WO2014184478A1 - Procédé de diagnostic de la coagulation intravasculaire disséminée (civd) - Google Patents

Procédé de diagnostic de la coagulation intravasculaire disséminée (civd) Download PDF

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WO2014184478A1
WO2014184478A1 PCT/FR2014/051091 FR2014051091W WO2014184478A1 WO 2014184478 A1 WO2014184478 A1 WO 2014184478A1 FR 2014051091 W FR2014051091 W FR 2014051091W WO 2014184478 A1 WO2014184478 A1 WO 2014184478A1
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microparticles
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civd
membrane
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PCT/FR2014/051091
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Florence TOTI
Ferhat MEZIANI
Xavier DELABRANCHE
Original Assignee
Hôpitaux Universitaires De Strasbourg
Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs -
Université De Strasbourg
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Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting and / or detecting disseminated intravascular coagulation (DIC) in a biological sample and a kit for predicting and / or detecting disseminated intravascular coagulation (DIC) in a sample. organic.
  • DIC disseminated intravascular coagulation
  • the present invention also relates to a method of monitoring the course of disseminated intravascular coagulation (DIC) from a biological sample.
  • DIC disseminated intravascular coagulation
  • the present invention relates in particular to a method of monitoring the efficacy of a treatment of disseminated intravascular coagulation (DIC) from a biological sample.
  • DIC disseminated intravascular coagulation
  • the present invention finds application particularly in the medical and veterinary field.
  • references in square brackets 20 ([]) refer to the list of references presented at the end of the text.
  • Coagulation is constantly activated during septic shock and participates in the host's defense. However, this activation
  • CIVD intravascular coagulation disseminated
  • PhtdSer phosphatidylserine
  • the microparticles constitute a pool of circulating biomarkers and bio-effectors capable of modulating many vascular functions including the procoagulant response and vasomotricity. They carry a biological signal specific to the conditions of their emission by the parental cell. In addition, their membrane characteristics confers properties generally procoagulant, pro-inflammatory and pro-apoptotic, but also pro-fibrinolytic.
  • the microparticles may prove beneficial or deleterious for the body.
  • the microparticles are detectable at low concentrations in the blood and in biological fluids and testify to the cellular homeostasis of the tissues.
  • High levels of circulating microparticles are reported in many thrombotic, inflammatory, traumatic, degenerative, or cancerous disease states.
  • the main source of microparticles is the platelet, but variations of microparticles from other cellular sources may be specifically associated with certain pathologies such as heart transplant rejection or pulmonary arterial hypertension.
  • microparticles could thus promote the important vasoplegia observed during septic shock, participate in the modulation of the oxidative status or contribute to a procoagulant status.
  • Serious infections such as septic shock, are characterized by activation of coagulation with a generally procoagulant and antifibrinolytic state.
  • hemostatic processes are necessary to defend the host against the pathogen and only excessive thrombin production can lead to visceral dysfunction.
  • the activation of coagulation and fibrinolysis reactions during sepsis limits the growth and dissemination of the pathogen, thus constituting a mechanism for defense as well as innate immunity or complement activation.
  • Microparticles that increase the surface of interaction with the circulating elements then have a beneficial effect. They thus promote receptor / ligand interactions and cell recruitment (platelets, monocytes, neutrophils) at the initial site of vascular injury and local inflammatory response.
  • the Tissue Factor (FT) carried by the monocytic microparticles would constitute a second procoagulant entity carried by the microparticles. Indeed, it plays a key role in the initiation and propagation of the coagulation cascade. It has been shown that monocytic microparticles participate in the dissemination of a procoagulant potential by expressing FT on their surface. The thrombin generation is possible on the surface of the microparticles exposing the FT (MP-FT +) independently of so-called contact phase coagulation reactions which require the presence of factor FXII. The procoagulant properties of MP-FT + have been reported in meningococcal infection but also after injection of LPS in healthy individuals.
  • the diagnosis of DIC is biologically difficult.
  • Two tests based on the development of scores combining the measurement of different biological variables have been proposed.
  • the first described in 2001 comes from the International Society for Thrombosis and Haemostasis (ISTH), the second from the Japanese Association for Acute Medicine (JAAM) in 2005 and reviewed in 2006.
  • the NSTH score is based on the presence of severe thrombocytopenia, a decrease in the prothrombin level (prolongation of the prothrombin time), a consumption of fibrinogen and an increase in D-dimer levels, markers of the fibrinolysis.
  • the JAAM score was developed to detect CIVD during septic shock, and does not retain fibrinogen as a diagnostic criterion while using more "consistent" cut-off values for D-dimer and platelets in a syndrome.
  • systemic inflammatory response SIRS
  • Further discussions at the ISTH CIVD committee level were conducted to decline the entity "CIVD” in obstetric, traumatic, septic or oncological coagulopathies to better define the parameters and threshold values of the ISTH score.
  • the present invention aims to overcome the disadvantages of the prior art by providing a method for predicting and / or detecting disseminated intravascular coagulation (DIC) from a biological sample comprising a measurement of the concentration of a biological marker.
  • DIC disseminated intravascular coagulation
  • the inventors of the present invention show that the method of the invention makes it possible to determine the presence of a CIVD in an individual presenting with septic shock and / or to identify an individual capable of developing a CIVD.
  • biological marker is meant at least one biological marker selected from the group comprising membrane microparticles carrying the CD31 differentiation cluster, membrane microparticles carrying the CD105 differentiation cluster, soluble E-selectin, soluble glycoprotein V circulating factor V and soluble P-selectin.
  • membrane microparticles is intended to mean the membrane microparticles released, for example into the vascular space from cells, for example endothelial cells, platelets, monocytes, granulocytes or polynuclear cells (neutrophils, eosinophils or basophils) or their circulating precursors, erythrocyte cells, lymphocytes or non-vascular origin.
  • the membrane microparticles may have a size, that is to say an individual diameter, between 50 nm and 1 ⁇ and may associate in aggregates with circulating cells including polynuclear.
  • membrane microparticles may carry tissue factor activity or fibrinolytic activity.
  • Biological sample herein means any sample obtained from mammals, for example a mammal selected from the group consisting of the order Monotremata, Didelphimorphia, Paucituberculata, Microbiotheria, Notoryctemorphia, Dasyuromorphia, Peramelemorphia, Diprotodontia, Tubulidentata, Sirenia, Afrosoricida, Macroscelidea, Hyracoidea, Proboscidea, Cingulata, for example the armadillo, Pilosa, Scandentia, Dermoptera, Primates, Rodentia, Lagomorpha, Erinaceomorpha, Soricomorpha, Chiroptera, Pholidota, Carnivora, Perissodactyla, Artiodactyla and Cetacea. It can be for example a human or an animal. This may be for example a farm animal, a pet, an endangered animal or any other animal, including genetically manipulated.
  • the biological sample may be a sample of blood, plasma, serum, bronchiolo-alveolar fluid.
  • the biological sample can come from a mammal having septic shock or a risk of septic shock.
  • the measurement of the concentration of the biological marker chosen can be carried out by any suitable method known to those skilled in the art.
  • the measurement of the concentration of membrane microparticles carrying a Differentiation Cluster can be carried out by any suitable method known to those skilled in the art. It may be for example a flow cytometry method based on the recognition of fluorescent probes, for example labeled antibodies, protein or lipid probes, fixed or not on beads, or even probes recognizing the genetic material included. in microparticles like miRNAs.
  • the probes may also be specific for PhosphatidylSerine (PhtdSer), for example annexin 5 or any other annexin derivative obtained by molecular engineering, for example diannexins.
  • the probes can also, for example, recognize lipids of the membrane and their degrees of compaction, for example lipid probes with longer or shorter carbon chains.
  • Protein probes can be, for example, antibodies detecting differentiation clusters on the surface of the microparticles or detecting any other protein or enzyme hosted on the surface of the microparticles or in the microparticle, such as metalloproteinases, enzymatic protein receptors, for example tissue factor or uPAR cytokines and interleukins. Measurement of the concentration of the microparticles can also be carried out by quantitative determination of total lipids or total proteins.
  • the measurement of the concentration of membrane microparticles can also be carried out, for example, via a prothrombinase assay as described in Hugel B, Zobairi F., Freyssinet JM. Measuring circulating cell-derived microparticles. J Thromb Haemost. 2004 Oct; 2 (10): 1846-7 [12]. Briefly, in this method, blood coagulation factors and calcium concentration are determined such that PhtdSer is the limiting parameter in the generation of soluble thrombin from exogenous prothrombin added to the reaction medium.
  • the results are expressed in nanomolar equivalent PhtdSer (nM eq PhtdSer) with reference to a standard curve established with liposomes of known composition and concentration as described in Hugel B, Zobairi F, Freyssinet JM. Measuring circulating cell-derived microparticles Thromb Haemost. 2004 Oct; 2 (10): 1846-7 [12].
  • the measurement of the concentration of the microparticles can also be carried out, for example, by measuring the tissue factor activity. Briefly, the method uses specific coagulation factors of the Tenase complex and dose factor Xa formation from factor X added in the reaction medium as described in Aupe K, Hugel B, Martin T, et al.
  • the activity carried by the MP-FT + is related to a standard curve of known concentration in tissue factor.
  • the concentration obtained is expressed in Moles per liter of tissue factor activity.
  • the measurement of the concentration of membrane microparticles can also be carried out, for example, by a chronometric method based on beads coated with a detection means, for example an antibody, allowing the identification (phenotype) and the measurement of a coagulation time. after addition of plasma without phospholipids.
  • the coagulation time is dependent on the amount of anionic phospholipids (PhtdSer) provided by the MPs specifically collected beforehand by the beads.
  • Calibration of the chronometric test from a solution of liposomes of known concentration may be carried out and may convert the chronometric result (seconds) into procoagulant activity (nM eq. Phtd Ser).
  • the measurement of the concentration of soluble biological markers can be carried out via an immunological method, for example an ELISA method, by Example after insolubilization on multiwell plate, or using antibody-coated beads for flow cytometric assay as described by Fu Q, Zhu J, Van Eyk JE. "Comparison of multiplex immunoassay platforms". Clin Chem. 2010 Feb; 56 (2): 314-8 [6] and / or any method known to those skilled in the art suitable for measuring the concentration of biological markers.
  • an immunological method for example an ELISA method, by Example after insolubilization on multiwell plate, or using antibody-coated beads for flow cytometric assay as described by Fu Q, Zhu J, Van Eyk JE. "Comparison of multiplex immunoassay platforms". Clin Chem. 2010 Feb; 56 (2): 314-8 [6] and / or any method known to those skilled in the art suitable for measuring the concentration of biological markers.
  • the measurement of the concentration may be carried out by an immunological method, for example it may be the method described in the document Lobb RR, Chi-
  • the concentration measurement can be carried out by an immunological method, for example it can be the process described in Dunlop LC, Skinner MP, Bendall LJ, Favaloro EJ, Castaldi PA, Gorman JJ, Gamble JR, MA Vadas, Berndt MC. Characterization of GMP-140 (P-selectin) as a Circulating Plasma Protein J Exp Med. 1992; 175: 1,147-50. [7] or Thom J, Gilmore G, Yi Q, Hankey GJ, Eikelboom JW. Measurement of soluble P-selectin and soluble CD40 ligand in serum and plasma. J Thromb Haemost. 2004 Nov; 2 (11): 2067-9. [8]
  • the measurement of the concentration can be carried out by an immunological method, for example it can be an Elisa process, it can be for example the method described in the Azorsa DO document. , Moog S, Ravanat C, Schuhler S, Follea G, Cazenave JP, et al. Measurement of GPV released by activated platelets using a sensitive immunocapture ELISA. Haemost thromb. 1999; 81 (1): 131-8 [9].
  • the measurement of the concentration can be carried out by an immunological method, for example an immunological method of the ELISA type, by a coagulation test allowing, for example, the measurement of the procoagulant activity, for example carried out by method time-dependent decalcified plasma according to the method of determining the time of Quick (addition of thromboplastin and factor V deficient plasma and measurement of the coagulation time after addition of calcium)
  • the contribution of factor V deficient plasma makes the time only of the rate
  • the result is expressed as a percentage (%) with respect to a reference curve obtained by diluting a pool of control plasmas
  • the measurement of the coagulation time can be magnetic (oscillation of a marble) or by measuring the optical density.
  • the present invention relates to a method for predicting and / or detecting disseminated intravascular coagulation (CIVD) comprising a measurement from a first biological sample of the Rm C Dio5 concentration of membrane microparticles carrying the differentiation 105 (CD105).
  • CIVD disseminated intravascular coagulation
  • the prediction and / or detection method may further comprise a step of comparing the measured Rm C Dio5 concentration with a reference value RCDIOS-
  • the reference value RCDIO S may be the value of the concentration of microparticles carrying the CD105 differentiation cluster measured in a healthy subject or the average of the value of the measured concentration in a group of healthy subjects of reference.
  • the term "healthy reference subject” is intended to mean a mammal, for example a human being or an animal, having no acute or chronic pathology and / or not taking medical treatment.
  • the group of "healthy subjects of reference” may be of the same sex and / or age as that of the mammal from which the biological sample is obtained.
  • the group of "healthy subjects of reference” is of the same sex and of the same age as that of the mammal from which the biological sample is obtained.
  • group of reference subjects is understood to mean a group making it possible to define a reliable reference interval. This may be for example a group comprising at least 20 subjects of reference as defined above, for example a group comprising from 40 to 200 reference subjects.
  • the reference value RCDIO5 is a value obtained by analyzing a ROC curve obtained from static analysis of values obtained from a group of reference subjects presenting with septic shock.
  • the reference value RCDIO S may be a value within a reference interval IRCDIO S which may be the values of the concentration of microparticles carrying the CD105 differentiation cluster measured in 90% of a group of healthy subjects. reference.
  • the reference value RCDIO S may be a concentration of microparticles carrying the differentiation cluster greater than 1.0 nM equivalent PhosphatidylSerine (eq.PhtdSer), advantageously greater than 1, 3nM eq. PhtdSer.
  • Rm C Di o5 greater than the reference value RCDIOS indicates a CIVD.
  • the inventors of the present invention have shown that the CIVD detection method comprising the determination of the Rm C Dio5 concentration allows a detection with a sensitivity greater than or equal to 67.5% and a specificity greater than or equal to 84, 6%
  • the method for predicting and / or detecting disseminated intravascular coagulation may further comprise a step of measuring, from a second biological sample, the concentration Rm C D3i of membrane microparticles carrying the Differentiation cluster 31 (CD31).
  • the second biological sample is a biological sample as defined above.
  • the second biological sample may be identical or different from the first biological sample.
  • the first and second biological samples can be one and the same sample.
  • the first and / or the second biological sample can come from a mammal with septic shock.
  • the method for predicting and / or detecting the CIVD may further comprise a step of comparing the measured concentration Rm C D3i with a reference value RCD3I -
  • the reference value RCD3I may be the value of the concentration of microparticles carrying the CD31 differentiation cluster measured in a healthy subject or the average of the value of the measured concentration in a group of healthy subjects of reference.
  • the reference value RCD3I can also be a value obtained by analysis of a ROC curve.
  • the reference value RCD3I can be a concentration of microparticles carrying the differentiation cluster of less than 1.5 nM eq. PhtdSer, advantageously less than 1, 4035 nM eq. PhtdSer.
  • a value Rm C D3i lower than the reference value RCD3I indicates a CIVD.
  • the inventors of the present invention have shown that the CIVD detection method comprising the determination of the Rm C D3i concentration allows a detection with a sensitivity greater than or equal to 80.0% and a specificity greater than or equal to 38, 5%.
