KR20130143642A

KR20130143642A - 단백질s 이상증의 검출방법

Info

Publication number: KR20130143642A
Application number: KR1020137026208A
Authority: KR
Inventors: 나오타카 하마사키; 도모히데 쓰다; 시우리 진
Original assignee: 각코호진 큐슈분카가쿠엔
Priority date: 2011-03-14
Filing date: 2012-03-12
Publication date: 2013-12-31
Also published as: JP5839256B2; CN103429752A; EP2700718A1; KR101600817B1; US20140057308A1; CN103429752B; WO2012124654A1; EP2700718A4; EP2700718B1; US20160076078A1; JP2012191852A

Abstract

단백질S 이상증을 정확하고 간편하게 또한 신속하게 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 단백질S 이상증의 검출방법은, 시료 중의 총 단백질S 활성치 및 총 단백질S 단백질량을 측정하는 공정 및 상기 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량을 비교하는 공정을 포함하는 것이다.

Description

단백질S 이상증의 검출방법{METHOD FOR DETECTING PROTEIN S DEFICIENCY}

본 발명은 단백질S 이상증(蛋白質S 異常症)의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명은 특히 임상검사, 분자생물학 및 의학 등의 생명과학분야 등에 있어서 유용한 것이다.

단백질S는 생체 내의 혈액응고계의 제어기구에 있어서 중심적으로 기능하는 혈장 단백질이다.

이 단백질S는 주로 혈액 내에 존재하는 것으로서 활성화 단백질C의 보결인자(補缺因子, 보조인자)이며, 활성화 단백질C의 활성을 상승시킬 수 있어서 혈액 내의 활성화 단백질C의 활동에 필수적인 것이다.

또 활성화 단백질C는, 인간에 있어서의 혈액응고를 촉진하는 활성화 혈액응고 제V인자(제Ｖａ인자; ＦＶａ) 및 활성화 혈액응고 제ＶＩＩＩ인자(제ＶＩＩＩａ인자; ＦＶＩＩＩａ)를 분해함으로써 혈액응고 반응을 억제하는 역할을 담당하는 인자이다.

단백질S는 C4b결합단백질(보체(complement) 제4인자 b결합 단백질; C4ｂＢＰ)과 1대1로 특이적으로 결합하여 복합체를 형성한다. 즉 C4b결합단백질은 단백질S의 리간드(ligand)가 된다.

이 단백질S와 C4b결합단백질의 복합체형성 반응은 아래에 나타내는 바와 같으나 이 반응은 가역반응(可逆反應)이다.

그리고 인간 혈액 내에 있어서는 보통 단백질S와 비교해서 C4b결합단백질의 몰(mol) 농도가 작고 또 해리정수도 작기 때문에, 혈액 내에는 「단백질S」 및 「단백질S-C4b결합단백질 복합체」만이 존재한다. 즉 상기한 반응의 평형은 완전히 우측으로 기울어져 있게 된다.

보통 건강인의 혈액 내(혈장 중)의 단백질S는 그 약 60%가 「단백질S-C4b결합단백질 복합체」(즉, 결합형)이며, 그 약 40%는 「유리(遊離)상태의 단백질S」(즉, 유리형)이다.

또 유리단백질S(즉 유리형)만이 활성화 단백질C에 대한 보조효소활성을 나타내어, 활성화 단백질C의 활성을 상승시킬 수 있다.

또 본 명세서에 있어서, 「단백질S」 또는 「C4b결합단백질」 등에 대해서 특별히 복합체(또는 결합형) 또는 유리(또는 유리형) 등의 기재가 없는 경우에는, 각각 이들 물질의 복합체(또는 결합형) 및 유리상태(또는 유리형)인 것들의 총칭을 의미하는 것으로 한다.

아래에 단백질C 및 단백질S에 의한 혈액응고계의 제어기구의 도식도를 나타냈다.

단백질C는 생체 내에 있어서, 트롬빈ㆍ트롬보모듈린(thrombinㆍthrombomodulin) 복합체에 의하여 한정 분해되어 활성화 펩티드(peptide)가 유리함으로써 활성화되어 활성화 단백질C가 된다.

활성화 단백질C는 인간에 있어서 혈액응고를 촉진하는 활성화 혈액응고 제V인자 및 활성화 혈액응고 제ＶＩＩＩ인자를 분해함으로써, 혈액응고 반응을 억제하는 역할을 담당하는 세린프로테아제(serineprotease)이다.

단백질S는 활성화 단백질C의 보결인자(보조인자)이고, 단백질S의 존재에 의하여 활성화 단백질C의 활성이 상승하고, 활성화 단백질C에 의하여 활성화 혈액응고 제V인자의 분해반응 및 활성화 혈액응고 제ＶＩＩＩ인자의 분해반응은 촉진된다.

혈액응고 반응을 억제하는 기능을 갖는 단백질S의 활성의 저하 또는 이상(異常)은 생체 내에 있어서 혈전증(血栓症)을 야기하는 원인이 될 수 있다.

실제로 단백질S의 선천성 이상증자(先天性異常症者)는 높은 빈도로 심부정맥혈전증, 표재성 정맥염(表在性靜脈炎) 또는 폐경색(肺梗塞) 등의 정맥성 혈전증 또는 심부전의 원인이 되는 관상동맥혈전증 등의 동맥성 혈전증 등이 발병한다.

또한 파종성 혈관내 응고 신드롬(播種性血管內凝固症候群, ＤＩＣ), 비타민K 결핍증 또는 간기능 저하증 등에 있어서도 단백질S의 활성의 저하 또는 이상이 나타난다.

즉 혈장 등 시료 중의 단백질S의 활성을 측정함으로써 단백질S의 활성의 저하 또는 이상을 파악할 수 있고, 나아가 혈전증 등의 질환의 발병의 예측, 조기발견 및 치료효과의 판정 등에 중요한 역할을 해낸다.

그런데 시료 중의 단백질S의 활성을 측정하는 방법으로서, 시료를 뱀의 독으로부터의 단백질C-활성화제와 함께 활성화 단백질C의 형성하에서 인큐베이트하고, 혈액응고 제ＸＩＩ인자, 혈액응고 제ＶＩＩ인자 또는 혈액응고 제11인자(프로트롬빈(prothrombin))의 활성화제를 첨가하고, 또한 혈액응고 인자 및 그 활성화제에 의하여 매개되는, 프로트롬빈으로부터의 트롬빈의 형성의 감소를 색소원 트롬빈 기질을 사용하여 측광측정하는 방법이 개시되어 있다(특허문헌1 참조).

시료 중의 단백질S의 활성을 측정하는 별도의 방법으로서, 혈장시료에 단백질C를 활성화하는 단백질C 활성화 물질 또는 활성화 단백질C를 첨가하고, 다음으로 활성화 혈액응고 제ＩＸ인자를 더하여 인큐베이트하고, 생성된 트롬빈의 양을 알려진 방법으로 측정하고, 이것을 단백질S 활성에 있어서 기지(旣知)의 표본을 측정해서 얻은 값과 비교하여, 시료 중의 단백질S의 활성을 측정하는 방법이 개시되어 있다(특허문헌2참조).

또한 시료 중의 단백질S의 활성을 측정하는 별도의 방법으로서, 시료를 활성화 단백질C, 혈액응고 제ＶＩＩＩ인자, 인지질 및 칼슘이온과 인큐베이트하고, 다음으로 이 혼합물을 활성화 혈액응고 제ＩＩ인자(트롬빈), 활성화 혈액응고 제ＩＸ인자 및 활성화 혈액응고 제X인자와 인큐베이트하고, 다음으로 이 인큐베이션 혼합물(incubation 混合物)에 활성화 혈액응고 제X인자 특이성기질을 첨가하여, 이 기질의 개열(開裂)에 의하여 생성된 시그널의 양을 측정하는 것으로 이루어지는, 시료 중의 단백질S의 활성을 측정하는 방법이 개시되어 있다(특허문헌3참조).

이들 종래의 시료 중의 단백질S의 활성측정방법 및 활성측정시약에 있어서, 그 측정반응에 사용하는 혈액응고 반응의 성분(인자)의 적어도 하나는, 시료에 포함되어 있는 성분(인자)을 그대로 사용하는 것이었다. 즉 시료에 포함되어 있는 성분에 의존하고 있는 것이었다.

따라서, 이렇게 시료에 포함되어 있는 성분(인자)을 그대로 사용하는 종래의 시료 중의 단백질S의 활성측정방법 및 활성측정시약에 있어서, 그 성분(인자)〔예를 들면 활성화 혈액응고 제X인자〕가 그 시료 제공자에게 있어서 결손 또는 저하되어 있을 때에는, 상기 측정반응의 반응성분(인자)의 적어도 1개가 충분한 양이 존재하지 않기 때문에, 측정반응은 충분하게 진행되지 않고, 얻어지는 단백질S 활성치는 경우에 따라 본래의 값에서 괴리(乖離)되어, 오차를 포함하게 되는 문제가 있는 것이었다.

즉 측정치가 혈액응고 반응에 관계되는 성분(인자)에 있어서 시료 중의 존재량(농도) 또는 그 돌연변이(mutation)에 의하여 영향을 받아 버린다는 문제가 있었다.

따라서, 본 발명자들은 시료에서 유래하지 않는 활성화 단백질C, 인지질, 칼슘이온, 활성화 혈액응고 제V인자, 활성화 혈액응고 제X인자, 프로트롬빈 및 트롬빈의 기질을 함유하는 시료 중의 단백질S의 활성측정시약 및, 시료에서 유래하지 않는 활성화 단백질C, 인지질, 칼슘이온, 활성화 혈액응고 제V인자, 활성화 혈액응고 제X인자, 프로트롬빈 및 트롬빈의 기질을 시료와 접촉시키고, 다음으로 상기의 각 성분에 의한 반응의 결과 트롬빈의 기질로부터 생성되는 시그널량을 측정하고, 다음으로 시료에 포함되는 단백질S의 활성에 따라 생성이 억제된 시그널량을 구하는 것으로써, 시료 중에 포함되어 있는 단백질S의 활성치를 얻는, 시료 중의 단백질S의 활성측정방법을 발명하여 개시했다(특허문헌4 및 비특허문헌1 참조).

그러나 종래의 시료 중의 단백질S의 활성측정방법 및 활성측정시약은 모두 유리단백질S(유리형)의 활성을 측정하는 것이었다.

즉, 종래의 시료 중의 단백질S의 활성측정방법 및 활성측정시약은 모두 시료 중에 존재하는 모든 단백질S〔단백질S와 C4b결합단백질의 복합체(결합형) 및 유리단백질S(유리형)〕를, 즉 총 단백질S의 활성을 측정할 수는 없는 것이었다.

그런데 단백질S 이상증은 반복해서 혈전증을 발병시키는 것으로 알려져 있고, 특히 단백질S 유전자 돌연변이는 아시아인에게 높은 빈도로 존재하는 것이 최근 많이 보고되고 있다.

예를 들면 일본인의 정맥혈전색전증(ＶｅｎｏｕｓＴｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ; ＶＴＥ)의 리스크 팩터(risk factor)의 하나로서 주목받고 있는 단백질S 토쿠시마(ＰＳ-K155E 유전자 돌연변이)가 그 중 하나이다.

또 단백질S 토쿠시마 등의 유전자 돌연변이에 의한 단백질S의 분자 이상은, 단백질ＳＩＩ형 이상증으로 분류되며 혈중에 분비되는 단백질S 단백질량은 정상이지만 단백질S 활성이 저하하는 것이다.

이 단백질S의 활성의 저하를 동반하는 단백질S 이상증의 검출은, 정맥혈전색전증 등의 혈전증 등의 질환의 예방, 진단 및 치료에 도움이 될 것이라고 생각된다.

그러나 이 단백질S 이상증은 종래의 방법 및 시약으로는 간편하고 또한 정확하게 검출하는 것이 곤란하다고 보고되어 있다(비특허문헌2 참조).

특허문헌1: 일본국 공개특허공보 특개소62-212569호 공보 특허문헌2: 일본국 특표평4-506603호 공보 특허문헌3: 일본국 특표평6-504682호 공보 특허문헌4: 일본국 공개특허 특개 2004-337143호 공보

비특허문헌1: ＣｌｉｎＣｈｅｍＬａｂＭｅｄ, 2004, Ｖｏｌ.42, Ｎｏ.3, p.350-352 비특허문헌2: ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓａｎｄＨａｅｍｏｓｔａｓｉｓ, 2006, Ｖｏｌ.4, p.2010-2013

본 발명의 과제는 단백질S 이상증을 정확하고 간편하며 또한 신속하게 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 단백질S 이상증의 검출방법에 대하여 검토를 거듭한 바, 시료 중의 총 단백질S 활성치 및 총 단백질S 단백질량(總蛋白質S 蛋白質量)을 측정하여 이들을 비교함으로써, 상기 과제를 해결할 수 있음을 밝혀내고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉 본 발명은 이하의 발명으로 이루어진다.

(1) 단백질S 이상증의 검출방법으로서, 시료 중의 총 단백질S 활성치 및 총 단백질S 단백질량을 측정하는 공정 및 상기 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량을 비교하는 공정을 포함하는 단백질S 이상증의 검출방법.

(2) 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량을 비교하여, 이 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량이 괴리하는 경우에는, 단백질S 이상증이거나 또는 그 의심이 된다고 판정하는 상기 (1)에 기재된 단백질S 이상증의 검출방법.

(3) 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량을 비교하는 것이, 이 총 단백질S 활성치를 이 총 단백질S 단백질량으로 나눈 비활성을 구하는 것인, 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 단백질S 이상증의 검출방법.

본 발명의 단백질S 이상증의 검출방법은 단백질S 이상증을 정확하고 간편하게 또한 신속하게 검출할 수 있는 것이다.

따라서, 본 발명의 단백질S 이상증의 검출방법을 사용함으로써, 단백질S의 이상증을 간편하고 또한 정확하게 검출하고, 혈전증 등의 질환의 예방, 진단 및 치료 등에 도움이 될 수 있다.

