 는 ELISA 측정에서 실시예에 따른 TAB-004 항원이 결합할 수 있는 펩타이드의 아미노산 서열이다. 상기 펩타이드는 TAB-004에 특이적으로 결합하는 항원결합기를 포함한다.
SEQ ID NO: 4 및 5는 각각 실시예에 따른 TAB-004 항체의 H사슬에 대한 뉴클레오타이드 및 코딩된 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 6 및 7은 각각 실시예에 따른 TAB-004 항체의 L사슬에 대한 뉴클레오타이드 및 코딩된 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 8 내지 10은 각각, 실시예에 따른 TAB-004 항체의 H사슬에 대한 CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열들이다.
SEQ ID NO: 11 내지 13은 각각, 실시예에 따른 TAB-004 항체의 L사슬에 대한 CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열들이다.
관련된 특허출원
본 출원은 2009년 10월 8일자로 출원된 미합중국 임시특허출원 일련번호 61/249,634를 우선권 주장하여 2010년 10월 8일자로 출원된 미합중국 특허출원 일련번호 12/924,952의 일부계속출원이다. 상기 특허출원들 각각의 개시 내용 전체는 본 명세서에 참조로서 포함된다.
서열 리스트
본 명세서 개시 내용과 관련된 서열 리스트는 수리관청인 미합중국 특허상표청에 2011년 5월 25일자로 생성된 파일명 "1276_5PCT_ST25.txt"의 21킬로바이트 ASCII 텍스트 파일로 전자적으로 제출되었다. EFS-Web 으로 제출된 서열 리스트 전체는 참조로서 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에 개시된 발명은 이하 참조문헌과 함께, 도면 및 예시들을 수반하여, 보다 완전히 개시될 것이며, 본 발명의 대표적인 실시예들이 도면 및 예시들에 기술될 것이다. 그러나, 본 발명은 다른 형태로 실시될 수 있으며, 앞으로 설명될 실시예들에 한정되어 해석되어서는 안될 것이다. 이보다는 이러한 실시예들은 설명을 철저하고 완전하게 하기 위하여 제공되고, 통상의 기술자에게 본 발명을 완전히 전달할 수 있을 것이다.
I. 정의
본 명세서에 사용된 용어는 특정한 실시예를 설명하기 위한 목적이며, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다.
아래의 용어들은 통상의 기술자들에게 잘 이해될 것이며, 아래의 정의들은 본 발명에 관한 설명을 용이하게 하기 위하여 제시된다.
기재된 모든 기술 및 과학 용어들은, 아래에 별도의 정의가 없으면, 본 기술분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가질 것으로 의도된다. 본 명세서에 사용된 기술들에 대한 참조는 본 기술 분야에서 일반적으로 알려진 기술들을 언급하려는 것이고, 본 발명의 기술 분야에서 통상의 기술자에게 자명한 다양한 변형이나 치환을 포함할 수 있다. 아래의 용어들은 본 발명의 기술 분야에서 통상의 기술자에게 용이하게 이해될 것으로 여겨지며, 아래의 정의들은 본 발명에 관한 설명을 용이하게 하기 위하여 제시될 수 있다.
실시예들에 관한 설명에서, 많은 기술 및 단계가 개시될 것이다. 이들 각각의 기술 및 단계는 개별적인 이득을 가지고, 각각의 기술 및 단계는 하나 또는 그 이상과 결합하여 사용될 수 있으며, 또는 어떤 모든 경우에 있어서 다른 개시된 기술들과 결합하여 사용될 수 있다.
따라서, 명확성을 위해, 설명은 매번 각각 단계의 가능한 모든 조합을 반복하는 것을 삼가할 것이다. 그럼에도 본 명세서 및 청구항들은, 그러한 조합들이 전적으로 본 명세서에 개시되고, 청구된 발명 범위 내에 있다는 것을 이해하며 해석되어야 한다.
오랜 특허법 관습에 따라, 청구항들을 포함한 본 명세서에 사용된 용어 "하나", "어떤", 및 "상기"는 "하나 또는 그 이상"을 의미할 수 있다. 예를 들어, "하나의 항체"의 구절은 동일한 항체의 다수를 포함하는 하나 또는 그 이상의 항체를 의미할 수 있다. 마찬가지로, 구절 "적어도 하나"는 본 명세서에서 언급되는 구성 (entity)에 사용되었을 때, 예를 들어, 그 구성의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 또는 그 이상(1에서 100 사이 그리고 100보다 큰 값을 가지는 모든 숫자를 포함하나 이에 제한되지 않음)을 의미할 수 있다.
별도의 기재가 없으면, 본 명세서와 청구항에 사용된 성분(ingredient)의 양, 반응 조건, 및 기타 등을 표시하는 모든 수는 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 변경될 것으로 이해될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "약"은 질량, 무게, 시간, 부피, 농도, 또는 퍼센트의 양과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때, 특정된 값으로부터 일 실시예에서 ±20%, 다른 실시예에서 ±10%, 다른 실시예에서 ±5%, 다른 실시예에서 ±1%, 다른 실시예에서 ±0.5%, 및 다른 실시예에서 ±0.1 %의 변형을 아우르는 것을 의미할 수 있으며, 그러한 변형은 기재된 방법을 수행하거나 그리고/또는 개시된 조성물에 사용하기에 적절할 수 있다. 따라서, 상반되는 기재가 없다면, 본 발명의 상세한 설명 및 첨부된 청구항에서 제시된 숫자로 나타난 한도(수치적인 한도)는 근사값이며, 상기 근사값은 본 발명에 의해 얻어지도록 모색된 원하는 속성에 따라 달라질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "그리고/또는"은 구성의 목록에 관한 맥락에서 사용되었을 때, 단수 또는 복수로 존재하는 구성을 의미할 수 있다. 따라서, 예를 들어, "A, B, C, 그리고/또는 D"라는 구절은 A, B, C, 및 D 각각을 포함하나, 또한 A, B, C, 및 D에 대한 어떤 모든 조합 및 부조합을 포함할 수 있다.
용어 "포함하는(comprising)"은 포괄적 또는 개방적이고, 추가적인 나열되지 않은 요소 그리고/또는 방법 단계를 배제하지 않으며, "구성하는(including)", "함유하는(containing)", 또는 "~에 의해 특정지어진(characterized by)" 과 동의어이다. "포함하는"은 지정된 요소 그리고/또는 단계가 존재하며, 다른 요소 그리고/또는 단계가 추가될 수 있되, 관련된 발명의 범위 내에 속하는 것을 의미하는 기술 용어이다.
본 명세서에 사용된 "이루어지는(consisting of)"의 구절은 특별히 나열되지 않은 어떤 요소, 단계, 및 성분을 배제할 수 있다. ""이루어지는" 이라는 용어가 청구항 본체부(body)의 절에 사용되었을 때, 전제부(preamble) 바로 다음에 사용되었을 때보다 보다, 그 절에서 제시된 구성요소만을 한정하는 것으로 이해되며, 다른 구성요소는 전체로서 청구항으로부터 배제되지 않는 것으로 여겨진다.
본 명세서에 기재된 "필수적으로 이루어지는"의 용어는, 관련된 기재 또는 청구항에 관한 범위를 특정한 물질 그리고/또는 단계로 한정할 수 있고, 덧붙여 개시된 그리고/또는 청구된 발명의 기본적인 또는 새로운 성질에 물질적으로 영향을 미치지 않는 것들을 한정할 수 있다. 예를 들어, 약학 조성물(pharmaceutical composition)은 하나의 약학적으로 활성 약물 또는 다수의 약학적으로 활성 약물들로 "필수적으로 구성될" 수 있는데, 이는 제시된 약학적으로 활성 약물은 약학 조성물 내에 존재하는 단지 약학적으로 활성 약물을 의미할 수 있다. 그러나, 담체, 부형제, 그리고/또는 다른 비활성 약물이 상기 약학 조성물 내에 존재할 것으로 여겨질 수 있다.
용어 "포함하는", "이루어지는" 및 "필수적으로 이루어지는"에 관하여, 상기 세 용어 중 하나가 사용된 본 명세서에서 사용된 곳에서, 본 명세서에 개시 및 청구된 발명은, 다른 두 개의 용어 중에서 어느 하나의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 실시예에서, 본 발명은 항체를 "포함하는" 조성물과 관련될 수 있다 통상의 기술자가 본 명세서의 기재를 잠시 본 후, 본 명세서에 개시된 발명은 항체로 "이루어지는" 조성물뿐만 아니라 상기 항체로 "필수적으로 이루어지는" 조성물을 아우르는 것임이 이해될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "대상"은 어떠한 척추(vertebrate) 또는 무척추 (invertebrate) 종의 구성원을 의미한다. 따라서, 실시예에서 "대상"은 동물계(Kingdom Animalia)의 구성원을 포함할 수 있는데, 상기 동물계의 구성원은 척색동물문(예를 들어, 경골어(Osteichythyes, bony fish), 양서류(Amphibia, amphibians), 파충류(Reptilia, reptiles), 조류(Aves, birds), 및 포유류(Mammalia, mammals)의 강(class)의 구성원) 및 이들을 아우르는 모든 목(order) 및 과(family)를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
일 실시예에 따르면 조성물 및 제조방법은 특히 온열 척추동물(warm-blooded vertebrate)에게 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시예들은 포유류 또는 조류와 관련될 수 있다. 보다 상세히는, 멸종위기로 인한 중요성(예를 들어, 시베리안 호랑이), 인간에게 경제적 중요성(인간에게 소비되기 위해 농장에서 사육되는 동물들), 그리고/또는 사회적 중요성(애완동물 또는 동물원에서 사육되는 동물들)을 가진 포유동물뿐 아니라, 인간 또는 다른 영장류와 같은 포유동물로부터 유도되거나, 그리고/또는 이들에게 사용되는 조성물 및 방법이 제공될 수 있다. 상기 포유동물들은 예를 들어, 인간 외의 육식 동물(carnivore, 예를 들어, 고양이 및 개), 돼지(swine)(예를 들어, 피그(pig), 식용돼지(hog), 및 멧돼지(wild boar)), 반추동물(ruminant)(예를 들어, 소(cattle), 황소(ox) 양(sheep), 기린(giraffe), 사슴(deer), 염소(goat), 들소(bison), 및 낙타(camel)), 설치류(rodent)(예를 들어, 마우스, 쥐(rat), 및 토끼(rabbit)), 유대목 동물(marsupial), 그리고 말(horse)일 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 조류에게 사용될 수 있는데, 상기 조류는 가금(fowl), 보다 상세하게, 인간에게 경제적으로 중요하므로 사육되는 가금(예를 들어, 칠면조(turkey), 닭(chicken), 오리(duck), 거위(goose), ?닭(guinea fowl), 및 기타 같은 종류의 가금(poultry))뿐만 아니라, 멸종위기에 처하거나, 동물원에서 사육되는 조류의 종류를 포함한다. 따라서, 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 사육되는 돼지 (피그 및 식용돼지), 반추동물, 말, 가금류, 및 기타 등을 포함하는 가축에게 사용되도록 제공될 수 있다.
유사하게, 본 명세서에 개시된 모든 유전자(gene), 유전자명(gene name), 유전자 산물(gene product)은, 본 명세서에 개시된 조성물 및 그 제조방법을 적용할 수 있는 어떤 종의 동종 그리고/또는 이종에 해당할 수 있다. 따라서, 유전자, 유전자명, 유전자 산물 용어들은 인간 및 마우스로부터 얻은 유전자 및 유전자 산물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정한 종으로부터 얻어진 유전자 및 유전자 산물이 기재되었을 때, 상기 기재는 예시적일 뿐이며, 그것이 명백히 지시하지 않는 한, 제한하여 해석되어서는 안될 것이다. 따라서, 예를 들어, GENBANK®에 접근번호 AAA60019 및 NP_004976로 존재하는 유전자에 대하여, 인간 아미노산 서열(amino acid sequence)은 다른 동물(포유동물, 어류, 양서류, 파충류, 및 조류를 포함하나 이에 한정되지 않음)로부터 얻어진 것과 동종의 유전자 및 유전자 산물을 포함하는 것으로 여겨질 수 있다. 또한, 상기 아미노산 서열을 코딩하는 어떤 및 모든 뉴클레오타이드 서열(nucleotide sequence)이 포함될 수 있다. 상기 인간 아미노산 서열 및 상기 뉴클레오타이드 서열은 상기 GENBANK® 목록(즉, 각각 J05582.1 및 NM_004985)에 해당하는 개시들을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
용어 "암(cancer) 및 "종양(tumer)"은 본 명세서에서 서로 교차가능하게 사용될 수 있고, 유방; 결장(colon); 직장(rectum); 폐(lung); 인두 중앙부(oropharynx); 하인두 (hypopharynx); 식도(esophagus); 위(stomach); 췌장(pancreas); 간(liver); 쓸개(gallbladder); 담관(bile duct); 소장(small intestine); 신장(kidney), 방광(bladder), 및 요로상피(urothelium)를 포함하는 요로(urinary tract); 자궁경관(cervix), 자궁(uterus), 난소(ovaries)를 포함하는 여성 생식기(female genital tract, 예를 들어, 융모암종(choriocarcinoma) 및 임신 영양 질환(gestational trophoblastic disease); 전립선(prostate), 정낭(seminal vesicles), 고환(testis) 및 생식 세포 종양(germ cell tumors)을 포함하는 남성 생식기(male genital tract); 갑상선(thyroid), 신장(adrenal), 및 뇌하수체(pituitary)를 포함하는 내분비선(endocrine glands); 피부(skin, 예를 들어, 혈관종(hemangiomas) 및 흑색종(melanomas)), 뼈(bone) 또는 연조직(soft tissue); 혈관(blood vessel, 예를 들어, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma)); 뇌(brain), 신경 (nerves), 안구(eye), 및 뇌척수막(meninge, 예를 들어, 성상 세포증(astrocytomas), 신경교종들(gliomas), 교아들종(glioblastomas), 병막아종(retinoblastomas), 신경종 (neuromas), 신경아세포종(neuroblastomas), 신경초종(Schwannomas) 및 수막종(meningiomas))을 포함하나 이에 제한되지 않는 대상 내 어떤 조직(tissue)의 1차 및 전이된 고형 종양(solid tumor) 및 암종(carcinoma) 모두를 의미할 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "암" 및 "종양"은 또한 개개의 종양의(neoplastic) 또는 종양발현 전의(pre-neoplastic) 세포뿐만 아니라 다세포의 종양을 의미하는 것으로 여겨질 수 있다. 실시예에서, 암 및 종양은 상피 조직의 암 및 종양을 포함할 수 있는데, 상피성 암(carcinoma)과 같은 예가 있으나 이에 한정되지 않는다. 실시예에서 종양은 선암(adenocarcinoma)일 수 있고, 일 실시예에 따른 종양은 췌장, 유방, 난소, 결장, 또는 직장의 선암 그리고/또는 이들로부터 유도된 전이된 세포(metastatic cell)의 선암일 수 있다.
본 명세서에 사용된 분자에 관한 맥락에서, 용어 "유효 인자(effector)"는 세포에 전달 그리고/또는 국소화되도록 설계된 활성도를 가지는 분자 또는 분자의 조합을 의미할 수 있다. 유효 인자는 라벨, 세포 독소, 효소, 성장 인자(growth factor), 전사 인자(transcription factor), 약물(drug) 등을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용된 면역 시스템 세포에 대한 맥락에 따르면, 용어 "유효 인자(effector)"는 자극에 대한 면역 반응과 관련된 특이적 기능을 수행하도록 도입된 면역 시스템 세포(immune system cell)를 의미할 수 있다. 예시적인 유효인자 세포는 자연 살해 (NK) 세포 및 세포 독성 T세포(cytotoxic T cell, Tc cells)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 "발현 벡터(expression vector)"는 적절한 숙주 세포(host cell)에서 특정 뉴클레오타이드 서열의 발현을 지시할 수 있고, 프로모터(promoter)를 포함할 수 있는 DNA 서열을 의미하는데, 상기 프로모터는 상기 관심있는 뉴클레오타이드 서열과 동작상 연결되고, 상기 뉴클레오타이드 서열은 말단 신호와 동작상 연결된다. 또한 일반적으로, 뉴클레오타이드 서열의 적절한 전사를 위해 요구되는 서열들을 포함할 수 있다. 관심있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 구조는 키메라(chimeric)일 수 있다. 상기 구조는 자연적으로 발생할 수도 있지만, 이형 발현에 유용한 재조합형태(recombinant form)로 얻어질 수도 있다. 실시예에서, 상기 발현 벡터는 고립된 핵산(isolated nucleic acid) 분자를 포함할 수 있는데, 상기 고립된 핵산 분자는 SEQ ID NOs: 4 및 6를 포함하거나, SEQ ID NOs: 5 및 7-13. 중에서 적어도 하나를 코딩할 수 있다. 실시예에서, 핵산 분자는, 상기 발현 벡터를 적절한 숙주에 도입하면 SEQ ID NO: 5, 7~13 중 하나 이상을 포함하는 온전한 재조합 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체가 상기 숙주에 의해 발현되도록, 상기 항체 분자의 부-서열을 인코딩하는 하나 이상의 추가 뉴클레오타이드 서열에 동작상 연결된 발현 벡터 내에 존재할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "혼성 세포(hybridoma)"는 항체-생성 림프구(lymphocyte) 및 비항체-생성 암 세포(일반적으로 골수종(myeloma) 또는 림프종(lymphoma) 세포)의 융합으로부터 실험실에서 생성된 세포 또는 세포주를 의미할 수 있다. 통상의 기술자에게 알려진 바와 같이, 혼성 세포는 특정한 단일클론 항체의 계속적인 공급을 확산 및 생성할 수 있다. 혼성 세포 발생에 관한 방법은 본 기술분야에 알려져 있다. (Harlow & Lane, 1988의 예를 참조하라).
본 명세서에 사용된 "동작상 연결된(operatively linked)" 및 "동작가능하게 연결된(operably linked)"의 용어는, 뉴클레오타이드 서열 전사가 전사 조절(transcriptional regulatory) 요소에 의해 조절 및 제어되는 것과 같은 식으로, 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 코딩된 서열 또는 개방 판독 프레임(open reading frame))과 연결된 전사 조절 요소를 의미할 수 있다. 상기 전사 조절 요소는 프로모터 서열, 전사 종료(transcription terminator) 서열의 예가 있으나, 이에 한정되지 않는다. 마찬가지로, 뉴클레오타이드 서열은 동작상 연결된 프로모터의 "전사 조절(transcriptional control)"을 받는다고 여겨질 수 있다. 프로포터 영역을 뉴클레오타이드 서열에 동작상 연결하는 기술은 본 기술 분야에 알려져 있다.
본 명세서에 사용된 "전구약물(prodrug)"은, 활성화 단계에 놓여질 때까지 시약의 생체 활성이 부족한 약물(예를 들어, 세포독성 시약)의 유사체(analog) 그리고/또는 전구체를 의미할 수 있다. 활성화 단계는 효소 분열(enzymatic cleavage), 환원제에 노출되는 것과 같은 화학적 활성화 단계 그리고/또는 광분해(photolysis)와 같은 물리적 활성화 단계를 포함할 수 있다. 실시예에서, 활성화는 대상의 체내에서 일어날 수 있다.
II . 항체, 및 상기 항체의 단편 및 유도체, 그리고 그들의 제조방법.
II .A. 개략
본 발명은 항체의 단편 및 유도체뿐만 아니라 분리된 항체(isolated antibody)의 실시예들을 제공할 수 있으며, 상기 분리된 항체, 단편, 및 유도체는 종양 내에 존재하는 항원들(MUC1 폴리펩타이드 내에 존재하는 항원들이 그러하나 이에 제한되지 않음)에 결합할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "항체" 및 "항체들"의 용어는 면역글로불린 유전자(immunoglobulin genes) 또는 상기 면역글로불린 유전자의 단편에 의해 주로 코딩되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 단백질을 의미한다. 면역글로불린 유전체는, 다수의 면역글로불린 변이영역 유전체뿐만 아니라 일반적으로 카파(κ), 람다(λ), 알파(α), 감마(γ), 델타(δ), 입실론(ε), 및 뮤(μ) 상수 영역 유전체도 포함할 수 있다. L 사슬은 κ 또는 λ로 분류될 수 있다. 포유동물에서 H사슬은 γ, μ, α, δ, 또는 ε로 분류되며, γ, μ, α, δ, 또는 ε는 차례로 각각 면역글로불린 강 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE을 정의할 수 있다. 다른 종들은 다른 L 및 H 사슬 유전자들을 가질 수 있는데(예를 들어, 어떤 조류가 IgY로 언급되는 것을 생산하는데, IgY는 암탉이 계란의 노른자에 저장하는 면역글로불린 종류이다.), 상기 L 및 H 사슬 유전자들은 본 명세서에 포함된 것과 유사할 수 있다. 일 실시예에 따르면, "항체"라는 용어는, 종양 항원에 존재하는 항원결정기(epitope)와 특이적으로 결합하는 항원을 의미하는데, 상기 종양 항원은 MUC1 폴리펩타이드 그리고/또는 K-ras를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일 실시예에서, 용어 "항체"는 SEQ ID NOs: 1-3 내에 존재하는 항원결정기와 특이적으로 결합하는 항체를 의미할 수 있다.
일반적인 면역글로불린(항체)의 구조적 단위는 사합체(tetramer)로 구성된다고 알려져 있다. 각각의 사합체는 두 개의 동일한 폴리펩타이드 사슬의 쌍을 포함하며, 각각의 쌍은 하나의 "L" 사슬(대략 25킬로달톤(kiloDalton, kDa)의 평균분자량) 및 하나의 "H" 사슬(대략 50 내지 70킬로달톤(kDa)의 평균 분자량)을 가질 수 있다. 상기 폴리펩타이드 사슬의 2개의 동일한 쌍은 상기 H 사슬 영역 내에 존재하는 이황화결합(disulfide bond)에 의하여 이합체(dimer)의 형태로 서로 고정될 수 있다. 각각 사슬의 N-말단은, 일차적으로 항원 인식의 책임이 있는 대략 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 변이 영역을 정의할 수 있다. ("항체결합부(paratope)"로 알려짐) 변이 L 사슬 및 변이 H 사슬은 각각 상기 L 및 H 사슬들을 의미할 수 있다.
항체는 일반적으로 온전한 면역글로불린 또는 다양한 펩티다아제로써 소화되어 만들어지는 다수의 완전히 특성화된 단편으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 파파인(papain) 항체 분자의 소화는 N-말단 위치의 상기 항체를 이황화결합으로 분할하는 것이다. 이는 3 개의 단편들을 만들어 낸다. : 2개의 동일한 "Fab" 단편들 및 "Fc" 단편은 이황화결합에 의해 서로 고정될 수 있다. 2 개의 동일한 "Fab" 단편들은 상기 L 사슬 및 상기 H 사슬의 N 말단을 가질 수 있다. "Fc" 단편은 상기 H 사슬의 상기 C-말단을 포함할 수 있다. 반면에, 펩신(pepsin)은, F(ab)'2"라고 알려진 단편을 만들어내도록, 경첩 영역(hinge region)에서 항체의 C-말단을 이황화결합으로 소화한다. "F(ab)'2"단편은 이황화결합에 의해 연결된 Fab 단편들의 이합체이다. 상기 F(ab)'2 단편은, 온화한 조건에서 경첩영역 내 상기 이황화결합이 깨져 감소될 수 있다. 이에 따라, 상기 F(ab')2 이합체가 2개의 "Fab'" 단량체(monomer)들로 변환될 수 있다. 상기 Fab' 단량체는 본질적으로 상기 경첩 영역의 부분을 가지는 Fab 단편일 수 있다. (다른 항체 단편들에 대한 보다 자세한 설명을 원하면, 폴(Paul), 1993의 예를 보라) 이와 같은 다양한 단편들에 대하여, Fab, F(ab')2, 및 Fab' 단편들은 적어도 하나의 온전한 항원 결합 도메인(항체결합부, paratope)를 포함할 수 있고, 이에 따라 항원들의 결합이 가능할 수 있다.