  • the inventors of the present invention have also shown that the CIVD detection method comprising the determination of the concentration of Rm C Dio5 and Rm C D3i allows a detection with a sensitivity greater than or equal to 67.5 and a specificity greater than or equal to 84.6.
  • the method for predicting and / or detecting the CIVD may further comprise a step of measuring in a third biological sample the concentration of at least one marker selected from the group comprising soluble ⁇ -selectin, the Soluble glycoprotein V and soluble P-Selectin.
  • the third biological sample is a biological sample as defined above.
  • the first, second and third biological samples may be independently identical or different from each other.
  • the first, second and third biological samples may be one and the same sample.
  • the first, second and third biological samples may independently come from a mammal with septic shock.
  • the method for predicting and / or detecting the CIVD may further comprise a step of measuring, in a fourth biological sample, the concentration of microparticles carrying the differentiation cluster CD1 1a, the number of leukocytes and the calculation of the RcDn / ieu ratio of the microparticle concentration carrying the differentiation cluster CD1 1 a on the leucocyte count.
  • the fourth biological sample is a biological sample as defined above.
  • the first, second, third and fourth biological samples may be independently identical or different from each other.
  • the first, second, third and fourth biological samples may be one and the same sample.
  • the first, second, third and fourth biological samples may independently come from a mammal having septic shock.
  • the prediction and / or detection method may further comprise a step of comparing the calculated ratio RcDn / ow with a reference value RocDn / i eu -
  • the reference value RocDn / ieu can be the value of the ratio of the concentration of microparticles carrying the differentiation cluster CD1 1 divided by the measured leucocyte count in a reference healthy subject or the average of the value the ratio measured in a group of healthy subjects of reference.
  • the reference value RocDn / ieu can be a value greater than 0.45nM / G
  • the measurement of the leucocyte concentration can be carried out by any method known to those skilled in the art. This may be, for example, a flow cytometry analysis method on a PLC, for example with the ADVIA 2120 PLC marketed by Siemens.
  • the inventors of the present invention have also surprisingly and unexpectedly shown that the aforementioned biological markers evolve as a function of time on the individual from which the sample originates. In addition, the inventors have surprisingly demonstrated that it is possible to predict the evolution / occurrence of a CIVD.
  • the present invention relates to a method for predicting and / or monitoring the evolution of disseminated intravascular coagulation (DIC) from a biological sample comprising the following steps:
  • V C DIOS value 1 if ROCDIOS is greater than the RCDIOS value or a VCDIOS value equal to 0 if ROCDIOS is less than the RCDIOS value
  • ⁇ is a value between -4.035 and -1.094
  • a is a value between 1. 638 and 4.066
  • ⁇ is a value between 0.193 and 3.138
  • the scores obtained can be correlated with the fate of the mammal from which it comes.
  • ⁇ can be equal to -2.565.
  • a may be equal to 2,852.
  • ⁇ may be equal to 1.665.
  • the score S can be of the following formula:
  • the method for predicting and / or monitoring the evolution of disseminated intravascular coagulation may further comprise the following steps:
  • S ' -4,259 + VCD105 x 3,246 + VCD31 x 2,1776 + VFV x 2,1059 wherein a value of S' greater than 0,2663 indicating a CIVD and / or the appearance of a CIVD.
  • the reference value RFV can also be a value obtained by analysis of a ROC curve obtained from static analysis of values obtained from a group of reference subjects.
  • the inventors have advantageously shown that when the value of S 'is greater than 0.2663 the method advantageously allows a prediction with a sensitivity greater than or equal to 87.5 and a specificity greater than or equal to 71.1.
  • the subject of the present invention is a method of monitoring the efficacy of a treatment of disseminated intravascular coagulation (DIC) from a biological sample comprising the following steps:
  • the inventors have shown that when the value of SCD105 is greater than or equal to 1, the treatment can be qualified as effective.
  • the method of monitoring the efficacy of a treatment of disseminated intravascular coagulation may further comprise:
  • step a) measuring the concentration of at least one biological marker selected from the concentration R0CD31 of membrane microparticles comprising the differentiation cluster 31 (CD31), the concentration of soluble E-selectin, the concentration of soluble glycoprotein V and / or soluble P-selectin concentration, and
  • step b) measuring the concentration of at least one biological marker selected from the concentration R1 CD31 of membrane microparticles comprising the differentiation cluster 31 (CD31), the concentration of soluble E-selectin, the concentration soluble glycoprotein V and / or soluble P-selectin concentration after treatment.
  • the present invention also relates to a kit for predicting and / or detecting disseminated intravascular coagulation (CIVD) according to the invention comprising means for measuring the concentration of membrane microparticles comprising the differentiation cluster 105 (CD105).
  • CIVD disseminated intravascular coagulation
  • CD105 concentration of membrane microparticles comprising the differentiation cluster 105
  • by means of measuring the concentration of membrane microparticles comprising the differentiation cluster 105 (CD105) is meant any means known to those skilled in the art for the detection of microparticles which carry CD105.
  • It may be for example molecules selected from the group comprising antibodies, lipid probes, synthetic or natural including annexins and their synthetic derivatives, insolubilized or not on any type of support, peptide or protein ligands, enzymes and chromogenic substrates and functionalized materials for insolubilization or capture of microparticles.
  • StreptaWell High Bind plates (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, ref .: 1 989 685 001) coated with streptavidin, IgG1-B1 antibodies (Leinco, St Louis, Missouri, USA, ref. 1128), IgG2a-Bi antibodies (Leinco, St.
  • human anti-CD105 antibodies Anti human CD105-Bi (R & D Systems, Mineapolis, USA, MAB10972), antibodies anti-human CD31: iMouse Anti human CD31-B1 (Caltag, Burlingam, USA, MHCD31 No. 15-4 PPACK (Merck, Darmstadt, Germany), Dns-GGACK (Merck, Darmstadt, Germany), Synthetic PS / PC Vesicles 33 / 67 (Avanti Polar), CaCI 2 (Sigma, St.
  • Human Factor Va human Factor Va
  • human factor Xa human Factor Xa
  • Human Factor Xa Human Factor Xa
  • EZ007B Biogenic, Perols, France
  • Human prothrombin Human Prothrombin
  • PP006C Hyphen BioMed, Neuville sur Oise, France
  • pNAPEP0216 reference: 61 01 0216, Cryop ep, adjoin, France
  • the present invention also relates to a kit for predicting and / or detecting disseminated intravascular coagulation (CIVD) according to the invention comprising means for measuring the concentration of membrane microparticles comprising the differentiation cluster 31 (CD31).
  • CIVD disseminated intravascular coagulation
  • CD31 differentiation cluster 31
  • by means of measuring the concentration of membrane microparticles bearing the differentiation cluster 31 (CD31) is meant any means known to those skilled in the art for the detection of the microparticles combined with the detection of CD31 or elements.
  • CD31 for example the RNAs and / or the proteins, for example molecules chosen from the group comprising antibodies, lipid, synthetic or natural probes including annexins and their synthetic or non-synthetic derivatives, whether insolubilized or not on any type of support, peptide or protein ligands, enzymes and chromogenic substrates, protein-catalyzed enzyme activities such as tissue factor activity. It may be for example a flow cytometry method based on the recognition of fluorescent probes, for example labeled antibodies or protein probes, fixed or not on beads.
  • Protein probes can be, for example, antibodies detecting the CD31 differentiation cluster on the surface of the microparticles or any other protein or enzyme hosted on the surface of the microparticles or in the microparticle in relation to the exposure of CD31. It can also be an ELISA detection of microparticles carrying CD31. Protein probes can be combined with lipid probes that recognize the PhtdSer or the lipids of the microparticle membrane and their degree of compaction.
  • the present invention also relates to a kit for predicting and / or detecting disseminated intravascular coagulation (CIVD) according to the invention comprising means for measuring the concentration of membrane microparticles comprising the differentiation cluster 105 (CD105) and / or means for measuring the concentration of membrane microparticles comprising the differentiation cluster 31 (CD31).
  • CIVD disseminated intravascular coagulation
  • CD105 membrane microparticles carrying the differentiation cluster 105
  • any means known to those skilled in the art for the detection of microparticles combined with the detection of CD105 or elements controlling the expression of CD105 for example RNAs, proteins, for example molecules selected from the group comprising antibodies, lipid probes, synthetic or natural including annexins and their synthetic derivatives or not, insolubilized or not on any type of support, peptide or protein ligands, enzymes and chromogenic substrates, proteins bearing own biological activity or capable of acquiring one by interaction with the surrounding medium selected from blood, plasma, serum, bronchoalveolar fluid and / or vascular tissue, enzymatic activities catalyzed by proteins such as tissue factor activity.
  • Protein probes may be, for example, antibodies detecting the CD105 differentiation cluster on the surface of the microparticles or any other protein or enzyme hosted on the surface of the microparticles or in the microparticle in relation to the exposure of CD105. It can also be an ELISA detection of microparticles carrying CD105. Protein probes can be combined with lipid probes that recognize the PhtdSer or the lipids of the microparticle membrane and their degree of compaction.
  • the present invention also relates to a kit for predicting and / or detecting disseminated intravascular coagulation (CIVD) according to the invention further comprising means for measuring at least one marker chosen from the group comprising ⁇ -soluble selectin , soluble glycoprotein V and soluble P-selectin.
  • CIVD disseminated intravascular coagulation
  • soluble E-selectin means any means known to those skilled in the art for the detection / measurement of said markers.
  • They may be, for example, molecules selected from the group comprising antibodies, for example specific for the soluble E-selectin fragment, the soluble fragment of P-selectin, factor V, peptide or protein ligands of these fragments.
  • receivers for example PSLG-1, functionalized or not to allow their insolubilization or their detection.
  • They may also be substrates and / or factor V activators.
  • FIG. 1 represents stick diagrams of the results obtained as a function of the presence of a CIVD (gray) or no CIVD (white) (the bar represents the median, the upper and lower limits the 25 th and 75 th percentiles and the bars "T" io th and 90 th percentiles).
  • the dashed lines represent normal values.
  • the ordinate represents either the platelet concentration in G / L, the prothrombin time in percent relative to a standard curve, the concentration of D-dimer in mg / L, the concentration of fibrin monomer in mg / L, the concentration in fragments of prothrombin F1 +2 in ⁇ / L or protein C in percent compared to a standard curve.
  • the abscissa represents the condition and day of measurement: 1 (D1), 3rd (D3) th and 7 (D7) day.
  • Figure 2A shows a bar graph of the concentration of membrane microparticles in PhosphatidylSerine equivalents (ordinate) during septic shock (in gray) or not (white) (the bar represents the median, the upper and lower limits 25 th and 75 th percentiles and bars "T" and the io th 90 th percentile).
  • the results shown are the total concentration of membrane microparticles (PhtdSer-microparticles), platelet-derived membrane microparticles (GPIb-microparticles), leukocyte-derived membrane microparticles (CD1 1-microparticles) and membrane microparticles derived from endothelial cells ( CD105-microparticles, CD31-microparticles and CD62E-microparticles).
  • Figure 2B shows a bar graph of the concentration of membrane microparticles in PhosphatidylSerine equivalents (ordinate) as a function of time during a CIVD (in gray) or not (white) (the bar represents the median, the upper and lower limits). less the 25 th and 75 th percentiles and bars "T" io th and 90 th percentiles). The dotted lines represent normal values.
  • Statistical analyzes represent the differences in repeated measures between subjects with or without a DIC as a function of time.
  • Figure 3A shows a bar graph of the concentration of platelet-derived membrane microparticles (GPIb-microparticles) (ordered) with a CIVD (in gray) or not (white) (the bar represents the median, the upper and lower limits the 25 th and 75 th percentiles and the T-bars the 10 th and 90 th percentiles).
  • GPIb-microparticles platelet-derived membrane microparticles
  • Figure 3B shows a bar graph of the concentration concentration of the soluble GPV concentration (sGPV) on the number of platelets (ordinate) with a CIVD (in gray) or not
  • Figure 4 shows bar graphs of the results obtained as a function of the presence of a CIVD (gray) or no CIVD
  • the dashed lines represent normal values.
  • the ordinate represents either the concentration of membrane microparticles carrying CD105 in nM equivalent PhosphatidylSerine, the concentration of membrane microparticles carrying CD31 in nM equivalent PhosphatidylSerine, the concentration of soluble E-selectin in pg / L, the ratio P-selectin soluble / platelet count in ⁇ g / G, tissue plasminogen activator concentration (t-PA) ng / L or concentration of inhibitor of plasminogen activator PAI-1.
  • the abscissa represents the condition and the day of measurement: 1 st (D1), 3 th (D3) and 7 th (D7).
  • Statistical analyzes represent the differences in repeated measures between subjects with or without a DIC as a function of time.
  • Figure 5 shows bar graphs of the results obtained as a function of the presence of a CIVD (gray) or no CIVD (white) (the bar represents the median, the upper and lower limits the 25 th and 75 th percentiles and bars "T" io th and 90 th percentiles).
  • the dashed lines represent normal values.
  • the ordinate represents either the concentration of leukocytes in G / L, the ratio of membrane microparticles carrying CD1 1 to / the number of leukocytes in nM / G, the concentration of interleukin 6 (IL-6) in ng / L, the concentration of interleukin 10 (IL-10) in ng / L, the tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) concentration in ng / L, the Chimo-attractant Monocytic Protein 1 (MCP-1) concentration in ng / L.
  • the abscissa represents the condition and day of measurement: 1 (D1), 3rd (D3) and 7 th
  • FIG. 6 represents a ROC curve obtained with the markers MP-CD105 and MP-CD31 with ordinate sensitivity and abscissa specificity (100-specificity).
  • Example 1 Study and Method for Detecting DIC
  • Table 1 below shows the characteristics of patients upon admission.
  • Bacteremia 9 (1 (1.9) 8 (20.0) 0.01
  • Hemostasis was analyzed with an STA-R Evolution (trademark) (Stago) automaton with usual commercial reagents according to a chronometric, chromogenic or immunoturbidimetric method; according to the cases were measured: the time of Quick converts in prothrombin rate (PT), factor V (FV), activated partial thromboplastin time (TCA or aPTT), fibrinogen (Fg), D-dimer (DDI) , antithrombin (AT), protein C (PC) and fibrin monomers (FM).
  • PT prothrombin rate
  • FV factor V
  • TCA or aPTT activated partial thromboplastin time
  • Fg fibrinogen
  • D-dimer D-dimer
  • AT antithrombin
  • PC protein C
  • FM fibrin monomers
  • Fragment 1 + 2 of prothrombin was quantified with the commercial ELISA kit Enzygost (registered trademark) F1 + 2 (Siemens) and the soluble platelet glycoprotein (sGPV) by ELISA using the commercial kit Asserachrom (trademark) sGPV, Stago.
  • the platelet and leukocyte count was obtained by a flow cytometry analysis method on routine hematology automatons, for example of the ADVIA 2120, Siemens AG type and collected from the medical reports.
  • Tissue-type plasminogen activator (t-PA) and plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1), interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10), tumor necrosis factor alpha (TNF- ⁇ ), monocyte chemotactic protein (MCP-1), soluble P-selectin and soluble E-selectin were quantified by an ELISA-derived immunological technique using beads.
  • functionalized FlowCytomix (Bender MedSystems GmbH) detected using a FACS-scan flow cytometer (Becton Dickinson). The results were analyzed using FlowCytomix Pro 3.0 software (Bender MedSystems GmbH).