도1은, 시료 중의 총 단백질S의 활성치의 측정결과와 시료 중의 총 단백질S의 단백질량의 측정결과의 비교를 나타내는 도면이다.

I. 단백질S 이상증의 검출방법의 총론

본 발명의 단백질S 이상증의 검출방법은, 시료 중의 총 단백질S 활성치 및 총 단백질S 단백질량을 측정하는 공정 및, 상기 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량을 비교하는 공정을 포함하는 것이다.

총 단백질S 활성치를 측정한다는 것은, 시료 중에 존재하는 모든 단백질S〔단백질S와 C4b결합단백질의 복합체(결합형) 및 유리단백질S(유리형)〕에 대하여 그 활성을 측정하는 것이다.

즉, 「유리단백질S(유리형)」의 활성에 더하여, 「단백질S와 C4b결합단백질의 복합체(결합형)」에 포함되는 단백질S가 유리단백질S(유리형)이 되었을 경우에 발현되는 활성도 함께 측정하는 것이다.

또한 총 단백질S 단백질량을 측정한다는 것은, 시료 중에 존재하는 모든 단백질S〔단백질S와 C4b결합단백질의 복합체(결합형) 및 유리단백질S(유리형)〕에 대하여 그 단백질량을 측정하는 것이다.

즉, 「유리단백질S(유리형)」의 단백질량에 더하여, 「단백질S와 C4b결합단백질의 복합체(결합형)」에 포함되는 단백질S의 단백질량도 함께 측정하는 것이다.

본 발명에 있어서 총 단백질S 활성치를 측정하는 방법(활성측정방법) 및 시약(활성측정시약)은 특별하게 한정되지 않고, 총 단백질S의 활성치를 측정할 수 있는 방법 및 시약이면 어떤 것이라도 좋다.

또한 본 발명에 있어서 총 단백질S 단백질량을 측정하는 방법(측정방법) 및 시약(측정시약)은 특별하게 한정되지 않고, 총 단백질S의 단백질량을 측정할 수 있는 방법 및 시약이면 어떤 것이라도 좋다.

다음으로 시료 중의 총 단백질S 활성치 및 총 단백질S 단백질량의 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량을 비교하는 공정에 있어서, 비교하는 방법에 대하여는 적절하게 정하면 좋고, 특별하게 한정되지 않는다.

이 비교방법에 대하여는, 예를 들면 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치의 수치와, 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 단백질량의 수치를 비교하는 것이나,

측정에 의하여 얻어진 총 단백질S 활성치를 그래프의 세로축(가로축도 좋다)에 플롯하고, 측정에 의하여 얻어진 총 단백질S 단백질량을 그래프의 가로축(세로축도 좋다)에 플롯하여, 이 그래프 상에서 비교하는 것이나 또는 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치를 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 단백질량으로 나눈 비활성을 구하는 것 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서는, 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량의 비교를, 이 총 단백질S 활성치를 이 총 단백질S 단백질량으로 나눈 비활성을 구함으로써 하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서는, 예를 들면 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량을 비교하여, 이 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량이 괴리하는 경우에는 단백질S 이상증이거나 또는 그 의심이 된다고 할 수 있다.

예를 들면 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치의 수치와 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 단백질량의 수치를 비교하여 괴리하는 경우에는, 단백질S 이상증이거나 또는 그 의심이 된다고 할 수 있다.

또한 예를 들면, 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치를 그래프의 세로축(가로축도 좋다)에 플롯하고, 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 단백질량을 그래프의 가로축(세로축도 좋다)에 플롯하여, 이 그래프 상에 있어서 판정의 결과, 이 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량이 괴리하는 경우에는 단백질S 이상증이거나 또는 그 의심이 된다고 할 수 있다.

예를 들면 이 그래프 상에 상기한 바와 같이 플롯한 점(데이터)이 y=x의 선(식) 위에 없고, 이 ｙ=x의 선(식)에서 떨어져 있는 경우에는, 괴리한다고 판정할 수도 있다.

또한 단백질S 이상증이 아님이 확인된 복수의 사람에 대하여 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량을 측정하고, 이 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량을 상기한 바와 같이 그래프 상에 플롯하고, 이 단백질S 이상증이 아님이 확인된 사람들의 시료에 대하여 플롯한 점(데이터)의 집합(또는 이 집합을 나타내는 식)과 대비하여, 이 집합(또는 이 집합을 나타내는 식)에서 떨어져 있는 경우에는, 괴리한다고 판정할 수도 있다.

또한 예를 들면, 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치를 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 단백질량으로 나눈 비활성을 구하는 것으로써, 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량을 비교하여, 이 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량이 괴리하는 경우에는, 단백질S 이상증이거나 또는 그 의심이 된다고 할 수 있다.

측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치를 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 단백질량으로 나눈 비활성을 구하는 것은, 예를 들면 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치의 수치를 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 단백질량의 수치로 나눔으로써 이 비활성을 구할 수 있지만, 또한 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치를 그래프의 세로축에 플롯하고, 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 단백질량을 그래프의 가로축에 플롯하여, 그래프를 작성하는 것 등에 의하여도 이 비활성을 구할 수 있다.

그리고 상기와 같이 하여, 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치를 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 단백질량으로 나눈 비활성을 구하고, 이 비활성의 값이 1이 아니고 1 보다 작게 떨어져 있는 값일 때는, 괴리한다고 판정할 수도 있다.

또한 단백질S 이상증이 아님이 확인된 복수의 사람에 대하여 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량을 측정하고, 이 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치를 이 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 단백질량으로 나누어서 비활성을 구하고, 이 단백질S 이상증이 아님이 확인된 사람들의 시료에 관한 비활성의 값의 집합(또는 이 집합을 나타내는 식)과 대비하여, 이 집합(또는 이 집합을 나타내는 식)에서 떨어져 있는 경우에는, 괴리한다고 판정할 수도 있다.

또, 이 단백질S 이상증이 아님이 확인된 사람들의 시료에 관한 비활성의 값의 집합(또는 이 집합을 나타내는 식)과 대비하여, 이 집합(또는 이 집합을 나타내는 식)에서 떨어져 있는 경우에는, 괴리한다고 판정하지만, 단백질S 이상증이 아님이 확인된 사람들의 시료에 관한 비활성 값의 집합에 있어서 표준편차의 2배 범위(보다 바람직하게는 이 표준편차의 3배의 범위)를 벗어나는 경우에는, 이 집합으로부터 떨어져 있고, 괴리한다고 판정하더라도 좋다.

또한 예를 들면, 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치를 그래프의 세로축에 플롯하고, 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 단백질량을 그래프의 가로축에 플롯하는 등 하여, 이 그래프 상에 비활성이 나타나도록 하고, 이 그래프 상에 나타난 비활성으로부터 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량이 괴리한다고 판정할 수 있는 경우에는, 단백질S 이상증이거나 또는 그 의심이 된다고 할 수 있다.

예를 들면 이 그래프 상에 상기한 바와 같이 플롯한 비활성의 점(데이터)이 y=x의 선(식) 위에 없고, 이 ｙ=x의 선(식)보다 아래로 떨어져 있는 경우에는, 괴리한다고 판정하고, 단백질S 이상증이거나 또는 그 의심이 된다고 할 수도 있다.

또한 단백질S 이상증이 아님이 확인된 복수의 사람에 대하여 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량을 측정하고, 이 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량을 상기한 바와 같이 그래프 상에 플롯하여, 이 그래프 상에 비활성이 나타나도록 하고, 이 단백질S 이상증이 아님이 확인된 사람들의 시료에 대하여 플롯한 비활성의 점(데이터)의 집합(또는 이 집합을 나타내는 식)과 대비하여, 이 집합(또는 이 집합을 나타내는 식)보다 아래로 떨어져 있는 경우에는, 괴리한다고 판정하고, 단백질S 이상증이거나 또는 그 의심이 된다고 할 수도 있다.

또, 이 단백질S 이상증이 아님이 확인된 복수의 사람에 대하여 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량을 측정하고, 이 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량을 상기한 바와 같이 그래프 상에 플롯하여, 이 그래프 상에 비활성이 나타나도록 하고, 이 단백질S 이상증이 아님이 확인된 사람들의 시료에 대하여 플롯한 비활성의 점(데이터)의 집합(또는 이 집합을 나타내는 식)과 대비하여, 이 집합(또는 이 집합을 나타내는 식)에서 떨어져 있는 경우에는, 괴리한다고 판정하지만, 단백질S 이상증이 아님이 확인된 사람들의 시료에 대하여 플롯한 비활성의 점(데이터)의 집합으로부터 평균치와 표준편차(이하, 「ＳＤ」라고도 한다)를 구하고, 평균-2ＳＤ(더 바람직하게는, 평균-3ＳＤ) 이하인 경우에는, 이 집합에서 떨어져 있고, 괴리한다고 판정하더라도 좋다.

ＩＩ．시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법

앞에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 있어서 총 단백질S 활성치를 측정하는 방법(활성측정방법) 및 시약(활성측정시약)은 특별하게 한정되지 않고, 총 단백질S의 활성치를 측정할 수 있는 방법 및 시약이면 어떤 것이라도 좋지만, 이하에서 이 시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법의 예에 대하여 설명한다.

Ｉ．총론

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서, 총 단백질S 활성의 측정반응시에 계면활성제를 존재시키는 것이 바람직하다.

또, 시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서는, 단백질S에 의한 활성화 단백질C의 활성상승 반응시 및 당해 활성상승한 활성화 단백질C에 의한 활성화 혈액응고 제V인자의 분해반응시에 계면활성제를 존재시키는 것이 바람직하다.

또한 시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서는, 총 단백질S 활성의 측정반응시에 포스파티딜콜린(phophatidylcholine), 포스파티딜세린(phophatidylserine) 및 포스파티딜에탄올아민으로 이루어진 인지질을 존재시키는 것이 바람직하다.

그리고 시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서는, 단백질S에 의한 활성화 단백질C의 활성상승 반응시 및 당해 활성상승한 활성화 단백질C에 의한 활성화 혈액응고 제V인자의 분해반응시에 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린 및 포스파티딜에탄올아민으로 이루어진 인지질을 존재시키는 것이 바람직하다.

또한 시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법은, 시료 중의 총 단백질S 활성의 측정이, 다음의 (a)∼(c)의 공정을 포함하는 방법에 의하여 이루어지는 것이 바람직하다.

(a) 활성화 단백질C, 계면활성제, 인지질, 칼슘이온, 활성화 혈액응고 제V인자, 활성화 혈액응고 제X인자, 프로트롬빈 및 트롬빈의 기질을 시료와 접촉시킨다.

(b) 다음으로 상기 (a)의 각 성분에 의한 반응의 결과 트롬빈의 기질로부터 생성되는 시그널량을 측정한다.

(c) 다음으로 이 시료에 포함되는 총 단백질S의 활성에 따라 생성이 억제된 시그널량에 의해, 시료 중에 포함되어 있는 총 단백질S의 활성치를 얻는다.

또한 시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서는, 시료 중의 총 단백질S 활성의 측정이, 다음의 (a)∼(e)의 공정을 포함하는 방법에 의하여 이루어지는 것이 바람직하다.

(a) 시료와, 적어도 활성화 단백질C, 계면활성제, 인지질 및 칼슘이온을 접촉시킴으로써, 시료에 단백질S가 포함되는 경우에는 활성화 단백질C의 활성이 상승한다.

(b) 다음으로 상기 (a)의 성분 및 활성화 혈액응고 제V인자의 존재하에서, 활성화 단백질C가 촉매하는 활성화 혈액응고 제V인자의 분해반응이, 상기 (a)에 있어서의 활성화 단백질C의 활성의 상승에 의하여 촉진된다.

(c) 다음으로 활성화 혈액응고 제V인자에 의하여 촉진되는, 인지질 및 칼슘이온의 존재하에서 활성화 혈액응고 제X인자가 촉매하는 프로트롬빈으로부터 트롬빈을 생성시키는 반응이, 상기 (b)에 있어서의 활성화 혈액응고 제V인자의 분해반응이 촉진됨으로써 억제되어서 트롬빈의 생성이 감소된다.

(d) 다음으로 상기 (c)에 있어서의 트롬빈의 생성의 감소에 의하여 트롬빈이 촉매하는 트롬빈의 기질로부터 시그널을 생기게 하는 반응이 억제된다.

(e) 다음으로 상기 (d)에 있어서의 반응의 억제에 의하여 생성이 억제된 시그널량을 측정함으로써, 시료 중에 포함되어 있는 총 단백질S의 활성치를 얻는다.

2. 시료 중의 총 단백질S의 활성측정의 방법

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서의 측정방법으로서, 다음의 (1) 또는 (2)에 기재된 방법 등을 들 수 있고, 이들 방법 등에 의하여 이루어지는 것이 바람직하다.

(1)

(a) 활성화 단백질C, 계면활성제, 인지질, 칼슘이온, 활성화 혈액응고 제V인자(제Ｖａ인자; ＦＶａ), 활성화 혈액응고 제X인자(제Ｘａ인자; ＦＸａ), 프로트롬빈 및 트롬빈의 기질을 시료와 접촉시킨다.

이들 성분과 시료의 접촉은, 1회에 모든 성분과 접촉하게 하여 하기 반응계의 모든 반응을 1단계로 행하여도 좋고(1스텝법), 또한 상기 성분을 나누어서 접촉을 복수 단계로 나누어 함으로써 하기 반응계의 반응을 복수 단계로 나누어 행하여도 좋다(다스텝법).

(b) 상기 (a)에 있어서의 접촉에 의하여 상기의 각 성분에 의한 하기의 반응이 진행한다.

그리고 이 일련의 반응에 의하여 트롬빈의 기질로부터 생성되는 시그널량을 측정한다.

즉 상기의 일련의 반응에 의하여 트롬빈의 기질이 트롬빈에 의하여 분해 등의 작용을 받고, 이 결과 발생하는 시그널의 양(예를 들면 흡광도 등)을 측정한다.

