JP2010539232A

JP2010539232A - 酸化還元反応によりモノクローナル抗体の結合特異性を改変させる方法

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Publication number: JP2010539232A
Application number: JP2010525802A
Authority: JP
Inventors: エーマッキンタイア、ジョン
Original assignee: レドックス−リアクティブリエイジェンツリミテッドライアビリティーカンパニー
Priority date: 2007-09-19
Filing date: 2008-08-26
Publication date: 2010-12-16
Also published as: US20090071842A1; WO2009038630A1; EP2190479A4; AU2008301948A1; EP2190479A1; CA2700128A1; US7989596B2

Abstract

モノクローナル抗体の結合特異性は、モノクローナル抗体を酸化剤または電位にさらすことによって改変される。

Description

本発明はモノクローナル抗体の結合特異性を可逆的に改変させる方法に関する。

本発明者は、正常な個体由来の血液や他の体液には相当数の自己抗体が含まれており、該自己抗体は酸化剤で処理すると自らの抗原を結合できるようになる、という発見を以前に報告している。例として、以下の文献を見られたい。

米国特許出願公開第２００５／０２６０６８１号明細書米国特許出願公開第２００５／０１０１０１６号明細書

Mclntyre, JA."The appearance and disappearance of antiphospholipid antibodies subsequent to oxidation-reduction reactions."Thromb. Res. 2004; 114:579-87. Mclntyre, JA, Wagenknecht, DR, & Faulk, WP."Autoantibodies unmasked by redox reactions."J. Autoimmun 2005; 24:311-17. Mclntyre, JA, Wagenknecht, DR, & Faulk, WP."Redox-reactive autoantibodies: Detection and physiological relevance."Autoimm. Rev. 2006; 5:76-83. Mclntyre, JA, Chapman, J, Shavit, E, Hamilton, RL, DeKosky, ST."Redox-reactive autoantibodies in Alzheimer's patients' cerebrospinal fluids: Preliminary studies."Autommunity, 2007; 40:390-6. Mclntyre, JA, Hamilton, RL, DeKosky, ST."Redox-reactive autoantibodies in cererebrospinal fluids."Ann. N.Y. Acad. Sci. 2007; 1109:296-302.

これらの文献では、正常な個体由来の血液は、多種多様なアイソタイプおよび特異性を有する相当数の自己抗体を含有しているが、これらの自己抗体は該文献中に記載された方法に従って、ある体液または血液が、例えば酸化剤や電流で酸化にさらされる場合にのみ検出できるということが報告されている。血液、血漿、血清、母乳、髄液および精製免疫グロブリン画分などの試料は酸化処理され、その後多様な種類の自己抗原および他の種類の抗原でアッセイされ、酸化により非マスク化されることができるマスク化自己抗体を同定できるということが報告されている。酸化により非マスク化された自己抗体には表２記載の以下のものを含む。

モノクローナル抗体の結合特異性は、酸化剤または直流を使用した、同様な処理によって改変できるということが現在発見されつつある。モノクローナル抗体は一般的に特異抗原のみを結合することを目的とするため、この発見は重要なものである。しかしながら、本明細書中に記載されている方法によれば、モノクローナル抗体の活性のスペクトルは、モノクローナル抗体が結合することを意図された特異抗原以外の抗原も含むように広げることができる。

本発明の一側面によれば、特異抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体を含む組成物を提供すること、およびモノクローナル抗体の結合特異性改変に影響を与えるのに充分な酸化剤または電位に該組成物をさらすことを含む方法が提供される。

