WO2012124654A1 - プロテインｓ異常症の検出方法 - Google Patents

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濱崎　直孝
友秀 津田
秀日 金
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Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting protein S abnormality.
  • the present invention is particularly useful in the field of life science such as clinical examination, molecular biology, and medicine.
  • Protein S is a plasma protein that functions centrally in the control mechanism of the blood coagulation system in the living body.
  • This protein S is mainly present in blood and is a prosthetic factor (cofactor) of activated protein C, which can increase the activity of activated protein C, and is activated in blood. It is indispensable for the function of protein C.
  • activated protein C decomposes activated blood coagulation factor V (factor Va; FVA) and activated blood coagulation factor VIII (factor VIIIa; FVIIIa) that promote blood coagulation in humans. It is a factor that plays a role in suppressing the blood coagulation reaction.
  • Protein S specifically binds one-to-one with a C4b binding protein (complement factor 4b binding protein; C4bBP) to form a complex. That is, the C4b binding protein is a protein S ligand.
  • C4b binding protein complement factor 4b binding protein
  • protein S-C4b binding protein complex ie, bound type
  • free protein ie free
  • protein S or “C4b binding protein” means that each of these substances, unless there is a description of complex (or binding type) or free (or free type). It shall mean the generic name of complex (or bound) and free (or free).
  • Protein C is activated in the living body by being limitedly decomposed by the thrombin / thrombomodulin complex and releasing the activated peptide, thereby becoming activated protein C.
  • Activating protein C is a serine protease that plays a role in suppressing blood coagulation reaction by decomposing activated blood coagulation factor V and activated blood coagulation factor VIII that promote blood coagulation in humans.
  • Protein S is a prosthetic factor (cofactor) of activated protein C, and the presence of protein S increases the activity of activated protein C, and the activated blood coagulation factor V degradation reaction by activated protein C and The degradation reaction of activated blood coagulation factor VIII is promoted.
  • a decrease or abnormality in the activity of protein S which has a function of suppressing the blood coagulation reaction, can cause thrombosis in vivo.
  • people with congenital anomalies of protein S frequently have arterial thrombosis such as deep vein thrombosis, venous thrombosis such as superficial phlebitis or pulmonary infarction, or coronary thrombosis causing heart failure. Will develop symptoms.
  • a decrease or abnormality in protein S activity is also observed in disseminated intravascular coagulation syndrome (DIC), vitamin K deficiency or hypofunction of the liver.
  • DIC disseminated intravascular coagulation syndrome
  • the sample is incubated with protein C monoactivator from snake venom in the form of activated protein C, and blood coagulation factor XII, blood coagulation factor VII
  • protein C monoactivator from snake venom in the form of activated protein C
  • blood coagulation factor XII blood coagulation factor VII
  • the activator of blood coagulation factor 11 is added and the decrease in thrombin formation from prothrombin mediated by blood coagulation factor and its activator is measured photometrically using a chromogenic thrombin substrate Is disclosed (see Patent Document 1).
  • a protein C activator or protein C activating protein C is added to a plasma sample, and then activated blood coagulation factor IX is added and incubated. Then, the amount of thrombin produced is measured by a known method, and this is compared with the value obtained by measuring a sample with known protein S activity to measure the activity of protein S in the sample. It is disclosed (see Patent Document 2).
  • the sample is incubated with activated protein C, blood coagulation factor VIII, phospholipids and calcium ions, and then this mixture is activated with blood coagulation.
  • factor II thrombin
  • activated blood coagulation factor IX activated blood coagulation factor IX
  • activated blood coagulation factor X specific substrate to the incubation mixture and cleave this substrate.
  • At least one of the components (factors) of the blood coagulation reaction used in the measurement reaction is a component (factor) contained in the sample. They were used as they were. That is, it depends on the components contained in the sample.
  • the components (factors) [for example, activated blood coagulation X
  • the factor is deficient or decreased in the sample provider, at least one of the reaction components (factors) of the measurement reaction is not present in a sufficient amount, so the measurement reaction does not proceed sufficiently and the protein obtained
  • the S activity value has a problem that it deviates from the original value and includes an error.
  • the measured value may be affected by the abundance (concentration) in the sample of the component (factor) related to the blood coagulation reaction or its variation.
  • the present inventors are in a sample containing activated protein C, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin and thrombin substrate that is not derived from the sample.
  • a protein S activity measuring reagent, and activated protein C, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin and thrombin substrate not derived from the sample Next, the amount of signal generated from the substrate of thrombin as a result of the reaction by each component described above is measured, and then the amount of signal whose generation is suppressed according to the activity of protein S contained in the sample is obtained.
  • both the conventional method for measuring the activity of protein S and the reagent for measuring the activity of protein S include all the proteins S present in the sample (complexes of protein S and C4b binding protein (binding type), and free protein). S (free form)], that is, the activity of total protein S could not be measured.
  • Protein S Tokushima (PS-K155E gene mutation), which is attracting attention as one of the risk factors for Japanese venous thromboembolism (VTE).
  • protein S molecular abnormalities due to gene mutations such as protein S Tokushima (PS-K155E gene mutation) are classified as protein SII type abnormalities, and the amount of protein S protein secreted into the blood is normal, but protein S S activity decreases.
  • Non-Patent Document 2 Detection of protein S abnormality accompanied by a decrease in protein S activity is considered to be useful for prevention, diagnosis and treatment of diseases such as thrombosis such as venous thromboembolism.
  • this protein S abnormality is difficult to detect simply and accurately with conventional methods and reagents (see Non-Patent Document 2).
  • An object of the present invention is to provide a method for accurately, simply and rapidly detecting protein S abnormality.
  • the present inventors can measure the total protein S activity value and the total protein S protein amount in a sample and compare them to solve the above problem. As a result, the present invention has been completed.
  • this invention consists of the following invention.
  • a method for detecting protein S abnormality a step of measuring a total protein S activity value and a total protein S protein amount in a sample, and a total protein S activity value and a total protein S protein obtained by the measurement
  • a method of detecting protein S abnormality comprising a step of comparing the amount.
  • the total protein S activity value obtained by the measurement is compared with the total protein S protein amount, and when this total protein S activity value and the total protein S protein amount are different, protein S abnormality is present. Or the detection method of protein S abnormality of the said (1) description that there is a suspicion.
  • (3) Comparing the total protein S activity value obtained by measurement and the total protein S protein amount is to obtain a specific activity obtained by dividing the total protein S activity value by the total protein S protein amount, (1) or the method for detecting a protein S abnormality according to (2).
  • the protein S abnormality detection method of the present invention can detect protein S abnormality accurately, simply and quickly.
  • protein S abnormality detection method of the present invention protein S abnormality can be detected easily and accurately, and can be used for prevention, diagnosis and treatment of diseases such as thrombosis.
  • the method for detecting protein S abnormality comprises a step of measuring a total protein S activity value and a total protein S protein amount in a sample, and a total protein S obtained by the measurement. A step of comparing the activity value and the total protein S protein amount.
  • the total protein S activity value is measured for all protein S present in the sample (complexes of protein S and C4b-binding protein (binding type) and free protein S (free type)).
  • the activity is to be measured. That is, in addition to the activity of “free protein S (free form)”, protein S contained in “complex of protein S and C4b binding protein (bound form)” becomes free protein S (free form). In this case, the activity expressed in the case of measurement is also measured.
  • the total protein S protein amount is measured with respect to all protein S present in the sample (complexes of protein S and C4b binding protein (bound type) and free protein S (free type)). It is to measure the amount of protein. In other words, in addition to the amount of “free protein S (free form)”, the amount of protein S contained in “complex of protein S and C4b binding protein (bound form)” is also measured. is there.
  • the method for measuring the total protein S activity value (activity measuring method) and the reagent (activity measuring reagent) are not particularly limited, and the method and reagent capable of measuring the total protein S activity value Anything can be used.
  • the method (measuring method) and the reagent (measuring reagent) for measuring the total protein S protein amount are not particularly limited, and may be any method and reagent capable of measuring the protein amount of total protein S. Anything is acceptable.
  • this comparison method for example, comparing the numerical value of the total protein S activity value obtained by measurement with the numerical value of the total protein S protein amount obtained by measurement,
  • the total protein S activity value obtained by measurement is plotted on the vertical axis (or horizontal axis) of the graph, and the total protein S protein amount obtained by measurement is plotted on the horizontal axis (or vertical axis) of the graph.
  • the specific activity obtained by dividing on the graph or dividing the total protein S activity value obtained by the measurement by the total protein S protein amount obtained by the measurement can be mentioned.
  • the comparison between the total protein S activity value obtained by measurement and the total protein S protein amount can be performed by determining the specific activity obtained by dividing the total protein S activity value by the total protein S protein amount. preferable.
  • the total protein S activity value obtained by measurement is compared with the total protein S protein amount, and the total protein S activity value and the total protein S protein amount are different, It can be assumed that the protein S abnormality is or is suspected.
  • the protein S abnormality is or is suspected. I can do it.
  • the total protein S activity value obtained by measurement is plotted on the vertical axis (or horizontal axis) of the graph, and the total protein S protein amount obtained by measurement is plotted on the horizontal axis (or vertical axis) of the graph.
  • the total protein S activity value and the total protein S protein amount are different from each other, it can be considered that protein S abnormality is present or suspected.
  • the total protein S activity value and the total protein S protein amount are measured for a plurality of people who are known not to have protein S abnormality, and the total protein S activity value and the total protein S protein amount obtained by this measurement are measured as described above. And plot this set (or this set) against a set of points (data) (or an expression representing this set) plotted for a sample of people who are known not to have this protein S disorder. It can also be determined that there is a deviation.
  • the total protein S activity value obtained by measurement and the total protein S protein amount are obtained. A comparison is made, and when the total protein S activity value and the total protein S protein amount deviate, it can be considered that protein S abnormality or suspected.
  • the specific activity obtained by dividing the total protein S activity value obtained by measurement by the total protein S protein amount obtained by measurement is, for example, the total value obtained by measuring the numerical value of the total protein S activity value obtained by measurement. This specific activity can be obtained by dividing by the numerical value of the protein S protein amount.
  • the total protein S activity value obtained by the measurement is plotted on the vertical axis of the graph, and the total protein S protein amount obtained by the measurement is plotted. This specific activity can also be obtained by plotting a graph on the horizontal axis of the graph to create a graph.
  • the specific activity obtained by dividing the total protein S activity value obtained by the measurement as described above by the total protein S protein amount obtained by the measurement was obtained, and the specific activity value was not 1 but was smaller than 1. If it is a value, it can also be determined that there is a divergence.
  • the total protein S activity value and the total protein S protein amount are measured for a plurality of people who are known not to have protein S abnormality, and the total protein S activity obtained by this measurement is obtained from this measurement.
  • the specific activity is determined by dividing by the amount of protein, and contrasted with a set of specific activity values (or an expression representing this set) for samples of people who are known not to have this protein S abnormality, and this set (or If it is far from the expression representing this set), it can be determined that there is a divergence.
  • this set (or an expression representing this set) is compared with a set of specific activity values (or an expression representing this nest) for samples of people who are known not to have protein S abnormality. If they are separated, it is determined that they are deviated, but a range that is twice the standard deviation of the set of specific activity values for samples of people who are known not to have protein S abnormality (more If it is preferably outside this range (three times the standard deviation), it may be determined that the user is separated from the set and deviated.
  • the total protein S activity value obtained by measurement is plotted on the vertical axis of the graph, and the total protein S protein amount obtained by measurement is plotted on the horizontal axis of the graph. As shown in the graph, when it can be determined that the total protein S activity value and the total protein S protein amount are different from the specific activity shown on the graph, the protein S abnormality is or is suspected. There can be.
  • the total protein S activity value and the total protein S protein amount are measured for a plurality of people who are known not to have protein S abnormality, and the total protein S activity value and the total protein S protein amount obtained by this measurement are measured as described above. Plot the specific activity on this graph so that the specific activity is represented on this graph, and the set of specific activity points (data) plotted for the samples of people who are known not to have this protein S disorder (or this If the expression is separated from this set (or an expression representing this set), it is determined that there is a divergence and the protein S abnormality is or is suspected. It can also be.
  • the total protein S activity value and the total protein S protein amount are measured for a plurality of people who are known not to have protein S abnormality, and the total protein S activity value and the total protein S protein amount obtained by this measurement are measured.
  • SD standard deviation
  • the method for measuring the total protein S activity value (activity measurement method) and the reagent (activity measurement reagent) are not particularly limited, Any method and reagent that can measure the activity value of total protein S may be used, but an example of a method for measuring the activity of total protein S in this sample will be described below.
  • the interface is increased during the activation reaction of activated protein C by protein S and during the decomposition reaction of activated blood coagulation factor V by activated protein C having increased activity.
  • an activator is present.
  • a phospholipid composed of phosphatidylcholine, phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine is present during the measurement reaction of total protein S activity.
  • phosphatidylcholine is used at the time of the activated protein C activity increase reaction by protein S and the activated blood coagulation factor V decomposition reaction by the activated protein C having increased activity.
  • a phospholipid consisting of phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine is present.
  • the method for measuring the activity of total protein S in the sample is preferably such that the measurement of the total protein S activity in the sample is performed by a method comprising the following steps (a) to (c).
  • a substrate of activated protein C, surfactant, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin and durombin is brought into contact with the sample.
  • the activity value of the total protein S contained in the sample is obtained from the signal amount whose production is suppressed according to the activity of the total protein S contained in the sample.
  • the measurement of the total protein S activity in the sample is preferably performed by a method including the following steps (a) to (e).
  • Method for measuring the activity of total protein S in a sample As the method for measuring the activity of total protein S in a sample, the method described in the following (1) or (2) can be mentioned, and these methods Etc. are preferably performed.
  • activated protein C activated protein C, surfactant, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V (factor Va; FVa), activated blood coagulation factor X (factor Xa; FXa), prothrombin and Contact the substrate of thrombin with the sample.
  • the contact between these components and the sample may be performed with all the components at one time, and all the reactions in the following reaction system may be performed in one stage (one-step method).
  • the reaction of the following reaction system may be performed in a plurality of stages by dividing the components and performing the contact in a plurality of stages (multi-step method).
  • a sample is brought into contact with at least activated protein C, a surfactant, a phospholipid, and force lucium ions.
  • activated protein C a surfactant, a phospholipid, and force lucium ions.
  • sample In the method for measuring the activity of total protein S in a sample, the sample is a substance that may contain protein S.
  • sample examples include biological samples (samples derived from humans or animals).
  • biological samples include blood, plasma, saliva, sweat, urine, tears, cerebrospinal fluid, ascites, amniotic fluid, and other biological fluids; liver, heart, brain, bone, hair, skin, nails, muscle, nerve tissue, etc. And extracts of organs, tissues, cells and the like.
  • Activated protein C The activated protein C used in the method for measuring the activity of total protein S in the sample can be used without particular limitation regardless of its origin (origin) and preparation method. For example, the thing derived from mammals, such as a human, a cow, or a pig, etc. can be mentioned. Moreover, what was refine
  • activated protein C is brought into contact with the sample, and when protein S is contained in the sample, this activity is present in the presence of phospholipid and calcium ions. Protein C activity is increased. Activated protein C serves as a catalyst for a reaction that decomposes activated blood coagulation factor V in the presence of phospholipids and calcium ions. Thus, the presence of protein S promotes the reaction of activated protein C degrading activated blood coagulation factor V.
  • activated protein C or the like may be performed simultaneously. Further, activated protein C is brought into contact with the sample together with phospholipid, and after being incubated at room temperature or 37 ° C. for at least 1 minute or more, preferably 5 minutes or more, then contacted with activated blood coagulation factor V and calcium ions, Incubation may be followed by a degradation reaction of activated blood coagulation factor V.
  • the concentration of the activated protein C is contacted with the activated blood coagulation factor V, and when the activated blood coagulation factor V is decomposed in the presence of a surfactant, phospholipid and calcium ion, Usually, it is preferably 1 pM to 100 nM. However, in order to obtain high measurement sensitivity, it is preferable that the activated protein C concentration is high. Therefore, the activated protein C concentration is more preferably 10 pM to 10 nM, and more preferably 100 pM to lnM. Particularly preferred.
  • surfactant In the method for measuring the activity of total protein S, it is preferable that a surfactant be present during the measurement reaction of the total protein S activity.
  • surfactant one or more kinds of various surfactants such as a nonionic surfactant, an amphoteric surfactant, an anionic surfactant or a cationic surfactant are appropriately present. You can do it.
  • surfactant examples include sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, decaglycerin fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene glycerin fatty acid ester, polyethylene glycol fatty acid ester, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene.
  • Nonionic surfactants such as phytosterol, phytostanol, polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether, polyoxyethylene alkylphenyl ether, polyoxyethylene castor oil, hydrogenated castor oil or polyoxyethylene lanolin; amphoteric such as betaine acetate Surfactant; or polyoxyethylene alkyl ether sulfate or polyoxyethylene alkyl ether acetate Anionic surfactants, and the like.