(c) 시료에 단백질S가 포함되어 있는 경우에는, 활성화 단백질C가 인지질 및 칼슘이온의 존재하에 활성이 상승하고, 이에 따라 활성화 혈액응고 제V인자의 분해가 촉진되므로, 그 결과 트롬빈이 촉매하는 트롬빈의 기질로부터 시그널을 생기게 하는 반응이 억제되어서, 시그널의 생성이 억제된다.

이 시그널 생성의 억제도(抑制度)는 시료에 포함되어 있는 총 단백질S의 활성치에 따라서 커지게 된다.

따라서 상기 (b)에 있어서 시그널량을 측정함으로써 생성이 억제된 시그널량을 측정하게 되고, 이에 따라 시료 중에 포함되어 있는 총 단백질S의 활성치를 얻을 수 있다.

(2)

활성화 단백질C, 계면활성제, 인지질, 칼슘이온, 활성화 혈액응고 제V인자(제Ｖａ인자; ＦＶａ), 활성화 혈액응고 제X인자(제Ｘａ인자; ＦＸａ), 프로트롬빈 및 트롬빈의 기질로 구성되는 다음의 반응계를 사용하여 시료 중의 단백질S의 활성치를 측정하는 방법으로서,

(a) 시료와, 적어도 활성화 단백질C, 계면활성제, 인지질 및 칼슘이온을 접촉시킨다.

이에 따라 시료에 단백질S가 포함되는 경우에는 인지질 및 칼슘이온의 존재하에 활성화 단백질C의 활성이 상승한다.

(b) 활성화 단백질C의 상기 (a)에 있어서의 활성의 상승에 의하여, 활성화 단백질C가 인지질 및 칼슘이온의 존재하에 촉매하는 활성화 혈액응고 제V인자의 분해반응이, 계면활성제의 공존하에서 촉진된다.

(c) 활성화 혈액응고 제V인자에 의하여 촉진된, 인지질 및 칼슘이온의 존재하에 활성화 혈액응고 제X인자가 촉매하는 프로트롬빈으로부터 트롬빈을 생성시키는 반응이, 상기 (b)에 있어서의 활성화 혈액응고 제V인자의 분해반응이 촉진됨으로써 억제되어서, 트롬빈의 생성이 감소한다.

(d) 상기 (c)에 있어서의 트롬빈의 생성의 감소에 의하여 트롬빈이 촉매하는 트롬빈의 기질로부터 시그널을 생기게 하는 반응이 억제된다.

또, 이 시그널 생성의 억제도는, 시료에 포함되어 있는 총 단백질S의 활성에 따라서 커지게 된다.

(e) 상기 (d)에 있어서의 반응의 억제에 의하여 생성이 억제된 시그널량을 측정한다.

이상과 같이 상기의 반응에 의하여 생성된 시그널량을 측정하여, 즉 생성이 억제된 시그널량을 측정함으로써, 시료 중에 포함되어 있는 총 단백질S의 활성치를 얻는다.

3. 시료

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서, 시료란, 단백질S를 함유할 가능성이 있는 물질이다.

이 시료로서, 예를 들면 생체시료(인간 또는 동물 등으로부터 유래하는 시료) 등을 들 수 있다.

생체시료로서는, 예를 들면 혈액, 혈장, 타액, 땀, 뇨, 눈물, 수액(髓液), 복수(腹水), 양수(羊水) 등의 생체의 액체; 간장, 심장, 뇌, 뼈, 모발, 피부, 손발톱, 근육, 신경조직 등의 장기, 조직, 세포 등의 추출액 등을 들 수 있다.

4. 활성화 단백질C

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서 사용하는 활성화 단백질C는, 그 유래(기원)나 조제 방법에 상관없이 특별히 제한되지 않고 사용할 수 있다.

예를 들면 인간, 소 또는 돼지 등의 포유동물로부터 유래하는 것 등을 들 수 있다. 또한 혈장 등의 체액 또는 장기 등으로부터 정제하여 조제한 것이나, 또는 유전자공학조작, 세포공학조작 혹은 세포배양조작 등에 의하여 조제한 것 등을 들 수 있다.

또한 시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서의 측정반응 중에, 단백질 C활성화 물질 등에 의하여 단백질C로부터 활성화 단백질C를 생성시켜서, 이것을 본 발명에 있어서의 활성화 단백질C로서 사용하여도 좋다.

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서, 활성화 단백질C는 시료와 접촉함으로써 시료 중에 단백질S가 포함되어 있는 경우에는, 인지질 및 칼슘이온의 존재하에서 이 활성화 단백질C의 활성이 상승한다.

그리고 활성화 단백질C는 인지질 및 칼슘이온의 존재하에서 활성화 혈액응고 제V인자를 분해하는 반응의 촉매가 된다.

따라서 단백질S가 존재함으로써 활성화 단백질C가 활성화 혈액응고 제V인자를 분해하는 반응은 촉진된다.

상기의 활성화 단백질C 등과 시료를 접촉시키는 것과, 활성화 단백질C를 활성화 혈액응고 제V인자 등과 접촉시키는 것은 동시에 행하여도 좋다.

또한 활성화 단백질C를 인지질과 함께 시료와 접촉시켜, 적어도 1분간 이상, 바람직하게는 5분간 이상, 실온 또는 37℃ 등에 있어서 인큐베이트한 후에, 활성화 혈액응고 제V인자 및 칼슘이온과 접촉시켜서 인큐베이트하여, 활성화 혈액응고 제V인자의 분해반응을 하게 하여도 좋다.

이 활성화 단백질C를 사용할 때의 농도는, 활성화 혈액응고 제V인자와 접촉시켜서 계면활성제, 인지질 및 칼슘이온의 존재하에 활성화 혈액응고 제V인자를 분해시킬 때에는, 보통 1ｐＭ∼100ｎＭ인 것이 바람직하다.

그러나 측정의 감도를 높게 얻기 위해서는, 활성화 단백질C 농도가 높은 편이 바람직하므로, 상기의 활성화 단백질C 농도로서는 10ｐＭ∼10ｎＭ인 것이 더 바람직하고, 100ｐＭ∼ｌｎＭ인 것이 특히 바람직하다.

5. 계면활성제

총 단백질S의 활성측정방법에 있어서는, 당해 총 단백질S 활성의 측정반응시에 계면활성제를 존재시키는 것이 바람직하다.

이 계면활성제는, 비이온성 계면활성제, 양(兩)이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제 또는 양(陽)이온성 계면활성제 등의 각종 계면활성제 등을 1종 또는 2종 이상 적절하게 존재시키면 좋다.

이 계면활성제로서는, 예를 들면 소르비탄 지방산 에스테르, 글리세린 지방산 에스테르, 데카글리세린 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌글리세린 지방산 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르, 폴리옥시에틸렌 피토스테롤, 피토스타놀, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 경화 피마자유 또는 폴리옥시에틸렌 라놀린 등의 비이온성 계면활성제; 아세트산 베타인 등의 양성(兩性) 계면활성제; 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 황산염 또는 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 아세트산염 등의 음이온성 계면활성제 등을 들 수 있다.

이 계면활성제가 비이온성 계면활성제인 경우, 그 ＨＬＢ(Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ-ＬｉｐｏｐｈｉｌｅＢａｌａｎｃｅ)는 10∼20의 범위인 것이 바람직하고, 12∼18의 범위인 것이 더 바람직하고, 13∼16의 범위인 것이 특히 바람직하다.

이 계면활성제는, 비이온성 계면활성제로서는, Ｔｒｉｔｏｎ X-100〔폴리옥시에틸렌(n=9,10)p-t-옥틸페닐에테르, ＨＬＢ:13.5〕, Ｔｒｉｔｏｎ X-114〔폴리옥시에틸렌(n=7,8)p-t-옥틸페닐에테르, ＨＬＢ:12.4〕, ＮＰ-10〔폴리옥시에틸렌(n=10)노닐페닐에테르, ＨＬＢ:16.5〕, ＮＰ-11〔폴리옥시에틸렌(n=11)노닐페닐에테르〕, ＮＰ-12〔폴리옥시에틸렌(n=12)노닐페닐에테르〕, ＮＰ-13〔폴리옥시에틸렌(n=13)노닐페닐에테르〕, ＮＰ-15〔폴리옥시에틸렌(n=15)노닐페닐에테르, ＨＬＢ:18.0〕, ＢＴ-9〔폴리옥시에틸렌(n=9) 2급 알킬에테르, ＨＬＢ:13.5〕, 또는 ＢＴ-12〔폴리옥시에틸렌(n=12) 2급 알킬에테르, ＨＬＢ:14.5〕 등이 바람직하다.

또한 양(兩)이온성 계면활성제로서는, ＡＭ-301〔라우릴디메틸아미노아세트산 베타인수용액〕 등이 바람직하다.

그리고 음이온성 계면활성제로서는, 사르코시네이트ＬＮ〔라우로일사르코신나트륨〕 등이 바람직하다.

또한 양(陽)이온성 계면활성제로서는, ＣＡ-2350〔염화 세틸트리메틸암모늄〕 등이 바람직하다.

총 단백질S 활성의 측정반응시에 계면활성제를 존재시킬 때의 농도는 특별하게 한정되는 것은 아니지만, 0.00001∼5%(W/V)가 바람직하고, 0.0001∼1%(W/V)가 보다 바람직하고, 0.001∼0.1%(W/V)가 더 바람직하고, 0.005∼0.05%(W/V)가 특히 바람직하다.

그리고 비이온성 계면활성제에 있어서는 0.001∼0.01%(W/V)가 매우 바람직하고, 양(兩)이온성 계면활성제에 있어서는 0.001∼0.01%(W/V)가 매우 바람직하고, 음이온성 계면활성제에 있어서는 0.001∼0.1%(W/V)가 매우 바람직하고, 양(陽)이온성 계면활성제에 있어서는 0.00001∼0.001%(W/V)가 매우 바람직하다.

총 단백질S의 활성측정방법에 있어서는, 시료 중에 포함되어 있는 단백질S에 의한 활성화 단백질C의 활성상승 반응시 및 당해 활성상승한 단백질C에 의한 활성화 혈액응고 제V인자의 분해반응시에, 계면활성제를 존재시키는 것이 시료 중의 총 단백질S의 활성측정을 위하여 바람직하다.

6. 인지질

(1) 총론

총 단백질S의 활성측정방법에 있어서는, 총 단백질S 활성의 측정반응시에 인지질을 존재시킨다.

이 인지질은 그 유래(기원)나 조제방법에 관계없이 특별히 제한되지 않고 사용할 수 있다.

예를 들면 인간, 소 또는 돼지 등의 포유동물로부터 유래하는 것, 그 이외의 동물로부터 유래하는 것, 식물로부터 유래하는 것, 미생물로부터 유래하는 것 또는 인공적으로 합성한 것 등을 들 수 있다.

총 단백질S 활성의 측정반응시에 인지질을 존재시킬 때의 농도는, 보통 0.03μM∼100μM인 것이 바람직하고, 0.3μM∼50μM인 것이 더 바람직하고, 3μM∼30μM인 것이 특히 바람직하다.

이 인지질로서는, 예를 들면 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤 또는 디포스파티딜글리세롤 등의 글리세롤인지질이나, 또는 스핑고미엘린 등의 스핑고인지질 등을 들 수 있다.

이 인지질로서는, 총 단백질S 활성의 측정반응시에 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린 및 포스파티딜에탄올아민으로 이루어진 인지질을 존재시키는 것이 시료 중의 총 단백질S의 활성측정을 위하여 바람직하다.

또한 이 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린 및 포스파티딜에탄올아민으로 이루어진 인지질을 존재시키는 경우, 이 3종류의 인지질의 조성으로서는, 포스파티딜에탄올아민의 조성비가 10%(W/Ｖ) 이상이며 또한 포스파티딜세린의 조성비가 20%(W/Ｖ) 이상인 것이 바람직하다.

특히, 포스파티딜에탄올아민의 조성비가 30%(W/Ｖ) 이상이며 또한 포스파티딜세린의 조성비가 30%(W/Ｖ) 이상인 것이 바람직하다.

(2) 활성화 단백질C에 의한 촉매반응에 사용하는 인지질

총 단백질S의 활성측정방법에 있어서는, 시료 중에 포함되어 있는 단백질S에 의한 활성화 단백질C의 활성상승 반응시 및 이 활성화 단백질C에 의한 활성화 혈액응고 제V인자의 분해반응 시에는, 그 활성화 단백질C의 활성상승 반응 및 활성화 혈액응고 제V인자의 분해반응에 필요한 인지질을 존재시킨다.

상기의 활성화 단백질C의 활성상승 반응시 및 활성화 혈액응고 제V인자의 분해반응시에 인지질을 존재시킬 때의 농도는, 보통 0.1μM∼100μM인 것이 바람직하고, 1μM∼50μM인 것이 더 바람직하고, 10μM∼30μM인 것이 특히 바람직하다.

이 인지질로서는, 상기의 활성화 단백질C의 활성상승 반응시 및 활성화 혈액응고 제V인자의 분해반응시에, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린 및 포스파티딜에탄올아민으로 이루어진 인지질을 존재시키는 것이, 시료 중의 총 단백질S의 활성측정을 위하여 바람직하다.

(3) 활성화 혈액응고 제X인자에 의한 촉매반응에 사용하는 인지질

총 단백질S의 활성측정방법에 있어서는, 활성화 혈액응고 제V인자의 존재하에 활성화 혈액응고 제X인자가 촉매하는 프로트롬빈으로부터 트롬빈을 생성시키는 반응시에는, 그 반응에 필요한 인지질을 존재시킨다.

상기의 프로트롬빈으로부터 트롬빈을 생성시키는 반응시에 인지질을 존재시킬 때의 농도는, 보통 0.1μM∼100μM인 것이 바람직하고, 0.5μM∼50μM인 것이 더 바람직하고, 1μM∼10μM인 것이 특히 바람직하다.