本発明の別の側面によれば、モノクローナル抗体を酸化剤または電位にさらすことで改変された結合特異性を有するモノクローナル抗体を含む組成物が提供される。

「対照」と指定された成体ウシ血漿（ＡＢＰ）含有希釈緩衝液中、および本発明の実施形態により「酸化還元」と指定されたモノクローナル抗体が電位にさらされた後の同一希釈緩衝液中における、抗グリコホリンＡモノクローナル抗体の、ａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣ結合プロファイル（光学濃度（ＯＤ）により測定）を示すグラフである。同じＥＬＩＳＡ試験パラメーターが、「対照」と指定されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有希釈緩衝液、および本発明の実施態様により「酸化還元」と指定されたモノクローナル抗体が電位にさらされた後の同一希釈緩衝液を用いても行われた。ＡＢＰ含有緩衝液（対照）中、および本発明の実施態様によりモノクローナル抗体が電位にさらされた後の同一希釈緩衝液（酸化還元）中に希釈されたモノクローナル抗ＣＸＣＲ４抗体のａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣ結合プロファイル（ＯＤにより測定）を示すグラフである。同様にモノクローナルはＢＳＡ含有緩衝液（対照）中、また本発明の実施態様によりモノクローナル抗体が電位にさらされた後の同一緩衝液（酸化還元）中に希釈された。ＡＢＰ含有希釈緩衝液（対照）中、および本発明の実施態様によりモノクローナル抗体が電位により処理された後の同一緩衝液（酸化還元）中における、ＣＤ６３モノクローナル抗体のａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣ結合プロファイル（ＯＤにより測定）を示すグラフである。同様にモノクローナルは、ＢＳＡ含有緩衝液（対照）中、および本発明の実施態様によりモノクローナル抗体が電位にさらされた後の同一緩衝液（酸化還元）中に希釈された。ＡＢＰ含有希釈緩衝液（対照）中、および本発明の実施態様によりモノクローナル抗体が電位にさらされた後のＡＢＰ希釈緩衝液中における、ベータ₂糖タンパク質−Ｉ（β₂ＧＰ-Ｉ）のａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣ結合量（ＯＤにより測定）を示すグラフである。同様にモノクローナルは、ＢＳＡ含有緩衝液（対照）中、および本発明の実施態様によりモノクローナル抗体が電位にさらされた後の同一緩衝液（酸化還元）中に希釈された。凝固因子VIIに対するモノクローナル抗体のａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣ結合プロファイル（ＯＤにより測定）を示すグラフである。特にこのモノクローナルは酸化改変しにくく、ａＰＬの非マスク化は観測されなかった。凝固因子IXに対するモノクローナル抗体のａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣ結合プロファイル（ＯＤにより測定）を示すグラフである。ＡＢＰ含有希釈緩衝液中において因子IXは負の電化を帯びたリン脂質、ＰＳおよびＣＬと結合し（対照）、それゆえ陽性モノクローナル抗因子IX反応がａＰＳやａＣＬとして見られることに注意されたい。ＥＭＦによる酸化還元はＡＢＰ希釈液中の因子IX結合に対してマスク化効果がなかった。反対に、因子IXが存在しないＡＢＳ希釈液（対照）中においては、ａＰＬ活性は観測されない。しかしながら、酸化還元の後、ａＰＥ活性およびａＰＣ活性の両方が非マスク化される。ＩｇＧアイソタイプ対照として商業的に販売されているＩｇＧ１モノクローナル抗体のａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣ結合プロファイル（ＯＤにより測定）を示すグラフである。このグラフにおいて、２つの異なる酸化剤、へミンとＥＭＦとの異なる効果の比較がなされている。詳細は図の説明文で提供される。図５のように、ＣＤ４４抗原に対するモノクローナル抗体のａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣの結合プロファイル（ＯＤにより測定）を示すグラフである。このモノクローナル抗体は、ヘミンまたはＥＭＦの酸化剤によりその結合活性を大幅には改変しない。該モノクローナルはしかしながら、その細胞表面抗原に結合し続ける。血小板抗原IIｂ−IIIａに対するモノクローナル抗体のａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣ結合プロファイル（ＯＤにより測定）を示すグラフである。ＡＢＰ含有希釈液（対照）においては、ａＰＳまたはａＣＬとして活性は見られない。懸濁液中のモノクローナルを本発明の実施態様により電位で処理した後（酸化還元）、ａＰＳおよびａＣＬのどちらもが該希釈緩衝液を使用することにより示されたように非マスク化された。ＢＳＡ含有希釈緩衝液（対照）中においては、ａＰＳおよびａＣＬに対する活性は観察されず、それゆえＡＢＰ希釈緩衝液中の負の電化を帯びたＰＳおよびＣＬにより結合される血漿タンパク質はＢＳＡ含有希釈緩衝液中には存在しなかった。モノクローナルの、本発明の実施態様による電位処理（酸化還元）は、ＢＳＡ含有緩衝液中のａＰＥおよびａＰＣシグナルの強度を増加させた。マウス腫瘍細胞株ＳＰ２／０で発見された原形質膜抗原に対して製造されたモノクローナル抗体へのＥＭＦ処理の効果を示すグラフである。このモノクローナル抗体は商業的に製造されたモノクローナル抗体製剤に存在し得る独自の変数（proprietary variables）に対する調整という明確な目的のために注文生産された。例えば、商業用モノクローナル抗体の製造者によって使用される懸濁溶液は、モノクローナル増殖培地からの残留物として動物の血清により汚染されている可能性があるのか？このような汚染はマウスモノクローナルのマスク化および／または非マスク化観察を妨げ得る。図１０に示すように、その実験計画では、培地そのものの、モノクローナル抗体を含有する培地、ＥＭＦ処理を行った後の培地およびＥＭＦ処理を施した後のモノクローナル抗体を含む培地の検査というものであった。また、さらなる検査のために、Ａタンパク質アフィニティーカラム（１．４６ｍｇ／ｍｌ）を使用することにより濃縮されたモノクローナル抗体を利用することができる。図１０は全てのａＰＬの非マスク化は単クローン抗体がＥＭＦで処理された後に検出されること、検出はＡＢＰ含有希釈緩衝液またはＢＳＡ含有希釈緩衝液のいずれかにおいて観察されることを示している。マウス腫瘍細胞株ＳＰ２／０で発見された原形質膜抗原に対して製造されたモノクローナル抗体へのＥＭＦ処理の効果を示すグラフである。このモノクローナル抗体は商業的に製造されたモノクローナル抗体製剤に存在し得る独自の変数（proprietary variables）に対する調整という明確な目的のために注文生産された。例えば、商業用モノクローナル抗体の製造者によって使用される懸濁溶液は、モノクローナル増殖培地からの残留物として動物の血清により汚染されている可能性があるのか？このような汚染はマウスモノクローナルのマスク化および／または非マスク化観察を妨げ得る。図１０に示すように、その実験計画では、培地そのものの、モノクローナル抗体を含有する培地、ＥＭＦ処理を行った後の培地およびＥＭＦ処理を施した後のモノクローナル抗体を含む培地の検査というものであった。また、さらなる検査のために、Ａタンパク質アフィニティーカラム（１．４６ｍｇ／ｍｌ）を使用することにより濃縮されたモノクローナル抗体を利用することができる。図１０は全てのａＰＬの非マスク化は単クローン抗体がＥＭＦで処理された後に検出されること、検出はＡＢＰ含有希釈緩衝液またはＢＳＡ含有希釈緩衝液のいずれかにおいて観察されることを示している。モノクローナル抗体抗グリコホリンＡを使用してＥＭＦ酸化を行った際の経時的な効果を示すグラフである。これは図１記載のモノクローナル抗体製剤と同一のものである。図１１はＥＭＦ処理の最初の一分間に、フローサイトメトリー平均チャネルシフト（mean channel shifts）（ＭＣＳ）により測定されたこのモノクローナルのその赤血球（ＲＢＣ）標的膜抗原への結合が下り坂になるということを明示している。しかしながら、フローサイトメトリー用に５秒間隔でアリコートを取得した最初の一分の後、付加的なＥＭＦ処理を続けると下方傾向の反転を引き起こし、ＥＭＦ処理の最初の１５〜２０秒の後に現れる値と近似するＭＣＳ値へと上向きにシフトする。１０秒間隔で観測され、図１で示されたａＰＬの非マスク化の時間と一致するＭＣＳの４０１から３８６へのシフトは、フローサイトメトリー実施者によれば重大であるとは考えられない。それにもかかわらず、該シフトはモノクローナルの結合特性に対して甚大な影響を及ぼす。したがって、ａＰＬ反応性の非マスク化（改変）はモノクローナルＲＢＣ結合特性にほとんど影響しない。しかしながら、ＥＭＦ酸化工程を１分伸ばせば、最初の一分間のＲＢＣへの結合の下方改変が可逆になることを示している。図１０でも示されたモノクローナル抗体の酸化処理は、非マスク化およびマスク化の時間と温度による可逆改変であるということを示すグラフである。−８０℃で保管された場合、ＥＭＦ処理後のａＰＬ活性に重大な損失はない。一方、３７℃で４日間保管した場合ａＰＬ反応性の損失を引き起こしたが、ａＰＬ反応性はモノクローナル抗体懸濁液に別のＥＭＦ処理を施すことで完全に回復（非マスク化）できる。この現象は、酸化された治療用モノクローナル抗体は、炎症部位のような、活性酸素種が発生する領域に現れ得る（非マスク化）ため、インビボでは重大な生理学的不利益がある可能性がある。これらの治療用モノクローナル抗体の非マスク化は、レシピエントにとって望ましくない病態生理学的結果へと導く恐れがある。実際、いくつかの治療用モノクローナル抗体が有害かつ予想外の副作用のために使用から除外されてきたのは、上記したことが原因であろう。図１０でも示されたモノクローナル抗体の酸化処理は、非マスク化およびマスク化の時間と温度による可逆改変であるということを示すグラフである。−８０℃で保管された場合、ＥＭＦ処理後のａＰＬ活性に重大な損失はない。一方、３７℃で４日間保管した場合ａＰＬ反応性の損失を引き起こしたが、ａＰＬ反応性はモノクローナル抗体懸濁液に別のＥＭＦ処理を施すことで完全に回復（非マスク化）できる。この現象は、酸化された治療用モノクローナル抗体は、炎症部位のような、活性酸素種が発生する領域に現れ得る（非マスク化）ため、インビボでは重大な生理学的不利益がある可能性がある。これらの治療用モノクローナル抗体の非マスク化は、レシピエントにとって望ましくない病態生理学的結果へと導く恐れがある。実際、いくつかの治療用モノクローナル抗体が有害かつ予想外の副作用のために使用から除外されてきたのは、上記したことが原因であろう。