  • this surfactant is a nonionic surfactant
  • its HLB Hydrophile Balance
  • HLB Hydrophile Balance
  • amphoteric surfactant AM-301 (lauryldimethylaminoacetic acid betaine aqueous solution) and the like are preferable.
  • anionic surfactant sarcosinate LN [lauroyl sarcosine sodium] etc. are preferable.
  • cationic surfactant CA-2350 [cetyltrimethylammonium chloride] and the like are preferable.
  • the concentration of the surfactant in the measurement reaction of the total protein S activity is not particularly limited, but is preferably 0.00001 to 5% (W / V), preferably 0.0001 to 1% (W / V) is more preferable, 0.001 to 0.1% (W / V) is further preferable, and 0.005 to 0.05% (W / V) is particularly preferable.
  • nonionic surfactants 0.001 to 0.01% (W / V) is very preferable, and for zwitterionic surfactants, 0.001 to 0.01% (W / V) is used. Highly preferred, 0.001-0.1% (W / V) is highly preferred for anionic surfactants and 0.00001-0.001% (W / V) for cationic surfactants. Is highly preferred.
  • the activation of activated protein C by the protein S contained in the sample and the degradation reaction of activated blood coagulation factor V by the activated protein C are performed.
  • the presence of a surfactant is preferred for measuring the activity of total protein S in the sample.
  • Phospholipid (1) General In the method for measuring the activity of total protein S, phospholipid is present during the measurement reaction of total protein S activity.
  • This phospholipid can be used without particular limitation, regardless of its origin (origin) and preparation method. Examples thereof include those derived from mammals such as humans, cows and pigs, those derived from other animals, those derived from plants, those derived from microorganisms, and those synthesized artificially.
  • the concentration at the time of the presence of phospholipid is usually preferably 0.03 ⁇ M to 100 ⁇ M, more preferably 0.3 ⁇ M to 50 ⁇ M, and 3 ⁇ M to 30 ⁇ M. Is particularly preferred.
  • the phospholipid examples include glycerophospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol and diphosphatidylglycerol, and sphingophospholipids such as sphingomyelin.
  • glycerophospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol and diphosphatidylglycerol
  • sphingophospholipids such as sphingomyelin.
  • the phospholipid which consists of a phosphatidylcholine, a phosphatidylserine, and a phosphatidylethanolamine exist in the measurement reaction of total protein S activity.
  • the composition of these three types of phospholipids is a composition ratio of phosphatidylethanolamine of 10% (W / V) or more, and The composition ratio of phosphatidylserine is preferably 20% (W / V) or more.
  • the composition ratio of phosphatidylethanolamine is preferably 30% (W / V) or more, and the composition ratio of phosphatidylserine is preferably 30% (W / V) or more.
  • the activated protein C is activated during the reaction of increasing the activity of activated protein C by protein S contained in the sample.
  • phospholipids necessary for the activity raising reaction of activated protein C and the degradation reaction of activated blood coagulation factor V are present.
  • This phospholipid can be used without particular limitation regardless of its origin (origin) and preparation method. Examples thereof include those derived from mammals such as humans, cows and pigs, those derived from other animals, those derived from plants, those derived from microorganisms, and those synthesized artificially.
  • the concentration of phospholipid in the presence of the activated protein C activity increasing reaction and the activated blood coagulation factor V decomposition reaction is preferably 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, and preferably 1 ⁇ M to 50 ⁇ M. More preferably, it is preferably 10 ⁇ M to 30 ⁇ M.
  • the phospholipid examples include glycerophospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol and diphosphatidylglycerol, and sphingophospholipids such as sphingomyelin.
  • glycerophospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol and diphosphatidylglycerol
  • sphingophospholipids such as sphingomyelin.
  • the composition of these three types of phospholipids is a composition ratio of phosphatidylethanolamine of 10% (W / V) or more, and The composition ratio of phosphatidylserine is preferably 20% (W / V) or more.
  • the composition ratio of phosphatidylethanolamine is preferably 30% (W / V) or more, and the composition ratio of phosphatidylserine is preferably 30% (W / V) or more.
  • Phospholipids used for catalytic reaction by activated blood coagulation factor X In the method for measuring the activity of total protein S, from prothrombin catalyzed by activated blood coagulation factor X in the presence of activated blood coagulation factor V In the reaction for generating thrombin, phospholipid necessary for the reaction is present.
  • This phospholipid can be used without particular limitation regardless of its origin (origin) and preparation method. Examples thereof include those derived from mammals such as humans, cows and pigs, those derived from other animals, those derived from plants, those derived from microorganisms, and those synthesized artificially.
  • the reaction for generating thrombin from prothrombin is usually preferably 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, more preferably 0.5 ⁇ M to 50 ⁇ M, and more preferably 1 ⁇ M to 10 ⁇ M. It is particularly preferred.
  • the phospholipid examples include glycerophospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol and diphosphatidylglycerol, and sphingophospholipids such as sphingomyelin.
  • glycerophospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol and diphosphatidylglycerol
  • sphingophospholipids such as sphingomyelin.
  • the phospholipid in the reaction for generating thrombin from the prothrombin, the presence of a phospholipid composed of phosphatidylcholine and phosphatidylserine, or phosphatidylcholine, phosphatidylserine, and phosphatidylethanolamine has the effect of promoting the reaction. This is preferable because it increases.
  • the composition of these two types of phospholipids is such that the composition ratio of phosphatidylcholine is 85% (W / V) to 50% (W / V),
  • the composition ratio of phosphatidylserine is preferably 15% (W / V) to 50% (W / V).
  • the composition ratio of phosphatidylcholine is 80% (W / V) to 70% (W / V)
  • the composition ratio of phosphatidylserine is 20% (W / V) to 30% (W / V). Is preferred.
  • the composition of the three types of phospholipids is a composition ratio of phosphatidylethanolamine of 10% (W / V) or more, and The composition ratio of phosphatidylserine is preferably 20% (W / V) or more.
  • the composition ratio of phosphatidylethanolamine is preferably 30% (W / V) or more, and the composition ratio of phosphatidylserine is preferably 30% (w / V) or more.
  • the phospholipid used in the above-mentioned activity-increasing reaction of activated protein C and the decomposition reaction of activated blood coagulation factor V may be used as it is. it can.
  • the composition of a suitable phospholipid differs depending on each reaction, and therefore it is preferable to use a phospholipid having a composition suitable for each reaction in the presence of the reaction.
  • a phospholipid having a composition suitable for the activated protein C activity increase reaction and the activated blood coagulation factor V decomposition reaction previously added is the prothrombin. Even if it coexists with a phospholipid having a composition more suitable for the reaction for generating thrombin, the method for measuring the activity of total brotein S and the reagent for measuring the activity in the sample of the present invention have no problem.
  • the activated blood coagulation factor V is decomposed by activated protein C when the activated protein C activity is increased by protein S contained in the sample.
  • Calcium ions are present at times and during the reaction of generating thrombin from prothrombin by activated blood coagulation factor X and activated blood coagulation factor V.
  • calcium ion not only calcium ion itself but also a compound containing calcium ion such as calcium salt can be used without particular limitation.
  • Examples of the compound containing calcium ions include calcium fluoride, calcium chloride, calcium bromide, calcium iodide, calcium sulfate, calcium nitrate, calcium acetate, calcium lactate, and calcium cyanide.
  • the concentration of this calcium ion is determined during the activation reaction of activated protein C by protein S contained in the sample, during the degradation reaction of activated blood coagulation factor V by activated protein C, and In the reaction for generating thrombin from prothrombin by activated blood coagulation factor X and activated blood coagulation factor V, it is usually preferably 0.1 mM to 100 mM, particularly preferably 1 mM to 10 mM. .
  • Activated blood coagulation factor V The activated blood coagulation factor V (factor Va; FVa) used in the method for measuring the activity of total protein S in a sample is not particularly limited, regardless of its origin (origin) or preparation method. Can be used. For example, the thing derived from mammals, such as a human, a cow, or a pig, etc. can be mentioned. Moreover, what was refine
  • activated blood coagulation factor V is degraded by activated protein C in the presence of a surfactant, phospholipid and calcium ions.
  • a surfactant phospholipid and calcium ions.
  • activated blood coagulation factor V promotes the reaction of generating thrombin from prothrombin, which is catalyzed by activated blood coagulation factor X in the presence of phospholipids and calcium ions.
  • the concentration at which this activated blood coagulation factor V is used is brought into contact with activated protein C to cause a reaction to decompose the activated blood coagulation factor V in the presence of a surfactant, phospholipid and calcium ions.
  • the amount be 0.5 pM to 5 nM.
  • the activated blood coagulation factor V concentration is more preferably 5 pM to 500 pM, and particularly preferably 20 pM to 200 pM.
  • the activated blood coagulation factor X (factor Xa; FXa) used in the method for measuring the activity of total protein S in the sample is not particularly limited, regardless of its origin (origin) or preparation method. Can be used. For example, the thing derived from mammals, such as a human, a cow, or a pig, etc. can be mentioned. Moreover, what was refine
  • activated blood coagulation factor X catalyzes a reaction that generates thrombin from prothrombin in the presence of phospholipids and calcium ions. This reaction of generating thrombin from prothrombin by activated blood coagulation factor X is promoted by the presence of activated blood coagulation factor V.
  • the concentration is usually in contact with activated blood coagulation factor V, prothrombin, etc., and when thrombin is produced from prothrombin in the presence of phospholipid and calcium ion, It is preferably 0.1 pM to 300 pM.
  • the activated blood coagulation factor X concentration is more preferably 1 pM to 100 pM, and particularly preferably 10 pM to 50 pM. preferable.
  • Prothrombin used in the method for measuring the activity of total protein S in a sample can be used without particular limitation regardless of its origin (origin) and preparation method.
  • the thing derived from mammals such as a human, a cow, or a pig, etc. can be mentioned.
  • purified and prepared from body fluids or organs, such as plasma, or what was prepared by genetic engineering operation, cell engineering operation, cell culture operation, etc. can be mentioned.
  • prothrombin becomes a substrate for a reaction catalyzed by activated blood coagulation factor X in the presence of phospholipids and calcium ions, and becomes thrombin.
  • This reaction of generating thrombin from prothrombin by activated blood coagulation factor X is promoted by the presence of activated blood coagulation factor V.
  • the concentration of brothrombin is usually in contact with activated blood coagulation factor V and activated blood coagulation factor X, and when thrombin is produced from prothrombin in the presence of phospholipid and calcium ions, It is preferably 1 nM to 50 ⁇ M, more preferably 50 nM to 5 ⁇ M, and particularly preferably 100 nM to 1 ⁇ M.
  • thrombin substrate used in the method for measuring the activity of total protein S in the sample is one that generates some signal by receiving a catalytic action as a protease of thrombin (as a substrate for thrombin), or in addition to the catalytic reaction by thrombin Furthermore, any signal can be used without particular limitation as long as other signals are generated by continuing other reactions.
  • This kind of signal is generated, but it is possible to detect the generation or change of a signal (signal) in optical, electrical, magnetic, or other energy by being catalyzed by thrombin. Means that.
  • Examples include those in which the absorbance, transmittance, or fluorescence intensity changes due to the catalytic action of thrombin, in which the light absorption curve changes, or in which light is emitted.
  • Examples of this include peptides or proteins bound to compounds that change absorbance, transmittance or fluorescence intensity, or light absorption curves when released, or peptides bound to compounds that emit light when released or Examples thereof include proteins and the like, and substances that release the compound from the peptide or protein by the catalytic action of thrombin.
  • thrombin is catalyzed, and when the compound is liberated, it can be detected as absorbance, transmittance or fluorescence intensity, light absorption curve change or light emission, etc.
  • the enzyme activity can be determined by measuring the amount of the generated signal (absorbance, transmittance or fluorescence intensity, change in light absorption curve or light emission, etc.).
  • Examples of such a substance include “HD-phenylalanyl-L-pipecolyl-L-arginyl-p-nitroanilide dihydrochloride” [Test Team (registered trademark) chromogenic substrate S-2238] (manufacturer : Chromogenix-Instrumentation Laboratories [Italy], distributor: Sekisui Medical [Japan]], "HD-Hexahydrotyrosyl-L-alanyl-L-arginyl-p-nitroanilide diacetate” [SPECTROZYME (registered trademark) TH] (AMERICAN DIAGNOSTICA, Cosmo Bio), “Benzoyl-phenylalanyl-valinyl-arginyl-p-nitroanilide hydrochloride” [Thrombin Substrate I, Colorimetric] (CALBIOCHEM, Cosmo Bio), “Tosyl-Glycyl-Prolyl” Arginyl-p-nitroanilide "
  • Contacting the activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X and prothrombin, etc., and contacting the generated thrombin with the substrate of this thrombin may be performed simultaneously or separately. The steps may be performed separately.
  • the thrombin produced is brought into contact with the thrombin substrate, and incubated at least at least 1 minute, preferably at least 5 minutes at room temperature or 37 ° C. to generate a signal from the thrombin substrate.
  • the concentration when this thrombin substrate is used is preferably preferably 5 ⁇ M to 100 mM, particularly preferably 50 ⁇ M to 10 mM, when the thrombin substrate is catalyzed by thrombin.
  • the substrate of thrombin in the method for measuring the activity of total protein S in a sample generates a signal by being catalyzed by thrombin generated from prothrombin.
  • the amount of signal generated from the thrombin substrate is measured.
  • the amount of this signal is the amount of the signal whose production is suppressed according to the activity value of total protein S in the sample.
  • Measurement of the generated signal amount may be appropriately performed according to the signal. For example, when the signal is a change in absorbance, transmittance, fluorescence intensity, light absorption curve or light emission, the absorbance, transmittance, fluorescence intensity, emission intensity, or the like is measured.
  • the substrate of thrombin is the above-mentioned “HD-phenylalanyl-L-pipecolyl-L-arginyl-p-nitroanilide dihydrochloride”, “HD-hexahydrotyrosyl- L-alanyl-L-arginyl-p-nitroanilide diacetate "," benzoyl-phenylalanyl-valinyl-arginyl-p-nitroanilide hydrochloride "or” tosyl-glycyl-prolyl-arginyl-p- "
  • the absorption of light that p-nitroaniline liberated by the catalytic action of thrombin has around 405 nm wavelength is at or near 405 nm wavelength.
  • the absorbance measurement may be a single wavelength measurement of only the main wavelength, or a dual wavelength measurement in which measurement is performed at the main wavelength and the sub wavelength.
  • the absorbance measurement may be performed by the end point method or the rate method.
  • Activity value of total protein S contained in the sample In the method for measuring the activity of total protein S in the sample, if protein S is contained in the sample, the activity of activated protein C increases and the activity is increased. The decomposition reaction of activated blood coagulation factor V is promoted, and the abundance (concentration) of activated blood coagulation factor V decreases. Then, since the effect of activating blood coagulation factor V to the reaction of generating thrombin from prothrombin catalyzed by activated blood coagulation factor X is reduced, the reaction of generating thrombin from prothrombin is suppressed.
  • generation of thrombin reduces, the reaction which produces a signal from the substrate of thrombin which this thrombin catalyzes is also suppressed, and the quantity of the signal to generate
  • the activity value of total protein S contained in the sample may be obtained as appropriate after measuring the amount of signal in which this generation is suppressed, but can be performed as follows, for example.
  • measurement operation is performed on at least one sample whose activity value of total protein S is known and a sample whose physiological protein S activity value is known to be “zero” (such as physiological saline or pure water).
  • a calibration curve is created by expressing the relationship between the generated signal amount (signal amount whose generation is suppressed) and the activity value of the total protein S contained in the sample in a mathematical expression or a graph. This calibration curve represents the relationship between the degree of inhibition of signal generation and the activity value of total protein S contained in the sample.
  • the measurement operation is performed in the same manner as described above for a sample whose activity value of total protein S is unknown, and the amount of signal generated (the amount of signal with suppressed generation) is obtained.
  • This signal amount is applied to the calibration curve, and the corresponding activity value of total protein S is determined.
  • the activity value of the total protein S of the sample can be obtained from the amount of signal generated in the sample whose total protein S activity value is unknown (the amount of signal whose generation is suppressed).
  • the calibration curve represents the relationship between the amount of signal (the amount of signal with suppressed generation), that is, the degree of inhibition of signal generation, and the activity value of total protein S contained in the sample.
  • the amount of signal in the calibration curve (the amount of signal whose generation is suppressed) may be the measured signal amount itself, or may be a numerical value calculated based on the value of the signal amount.
  • the calibration curve may represent a relationship between a numerical value calculated based on the measured signal amount value and the activity value of total protein S contained in the sample. Even in this case, the numerical value calculated based on the value of the measured signal amount corresponds to the signal amount whose generation is suppressed.
  • Examples of the numerical value calculated based on the measured signal amount value include, for example, a numerical value of a change amount of the measured signal amount per unit time, or a first derivative of the measured signal amount value with respect to time. Or a numerical value calculated by second-order differentiation.
  • the amount of change per minute in the absorbance obtained by measurement, or the rate of change in absorbance obtained by first derivative of the absorbance obtained by measurement with respect to time, or the absorbance obtained by measurement in time can be exemplified.