다양한 항체 단편들이 온전한 항체의 소화의 측면에서 정의되었으나, 통상의 기술자는 이러한 다양한 단편들(Fab'단편들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.)이 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법론에 의해 데노보(denovo) 합성될 수 있다는 것을 알 것이다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 상기 "항체"의 용어는 전체 항체들을 변경하여 생산된 항체 단편들 그리고/또는 재조합 DNA 방법론을 사용하여 데노보 합성된 항체 단편들 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 "항체" 용어는 적어도 하나의 항원 결합 도메인(항체결합부, paratope)을 갖는 단편을 포함할 수 있다.
항체들은 단일클론 또는 다중클론일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "다중클론" 용어는 정해진 항체 집단 내에 함께 존재하는 항체 및 다른 항체 생산 세포(예를 들어, B세포)로부터 유도된 항체를 의미한다. 예시적인 다중클론항체는 특정 항원과 결합하는 항체 및 항원에 대항하여 면역반응을 일으킨 후에 동물 혈액 내에 발견되는 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 그러나, 항체의 다중클론 제조는 적어도 2 개의 다른 항체들을 인공적으로 혼합하여 조제될 수 있다. 이에 따라, 다중클론항체는 일반적으로 다른 항체들을 포함할 수 있는데, 상기 다른 항체들은 어떤 정해진 항원의 동일 그리고/또는 상이한 항원결정기("항원결정인자(antigenic determinant)" 또는 "결정인자(determinant)"로 불림)에 대항하여 유도될 수 있다. (즉 결합될 수 있다)
본 명세서에서 사용된 ""단일클론" 용어는 단일 항체 종 그리고/또는 단일 항체 종의 실질적으로 균질한 집단을 의미할 수 있다. 다른 예로, "단일클론"은 개개의 항체 또는 개개의 항체의 집단을 의미할 수 있는데, 상기 항체는 소수 존재하는 자연적인 돌연변이의 발생을 제외하고는 특이성 및 친화력(affinity)이 동일할 수 있다. 일반적으로, 단일클론 항체(mAb 또는 moAb)는 단일 B세포 또는 그들의 자손 세포(progeny cell)에 의하여 생산될 수 있다. (비록 실시예들이 본 명세서에 기재된 분자생물학적 기술에 의하여 만들어진 "단일클론" 항체를 포함한다고 하더라도) 단일클론 항체(mAb 또는 moAb)는 매우 특이적이며, 일반적으로 단일항원 결합자리에 대항하여 유도될 수 있다. 게다가, 다중클론 항체와 대조적으로, 지정된 mAb는 일반적으로 상기 항원의 단일 항원결정기에 대항하여 유도될 수 있다.
특이성에 덧붙여, mAb는 다른 항체에 의해 오염되지 않고 합성될 수 있는 점에서 유리할 수 있다. 그러나, "단일클론"의 변형은, 어떤 특정한 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 일 실시예에 따른 상기mAb들은 Kohler등에 의해 1975년 처음 발견된 혼성세포(hybridoma) 방법론을 사용하여 제조될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기mAb들은 재조합 DNA법을 사용하여 원핵(prokaryotic) 또는 진핵(eukaryotic) 세포에서 만들어질 수 있다. (참조에 의해 결합된 미국특허등록 US 4,816,567의 전체 내용의 예를 보라) mAb들은 etal ., 1991 및 arks etal ., 1991에 기재된 방법들의 예를 사용하여 파지(phage) 항체 라이브러리(library)로부터 분리될 수 있다.
실시예에 따르면 항체, 단편, 및 유도체는 키메라 항체(chimeric antibody)를 포함할 수 있다. 본 명세서의 항체의 내용과 관련하여 "키메라(chimeric)" 및 그들의 문법적으로 변형된 용어는 상수 영역 및 변수 영역을 가지는 항체 유도체를 의미할 수 있다. 상기 상수 영역은 하나의 종의 항체 상수 영역으로부터 본질적으로 또는 배타적으로 유도될 수 있다. 상기 변수 영역들은 다른 종들의 변수영역의 서열로부터 본질적으로 또는 배타적으로 유도될 수 있다.
상기 변수 영역은, 항체가 항원의 항원결합기를 선택적으로 인식하고, 상기 항원의 항원결합기와 특이적으로 결합하도록 한다. 즉, VL도메인 및 VH 도메인, 또는 이러한 다양한 도메인들 내의 상보성결정영역들(CDRs)의 부분집합(subset), 항체의 부분집합은, 결합하여 상기 변이 영역을 형성하는데, 상기 변이 영역은 3차원 항체 결합 자리를 정의한다. 4차 항체 구조는 상기 항체의 각각의 가지(arm)의 말단에 존재하는 항원 결합 자리를 형성한다. 보다 상세하게, 상기 항원 결합 자리는, 3개의 CDRs에 의해 각각의 상기 VH 및 VL 사슬들에 정의될 수 있다. 예를 들어, 완전한 면역글로불린 분자(카멜리드(camelid) 종으로부터 유도된 특정 면역 글로불린 분자, 또는 카멜리드(camelid) 면역글로불린에 계열의 유전자 조작된 특정 면역글로불린 분자)는 L사슬이 배제된 H 사슬만으로 이루어질 수 있다. (Hamers-Casterman et al ., 1993의 예를 참조하라)
자연적으로 발생하는 항체에서, 각각의 항원 결합 도메인 내에 존재하는 6개의 CDR들이 있는데, 상기 항원 결합 도메인은 짧고 비연속적인 아미노산 서열이다. 항체가 수용액에서 3차원 구조를 가짐에 따라, 상기 아미노산은 상기 항원 결합 도메인을 형성하도록 특이적으로 위치할 수 있다. 상기 항원 결합 도메인 내에 상기 아미노산의 잔여물들은 "프레임(framework)" 영역으로 정의되며, 더 적은 분자간 변이성을 나타낸다. 프레임 영역은 광범위하게 β-시트 구조(β-sheet conformation)를 채택하고, 상기 CDR은 상기 β-시트 구조와 연결되며, 때때로 상기 β-시트 영역의 일부분을 형성한다. 프레임 영역은 뼈대(scaffold)를 형성하는 역할을 할 수 있는데, 상기 뼈대는 사슬간 비공유결합에 의해 상기 CDR들을 올바른 방향에 위치하도록 제공될 수 있다. 상기 위치된 CDR에 의해 형성된 상기 항원 결합 도메인은, 상기 항원결합기에 상보적인 표면을 면역 활성화된 항원에 정의한다. 상기 상보적인 표면은, 항체와 동족인 항원결합기에 대한 항체의 비공유결합을 촉진시킬 수 있다. 상기 CDR 및 상기 프레임 영역 각각을 포함하는 상기 아미노산은, 통상의 기술자에게 용이하게 특정 H 또는 L 사슬 변수 도메인과 동일시될 수 있는데, 종래 알려졌기 때문이다. (Chothia & Lesk, 1987; Kabat et al ., 1991; Martin, 1996; Johnson & Wu, 2000의 예를 참조하라)
키메라 항체의 특정종류는 "인간화(humanized) 항체"이고, 상기 인간화 항체는 인간 항체 CDR을 생산하기 위하여 예를 들어, 마우스의 항체의 CRD의 치환에 의해 만들어질 수 있다. (PCT 국제 출원번호 WO 1992/22653의 예를 참조하라) 따라서, 실시예에 따른 인간 항체는, CDR외에 상수 영역 및 변이 영역을 가질 수 있는데, 상기 CRD은 인간 항체에 대응되는 영역으로부터 본질적으로 또는 배타적으로 유도된 CDR 및 인간 외에 동물로부터 본질적으로 또는 배타적으로 유도된 CDR이다.
본 명세서에 개시된 상기 항체, 단편, 및 유도체는 단일 사슬 항체 및 단일 사슬 항체 단편일 수 있다. 단일 사슬 항체 단편은 적어도 하나의 변수 영역 그리고/또는 온전한 항체의 CDR을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 항체의 상수 도메인의 일부 또는 전부가 결핍될 수 있다. 상수 도메인은 항원 결합에 필수적이지 않으나, 온전한 항체의 상기 구조의 중요한 부분을 구성할 수 있다.
단일 사슬 항체 단편은 상수 도메인의 부분 또는 전부를 포함하는 항체의 사용과 관련된 몇몇 문제들을 극복할 수 있다. 예를 들어, 단일 사슬 항체 단편은 생물 분자 및 상기 H 사슬 상수 영역 사이의 원하지 않는 상호작용, 그리고/또는 다른 원하지 않는 생물학적 활동(biological activity)으로부터 자유로운 경향이 있다. 게다가, 단일 사슬 항체 단편은 온전한 항체보다 상당히 더 작을 수 있어, 온전한 항체보다 더 큰 모세관 투과성(capillary permeability)에 의해 특성화될 수 있고, 단일 사슬 항체 단편을 더 효과적으로 국소화시키고 표적 항원 결합 자리에 결합시킬 수 있다. 또한, 항체 단편은 원핵세포(prokaryotic cell)에서 비교적 대규모로 생산될 수 있어, 그들의 생산이 촉진될 수 있다. 게다가, 상기 단일 사슬 단편의 상대적으로 작은 크기는, 온전한 항체보다 수용부위에서 면역 반응을 덜 자극하도록 한다. 일 실시예에 따른 단일 사슬 항체 단편은 단일 사슬 단편 변이(scFv) 항체 및 그들의 유도체(탄뎀 디-scFv (tandem di-scFv), 탄뎀 트리-scFv(tandem tri-scFv), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라아바디(tetrabody), 미니안티바디(miniantibody), 및 미니바디(minibody)의 예가 있으나, 이에 제한되지 않음)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
Fv 단편은 면역글로불린 H 및 L 사슬들의 N말단에서 변이 단편(variable fragment)에 해당한다. Fv 단편은, Fab 단편보다 그들의 두 사슬 간의 낮은 상호작용 에너지를 가지는 것으로 여겨진다. 상기 VH 및 VL 도메인들 간에 연합(association)을 안정화시키기 위하여, 그들은 펩타이드(peptide, Bird etal ., 1988; Huston etal ., 1988의 예를 참조하라), 이황화 결합(disulfide bridge, Glockshuber etal ., 1990의 예를 참조하라) 그리고/또는 "구멍에서 마디(knob in hole)" 변이(Zhu etal., 1997의 예를 참조하라)에 의해 결합될 수 있다. ScFv단편은 통상의 기술자에게 널리 알려진 방법에 의해 생산될 수 있다.(Whitlow etal .,1991; Huston etal .,1993의 예를 참조하라)
scFv는 대장균(E. coli)과 같은 박테리아 세포에서 또는 진핵세포(eukaryotic cell)에서 생산될 수 있다. scFv의 잠재적인 약점은 산물의 1가(monovalency) 및 그들의 짧은 반감기인데, 산물의 1가는 다가 결합(polyvalent binding)으로 인해 결합활성이 증가되는 것을 불가능하게 할 수 있다. 이러한 문제들을 극복하기 위한 시도는, 추가의 C-말단 시스테인(cysteine)을 포함하는 scFv로부터 화학적 커플링(chemical coupling coupling)에 의해 또는 짝짓지 않은 C-말단시스테인 잔기(residue)를 포함하는 scFv의 자발적인 자리 특이 이합체화(site-specific dimerization)에 의해 생산된 2가(bivalent)의 (scFv')2 를 포함한다. (상기 화학적 커플링에 의한 경우는 Adams etal ., 1993; McCartney etal ., 1995의 예를, 상기 자리 특이 이합체화에 의한 경우는 Kipriyanov etal .,1995의 예를 참조하라)
대안적으로, 펩타이드 결합이 "디아바디들(diabodies)"을 형성하기 위해 3 내지 12 잔기로 짧아짐에 의해, scFv는 다합체를 형성하도록 강요받을 수 있다.(Holliger etal ., 1993의 예를 참조하라) 결합을 더 감소시키는 것은, scFv 삼합체들(trimera, triabodies) 및 사합체들(tetramers, tetrabodies)을 야기할 수 있다.(삼합체에 관하여는 Kortt etal .,1997을, 사합체에 관하여는 Le Gall etal .,1999를 참조하라) 2가 scFv분자의 구조는 "미니안티바디들(miniantibodies.,Pack etal .,1992의 예를 참조하라)" 및 "미니바디들(minibodies, Hu etal .,1996의 예를 참조하라)"을 형성하도록 단백질 이합체화 모티프(motif)를 사용한 유전적인 혼합에 의해 이루어질 수 있다. scFv-scFv 탄뎀(scFv-scFv tandem, (scFv)2)은 2 개의 scFc 유닛을 3차 펩타이드 결합에 의해 연결함으로써 생산될 수 있다.(Kurucz etal .,1995을 참조하라).
양특이성 디아바디(diabody)는 두 개의 단일 사슬 혼합 생산물의 비공유결합을 통하여 만들어질 수 있다. 상기 단일 사슬 혼합 생산물은, 하나의 항체로부터 짧은 결합에 의해 다른 항체의 VL도메인에 연결된 VH도메인을 포함할 수 있다. (Kipriyanov etal ., 1998의 예를 참조하라). 양특이성 디아바디의 안정성은 앞서 설명한 이황화결합 또는 "구멍 내의 마디(knob in hole)" 변이의 단일 사슬의 도입에 의해 또는 단일 사슬 diabodies (scDb)의 형성에 의해 증대될 수 있다. 2개의 혼합 scFv 단편은 펩타이드 결합을 통하여 연결될 수 있다. (Kontermann etal ., 1999의 예를 참조).
4가 양특이성 분자는 일 예로, scFv 단편을 IgG 분자의 CH3도메인과 또는 Fab단편과 경첩영역을 통해 혼합(fusing)시켜 생산될 수 있다.(Coloma etal ., 1997의 예를 참조하라). 다른 예로, 4가 양특이성 분자는 양특이성 단일 사슬 다아바디의 혼합에 의해 만들어질 수 있다.(Alt etal., 1999의 예를 참조하라) 더 작은 4가 양특이성 분자는 scFv-scFv 탄뎀(tandem) 또는 단일 사슬 분자 중의 어느 하나의 이합체화에 의해 형성될 수 있다. 상기 scFv-scFv 탄뎀은 나선-고리-나선(helix-loop-helix) 계열(DiBi miniantibodies, Muller etal ., 1998의 예를 참조하라)을 포함하는 결합을 가질 수 있다. 상기 단일 사슬 분자는 분자 내 짝지음을 방지하는 방향으로 4 개의 변이 도메인들((VH 및 VL)을 포함할 수 있다.
양특이성 단편은 Fab' 단편의 화학적 커플링에 의해 또는 루신 지퍼(leucine zipper)를 통한 헤테로이합체화(heterodimerization)에 의해 만들어질 수 있다.(Shalaby etal ., 1992; Kostelny etal .,1992의 예를 참조하라) 또한 분리된 VH 및 VL 도메인들에도 적용될 수 있다.(미국 등록 특허 6,172,197; 6,248,516; 및 6,291,158의 예를 참조하라)
실시예에 따르면, 본 발명은 항체의 기능상의 동일성을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "기능상 동일(functional equivalent)"은. 항체에 관하여 언급할 때, 특정 항체와 비슷한 결합 특성을 가진 분자를 의미할 수 있다. 일 실시예에서, 키메라, 인간화, 및 단일 사슬 항체, 그리고 상기 항체들의 단편은 대응되는 항체에 기능상 동일하다고 여겨질 수 있는데, 상기 항체는 키메라, 인간화, 및 단일 사슬 항체, 그리고 상기 항체들의 단편이 기반한 것이다. 실시예에 따르면 본 발명은, 본 명세서에 기재된 TAB-004 mAb에 관한 기능상의 동일성을 제공한다.
기능상 동일은 본 명세서에 개시된 항체의 변이 또는 고변이 영역의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 핵산 그리고/또는 아미노산 서열에 관하여, "실질적으로 동일한"의 구절은 다른 핵산 그리고/또는 아미노산 서열과 일 실시예에서 적어도 80%, 다른 실시예에서 적어도 85%, 다른 실시예에서 적어도 90%, 다른 실시예에서 적어도 91%, 다른 실시예에서 적어도 92%, 다른 실시예에서 적어도 93%, 다른 실시예에서 적어도 84%, 다른 실시예에서 적어도 95%, 다른 실시예에서 적어도 96%, 다른 실시예에서 적어도 96, 다른 실시예에서 적어도 97, 다른 실시예에서 적어도 98%, 및 다른 실시예에서 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 바이오 서열을 의미할 수 있다. 상기 서열 동일성은 Pearson &Lipman, 1988에 따른 FASTA 조사 방법에 의해 결정될 수 있다. 실시예에 따르면 상기 퍼센트 동일성 계산은 본 명세서에 기재된 항체의 핵산 그리고/또는 아미노산 서열의 전체 길이에 대하여 수행될 수 있다.
실시예에 의하면, 뉴클레오타이드(nucleotide) 서열의 기능상 동일은 같은 아미노산 서열을 코팅하는 것일 수 있다 뉴클레오타이드(nucleotide) 서열의 기능상 동일은 같은 아미노산 서열을 코팅하는 서열일 수 있다.(즉, 하나 또는 그 이상의 기능적으로 동일한 코돈을 포함할 수 있다) 기능적으로 동일한 코돈의 목록은 표 1에 나타나있다.
기능상으로 동일한 코돈들
아미노산 코돈들
알라닌 (Alanine, Ala or A) GCA; GCC; GCG; GCU
시스테인(Cysteine, Cys or C) UGC; UGU
아스파트산(Aspartic Acid, Asp or D) GAC; GAU
글루탐산(Glumatic acid, Glu or E) GAA; GAG
페닐알라닌(Phenylalanine, Phe or F) UUC; UUU
글리신(Glycine, Gly or G) GGA; GGC; GGG; GGU
히스티딘(Histidine, His or H) CAC; CAU
이소루신(Isoleucine, Ile or I) AUA; AUC; AUU
라이신(Lysine, Lys or K) AAA; AAG
메타오닌(Methionine, Met or M) AUG
아스파라긴(Asparagine, Asn or N) AAC; AAU
프롤린(Proline, Pro or P) CCA; CCC; CCG; CCU
글루타민(Glutamine, Gln or Q) CAA; CAG
트레오닌(Threonine, Thr or T) ACA; ACC; ACG; ACU
발린(Valine, Val or V) GUA; GUC; GUG; GUU
트립토판(Tryptophan, Trp or W) UGG
티로신(Tyrosine, Tyr or Y) UAC; UAU
루신(Leucine, Leu or L) UUA; UUG; CUA; CUC; CUG; CUU
아르기닌(Arginine, Arg or R) AGA; AGG; CGA; CGC; CGG; CGU
세린(Serine, Ser or S) ACG; AGU; UCA; UCC; UCG; UCU
실시예에 따르면, 특정 아미노산 서열의 기능상 동일은 하나 또는 그 이상의 보존상(conservative) 아미노산 치환을 갖는 아미노산을 의미한다. 보존상 아미노산 치환은 동일한 클래스의 아마노산에 대한 다른 아미노산의 치환을 의미한다.(예를 들어, 글리신을 발린으로, 또는 라이신을 아르기닌으로) 프로로구아닌(prouroguanylin) 그리고/또는 프로로구아닌(prouroguanylin) 단편과 기능적으로 동일한 폴리펩타이드는, 무작위 돌연변이(random mutagenesis)를 사용하여 코딩된 핵산에 통상의 기술자에게 널리 알려진 기술에 의해 만들어질 수 있다. 그러나, 상기 폴리펩타이드는 (통상의 기술자에게 널리 알려진 기술을 사용한) 자리-지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)에 의해 생성될 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 증가된 기능성 또는 감소된 기능성을 가질 수 있다.
기능상 동일은, 온전한 항체의 결합 특성과 동일 또는 유사한 결합 특성을 갖는 항체의 단편을 포함할 수 있다. 상기 단편은 하나 또는 두 개의 Fab 단편, F(ab')2 단편, F(ab')단편, Fv 단편, 또는 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함하는 단편을 포함할 수 있다. 실시예에서, 항체 단편은 온전한 항체의 6 개의 CDR 모두를 포함하는데(예를 들어, 각각 SEQ ID NOs: 8-13를 포함하는 CDR을 포함할 수 있다), 비록 상기 영역들의 전부보다 더 적게 포함하는 단편(예를 들어, 3 개, 4 개 또는 5개의 CDR)이 본 명세서에 개시된 항체 단편과 기능적으로 동일하다 하더라도 마찬가지이다. 게다가, 기능상 동일은 다음의 면역글로불린 클래스: IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE, 및 부클래스(중에 어느 하나의 구성원일 수 있고, 또는 어느 하나의 구성원과 결합할 수 있다. 상기 부클래스는 비포유류 대상에게 적절할 수 있는 다른 부클래스(예를 들어, 닭 및 다른 조류 종의 lgY) 뿐만 아니라 상기 면역 글로불린 클래스의 부클래스일 수 있다.
기능상 동일은 앱타머(aptamer) 및 다른 비항체 분자(본 명세서에 개시된 온전한 항체와 동일 또는 유사한 결합특성을 가지는 분자인 경우)를 포함할 수 있다.
실시예에 따르면, 상기 항체, 단편, 및 유도체는, 키메라 항체, 또는 키메라 항체의 단편, 또는 키메라 항체의 유도체, 인간항체, 또는 인간항체의 단편, 또는 인간항체의 유도체, 단일 사슬 항체, 또는 단일 사슬 항체의 단편 또는 단일 사슬 항체의 유도체, 이들의Fab 단편, 이들의F(ab')2 단편, 이들의Fv단편, 및 이들의Fab'단편 뿐만 아니라, 혼성세포주 ATCC 번호 PTA-11550에 의해 생산된 단일 클론 항체 TAB-004로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다. 실시예에서, 본 명세서에 개시된 항체, 상기 항체의 단편, 및 유도체는 단일 클론 항체 TAB-004에 대한 결합 특성을 가질 수 있다. 항체, 단편, 및 유도체는, 단일 클론 항체 TAB-004에 대한 결합특성의 최소한 조금 및 어떤 경우에는 전부를 가질 수 있다. 실시예에서, 본 명세서에 개시된 항체, 상기 항체의 단편, 및 유도체는 SEQ ID NO: 1-3내에 존재하는 항원결정기와 결합할 수 있고, 일 실시예에 따른 항원결정기는 SEQ ID NO: 3 내에 존재할 수 있다.