  • microparticles were measured by functional enzymatic assay called prothrombinase assay, which detects the PhosphatidylSerine (PhtdSer) exposed on the surface of the PM and after capture of the microparticles on insolubilized annexin-5 or insolubilized antibodies according to the method described in Hugel et al. [12].
  • prothrombinase assay detects the PhosphatidylSerine (PhtdSer) exposed on the surface of the PM and after capture of the microparticles on insolubilized annexin-5 or insolubilized antibodies according to the method described in Hugel et al. [12].
  • PhtdSer PhosphatidylSerine
  • the results were expressed in nanomoles per liter of PhosphatidylSerine equivalent (nM eq PhtdSer) with reference to a standard curve established with liposomes of known composition and concentration ([13]).
  • the phenotype of PM was determined using biotinylated specific antibodies in place of annexin-5: anti-GPIb (platelets), anti-CD1 1a (leukocytes), anti-CD62E (E-selectin, stimulated endothelial cells), anti-CD31) and anti-CD105 (endothelial cells).
  • the limits / normal values in healthy volunteers were previously established in the inventors' laboratory by the same method.
  • the particular method / solutions used to determine the concentration of the microparticles as well as the markers were as follows:
  • the plasma of patients in the cohort was treated as follows:
  • the assay was performed on StreptaWell High Bind plate (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, ref .: 1 1 989 685 001)
  • a stock solution (0.32 mg / mL) annexinV-Biotinylated is prepared and diluted to 250 ng / mL.
  • a solution of IgG1 -Biotinylated antibody (Leinco, St Louis, Missouri, USA, ref 1128) (stock 100 Mg / mL) was diluted to 10 g / mL.
  • IgG2a-Biotinylated Antibody Solution (Leinco, St. Louis, Missouri, USA, Cat # 1129) (stock 500 ⁇ g / mL) diluted to 10 ⁇ g / mL.
  • a solution comprising the Mouse Anti human Gp1 b-alpha-Bi 2008 (supplied by Institut Lanza and biotinylated in the laboratory (stock 1, 1 mg / ml) was diluted to 2 ⁇ g / ml, a solution comprising Anti Mouse Mouse antibodies.
  • CD105-Biotinylated human (R & D Systems, Mineapolis, USA, MAB10972 ref.) (stock 0.48 mg / mL) was diluted to 10 ⁇ g / mL A solution comprising Mouse Anti human CD31 -Biotinylated mouse antibodies (Caltag, Burlingam, USA, ref MHCD31 15-4) (stock 200 Mg / mL) was diluted to 10 Mg / mL A solution comprising Mouse Anti human CD1 1a-Biotinylated (Leinco, St. Louis, Missouri, USA, ref.
  • PPP Platelet-poor plasma pool
  • Detection of prothrombinase activity A pool of factors comprising 1M CaCl 2 (Sigma, St Louis, Missouri, USA, 2 mM in the 100 ⁇ reaction medium: MR), human factor Va ("Human Factor Va” reference: 405, American Diagnostica, Stamfort, USA, 250 ⁇ M in 100 ⁇ M of MR), human factor Xa "Human Factor Xa” reference: EZ007B, Biogenic, Perols, France, 106 ⁇ M in the 100 ⁇ M of MR) a been used. 100 L / well of said pool were added. The plate was then shaken.
  • the prothrombin used was human prothrombin (reference PP006C, Hyphen BioMed, Neuville sur Oise, France, 3.5 ⁇ in the 50 ⁇ l) and 50 L / well were added and the plate stirred and incubated for 10 min. at 37 ° C.
  • the chromogenic substrate was pNAPEP0216 (reference: 61 01 0216, Cryopep, adjoin, France, 1, 52 mM in the 50 [il]: 50 L / well were added.
  • An immediate kinetic reading after addition of the substrate at 405 nm over 3 minutes (8 to 10 s between the points, Vmax on 3 points) was carried out using a Versamax spectrometer (Molecular
  • membrane microparticles have been used as cellular substitutes to detect activation of vascular cells over time.
  • patients with septic shock showed a three-fold increase (p ⁇ 0.001) in all of the procoagulant membrane microparticles at day 1 (D1) rate which remained high at day 7 (D7) ( Figure 2).
  • Membrane microparticles of endothelial cells have also been increased (membrane microparticles carrying the markers CD105 and CD31) even if no modification of the levels of E-selectin (CD62E-membrane microparticles) could be detected ( Figure 2).
  • CD105-carrying membrane microparticle (CD105-MPs) concentrations remained significantly elevated (p ⁇ 0.001) in the CIVD and tended to return to baseline at the end of the follow-up period (p ⁇ 0.05) ( Figure 4).
  • activated protein C drotrecogin alfa [activated], Xigris®, Eli Lilly, IN
  • CD1 1a (Leukocytes) 3.2 ⁇ 2.2 4.5 ⁇ 2.8 * * 5.9 ⁇ 3.9
  • CD31 Endothelium -
  • CD105 Endothelium -
  • CD62E Endothelium -
  • Antithrombin (%) [70-130] 82 ⁇ 37 * 56 ⁇ 38 * 72 ⁇ 31
  • * means p ⁇ 0.05 without C VD vs. CIVD at first day
  • ⁇ means p ⁇ 0.05 without CIVD vs. DIC on the second day
  • ⁇ means p ⁇ 0.05 CIVD first day vs. DIC on the second day.
  • Example 2 Determination of the algorithm for detection / prediction of the CIVD in a test subject and implementation.
  • V C DIO S was equal to 1 if the concentration in a plasma sample of membrane microparticles carrying CD105 was greater than 1.3 nM eq. PhtdSer or equal to 0 if the concentration in a plasma sample of membrane microparticles carrying CD105 was less than or equal to 1, 3 nM eq. PhtdSer; and the V C D3i value was 1 if the concentration in a plasma sample of the CD105-carrying membrane microparticles was less than or equal to 1.4035 nM eq PhtdSer or equal to 0 if the concentration in a plasma sample of the membrane microparticles CD105 carriers were greater than 1.4035 nM PhtdSer eq.
  • Example 3 Example of Measurement / Detection of Microparticles with a Kit / Diagnostic Kit After sampling, the plasma sample is filtered on a multi-well plate with a porous bottom (diameter 0.1 ⁇ ) or on any other individual filter in order to obtain the plasmas lacking microparticles for biological assays, and allowing extensive washing of the microparticles retained on the filters and measuring their possible concentration.
  • Functionalized beads for example magnetic beads or fluorescent polystyrene beads bearing antibodies directed against the CD105 marker, and beads bearing annexin or antibodies against PhtdSer, are used to respectively measure the concentration of membrane microparticles carrying the CD marker 105 and the total concentration of membrane microparticles in the sample.
  • functionalized beads bearing streptavidin molecules or antibodies recognizing the biotinylated antibodies directed against CD105 or against the PhtdSer sought on the microparticles are used. Beads larger than one micron optionally serve as a microparticle capture surface in the plasma sample.
  • the beads are separated from the plasma simply by deposition on a microplate with a porous bottom or on an individual column (magnetized or not) to allow the extensive washing of the microparticles before their revelation.
  • Plasma depleted in microbeads and microparticles can be collected after isolation of the beads to allow further assays of circulating markers.
  • the beads are then used independently in one of the following measurement methods:
  • Flow cytometry method based on beads coated with an antibody or a ligand (of defined size and auto-fluorescence) allowing identification (phenotype) and secondarily revealed by a secondary antibody or by annexin- 5 whose intensity is correlated with the number of microparticles present on the beads.
  • Beads of different calibres and fluorescence are optionally used depending on the primary antibody (phenotyping) secondarily treated with a fluorescent secondary antibody against PhtdSer or with annexin-5 fluorescent. Phenotyping depends on the size and the fluorescence of the beads, the quantification of the intensity of the secondary fluorescence.
  • This system has been developed for multiplex assays of circulating proteins. The labeling is that of an ELISA (approximately 3 to 4 hours) and the acquisition is done on flow cytometer with interpretation by software. FlowCytomix (Bender MedSystem, GmbH) has developed this type of multitest.
  • the amount of thrombin generated is then dependent on the amount of anionic phospholipids (PhtdSer) provided by the MPs specifically captured by the beads and is then revealed by addition of a chromogenic substrate. Calibration of the colorimetric test from a solution of liposomes of known concentration is optionally possible and makes it possible to convert the colorimetric result (mDO / min) into procoagulant activity (nM eq. Phtd Ser).

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Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) dans un échantillon biologique et à un kit de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) dans un échantillon biologique. La présente invention se rapporte également à un procédé de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique et à un procédé de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique. La présente invention trouve des applications notamment dans le domaine médical et vétérinaire.

Description

PROCÉDÉ DE DIAGNOSTIC DE LA COAGULATION INTRAVASCULAIRE DISSÉMINÉE(CIVD)
DESCRIPTION
5 Domaine technique
La présente invention se rapporte à un procédé de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) dans un échantillon biologique et à un kit de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) dans un échantillon 10 biologique.
La présente invention se rapporte également à un procédé de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique.
La présente invention se rapporte notamment à un procédé de 15 suivi de l'efficacité d'un traitement d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique.
La présente invention trouve une application notamment dans le domaine médical et vétérinaire.
Dans la description ci-dessous, les références entre crochets 20 ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte.
État de la technique
Le choc septique est un syndrome caractérisé par une réaction inflammatoire de l'hôte en réponse à un agent pathogène responsable
25 d'une hypotension résistante à l'expansion volémique et nécessitant l'introduction de vasopresseurs (noradrénaline) et s'accompagnant de défaillances viscérales.
La coagulation est activée de manière constante au cours du choc septique et participe à la défense de l'hôte. Toutefois, cette activation
30 peut être « dérégulée » avec une thrombopénie et une consommation des facteurs de la coagulation et des inhibiteurs se traduisant par des microthromboses et responsable d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD). Cet état procoagulant est lié à une activation cellulaire intense via l'induction de cytokines pro-inflammatoires et à des modifications phénotypiques de l'endothélium vasculaire, qui prend alors un caractère pro-adhésif, pro-inflammatoire et pro-thrombotique
L'association entre CIVD, gravité et défaillance multiviscérale est connue de longue date, motivant l'utilisation de traitements anticoagulants au cours du choc septique en plus des traitements étiologiques et des défaillances d'organes. Toutefois, les études cliniques portant sur des traitements ayant un impact sur la coagulation - qui n'ont jamais ciblé spécifiquement les patients présentant une CIVD - se sont révélées décevantes car ne permettant pas d'améliorer le pronostic des patients. Toutefois, l'analyse en sous-groupes, a permis de mettre en évidence une amélioration des patients traités ayant présenté une CIVD.
Les données actuelles de la littérature montrent qu'un choc septique est accompagné par une intense activation cellulaire inflammatoire, à l'origine d'un remodelage de la membrane plasmique de la cellule. De façon caractéristique, la membrane la phosphatidylsérine (PhtdSer) est transloquée du feuillet interne dans le feuillet externe de la bicouche tandis que le cytosquelette est clivé et n'est plus capable de contrebalancer les tensions membranaires dues à cette translocation. L'ensemble aboutit à la libération de microparticules dans l'espace vasculaire. L'exposition de PhtdSer est une caractéristique commune aux microparticules. La détection de la PhtdSer permet d'accéder à la mesure de la quantité totale des microparticules quelle que soit leur origine cellulaire. Toute cellule est capable d'émettre des microparticules. Dans le vaisseau, les microparticules constituent un pool de biomarqueurs et de bio-effecteurs circulants capables de moduler de nombreuses fonctions vasculaires dont la réponse procoagulante et la vasomotricité. Elles véhiculent un signal biologique propre aux conditions de leur émission par la cellule parentale. De plus, leurs caractéristiques membranaires leur confèrent des propriétés généralement procoagulantes, pro-inflammatoires et pro-apoptotiques, mais aussi pro-fibrinolytiques.
Ainsi, selon le contexte physiopathologique, les microparticules peuvent s'avérer bénéfiques ou délétères pour l'organisme. Chez l'homme, en dehors de toute situation pathologique, les microparticules sont détectables à de faibles concentrations dans le sang et dans les fluides biologiques et témoignent de l'homéostasie cellulaire des tissus. Des taux élevés de microparticules circulantes sont rapportés dans de nombreux états pathologiques thrombotiques, inflammatoires, traumatiques, dégénératifs ou cancéreux. Dans le compartiment vasculaire, la source principale de microparticules serait la plaquette mais les variations de microparticules d'autres sources cellulaires peuvent être spécifiquement associées à certaines pathologies comme le rejet de greffe cardiaque ou l'hypertension artérielle pulmonaire.
Au cours du choc septique, la génération de microparticules d'origines endothéliale, plaquettaire et monocytaire, mais aussi érythrocytaire ou granulocytaire est rapportée. Dans ce contexte particulier, leurs propriétés pro-inflammatoires et pro-apoptotiques favoriseraient la survenue d'un syndrome de défaillance multiviscérale.
Chez le rat, il a été démontré que les microparticules pourraient ainsi promouvoir l'importante vasoplégie observée au cours du choc septique, participer à la modulation du statut oxydant ou encore, contribuer à un statut procoagulant.
Les infections graves, comme le choc septique, sont caractérisées par une activation de la coagulation avec globalement un état procoagulant et antifibrinolytique. Au cours du sepsis, les processus hémostatiques sont cependant nécessaires à la défense de l'hôte contre l'agent pathogène et seule une production excessive de thrombine peut mener à la dysfonction viscérale. L'activation des réactions de coagulation puis de fibrinolyse au cours du sepsis permet de limiter la croissance et la dissémination de l'agent pathogène, constituant ainsi un mécanisme de défense au même titre que l'immunité innée ou l'activation du complément. Les microparticules qui augmentent la surface d'interaction avec les éléments circulants ont alors un effet bénéfique. Elles favorisent ainsi les interactions récepteurs/ligands et le recrutement des cellules (plaquettes, monocytes, neutrophiles) au site initial de la lésion vasculaire et de la réaction inflammatoire locale.
Dans la coagulopathie du choc septique, le Facteur Tissulaire (FT) porté par les microparticules monocytaires constituerait une deuxième entité procoagulante portée par les microparticules. En effet, il joue un rôle clé dans l'initiation et la propagation de la cascade de la coagulation. Il a été montré que les microparticules monocytaires participent à la dissémination d'un potentiel procoagulant en exprimant le FT à leur surface. La génération de thrombine est possible à la surface des microparticules exposant le FT (MP-FT+) de façon indépendante des réactions de la coagulation dites de la phase contact qui nécessitent la présence de facteur FXII. Les propriétés procoagulantes des MP-FT+ ont été rapportées dans l'infection au méningocoque mais aussi après injection de LPS chez des individus sains. Dans ce dernier cas, une augmentation forte et transitoire des concentrations en MP-TF+ est observée 3-4 heures après l'injection. Elle s'accompagne d'une monocytopénie transitoire, ce qui suggère que ces microparticules constitueraient alors le support principal de la réponse procoagulante dépendante du Facteur Tissulaire et donc de la génération de thrombine.
Le diagnostic de CIVD est difficile sur le plan biologique. En particulier, il n'existe pas à ce jour de « définition biologique » consensuelle de la CIVD. Deux tests basés sur l'élaboration de scores combinant la mesure de différentes variables biologiques ont été proposés. Le premier décrit en 2001 émane de l'International Society for Thrombosis and Haemostasis (ISTH), le second de la Japanese Association for Acute Medicine (JAAM) en 2005 et revu en 2006. Le score de NSTH est basé sur la présence d'une thrombopénie sévère, d'une diminution du taux de prothrombine (allongement du temps de Quick), d'une consommation du fibrinogène et d'une élévation des D- dimères, marqueurs de la fibrinolyse. Il permet de diagnostiquer les CIVD survenant au cours des pathologies néoplasiques, des traumatismes, des pathologies obstétricales mais apparaît déficient au cours du choc septique en raison de l'importance du syndrome inflammatoire qui s'accompagne d'une thrombocytose, d'une élévation du fibrinogène et de la présence de D-dimères. Le Score ISTH s'avère donc peu à-même de permettre une détection de CIVD lors d'un choc septique.
