KR20130138211A

KR20130138211A - 아밀로이드 단백질을 검출하기 위한 시스템 및 방법

Info

Publication number: KR20130138211A
Application number: KR1020137006889A
Authority: KR
Inventors: 폴 디. 하르퉁; 빈센트 발보; 찰스 게르방에; 게랄드 디. 카글; 데니스 제이. 닐란
Original assignee: 코그놉틱스, 인코포레이티드
Priority date: 2010-08-16
Filing date: 2011-08-12
Publication date: 2013-12-18
Also published as: EP2420179A2; CN103153168A; US20160183859A1; JP2013534171A; TW201215876A; MX357628B; AU2011292233A1; NZ607257A; KR101905436B1; US9451909B2; AU2011292233B2; AR082707A1; EP2605694B1; JP2015166749A; US20130135580A1; BR112013003754A2; EP2420179A3; CA2807683A1; EP2605694A1; JP5863797B2

Abstract

본 발명의 구체예에 따른 포유동물의 눈에서 아밀로이드 단백질을 검출하는 방법 및 장치가 제공된다. 방법은 각각의 아밀로이드-결합 화합물이 아밀로이드 단백질에 결합될 때 적어도 아밀로이드-결합 화합물에서 형광을 생성하는 데 적절한, 파장 성질, 편광 성질 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 갖는 광원으로 눈을 비추는 단계로서, 상기 아밀로이드-결합 화합물이 눈에 도입되고 특히 아밀로이드 형성 장애를 나타내는 아밀로이드 단백질에 결합되는, 단계; 및 적어도 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광에 대해 형광의 시간 붕괴율을 결정하는 단계로서, 상기 결정 단계가 적어도 시간 붕괴율에 근거하여 눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물의 존재를 구별하는 것을 허용하는, 단계를 포함한다.

Description

아밀로이드 단백질을 검출하기 위한 시스템 및 방법 {SYSTEM AND METHOD FOR DETECTING AMYLOID PROTEINS}

본 출원은 2010년 8월 16일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/374,131호 및 2010년 12월 21일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/425,490호의 우선권을 주장하며, 35 U.S.C § 119 또는 365 하에 2011년 2월 11일자로 출원된 유럽 특허출원 제11001148.3호의 우선권을 주장한다.

또한 본 출원은 현재 미국 특허 제7,828,436호인 2007년 4월 11일자로 출원된 미국 특허출원 제11/786,514호; 및 2008년 5월 21일자로 출원되고 미국 특허출원 공개 제2009/0041666호로서 공개된 미국 특허출원 제12/154,226호; 및 미국 특허 제7,107,092호 및 미국 특허 제7,297,326호와 관련이 있다.

모든 상기 특허, 공개 및 출원의 전체 내용은 본원에 참조로서 포함된다.

질병은 이의 진행 중에 조기에 발견하는 것이 항상 바람직하다. 조기 발견은 다양한 질병을 치료함에 있어 더 높은 성공률을 내는 것으로 일반적으로 증명된 조기 치료(early treatment)를 가능하게 한다. 사람의 눈, 그리고 특히 눈의 수정체를 분석하는 것은, 여러 유형의 질병들의 조치를 가져올 수 있는 것으로 밝혀져왔다. 예컨대, 연구자들은 알츠하이머 질병 (AD) 환자들의 눈의 수정체의 핵상에서 β-아밀로이드 펩티드 및 이들의 응집체를 발견하였다. 골드스타인(Goldstein) 등의 미국 특허 제7,297,326호를 참조하라. 핵상은 오직 밀리미터 두께의 부분이므로, 수정체의 이러한 부위로부터 얻어진 측정은 위치에 있어서 정확하고, 정보에 있어 구체적이고, 습득에 있어 빨라야 할 필요가 있다. 이는 특히, 환자가 환한 목표물을 응시하고 있을 때조차도 인간의 눈이 거의 끊임없이 움직이기 때문에 그러하다.