본 명세서에 기재된 "TAB-004" 용어는" TAB-004"로 지정된 혼성세포주에 의해 생산된 mAb를 의미하는데, mAb는 부다페스트 조약의 조건에 따라 미합중국, 20110-2209버지니아주 머네서스(Manassas) Boulevard대학 10801, ATCC(American Type Culture Collection)에 접근 번호 PTA-11550로 2010년 12월 16일 기탁되었다. TAB-004는 인간의 뮤신-1(mucin-1, MUC1) 폴리펩타이드에 존재하는 항원결정기에 결합하는 것으로 알려진 lgG 동형(isotype)의 mAb일 수 있다. 상술된 살시예에서, TAB-004는 SEQ ID NO: 3 내에 존재하는 항원결정기에 결합할 수 있다. TAB-004 는 SEQ ID NOs. 8-13 내에 개시된 CDR서열을 구성할 수 있다.
본 명세서에 개시된 ""MUC1"의 용어는 아래와 같이 정의된 분자를 의미한다. MUC1은 분자의 상피 뮤신 군(epithelial mucin family) 중의 하나이다. MUC1은 다수의 상피 암(epithelial cancer)에서 널리 발현될 수 있고, 비정상적으로 당화(glycosylate)되어 비악성(non-malignant) 세포에 의해 발현된 것과 구조적 및 항원적으로 구별될 수 있다.(Barratt-Boyes, 1996; Price etal., 1998; Peterson etal., 1991의 예를 참조하라) MUC1의 지배적인 형태는 다수의 20개의 아마노산 탄뎀 반복, 막 영역(transmembrane region), 및 세포질 꼬리(cytoplasmic tail)를 가진 고 면역원(immunogenic) 세포 외(extracellular) 뮤신과 같은 도메인으로 구성된 고분자량의 분자이다.(Quin etal., 2000; McGucken etal., 1995; Dong etal., 1997).
MUC1은 유방 및 췌장을 포함한 대부분의 상피 샘암종(adenocarcinoma) 내에서 과발현되고 비정상적으로 당화될 수 있다. 상기 유방 및 췌장의 샘암종은 MUC1을 과발현시킬 뿐만 아니라, MUC1을 순환에 배출시킬 수 있다. 높은 MUC1혈청(serum) 수치는 진행성 질환(progressive disease)과 관련이 있다. 항원 내에서 발현되는 항원결정기의 복합 또는 이형 성질 때문에, MUC1은 전향 바이오마커(prospective biomarker)로써 활용되어 왔다. 암 세포에 의해 합성된 MUC1는, 비정상적인 올리고당류 프로필(oligosaccharide profile)을 대개 나타낸다. 비정상적인 올리고당류 프로필은 Tn과 같은 잠재 항원결정기 뿐만 아니라 sialyl-Lea(CA19-9 실험에서 분석됨), sialyl-Lex, 및sialyl-Tn(TAG-72)와 같은 네오마커(neomarker)의 발현을 일으킨다.
게다가, 저당화(underglycosylation) 때문에, 뮤신의 펩타이드 코어(core)는 노출될 수 있는데, 상기 정상 조직-유도된 MUC1 이 접근하지 못하는 코어 내에 있는 항원결정기는 잠재적인 바이오마커의 역할을 할 수 있다. 따라서, 정상 대 악성 조직의 차이는, 악성 조직에 대하여 더 높은 특이성을 보이는 서로 구별되는 항원결정기를 제공할 있다. 상기 항원 결정기에 대한 몇몇 실험은 환자관리용으로 사용할 수 있는데, CA15-3 (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinoise, United States of America), CA 27-29 (Bayer Diagnostics, Tarrytown, New York, United States of America), 및 CA19-9 (Panomics Inc, Redwood City, California, United States of America)를 포함한다. 따라서, 아무도 표2에 나타난 것과 같은 특정한 진단값(diagnostic value)을 증명하지 못하였는데, 낮은 특이성에 적어도 일부 기인했기 때문이다.
변이 조직에서 MUC1 의 과발현을 평가하기 위해 사용된 측정*
측정 MUC1이 과발현되는 곳의 암 MUC1이 과발현되는 곳에서 암이 아닌 조건
CA 15-5 유방, 페, 난소, 자궁(endometrial), 방광, 췌장, 위장(gastrointestinal) 간질환(경화(cirrohosis), 간염(hepatitis)), 루푸스(lupus) 사르코이드(sarcoid), 결핵(tuberculosis), 암이 아닌 유방병변(non-cancerous breast lesions)
CA 19-9 췌장, 결장직장(colorectal), 간, 위장 및 담도계(stomach and biliary tree) 암들 췌장염(pancreatitis), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 쓸개관의 염증 또는 막힘(inflammation or blockage of the bile duct)
CA 27-29 유방, 결장(colon), 위(gastric), 간, 폐, 췌장, 난소, 전립선(prostate) 암들 난소 낭(ovarian cysts), 간 및 신장 장애(liver and kidney disorders), 암이 아닌 유방 문제
* Perkins et al., 3002으로부터 각색됨
최근, PAM4로 알려진 또 다른 MUC1 항체는 췌장에 대한 높은 선택성 및 특이성으로 인해, 췌장암에 사용되는 것이 주목받고 있다. 그러나 유방 및 난소암과 같은 다른 상피 암의 경우는 아니다. (Gold et al., 2007).
정상 상피 조직에서, MUC1은 상기 세포들의 꼭대기 영역(apical region)에 국소화된다. 악성형질변환(Malignant transformation)은 유전자 증폭(gene amplification) 그리고/또는 증가된 전사활성화(transcriptional activation)에 의해 MUC1의 상향조절(upregulation)의 결과를 가져오며, 세포 표면에서 MUC1의 분산은 더 이상 상기 꼭대기 영역에 한정되지 않는다.(Bieche & Lidereau, 1997). MUC1의 작용이 정화(clarification)를 기다리는 동안에, MUC1의 높은 세포질 발현(cytoplasmic expression)은 유방 그리고/또는 난소 암을 갖는 환자들의 낮은 예후와 관련되어 있다.
MUC1은 세포 부착(cell adhesion), 세포 신호(cell signaling), 및 면역 반응에서 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었다.(Quin etal., 2000; McGucken etal., 1995; Dong etal., 1997; Henderson etal., 1998). 인간으로부터 얻어진 MUC1유전자 산물에 대한 아미노산 서열의 비제한적인 예는 SEQ ID NO: 1 에 존재한다. 다른 종들로부터 생산된 MUC1 유전자의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 GENBANK® 접근 번호 AAA39755, Q02496, 및 NP_038633(마우스), NP_036734(쥐(rat)), NP_001181906 (개), AAO63589 (돼지), and NP_776540(소)을 포함할 수 있다.
덧붙여, TAB-004가 K-ras 폴리펩타이드, 그리고 특히 돌연변이(mutant) K-ras 폴리펩타이드와 결합하는 것이 알려져 있다. 본 명세서에 사용된 "K-ras" 용어는 종양원(oncogene) 유전자 및 그들의 유전자 산물을 의미할 수 있다.(Kahn etal., 1987의 예를 참조하라). 예시적인 K-ras 유전자 산물은, 본 명세서에 SEQ ID NO: 2로 개시된 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 인간 K-ras 유전자 산물일 수 있다. 상기 SEQ ID NO: 2는 GENBANK® 의 접근 번호 NP_004976에 해당한다.
본 명세서에 사용된 ""K-ras"는 K-ras의 돌연변이 형태를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "돌연변이 K-ras(mutated K-ras)", "돌연변이 K-ras 폴리펩타이드(mutant K-ras polypeptide)", 및 "돌연변이 K-ras 단백질(mutant K-ras protein)"은, K-ras 폴리펩타이드를 언급하는 것과 호환하여 사용가능하며, 상기 K-ras 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2와 비교하여, 적어도 하나의 K-ras 돌연변이를 포함할 수 있다. 실시예에서 돌연변이 K-ras 폴리펩타이드는 성숙한 폴리펩타이드(mature polypeptide)의 아미노산 번호 12 또는 13 중에서 어느 하나에 돌연변이를 포함할 수 있다.(즉, 성숙한 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 1번 위치에 메타오닌(methionine) 잔기를 포함하지 않기 때문에, SEQ ID NO: 2 의 아미노산 위치 13 또는 14) 실시예에 따른 돌연변이 K-ras 폴리펩타이드는, 글리신-12(glycine-12)부터 세린(serin)까지 돌연변이(이하, "G12S"라 한다), G12V, G12D, G12A, G12C, G13A, 및 G13D 중에서 선택된 돌연변이를 포함할 수 있다. 항체가 일부분 결합한 돌연변이 K-rasG12D 폴리펩타이드의 대표적인 예가 SEQ ID NO: 2에 나타나 있으며, Kahnetal ., 1987.에 기재되어 있다. 일 실시예에 따른 항체, 상기 항체의 단편, 및 유도체는 K-ras 폴리펩타이드의 부분과 결합하는데, 상기 K-ras 폴리펩타이드는 G12D 돌연변이를 포함한다.(이하, "돌연변이 K-ras G12D" 또는 "K-rasG12D라 한다) 추가의 예시적인 돌연변이 K-ras 는 대립 형질 변이(allelic variant), 스플라이스 변이(splice variant), 유도된 변이(derivative variant), 치환 변이(substitution variant), 결손 변이(deletion variant), 삽입 변이(insertion variant), 융합 폴리펩타이드(fusion polypeptide), 이종(ortholog), 및 종간 동족체(interspecies homolog)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 실시예에서, 돌연변이 K-ras 폴리펩타이드는 C- 또는 N-말단에 하나 또는 그 이상의 추가적인 잔기를 포함할 수 있다. 상기 추가적인 잔기는 선도 서열 잔기(leader sequence residue), 표적 잔기(targeting residue), 아미노 말단 메타오닌 잔기(amino terminal methionine residue), 라이신 잔기(lysine residue), 표지 잔기(tag residue), 그리고/또는 융합 단백질 잔기(fusion protein residue)의 예와 같으나, 이에 제한되지 않는다.
II .B. 본 발명의 실시예에 따른 항체, 상기 항체의 단편, 그리고/또는 유도체를 포함하는 조성물
본 발명은 실시예들에 따른 항체, 상기 항체의 단편, 그리고/또는 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다. 실시예에 따른 예시적인 조성물의 도식화된 설명 및 예시적인 사용이 도 6에서 제공된다.
일 실시예에 따른 조성물은 본 명세서에 개시된 항체, 상기 항체의 단편, 그리고/또는 이들의 유도체를 포함하며, 하나 또는 그 이상의 약리학적으로 허용 가능한 담체(carrier) 그리고/또는 부형제(excipient)를 포함할 수 있다. 실시예에서, 상기 허용가능한 담체 그리고/또는 첨가제는 인간에의 사용이 약리학적으로 허용가능할 수 있다. 적절한 제형(formulation)은 목표한 수용체(recipient)의 체액(bodily fluids)과 등장성인(isotonic) 제형을 만들어내는 항산화제(anti-oxidant), 버퍼(buffer), 제균제(bacteriostat), 살균 항생제(bactericidal antibiotics), 및 용질(solute)을 포함하는 수용성 및 비수용성 무균 주입(sterile injection) 용액; 및 현탁용제(suspending agent) 및 증점제(thickening agent)를 포함하는 수용성 및 비수용성 무균 주입 서스펜션(suspension)을 포함할 수 있다. 상기 제형은 유닛 투여 또는 다중 투여 용기, 예를 들어, 봉인된 앰플 및 바이엘 내에 존재할 수 있다. 그리고, 상기 제형은 무균 액체 담체, 예를 들어 주입용 물을 사용하기 전에 즉각적으로 첨가하는 것이 요구되는, 냉동 또는 냉동-건조(동결건조된(lyophilized))된 조건에서 저장될 수 있다. 몇몇 예시적인 성분(ingredient)은 일 실시예에서 0.1 내지 10 mg/ml의 범위의, 다른 실시예에서는 대략 2.0 mg/ml 범위의 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS); 그리고/또는 일 실시예에서 10 내지 100 mg/ml 범위의, 다른 실시예에서 대략 30 mg/ml 범위의 만니톨(mannitol), 또는 다른 당류; 그리고/또는 인산염완충 식염수(phosphate-buffered saline, PBS)일 수 있다. 논의되는 제형 타입을 유념한다면, 본 기술분야의 종래 다른 어떤 시약이 사용될 수 있다.
실시예에 따른 조성물은 활성 약물(active agent)을 포함할 수 있는데, 상기 활성 약물은 요법 모이어티(therapeutic moiety), 진단 모이어티(diagnostic moiety), 그리고/또는 생체 활성 모이어티(biologically active moiety)를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "활성 약물"의 구절은 본 명세서에 개시된 조성물의 성분(component)를 의미할 수 있다. 상기 조성물은, 대상에 요법 이익(therapeutic benefit)을 제공하고; 상기 조성물이 축적되는 세포 또는 조직의 가시화, 및 항체, 단편 및 이들의 유도체가 결합하는 항원결정기의 발견을 가능하게 하고; 그리고/또는 활성을 증대시킬 수 있다. 실시예에 따른 활성 약물은 방사선 분자(radioactive molecule, 방사성핵종(radionuclide) 및 방사선 동위원소(radioisotope)를 포함하나 이에 제한되지 않음), 증감제 분자(sensitizer molecule) 영상 시약(imaging agent), 또는 다른 측정 시약, 독소(toxin), 세포독소(cytotoxin), 항혈관생성제(anti-angiogenic agent), 항종양제(anti-tumor agent), 화학요법제(chemotherapeutic agent), 면역조절제(immunomodulator), 사이토카인(cytokine), 리포터 그룹(reporter group) 및 이들의 조합으로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다. 이러한 범주는 상호 배타적인 의도가 아니다. 예를 들어, 어떤 방사선 분자는 또한 화학 요법제이고, 어떤 면역조절제가 사이토카인(cytokine)인 것 등과 같다.
실시예에서, 활성 약물은 화학 요법제(chemotherapeutic)일 수 있다. 다양한 화학요법제들이 본 발명의 통상의 기술자에게 알려져 있고 질소 머스터드(nitrogen mustard, 예를 들어, 클로로람부실(Chlorambucil), 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide), 이소파미드(isofamide), 메클로레타민(mechlorethamine), 멜파란(elphalan), 유레실 머스터드(uracil mustard)), 아지리딘(aziridine, 예를 들어 티오테파(Thiotepa)), 메탄설포네이트 에스테르(methanesulfonate ester, 예를 들어, 부설판(busulfan)), 니트로소 우레아(nitroso ureas, 예를 들어, 칼무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin)), 백금 복합체(platinum complexes, 예를 들어, 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin)), 및 생체환원 알킬레이터(bioreductive alkylators, 예를 들어, 미토마이신 C(mitomycin C), 프로카르바진(procarbazine))과 같은 알킬화제(alkylating agent); DNA 서열 절단 약물 (DNA strand breaking agents, 예를 들어, 블레오마이신(Bleomycin)); DNA 토포아이소머라아제 I 저해제(DNA topoisomerase I inhibitors, 예를 들어, 캠토테신(camptothecin) 및 이를 포함하는 유도체, 그러나 10-하이드록시캠토테신(10-hydroxycamptothecin)에 한정되지 않음), DNA 토포아이소머라아제 II 저해제(DNA topoisomerase II inhibitor, 예를 들어, 암사크린(amsacrine), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 아이다루비신(idarubicin), 미톡산트론(mitoxantrone), 에토포시드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 포도필로톡신(Podophyllotoxin)); DNA 마이너 그루브 결합체(DNA minor groove binder, 예를 들어, 플리카마이신 (plicamycin); 엽산 길항제(folate antagonist, 예를 들어, 메토트렉사트(methotrexate) 및 트리메트렉사트(trimetrexate)), 피리미딘 길항제(pyrimidine antagonist, 예를 들어, 플루오르우라실(fluorouracil), 플루오르데옥시우리딘(fluorodeoxyuridine), CB3717, 아자시티딘(azacytidine), 사이타라빈(cytarabine), 플록스우리딘(floxuridine)), 퓨린 길항제(purine antagonist, 예를 들어, 메르캅토퓨린(mercaptopurine), 6-티오구아닌(6-thioguanine), 플루다라빈(fludarabine), 펜토스테틴(pentostatin)), 당 변형 유사체들(ugar modified analogs, 예를 들어, 사이르아빈(cyctrabine), 플루다라빈(fludarabine)), 및 리보누클레오타이드 환원표소 저해제(ribonucleotide reductase inhibitor, 예를 들어, 이드록시우레아(hydroxyurea))와 같은 대사길항물질(anti-metabolite); 튜불린 상호작용 시약(tubulin interactive agent, 예를 들어, 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 파클리탁셀(paclitaxel)); 부신 피질 스테로이드(adrenal corticosteroid, 예를 들어, 프레드니손(prednisone), 덱사메사손(dexamethasone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 프레드니솔론(prednisolone); 에스트로겐(estrogen) 및 관련된 화합물들(예를 들어, 에티닐 에스트라디올(ethinyl estradiol), 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbesterol), 클로로트리아니센(chlorotrianisene), 이데네스트롤(idenestrol)), 프로게스틴(progestin, 예를 들어, 하이드록시프로게스테론 카프론산염(hydroxyprogesterone caproate), 메드록시프로게스테론(medroxyprogesterone), 메게스트롤(megestrol)), 안드로젠(androgen, 예를 들어, 테스토스테론(testosterone), 테스토스테론 프로피오네이트(testosterone propionate)), 플루옥시메스테론(fluoxymesterone), 메틸테스토스테론(methyltestosterone)), 루틴화 호르몬 자극호르몬제(leutinizing hormone releasing hormone agent) 그리고/또는 성선 자극 호르몬 길항제(gonadotropin-releasing hormone antagonist, 예를 들어, 류프로라이드 아세테이트(leuprolide acetate), 고세렐린 아세테이트(goserelin acetate)), 항에스트로겐제(anti-estrogenic agent, 예를 들어, 타모시펜(tamoxifen)), 항안드로겐제(anti-androgen agent, 예를 들어, 플루타미드(flutamide)), 및 항부신제(anti-adrenal agent, 예를 들어, 미토탄 (mitotane), 아미노글루테티미드(aminoglutethimide))와 같은 호르몬 차단제(hormonal blocking agent) 를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 다른 화학 요법제는 택솔(taxol), 레티노산(retinoic acid) 및 상기 레티노산의 유도체(예를 들어, 13-시스-레티노산(13-cis-retinoic acid), 모든 트렌스 레티노산(all-trans-retinoic acid), 및 9-시스 레티노산(9-cis-retinoic acid)), 솔파디아졸(sulfathiazole), 미토마이신 C(cmitomycin C), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 설파디에톡산(sulfadiethoxane), 그리고 겜시타빈(gemcitabine, 4-아미노-1-(2-데옥시2-,2-디플루오르-β-D-erythro -펜토퓨라노실)피리미딘-2(1H)-on-2′,2′-디플루오르-2′-데옥시사이티딘(4-amino-1-(2-deoxy-2,2-difluoro-β-D-erythro-pentofuranosyl)pyrimidin-2(1H)-on-2′,2′-difluoro-2′-deoxycytidine)을 포함할 수 있으나, 이제 한정되지 않는다.
실시예에서, 활성 약물은 항-혈관생성 약물(anti-angiogenic agent)을 포함할 수 있다. 다양한 항-혈관생성 약물을 본 발명의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고, 혈관상피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)군 및 이들의 수용체(예를 들어, 증식당뇨망막병증(bevacizumab) 및 다른 항-혈관상피세포 성장인자(VEGF) 항체)의 저해제, 그리고/또는 길항제 그리고 뉴로클로필린-1 길항제를 포함하나, 이제 제한되지 않는다.
실시예에 따르면, 상기 조성물은 추가적인 보조제(adjuvant) 그리고/또는 면역조절제(immunomodulator)와 함께 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "면역 조절 약제(immune modulating agent)" 및 "면역제어 약제(immunomodulating agent)"의 용어는 면역 반응을 조절하는 분자를 의미할 수 있다. 예시적인 면역조절제(immunomodulator)는 사이토카인(cytokine, 사이토카인 IFN-a, IFN-g, IL-2, IL-4, IL-6, TNF, 및 면역세포에 영향을 주는 다른 사이토카인을 포함하나, 이에 제한되지 않음), CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(CpG ODN)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 예시적인 면역조절제는 수지상 세포 활성화제(dendritic cell activator, Rothenfusser etal ., 2002의 예를 참조)로서 기능을 하고, 표 3에서 상세히 기술된다.
예시적인 면역조절제*
표적 조절
인돌아민 2, 3-이산소화효소
(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)		 1MT; MTH-Trp
아르기나아제(arginase, ARG) ABH; BEC
유도된 이산화질소 합성제
(inducible nitric oxide synthase, iNOS)		 L-NMMA
ARG/iNOS NCX-4016
COX-2 Celecoxib; Rofecoxib
EP2/EP4 CP-533536
TGFβRI SB-505124; SD-505124;LY580276
JAK/STAT JSI-124; CPA-7
VEGFR1/FLT1 SU5416; AG-013736
CCR4 IC-487892
CXCR4 AMD3100
CCR2 INCB3344
* Muller & Scherle, 2006 및 이의 참조문헌을 참고하라. MTH-TRP: 메틸-사이오히단토인-트립토판(methyl-thiohydantoin-tryptophan); ABH: 2(S)-아미노-6-보로노헥사노익산(2(S)-amino-6-boronohexanoic acid); BEC: S-(2-보로노에틸)-L-시스테인(S-(2-boronoethyl)-L-cysteine); L-NMMA: L-NG-모노메틸 아르기닌(L-NG-monomethyl arginine); NCX-4016: 니트로아스피린(nitroaspirin); Emanueli etal ., 2004를 참고하라; CP-533536: Cameron etal., 2009을 참고하라; SB-505124: DeCosta Byfield etal, 2004를 참고하라; SD-505124: Muller & Scherle, 2006을 참고하라 ; LY580276: Sawyer etal ., 2004을 참고하라; JSI-124: Blaskovich etal ., 2003을 참고하라; CPA-7: Littlefield etal., 2008을 참고하라 ;SU5416: Fong etal ., 1999을 참고하라 ; AG-013736 (Axitinib); Rugo etal ., 2005를 참고하라; IC-487892: ICOS Corp., Bothell, Washington, United States of America; AMD3100:Donzella etal ., 1998을 참고하라.
요법 응용에 관하여, 실시예에 따른 조성물의 요법 유효량이 대상에게 투여될 수 있다. "요법 유효량(therapeutically effective amount)"은 측정가능한 생체 종양 반응(biological tumor response)을 초래하기에 충분한 조성물의 양을 의미할 수 있다. 상기 생체 종양 반응은 면역자극성(immunostimulatory), 항-혈관생성 반응(an anti-angiogenic response), 세포독성 반응(cytotoxic response), 종양 퇴화(tumor regression), 그리고/또는 종양 성장 억제(tumor growth inhibition)의 예가 있으나 이에 한정되지 않는다. 실시예에 따른 조성물에서 활성화 성분(active ingredient)의 실투여수치(actual dosage level)는 특정 대상에 대해 원하는 요법 반응을 달성하는 데 유효한 활성 약물의 투여되는 양에 따라 다양할 수 있다. 선택된 투여수치(selected dosage level)는 상기 조성물의 활성도, 제형(formulation), 투여 방법, 다른 약물 또는 치료법(treatment)과의 조합, 종양의 크기 및 수명, 그리고 치료되는 대상의 신체 상태(physical condition) 및 이전의 병력(prior medical history)을 포함하는 다양한 요소에 의존할 것이다. 본 발명 주제의 실시예에서, 최소량(minimal dose)이 투여되고, 용량(dose)은 용량제한독성(dose-limiting toxicity)이 없을 때부터 단계적으로 증가될 수 있다. 요법 유효량의 측정 및 조절, 그리고 언제 및 어떻게 요법 유효량의 조절을 하는지에 관한 평가는 약리 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다.