Le score JAAM a été développé afin de détecter la CIVD lors de choc septique, et ne retient pas le fibrinogène comme critère diagnostic tout en utilisant des valeurs seuil plus « cohérentes » pour les D-dimères et les plaquettes dans le cadre d'un syndrome de réponse inflammatoire systémique (SIRS). De nouvelles discussions au niveau du comité CIVD de l'ISTH ont été conduites pour décliner l'entité « CIVD » en coagulopathies obstétricales, traumatiques, septiques ou oncologiques afin de mieux définir les paramètres et valeurs seuils du score ISTH.
En pratique, l'usage des scores précités nécessite une mise en œuvre spécifique, à partir d'échantillons particuliers.
En outre, il n'existe pas actuellement de procédé permettant de détecter de manière sure et systématique une coagulation intravasculaire disséminée. Il n'existe pas non plus de procédé et/ou de moyen permettant de prédire la survenue, par exemple à partir d'un échantillon biologique, d'une coagulation intravasculaire disséminée.
De plus, il n'existe pas dans l'état de la technique de procédé permettant de déterminer chez un individu présentant un choc septique si celui-ci va déclencher/présenter dans un futur proche une coagulation intravasculaire disséminée.
II existe donc un réel besoin de trouver un procédé et/ou un moyen palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier d'un procédé rapide et efficace permettant de détecter la CIVD réduire les coûts et d'améliorer ainsi le pronostic vital des individus.
Description de l'invention
La présente invention a pour but de surmonter les inconvénients de l'art antérieur en fournissant un procédé de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant une mesure de la concentration d'un marqueur biologique.
En particulier, les inventeurs de la présente invention montrent que le procédé de l'invention permet de déterminer la présence d'une CIVD chez un individu présentant un choc septique et/ou d'identifier un individu susceptible de développer une CIVD.
Dans la présente par « marqueur biologique » on entend au moins un marqueur biologique choisi dans le groupe comprenant les microparticules membranaires porteuses du cluster de différenciation CD31 , les microparticules membranaires porteuses du cluster de différenciation CD105, la E-Sélectine soluble, la glycoprotéine V soluble, le facteur V circulant et la P-Sélectine soluble.
Selon l'invention par « microparticules membranaires », on entend les microparticules membranaires libérées, par exemple dans l'espace vasculaire à partir de cellules, par exemple des cellules endothéliales, des plaquettes, des monocytes, des granulocytes ou polynucléaires (neutrophiles, éosinophiles ou basophiles) ou de leurs précurseurs circulants, des cellules érythrocytaires, des lymphocytes ou d'origine non vasculaire. Par exemple, les microparticules membranaires peuvent avoir une taille, c'est-à-dire un diamètre individuel, compris entre 50 nm et 1 μιτι et peuvent s'associer en agrégats avec des cellules circulantes notamment les polynucléaires. Par exemple, les microparticules membranaires peuvent porter une activité facteur tissulaire ou une activité fibrinolytique. Dans la présente par « échantillon biologique » on entend tout échantillon obtenu à partir de mammifères, par exemple un mammifère choisi dans le groupe comprenant l'ordre Monotremata, Didelphimorphia, Paucituberculata, Microbiotheria, Notoryctemorphia, Dasyuromorphia, Peramelemorphia, Diprotodontia, Tubulidentata, Sirenia, Afrosoricida, Macroscelidea, Hyracoidea, Proboscidea, Cingulata, par exemple le tatou, Pilosa, Scandentia, Dermoptera, Primates, Rodentia, Lagomorpha, Erinaceomorpha, Soricomorpha, Chiroptera, Pholidota, Carnivora, Perissodactyla, Artiodactyla et Cetacea. Il peut s'agir par exemple d'un humain ou d'un animal. Il peut s'agir par exemple d'un animal d'élevage, d'un animal de compagnie, d'un animal en voie de disparition ou de tout autre animal, y compris manipulé génétiquement.
Selon l'invention, l'échantillon biologique peut être un échantillon de sang, de plasma, de sérum, de liquide bronchiolo-alvéolaire.
Selon l'invention, l'échantillon biologique peut provenir d'un mammifère présentant un choc septique ou un risque de choc septique.
Selon l'invention la mesure de la concentration du marqueur biologique choisi peut être réalisée par tout procédé adapté connu de l'homme du métier.
Par exemple, la mesure de la concentration de microparticules membranaires porteuse de Cluster de Différenciation peut être réalisée par tout procédé adapté connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'un procédé en cytométrie en flux basée sur la reconnaissance de sondes fluorescentes, par exemple des anticorps marqués, des sondes protéiques ou lipidiques, fixées ou non sur des billes, voire des sondes reconnaissant le matériel génétique inclus dans les microparticules comme les miRNA. Les sondes peuvent aussi être spécifique de la PhosphatidylSérine (PhtdSer) par exemple l'annexine 5 ou tout autre dérivé d'annexine obtenu par génie moléculaire, par exemple les diannexines. Les sondes peuvent également, par exemple, reconnaître des lipides de la membrane et leurs degrés de compaction, par exemple des sondes lipidiques à chaînes carbonées plus ou moins longues. Les sondes protéiques peuvent être par exemple des anticorps détectant les clusters de différentiation à la surface des microparticules ou détectant toute autre protéine ou enzyme hébergée à la surface des microparticules ou dans la microparticule comme les métalloprotéinases, les récepteurs de protéines à activités enzymatiques, par exemple le facteur tissulaire ou uPAR les cytokines et interleukines. La mesure de la concentration des microparticules peut également être réalisée par dosage quantitatif des lipides totaux ou des protéines totales. La mesure de la concentration de microparticules membranaire peut être également réalisée, par exemple, via un test prothrombinase tel que décrit dans Hugel B, Zobairi F, Freyssinet JM. Measuring circulating cell-derived microparticles. J Thromb Haemost. 2004 Oct;2(10):1846-7 [12]. Brièvement, dans ce procédé, les facteurs de coagulation du sang et la concentration de calcium sont déterminés en sorte que PhtdSer est le paramètre limitant dans la génération de thrombine soluble à partir de prothrombine exogène ajoutée dans le milieu réactionnel. Les résultats sont exprimés en nanomolaire d'équivalent PhtdSer (nM éq. PhtdSer) par référence à une courbe étalon établie avec des liposomes de composition connue et concentration tel que décrit dans Hugel B, Zobairi F, Freyssinet JM. « Measuring circulating cell- derived microparticles » J Thromb Haemost. 2004 Oct;2(10):1846-7 [12]. La mesure de la concentration des microparticules peut également être réalisée, par exemple, par mesure de l'activité facteur tissulaire. Brièvement le procédé utilise des facteurs de la coagulation spécifiques du complexe dit Tenase et de dose la formation de facteur Xa à partir de facteur X ajouté dans le milieu réactionnel tel que décrit dans Aupeix K, Hugel B, Martin T, et al. « The significance of shed membrane particles during programmed cell death in vitro, and in vivo, in HIV-1 infection. » J Clin Invest 1997; 99(7): 1546-54. [13]. L'activité portée par les MP-FT+ est rapportée à une courbe étalon de concentration connue en facteur tissulaire. La concentration obtenue est exprimé en Moles par litre d'activité facteur tissulaire. La mesure de la concentration de microparticules membranaires peut être également réalisée par exemple par une méthode chronométrique basée sur des billes recouvertes par un moyen de détection, par exemple un anticorps, permettant l'identification (phénotype) et la mesure d'un temps de coagulation après ajout d'un plasma dépourvu de phospholipides. Dans cette méthode, le temps de coagulation est dépendant de la quantité de phospholipides anioniques (PhtdSer) apportés par les MPs spécifiquement captées au préalable par les billes. Une calibration du test chronométrique à partir d'une solution de liposomes de concentration connue afin peut être éventuellement effectuée et permet de convertir le résultat chronométrique (secondes) en activité procoagulante (nM eq. Phtd Ser).
La mesure de la concentration de marqueurs biologiques solubles, par exemple la E-Sélectine soluble, la glycoprotéine V soluble, le facteur V et/ou la P-Sélectine soluble, peut être réalisée via un procédé immunologique, par exemple un procédé ELISA, par exemple après insolubilisation sur plaque multipuits, ou en utilisant des billes recouvertes d'anticorps pour un dosage par cytométrie en flux tels que décrits par Fu Q, Zhu J, Van Eyk JE. « Comparison of multiplex immunoassay platforms ». Clin Chem. 2010 Feb;56 (2) : 314-8 [6] et/ou tout procédé connue de l'homme du métier adapté à la mesure de la concentration de marqueurs biologiques.
Par exemple, pour la E-Sélectine soluble la mesure de la concentration peut être réalisée par un procédé immunologique, par exemple il peut s'agir du procédé décrit dans le document Lobb RR, Chi-
Rosso G, Leone DR, Rosa MD, Bixler S, Newman BM, Luhowskyj S, Benjamin CD, Dougas IG, Goelz SE, et al. « Expression and functional characterization of a soluble form of endothelial-leukocyte adhésion molécule 1 » J Immunol. 1991 ;147:124-9 [6] ou Okajima K, Harada N, Sakurai G, Soga Y, Suga H, Terada T, et al. « Rapid assay for plasma soluble E-selectin predicts the development of acute respiratory distress syndrome in patients with systemic inflammatory response syndrome» Transi Res. 2006 Dec; 148 (6):295-300 [4].
Par exemple, pour la P-Selectine la mesure de la concentration peut être réalisée par un procédé immunologique, par exemple il peut s'agir du procédé décrit dans le document Dunlop LC, Skinner MP, Bendall LJ, Favaloro EJ, Castaldi PA, Gorman JJ, Gamble JR, Vadas MA, Berndt MC. « Characterization of GMP-140 (P-selectin) as a circulating plasma protein» J Exp Med. 1992; 175: 1 147-50. [7] ou Thom J, Gilmore G, Yi Q, Hankey GJ, Eikelboom JW. « Measurement of soluble P-selectin and soluble CD40 ligand in sérum and plasma. » J Thromb Haemost. 2004 Nov;2(1 1 ):2067-9. [8]
Par exemple, pour la glycoprotéine V soluble la mesure de la concentration peut être réalisée par un procédé immunologique, par exemple il peut s'agir d'un procédé Elisa, il peut s'agir par exemple du procédé décrit dans le document de Azorsa DO, Moog S, Ravanat C, Schuhler S, Follea G, Cazenave JP, et al. « Measurement of GPV released by activated platelets using a sensitive immunocapture ELISA-its use to follow platelet storage in transfusion. » Thromb Haemost. 1999;81 (1 ):131 -8 [9].
Par exemple, pour le facteur V la mesure de la concentration peut être réalisée par un procédé immunologique, par exemple un procédé immunologique de type ELISA, par un test de coagulation permettant par exemple, la mesure de l'activité procoagulante par exemple réalisée par méthode chronométrique sur plasma décalcifié selon la méthode de détermination du temps de Quick (adjonction de thromboplastine et de plasma déficient en facteur V et mesure du temps de coagulation après adjonction de calcium. L'apport de plasma déficient en facteur V rend le temps uniquement du taux de facteur V apporté par le plasma à étudier. Le résultat est exprimé en pourcentage (%) par rapport à une courbe de référence obtenue par dilution d'un pool de plasmas témoins. La mesure du temps de coagulation peut être magnétique (oscillation d'une bille) ou par mesure de la densité optique. Il peut s'agir par exemple du procédé décrit dans le document QUICK AJ. « The assay and properties of labile factor (factor V). » J Clin Pathol 1960;13:457-62 [10], ou par un procédé enzymologique, il peut s'agir par exemple du procédé décrit dans le document Tilley D, Levit I, Samis JA. « Measurement of factor v activity in human plasma using a microplate coagulation assay. » J Vis Exp. 2012(67) [1 1].
En particulier, la présente invention à pour objet un procédé de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) comprenant une mesure à partir d'un premier échantillon biologique de la concentration RmCDio5 de microparticules membranaires porteuses du cluster de différenciation 105 (CD105).
Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection peut comprendre en outre une étape de comparaison de la concentration RmCDio5 mesurée avec une valeur de référence RCDIOS-
Selon l'invention la valeur de référence RCDIOS peut être la valeur de la concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation CD105 mesurée chez un sujet sain ou la moyenne de la valeur de la concentration mesurée chez un groupe de sujets sains de référence.
Dans la présente par « sujet sain de référence », on entend un mammifère, par exemple un être humain ou un animal, n'ayant pas de pathologie aiguë ou chronique et/ou ne prenant pas de traitement médical. Selon l'invention, le groupe de « sujets sains de référence » peut être de même sexe et/ou de même âge que celui du mammifère à partir duquel est obtenu l'échantillon biologique. Avantageusement le groupe de « sujets sains de référence » est de même sexe et de même âge que celui du mammifère à partir duquel est obtenu l'échantillon biologique
Selon l'invention par « groupe de sujets de référence » on entend un groupe permettant de définir un intervalle de référence fiable. Il peut s'agir par exemple d'un groupe comprenant au moins 20 sujets de référence tel que définis ci-dessus, par exemple un groupe comprenant de 40 à 200 sujets de référence. Selon l'invention, la valeur de référence RCDIO5 est une valeur obtenue par analyse d'une courbe ROC obtenue à partir d'analyse statique de valeurs obtenues à partir d'un groupe de sujets de référence présentant un choc septique
Selon l'invention, la valeur de référence RCDIOS peut être une valeur comprise dans un intervalle de référence IRCDIOS qui peut être les valeurs de la concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation CD105 mesurée chez 90% d'un groupe de sujets sains de référence.
Selon l'invention la valeur de référence RCDIOS peut être une concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation supérieure à 1 ,0 nM équivalent PhosphatidylSérine (eq. PhtdSer), avantageusement supérieure à 1 ,3nM eq. PhtdSer.
Avantageusement, les inventeurs ont montré qu'une valeur
RmCDi o5 supérieure à la valeur de référence RCDIOS indique une CIVD.
Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont montré que le procédé de détection de la CIVD comprenant la détermination de la concentration RmCDio5 permet une détection avec une sensibilité supérieure ou égale à 67,5 % et une spécificité supérieure ou égale à 84,6 %
Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) peut comprendre en outre une étape de mesure à partir d'un second échantillon biologique de la concentration RmCD3i de microparticules membranaires porteuses du le cluster de différenciation 31 (CD31 ).
Selon l'invention, le second échantillon biologique est un échantillon biologique tel que défini ci-dessus.
Selon l'invention, le second échantillon biologique peut être identique ou différent du premier échantillon biologique. Selon l'invention, les premier et second échantillons biologiques peuvent être un seul et même échantillon.
Selon l'invention, le premier et/ou le second échantillon biologique peut provenir d'un mammifère présentant un choc septique.
Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de la CIVD peut comprendre en outre une étape de comparaison de la concentration RmCD3i mesurée avec une valeur de référence RCD3I -
Selon l'invention la valeur de référence RCD3I peut être la valeur de la concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation CD31 mesurée chez un sujet sain ou la moyenne de la valeur de la concentration mesurée chez un groupe de sujets sains de référence.