  • proteins such as human serum albumin (HSA), bovine serum albumin (BSA) or albumin such as ovalbumin, casein, or gelatin are present during the activity measurement reaction. It is preferable.
  • the concentration at which this protein is present is usually preferably 0.1 ⁇ M to 1 mM.
  • Salt In the method for measuring the activity of total protein S in a sample, a salt such as a halogen element and an alkali metal salt or a halogen element and an alkaline earth metal salt is preferably present during the activity measurement reaction.
  • Examples of the salt of halogen element and alkali metal include sodium chloride, potassium chloride, sodium fluoride, potassium fluoride, sodium bromide or potassium bromide.
  • examples of the salt of a halogen element and an alkaline earth metal include magnesium chloride, magnesium fluoride, and magnesium bromide.
  • the concentration at which this salt is present is usually preferably 5 mM to 1 M, particularly preferably 50 mM to 250 mM.
  • Diluent In the method for measuring the activity of total protein S in a sample, it is preferable for the activity measurement reaction to be performed after the sample is diluted with a diluent for the activity measurement of total protein S in the sample.
  • the pH of the diluted solution is not particularly limited, but is preferably in the pH range of pH 6.0 to pH 10.0 (20 ° C.), preferably in the pH range of pH 6.5 to pH 8.5 (20 ° C.). More preferably.
  • this dilution liquid in order to maintain pH in the said pH range, it is preferable to make this dilution liquid contain or contain the buffer which has a buffer capacity in the said pH range suitably.
  • components such as proteins, salts, surfactants, preservatives, stabilizers, activators, or saccharides can be appropriately contained in the diluting solution as necessary.
  • diluent examples include water, physiological saline, phosphate buffered physiological saline, and buffer solution.
  • the dilution ratio when the sample is diluted with this diluent is not particularly limited, but is preferably 2 to 60 times, preferably 5 to 40 times for measuring the activity of total protein S in the sample. More preferred is 10 to 20 times.
  • the above activity measurement reaction is preferably carried out in the range of pH 6.0 to pH 10.0 (20 ° C.), and pH 6.5 to pH 8.5 (20 ° C.). It is particularly preferable to carry out within the range.
  • a buffer having a buffering capacity is appropriately present in the pH range in order to keep the pH in the activity measurement reaction in the pH range.
  • components other than the above-described components such as preservatives, stabilizers, activators, or saccharides, may be used as necessary for the activity measurement reaction. Sometimes it can exist.
  • the activity of the total protein S in the sample may be measured by a method or using an apparatus such as an automatic analyzer.
  • the above-described activity measurement reaction may be carried out by bringing all components into contact with the sample at one time and performing all the reactions in one stage.
  • the activity measurement reaction may be divided into a plurality of stages by dividing the components and performing the contact in a plurality of stages (multi-step method). There are no particular restrictions on the division into multiple stages, but it can be carried out, for example, as follows.
  • Method for measuring protein amount of total protein S in a sample As described above, in the present invention, the method (measuring method) and reagent (measuring reagent) for measuring the total protein S protein amount are not particularly limited. Any method and reagent can be used as long as it can measure the protein amount of protein S. Hereinafter, an example of a method for measuring the protein amount of total protein S in this sample will be described.
  • This is a method for measuring the amount of protein of total protein S in a sample.
  • the sample is brought into contact with a carrier particle on which an antibody against protein S is immobilized, and an antigen-antibody reaction between the antibody and protein S contained in the sample.
  • a carrier particle on which an antibody against protein S is immobilized In the method of measuring the total amount of protein S protein in the sample by measuring the generated aggregate, it is preferable that C4b binding protein is present during the antigen-antibody reaction.
  • the carrier particles are preferably latex particles.
  • the measurement of the total protein S protein amount in the sample may be performed by a method including the following steps (a) and (b). preferable.
  • B A step of contacting the mixed solution with carrier particles on which an antibody against protein S is immobilized, and measuring an aggregate produced by an antigen-antibody reaction between the antibody, a complex of protein S and a C4b binding protein.
  • the antibody to protein S refers to an antibody that can bind to protein S (anti-protein S antibody).
  • anti-protein S antibody examples include monoclonal antibodies (which can bind to protein S), polyclonal antibodies, antisera containing polyclonal antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies or single chain antibodies (scFv), and these And the like [Fab, F (ab ′) 2 , Fab ′, Fv, sFv, dsFv, etc.].
  • a derivative obtained by binding a protein or a low molecular weight compound to the antibody or antibody fragment can also be used.
  • the origin of the anti-protein S antibody is not particularly limited, and for example, mammals (mouse, rabbit, rat, sheep, goat, horse, etc.) or birds (chicken, quail, pheasant, ostrich, duck etc.) Etc.
  • the carrier particle in the method for measuring the protein amount of total protein S in a sample, can be used without particular limitation as long as it can immobilize the anti-protein S antibody.
  • a carrier particle used in a measurement reagent and a measurement method for measuring the total protein S protein amount in a sample using an antigen-antibody reaction between protein S and anti-protein S antibody, or a measurement method. Any carrier particles may be used.
  • the material of the carrier particles is not particularly limited.
  • Copolymer polyacrolein, styrene-methacrylic acid copolymer, styrene-glycidyl (meth) acrylic acid copolymer, styrene-butadiene copolymer, methacrylic acid polymer, acrylic acid polymer, gelatin, silica, alumina, Examples thereof include carbon black, metal compounds, metals, ceramics, and magnetic materials.
  • carrier particles examples include latex particles, metal colloid particles, liposomes, microcapsules, and red blood cells.
  • the carrier particles are preferably latex particles.
  • the anti-protein S antibody can be immobilized on carrier particles by a known method such as physical adsorption, chemical binding, or a combination thereof.
  • a known method such as physical adsorption, chemical binding, or a combination thereof.
  • the anti-protein S antibody and the carrier particles are mixed and brought into contact with each other in a solution such as a buffer solution according to a known method, or the anti-protein S antibody dissolved in the buffer solution or the like is used. It can be performed by contacting with carrier particles.
  • the surface of the carrier particles immobilized with the anti-protein S antibody is treated with bovine.
  • Blocking treatment of carrier particles (masking treatment) by treatment with a known method such as serum albumin (BSA), protein such as casein, gelatin, ovalbumin or its salt, surfactant or nonfat dry milk ) May be performed.
  • BSA serum albumin
  • protein such as casein, gelatin, ovalbumin or its salt, surfactant or nonfat dry milk
  • the size (particle size) of carrier particles such as latex particles is not particularly limited. Absent. However, reasons such as the degree to which the carrier particles on which the anti-protein S antibody is immobilized generate an aggregate (aggregate) with protein S contained in the sample, and the ease of measurement of the generated aggregate More preferably, the carrier particle size (particle diameter) has an average diameter (average particle diameter) of preferably 0.01 ⁇ m to 10 ⁇ m, and more preferably 0.04 ⁇ m to 1 ⁇ m. In the method for measuring the protein amount of protein S in a sample, two or more types of carriers having different sizes (particle diameters), materials, shapes, etc. may be used as the carrier particles.
  • the concentration of the carrier particles immobilized with the anti-protein S antibody during the measurement reaction is as described above. Since the optimum concentration differs depending on various conditions such as the distribution density of the specific binding substance on the carrier surface, the size (particle size) of the carrier particles, and the mixing ratio of the sample and the measuring reagent, it cannot be generally stated.
  • the anti-protein S antibody is usually mixed with the anti-protein S antibody immobilized on the carrier particles and the protein S contained in the sample during the measurement reaction in which the antigen-antibody reaction is performed.
  • the concentration of the carrier particles on which the S antibody is immobilized is 0.001 to 1% (W / V) in the reaction mixture during the measurement reaction. It is preferable that the measurement reagent contains carrier particles on which the anti-protein S antibody having such a concentration in the solution is immobilized.
  • carrier particles on which an anti-protein S antibody is immobilized are converted to proteins such as bovine serum albumin (BSA), human serum albumin (HSA), casein or a salt thereof; Various metal ions such as ions; Various salts such as calcium salts; Various sugars; Nonfat dry milk; Various animal sera such as normal rabbit serum; Various preservatives such as sodium azide or antibiotics; Activating substances; Coexist with one or more kinds of non-specific reaction-inhibiting substances; or various surfactants such as nonionic surfactants, amphoteric surfactants or anionic surfactants; You may let them.
  • the concentration when the above substances coexist is not particularly limited, but is preferably 0.001 to 10% (W / V), and particularly preferably 0.01 to 5% (W / V). .
  • C4b binding protein In the method for measuring the protein amount of total protein S in a sample, it is preferable that a C4b binding protein is present.
  • the C4b binding protein is a high-molecular glycoprotein produced by hepatocytes or macrophages and specifically binds protein S in a one-to-one relationship to form a complex.
  • the C4b binding protein used in the method for measuring the protein amount of total protein S in a sample can be used without any particular limitation regardless of its origin (origin) or preparation method.
  • the thing derived from mammals such as a human, a cow, or a pig, etc. can be mentioned.
  • purified and prepared from body fluids or organs, such as plasma, or what was prepared by genetic engineering operation, cell engineering operation, cell culture operation, etc. can be mentioned.
  • the concentration at which the C4b binding protein is present in the measurement reagent for the total protein S protein is determined by the C4b binding in the measurement reaction solution after mixing the sample and the measurement reagent. It is preferable to set the ratio of the protein to the free protein S contained in the sample to be 0.9 or more (C4b binding protein / free protein S ⁇ 0.9).
  • the C4b binding protein is present in the reagent for measuring the total protein S protein amount.
  • This C4b binding protein is mixed with an anti-protein S antibody immobilized on carrier particles and the protein contained in the sample. Any method can be used as long as it can be present in the above-mentioned reagent for measuring the amount of protein S in the measurement reaction in which the antigen-antibody reaction with S is performed.
  • an anti-protein S antibody immobilized on carrier particles is prepared by preparing a reagent containing the above-mentioned C4b binding protein in a buffer and mixing with a reagent containing carrier particles on which anti-protein S antibody is immobilized.
  • the C4b binding protein may be present during a measurement reaction in which an antigen-antibody reaction is performed with protein S contained in the sample.
  • both a “complex of protein S and C4b binding protein (binding type)” and “free protein S (free type)” exist in the sample of a healthy person.
  • the C4b binding protein is mixed with and brought into contact with the sample, so that the free protein S contained in the sample forms a complex with the C4b binding protein. That is, all of the protein S in the sample is a “complex of protein S and C4b binding protein (binding type)”.
  • the protein amount of all the protein S [complex of protein S and C4b binding protein (binding type) and free protein S (free type)] That is, it is possible to measure the protein amount of the total protein S.
  • sample in the method for measuring the amount of protein of total protein S in a sample, is a sample that may contain protein S and is intended to measure the presence or absence or content (concentration) of protein S.
  • samples include, for example, human or animal blood, serum, plasma, saliva, sweat, urine, tears, cerebrospinal fluid, amniotic fluid, ascites fluid, or liver, heart, brain, bone, hair, skin, Examples include organs such as nails, muscles, and nerve tissues, extracts of tissues or cells, and the like that may contain protein S.
  • the measuring method of the protein amount of the total protein S in the sample is the aggregation produced by the antigen-antibody reaction between the “antibody against protein S” immobilized on the carrier particles and the “protein S” contained in the sample.
  • a C4b binding protein is present during the antigen-antibody reaction.
  • the measurement operation in the method for measuring the protein amount of total protein S in a sample can be performed according to a known measurement operation.
  • This measurement may be performed by a method or using an apparatus such as an analyzer.
  • this measurement may be performed by a one-step method (one-reagent method) or a method performed by a plurality of operation steps such as a two-step method (two-reagent method).
  • First reagent buffer containing C4b binding protein
  • Second reagent buffer containing latex particles on which an antibody against protein S is immobilized
  • a certain amount of a sample such as plasma and a certain amount of the first reagent are mixed and allowed to stand at a certain temperature for a certain time.
  • the mixing ratio (quantity ratio) of a sample and a 1st reagent suitably.
  • the temperature at the time of standing is preferably a constant temperature within a range of room temperature (1 to 30 ° C.) or slightly warm (30 to 40 ° C.) (for example, 37 ° C. or the like).
  • free protein S contained in the sample forms a complex with the C4b binding protein. That is, all of the protein S in the sample is a “complex of protein S and C4b binding protein (binding type)”.
  • the temperature at the time of standing is preferably a constant temperature within a range of room temperature (1 to 30 ° C.) or temperature collection (30 to 40 ° C.) (for example, 37 ° C. or the like).
  • the standing time is preferably a fixed time of 1 minute or more and 10 minutes or less, and more preferably a fixed time of 3 minutes or more and 5 minutes or less.
  • the reaction mixture is irradiated with light, and the transmitted light intensity at an appropriate wavelength, which is a signal generated by the aggregates of the latex particles generated, is decreased (increase in absorbance). ) Or by measuring the increase in scattered light intensity, the amount of the aggregate produced, that is, the amount of total protein S in the sample is determined.
  • Example 1 Comparison of activity value of total protein S and protein amount of total protein S
  • Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Japan) 0.06% (W / V) Bovine serum albumin (BSA) 0.1% (W / V) Sodium chloride 0.1M Trisodium citrate 10.6 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
  • Activated protein C purified human activated protein C; Enzyme Research Laboratories, Inc., USA
  • Surfactant Phospholipid Calcium chloride 2.5 mM Bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA) 0.1. % (W / V) Sodium chloride 0.1M Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
  • the surfactant contained Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan) so as to have a concentration of 0.006% (W / V).
  • Phospholipids include phosphatidylserine (porcine brain phosphatidylserine; PS; DOOSAN Serial Research Laboratories, Korea) 0.4 mg, phosphatidylcholine (porcine liver phosphatidylcholine; PC; DOOSAN Serial Research Laboratories, Korea) 0.4 mg, 0.4 mg of ethanolamine (porcine liver phosphatidylethanolamine; PE; DOOSAN Secondary Research Laboratories, Korea) was collected in each test tube, and after evaporation of chloroform as a solvent with an evaporator, distilled water was added and vigorously added for 1 minute.
  • Phospha prepared by sonication at 60 ° C for 10 minutes after stirring The composition ratio of dilserine, phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine is 1: 1: 1 (that is, 33.33% (W / V): 33.33% (W / V): 33.33% (W / V)). Phospholipids were included to a concentration of 24 ⁇ M.
  • Second Reagent The following components were dissolved in pure water so that each concentration was as described, and the pH was adjusted to 8.0 (20 ° C.) to prepare a second reagent.
  • Activated blood coagulation factor V purified human activated blood coagulation factor V; Haematologic Technologies, Inc., USA
  • BSA Bovine serum albumin
  • W / V Sodium chloride 0.1M Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
  • the surfactant contained Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Japan) so as to have a concentration of 0.006% (W / V).
  • Activated blood coagulation factor X purified bovine activated blood coagulation factor X; New England Biolabs, Inc, USA
  • 50 pM Prothrombin purified human prothrombin; Enzyme Research Laboratories, Inc., USA
  • 738 nM Test Team registered trademark
  • chromogenic substrate S-2238 thrombin substrate [chromogenic substrate for thrombin]; manufacturer: Chromogenix-Instrumentation Laboratories [Italy], distributor: Sekisui Medical [Japan] 750 ⁇ M Phospholipid calcium chloride 5.0 mM Bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA) 0.1% (W / V) Sodium chloride 0.15M Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
  • Phospholipids include phosphatidylserine (porcine brain phosphatidylserine; PS; DOOSSAN Serious Research Laboratories, Korea) 0.6 mg, phosphatidylcholine (porcine liver phosphatidylcholine; PC; DOOSAN Serious Research Laboratories, Korea) 0.4 mg, 1.0 mg of ethanolamine (pig liver phosphatidylethanolamine; PE; DOOSAN Serial Research Laboratories, Korea) was collected in a test tube, and after evaporation of chloroform as a solvent with an evaporator, distilled water was added for 1 minute. After vigorous stirring, phosphine prepared by sonication at 60 ° C. for 10 minutes 6.
  • a phospholipid having a composition ratio of tidyserine, phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine of 3: 2: 5 (that is, 30% (W / V): 20% (W / V): 50% (W / V)); It contained so that it might become a density
  • Plasma of 211 healthy people Seven patients who have been found to be PS-K155E heterozygote (protein S Tokushima, which is one of the abnormalities of protein S), which is a protein S gene mutation Plasma (3) One plasma known to be PS-K155E homozygote (Protein S Tokushima, one of the abnormalities of Protein S), a genetic mutation of Protein S (4) Protein S Plasma of one who has been found to be a C206F heterozygote (a protein S abnormality)
  • Each of the two samples was diluted with the dilution liquid of (1) described above at a dilution ratio of 15 times.
  • a sample with a known total protein S activity value is measured in advance as described above, and the change in absorbance per minute of the measured absorbance change (reaction time course) after addition of the third reagent is expressed as time.
  • a calibration curve was prepared by obtaining a linear equation (differential line) for the curve and plotting the slope of this line against this known total protein S activity value.
  • the absorbance change amount per minute of the absorbance change (reaction time course) after the addition of the third reagent, obtained by measuring the sample of 2 as described in 3 above, is expressed linearly (differentiated) with respect to time.