이 인지질로서는, 상기의 프로트롬빈으로부터 트롬빈을 생성시키는 반응시에, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜세린, 또는 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린 및 포스파티딜에탄올아민으로 이루어진 인지질을 존재시키는 것이, 상기 반응의 촉진효과가 높아지므로 바람직하다.

또한 이 포스파티딜콜린 및 포스파티딜세린으로 이루어진 인지질을 존재시키는 경우, 이 2종류의 인지질의 조성으로서는, 포스파티딜콜린의 조성비가 85%(W/V)∼50%(W/V)이고, 또한 포스파티딜세린의 조성비가 15%(W/V)∼50%(W/V)인 것이 바람직하다.

특히 포스파티딜콜린의 조성비가 80%(W/V)∼70%(W/V)이고 또한 포스파티딜세린의 조성비가 20%(W/V)∼30%(W/V)인 것이 바람직하다.

또는 이 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린 및 포스파티딜에탄올아민으로 이루어진 인지질을 존재시키는 경우, 이 3종류의 인지질의 조성으로서는, 포스파티딜에탄올아민의 조성비가 10%(W/Ｖ) 이상이며 또한 포스파티딜세린의 조성비가 20%(W/Ｖ) 이상인 것이 바람직하다.

특히 포스파티딜에탄올아민의 조성비가 30%(W/Ｖ) 이상이며 또한 포스파티딜세린의 조성비가 30%(W/Ｖ) 이상인 것이 바람직하다.

또, 이 프로트롬빈으로부터 트롬빈을 생성시키는 반응시의 인지질로서는, 상기의 활성화 단백질C의 활성상승 반응시 및 활성화 혈액응고 제V인자의 분해반응시에 사용한 인지질을 그대로 사용할 수 있다.

그러나 전술한 대로 적절한 인지질의 조성이 각각의 반응에 따라서 다르기 때문에, 각각의 반응에 적절한 조성의 인지질을 그 반응시에 존재시켜서 사용하는 것이 바람직하다.

이 프로트롬빈으로부터 트롬빈을 생성시키는 반응시에 먼저 가한, 상기의 활성화 단백질C의 활성상승 반응 및 활성화 혈액응고 제V인자의 분해반응에 적절한 조성의 인지질이, 이 프로트롬빈으로부터 트롬빈을 생성시키는 반응에 적절한 조성의 인지질과 공존한다고 하더라도, 본 발명의 시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법 및 활성측정시약에 있어서는 전혀 지장이 없다.

7. 칼슘이온

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서는, 시료 중에 포함되어 있는 단백질S에 의한 활성화 단백질C의 활성상승 반응시, 활성화 단백질C에 의한 활성화 혈액응고 제V인자의 분해반응시, 및 활성화 혈액응고 제X인자 및 활성화 혈액응고 제V인자에 의한 프로트롬빈으로부터 트롬빈을 생성시키는 반응 시에는, 칼슘이온을 존재시킨다.

이 칼슘이온으로서는 칼슘이온 자체는 물론이고, 칼슘의 염 등의칼슘이온을 포함하는 화합물이면, 특별히 제한되지 않고 사용할 수 있다.

이 칼슘이온을 포함하는 화합물로서는, 예를 들면 불화칼슘, 염화칼슘, 브롬화칼슘, 요오드화칼슘, 황산칼슘, 질산칼슘, 아세트산칼슘, 유산칼슘 또는 시안화칼슘 등을 들 수 있다.

이 칼슘이온을 사용할 때의 농도는, 시료 중에 포함되어 있는 단백질S에 의한 활성화 단백질C의 활성상승 반응시, 활성화 단백질C에 의한 활성화 혈액응고 제V인자의 분해반응시, 그리고 활성화 혈액응고 제X인자 및 활성화 혈액응고 제V인자에 의한 프로트롬빈으로부터 트롬빈을 생성시키는 반응시에는, 보통 0.1ｍＭ∼100ｍＭ인 것이 바람직하고, 1ｍＭ∼10ｍＭ인 것이 특히 바람직하다.

8. 활성화 혈액응고 제V인자

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서 사용하는 활성화 혈액응고 제V인자(제Ｖａ인자; ＦＶａ)는, 그 유래(기원)나 조제방법에 관계없이 특별히 제한되지 않고 사용할 수 있다.

예를 들면 인간, 소 또는 돼지 등의 포유동물로부터 유래하는 것 등을 들 수 있다.

또한 혈장 등의 체액 또는 장기 등으로부터 정제하여 조제한 것이나, 또는 유전자공학조작, 세포공학조작 혹은 세포배양조작 등에 의하여 조제한 것 등을 들 수 있다.

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서, 활성화 혈액응고 제V인자는 계면활성제, 인지질 및 칼슘이온의 존재하에서, 활성화 단백질C에 의하여 분해된다.

그리고 시료 중에 단백질S가 포함되어 있을 경우, 그 단백질S의 존재에 의하여 활성화 단백질C의 활성이 상승하여, 이 분해반응은 촉진된다.

활성화 혈액응고 제V인자는, 인지질 및 칼슘이온의 존재하에 활성화 혈액응고 제X인자가 촉매하는, 프로트롬빈으로부터 트롬빈을 생성시키는 반응을 촉진하는 것이다.

따라서 시료 중에 단백질S가 포함되어 있으면, 활성화 단백질C의 활성이 상승하여 활성화 혈액응고 제V인자의 분해반응이 촉진되고, 활성화 혈액응고 제V인자의 존재량(농도)은 적어진다.

그러면 활성화 혈액응고 제X인자가 촉매하는 프로트롬빈으로부터 트롬빈을 생성시키는 반응에 대한 활성화 혈액응고 제V인자의 촉진효과가 작아지므로, 상기의 프로트롬빈으로부터 트롬빈을 생성시키는 반응은 억제된다.

상기의 활성화 혈액응고 제V인자와 활성화 단백질C 등을 접촉시키는 것과 활성화 혈액응고 제V인자와 활성화 혈액응고 제X인자 및 프로트롬빈 등을 접촉시키는 것은 동시에 이루어져도 좋다.

그러나 활성화 혈액응고 제V인자를 계면활성제, 인지질 및 칼슘이온과 함께 활성화 단백질C와 접촉시켜 적어도 1분간 이상, 바람직하게는 5분간 이상, 실온 또는 37℃ 등에 있어서 인큐베이트한 후에, 활성화 혈액응고 제X인자 및 프로트롬빈 등과 접촉시켜, 인큐베이트하여 프로트롬빈으로부터 트롬빈을 생성시키는 반응을 행하는 것이 바람직하다.

이 활성화 혈액응고 제V인자를 사용할 때의 농도는, 활성화 단백질C와 접촉시켜 계면활성제, 인지질 및 칼슘이온의 존재하에 활성화 혈액응고 제V인자를 분해하는 반응을 행할 때에는, 보통 0.5ｐＭ∼5ｎＭ인 것이 바람직하다.

그러나 이 활성화 혈액응고 제V인자의 농도가 높으면, 시료에서 유래하는 성분(인자) 등에 의한 혈액응고 반응이 진행되어 버려서, 피보린이 석출되거나 또는 막대한 발색이 발생해서 정확하게 측정할 수 없게 되므로, 상기의 활성화 혈액응고 제V인자 농도로서는 5ｐＭ∼500ｐＭ인 것이 더 바람직하고, 20ｐＭ∼200ｐＭ인 것이 특히 바람직하다.

9. 활성화 혈액응고 제X인자

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서 사용하는 활성화 혈액응고 제X인자(제Ｘａ인자; ＦＸａ)는, 그 유래(기원)나 조제방법에 관계없이 특별히 제한되지 않고 사용할 수 있다.

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서, 활성화 혈액응고 제X인자는, 인지질 및 칼슘이온의 존재하에서 프로트롬빈으로부터 트롬빈을 생성시키는 반응을 촉매한다.

이 활성화 혈액응고 제X인자에 의한 프로트롬빈으로부터 트롬빈을 생성시키는 반응은, 활성화 혈액응고 제V인자의 존재에 의하여 촉진된다.

따라서, 앞서 설명한 바와 같이 시료 중에 단백질S가 포함되어 있으면 활성화 단백질C의 활성이 상승하고, 이에 따라 활성화 혈액응고 제V인자의 분해반응이 촉진되어, 이 때문에 활성화 혈액응고 제X인자가 촉매하는 트롬빈을 생성시키는 반응에 대한 활성화 혈액응고 제V인자의 촉진효과가 작아지므로, 상기의 트롬빈을 생성시키는 반응은 억제된다.

이 활성화 혈액응고 제X인자를 사용할 때의 농도는, 활성화 혈액응고 제V인자 및 프로트롬빈 등과 접촉시켜 인지질 및 칼슘이온의 존재하에서 프로트롬빈으로부터 트롬빈을 생성시킬 때에는, 보통 0.1ｐＭ∼300ｐＭ인 것이 바람직하다.

그러나 이 활성화 혈액응고 제X인자의 농도가 높다면, 이전의 활성화 혈액응고 제V인자의 경우와 같이 시료에서 유래하는 성분(인자) 등에 의한 혈액응고 반응이 진행되어 버려서, 피보린이 석출되거나 또는 막대한 발색이 발생해서 정확하게 측정할 수 없게 되므로, 상기의 활성화 혈액응고 제X인자 농도로서는, 1ｐＭ∼100ｐＭ인 것이 더 바람직하고, 10ｐＭ∼50ｐＭ인 것이 특히 바람직하다.

10. 프로트롬빈

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서 사용하는 프로트롬빈은, 그 유래(기원)나 조제방법에 관계없이 특별히 제한되지 않고 사용할 수 있다.

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서, 프로트롬빈은 인지질 및 칼슘이온의 존재하에서 활성화 혈액응고 제X인자가 촉매하는 반응의 기질이 되어 트롬빈이 된다.

이 활성화 혈액응고 제X인자에 의한 프로트롬빈으로부터 트롬빈을 생성시키는 반응은 활성화 혈액응고 제V인자의 존재에 의하여 촉진된다.

따라서, 앞서 설명한 바와 같이 시료 중에 단백질S가 포함되어 있으면 활성화 단백질C의 활성이 상승하고, 이에 따라 활성화 혈액응고 제V인자의 분해반응이 촉진되어, 이 때문에 활성화 혈액응고 제X인자가 촉매하는 프로트롬빈으로부터 트롬빈을 생성시키는 반응에 대한 활성화 혈액응고 제V인자의 촉진효과가 작아지므로, 상기의 프로트롬빈으로부터 트롬빈을 생성시키는 반응은 억제되어, 생성되는 트롬빈의 양(농도)은 감소된다.

이 프로트롬빈을 사용할 때의 농도는, 활성화 혈액응고 제V인자 및 활성화 혈액응고 제X인자와 접촉시켜서 인지질 및 칼슘이온의 존재하에서 프로트롬빈으로부터 트롬빈을 생성시킬 때에는, 보통 1ｎＭ∼50μM인 것이 바람직하고, 50ｎＭ∼5μM인 것이 더 바람직하고, 그리고 100ｎＭ∼1μM인 것이 특히 바람직하다.

11. 트롬빈의 기질

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서 사용하는 트롬빈의 기질은, 트롬빈의 프로테아제(protease)로서의 촉매작용을 (트롬빈의 기질로서) 받음으로써 어떤 시그널을 발생하는 것, 또는 트롬빈에 의한 촉매반응에 더해 또 다른 반응을 계속함으로써 어떤 시그널이 발생하는 것이면, 특별히 제한되지 않고 사용할 수 있다.

이 어떤 시그널이 발생한다는 것에 있어서, 이것은 트롬빈의 촉매작용을 받음으로써 광학적, 전기적, 자기적 또는 다른 에너지 등에 있어서의 시그널(신호)의 생성 또는 변화를 검출할 수 있는 것을 의미한다.

예를 들면 트롬빈의 촉매작용을 받음으로써, 흡광도, 투과율 또는 형광강도가 변화되는 것, 빛의 흡수곡선이 변화되는 것, 또는 발광하는 것 등을 들 수 있다.

그 일례로서는, 유리했을 때에 흡광도, 투과율 또는 형광강도 또는 빛의 흡수곡선이 변화되는 것과 같은 화합물을 결합한 펩티드 또는 단백질, 또는 유리했을 때에 발광하는 것과 같은 화합물을 결합한 펩티드 또는 단백질 등이며, 트롬빈의 촉매작용에 의하여 상기의 화합물이 상기의 펩티드 또는 단백질에 의하여 유리하는 것과 같은 물질 등을 들 수 있다.

이러한 물질에 있어서는, 트롬빈의 촉매작용을 받아서 상기 화합물이 유리함으로써 흡광도, 투과율 또는 형광강도 또는 빛의 흡수곡선의 변화 또는 발광 등으로서 검출할 수 있기 때문에, 트롬빈의 촉매작용 즉 트롬빈의 효소활성을, 생성된 시그널(흡광도, 투과율 또는 형광강도 또는 빛의 흡수곡선의 변화 또는 발광 등)의 양을 측정함으로써 구할 수 있다.