Selon l'invention, la valeur de référence RCD3I peut être également une valeur obtenue par analyse d'une courbe ROC.
Selon l'invention la valeur de référence RCD3I peut être une concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation inférieure à 1 ,5 nM eq. PhtdSer, avantageusement inférieure à 1 ,4035 nM eq. PhtdSer.
Avantageusement, les inventeurs ont montré qu'une valeur RmCD3i inférieure à la valeur de référence RCD3I indique une CIVD.
Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont montré que le procédé de détection de la CIVD comprenant la détermination de la concentration RmCD3i permet une détection avec une sensibilité supérieure ou égale à 80,0 % et une spécificité supérieure ou égale à 38,5 %.
Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont également montré que le procédé de détection de la CIVD comprenant la détermination de la concentration de la RmCDio5 et de la RmCD3i permet une détection avec une sensibilité supérieure ou égale à 67,5 et une spécificité supérieure ou égale à 84,6. Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de la CIVD peut comprendre en outre une étape de mesure dans un troisième échantillon biologique de la concentration d'au moins un marqueur choisi dans le groupe comprenant ΙΈ-Sélectine soluble, la glycoprotéine V soluble et la P-Sélectine soluble.
Selon l'invention, le troisième échantillon biologique est un échantillon biologique tel que défini ci-dessus.
Selon l'invention les premier, second et troisième échantillons biologiques peuvent être indépendamment identiques ou différents les uns des autres.
Selon l'invention, les premier, second et troisième échantillons biologiques peuvent être un seul et même échantillon.
Selon l'invention, les premier, second et troisième échantillons biologiques peuvent indépendamment provenir d'un mammifère présentant un choc septique.
Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de la CIVD peut comprendre en outre une étape de mesure, dans un quatrième échantillon biologique, de la concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation CD1 1 a, de la numération des leucocytes et du calcul du rapport RcDn/ieu de la concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation CD1 1 a sur la numération en leucocytes.
Selon l'invention, le quatrième échantillon biologique est un échantillon biologique tel que défini ci-dessus.
Selon l'invention les premier, second, troisième et quatrième échantillons biologiques peuvent être indépendamment identiques ou différents les uns des autres.
Selon l'invention, les premier, second, troisième et quatrième échantillons biologiques peuvent être un seul et même échantillon. Selon l'invention, les premier, second, troisième et quatrième échantillons biologiques peuvent indépendamment provenir d'un mammifère présentant un choc septique.
Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection peut comprendre en outre une étape de comparaison du rapport RcDn/ieu calculée avec une valeur de référence RocDn/ieu-
Selon l'invention, la valeur de référence RocDn/ieu peut être la valeur du rapport de la concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation CD1 1 a divisée par la numération en leucocyte mesuré chez un sujet sain de référence ou la moyenne de la valeur du rapport mesurée chez un groupe de sujets sains de référence.
Selon l'invention, la valeur de référence RocDn/ieu peut être une valeur supérieure à 0,45nM/G
La mesure de la concentration de leucocytes peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'un procédé d'analyse en cytométrie en flux sur automate, par exemple avec l'automate ADVIA 2120 commercialisé par la société Siemens.
Les inventeurs de la présente invention ont également montré de manière surprenante et inattendue que les marqueurs biologiques précités évoluent en fonction du temps sur l'individu d'où provient l'échantillon. En outre, les inventeurs ont démontré de manière surprenante qu'il est possible de prévoir l'évolution/la survenue d'une CIVD.
Aussi, la présente invention a pour objet un procédé de prédiction et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes :
a. mesure de la concentration ROCDIOS de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105) et de la concentration ROCD3I de microparticules membranaire portant le cluster de différenciation 31 (CD31 ) b. comparaison de la valeur mesurée ROCDIOS avec une valeur de référence RCDIOS
c. comparaison de la valeur mesurée ROCD3I avec une valeur de référence RCD3I
d. Affectation d'une valeur VCDIOS égale à 1 si ROCDIOS est supérieure à la valeur RCDIOS ou d'une valeur VCDIOS égale à 0 si ROCDIOS est inférieure à la valeur RCDIOS
e. Affectation d'une valeur VCD3i égale à 1 si R0CD31 est inférieure à la valeur RCD3i OU d'une valeur VCD3i égale à 0 si R0CD31 est supérieure à la valeur RCD3i
f. Calcul du score S selon la formule suivante :
S = ε + VCDIOS x a + VCD31 X β
dans laquelle ε est une valeur comprise entre -4,035 et -1 ,094, a est une valeur comprise entre 1 ,638 et 4,066
β est une valeur comprise entre 0,193 et 3,138
dans lequel une valeur de S supérieure à 0,2892 indiquant une CIVD et/ou l'apparition d'une CIVD.
En d'autres termes les scores obtenus peuvent être corrélés avec le devenir du mammifère dont il provient.
Avantageusement selon l'invention, ε peut être égal à -2,565.
Avantageusement selon l'invention, a peut être égal à 2,852.
Avantageusement selon l'invention, β peut être égal à 1 ,665.
Ainsi, selon l'invention, le score S peut être de formule suivante :
S = -2,565 + VCDIOS X 2,852 + VCD31 x 1 ,665.
En outre, les inventeurs ont montré que lorsque la valeur de S est supérieure à 0,2892 le procédé permet avantageusement une prédiction avec une sensibilité supérieure ou égale à 67,5 et une spécificité supérieure ou égale à 84,6. Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) peut comprendre en outre les étapes suivantes :
b'. mesure de la concentration RoFv du facteur V;
c'. comparaison de la valeur mesurée ROFV avec une valeur de référence RFV
d'. affectation d'une valeur VFv égale 1 si ROFV est supérieure à la valeur RFv ou d'une valeur VFv égale 0 si ROFV est inférieure à la valeur RFv f. Calcul du score S' selon la formule suivante :
S'= -4,259 + VCD105 x 3,246 + VCD31 x 2,1776 + VFV x 2,1059 dans lequel une valeur de S' supérieure à 0,2663 indiquant une CIVD et/ou l'apparition d'une CIVD.
Selon l'invention, la valeur de référence RFV peut être également une valeur obtenue par analyse d'une courbe ROC obtenu à partir d'analyse statique de valeurs obtenues à partir d'un groupe de sujets de référence
En outre, les inventeurs ont montré avantageusement que lorsque la valeur de S' est supérieure à 0,2663 le procédé permet avantageusement une prédiction avec une sensibilité supérieure ou égale à 87,5 et une spécificité supérieure ou égale à 71 ,1 .
Les inventeurs de la présente invention ont également montré de manière surprenante et inattendue que les marqueurs biologiques précités évoluent en fonction du temps et de l'application d'un traitement sur l'individu d'où provient l'échantillon. Aussi, la présente invention à pour objet un procédé de suivi de l'efficacité d'un traitement de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes :
a. mesure de la concentration ROCDIOS de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105) avant ledit traitement ; b. mesure de la concentration RICDIOS de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105), après ledit traitement ; et
c. détermination du rapport SCD105 selon la formule suivante
SCD105 = (Ri CD105 / RoCD105)
une valeur de SCD105 supérieure ou égale à 1 indiquant l'évolution de la CIVD.
Avantageusement, les inventeurs ont montré que lorsque que la valeur de SCD105 est supérieure ou égale à 1 , le traitement peut être qualifié d'efficace.
Selon l'invention le procédé de suivi de l'efficacité d'un traitement de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) peut comprendre en outre :
- à l'étape a) la mesure de la concentration d'au moins un marqueur biologique choisi parmi la concentration R0CD31 de microparticules membranaires comprenant le cluster de différenciation 31 (CD31 ), la concentration en l'E-Selectine soluble, la concentration en glycoprotéine V soluble et/ou la concentration en P-sélectine soluble, et
- à l'étape b) la mesure de la concentration d'au moins un marqueur biologique choisi parmi la concentration R1 CD31 de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 31 (CD31 ), la concentration en l'E-Sélectine soluble, la concentration en glycoprotéine V soluble et/ou la concentration en P-sélectine soluble après le traitement.
La présente invention a également pour objet un kit de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) selon l'invention comprenant des moyens de mesure de la concentration de microparticules membranaires comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105). Selon l'invention par moyens de mesure de la concentration de microparticules membranaires comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105) on entend tout moyen connu de l'homme du métier pour la détection des microparticules qui portent CD105. Il peut s'agir par exemple des molécules choisies dans le groupe comprenant des anticorps, des sondes lipidiques, synthétiques ou naturelles incluant les annexines et leurs dérivés synthétiques, insolubilisés ou non sur tout type de support, des ligands peptidiques ou protéiques, des enzymes et substrats chromogéniques et des matériaux fonctionnalisés pour l'insolubilisation ou la capture des microparticules. Il peut s'agir par exemple de plaques StreptaWell High Bind (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, réf. : 1 1 989 685 001 ) recouvertes de streptavidine, des anticorps lgG1 -Bi (Leinco, St Louis, Missouri, USA, réf. 1128), des anticorps lgG2a-Bi (Leinco, St Louis, Missouri, USA, réf. 1129), des anticorps anti-CD105 humain: Anti human CD105-Bi (R&D Systems, Mineapolis, USA, réf. MAB10972), des anticorps anti-CD31 humain: iMouse Anti human CD31 -Bi (Caltag, Burlingam, USA, réf. MHCD31 15-4 PPACK (Merck, Darmstadt, Germany), Dns-GGACK (Merck, Darmstadt, Germany), Vésicules synthétiques PS/PC 33/67 (Avanti Polar), CaCI2 (Sigma, St Louis, Missouri, USA), facteur humain Va ("Human Factor Va") (référence : 405, American Diagnostica, Stamfort, USA), facteur humain Xa ("Human Factor Xa") (référence : EZ007B, Biogenic, Perols, France), Prothrombine humaine ("Human Prothrombin") (référence PP006C, Hyphen BioMed, Neuville sur Oise, France), pNAPEP0216 (référence : 61 01 0216, Cryopep, Montpellier, France)
La présente invention a également pour objet un kit de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) selon l'invention comprenant des moyens de mesure de la concentration de microparticules membranaires comprenant le cluster de différenciation 31 (CD31 ). Selon l'invention par moyens de mesure de la concentration de microparticules membranaires portant le cluster de différenciation 31 (CD31 ) on entend on entend tout moyen connu de l'homme du métier pour la détection des microparticules combiné avec la détection de CD31 ou des éléments de contrôlant l'expression de CD31 , par exemple les ARNs et/ou les protéines, par exemple des molécules choisies dans le groupe comprenant des anticorps, des sondes lipidiques, synthétiques ou naturelles incluant les annexines et leurs dérivés synthétiques ou non, insolubilisés ou non sur tout type de support, des ligands peptidiques ou protéiques, des enzymes et des substrats chromogéniques, des activités enzymatiques catalysées par des protéines comme l'activité facteur tissulaire. Il peut s'agir par exemple d'un procédé en cytométrie en flux basée sur la reconnaissance de sondes fluorescentes, par exemple des anticorps marqués ou des sondes protéiques, fixés ou non sur des billes. Les sondes protéiques peuvent être par exemple des anticorps détectant le cluster de différentiation CD31 à la surface des microparticules ou toute autre protéine ou enzyme hébergée à la surface des microparticules ou dans la microparticule en relation avec l'exposition de CD31 . Il peut également s'agir d'une détection par ELISA des microparticules porteuses de CD31 . Les sondes protéiques peuvent être combinées à des sondes lipidiques qui reconnaissent la PhtdSer ou encore les lipides de la membrane des microparticules et leur degré de compaction.
La présente invention a également pour objet un kit de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) selon l'invention comprenant des moyens de mesure de la concentration de microparticules membranaires comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105) et/ou des moyens de mesure de la concentration de microparticules membranaires comprenant le cluster de différenciation 31 (CD31 ).
Selon l'invention par moyens de mesure de la concentration de microparticules membranaires portant le cluster de différenciation 105 (CD105) on entend on entend tout moyen connu de l'homme du métier pour la détection des microparticules combiné avec la détection de CD105 ou des éléments de contrôlant l'expression de CD105, par exemple les ARNs, les protéines, par exemple des molécules choisies dans le groupe comprenant des anticorps, des sondes lipidiques, synthétiques ou naturelles incluant les annexines et leurs dérivés synthétiques ou non, insolubilisés ou non sur tout type de support, des ligands peptidiques ou protéiques, des enzymes et des substrats chromogéniques, des protéines portant une activité biologique propre ou capables d'en acquérir une par interaction avec le milieu environnant choisie parmi le sang, plasma, sérum, liquide bronchoalvéolaire et/ou le tissu vasculaire, des activités enzymatiques catalysées par des protéines comme l'activité facteur tissulaire. Il peut s'agir par exemple d'un procédé en cytométrie en flux basée sur la reconnaissance de sondes fluorescentes, par exemple des anticorps marqués ou des sondes protéiques, fixés ou non sur des billes. Les sondes protéiques peuvent être par exemple des anticorps détectant le cluster de différentiation CD105 à la surface des microparticules ou toute autre protéine ou enzyme hébergée à la surface des microparticules ou dans la microparticule en relation avec l'exposition de CD105. Il peut également s'agir d'une détection par ELISA des microparticules porteuses de CD105. Les sondes protéiques peuvent être combinées à des sondes lipidiques qui reconnaissent la PhtdSer ou encore les lipides de la membrane des microparticules et leur degré de compaction. La présente invention a également pour objet un kit de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) selon l'invention comprenant en outre des moyens de mesure d'au moins un marqueur choisi dans le groupe comprenant ΙΈ-Selectine soluble, la glycoprotéine V soluble et la P-sélectine soluble.
Selon l'invention par moyens de mesure d'au moins un marqueur choisi dans le groupe comprenant la E-Selectine soluble, la glycoprotéine V soluble et la P-sélectine soluble, on entend tout moyen connu de l'homme du métier pour la détection / mesure des dits marqueurs. Il peut s'agir par exemple des molécules choisies dans le groupe comprenant des anticorps, par exemple spécifique du fragment soluble de la E- sélectine, du fragment soluble de la P-sélectine, du facteur V, des ligands peptidiques ou protéiques de ces fragments, par exemple des récepteurs par exemple le PSLG-1 , fonctionnalisés ou non pour permettre leur insolubilisation ou leur détection. Il peut également s'agir de substrats et/ou d'activateurs du facteur V.
D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif.
Brève description des figures
- La figure 1 représente des diagrammes en bâton des résultats obtenus en fonction de la présence d'une CIVD (gris) ou pas de CIVD (blanc) (la barre représente la médiane, les limites supérieures et inférieures les 25eme et 75eme percentiles et les barres en « T » les i oeme et 90eme percentiles). Les lignes en pointillés représentent les valeurs normales. L'ordonnée représente soit la concentration en plaquettes en G/L, le temps prothrombine en pourcent par rapport à une courbe étalon, la concentration en D-dimères en mg/L, la concentration en monomère de fibrine en mg/L, la concentration en fragments de prothrombine F1 +2 en μηηοΙ/L ou la protéine C en pourcent par rapport à une courbe étalon. L'abscisse représente la condition et le jour de mesure : 1 er (D1 ), 3eme (D3) et 7ème (D7) jour.