진단 응용에서, 실시예에 따른 조성물의 검출량(detectable amount)이 대상에게 투여될 수 있다. "검출량(detectable amount)"은, 조성물에 관하여 사용되었을 때, 조성물의 존재가 체내(invivo) 또는 체외(invitro)에서 측정될 수 있는 조성물의 용량을 의미한다. 검출량은 많은 요인들에 따라 다양할 수 있는데, 상기 많은 요인들은 라벨된 조성물의 화학적 특성, 검출가능한 라벨, 상기 라벨링 방법, 영상 방법, 그리고, 이들과 관련된 영상 및 파라미터 방법, 대상에서 라벨된 약물의 대사(metabolism), 라벨의 안정도(방사선핵종(radionuclide) 라벨의 반감기를 포함하나 이제 한정되지 않음), 영상 이전의 상기 조성물의 투여에 따른 반감기 경과(time elapsed), 투여 방법, 대상의 신체 상태 및 이전의 병력, 그리고 종양 또는 의심되는 종양의 크기와 수명을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 검출량은 다양할 수 있으며, 특정한 응용에 맞추어질 수 있다. 본 발명의 연구 후에도, 검출량을 측정하는 것은 통상의 기술자의 범위 내에 있다.
본 명세서에 개시된 "검출가능한 모이어티(detectable moiety)", "검출가능한 라벨(detectable label)" 및 "검출 시약(detectable agent)"은 항체, 또는 상기 항체의 단편, 또는 이들의 유도체에 첨가될 수 있는 어떤 모이어티에 의해 측정될 수 있으며, 체내 그리고/또는 체외에서 상기 항체, 단편, 이들의 유도체를 검출하는 것을 가능하게 하는 어떤 분자를 의미할 수 있다. 대표적인 검출 모이어티는 발색단(chromophores), 형광(fluorescent) 모이어티, 효소(enzyme), 항원, 선택적인 반응성을 가진 그룹들, 화학발광(chemiluminescent) 모이어티, 및 전기화학적으로 검출가능한(electrochemically detectable) 모이어티 등을 포함할 수 있다. 실시예에서, 항체는 바이오티닐(biotinyl)화될 수 있다. .
실시예에서, 검출가능한 모이어티는 형광단(fluorophore)을 포함할 수 있다. 실시예에 따르면, 형광단의 접합(conjugation)이 조성물 내에서 체내(예를 들어, 대상에 주입 후) 그리고/또는 체외 중 어느 하나에서 검출가능하고, 상기 항체, 또는 상기 항체의 단편, 또는 이들의 유도체가 그것의 항원결정기와 결합하는 능력에 부정적인 영향을 미치지 않는 결과를 가져온다면, 형광단은 조성물 내에 사용될 수 있다. 대표적인 형광단은 디메틸아미노쿠마린-3-카르복시산(7-dimethylaminocoumarin-3-carboxylic acid, 댄실 염화물(dansyl chloride), 니트로벤조디아조아민(nitrobenzodiazolamine, NBD), 다브실 염화물(dabsyl chloride), 신남산(cinnamic acid), 플루오레세인 카르복시산(fluorescein carboxylic acid), 나일 블루(Nile Blue), 테트라메틸카르복시로도아민(tetramethylcarboxyrhodamine), 테트라에틸술로호다민(tetraethylsulfohodamine), 5-5-카르복시-X로다민(5-5-carboxy-X-rhodamine, 5-ROX), 및 6-카르복시-X-로다민(6-carboxy-X-rhodamine, 6-ROX)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 대표적인 형광단은 예시적일 뿐이며, 추가적인 형광단이 더 사용될 수 있음이 이해될 수 있다. 예를 들어, ALEXA FLUOR® 염료 시리즈는 다른 방출 스펙트럼(emission spectra)에 의해 특성화된 적어도 19개의 다른 염료들을 포함할 수 있다. 이러한 염료들은 ALEXA FLUOR® 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, and 750 (미합중국 캘리포니아 칼스배드(Carlsbad)에 있는 Invitrogen사로부터 입수 가능), 및 통상의 기술자가 즉각 설명서를 고려한 후 만들어질 수 있는 어떤 염료를 사용할지에 대한 선택을 포함할 수 있다. 많은 검출가능한 모이어티, 각각의 방출 스펙트럼, 그리고 측정 기술들 등이 사용되더라도, 상기 설명서는 특정한 ALEXA FLUOR®의 화학 조성물을 포함하나 이에 제한되지 않는 표준에 기초할 수 있다.
실시예에서 검출가능한 모이어티는 시아닌(cyanine) 염료를 포함할 수 있다. 실시예에 따른 항체, 단편, 그리고/또는 이들의 유도체에 의해 접합된 시아닌 염료의 비제한적인 예시는 Amersham Biosciences(미합중국 뉴저지주 피스카타웨이(Piscataway))에 의해 공급된 숙신이미드 에스더 Cy5, Cy5.5, 및 Cy7을 포함할 수 있다.
실시예에서, 검출가능한 모이어티는 근적외선(near infrared, NIR) 염료를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 항체, 상기 항체의 단편, 및 이들의 유도체 접합될 수 있는 근적외선 염료들의 비제한적인 예시는 NIR641, NIR664, NIT7000, 및 NIT782를 포함할 수 있다. .
실시예에서, 상기 바이오티닐이 부착된(biotinylated) 항체는 아비딘(avidin) 또는 스프렙타아비딘(streptavidin) 그룹을 포함하며, Cy3, Cy5, Cy7, 및 INVITROGEN™ 미합중국 캘리포니아주 칼스배드)로부터 입수가능한 형광 라벨 시리즈 ALEXA FLUOR® 중의 어떤 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는 형광 라벨(fluorescent label)과 접합된 이차 항체를 사용하여 측정될 수 있다. 실시예에서, 상기 항체, 단편, 또는 이들의 유도체는 형광 라벨과 직접 부착(label)될 수 있고, 상기 항체와 결합한 세포들은 형광 활성화된 세포 분류에 의해 구분될 수 있다. 추가적인 검출 전략은 통상의 기술자에게 알려져 있다.
진단 응용에서(진단 응용들 및 영상 응용들을 포함하나 이에 제한되지 않음), 일 실시예에 따른 항체는 검출가능한 모이어티에 의해 라벨될 수 있다. 상기 검출가능한 모이어티는 직간접적으로 검출가능한 신호를 만들 수 있는 어떤 것일 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 모이어티는 방사선 동위원소(radioisotope); 형광(fluorescent) 또는 화학발광(chemiluminescent) 화합물; 또는 효소를 포함할 수 있다. 방사선 동위원소는 3H, 14C, 32P, 35S, 125I, 또는 131I를 예로 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 형광(fluorescent) 또는 화학발광(chemiluminescent) 화합물은 플루오레세인 이소시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 또는 루시퍼린(luciferin)을 예로 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 효소는 포스타파아제(alkaline phosphatase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), 또는 홀스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)를 예로 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 종양의 진단 방법을 더 제공하는데, 상기 종양 시료(sample) 또는 생검(생체검사, biopsy)은 체외에서 평가될 수 있다. 실시예에서, 표적화 리간드(ligand)는 이하 각각 설명될 형광 라벨(fluorescent label), 항원결정기 표지(epitope tag), 또는 방사선 라벨(radioactive label)과 같은 검출가능한 라벨을 포함할 수 있다.
형광. 어떤 검출가능한 형광 염료가 사용될 수 있는데, 상기 어떤 검출 가능한 형광 염료는 FITC(플루오레세인 이소시아네이트, fluorescein isothiocyanate), FLUOR X™, ALEXA FLUOR®, OREGON GREEN®, TMR(테트라메틸로다민, tetramethylrhodamine), ROX(X-로다민, X-rhodamine), TEXAS RED®, BODIPY® 630/650, 및 Cy5(미합중국 뉴저지주 피스카타웨이(Piscataway)에 위치한 주식회사 Amersham Pharmacia Biotech of Piscataway 또는 미합중국 오리건주 유진(Eugene)에 위치한 주식회사 Molecular Probes 로부터 입수가능)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
형광 라벨은, 사용되는 특정한 라벨에 적합한 방출(emission) 또는 흡수(absorbance) 스펙트럼을 사용하여 직접적으로 검출될 수 있다. 일반적인 연구 장비는 형광(fluorescence)의 체외 검출용으로 개발되었고, GSI Lumonics(미합중국 메사추세츠주 워터타운(Watertown)) 및 Genetic MicroSystems Inc.(미합중국 메사추세츠주 워번(Woburn))로부터 입수가능한 기구들을 포함할 수 있다. 대부분의 상업용 시스템은 광전자 증배관(photomultiplier tube) 검출을 이용하는 스캐닝 기술의 형태를 사용한다. 형광 시료를 분석할 때 고려 기준이 Alexay etal ., 1996.에 요약되어 있다.
항원결정기 표지의 검출. 만일 항원결정기 라벨이 사용되었다면, 상기 항원결정기와 결합하는 단백질 또는 화합물은 상기 항원결정기를 검출하는 데 사용될 수 있다. 대표적인 항원결정기 라벨은 바이오틴(biotin)인데, 아비딘 접합 형광단(avidin-conjugated fluorophore), 예를 들어, 아비딘-FITC와 결합하여 검출될 수 있다. 추가적으로, 상기 라벨은 HRP 효소 산물에 대한 비색(colorimetric) 검출 후에, 아비딘-홀스래디쉬 퍼옥시다아제(avidin-horseradish peroxidase, HRP) 스프렙타아비딘 접합체(streptavidin conjugate)에 의해 검출된다. 상기 비색 또는 발광 산물/접합체의 생성은 각각 분광광도계(spectrophotometer) 또는 광도계(luminometer)을 사용하여 측정될 수 있다.
방사선 사진 검출( Autoradiographic Detection ). 방사선 라벨(예를 들어, 131I 또는 99 mTc) 검출은 통상의 기술자에게 알려진 바와 같이 종래의 방사선 사진 촬영법(autoradiography) 또는 인광영상기(phosphorimager)를 사용하여 수행될 수 있다. 선호되는 촬영 방법, 사진 증진 발광 영상 평판(photostimulable luminescence imaging plate, 미합중국 코네티컷주 스탬포드(Stamford)에 위치한 Fuji Medical Systems 사)을 사용한다. 간단히, 사진 증진 발광(photostimulable luminescence)은 스캐닝하는 동안 레이저 자극에 따른, 조사된 인광 평판(phosphorous plate)에서 방출된 빛의 양이다. 상기 평판의 발광 반응은 활성도에 선형적으로 비례할 수 있다.(Amemiya etal ., 1988; Hallahan etal ., 2001a)
본 기술 분야에서 항체가 검출가능한 모이어티에 접합되는 어떤 방법도 사용될 수 있다.(Hunter etal ., 1962; David etal ., 1974; Pain etal ., 1981 그리고 Nygren, 1982.)
약물 담체 . 실시예에 따른 조성물은 약물 준비 및 투약을 가능하게 하는 약물 담체를 더 포함할 수 있다. 유전자 요법 벡터(gene therapy vector, 예를 들어, 바이러스 벡터(viral vector) 또는 플라스미드(plasmid)), 마이크로캡슐(microcapsule, 예를 들어, 미소구체(microsphere) 또는 나노구체(nanaosphere), Manome etal ., 1994; Hallahan etal ., 2001b; Saltzman & Fung, 1997를 참조), 펩타이드(미국특허등록 6,127,339 및 5,574,172), 클루코오즈아미노글리칸(glycosaminoglycan, 미국특허등록 6,106,866 참조), 지방산(미국특허등록 5,994,392), 지방 에멀젼(fatty emulsion, U.S. 미국특허등록 5,651,991 참조), 지질(lipid) 또는 지질 유도체(미국특허등록 5,786,387), 콜라겐(collagen, 미국특허등록 5,922,356), 다당류(polysaccharide) 또는 이들의 유도체(미국특허등록 5,688,931), 나노서스펜션(nanosuspension, 미국특허등록. 5,858,410 참조), 폴리머 미셀(polymeric micelle) 또는 접합체(Goldman etal ., 1997; 미국특허등록 4,551,482; 5,714,166; 5,510,103; 5,490,840; 및 5,855,900), 그리고 폴리좀(미국특허등록 5,922,545)을 포함하나 이에 한정되지 않는 어떤 적절한 약물 전달 매개체(delivery vehicle) 또는 담체가 사용될 수 있다.
표적화 리간드의 접합( conjugation ). 항체, 단편, 또는 유도체는 환원 본 기술분야에 알려진 방법을 사용하여 약물 또는 약물 담체와 결합될 수 있는데, 상기 방법은 알킬화(reductive alkylation) 및 글루타르알데히드 교차결합(glutaraldehyde crosslinking)에 의한 카르보이미드 접합(carbodiimide conjugation), 에스터화(esterification), 과옥소산나트륨 산화(sodium periodate oxidation)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.(Goldman etal ., 1997; Cheng, 1996; Neri etal ., 1997; Nabel, 1997; Park etal., 1997; Pasqualini etal ., 1997; Bauminger &Wilchek, 1980 미국특허등록 6,071,890; 및 유럽 특허등록. 0 439 095.의 예를 참조)
투여. 실시예에 따른 조성물 투여의 적절한 방법은 혈관 내의(intravascular), 피하의(subcutaneous), 근육 내의(intramuscular), 및 종양 내의(intratumoral) 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 실시예에서, "혈관 내의 투여" 및 "혈관 내의 공급(intravascular provision)"의 구절은 조성물이 대상의 관 망(vascular network) 내에 직접적으로 투여되는 것을 의미할 수 있다. 조성물의 혈관 내 투여용으로 사용되는 기술은 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 정맥으로의(intravenous) 투여 및 동맥으로의(intraarterial) 투여를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 조성물이 투여되는 대상의 종에 적어도 부분적으로 의존하여, 혈관 내의 투여용 자리(site) 및 방법이 선택될 수 있다. 조성물이 폐의 통로(pulmonary pathway)에 전달되기 위하여, 조성물은 에어로졸(aerosol) 또는 콜스 스프레이(coarse spray)에 의해 투여될 수 있다.
III . 생물학적 시료에서 항원결정기 검출 방법
또한, 본 명세서에 개시된 발명 주제의 항체들, 그리고/또는 상기 항체들의 단편들 그리고/또는 상기 항체들의 유도체들은 체내(in vivo) 영상화에 유용하되, 방사선 비투과제 그리고/또는 방사선동위원소와 같은 검출가능한 모이어티(moiety)로 표지된 항체는 대상에게 투여되며, 몇몇 실시예들에서, 정맥주사를 통해 투여되며, 상기 대상 내에서 상기 표지된 항체의 존재 및 위치가 측정된다. 상기 영상 기술은 악성암의 병기 및 치료에 유용할 수 있다.
그래서, 몇몇 실시예들에서, 본 명세서에 개시된 발명 주제의 조성물은 체내(in vivo)에서 검출될 수 있는 표지를 포함한다. 본 명세서에서 영상화 또는 검출 방법을 기술하기 위하여 사용되는 "체내(in vivo)"라는 용어는, 신티그램 촬영법(scintigraphic methods), 자기공명화상법, 초음파, 또는 형광 발광과 같이 일반적으로 비 침습적(non-invasive) 방법을 말한다. 상기 신티그램 촬영법(scintigraphic methods), 자기공명화상법, 초음파, 또는 형광 발광은 각각 아래에서 간략하게 기술된다. 상기 "비 침습적(non-invasive) 방법"은 체내 영상화를 가능하게 하는 조영제의 투여를 채용하는 방법을 배제하는 것은 아니다.
몇몇 실시예들에서, 검출 가능한 모이어티는, 전술된 본 명세서에서 더욱 상세하게 나와 있는 것과 같은 본 명세서의 일 실시예예 따른 항체, 단편, 또는 유도체와, 치료제, 진단 시약, 시약 전달체 또는 이들의 조합들과 결합될 수 있거나, 다르게 연관될 수 있다. 대상에게 표지된 조성물의 투여 후에, 그리고 결합하기에 충분한 시간 후에, 상기 구성물의 생물학적 분배가 가시화될 수 있다. "결합하기에 충분한 시간(time sufficient for binding)"은 상기 표지된 시약과 방사선-유도 타겟 분자가 결합하는 일시적 기간을 말한다.
신티그램 촬영법. 신티그램 촬영법은 단광자 방사선 방사 단층촬영(Single Photon Emission Computed Tomography, SPECT), 양전자 방사 단층 촬영(Positron Emission Tomography, PET), 감마 카메라 영상, 그리고 렉틸리니어 스케닝(rectilinear scanning)을 포함한다. 감마 카메라 및 렉틸리니어 스케닝 각각은 단층에서 방사선을 검출하는 장비를 대표한다. SPECT 시스템은 하나 이상의 감마 카메라의 이용을 기본으로 하며, 상기 하나 이상의 감마 카메라는 분석의 대상을 회전하여, 일차원 이상에서 방사선을 통합시킨다. PET 시스템은 다중차원에서 방사선을 검출하는 원통 내의 검출기 어레이를 포함한다.
본 발명의 개시된 발명 주제의 검출 그리고/또는 영상화 방법을 실행하기에 적합한 촬영 장비, 및 상기 장비를 사용하기 위한 사용 설명서는 상업적 소스로부터 용이하게 이용가능하다. PET 및 SPECT 시스템 모두는 미국의 캘리포니아주의 밀피타스의 ADAC, 및 미국의 일리노이주의 호프만 에스테이트의 지멘스에 의해 제공된다. 신티그램 촬영법에 관련된 장비는 사용될 수 있으며, 예컨대, 공통 소스 포커스를 갖는 콜리메이팅 구조(collimating structre)의 다수의 센서들을 포함하는 방사선-영상 장비가 있다.
신티그램 촬영이 채용될 때, 상기 검출 가능한 표지는, 몇몇 실시예에서 방사성 핵종 표지를 포함하며, 몇몇 실시예에서는 18F, 64Cu, 65Cu, 67Ga, 68Ga, 77Br, 80 mBr, 95Ru, 97Ru, 103Ru, 105Ru, 99 mTc, 107Hg, 203Hg, 123I, 124I, 125I, 126I, 131I, 133I, 111In, 113mIn, 99 mRe, 105Re, 101Re, 186Re, 188Re, 121 mTe, 122 mTe, 125 mTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm, 및 상기 언급한 물질들로부터 유도된 질화물 또는 산화물로부터 선택된 방사성 핵종 표지를 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 방사선 핵종 표지가 131I 또는 99 mTc을 포함한다.
개시된 방법에 따라서 사용되기 위한 분자의 방사성 핵종 표지 방법은 당해 기술에서 알려져 있다. 예를 들면, 표적 분자는 방사성동위원소가 그것(분자)에 직접적으로 결합될 수 있도록 유도될 수 있다 (Yoo et al. 1997). 또한, 결합(conjugation)을 할 수 있는 연결자(linker)가 추가될 수 있다. 대표적인 연결자는 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트(diethylenetriamine pentaacetate, DTPA)-이소티오시아네트(isothiocyanate), 숙신닐이미딜 6-하이드라지늄 니코틴네이드 하이드로클로라이드(succinimidyl 6-hydrazinium nicotinate hydrochloride, SHNH), 및 헥사메틸프로필렌 아민 옥심(hexamethylpropylene amine oxime)을 포함한다(HMPAO; Chattopadhyay et al ., 2001; Sagiuchi et al ., 2001; 및 미국등록특허번호 번호 6,024,938). 추가적인 방법은 미국등록특허번호6,080,384; Hnatowich et al ., 1996; 및 Tavitian e tal ., 1998에서 확인될 수 있다.
상기 표지 모이어티가 방사성 핵종일 때, 방사선 분해의 손상을 방지하거나 최소화하기 위한 안정제-예컨대, 아스코르브산(ascorbic acid), 겐티신산(gentisic acid), 또는 다른 적절한 항산화제와 같은-가 상기 표지된 표적 분자를 포함하는 조성물에 추가될 수 있다.
자기공명화상법( MRI ). 자기 공명 화상의 기초 기술은 특별한 화학적 환경에서 물 양성자의 상대적 이완율을 기반으로 영상을 생성한다. 본 명세서에서 사용된 것 같이, "자기 공명 화상"이라는 용어는 종래의 자기 공명 화상, 자화 이동 영상(magnetization transfer imaging, MTI), 양성자 자기 공명 분광(proton magnetic resonance spectroscopy, MRS), 확산 가중 이미지화(diffusion-weighted imaging, DWI) 및 기능적 MR 이미지화(fMRI; 예컨대, Rovaris et al ., 2001; Pomper & Port, 2000; 및 본 명세서 내 인용참증을 참조)를 포함하는 자기성 소스 기술들을 말한다.
자기성 소스 영상화에 사용되는 조영제들은, 상자성 또는 초상자성 이온들, 철 산화물 입자들(Weissleder et al ., 1992; Shen et al ., 1993), 그리고 수용성 조영제들을 포함하되, 이들로 한정되지 않는다. 상자성 및 초상자성 이온들은 철(iron), 구리(copper), 망간(manganese), 크롬(chromium), 에르븀(erbium), 유로퓸(europium), 디스프로슘(dysprosium), 홀뮴(holmium) 및 가돌리늄(gadolinium)의 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 금속들은 철, 망간 및 가돌리늄이며, 가장 바람직하게는 가돌리늄이다.
진단 표지 기술에서 숙련된 자들은 금속 이온들이 킬레이트 모이어티들에 의해 결합될 수 있다는 것을 알며, 차례로 본 명세서에 개시된 발명 주제의 방법에 따라서 상기 금속 이온들은 치료제와 결합될 수 있다. 예를 들면, 가돌리늄 이온은 디에틸렌트리아민 펜타아세트 산(DTPA)에 의해 킬레이트 화합물이 된다. 란탄족 이온들은 테트라아자사이클로도도디케인 화합물(azacyclododecane compounds)에 의해 킬레이트 화합물이 된다. 미국등록특허번호5,738,837 및 미국등록특허번호 번호5,707,605를 참조한다. 또한, 조영제는 리포좀 내에 담지되어 이동될 수 있다(Schwendener, 1992).
자기성 소스를 사용하여 유도된 영상은 예를 들면, 초전도 양자 간섭 자기계(superconducting quantum interference device magnetometer, SQUID, 미국의 캘리포니아주의 산디에고의 쿼텀 디자인으로부터 교육이 가능함, 또한 미국등록특허번호 5,738,837를 참조)를 사용하여 획득될 수 있다.
초음파. 초음파 영상화는 암을 포함하는 표적 조직의 정량적이고 구조적인 정보를 획득하는데 사용될 수 있다. 마이크로버블 기체와 같은 조영제의 투여는, 초음파 검사 동안 표적 조직의 가시화를 강화시킬 수 있다. 몇몇의 실시예들에서, 상기 조영제는, 예를 들면, 본 명세서에서 개시된 가이드 시약 전달(예를 들면, 방사선 가이드 시약 전달)을 위한 펩타이드를 사용하여, 관심의(목적하는) 표적 조직으로 선택적으로 표적될 수 있다. 체내에서 마이크로버블을 제공하기 위한 대표적인 시약들은, 기체가 채워진 친유성 또는 지질계 버블(예를 들면, 미국등록특허 Nos. 6,245,318; 6,231,834; 6,221,018; 및 5,088,499)을 포함하되, 이들로 한정하지는 않는다. 더불어, 기체 또는 액체는 다공성 무기 파티클들 내에 갇히게 되며, 상기 다공성 무기 파티클이 대상에 전달되면 마이크로 버블을 방출하는데 이용된다(미국등록특허번호 6,254,852 및 미국등록특허번호 5,147,631).