本発明はモノクローナル抗体の結合特異性を改変する方法に関する。

モノクローナル抗体の「結合特異性を改変する」という用語は、モノクローナル抗体が、以前は特異的に結合できなかった抗原またはリガンドを特異的に結合できるようになるように、酸化や還元分裂などによって変化または改変させられる過程を意味する。例えば抗体活性のスペクトルは、モノクローナル抗体が他の抗原と結合するように広げられ得る。「結合特異性を改変する」という用語はまた、モノクローナル抗体が、以前は特異的に結合できた抗原またはリガンドを特異的に結合できないようになるように、酸化や還元などによって変化または改変させられる過程にも適用されるが、この文脈において、この用語は可逆的な変化を意味するものであり、タンパク質の変性などの永続的で不可逆的変化を意味するものではないことを理解されたい。

「モノクローナル抗体」という用語は、一般的に特定の抗原に対する結合特異性に基づき選択され、その後クローン化されるか、あるいはそれぞれが同一の分子構造を有する一組の抗体分子を産生するために製造される抗体を意味する。多くの抗原に対するモノクローナル抗体が商業的に入手可能である。

本発明の方法では、モノクローナル抗体の結合特異性は該モノクローナル抗体を酸化剤または電流にさらすことで改変される。例えば、モノクローナル抗体の結合特異性は、ここで記載する方法が実行される以前は結合できなかった抗原をモノクローナル抗体が結合できるように改変することができる。