La figure 2 A représente un diagramme en bâton de la concentration des microparticules membranaires en équivalents PhosphatidylSérine (ordonnée) lors d'un choc septique (en gris) ou non (blanc) (la barre représente la médiane, les limites supérieures et inférieures les 25eme et 75eme percentiles et les barres en « T » les i oeme et 90eme percentiles). Les résultats représentés sont la concentration totale de Microparticules membranaires (PhtdSer-microparticules), des microparticules membranaires dérivées des plaquettes (GPIb- microparticules), des microparticules membranaires dérivées des leucocytes (CD1 1 a-microparticules) et des microparticules membranaires dérivées des cellules endothéliales (CD105-microparticules, CD31 - microparticules and CD62E-microparticules).
La figure 2 B représente un diagramme en bâton de la concentration des microparticules membranaires en équivalents PhosphatidylSérine (ordonnée) en fonction du temps lors d'une CIVD (en gris) ou non (blanc) (la barre représente la médiane, les limites supérieure et inférieure les 25eme et 75eme percentiles et les barres en « T » les i oeme et 90eme percentiles). Les lignes en pointillées représentent les valeurs normales. Les analyses statistiques représentent les différences des mesures répétées entre les sujets avec une CIVD ou non en fonction du temps.
La figure 3 A représente un diagramme en bâton de la concentration des microparticules membranaires dérivées des plaquettes (GPIb-microparticules) (ordonnée) avec une CIVD (en gris) ou non (blanc) (la barre représente la médiane, les limites supérieure et inférieure les 25ème et 75ème percentiles et les barres en « T » les 10ème et 90ème percentiles).
La figure 3 B représente un diagramme en bâton de la concentration du rapport de la concentration de la GPV soluble (sGPV) sur le nombre de plaquettes (ordonnée) avec une CIVD (en gris) ou non
(blanc) (la barre représente la médiane, les limites supérieures et inférieures les 25eme et 75eme percentiles et les barres en « T » les i oeme et 90ème percentiles).
La figure 4 représente des diagrammes en bâton des résultats obtenus en fonction de la présence d'une CIVD (gris) ou pas de CIVD
(blanc) (la barre représente la médiane, les limites supérieure et inférieure les 25eme et 75eme percentiles et les barres en « T » les 10eme et 90eme percentiles). Les lignes en pointillés représentent les valeurs normales. L'ordonnée représente soit la concentration des microparticules membranaires portant le CD105 en nM équivalent PhosphatidylSérine, la concentration des microparticules membranaires portant le CD31 en nM équivalent PhosphatidylSérine, la concentration en E-sélectine soluble en pg/L, le rapport P-sélectine soluble / nombre de plaquettes en pg/G, la concentration en activateur tissulaire du plasminogène (t-PA) ng/L ou la concentration en inhibiteur de l'activateur du plasminogène PAI-1 . L'abscisse représente la condition et le jour de mesure : 1 er (D1 ), 3eme (D3) et 7eme (D7). Les analyses statistiques représentent les différences des mesures répétées entre les sujets avec une CIVD ou non en fonction du temps.
La figure 5 représente des diagrammes en bâton des résultats obtenus en fonction de la présence d'une CIVD (gris) ou pas de CIVD (blanc) (la barre représente la médiane, les limites supérieures et inférieures les 25eme et 75eme percentiles et les barres en « T » les i oeme et 90eme percentiles). Les lignes en pointillés représentent les valeurs normales. L'ordonnée représente soit la concentration des leucocytes en G/L, du rapport microparticules membranaires portant le CD1 1 a /le nombre de leucocyte en nM/G, la concentration de l'interleukine 6 (IL-6) en ng/L, la concentration de l'interleukine 10 (IL-10) en ng/L, la concentration de facteur nécrosant de tumeur alpha (TNF-alpha) en ng/L, la concentration en protéine 1 Monocytaire Chimo-attractante (MCP-1 ) en ng/L. L'abscisse représente la condition et le jour de mesure : 1 er (D1 ), 3ème (D3) et 7ème
(D7). Les analyses statistiques représentent les différences des mesures répétées entre les sujets avec une CIVD ou non en fonction du temps.
La figure 6 représente une courbe ROC obtenue avec les marqueurs MP-CD105 et MP-CD31 avec en ordonnée la sensibilité et en abscisse la spécificité (100-spécificité). EXEMPLES
Exemple 1 : étude et procédé de détection de la CIVD
1 . Matériel et méthodes :
Les patients : Cent patients adultes consécutifs (18 à 85 ans) atteints de choc septique ont été inclus de façon prospective après l'admission en unité de réanimation médicale (soins intensifs médicaux) de trois hôpitaux tertiaires et 92 patients ont été étudiés. Le comité d'éthique du Centre Hospitalier Universitaire de Strasbourg a approuvé cette étude (Comité de Protection des Personnes Est-IV, Strasbourg). Le consentement éclairé a été obtenu auprès du patient ou, s'il n'était pas en mesure de consentir, auprès de la famille au moment de l'admission, et confirmé par le patient dès que son état le permettait. Les soins ont été prodigués selon l'état de l'art et sans intervention thérapeutique spécifique. Les patients présentant une insuffisance cardiaque (classe NYHA IV) ou hépatique (Child-Plugg C) au stade terminal, ou présentant des maladies cancéreuses évolutives ont été exclus. Six patients ont été exclus en raison d'une coagulation ou d'un volume insuffisant de plasma et deux patients présentant un âge supérieur à 85 ans et une insuffisance hépato-cellulaire Child C ont été exclus (tableau 1 ).
Le tableau 1 ci-dessous présente les caractéristiques des patients lors de leur admission.
Pas de
Total N=92 CIVD Valeur p
CIVD N=52
Caractéristiques
Sexe masculin
59 (64,1 ) 33 (63,5) 26 (65,0) 0,97 N (%)
Age 61 ,5 (15,0) 62,3 (14,4) 60,5 (15,9) 0,58
SAPS II 57,5 (18,1 ) 51 ,9 14,3 64,9 20,0 <0,01
Mortalité (jours 15 (16 ,3) 5 (9 ,6) 10 (25,0) 0,09 7)
Mortalité (jours
27 (29,3) 15 (28,8) 12 (30,0) 0,91 28) N (%)
Défaut d'organes
SOFA 9,9 (3,0) 8,5 (2,1) 11,8 (3,0) <0,01
Choc 92 (100 ,0) 52 (100,0) 40 (100,0) 1,00
Détresse
85 (92,4) 46 (88,5) 39 (97,5) 0D.23 respiratoire
Insuffisance
52 (56,5) 19 (36,5) 33 (82,5) <0,01 rénale aiguë
Insuffisance
7 (7,6) 2 (3,8) 5(12,5) 0,24 hépatique
Coma 23 (25,0) 10 (19,2) 13 (32,5) 0,22
Site d'infection
Pneumonie 49 (53,3) 33 (63,5) 16 (40,0) 0,03
Urinaire 13 (14,1) 7(13,5) 6 (15,0) 0,83
Abdominal 13 (14,1) 8(15,4) 5(12,5) 0,69
Bactériémie 9 (9,8) 1 (1,9) 8 (20,0) 0,01
Autre 12 (13,3) 3 (5,8) 9 (22,5) 0,03
Microorganisme
Cocci gram-
27 (29,3) 11 (21,2) 16 (40,0) 0 ,50 positifs
Enterobactéries 20 (21,7) 12 (23,1) 8 (20,0)
Autre bacilles
13 (14,1) 8(15,4) 5(12,5)
gram-négatifs
Autres 12 (13,0) 6(11,5) 6 (15,0)
Thérapie
Figure imgf000029_0001
sans ventilation
La collecte de sang et l'analyse des échantillons ont été réalisées comme suit :
Quinze millilitres de sang ont été recueillis sur citrate de sodium (0,139 M) et immédiatement centrifugés deux fois à 4500 x g pendant 15 min pour obtenir un plasma pauvre en plaquettes (PPP), congelés à -80°C avant analyse. Le prélèvement a été effectué peu de temps après l'admission en réanimation (au premier jour D1 ), puis les matins suivants (jours 2, 3, 4 et 7). L'hémostase a été analysée avec un automate STA-R Evolution (marque déposée) (Stago) avec des réactifs commerciaux habituels selon un procédé chronométrique, chromogénique ou immunoturbidimétrique ; selon les cas ont été mesuré : le temps de Quick convertit en taux de prothrombine (PT), le facteur V (FV), le temps de céphaline activée (TCA ou aPTT), le fibrinogène (Fg), D-dimères (DDI), l'antithrombine (AT), la protéine C (PC) et des monomères de fibrine (FM). Le Fragment 1 +2 de la prothrombine (F1 +2) a été quantifié avec le kit ELISA commercial Enzygost (marque déposée) F1 +2 (Siemens) et la glycoprotéine V plaquettaire soluble (sGPV) par ELISA en utilisant le kit commercial Asserachrom (marque déposée) sGPV, Stago.
Les réactifs en fonction du marqueur et des procédés utilisés sont indiqués dans le tableau 2 suivant
Tableau 2. Références des réactifs utilisés
Méthode Référence Fournisseur
PT Chronométrique STA-NEOPLASTINE Cl 10 Stago
FV Chronométrique STA-DEFICIENT V Stago
TCA Chronométrique STA-PTT AUTOMATE 5 Stago
Fg Chronométrique STA-FIBRINOGEN 5 Stago
AT Chromogénique STA-STACHROM AT III 6 Stago
PC Chromogénique STA-STACHROM Stago
PROTEIN C
D-Di Immuno-turbidimétrique STA-LIATEST D Dl Stago
FM Immuno-turbidimétrique STA-LIATEST FM Stago
F1 +2 ELISA Enzygnost® F 1 +2 Siemens sGPV ELISA Asserachrom sGPV Stago
La numération des plaquettes et des leucocytes a été obtenue par un procédé d'analyse en cytométrie en flux sur automates de routine d'hématologie, par exemple de type ADVIA 2120, Siemens AG et collectée à partir des rapports médicaux.
L'activateur du plasminogène de type tissulaire (t-PA) et l'inhibiteur de l'activateur de plasminogène 1 (PAI-1 ), l'interleukine 6 (IL-6), l'interleukine 10 (IL-10), le facteur nécrosant de tumeur alpha (TNF-a), la protéine chimiotactique des monocytes-1 (MCP-1 ), la P-sélectine soluble et la E-sélectine soluble ont été quantifiés par une technique immunologique dérivée d'ELISA utilisant les billes fonctionnalisées FlowCytomix (Bender MedSystems GmbH) détectées à l'aide d'un cytomètre en flux FACS-scan (Becton Dickinson). Les résultats ont été analysés en utilisant le logiciel FlowCytomix Pro 3.0 (Bender MedSystems GmbH).
Selon l'enseignement du document Finjheer R et al. (Fijnheer R, Frijns CJ, Korteweg J, et al. « The origin of P-selectin as a circulating plasma protein.» Thromb Haemost 1997; 77(6): 1081 -5. [1 ]) la P-sélectine soluble et le rapport P-sélectine soluble / plaquette ont été calculés afin d'évaluer la contribution relative de l'origine plaquettaire et de la P- sélectine endothéliale.
Score CIVD
Les scores CIVD ont été calculés selon le score JAAM 2006
(Gando S, Iba T, Eguchi Y, et al. A multicenter, prospective validation of disseminated intravascular coagulation diagnostic criteria for critically ill patients: comparing current criteria. Crit Care Med 2006; 34(3): 625-31 . [2]) par mesure répétée pendant les premières 24 heures et une CIVD précoce a été confirmée si les scores étaient supérieurs ou égale à 4 à l'admission (jour 1 ) et / ou au deuxième jour.
L'analyse des microparticules et la détermination de leur concentration a été évaluée comme suit : les microparticules (MP) ont été mesurées par dosage enzymatique fonctionnel appelé dosage prothrombinase qui détecte la PhosphatidylSérine (PhtdSer) exposée à la surface des MP et après capture des microparticules sur de l'annexine-5 insolubilisée ou des anticorps insolubilisés selon le procédé décrit dans Hugel et al. [12]. En bref, dans cette analyse fonctionnelle, les facteurs de coagulation sanguine et les concentrations de calcium sont établies pour s'assurer que la PhtdSer est le paramètre limitant de la génération de la thrombine soluble à partir de la prothrombine exogène. Les résultats ont été exprimés en nanomoles par litre d'équivalent PhosphatidylSérine (nM éq. PhtdSer) par référence à une courbe étalon établie avec des liposomes de composition et de concentration connues ([13]). Le phénotype des MP a été déterminé en utilisant des anticorps spécifiques biotinylésau lieu de l'annexine-5: anti-GPIb (plaquettes), anti-CD1 1 a (leucocytes), anti-CD62E (E-sélectine, cellules endothéliales stimulées), anti-CD31 ) et anti-CD105 (cellules endothéliales). Les limites/valeurs normales chez des volontaires sains ont été établis précédemment dans le laboratoire des inventeurs selon le même procédé. En outre, le procédé / les solutions particulières utilisées pour déterminer la concentration des microparticules ainsi que les marqueurs était les suivants :
1 ère étape : Phase préanalytique de lavage des microparticules de plasma de patients
Le plasma de patients de la cohorte a été traité comme suit :
- Mélange de 900 μΙ_ plasma + 9 μΙ_ du mélange (PPACK [50 pM]/Dns-GGACK [50 MM]/CaCI2 [50 mM] (1/1 ))
- Laisser incuber 10 minutes à température ambiante à savoir 22°C
- Centrifugation 1 heure à 14000 x g
- Jeter le surnageant
- Gratter le culot qui contient les microparticules à l'aide d'un portoir
- Ajouter 900 μί de tampon TBS (50 mM Tris, 120 mM NaCI, 2,7 mM KCI, pH 7,5) Albumine 3g/L (sans Calcium)
- Centrifuger 1 h à 14000 x g
- Jeter le surnageant
- Gratter le culot qui contient les microparticules lavées à l'aide d'un portoir
- Ajouter 900μΙ TBS Albumine humaine 3g/L (sans Calcium)
- Conservation des échantillons à -80°C avant dosage.
Toutes les dilutions ont été réalisées dans du TBS, Ca2+ 1 mM, tween 0,05% (tampon T) et les lavages dans du TBS, Ca2+ 1 mM (tampon
2ème étape : dosage et phénotypage des Microparticules
Dans cet étape, le dosage a été réalisé sur plaque StreptaWell High Bind (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, réf. : 1 1 989 685 001 )
Toute les dilutions ont été réalisée avec du TBS, Ca2+ 1 mM, Albumine humaine 3 g/L et les lavages soit en TBS, Ca 2+ 1 mM, tween 0,05% (tampon T) ou en TBS, Ca2+ 1 mM (tampon L) Insolubilisation de l'Annexine 5-Biotinylée et des Anticorps-Biotinylés :
Une solution stock (0,32 mg/mL) d'annexineV-Biotinylée est préparée est diluée à 250 ng/mL. Une solution d'anticorps lgG1 -Biotinylé (Leinco, St Louis, Missouri, USA, réf. 1128) (stock 100 Mg/mL) a été diluée à 10 g/mL. Une solution d'anticorps lgG2a-Biotinylé (Leinco, St Louis, Missouri, USA, réf. 1129) (stock 500 Mg/mL) diluée à 10 Mg/mL. Une solution comprenant la Mouse Anti human Gp1 b-alpha-Bi 2008 (fourni par François Lanza et biotinylé au laboratoire (stock 1 , 1 mg/mL) a été diluée à 2 Mg/mL. Une solution comprenant des anticorps de souris Mouse Anti human CD105-Biotinylé (R&D Systems, Mineapolis, USA, réf. MAB10972) (stock 0,48 mg/mL) a été diluée à 10 Mg/mL. Une solution comprenant des anticorps de souris Mouse Anti human CD31 -Biotinylé (Caltag, Burlingam, USA, réf. MHCD31 15-4) (stock 200 Mg/mL) a été diluée à 10 Mg/mL. Une solution comprenant Mouse Anti human CD1 1 a-Biotinylé (Leinco, St Louis, Missouri, USA, réf. C172) (stock 100 Mg/mL) a été diluée à 1 0 Mg/mL. Une solution comprenant le Mouse Anti human CD62E-Biotinylé (Ancell, Bayport, MN, USA, réf. : 240-030) (stock 1 mg/mL) a été diluée à 10 Mg/mL. Chacune des solutions a été ajoutée indépendamment dans différents puits (100 ML/puits). La plaque avec les puits dans lesquels les solutions sont présentes a été agitée et incubée 30 minutes à 37°C. La plaque a été ensuite lavée trois fois avec 250 M L de tampon L
Préparation des plasmas de référence : des échantillons de pool de plasma pauvre en plaquettes (PPP) ont été décongelés et 50 μΜ de PPACK (Merck, Darmstadt, Germany) et 50 μΜ de Dns-GGACK (Merck, Darmstadt, Germany) ont été ajoutés et agités.