  • a straight line) was obtained, and the slope of this straight line was applied to the calibration curve to calculate the activity value of total protein S in the sample. That is, the acceleration of change in absorbance (second derivative of absorbance) was obtained from the absorbance obtained by measurement, and applied to a calibration curve to calculate the activity value of total protein S in the sample.
  • Second reagent (a) Preparation of anti-protein S antibody
  • the present inventors prepared anti-protein S antibody according to a conventional method using purified free protein S as an immunizing antigen.
  • a hybridoma producing a monoclonal antibody that specifically binds to a site other than the binding site of protein S to the C4b binding protein was screened to obtain a mouse / mouse hybridoma (strain 9H6).
  • mice anti-protein S monoclonal antibody produced from this hybridoma 9H6 strain was dissolved in 0.5 mL of sodium phosphate buffer (pH 7.5). To this, 0.01 mL of N, N-dimethylformamide in which 0.6 mg of S-acetylmercaptosuccinic anhydride was dissolved was added and incubated at room temperature for 30 minutes.
  • the mercapto-succinylated mouse anti-protein S monoclonal antibody prepared in (a) above was added to 1.2 mL of the latex particle suspension that was allowed to stand on ice for 10 minutes at a concentration of 0.083 g / dL in a 50 mM MES-HCl buffer.
  • the liquid [pH 6.0 (20 degreeC)] 1.8mL mixed liquid was added, and it stirred at 4 degreeC overnight.
  • the precipitate was suspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0 (20 ° C.)) containing 0.8% BSA and left at 37 ° C. for 3 hours. The blocking process was performed.
  • Measurement and calculation of the amount of total protein S in the sample Measurement procedure (a) The measurement was performed using a Toshiba-120FR automatic analyzer (manufactured by Toshiba Medical Systems). First, 3 ⁇ L of the sample 2 was added to a measurement cell (cuvette). Next, 100 ⁇ L of the first reagent (1) was added to these measurement cells (cuvettes) and mixed. These measurement cells (cuvettes) were allowed to stand at 37 ° C. Thereby, the complex of the free protein S contained in the sample and the C4b binding protein in the first reagent was formed. That is, all the protein S contained in the sample became a “complex of protein S and C4b binding protein (binding type)”.
  • FIG. 1 is a diagram comparing the measurement result of the activity value of total protein S in the sample in I and the measurement result of the protein amount of total protein S in the sample in II.
  • the horizontal axis (x) represents the measurement result of the protein amount of total protein S in the sample by the latex turbidimetric method of II. The unit of this measured value is “ ⁇ g / mL”.
  • the vertical axis (y) represents the measurement result of the activity value of total protein S in the sample in I. The unit of this measured value is “ ⁇ g / mL equivalent”.
  • total protein S total protein S
  • Activity value / total protein S protein amount was determined.
  • the average value and standard deviation (SD) of the specific activity of protein S of the plasma samples of 211 healthy people were calculated, and the range of the mean ⁇ 2SD (0.98 ⁇ 0.26) was determined. Since there were 10 samples out of this range, 201 samples of healthy persons excluding these 10 samples were obtained again from the measurement result of the activity value of total protein S and the measurement result of the protein amount of total protein S.
  • the average value and standard deviation of the specific activity of protein S (total protein S activity value / total protein S protein amount) were calculated, and the range of mean ⁇ 2SD (0.99 ⁇ 0.20) and mean ⁇ 3SD (0. 99 ⁇ 0.30).
  • this figure also represents the specific activity which divided
  • the activity value of total protein S in the sample and the protein amount of total protein S in the sample were measured, and the activity value of total protein S and the protein amount of total protein S obtained by this measurement were determined as specific activity. It was confirmed that abnormalities of protein S such as mutations in the protein S gene can be detected by comparing the values obtained by, for example.
  • FIG. 1 seven plasma samples that have been found to be PS-K155E heterozygotes (one of the abnormalities of protein S), which is a genetic mutation of protein S in 2 (2) of I above Is indicated by “ ⁇ ”.
  • one of the plasma samples known to be a C206F heterozygote one of protein S abnormalities
  • I-2 (4) protein S gene mutation of I-2
  • the activity value of total protein S in the sample and the protein amount of total protein S in the sample are measured, and the specific activity is obtained from the activity value of total protein S and the protein amount of total protein S obtained by this measurement. It was also confirmed from the comparison results of nine samples of these protein S gene mutations that protein S abnormalities such as protein S gene mutations can be detected by comparing the above.
  • the protein S abnormality detection method of the present invention can detect protein S abnormality accurately, simply and quickly.
  • protein S abnormality detection method of the present invention protein S abnormality can be detected easily and accurately, and can be used for prevention, diagnosis and treatment of diseases such as thrombosis.

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Abstract

　プロテインＳ異常症を正確、簡便かつ迅速に検出する方法を提供する。　本発明のプロテインＳ異常症の検出方法は、試料中の総プロテインＳ活性値及び総プロテインＳタンパク質量を測定する工程、及び、前記測定により得た総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量とを比較する工程、を含むものである。

Description

プロテインＳ異常症の検出方法
　本発明は、プロテインＳ異常症の検出方法に関するものである。
　本発明は、特に、臨床検査、分子生物学、及び医学などの生命科学分野等において有用なものである。
　プロテインＳは、生体内の血液凝固系の制御機構において中心的に機能する血漿クンパク質である。
　このプロテインＳは、主に血液中に存在するものであって、活性化プロテインＣの補欠因子（補助因子）であり、活性化プロテインＣの活性を上昇させることができ、血液中での活性化プロテインＣの働きに欠かせないものである。
　なお、活性化プロテインＣは、ヒトにおける血液凝固を促進する活性化血液凝固第Ｖ因子（第Ｖａ因子；ＦＶａ）、及び活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子（第ＶＩＩＩａ因子；ＦＶＩＩＩａ）を分解することにより、血液凝固反応を抑制する役割を担った因子である。
　プロテインＳは、Ｃ４ｂ結合タンパク質（補体第４因子ｂ結合タンパク質；Ｃ４ｂＢＰ）と１対１で特異的に結合し、複合体を形成する。つまり、Ｃ４ｂ結合タンパク質は、プロテインＳのリガンドとなる。
　このプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体形成反応は、下に示した通りであるが、この反応は可逆反応である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　そして、ヒト血液中においては、通常、プロテインＳに比べてＣ４ｂ結合タンパク質のモル濃度は小さく、また解離定数も小さいため、血液中には「プロテインＳ」及び「プロテインＳ－Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体」のみ存在する。つまり、上記の反応の平衡は、完全に右に寄っていることになる。
　通常、健常者の血液中（血漿中）のプロテインＳは、その約６０％が「プロテインＳ一Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体」（すなわち、結合型）であり、その約４０％は「遊離状態のプロテインＳ」（すなわち、遊離型）である。
　なお、遊離のプロテインＳ（すなわち、遊離型）のみが、活性化プロテインＣに対する補酵素活性を示し、活性化プロテインＣの活性を上昇させることができるのである。
　なお、本明細書において、「プロテインＳ」又は「Ｃ４ｂ結合タンパク質」等の語は、特に複合体（若しくは結合型）又は遊離（若しくは遊離型）等の記載が無い場合は、それぞれこれらの物質の複合体（又は結合型）及び遊離状態（又は遊離型）のものの総称を意昧するものとする。
　下に、プロテインＣ及びプロテインＳによる血液凝固系の制御機構の模式図を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　プロテインＣは生体内において、トロンビン・トロンボモジュリン複合体により限定分解され活性化ペプチドが遊離することにより活性化され、活性化プロテインＣとなる。
　活性化プロテインＣは、ヒトおける血液凝固を促進する活性化血液凝固第Ｖ因子、及び活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子を分解することにより、血液凝固反応を抑制する役割を担ったセリンプロテアーゼである。
　プロテインＳは、活性化プロテインＣの補欠因子（補助因子）であり、プロテインＳの存在により、活性化プロテインＣの活性は上昇し、活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応及び活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子の分解反応は促進される。
　血液凝固反応を抑制する働きを持つプロテインＳの活性の低下又は異常は、生体内において血栓症を引き起こす原因となりうる。
　実際、プロテインＳの先天性異常症者は、高い頻度で深部静脈血栓症、表在性静脈炎若しくは肺梗塞などの静脈性血栓症、又は心不全の原因となる冠状動脈血栓症などの動脈性血栓症等を発症することになる。
　また、播種性血管内凝固症候群(ＤＩＣ)、ビタミンＫ欠乏症又は肝機能低下症等においても、プロテインＳの活性の低下又は異常が認められる。
　即ち、血漿等の試料中のプロテインＳの活性を測定することにより、プロテインＳの活性の低下又は異常を把握することができ、引いては血栓症等の疾患の発症の予測、早期発見及び治療効果の判定等に重要な役割を果たすものである。
　ところで、試料中のプロテインＳの活性を測定する方法として、試料を蛇毒からのプロテインＣ一活性化剤と共に、活性化プロテインＣの形成下にインキュベートし、血液凝固第ＸＩＩ因子、血液凝固第ＶＩＩ因子又は血液凝固第１１因子（プロトロンビン）の活性化剤を添加し、かつ血液凝固因子及びその活性剤により媒介される、プロトロンビンからのトロンビンの形成の減少を、色素原トロンビン基質を使用して測光測定する方法が開示されている（特許文献１参照。）。
　別の試料中のプロテインＳの活性を測定する方法として、血漿試料にプロテインＣを活性化するプロテインＣ活性化物質又は活性化プロテインＣを添加し、次に活性化血液凝固第ＩＸ因子を加えインキュベートし、生成するトロンビンの量を知られた方法で測定し、これをプロテインＳ活性が既知の標品を測定して得た値と比較して、試料中のプロテインＳの活性を測定する方法が開示されている（特許文献２参照。）。
　また、別の試料中のプロテインＳの活性を測定する方法として、試料を、活性化プロテインＣ、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、リン脂質及びカルシウムイオンとインキュベートし、次にこの混合物を、活性化血液凝固第ＩＩ因子（トロンビン）、活性化血液凝固第ＩＸ因子及び活性化血液凝固第Ｘ因子とインキュベートし、次にこのインキュベーション混合物へ活性化血液凝固第Ｘ因子特異性基質を添加し、この基質の開裂によって生成したシグナルの量を測定することよりなる、試料中のプロテインＳの活性を測定する方法が開示されている（特許文献３参照。）。
　これら従来の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、その測定反応に使用する血液凝固反応の成分（因子）の少なくとも一つは、試料に含まれている成分（因子）をそのまま用いているものであった。すなわち、試料に含まれている成分に依存しているものであった。
　従って、このような試料に含まれている成分（因子）をそのまま用いる従来の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、その成分（因子）〔例えば、活性化血液凝固第Ｘ因子〕がその試料提供者において欠損又は低下しているときには、前記測定反応の反応成分（因子）の少なくとも一つが十分量存在しない訳であるから、測定反応は十分に進行せず、得られるプロテインＳ活性値は、場合により本来の値より乖離し、誤差を含むものになるという問題を有するものであった。
　すなわち、測定値が、血液凝固反応に係わる成分（因子）の試料中の存在量（濃度）又はその変異により、彩響を受けてしまうことが起こるという問題を有するものであった。
　そこで、本発明者らは、試料に由来しない、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有する試料中のプロテインＳの活性測定試薬、並びに、試料に由来しない、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させ、次に、前記の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定し、次に、試料に含まれるプロテインＳの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量を求めることにより、試料中に含まれていたプロテインＳの活性値を得る試料中のプロテインＳの活性測定方法を発明し、開示した（特許文献４及び非特許文献１参照。）。
　しかしながら、従来の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬は、いずれも遊離のプロテインＳ（遊離型）の活性を測定するものであった。
　つまり、従来の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬はいずれも、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕を、すなわち、総プロテインＳの活性を測定することは出来ないものであった。
　ところで、プロテインＳ異常症は、反復して血栓症を発症することが知られており、特にプロテインＳ遺伝子変異はアジア人に高頻度に存在することが近年数多く報告されている。
　例えば、日本人の静脈血栓塞栓症（Ｖｅｎｏｕｓ　Ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ；ＶＴＥ）のリスクファクターの一つとして注目されているプロテインＳ徳島（ＰＳ－Ｋ１５５Ｅ遺伝子変異）がその一つである。
　なお、プロテインＳ徳島（ＰＳ－Ｋ１５５Ｅ遺伝子変異）等の遺伝子変異によるプロテインＳの分子異常は、プロテインＳＩＩ型異常症に分類され、血中に分泌されるプロテインＳタンパク質量は正常であるが、プロテインＳ活性が低下するものである。
　このプロテインＳの活性の低下をともなうプロテインＳ異常症の検出は、静脈血栓塞栓症などの血栓症等の疾患の予防、診断及び治療に役立つものと思われる。
　しかしながら、このプロテインＳ異常症は、従来の方法及び試薬では、簡便かつ正確に検出することは困難であることが報告されている（非特許文献２参照。）。
特開昭６２－２１２５６９号公報 特表平４－５０６６０３号公報 特表平６－５０４６８２号公報 特開２００４－３３７１４３号公報
Ｃｌｉｎ　Ｃｈｅｍ　Ｌａｂ　Ｍｅｄ,２００４,Ｖｏｌ.４２,Ｎｏ.３,ｐ.３５０－３５２ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ,２００６,Ｖｏｌ.４,ｐ.２０１０－２０１３
　本発明の課題は、プロテインＳ異常症を正確、簡便かつ迅速に検出する方法を提供することである。
　本発明者らは、プロテインＳ異常症の検出方法について検討を重ねたところ、試料中の総プロテインＳ活性値及び総プロテインＳタンパク質量を測定し、これらを比較することにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の発明よりなる。
（１）　プロテインＳ異常症の検出方法であって、試料中の総プロテインＳ活性値及び総プロテインＳタンパク質量を測定する工程、及び、前記測定により得た総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量とを比較する工程、を含むプロテインＳ異常症の検出方法。
（２）　測定により得た総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量とを比較し、この総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量とが乖離している場合にはプロテインＳ異常症である又はその疑いがあるとする、前記（１）記載のプロテインＳ異常症の検出方法。
（３）　測定により得た総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量とを比較することが、この総プロテインＳ活性値をこの総プロテインＳタンパク質量で除した比活性を求めることである、前記（１）又は（２）記載のプロテインＳ異常症の検出方法。
　本発明のプロテインＳ異常症の検出方法は、プロテインＳ異常症を正確、簡便かつ迅速に検出することが出来るものである。
　よって、本発明のプロテインＳ異常症の検出方法を用いることにより、プロテインＳの異常症を簡便かつ正確に検出し、血栓症等の疾患の予防、診断及び治療等に役立てることができる。
試料中の総プロテインＳの活性値の測定結果と試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定結果との比較を示した図である。
Ｉ．プロテインＳ異常症の検出方法の総論
　本発明のプロテインＳ異常症の検出方法は、試料中の総プロテインＳ活性値及び総プロテインＳタンパク質量を測定する工程、及び、前記測定により得た総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量とを比較する工程、を含むものである。