本発明の方法を実行するために酸化剤を使用する場合、酸化剤は生物分子の酸化還元状態を改変できるような化合物であればよい。より詳しくは、酸化剤は、電子供与体として働く他の分子に対する電子受容体として働くことにより還元される能力を有する分子である。適当な酸化剤には、例えば第二鉄と第一鉄状態の間を行ったり来たりできる鉄のような酸化還元が可能な金属などの、酸化還元反応で使用できる配位（遷移）金属を含む多くの化合物が含まれる。他の酸化剤の例としては、ヘミンやクロロフィル分子中の配位マグネシウム金属、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ₄）および過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ₄）が挙げられるが、これらに制限されるものではない。一般的には、遷移金属の酸化剤が使用される場合、モノクローナル抗体と酸化剤との混合物を一定時間、典型的には１２〜２４時間の間インキュベートしなければならない。酸化剤はモノクローナル抗体の結合特異性を改変するのに充分な濃度で使用されるべきだが、モノクローナル抗体を破壊したり変性したりするほどの濃度で使用されるべきではない。種類が異なるモノクローナル抗体は種々の抗酸化剤と異なった相互作用をするということが発見されている。

本発明の方法を実行するためにＤＣ電流が使用される場合、処理されるべき試料を含む導電性溶液にプラス極とマイナス極を浸漬するなど、あらゆる電流の送達手段で方法を実行してもよい。モノクローナル抗体を含む溶液は、モノクローナル抗体の結合特異性を改変させるのに充分な大きさ、および充分な時間電位にさらされる。溶液を６〜２４ボルトの電位の中に数秒から数分さらすことで陽性の結果が得られることがわかっている。さらに長期間電流の中にさらすことは、結合特異性の改変を反転させる結果を招き得る。これは、グリコホリンＡモノクローナル抗体およびフローサイトメトリーを使用し、ＥＭＦ処理の時間に対する赤血球への抗体の反応性を測定することで見られる。図１１は最初の６０秒間ＥＭＦ処理が５秒長くなるごとに平均チャネルシフト（ＭＣＦ）に見られる減少を示している。しかしながら、付加的にＥＭＦ処理を１分長く適用すると（合計２分）、下方傾向は反転しＭＣＳ値の増加を引き起こす。

特定の理論に縛られることなく、モノクローナル抗体を酸化剤や電流にさらすことで、モノクローナル抗体のＦａｂ部分にある抗原結合部位を酸化および／または還元できると考えられている。ＩＶＩｇにより行われ、モノクローナル抗ニトロチロシン抗体による検出を使用する酸化実験においては、ヘミンにより酸化にさらされたＩｇＧは未処理のＩｇＧよりもよりニトロシリル化されていることが見出されている。したがって、同様の機序がモノクローナル抗体で有効であり得ること、およびモノクローナル抗体の抗原結合部位の改変は、抗原結合部位におけるコンホメーション変化を生み出し得る、抗体の超可変領域内およびその周囲の芳香環含有アミノ酸（例えば、チロシンおよびトリプトシン）の可逆的なニトロシル化により達成されることが理論化され得る。

目的のある特定のモノクローナル抗体が、酸化還元状態を変えることによりで改変し得る結合特異質を有するものであるのかどうか、およびモノクローナル抗体の結合特異性を改変する条件の有効性は、モノクローナル抗体の酸化還元状態を変化させ、例えば該モノクローナル抗体を酸化剤または電流にさらし、その後モノクローナル抗体の結合特異性が改変したかどうかを判断するためにＥＬＩＳＡまたは他のリガンド−受容体アッセイを使用することで容易に判断される。言い換えれば、モノクローナル抗体のアッセイは、過程によりモノクローナル抗体の結合特異性が改変されたかどうかを確かめるために、モノクローナル抗体が酸化還元状態の変化にさらされた前と後とに実行することができる。例えば、特定のモノクローナル抗体を改変させるための最善な酸化剤または方法は、単純な実験により容易に決定することができる。実験データは、種々の酸化剤が種々の自己抗体特異性を非マスク化できることを示している。

本発明のさらなる側面は、酸化剤または電流にさらすことで改変されたモノクローナル抗体である。より詳細には以下の実施例で説明するが、以下に示すモノクローナル抗体の結合特異性が、カルジオリピン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルセリンの少なくとも１つに関してその結合プロファイルを変えるように改変できたことがこれまでにわかった。当該モノクローナル抗体とは、抗グリコホリンＡモノクローナル抗体、抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体、ＣＤ６３モノクローナル抗体、Ｂ₂ＧＰ−Ｉモノクローナル抗体、抗血小板IIｂ−IIIａモノクローナル抗体、ガンマ１マウスアイソタイプ対照モノクローナル抗体である。因子IXに対するモノクローナル抗体と同じように、因子VIIに対するモノクローナル抗体やＣＤ４４に対するモノクローナル抗体の結合特性の改変はＥＬＩＳＡ試験に使用される希釈緩衝液に依存していた。

本発明を説明した上で、以下の実施例は、現在知られている本発明を実行するためのベストモードを含む、本発明の詳細な適用を説明するために提供される。これら特定の実施例は本出願に記載されている発明の範囲を制限するものではない。