본 명세서에 개시된 발명 주제를 가지고 사용하기에 적합한 기체들, 액체들, 및 그들의 조합들은, 공기; 질소; 산소; 이산화타소; 수소; 질화 산소; 헬륨, 아르곤, 제논 또는 크립톤과 같은 불활성 기체; 육플루오린화 황(sulfur hexafluoride), 십플루오린화 이황(disulfur decafluoride) 또는 오플루오린화 삼플루오로멜틸황(trifluoromethylsulfur pentafluoride)과 같은 플루오린화 황; 셀레늄 헥사플루오라이드(selenium hexafluoride); 선택적으로 테트라메틸실란과 같은 할로겐화 실란; 낮은 분자량의 하이드로카본(예를 들면, 탄소 원자 7개까지 포함) 예를 들면, 메탄, 에칸, 프로판, 부탄 또는 펜탄, 사이클로 부탄 또는 사이클로펜탄과 같은 사이클로알칸, 프로펜 또는 부텐과 같은 알켄, 또는 아세틸렌과 같은 알케인; 에테르; 케톤; 에스테르; 할로겐화 저분자량 하이드로카본(예를 들면, 탄소 원자 7개까지 포함); 또는 상기의 물질들 중 어떤 것들의 혼합물을 포함한다. 할로겐화 하이드로카본 기체들은 확장된 수명을 보여주며, 그래서 몇몇 응용들에서 더 바람직하다. 이러한 그룹(할로겐화 하이드로카본)의 대표적인 기체들은 데카플루오로부탄(decafluorobutane), 옥타플루오로사이클로부탄(octafluorocyclobutane), 데카플루오로이소부탄(decafluoroisobutane), 옥타플루오로프로판(octafluoropropane), 옥타플루오로사이클로프로판(octafluorocyclopropane), 도데카플루오로펜탄(dodecafluoropentane), 데카플루오로사이클로펜탄(decafluorocyclopentane), 데카플루오로이소펜탄(decafluoroisopentane), 퍼플루오로헥산(perfluorohexane), 퍼플루오로사이클로헥산(perfluorocyclohexane), 퍼플루오로이소헥산(perfluoroisohexane), 설퍼 헥사플루오라이드(sulfur hexafluoride), 및 퍼플루오로오탄(perfluorooctaines), 퍼플루오로노난(perfluorononanes); 퍼플루오로테칸(perfluorodecanes), 선택적으로 브롬화(optionally brominated)를 포함한다.
친유성 버블들에 표적 리간드들의 부착은 기준 단백질-폴리머 또는 단백질-지질 부착 방법(예를 들면, 카보디이미드(carbodiimide, EDC) 또는 디오프로피오네이트(thiopropionate, SPDP))에 따라서, 화학적 가교제를 통해 완성될 수 있다. 표적화 효율을 증대시키기 위하여, 큰 기체로 채워진 버블들이 분지되거나 선형의 합성 폴리머(미국등록특허번호 6,245,318)와 같은 유연한 스페이서 암(flexible spacer arm)을 이용하여, 표적 리간들와 결합될 수 있다. 표적 리간드는, 코팅, 흡착, 성층, 또는 (다공성 무기 파티클) 외부면에 상기 표적 리간드가 반응함(미국등록특허번호 6,254,852)으로써, 상기 다공성의 무기 파티클에 부착될 수 있다.
초음파 데이터 세트를 획득하기 위한 초음파 장비의 설명서 및 기술적 방법은 Coatney, 2001; Lees, 2001; 및 하기의 인용참증들에서 확인된다.
형광발광 이미지. 비-가시적 이미지 방법은 형광 발광 표지의 검출을 포함할 수 있다. 친유성 성분(치료제, 진단제, 벡터, 또는 시약 전달체)를 포함하는 시약은, 채내 영상화(예를 들면, Heredia et al ., 1991; Ragnarson et al ., 1992; Fraser, 1996을 참조)를 위해 적합한 다양한 친유성 염색제 중 어느 하나를 가지고 표지될 수 있다. 대표적인 표지는, 카르복시아닌(carbocyanine) 및 아미노스티릴(aminostyryl) 염색제들, 바람직하게 긴 사슬의 디아킬 카르복시아닌(dialkyl carbocyanines, 예를 들면, 미국의 오레곤주, 유진의 Molecular Probes사로부터 이용가능한 DiI, DiO, 및 DiD) 및 디아킬아미노스틸릴(dialkylaminostyryl) 염색제를 포함하되, 이들도 한정하지는 않는다. 친유성 형광발광 표지들은 당해 기술에서 숙련자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 형성될 수 있다. 예를 들면, VYBRANT™ 셀 표지 용액들은 다른 친유성 성분들(미국의 오레곤주의 유진의 Molecular Probes사)의 배양된 셀들을 표지하기에 효과적이다.
또한, 형광 발광 표지는 Cy5.5 및 Cy5(미국의 일리노이스주의 알링턴 하이츠의 Amersham으로부터 사용가능), IRD41 및 IRD700(네브라스카주의 링컨의 Li-Cor사), NIR-1 (일본의 쿠마모토의 Dejindo사로부터 사용가능), 및 라졸라 블루(LaJolla Blue, 미국의 플로리다주의 마이아미의 Diatron사로부터 사용가능, Licha et al ., 2000; Weissleder et al ., 1999; Vinogradov et al ., 1996을 참조)을 포함하는 술폰산화 시아닌 염색제를 포함한다.
더욱이, 형광 발광 표지는 란탄족 이온들로부터 유도된 유기 킬레이트를 포함할 수 있으며, 예를 들면, 테르븀(terbium) 및 유로퓸(europium)의 형광 발광 킬레이트(미국등록특허번호 5,928,627)가 있다. 상기 표지들은 본 명세서에서 개시된 시약과 결합되거나 공유 결합될 수 있다.
형광 발광 표지의 체내 검출을 위하여, 영상은 사용된 특이한 표지에 적합한 방출 스펙트럼 및 흡광 스펙트럼을 사용하여 생성된다. 상기 영상은 예를 들면, 확산광 분광계(diffuse optical spectroscopy)에 의해 가시화될 수 있다. 추가적인 방법 및 영상화 시스템은 미국등록특허번호 5,865,754; 미국등록특허번호 6,083,486; 및 미국등록특허번호 6,246,901, 다른 참증들에서 기술된다.
IV . 암의 검출 방법 및 치료 방법
몇몇 실시예들에서, 본 명세서에 개시된 발명 주제의 상기 항체들, 항체들, 단편들, 그리고/또는 유도체들은 체내에서 암을 영상화하는데 적용되되, 방사선비투과 약물, 방사성동위원소 또는 다른 영상 시약과 같은 이미지 모이어티로 표지된 본 명세서에 개시된 발명 주제의 조성물은 대상에게 투여되고, 상기 대상에서 검출되도록-표지된 구성물의 존재 및 위치가 측정된다. 이러한 영상화 기술은 악성 암의 병기 및 치료에 유용할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 항체는 대상 내 인시튜(in-situ)에서 검출가능한 모이어티를 가지고, 예를 들면 핵 자기 공명, 방사선 또는 당해 기술에서 알려진 다른 검출 방법들에 의해, 표지시킬 수 있다.
본 명세서에 개시된 주제는 대상 내에서 암을 검출하는 방법을 제공한다. 몇몇의 실시예들에서, 본 명세서에서 개시된 방법은 (a) 대상에게, 본 명세서에 개시된 발명 주제의 검출가능한 표지에 결합된 상기 항체, 또는 상기 항체의 단편 또는 상기 항체의 유도체를 투여하는 것; (b) 상기 검출 가능한 표지를 검출하여 상기 암을 검출하는 것을 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 종양은 췌장, 유방, 난소, 결장 또는 직장의 종양, 그리고/또는 상기 종양으로부터 유도되고 선택적으로 MUC1, 변종 K-ras 또는 이 둘 모두를 발현하는 전이세포이다.
본 명세서에 개시된 발명 주제의 몇몇의 실시예들에서, 상기 검출 가능한 표지는 상자성, 방사성, 및 형광의 이온들로 이루어진 그룹으로터 선택된 영상 시약을 포함하되, 상세하게 전술한 것들로 한정되는 것은 아니다. 상기 개시된 것을 고려해서, 상기 방사성 영상 시약은 예를 들면, 감마-방출제, 양전자-방출제, x-선-방출제 또는 검출 방법이 가능하게 하는 다른 시약들일 수 있다. 방사성 영상 시약들의 예들로는, 43K, 52Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 77Br, 81Rb/81MKr, 87 MSr, 99 MTc, 111In, 113In, 123I, 125I, 127Cs, 129Cs, 131I, 132I, 197Hg, 203Pb, and 206Bi을 포함하되, 본 명세서에 개시된 발명 주제는 이러한 방사성동위원소들로만 한정되지 않는다.
본 명세서에 개시된 발명 주제는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 방법은 활성 약물과 결합된 본 명세서에 개시된 발명 주제의 항체, 또는 상기 항체의 단편 또는 상기 항체의 유도체를 포함하는 조성물을 상기 대상에게 투여하고, 상기 활성 약물은 상기 암에 접촉하여 상기 암을 치료한다. 활성 약물의 예시는, 치료 시약들, 선택적으로 화학요법제, 독소, 방사성요법제 및 상기 언급된 물질들의 조합들이되, 이들로 한정되지는 않는다.
예를 들면, 본 명세서에 개시된 발명 주제의 조성물은 본 명세서에 개시된 바와 같이 화학요법제에 결합된 항체, 또는 항체의 단편 또는 항체의 유도체를 포함할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 화학요법제는 항암제, 사이토토킨(cytokine), 대사 길항제(anti-metabolite), 알킬화제(alkylating agent), 호르몬, 메토트렉사트(methotrexate), 독소루비신(doxorubicin), 다이노루비신(daunorubicin), 시토신(cytosine), 알라비노사이드(arabinoside), 에토포시드(etoposide), 5-플루러유러실(5-fluorouracil), 메팔란(melphalan), 클로람부실(chlorambucil), 니트로겐 머스타드(nitrogen mustard), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 시스-플레티늄(cis-platinum), 빈데신(vindesine), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloids), 마이토마이신(mitomycin), 블레오마이신(bleomycin), 푸로티오닌(purothionin), 마크로모마이신(macromomycin), 1,4-벤조퀴논(1,4-benzoquinone) 유도체들, 트레니몬(trenimon), 스테로이드(steroids), 아미놉테린(aminopterin), 안트라사이클린(anthracyclines), 디메콜신(demecolcine), 에토포시드(etoposide), 미스라마이신(mithramycin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노마이신(daunomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin), 마크로마이신(macromycin), 알파-아마니틴(α-amanitin) 및 이들의 조합들 중 선택된다.
추가적으로, 본 명세서에 개시된 발명 주제의 조성물은, 본 명세서에 개시된 독소와 결합된 항체, 또는 항체의 단편 또는 항체의 유도체를 포함할 수 있다. 독소의 예시들은, 럿셀사독(Russell's Viper Venom), 활성화된 인자 IX(activated Factor IX), 활성화된 인자 X(activated Factor X), 트롬빈(thrombin), 포스폴리파아제C(phospholipase C), 코르바 독 인자(cobra venom factor), 리신(ricin), 리신A 사슬(ricin A chain), 수도모나스 독소(Pseudomonas exotoxin), 디프테리아 독소(diphtheria toxin), 소 췌장 리보핵산분해효소(bovine pancreatic ribonuclease), 미국자리공 항바이러스 단백질(pokeweed antiviral protein), 아브린(abrin), 아브린A 사슬(abrin A chain), 겔로닌(gelonin), 사포린(saporin), 모데신(modeccin), 비스큐민(viscumin), 볼켄신(volkensin), 및 이들의 조합을 포함하되, 이것들로 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 개시된 발명 주제의 조성물은 본 명세서에 개시된 바와 같이 방사성요법제과 결합된 항체, 또는 항체의 단편 또는 항체의 유도체를 포함할 수 있다. 상기 방사성요법제의 예시들로는 47Sc, 67Cu, 90Y, 109Pd, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 199Au, 211At, 212Pb, 212Bi, 32P, 33P, 71Ge, 77As, 103Pb, 105Rh, 111Ag, 119Sb, 121Sn, 131Cs, 143Pr, 161Tb, 177Lu, 191Os, 193 MPt, and 197Hg을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서에 개시된 발명 주제는 대상 내 암 성장을 억제하기 위한 방법을 제공한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 방법은 암 투병 중인 환자에게 본 명세서에 개시된 발명 주제의 분리된 항체, 항체의 단편 또는 항체의 유도체의 효율적인 양을 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 본 명세서의 개시된 발명 주제의 상기 항체, 항체의 단편 또는 항체의 유도체는 SEQ ID NOs: 1-3 내에서 존재하는 항원결정기와 결합한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 종양은 췌장, 유방, 난소, 결장 또는 직장의 종양 그리고/또는 상기 종양으로부터 유도되고 선택적으로 MUC1, 변종K-ras 또는 이 둘 모두를 발현하는 전이 세포이다.
본 명세서에 개시된 발명 주제는, 조합된 치료법들의 일부로서 본 명세서에 개시된 상기 조성물 및 방법을 적용하는 것을 포함한다. 본 명세서에 개시된 발명 주제는 몇몇 실시예들에서, 상기 대상에게 하나 이상의 추가적인 항암 치료법을 투여하는 것을 제공한다. 항암 치료제들의 예시들로는 방사선치료, 화학요법, 추가적인 면역치료, 항염증치료, 및 이들의 조합들을 포함하되, 이로 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, 항염증치료는 상기 환자에게 소염제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 소염제는 비-스테로이드 소염제(non-steroidal anti-inflammatory drug, NSAID)를 포함하되, 이로 한정되지 않는다. NSAID의 예시들로는 사이클로옥시게나제 억제제들(예를 들면, 인도메타신, indomethacin), 특히, 사이클로옥시게나제-2-특이적 억제제들이며, 이들로 한정되지는 않는다. 사이클로옥시게나제-2-특이적 억제제들의 예는 셀레콕시브(celecoxib) 및 로페콕시브(rofecoxib)이며 이것으로 한정되지 않는다.
또한 조합 치료법은, 하나 이상의 추가적인 항암치료법-예컨대, 4-아미노-1-(2-디옥시-2,2-디플루오로-β-D-에리트로-펜토푸란노실)피리미딘 -2(1H)-on-2',2'-디플루오로-2'-디옥시사이티딘(4-amino-1-(2-deoxy-2,2-difluoro-β-D-erythro-pentofuranosyl)pyrimidin-2(1H)-on-2',2'-difluoro-2'-deoxycytidine)인 젬시타빈(gemcitabine); 4-[5-(4-메틸페닐)-3-(트리플루오로메틸)피라졸-1-일]벤젠술폰아미드(4-[5-(4-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)pyrazol-1-yl]benzenesulfonamide)인 셀레콕시브(celecoxib); 그들의 제약적으로 수용이 가능한 염류들, 그리고/또는 그들의 조합-을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
조합 치료법들은, 본 명세서에 개시된 발명 주제의 조성물들의 투여 전에, 투여하는 동안 그리고/또는 투여 후에, 대상에게 이온화 방사선의 투여를 포함한다.
치료 장비들에 있어서, 상기 항체들, 항체의 단편들, 항체의 유도체들 그리고/또는 그들의 결합체들은 대상에게 예컨대, 제약적으로 수용 가능한 제형으로 투여될 수 있다. 그들은 한 회분의 양으로 또는 일정 기간 동안 지속적으로, 정맥으로, 근육으로, 피하로, 관절 내로, intrasynovial, 척추 강내로, 경구로, 국소적으로, 또는 흡입의 경로들로 투여될 수 있다. 상기 항체들 그리고/또는 결합체들은 또한 종양 내로, 종양 부근으로, 병소 내로, 또는 병소 부근의 경로들로 투여될 수 있어, 목적된 것과 같이, 시스템적인 치료 효과뿐만 아니라 지역적으로도 분투(치료)한다.
적합한 제약적으로 허용가능한 담체들, 희석액들 그리고/또는 약학 첨가제들은 clinical situation warrants로서 당해 기술에서 숙련된 자들에 의해 잘 알려져 있으며, 적용될 수 있다. 적합한 담체들, 희석액들 그리고/또는 약학 첨가제들의 예들은 (1) 둘베코의 인산 완충 식염수(Dulbecco's phosphate buffered saline), pH 약 7.4, 약 1 mg/ml 내지 25 mg/ml 인혈청 알부민(human serum albumin)을 포함함; (2) 0.9% 식염수 (0.9% w/v NaCl), 및 (3) 5% (w/v) 덱스트로오스(dextrose)을 포함한다.
수용성 제형일 때, 상기 항체는 냉동 건조되는 것보다는 일반적으로 약 0.1 mg/ml 내지 100mg/ml 양에서, 이러한 범위 외의 넓은 범위가 허용됨에도 불구하고, 형성될 수 있다.
제조 및 투여량에 관한 추가적인 설명에 대해서는, 미국등록특허번호 5,326,902; 미국등록특허번호 5,234,933; PCT 국제공개특허번호 WO 1993/25521; Gennaro, 1990; Goodman et al ., 1996; Berkow et al ., 1997; Speight et al ., 1997; Duch et al., 1998; Ebadi, 1998; Katzung, 2001; Gennaro, 2003을 참조한다.
본 명세서에 개시된 발명 주제의 조성물들 및 방법은 인 비트로(in vitro ), 인 비보(in vivo), 또는 익스 비보(ex vivo)에서 적용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 발명 주제의 상기 조성물들 및 방법은 MUC1 또는 변종된 K-ras 발현이 상승하는 암의 선별 그리고/또는 치료를 위하여 사용될 수 있다. 이러한 암들의 예들은, 난소, 유방, 폐, 췌장, 및 전립선의 종양을 포함하되, 이것으로 한정되지 않는다.
질병(암)을 치료하기 위하여, 본 명세서에 개시된 발명 주제의 항체, 상기 항체의 단편 또는 상기 항체의 유도체 그리고/또는 그들의 조합들의 적절한 복용량은, 치료될 질병의 형태, 질병의 경중 및 병기, 상기 항체들 그리고/또는 조합들이 예방 목적으로 또는 치료 목적으로 투여되는지, 이전의 치료의 과정, 환자의 병력 및 상기 항체들 그리고/또는 조합들에 대한 반응, 및 담당 의사의 재량에 따라 결정될 수 있다. 본 명세서에 개시된 발명 주제의 상기 항체들 그리고/또는 조합들은 환자에게 한번에, 또는 몇몇 또는 많은 치료의 과정으로 투여될 수 있다.
V.암 세포와 암 줄기 세포의 검출, 정제 및 표적
본 명세서에 개시된 발명 주제는, 대상 내에서 또는 대상으로부터 분리된 암세포, 암줄기세포 또는 둘 다를, 본 명세서의 개시된 항체, 항체의 단편 또는 항체의 유도체를 사용하여, 검출하고, 정제하고, 표적하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시예들에서, 본 명세서에 개시된 발명 주제는, 항체 또는 항체의 단편 또는 항체의 유도체가 종양을 가졌거나, 현재 가지고 있는 대상으로부터 분리된 생물학적 시료 내 존재하는 암세포, 암 줄기 세포 또는 둘 다와 결합하는 것을 검출함으로써, 암 세포 및 종양 줄기 세포 또는 둘 다를 검출하는 방법을 제공한다. 본 명세서에서 개시된 검출 가능한 표지가 채용하는 조성물은 이런 목적을 위해 적용될 수 있다.
추가적으로, 본 명세서에 개시된 발명 주제는 암 줄기 세포의 정제를 위한 방법을 제공한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 방법은 (a) 암 줄기 세포를 포함하는 것으로 의심되는 세포 집단을 제공하는 단계; (b) 항체, 또는 상기 항체의 단편 또는 항체의 유도체와 결합하는 세포의 부-집단을 확인하는 단계, 상기 결합은 SEQ ID NOs: 1-3 내에 존재하는 항원 결정기와의 결합 (c) 세포 부-집단을 정제하는 단계를 포함한다. 정제 방법에 있어서, 몇몇 실시예들에서 세포의 집단은 종양을 가진 대상으로부터 분리된 순환 세포를 포함한다.
몇몇 실시예들에서, 상기 방법은, 상기 확인하는 단계 전에 세포 집합으로부터 양성 계열(lineage positive, lin+)을 제거하는 단계 또는, 정제된 부-집단으로부터 lin+를 제거하는 단계를 더 포함한다. 상기 세포 집단으로부터 lin+ 세포를 제거하는 방법은 당해 기술에서 알려져 있다. 실시예적인 방법은 하기와 같다:
단세포 부유액은 대상(예를 들면, 혈액, 림프액, 골수천자액, 등)로부터 분리되거나, 조직들로부터 준비된다. 조직들의 경우에서, 암 줄기 세포를 갖는 것으로 의심되는 조직의 부분들을 기계적으로 균질화시킬 수 있으며, 37℃에서 30분 동안 콜라겐분해효소 IV(collagenase IV) 및 DNA분해효소(DNase)을 가지고 분해시킬 수 있다. 상기 종양으로부터의 전혈과 단세포 부유액은, 예를 들면, Miltenyi Biotec사(독일의 베르기슈 글라트바흐)에서 파는 몇몇 종-특이 계통 세포 감손 키트들(species-specific Lineage Cell Depletion Kits) 중 하나를 사용함으로써, 계통 세포 감손(lineage cell depletion)을 받는다. 상기 종-특이 계통 세포 감손 키트들은 이하의 계통 항체(lineage antigen)로 발현하는 세포를 제거시킨다: 세포 부유액으로부터 CD2, CD3, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD56, CD123, and CD235a. 그러고 나서, 음성 계열(lineage negative) 부-집단은 흘림 세포계측법(flow cytometry)을 사용하여, MUC1으로 발현하는 세포에 대하여, 예를 들면, 본 명세서에 개시된 발명 주제의 단일 클론 항체 TAB-004를 사용하여, 선별될 수 있다. 다양한 선택들의 단계들은 다른 순서로도 수행될 수 있다는 것은 이해될 수 있다. 만약 원한다면, 줄기 세포 표지자들 CD133 (AC133) 그리고/또는 CD24+/CD44+에 직접적으로 대항하는 항체들이 또한 채용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 발명 주제는 대상 내 순환하는 암 줄기 세포에 활성 약물을 표적하기 위한 방법을 제공한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 방법은, 본 명세서에 개시된 발명 주제의 항체, 또는 상기 항체의 단편 또는 항체의 유도체를 포함하는 조성물과 활성 약물을 가지고, 암 줄기 세포(선택적으로, 순환하는 암 줄기 세포)을 접촉시키는 것을 포함한다. 그래서, 상기 조성물은 상기 활성 약물을 암 줄기 세포로 전달한다. 본 명세서에 개시된 활성 약물은, 본 명세서에 개시된 조성물들 및 방법을 채용하여, 암 줄기 세포에 표적될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 활성 약물은 요법제, 화학요법치료제, 독소, 방사성요법제, 또는 그들의 조합들을 포함한다.