이러한 물질로서는, 예를 들면 「H-D-페닐알라닐-L-피페콜릴-L-아르기닐-p-니트로아닐리드/2염산염」〔테스트팀(등록상표) 발색기질 S-2238〕(제조원:Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ-ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ사〔이탈리아〕, 판매원: 세키스이메디컬사〔일본국〕), 「H-D-헥사하이드로티로실-L-알라닐-L-아르기닐-p-니트로아닐리드/2아세트산염」〔ＳＰＥＣＴＲＯＺＹＭＥ(등록상표) ＴＨ〕(ＡＭＥＲＩＣＡＮＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ사ㆍ코스모바이오사), 「벤조일-페닐알라닐-발리닐-아르기닐-p-니트로아닐리드/염산염」[ＴｈｒｏｍｂｉｎＳｕｂｓｔｒａｔｅ I, Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ](ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ사ㆍ코스모바이오사), 「토실-글리실-프로릴-아르기닐-p-니트로아닐리드」〔ＣＨＲＯＭＯＺＹＭＥＴＨ〕(ＰＥＮＴＡＰＨＡＲＭ사), 「H-D-페닐알라닐-프로릴-아르기닐-3-카르복시-4-히드록시-아닐린」(다이이치산쿄사), 「벤조일-페닐알라닐-발리닐-아르기닐-ＡＭＣㆍ염산염」〔ＴｈｒｏｍｂｉｎＳｕｂｓｔｒａｔｅＩＩＩ, Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ〕(ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ사ㆍ코스모바이오사), 「t-부톡시카르보닐-아스파라길(O-벤질)-프로릴-아르기닐-ＭＣＡ」(펩티드연구소), 또는 「t-부톡시카르보닐-발리닐-프로릴-아르기닐-ＭＣＡ」(펩티드연구소) 등을 들 수 있다. 또, 특히 「H-D-페닐알라닐-L-피페콜릴-L-아르기닐-p-니트로아닐리드/2염산염」이 바람직하다.

상기의 활성화 혈액응고 제V인자와 활성화 혈액응고 제X인자와 프로트롬빈 등을 접촉시키는 것과, 생성된 트롬빈과 이 트롬빈의 기질을 접촉시키는 것은 동시에 하더라도 좋고, 각각의 단계로서 나누어 하여도 좋다.

어느 방법이든지 생성된 트롬빈에 트롬빈의 기질을 접촉시켜, 적어도 1분간 이상, 바람직하게는 5분간 이상, 실온 또는 37℃ 등에 있어서 인큐베이트하여 트롬빈의 기질로부터 시그널을 발생시킨다.

이 트롬빈의 기질을 사용할 때의 농도는, 이 트롬빈의 기질이 트롬빈의 촉매작용을 받을 때에, 보통 5μM∼100ｍＭ인 것이 바람직하고, 50μM∼10ｍＭ인 것이 특히 바람직하다.

12. 시그널량의 측정

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서의 트롬빈의 기질은, 프로트롬빈으로부터 생성된 트롬빈의 촉매작용을 받음으로써 시그널을 발생시킨다.

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서는 이 트롬빈의 기질로부터 생성된 시그널의 양을 측정한다.

시료 중에 단백질S가 포함되어 있을 경우, 이 시그널의 양은 시료 중에 있어서 총 단백질S의 활성치에 따라 생성이 억제된 시그널의 양이다.

이 생성된 시그널량(생성이 억제된 시그널량)의 측정은 그 시그널에 따라 적절하게 하면 좋다.

예를 들면 시그널이 흡광도, 투과율 또는 형광강도 또는 빛의 흡수곡선의 변화 또는 발광 등인 경우에는, 흡광도, 투과율, 형광강도 또는 발광강도 등을 측정하는 것 등에 의하여 이루어진다.

더 구체적으로는 트롬빈의 기질이, 상기의 「Ｈ-D-페닐알라닐-L-피페콜릴-L-아르기닐-p-니트로아닐리드/2염산염」, 「H-D-헥사하이드로티로실-L-알라닐-L-아르기닐-p-니트로아닐리드/2아세트산염」, 「벤조일-페닐알라닐-발리닐-아르기닐-p-니트로아닐리드/염산염」, 또는 「토실-글리실-프로릴-아르기닐-p-니트로아닐리드」 등, 펩티드에 p-니트로아닐린을 결합시킨 물질인 경우에는, 트롬빈의 촉매작용에 의하여 유리한 ｐ-니트로아닐린이 파장 405ｎｍ부근에서 구비하는 빛의 흡수를, 즉 파장 405ｎｍ 또는 그 부근의 파장에 있어서 흡광도를 측정함으로써 실시한다.

이 경우, 흡광도의 측정은 주파장(主波長)만의 1파장 측정이어도 좋고, 또는 주파장과 부파장(副波長)을 측정하는 2파장 측정이어도 좋다.

그리고 이 흡광도의 측정은 엔드포인트(end point)법이어도 좋고, 또는 레이트법이어도 좋다.

13. 시료 중에 포함되어 있는 총 단백질S의 활성치

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서는, 시료 중에 단백질S가 포함되어 있으면, 활성화 단백질C의 활성이 상승하여 활성화 혈액응고 제V인자의 분해반응이 촉진되어서, 활성화 혈액응고 제V인자의 존재량(농도)은 적어진다.

이에 따라 트롬빈의 생성이 감소하기 때문에, 이 트롬빈이 촉매하는 트롬빈의 기질로부터 시그널을 생기게 하는 반응도 억제되어서 생성되는 시그널의 양은 억제된다.

즉 시료 중에 포함되는 총 단백질S의 활성치에 따라서 이 시그널 생성의 억제도는 커지게 된다.

따라서 시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서는, 시료와 활성화 단백질C 등을 접촉시켜 상기한 바와 같이 반응하게 함으로써 생성된 시그널량을 측정하여, 즉 생성이 억제된 시그널량을 측정함으로써, 시료 중에 포함되어 있는 총 단백질S의 활성치를 얻는다.

이 생성이 억제된 시그널량을 측정한 후에, 시료 중에 포함되어 있는 총 단백질S의 활성치를 얻는 것은 적절하게 하면 되는데, 예를 들면 하기와 같이 할 수 있다.

총 단백질S의 활성치를 알고 있는 시료의 적어도 1개와, 총 단백질S의 활성치가 「제로」인 것을 알고 있는 시료(생리식염수 또는 순수(純水) 등)에 대하여, 상기한 바와 같이 측정조작을 하여 생성된 시그널량(생성이 억제된 시그널량)을 구한다.

그리고 이 생성된 시그널량(생성이 억제된 시그널량)과 시료 중에 포함되는 총 단백질S의 활성치의 관계를 수식 또는 그래프 등으로 나타내어 검량선(檢量線)을 작성한다.

이 검량선은, 즉 시그널 생성의 억제도와 시료 중에 포함되는 총 단백질S의 활성치의 관계를 나타낸 것이다.

다음으로 총 단백질S의 활성치가 미지(未知)인 시료에 대하여, 상기한 바와 같이 마찬가지로 측정조작을 하여 생성된 시그널량(생성이 억제된 시그널량)을 구한다.

이 시그널량을 상기의 검량선에 적용시켜, 상당하는 총 단백질S의 활성치를 구한다.

이에 따라 총 단백질S의 활성치가 미지인 시료에 있어서 생성된 시그널량(생성이 억제된 시그널량)에 의해 그 시료의 총 단백질S의 활성치를 얻을 수 있다.

상기의 검량선은, 시그널량(생성이 억제된 시그널량) 즉 시그널 생성의 억제도와, 시료 중에 포함되는 총 단백질S의 활성치의 관계를 나타낸 것으로, 이 검량선에 있어서의 시그널량(생성이 억제된 시그널량)은 측정된 시그널량 바로 그것이어도 좋지만, 그 시그널량의 값을 기초로 산출한 수치이더라도 좋다.

즉, 상기의 검량선은, 측정된 시그널량의 값을 기초로 산출한 수치와 시료 중에 포함되는 총 단백질S의 활성치의 관계를 나타낸 것이더라도 좋다.

이 경우이더라도 측정된 시그널량의 값을 기초로 산출한 수치는, 생성이 억제된 시그널량에 대응한 것이다.

이 측정된 시그널량의 값을 기초로 산출한 수치로서는, 예를 들면 측정된 시그널량의 단위시간당 변화량의 수치, 또는 측정된 시그널량의 값을 시간에 대하여 1차 미분하여 산출한 수치, 또는 2차 미분하여 산출한 수치 등을 들 수 있다.

예로서, 측정에 의하여 얻어진 흡광도의 1분간당의 변화량, 또는 측정에 의하여 얻어진 흡광도를 시간에 대하여 1차 미분하여 얻은 흡광도 변화의 속도, 또는 측정에 의하여 얻어진 흡광도를 시간에 대하여 2차 미분하여 얻은 흡광도 변화의 가속도 등을 들 수 있다.

14. 단백질

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서는, 인간 혈청 알부민(ＨＳＡ), 소 혈청 알부민(ＢＳＡ) 또는 난백 알부민 등의 알부민, 카제인, 또는 젤라틴 등의 단백질을 상기의 활성측정반응시에 존재시키는 것이 바람직하다.

이 단백질을 존재시키는 농도는 보통 0.1μM∼1ｍＭ인 것이 바람직하다.

15. 염

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서는, 할로겐 원소와 알칼리 금속의 염, 또는 할로겐 원소와 알칼리토류 금속의 염 등의 염을 상기의 활성측정반응시에 존재시키는 것이 바람직하다.

할로겐 원소와 알칼리 금속의 염으로서는, 예를 들면 염화나트륨, 염화칼륨, 불화나트륨, 불화칼륨, 브롬화나트륨 또는 브롬화칼륨 등을 들 수 있다.

또한 할로겐 원소와 알칼리토류 금속의 염으로서는, 예를 들면 염화마그네슘, 불화마그네슘 또는 브롬화마그네슘 등을 들 수 있다.

이 염을 존재시키는 농도는 보통 5ｍＭ∼1M인 것이 바람직하고, 50ｍＭ∼250ｍＭ인 것이 특히 바람직하다.

16. 희석액

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서는, 시료를 희석액에 의하여 희석한 후에 상기의 활성측정반응을 행하는 것이 시료 중의 총 단백질S의 활성측정을 위하여 바람직하다.

이 희석액의 ｐＨ는 특별히 한정되지는 않지만, ｐＨ6.0∼ｐＨ10.0(20℃)의 ｐＨ범위인 것이 바람직하고, ｐＨ6.5∼ｐＨ8.5(20℃)의 ｐＨ범위인 것이 더 바람직하다.

또, 이 희석액에는 ｐＨ를 상기의 ｐＨ범위로 유지하기 위해서 상기의 ｐＨ범위에서 완충능력을 구비하는 완충제를 적절하게 존재시키거나 또는 함유시키는 것이 바람직하다.

또한 이 희석액에는 필요에 따라서 적절하게 단백질, 염, 계면활성제, 방부제, 안정화제, 활성화제 또는 당류 등의 성분을 함유시킬 수 있다.

이 희석액으로서는, 예를 들면 물, 생리식염수, 인산 완충 생리식염수, 또는 완충액 등을 들 수 있다.

이 희석액에 의하여 시료를 희석할 때의 희석배율로는, 특별히 한정되지는 않지만, 시료 중의 총 단백질S의 활성측정을 위해서는 2배∼60배가 바람직하고, 5배∼40배가 더 바람직하고, 10배∼20배가 특히 바람직하다.

17. ｐＨ

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서는, 상기의 활성측정반응을 ｐＨ6.0∼ｐＨ10.0(20℃)의 범위에서 하는 것이 바람직하고, ｐＨ6.5∼ｐＨ8.5(20℃)의 범위에서 하는 것이 특히 바람직하다.

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서는, 활성측정반응에 있어서의 ｐＨ를 상기의 ｐＨ범위로 유지하기 위하여 상기의 ｐＨ범위에서 완충능력을 구비하는 완충제를 적절하게 존재시키는 것이 바람직하다.

18. 기타 성분

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서는, 필요에 따라서 적절하게 방부제, 안정화제, 활성화제 또는 당류 등, 상기 기재한 성분 이외의 성분을 상기의 활성측정반응시에 존재시킬 수 있다.

19. 측정방법

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 있어서, 시료 중에 있어서 총 단백질S의 활성의 측정은 용수법(用手法)에 의하여 이루어져도 좋고, 또는 자동분석장치 등의 장치를 사용하여 실시하여도 좋다.

20. 측정단계

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법에 대하여 상기에 상세히 설명한 활성측정반응은, 1회에 모든 성분과 시료를 접촉하게 하여 모든 반응을 1단계로 하여도 좋고(1스텝법), 또한 성분을 나누어서 접촉을 복수 단계로 나누어서 함으로써 활성측정반응을 복수 단계로 나누어 하여도 좋다(다스텝법).

복수 단계로 나누는 경우, 특별한 제한은 없지만, 예를 들면 다음과 같이 할 수 있다.

(1) 2스텝법-1

(a) 시료, 활성화 단백질C, 계면활성제, 인지질, 칼슘이온 및 활성화 혈액응고 제V인자를 접촉시킨다.

(b) 다음으로 상기 (a)의 것에 활성화 혈액응고 제X인자, 프로트롬빈 및 트롬빈의 기질을 접촉시킨다.

(2) 2스텝법-2

(a) 시료, 활성화 단백질C, 계면활성제, 인지질 및 칼슘이온을 접촉시킨다.

(b) 다음으로 상기 (a)의 것에 활성화 혈액응고 제V인자, 활성화 혈액응고 제X인자, 프로트롬빈, 트롬빈의 기질 및 인지질을 접촉시킨다.

(3) 3스텝법

(b) 다음으로 상기 (a)의 것에 활성화 혈액응고 제V인자를 접촉시킨다.

(c) 또한 상기 (b)의 것에 활성화 혈액응고 제X인자, 프로트롬빈 및 트롬빈의 기질을 접촉시킨다.

ＩＩＩ．시료 중의 총 단백질S의 단백질량 측정방법

앞에서 설명한 바와 같이 본 발명에 있어서, 총 단백질S의 단백질량을 측정하는 방법(측정방법) 및 시약(측정시약)은 특별하게 한정되지 않고, 총 단백질S의 단백질량을 측정할 수 있는 방법 및 시약이면 어떤 것이라도 좋지만, 이하에서 이 시료 중의 총 단백질S의 단백질량 측정방법의 예에 대하여 설명한다.

1. 총론

시료 중의 총 단백질S의 단백질량 측정방법에서, 단백질S에 대한 항체(抗體)를 고정화(固定化)한 담체입자(擔體粒子)와 시료를 접촉시켜, 상기 항체와 시료에 포함되어 있는 단백질S의 항원항체반응에 의하여 생성된 응집물을 측정함으로써, 시료 중에 있어서 총 단백질S의 단백질량을 측정하는 방법에 있어서, 상기 항원항체반응의 반응시에 C4b결합단백질을 존재시키는 것이 바람직하다.