本明細書に記載することに関し特に断りのない限り、以下の手順が一般的に使用された。２５０μｌのモノクローナル抗体が市販されているバイアルまたはボトルから直接使用された。該モノクローナル抗体はパラフィルムシート上に発泡液として置かれた。黒鉛電極を６〜９ボルトバッテリの正極および負極、もしくは８ボルトの電源（ＢＫプレシジョン（BK Precision）社製）セットに接続され、モノクローナル抗体を含む発泡溶液中に１０秒間沈められた。（ここで代わりになる処理として、モノクローナル抗体をヘミンと混合し、その混合物を振動または振とうしながら３６℃で１２〜２４時間インキュベートする処理が使用される。）電流またはヘミンによる処理に続き、モノクローナル抗体の試料を、抗リン脂質抗体の存在を確かめるためにａＰＬ単独の試験結果を提供する総合自家（comprehensive in-house）ＥＬＩＳＡａＰＬフォーマットを使用して試験した。試験手順のさらなる詳細については以下の文献において説明されており、参考として本明細書中に組み込まれる。Wagenknecht, DR, et al., The Evolution, Evaluation and Interpretation of Antiphospholipid Antibody Assays, Clinical Immunology Newsletter, Vol. 15, No.2／3（1995）pp.28-38 および Mclntyre, JA, et al., Frequency and Specificities of Antiphospholipid Antibodies（aPL）in Volunteer Blood Donors, Immunobiology 207（1）:59-63, 2003。

１）ａＰＳ＝抗ホスファチジルセリン、２）ａＣＬ＝カルジオリピン、３）ａＰＥ＝ホスファチジルエタノールアミンおよび４）ａＰＣ＝ホスファチジルコリンの４つのａＰＬ特異性が評価された。各モノクローナル抗体試料は、酸化の前と後とに１／１０に希釈され、リン脂質結合血漿タンパクを含む１０％の成体ウシ血漿（ＡＢＰ）か、またはリン脂質結合血漿タンパクを含まない１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のどちらかを補足したＴＲＩＳ希釈緩衝液の存在（依存）および非存在（独立）においてそれぞれ評価した。

図７、１０および１２を除いて、本出願において示された図に使用されるモノクローナル抗体はヒトタンパク質に対するものであり、病院検査室用に商業上製造販売されているものであった。これらマウスモノクローナル抗体は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂを表した。それゆえ、ＩｇＧサブクラスは全て酸化還元（redox）による改変が可能である。公開されたポリクローナル抗体のデータと同様に、酸化還元反応に続くモノクローナル抗体反応性の非マスク化およびマスク化を検出した。引用されたすべてのＥＬＩＳＡデータは三重でなされた。本発明者らは、酸化還元反応に起因する結合の改変を試験するために自家ａＰＬＥＬＩＳＡを使用した。なぜなら本発明者らはこのアッセイを何年も経験しており、本発明者らの実験室では年に何千もの試験が行われているからである。アッセイ手順の記述は上記の文献に見られるだろう。全てのモノクローナル抗体懸濁液は、特に記されていない限りＥＬＩＳＡで試験を行う前に１／１０に希釈された。

本明細書中に記載された様々な実験により得られたａＰＬ特異性の結果は添付の図面に提供される。陽性／陰性の結果は光学濃度（ＯＤ）の観点で表される。本明細書中で結果を説明する場合、「非マスク化」という用語は一般的に、例えばリン脂質抗原への結合の強まりが観測される場合など、モノクローナル抗体の結合特異性の改変が観察される状態を意味する。

実施例１
ヒトグリコホリンＡに対するマウスモノクローナルＩｇＧ２ｂ抗体を含む製造者の気泡溶液２５０μｌはパラフィルム台に置かれた。溶液を２つの電極（陽極と陰極）を１０秒間８ボルトの電源セットに取り付けることで発生する８ボルトのＥＭＦに１０秒間さらした。各モノクローナル抗体溶液は以下の結合特異性、すなわち抗ホスファチジルセリン（ａＰＳ）、抗カルジオリピン（ａＣＬ）、抗ホスファチジルエタノールアミン（ａＰＥ）および抗ホスファチジルコリン（ａＰＣ）について酸化前後にアッセイされた。対照溶液と酸化還元処理がなされた溶液は、その後それぞれ別々のＴＲＩＳ希釈緩衝液、１つは１０％の成体ウシ血漿（ＡＢＰ）を補足したもの、もう１つは１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補足したものに１／１０に希釈されたａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣ結合特異性についてアッセイされた。ＥＭＦ処理前（「対照」）およびＥＭＦ処理後（「酸化還元」）の抗グリコホリンＡモノクローナル抗体のＡＢＰ含有希釈液およびＢＳＡ含有希釈液での結合プロファイルは図１に示されている。図１では、未処理、すなわち対照では、グリコホリンＡは抗リン脂質抗体（ａＰＬ）活性はもたないが、起電力（ＥＭＦ）を使用して酸化還元処理をした後、有意なａＰＬ反応性が検出された。ａＰＬ検出のためのＥＬＩＳＡは、１０％の成体ウシ血漿（ＡＢＰ）を含む希釈液か、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む希釈液のいずれかの２つのＴＲＩＳ緩衝液希釈液中で行われた。ＡＢＰは、特定のａＰＬは検出可能となるためにリン脂質結合タンパク質を要求するので、血漿タンパク質で緩衝液を補い、一方リン脂質結合タンパク質と独立したａＰＬは追加の血漿タンパクなしで結合するであろう。この実施例において、ＰＳへの結合はどちらの緩衝液においても不確かである。ＰＥへの結合はＢＳＡ緩衝液中で観測され、このことはａＰＥが、ＡＢＰが存在する場合ＰＥと結合しないことを示唆している。なぜならａＰＥよりもＰＥとの結合に高い親和性を有する血漿タンパクにより妨げられているからである。