　なお、総プロテインＳ活性値を測定するとは、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合クンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕についてその活性を測定することである。
　つまり、「遊離のプロテインＳ（遊離型）」の活性に加えて、「プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）」に含まれるプロテインＳが遊離のプロテインＳ（遊離型）となった場合に発現する活性もあわせて測定することである。
　また、総プロテインＳタンパク質量を測定するとは、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合クンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕についてそのタンパク質量を測定することである。
　つまり、「遊離のプロテインＳ（遊離型）」のタンパク質量に加えて、「プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）」に含まれるプロテインＳのタンパク質量もあわせて測定することである。
　なお、本発明においては、総プロテインＳ活性値を測定する方法（活性測定方法）及び試薬（活性測定試薬）は、特に限定はなく、総プロテインＳの活性値を測定することができる方法及び試薬であればどのようなものでもよい。
　また、本発明においては、総プロテインＳタンパク質量を測定する方法（測定方法）及び試薬（測定試薬）は、特に限定はなく、総プロテインＳのタンパク質量を測定することができる方法及び試薬であればどのようなものでもよい。
　次に、試料中の総プロテインＳ活性値及び総プロテインＳタンパク質量の測定により得た総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量とを比較する工程であるが、この比較する方法については適宜定めればよく、特に限定はない。
　この比較の方法については、例えば、測定により得た総プロテインＳ活性値の数値と、測定により得た総プロテインＳタンパク質量の数値を比較することや、
測定により得られた総プロテインＳ活性値をグラフの縦軸（横軸でもよい）にプロットし、測定により得られた総プロテインＳタンパク質量をグラフの横軸（縦軸でもよい）にプロットして、このグラフ上で比較することや、又は測定により得た総プロテインＳ活性値を測定により得た総プロテインＳタンパク質量で除した比活性を求めること等を挙げることが出来る。
　本発明においては、測定により得た総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量との比較を、この総プロテインＳ活性値をこの総プロテインＳタンパク質量で除した比活性を求めることにより行うことが好ましい。
　なお、本発明においては、例えば、測定により得た総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量とを比較し、この総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量とが乖離している場合にはプロテインＳ異常症である又はその疑いがあるとすることが出来る。
　例えば、測定により得た総プロテインＳ活性値の数値と、測定により得た総プロテインＳタンパク質量の数値を比較して、乖離している場合にはプロテインＳ異常症である又はその疑いがあるとすることが出来る。
　また、例えば、測定により得た総プロテインＳ活性値をグラフの縦軸（横軸でもよい）にプロットし、測定により得た総プロテインＳタンパク質量をグラフの横軸（縦軸でもよい）にプロットして、このグラフ上における判定の結果、この総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量とが乖離している場合にはプロテインＳ異常症である又はその疑いがあるとすることが出来る。
　例えば、このグラフ上に前記の通りプロットした点（データ）がｙ＝ｘの線（式）の上になく、このｙ＝ｘの線（式）から離れている場合は、乖離していると判定することもできる。
　また、プロテインＳ異常症でないことが分かっている複数の人について総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量を測定し、この測定により得た総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量を前記の通りにグラフ上にプロットし、このプロテインＳ異常症でないことが分かっている人達の試料についてプロットした点（データ）の集合（又はこの集合を表す式）と対比を行ない、この集合（又はこの集合を表す式）から離れている場合には、乖離していると判定することもできる。
　また、例えば、測定により得た総プロテインＳ活性値を測定により得た総プロテインＳタンパク質量で除した比活性を求めることにより、測定により得た総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量との比較を行い、この総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量とが乖離している場合にはプロテインＳ異常症である又はその疑いがあるとすることが出来る。
　なお、測定により得た総プロテインＳ活性値を測定により得た総プロテインＳタンパク質量で除した比活性を求めることは、例えば、測定により得た総プロテインＳ活性値の数値を測定により得た総プロテインＳタンパク質量の数値で除することによりこの比活性を求めることが出来るが、また、測定により得た総プロテインＳ活性値をグラフの縦軸にプロットし、測定により得た総プロテインＳタンパク質量をグラフの横軸にプロットしてグラフを作成すること等によってもこの比活性を求めることが出来る。
　そして、前記のようにして測定により得た総プロテインＳ活性値を測定により得た総プロテインＳタンパク質量で除した比活性を求め、この比活性の値が１ではなく、１よりも小さく離れた値であるときは、乖離していると判定することもできる。
　また、プロテインＳ異常症でないことが分かっている複数の人について総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量を測定し、この測定により得た総プロテインＳ活性徴をこの測定により得た総プロテインＳタンパク質量で除して比活性を求め、このプロテインＳ異常症でないことが分かっている人達の試料についての比活性の値の集合（又はこの集合を表す式）と対比を行ない、この集合（又はこの集合を表す式）から離れている場合には、乖離していると判定することもできる。
　なお、この、プロテインＳ異常症でないことが分かっている人達の試料についての比活性の値の集合（又はこの巣合を表す式）と対比を行ない、この集合（又はこの集合を表す式）から離れている場合には、乖離していると判定することであるが、プロテインＳ異常症でないことが分かっている人達の試料についての比活性の値の集合の標準偏差の２倍の範囲（より好ましくはこの標準偏差の３倍の範囲）を外れる場合には、この集合から離れており、乖離していると判定してもよい。
　また、例えば、測定により得た総プロテインＳ活性値をグラフの縦軸にプロットし、測定により得た総プロテインＳタンパク質量をグラフの横軸にプロットする等して、このグラフ上に比活性が表されるようにし、このグラフ上に表された比活性より、総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量とが乖離していると判定できる場合にはプロテインＳ異常症である又はその疑いがあるとすることが出来る。
　例えば、このグラフ上に前記の通りプロットした比活性の点（データ）がｙ＝ｘの線（式）の上になく、このｙ＝ｘの線（式）よりも下で離れている場合は、乖離していると判定し、プロテインＳ異常症である又はその疑いがあるとすることもできる。
　また、プロテインＳ異常症でないことが分かっている複数の人について総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量を測定し、この測定により得た総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量を前記の通りにグラフ上にプロットし、このグラフ上に比活性が表されるようにし、このプロテインＳ異常症でないことが分かっている人達の試料についてプロットした比活性の点（データ）の集合（又はこの集合を表す式）と対比を行ない、この集合（又はこの集合を表す式）よりも下で離れている場合には、乖離していると判定し、プロテインＳ異常症である又はその疑いがあるとすることもできる。
　なお、この、プロテインＳ異常症でないことが分かっている複数の人について総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量を測定し、この測定により得た総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量を前記の通りにグラフ上にプロットし、このグラフ上に比活性が表されるようにし、このプロテインＳ異常症でないことが分かっている人達の試料についてプロットした比活性の点（データ）の集合（又はこの集合を表す式）と対比を行ない、この集合（又はこの集合を表す式）から離れている場合には、乖離していると判定することであるが、プロテインＳ異常症でないことが分かっている人達の試料についてプロットした比活性の点（データ）の集合より平均値と標準偏差（以下、「ＳＤ」ということがある）を求め、平均－２ＳＤ（より好ましくは、平均－３ＳＤ）以下の場合には、この集合から離れており、乖離していると判定してもよい。
ＩＩ．試料中の総プロテインＳの活性測定方法
　先に述べたように、本発明においては、総プロテインＳ活性値を測定する方法（活性測定方法）及び試薬（活性測定試薬）は、特に限定はなく、総プロテインＳの活性値を測定することができる方法及び試薬であればどのようなものでもよいが、以下、この試料中の総プロテインＳの活性測定方法の例について説明を行う。
Ｉ．総論
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法であるが、総プロテインＳ活性の測定反応時に、界面活性剤を存在させることが好ましい。
　なお、試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、プロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させることが好ましい。
　また、試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、総プロテインＳ活性の測定反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが好ましい。
　そして、試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、プロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが好ましい。
　更に、試料中の総プロテインＳの活性測定方法は、試料中の総プロテインＳ活性の測定が、次の（ａ）～（ｃ）の工程を含む方法により行われるものであることが好ましい。
（ａ）　活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びドロンビンの基質を試料と接触させる。
（ｂ）　次に、前記（ａ）の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
（ｃ）　次に、この試料に含まれる総プロテインＳの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量より、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
　また、試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、試料中の総プロテインＳ活性の測定が、次の（ａ）～（ｅ）の工程を含む方法により行われるものであることが好ましい。
（ａ）　試料と、少なくとも活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させることにより、試料にプロテインＳが含まれる場合には活性化プロテインＣの活性が上昇する。
（ｂ）　次に、前記（ａ）の成分及び活性化血液凝固第Ｖ因子の存在下、活性化プロテインＣが触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が、前記（ａ）における活性化プロテインＣの活性の上昇により、促進される。
（ｃ）　次に、活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（ｂ）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減される。
（ｄ）　次に、前記（ｃ）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
（ｅ）　次に、前記（ｄ）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
２．試料中の総プロテインＳの活性測定の方法
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法における測定の方法として、次の（１）又は（２）に記載の方法等を挙げることができ、これらの方法等により行うことが好ましい。
（１）
（ａ）　活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子（第Ｖａ因子；ＦＶａ）、活性化血液凝固第Ｘ因子（第Ｘａ因子；ＦＸａ）、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
　なお、これらの成分と試料との接触は、１回に全ての成分との接触を行わせて、下記の反応系の全ての反応を１段階に行ってもよく（１ステップ法）、また、前記成分を分け、接触を複数段階に分けて行うことにより下記の反応系の反応を複数段階に分けて行ってもよい（多ステップ法）。
（ｂ）　前記（ａ）における接触により、前記の各成分による下記の反応が進行する。
　そして、この一連の反応によりトロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
　即ち、前記の一連の反応により、トロンビンの基質がトロンビンにより分解等の作用を受け、この結果生じるシグナルの量（例えば、吸光度等）を測定する。
（ｃ）　試料にプロテインＳが含まれている場合には、活性化プロテインＣがリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性が上昇し、これにより活性化血液凝固第Ｖ因子の分解が促進されるので、その結果トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制されて、シグナルの生成が抑制される。
　このシグナル生成の抑制度は、試料に含まれていた総プロテインＳの活性値に応じて大きくなる。
　従って、前記（ｂ）においてシグナル量を測定することにより、生成が抑制されたシグナル量を測定することになり、これにより試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
（２）
　活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子（第Ｖａ因子；ＦＶａ）、活性化血液凝固第Ｘ因子（第Ｘａ因子；ＦＸａ）、プロトロンビン及びトロンビンの基質より構成される次の反応系を用いて試料中のプロテインＳの活性値を測定する方法であって、
（ａ）　試料と、少なくとも活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及び力ルシウムイオンを接触させる。
　これにより、試料にプロテインＳが含まれる場合にはリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化プロテインＣの活性が上昇する。
（ｂ）　活性化プロテインＣの前記（ａ）における活性の上昇により、活性化プロテインＣがリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が、界面活性剤の共存下で促進される。
（ｃ）　活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（ｂ）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減する。
（ｄ）　前記（ｃ）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
　なお、このシグナル生成の抑制度は、試料に含まれていた総プロテインＳの活性に応じて大きくなる。
（ｅ）　前記（ｄ）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定する。
　以上の通り前記の反応により生成したシグナル量を測定し、すなわち生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
３．試料
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法において、試料とは、プロテインＳを含有する可能性がある物質である。
　この試料として、例えば、生体試料（ヒト又は動物などに由来する試料）等を挙げることができる。
　生体試料としては、例えば、血液、血漿、唾液、汗、尿、涙、髄液、腹水、羊水などの生体の液体；肝臓、心臓、脳、骨、毛髪、皮膚、爪、筋肉、神経組織などの臓器、組織、細胞などの抽出液等を挙げることができる。
４．活性化プロテインＣ
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法において用いる活性化プロテインＣは、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
　例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
　また、試料中の総プロテインＳの活性測定方法における測定反応中に、プロテインＣ活性化物質等によりプロテインＣより活性化プロテインＣを生成させて、これを本発明における活性化プロテインＣとして用いてもよい。
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法において、活性化プロテインＣは、試料と接触することにより、試料中にプロテインＳが含まれている場合には、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、この活性化プロテインＣの活性が上昇する。
　そして、活性化プロテインＣは、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、活性化血液凝固第Ｖ因子を分解する反応の触媒となる。
　よって、プロテインＳが存在することにより、活性化プロテインＣが活性化血液凝固第Ｖ因子を分解する反応は促進される。
　前記の活性化プロテインＣ等と試料を接触させることと、活性化プロテインＣを活性化血液凝固第Ｖ因子等と接触させることは、同時に行ってもよい。
　また、活性化プロテインＣをリン脂質とともに試料と接触させ、少なくとも１分間以上、好ましくは５分間以上、室温又は３７℃等においてインキュベートした後に、活性化血液凝固第Ｖ因子及びカルシウムイオンと接触させ、インキュベートして、活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応を行わせてもよい。
　この活性化プロテインＣを用いる際の濃度は、活性化血液凝固第Ｖ因子と接触させ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｖ因子を分解させる際には、通常、１ｐＭ～１００ｎＭにあることが好ましい。
　しかしながら、測定の感度を高く得るには、活性化プロテインＣ濃度が高い方が好ましいので、前記の活性化プロテインＣ濃度としては、１０ｐＭ～１０ｎＭにあることがより好ましく、１００ｐＭ～ｌｎＭにあることが特に好ましい。
５．界面活性剤
　総プロテインＳの活性測定方法においては、当該総プロテインＳ活性の測定反応時に、界面活性剤を存在させることが好ましい。
　この界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤又は陽イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上を適宜存在させればよい。
　この界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ボリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシブロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
　なお、この界面活性剤が非イオン性界面活性剤の場合、そのＨＬＢ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ－Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ　Ｂａｌａｎｃｅ）は、１０～２０の範囲のものが好ましく、１２～１８の範囲のものがより好ましく、１３～１６の範囲のものが特に好ましい。
　この界面活性剤は、非イオン性界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ一１００〔ポリオキシエチレン（ｎ＝９，１０）ｐ－ｔ－オクチルフェニルエーテル、ＨＬＢ：１３．５〕、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１１４〔ポリオキシエチレン（ｎ＝７，８）ｐ－ｔ－オクチルフェニルエーテル、ＨＬＢ：１２．４〕、ＮＰ－１０〔ポリオキシエチレン（ｎ＝１０）ノニルフェニルエーテル、ＨＬＢ：１６．５〕、ＮＰ－１１〔ポリオキシエチレン（ｎ＝１１）ノニルフェニルエーテル〕、ＮＰ－１２〔ポリオキシエチレン（ｎ＝１２）ノニルフェニルエーテル〕、ＮＰ－１３〔ポリオキシエチレン（ｎ＝１３）ノニルフェニルエーテル〕、ＮＰ－１５〔ポリオキシエチレン（ｎ＝１５）ノニルフェニルエーテル、ＨＬＢ：１８．０〕、ＢＴ－９［ポリオキシエチレン（ｎ＝９）２級アルキルエーテル、ＨＬＢ：１３．５〕、又はＢＴ－１２〔ポリオキシエチレン（ｎ＝１２）２級アルキルエーテル、ＨＬＢ：１４．５〕等が好ましい。
　また、両イオン性界面活性剤としては、ＡＭ－３０１〔ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン水溶液〕等が好ましい。
　そして、陰イオン性界面活性剤としては、サルコシネート　ＬＮ〔ラウロイルサルコシンナトリウム〕等が好ましい。
　更に、陽イオン性界面活性剤としては、ＣＡ－２３５０〔塩化セチルトリメチルアンモニウム〕等が好ましい。
　なお、総プロテインＳ活性の測定反応時に界面活性剤を存在させる際の濃度は、特に限定されるものではないが、０．００００１～５％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、０．０００１～１％（Ｗ／Ｖ）がより好ましく、０．００１～０．１％（Ｗ／Ｖ）が更に好ましく、０．００５～０．０５％（Ｗ／Ｖ）が特に好ましい。
　そして、非イオン性界面活性剤においては０．００１～０．０１％（Ｗ／Ｖ）が非常に好ましく、両イオン性界面活性剤においては０．００１～０．０１％（Ｗ／Ｖ）が非常に好ましく、陰イオン性界面活性剤においては０.００１～０．１％（Ｗ／Ｖ）が非常に好ましく、陽イオン性界面活性剤においては０．００００１～０．００１％（Ｗ／Ｖ）が非常に好ましい。
　なお、総プロテインＳの活性測定方法においては、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させることが、試料中の総プロテインＳの活性測定のために好ましい。
６．リン脂質
（１）総論
　総プロテインＳの活性測定方法においては、総プロテインＳ活性の測定反応時に、リン脂質を存在させる。
　このリン脂質は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる、
　例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの、その他の動物由来のもの、植物由来のもの、微生物由来のもの又は人工的に合成したもの等を挙げることができる。
　総プロテインＳ活性の測定反応時に、リン脂質を存在させる際の濃度は、通常、０．０３μＭ～１００μＭにあることが好ましく、０．３μＭ～５０μＭにあることがより好ましく、３μＭ～３０μＭにあることが特に好ましい。
　このリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール若しくはジホスファチジルグリセロールなどのグリセロリン脂質や、又はスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質等を挙げることができる。