시료 중의 총 단백질S의 단백질량 측정방법에 있어서는, 담체입자가 라텍스입자인 것이 바람직하다.

시료 중의 총 단백질S의 단백질량 측정방법에 있어서는, 시료 중에 있어서 총 단백질S 단백질량의 측정이, 다음의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는 방법에 의하여 이루어지는 것이 바람직하다.

(a) 시료와 C4b결합단백질을 혼합하고 접촉시켜서, 이 혼합액 중에 있어서 상기 시료에 포함되는 유리단백질S와 C4b결합단백질의 복합체를 형성시키는 공정.

(b) 상기 혼합액을 단백질S에 대한 항체를 고정화한 담체입자와 접촉시켜, 상기 항체와, 단백질S와 C4b결합단백질의 복합체의 항원항체반응에 의하여 생성된 응집물을 측정하는 공정.

2. 단백질S에 대한 항체

시료 중의 총 단백질S의 단백질량 측정방법에 있어서, 단백질S에 대한 항체란, 단백질S에 결합할 수 있는 항체(항단백질S 항체)를 말한다.

이 항단백질S 항체로서는, 예를 들면 (단백질S에 결합할 수 있는) 모노크로날 항체(monoclonal antibody), 폴리클로날 항체(polyclonal antibody), 폴리클로날 항체를 포함하는 항혈청, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 1개사슬 항체(ｓｃＦｖ) 및 이들의 항체의 단편〔Ｆａｂ, F(ａｂ')₂, Ｆａｂ', Ｆｖ, ｓＦｖ, ｄｓＦｖ 등〕 등을 들 수 있다.

또한 상기의 항체 또는 항체 단편에 단백질 또는 저분자화합물을 결합시킨 유도체를 사용할 수도 있다.

또, 항단백질S 항체의 유래에 관해서는 특별히 한정되지는 않고, 예를 들면 포유동물(생쥐, 토끼, 쥐, 양, 염소, 또는 말 등), 또는 조류(닭, 메추리, 꿩, 타조, 또는 오리 등) 등을 들 수 있다.

3. 담체입자

시료 중의 총 단백질S의 단백질량 측정방법에 있어서, 담체입자는 상기의 항단백질S 항체를 고정화할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않고 사용할 수 있다.

즉 단백질S와 항단백질S 항체의 항원항체반응을 이용해서 시료 중에 있어서 총 단백질S 단백질량을 측정하는 측정시약 및 측정방법에 사용되고 있는 담체입자, 또는 사용하는 것이 가능한 담체입자이면 좋다.

이 담체입자의 재질은 특별하게 한정되지 않고, 예를 들면 폴리스티렌, 스티렌-스티렌술폰산염 공중합체, 아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌 공중합체, 염화비닐-아크릴산 에스테르 공중합체, 아세트산 비닐-아크릴산 공중합체, 폴리아크롤레인, 스티렌-메타크릴산 공중합체, 스티렌-글리시딜(메타)아크릴산 공중합체, 스티렌-부타디엔 공중합체, 메타크릴산 중합체, 아크릴산 중합체, 젤라틴, 실리카, 알루미나, 카본블랙, 금속화합물, 금속, 세라믹스 또는 자성체(磁性體) 등을 들 수 있다.

그리고 이 담체입자로서는, 예를 들면 라텍스입자, 금속 콜로이드 입자, 리포솜(liposome), 마이크로캡슐 또는 적혈구 등의 입자 등을 들 수 있다.

또한 이 담체입자로서는 라텍스입자인 것이 바람직하다.

시료 중의 총 단백질S의 단백질량 측정방법에 있어서 항단백질S 항체를 담체입자에 고정화하는 것은, 물리적 흡착법, 화학적 결합법 또는 이들의 병용 등 공지의 방법에 의하여 이루어질 수 있다.

물리적 흡착법에 의한 경우에는, 공지의 방법을 따라 항단백질S 항체와 담체입자를 완충액 등의 용액중에서 혼합해 접촉시키거나, 또는 완충액 등으로 용해한 항단백질S 항체를 담체입자에 접촉시키는 것 등에 의하여 이루어질 수 있다.

또한 화학적 결합법에 의하여 이루어지는 경우에는, 일본임상병리학회 편 「임상병리 임시증간특집 제53호 임상검사를 위한 이뮤노어세이(immunoassay)-기술과 응용-」, 임상병리간행회, 1983년 발행; 일본생화학회 편 「신(新)생화학실험 강좌1 단백질ＩＶ」, 동경화학동인, 1991년 발행 등에 기재된 공지의 방법에 따라서, 항단백질S 항체와 담체입자를 글루타알데히드(glutaraldehyde), 카르보디이미드, 이미드에스테르 또는 말레이미드 등의 2가성(價性)의 가교시약(架橋試藥)과 혼합하여 접촉시켜, 항단백질S 항체와 담체입자의 각각의 아미노기, 카르복실기, 티올기, 알데히드기 또는 수산기 등과 상기의 2가성의 가교시약을 반응시키는 것 등에 의하여 이루어질 수 있다.

항단백질S 항체를 고정화한 담체입자의 자연응집이나 비특이적 반응 등을 억제하기 위해서 처리할 필요가 있으면, 항단백질S 항체를 고정화한 담체입자의 표면에 소 혈청 알부민(ＢＳＡ), 카제인, 젤라틴, 난백 알부민 또는 그 염 등의 단백질, 계면활성제 또는 탈지분유 등을 접촉시켜 피복시키는 것 등의 공지의 방법에 의하여 처리하여, 담체입자의 블록킹 처리(마스크 처리)를 하여도 좋다.

시료 중의 총 단백질S의 단백질량의 측정을 라텍스 면역비탁법(latex 免疫比濁法) 등의 비탁법에 의하여 측정하는 경우, 라텍스입자 등의 담체입자의 크기(입경)에 대하여는 특별한 제한은 없다.

그러나 항단백질S 항체를 고정화한 담체입자가, 시료 중에 포함되어 있는 단백질S와의 응집물(응집덩어리)을 생성하는 정도 및 이 생성된 응집물의 측정의 용이성 등의 이유로, 담체입자의 크기(입경)는 그 평균 지름(평균 입경)이 0.01μm∼10μm인 것이 바람직하고, 0.04μm∼1μm인 것이 더 바람직하다.

시료 중의 단백질S의 단백질량의 측정방법에 있어서, 담체입자는 그 크기(입경), 재질, 또는 형상 등이 다른 2종류 이상의 담체를 사용하더라도 좋다.

시료 중의 총 단백질S의 단백질량의 측정을 라텍스 면역비탁법 등의 비탁법에 의하여 측정하는 경우, 항단백질S 항체를 고정화한 담체입자의 측정반응시에 있어서의 농도는, 담체 표면상에서 상기의 특이적 결합물질의 분포밀도, 담체입자의 크기(입경), 시료와 측정시약의 혼합비율 등의 각종 조건에 따라 알맞은 농도가 다르기 때문에, 일률적으로 말할 수는 없다.

그러나 통상적으로는, 시료와 측정시약이 혼합되어서, 담체입자에 고정화된 항단백질S 항체와 시료 중에 포함되어 있는 단백질S와의 항원항체반응이 이루어지는 측정반응시에, 항단백질S 항체를 고정화한 담체입자의 농도가 이 측정반응시의 반응혼합액 중에 있어서 0.005∼1%(W/V)가 되도록 하는 것이 일반적이고, 이 경우에 반응혼합액 중에 있어서 이러한 농도가 되도록 하는 농도의, 항단백질S 항체를 고정화한 담체입자를 측정시약에 함유시키는 것이 바람직하다.

시료 중의 총 단백질S의 단백질량의 측정방법에 있어서는, 항단백질S 항체를 고정화한 담체입자를, 소 혈청 알부민(ＢＳＡ), 인간 혈청 알부민(ＨＳＡ), 카제인 또는 그 염 등의 단백질; 칼슘이온 등의 각종 금속이온; 칼슘 염 등의 각종 염류; 각종 당류; 탈지분유; 정상 토끼 혈청 등의 각종 동물혈청; 아지화나트륨 또는 항생물질 등의 각종 방부제; 활성화 물질; 반응촉진물질; 폴리에틸렌글리콜 등의 감도증가물질; 비특이적 반응억제물질; 또는 비이온성 계면활성제, 양성(兩性)계면활성제 또는 음이온성 계면활성제 등의 각종 계면활성제 등의 1종 또는 2종 이상과 공존시켜도 좋다.

그리고 상기한 각 물질을 공존시킬 때의 농도는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 0.001∼10%(W/V)가 바람직하고, 특히 0.01∼5%(W/V)가 바람직하다.

4. C4b결합단백질

시료 중의 총 단백질S의 단백질량의 측정방법에 있어서는 C4b결합단백질을 존재시키는 것이 바람직하다. 여기에서 C4b결합단백질이란, 간세포나 대식세포(macrophage)에서 생산되는 고분자 당단백질로서, 단백질S와 1대1로 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 것을 말한다.

또한 시료 중의 총 단백질S의 단백질량의 측정방법에 있어서 사용하는 C4b결합 단백질은, 그 유래(기원)나 조제방법에 관계없이 특별히 제한되지 않고 사용할 수 있다.

예를 들면 인간, 소 또는 돼지 등의 포유동물로부터 유래하는 것 등을 들 수 있다. 또한 혈장 등의 체액 또는 장기 등으로부터 정제하여 조제한 것이나 또는 유전자공학조작, 세포공학조작 혹은 세포배양조작 등에 의하여 조제한 것 등을 들 수 있다.

시료 중의 총 단백질S의 단백질량 측정방법에 있어서 상기의 C4b결합 단백질을 총 단백질S 단백질량의 측정시약에 존재시키는 농도는, 시료와 측정시약을 혼합한 후의 측정반응액 중에 있어서 C4b결합단백질과 시료에 포함되어 있는 유리단백질S와의 비가 0.9 이상(C4b결합단백질/유리단백질S≥0.9)이 되도록 설정하는 것이 바람직하다.

상기의 C4b결합 단백질을 총 단백질S 단백질량의 측정시약에 존재시키는 방법은, 이 C4b결합 단백질을, 담체입자에 고정화된 항단백질S 항체와 시료에 포함되어 있는 단백질S의 항원항체반응이 이루어지는 측정반응시에, 상기의 총 단백질S 단백질량의 측정시약에 존재시킬 수 있으면 어떤 방법이어도 좋다.

예를 들면 상기의 C4b결합 단백질을 완충액에 함유시킨 시약을 조제하고, 항단백질S 항체를 고정화한 담체입자를 포함하는 시약과 혼합함으로써, 담체입자에 고정화된 항단백질S 항체와 시료에 포함되어 있는 단백질S의 항원항체반응이 이루어지는 측정반응시에 C4b결합단백질을 존재시키면 좋다.

또한 보통 건강인의 시료 중에는 「단백질S와 C4b결합단백질의 복합체(결합형)」와 「유리단백질S(유리형)」의 양방이 존재하고 있는데, 본 발명에 있어서는 C4b결합단백질을 시료와 혼합하여 접촉시킴으로써, 시료에 포함되어 있는 유리단백질S가 이 C4b결합 단백질과 복합체를 형성한다.

즉 시료 중의 단백질S는 모두 「단백질S와 C4b결합단백질의 복합체(결합형)」가 된다.

이에 따라 시료 중의 총 단백질S의 단백질량 측정방법에서는, 모든 단백질S〔단백질S와 C4b결합단백질의 복합체(결합형) 및 유리단백질S(유리형)〕에 대하여 그 단백질량을, 즉 총 단백질S의 단백질량을 측정할 수 있다.

5. 시료

시료 중의 총 단백질S의 단백질량 측정방법에 있어서, 시료란, 단백질S가 존재할 가능성이 있고 또한 단백질S의 존재의 유무, 또는 함유량(농도)을 측정하려고 하는 것을 말한다.

이러한 시료로서는, 예를 들면 인간 또는 동물의 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 땀, 뇨, 눈물, 수액, 양수, 복수 등의 체액, 또는 간장, 심장, 뇌, 뼈, 모발, 피부, 손발톱, 근육, 신경조직 등의 장기, 조직 또는 세포 등의 추출액 등, 단백질S가 포함될 가능성이 있는 것을 들 수 있다.

6. 측정방법

시료 중의 총 단백질S의 단백질량의 측정방법은, 담체입자에 고정화된 「단백질S에 대한 항체」와 시료 중에 포함되어 있는 「단백질S」의 항원항체반응에 의하여 생성된 응집물을 측정함으로써 시료 중에 있어서 총 단백질S 단백질량을 측정하는 방법에 있어서, 상기 항원항체반응의 반응시에 C4b결합단백질을 존재시키는 것이다.

시료 중의 총 단백질S의 단백질량의 측정방법에 있어서의 측정조작은, 공지의 측정조작을 따라서 할 수 있다.

이 측정은 용수법에 의하여 이루어져도 좋고, 또는 분석장치 등의 장치를 사용하여 실시하여도 좋다.

또한 이 측정은 1스텝법(1시약법)에 의하여 이루어져도 좋고, 또는 2스텝법(2시약법) 등의 복수의 조작 스텝에 의하여 이루어지는 방법으로 실시하더라도 좋다.

이하, 라텍스 면역비탁법을 측정원리로 하는 시료 중에 있어서 총 단백질S 단백질량의 측정시약을 사용하여 시료 중의 총 단백질S의 단백질량을 측정하는 경우를 예로 들어, 구체적으로 설명한다.

(1) 우선, 시료 중의 총 단백질S의 단백질량의 측정시약으로서, 이하의 것을 준비한다.

