JP5176085B2 - プロテインｓ及びプロテインｃの活性測定方法並びに活性測定試薬 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液凝固反応に係わる成分（因子）の試料中の存在量（濃度）又はその変異により、測定値が影響を受けることがなく、高感度に測定を行うことができる、試料中のプロテインＳの活性の測定方法及び測定試薬に関するものである。
また、本発明は、血液凝固反応に係わる成分（因子）の試料中の存在量（濃度）又はその変異により、測定値が影響を受けることがなく、高感度に測定を行うことができる、試料中のプロテインＣの活性の測定方法及び測定試薬に関するものである。
本発明は、特に、臨床検査、分子生物学、及び医学などの生命科学分野等において有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】
プロテインＣとプロテインＳは、いずれも生体内の血液凝固系の制御機構において中心的に機能する血漿タンパク質である。
このプロテインＣ及びプロテインＳによる血液凝固系の制御機構の模式図を、下に示した。
【０００３】
【化３】
【０００４】
プロテインＣは生体内において、トロンビン・トロンボモジュリン複合体により限定分解され活性化ペプチドが遊離することにより活性化され、活性化プロテインＣとなる。
活性化プロテインＣは、ヒトおける血液凝固を促進する活性化血液凝固第Ｖ因子、及び活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子を分解することにより、血液凝固反応を抑制する役割を担ったセリンプロテアーゼである。
プロテインＳは、活性化プロテインＣの補欠因子（補助因子）であり、プロテインＳの存在により、活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応及び活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子の分解反応は、促進される。
【０００５】
血液凝固反応を抑制する働きを持つプロテインＣ及びプロテインＳの活性の低下又は欠損は、生体内において血栓症を引き起こす原因となりうる。
実際、プロテインＣ又はプロテインＳの先天性欠損症者は、高い頻度で深部静脈血栓症、表在性静脈炎若しくは肺梗塞などの静脈性血栓症、又は心不全の原因となる冠状動脈血栓症などの動脈性血栓症等を発症することになる。
また、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、ビタミンＫ欠乏症又は肝機能低下症等においても、プロテインＣ及びプロテインＳの活性の低下又は欠損が認められる。
即ち、血漿等の試料中のプロテインＣの活性又はプロテインＳの活性を測定することにより、プロテインＣ又はプロテインＳの活性の低下又は欠損を把握することができ、引いては血栓症等の疾患の発症の予測、早期発見及び治療効果の判定等に重要な役割を果たすものである。
【０００６】
試料中のプロテインＣの活性又はプロテインＳの活性を測定する方法として、試料を蛇毒からのプロテインＣ−活性化剤と共に、活性化プロテインＣ又はプロテインＳの形成下にインキュベートし、血液凝固第ＸＩＩ因子、血液凝固第ＶＩＩ因子又は血液凝固第ＩＩ因子（プロトロンビン）の活性化剤を添加し、かつ血液凝固因子及びその活性剤により媒介される、プロトロンビンからのトロンビンの形成の減少を、色素原トロンビン基質を使用して測光測定する方法が開示されている（特許文献１参照。）。
【０００７】
別の試料中のプロテインＳの活性を測定する方法として、血漿試料にプロテインＣを活性化するプロテインＣ活性化物質又は活性化プロテインＣを添加し、次に活性化血液凝固第ＩＸ因子を加えインキュベートし、生成するトロンビンの量を知られた方法で測定し、これをプロテインＳ活性が既知の標品を測定して得た値と比較して、試料中のプロテインＳの活性を測定する方法が開示されている（特許文献２参照。）。
【０００８】
また、他の試料中のプロテインＣの活性を測定する方法として、血漿試料にプロテインＣを活性化するプロテインＣ活性化物質又はプロテインＳを添加し、次に活性化血液凝固第ＩＸ因子を加えインキュベートし、生成するトロンビンの量を知られた方法で測定し、これをプロテインＣ活性が既知の標品を測定して得た値と比較して、試料中のプロテインＣの活性を測定する方法が開示されている（特許文献２参照。）。
【０００９】
更に、別の試料中のプロテインＳの活性を測定する方法として、試料を、活性化プロテインＣ、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、リン脂質及びカルシウムイオンとインキュベートし、次にこの混合物を、活性化血液凝固第ＩＩ因子（トロンビン）、活性化血液凝固第ＩＸ因子及び活性化血液凝固第Ｘ因子とインキュベートし、次にこのインキュベーション混合物へ活性化血液凝固第Ｘ因子特異性基質を添加し、この基質の開裂によって生成したシグナルの量を測定することよりなる、試料中のプロテインＳの活性を測定する方法が開示されている（特許文献３参照。）。
【００１０】
【特許文献１】
特開昭６２−２１２５６９号公報
【特許文献２】
特表平４−５０６６０３号公報
【特許文献３】
特表平６−５０４６８２号公報
【００１１】
これら従来の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬、並びにプロテインＣの活性測定方法及び活性測定試薬においては、その測定反応に使用する血液凝固反応の成分（因子）の少なくとも一つは、試料に含まれている成分（因子）をそのまま用いている。すなわち、試料に含まれている成分に依存している。
【００１２】
しかしながら、この試料に含まれている成分（因子）を測定反応に用いる場合、その成分（因子）〔例えば、活性化血液凝固第Ｘ因子〕がその試料提供者において欠損又は低下しているときには、前記測定反応の反応成分（因子）の少なくとも一つが十分量存在しない訳であるから、測定反応は十分に進行せず、得られる測定値（プロテインＣ活性値又はプロテインＳ活性値）は、場合により本来の値よりかい離し、誤差を含むものになる。
即ち、測定値が、血液凝固反応に係わる成分（因子）の試料中の存在量（濃度）又はその変異により、影響を受けてしまうことが起こるのである。
これは、プロテインＣ活性又はプロテインＳ活性を測定しようとする患者は、血液凝固・線溶系に異常が生じている可能性が高く、それ故、前記反応成分（因子）が欠損又は低下している可能性が大きいので、前記のような問題は決して稀なことではないのである。
【００１３】
また、従来の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬、並びにプロテインＣの活性測定方法及び活性測定試薬は、その測定反応が数多くの反応を経るものであり、測定に必要な成分も多く、複雑なものであった。このためこの測定反応は様々な因子や種々の条件による影響を受け易いものであった。
【００１４】
更に、従来の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬、並びにプロテインＣの活性測定方法及び活性測定試薬は、測定の感度が十分高いとは言えないものであった。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、血液凝固反応に係わる成分（因子）の試料中の存在量（濃度）又はその変異により、測定値が影響を受けてしまうことがなく、測定反応に用いる反応の数及び測定に必要な成分の数が多くなく、よりシンプルなものであって、様々な因子や種々の条件による影響を受け難いものであり、かつ高い測定感度が得られる、試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬、並びに試料中のプロテインＣの活性測定方法及び活性測定試薬を提供することである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
１．試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬
本発明は、試料中のプロテインＳの活性値を測定する方法であって、
（ａ） 試料に由来しない、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させ、
（ｂ） 前記（ａ）の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定し、
（ｃ） 試料に含まれるプロテインＳの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量を求める、
ことにより、試料中に含まれていたプロテインＳの活性値を得る試料中のプロテインＳの活性測定方法である。
【００１７】
また、本発明は、試料に由来しない、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質より構成される下記の反応系を用いて試料中のプロテインＳの活性値を測定する方法であって、
【００１８】
【化４】
【００１９】
（１） 試料と少なくとも活性化プロテインＣ及びリン脂質を接触させることにより、試料にプロテインＳが含まれる場合にはリン脂質の存在下に活性化プロテインＣが更に活性化され、
（２） 活性化プロテインＣの前記（１）における更なる活性化により、活性化プロテインＣがリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進され、
（３） 活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（２）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減し、
（４） 前記（３）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制され、
（５） 前記（４）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定する、
ことにより、試料中に含まれていたプロテインＳの活性値を得る試料中のプロテインＳの活性測定方法である。
【００２０】
更に、本発明は、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有する試料中のプロテインＳの活性測定試薬である。
【００２１】
２．試料中のプロテインＣの活性測定方法及び活性測定試薬
本発明は、試料中のプロテインＣの活性値を測定する方法であって、
（ａ） 試料に由来しない、プロテインＣ活性化物質、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させ、
（ｂ） 前記（ａ）の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定し、
（ｃ） 試料に含まれるプロテインＣの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量を求める、
ことにより、試料中に含まれていたプロテインＣの活性値を得る試料中のプロテインＣの活性測定方法である。
【００２２】
また、本発明は、試料に由来しない、プロテインＣ活性化物質、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質より構成される下記の反応系を用いて試料中のプロテインＣの活性値を測定する方法であって、
【００２３】
【化５】
【００２４】
（１） 試料と少なくともプロテインＣ活性化物質を接触させることにより、試料にプロテインＣが含まれる場合には、プロテインＣより活性化プロテインＣが生成し、
（２） これにより生成した活性化プロテインＣがリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が進行し、
（３） 活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（２）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が進行することにより抑制されて、トロンビンの生成が低減し、
（４） 前記（３）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制され、
（５） 前記（４）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定する、
ことにより、試料中に含まれていたプロテインＣの活性値を得る試料中のプロテインＣの活性測定方法である。
【００２５】
更に、本発明は、プロテインＣ活性化物質、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有する試料中のプロテインＣの活性測定試薬である。
【００２６】
【発明の実施の形態】
Ｉ．試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬
１．総論
本発明の試料中のプロテインＳの活性測定方法は、試料に由来しない、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子（Ｖａ）、活性化血液凝固第Ｘ因子（Ｘａ）、プロトロンビン及びトロンビンの基質より構成される下記の反応系を用いて試料中のプロテインＳの活性値を測定する方法である。
【００２７】
【化６】
【００２８】
ここで、「試料に由来しない」とは、試料に含まれていたもの以外の、という意味であり、本発明の試料中のプロテインＳの活性測定方法においては、測定反応に必要な各成分（因子）〔活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質〕は、試料に含まれていたものに依存し用いるのではなく、試料に含まれていたもの以外のものを別に添加するなどして、測定反応系に充分な量の各成分（因子）を存在させて用いる。
【００２９】
これにより、例え、前記の各成分（因子）のいずれかが欠損又は低下しているような患者の試料においても、その成分（因子）の欠損又は低下による影響を受けることなく測定反応が進行し、正確なプロテインＳの活性値を求めることができるのである。
【００３０】
但し、本発明の活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料に含まれていた前記成分が測定反応において働いたとしても、それは本発明において問題ないものであり、本発明の趣旨から外れるものではない。
【００３１】
本発明においては、測定反応に必要な各成分（因子）を測定反応を進行させるのに十分な量存在させて、試料に含まれる成分（因子）の量に依存せず影響を受けないようにしているものであって、試料に含まれていた成分（因子）が更に働いたとしても、測定反応において支障はなく、本発明の趣旨に相違するものではない。
【００３２】
本発明の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬について、以下、より具体的に説明を行う。
（ａ） 前述の通りの試料に由来しない、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子（Ｖａ）、活性化血液凝固第Ｘ因子（Ｘａ）、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
なお、これらの成分と試料との接触は、１回に全ての成分との接触を行わせて、下記の反応系の全ての反応を１段階に行ってもよく（１ステップ法）、また、前記成分を分け、接触を複数段階に分けて行うことにより下記の反応系の反応を複数段階に分けて行ってもよい（多ステップ法）。
【００３３】
（ｂ） 前記（ａ）における接触により、前記の各成分による下記の反応が進行する。
そして、この一連の反応によりトロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
即ち、前記の一連の反応により、トロンビンの基質がトロンビンにより分解等の作用を受け、この結果生じるシグナルの量（例えば、吸光度等）を測定する。
【００３４】
（ｃ） 試料にプロテインＳが含まれている場合には、前記の反応における活性化プロテインＣがリン脂質の存在下に更に活性化され、これにより活性化血液凝固第Ｖ因子の分解が促進されるので、その結果トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制されて、シグナルの生成が抑制される。
このシグナル生成の抑制度は、試料に含まれていたプロテインＳの活性値に応じて大きくなる。
従って、前記（ｂ）においてシグナル量を測定することにより、生成が抑制されたシグナル量を測定することになり、これにより試料中に含まれていたプロテインＳの活性値を得ることができる。
【００３５】
【化７】
【００３６】
また、本発明の試料中のプロテインＳの活性測定方法は、以下のものでもある。
試料に由来しない、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子（Ｖａ）、活性化血液凝固第Ｘ因子（Ｘａ）、プロトロンビン及びトロンビンの基質より構成される下記の反応系を用いて試料中のプロテインＳの活性値を測定する方法であって、
【００３７】
（１） 試料と少なくとも活性化プロテインＣ及びリン脂質を接触させる。
これにより、試料にプロテインＳが含まれる場合にはリン脂質の存在下に活性化プロテインＣが更に活性化される。
【００３８】
（２） 活性化プロテインＣの前記（１）における更なる活性化により、活性化プロテインＣがリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進される。
【００３９】
（３） 活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（２）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減する。
【００４０】
（４） 前記（３）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
なお、このシグナル生成の抑制度は、試料に含まれていたプロテインＳの活性に応じて大きくなる。
【００４１】
（５） 前記（４）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定する。
以上の通り前記の反応により生成したシグナル量を測定し、すなわち生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていたプロテインＳの活性値を得る。
【００４２】
【化８】
【００４３】
本発明の試料中のプロテインＳの活性測定試薬は、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有するものである。
必要に応じて前記成分以外の成分を含んでいても構わない。
なお、本発明の活性測定試薬は、含有させる前記成分を分け、複数の測定試薬より構成されるようにしてもよい。
【００４４】
２．試料
本発明の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬において、試料とは、プロテインＳを含有する可能性がある物質である。
【００４５】
この試料として、例えば、生体試料（ヒト又は動物などに由来する試料）を挙げることができる。
【００４６】
生体試料としては、例えば、血液、血漿、唾液、汗、尿、涙、髄液、腹水、羊水などの生体の液体；肝臓、心臓、脳、骨、毛髪、皮膚、爪、筋肉、神経組織などの臓器、組織、細胞などの抽出液等を挙げることができる。
【００４７】
３．活性化プロテインＣ
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において用いる活性化プロテインＣは、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
また、本発明の活性測定方法及び活性測定試薬における測定反応中に、プロテインＣ活性化物質等によりプロテインＣより活性化プロテインＣを生成させて、これを本発明における活性化プロテインＣとして用いてもよい。
【００４８】
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において、活性化プロテインＣは、試料と接触することにより、試料中にプロテインＳが含まれている場合には、リン脂質の存在下、その活性が更に活性化される。
そして、活性化プロテインＣは、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、活性化血液凝固第Ｖ因子を分解する反応の触媒となる。
よって、プロテインＳが存在することにより、活性化プロテインＣが活性化血液凝固第Ｖ因子を分解する反応は促進される。
【００４９】
前記の活性化プロテインＣ等と試料を接触させることと、活性化プロテインＣを活性化血液凝固第Ｖ因子等と接触させることは、同時に行ってもよい。
しかしながら、活性化プロテインＣをリン脂質とともに試料と接触させ、少なくとも１分間以上、好ましくは５分間以上、室温又は３７℃等においてインキュベートした後に、活性化血液凝固第Ｖ因子及びカルシウムイオンと接触させ、インキュベートして、活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応を行わせることが好ましい。
【００５０】
この活性化プロテインＣを用いる際の濃度は、活性化血液凝固第Ｖ因子と接触させリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｖ因子を分解させる際には、通常、１ｐＭ〜１００ｎＭにあることが好ましい。
しかしながら、測定の感度を高く得るには、活性化プロテインＣ濃度が高い方が好ましいので、前記の活性化プロテインＣ濃度としては、１０ｐＭ〜１０ｎＭにあることがより好ましく、１００ｐＭ〜１ｎＭにあることが特に好ましい。
【００５１】
また、本発明の活性測定試薬においては、前記の分解反応時に活性化プロテインＣが前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、活性化プロテインＣを、１ｐＭ〜２００ｎＭ含有させることが好ましく、１０ｐＭ〜２０ｎＭ含有させることがより好ましく、１００ｐＭ〜２ｎＭ含有させることが特に好ましい。
【００５２】
４．活性化プロテインＣによる触媒反応に用いるリン脂質