　なお、このリン脂質としては、総プロテインＳ活性の測定反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが、試料中の総プロテインＳの活性測定のために好ましい。
　また、このホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる場合、この３種類のリン脂質の組成としては、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が１０％（Ｗ／Ｖ）以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が２０％（Ｗ／Ｖ）以上であることが好ましい。
　特に、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が３０％（Ｗ／Ｖ）以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が３０％（Ｗ／Ｖ）以上であることが好ましい。
（２）活性化プロテインＣによる触媒反応に用いるリン脂質
　総プロテインＳの活性測定方法においては、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、及びこの活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時には、その活性化プロテインＣの活性上昇反応及び活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応に必要なリン脂質を存在させる。
　このリン脂質は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
　例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの、その他の動物由来のもの、植物由来のもの、微生物由来のもの又は人工的に合成したもの等を挙げることができる。
　前記の活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時にリン脂質を存在させる際の濃度は、通常、０．１μＭ～１００μＭにあることが好ましく、１μＭ～５０μＭにあることがより好ましく、１０μＭ～３０μＭにあることが特に好ましい。
　このリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール若しくはジホスファチジルグリセロールなどのグリセロリン脂質や、又はスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質等を挙げることができる。
　なお、このリン脂質としては、前記の活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが、試料中の総プロテインＳの活性測定のために好ましい。
　また、このホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる場合、この３種類のリン脂質の組成としては、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が１０％（Ｗ／Ｖ）以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が２０％（Ｗ／Ｖ）以上であることが好ましい。
　特に、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が３０％（Ｗ／Ｖ）以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が３０％（Ｗ／Ｖ）以上であることが好ましい。
（３）活性化血液凝固第Ｘ因子による触媒反応に用いるリン脂質
　総プロテインＳの活性測定方法においては、活性化血液凝固第Ｖ因子の存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時には、その反応に必要なリン脂質を存在させる。
　このリン脂質は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
　例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの、その他の動物由来のもの、植物由来のもの、微生物由来のもの又は人工的に合成したもの等を挙げることができる。
　前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応特にリン脂質を存在させる際の濃度は、通常、０．１μＭ～１００μＭにあることが好ましく、０．５μＭ～５０μＭにあることがより好ましく、１μＭ～１０μＭにあることが特に好ましい。
　このリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール若しくはジホスファチジルグリセロールなどのグリセロリン脂質や、又はスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質等を挙げることができる。
　なお、このリン脂質としては、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時に、ホスファチジルコリン及びホスファチジルセリン、又はホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが、前記反応の促進の効果が高くなるため好ましい。
　また、このホスファチジルコリン及びホスファチジルセリンよりなるリン脂質を存在させる場合、この２種類のリン脂質の組成としては、ホスファチジルコリンの組成比が８５％（Ｗ／Ｖ）～５０％（Ｗ／Ｖ）であり、かつホスファチジルセリンの組成比が１５％（Ｗ／Ｖ）～５０％（Ｗ／Ｖ）であることが好ましい。
　特に、ホスファチジルコリンの組成比が８０％（Ｗ／Ｖ）～７０％（Ｗ／Ｖ）であり、かつホスファチジルセリンの組成比が２０％（Ｗ／Ｖ）～３０％（Ｗ／Ｖ）であることが好ましい。
　あるいは、このホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる場合、この３種類のリン脂質の組成としては、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が１０％（Ｗ／Ｖ）以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が２０％（Ｗ／Ｖ）以上であることが好ましい。
　特に、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が３０％（Ｗ／Ｖ）以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が３０％（ｗ／Ｖ）以上であることが好ましい。
　なお、このプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際のリン脂質としては、前記の活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に用いたリン脂質をそのまま用いることができる。
　しかしながら、先に述べたとおり、適したリン脂質の組成がそれぞれの反応により異なるので、各々の反応に適した組成のリン脂質をその反応時に存在させて用いることが好ましい。
　なお、このプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際に、先に加えた前記の活性化プロテインＣの活性上昇反応及び活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応に適した組成のリン脂質が、このプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に適した組成のリン脂質と共存したとしても、本発明の試料中の総ブロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては全く支障はない。
７．カルシウムイオン
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時、及び活性化血液凝固第Ｘ因子及び活性化血液凝固第Ｖ因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時には、カルシウムイオンを存在させる。
　このカルシウムイオンとしては、カルシウムイオン自体はもちろんのこと、又はカルシウムの塩等のカルシウムイオンを含む化合物であれば、特に制限なく用いることができる。
　このカルシウムイオンを含む化合物としては、例えば、フッ化カルシウム、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、乳酸カルシウム又はシアン化カルシウム等を挙げることができる。
　このカルシウムイオンを用いる際の濃度は、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応の際、活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応の際、そして活性化血液凝固第Ｘ因子及び活性化血液凝固第Ｖ因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際には、通常、０．１ｍＭ～１００ｍＭにあることが好ましく、１ｍＭ～１０ｍＭにあることが特に好ましい。
８．活性化血液凝固第Ｖ因子
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法において用いる活性化血液凝固第Ｖ因子（第Ｖａ因子；ＦＶａ）は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
　例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。
　また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法において、活性化血液凝固第Ｖ因子は、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、活性化プロテインＣにより分解される。
　そして、試料中にプロテインＳが含まれている場合そのプロテインＳの存在により、活性化プロテインＣの活性が上昇して、この分解反応は促進される。
　また、活性化血液凝固第Ｖ因子は、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒する、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応を促進するものである。
　よって、試料中にプロテインＳが含まれていると、活性化プロテインＣの活性が上昇して、活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されて、活性化血液凝固第Ｖ因子の存在量（濃度）は少なくなる。
　そうすると、活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第Ｖ因子の促進効果が小さくなるので、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は抑制される。
　前記の活性化血液凝固第Ｖ因子と活性化プロテインＣ等とを接触させることと、活性化血液凝固第Ｖ因子と活性化血液凝固第Ｘ因子及びプロトロンビン等とを接触させることは、同時に行ってもよい。
　しかしながら、活性化血液凝固第Ｖ因子を、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンとともに活性化プロテインＣと接触させ、少なくとも１分間以上、好ましくは５分間以上、室温又は３７℃等においてインキュベートした後に、活性化血液凝固第Ｘ因子及びプロトロンビン等と接触させ、インキュベートして、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応を行わせることが好ましい。
　この活性化血液凝固第Ｖ因子を用いる際の濃度は、活性化プロテインＣと接触させ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｖ因子を分解する反応を行わせる際には、通常、０．５ｐＭ～５ｎＭにあることが好ましい。
　しかしながら、この活性化血液凝固第Ｖ因子の濃度が高いと、試料に由来する成分（因子）等による血液凝固反応が進行してしまい、フィブリンが析出したり又は多大な発色が生じて正確な測定が行えなくなるので、前記の活性化血液凝固第Ｖ因子濃度としては、５ｐＭ～５００ｐＭにあることがより好ましく、２０ｐＭ～２００ｐＭにあることが特に好ましい。
９．活性化血液凝固第Ｘ因子
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法において用いる活性化血液凝固第Ｘ因子（第Ｘａ因子；ＦＸａ）は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
　例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。
　また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法において、活性化血液凝固第Ｘ因子は、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応を触媒する。
　この活性化血液凝固第Ｘ因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は、活性化血液凝固第Ｖ因子の存在により促進される。
　よって、先に述べたように、試料中にプロテインＳが含まれていると、活性化プロテインＣの活性が上昇し、これにより活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進され、このため活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第Ｖ因子の促進効果が小さくなるので、前記のトロンビンを生成させる反応は抑制される。
　この活性化血液凝固第Ｘ因子を用いる際の濃度は、活性化血液凝固第Ｖ因子及びプロトロンビン等と接触させ、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる際には、通常、０．１ｐＭ～３００ｐＭにあることが好ましい。
　しかしながら、この活性化血液凝固第Ｘ因子の濃度が高いと、先の活性化血液凝固第Ｖ因子の場合と同様、試料に由来する成分（因子）等による血液凝固反応が進行してしまい、フィブリンが析出したり又は多大な発色が生じて正確な測定が行えなくなるので、前記の活性化血液凝固第Ｘ因子濃度としては、１ｐＭ～１００ｐＭにあることがより好ましく、１０ｐＭ～５０ｐＭにあることが特に好ましい。
１０．プロトロンビン
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法において用いるプロトロンビンは、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
　例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。
　また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法において、プロトロンビンは、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒する反応の基質となり、トロンビンになる。
　この活性化血液凝固第Ｘ因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は、活性化血液凝固第Ｖ因子の存在により促進される。
　よって、先に述べたように、試料中にプロテインＳが含まれていると、活性化プロテインＣの活性が上昇し、これにより活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進され、このため活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第Ｖ因子の促進効果が小さくなるので、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は抑制され、生成されるトロンビンの量（濃度）は低減される。
　このブロトロンビンを用いる際の濃度は、活性化血液凝固第Ｖ因子及び活性化血液凝固第Ｘ因子と接触させ、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる際には、通常、１ｎＭ～５０μＭにあることが好ましく、５０ｎＭ～５μＭにあることがより好ましく、そして１００ｎＭ～１μＭにあることが特に好ましい。
１１．トロンビンの基質
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法において用いるトロンビンの基質は、トロンビンのプロテアーゼとしての触媒作用を（トロンビンの基質として）受けることにより何らかのシグナルを生じるもの、又はトロンビンによる触媒反応に加え更に他の反応を続けることにより何らかのシグナルが生じるものであれば、特に制限なく用いることができる。
　この何らかのシグナルが生じるということであるが、これはトロンビンの触媒作用を受けることにより光学的、電気的、磁気的若しくは他のエネルギー等におけるシグナル（信号）の生成又は変化を検出することができるということを意味する。
　例えば、トロンビンの触媒作用を受けることにより、吸光度、透過率若しくは蛍光強度が変化するもの、光の吸収曲線が変化するもの、又は発光するもの等を挙げることができる。
　この一例としては、遊離したときに吸光度、透過率若しくは蛍光強度、又は光の吸収曲線が変化するような化合物を結合したペプチド又はタンパク質、或いは遊離したときに発光するような化合物を結合したペプチド又はタンパク質等であって、トロンビンの触媒作用により前記の化合物が前記のペプチド又はタンパク質より遊離するような物質等を挙げることができる。
　このような物質においては、トロンビンの触媒作用を受け、前記化合物が遊離することにより、吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線の変化或いは発光等として検出できるので、トロンビンの触媒作用すなわちトロンビンの酵素活性を、生成したシグナル（吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線の変化或いは発光等）の量を測定することにより求めることができる。
　このような物質としては、例えば、「Ｈ－Ｄ－フェニルアラニル－Ｌ－ピペコリル－Ｌ－アルギニル－ｐ－ニトロアニリド・二塩酸塩」〔テストチーム（登録商標）発色基質Ｓ－２２３８〕（製造元：Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ－Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社〔イタリア国〕、販売元：積水メディカル社〔日本国〕）、「Ｈ－Ｄ－ヘキサハイドロチロシル－Ｌ－アラニル－Ｌ－アルギニル－ｐ－ニトロアニリド・二酢酸塩」〔ＳＰＥＣＴＲＯＺＹＭＥ（登録商標）ＴＨ〕（ＡＭＥＲＩＣＡＮ
ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ社・コスモバイオ社）、「ベンゾイル－フェニルアラニル－バリニル－アルギニル－ｐ－ニトロアニリド・塩酸塩」［Ｔｈｒｏｍｂｉｎ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｉ，Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ］（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社・コスモバイオ社）、「トシル－グリシル－プロリル－アルギニル－ｐ－ニトロアニリド」〔ＣＨＲＯＭＯＺＹＭＥ
ＴＨ〕（ＰＥＮＴＡＰＨＡＲＭ社）、「Ｈ－Ｄ－フェニルアラニル－プロリル－アルギニル－３－カルボキシ－４－ヒドロキシ－アニリン」（第一三共社）、「ベンゾイル－フェニルアラニル－バリニル－アルギニル－ＡＭＣ・塩酸塩」〔Ｔｈｒｏｍｂｉｎ
ＳｕｂｓｔｒａｔｅＩＩＩ，Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ〕（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社・コスモバイオ社）、「ｔ－ブトキシカルボニル－アスパラギル（○－ベンジル）－プロリル－アルギニル－ＭＣＡ」（ペプチド研究所）、又は「ｔ－ブトキシカルボニル－バリニル－プロリル－アルギニル－ＭＣＡ」（ペプチド研究所）等を挙げることができる。なお、特に「Ｈ－Ｄ－フェニルアラニル－Ｌ－ピペコリル－Ｌ－アルギニル－ｐ－ニトロアニリド・二塩酸塩」が好ましい。
　前記の活性化血液凝固第Ｖ因子と活性化血液凝固第Ｘ因子とプロトロンビン等とを接触させることと、生成したトロンビンとこのトロンビンの基質とを接触させることは、同時に行ってもよいし、別々の段階として分けて行ってもよい。
　なお、いずれにしても、生成したトロンビンにトロンビンの基質を接触させ、少なくとも１分間以上、好ましくは５分間以上、室温又は３７℃等においてインキュベートして、トロンビンの基質からシグナルを生じさせる。
　このトロンビンの基質を用いる際の濃度は、このトロンビンの基質がトロンビンの触媒作用を受ける際に、通常、５μＭ～１００ｍＭにあることが好ましく、５０μＭ～１０ｍＭにあることが特に好ましい。
１２．シグナル量の測定
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法におけるトロンビンの基質は、プロトロンビンより生成したトロンビンの触媒作用を受けることによりシグナルを生じる。
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、このトロンビンの基質より生成したシグナルの量を測定する。
　なお、試料中にプロテインＳが含まれている場合、このシグナルの量は、試料中の総プロテインＳの活性値に応じて生成が抑制されたシグナルの量である。
　この生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）の測定は、そのシグナルに応じて適宜行えばよい。
　例えば、シグナルが、吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線の変化或いは発光等である場合には、吸光度、透過率、蛍光強度又は発光強度などを測定する等により行う。
　より具体的には、トロンビンの基質が、前記の「Ｈ－Ｄ－フェニルアラニル－Ｌ－ピペコリル－Ｌ－アルギニル－ｐ－ニトロアニリド・二塩酸塩」、「Ｈ－Ｄ－ヘキサハイドロチロシル－Ｌ－アラニル－Ｌ－アルギニル－ｐ－ニトロアニリド・二酢酸塩」、「ベンゾイル－フェニルアラニル－バリニル－アルギニル－ｐ－ニトロアニリド・塩酸塩」、又は「トシル－グリシル－プロリル－アルギニル－ｐ－ニトロアニリド」等の、ペプチドにｐ－ニトロアニリンを結合させた物質である場合には、トロンビンの触媒作用により遊離したｐ－ニトロアニリンが波長４０５ｎｍ近辺に有する光の吸収を、波長４０５ｎｍ又はその近辺の波長において吸光度を測定することにより行う。
　この場合、吸光度の測定は、主波長のみの一波長測定でもよいし、又は主波長と副波長においで測定する二波長測定でもよい。
　そして、この吸光度の測定は、エンドポイント法でもよいし、又はレート法でもよい。
１３．試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、試料中にプロテインＳが含まれていると、活性化プロテインＣの活性が上昇して、活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されて、活性化血液凝固第Ｖ因子の存在量（濃度）は少なくなる。
　そうすると、活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第Ｖ因子の促進効果が小さくなるので、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は抑制される。
　これにより、トロンビンの生成が低減するので、このトロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応も抑制されて、生成するシグナルの量は抑制される。
　すなわち、試料中に含まれる総プロテインＳの活性値に応じて、このシグナル生成の抑制度は大きくなる。
　従って、試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、試料と活性化プロテインＣ等とを接触させ前記の通りの反応を行わせることによって生成したシグナル量を測定して、すなわち生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