예를 들면, 몇몇 실시예들에서 상기 요법제는 면역조절물질을 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 면역조절물질은 인돌아민 2,3-이산소화효소(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO) 억제제(예를 들면, 1-메틸-DL-트립토판(1-methyl-DL-tryptophan, 1MT)); EP2/EP4 수용체 대항제(EP2/EP4 receptor antagonist); CXCR4 대항제(CXCR4 antagonist); 혈관 내피 성장 인자 수용체 1 대항제(vascular endothelial growth factor receptor 1 antagonist), 셀리브렉스(Celebrex), TGFβR1 대항제, 및 가지세포활성 약물(dendritic cell activator)의 하나 이상일 수 있다. 이러한 면역조절물질들의 비-한정 예시들은 상기 도 3에 제공된다.
VI .대상 내 암의 재발 그리고/또는 진행을 예지하는 방법
2010년, 유방암 및 췌장암은 각각 암 사망 원인의 3위 및 4위이다. 유방암은 여성들 사이에서 가장 일반적으로 진단되는 암이고, 반면 췌장암은 가장 드물지만 암 중에서 가장 예후가 좋지 않다. 췌장암에 연관된 좋지 않은 예후는, 초기 단계에서 질병을 진단하는 이른 검출 방법의 부족함으로부터 적어도 일부가 발생한다. 유방암에서는 유방 촬영술이 유방암의 이른 검진을 상당히 개선시켰으나, 그것은 단점이 아니지 않다. 유방암의 20%까지의 오진과 잘못된-양성 결과들은 불안감과 고비용의 추가적 테스트를 야기시킬 수 있다. 유방촬영 선별에서, 특이성의 결핍은 암이 있다는 "과-진단"과 불필요한 치료를 발생시킬 수 있다.
또 다른 근심은 환자 내 초기 암으로부터의 떨어진 부분으로의 전이의 존재이다. 상기 전이는 일반적으로 좋지 않은 예후와 연관성이 있으며, 환자들에게 투여되는 치료의 과정에 대단한 영향을 준다. 전이를 검출하기 위한 사용되는 최근의 방법은, 컴퓨터 단층촬영(computed tomography, CT), 양성자 방사 단층촬영(positron emission tomography, PET), 및 자기 공명 촬영(magnetic resonance imaging, MRI)를 포함한다. 이러한 장비들은 고가이며, 개인에 따라 위험하고, 특이성 및 민감성이 부족할 수 있으며, 일반적으로 소전이(micrometastase)의 검출이 불가능하다.
또한, 환자들 내에서 재발을 모니터링하는 것은 적합하게 맞춰진 특이한 약물 치료를 필요로 한다. 암 항체들- 예를 들면CA 19-9, CA 15-3, 및 CA 27-29을 포함하되 이로 한정되지 않으며-을 위한 혈액-기반 테스트들은 이러한 목적들을 위해 채용될 수 있다. 하지만 이러한 테스들은, 암 이외의 상황들이 상기 및 다른 임의의 "암-관련된 항제들"의 상승을 야기시켜, 종종 특이성이 부족하다. 또한 암 진행에서, 증후가 나타나기 전에 암을 검출할 만큼, 이러한 표지자들의 발현 레벨들은 종종 비효율적으로 높다. 소전이들 및 재발을 검출할 뿐 아니라, 초기 단계에서 암을 특이하게 검출하는 방법론들의 발전은 췌장 및 유방의 종양 환자들에게 개선된 결과들로 유익할 수 있다.
VI .A. 암의 재발을 예지하는 방법
몇몇의 실시예들에서, 본 명세서에 개시된 발명 주제는 대상에서 암의 재발을 예지하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 방법은 (a) 암이 있는 대상으로부터 순환 세포를 포함하는 생체 시료를 분리하는 단계; (b) 상기 생체 시료를 본 명세서에 개시된 발명 주제의 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 항체의 유도체에 접촉시키는 단계; 그리고, (c) 상기 생체 시료에서 본 명세서에 개시된 발명 주제의 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 항체의 유도체에 결합한 하나 이상의 순환 세포를 확인하는 단계를 포함하며, 이로써 암의 재발이 상기 대상 내에서 예지된다. 이러한 방법에 대하여, 본 명세서에 개시된 발명 주제의 항체들, 항체의 단편들 그리고/또는 항체의 유도체들에 결합된 순환 세포들을 확인하는 것은, 대상이 이전에 순환 세포에 대하여 음성이었을 때, 상기 대상의 암의 재발을 인지할 수 있다. 몇몇의 실시예들에서, 본 명세서에 개시된 발명 주제의 하나 이상의 항체들, 항체의 단편들 또는 항체의 유도체들과 결합한 순환 세포들의 존재는, 순환 세포에 대해 음성인 대상이 전이성 질병 위험이 높아진 시점이다.
VI .B. 암의 진행을 예지하는 방법
본 명세서에 개시된 발명 주제은 또한 대상에서 암의 진행을 예지하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 방법은 암이 있는 대상으로부터 순환 세포를 포함하는 생체 시료를 분리하는 단계; 상기 생체 시료를 본 명세서에 개시된 발명의 주제의 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체에 접촉시키되, 상기 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체가 상기 생체 시료에 존재한다면 존재하는 종양 그리고/또는 암세포에 존재하는 항원결정부에 결합하기에 충분한 조건하에서 접촉시키는 단계; 그리고, 상기 생체 시료에서 상기 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체에 결합한 하나 이상의 순환 세포를 확인하는 단계를 포함하여, 상기 대상에서 암의 진행은 예지될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 생체 시료는 혈액 시료, 림프 시료 또는 상기 시료의 부분을 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 암은 췌장암 또는 유방암이다.
몇몇 실시예들에서, 상기 항체는 ATCC(American Type Culture Collection)에 부다페스트 협상(Budapest Treaty)의 용어 하에서 접근 번호 PTA-11550로, 미국, 20110-2209, 버지니아주 마나사스 보우리바드 대학(University Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, United States of America), 2010년 12월 16일 기탁된 혼성세포주 TAB-004에 의해 생성된 단일클론 항체이다.
몇몇 실시예들에서, 상기 항체의 단편 또는 유도체들은 키메라 항체 또는 상기 키메라 항체의 단편 또는 유도체; 인간화 항체 또는 상기 인간화 항체의 단편 또는 유도체; 인간 항체 또는 상기 인간 항체의 단편 또는 유도체; 단일 사슬 항체 또는 상기 단일 사슬 항체의 단편 또는 유도체; 그리고, Fab 단편으로 구성된 그룹에서 선택되며, 상기 키메라 항체, 상기 인간화 항체, 상기 인간 항체, 상기 단일 사슬 항체, 또는 상기 Fab 단편은 단일클론 항체 TAB-004의 CDRs를 포함한다. 그리고,
몇몇 실시에들에서, 상기 단일클론 항체 TAB-004의 CRDs는 SEQ ID NO: 8을 포함하는 H 사슬 CDR1; SEQ ID NO: 9를 포함하는 H 사슬 CDR2; SEQ ID NO: 10을 포함하는 H 사슬 CDR3; SEQ ID NO: 11을 포함하는 L 사슬 CDR1; SEQ ID NO: 12를 포함하는 L 사슬 CDR2; 그리고, SEQ ID NO: 13을 포함하는 L 사슬 CDR3을 포함한다.
본 명세서에 개시된 발명 주제의 상기 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체는, 암 환자의 혈액 또는 다른 생체 시료에서 순환 암 세포(CTCs)의 존재를 검출하기 위하여 적용될 수 있는데, 이는 CTCs의 존재는 전이성 질병과 좋지 않은 예후의 가능성의 중요한 지표일 수 있기 때문이다. 최근, CellSearch® 시스템(Veridex, LLC, Raritan, New Jersey, United States of America)은 전이성 유방, 직장, 및 전립선 암에서 CTCs을 측정하는 FDA(United States Food and Drug Administration)에 의해 승인된 유일한 방법이다. 이 시스템은 CTCs에서 상피 세포 표면 표지자 EpCAM의 검출을 기반으로 한다. 전이성 유방암에서, 일차 치료 초기 전 CTCs의 검출은 무진행 생존 및 전체 생존율의 높은 예측을 보인다. 기준선에서 및 첫 조치(4주)에서 혈액의 7.5ml 당 CTCs 5 이상을 갖는 환자들이, CTCs 5 이하를 갖는 환자들보다 더 좋지 않은 예후를 나타냈다(Cristofanilli et al ., 2005). 유사하게, 췌장암에서, 좋지 않은 예후에 연관된 혈액7.5ml당 CTCs은 1보다 크다(Kurihara et al ., 2008).
그러나, 실제로 전이성 병변으로 형성되는 CTCs의 능력은 의문으로 남는다. 상피-중간엽 전이(epithelial-mesenchymal transition, EMT)라고 불리는 변형 과정에서, 암 세포는 침습 표현형을 갖는 암 세포가 몇몇의 상피 항체들을 상실하기 때문에, 최근에는 EpCAM-발현 CTCs이 전이를 예측하는데 있어서, 극히 작게 작용한다. 사실, 소전이에 의한 낮은 EpCAM 발현은 개시되었고, EpCAM에 대한 항체들을 사용하여 CTCs을 분리하기 위한 시도들은 현재까지 성공되지 못했다. MUC1-발현 셀들은 높은 전이 가능성을 가지며, MUC1는 CTCs 상에서 발현되는 것을 발견했기 때문에, 본 명세서에 개시된 항체들 및 상기 항체들의 단편들 및 상기 항체들의 유도체들은 TAB-004항체를 포함하되 이로 한정되지 않으며, 상기 항체들 및 상기 항체들의 단편들 및 상기 항체들의 유도체들은, EpCAM-발현 CTCs을 검출하기 위한 시도를 기반으로 하는 전략과 비교할 때, 매우 신뢰하고 개선된 전이의 예지자으로서 기능할 수 있다.
VII . Other Uses
본 명세서에 개시된 발명 주제의 항체들은 직접 또는 간접적 샌드위치 측정, 및 면역침전 측정(Zola, 1987; Harlow & Lane, 1988을 참조)과 같은 다양한 측정법들에서 적용될 수 있으며, 이것들로 한정하는 것은 아니다.
본 명세서에 개시된 발명 주제의 항체들은 친화성 정제제로서 사용될 수 있다. 이 과정에서, 하나 이상의 항체들은, 당해 기술에서 잘 알려진 방법을 사용하여, 적당한 지지대(예를 들면, 세파덱스 수지 또는 필터 페이퍼, 이들로 한정되지 않음) 상에 고정된다.
실험예들
이하의 실험예들은 실례가 되는 실시예들을 제공한다. 본 명세서에서의 개시 및 당해 기술 분야의 일반적인 기술 수준을 고려하여, 통상의 지식을 가진 자들은 이하의 실험예들이 단지 예시적인 의도이며 다양한 변화들, 변형들 및 대안들이 본 명세서에서 개시된 주제의 범위를 벗어나지 않고 이용될 수 있음을 이해할 것이다.
실험예1
인간 MUC1 을 발현시키는 췌장 샘암종 마우스들( mice ) 의 생성
인간MUC1을 발현시켰고 췌장 샘암종을 발생시키는 삼중의 형질전환 마우스 라인을 생성하기 위한 전략이 도 3에 도시된다. 요약하면, 발생부터 성체가 될 때까지 췌장에서 Cre 재조합효소를 발현시키는 P48Cre /+ 마우스들(Kawaguchi et al ., 2002)과, Cre를 발현하는 세포들내에서 활성화되는 전사적으로 비활성인 K-rasG12D 대립형질을 포함하는LSL-KrasG12D /+ 마우스들(Jackson et al ., 2001; Kawaguchi et al ., 2002)을 교배시켰다. P48Cre /+ 와LSL-KrasG12D /+ 모두에 양성이었던 자손들("PDA 마우스들"로 명명된)은, 인간 MUC1 전이 유전자를 운반했던 형질전한 마우스 라인(MUC1.Tg)과 짝을 이뤘고, 이형 접합체로서 유지되었다(도 3 참조).
MUC1.Tg 마우스들은 인간 MUC1을 발현시켰고, B-세포 및 T-세포 구획 내성(compartment tolerance)을 나타냈었고, 또한 전이유전자에 의해 암호화된 단백질과의 면역접종에 면역성이 있었다(Rowse et al ., 1998). 인간 MUC1 전이유전자가 이러한 마우스들 안에서 자신의 프로모터에 의해 구현됐었기 때문에, 그 발현 레벨들은 조직 특이적이었고 적절했다. 종양 내에서 단일 상피 조직의 낮은 레벨 내강 표면들과 증가된 발현이 관찰되었다.
P48Cre /+, LSL-KrasG12D /+ 및 인간 MUC1 (본 명세서에서 "PDA.MUC1.Tg" 마우스들로 언급된)에 양성이었던 마우스들은 3개의 전이유전자들을 운반했다. 모든 PDA x MUC1.Tg 마우스들은, PanIN-IA, PanIN-IB, PanIN-2, PanIN-3 및 샘암종을 포함하는 서로 상이한 병기의 췌장상피내종양(developedpancreatic intraepithelial neoplasia, PanINs)을 발생시켰다(Tinder et al ., 2008; Mukherjee et al ., 2009). PDA x MUC1.Tg 췌장의 다양한 시기들의 대표적인 절편들은 도 1B에 도시된다. 이러한 마우스들의 약 80%는 26주까지 샘암종을 발생시켰고, 그 마우스들의 거의 100%는 34주까지 샘암종을 발생시켰다.
인간 MUC1을 발현시키고, K-rasG12D 종양 항원들을 변종 시키는 PDA.MUC1.Tg 마우스들(도3)로부터, 삼중 형질전환 마우스들에 의해 발현된 종양관련항원들에 대한 항혈청을 생산하기 위하여 단백질 용해액들이 조제되었다. 간략하게, 5mg의 단백질 용해액은 불완전 프로인드 보강제(Incomplete Freund's Adjuvant, IFA)와 혼합 되었고 Balb/c 마우스를 면역화하는데 사용되었다. 융합세포들이 면역된 마우스의 비장 세포들과 골수종 세포들의 융합에 의해 생성되었고, 융합세포들의 선별에 의해TAB-004항체가 확인되었다. 이러한 단일클론항체는 IgG 동형(isotype)이 되도록 결정되었다. 정제된 항체는 종양-관련 글리코실레이트 MUC1(tumor-associated glycosylated MUC1)과 결합된다.
항원결정부 선별은 본 명세서에서 서술된 TAB-004 단일클론항체(mAb)가 SEQ ID NO: 3 내에서 존재하는 항원결정부위에 결합되는 것을 결정했다. 항체는 인간 췌장(도 1B) 및 인간 유방(도 2A 및 2B)으로부터 분리된 종양 조직과 강하게 반응했지만, 정상적인 췌장 또는 유방 조직(도 1A 및 2C 참조)에 눈에 띄게 결합하지 않았다.
흥미롭게도, TAB-004 항체는 변종 K-ras와 교차 반응했으며, K-ras돌연변이는 발현시키지만 인간 MUC1은 발현시키지 않는 종양 조직들이 항체와 양성 염색되는 것을 보여줬다. 모든 전이성 병변들은 양성 반응을 보였고, TAB-004가 변종 K-ras 폴리펩타이드 내에서 존재하는 항원결정부위에 결합될 수 있음을 보여줬다.
실험예2
종양 세포들의 FACS 분류
결합할 수 있는 능력을 결정하고, 상이한 환경에서 상이한 조건 하에서 존재하는 종양 세포들과 분류하기 위하여, 형광 활성 세포 분류법(Fluorescence Activating Cell Sorting, FACS)을 이용하여, TAB-004 항체를 다양한 시료들과 실험하였다.
제1 실험에서, TAB-004 항체로 CD133+ 및 CD24+/CD44+/EpCAM+의 정제된 집단으로부터 염색한 세포들을 사용하였다. 췌장 샘암종의 절편들은 37℃, 30분 동안의 콜라겐분해효소 IV (collagenase IV) 및 DNA분해효소(DNase)에서 기계적으로 동질화 및 동화된다. 종양으로부터의 전혈 및 단일 세포의 부유액(suspension)은, 계열 셀 감손 키트(Lineage Cell Depletion Kit, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany, Catalogue No. 130-092-211)를 이용하여 계열 셀 감손을 수행하였으며, 그래서 하기의 계열 항원들이 발현하는 세포들을 제거한다: 세포 부유액으로부터의 CD2, CD3, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD56, CD123, 및 CD235a. 췌장암에 걸린 환자들의 혈액 세포들 또는 종양 세포들로부터의 음성 계열(lin-) 세포들은, MUC1을 발현시키는 세포들을 위한 흐름세포측정법을 사용하고, TAB-004 항체 및 후속하는 췌장 줄기 표지자 CD133 (AC133) 또는 CD24+/CD44+를 이용하여 선별되었다.
도 7A 및 7B은 CD133+ (도 7A) 및 CD24+/CD44+/EpCAM+ (도 7B) 세포들의 형광 활성 세포 분류법(FACS)의 분류 및 본 명세서에서 개시하고 있는 TAB-004항체가 이러한 집단에 결합되는 정도의 히스토그램들이다.
FACS 분석은, 정상적 세포와, 췌장암 조직으로부터 분리된 췌장암 세포에서, TAB-004 항체를 이용하는 MUC1 발현과, 암 세포를 포함하는 세포들의 이동성과 연관된 폴리펩타이드 CXCR4의 발현을 비교하기 위해 사용되었다. 그 결과들이 도 8에 도시된다.
도 8에서, TAB-004 항체 대 CXCR4 항체로 염색된 조직학적으로 정상적인 췌장 조직(도 8C) 대 인접 췌장 샘암종 조직(도 8D)의 세포들의 분포가 비교되었다. 도시된 바와 같이, MUC1 또는 CXCR4에 양성인 세포들은 조직학적으로 정상인 인접 췌장 조직에서보다 췌장 샘암종 조직에서 더 풍부했다. 도 8A 및 8B들은 음성 조절들의 결과들(도 8A - 항체 없음; 도 8B-동형 통제 항체)을 보여준다.
그리고 마지막으로, TAB-004 항체가 상피성 종양들을 검출하는데 최근 사용되는 EpCAM 항체와 비교되었다. 도 9는 TAB-004 항체가 췌장암 환자들의 순환종양세포들을 검출하는 데에 있어 표준 EpCAM 항체보다 우수하다는 것을 보여주는 FACS 도표들의 시리즈를 제공한다.
먼저, 정상적인 통제 개체로부터의 전혈이 700ml의 혈액당 PANC1 췌장암 세포주 250 세포들에 있으며, PANC1 세포들은 TAB-004 항체를 이용하여 염색되었다. 0.1mg/ml 부터 0.004mg/ml의 범위 내 TAB-004 항체의 세 개의 다른 농도들에 상응하는, 완전 까만 검은색(right-most black), 옅은 회색(light gray) 및 중간 밝기의 회색(medium gray lines)의 라인들과, EpCAM 항체에 상응하는 짙은 회색(dark gray) 라인의 비교는 이와 같은 4가지 프레파라트들(preparations) 모두가 이러한 프레파라트들(preparations)의 PANC1 세포들을 매우 훌륭하게 검출할 수 있었음을 보여준다.
다음으로, 두 환자(각각 환자1, 환자2)의 혈액 내 존재하는 순환 종양 세포 존재를 검출하기 위한 TAB-004 및EpCAM 항체들의 능력이 테스트 되었다. 도 9B 및 9C들에 보여진 바와 같이, 환자 혈액 내에서 순환 종양 세포들을 검출하기 위한 TAB-004 항체와 EpCAM 항체 사이에 명확히 관찰할 수 있는 차이가 있었다. 특히, EpCAM-PE 항체(도 9B 및 9C의 짙은 회색 라인 참조)가 아닌 TAB-004-PE 항체(도 9B의 완전 까만 검은색 라인과 도 9C의 완전 까만 검은색 및 옅은 회색 라인들 참조)는 환자들 혈액의 순환 종양 세포들을 검출할 수 있었으며, 최근 이러한 목적에 일반적으로 사용되는 EpCAM 항체보다 TAB-004가 훨씬 더 우수하다는 것을 제시하였다.
실험예3
TAB -004 접합체들의 생산
본 명세서에 개시된 발명 주제의 TAB-004 항체는 1-메틸-DL-트립토판(1-methyl-DL-tryptophan: 1MT); EP2/EP4 수용체 길항제; 및 수지상 세포 활성체로서의 기능을 하는 CpG 올리고디옥시뉴클레오티드(CpG ODN)에 접합되었다(Rothenfusser et al ., 2002). CpG ODN에 접합된 TAB-004 항체의 기능적 역할에 대한 데이터는 항체들의 기능성 및 본 명세서에 개시된 발명 주제의 접합체들의 비제한적인 예시와 함께 제공된다.
단독 또는 CpG ODN에 접합된 TAB-004 항체가 삼중 형질전환 PDA.MUC1.TG 마우스들로부터 생성된 종양 세포주(본 명세서에서 "KCM"으로 언급된; 도 3참조)에 결합되었다. 출원자들은 어떤 특정한 작동 원리에 의해 결합되는 것을 원하지 않는 반면에, 항체들은 자연 살해 세포들(NK 세포들) 및 KCM 세포주뿐만 아니라 YAC세포들과 같은 표적에 대한 NK 세포의 용균 활성을 더욱 강화시킨 CpG ODN과의 접합체를 활성화시킨 것으로 나타났다(도 4 참조).
실험예 4
TAB -004- CpG ODN 복합체( conjugate )의 생체내 항종양 활동
열 마리의 마우스들로, 삼중 유전자도입 PDA.MUC1.Tg 마우스로부터 생성된 KCM 확립 췌장암 세포주를 주입시켰다. 도 5A 및 도 5B에는 처치 그룹들, 스케쥴, 및 투여량이 설명되었다. 간략히, 0번째 날에, 3 ⅹ106 의 KCM종양 셀이 마우스들(n=10)의 측면 영역에 피하 투여되었다. 4, 10, 및 16번째 날에는, 각 마우스에 50 μg의 TAB-004-CpG ODN 복합체가 종양에 직접 주입(보조제(adjuvant) 없이)되었다. 대조를 위하여, 항체 단독 그룹(복합되지 않은 TAB-004)에 같은 양의 항체가 주입되었다. 마우스들은 20번째 날에 죽여서 종양을 회수하였다.
도 5에 도시된 바와 같이, 복합화된 항체를 통한 처치는 확립된 종양의 성장을 중지시켜 완전한 제거에 이르렀다. 이와 같은 데이터는 심지어 처치의 중단 이후에도, TAB-004-CpG ODN 복합체 처치를 받은 마우스는 종양이 다시 커지지 않으며(도 5 참조), TAB-004-CpG ODN 복합체의 암-상피성 암, 특히 췌장암을 포함하나 이에 제한되지 않는-에 대한 백신으로의 사용을 뒷받침한다.