実施例２
抗グリコホリンＡモノクローナル抗体の代わりにマウス抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体というＣＤ４陽性細胞のＨＩＶ感染の共受容体がモノクローナル抗体として使用されていること以外は実施例１を繰り返した。当該処理および試験の形式は図１と同様である。ＥＭＦ処理前（「対照」）およびＥＭＦ処理後（「酸化還元」）抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体のＡＢＰ含有希釈液およびＢＳＡ含有希釈液での結合プロファイルは図２に示されている。図２に示されているように、ＡＢＰ含有希釈緩衝液中ではほとんど活性が見られない。有意なａＰＣ反応性が、ＢＳＡを含む緩衝液に希釈された対照試料に見られ、酸化還元処理された試料で増加する。さらに、有意なａＰＥ、ａＣＬおよびａＰＳ反応性は、モノクローナルの酸化、およびＢＳＡを含む緩衝液中への希釈後に現れる。

実施例３
抗グリコホリンＡモノクローナル抗体の代わりにＣＤ６３モノクローナル抗体がモノクローナル抗体として使用されたこと以外は実施例１を繰り返した。ＣＤ６３に対するＩｇＧ１モノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ試験形式は、図１および２で記載されているものと同一である。ＥＭＦ処理前（「対照」）およびＥＭＦ処理後（「酸化還元」）のＣＤ６３モノクローナル抗体のＡＢＰ含有希釈液およびＢＳＡ含有希釈液の結合プロファイルは図３に示されている。図３で示されているように、当該モノクローナルのＥＭＦによる酸化は単一の改変、すなわち、ＢＳＡ緩衝液サンプル中におけるａＰＣの出現を示した。

実施例４
抗グリコホリンＡモノクローナル抗体の代わりに血漿タンパクへのモノクローナル抗体、ベータ２糖タンパク質Ｉ（β₂ＧＰ−Ｉ）がモノクローナル抗体として使用されていること以外は実施例１を繰り返した。ＥＭＦ処理前（「対照」）およびＥＭＦ処理後（「酸化還元」）のβ₂ＧＰ−Ｉモノクローナル抗体のＡＢＰ含有希釈液およびＢＳＡ含有希釈液での結合プロファイルは図４に示されている。図４の興味深い特徴は、ＡＢＰを含む緩衝液である。β₂ＧＰ−ＩはＢＳＡ希釈緩衝液中には存在しないが、ＡＢＰ希釈緩衝液中には存在する。β₂ＧＰ−Ｉはカルジオリピンと結合し、対照試料で示されるようにモノクローナルによって認識される。しかしながら、ＥＭＦによる酸化還元の後、モノクローナルは自身のβ₂ＧＰ−Ｉ抗原を認識できなくなる。それゆえ酸化がモノクローナルのβ₂ＧＰ−Ｉに対する結合部位を改変させている。しかしながら、モノクローナルの酸化後、ＡＢＰ含有希釈緩衝液中のａＰＥ抗体としての反応性およびＢＳＡ含有希釈緩衝液中のａＰＣ反応性が存在する。ゆえに、該モノクローナルのａＰＬ反応ではマスク化と非マスク化が同時に存在している。

実施例５
抗グリコホリンＡモノクローナル抗体の代わりに抗因子VIIモノクローナル抗体がモノクローナル抗体として使用されていること以外は実施例１を繰り返した。ＡＢＰおよびＢＳＡを含む希釈液の結合プロファイル、また抗因子VIIモノクローナル抗体のＥＭＦ処理前（「対照」）およびＥＭＦ処理後（「酸化還元」）の結合プロファイルは図５に示されている。図５に示されているように、酸化還元改変はａＰＬ結合に対して観察されなかった。

実施例６
抗グリコホリンＡモノクローナル抗体の代わりに因子IXモノクローナル抗体がモノクローナル抗体として使用されていること以外は、実施例１を繰り返した。ＥＭＦ処理前（「対照」）およびＥＭＦ処理後（「酸化還元」）因子IXモノクローナル抗体のＡＢＰ含有希釈液およびＢＳＡ含有希釈液の結合プロファイルは図６に示されている。図６で示されているように、ＡＢＰ希釈緩衝液中に存在する因子IXは、対照および酸化還元試料において抗体により同じように認識可能であるという事実により、因子IXに対するＩｇＧモノクローナル抗体は酸化還元処理では改変しない（マスク化）。ＢＳＡ希釈液中には利用可能な因子IXが存在しないため、対照は陰性だが、ａＰＥとａＰＣとの両方がＥＭＦ酸化還元処理により非マスク化される。