정상적인 제어값과 비교하여 시험 포유동물의 눈의 핵상 및/또는 피질 수정체 부위에서 β-아밀로이드 펩티드 및 이들의 응집체의 양의 존재, 또는 증가는, 시험 포유동물이 아밀로이드 형성 장애와 같은 신경병성 질병을 앓고 있거나, 발생 위험이 있음을 가리킨다는 것으로 나타났다.

아밀로이드 형성 장애의 조기 발견을 허용하기 위한 시스템 및 방법에 대한 계속적인 필요성이 있다.

본 발명의 일 구체예에 따라, 포유동물의 눈에서, 응집체를 포함하는 아밀로이드 단백질과 같은 아밀로이드 단백질을 검출하는 방법이 제공된다. 몇 구체예들에서, 아밀로이드 단백질의 검출은 아밀로이드 형성 장애를 나타낸다. 이 방법은 이들 각각은 아밀로이드-결합 화합물이 아밀로이드 단백질에 결합될 때 적어도 아밀로이드-결합 화합물에서 형광을 생성하는 데 적절하다. 파장 성질, 편광 성질 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 갖는 광원으로 눈을 비추는 단계로서, 상기 아밀로이드-결합 화합물이 눈에 도입되고 특히 아밀로이드 형성 장애를 나타내는 아밀로이드 단백질에 결합되는 단계; 눈에 비춘 결과로서 생성된 형광을 포함하는 빛을 수용하는 단계; 및 적어도 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광에 대해 형광의 시간 붕괴율을 결정하는 단계로서, 상기 결정 단계가 적어도 시간 붕괴율에 근거하여 눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물의 존재를 구별하는 것을 허용하는 단계를 포함한다.

추가의 관련 구체예들에서, 이 방법은 적어도 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광에 대해 형광의 강도를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물의 양은 강도 및 시간 붕괴율 중 하나 이상에 근거하여 결정될 수 있다. 이 방법은 눈의 조직으로부터 방출된 자연 형광으로 인한 형광 신호의 증가에 근거하여 눈의 수정체 피막과 같은 안구 계면의 위치를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 눈의 하나 이상의 부위는 광원에 의한 빛을 사용하여 샘플링될 수 있으며, 이러한 샘플링은 광원에 의한 빛을 사용한 부위 또는 부위들 내에서 다른 위치들의 샘플링 또는 전체 부위의 측정 중 하나 이상을 수행하는 것을 포함하고, 다른 위치들의 샘플링은 눈 내에서 하나 이상의 점, 면 및/또는 체적(volume)에 빛을 비추는 것을 포함한다. 샘플링은 눈의 하나 이상의 부위를 가로질러 다른 위치들을 샘플링하는 것을 포함할 수 있다. 예컨대, 눈의 평면 스캔은 눈 내부로의 깊이 방향으로 확장하는 수직 축을 따라 연속적인 면에서 광원을 사용하여 수행될 수 있다. 눈의 핵상의 위치는 (ⅰ) 눈 수정체 피막의 계면의 또는 각막 계면과 같은 특정한 해부학적 구조로부터 떨어진 거리 또는 (ⅱ) 강도 측정에서 변화(기울기)의 탐지에 근거하여 결정될 수 있다. 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물의 존재를 구별하는 것은 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물을 눈의 조직의 백그라운드 자가형광, 및 다른 비-특이적 입자들뿐만 아니라 결합되지 않은 영상화제의 자가형광으로부터 구별하는 것을 포함할 수 있다. 이 방법은 하기의 하나 이상의 존재 및 하나 이상의 양을 구별하는 것을 포함할 수 있다: 아밀로이드-결합 화합물; 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물; 및 아밀로이드 단백질. 아밀로이드 단백질은 응집체 또는 프리-아밀로이드(pre-amyloid) 단백질 응집체(이량체, 삼량체 또는 펩티드 Aβ_1-42및/또는 A_1-40의 더 높은 차수의 올리고머를 포함한다)를 포함할 수 있다. 예컨대, 아밀로이드 단백질은 β-아밀로이드를 포함할 수 있다. 아밀로이드 형성 장애는 알츠하이머 질병을 포함할 수 있다.