실험예 5
항체 복제, 제조합 항체 생산, 항원 결합 확인, 및 CDRs 의 염기서열결정
TAB-004 항체의 MUC1에의 결합 능력을 확인하고 CDRs의 아미노산 염기서열을 결정하기 위하여, RNA모두가 하이브리도마(hybridoma) 세포주 ATCC No. PTA-11550으로부터 추출되었고, 역전사 PCR(RT-PCR)이 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄 특정 프라이머 세트들(immunoglobulin heavy- and light chain-specific primer sets) 및 QIAGEN® OneStep RT-PCR Kit을 이용하여 수행되었다. 각 세트들에 대하여, 다중의 경쇄 및 중쇄 RT-PCR 반응들이 다양한 영역들의 선도 서열(leader sequences)을 커버하는 축퇴성 포워드 프라이머 혼합물(degenerate forward primer mixtures)을 이용하여 수행되었다. 포워드 프라이머들은 다른 농도로 사용되었으며, 리버스 프라이머들(중쇄 또는 경쇄 유전자들의 불변 부위에 위치한)은 반응 당 50ng였다. 아래의 RT-PCR 조건이 이용되었다:
역전사: 50℃에서 30분;
최초 PCR 활성 단계: 95℃에서 15분
사이클링: 94℃에서 25초동안 20사이클
54℃에서 30초;
72℃에서 30초;
최종 연장: 72℃에서 10분.
다음으로, 제 2 라운드 반중첩 PCR이 사용되었다. 비록 각 프라이머의 양이 상술된 RT-PCR 조건에 비하여 두배였으나, 포워드 프라이머들은 제 1 라운드 RT-PCR에 사용된 것과 동일하였다. 중쇄 염기서열에 특화된 반중첩 리버스 프라이머들이 반응 당 100ng이 사용되었다. PCR 조건은 다음과 같다:
95℃에서 5분간 최초 변성;
사이클링 : 95℃에서 25초 동안 25 사이클;
57℃에서 30초 동안;
68℃에서 30초 동안;
최종 연장: 68℃에서 10분.
상기 PCR이 완결된 후, PCR 산출물은 시료가 아가로스겔 상에서 분리되었고, 산출물들은 시각화되었다. 몇몇 중쇄 및 경쇄 PCR 산출물들이 서브클론되었고, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들이 염기서열되었다. 결과적인 인코딩된 뉴클레오티드 염기서열, 및 그의 아미노산 염기서열이 SEQ ID NOs: 4-7에 기재되고, 그로부터 추론된 CDRs의 아미노산 염기서열이 표 4에 요약되었다.
TAB -004 단일 클론 항체의 중쇄 및 경쇄의CDRs 의 아미노산 염기서열
IgG 사슬 CDR1 염기서열 CDR2 염기서열 CDR3 염기서열
중쇄 GYTFTNYW
(SEQ ID NO: 8)		 INPSSGYT
(SEQ ID NO: 9)		 STYYGDYLFPY
(SEQ ID NO: 10)
경쇄 QDIVYGNGNTY
(SEQ ID NO: 11)		 KVS
(SEQ ID NO: 12)		 FQGSHVPYT
(SEQ ID NO: 13)
다음으로, 재조합 항체들이 제조된다. 상기 재조합 항체들은 상술한 제 2 라운드 반중첩 PCR에 이어, 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-11550로부터 분리된 모든 RNA의 RT-PCR 증폭을 하는 다른 라운드에 의하여 제조된다. 증폭된 중쇄 염기서열들 및 경쇄 염기서열들은 개별적으로 플라스미드 항체 발현 벡터들(expression vectos)로 서브클로닝된다.
다음으로, 상기 플라스미드들은 CHO 셀들에서 핵산전달감염(transfected)되고, 인간 lgG1 백본(backbone)을 갖는 재조합 lgG이 제조되었다. 핵산전달감염된 CHO 셀들로부터의 상청액(Supernatant)의 항원결합(antigen binding)이 96-웰 ELISA 포맷에서 테스트되었다. 상기 상청액 내의 재조합 lgG의 농도가 낮음(즉, 약 10ng/ml)에도 불구하고, 몇몇 상청액 시료들은 매우 강한 결합을 나타내었다. 상기 상청액 내의 항체의 상대적으로 낮은 농도 하에서, 상기 ELISA 결과는 재조합 항체들이 매우 강력하다는 것을 나타낸다.
재조합 항체 플라스미드들의 삽입 염기서열(sequences of the inserts)는DNA염기서열에 의해 결정되었다. 모든 것은 하나의 중쇄 염기서열 및 하나의 경쇄 염기서열에 부합하였다. 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들의 뉴클레오티드 및 아미노산 염기서열이 결정되고, 그로부터 추론된 CDR 염기서열이 SEQ ID NOs: 8-13에 기재되었다.
실험예 6
유방 및 췌장암들에 있어서, 다른 종양 항원-기반의 검출 전략에 대한 TAB -004 항체의 성능 비교
유방암에 대한CA 15-3, CA 27-29 및 췌장암에 대한 CA 19-9을 포함하여, 종양 항원들에 대한 임상적인 혈액 기반의 테스트들이 최근에 가능하다. 암이 아닌(Non-cancerous) 조건들 및 양성 질환(benign disease)은 이 종양 항원들의 수치를 높일 수 있고, 따라서 암을 정확히 검출하는데 이용되는 이러한 항체의 능력에 부정적 영향을 미친다. 이와 같은 낮은 특이성의 결과에 따라, 이러한 테스트들은 중대한 진단적 가치를 가진다고 입증되지 않았다.
따라서, 환자의 플라즈마 내의 MUC1의 분비 레벨을 검출하는 TAB-004 의 능력이, 플라즈마 시료들 내의 이러한 항체들의 성능과 비교되었다. 효소면역측정(enzyme immunoassay: EIA)이, 순환계 내의 MUC1의 분비 레벨을 포착하고 검출하기 위한 TAB-004 항체를 사용하여, 최적화되었다. 간략히, 96-웰 ELISA 플레이트가 50μg/mL in PBS 에서 100μL 의 TAB-004 항체에 의하여 코팅되었고, 4℃에서 하루밤 동안 배양되었다. 배양 후, 과한 TAB-004 포착 항체는 플레이트로부터 제거되었다. 상기 플레이트는, 비-특이성 결합을 방지하기 위하여 PBS 내에서 1% 분유 200 μL을 가지고 차단되었고, 4℃에서 한 시간 동안 배양되었다. 상기 플레이트는 ELISA 플레이트 워셔를 이용하여 Tween®-20의 0.05%(v/v) 함량의 PBS 250 μL로 광범위하게(3차례) 세척되었다. MUC1 TR로부터 준비된 25-mer 폴리펩타이드를 사용하는 MUC1 스탠다드가, 0~2000 U/ml범위로 준비되었다. 테스트 플라즈마는 PBS의 0.1% 우유에서 1:2, 및 1:10으로 희석되었고, 100 μL가 적절한 웰에 세차례(in triplicate)에 걸쳐 첨가되었으며, 상기 플레이트들은 37℃에서 2시간 동안 배양되었다.
그 후, 플레이트들은 세척되고 다클론 래빗 항-MUC1 항체(Genway) 가 PBS내 0.1% 우유에서 1:300,000 농도로 희석되어 각 웰에 추가되었고, 플레이트는 37℃에서 한 시간 동안 배양되었다. 상기 다클론 항체는 웰들로부터 세척되었고 홍당무과산화효소(horse radish peroxidase)- 표지된 고트(goat) 항-래빗 lgG이 PBS 내 0.1% 우유에서 1:1,000로 희석되도록 추가되고 37℃에서 한 시간 동안 배양되었다. 플레이트들의 세척 이후, 각 웰들에 과산화효소 기질(peroxidase substrate, TMB)로 구성된 용액 100μL이 첨가되었고, 플레이트들은 실온의 암흑속에서 30분 동안 배양되었다. 반응은 4.0N의 황산 25μL의 첨가에 의하여 중지되고, SPECTRA-MAX 250 스펙트로미터를 이용하여 450nm의 파장에서 광학 밀도가 판독되었다. 미지의 시료들의 농도를 결정하기 위하여 회기 분석(regression analyses)으로 스탠다드 커브들이 생성되었다.
MUC1의 최초 표준 시료(referece standard)에 기초하여, 임의의 단위 (U)/ml 가 선택되었다. 선형 범위는 50-800 units/ml의 MUC1 항원으로 결정되었다. 테스트에 사용되는 장비, 연구자, 및 시약들이 예측된 것과 같이 작용하도록, 인트라 및 인터 측정(Intra-and inter-assay) 변이들은 정상 및 비정상 시료들을 포함시켜 통제되었다.
TAB-004 EIA 측정은 CA15-3(Abbot Laboratories, 애봇 파크, 일리노이, 미국) 유방암 시료들과 비교되었다. 유방암을 위한CA27-29 (Bayer Diagnostics, 테리타운, 뉴욕) 및 췌장암을 위한 CA19-9 (Panomics Inc, 레드우드 시티, 캘리포니아, 미국) 시료들(EIA 측정을 사용하는)과의 비교가 또한 수행되었다. TAB-004 EIA 와 상업적으로 통용되는 EIAs의 민감도 및 특이성을 비교 평가하기 위하여 통계학적 분석들이 수행되었다.
TAB-004 EIA는 36명의 유방암 환자들, 24명의 전립선암 환자들, 4명의 췌장암 환자들, 13명의 식도암 환자들, 12명의 정상인들, 3명의 췌장염 환자들 및 1명의 당뇨병 환자(췌장염 및 당뇨병은 CA 15-3, CA 27-29, 및 CA 19-9 항원들이 존재를 테스트하는 분석을 사용 시에 잘못된 양성으로 검출되는 두 가지 조건들임)로부터의 플라즈마를 사용하였다. 대부분의 암 시료들은 말기암들로부터 테스트되었다.
40U/ml이하의 절단값(cutoff value)는 12명의 정상인에 대한 예비적 데이터로부터 도출되었다. 플라즈마의 평균 편차 및 표준 편차 값들(17.42 및 7.07 units/ml) 각각이 도출되었다(도 10 참조). 본 연구에서, 우리는 40units/ml의 플라즈마보다 적은 값을 정상으로 볼 예정이다. 이는 정규 분포를 가정할 때, 99.8% 이상의 인구를 커버할 것이다. 우리는 우리의 기준 편차가 인위적으로 부풀려질 것 같은 예비적 데이터에 단지 12명의 시료들을 가졌다는 조건 하에서 본 연구의 일부로 절단값을 개선할 예정이다.
상기 40U/ml이하의 절단값에서 건강하지도 않고 췌장염 플라즈마가 양성이었고, 반면에, 암 시료들로부터의 모든 플라즈마는 40U/ml이상이었다(도 10 참조). 본 데이터는 CA 15-3 항원을 검출하기 위하여 디자인된 측정에 비교할 때, TAB-004 EIA 측정은 정상인 참여자들의 플라즈마와 유방암 환자들의 플라즈마에서 종양 항원을 더욱 특이적이로 더 높은 민감성으로 검출하는데 탁월하다는 것을 나타낸다. TAB-004에 있어서 오진된 양성이 없었지만, CA15-3에 기초한 측정(p=0.031, 단측 측정(one-tailed test) 사용; 31U/ml이하, CA15-3에 기초한 측정에 대하여 공포된 절단값)에서는 12명의 정상 환자들 중 5명에 대하여 오진의 양성 결과가 도출되었다. 모든 암 환자들의 플라즈마는 TAB-004에서 양성이었으나, CA-15-3(31U/ml이하)에서는 36개의 플라즈마 시료들 중 3개가 오진의 음성을 나타내었다. 전반적으로, 암의 플라즈마 및 정상 플라즈마 사이의 차이는 유방암 환자들에 있어서, CA15-3 테스트에 비교할 때, TAB-003에 대하여 훨씬 컸다. 또한 CA15-3 테스트가 사용될 때 정상 플라즈마 및 암 플라즈마 사이의 상당한 중첩이 있었으나, TAB-004 테스트가 사용될 때는 중첩이 없었다(도 10 참조).
질병의 병기에 접근하기 위한 TAB-004 항체 성능을 평가하기 위하여, TAB-004 EIA이 0기, 2기, 3기 및 4기의 췌장암 환자들 플라즈마 시료들 5개(n=5)에 대하여 수행되었다. 도 11은 TAB-004와 CA 15-3 측정들의 평균 차이가 모든 4 개의 종양 병기들(0기 p=0.049; 2기 p=0.008; 3기 p=0.017; 및 4기 p= 0.008)에 대하여 통계학적으로 의미가 있다는 것을 보여준다. TAB-004 측정은 모든 20 개의 시료들에서 CA 15-3보다 높은 값을 제공하였다. 또한, TAB-004 측정 레벨들은 종양 병기에 의존하며, 이는 0기, 2기 및 3기 사이의 차이를 예측할 수 없는 CA 15-3 측정과는 달리, 상기 레벨들이 질병의 진행에 따라 증가하기 때문이다. 도 10에서 발견된 통상 범위(40U/ml이하)로부터 수집된 단계(stage) 데이터를 비교하면, TAB-004가 2기 및 3기를 진단하는 데 있어서 CA-15-3에 비하여 월등했다. 모든 2기 및 3기의 환자들이 정상 범위를 넘는 TAB-004 측정 값들을 나타내는 반면, CA 15-3 측정에 대해서는 10개 중 단지 2개만이 정상 범위를 넘었다.
실험예 7
질병 진행 및 재발을 갖는 순환 MUC1 의 상관성 레벨
TAB-004는 질병의 재발 및 진행을 정확히 예측하는 잠재력을 평가하기 위하여 적용된다. II기 및 III/IV기의 유방암 환자들 100(n=100)의 플라즈마가 처치 전, 및 일반적인 케어 치료의 종료에서 6, 12, 및 18 개월이 지난 후 평가된다. 본 그룹에서 재발은 24개월 이후로 평가된다. 2기, 3기, 및 4기에 있는 췌장 환자들 50명(n=50)의 플라즈마가 처치 전, 일반적인 케어 치료 후 3, 6, 9, 및 12 개월에서 평가된다.
시료 수집. 플라즈마는 정기적인 후속 방문에 의하여 수집된다. 질병 병기는 병리학적 평가에 의하여 확인되며, 재발은 통상적인 영상화 기술들로 확인된다. 데이터베이스는 췌장암 환자들에게 수행된 어떠한 화학요법들 및 부가적인 치료들을 상세하게 유지시킨다.
유방암에 있어서, 일반적으로 재발율은 췌장암에 비하여 많이 낮으며, 따라서 췌장암 환자들(아래에 통계적으로 정의된)보다 적은 수가 적용되었다. 표준적인 후속 방문 시간이 다르기 때문에, 플라즈마를 수집하는 시간도 또한 유방암과 췌장암 사이에 차이가 있다.
췌장암 환자들에 있어서, 3기 및 4기 환자들의 일부는 통상적으로 6개월에서 1년까지 더 생존하며, 따라서 진단 이후의 높은 사망률에 기인하여 치료의 종료까지 기다리는 것이 불가능하다. 시료들은 환자들이 치료를 받는 중에 수집된다. 수술을 받는 환자들의 경우, 시료들은 치료 요법에 관계 없이 수술 이전 및 수술 후 3, 6, 9, 및 12 개월에 수집된다. 절제 불가능한 암을 가지는 환자들에 있어서, 시료들은 치료 요법에 관계 없이 치료의 시작 이전 진단 시, 및 진단 후 3, 6, 9, 12개월에 수집된다. 대부분의 환자들이 1년 이내의 재발이 예상되기 때문에, 시도는 12개월에 종료된다. 유방암의 경우, III/IV기만이 2년 이내에 재발될 것으로 통상적으로 예상된다. 그러나 비교를 위하여 II기의 환자들도 포함된다. 플라즈마는 치료 이전, 및 치료의 종료 후 6, 12, 및 18개월에 수집된다.
분석 및 통계: 분석은 TAB-004 측정의 유방암 환자들의 재발 그리고/또는 사망을 예측하는 능력을 결정하기 위하여 수행된다. 환자들은 연구 기간 동안 재발되는 환자와, 재발되지 않은 환자로 양분된다. 재발을 예측하는 것에 있어서 TAB-004의 자연적 차단점(natural cut point)이 있는지 결정하기 위하여, 반응자 작용 커브(Receiver Operating Curves, ROCs)가 구성된다. 재발한 환자의 경우, TAB-004 이전의 레벨이 분석에 사용되며, 최종 TAB-004 값들은 재발이 없는 경우에 사용된다. 예를 들면, 재발이 15개월에 발생한다면 12개월의 TAB-004 레벨이 사용된다. Cox 비례 위험 모형(Cox proportional hazard model)은 재발 시간(시점)을 종속(결과) 변수로써 수행된다. 상기 Cox 모델은 정확하게 후속 및 삭제된(검열된) 데이터들의 소실을 설명하는 다변수의 과정이다. 나이, 종양 병기, 및 암 등급, 및 TAB-004 값은 독립적인 예측 변수로 입력된다. 만일 ROC가 재발을 예측하는데 있어 자연적인 차단점을 결정한다면, 이러한 양분된(차단점의 위 또는 아래) 변수가 TAB-004의 실제 값을 대신하여 다른 Cox 모델에 사용된다. TAB-004 변수에 대해 통계학적으로 중용한 p-value 는 환자의 나이, 종양 병기, 및 종양의 등급을 조정할 경우 TAB-004가 재발에 대한 독립적인 예측변수라는 것을 나타낸다. 이전의 분석들의 세트가 재발 또는 사망을 종속 변수로 시간에 따라 반복된다. 0기, I기, 및 II기의 암을 가진 환자들에서, 이와 같은 접근은 III/IV (전이성)기의 암으로 가는 시간을 예측하는데 사용된다.
이와 같은 세트의 분석은 췌장암을 갖는 환자들로부터의 데이터에 또한 수행된다. 췌장암의 극도로 높은 사망률 때문에, 재발까지의 또는 4기 질병까지의 시간을 예측하는 경우, Cox 모델에서 안정적인 계수들을 획득하는 것은 어려울 수 있다. 따라서, 암이 재발하는 몇몇 경우들 또는 환자들이 2기 또는 3기에서 전이성 암인 4기로 진행하는 몇몇 경우들이 연구 기간 동안 발생할 것이다.
실험예 8
질병 예후을 갖는 TAB -004- positive CTCs 의 상관 레벨 및 TAB -004 혈장 레벨, 그리고 TAB -004을 가지며 분리된 CTCs 대 EpCAM 항체의 비교 수 및 전이 가능성
순환 암 세포들(CTCs)은 혈류 내 암 세포로서 정의된다. 최근 베리덱스 셀 서치® 시스템(Veridex Cell Search® system)은 전이성 유방, 직장 및 췌장 암 환자 내 CTCs를 측정하기 위한 FDA가 승인한 유일한 방법이다. 이 시스템을 사용하면, 췌장 암 환자들 내 CTCs<1 및 생존 사이에 연관을 보였다. 흥미롭게도, 본 실험예에서, CTCs의 존재가 종양 항체CA 19-9의 혈청 레벨이 증가와 연관됨을 보였고, 종양 항체의 혈청 레벨은 순환계에서 종양 세포가 있음을 예측할 수 있다. 전이성 유방암 환자들에서, 5와 같거나 작은 CTCs은 무진행 생존 및 전체 생존의 독립적인 예지자이었다. 게다가, 전이성 유방 암 환자에서, CTC 레벨은, 최근의 영상화 방법들보다 더 빠르고 더 재현가능한, 질병 상태의 징후이다.
CTC 평가에 대한 승인된 방법은, 혈액으로부터 EpCAM-발현 세포를 분리하는 것과, 그러고 나서 염색한 상피-특이성 세포각질의 존재, 염색한 적합한 핵의 존재, 그리고 백혈구-특이성 CD45 부재를 가지고 CTCs로서 상기 세포를 확증하는 것을 수반한다. 상기 방법에서 주의사항은 EpCAM 발현 세포에 대한 규제이다. 연구들은 이주 표현형을 획득한 세포가 그 상피성 특성들을 상실하고 간엽성 특성을 획득한다는 것을 제안하며, 표현형적으로 악성 암 진행을 담당하는 세포들로 간주된다. CTCs의 EpCAM 분리는 가장 강한 CTCs를 "상실"할 수 있다-간엽성의 표현형을 가진 CTCs.
유방 및 췌장의 원발성 및 전이성 종양들 모두는 본 실시예들의 TAB-004 항체로 인식되는 종양-관련 MUC1의 높은 레벨로 발현한다. 그러므로, 상기 환자들에서 CTCs는 TAB-004 항체에 의해 인식될 수 있다. 초기 실험들에서, MUC1의 레벨은 TAB-004 항체를 사용하는 것으로 평가되었다. 첫째, 7.5ml 혈액 시료(인간 시료와 유사한)를 사용하는 MUC1-발현 CTCs를 측정하기 위하여 베리덱스 셀 서치® 시스템을 사용하는 재량은 PANC1 세포를 첨가하였고, 그것은 인간의 췌장 암 세포주를 실험하는 것이다. CTCs (EpCAM+ cells)의 약 90%가 MUC1를 발현시켰다. 더욱이, 환자들 시료들이 수집되었고, TAB-004이 약 33% 내지 100% 효율까지 CTCs으로 인식하는 것을 확인했다. 그러므로 TAB-004항체를 사용하는 것이 췌장 및 유방의 암 환자들에서 소전이를 정확하게 검출하는 것을 나타낸다.