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの更なる活性化時、及びこの活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時には、その活性化及び分解反応に必要なリン脂質を存在させる。
【００５３】
このリン脂質は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの、その他の動物由来のもの、植物由来のもの、微生物由来のもの又は人工的に合成したもの等を挙げることができる。
このリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール若しくはジホスファチジルグリセロールなどのグリセロリン脂質や、又はスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質等を挙げることができる。
【００５４】
前記の活性化プロテインＣの更なる活性化時、及び活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に用いるリン脂質としては、ホスファチジルコリンのみを単独で用いるか、又はホスファチジルコリンとホスファチジルセリンの混合物を用いることが、前記活性化及び分解反応促進の効果が高くなるため好ましい。
ホスファチジルコリンの組成比が８５％〜７０％であり、かつホスファチジルセリンの組成比が１５％〜３０％であることがより好ましい。
特に、ホスファチジルコリンの組成比が８５％〜８０％であり、かつホスファチジルセリンの組成比が１５％〜２０％であることが好ましい。
【００５５】
このリン脂質を用いる際の濃度は、活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応の際には、通常、０．１μＭ〜１００μＭにあることが好ましく、０．５μＭ〜１０μＭにあることが特に好ましい。
そして、本発明の活性測定試薬においては、前記の活性化時及び分解反応時にリン脂質が前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、リン脂質を０．１μＭ〜２００μＭ含有させることが好ましく、０．５μＭ〜２０μＭ含有させることが特に好ましい。
【００５６】
５．カルシウムイオン
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬においては、活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時、及び活性化血液凝固第Ｘ因子及び活性化血液凝固第Ｖ因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時には、カルシウムイオンを存在させる。
【００５７】
このカルシウムイオンとしては、カルシウムイオン自体はもちろんのこと、又はカルシウムの塩等のカルシウムイオンを含む化合物であれば、特に制限なく用いることができる。
【００５８】
このカルシウムイオンを含む化合物としては、例えば、フッ化カルシウム、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、乳酸カルシウム又はシアン化カルシウム等を挙げることができる。
【００５９】
このカルシウムイオンを用いる際の濃度は、活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応の際、そして活性化血液凝固第Ｘ因子及び活性化血液凝固第Ｖ因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際には、通常、０．１ｍＭ〜１００ｍＭにあることが好ましく、１ｍＭ〜１０ｍＭにあることが特に好ましい。
そして、本発明の活性測定試薬においては、前記の分解反応時及びトロンビン生成反応時にカルシウムイオンが前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、カルシウムイオン又はカルシウムイオンを含む化合物を、０．１ｍＭ〜２００ｍＭ含有させることが好ましく、１ｍＭ〜２０ｍＭ含有させることが特に好ましい。
【００６０】
６．活性化血液凝固第Ｖ因子
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において用いる活性化血液凝固第Ｖ因子は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
【００６１】
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において、活性化血液凝固第Ｖ因子は、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、活性化プロテインＣにより分解される。
そして、試料中にプロテインＳが含まれている場合そのプロテインＳの存在により、活性化プロテインＣが更に活性化されて、この分解反応は促進される。
【００６２】
また、活性化血液凝固第Ｖ因子は、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒する、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる３反応を促進するものである。
【００６３】
よって、試料中にプロテインＳが含まれていると、活性化プロテインＣが更に活性化されて、活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されて、活性化血液凝固第Ｖ因子の存在量（濃度）は少なくなる。そうすると、活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第Ｖ因子の促進効果が小さくなるので、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は抑制される。
【００６４】
前記の活性化血液凝固第Ｖ因子と活性化プロテインＣ等とを接触させることと、活性化血液凝固第Ｖ因子と活性化血液凝固第Ｘ因子及びプロトロンビン等とを接触させることは、同時に行ってもよい。
しかしながら、活性化血液凝固第Ｖ因子をリン脂質及びカルシウムイオンとともに活性化プロテインＣと接触させ、少なくとも１分間以上、好ましくは５分間以上、室温又は３７℃等においてインキュベートした後に、活性化血液凝固第Ｘ因子、リン脂質及びプロトロンビン等と接触させ、インキュベートして、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応を行わせることが好ましい。
【００６５】
この活性化血液凝固第Ｖ因子を用いる際の濃度は、活性化プロテインＣと接触させリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｖ因子を分解させる際には、通常、０．５ｐＭ〜５ｎＭにあることが好ましい。
しかしながら、この活性化血液凝固第Ｖ因子の濃度が高いと、試料に由来する成分（因子）等による血液凝固反応が進行してしまい、フィブリンが析出したり多大な発色が生じて正確な測定が行えなくなるので、前記の活性化血液凝固第Ｖ因子濃度としては、５ｐＭ〜５００ｐＭにあることがより好ましく、２０ｐＭ〜２００ｐＭにあることが特に好ましい。
【００６６】
また、本発明の活性測定試薬においては、前記の分解反応時に活性化血液凝固第Ｖ因子が前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、活性化血液凝固第Ｖ因子を、０．５ｐＭ〜１０ｎＭ含有させることが好ましく、５ｐＭ〜１ｎＭ含有させることがより好ましく、２０ｐＭ〜４００ｐＭ含有させることが特に好ましい。
【００６７】
７．活性化血液凝固第Ｘ因子
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において用いる活性化血液凝固第Ｘ因子は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
【００６８】
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において、活性化血液凝固第Ｘ因子は、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応を触媒する。
この活性化血液凝固第Ｘ因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は、活性化血液凝固第Ｖ因子の存在により促進される。
【００６９】
よって、先に述べたように、試料中にプロテインＳが含まれていると、活性化プロテインＣが更に活性化され、これにより活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進され、このため活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第Ｖ因子の促進効果が小さくなるので、前記のトロンビンを生成させる反応は抑制される。
【００７０】
この活性化血液凝固第Ｘ因子を用いる際の濃度は、活性化血液凝固第Ｖ因子及びプロトロンビン等と接触させ、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる際には、通常、０．１ｐＭ〜３００ｐＭにあることが好ましい。
しかしながら、この活性化血液凝固第Ｘ因子の濃度が高いと、先の活性化血液凝固第Ｖ因子の場合と同様、試料に由来する成分（因子）等による血液凝固反応が進行してしまい、フィブリンが析出したり多大な発色が生じて正確な測定が行えなくなるので、前記の活性化血液凝固第Ｘ因子濃度としては、１ｐＭ〜１００ｐＭにあることがより好ましく、１０ｐＭ〜５０ｐＭにあることが特に好ましい。
【００７１】
また、本発明の活性測定試薬においては、前記のトロンビン生成反応時に活性化血液凝固第Ｘ因子が前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、活性化血液凝固第Ｘ因子を、０．１ｐＭ〜６００ｐＭ含有させることが好ましく、１ｐＭ〜２００ｐＭ含有させることがより好ましく、１０ｐＭ〜１００ｐＭ含有させることが特に好ましい。
【００７２】
８．活性化血液凝固第Ｘ因子による触媒反応に用いるリン脂質
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬においては、活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際に、その反応に必要なリン脂質を存在させる。
【００７３】
このリン脂質は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの、その他の動物由来のもの、植物由来のもの、微生物由来のもの又は人工的に合成したもの等を挙げることができる。
このリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール若しくはジホスファチジルグリセロールなどのグリセロリン脂質や、又はスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質等を挙げることができる。
【００７４】
前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際に存在させるリン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルセリンとホスファチジルコリンとの混合物を用いることが、前記反応の促進の効果が高くなるため好ましい。
ホスファチジルエタノールアミンの組成比が４０％以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が２５％以上であることがより好ましい。
特に、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が５０％以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が３０％以上であることが好ましい。
【００７５】
このリン脂質を用いる際の濃度は、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際には、通常、０．１μＭ〜１００μＭにあることが好ましく、０．５μＭ〜１０μＭにあることが特に好ましい。
そして、本発明の活性測定試薬においては、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際にリン脂質が前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、リン脂質を０．１μＭ〜２００μＭ含有させることが好ましく、０．５μＭ〜２０μＭ含有させることが特に好ましい。
【００７６】
なお、このプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際のリン脂質としては、前記の活性化プロテインＣの更なる活性化時及び活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に用いたリン脂質をそのまま用いることができる。
しかしながら、先に述べたとおり、適したリン脂質の組成がそれぞれの反応により異なるので、各々の反応に適した組成のリン脂質をその反応時に存在させて用いることが好ましい。
なお、このプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際に、先に加えた前記の活性化プロテインＣの更なる活性化及び活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応に適した組成のリン脂質が、このプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に適した組成のリン脂質と共存したとしても、本発明の活性測定方法及び活性測定試薬においては全く支障はない。
【００７７】
９．プロトロンビン
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において用いるプロトロンビンは、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
【００７８】
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において、プロトロンビンは、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒する反応の基質となり、トロンビンになる。
この活性化血液凝固第Ｘ因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は、活性化血液凝固第Ｖ因子の存在により促進される。
【００７９】
よって、先に述べたように、試料中にプロテインＳが含まれていると、活性化プロテインＣが更に活性化され、これにより活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進され、このため活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第Ｖ因子の促進効果が小さくなるので、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は抑制され、生成されるトロンビンの量（濃度）は低減される。
【００８０】
このプロトロンビンを用いる際の濃度は、活性化血液凝固第Ｖ因子と接触させ、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる際には、通常、１ｎＭ〜５０μＭにあることが好ましく、５０ｎＭ〜５μＭにあることがより好ましく、そして１００ｎＭ〜１μＭにあることが特に好ましい。
【００８１】
また、本発明の活性測定試薬においては、前記のトロンビン生成反応時にプロトロンビンが前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、プロトロンビンを、１ｎＭ〜１００μＭ含有させることが好ましく、５０ｎＭ〜１０μＭ含有させることがより好ましく、１００ｎＭ〜２μＭ含有させることが特に好ましい。
【００８２】
１０．トロンビンの基質
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において用いるトロンビンの基質は、トロンビンのプロテアーゼとしての触媒作用を（トロンビンの基質として）受けることにより何らかのシグナルを生じるもの、又はトロンビンによる触媒反応に加え更に他の反応を続けることにより何らかのシグナルが生じるものであれば、特に制限なく用いることができる。
【００８３】
この何らかのシグナルが生じるということであるが、これはトロンビンの触媒作用を受けることにより光学的、電気的、磁気的若しくは他のエネルギー等におけるシグナル（信号）の生成又は変化を検出することができるということを意味する。
【００８４】
例えば、トロンビンの触媒作用を受けることにより、吸光度、透過率若しくは蛍光強度が変化するもの、又は光の吸収曲線が変化するもの等を挙げることができる。
【００８５】
この一例としては、遊離したときに吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線が変化するような化合物を結合したペプチド又はタンパク質であって、トロンビンの触媒作用により前記の化合物が前記のペプチド又はタンパク質より遊離するような物質を挙げることができる。
このような物質においては、トロンビンの触媒作用を受け、前記化合物が遊離することにより、吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線の変化として検出できるので、トロンビンの触媒作用すなわちトロンビンの酵素活性を、生成したシグナル（吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線の変化）の量を測定することにより求めることができる。
【００８６】
このような物質としては、例えば、「Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩」〔テストチーム（登録商標）発色基質Ｓ−２２３８〕（ＣＨＲＯＭＯＧＥＮＩＸ社・第一化学薬品社）、「Ｈ−Ｄ−ヘキサハイドロチロシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二酢酸塩」〔ＳＰＥＣＴＲＯＺＹＭＥ（登録商標）ＴＨ〕（ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ社・コスモバイオ社）、「ベンゾイル−フェニルアラニル−バリニル−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・塩酸塩」〔Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｉ，Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ〕（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社・コスモバイオ社）、「トシル−グリシル−プロリル−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド」〔ＣＨＲＯＭＯＺＹＭＥ ＴＨ〕（ＰＥＮＴＡＰＨＡＲＭ社）、「Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−アルギニル−３−カルボキシ−４−ヒドロキシ−アニリン」（三共社）、「ベンゾイル−フェニルアラニル−バリニル−アルギニル−ＡＭＣ・塩酸塩」〔Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ＩＩＩ，Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ〕（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社・コスモバイオ社）、「ｔ−ブトキシカルボニル−アスパラギル（Ｏ−ベンジル）−プロリル−アルギニル−ＭＣＡ」（ペプチド研究所）、又は「ｔ−ブトキシカルボニル−バリニル−プロリル−アルギニル−ＭＣＡ」（ペプチド研究所）等を挙げることができる。なお、特に「Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩」が好ましい。
【００８７】
前記の活性化血液凝固第Ｖ因子と活性化血液凝固第Ｘ因子とプロトロンビン等とを接触させることと、生成したトロンビンとこのトロンビンの基質とを接触させることは、同時に行ってもよいし、別々の段階として分けて行ってもよい。
【００８８】
なお、いずれにしても、生成したトロンビンにトロンビンの基質を接触させ、少なくとも１分間以上、好ましくは５分間以上、室温又は３７℃等においてインキュベートして、トロンビンの基質からシグナルを生じさせる。
【００８９】
このトロンビンの基質を用いる際の濃度は、このトロンビンの基質がトロンビンの触媒作用を受ける際に、通常、５μＭ〜１００ｍＭにあることが好ましく、５０μＭ〜１０ｍＭにあることが特に好ましい。
そして、本発明の活性測定試薬においては、トロンビンの触媒作用を受ける際にこのトロンビンの基質が前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、このトロンビンの基質を、５μＭ〜２００ｍＭ含有させることが好ましく、５０μＭ〜２０ｍＭ含有させることが特に好ましい。
【００９０】
１１．シグナル量の測定
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬におけるトロンビンの基質は、プロトロンビンより生成したトロンビンの触媒作用を受けることによりシグナルを生じる。
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬においては、このトロンビンの基質より生成したシグナルの量を測定する。
なお、試料中にプロテインＳが含まれている場合、このシグナルの量は、試料中のプロテインＳの活性値に応じて生成が抑制されたシグナルの量である。
【００９１】