추가의 관련 구체예들에서, 아밀로이드-결합 화합물은 분자 회전자, 크리사민(Chrysamine) 및/또는 크리사민 유도체, 콩고 레드(Congo red) 및/또는 콩고 레드 유도체 아밀로이드-결합 화합물; 크리사민 G 또는 크리사민 G 유도체 아밀로이드-결합 화합물; 티오플라빈(Thioflavin) T 또는 티오플라빈 T 유도체 아밀로이드-결합 화합물; 및 티오플라빈 S 또는 티오플라빈 S 유도체 아밀로이드-결합 화합물을 포함할 수 있다. 이 방법은 오직 형광의 검출에만 근거하여 적어도 아밀로이드 단백질의 존재를 구별하는 것을 포함할 수 있다. 이 방법은 눈의 특정 영역에서 특정 붕괴율을 갖는 광자의 평균 숫자를 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 눈에 대한 아밀로이드-결합 화합물의 전달률, 눈으로 전달된 아밀로이드-결합 화합물의 공간적 분포, 및/또는 눈의 각막의 계면에서 아밀로이드-결합 화합물의 농도의 기울기는 검출된 형광에 근거하여 결정될 수 있다. 더욱이, 안구의 수양액에서 아밀로이드-결합 화합물의 공간적 분포 및/또는 아밀로이드-결합 화합물의 시간적 분포는 검출된 형광에 근거하여 결정될 수 있다.

이 방법은 해부학적 구조 또는 하부구조의 적어도 일부 자연 형광 여기에 근거하여 눈의 해부학적 구조 또는 하부구조의 일차원 이상을 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일차원 이상을 결정하는 것은 구조 또는 하부구조의 두께를 결정하는 것, 구조 또는 하부구조의 모양을 결정하는 것, 및 눈의 하나 이상의 구조 또는 하부구조 사이의 거리를 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 일차원 이상을 결정하는 것은 각막 두께, 각막 모양, 수양액 깊이, 수정체 모양 또는 수정체 두께를 결정하는 것, 또는 수정체의 표면으로부터 피질 또는 핵상 또는 핵까지의 거리와 같은, 수정체 또는 눈의 다른 구조 또는 하부구조 내에서 내부 치수를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이 방법은 포토다이오드, 광전자배증관, 전하-결합 소자(CCD) 및 강화된 전하-결합 소자(ICCD) 중 하나 이상과 같은 광검출기 장치; 예를 들면 고속 애벌란시 포토다이오드 검출기를 사용하여 눈에 의해 생성된 형광을 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이 방법은 눈에 의해 생성된 형광의 시간 상관 개별 광자 계수를 수행하는 것을 포함할 수 있다. 시간 상관 개별 광자 계수는 시간 채널 유닛의 함수로서 광자 수의 분포에 근거하여 형광의 시간 붕괴율을 결정하는 것과 광원을 펄싱하는 것을 포함할 수 있다.