[서열리스트]
SEQ ID NO : 1:
TSSNHSTSPQLSTGVSFFFLSFHISNLQFNSSLEDPSTDYYQELQRDISEMFLQIYKQGGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL
SEQ ID NO : 2:
MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEKMSKDGKKKKKKSKTKCVIM
SEQ ID NO : 3: STAPPVHNVTSAPDTRPAPGSTAPP
SEQ ID NO : 4:
gaggtccagctgcagcagtctgggggtgaacgggcaacacctggggcctcagtgaagatgtcctgcaagacttctggctacacctttactaactactggatgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggatacattaatcctagcagtggttatactcagtacaatcagaagttcaaggacaaggccacattgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatacaactaagcagcctgacatctgaagactctgcagtctattactgttcaacctactatggtgactacttgtttccttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca
SEQ ID NO : 5:
EVQLQQSGGERATPGASVKMSCKTSGYTFTNYWMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSSGYTQYNQKFKDKATLTADKSSSTAYIQLSSLTSEDSAVYYCSTYYGDYLFPYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO : 6:
gatgttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcaggacattgtatatggtaatggaaacacctatttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccggttttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgctttcaaggttcacatgttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgg
SEQ ID NO : 7:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQDIVYGNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO : 8: GYTFTNYW
SEQ ID NO : 9: INPSSGYT
SEQ ID NO : 10: STYYGDYLFPY
SEQ ID NO : 11: QDIVYGNGNTY
SEQ ID NO : 12: KVS
SEQ ID NO : 13: FQGSHVPYT
본 명세서에 개시된 발명 주제의 다양한 상세한 설명은 본 명세서에 개시된 발명 주제에 범위로부터 벗어나지 않으면 변경될 수 있다. 더욱이, 상기의 기재는 단순히 설명의 목적으로 사용되며, 한정의 목적으로 사용되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> The University of North Carolina at Charlotte Mukherjee, Pinku <120> TUMOR SPECIFIC ANTIBODIES AND USES THEREFOR <130> 1276/5 PCT <150> US 12/924,952 <151> 2010-10-08 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1255 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr 1 5 10 15 Val Leu Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser Thr Pro Gly 20 25 30 Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Ser Ser 35 40 45 Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu Ser Ser His 50 55 60 Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Gln Gly Gln Asp Val Thr Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr Trp Gly Gln 85 90 95 Asp Val Thr Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Thr 100 105 110 Pro Pro Ala His Asp Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Lys Pro Ala Pro 115 120 125 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 130 135 140 Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser 145 150 155 160 Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 165 170 175 Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 180 185 190 Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 195 200 205 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 210 215 220 Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser 225 230 235 240 Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 245 250 255 Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 260 265 270 Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 275 280 285 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 290 295 300 Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser 305 310 315 320 Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 325 330 335 Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 340 345 350 Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 355 360 365 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 370 375 380 Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser 385 390 395 400 Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 405 410 415 Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 420 425 430 Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 435 440 445 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 450 455 460 Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser 465 470 475 480 Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 485 490 495 Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 500 505 510 Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 515 520 525 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 530 535 540 Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser 545 550 555 560 Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 565 570 575 Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 580 585 590 Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 595 600 605 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 610 615 620 Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser 625 630 635 640 Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 645 650 655 Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 660 665 670 Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 675 680 685 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 690 695 700 Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser 705 710 715 720 Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 725 730 735 Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 740 745 750 Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 755 760 765 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 770 775 780 Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser 785 790 795 800 Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 805 810 815 Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 820 825 830 Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 835 840 845 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 850 855 860 Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser 865 870 875 880 Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 885 890 895 Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 900 905 910 Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 915 920 925 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn 930 935 940 Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser 945 950 955 960 Ala Ser Gly Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Thr Leu Val His Asn Gly 965 970 975 Thr Ser Ala Arg Ala Thr Thr Thr Pro Ala Ser Lys Ser Thr Pro Phe 980 985 990 Ser Ile Pro Ser His His Ser Asp Thr Pro Thr Thr Leu Ala Ser His 995 1000 1005 Ser Thr Lys Thr Asp Ala Ser Ser Thr His His Ser Ser Val Pro 1010 1015 1020 Pro Leu Thr Ser Ser Asn His Ser Thr Ser Pro Gln Leu Ser Thr 1025 1030 1035 Gly Val Ser Phe Phe Phe Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu Gln 1040 1045 1050 Phe Asn Ser Ser Leu Glu Asp Pro Ser Thr Asp Tyr Tyr Gln Glu 1055 1060 1065 Leu Gln Arg Asp Ile Ser Glu Met Phe Leu Gln Ile Tyr Lys Gln 1070 1075 1080 Gly Gly Phe Leu Gly Leu Ser Asn Ile Lys Phe Arg Pro Gly Ser 1085 1090 1095 Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn 1100 1105 1110 Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala 1115 1120 1125 Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp 1130 1135 1140 Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val Pro Gly 1145 1150 1155 Trp Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu Val Ala Leu 1160 1165 1170 Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gln Cys Arg Arg 1175 1180 1185 Lys Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr 1190 1195 1200 His Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg Tyr 1205 1210 1215 Val Pro Pro Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser 1220 1225 1230 Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val 1235 1240 1245 Ala Ala Ala Ser Ala Asn Leu 1250 1255 <210> 2 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly 35 40 45 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr 50 55 60 Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80 Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr 85 90 95 Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val 100 105 110 Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys 115 120 125 Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr 130 135 140 Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160 Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys 165 170 175 Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met 180 185 <210> 3 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized peptide <400> 3 Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg 1 5 10 15 Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro 20 25 <210> 4 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinantly generated IgG with TAB-004 CDRs - heavy chain sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <400> 4 gag gtc cag ctg cag cag tct ggg ggt gaa cgg gca aca cct ggg gcc 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Glu Arg Ala Thr Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag atg tcc tgc aag act tct ggc tac acc ttt act aac tac 96 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 tgg atg cac tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt ctg gaa tgg att 144 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga tac att aat cct agc agt ggt tat act cag tac aat cag aag ttc 192 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Gln Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag gac aag gcc aca ttg act gca gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ata caa cta agc agc ctg aca tct gaa gac tct gca gtc tat tac tgt 288 Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 tca acc tac tat ggt gac tac ttg ttt cct tac tgg ggc caa ggg act 336 Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Tyr Leu Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 ctg gtc act gtc tct gca 354 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 5 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Glu Arg Ala Thr Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Gln Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Tyr Leu Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 6 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinantly generated IgG with TAB-004 CDRs - light chain sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(339) <400> 6 gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga 48 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag gac att gta tat ggt 96 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asp Ile Val Tyr Gly 20 25 30 aat gga aac acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cca ggc cag tct 144 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cgg ttt tct ggg gtc cca 192 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctc aag atc 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat tac tgc ttt caa ggt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 tca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 336 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 cgg 339 Arg <210> 7 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asp Ile Val Tyr Gly 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 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<213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 sequence from light chain of TAB-004 antibody <400> 13 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr 1 5

Claims (60)

  1. 단일클론항체 TAB-004의 상보성결정영역들(CDRs)을 포함하는 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체는 다중클론항체인 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체는 단일클론항체인 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체는 인간 항체 또는 인간화 항체인 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체는:
    ATCC(American Type Culture Collection)에 접근 번호 PTA-11550로 2010년 12월 16일 기탁된 혼성세포주 TAB-004; 키메라 항체 또는 상기 키메라 항체의 단편 또는 유도체; 인간화 항체 또는 상기 인간화 항체의 단편 또는 유도체; 인간 항체 또는 상기 인간 항체의 단편 또는 유도체; 단일 사슬 항체 또는 상기 단일 사슬 항체의 단편 또는 유도체; 그리고, Fab 단편으로 구성된 그룹에서 선택되며,
    상기 키메라 항체, 상기 인간화 항체, 상기 인간 항체, 상기 단일 사슬 항체, 또는 상기 Fab 단편은 단일클론 항체 TAB-004의 상보성결정영역을 포함하는 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 단일클론항체 TAB-004의 상보성결정영역은 SEQ ID NO: 8을 포함하는 H 사슬 CDR1; SEQ ID NO: 9를 포함하는 H 사슬 CDR2; SEQ ID NO: 10을 포함하는 H 사슬 CDR3; SEQ ID NO: 11을 포함하는 L 사슬 CDR1; SEQ ID NO: 12를 포함하는 L 사슬 CDR2; 그리고, SEQ ID NO: 13을 포함하는 L 사슬 CDR3을 포함하는 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체는 SEQ ID NO: 5를 포함하는 또는 SEQ ID NO: 4를 포함하는 핵산분자에 의해 코딩되는 H 사슬 변이영역 그리고/또는 SEQ ID NO: 7을 포함하는 또는 SEQ ID NO: 6을 포함하는 핵산분자에 의해 코딩되는 L 사슬 변이영역을 포함하는 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체.
  8. 제1항의 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체; 그리고 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하며, 선택적으로 상기 약리학적으로 허용가능한 담체는 인간에의 사용이 허용되는 조성물.
  9. 활성 약물에 접합한 제1항의 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체를 포함하는 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 활성 약물은, 방사성 분자, 방사성핵종, 증감제 분자, 영상 시약, 방사성 동위원소, 독소, 세포독소, 항혈관생성제, 항종양제, 화학요법제, 면역조절제, 사이토카인, 리포터 그룹 및 이들의 조합으로 구성된 그룹에서 선택되는 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 방사성 동위원소는 10B, 211At, 212Pb, 212Bi, 125I, 131I, 35S 및 3H 로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 면역조절제는, 인돌아민 2, 3-이산소화효소(IDO), 억제제, 선택적으로 1-메틸-DL-트립토판(1MT); EP2/EP4 수용체 길항제; 고리형 산소화효소 억제제, 선택적으로 인도메타신; 그리고, 수지상 세포 활성화제, 선택적으로 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(CpG ODN)로 이루어진 그룹에서 선택되는 조성물.
  13. 제1항의 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체; 그리고 그 사용 설명서를 포함하는 키트.
  14. 종양 세로로 활성 약물을 표적 전달하는 데 사용하는 전달 매개체로서,
    상기 전달 매개체는 제1항의 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체를 포함하는 표적화 약제를 포함하는 전달 매개체.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 활성 약물은 방사성 분자, 방사성핵종, 증감제 분자, 영상 시약; 방사성 동위원소, 독소, 세포독소, 항혈관생성제, 항종양제, 화학요법제, 면역조절제, 사이토카인, 리포터 그룹 및 이들의 조합으로 구성된 그룹에서 선택되는 전달 매개체.
  16. 제1항의 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체를 생성하는 분리된 세포.
  17. 제1항의 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체를 생성하는 혼성 세포로서,
    선택적으로 상기 혼성 세포는 부다페스트 조약에 따라 ATCC(American Type Culture Collection)에 2010년 12월 16일 기탁된 혼성세포주 ATCC 접근 번호 PTA-11550인 혼성 세포.
  18. 생체 시료에서 단일클론 항체 TAB-004에 결합하는 항원결정기의 존재를 검출하는 방법으로,
    상기 방법은:
    (a) 상기 생체 시료를 제1항의 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체에 접촉시키는 단계; 그리고,
    (b) 상기 생체 시료에서 단일클론 항체 TAB-004에 결합하는 항원결정기의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    제1항의 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체는 뮤신(MUC1) 폴리펩타이드 또는 K-ras 폴리펩타이드, 선택적으로 변종 K-ras 폴리펩타이드에 존재하는 항원결정기에 결합하는 방법.
  20. 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체를 제조하는 방법으로,
    상기 방법은:
    (a) 제6항의 분리된 세포 또는 제17항의 혼성 세포를 상기 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체가 발현하는 조건하에서 배양하는 단계; 그리고,
    (b) 상기 세포 또는 혼성 세포 그리고/또는 상기 세포 또는 상기 혼성 세포가 성장하는 환경으로부터 상기 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  21. 종양 그리고/또는 암세포를 검출하는 방법으로,
    상기 방법은:
    (a) 대상의 또는 대상으로부터 분리된 생체 시료를 제1항의 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체를 포함하는 조성물에 접촉시키되, 상기 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체가 상기 생체 시료에 존재한다면 존재하는 종양 그리고/또는 암세포에 존재하는 항원결정부에 결합하기에 충분한 조건하에서 접촉시키는 단계; 그리고,
    (b) 제1항의 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체가 상기 항원결정부에 결합한 것을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 종양 그리고/또는 암세포는 췌장, 유방, 난소, 결장 또는 직장의 종양 그리고/또는 상기 종양으로부터 유도되고 선택적으로 MUC1, 변종 K-ras 또는 이 둘 모두를 발현하는 전이세포인 방법.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체는 상자성 이온, 방사성 이온 및 형광 발생 이온으로 구성된 그룹에서 선택되는 영상 시약을 포함하는 검출가능한 라벨에 접합되는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 방사성 영상 시약은 감마선 에미터, 양전자 에미터 및 X-선 에미터로 구성된 그룹에서 선택되는 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 방사성 영상 시약은 43K, 52Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 77Br, 81Rb/81MKr, 87MSr, 99 MTc, 111In, 113In, 123I, 125I, 127Cs, 129Cs, 131I, 132I, 197Hg, 203Pb 및 206Bi로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법.
  26. 제21항에 있어서,
    상기 생체 시료는 혈액 시료 또는 혈액 시료에서 유도된 부분인 방법.
  27. 대상의 종양을 치료하는 방법으로,
    상기 방법은 활성 약물에 접합한 제1항의 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체를 포함하는 조성물을 대상에 투여함을 포함하고 이로써 상기 활성 약물이 종양과 접촉하여 종양을 치료하는 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 활성 약물은 요법제, 선택적으로 화학요법제, 독소, 방사성요법제 또는 그 조합을 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 화학요법제는 항종양 약물, 사이토카인, 대사 길항제, 알킬화제, 호르몬, 메토트렉세이트, 독소루비신, 다우노루비신, 시토신, 아라비노사이드, 5-플루오로우라실, 멜팔란, 클로람부실, 질소머스타드, 시클로포스파미드, 시스-플라티넘, 빈데신, 빈카 알칼로이드, 미토마이신, 블레오마이신, 푸로티오닌, 마크로마이신, 1,4-벤조퀴논 유도체, 트레니몬, 스테로이드, 아미노프테린, 안트라사이클린, 데메콜신, 에토포시드, 미트라마이신, 독소루비신, 다우노마이신, 빈블라스틴, 네오카르지노스타틴, 마크로마이신, 알파-아만틴 및 그 조합으로 구성된 그룹에서 선택되는 방법.
  30. 제28항에 있어서,
    상기 독소는 럿셀사독, 활성화된 인자 IX, 활성화된 인자 X, 트롬빈, 인지질분해효소, 코브라 독 인자, 리신, 리신 A 사슬, Pseudomonas 내독소, 디프테리아 독소, 소 췌장 리보핵산분해효소, 미국자리공 항바이러스 단백질, 아브린, 아브린 A 사슬, 겔로닌, 사로핀, 모데신, 비스큐민, 볼켄신 및 이들의 조합으로 구성된 그룹에서 선택되는 방법.
  31. 제28항에 있어서,
    상기 방사성요법제는 47Sc, 67Cu, 90Y, 109Pd, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 199Au, 211At, 212Pb, 212Bi, 32P, 33P, 71Ge, 77As, 103Pb, 105Rh, 111Ag, 119Sb, 121Sn, 131Cs, 143Pr, 161Tb, 177Lu, 191Os, 193 MPt, 197Hg 로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법.
  32. 대상에서 종양 성장을 억제하는 방법으로,
    상기 방법은:
    단일클론항체 TAB-004의 상보성결정영역들(CDRs)을 포함하는 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체의 유효량을 종양이 있는 대상에게 투여함을 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 종양은 췌장, 유방, 난소, 결장 또는 직장의 종양 그리고/또는 상기 종양으로부터 유도되고 선택적으로 MUC1, 변종 K-ras 또는 이 둘 모두를 발현하는 전이세포인 방법.
  34. 제27항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상에 하나 이상의 항종양 치료를 행함을 더 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 하나 이상의 항종양 요법제는 방사성요법, 화학요법, 면역요법, 항염증요법, 그리고 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 항염증 용법은 상기 대상에게 고리형 산소화효소 억제제, 선택적으로 고리형 산소화효소-2-특이 억제제를 투여함을 포함하는 방법.
  37. 제35항에 있어서,
    상기 하나 이상의 항종양 요법은 젬시타빈(4-아미노-1(2-데옥시 2,2-디플루오로-β-D-에리쓰로-펜토퓨라노실)피리미딘-2(1H)-온-2',2'-디플루오로-2'-데옥시시티딘) 및 쎄리콕시브(4-[5-(4-메틸페닐)-3-(트리플루오로메틸)피라졸-1-일]벤젠술폰아미드) 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염 중 하난 또는 둘 모두를 상기 대상에게 투여함을 포함하는 방법.
  38. 제32항에 있어서,
    상기 단일클론 항체 TAB-004의 상기 상보성결정영역들은 SEQ ID NO: 8을 포함하는 H 사슬 CDR1; SEQ ID NO: 9를 포함하는 H 사슬 CDR2; SEQ ID NO: 10을 포함하는 H 사슬 CDR3; SEQ ID NO: 11을 포함하는 L 사슬 CDR1; SEQ ID NO: 12를 포함하는 L 사슬 CDR2; 그리고, SEQ ID NO: 13을 포함하는 L 사슬 CDR3을 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체는 SEQ ID NO: 5를 포함하는 또는 SEQ ID NO: 4를 포함하는 핵산분자에 의해 코딩되는 H 사슬 변이영역 그리고/또는 SEQ ID NO: 7을 포함하는 또는 SEQ ID NO: 6을 포함하는 핵산분자에 의해 코딩되는 L 사슬 변이영역을 포함하는 방법.
  40. 암 줄기 세포를 정제하는 방법으로,
    상기 방법은:
    (a) 암 줄기 세포를 포함하는 것으로 의심되는 세포 집단을 제공하는 단계:
    (b) 단일클론항체 TAB-004의 상보성결정영역들(CDRs)을 포함하는 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체에 결합하는 세포 부-집단을 확인하는 단계; 그리고,
    (c) 상기 세포 부-집단을 정제하는 단계를 포함하는 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 세포 집단은 종양 그리고/또는 암을 가진 대상으로부터 분리된 순환 세포들을 포함하는 방법.
  42. 제40항에 있어서,
    양성 계열(lineage-positive:lin+) 세포를, 상기 확인하는 단계 이전에 그리고/또는 상기 정제하는 단계 이후에, 제거하는 단계를 더 포함하는 방법.
  43. 대상에서 활성 약물을 순환하는 암 줄기 세포에 표적화 하는 방법으로,
    상기 방법은:
    상기 순환하는 암 줄기 세포를, 단일클론항체 TAB-004의 상보성결정영역들(CDRs)을 포함하는 항원 또는 상기 항원의 단편 또는 유도체, 및 활성 약물을 포함하는 조성물에 접촉시키는 단계를 포함하고, 선택적으로 상기 활성 약물은 요법제, 선택적으로 화학요법제, 독소, 방사성요법제 또는 그 조합을 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서,
    상기 요법제는 면역조절제를 포함하고, 상기 면역조절제는 선택적으로 인돌아민 2, 3-이산소화효소(IDO), 억제제, 선택적으로 1-메틸-DL-트립토판(1MT); 데/EP4 수용체 길항제; 고리형 산소화효소 억제제, 선택적으로 인도메타신; 그리고, 수지상 세포 활성화제, 선택적으로 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(CpG ODN)로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법.
  45. 암 치료를 받은 대상에서 암의 재발을 예지하는 방법으로,
    상기 방법은:
    (a) 암이 있는 대상으로부터 순환 셀을 포함하는 생체 시료를 분리하는 단계;
    (b) 상기 생체 시료를 제1항의 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체에 접촉시키되, 상기 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체가 상기 생체 시료에 존재한다면 존재하는 종양 그리고/또는 암세포에 존재하는 항원결정부에 결합하기에 충분한 조건하에서 접촉시키는 단계; 그리고,
    (c) 상기 생체 시료에서 제1항의 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체에 결합한 하나 이상의 순환 세포를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 생체 시료는 혈액 시료, 림프 시료 또는 상기 혈액 시료 또는 림프 시료의 부분을 포함하는 방법.
  47. 제45항에 있어서,
    상기 암은 췌장암 또는 유방암인 방법.
  48. 제45항에 있어서,
    상기 항체, 또는 상기 항체로부터 유도된 단편은 ATCC(American Type Culture Collection)에 접근 번호 PTA-11550로 2010년 12월 16일 기탁된 혼성세포주 TAB-004에 의해 생성된 단일클론 항체; 키메라 항체 또는 상기 키메라 항체의 단편 또는 유도체; 인간화 항체 또는 상기 인간화 항체의 단편 또는 유도체; 인간 항체 또는 상기 인간 항체의 단편 또는 유도체; 단일 사슬 항체 또는 상기 단일 사슬 항체의 단편 또는 유도체; 그리고, Fab 단편으로 구성된 그룹에서 선택되며,
    상기 키메라 항체, 상기 인간화 항체, 상기 인간 항체, 상기 단일 사슬 항체, 또는 상기 Fab 단편은 단일클론 항체 TAB-004의 CDRs를 포함하는 방법.
  49. 제48항에 있어서,
    상기 단일클론항체 TAB-004의 CDRs는 SEQ ID NO: 8을 포함하는 H 사슬 CDR1; SEQ ID NO: 9를 포함하는 H 사슬 CDR2; SEQ ID NO: 10을 포함하는 H 사슬 CDR3; SEQ ID NO: 11을 포함하는 L 사슬 CDR1; SEQ ID NO: 12를 포함하는 L 사슬 CDR2; 그리고, SEQ ID NO: 13을 포함하는 L 사슬 CDR3을 포함하는 방법.
  50. 제49항에 있어서,
    상기 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체는 SEQ ID NO: 5를 포함하는 또는 SEQ ID NO: 4를 포함하는 핵산분자에 의해 코딩되는 H 사슬 변이영역 그리고/또는 SEQ ID NO: 7을 포함하는 또는 SEQ ID NO: 6을 포함하는 핵산분자에 의해 코딩되는 L 사슬 변이영역을 포함하는 방법.
  51. 대상에서 암의 진행을 예지하는 방법으로,
    상기 방법은:
    (a) 암이 있는 대상으로부터 순환 셀을 포함하는 생체 시료를 분리하는 단계;
    (b) 상기 생체 시료를 제1항의 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체에 접촉시키되, 상기 분리된 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체가 상기 생체 시료에 존재한다면 존재하는 종양 그리고/또는 암세포에 존재하는 항원결정부에 결합하기에 충분한 조건하에서 접촉시키는 단계; 그리고,
    (c) 상기 생체 시료에서 제1항의 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체에 결합한 하나 이상의 순환 세포를 확인하는 단계를 포함하며,
    상기 방법에 의해서 대상에서 암의 진행이 예지되는 방법.
  52. 제51항에 있어서,
    상기 생체 시료는 혈액 시료, 림프 시료 또는 상기 시료의 부분인 방법.
  53. 제51항에 있어서,
    상기 암은 췌장암 또는 유방암인 방법.
  54. 제51항에 있어서,
    상기 항체, 또는 상기 항체로부터 유도된 단편은 ATCC(American Type Culture Collection)에 접근 번호 PTA-11550로 2010년 12월 16일 기탁된 혼성세포주 TAB-004에 의해 생성된 단일클론 항체; 키메라 항체 또는 상기 키메라 항체의 단편 또는 유도체; 인간화 항체 또는 상기 인간화 항체의 단편 또는 유도체; 인간 항체 또는 상기 인간 항체의 단편 또는 유도체; 단일 사슬 항체 또는 상기 단일 사슬 항체의 단편 또는 유도체; 그리고, Fab 단편으로 구성된 그룹에서 선택되며,
    상기 키메라 항체, 상기 인간화 항체, 상기 인간 항체, 상기 단일 사슬 항체, 또는 상기 Fab 단편은 단일클론 항체 TAB-004의 CDRs를 포함하는 방법.
  55. 제54항에 있어서,
    상기 단일클론 항체 TAB-004의 CRDs는 SEQ ID NO: 8을 포함하는 H 사슬 CDR1; SEQ ID NO: 9를 포함하는 H 사슬 CDR2; SEQ ID NO: 10을 포함하는 H 사슬 CDR3; SEQ ID NO: 11을 포함하는 L 사슬 CDR1; SEQ ID NO: 12를 포함하는 L 사슬 CDR2; 그리고, SEQ ID NO: 13을 포함하는 L 사슬 CDR3을 포함하는 방법.
  56. 제55항에 있어서,
    상기 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체는 SEQ ID NO: 5를 포함하는 또는 SEQ ID NO: 4를 포함하는 핵산분자에 의해 코딩되는 H 사슬 변이영역 그리고/또는 SEQ ID NO: 7을 포함하는 또는 SEQ ID NO: 6을 포함하는 핵산분자에 의해 코딩되는 L 사슬 변이영역을 포함하는 방법.
  57. 제51항에 있어서,
    상기 암의 진행은 상기 대상에서 상기 암의 전이를 포함하는 방법.
  58. SEQ ID ID NO: 4 및 SEQ ID ID NO: 6 중 적어도 하나를 포함하는 또는 SEQ ID NO: 5, 7~13 중 적어도 하나를 인코딩하는 분리된 핵산 분자.
  59. 제58항에 있어서,
    상기 분리된 핵산 분자는 벡터, 선택적으로 발현 벡터 내에 존재하는 분리된 핵산 분자.
  60. 제59항에 있어서,
    상기 분리된 핵산 분자는, 상기 발현 벡터를 적절한 숙주에 도입하면 SEQ ID NO: 5, 7~13 중 하나 이상을 포함하는 온전한 재조합 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 유도체가 상기 숙주에 의해 발현되도록, 상기 항체 분자의 부-서열을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열에 동작상 연결된 발현 벡터 내에 존재하는 핵산 분자.
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