Préparation des vésicules standards : une gamme de vésicules congelées allant d'environ 2 à 30 nM eq PhtSer ont été déposés. Les vésicules étaient les PS/PC 33%/67% (mol/mol) (Avanti Polar) avec une solution de CaCI2 50 mM Préparation des microparticules lavées issues de plasma de patients de la cohorte: les microparticules lavées ont été mises dans une solution comprenant 30 mM final de Calcium
Dépôt des échantillons et standards :
100 L/puits de solution d'échantillons et standards ont été déposés et la plaque a été mise sous agitation et incubation 1 heure à 37°C. Des Lavages ont été ensuite réalisés comme suit :
- 3 X 5 min. Χ 250 μΙ_ de tampon T à 22°C
- 1 X 5 min. X 250 μΙ_ de tampon L à température ambiante à savoir 22°C.
Détection de l'activité prothrombinase : Un pool de facteurs comprenant du CaC^ 1 M (Sigma, St Louis, Missouri, USA, 2 mM dans les 100 μί de milieu réactionnel : MR), du facteur Va humain (« Human Facteur Va » référence : 405, American Diagnostica, Stamfort, USA, 250 pM dans les 100 μί de MR), du facteur Xa humain « Human Facteur Xa » référence : EZ007B, Biogenic, Perols, France, 106 pM dans les 100 μί de MR) a été utilisé. 100 L/puits dudit pool ont été ajoutés. La plaque a été ensuite agitée. La prothrombine utilisée était la prothrombine humaine (référence PP006C, Hyphen BioMed, Neuville sur Oise, France, 3,5 μΜ dans les 50 μί) et 50 L/puits ont été ajoutés et la plaque agitée et incubée 10 min. à 37°C. Le substrat chromogène était le pNAPEP0216 (référence : 61 01 0216, Cryopep, Montpellier, France, 1 ,52 mM dans les 50 [il) : 50 L/puits ont été ajoutés. Une lecture cinétique immédiate après ajout du substrat à 405 nm sur 3 minutes (8 à 10 s entre les points, Vmax sur 3 points) a été réalisée à l'aide d'un spectromètre Versamax (Molecular
Devices, Wokingam Berkshire, UK).
Statistique
Les variables ont été décrites comme des fréquences, et la comparaison a été faite par un test de χ2 ou un test exact de Fisher. Les données quantitatives ont été données en moyennes et déviations standards et analysées avec le test de Kruskall-Wallis. Les mesures répétées ont été analysées par ANOVA ou avec un modèle linéaire mixte et deux voies ANOVA comprenant les analyses post-hoc qui ont été réalisées en utilisant le test t avec correction de Bonferroni pour les multiples comparaisons lorsque indiqué. Avant de procéder à cette analyse, les variables ont été évaluées pour leur normalité et les variables dont la distribution n'est pas normalisée ont été transformées en utilisant soit une transformation logarithmique, racine carrée, inverse ou exponentielle. Plusieurs modèles de régression logistique ont été effectuées pour expliquer la survenue d'une CIVD. Il a été vérifié que la mort avant le jour 7 n'a pas d'influence sur les niveaux ou l'évolution dans le temps des microparticules, F1 +2, AT, PC, leucocytes, plaquettes, sGPV/plaquettes, E-sélectine soluble, P-sélectine soluble et l'IL-10. Toutes les statistiques ont été réalisées avec le logiciel MedCalc® 12.5.0 (Ostend, Belgium) (http://www.medcalc.org/index.php Version de 2012). Une valeur de p<0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
2. Résultats
Les principales caractéristiques des 92 patients à l'admission sont résumées dans le tableau 1 ci-dessus. Selon le score de JAAM, 40 patients (43,5%) présentaient les critères d'une CIVD précoce, 30 patients à l'admission (D1 ) (32,6%) et 10 au deuxième jour (D2) (10,9%). Les patients avec une CIVD précoce étaient plus gravement malades avec une plus grande SAPS2 et un score de SOFA plus élevé (p <0,01 et p <0,001 respectivement). Chez ces patients, l'insuffisance rénale aiguë et une thérapie de remplacement rénale (p<0,001 et p<0,01 ) étaient plus fréquentes. Les marqueurs plasmatiques inflammatoires (IL-6, IL-10, TNF- a et CRP) étaient considérablement augmentés chez tous les patients (p<0,05) et significativement plus élevée dans une CIVD précoce (p <0,05), sauf pour la CRP. Aucune différence liée à la consommation de tabac (p=0,06), à la BPCO, au diabète sucré, au cancer, à l'hypertension ou à une maladie cardiaque ischémique n'a été mise en évidence entre les patients avec ou sans CIVD précoce. Les sujets avec une CIVD présentaient une mortalité précoce plus élevée (p=0,09).
L'impact du type de micro-organismes ou du site de l'infection impliqué dans la survenue d'une CIVD est toujours controversé. Dans le présent exemple, la CIVD était significativement associée à une infection du sang (p=0,01 ).
Comme attendu, l'activation de l'hémostase était présente dans le diagnostic de tous les patients quel que soit le diagnostic lié à la CIVD. De manière surprenante, nous avons mis en évidence la hausse initiale de F1 +2 et des monomères de fibrine confirmant la génération de thrombine précoce et la formation de fibrine alors que l'AT et la PC ont diminué révélant une consommation d'inhibiteurs naturels de la coagulation (figure
1 )- Dans les deux groupes, la génération de thrombine et la fibrinolyse ont persistées au fil du temps, malgré les soins apportés et la restauration des facteurs de coagulation et des inhibiteurs. Néanmoins, un retard de la restauration de AT et PC a été observé chez les patients avec une CIVD (p<0,05 entre le jour 1 et 7 (D1 -D7)) (Figure 1 ).
Pour évaluer la contribution des cellules endothéliales, des leucocytes et des plaquettes, les microparticules membranaires ont été utilisées comme substituts cellulaire pour détecter l'activation des cellules vasculaires au cours du temps. Par rapport à la normale, les patients en choc septique ont montré une augmentation trois fois plus élevé (p<0,001 ) de l'ensemble des microparticules membranaires procoagulantes au premier jour (D1 ) taux qui est demeurée élevée au septième jour (D7) (Figure 2). Les microparticules membranaires circulantes originaires des leucocytes (CD1 1 a-microparticules membranaires) et des plaquettes (GPIb-microparticules membranaires) étaient significativement augmentées au premier jour (D1 ) (p<0,001 et p=0,02 respectivement). Les microparticules membranaires de cellules endothéliales été également augmentées (les microparticules membranaires portant les marqueurs CD105 et CD31 ) même si aucune modification des niveaux de la E- sélectine (CD62E-microparticules membranaires) n'a pu être détectée (Figure 2).
Le présent exemple démontre donc clairement et de manière surprenante que les patients avec une CIVD présentaient un profil de microparticules membranaires particulier. En effet, il a été observé que la concentration de microparticules membranaires (GPIb-MP) circulantes d'origine plaquettaire était inférieure chez les individus avec CIVD. La génération de ces microparticules était directement dépendante de la concentration de plaquettes disponibles pour l'activation (r2 = 0,24, p<0,001 ). En effet, le rapport GPIb-microparticules/plaquettes est resté stable et normal au fil du temps (environ 0,025nM/G) (Figure 3).
La GPV soluble (sGPV) a été évaluée comme un autre indicateur de l'activation plaquettaire par la thrombine et le rapport sGPV/plaquettes était significativement plus élevée chez les individus avec une CIVD (0,7 ± 1 ,1 vs. 0,2 ± 0,2 pg/G, p=0,02) (figure 3) en dépit des concentrations plasmatique normales de sGPV.
Bien que la mesure des GPIb-microparticules soit apparue comme un outil fiable pour détecter l'activation plaquettaire, le rapport sGPV/plaquettes était plus précis pour montrer l'activation des plaquettes due à la présence de thrombine au cours de la CIVD.
Indépendamment de la présence d'une CIVD (p=0,15), l'apoptose des cellules endothéliales a été mise en évidence par une augmentation importante des microparticules membranaires porteuses du cluster de différenciation CD31 à des concentrations élevées jusqu'au 7eme jour (D7) (p= 0,19) (figure 4). Par ailleurs, les concentrations plasmatiques de PAI-1 et t-PA n'étaient pas significativement plus élevées dans la CIVD (figure 4).
Les concentrations de Microparticules membranaires porteuses du CD105 (CD105-MPs) sont restées considérablement élevées (p <0,001 ) dans la CIVD et avaient tendance à revenir à l'état initial à la fin de la période de suivi (p <0,05) (figure 4). De manière surprenante, le traitement par la protéine C activée (drotrécogine alfa [activée], Xigris®, Eli Lilly, IN) s'est traduit par une diminution au troisième jour de la génération des microparticules membranaires porteuses du marqueur CD31 et des microparticules membranaires porteuses du marqueur CD105 (CD31 -MPs, p=0,06 et CD105-MPs p<0,001 ) (données non présentées).
Les formes circulantes solubles de la P-sélectine et de la E- sélectine, éventuellement libérées après clivage protéolytique de l'endothélium, ont été évaluées comme indicateurs d'activation indirecte. La P-sélectine soluble est restée inchangée dans la quasi-totalité des patients. En revanche, aucun patient avec CIVD n'a montré une amélioration du rapport sP-Sélectine/plaquettes indiquant peut-être une contribution endothéliale (p=0,04) (figure 4). En effet, la E-Sélectine soluble a été augmentée dans les deux groupes et à des niveaux supérieurs chez les individus avec une CIVD (p=0,02), confirmant l'important stress endothélial suggéré par les mesures de MP.
À l'admission, l'activation des leucocytes et la sécrétion des CD1 1 a-MPs était drastique chez les patients avec une CIVD (9,2 ± 8,7nM éq. PhtdSer, p=0,02 vs. pas de CIVD), tandis que le nombre de leucocytes était similaire dans les deux sous-ensembles (Figure 5). Le rapport du nombre de CD1 1 a-MPs/leucocyte est resté constant au cours de la période de suivi chez les patients sans CIVD (0,4 nM/G) alors qu'il a diminué de 1 ,5 nM/G au niveau de base au 7eme jour chez les individus avec une CIVD. Cette observation suggère que l'activation des leucocytes dans les CIVD diminue dans le temps après sept jours. La pertinence des variations des microparticules membranaire (MP) ci-dessus a également été examinée par une analyse par régression multiple effectuée au premier jour, qui excluait les paramètres du JAAM liés à l'hémostase (nombre de plaquettes, TP, DDi, GPIb-microparticules membranaires, P-Sélectine soluble / plaquettes, sGPV / plaquettes). Ainsi, il a été démontré de manière surprenante et inattendue que les microparticules membranaires porteuses du cluster de différenciation CD 105 (CD105-MP), les microparticules membranaires porteuses du cluster de différenciation CD 31 (CD31 -MP) et/ou le facteur V (FV) sont significativement associés à une CIVD comme montré dans le tableau 3 ci-dessous. Ces biomarqueurs originaux apparaissent clairement d'un intérêt particulier en raison de leurs variations plus importantes que celles des variables techniques couramment utilisées en pratique clinique et qui qui ne permettent pas la détection précoce et précise de la CIVD.
Tableau 3 : résultat de la courbe de régression logistique multiple à l'admission (CIVD précoce vs. pas de CIVD)
Figure imgf000039_0001
Afin de définir un profil biologique spécifique à l'admission (D1 ), signe de la survenue d'une CIVD (pré-état CIVD), les valeurs ont été mesurées chez les patients qui développent une CIVD au deuxième jour tel que présenté sur le tableau 4, et il a été démontré de manière surprenante et inattendue qu'ils sont caractérisés par des concentrations élevées de microparticules membranaires portant le CD105 (p<0,05 vs. pas de CIVD), ce qui a permis de déterminer et identifier trois profils de patients différents : pas de CIVD, pré-CIVD et CIVD. Tableau 4 : microparticules et hémostase à l'admission
Pré CIVD
CIVD
(CIVD
Pas de identifiée
identifiée au
Normal CIVD au premier
deuxième N=52 jour
jour) N=30
N=10
Microparticules (nMeq PhdSer)
Anx-A5 (Total) 4,9 ±2,0 14,0±7,7 16,1 ±9,7 14,3±7,6
GPIba3(Plaquettes) 3,5±2,2 6,6±6,4* 2,5±3,1 * 4,3±4,1
10,3±1 1 ,6
CD1 1 a (Leucocytes) 3,2±2,2 4,5±2,8* * 5,9±3,9
CD31 (Endothélium -
0,1 ±0,1 1 ,6±2,0 1 ,1 ±1 ,2 1 ,2±1 ,1 apoptoses)
CD105 (Endothélium -
0,4±0,3 0,8±0,6*† 2,7±2,4* 1 ,8±1 ,7† activation)
CD62E (Endothélium -
0,0±0,0 0,0±0,1 0,3±0,9 0,0±0,1 activation)
Hémostase
Leucocytes (G/L) [4,2-10,7] 16,0±9,5† 16,1 ±15,9 9,2±1 1 ,5†
Plaquettes (G/L) [150-400] 2751130*† 94±88*§ 213±178†§
Temps prothrombine (%) [70-120] 45±19* 35±17* 36±16
Fibrinogène (g/L) [2,0-4,0] 5,8±1 ,9 4,6±2,2 5,3±2,6
14,4±7,3*
D-Dimères (mg/L) [<0,4] 4,5±4,3*† 4,5±3,5†§
§
Antithrombine (%) [70-130] 82±37* 56±38* 72±31
Protéine C (%) [70-130] 57±30* 34±20* 45±23
Fibrine Monomères
[<10] 29±50* 84±73* 32±40 (mg/L)
Prothrombine fragment
[70-230] 5081409† 651 ±416 9231471† 1 +2 (μΓΤΐοΙ/L)
Glycoprotéine Soluble
[10-60] 47±33 49±36 28±1 1 (GP)V (Mg/L) sGPV/ plaquettes (pg/G) [0,2±0,1 ] 0,210,2* 0,9+1 ,2*§ 0,2+0, 1 §
Activateur du t-
2,9±1 ,4 13,4±14,4 15,6+17,4 26,6±26,3 Plasminogène ( g/L)
Plasminogen Activator
[<10] 34,8±25,8 39,9+23,5 52,3±36,8 Inhibitor ( g/L)
E-Sélectine Soluble 1 144+152
[100±35] 4721522*† 1007±1095 (SCD62E) (Mg/L)† 5*
sCD62P/plaquettes (pg/G) [0,5±0,1 ] 0,8±0,8*† 3,3+5,7*§ 0,6±0,5†§
Cytokines et chémokines
383516530 6095+801
lnterleukine-6 (ng/L) [<5]† 14489±8949 † 4
3614+598 3805±5919 lnterleukin-10 (ng/L) [<10] 55111273*†
0* †
Facteur alpha Nécrosants
[<4] 157+212† 250+279 348±251† de tumeurs(ng/L)
Monocyte Chemotactic 1 1 x8+10x4* 17x7+1 1 x 24x6±1 1 x3
[1 ,0±0,3]
Protein-1 ( g L) † 5* †
Dans lequel * signifie un p<0,05 sans C VD vs. CIVD au premier jour, † signifie p<0,05 sans CIVD vs. CIVD au second jour; § signifie p<0,05 CIVD premier jour vs. CIVD au deuxième jour.