　この生成が抑制されたシグナル量を測定した後、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得ることは、適宜行えばよいが、例えば以下のようにして行うことができる。
　総プロテインＳの活性値が分かっている試料の少なくとも一つと、総プロテインＳの活性値が「ゼロ」であることが分かっている試料（生理食塩水又は純水等）について、前記の通り測定操作を行い、生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）を求める。
　そして、この生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）と試料中に含まれる総プロテインＳの活性値との関係を、数式又はグラフ等に表して、検量線を作成する。
　この検量線は、すなわち、シグナル生成の抑制度と試料中に含まれる総プロテインＳの活性値との関係を表したものである。
　次に、総プロテインＳの活性値が未知の試料について、前記の通り同様に測定操作を行い、生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）を求める。
　このシグナル量を前記の検量線に当てはめ、相当する総プロテインＳの活性値を求める。
　これにより、総プロテインＳの活性値が未知の試料における生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）より、その試料の総プロテインＳの活性値を得ることができる。
　なお、前記の検量線は、シグナル量（生成が抑制されたシグナル量）すなわちシグナル生成の抑制度と、試料中に含まれる総プロテインＳの活性値との関係を表したものであるが、この検量線におけるシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）は、測定されたシグナル量そのものでもよいが、そのシグナル量の値を基に算出した数値であってもよい。
　つまり、前記の検量線は、測定されたシグナル量の値を基に算出した数値と、試料中に含まれる総プロテインＳの活性値との関係を表したものであってもよい。
　なお、この場合であっても、測定されたシグナル量の値を基に算出した数値は、生成が抑制されたシグナル量に対応したものである。
　この測定されたシグナル量の値を基に算出した数値としては、例えば、測定されたシグナル量の単位時間当たりの変化量の数値、又は測定されたシグナル量の値を時間に対して一次微分して算出した数値、若しくは二次微分して算出した数値等を挙げることができる。
　例として、測定により得られた吸光度の１分間当たりの変化量、又は測定により得られた吸光度を時間に対して一次微分して得た吸光度変化の速度、若しくは測定により得られた吸光度を時間に対して二次微分して得た吸光度変化の加速度等を挙げることができる。
１４．タンパク質
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくは卵白アルブミンなどのアルブミン、カゼイン、又はゼラチン等のタンパク質を前記の活性測定反応時に存在させることが好ましい。
　このタンパク質を存在させる濃度は、通常、０．１μＭ～１ｍＭにあることが好ましい。
１５．塩
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、ハロゲン元素とアルカリ金属の塩又はハロゲン元素とアルカリ土類金属の塩等の塩を前記の活性測定反応時に存在させることが好ましい。
　ハロゲン元素とアルカリ金属の塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、フツ化ナトリウム、フツ化カリウム、臭化ナトリウム又は臭化カリウム等を挙げることができる。
　また、ハロゲン元素とアルカリ土類金属の塩としては、例えば、塩化マグネシウム、フッ化マグネシウム又は臭化マグネシウム等を挙げることができる。
　この塩を存在させる濃度は、通常、５ｍＭ～１Ｍにあることが好ましく、５０ｍＭ～２５０ｍＭにあることが特に好ましい。
１６．希釈液
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、試料を希釈液により希釈した後に、前記の活性測定反応を行わせることが、試料中の総プロテインＳの活性測定のために好ましい。
　この希釈液のｐＨは、特に限定はないが、ｐＨ６．０～ｐＨ１０.０（２０℃）のｐＨ範囲のものであることが好ましく、ｐＨ６．５～ｐＨ８．５（２０℃）のｐＨ範囲のものであることがより好ましい。
　なお、この希釈液には、ｐＨを前記のｐＨ範囲に保つため、前記のｐＨ範囲に緩衝能を有する緩衝剤を適宜存在させ又は含有させることが好ましい。
　また、この希釈液には、必要に応じて適宜、タンパク質、塩、界面活性剤、防腐剤、安定化剤、活性化剤、又は糖類等の成分を含有させることができる。
　この希釈液としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、又は緩衝液等を挙げることができる。
　この希釈液により試料を希釈する際の希釈倍率であるが、特に限定はないものの、試料中の総プロテインＳの活性測定のためには、２倍～６０倍が好ましく、５倍～４０倍がより好ましく、１０倍～２０倍が特に好ましい。
１７．ｐＨ
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、前記の活性測定反応を、ｐＨ６．０～ｐＨ１０．０（２０℃）の範囲で行うことが好ましく、ｐＨ６．５～ｐＨ８．５（２０℃）の範囲で行うことが特に好ましい。
　なお、試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、活性測定反応におけるｐＨを前記のｐＨ範囲に保つため、前記のｐＨ範囲に緩衝能を有する緩衝剤を適宜存在させることが好ましい。
１８．他の成分
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、必要に応じて適宜、防腐剤、安定化剤、活性化剤、又は糖類等の前記記載した成分以外の成分を前記の活性測定反応時に存在させることができる。
１９．測定手法
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法における、試料中の総プロテインＳの活性の測定は、用手法により行ってもよく、又は自動分析装置等の装置を使用して行ってもよい。
２０．測定段階
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法おいて、前記詳述した活性測定反応は、１回に全ての成分と試料との接触を行わせて、全ての反応を１段階に行ってもよく（１ステップ法）、また、成分を分け、接触を複数段階に分けて行うことにより活性測定反応を複数段階に分けて行ってもよい（多ステップ法）。
　複数段階に分ける揚合、特に制限はないが、例えば次のように行うことができる。
（１）２ステップ法－１
（ａ）　試料、活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン及び活性化血液凝固第Ｖ因子を接触させる。
（ｂ）　次に、前記（ａ）のものに、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を接触させる。
（２）２ステップ法－２
（ａ）　試料、活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させる。
（ｂ）　次に、前記（ａ）のものに、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質を接触させる。
（３）３ステップ法
（ａ）　試料、活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させる。
（ｂ）　次に、前記（ａ）のものに、活性化血液凝固第Ｖ因子を接触させる。
（ｃ）　更に、前記（ｂ）のものに、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を接触させる。
ＩＩＩ．試料中の総プロテインＳのタンパク質量測定方法
　先に述べたように、本発明においては、総プロテインＳタンパク質量を測定する方法（測定方法）及び試薬（測定試薬）は、特に限定はなく、総プロテインＳのタンパク質量を測定することができる方法及び試薬であればどのようなものでもよいが、以下、この試料中の総プロテインＳのタンパク質量測定方法の例について説明を行う。
１．総論
　試料中の総プロテインＳのタンパク質量測定方法であるが、プロテインＳに対する抗体を固定化した担体粒子と試料とを接触させ、前記抗体と試料に含まれていたプロテインＳとの抗原抗体反応により生成した凝集物を測定することにより、試料中の総プロテインＳタンパク質量を測定する方法において、前記抗原抗体反応の反応時にＣ４ｂ結合タンパク質を存在させるものであることが好ましい。
　なお、試料中の総プロテインＳのタンパク質量測定方法においては、担体粒子がラテックス粒子であることが好ましい。
　また、試料中の総プロテインＳのタンパク質量測定方法においては、試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定が、次の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む方法により行われるものであることが好ましい。
（ａ）試料と、Ｃ４ｂ結合タンパク質とを混合し、接触させ、この混合液中において前記試料に含まれる遊離のプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体を形成させる工程。
（ｂ）前記混合液をプロテインＳに対する抗体を固定化した担体粒子と接触させ、前記抗体とプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体との抗原抗体反応により生成した凝集物を測定する工程。
２．プロテインＳに対する抗体
　試料中の総プロテインＳのタンパク質量測定方法において、プロテインＳに対する抗体とは、プロテインＳに結合することができる抗体（抗プロテインＳ抗体）のことをいう。
　この抗プロテインＳ抗体としては、例えば、（プロテインＳに結合することができる）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体を含む抗血清、キメラ抗体、ヒト化抗体又は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、及びこれらの抗体の断片〔Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｄｓＦｖなど〕等を挙げることができる。
　また、前記の抗体又は抗体断片に、蛋白質又は低分子化合物を結合させた誘導体を使用することもできる。
　なお、抗プロテインＳ抗体の由来については特に限定はなく、例えば、哺乳動物（マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、若しくはウマなど）、又は鳥類（ニワトリ、ウズラ、キジ、ダチョウ、若しくはアヒルなど）等を挙げることができる。
３．担体粒子
　試料中の総プロテインＳのタンパク質量測定方法において、担体粒子は、前記の抗プロテインＳ抗体を固定化することができるものであれば、特に制限なく用いることができる。
　すなわち、プロテインＳと抗プロテインＳ抗体との抗原抗体反応を利用して試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定を行う測定試薬及び測定方法に使用されている担体粒子、又は使用することが可能な担体粒子であればよい。
　この担体粒子の材質は、特に限定はなく、例えば、ポリスチレン、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル－アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン－ブタジエン共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ゼラチン、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等を挙げることができる。
　そして、この担体粒子としては、例えば、ラテックス粒子、金属コロイド粒子、リポソーム、マイクロカプセル、又は赤血球等の粒子等を挙げることができる。
　また、この担体粒子としては、ラテックス粒子であることが好ましい。
　試料中の総プロテインＳのタンパク質量測定方法において、抗プロテインＳ抗体を担体粒子に固定化することは、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行うことができる。
　物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗プロテインＳ抗体と、担体粒子とを、緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、或いは緩衝液等に溶解した抗プロテインＳ抗体を、担体粒子に接触させること等により行うことができる。
　また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号　臨床検査のためのイムノアッセイ－技術と応用－」，臨床病理刊行会，１９８３年発行;日本生化学会編「新生化学実験講座１　タンパク質ＩＶ」、東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗プロテインＳ抗体と、担体粒子とを、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗プロテインＳ抗体と、担体粒子の、それぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と前記の二価性の架橋試薬とを反応させること等により行うことができる。
　更に、抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子の自然凝集や、非特異的反応等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子の表面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、担体粒子のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
　なお、試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定を、ラテックス免疫比濁法等の比濁法により測定を行う場合、ラテックス粒子等の担体粒子の大きさ（粒径）については、特に制限はない。
　しかし、抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子が、試料中に含まれていたプロテインＳとの凝集物（凝集塊）を生成する程度、及びこの生成した凝集物の測定の容易さ等の理由より、担体粒子の大きさ（粒径）は、その平均径（平均粒径）が、０．０１μｍ～１０μｍであることが好ましく、０．０４μｍ～１μｍであることがより好ましい。
　また、試料中のプロテインＳのタンパク質量の測定方法において、担体粒子は、その大きさ（粒径）、材質、又は形状等が異なる２種類以上の担体を使用してもよい。
　なお、試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定を、ラテックス免疫比濁法等の比濁法により測定を行う場合、抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子の測定反応時における濃度は、前記の特異的結合物質の担体表面上での分布密度、担体粒子の大きさ（粒径）、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概に言うことはできない。
　しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、担体粒子に固定化された抗プロテインＳ抗体と、試料中に含まれていたプロテインＳとの、抗原抗体反応が行われる測定反応時に、抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子の濃度が、この測定反応時の反応混合液中において０.００５～１％（Ｗ／Ｖ）となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子を測定試薬に含有させることが好ましい。
　試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定方法においては、抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質；カルシウムイオンなどの各種金属イオン；カルシウム塩などの各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上と共存させてもよい。
　そして、上記の各物質を共存させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１～１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１～５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
４．Ｃ４ｂ結合タンパク質
　試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定方法においては、Ｃ４ｂ結合タンパク質を存在させることが好ましい。ここで、Ｃ４ｂ結合タンパク質とは、肝細胞やマクロファージで産生される高分子糖タンパク質であり、プロテインＳと１対１で特異的に結合し、複合体を形成するものをいう。
　また、試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定方法において用いるＣ４ｂ結合タンパク質は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
　例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
　試料中の総プロテインＳのタンパク質量測定方法において、前記のＣ４ｂ結合タンパク質を総プロテインＳタンパク質量の測定試薬に存在させる濃度は、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、Ｃ４ｂ結合タンパク質と試料に含まれていた遊離プロテインＳとの比が０．９以上（Ｃ４ｂ結合タンパク質／遊離プロテインＳ≧０．９）となるように設定することが好ましい。
　なお、前記のＣ４ｂ結合タンパク質を総プロテインＳタンパク質量の測定試薬に存在させる方法であるが、このＣ４ｂ結合タンパク質を、担体粒子に固定化された抗プロテインＳ抗体と、試料に含まれていたプロテインＳとの、抗原抗体反応が行われる測定反応時に、前記の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬に存在させることができればいかなる方法でも良い。
　例えば、前記のＣ４ｂ結合タンパク質を緩衝液に含有させた試薬を調製し、抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子を含む試薬と混合することによって、担体粒子に固定化された抗プロテインＳ抗体と試料に含まれていたプロテインＳとの、抗原抗体反応が行われる測定反応時に、Ｃ４ｂ結合タンパク質を存在させるようにすれば良い。
　なお、通常、健常者の試料中には、「プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）」と、「遊離のプロテインＳ（遊離型）」の両方が存在しているが、本発明においては、Ｃ４ｂ結合タンパク質を、試料と混合、接触させることにより、試料に含まれていた遊離のプロテインＳがこのＣ４ｂ結合クンパク質と複合体を形成する。
　すなわち、試料中のプロテインＳは、全て「プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）」となる。
　これにより、試料中の総プロテインＳのタンパク質量測定方法では、全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕についてそのタンパク質量を、すなわち、総プロテインＳのタンパク質量を測定することが可能となる。
５．試料
　試料中の総プロテインＳのタンパク質量測定方法において、試料とは、プロテインＳが存在する可能性があり、かつプロテインＳの存在の有無、又は含有量（濃度）の測定を行おうとするものをいう。
　このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、唾液、汗、尿、涙、髄液、羊水、腹水などの体液、又は肝臓、心臓、脳、骨、毛髪、皮膚、爪、筋肉、神経組織などの臓器、組織若しくは細胞などの抽出液等、プロテインＳが含まれる可能性のあるものを挙げることができる。
６．測定方法
　試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定方法は、担体粒子に固定化された「プロテインＳに対する抗体」と試料中に含まれていた「プロテインＳ」との抗原抗体反応により生成した凝集物を測定することにより、試料中の総プロテインＳタンパク質量を測定する方法において、該抗原抗体反応の反応時にＣ４ｂ結合タンパク質を存在させるものである。
　試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定方法における測定操作は、公知の測定操作に従って行うことができる。
　この測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
　また、この測定は、１ステップ法（１試薬法）により行ってもよいし、又は２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。
　以下、ラテックス免疫比濁法を測定原理とする試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬を用いて、試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定を行う場合を例にとって、具体的に説明を行う。
（１）まず、試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定試薬として、以下のものを準備する。
　第１試薬：Ｃ４ｂ結合タンパク質を含有する緩衝液
　第２試薬：プロテインＳに対する抗体を固定化したラテックス粒子を含有する緩衝液
（２）血漿等の試料の一定量と前記の第１試薬の一定量を混合し、一定温度下で一定時間静置する。
　なお、試料と第１試薬の混合比率（量比）は、適宜選択すればよい。
　また、前記の静置時の温度は、室温（１～３０℃）又は微温（３０～４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい（例えば、３７℃等）。
　試料と第１試薬との混合により、試料に含まれていた遊離のプロテインＳがこのＣ４ｂ結合タンパク質と複合体を形成する。
　すなわち、試料中のプロテインＳは、全て「プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）」となる。
（３）一定時間後、前記の試料と第１試薬との混合液に、前記の第２試薬の一定量を添加、混合し、反応混合液として、一定温度下で一定時間静置する。
　なお、第２試薬の添加量は、適宜選択すればよい。
　また、前記の静置時の温度は、室温（１～３０℃）又は徴温（３０～４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい（例えば、３７℃等）。
　そして、前記の静置の時間は、１分以上、１０分以下の一定時間であることが好ましく、３分以上、５分以下の一定時間であることがより好ましい。
　試料と第１試薬との混合液への第２試薬の添加、混合により、ラテックス粒子に固定化した抗プロテインＳ抗体と、試料中のプロテインＳ（プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型））との抗原抗体反応（測定反応）を行わせる。
　そして、この抗原抗体反応（測定反応）により、「…〔抗プロテインＳ抗体＝ラテックス粒子＝抗プロテインＳ抗体〕－〔プロテインＳ〕－〔抗プロテインＳ抗体＝ラテックス粒子＝抗プロテインＳ抗体〕…」の架橋が形成され、抗プロテインＳ抗体を固定化したラテックス粒子同士の凝集物が生成する。
（４）そして、分析装置又は分光光度計等において、反応混合液に光を照射して、生成したラテックス粒子同士の凝集物により生ずるシグナルである適当な波長の透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加を測定することにより、生成した前記凝集物の量、すなわち、試料中の総プロテインＳのタンパク質量を求める。
（５）そして、「試料の測定を行って得た測定値（透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値）」と、「標準液、標準血清等の標準物質（既知濃度のプロテインＳを含む試料）の測定を行って得た測定値（透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値）」とを比較することにより、測定を行った試料中の総プロテインＳのタンパク質量（濃度）の算出を行う。