この生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）の測定は、そのシグナルに応じて適宜行えばよい。
例えば、シグナルが、吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線の変化である場合には、吸光度、透過率又は蛍光強度を測定する等により行う。
より具体的には、トロンビンの基質が、前記の「Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩」、「Ｈ−Ｄ−ヘキサハイドロチロシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二酢酸塩」、「ベンゾイル−フェニルアラニル−バリニル−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・塩酸塩」、又は「トシル−グリシル−プロリル−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド」等の、ペプチドにｐ−ニトロアニリンを結合させた物質である場合には、トロンビンの触媒作用により遊離したｐ−ニトロアニリンが波長４０５ｎｍ近辺に有する光の吸収を、波長４０５ｎｍ又はその近辺の波長において吸光度を測定することにより行う。
この場合、吸光度の測定は、主波長のみの一波長測定でもよいし、又は主波長と副波長において測定する二波長測定でもよい。
そして、この吸光度の測定は、エンドポイント法でもよいし、又はレート法でもよい。
【００９２】
１２．試料中に含まれていたプロテインＳの活性値
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料中にプロテインＳが含まれていると、活性化プロテインＣが更に活性化されて、活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されて、活性化血液凝固第Ｖ因子の存在量（濃度）は少なくなる。
そうすると、活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第Ｖ因子の促進効果が小さくなるので、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は抑制される。
これにより、トロンビンの生成が低減するので、このトロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応も抑制されて、生成するシグナルの量は抑制される。
すなわち、試料中に含まれるプロテインＳの活性値に応じて、このシグナル生成の抑制度は大きくなる。
従って、本発明の活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料と活性化プロテインＣ等とを接触させ前記の通りの反応を行わせることによって生成したシグナル量を測定して、すなわち生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていたプロテインＳの活性値を得る。
【００９３】
この生成が抑制されたシグナル量を測定した後、試料中に含まれていたプロテインＳの活性値を得ることは、適宜行えばよいが、例えば以下のようにして行うことができる。
【００９４】
プロテインＳの活性値が分かっている試料の少なくとも一つと、プロテインＳの活性値が「ゼロ」であることが分かっている試料（生理食塩水又は純水等）について、前記の通り測定操作を行い、生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）を求める。
そして、この生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）と試料中に含まれるプロテインＳの活性値との関係を、数式又はグラフ等に表して、検量線を作成する。
この検量線は、すなわち、シグナル生成の抑制度と試料中に含まれるプロテインＳの活性値との関係を表したものである。
次に、プロテインＳの活性値が未知の試料について、前記の通り同様に測定操作を行い、生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）を求める。
このシグナル量を前記の検量線に当てはめ、相当するプロテインＳの活性値を求める。
これにより、プロテインＳの活性値が未知の試料における生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）より、その試料のプロテインＳの活性値を得ることができる。
【００９５】
なお、前記の検量線は、シグナル量（生成が抑制されたシグナル量）すなわちシグナル生成の抑制度と、試料中に含まれるプロテインＳの活性値との関係を表したものであるが、この検量線におけるシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）は、測定されたシグナル量そのものでもよいが、そのシグナル量の値を基に算出した数値であってもよい。
【００９６】
つまり、前記の検量線は、測定されたシグナル量の値を基に算出した数値と、試料中に含まれるプロテインＳの活性値との関係を表したものであってもよい。この場合であっても、測定されたシグナル量の値を基に算出した数値は、生成が抑制されたシグナル量に対応したものである。
【００９７】
この測定されたシグナル量の値を基に算出した数値としては、例えば、測定されたシグナル量の単位時間当たりの変化量の数値、又は測定されたシグナル量の値を時間に対して一次微分して算出した数値、若しくは二次微分して算出した数値等を挙げることができる。
【００９８】
例として、測定により得られた吸光度の１分間当たりの変化量、又は測定により得られた吸光度を時間に対して一次微分して得た吸光度変化の速度、若しくは測定により得られた吸光度を時間に対して二次微分して得た吸光度変化の加速度等を挙げることができる。
【００９９】
１３．タンパク質
本発明の活性測定方法及び活性測定方法においては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくは卵白アルブミンなどのアルブミン、カゼイン、又はゼラチン等のタンパク質を前記の活性測定反応時に存在させることが好ましく、又は活性測定試薬に含有させることが好ましい。
【０１００】
このタンパク質を存在させる濃度は、通常、０．１μＭ〜１ｍＭにあることが好ましい。
そして、本発明の活性測定試薬においては、このタンパク質が前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、このタンパク質を、０．１μＭ〜２ｍＭ含有させることが好ましい。
【０１０１】
１３．塩
本発明の活性測定方法及び活性測定方法においては、ハロゲン元素とアルカリ金属の塩又はハロゲン元素とアルカリ土類金属の塩等の塩を前記の活性測定反応時に存在させることが好ましく、又は活性測定試薬に含有させることが好ましい。
【０１０２】
ハロゲン元素とアルカリ金属の塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、臭化ナトリウム又は臭化カリウム等を挙げることができる。
また、ハロゲン元素とアルカリ土類金属の塩としては、例えば、塩化マグネシウム、フッ化マグネシウム又は臭化マグネシウム等を挙げることができる。
【０１０３】
この塩を存在させる濃度は、通常、５ｍＭ〜１Ｍにあることが好ましく、５０ｍＭ〜２５０ｍＭにあることが特に好ましい。
そして、本発明の活性測定試薬においては、この塩が前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、この塩を、５ｍＭ〜２Ｍ含有させることが好ましく、５０ｍＭ〜５００ｍＭ含有させることが特に好ましい。
【０１０４】
１４．ｐＨ
本発明の活性測定方法においては、この活性測定反応を、ｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０（２０℃）の範囲で行うことが好ましく、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５（２０℃）の範囲で行うことが特に好ましい。
また、本発明の活性測定試薬は、活性測定反応が前記のｐＨ範囲で行われるようなｐＨであることが好ましい。
例えば、本発明の活性測定試薬のｐＨが、ｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０（２０℃）の範囲にあることが好ましく、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５（２０℃）の範囲にあることが特に好ましい。
【０１０５】
なお、本発明の活性測定方法及び活性測定試薬においては、活性測定反応におけるｐＨ又は活性測定試薬のｐＨを前記のｐＨ範囲に保つため、前記のｐＨ範囲に緩衝能を有する緩衝剤を適宜存在させ又は含有させることが好ましい。
【０１０６】
１５．他の成分
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬においては、必要に応じて適宜、防腐剤、安定化剤、活性化剤、糖類又は界面活性剤等の前記記載した成分以外の成分を前記の活性測定反応時に存在させ、又は活性測定試薬に含有させることができる。
【０１０７】
１６．測定手法
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬における、試料中のプロテインＳの活性の測定は、用手法により行ってもよく、又は自動分析装置等の装置を使用して行ってもよい。
【０１０８】
１７．測定段階
本発明の活性測定方法おいて、前記詳述した活性測定反応は、１回に全ての成分と試料との接触を行わせて、全ての反応を１段階に行ってもよく（１ステップ法）、また、成分を分け、接触を複数段階に分けて行うことにより活性測定反応を複数段階に分けて行ってもよい（多ステップ法）。
複数段階に分ける場合、特に制限はないが、例えば次のように行うことができる。
【０１０９】
・ ２ステップ法−１
▲１▼ 試料、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン及び活性化血液凝固第Ｖ因子を接触させる。
▲２▼ 次に、前記▲１▼のものに、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質を接触させる。
【０１１０】
・ ２ステップ法−２
▲１▼ 試料、活性化プロテインＣ及びリン脂質を接触させる。
▲２▼ 次に、前記▲１▼のものに、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質を接触させる。
【０１１１】
・ ３ステップ法
▲１▼ 試料、活性化プロテインＣ及びリン脂質を接触させる。
▲２▼ 次に、前記▲１▼のものに、カルシウムイオン及び活性化血液凝固第Ｖ因子を接触させる。
▲３▼ 更に、前記▲２▼のものに、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質を接触させる。
【０１１２】
１８．活性測定試薬の構成
本発明の活性測定試薬おいて、前記詳述した活性測定反応の各成分は、全て一つの試薬中に含有させてもよく（１試薬系）、また、各成分を複数の試薬に分けて含有させてもよい（複数試薬系）。
各成分を複数の試薬に分けて含有させる場合、特に制限はないが、例えば次のように含有させることができる。
【０１１３】
・ ２試薬系−１
▲１▼ 活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン及び活性化血液凝固第Ｖ因子。
▲２▼ 活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質。
【０１１４】
・ ２試薬系−２
▲１▼ 活性化プロテインＣ及びリン脂質。
▲２▼ カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質。
【０１１５】
・ ３試薬系
▲１▼ 活性化プロテインＣ及びリン脂質。
▲２▼ カルシウムイオン及び活性化血液凝固第Ｖ因子。
▲３▼ 活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質。
【０１１６】
・ ４試薬系
▲１▼ 活性化プロテインＣ及びリン脂質。
▲２▼ カルシウムイオン及び活性化血液凝固第Ｖ因子。
▲３▼ 活性化血液凝固第Ｘ因子及びリン脂質。
▲４▼ プロトロンビン及びトロンビンの基質。
【０１１７】
ＩＩ．試料中のプロテインＣの活性測定方法及び活性測定試薬
１．総論
本発明の試料中のプロテインＣの活性測定方法は、試料に由来しない、プロテインＣ活性化物質、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子（Ｖａ）、活性化血液凝固第Ｘ因子（Ｘａ）、プロトロンビン及びトロンビンの基質より構成される下記の反応系を用いて試料中のプロテインＣの活性値を測定する方法である。
【０１１８】
【化９】
【０１１９】
この「試料に由来しない」については、先の「Ｉ．試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬」の項において述べた通りである。
【０１２０】
本発明の試料中のプロテインＣの活性測定方法について、以下、より具体的に説明を行う。
（ａ） 前述の通りの試料に由来しない、プロテインＣ活性化物質、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子（Ｖａ）、活性化血液凝固第Ｘ因子（Ｘａ）、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
なお、これらの成分と試料との接触は、１回に全ての成分との接触を行わせて、下記の反応系の全ての反応を１段階に行ってもよく（１ステップ法）、また、前記成分を分け、接触を複数段階に分けて行うことにより下記の反応系の反応を複数段階に分けて行ってもよい（多ステップ法）。
【０１２１】
（ｂ） 前記（ａ）における接触により、前記の各成分による下記の反応が進行する。
そして、この一連の反応によりトロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
即ち、前記の一連の反応により、トロンビンの基質がトロンビンにより分解等の作用を受け、この結果生じるシグナルの量（例えば、吸光度等）を測定する。
【０１２２】
（ｃ） 試料にプロテインＣが含まれている場合には、前記の反応におけるプロテインＣがプロテインＣ活性化物質により活性化されて活性化プロテインＣとなり、これにより活性化血液凝固第Ｖ因子の分解が促進されるので、その結果トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制されて、シグナルの生成が抑制される。
このシグナル生成の抑制度は、試料に含まれていたプロテインＣの活性値に応じて大きくなる。
【０１２３】
従って、前記（ｂ）においてシグナル量を測定することにより、生成が抑制されたシグナル量を測定することになり、これにより試料中に含まれていたプロテインＣの活性値を得ることができる。
【０１２４】
【化１０】
【０１２５】
また、本発明の試料中のプロテインＣの活性測定方法は、以下のものでもある。
試料に由来しない、プロテインＣ活性化物質、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子（Ｖａ）、活性化血液凝固第Ｘ因子（Ｘａ）、プロトロンビン及びトロンビンの基質より構成される下記の反応系を用いて試料中のプロテインＣの活性値を測定する方法であって、
【０１２６】
（１） 試料と少なくともプロテインＣ活性化物質を接触させる。これにより、試料にプロテインＣが含まれる場合には、プロテインＣが活性化されて活性化プロテインＣが生成する。
【０１２７】
（２） 前記（１）において生成した活性化プロテインＣがリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が進行する。
【０１２８】
（３） 活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（２）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が進行することにより抑制されて、トロンビンの生成が低減する。
【０１２９】
（４） 前記（３）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
なお、このシグナル生成の抑制度は、試料に含まれていたプロテインＣの活性に応じて大きくなる。
【０１３０】
（５） 前記（４）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定する。
以上の通り前記の反応により生成したシグナル量を測定し、すなわち生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていたプロテインＣの活性値を得る。
【０１３１】
【化１１】
【０１３２】
本発明の試料中のプロテインＣの活性測定試薬は、プロテインＣ活性化物質、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有するものである。
必要に応じて前記成分以外の成分を含んでいても構わない。
なお、本発明の活性測定試薬は、含有させる前記成分を分け、複数の測定試薬より構成されるようにしてもよい。
【０１３３】
２．プロテインＣ活性化物質
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において用いるプロテインＣ活性化物質は、プロテインＣより活性化プロテインＣを生成させることができるものであれば、特に制限なく用いることができる。
このプロテインＣ活性化物質としては、例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｃｏｐｐｅｒｈｅａｄ ｓｎａｋｅ、Ｍｏｃｃａｓｉｎ ｓｎａｋｅ等由来の蛇毒酵素等を挙げることができる。また、遺伝子工学操作、細胞工学操作又は細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
【０１３４】
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において、プロテインＣ活性化物質は、試料と接触することにより、試料中にプロテインＣが含まれている場合には、プロテインＣを活性化し活性化プロテインＣを生成させる。
そして、活性化プロテインＣは、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、活性化血液凝固第Ｖ因子を分解する反応の触媒となる。
よって、試料中にプロテインＣが存在することにより、活性化プロテインＣが活性化血液凝固第Ｖ因子を分解する反応が起こり進行する。
【０１３５】
前記のプロテインＣ活性化物質と試料とを接触させることと、これに活性化血液凝固第Ｖ因子等とを接触させることは、同時に行ってもよい。
しかしながら、プロテインＣ活性化物質を試料と接触させ、少なくとも１分間以上、好ましくは５分間以上、室温又は３７℃等においてインキュベートした後に、活性化血液凝固第Ｖ因子、リン脂質及びカルシウムイオンと接触させ、インキュベートして、活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応を行わせることが好ましい。
【０１３６】
３．プロテインＳ
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬においては、生成した活性化プロテインＣにプロテインＳをリン脂質の存在下に接触させること、又は活性測定試薬にプロテインＳを含有させてもよい。
【０１３７】
ここで用いるプロテインＳは、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
【０１３８】
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において、プロテインＳは、生成した活性化プロテインＣとリン脂質の存在下に接触させることにより、活性化プロテインＣを更に活性化する。
よって、生成した活性化プロテインＣとプロテインＳとをリン脂質の存在下に接触させることにより、活性化プロテインＣがリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｖ因子を分解する反応は更に促進される。
【０１３９】
なお、活性化プロテインＣとプロテインＳとをリン脂質の存在下に接触させることと、活性化プロテインＣを活性化血液凝固第Ｖ因子等と接触させることは、同時に行ってもよい。
しかしながら、活性化プロテインＣをリン脂質とともにプロテインＳと接触させ、少なくとも１分間以上、好ましくは５分間以上、室温又は３７℃等においてインキュベートした後に、活性化血液凝固第Ｖ因子及びカルシウムイオンと接触させ、インキュベートして、活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応を行わせることが好ましい。
【０１４０】
４．試料
本発明の試料中のプロテインＣの活性測定方法及び活性測定試薬において、試料とは、プロテインＣを含有する可能性がある物質である。
【０１４１】
この試料として、例えば、生体試料（ヒト又は動物などに由来する試料）を挙げることができる。
【０１４２】
生体試料としては、例えば、血液、血漿、唾液、汗、尿、涙、髄液、腹水、羊水などの生体の液体；肝臓、心臓、脳、骨、毛髪、皮膚、爪、筋肉、神経組織などの臓器、組織、細胞などの抽出液等を挙げることができる。
【０１４３】
５．他の事項
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬における他の事項は、先の「Ｉ．試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬」の項に記載した事項の通りである。
【０１４４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に説明する。なお、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【０１４５】
〔実施例１〕（試料中のプロテインＳ活性測定の検量線の作成）