実施例７
抗グリコホリンＡモノクローナル抗体の代わりにマウス対照モノクローナル抗体がモノクローナル抗体として使用されていること以外は実施例１を繰り返した。加えて、代わりとなる酸化処理は上述した条件下でヘミンを用いることにより行われた。より詳細には、ヘミン２．５μｌ（１５．１５ｍｇ／ｍｌ）をモノクローナル抗体溶液０．５ｍｌに添加し、振動台上で３６℃で一晩インキュベートした。ヘミンまたはＥＭＦ処理前（「対照」）および「ＥＭＦ」または「ヘミン」処理後のガンマ１マウス対照モノクローナル抗体のＡＢＰ含有希釈液およびＢＳＡ含有希釈液の結合プロファイルは図７に示されている。図７は、モノクローナル結合活性の改変は酸化剤によって影響されることを示している。当該実施例において、ヘミンはａＰＳ、ａＣＬおよびａＰＥ反応性を非マスク化するが、ＥＭＦ処理ではしなかった。ヘミンおよびＥＭＦはどちらもａＰＣを非マスク化でき、これはモノクローナルがＢＳＡを含む緩衝液に希釈される際に一番顕著となる。当該グラフ中のモノクローナル抗体はｌｇＧアイソタイプ対照抗体として商業的に販売されており、記録されたその抗原はヒトのレパートリーには見られないタンパク質であるヘモシアニンであった。ＥＭＦ処理は図１記載のものと同一であった。

実施例８
抗グリコホリンＡモノクローナル抗体の代わりにＣＤ４４モノクローナル抗体がモノクローナル抗体として使用されていること以外は実施例１を繰り返した。処理前（「対照」）および「ヘミン」または「ＥＭＦ」処理後の抗ＣＤ４４のモノクローナル抗体のＡＢＰ含有希釈液およびＢＳＡ含有希釈液の結合プロファイルは図８に示されている。図８は商業的に生産された抗原ＣＤ４４に対するＩｇＧ１モノクローナル抗体は、図５記載のようにヘミンおよび／またはＥＭＦで処理した際に結合の改変に対して反応しにくいことを示している。

実施例９
抗グリコホリンＡモノクローナル抗体の代わりに抗血小板IIｂ−IIIａマウスモノクローナル抗体がモノクローナル抗体として使用されていること以外は実施例１を繰り返した。「ＥＭＦ」処理前（「対照」）および「ＥＭＦ」処理後（「酸化還元」）のＣＤ６３マウスモノクローナル抗体のＡＢＰを含む希釈液およびＢＳＡを含む希釈液に関する結合プロファイルは図９に示されている。図９は血小板抗原IIｂ−IIIａに対して商業的に製造されたＩｇＧ１モノクローナルがＥＭＦ処理後に非マスク化され、ＡＢＰ含有希釈液の存在下でａＰＳおよびａＣＬとして現れたが、ＢＳＡ含有希釈液では現れなかったということを示している。この結果に対する適切な説明は、ＰＳおよびＣＬと結合でき、モノクローナルの酸化でその結合特性が改変されたＡＢＰ中の血漿抗原の存在である。

実施例１０
抗グリコホリンＡモノクローナル抗体の代わりにマウス腫瘍細胞株ＳＰ２／０に対する注文生産されたモノクローナル抗体がモノクローナル抗体として使用されること以外は実施例１を繰り返した。このモノクローナル抗体（Ｍａｂ）は培地中に産生され、該培地では全ての構成成分がわかっており、培地の試料は可能性のあるＥＬＩＳＡ対照が全て行われることを確実にするため、モノクローナル増殖の前後に得た。ＥＭＦ処理前（「Ｃｎｔｌ」）およびＥＭＦ処理後（「ＥＭＦ」）のＳＰ２／０モノクローナル抗体のＡＢＰ希釈液（図１０Ａ）およびＢＳＡ希釈液（図１０Ｂ）に対する結合プロファイルが示される。詳細には、図１０（Ａ）はマウス腫瘍細胞株ＳＰ２／０に対して製造されたモノクローナル抗体（Ｍａｂ）のＥＭＦ処理の効果を示すグラフである。全ての培地成分はわかっていたため、上図に示されるＥＭＦ処理による酸化は当該モノクローナルのａＰＬ反応性を非マスク化する。この図において、左側のＥＭＦ＋ＭａｂはＡＢＰを含む希釈緩衝液中に１／１０で希釈されたＡタンパク質精製モノクローナル（１．４６ｍｇ／ｍｌ）の酸化を表し、ＥＬＩＳＡは基質で１０分間のみ展開した。残りのＥＬＩＳＡの棒グラフは７０分間の基質の展開を表している。予期されるように、濃縮せずに酸化されたモノクローナルを含む培地は、陽性結果を出現させるためにはかなり多くの展開時間を必要とする。図１０（Ｂ）は図１０Ａで述べられている試料および条件と同一のものを表すが、このグラフにおける希釈緩衝液はＢＳＡを含有している。ＡＢＰ希釈液と比較した場合にＢＳＡ希釈緩衝液中で見られる一番印象的な結果は、ａＰＣのシグナルの増加である。これはＡＢＰ含有緩衝液におけるａＰＣと血漿タンパク質間の結合競合、またはａＰＣの非マスク化を防ぐために非常に効果的なＡＢＰ含有緩衝液中の酸化防止剤を表わす可能性がある。