제1시약: C4b결합단백질을 함유하는 완충액

제2시약: 단백질S에 대한 항체를 고정화한 라텍스입자를 함유하는 완충액

(2) 혈장 등의 시료의 일정량과 상기의 제1시약의 일정량을 혼합하고, 일정 온도하에서 일정시간 정치(靜置)한다.

또, 시료와 제1시약의 혼합비율(질량비)은 적절하게 선택하면 좋다.

또한 상기의 정치시의 온도는, 실온(1∼30℃) 또는 미온(30∼40℃)의 범위내의 일정 온도인 것이 바람직하다(예를 들면 37℃ 등).

시료와 제1시약의 혼합에 의하여 시료에 포함되어 있는 유리단백질S가 이 C4b결합 단백질과 복합체를 형성한다.

(3) 일정시간 경과 후, 상기의 시료와 제1시약의 혼합액에 상기의 제2시약의 일정량을 첨가하고 혼합하여 반응혼합액으로서 일정 온도하에서 일정시간 정치한다.

또, 제2시약의 첨가량은 적절하게 선택하면 좋다.

또한 상기의 정치시의 온도는 실온(1∼30℃) 또는 미온(30∼40℃)의 범위내의 일정 온도인 것이 바람직하다(예를 들면 37℃ 등).

그리고 상기의 정치시간은 1분 이상, 10분 이하의 일정시간인 것이 바람직하고, 3분 이상, 5분 이하의 일정시간인 것이 더 바람직하다.

시료와 제1시약의 혼합액에 제2시약의 첨가, 혼합에 의하여, 라텍스입자에 고정화한 항단백질S 항체와 시료 중의 단백질S(단백질S와 C4b결합단백질의 복합체(결합형))의 항원항체반응(측정반응)이 이루어지게 한다.

그리고 이 항원항체반응(측정반응)에 의하여 「…〔항단백질S 항체=라텍스입자=항단백질S 항체〕-〔단백질S〕-〔항단백질S 항체=라텍스입자=항단백질S 항체〕…」의 가교가 형성되고, 항단백질S 항체를 고정화한 라텍스입자끼리의 응집물이 생성된다.

(4) 그리고 분석장치 또는 분광광도계 등에 있어서, 반응혼합액에 빛을 조사하여, 생성된 라텍스입자끼리의 응집물에 의하여 생기는 시그널인 적절한 파장의 투과광 강도의 감소(흡광도의 증가) 또는 산란광 강도의 증가를 측정함으로써, 생성된 상기 응집물의 양, 즉 시료 중의 총 단백질S의 단백질량을 구한다.

(5) 그리고 「시료를 측정하여 얻은 측정치(투과광 강도의 감소(흡광도의 증가) 또는 산란광 강도의 증가의 값)」와, 「표준액, 표준혈청 등의 표준물질(이미 알고 있는 농도의 단백질S를 포함하는 시료)을 측정하여 얻은 측정치(투과광 강도의 감소(흡광도의 증가) 또는 산란광 강도의 증가의 값)」를 비교함으로써, 측정한 시료 중의 총 단백질S의 단백질량(농도)을 산출한다.

<실시예>

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더 설명한다. 또, 본 발명은 이들에 의하여 한정되는 것은 아니다.

〔실시예1〕(총 단백질S의 활성치와 총 단백질S의 단백질량의 비교)

시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법 및 활성측정시약으로부터 얻은 총 단백질S의 활성치와, 라텍스 비탁법에 의한 시료 중의 총 단백질S의 단백질량의 측정방법 및 측정시약으로부터 얻은 총 단백질S의 단백질량을 비교하였다.

Ⅰ. 시료 중의 총 단백질S의 활성측정방법 및 활성측정시약에 의한 측정

1. 총 단백질S의 활성측정시약

(1) 희석액

하기의 성분을 각각 기재의 농도가 되도록 순수에 용해하고, ｐＨ를 ｐＨ8.0(20℃)로 조정하여 희석액을 조제하였다.

Ｔｒｉｔｏｎ X-100(와코쥰야쿠공업사, 일본국) 0.06%(W/V)

소 혈청 알부민(ＢＳＡ) 0.1%(W/V)

염화나트륨 0.1M

구연산 3나트륨 10.6ｍＭ

트리스(히드록시메틸)아미노메탄 50ｍＭ

(2) 제1시약

하기의 성분을 각각 기재의 농도가 되도록 순수에 용해하고, ｐＨ를 ｐＨ8.0(20℃)로 조정하여 제1시약을 조제하였다.

활성화 단백질C(정제 인간 활성화 단백질C; ＥｎｚｙｍｅＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｉｎｃ사, 미국) 397ｐＭ

계면활성제

인지질

염화칼슘 2.5ｍＭ

소 혈청 알부민(ＢＳＡ; Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ사, 미국) 0.1.%(W/V)

염화나트륨 0.1M

트리스(히드록시메틸)아미노메탄 50ｍＭ

계면활성제는, Ｔｒｉｔｏｎ X-100(와코쥰야쿠공업사, 일본국)을 0.006%(W/V)의 농도가 되도록 함유시켰다.

또한 인지질은, 포스파티딜세린(돼지 뇌 포스파티딜세린; ＰＳ; ＤＯＯＳＡＮＳｅｒｄａｒｙＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ사, 한국) 0.4mg, 포스파티딜콜린(돼지 간장 포스파티딜콜린; ＰＣ; ＤＯＯＳＡＮＳｅｒｄａｒｙＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ사, 한국) 0.4mg 및 포스파티딜에탄올아민(돼지 간장 포스파티딜에탄올아민; ＰＥ; ＤＯＯＳＡＮＳｅｒｄａｒｙＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ사, 한국) 0.4mg를 각각 시험관에 채취하고 증발기(蒸發器)에서 용매인 크로로포름을 증발시킨 후에, 증류수를 첨가하여 1분간 격렬하게 교반한 후에, 60℃에서 10분간 초음파처리를 하여 조제한 포스파티딜세린, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민의 조성비가 1:1:1(즉 33.33%(W/V):33.33%(W/V):33.33%(W/V))인 인지질을 24μM의 농도가 되도록 함유시켰다.〔또, 이 포스파티딜세린, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민의 조성비가 1:1:1인 인지질을, 이하 「인지질(ＰＳ:ＰＣ:ＰＥ=1:1:1)」라고도 한다.]

(3) 제2시약

하기의 성분을 각각 기재의 농도가 되도록 순수에 용해하고, ｐＨ를 ｐＨ8.0(20℃)으로 조정하여 제2시약을 조제하였다.

활성화 혈액응고 제V인자(정제 인간 활성화 혈액응고 제V인자; ＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃＴｅｃｈｎｏｌｉｅｓ, Ｉｎｃ사, 미국) 357ｐＭ

계면활성제

인지질

염화칼슘 2.5ｍＭ

소 혈청 알부민(ＢＳＡ; Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ사, 미국) 0.1%(W/V)

염화나트륨 0.1M

트리스(히드록시메틸)아미노메탄 50ｍＭ

또한 인지질은, 상기의 인지질(ＰＳ:ＰＣ:ＰＥ=1:1:1)을 24μM의 농도가 되도록 함유시켰다.

(4) 제3시약

하기의 성분을 각각 기재의 농도가 되도록 순수에 용해하고, ｐＨ를 ｐＨ7.5(20℃)로 조정하여 제3시약을 조제하였다.

활성화 혈액응고 제X인자(정제 소 활성화 혈액응고 제X인자; ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ, Ｉｎｃ사, 미국) 50ｐＭ

프로트롬빈(정제 인간 프로트롬빈; ＥｎｚｙｍｅＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｉｎｃ사, 미국) 738ｎＭ

테스트팀(등록상표) 발색 기질S-2238(트롬빈의 기질〔트롬빈의 발색 기질〕; 제조원: Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ-ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ사〔이탈리아〕, 판매원: 세키스이메디컬사〔일본국〕 750μM

인지질

염화칼슘 5.0ｍＭ

염화나트륨 0.15M

트리스(히드록시메틸)아미노메탄 50ｍＭ

인지질은, 포스파티딜세린(돼지 뇌 포스파티딜세린; ＰＳ; ＤＯＯＳＡＮＳｅｒｄａｒｙＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ사, 한국) 0.6mg, 포스파티딜콜린(돼지 간장 포스파티딜콜린; ＰＣ; ＤＯＯＳＡＮＳｅｒｄａｒｙＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ사, 한국) 0.4mg 및 포스파티딜에탄올아민(돼지 간장 포스파티딜에탄올아민; ＰＥ; ＤＯＯＳＡＮＳｅｒｄａｒｙＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ사, 한국) 1.0mg를 각각 시험관에 채취하고 증발기에서 용매인 클로로포름을 증발시킨 후에, 증류수를 첨가하여 1분간 격렬하게 교반한 후에, 60℃에서 10분간 초음파처리를 하여 조제한 포스파티딜세린, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민의 조성비가 3:2:5(즉 30%(W/V):20%(W/V):50%(W/V))인 인지질을 7.5μM의 농도가 되도록 함유시켰다.〔또, 이 포스파티딜세린, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민의 조성비가 3:2:5인 인지질을, 이하 「인지질(ＰＳ:ＰＣ:ＰＥ=3:2:5)」이라고도 한다.〕

2.시료

다음의 (1)∼(4)를 각각 시료로서 사용하였다.

(1) 건강한 사람 211명의 혈장

(2) 단백질S의 유전자 돌연변이인 ＰＳ-K155E 헤테로 접합체(단백질S의 이상증의 하나인 단백질S 토쿠시마)인 것이 밝혀진 7명의 혈장

(3) 단백질S의 유전자 돌연변이인 ＰＳ-K155E 호모 접합체(단백질S의 이상증의 하나인 단백질S 토쿠시마)인 것이 밝혀진 1명의 혈장

(4) 단백질S의 유전자 돌연변이인 Ｃ206F 헤테로 접합체(단백질S의 이상증의 하나)인 것이 밝혀진 1명의 혈장

3. 시료 중에 있어서 총 단백질S의 활성치의 측정

각 시료의 총 단백질S의 활성치의 측정은 히타치하이테크놀러지즈사(일본국)의 7170Ｓ형 범용자동분석장치를 사용하여 실시하였다.

(1) 상기 2.의 시료 각각에 대하여, 상기 1.의 (1)의 희석액에 의하여 희석배율 15배로 희석하였다.

(2) 상기 (1)에서 희석한 시료 2.0μL에 상기 1.의 (2)의 제1시약 98μL을 첨가하고, 37℃에서 1.4분간 반응시켰다.

(3) 다음으로 상기 1.의 (3)의 제2시약 20μL을 첨가하고, 37℃에서 8.3분간 반응시켰다.

(4) 다음으로 상기 1.의 (4)의 제3시약 236μL을 첨가하고, 37℃에서 반응시켰다.

(5) 상기 (4)에 있어서의 제3시약을 첨가한 후, 주파장 405ｎｍ 및 부파장 505ｎｍ에 있어서의 흡광도의 변화를 12.3분간 측정하였다.

4. 시료 중에 있어서 총 단백질S의 활성치의 산출

상기 3.의 (5)에 있어서 측정한 제3시약 첨가후의 흡광도 변화(반응의 타임 코스)의 값을 미분하여 시료 중에 있어서 총 단백질S의 활성치를 구하였다.

또한, 미리, 총 단백질S 활성치를 이미 알고 있는 시료에 대하여 상기 3.과 같이 측정하고, 측정한 제3시약 첨가후의 흡광도 변화(반응의 타임 코스)의 1분간당의 흡광도 변화량을 시간에 대하여 직선식(미분직선)을 구하고, 이 직선의 경사를 이 이미 알고 있는 총 단백질S 활성치에 대하여 플롯하여 검량선을 작성하였다.

그리고 상기 2.의 시료를 상기 3.과 같이 측정하여 얻은 제3시약 첨가후의 흡광도 변화(반응의 타임 코스)의 1분간당의 흡광도 변화량을 시간에 대하여 직선식(미분직선)을 구하고, 이 직선의 경사를 상기의 검량선에 적용시켜, 시료 중에 있어서 총 단백질S의 활성치를 산출하였다.

즉, 측정에 의하여 얻어진 흡광도로부터 흡광도 변화의 가속도(흡광도의 2차미분값)를 구하고 검량선에 적용시킴으로써, 시료 중에 있어서 총 단백질S의 활성치를 산출하였다.

이 시료 중에 있어서 총 단백질S의 활성치를 측정하여 얻어진 결과를 도1에 나타냈다.

ＩＩ．라텍스 비탁법에 의한 시료 중의 총 단백질S의 단백질량의 측정방법 및 측정시약에 의한 측정

1. 라텍스 비탁법에 의한 총 단백질S의 단백질량의 활성측정시약

(1) 제1시약

C4b결합단백질을 Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋ의 방법〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．, 209권, 847∼856쪽, 1983년〕에 의거하여 인간 혈장으로부터 조제하였다.

다음으로 0.1%(W/V) ＢＳＡ, 0.3ｍｏｌ/L 염화나트륨 및 0.05% 아지화나트륨을 함유하는 50ｍＭＭＥＳ-염산완충액〔ｐＨ6.2(20℃)〕을 조제하였다.

여기에, 상기한 바와 같이 조제한 C4b결합 단백질을 25μg/ｍＬ의 농도가 되도록 첨가하고, 제1시약으로 하였다.

(2) 제2시약

(a) 항단백질S 항체의 조제

본 발명자들이 정제한 유리상태의 단백질S를 면역항원으로 하여, 보통의 방법에 따라서 항단백질S 항체를 조제하였다.

단백질S의 C4b결합 단백질과의 결합 부위 이외의 부위에 특이적으로 결합하는 모노크로날 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)를 스크리닝(screening)하고, 마우스/마우스의 하이브리도마(9H6주)를 얻었다.

이 하이브리도마(9H6주)에서 생산된 마우스 항단백질Ｓ/모노크로날 항체의 5mg를 0.5ｍＬ의 인산나트륨 완충액(ｐＨ7.5)에 용해하였다.