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬により試料中のプロテインＳ活性値を測定する際の検量線を作成した。
【０１４６】
（１）プロテインＳ活性測定試薬
▲１▼第１試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ７．５（２０℃）の試薬を調製した。
【０１４７】
活性化プロテインＣ ３４４ｐＭ
リン脂質（ホスファチジルコリン８０％，ホスファチジルセリン２０％）
１０μＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） １５μＭ
塩化ナトリウム １５０ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
【０１４８】
▲２▼第２試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ７．５（２０℃）の試薬を調製した。
【０１４９】
活性化血液凝固第Ｖ因子 ３３１ｐＭ
リン脂質（ホスファチジルコリン８０％，ホスファチジルセリン２０％）
１０μＭ
塩化カルシウム ５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） １５μＭ
塩化ナトリウム １５０ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
【０１５０】
▲３▼第３試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ７．５（２０℃）の試薬を調製した。
【０１５１】
活性化血液凝固第Ｘ因子 ４４ｐＭ
リン脂質（ホスファチジルエタノールアミン５０％，ホスファチジルセリン３０％，ホスファチジルコリン２０％） ７．５μＭ
Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩（トロンビンの基質） ７５０μＭ
プロトロンビン ６９５ｎＭ
塩化カルシウム ５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） １５μＭ
塩化ナトリウム １５０ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
【０１５２】
（２）試料
精製したプロテインＳ（純度９９％以上）を、各々下記の活性値となるようにプロテインＳを含まないヒト血漿に添加し、プロテインＳの活性値が分かっている下記の３種類の試料を調製した。
なお、プロテインＳを含まないヒト血漿は、抗プロテインＳ抗体を固定化したカラムにヒト血漿を通し、このカラムを素通りしたものを分取することにより得た。
【０１５３】
▲１▼ １５μｇ／ｍＬ相当
▲２▼ １０μｇ／ｍＬ相当
▲３▼ ５μｇ／ｍＬ相当
【０１５４】
また、このプロテインＳを含まないヒト血漿を、プロテインＳ活性値が「ゼロ」の試料とした。
▲４▼ ０μｇ／ｍＬ相当
【０１５５】
なお、本明細書及び図面においては、ヒト血漿より精製して得たプロテインＳ精製品（純度９９％以上）１μｇ／ｍＬが有するプロテインＳ活性値を、プロテインＳ活性値１μｇ／ｍＬ相当と定義した。
よって、本明細書及び図面においては、プロテインＳの活性値は、プロテインＳ濃度（μｇ／ｍＬ）相当の値で表している。
【０１５６】
（３）試料中のプロテインＳの活性値の測定
▲１▼ 前記（２）の４種類の試料の各々について、その４μＬと前記の第１試薬の９６μＬを混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。
▲２▼ その後、これに前記の第２試薬の１００μＬを添加混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。
▲３▼ 次に、前記▲２▼の混合液の１８０μＬを分取し、これに３７℃で５分間インキュベートしておいた前記の第３試薬の３６０μＬを添加混合して、３７℃でインキュベートした。
【０１５７】
▲４▼ 前記▲３▼における添加混合の後、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
この吸光度の変化を表したグラフを図１に示した。
この図において、横軸は前記▲３▼における添加混合の後の時間（分）を表し、縦軸は波長４０５ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓ．）を表す。
また、この図において、「●」はプロテインＳ活性が０μｇ／ｍＬ相当の試料の吸光度を示し、「▲」はプロテインＳ活性が５μｇ／ｍＬ相当の試料の吸光度を示し、「▲黒四角▼」はプロテインＳ活性が１０μｇ／ｍＬ相当の試料の吸光度を示し、そして「◆」はプロテインＳ活性が１５μｇ／ｍＬ相当の試料の吸光度を示す。
【０１５８】
▲５▼ 前記▲３▼における添加混合後１７分目から２３分目迄の、前記図１のグラフにおける１分間当たりの吸光度変化量すなわち吸光度変化の傾きの値を縦軸に取り、前記の添加混合後の時間を横軸にとってグラフを作成した。この縦軸の吸光度変化の傾きの値は、すなわち吸光度の一次微分値であり、吸光度変化の速度を表している。
このグラフを図２に示した。
この図において、「●」はプロテインＳ活性が０μｇ／ｍＬ相当の試料における値を示し、「▲」はプロテインＳ活性が５μｇ／ｍＬ相当の試料における値を示し、「▲黒四角▼」はプロテインＳ活性が１０μｇ／ｍＬ相当の試料における値を示し、そして「◆」はプロテインＳ活性が１５μｇ／ｍＬ相当の試料における値を示す。
なお、例えば、横軸の１８分の目盛りにおける値は、前記▲３▼における添加混合の後の１８分目から１９分目までの１分間当たりの吸光度変化量すなわち吸光度変化の傾きの値（吸光度の一次微分値）を表している。
【０１５９】
▲６▼ 次に、前記▲５▼におけるグラフ（図２）の各ラインの傾きの値を縦軸に取り、前記の各試料のプロテインＳ活性値（μｇ／ｍＬ相当）を横軸にとってグラフを作成した。この縦軸の値は、すなわち吸光度の二次微分値であり、吸光度変化の加速度を表している。
このグラフを図３に示した。
この図３のグラフが、試料中のプロテインＳ活性値の測定における検量線を示したグラフである。
【０１６０】
プロテインＳ活性値が分からない試料については、前記の通りの活性測定操作を行い、測定により得られた吸光度（生成が抑制されたシグナル量）より吸光度変化の加速度（吸光度の二次微分値）を求め、この値を前記の図３のグラフに当てはめることにより、試料中に含まれていたプロテインＳの活性値を得ることができる。
【０１６１】
〔実施例２〕（試料中のプロテインＳ活性値の測定）
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬によりヒト血漿試料中のプロテインＳの活性値を測定した。
【０１６２】
（１）本発明のプロテインＳ活性測定試薬
前記実施例１において調製した、第１試薬、第２試薬及び第３試薬をそれぞれ用いた。
【０１６３】
（２）凝固時間法によるプロテインＳ活性測定試薬
従来の試料中のプロテインＳの活性測定試薬として、市販の凝固時間法による血漿中プロテインＳ活性測定試薬「スタクロット プロテインＳ」（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いた。
【０１６４】
（３）試料
下記の６種類のヒト血漿を試料とした。
▲１▼ 試料−１（健常者の血漿）
▲２▼ 試料−２（周産期の女性の血漿）
▲３▼ 試料−３（周産期の女性の血漿）
▲４▼ 試料−４（周産期の女性の血漿）
▲５▼ 試料−５（周産期の女性の血漿）
▲６▼ 試料−６（周産期の女性の血漿）
【０１６５】
（４）試料中のプロテインＳの活性値の測定
▲１▼本発明のプロテインＳ活性測定試薬による測定
前記（３）の６種類の試料の各々について、前記実施例１の（３）の▲１▼〜▲６▼の記載の通りに測定操作を行い、吸光度変化の加速度の値（吸光度の二次微分値）を求めた。
この吸光度変化の加速度の値（吸光度の二次微分値）を、前記実施例１で作成した検量線のグラフ（図３）に当てはめて、試料中に含まれていたプロテインＳの活性値を各々得た。
この測定により得たプロテインＳ活性値を表１に示した。
【０１６６】
▲２▼凝固時間法によるプロテインＳ活性測定試薬
前記（３）の６種類の試料の各々について、前記の「スタクロット プロテインＳ」（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用い、この添付文書の操作法の記載の通りに測定を行い、凝固時間法によるプロテインＳの活性値を各々得た。
なお、前記実施例１の（２）において用いた、精製したプロテインＳ（純度９９％以上）を試料として作成した検量線により、プロテインＳ活性値を得た。
そして、凝固時間の測定は、血液凝固測定装置「ベーリング フィブリンタイマ ＩＩ」（ヘキストジャパン社）を用いて行った。
この測定により得たプロテインＳ活性値も表１に示した。
【０１６７】
【表１】
【０１６８】
（５）まとめ
表１より分かるように、本発明のプロテインＳ活性測定試薬により測定した血漿試料のプロテインＳ活性値と、凝固時間法によるプロテインＳ活性測定試薬により測定した血漿試料のプロテインＳ活性値とは、いずれの試料においても一致した。
このことより、本発明の活性測定方法及び活性測定試薬により求めた試料中に含まれるプロテインＳの活性値は、正確なものであることが確かめられた。
【０１６９】
〔実施例３〕（活性化プロテインＣによる触媒反応に用いるリン脂質の検討）
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において、活性化プロテインＣによる触媒反応に用いるリン脂質の組成について検討を行った。
【０１７０】
（１）プロテインＳ活性測定試薬
▲１▼第１試薬
リン脂質の組成が異なる６種類の第１試薬を以下のようにして調製した。
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ７．５（２０℃）に調整した。
【０１７１】
活性化プロテインＣ ３４４ｐＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） １５μＭ
塩化ナトリウム １５０ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
リン脂質 １０μＭ
（ａ）ホスファチジルコリン１００％，ホスファチジルセリン０％
（ｂ）ホスファチジルコリン９５％，ホスファチジルセリン５％
（ｃ）ホスファチジルコリン９０％，ホスファチジルセリン１０％
（ｄ）ホスファチジルコリン８５％，ホスファチジルセリン１５％
（ｅ）ホスファチジルコリン８０％，ホスファチジルセリン２０％ 又は、
（ｄ）ホスファチジルコリン７５％，ホスファチジルセリン２５％
【０１７２】
▲２▼第２試薬
リン脂質の組成が異なる６種類の第２試薬を以下のようにして調製した。
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ７．５（２０℃）に調整した。
【０１７３】
活性化血液凝固第Ｖ因子 ３３１ｐＭ
塩化カルシウム ５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） １５μＭ
塩化ナトリウム １５０ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
リン脂質 １０μＭ
（ａ）ホスファチジルコリン１００％，ホスファチジルセリン０％
（ｂ）ホスファチジルコリン９５％，ホスファチジルセリン５％
（ｃ）ホスファチジルコリン９０％，ホスファチジルセリン１０％
（ｄ）ホスファチジルコリン８５％，ホスファチジルセリン１５％
（ｅ）ホスファチジルコリン８０％，ホスファチジルセリン２０％ 又は、
（ｆ）ホスファチジルコリン７５％，ホスファチジルセリン２５％
【０１７４】
▲３▼第３試薬
前記実施例１の（１）の▲３▼において調製した第３試薬を用いた。
【０１７５】
（２）試料
▲１▼ プロテインＳの活性値が０．２μｇ／ｍＬ相当となるように、プロテインＳを、前記実施例１の（２）で調製したプロテインＳを含まないヒト血漿に添加し、プロテインＳ活性値が０．２μｇ／ｍＬ相当の試料を調製した。
【０１７６】
▲２▼ 前記のプロテインＳを含まないヒト血漿を、プロテインＳ活性値が０μｇ／ｍＬ相当の試料とした。
【０１７７】
（３）試料中のプロテインＳの活性値の測定
前記（２）の２種類の試料の各々について、前記（１）の▲１▼で調製した６種類の第１試薬のそれぞれ、及び前記（１）の▲２▼で調製した６種類の第２試薬のそれぞれ、並びに前記（１）の▲３▼で調製した第３試薬を用いて、前記実施例１の（３）の▲１▼〜▲６▼の記載の通りに測定操作を行い、吸光度変化の加速度の値（吸光度の二次微分値）を求めた。
なお、この測定において、第１試薬と第２試薬は、各々リン脂質の組成が同一なもの同士を組み合わせて用いた。
【０１７８】
（４）リン脂質の組成による効果の検討
プロテインＳ活性値が０．２μｇ／ｍＬ相当であるヒト血漿試料の吸光度変化の加速度の値（吸光度の二次微分値）を、プロテインＳ活性値が０μｇ／ｍＬ相当であるヒト血漿試料の吸光度変化の加速度の値（吸光度の二次微分値）で除して比（α０．２／α０）を求めた。
これを表２に示した。
この比の値が低い程、プロテインＳ活性値が０．２μｇ／ｍＬ相当であるヒト血漿試料とプロテインＳ活性値が０μｇ／ｍＬ相当であるヒト血漿試料とで、得られたシグナル量に差が生じていることになり、測定の感度がより高いことになるので、プロテインＳ活性値の測定においては好ましい。
【０１７９】
【表２】
【０１８０】
この表より、活性化プロテインＣによる触媒反応時に存在させるリン脂質の組成が、「ホスファチジルコリン８５％，ホスファチジルセリン１５％」、「ホスファチジルコリン８０％，ホスファチジルセリン２０％」、及び「ホスファチジルコリン７５％，ホスファチジルセリン２５％」のときが、他の組成の時よりも前記の比の値が低く、すなわち測定反応が促進されて、測定の感度がより高くなっていることが分かる。
【０１８１】
このことより、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの更なる活性化時、及びこの活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に存在させるリン脂質の組成としては、ホスファチジルコリンの組成比を８５％〜７５％として、かつホスファチジルセリンの組成比を１５％〜２５％とすることにより、前記反応が促進されて、測定の感度がより高くなることが確かめられた。
【０１８２】
〔実施例４〕（活性化血液凝固第Ｘ因子による触媒反応に用いるリン脂質の検討）
活性化血液凝固第Ｘ因子によるトロンビンを生成させる触媒反応に用いるリン脂質の組成について検討を行った。
なお、本検討においては、活性化血液凝固第Ｘ因子の触媒反応におけるリン脂質の組成の効果を見るのが目的であるので、活性化血液凝固第Ｘ因子より始まる反応系において検討を行った。
【０１８３】
（１）リン脂質組成検討試薬
▲１▼第１試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ７．５（２０℃）の試薬を調製した。
【０１８４】
活性化血液凝固第Ｖ因子 ３３１ｐＭ
リン脂質（ホスファチジルコリン８０％，ホスファチジルセリン２０％）
１０μＭ
塩化カルシウム ５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） １５μＭ
塩化ナトリウム １５０ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
【０１８５】
▲２▼第２試薬
リン脂質の組成が異なる４種類の第２試薬を以下のようにして調製した。
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．５（２０℃）に調整した。
【０１８６】
活性化血液凝固第Ｘ因子 ４４ｐＭ
Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩（トロンビンの基質） ７５０μＭ
プロトロンビン ６９５ｎＭ
塩化カルシウム ５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） １５μＭ
塩化ナトリウム １５０ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
リン脂質 ７．５μＭ
（ａ）ホスファチジルエタノールアミン５０％，ホスファチジルセリン４０％，ホスファチジルコリン１０％
（ｂ）ホスファチジルエタノールアミン５０％，ホスファチジルセリン３０％，ホスファチジルコリン２０％
（ｃ）ホスファチジルエタノールアミン５０％，ホスファチジルセリン２０％，ホスファチジルコリン３０％ 又は、
（ｄ）ホスファチジルエタノールアミン５０％，ホスファチジルセリン１０％，ホスファチジルコリン４０％
【０１８７】
（２）リン脂質の組成による効果の測定
▲１▼ ３７℃で５分間インキュベートしておいた前記（１）の第１試薬の１８０μＬと、３７℃で５分間インキュベートしておいた前記（１）の第２試薬の３６０μＬとを混合して、３７℃でインキュベートした。
【０１８８】
▲２▼ 前記▲１▼における添加混合の後、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
この吸光度の変化を表したグラフを図４に示した。
この図において、横軸は前記▲１▼における添加混合の後の時間（分）を表し、縦軸は波長４０５ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓ．）を表す。
【０１８９】
また、この図において、「●」は第２試薬におけるリン脂質の組成が「ホスファチジルエタノールアミン５０％，ホスファチジルセリン４０％，ホスファチジルコリン１０％」のときの吸光度を示し、「◆」は第２試薬におけるリン脂質の組成が「ホスファチジルエタノールアミン５０％，ホスファチジルセリン３０％，ホスファチジルコリン２０％」のときの吸光度を示し、「▲」は第２試薬におけるリン脂質の組成が「ホスファチジルエタノールアミン５０％，ホスファチジルセリン２０％，ホスファチジルコリン３０％」のときの吸光度を示し、そして、「▲黒四角▼」は第２試薬におけるリン脂質の組成が「ホスファチジルエタノールアミン５０％，ホスファチジルセリン１０％，ホスファチジルコリン４０％」のときの吸光度を示す。
【０１９０】
（３）リン脂質の組成による効果の検討
この図４においては、吸光度増加の立ち上がりが早く、より短時間の内に吸光度がプラトーに達するものほど、活性化血液凝固第Ｘ因子の触媒作用によるトロンビンの生成反応が促進されて、測定の感度がより高くなるものである。
【０１９１】
この図より、活性化血液凝固第Ｘ因子による触媒反応時に存在させるリン脂質の組成が、「ホスファチジルエタノールアミン５０％，ホスファチジルセリン４０％，ホスファチジルコリン１０％」、及び「ホスファチジルエタノールアミン５０％，ホスファチジルセリン３０％，ホスファチジルコリン２０％」のときが、他の組成の時よりも吸光度増加の立ち上がりが早く、より短時間の内に吸光度がプラトーに達している。すなわち、活性化血液凝固第Ｘ因子によるトロンビンの生成反応が促進されて、測定の感度がより高くなっていることが分かる。
【０１９２】
このことより、活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時に存在させるリン脂質の組成としては、ホスファチジルエタノールアミンの組成比を５０％以上として、かつホスファチジルセリンの組成比を３０％以上とすることにより、前記反応が促進されて、測定の感度がより高くなることが確かめられた。
【０１９３】
【発明の効果】
本発明の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬、並びに本発明の試料中のプロテインＣの活性測定方法及び活性測定試薬は、血液凝固反応に係わる成分（因子）の試料中の存在量（濃度）により又はその変異によって、測定により得られるプロテインＳ活性値又はプロテインＣ活性値が影響を受けてしまうことがないものである。そして、測定反応に用いる反応の数及び測定に必要な成分の数が多くなく、よりシンプルなものであって、様々な因子や種々の条件による影響を受け難いものである。また、試料中のプロテインＳ活性値及びプロテインＣ活性値の測定反応の至適条件を見出したことにより、前記測定反応を促進することができ、高い測定感度が得られるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】プロテインＳ活性値が分かっている３種類の試料を測定したときの波長４０５ｎｍにおける吸光度の時間による変化を示した図である。
【図２】プロテインＳ活性値が分かっている３種類の試料の吸光度変化の傾きと時間との関係を示した図である。
【図３】試料中のプロテインＳ活性の測定における検量線を示した図である。
【図４】活性化血液凝固第Ｘ因子の触媒反応におけるリン脂質の組成の効果を示した図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液凝固反応に係わる成分（因子）の試料中の存在量（濃度）又はその変異により、測定値が影響を受けることがなく、高感度に測定を行うことができる、試料中のプロテインＳの活性の測定方法及び測定試薬に関するものである。
また、本発明は、血液凝固反応に係わる成分（因子）の試料中の存在量（濃度）又はその変異により、測定値が影響を受けることがなく、高感度に測定を行うことができる、試料中のプロテインＣの活性の測定方法及び測定試薬に関するものである。
本発明は、特に、臨床検査、分子生物学、及び医学などの生命科学分野等において有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】
プロテインＣとプロテインＳは、いずれも生体内の血液凝固系の制御機構において中心的に機能する血漿タンパク質である。
このプロテインＣ及びプロテインＳによる血液凝固系の制御機構の模式図を、下に示した。
【０００３】
【化３】
プロテインＣは生体内において、トロンビン・トロンボモジュリン複合体により限定分解され活性化ペプチドが遊離することにより活性化され、活性化プロテインＣとなる。
活性化プロテインＣは、ヒトおける血液凝固を促進する活性化血液凝固第Ｖ因子、及び活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子を分解することにより、血液凝固反応を抑制する役割を担ったセリンプロテアーゼである。