実施例１１
モノクローナルが自身の赤血球（ＲＢＣ）標的膜抗原を認識することに対するＥＭＦ酸化の影響を調べるため、実施例１で使用された抗グリコホリンＡモノクローナル抗体と同一のものを使用した。この実験計画でも２５０μｌのモノクローナル抗体溶液の発泡液をパラフィルム上で使用するが、ＲＢＣ結合についてフローサイトメトリーにより試験するため、３μｌの試料を最初の１分間に５秒間隔で回収した。６０秒後、付加的なＥＭＦ処理が途切れることなくさらに６０秒なされた（ＥＭＦ時間の合計は２分）。この実験の結果は図１１に提供される。詳細には、図１１は赤血球（ＲＢＣ）結合のフローサイトメトリー分析を使用することにより、図１で示された抗グリコホリンＡモノクローナル抗体（抗ＧｌｙＡ）製剤と同一のものに対するＥＭＦ酸化の時間増加の効果を説明している。ＥＭＦ処理の最初の１分間、ＲＢＣ結合アッセイのためにモノクローナル抗体のアリコートが５秒ごとに試料として採取した。ＥＭＦを行う前４０１だった平均チャネルシフト（ＭＣＳ）は６０秒で２２３まで低下したことが観測された。１０秒間で４０１から３８６へのＭＣＳが観測され、これは図１記載のａＰＬを非マスク化するためと見られた。ＭＣＳの１５の差は、フローサイトメトリーの実施者には重大だとは見なされない。６０秒後アリコートが回収され、付加的なＥＭＦ酸化が残っているモノクローナル抗体に６０秒間適用された。拡大されたＥＭＦ酸化時間は合計１２０秒で、折れ線グラフが示すように、ＲＢＣへの結合の低下傾向が逆転し、ＭＣＳはＥＭＦ酸化にさらして初めの２０秒が経過した後のＭＣＳと同値の３５９になった。

実施例１２
図１２Ａおよび１２Ｂに示されるモノクローナル抗体の結合特性を改変する可逆性は時間と気温に依存する。−８０℃で保管された場合、酸化したモノクローナル抗体はそのａＰＬ反応性を保持する。３７℃でモノクローナル抗体を保管した場合、ａＰＬ結合特異性は急速に失われ、元の酸化されていないａＰＬの状態へと戻る。しかしながら、もう１つのＥＭＦ酸化処理は、３７℃で保管されたモノクローナルをもう一度非マスク化する。詳細には、図１２に示されているように、酸化されたマウス腫瘍ＳＰ２／０に対するモノクローナル抗体を３７℃で４日間保管すると、−８０度の時には観測されなかったａＰＬ非マスク化活性の喪失が見られる。３７℃の試料がもう１つのＥＭＦ処理にさらされた場合、ａＰＬ反応性はもう一度非マスク化される。残念ながら、この実験においては、ＯＤを読み取る前にａＰＥ培養皿が落下してしまったので左のパネルのヒストグラムはａＰＥの箇所が空白である。しかしながら、この実験はポリクローナルＩｇＧおよびＥＭＦで何度か行われており、３７℃で保管した場合ａＰＥの損失が見られること、２度目のＥＭＦ処理の後ａＰＥが回復することが示されている。

当然、本発明の多くの修飾や変更は前述した教示に照らして可能である。したがって、添付の特許請求の範囲内で、本発明は特別に記載されている以外実施できるということが理解されるべきである。

Claims

モノクローナル抗体の結合特異性を改変する方法であって、モノクローナル抗体を酸化剤または電位にさらすことを含む方法。
特定の第１抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体を含有する溶液を提供すること、および
該モノクローナル抗体の結合特異性を改変するのに充分な酸化剤または電位に組成物をさらすこと
を含む方法。
前記組成物が酸化剤または電位にさらされた後、前記モノクローナル抗体が第１抗原以外の抗原に対して結合親和性を有するかどうかを決定するために該モノクローナル抗体をスクリーニングすることをさらに含む請求項２記載の方法。
酸化剤がヘミンである請求項２記載の方法。
前記組成物を電位にさらすことが、バッテリの正極および負極または電源に接続された電極をモノクローナル抗体を含む溶液にあらかじめ定められた時間沈めることにより実施される請求項２記載の方法。
モノクローナル抗体を含む溶液が、その商業的製造業者の緩衝液、ＴＲＩＳ緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水または培地を含有する請求項２記載の方法。
モノクローナル抗体が、
マウスモノクローナル因子VII抗体；
マウスモノクローナルβ₂ＧＰ−Ｉ抗体；
マウス抗血小板IIｂ−IIIａモノクローナル抗体；
ＣＤ６３マウスモノクローナル抗体；
マウスモノクローナル因子IX抗体；
マウスモノクローナルグリコホリンＡ抗体；
マウスモノクローナル抗ＣＸＣＲ４抗体；
ガンマ１マウス対照モノクローナル抗体；
ＣＤ４４マウスモノクローナル抗体；および
マウス腫瘍細胞株ＳＰ２／０に対して注文生産されたマウスモノクローナル抗体
からなる群より選択される請求項２記載の方法。
さらに、改変された結合特異性を有するモノクローナル抗体を溶液から回収することを含む請求項２記載の方法。
前記モノクローナル抗体が治療剤または治療剤候補であり、前記スクリーニングが、該モノクローナル抗体が酸化条件化で自己抗体活性を有するかどうかを評価するために行われる請求項３記載の方法。
モノクローナル抗体を酸化剤または電位にさらすことにより改変された結合特異性を有するモノクローナル抗体。
モノクローナル抗体の結合特異性が、バッテリの正極および負極または電源に接続された電極をモノクローナル抗体を含む溶液に沈めることにより改変される請求項１０記載のモノクローナル抗体。
モノクローナル抗体の結合特異性が、モノクローナル抗体を含む溶液をヘミンと共にインキュベートすることにより改変される請求項１０記載のモノクローナル抗体。