이것에 0.6mg의 Ｓ-아세틸메르캅토 호박산무수물을 용해한 0.01ｍＬ의 N,N-디메틸포름아미드를 가하여, 실온에서 30분간 인큐베이트하였다.

다음으로 이것에 0.1M ＥＤＴＡ수용액 0.02ｍＬ, 1M 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충액(ｐＨ7.0) 0.1ｍＬ 및 1M 히드록실아민염산 완충액(ｐＨ7.0) 0.1ｍＬ을 각각 더하여 30℃에서 30분간 인큐베이트하였다.

그 후에 이것을 5ｍＭＥＤＴＡ를 포함하는 0.1M 인산나트륨 완충액(ｐＨ6.0)으로 평형화해 둔 세파덱스 G-25 칼럼으로 겔 여과를 하고, 메르캅토ㆍ석시닐화(succinyl化)한 마우스 항단백질S 모노크로날 항체를 얻었다.

(b) 항단백질S 항체 고정화 라텍스입자 현탁액의 조제

평균 입경 0.192μm의 라텍스입자의 10% 현탁액 1.0ｍＬ과 50ｍＭＭＥＳ-염산완충액〔ｐＨ6.0(20℃)〕 1.0ｍＬ을 혼화(混和)하고, 또한 320ｍＭ 카르보디이미드(도닌화학연구소; 제품번호:348-03631) 수용액 32μL을 첨가해서 혼화하여 빙상(氷上)에서 10분간 방치하였다.

상기의 빙상에서 10분간 방치한 라텍스입자 현탁액 1.2ｍＬ에, 상기 (a)에서 조제한 메르캅토ㆍ석시닐화한 마우스 항단백질S모노크로날 항체를 0.083g/ｄＬ의 농도로 50ｍＭＭＥＳ-염산완충액〔ｐＨ6.0(20℃)〕에 혼화한 액 1.8ｍＬ을 가하여, 4℃에서 하룻밤 교반하였다.

다음으로 원심분리에 의하여 상청(上淸, supernatant)을 제거한 후에, 침전부(沈澱部)를 0.8% ＢＳＡ를 포함하는 50ｍＭＴｒｉｓ-염산완충액〔ｐＨ8.0(20℃)〕으로 현탁하고, 37℃에서 3시간 방치하여, 블록킹처리를 하였다.

다음에 원심분리에 의하여 침전부를 회수한 후에, 이것을 0.1% ＢＳＡ를 포함하는 0.05% 아지화나트륨 수용액으로 재분산(再分散)시키고, 파장 700ｎｍ에 있어서의 흡광도가 15,0ＯＤ가 되도록 현탁하였다.

이것을 항단백질S 항체 고정화 라텍스입자 현탁액으로 하였다.

(c) 제2시약의 조제

상기 (b)에서 조제한 항단백질S 항체 고정화 라텍스입자 현탁액을, 0.1% ＢＳＡ를 포함하는 0.05% 아지화나트륨 수용액으로 10배 희석하여, 0.1%의 「항단백질S 항체 고정화 라텍스입자」를 함유하는 현탁액을 조제하였다.

이것을 제2시약으로 하였다.

2. 시료

상기의 Ｉ.의 2.의 (1)∼(4)의 각 시료를, 시료로서 사용하였다.

3. 시료 중의 총 단백질S의 단백질량의 측정 및 산출

(1) 측정순서

(a) 측정은 도시바-120ＦＲ 자동분석장치(도시바메디칼시스템즈사 제품)을 사용하여 실시하였다.

우선, 측정용 셀(큐벳)에 상기 2.의 시료 3μL을 첨가하였다.

다음으로 이들 측정용 셀(큐벳)에 상기 1.의 (1)의 제1시약 100μL을 첨가하여 혼합하였다.

그리고 이들 측정용 셀(큐벳)을 37℃에서 정치하였다.

이에 따라 상기의 시료에 포함되어 있는 유리단백질S와 상기의 제1시약중의 C4b결합 단백질과의 복합체를 형성시켰다. 즉 시료에 포함되어 있는 단백질S는 모두 「단백질S와 C4b결합단백질의 복합체(결합형)」가 되었다.

(b) 상기의 제1시약의 첨가후 4분 40초째(16포인트째)에 이들 측정용 셀(큐벳) 내의 혼합액에 상기 1.의 (2)의 (ｃ)의 제2시약 100μL을 더 첨가하여 혼합하였다.

(c) 상기의 제1시약의 첨가후 5분 35초째(19포인트째)에 이들 측정용 셀(큐벳) 내의 혼합액의 흡광도(파장700ｎｍ)를 시료 맹검(盲檢)으로서 측정하였다.

그리고 이들 측정용 셀(큐벳)을 37℃에서 정치하여 반응하게 하였다.

이에 따라 상기의 라텍스입자에 고정화된 항단백질S 항체와 상기의 시료에 포함되어 있는 단백질S의 항원항체반응이 이루어지게 하여, 라텍스입자의 응집 덩어리를 생성시켰다.

(d) 상기의 제1시약의 첨가후 9분 47초째(33포인트째)에 이 측정용 셀(큐벳) 내의 반응혼합액의 흡광도(파장700ｎｍ)를 상기 시료의 측정치로서 측정하였다.

(e) 상기 (d)에 있어서 측정한 흡광도(측정치)로부터 상기 (c)에 있어서 측정한 흡광도(시료 맹검)를 빼서 흡광도 차이를 얻었다.

이 흡광도 차이는 시료에 포함되는 총 단백질S 단백질량(농도)에 비례하는 것이다.

이들 시료의 흡광도 차이로 검량선을 작성하고, 실검체(3.2% 구연산혈장)를 같은 방법으로 측정했을 때의 흡광도 차이를 검량선에 적용시켜, 시료 중의 총 단백질S 단백질 농도를 구하였다.

이렇게 하여 상기 2.의 각 시료의 총 단백질S의 단백질량을 얻었다.

이 시료 중의 총 단백질S의 단백질량을 측정하여 얻어진 결과를 도1에 나타냈다.

ＩＩＩ．측정결과

1. 도면의 설명

상기 I.에 있어서의 시료 중에 있어서 총 단백질S의 활성치의 측정결과와, 상기 ＩＩ.에 있어서의 시료 중의 총 단백질S의 단백질량의 측정결과를 비교하는 도면을 도1로서 나타냈다.

이 도면에 있어서, 가로축(x)은 상기 ＩＩ.의 라텍스 비탁법에 의한 시료 중의 총 단백질S의 단백질량의 측정결과를 나타낸다. 이 측정치의 단위는 「μg/ｍＬ」이다.

또한 이 도면에 있어서, 세로축(y)은 상기 I.에 있어서의 시료 중에 있어서 총 단백질S의 활성치의 측정결과를 나타낸다. 이 측정치의 단위는 「μg/ｍＬ당량」이다.

2. 건강한 사람의 시료의 비교

상기 I.의 총 단백질S의 활성치의 측정결과와 상기 ＩＩ.의 라텍스 비탁법에 의한 총 단백질S의 단백질량의 측정결과의 비교를 다음과 같이 하였다.

시료가 건강한 사람 211명의 혈장인 경우에 대하여, 상기 I의 총 단백질S의 활성치의 측정결과와 상기 ＩＩ.의 총 단백질S의 단백질량의 측정결과로부터, 단백질S의 비활성(총 단백질S 활성치/총 단백질S 단백질량)을 구하였다.

이 건강한 사람 211명의 혈장 시료의 단백질S의 비활성의 평균치와 표준편차(ＳＤ)를 산출하여, 평균±2ＳＤ(0.98±0.26)의 범위를 구하였다.

이 범위를 벗어나는 시료가 10개 있었으므로, 이 10개의 시료를 제외한 건강한 사람 201명의 시료에 대하여, 다시 총 단백질S의 활성치의 측정결과와, 총 단백질S의 단백질량의 측정결과로부터 구한 단백질S의 비활성(총 단백질S 활성치/총 단백질S 단백질량)의 평균치와 표준편차를 산출하고, 평균±2ＳＤ(0.99±0.20)의 범위와 평균±3ＳＤ(0.99±0.30)의 범위를 구하였다.

이 도면은 각각의 시료에 대하여 시료 중에 있어서 총 단백질S의 활성치를 총 단백질S의 단백질량으로 나눈 비활성을 나타내는 것이기도 하다.

이 도면에 있어서, 비활성의 평균치인 ｙ=0.99x의 식의 선을 실선으로 나타냈다.

또한 이 식 y=0.99x의 선의 위 및 아래에 평균±2ＳＤ를 나타내는 선(y=1.19x 및 y=0.79x)을 파선으로 이 도면에 나타냈다.

그리고 이 식 y=0.99x의 선의 위에 평균+3ＳＤ를 나타내는 선(y=1.29x)을 점선으로, 또한 이 식 y=0.99x의 선 밑에 평균-3ＳＤ를 나타내는 선(y=0.69x)을 실선으로 이 도면에 나타냈다.

건강한 사람 211명의 혈장의 시료의 측정결과에 있어서, 이 도1에서 상기의 ｙ=0.69x(평균-3ＳＤ)의 선보다 아래로 벗어나는 것이 7개 확인되었다.

즉 총 단백질S의 활성치를 총 단백질S의 단백질량으로 나눈 비활성이 0.69 이하인 시료가 7개 확인되었다.

이들 비활성이 0.69 이하인 7개의 시료 중, 즉 총 단백질S의 활성치와 총 단백질S의 단백질량이 크게 괴리하는 7개의 시료 중, 동의를 얻은 3개의 시료에 대하여 단백질S 유전자의 염기배열을 조사한 바, 이들 3개의 시료 모두 단백질S유전자의 ＰＳ-K155E 돌연변이(단백질S의 이상증의 하나)인 것이 밝혀졌다.〔도1에 있어서, 이들 3개의 시료에 화살표(↓또는↑)를 붙였다.〕

이것으로부터, 시료 중에 있어서 총 단백질S의 활성치 및 시료 중의 총 단백질S의 단백질량을 측정하고, 이 측정에 의하여 얻은 총 단백질S의 활성치와 총 단백질S의 단백질량을, 비활성을 구하는 것 등에 의하여 비교함으로써, 단백질S의 유전자의 돌연변이 등, 단백질S의 이상증을 검출할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

3. 단백질S의 유전자 돌연변이(단백질S의 이상증)인 것이 밝혀진 시료의 비교

상기 I.의 2.의 (2)∼(4)의 단백질S의 유전자 돌연변이(단백질S의 이상증)인 것이 밝혀진 시료(총 9명의 시료)의 각각에 대하여, 상기 I의 총 단백질S의 활성치의 측정결과와 상기 ＩＩ.의 라텍스 비탁법에 의한 총 단백질S의 단백질량의 측정결과를 비교한다.

도1에 있어서, 상기 I.의 2.의 (2)의 단백질S의 유전자 돌연변이인 ＰＳ-K155E 헤테로 접합체(단백질S의 이상증의 하나)인 것이 밝혀진 7명의 혈장의 시료를 「●」로 나타냈다.

또한 상기 I.의 2.의 (3)의 단백질S의 유전자 돌연변이인 ＰＳ-K155E 호모 접합체(단백질S의 이상증의 하나)인 것이 밝혀진 1명의 혈장의 시료를 「◆」로 나타냈다.

그리고 상기 I.의 2.의 (4)의 단백질S의 유전자 돌연변이인 Ｃ206F 헤테로 접합체(단백질S의 이상증의 하나)인 것이 밝혀진 1명의 혈장의 시료를 「□」로 나타냈다.

단백질S의 유전자 돌연변이인 것이 밝혀진 이들 9개의 시료(●, ◆ 및 □)는 모두 상기의 도1에 있어서 ｙ=0.69x(평균-3ＳＤ)의 선보다 아래로 벗어났음을 알 수 있다.

즉, 단백질S의 유전자 돌연변이인 것이 밝혀진 이들 9개의 시료(●, ◆ 및 □)는 모두 총 단백질S의 활성치를 총 단백질S의 단백질량으로 나눈 비활성이 0.69 이하인 것임을 알 수 있다.

즉, 이들 9개의 시료는 총 단백질S의 활성치와 총 단백질S의 단백질량이 크게 괴리함을 알 수 있다.

따라서, 시료 중에 있어서 총 단백질S의 활성치 및 시료 중의 총 단백질S의 단백질량을 측정하고, 이 측정에 의하여 얻은 총 단백질S의 활성치와 총 단백질S의 단백질량을, 비활성을 구하는 것 등에 의하여 비교함으로써, 단백질S의 유전자의 돌연변이 등의 단백질S의 이상증을 검출할 수 있음을, 이들 단백질S의 유전자 돌연변이의 9개의 시료의 비교결과로부터도 확인할 수 있었다.

본 발명의 단백질S 이상증의 검출방법은 정확하고 간편하게 또한 신속하게 단백질S 이상증을 검출할 수 있는 것이다.

따라서, 본 발명의 단백질S 이상증의 검출방법을 사용함으로써 단백질S의 이상증을 간편하고 또한 정확하게 검출하여, 혈전증 등의 질환의 예방, 진단 및 치료 등에 도움이 될 수 있다.

Claims

단백질S 이상증(蛋白質S 異常症)의 검출방법으로서,
시료(試料) 중의 총 단백질S 활성치(總蛋白質S 活性値) 및 총 단백질S 단백질량(總蛋白質S 蛋白質量)을 측정하는 공정 및
상기 측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량을 비교하는 공정을
포함하는 단백질S 이상증의 검출방법.
제1항에 있어서,
측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량을 비교하여, 이 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량이 괴리(乖離)하고 있는 경우에는, 단백질S 이상증이거나 또는 그 의심이 된다고 판정하는 단백질S 이상증의 검출방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
측정에 의하여 얻은 총 단백질S 활성치와 총 단백질S 단백질량을 비교하는 것이, 상기 총 단백질S 활성치를 상기 총 단백질S 단백질량으로 나눈 비활성(非活性)을 구하는 것인 단백질S 이상증의 검출방법.