プロテインＳは、活性化プロテインＣの補欠因子（補助因子）であり、プロテインＳの存在により、活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応及び活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子の分解反応は、促進される。
【０００５】
血液凝固反応を抑制する働きを持つプロテインＣ及びプロテインＳの活性の低下又は欠損は、生体内において血栓症を引き起こす原因となりうる。
実際、プロテインＣ又はプロテインＳの先天性欠損症者は、高い頻度で深部静脈血栓症、表在性静脈炎若しくは肺梗塞などの静脈性血栓症、又は心不全の原因となる冠状動脈血栓症などの動脈性血栓症等を発症することになる。
また、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、ビタミンＫ欠乏症又は肝機能低下症等においても、プロテインＣ及びプロテインＳの活性の低下又は欠損が認められる。
即ち、血漿等の試料中のプロテインＣの活性又はプロテインＳの活性を測定することにより、プロテインＣ又はプロテインＳの活性の低下又は欠損を把握することができ、引いては血栓症等の疾患の発症の予測、早期発見及び治療効果の判定等に重要な役割を果たすものである。
【０００６】
試料中のプロテインＣの活性又はプロテインＳの活性を測定する方法として、試料を蛇毒からのプロテインＣ−活性化剤と共に、活性化プロテインＣ又はプロテインＳの形成下にインキュベートし、血液凝固第ＸＩＩ因子、血液凝固第ＶＩＩ因子又は血液凝固第ＩＩ因子（プロトロンビン）の活性化剤を添加し、かつ血液凝固因子及びその活性剤により媒介される、プロトロンビンからのトロンビンの形成の減少を、色素原トロンビン基質を使用して測光測定する方法が開示されている（特許文献１参照。）。
【０００７】
別の試料中のプロテインＳの活性を測定する方法として、血漿試料にプロテインＣを活性化するプロテインＣ活性化物質又は活性化プロテインＣを添加し、次に活性化血液凝固第ＩＸ因子を加えインキュベートし、生成するトロンビンの量を知られた方法で測定し、これをプロテインＳ活性が既知の標品を測定して得た値と比較して、試料中のプロテインＳの活性を測定する方法が開示されている（特許文献２参照。）。
【０００８】
また、他の試料中のプロテインＣの活性を測定する方法として、血漿試料にプロテインＣを活性化するプロテインＣ活性化物質又はプロテインＳを添加し、次に活性化血液凝固第ＩＸ因子を加えインキュベートし、生成するトロンビンの量を知られた方法で測定し、これをプロテインＣ活性が既知の標品を測定して得た値と比較して、試料中のプロテインＣの活性を測定する方法が開示されている（特許文献２参照。）。
【０００９】
更に、別の試料中のプロテインＳの活性を測定する方法として、試料を、活性化プロテインＣ、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、リン脂質及びカルシウムイオンとインキュベートし、次にこの混合物を、活性化血液凝固第ＩＩ因子（トロンビン）、活性化血液凝固第ＩＸ因子及び活性化血液凝固第Ｘ因子とインキュベートし、次にこのインキュベーション混合物へ活性化血液凝固第Ｘ因子特異性基質を添加し、この基質の開裂によって生成したシグナルの量を測定することよりなる、試料中のプロテインＳの活性を測定する方法が開示されている（特許文献３参照。）。
【００１０】
【特許文献１】
特開昭６２−２１２５６９号公報
【特許文献２】
特表平４−５０６６０３号公報
【特許文献３】
特表平６−５０４６８２号公報
【００１１】
これら従来の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬、並びにプロテインＣの活性測定方法及び活性測定試薬においては、その測定反応に使用する血液凝固反応の成分（因子）の少なくとも一つは、試料に含まれている成分（因子）をそのまま用いている。すなわち、試料に含まれている成分に依存している。
【００１２】
しかしながら、この試料に含まれている成分（因子）を測定反応に用いる場合、その成分（因子）〔例えば、活性化血液凝固第Ｘ因子〕がその試料提供者において欠損又は低下しているときには、前記測定反応の反応成分（因子）の少なくとも一つが十分量存在しない訳であるから、測定反応は十分に進行せず、得られる測定値（プロテインＣ活性値又はプロテインＳ活性値）は、場合により本来の値よりかい離し、誤差を含むものになる。
即ち、測定値が、血液凝固反応に係わる成分（因子）の試料中の存在量（濃度）又はその変異により、影響を受けてしまうことが起こるのである。
これは、プロテインＣ活性又はプロテインＳ活性を測定しようとする患者は、血液凝固・線溶系に異常が生じている可能性が高く、それ故、前記反応成分（因子）が欠損又は低下している可能性が大きいので、前記のような問題は決して稀なことではないのである。
【００１３】
また、従来の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬、並びにプロテインＣの活性測定方法及び活性測定試薬は、その測定反応が数多くの反応を経るものであり、測定に必要な成分も多く、複雑なものであった。このためこの測定反応は様々な因子や種々の条件による影響を受け易いものであった。
【００１４】
更に、従来の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬、並びにプロテインＣの活性測定方法及び活性測定試薬は、測定の感度が十分高いとは言えないものであった。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、血液凝固反応に係わる成分（因子）の試料中の存在量（濃度）又はその変異により、測定値が影響を受けてしまうことがなく、測定反応に用いる反応の数及び測定に必要な成分の数が多くなく、よりシンプルなものであって、様々な因子や種々の条件による影響を受け難いものであり、かつ高い測定感度が得られる、試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬、並びに試料中のプロテインＣの活性測定方法及び活性測定試薬を提供することである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
１．試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬
本発明は、試料中のプロテインＳの活性値を測定する方法であって、
（ａ） 試料に由来しない、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させ、
（ｂ） 前記（ａ）の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定し、
（ｃ） 試料に含まれるプロテインＳの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量を求める、
ことにより、試料中に含まれていたプロテインＳの活性値を得る試料中のプロテインＳの活性測定方法である。
【００１７】
また、本発明は、試料に由来しない、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質より構成される下記の反応系を用いて試料中のプロテインＳの活性値を測定する方法であって、
【００１８】
【化４】
（１） 試料と少なくとも活性化プロテインＣ及びリン脂質を接触させることにより、試料にプロテインＳが含まれる場合にはリン脂質の存在下に活性化プロテインＣが更に活性化され、
（２） 活性化プロテインＣの前記（１）における更なる活性化により、活性化プロテインＣがリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進され、
（３） 活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（２）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減し、
（４） 前記（３）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制され、
（５） 前記（４）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定する、
ことにより、試料中に含まれていたプロテインＳの活性値を得る試料中のプロテインＳの活性測定方法である。
【００２０】
更に、本発明は、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有する試料中のプロテインＳの活性測定試薬である。
【００２１】
２．試料中のプロテインＣの活性測定方法及び活性測定試薬
本発明は、試料中のプロテインＣの活性値を測定する方法であって、
（ａ） 試料に由来しない、プロテインＣ活性化物質、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させ、
（ｂ） 前記（ａ）の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定し、
（ｃ） 試料に含まれるプロテインＣの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量を求める、
ことにより、試料中に含まれていたプロテインＣの活性値を得る試料中のプロテインＣの活性測定方法である。
【００２２】
また、本発明は、試料に由来しない、プロテインＣ活性化物質、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質より構成される下記の反応系を用いて試料中のプロテインＣの活性値を測定する方法であって、
【００２３】
【化５】
（１） 試料と少なくともプロテインＣ活性化物質を接触させることにより、試料にプロテインＣが含まれる場合には、プロテインＣより活性化プロテインＣが生成し、
（２） これにより生成した活性化プロテインＣがリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が進行し、
（３） 活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（２）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が進行することにより抑制されて、トロンビンの生成が低減し、
（４） 前記（３）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制され、
（５） 前記（４）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定する、
ことにより、試料中に含まれていたプロテインＣの活性値を得る試料中のプロテインＣの活性測定方法である。
【００２５】
更に、本発明は、プロテインＣ活性化物質、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有する試料中のプロテインＣの活性測定試薬である。
【００２６】
【発明の実施の形態】
Ｉ．試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬
１．総論
本発明の試料中のプロテインＳの活性測定方法は、試料に由来しない、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子（Ｖａ）、活性化血液凝固第Ｘ因子（Ｘａ）、プロトロンビン及びトロンビンの基質より構成される下記の反応系を用いて試料中のプロテインＳの活性値を測定する方法である。
【００２７】
【化６】
ここで、「試料に由来しない」とは、試料に含まれていたもの以外の、という意味であり、本発明の試料中のプロテインＳの活性測定方法においては、測定反応に必要な各成分（因子）〔活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質〕は、試料に含まれていたものに依存し用いるのではなく、試料に含まれていたもの以外のものを別に添加するなどして、測定反応系に充分な量の各成分（因子）を存在させて用いる。
【００２９】
これにより、例え、前記の各成分（因子）のいずれかが欠損又は低下しているような患者の試料においても、その成分（因子）の欠損又は低下による影響を受けることなく測定反応が進行し、正確なプロテインＳの活性値を求めることができるのである。
【００３０】
但し、本発明の活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料に含まれていた前記成分が測定反応において働いたとしても、それは本発明において問題ないものであり、本発明の趣旨から外れるものではない。
【００３１】
本発明においては、測定反応に必要な各成分（因子）を測定反応を進行させるのに十分な量存在させて、試料に含まれる成分（因子）の量に依存せず影響を受けないようにしているものであって、試料に含まれていた成分（因子）が更に働いたとしても、測定反応において支障はなく、本発明の趣旨に相違するものではない。
【００３２】
本発明の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬について、以下、より具体的に説明を行う。
（ａ） 前述の通りの試料に由来しない、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子（Ｖａ）、活性化血液凝固第Ｘ因子（Ｘａ）、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
なお、これらの成分と試料との接触は、１回に全ての成分との接触を行わせて、下記の反応系の全ての反応を１段階に行ってもよく（１ステップ法）、また、前記成分を分け、接触を複数段階に分けて行うことにより下記の反応系の反応を複数段階に分けて行ってもよい（多ステップ法）。
【００３３】
（ｂ） 前記（ａ）における接触により、前記の各成分による下記の反応が進行する。
そして、この一連の反応によりトロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
即ち、前記の一連の反応により、トロンビンの基質がトロンビンにより分解等の作用を受け、この結果生じるシグナルの量（例えば、吸光度等）を測定する。
【００３４】
（ｃ） 試料にプロテインＳが含まれている場合には、前記の反応における活性化プロテインＣがリン脂質の存在下に更に活性化され、これにより活性化血液凝固第Ｖ因子の分解が促進されるので、その結果トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制されて、シグナルの生成が抑制される。
このシグナル生成の抑制度は、試料に含まれていたプロテインＳの活性値に応じて大きくなる。
従って、前記（ｂ）においてシグナル量を測定することにより、生成が抑制されたシグナル量を測定することになり、これにより試料中に含まれていたプロテインＳの活性値を得ることができる。
【００３５】
【化７】
また、本発明の試料中のプロテインＳの活性測定方法は、以下のものでもある。
試料に由来しない、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子（Ｖａ）、活性化血液凝固第Ｘ因子（Ｘａ）、プロトロンビン及びトロンビンの基質より構成される下記の反応系を用いて試料中のプロテインＳの活性値を測定する方法であって、
【００３７】
（１） 試料と少なくとも活性化プロテインＣ及びリン脂質を接触させる。
これにより、試料にプロテインＳが含まれる場合にはリン脂質の存在下に活性化プロテインＣが更に活性化される。
【００３８】
（２） 活性化プロテインＣの前記（１）における更なる活性化により、活性化プロテインＣがリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進される。
【００３９】
（３） 活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（２）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減する。
【００４０】
（４） 前記（３）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
なお、このシグナル生成の抑制度は、試料に含まれていたプロテインＳの活性に応じて大きくなる。
【００４１】
（５） 前記（４）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定する。
以上の通り前記の反応により生成したシグナル量を測定し、すなわち生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていたプロテインＳの活性値を得る。
【００４２】
【化８】
本発明の試料中のプロテインＳの活性測定試薬は、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有するものである。
必要に応じて前記成分以外の成分を含んでいても構わない。
なお、本発明の活性測定試薬は、含有させる前記成分を分け、複数の測定試薬より構成されるようにしてもよい。
【００４４】
２．試料
本発明の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬において、試料とは、プロテインＳを含有する可能性がある物質である。
【００４５】
この試料として、例えば、生体試料（ヒト又は動物などに由来する試料）を挙げることができる。
【００４６】
生体試料としては、例えば、血液、血漿、唾液、汗、尿、涙、髄液、腹水、羊水などの生体の液体；肝臓、心臓、脳、骨、毛髪、皮膚、爪、筋肉、神経組織などの臓器、組織、細胞などの抽出液等を挙げることができる。
【００４７】
３．活性化プロテインＣ
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において用いる活性化プロテインＣは、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
また、本発明の活性測定方法及び活性測定試薬における測定反応中に、プロテインＣ活性化物質等によりプロテインＣより活性化プロテインＣを生成させて、これを本発明における活性化プロテインＣとして用いてもよい。
【００４８】
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において、活性化プロテインＣは、試料と接触することにより、試料中にプロテインＳが含まれている場合には、リン脂質の存在下、その活性が更に活性化される。
そして、活性化プロテインＣは、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、活性化血液凝固第Ｖ因子を分解する反応の触媒となる。
よって、プロテインＳが存在することにより、活性化プロテインＣが活性化血液凝固第Ｖ因子を分解する反応は促進される。
【００４９】
前記の活性化プロテインＣ等と試料を接触させることと、活性化プロテインＣを活性化血液凝固第Ｖ因子等と接触させることは、同時に行ってもよい。
しかしながら、活性化プロテインＣをリン脂質とともに試料と接触させ、少なくとも１分間以上、好ましくは５分間以上、室温又は３７℃等においてインキュベートした後に、活性化血液凝固第Ｖ因子及びカルシウムイオンと接触させ、インキュベートして、活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応を行わせることが好ましい。
【００５０】
この活性化プロテインＣを用いる際の濃度は、活性化血液凝固第Ｖ因子と接触させリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｖ因子を分解させる際には、通常、１ｐＭ〜１００ｎＭにあることが好ましい。
しかしながら、測定の感度を高く得るには、活性化プロテインＣ濃度が高い方が好ましいので、前記の活性化プロテインＣ濃度としては、１０ｐＭ〜１０ｎＭにあることがより好ましく、１００ｐＭ〜１ｎＭにあることが特に好ましい。
【００５１】
また、本発明の活性測定試薬においては、前記の分解反応時に活性化プロテインＣが前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、活性化プロテインＣを、１ｐＭ〜２００ｎＭ含有させることが好ましく、１０ｐＭ〜２０ｎＭ含有させることがより好ましく、１００ｐＭ〜２ｎＭ含有させることが特に好ましい。
【００５２】
４．活性化プロテインＣによる触媒反応に用いるリン脂質
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの更なる活性化時、及びこの活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時には、その活性化及び分解反応に必要なリン脂質を存在させる。
【００５３】
このリン脂質は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの、その他の動物由来のもの、植物由来のもの、微生物由来のもの又は人工的に合成したもの等を挙げることができる。
このリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール若しくはジホスファチジルグリセロールなどのグリセロリン脂質や、又はスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質等を挙げることができる。
【００５４】
前記の活性化プロテインＣの更なる活性化時、及び活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に用いるリン脂質としては、ホスファチジルコリンのみを単独で用いるか、又はホスファチジルコリンとホスファチジルセリンの混合物を用いることが、前記活性化及び分解反応促進の効果が高くなるため好ましい。
ホスファチジルコリンの組成比が８５％〜７０％であり、かつホスファチジルセリンの組成比が１５％〜３０％であることがより好ましい。