　以下、本発明を実施例により更に説明する。なお、本発明はこれらにより限定されるものではない。
〔実施例１〕（総プロテインＳの活性値と総プロテインＳのタンパク質量との比較）
　試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬により得た総プロテインＳの活性値と、ラテックス比濁法による試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定方法及び測定試薬により得た総プロテインＳのタンパク質量とを比較した。
１．試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬による測定
１．総プロテインＳの活性測定試薬
（１）希釈液
　下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、希釈液を調製した。
　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（和光純薬工業社、日本国）　　０．０６％（Ｗ／Ｖ）
　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　　０．１％（Ｗ／Ｖ）
　塩化ナトリウム　　０．１Ｍ
　クエン酸三ナトリウム　　１０．６ｍＭ
　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン　５０ｍＭ
（２）第１試薬
　下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第１試薬を調製した。
　活性化プロテインＣ（精製ヒト活性化プロテインＣ；Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国）　　３９７ｐＭ
　界面活性剤
　リン脂質
　塩化カルシウム　　２．５ｍＭ
　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）　　０．１．％（Ｗ／Ｖ）
　塩化ナトリウム　　　０．１Ｍ
　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン　　５０ｍＭ
　なお、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（和光純薬工業社、目本国）を０.００６％（Ｗ／Ｖ）の濃度となるように含有させた。
　また、リン脂質は、ホスファチジルセリン（ブタ脳ホスファチジルセリン；ＰＳ；ＤＯＯＳＡＮ　Ｓｅｒｄａｒｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．４ｍｇ、ホスファチジルコリン（ブタ肝臓ホスファチジルコリン；ＰＣ；ＤＯＯＳＡＮ　Ｓｅｒｄａｒｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．４ｍｇ、及びホスファチジルエタノールアミン（ブタ肝臓ホスファチジルエタノールアミン；ＰＥ；ＤＯＯＳＡＮ　ＳｅｒｄａｒｙＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．４ｍｇをそれぞれ試験管に採取し、エバポレーターにて溶媒であるクロロフォルムを蒸発させた後、蒸留水を添加し１分間激しく撹絆した後、６０℃で１０分間超音波処理を行って調製したホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が１：１：１（すなわち、３３．３３％（Ｗ／Ｖ）：３３．３３％（Ｗ／Ｖ）：３３．３３％（Ｗ／Ｖ））のリン脂質を、２４μＭの濃度となるように含有させた。〔なお、このホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が１：１：１のリン脂質を、以下「リン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝１：１：１）」ということがある。］
（３）第２試薬
　下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第２試薬を調製した。
　活性化血液凝固第Ｖ因子（精製ヒト活性化血液凝固第Ｖ因子；Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ　Ｔｅｃｈｎｏｌｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国）　　３５７ｐＭ
　界面活性剤
　リン脂質
　塩化カルシウム　　２．５ｍＭ
　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）　　０．１％（Ｗ／Ｖ）
　塩化ナトリウム　　　０．１Ｍ
　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン　　５０ｍＭ
　なお、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（和光純薬工業社、日本国）を０．００６％（Ｗ／Ｖ）の濃度となるように含有させた。
　また、リン脂質は、前記のリン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝１：１：１）を、２４μＭの濃度となるように含有させた。
（４）第３試薬
　下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．５（２０℃）に調整して、第３試薬を調製した。
　活性化血液凝固第Ｘ因子（精製ウシ活性化血液凝固第Ｘ因子；Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ社、米国）　　５０ｐＭ
　プロトロンビン（精製ヒトプロトロンビン；Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国）　　７３８ｎＭ
　テストチーム（登録商標）発色基質Ｓ－２２３８（トロンビンの基質〔トロンビンの発色基質〕；製造元：Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ－Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社〔イタリア国〕、販売元：積水メディカル社〔日本国〕　　７５０μＭ
　リン脂質
　塩化カルシウム　　５．０ｍＭ
　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）　　０．１％（Ｗ／Ｖ）
　塩化ナトリウム　　　０．１５Ｍ
　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン　　５０ｍＭ
　なお、リン脂質は、ホスファチジルセリン（ブタ脳ホスファチジルセリン；ＰＳ；ＤＯＯＳＡＮ　Ｓｅｒｄａｒｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．６ｍｇ、ホスファチジルコリン（ブタ肝臓ホスファチジルコリン；ＰＣ；ＤＯＯＳＡＮ　Ｓｅｒｄａｒｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．４ｍｇ、及びホスファチジルエタノールアミン（ブタ肝臓ホスファチジルエタノールアミン；ＰＥ；ＤＯＯＳＡＮ　Ｓｅｒｄａｒｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）１．０ｍｇをそれぞれ試験管に採取し、エバポレーターにて溶媒であるクロロフォルムを蒸発させた後、蒸留水を添加し１分間激しく撹拌した後、６０℃で１０分間超音波処理を行って調製したホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が３：２：５（すなわち、３０％（Ｗ／Ｖ）：２０％（Ｗ／Ｖ）：５０％（Ｗ／Ｖ））のリン脂質を、７．５μＭの濃度となるように含有させた。〔なお、このホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が３：２：５のリン脂質を、以下「リン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝３：２：５）」ということがある。〕
２．試料
　次の（１）～（４）をそれぞれ試料として用いた。
（１）健常人２１１名の血漿
（２）　プロテインＳの遺伝子変異であるＰＳ－Ｋ１５５Ｅヘテロ接合体（プロテインＳの異常症の一つであるプロテインＳ徳島）であることが判明している７名の血漿
（３）　プロテインＳの遺伝子変異であるＰＳ－Ｋ１５５Ｅホモ接合体（プロテインＳの異常症の一つであるプロテインＳ徳島）であることが判明している１名の血漿
（４）　プロテインＳの遺伝子変異であるＣ２０６Ｆヘテロ接合体（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明している１名の血漿
３．試料中の総プロテインＳの活性値の測定
　各試料の総プロテインＳの活性値の測定は、日立ハイテクノロジーズ社（日本国）の７１７０Ｓ形汎用自動分析装置を使用して行った。
（１）　前記２の試料それぞれについて、前記１の（１）の希釈液により希釈倍率１５倍で希釈を行った。
（２）　前記（１）で希釈した試料２．０μＬに、前記１の（２）の第１試薬の９８μＬを添加し、３７℃で１．４分間反応させた。
（３）　次に、前記１の（３）の第２試薬の２０μＬを添加し、３７℃で８．３分間反応させた。
（４）　次に、前記１の（４）の第３試薬の２３６μＬを添加し、３７℃で反応させた。
（５）　前記（４）における第３試薬の添加の後、主波長４０５ｎｍ及び副波長５０５ｎｍにおける吸光度の変化を１２．３分間測定した。
４．試料中の総プロテインＳの活性値の算出
　前記３の（５）において測定した第３試薬添加後の吸光度変化（反応のタイムコース）の値を微分して、試料中の総プロテインＳの活性値を求めた。
　なお、予め、総プロテインＳ活性値が既知の試料について、前記３の通り測定を行い、測定した第３試薬添加後の吸光度変化（反応のタイムコース）の１分間当りの吸光度変化量を、時間に対して直線式（微分直線）を求め、この直線の傾きをこの既知の総プロテインＳ活性値に対してプロットして検量線を作成した。
　そして、前記２の試料を前記３の通り測定を行って得た、第３試薬添加後の吸光度変化（反応のタイムコース）の１分間当りの吸光度変化量を、時間に対して直線式（微分直線）を求め、この直線の傾きを前記の検量線に当てはめて、試料中の総プロテインＳの活性値を算出した。
　すなわち、測定により得られた吸光度より吸光度変化の加速度（吸光度の二次微分値）を求め、検量線に当てはめることにより、試料中の総プロテインＳの活性値を算出した。
　この試料中の総プロテインＳの活性値の測定を行って得られた結果を図１に示した。
ＩＩ．ラテックス比濁法による試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定方法及び測定試薬による測定
１．ラテックス比濁法による総プロテインＳのタンパク質量の活性測定試薬
（１）第１試薬
　Ｃ４ｂ結合タンパク質を、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８４７～８５６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
　次に、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡ、０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭ　ＭＥＳ－塩酸緩衝液〔ｐＨ６．２（２０℃）〕を調製した。
　ここに、前記の通り調製したＣ４ｂ結合タンパク質を２５μｇ／ｍＬの濃度となるように添加し、第１試薬とした。
（２）第２試薬
（ａ）抗プロテインＳ抗体の調製
　本発明者らが、精製した遊離状態のプロテインＳを免疫抗原として、常法に従って抗プロテインＳ抗体の調製を行った。
　プロテインＳのＣ４ｂ結合タンパク質との結合部位以外の部位に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングを行い、マウス／マウスのハイブリドーマ（９Ｈ６株）を得た。
　このハイブリドーマ（９Ｈ６株）より産生されたマウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体の５ｍｇを、０．５ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。
　これに、０．６ｍｇのＳ－アセチルメルカプトコハク酸無水物を溶解した０．０１ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、室温で３０分間インキュベートした。
　次に、これに、０．１Ｍ　ＥＤＴＡ水溶液の０．０２ｍＬ、１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬ、及び１Ｍヒドロキシルアミン塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬをそれぞれ加え、３０℃で３０分間インキュベートした。
　その後、これを、５ｍＭ　ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいた、セファデックスＧ－２５カラムでゲルろ過を行い、メルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインＳモノクローナル抗体を得た。
（ｂ）抗プロテインＳ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
　平均粒径０．１９２μｍのラテックス粒子の１０％懸濁液１．０ｍＬと５０ｍＭ　ＭＥＳ－塩酸緩衝液〔ｐＨ６．０（２０℃）〕１．０ｍＬとを混和し、更に３２０ｍＭカルボジイミド（同仁化学研究所；製品番号：３４８－０３６３１）水溶液３２μＬを添加して混和し、氷上で１０分間放置した。
　前記の氷上で１０分間放置したラテックス粒子懸濁液１．２ｍＬに、前記（ａ）で調製したメルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインＳモノクローナル抗体を０．０８３ｇ／ｄＬの濃度で５０ｍＭ　ＭＥＳ－塩酸緩衝液〔ｐＨ６．０（２０℃）〕に混和した液１．８ｍＬを加え、４℃で一晩撹拌した。
　次に、遠心分離により上清を除去した後、沈殿部を０．８％ＢＳＡを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液〔ｐＨ８．０（２０℃）〕にて懸濁し、３７℃で３時間放置し、ブロッキング処理を行った。
　次に、遠心分離により沈殿部を回収した後、これを０．１％ＢＳＡを含む０．０５％アジ化ナトリウム水溶液で再分散し、波長７００ｎｍにおける吸光度が１５，０ＯＤとなるように懸濁した。
　これを抗プロテインＳ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液とした。
（ｃ）第２試薬の調製
　前記（ｂ）で調製した抗プロテインＳ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液を、０．１％ＢＳＡを含む０．０５％アジ化ナトリウム水溶液で１０倍希釈し、０．１％の「抗プロテインＳ抗体固定化ラテックス粒子」を含有する懸濁液を調製した。
　これを第２試薬とした。
２．試料
　前記のＩの２の（１）～（４）の各試料を、試料として用いた。
３．試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定及び算出
（１）測定手順
（ａ）測定は、東芝－１２０ＦＲ自動分析装置（東芝メディカルシステムズ社製）を使用して行った。
　まず、測定用セル（キュベット）に、前記２の試料の３μＬを添加した。
　次に、これらの測定用セル（キュベット）に、前記１の（１）の第１試薬の１００μＬを添加し、混合した。
　そして、これらの測定用セル（キュベット）を、３７℃で静置した。
　これにより、前記の試料に含まれていた遊離のプロテインＳと、前記の第１試薬中のＣ４ｂ結合タンパク質との複合体を形成させた。すなわち、試料に含まれていたプロテインＳは、全て「プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）」となった。
（ｂ）前記の第１試薬の添加後４分４０秒目（１６ポイント目）に、これらの測定用セル（キュベット）内の混合液に、更に、前記１の（２）の（ｃ）の第２試薬の１００μＬを添加し、混合した。
（ｃ）前記の第１試薬の添加後５分３５秒目（１９ボイント目）に、これらの測定用セル（キュベット）内の混合液の吸光度（波長７００ｎｍ）を試料盲検として測定した。
　そして、これらの測定用セル（キュベット）を、３７℃で静置して、反応を行わせた。
　これにより、前記のラテックス粒子に固定化された抗プロテインＳ抗体と、前記の試料に含まれていたプロテインＳとの抗原抗体反応を行わせ、ラテックス粒子の凝集塊を生成させた。
（ｄ）前記の第１試薬の添加後９分４７秒目（３３ボイント目）に、この測定用セル（キュベット）内の反応混合液の吸光度（波長７００ｎｍ）を、前記試料の測定値として測定した。
（ｅ）前記（ｄ）において測定した吸光度（測定値）から前記（ｃ）において測定した吸光度（試料盲検）を差し引き、吸光度差を得た。
　なお、この吸光度差は試料に含まれる総プロテインＳタンパク質量（濃度）に比例したものである。
　これらの試料の吸光度差より検量線を作成し、実検体（３．２％クエン酸血漿）を同様の方法で測定した際の吸光度差を検量線に当てはめて、試料中の総プロテインＳタンパク質濃度を求めた。
　このようにして、前記２の各試料の総プロテインＳのタンパク質量を得た。
　この試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定を行って得られた結果を図１に示した。
ＩＩＩ．測定結果
１．図の説明
　前記Ｉにおける試料中の総プロテインＳの活性値の測定結果と、前記ＩＩにおける試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定結果とを比較する図を、図１として示した。
　この図において、横軸（ｘ）は前記ＩＩのラテックス比濁法による試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位は「μｇ／ｍＬ」である。
　また、この図において、縦軸（ｙ）は前記Ｉにおける試料中の総プロテインＳの活性値の測定結果を表す。この測定値の単位は「μｇ／ｍＬ当量」である。
２．健常人の試料の比較
　前記Ｉの総プロテインＳの活性値の測定結果と、前記ＩＩのラテックス比濁法による総プロテインＳのタンパク質量の測定結果との比較を、次のようにして行った。
　試料が健常人２１１名の血漿である場合について、前記Ｉの総プロテインＳの活性値の測定結果と、前記ＩＩの総プロテインＳのタンパク質量の測定結果より、プロテインＳの比活性（総プロテインＳ活性値／総プロテインＳタンパク質量）を求めた。
　この健常人２１１名の血漿の試料のプロテインＳの比活性の平均値と標準偏差（ＳＤ）を算出し、平均±２ＳＤ（０．９８±０．２６）の範囲を求めた。
　この範囲を外れる試料が１０あったので、この１０の試料を除外した健常人２０１名の試料について、再度、総プロテインＳの活性値の測定結果と、総プロテインＳのタンパク質量の測定結果より求めたプロテインＳの比活性（総プロテインＳ活性値／総プロテインＳタンパク質量）の平均値と標準偏差を算出し、平均±２ＳＤ（０．９９±０．２０）の範囲と平均±３ＳＤ（０．９９±０．３０）の範囲を求めた。
　なお、この図は、各々の試料について、試料中の総プロテインＳの活性値を総プロテインＳのタンパク質量で除した比活性を表すものでもある。
　この図において、比活性の平均値であるｙ＝０．９９ｘの式の線を実線で表した。
　また、この式ｙ＝０．９９ｘの線の上及び下に、平均±２ＳＤを示す線（ｙ＝１．１９ｘ、及びｙ＝０．７９ｘ）を破線でこの図に表した。
　そして、この式ｙ＝０．９９ｘの線の上に平均＋３ＳＤを示す線（ｙ＝１．２９ｘ）を点線で、またこの式ｙ＝０．９９ｘの線の下に平均－３ＳＤを示す線（ｙ＝０．６９ｘ）を実線でこの図に表した。
　健常人２１１名の血漿の試料の測定結果において、この図１で、前記のｙ＝０．６９ｘ（平均－３ＳＤ）の線よりも下に外れるものが、７つ認められた。
　すなわち、総プロテインＳの活性値を総プロテインＳのタンパク質量で除した比活性が０．６９以下の試料が、７つ認められた。
　これらの比活性が０．６９以下の７つの試料のうち、すなわち総プロテインＳの活性値と総プロテインＳのタンパク質量が大きく乖離している７つの試料のうち、同意が得られた３つの試料についてプロテインＳ遺伝子の塩基配列を調べたところ、これらの３つの試料のいずれもプロテインＳ遺伝子のＰＳ－Ｋ１５５Ｅ変異（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明した。〔図１において、これらの３つの試料に矢印（↓又は↑）を付した。〕
　このことより、試料中の総プロテインＳの活性値及び試料中の総プロテインＳのタンパク質量を測定し、この測定により得た総プロテインＳの活性値と総プロテインＳのタンパク質量とを、比活性を求める等により比較することにより、プロテインＳの遺伝子の変異等のプロテインＳの異常症を検出することが出来ることが確かめられた。
３．プロテインＳの遺伝子変異（プロテインＳの異常症）であることが判明している試料の比較
　前記Ｉの２の（２）～（４）のプロテインＳの遺伝子変異（プロテインＳの異常症）であることが判明している試料（計９名の試料）のそれぞれについて、前記Ｉの総プロテインＳの活性値の測定結果と、前記ＩＩのラテックス比濁法による総プロテインＳのタンパク質量の測定結果との比較を行う。
　図１において、前記Ｉの２の（２）のプロテインＳの遺伝子変異であるＰＳ－Ｋ１５５Ｅヘテロ接合体（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明している７名の血漿の試料を「●」で示した。
　また、前記Ｉの２の（３）のプロテインＳの遺伝子変異であるＰＳ－Ｋ１５５Ｅホモ接合体（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明している１名の血漿の試料を「◆」で示した。
　そして、前記Ｉの２の（４）のプロテインＳの遺伝子変異であるＣ２０６Ｆヘテロ接合体（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明している１名の血漿の試料を「□」で示した。
　プロテインＳの遺伝子変異であることが判明しているこれらの９つの試料（●、◆及び□）はいずれも、前記の図１におけるｙ＝０．６９ｘ（平均－３ＳＤ）の線よりも下に外れていることが分かる。
　すなわち、プロテインＳの遺伝子変異であることが判明しているこれらの９つの試料（●、◆及び□）はいずれも、総プロテインＳの活性値を総プロテインＳのタンパク質量で除した比活性が０．６９以下であることが分かる。
　つまり、これらの９つの試料は、総プロテインＳの活性値と総プロテインＳのタンパク質量が大きく乖離していることが分かる。
　よって、試料中の総プロテインＳの活性値及び試料中の総プロテインＳのタンパク質量を測定し、この測定により得た総プロテインＳの活性値と総プロテインＳのタンパク質量とを、比活性を求める等により比較することにより、プロテインＳの遺伝子の変異等のプロテインＳの異常症を検出することが出来ることが、これらのプロテインＳの遺伝子変異の９つの試料の比較結果からも確かめられた。
　本発明のプロテインＳ異常症の検出方法は、正確、簡便かつ迅速にプロテインＳ異常症を検出することができるものである。
　よって、本発明のプロテインＳ異常症の検出方法を用いることにより、プロテインＳの異常症を簡便かつ正確に検出し、血栓症等の疾患の予防、診断及び治療等に役立てることができる。

Claims (3)

  1. プロテインＳ異常症の検出方法であって、試料中の総プロテインＳ活性値及び総プロテインＳタンパク質量を測定する工程、及び、前記測定により得た総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量とを比較する工程、を含むプロテインＳ異常症の検出方法。
  2. 測定により得た総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量とを比較し、この総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量とが乖離している場合にはプロテインＳ異常症である又はその疑いがあるとする、請求項１記載のプロテインＳ異常症の検出方法。
  3. 測定により得た総プロテインＳ活性値と総プロテインＳタンパク質量とを比較することが、この総プロテインＳ活性値をこの総プロテインＳタンパク質量で除した比活性を求めることである、請求項１又は請求項２記載のプロテインＳ異常症の検出方法。
     
PCT/JP2012/056288 2011-03-14 2012-03-12 プロテインｓ異常症の検出方法 WO2012124654A1 (ja)

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