En revanche, les variations des rapports de P-sélectine soluble/plaquettes et sGPV/plaquettes (marqueurs de la contribution des plaquettes) étaient moins significatifs et ne permettent pas de déterminer les trois différent profils de patients précités (p <0,05 CIVD au deuxième jour vs CIVD au premier jour) malgré une génération majeure de thrombine (F1 +2) (p<0,05 vs pas de CIVD). L'activation des leucocytes est déjà évidente à D1 avec une baisse significative du nombre de leucocytes et une augmentation du rapport microparticules membranaires porteuses du CD1 1 a/leucocytes. Au total, ces données reflètent peut-être la dysfonction endothéliale chez les patients atteints de CIVD et montre que les microparticules membranaires porteuses du CD105 ont une valeur diagnostique pour la détection précoce de la CIVD chez les patients (tableau 3).
Les résultats obtenus démontrent clairement que les microparticules membranaires sont également un outil précieux pour la détection des événements cellulaires tardifs au cours de la septicémie. En outre, en raison de la baisse spécifique des valeurs de microparticules membranaires porteuses du CD105 qui sont revenu à la normale au 7eme jour chez les patients CIVD, ces microparticules membranaires se révèlent être un très bon indicateur du suivi de la CIVD due, notamment à des lésions endothéliales (figure 4).
Cet exemple démontre que la concentration des microparticules membranaires porteuses du CD105 et la concentration des microparticules membranaires porteuses du CD31 sont des marqueurs de la CIVD.
Une analyse statistique des données biologiques obtenues a été ensuite réalisée. Il s'agissait en particulier d'une analyse par régression logistique ciblée sur la concentration des microparticules membranaires porteuses du CD105, la concentration des microparticules membranaires porteuses du CD31 et de la concentration du facteur V (FV) fonction de la présence ou absence de la CIVD chez les patients précités.
Pour ce faire, le logiciel utilisé était MedCalc® 12.5.0 (Ostend,
Belgium, http://www.medcalc.org/index.php, version de 2012) en utilisant les fonctions :
- Frequency table & Chi-square test,
- Fisher's exact test,
- Kruskal-Wallis test,
- One-way analysis of variance,
- Repeated measures analysis of variance,
- Logistik régression,
- ROC curve analysis
et a permis la détermination d'une règle de décision et l'élaboration d'une courbe ROC (figure 6) (Delacour, H., et al., La Courbe ROC (receiver operating characteristic) : principes et principales applications en biologie clinique, Annales de biologie clinique, 2005 ; 63 (2) : 145-54 [14]).
Cette analyse a montré que lors d'un choc septique, une concentration dans un échantillon de plasma des microparticules membranaires porteuses du CD105 supérieure à 1 ,3 nM éq. PhtdSer déterminée selon le procédé décrit ci-dessus, permet de détecter une CIVD avec une sensibilité 67,5 % et une spécificité de 84,6 %
Cette analyse a également montré que lors d'un choc septique, une concentration dans un échantillon de plasma des microparticules membranaires porteuses du CD31 inférieur ou égale à 1 ,4035 nM éq. PhtdSer déterminée selon le procédé décrit ci-dessus, permet de détecter une CIVD avec une sensibilité de 80,0 % et une spécificité de 38,5 %.
Enfin cette étude à montrer que lors d'un choc septique, une concentration dans un échantillon de plasma des microparticules membranaires porteuses du CD105 supérieure à 1 ,3 nM éq. PhtdSer et une concentration dans un échantillon de plasma des microparticules membranaires porteuses du CD31 inférieur ou égale à 1 ,4035 nM éq. PhtdSer déterminées selon le procédé décrit ci-dessus permet de détecter une CIVD avec une sensibilité de 67,5 et une spécificité de 84,6.
Exemple 2 : détermination de l'algorithme pour détection/prédiction de la CIVD chez un sujet test et mise en œuvre.
Dans cet exemple, la détermination de l'algorithme de détection/prédiction de la CIVD a été effectuée à partir de données cliniques obtenues à l'exemple 1 précité.
Pour ce faire, une analyse statistique a été effectuée via MedCalc® 12.5.0 (Ostend, Belgium, http://www.medcalc.org/index.php, version de 2012) en utilisant les fonctions :
- Frequency table & Chi-square test, - Fisher's exact test, - Kruskal-Wallis test,
- One-way analysis of variance,
- Repeated measures analysis of variance,
- Logistik régression,
- ROC curve analysis
La construction de l'algorithme a été menée à l'aide de la modélisation par régression logistique de la CIVD précoce (Pré CIVD) dans la cohorte de patients de l'exemple 1 : analyse univariée puis multivariée pour les variables liées significativement à la survenue d'une CIVD précoce avec p<0,20. Dans ce contexte, chaque patient a été caractérisé par les concentrations vCDi o5 et vCD3 i calculées suivant le procédé décrit dans l'exemple 1 .
L'application du procédé de calcul du score de prédiction S à partir de la formule suivante :
S = -2,565 + VcDios x 2,852 + VCD31 x 1 ,665
Dans laquelle la valeur VCDIOS était égale à 1 si la concentration dans un échantillon de plasma des microparticules membranaires porteuses du CD105 était supérieure à 1 ,3 nM éq. PhtdSer ou égale à 0 si la concentration dans un échantillon de plasma des microparticules membranaires porteuses du CD105 était inférieure ou égale à 1 ,3 nM éq. PhtdSer ; et la valeur VCD3i était égale à 1 si la concentration dans un échantillon de plasma des microparticules membranaires porteuses du CD105 était inférieure ou égale à 1 ,4035 nM éq PhtdSer ou égale à 0 si la concentration dans un échantillon de plasma des microparticules membranaires porteuses du CD105 était supérieure à 1 ,4035 nM éq PhtdSer.
Une valeur de S supérieure à 0,2892 indiquant une CIVD et/ou l'apparition d'une CIVD. Le procédé a été également mis en œuvre avec le score de prédiction suivant : S = ε + vCDi o5X G + VCD31 X ,
dans lequel -4,035 < ε < -1 ,094, 1 ,638 < a < 4,066 et 0,193 < β < 3,138. Ce score a été réalisé sur la base d'un intervalle de confiance à 95% des différents coefficients et permet de déterminer la présence et/ou l'apparition d'une CIVD.
Exemple 3 : exemple de mesure/détection des microparticules avec une trousse/kit diagnostique Après prélèvement, l'échantillon plasmatique est filtré sur plaque multipuits à fond poreux (diamètre 0,1 μιτι) ou sur tout autre filtre individuel afin d'obtenir les plasmas dépourvus de microparticules pour des dosages biologiques, et de permettre le lavage extensif des microparticules retenues sur les filtres et de mesurer leur concentration éventuelle.
Des billes fonctionnalisées par exemple des billes magnétiques ou des billes de polystyrène fluorescentes portant des anticorps dirigés contre le marqueur CD105 et des billes portant de l'annexine 5 ou des anticorps contre la PhtdSer sont utilisées afin de mesurer respectivement la concentration de microparticules membranaires portant le marqueur CD 105 et la concentration totale de microparticules membranaires dans l'échantillon. Dans un autre mode de réalisation des billes fonctionnalisées portant des molécules de streptavidine ou des anticorps reconnaissants les anticorps biotinylés dirigés contre CD105 ou contre la PhtdSer recherchés sur les microparticules sont utilisées. Les billes de taille supérieure à un micromètre servent éventuellement de surface de capture des microparticules dans l'échantillon plasmatique. Dans ce cas, les billes sont séparées du plasma par simple dépôt sur microplaque à fond poreux ou sur colonne individuelle (aimantée ou non) pour permettre le lavage extensif des microparticules avant leur révélation. Le plasma dépiété en microbilles et microparticules peut être recueilli après isolement des billes pour permettre d'autres dosages de marqueurs circulants. Les billes sont ensuite utilisées indépendamment dans une des méthodes de mesure suivantes :
- méthode en cytométrie en flux, basée sur des billes recouvertes par un anticorps ou un ligand (de taille et d'auto-fluorescence définie) permettant l'identification (phénotype) et secondairement révélée par un anticorps secondaire ou par de l'annexine-5 dont l'intensité est corrélée au nombre de microparticules présentes sur les billes. Des billes de calibres et de fluorescence différentes sont éventuellement utilisées en fonction de l'anticorps primaire (phénotypage) secondairement traitées par un anticorps secondaire fluorescent anti PhtdSer ou par de l'annexine-5 fluorescente. Le phénotypage dépend de la taille et de la fluorescence propre des billes, la quantification de l'intensité de la fluorescence secondaire. Ce système a été développé pour des dosages multiplex de protéines circulantes. Le marquage est celui d'un ELISA (environ 3 à 4 heures) et l'acquisition se fait sur cytomètre en flux avec interprétation par logiciel. FlowCytomix (Bender MedSystem, GmbH) a développé ce type de multitest.
- méthode en turbidimétrie, basée sur des billes recouvertes par un anticorps permettant l'identification (phénotype) et s'agglutinant en fonction de la densité de capture.
- méthode chronométrique basée sur des billes recouvertes par un anticorps permettant l'identification (phénotype) et la mesure d'un temps de coagulation après ajout d'un plasma dépourvu de phospholipides. Le temps de coagulation devient alors dépendant de la quantité de phospholipides anioniques (PhtdSer) apportés par les MPs spécifiquement captées par les billes. Une calibration du test chronométrique à partir d'une solution de liposomes de concentration connue afin est optionnellement effectuable et permet de convertir le résultat chronométrique (secondes) en activité procoagulante (nM eq. PhtdSer). - méthode colorimétrique basée sur des billes recouvertes par un anticorps permettant l'identification (phénotype) et la mesure d'une activité procoagulante par utilisation d'un test enzymatique prothrombinase. La quantité de thrombine générée est alors dépendante de la quantité de phospholipides anioniques (PhtdSer) apportés par les MPs spécifiquement captées par les billes et est alors révélée par addition d'un substrat chromogénique. Une calibration du test colorimétrique à partir d'une solution de liposomes de concentration connue est optionnellement effectuable et permet de convertir le résultat colorimétrique (mDO/min) en activité procoagulante (nM eq. Phtd Ser).
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Claims

REVENDICATIONS
1 . Procédé in-vitro de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un premier échantillon biologique comprenant une mesure de la concentration RmCDio5 de microparticules membranaires porteuses du cluster de différenciation 105 (CD105).
2. Procédé de prédiction et/ou de détection selon la revendication 1 , comprenant en outre une étape de comparaison de la concentration mesurée avec une valeur de référence RCDI OS-
3. Procédé de prédiction et/ou de détection selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'échantillon biologique est choisi dans le groupe comprenant un échantillon de sang, de plasma, de sérum, liquide de lavage bronchiolo-alvéolaire.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant en outre une étape de mesure à partir d'un second échantillon biologique de la concentration RmCD3i de microparticules membranaires porteuses du le cluster de différenciation 31 (CD31 ).
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant en outre une étape de comparaison de la concentration mesurée avec une valeur de référence RCD3I■
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel lesdits premier et second échantillons biologiques sont un seul et même échantillon.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel lesdits premier et second échantillons biologiques proviennent d'un patient présentant un choc septique.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel la valeur de référence RCDIOS est supérieure à 1 ,3 nM équivalent PhosphatidylSérine (éq. PhtdSer).
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, dans lequel la valeur de référence RCD3I est inférieure à 1 ,4035 nM éq. PhtdSer.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel le procédé comprend en outre la mesure dans un troisième échantillon biologique de la concentration d'au moins un marqueur choisi dans le groupe comprenant ΙΈ-Sélectine soluble, la glycoprotéine V soluble et la P-sélectine soluble
1 1 . Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel le procédé comprend en outre la mesure dans un quatrième échantillon biologique de la concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation CD1 1 a, de la numération des leucocytes et du calcul du rapport RcDn/ieu de la concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation CD1 1 a sur la numération des leucocytes.
12. Procédé selon la revendication 10, dans lequel lesdits premier, second et troisième échantillons biologiques sont un seul et même échantillon.
13. Procédé de prédiction et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes :
a. mesure de la concentration ROCDIOS de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105), de la concentration ROCD3I de microparticules membranaire portant le cluster de différenciation 31 (CD31 ),
b. comparaison de la valeur mesurée ROCDIOS avec une valeur de référence RCDIOS
c. comparaison de la valeur mesurée ROCD3I avec une valeur de référence RCD3I
d. affectation d'une valeur VCDIOS égale à 1 si ROCDIOS est supérieure à la valeur RCDIOS OU d'une valeur CD 105 égale à 0 si RocDios est inférieure à la valeur RCDIOS, e. affectation d'une valeur VCD3i égale à 1 si ROCD3I est inférieur à la valeur RCD3i OU d'une valeur CD 31 égale à 0 si RocD3i est supérieure à la valeur RCD3i
f. calcul du score S selon la formule suivante :
Figure imgf000052_0001
dans laquelle ε est compris de -4,035 à -1 ,094, a est compris de 1 ,638 à 4,066, β est compris de 0,193 à 3,138
14. Procédé de prédiction et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) selon la revendication 13 dans lequel dans la formule S ε est égal à -2,565, a est égal à 2,852 et β est égal à 1 ,665.
15. Procédé de suivi de l'efficacité d'un traitement de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes :
a. mesure de la concentration ROCDIOS de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105) avant ledit traitement ;
b. mesure de la concentration RICDIOS de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105), après ledit traitement ; et c. détermination du rapport SCD105 selon la formule suivante :
SCD105= (R1 CD105 /R0CD105)
une valeur de SCD105 supérieure ou égale à 1 indiquant une évolution de la CIVD
16. Kit de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) portant des moyens de mesure de la concentration de microparticules membranaires comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105).
17. Kit selon la revendication 16 comprenant en outre des moyens de mesure de la concentration de microparticules membranaires portant le cluster de différenciation 31 (CD31 ).
18. Kit selon la revendication 16 ou 17 comprenant en outre des moyens de mesure d'au moins un marqueur choisi dans le groupe comprenant ΙΈ-Sélectine soluble, la glycoprotéine V soluble, le facteur V et la P-sélectine soluble.
19. Kit selon l'une quelconque des revendications 16 à 18 dans lequel les moyens de mesure de la concentration de microparticules membranaires portant le cluster de différenciation 105 (CD105) sont choisis dans le groupe comprenant des anticorps, des sondes lipidiques, synthétiques ou naturelles, des ligands peptidiques ou protéiques, des enzymes, des substrats chromogéniques, des protéines portant une activité biologique propre ou capables d'en acquérir une par interaction avec le milieu environnant choisie parmi le sang, plasma, sérum, liquide bronchoalvéolaire et/ou le tissu vasculaire.
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