特に、ホスファチジルコリンの組成比が８５％〜８０％であり、かつホスファチジルセリンの組成比が１５％〜２０％であることが好ましい。
【００５５】
このリン脂質を用いる際の濃度は、活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応の際には、通常、０．１μＭ〜１００μＭにあることが好ましく、０．５μＭ〜１０μＭにあることが特に好ましい。
そして、本発明の活性測定試薬においては、前記の活性化時及び分解反応時にリン脂質が前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、リン脂質を０．１μＭ〜２００μＭ含有させることが好ましく、０．５μＭ〜２０μＭ含有させることが特に好ましい。
【００５６】
５．カルシウムイオン
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬においては、活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時、及び活性化血液凝固第Ｘ因子及び活性化血液凝固第Ｖ因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時には、カルシウムイオンを存在させる。
【００５７】
このカルシウムイオンとしては、カルシウムイオン自体はもちろんのこと、又はカルシウムの塩等のカルシウムイオンを含む化合物であれば、特に制限なく用いることができる。
【００５８】
このカルシウムイオンを含む化合物としては、例えば、フッ化カルシウム、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、乳酸カルシウム又はシアン化カルシウム等を挙げることができる。
【００５９】
このカルシウムイオンを用いる際の濃度は、活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応の際、そして活性化血液凝固第Ｘ因子及び活性化血液凝固第Ｖ因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際には、通常、０．１ｍＭ〜１００ｍＭにあることが好ましく、１ｍＭ〜１０ｍＭにあることが特に好ましい。
そして、本発明の活性測定試薬においては、前記の分解反応時及びトロンビン生成反応時にカルシウムイオンが前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、カルシウムイオン又はカルシウムイオンを含む化合物を、０．１ｍＭ〜２００ｍＭ含有させることが好ましく、１ｍＭ〜２０ｍＭ含有させることが特に好ましい。
【００６０】
６．活性化血液凝固第Ｖ因子
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において用いる活性化血液凝固第Ｖ因子は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
【００６１】
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において、活性化血液凝固第Ｖ因子は、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、活性化プロテインＣにより分解される。
そして、試料中にプロテインＳが含まれている場合そのプロテインＳの存在により、活性化プロテインＣが更に活性化されて、この分解反応は促進される。
【００６２】
また、活性化血液凝固第Ｖ因子は、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒する、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる３反応を促進するものである。
【００６３】
よって、試料中にプロテインＳが含まれていると、活性化プロテインＣが更に活性化されて、活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されて、活性化血液凝固第Ｖ因子の存在量（濃度）は少なくなる。そうすると、活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第Ｖ因子の促進効果が小さくなるので、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は抑制される。
【００６４】
前記の活性化血液凝固第Ｖ因子と活性化プロテインＣ等とを接触させることと、活性化血液凝固第Ｖ因子と活性化血液凝固第Ｘ因子及びプロトロンビン等とを接触させることは、同時に行ってもよい。
しかしながら、活性化血液凝固第Ｖ因子をリン脂質及びカルシウムイオンとともに活性化プロテインＣと接触させ、少なくとも１分間以上、好ましくは５分間以上、室温又は３７℃等においてインキュベートした後に、活性化血液凝固第Ｘ因子、リン脂質及びプロトロンビン等と接触させ、インキュベートして、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応を行わせることが好ましい。
【００６５】
この活性化血液凝固第Ｖ因子を用いる際の濃度は、活性化プロテインＣと接触させリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｖ因子を分解させる際には、通常、０．５ｐＭ〜５ｎＭにあることが好ましい。
しかしながら、この活性化血液凝固第Ｖ因子の濃度が高いと、試料に由来する成分（因子）等による血液凝固反応が進行してしまい、フィブリンが析出したり多大な発色が生じて正確な測定が行えなくなるので、前記の活性化血液凝固第Ｖ因子濃度としては、５ｐＭ〜５００ｐＭにあることがより好ましく、２０ｐＭ〜２００ｐＭにあることが特に好ましい。
【００６６】
また、本発明の活性測定試薬においては、前記の分解反応時に活性化血液凝固第Ｖ因子が前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、活性化血液凝固第Ｖ因子を、０．５ｐＭ〜１０ｎＭ含有させることが好ましく、５ｐＭ〜１ｎＭ含有させることがより好ましく、２０ｐＭ〜４００ｐＭ含有させることが特に好ましい。
【００６７】
７．活性化血液凝固第Ｘ因子
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において用いる活性化血液凝固第Ｘ因子は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
【００６８】
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において、活性化血液凝固第Ｘ因子は、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応を触媒する。
この活性化血液凝固第Ｘ因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は、活性化血液凝固第Ｖ因子の存在により促進される。
【００６９】
よって、先に述べたように、試料中にプロテインＳが含まれていると、活性化プロテインＣが更に活性化され、これにより活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進され、このため活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第Ｖ因子の促進効果が小さくなるので、前記のトロンビンを生成させる反応は抑制される。
【００７０】
この活性化血液凝固第Ｘ因子を用いる際の濃度は、活性化血液凝固第Ｖ因子及びプロトロンビン等と接触させ、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる際には、通常、０．１ｐＭ〜３００ｐＭにあることが好ましい。
しかしながら、この活性化血液凝固第Ｘ因子の濃度が高いと、先の活性化血液凝固第Ｖ因子の場合と同様、試料に由来する成分（因子）等による血液凝固反応が進行してしまい、フィブリンが析出したり多大な発色が生じて正確な測定が行えなくなるので、前記の活性化血液凝固第Ｘ因子濃度としては、１ｐＭ〜１００ｐＭにあることがより好ましく、１０ｐＭ〜５０ｐＭにあることが特に好ましい。
【００７１】
また、本発明の活性測定試薬においては、前記のトロンビン生成反応時に活性化血液凝固第Ｘ因子が前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、活性化血液凝固第Ｘ因子を、０．１ｐＭ〜６００ｐＭ含有させることが好ましく、１ｐＭ〜２００ｐＭ含有させることがより好ましく、１０ｐＭ〜１００ｐＭ含有させることが特に好ましい。
【００７２】
８．活性化血液凝固第Ｘ因子による触媒反応に用いるリン脂質
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬においては、活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際に、その反応に必要なリン脂質を存在させる。
【００７３】
このリン脂質は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの、その他の動物由来のもの、植物由来のもの、微生物由来のもの又は人工的に合成したもの等を挙げることができる。
このリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール若しくはジホスファチジルグリセロールなどのグリセロリン脂質や、又はスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質等を挙げることができる。
【００７４】
前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際に存在させるリン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルセリンとホスファチジルコリンとの混合物を用いることが、前記反応の促進の効果が高くなるため好ましい。
ホスファチジルエタノールアミンの組成比が４０％以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が２５％以上であることがより好ましい。
特に、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が５０％以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が３０％以上であることが好ましい。
【００７５】
このリン脂質を用いる際の濃度は、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際には、通常、０．１μＭ〜１００μＭにあることが好ましく、０．５μＭ〜１０μＭにあることが特に好ましい。
そして、本発明の活性測定試薬においては、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際にリン脂質が前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、リン脂質を０．１μＭ〜２００μＭ含有させることが好ましく、０．５μＭ〜２０μＭ含有させることが特に好ましい。
【００７６】
なお、このプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際のリン脂質としては、前記の活性化プロテインＣの更なる活性化時及び活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に用いたリン脂質をそのまま用いることができる。
しかしながら、先に述べたとおり、適したリン脂質の組成がそれぞれの反応により異なるので、各々の反応に適した組成のリン脂質をその反応時に存在させて用いることが好ましい。
なお、このプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際に、先に加えた前記の活性化プロテインＣの更なる活性化及び活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応に適した組成のリン脂質が、このプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に適した組成のリン脂質と共存したとしても、本発明の活性測定方法及び活性測定試薬においては全く支障はない。
【００７７】
９．プロトロンビン
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において用いるプロトロンビンは、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
【００７８】
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において、プロトロンビンは、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒する反応の基質となり、トロンビンになる。
この活性化血液凝固第Ｘ因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は、活性化血液凝固第Ｖ因子の存在により促進される。
【００７９】
よって、先に述べたように、試料中にプロテインＳが含まれていると、活性化プロテインＣが更に活性化され、これにより活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進され、このため活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第Ｖ因子の促進効果が小さくなるので、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は抑制され、生成されるトロンビンの量（濃度）は低減される。
【００８０】
このプロトロンビンを用いる際の濃度は、活性化血液凝固第Ｖ因子と接触させ、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる際には、通常、１ｎＭ〜５０μＭにあることが好ましく、５０ｎＭ〜５μＭにあることがより好ましく、そして１００ｎＭ〜１μＭにあることが特に好ましい。
【００８１】
また、本発明の活性測定試薬においては、前記のトロンビン生成反応時にプロトロンビンが前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、プロトロンビンを、１ｎＭ〜１００μＭ含有させることが好ましく、５０ｎＭ〜１０μＭ含有させることがより好ましく、１００ｎＭ〜２μＭ含有させることが特に好ましい。
【００８２】
１０．トロンビンの基質
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において用いるトロンビンの基質は、トロンビンのプロテアーゼとしての触媒作用を（トロンビンの基質として）受けることにより何らかのシグナルを生じるもの、又はトロンビンによる触媒反応に加え更に他の反応を続けることにより何らかのシグナルが生じるものであれば、特に制限なく用いることができる。
【００８３】
この何らかのシグナルが生じるということであるが、これはトロンビンの触媒作用を受けることにより光学的、電気的、磁気的若しくは他のエネルギー等におけるシグナル（信号）の生成又は変化を検出することができるということを意味する。
【００８４】
例えば、トロンビンの触媒作用を受けることにより、吸光度、透過率若しくは蛍光強度が変化するもの、又は光の吸収曲線が変化するもの等を挙げることができる。
【００８５】
この一例としては、遊離したときに吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線が変化するような化合物を結合したペプチド又はタンパク質であって、トロンビンの触媒作用により前記の化合物が前記のペプチド又はタンパク質より遊離するような物質を挙げることができる。
このような物質においては、トロンビンの触媒作用を受け、前記化合物が遊離することにより、吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線の変化として検出できるので、トロンビンの触媒作用すなわちトロンビンの酵素活性を、生成したシグナル（吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線の変化）の量を測定することにより求めることができる。
【００８６】
このような物質としては、例えば、「Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩」〔テストチーム（登録商標）発色基質Ｓ−２２３８〕（ＣＨＲＯＭＯＧＥＮＩＸ社・第一化学薬品社）、「Ｈ−Ｄ−ヘキサハイドロチロシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二酢酸塩」〔ＳＰＥＣＴＲＯＺＹＭＥ（登録商標）ＴＨ〕（ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ社・コスモバイオ社）、「ベンゾイル−フェニルアラニル−バリニル−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・塩酸塩」〔Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｉ，Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ〕（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社・コスモバイオ社）、「トシル−グリシル−プロリル−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド」〔ＣＨＲＯＭＯＺＹＭＥ ＴＨ〕（ＰＥＮＴＡＰＨＡＲＭ社）、「Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−アルギニル−３−カルボキシ−４−ヒドロキシ−アニリン」（三共社）、「ベンゾイル−フェニルアラニル−バリニル−アルギニル−ＡＭＣ・塩酸塩」〔Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ＩＩＩ，Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ〕（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社・コスモバイオ社）、「ｔ−ブトキシカルボニル−アスパラギル（Ｏ−ベンジル）−プロリル−アルギニル−ＭＣＡ」（ペプチド研究所）、又は「ｔ−ブトキシカルボニル−バリニル−プロリル−アルギニル−ＭＣＡ」（ペプチド研究所）等を挙げることができる。なお、特に「Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩」が好ましい。
【００８７】
前記の活性化血液凝固第Ｖ因子と活性化血液凝固第Ｘ因子とプロトロンビン等とを接触させることと、生成したトロンビンとこのトロンビンの基質とを接触させることは、同時に行ってもよいし、別々の段階として分けて行ってもよい。
【００８８】
なお、いずれにしても、生成したトロンビンにトロンビンの基質を接触させ、少なくとも１分間以上、好ましくは５分間以上、室温又は３７℃等においてインキュベートして、トロンビンの基質からシグナルを生じさせる。
【００８９】
このトロンビンの基質を用いる際の濃度は、このトロンビンの基質がトロンビンの触媒作用を受ける際に、通常、５μＭ〜１００ｍＭにあることが好ましく、５０μＭ〜１０ｍＭにあることが特に好ましい。
そして、本発明の活性測定試薬においては、トロンビンの触媒作用を受ける際にこのトロンビンの基質が前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、このトロンビンの基質を、５μＭ〜２００ｍＭ含有させることが好ましく、５０μＭ〜２０ｍＭ含有させることが特に好ましい。
【００９０】
１１．シグナル量の測定
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬におけるトロンビンの基質は、プロトロンビンより生成したトロンビンの触媒作用を受けることによりシグナルを生じる。
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬においては、このトロンビンの基質より生成したシグナルの量を測定する。
なお、試料中にプロテインＳが含まれている場合、このシグナルの量は、試料中のプロテインＳの活性値に応じて生成が抑制されたシグナルの量である。
【００９１】
この生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）の測定は、そのシグナルに応じて適宜行えばよい。
例えば、シグナルが、吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線の変化である場合には、吸光度、透過率又は蛍光強度を測定する等により行う。
より具体的には、トロンビンの基質が、前記の「Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩」、「Ｈ−Ｄ−ヘキサハイドロチロシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二酢酸塩」、「ベンゾイル−フェニルアラニル−バリニル−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・塩酸塩」、又は「トシル−グリシル−プロリル−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド」等の、ペプチドにｐ−ニトロアニリンを結合させた物質である場合には、トロンビンの触媒作用により遊離したｐ−ニトロアニリンが波長４０５ｎｍ近辺に有する光の吸収を、波長４０５ｎｍ又はその近辺の波長において吸光度を測定することにより行う。
この場合、吸光度の測定は、主波長のみの一波長測定でもよいし、又は主波長と副波長において測定する二波長測定でもよい。
そして、この吸光度の測定は、エンドポイント法でもよいし、又はレート法でもよい。
【００９２】
１２．試料中に含まれていたプロテインＳの活性値
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料中にプロテインＳが含まれていると、活性化プロテインＣが更に活性化されて、活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されて、活性化血液凝固第Ｖ因子の存在量（濃度）は少なくなる。
そうすると、活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第Ｖ因子の促進効果が小さくなるので、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は抑制される。
これにより、トロンビンの生成が低減するので、このトロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応も抑制されて、生成するシグナルの量は抑制される。
すなわち、試料中に含まれるプロテインＳの活性値に応じて、このシグナル生成の抑制度は大きくなる。
従って、本発明の活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料と活性化プロテインＣ等とを接触させ前記の通りの反応を行わせることによって生成したシグナル量を測定して、すなわち生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていたプロテインＳの活性値を得る。
【００９３】
この生成が抑制されたシグナル量を測定した後、試料中に含まれていたプロテインＳの活性値を得ることは、適宜行えばよいが、例えば以下のようにして行うことができる。
【００９４】
プロテインＳの活性値が分かっている試料の少なくとも一つと、プロテインＳの活性値が「ゼロ」であることが分かっている試料（生理食塩水又は純水等）について、前記の通り測定操作を行い、生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）を求める。
そして、この生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）と試料中に含まれるプロテインＳの活性値との関係を、数式又はグラフ等に表して、検量線を作成する。
この検量線は、すなわち、シグナル生成の抑制度と試料中に含まれるプロテインＳの活性値との関係を表したものである。
次に、プロテインＳの活性値が未知の試料について、前記の通り同様に測定操作を行い、生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）を求める。
このシグナル量を前記の検量線に当てはめ、相当するプロテインＳの活性値を求める。
これにより、プロテインＳの活性値が未知の試料における生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）より、その試料のプロテインＳの活性値を得ることができる。
【００９５】
なお、前記の検量線は、シグナル量（生成が抑制されたシグナル量）すなわちシグナル生成の抑制度と、試料中に含まれるプロテインＳの活性値との関係を表したものであるが、この検量線におけるシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）は、測定されたシグナル量そのものでもよいが、そのシグナル量の値を基に算出した数値であってもよい。
【００９６】
つまり、前記の検量線は、測定されたシグナル量の値を基に算出した数値と、試料中に含まれるプロテインＳの活性値との関係を表したものであってもよい。この場合であっても、測定されたシグナル量の値を基に算出した数値は、生成が抑制されたシグナル量に対応したものである。
【００９７】
この測定されたシグナル量の値を基に算出した数値としては、例えば、測定されたシグナル量の単位時間当たりの変化量の数値、又は測定されたシグナル量の値を時間に対して一次微分して算出した数値、若しくは二次微分して算出した数値等を挙げることができる。
【００９８】
例として、測定により得られた吸光度の１分間当たりの変化量、又は測定により得られた吸光度を時間に対して一次微分して得た吸光度変化の速度、若しくは測定により得られた吸光度を時間に対して二次微分して得た吸光度変化の加速度等を挙げることができる。
【００９９】
１３．タンパク質
本発明の活性測定方法及び活性測定方法においては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくは卵白アルブミンなどのアルブミン、カゼイン、又はゼラチン等のタンパク質を前記の活性測定反応時に存在させることが好ましく、又は活性測定試薬に含有させることが好ましい。
【０１００】
このタンパク質を存在させる濃度は、通常、０．１μＭ〜１ｍＭにあることが好ましい。
そして、本発明の活性測定試薬においては、このタンパク質が前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、このタンパク質を、０．１μＭ〜２ｍＭ含有させることが好ましい。
【０１０１】
１３．塩
本発明の活性測定方法及び活性測定方法においては、ハロゲン元素とアルカリ金属の塩又はハロゲン元素とアルカリ土類金属の塩等の塩を前記の活性測定反応時に存在させることが好ましく、又は活性測定試薬に含有させることが好ましい。
【０１０２】
ハロゲン元素とアルカリ金属の塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、臭化ナトリウム又は臭化カリウム等を挙げることができる。
また、ハロゲン元素とアルカリ土類金属の塩としては、例えば、塩化マグネシウム、フッ化マグネシウム又は臭化マグネシウム等を挙げることができる。
【０１０３】
この塩を存在させる濃度は、通常、５ｍＭ〜１Ｍにあることが好ましく、５０ｍＭ〜２５０ｍＭにあることが特に好ましい。
そして、本発明の活性測定試薬においては、この塩が前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、この塩を、５ｍＭ〜２Ｍ含有させることが好ましく、５０ｍＭ〜５００ｍＭ含有させることが特に好ましい。
【０１０４】
１４．ｐＨ
本発明の活性測定方法においては、この活性測定反応を、ｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０（２０℃）の範囲で行うことが好ましく、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５（２０℃）の範囲で行うことが特に好ましい。
また、本発明の活性測定試薬は、活性測定反応が前記のｐＨ範囲で行われるようなｐＨであることが好ましい。
例えば、本発明の活性測定試薬のｐＨが、ｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０（２０℃）の範囲にあることが好ましく、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５（２０℃）の範囲にあることが特に好ましい。
【０１０５】
なお、本発明の活性測定方法及び活性測定試薬においては、活性測定反応におけるｐＨ又は活性測定試薬のｐＨを前記のｐＨ範囲に保つため、前記のｐＨ範囲に緩衝能を有する緩衝剤を適宜存在させ又は含有させることが好ましい。
【０１０６】
１５．他の成分
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬においては、必要に応じて適宜、防腐剤、安定化剤、活性化剤、糖類又は界面活性剤等の前記記載した成分以外の成分を前記の活性測定反応時に存在させ、又は活性測定試薬に含有させることができる。
【０１０７】
１６．測定手法
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬における、試料中のプロテインＳの活性の測定は、用手法により行ってもよく、又は自動分析装置等の装置を使用して行ってもよい。
【０１０８】
１７．測定段階
本発明の活性測定方法おいて、前記詳述した活性測定反応は、１回に全ての成分と試料との接触を行わせて、全ての反応を１段階に行ってもよく（１ステップ法）、また、成分を分け、接触を複数段階に分けて行うことにより活性測定反応を複数段階に分けて行ってもよい（多ステップ法）。
複数段階に分ける場合、特に制限はないが、例えば次のように行うことができる。
【０１０９】
・ ２ステップ法−１
▲１▼ 試料、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン及び活性化血液凝固第Ｖ因子を接触させる。
▲２▼ 次に、前記▲１▼のものに、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質を接触させる。
【０１１０】
・ ２ステップ法−２
▲１▼ 試料、活性化プロテインＣ及びリン脂質を接触させる。
▲２▼ 次に、前記▲１▼のものに、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質を接触させる。
【０１１１】
・ ３ステップ法
▲１▼ 試料、活性化プロテインＣ及びリン脂質を接触させる。
▲２▼ 次に、前記▲１▼のものに、カルシウムイオン及び活性化血液凝固第Ｖ因子を接触させる。
▲３▼ 更に、前記▲２▼のものに、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質を接触させる。
【０１１２】
１８．活性測定試薬の構成
本発明の活性測定試薬おいて、前記詳述した活性測定反応の各成分は、全て一つの試薬中に含有させてもよく（１試薬系）、また、各成分を複数の試薬に分けて含有させてもよい（複数試薬系）。
各成分を複数の試薬に分けて含有させる場合、特に制限はないが、例えば次のように含有させることができる。
【０１１３】
・ ２試薬系−１
▲１▼ 活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン及び活性化血液凝固第Ｖ因子。
▲２▼ 活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質。
【０１１４】
・ ２試薬系−２
▲１▼ 活性化プロテインＣ及びリン脂質。
▲２▼ カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質。
【０１１５】
・ ３試薬系
▲１▼ 活性化プロテインＣ及びリン脂質。
▲２▼ カルシウムイオン及び活性化血液凝固第Ｖ因子。
▲３▼ 活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質。
【０１１６】
・ ４試薬系
▲１▼ 活性化プロテインＣ及びリン脂質。
▲２▼ カルシウムイオン及び活性化血液凝固第Ｖ因子。
▲３▼ 活性化血液凝固第Ｘ因子及びリン脂質。
▲４▼ プロトロンビン及びトロンビンの基質。
【０１１７】
ＩＩ．試料中のプロテインＣの活性測定方法及び活性測定試薬
１．総論
本発明の試料中のプロテインＣの活性測定方法は、試料に由来しない、プロテインＣ活性化物質、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子（Ｖａ）、活性化血液凝固第Ｘ因子（Ｘａ）、プロトロンビン及びトロンビンの基質より構成される下記の反応系を用いて試料中のプロテインＣの活性値を測定する方法である。
【０１１８】
【化９】
この「試料に由来しない」については、先の「Ｉ．試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬」の項において述べた通りである。
【０１２０】
本発明の試料中のプロテインＣの活性測定方法について、以下、より具体的に説明を行う。
（ａ） 前述の通りの試料に由来しない、プロテインＣ活性化物質、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子（Ｖａ）、活性化血液凝固第Ｘ因子（Ｘａ）、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
なお、これらの成分と試料との接触は、１回に全ての成分との接触を行わせて、下記の反応系の全ての反応を１段階に行ってもよく（１ステップ法）、また、前記成分を分け、接触を複数段階に分けて行うことにより下記の反応系の反応を複数段階に分けて行ってもよい（多ステップ法）。
【０１２１】
（ｂ） 前記（ａ）における接触により、前記の各成分による下記の反応が進行する。
そして、この一連の反応によりトロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
即ち、前記の一連の反応により、トロンビンの基質がトロンビンにより分解等の作用を受け、この結果生じるシグナルの量（例えば、吸光度等）を測定する。
【０１２２】
（ｃ） 試料にプロテインＣが含まれている場合には、前記の反応におけるプロテインＣがプロテインＣ活性化物質により活性化されて活性化プロテインＣとなり、これにより活性化血液凝固第Ｖ因子の分解が促進されるので、その結果トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制されて、シグナルの生成が抑制される。
このシグナル生成の抑制度は、試料に含まれていたプロテインＣの活性値に応じて大きくなる。
【０１２３】
従って、前記（ｂ）においてシグナル量を測定することにより、生成が抑制されたシグナル量を測定することになり、これにより試料中に含まれていたプロテインＣの活性値を得ることができる。
【０１２４】
【化１０】
また、本発明の試料中のプロテインＣの活性測定方法は、以下のものでもある。
試料に由来しない、プロテインＣ活性化物質、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子（Ｖａ）、活性化血液凝固第Ｘ因子（Ｘａ）、プロトロンビン及びトロンビンの基質より構成される下記の反応系を用いて試料中のプロテインＣの活性値を測定する方法であって、
【０１２６】
（１） 試料と少なくともプロテインＣ活性化物質を接触させる。これにより、試料にプロテインＣが含まれる場合には、プロテインＣが活性化されて活性化プロテインＣが生成する。
【０１２７】
（２） 前記（１）において生成した活性化プロテインＣがリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が進行する。
【０１２８】
（３） 活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（２）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が進行することにより抑制されて、トロンビンの生成が低減する。
【０１２９】
（４） 前記（３）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
なお、このシグナル生成の抑制度は、試料に含まれていたプロテインＣの活性に応じて大きくなる。
【０１３０】
（５） 前記（４）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定する。
以上の通り前記の反応により生成したシグナル量を測定し、すなわち生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていたプロテインＣの活性値を得る。
【０１３１】
【化１１】
本発明の試料中のプロテインＣの活性測定試薬は、プロテインＣ活性化物質、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有するものである。
必要に応じて前記成分以外の成分を含んでいても構わない。
なお、本発明の活性測定試薬は、含有させる前記成分を分け、複数の測定試薬より構成されるようにしてもよい。
【０１３３】
２．プロテインＣ活性化物質
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において用いるプロテインＣ活性化物質は、プロテインＣより活性化プロテインＣを生成させることができるものであれば、特に制限なく用いることができる。
このプロテインＣ活性化物質としては、例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｃｏｐｐｅｒｈｅａｄ ｓｎａｋｅ、Ｍｏｃｃａｓｉｎ ｓｎａｋｅ等由来の蛇毒酵素等を挙げることができる。また、遺伝子工学操作、細胞工学操作又は細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
【０１３４】
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において、プロテインＣ活性化物質は、試料と接触することにより、試料中にプロテインＣが含まれている場合には、プロテインＣを活性化し活性化プロテインＣを生成させる。
そして、活性化プロテインＣは、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、活性化血液凝固第Ｖ因子を分解する反応の触媒となる。
よって、試料中にプロテインＣが存在することにより、活性化プロテインＣが活性化血液凝固第Ｖ因子を分解する反応が起こり進行する。
【０１３５】
前記のプロテインＣ活性化物質と試料とを接触させることと、これに活性化血液凝固第Ｖ因子等とを接触させることは、同時に行ってもよい。
しかしながら、プロテインＣ活性化物質を試料と接触させ、少なくとも１分間以上、好ましくは５分間以上、室温又は３７℃等においてインキュベートした後に、活性化血液凝固第Ｖ因子、リン脂質及びカルシウムイオンと接触させ、インキュベートして、活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応を行わせることが好ましい。
【０１３６】
３．プロテインＳ
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬においては、生成した活性化プロテインＣにプロテインＳをリン脂質の存在下に接触させること、又は活性測定試薬にプロテインＳを含有させてもよい。
【０１３７】
ここで用いるプロテインＳは、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
【０１３８】
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において、プロテインＳは、生成した活性化プロテインＣとリン脂質の存在下に接触させることにより、活性化プロテインＣを更に活性化する。
よって、生成した活性化プロテインＣとプロテインＳとをリン脂質の存在下に接触させることにより、活性化プロテインＣがリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｖ因子を分解する反応は更に促進される。
【０１３９】
なお、活性化プロテインＣとプロテインＳとをリン脂質の存在下に接触させることと、活性化プロテインＣを活性化血液凝固第Ｖ因子等と接触させることは、同時に行ってもよい。
しかしながら、活性化プロテインＣをリン脂質とともにプロテインＳと接触させ、少なくとも１分間以上、好ましくは５分間以上、室温又は３７℃等においてインキュベートした後に、活性化血液凝固第Ｖ因子及びカルシウムイオンと接触させ、インキュベートして、活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応を行わせることが好ましい。
【０１４０】
４．試料
本発明の試料中のプロテインＣの活性測定方法及び活性測定試薬において、試料とは、プロテインＣを含有する可能性がある物質である。
【０１４１】
この試料として、例えば、生体試料（ヒト又は動物などに由来する試料）を挙げることができる。
【０１４２】
生体試料としては、例えば、血液、血漿、唾液、汗、尿、涙、髄液、腹水、羊水などの生体の液体；肝臓、心臓、脳、骨、毛髪、皮膚、爪、筋肉、神経組織などの臓器、組織、細胞などの抽出液等を挙げることができる。
【０１４３】
５．他の事項
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬における他の事項は、先の「Ｉ．試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬」の項に記載した事項の通りである。
【０１４４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に説明する。なお、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【０１４５】
〔実施例１〕（試料中のプロテインＳ活性測定の検量線の作成）
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬により試料中のプロテインＳ活性値を測定する際の検量線を作成した。
【０１４６】
（１）プロテインＳ活性測定試薬
▲１▼第１試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ７．５（２０℃）の試薬を調製した。
【０１４７】
活性化プロテインＣ ３４４ｐＭ
リン脂質（ホスファチジルコリン８０％，ホスファチジルセリン２０％）
１０μＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） １５μＭ
塩化ナトリウム １５０ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
【０１４８】
▲２▼第２試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ７．５（２０℃）の試薬を調製した。
【０１４９】
活性化血液凝固第Ｖ因子 ３３１ｐＭ
リン脂質（ホスファチジルコリン８０％，ホスファチジルセリン２０％）
１０μＭ
塩化カルシウム ５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） １５μＭ
塩化ナトリウム １５０ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
【０１５０】
▲３▼第３試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ７．５（２０℃）の試薬を調製した。
【０１５１】
活性化血液凝固第Ｘ因子 ４４ｐＭ
リン脂質（ホスファチジルエタノールアミン５０％，ホスファチジルセリン３０％，ホスファチジルコリン２０％） ７．５μＭ
Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩（トロンビンの基質） ７５０μＭ
プロトロンビン ６９５ｎＭ
塩化カルシウム ５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） １５μＭ
塩化ナトリウム １５０ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
【０１５２】
（２）試料
精製したプロテインＳ（純度９９％以上）を、各々下記の活性値となるようにプロテインＳを含まないヒト血漿に添加し、プロテインＳの活性値が分かっている下記の３種類の試料を調製した。
なお、プロテインＳを含まないヒト血漿は、抗プロテインＳ抗体を固定化したカラムにヒト血漿を通し、このカラムを素通りしたものを分取することにより得た。
【０１５３】
▲１▼ １５μｇ／ｍＬ相当
▲２▼ １０μｇ／ｍＬ相当
▲３▼ ５μｇ／ｍＬ相当
【０１５４】
また、このプロテインＳを含まないヒト血漿を、プロテインＳ活性値が「ゼロ」の試料とした。
▲４▼ ０μｇ／ｍＬ相当
【０１５５】
なお、本明細書及び図面においては、ヒト血漿より精製して得たプロテインＳ精製品（純度９９％以上）１μｇ／ｍＬが有するプロテインＳ活性値を、プロテインＳ活性値１μｇ／ｍＬ相当と定義した。
よって、本明細書及び図面においては、プロテインＳの活性値は、プロテインＳ濃度（μｇ／ｍＬ）相当の値で表している。
【０１５６】
（３）試料中のプロテインＳの活性値の測定
▲１▼ 前記（２）の４種類の試料の各々について、その４μＬと前記の第１試薬の９６μＬを混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。
▲２▼ その後、これに前記の第２試薬の１００μＬを添加混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。
▲３▼ 次に、前記▲２▼の混合液の１８０μＬを分取し、これに３７℃で５分間インキュベートしておいた前記の第３試薬の３６０μＬを添加混合して、３７℃でインキュベートした。
【０１５７】
▲４▼ 前記▲３▼における添加混合の後、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
この吸光度の変化を表したグラフを図１に示した。
この図において、横軸は前記▲３▼における添加混合の後の時間（分）を表し、縦軸は波長４０５ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓ．）を表す。
また、この図において、「●」はプロテインＳ活性が０μｇ／ｍＬ相当の試料の吸光度を示し、「▲」はプロテインＳ活性が５μｇ／ｍＬ相当の試料の吸光度を示し、「▲黒四角▼」はプロテインＳ活性が１０μｇ／ｍＬ相当の試料の吸光度を示し、そして「◆」はプロテインＳ活性が１５μｇ／ｍＬ相当の試料の吸光度を示す。
【０１５８】
▲５▼ 前記▲３▼における添加混合後１７分目から２３分目迄の、前記図１のグラフにおける１分間当たりの吸光度変化量すなわち吸光度変化の傾きの値を縦軸に取り、前記の添加混合後の時間を横軸にとってグラフを作成した。この縦軸の吸光度変化の傾きの値は、すなわち吸光度の一次微分値であり、吸光度変化の速度を表している。
このグラフを図２に示した。
この図において、「●」はプロテインＳ活性が０μｇ／ｍＬ相当の試料における値を示し、「▲」はプロテインＳ活性が５μｇ／ｍＬ相当の試料における値を示し、「▲黒四角▼」はプロテインＳ活性が１０μｇ／ｍＬ相当の試料における値を示し、そして「◆」はプロテインＳ活性が１５μｇ／ｍＬ相当の試料における値を示す。
なお、例えば、横軸の１８分の目盛りにおける値は、前記▲３▼における添加混合の後の１８分目から１９分目までの１分間当たりの吸光度変化量すなわち吸光度変化の傾きの値（吸光度の一次微分値）を表している。
【０１５９】
▲６▼ 次に、前記▲５▼におけるグラフ（図２）の各ラインの傾きの値を縦軸に取り、前記の各試料のプロテインＳ活性値（μｇ／ｍＬ相当）を横軸にとってグラフを作成した。この縦軸の値は、すなわち吸光度の二次微分値であり、吸光度変化の加速度を表している。
このグラフを図３に示した。
この図３のグラフが、試料中のプロテインＳ活性値の測定における検量線を示したグラフである。
【０１６０】
プロテインＳ活性値が分からない試料については、前記の通りの活性測定操作を行い、測定により得られた吸光度（生成が抑制されたシグナル量）より吸光度変化の加速度（吸光度の二次微分値）を求め、この値を前記の図３のグラフに当てはめることにより、試料中に含まれていたプロテインＳの活性値を得ることができる。
【０１６１】
〔実施例２〕（試料中のプロテインＳ活性値の測定）
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬によりヒト血漿試料中のプロテインＳの活性値を測定した。
【０１６２】
（１）本発明のプロテインＳ活性測定試薬
前記実施例１において調製した、第１試薬、第２試薬及び第３試薬をそれぞれ用いた。
【０１６３】
（２）凝固時間法によるプロテインＳ活性測定試薬
従来の試料中のプロテインＳの活性測定試薬として、市販の凝固時間法による血漿中プロテインＳ活性測定試薬「スタクロット プロテインＳ」（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いた。
【０１６４】
（３）試料
下記の６種類のヒト血漿を試料とした。
▲１▼ 試料−１（健常者の血漿）
▲２▼ 試料−２（周産期の女性の血漿）
▲３▼ 試料−３（周産期の女性の血漿）
▲４▼ 試料−４（周産期の女性の血漿）
▲５▼ 試料−５（周産期の女性の血漿）
▲６▼ 試料−６（周産期の女性の血漿）
【０１６５】
（４）試料中のプロテインＳの活性値の測定
▲１▼本発明のプロテインＳ活性測定試薬による測定
前記（３）の６種類の試料の各々について、前記実施例１の（３）の▲１▼〜▲６▼の記載の通りに測定操作を行い、吸光度変化の加速度の値（吸光度の二次微分値）を求めた。
この吸光度変化の加速度の値（吸光度の二次微分値）を、前記実施例１で作成した検量線のグラフ（図３）に当てはめて、試料中に含まれていたプロテインＳの活性値を各々得た。
この測定により得たプロテインＳ活性値を表１に示した。
【０１６６】
▲２▼凝固時間法によるプロテインＳ活性測定試薬
前記（３）の６種類の試料の各々について、前記の「スタクロット プロテインＳ」（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用い、この添付文書の操作法の記載の通りに測定を行い、凝固時間法によるプロテインＳの活性値を各々得た。
なお、前記実施例１の（２）において用いた、精製したプロテインＳ（純度９９％以上）を試料として作成した検量線により、プロテインＳ活性値を得た。
そして、凝固時間の測定は、血液凝固測定装置「ベーリング フィブリンタイマ ＩＩ」（ヘキストジャパン社）を用いて行った。
この測定により得たプロテインＳ活性値も表１に示した。
【０１６７】
【表１】
（５）まとめ
表１より分かるように、本発明のプロテインＳ活性測定試薬により測定した血漿試料のプロテインＳ活性値と、凝固時間法によるプロテインＳ活性測定試薬により測定した血漿試料のプロテインＳ活性値とは、いずれの試料においても一致した。
このことより、本発明の活性測定方法及び活性測定試薬により求めた試料中に含まれるプロテインＳの活性値は、正確なものであることが確かめられた。
【０１６９】
〔実施例３〕（活性化プロテインＣによる触媒反応に用いるリン脂質の検討）
本発明の活性測定方法及び活性測定試薬において、活性化プロテインＣによる触媒反応に用いるリン脂質の組成について検討を行った。
【０１７０】
（１）プロテインＳ活性測定試薬
▲１▼第１試薬
リン脂質の組成が異なる６種類の第１試薬を以下のようにして調製した。
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ７．５（２０℃）に調整した。
【０１７１】
活性化プロテインＣ ３４４ｐＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） １５μＭ
塩化ナトリウム １５０ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
リン脂質 １０μＭ
（ａ）ホスファチジルコリン１００％，ホスファチジルセリン０％
（ｂ）ホスファチジルコリン９５％，ホスファチジルセリン５％
（ｃ）ホスファチジルコリン９０％，ホスファチジルセリン１０％
（ｄ）ホスファチジルコリン８５％，ホスファチジルセリン１５％
（ｅ）ホスファチジルコリン８０％，ホスファチジルセリン２０％ 又は、
（ｄ）ホスファチジルコリン７５％，ホスファチジルセリン２５％
【０１７２】
▲２▼第２試薬
リン脂質の組成が異なる６種類の第２試薬を以下のようにして調製した。
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ７．５（２０℃）に調整した。
【０１７３】
活性化血液凝固第Ｖ因子 ３３１ｐＭ
塩化カルシウム ５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） １５μＭ
塩化ナトリウム １５０ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
リン脂質 １０μＭ
（ａ）ホスファチジルコリン１００％，ホスファチジルセリン０％
（ｂ）ホスファチジルコリン９５％，ホスファチジルセリン５％
（ｃ）ホスファチジルコリン９０％，ホスファチジルセリン１０％
（ｄ）ホスファチジルコリン８５％，ホスファチジルセリン１５％
（ｅ）ホスファチジルコリン８０％，ホスファチジルセリン２０％ 又は、
（ｆ）ホスファチジルコリン７５％，ホスファチジルセリン２５％
【０１７４】
▲３▼第３試薬
前記実施例１の（１）の▲３▼において調製した第３試薬を用いた。
【０１７５】
（２）試料
▲１▼ プロテインＳの活性値が０．２μｇ／ｍＬ相当となるように、プロテインＳを、前記実施例１の（２）で調製したプロテインＳを含まないヒト血漿に添加し、プロテインＳ活性値が０．２μｇ／ｍＬ相当の試料を調製した。
【０１７６】
▲２▼ 前記のプロテインＳを含まないヒト血漿を、プロテインＳ活性値が０μｇ／ｍＬ相当の試料とした。
【０１７７】
（３）試料中のプロテインＳの活性値の測定
前記（２）の２種類の試料の各々について、前記（１）の▲１▼で調製した６種類の第１試薬のそれぞれ、及び前記（１）の▲２▼で調製した６種類の第２試薬のそれぞれ、並びに前記（１）の▲３▼で調製した第３試薬を用いて、前記実施例１の（３）の▲１▼〜▲６▼の記載の通りに測定操作を行い、吸光度変化の加速度の値（吸光度の二次微分値）を求めた。
なお、この測定において、第１試薬と第２試薬は、各々リン脂質の組成が同一なもの同士を組み合わせて用いた。
【０１７８】
（４）リン脂質の組成による効果の検討
プロテインＳ活性値が０．２μｇ／ｍＬ相当であるヒト血漿試料の吸光度変化の加速度の値（吸光度の二次微分値）を、プロテインＳ活性値が０μｇ／ｍＬ相当であるヒト血漿試料の吸光度変化の加速度の値（吸光度の二次微分値）で除して比（α０．２／α０）を求めた。
これを表２に示した。
この比の値が低い程、プロテインＳ活性値が０．２μｇ／ｍＬ相当であるヒト血漿試料とプロテインＳ活性値が０μｇ／ｍＬ相当であるヒト血漿試料とで、得られたシグナル量に差が生じていることになり、測定の感度がより高いことになるので、プロテインＳ活性値の測定においては好ましい。
【０１７９】
【表２】
この表より、活性化プロテインＣによる触媒反応時に存在させるリン脂質の組成が、「ホスファチジルコリン８５％，ホスファチジルセリン１５％」、「ホスファチジルコリン８０％，ホスファチジルセリン２０％」、及び「ホスファチジルコリン７５％，ホスファチジルセリン２５％」のときが、他の組成の時よりも前記の比の値が低く、すなわち測定反応が促進されて、測定の感度がより高くなっていることが分かる。
【０１８１】
このことより、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの更なる活性化時、及びこの活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に存在させるリン脂質の組成としては、ホスファチジルコリンの組成比を８５％〜７５％として、かつホスファチジルセリンの組成比を１５％〜２５％とすることにより、前記反応が促進されて、測定の感度がより高くなることが確かめられた。
【０１８２】
〔実施例４〕（活性化血液凝固第Ｘ因子による触媒反応に用いるリン脂質の検討）
活性化血液凝固第Ｘ因子によるトロンビンを生成させる触媒反応に用いるリン脂質の組成について検討を行った。
なお、本検討においては、活性化血液凝固第Ｘ因子の触媒反応におけるリン脂質の組成の効果を見るのが目的であるので、活性化血液凝固第Ｘ因子より始まる反応系において検討を行った。
【０１８３】
（１）リン脂質組成検討試薬
▲１▼第１試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ７．５（２０℃）の試薬を調製した。
【０１８４】
活性化血液凝固第Ｖ因子 ３３１ｐＭ
リン脂質（ホスファチジルコリン８０％，ホスファチジルセリン２０％）
１０μＭ
塩化カルシウム ５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） １５μＭ
塩化ナトリウム １５０ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
【０１８５】
▲２▼第２試薬
リン脂質の組成が異なる４種類の第２試薬を以下のようにして調製した。
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．５（２０℃）に調整した。
【０１８６】
活性化血液凝固第Ｘ因子 ４４ｐＭ
Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩（トロンビンの基質） ７５０μＭ
プロトロンビン ６９５ｎＭ
塩化カルシウム ５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） １５μＭ
塩化ナトリウム １５０ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
リン脂質 ７．５μＭ
（ａ）ホスファチジルエタノールアミン５０％，ホスファチジルセリン４０％，ホスファチジルコリン１０％
（ｂ）ホスファチジルエタノールアミン５０％，ホスファチジルセリン３０％，ホスファチジルコリン２０％
（ｃ）ホスファチジルエタノールアミン５０％，ホスファチジルセリン２０％，ホスファチジルコリン３０％ 又は、
（ｄ）ホスファチジルエタノールアミン５０％，ホスファチジルセリン１０％，ホスファチジルコリン４０％
【０１８７】
（２）リン脂質の組成による効果の測定
▲１▼ ３７℃で５分間インキュベートしておいた前記（１）の第１試薬の１８０μＬと、３７℃で５分間インキュベートしておいた前記（１）の第２試薬の３６０μＬとを混合して、３７℃でインキュベートした。
【０１８８】
▲２▼ 前記▲１▼における添加混合の後、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
この吸光度の変化を表したグラフを図４に示した。
この図において、横軸は前記▲１▼における添加混合の後の時間（分）を表し、縦軸は波長４０５ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓ．）を表す。
【０１８９】
また、この図において、「●」は第２試薬におけるリン脂質の組成が「ホスファチジルエタノールアミン５０％，ホスファチジルセリン４０％，ホスファチジルコリン１０％」のときの吸光度を示し、「◆」は第２試薬におけるリン脂質の組成が「ホスファチジルエタノールアミン５０％，ホスファチジルセリン３０％，ホスファチジルコリン２０％」のときの吸光度を示し、「▲」は第２試薬におけるリン脂質の組成が「ホスファチジルエタノールアミン５０％，ホスファチジルセリン２０％，ホスファチジルコリン３０％」のときの吸光度を示し、そして、「▲黒四角▼」は第２試薬におけるリン脂質の組成が「ホスファチジルエタノールアミン５０％，ホスファチジルセリン１０％，ホスファチジルコリン４０％」のときの吸光度を示す。
【０１９０】
（３）リン脂質の組成による効果の検討
この図４においては、吸光度増加の立ち上がりが早く、より短時間の内に吸光度がプラトーに達するものほど、活性化血液凝固第Ｘ因子の触媒作用によるトロンビンの生成反応が促進されて、測定の感度がより高くなるものである。
【０１９１】
この図より、活性化血液凝固第Ｘ因子による触媒反応時に存在させるリン脂質の組成が、「ホスファチジルエタノールアミン５０％，ホスファチジルセリン４０％，ホスファチジルコリン１０％」、及び「ホスファチジルエタノールアミン５０％，ホスファチジルセリン３０％，ホスファチジルコリン２０％」のときが、他の組成の時よりも吸光度増加の立ち上がりが早く、より短時間の内に吸光度がプラトーに達している。すなわち、活性化血液凝固第Ｘ因子によるトロンビンの生成反応が促進されて、測定の感度がより高くなっていることが分かる。
【０１９２】
このことより、活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時に存在させるリン脂質の組成としては、ホスファチジルエタノールアミンの組成比を５０％以上として、かつホスファチジルセリンの組成比を３０％以上とすることにより、前記反応が促進されて、測定の感度がより高くなることが確かめられた。
【０１９３】
【発明の効果】
本発明の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬、並びに本発明の試料中のプロテインＣの活性測定方法及び活性測定試薬は、血液凝固反応に係わる成分（因子）の試料中の存在量（濃度）により又はその変異によって、測定により得られるプロテインＳ活性値又はプロテインＣ活性値が影響を受けてしまうことがないものである。そして、測定反応に用いる反応の数及び測定に必要な成分の数が多くなく、よりシンプルなものであって、様々な因子や種々の条件による影響を受け難いものである。また、試料中のプロテインＳ活性値及びプロテインＣ活性値の測定反応の至適条件を見出したことにより、前記測定反応を促進することができ、高い測定感度が得られるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】プロテインＳ活性値が分かっている３種類の試料を測定したときの波長４０５ｎｍにおける吸光度の時間による変化を示した図である。
【図２】プロテインＳ活性値が分かっている３種類の試料の吸光度変化の傾きと時間との関係を示した図である。
【図３】試料中のプロテインＳ活性の測定における検量線を示した図である。
【図４】活性化血液凝固第Ｘ因子の触媒反応におけるリン脂質の組成の効果を示した図である。
Claims (5)
- 試料に由来しない、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質より構成される反応系であって、活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子により促進される活性化血液凝固第ＩＸ因子による血液凝固第Ｘ因子の活性化反応を含まない下記の反応系を用いて、試料に含まれるプロテインＳにより促進される活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応に基づいて、試料中のプロテインＳの活性値を測定する方法であって、
（２） 活性化プロテインＣの前記（１）における更なる活性化により、活性化プロテインＣがリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進され、
（３） 活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（２）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減し、
（４） 前記（３）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制され、
（５） 前記（４）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を試料に含まれていたプロテインＳの活性値に応じたものとして測定する、
ことにより、試料中に含まれていたプロテインＳの活性値を得るものであって、プロテインＳ−欠乏血漿を測定に使用しない、試料中のプロテインＳの活性測定方法。 - シグナル量の測定が、吸光度、透過率又は蛍光強度を測定することにより行うものである、請求項１記載の試料中のプロテインＳの活性測定方法。
- 測定されたシグナル量の単位時間当たりの変化量の数値、又は測定されたシグナル量の値を時間に対して一次微分して算出した数値、若しくは二次微分して算出した数値と、試料中のプロテインＳの活性値との関係を表した検量線を用いて、試料中に含まれるプロテインＳの活性値を得る、請求項１又は請求項２記載の試料中のプロテインＳの活性測定方法。
- 測定により得られた吸光度の１分間当たりの変化量、又は測定により得られた吸光度を時間に対して一次微分して得た吸光度変化の速度、若しくは測定により得られた吸光度を時間に対して二次微分して得た吸光度変化の加速度と、試料中のプロテインＳの活性値との関係を表した検量線を用いて、試料中に含まれるプロテインＳの活性値を得る、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の試料中のプロテインＳの活性測定方法。
- 活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有し、プロテインＳ−欠乏血漿を含有しないものである、請求項１記載の試料中のプロテインＳの活性測定方法に使用する試料中のプロテインＳの活性測定試薬。
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