추가의 관련 구체예들에서, 이 방법은 여기된 자연 형광을 결정하고 이로 인해 눈에서 관심 있는 하나 이상의 부위를 결정하기 위해 눈 내에서 스캔하는 단계; 및 광원에 의한 빛을 사용하여 눈에서 관심 있는 하나 이상의 부위를 샘플링하는 단계로서, 상기 샘플링은 하나 이상의 부위의 하나 이상의 전체 부위의 측정을 수행하는 또는 광원에 의한 빛을 사용하여 하나 이상의 부위 내에서 다른 위치들의 샘플링 중 하나 이상을 포함하여, 상기 다른 위치들의 샘플링이 하나 이상의 부위 내에서 점, 면 또는 체적 중 하나 이상을 비추는 단계를 포함할 수 있고; 여기서 샘플링은 하나 이상의 샘플링된 부위 내에서 적어도 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광에 대한 형광의 시간 붕괴율 및 형광의 강도를 결정하기 위한 것이다. 예컨대, 이 방법은 축 스캔의 각각의 지점을 따라 여기된 자연 형광을 결정하고 이로 인해 눈에서 관심 있는 하나 이상의 위치를 결정하기 위해, 눈 내부로의 깊이 방향으로 축 스캔 (z-스캔)을 수행하는 단계; 및 각각의 평면 스캔의 각각의 지점에서 적어도 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광에 대해 형광의 시간 붕괴율 및 형광의 강도를 결정하기 위해, 축 스캔의 방향과 수직인 연속적인 면에서, 광원을 사용하여 눈의 평면 스캔을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 이 방법은 아밀로이드 형성 장애를 나타내는 아밀로이드 단백질에 대해 눈 내에서 실시간 서치를 가능하게 할 수 있다.

추가의 관련 구체예들에서, 이 방법은 눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 대한 형광 여기 스펙트럼의 피크 부위에 대해 적절한 파장의 빛으로 눈을 비추는 단계; 및 눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물의 형광 방출 스펙트럼의 피크 부위에 대해 적절한 파장의 눈으로부터 수용된 빛을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 아밀로이드-결합 화합물은 화합물 #11일 수 있다. 여기 스펙트럼은 약 470 nm의 피크를 가질 수 있고, 눈을 비추는 단계가 여기 스펙트럼의 피크의 ±약 20 nm 내의 파장에 있으며, 방출 스펙트럼은 약 580 nm의 피크를 가질 수 있고, 눈으로부터 수용된 빛을 검출하는 단계가 방출 스펙트럼의 피크의 ±약 20 nm 내의 파장에 있다.

본 발명에 따른 다른 구체예에서, 포유동물의 눈에서 아밀로이드 단백질을 검출하기 위한 장치가 제공된다. 이 장치는 이들 각각은 적어도 아밀로이드-결합 화합물이 아밀로이드 단백질에 결합될 때 적어도 형광을 생성하는 데 적절하다. 빛의 파장, 빛의 편광 또는 이들의 조합 중 하나 이상으로 눈을 비추는 빛을 방출하도록 설정된 광원으로서, 상기 아밀로이드-결합 화합물이 눈에 도입되고 특히 아밀로이드 형성 장애를 나타내는 아밀로이드 단백질에 결합되는, 광원; 및 눈에 비춘 결과로서 생성된 형광을 포함하는 빛을 수용하고 적어도 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광에 대해 형광의 시간 붕괴율을 결정하도록 설정된 광학 유닛으로서, 상기 결정이 적어도 시간 붕괴율에 근거하여 눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물의 존재를 구별하는 것을 허용하는 광학 유닛을 포함한다.

추가의 관련 구체예들에서, 광학 유닛은 분자 회전자(rotor) 아밀로이드-결합 화합물; 콩고 레드(Congo red) 또는 콩고 레드 유도체 아밀로이드-결합 화합물; 크리사민(Chrysamine) 아밀로이드-결합 화합물; 크리사민 유도체 아밀로이드-결합 화합물; 크리사민 G 또는 크리사민 G 유도체 아밀로이드-결합 화합물; 티오플라빈(Thioflavin) T 또는 티오플라빈 T 유도체 아밀로이드-결합 화합물; 및 티오플라빈 S 또는 티오플라빈 S 유도체 아밀로이드-결합 화합물 중 하나 이상에 대해 시간 붕괴율을 결정하도록 설정될 수 있다. 광학 유닛은 적어도 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광에 대해 형광의 강도를 결정할 수 있다. 광학 유닛은 강도 및 시간 붕괴율 중 하나 이상에 근거하여, 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물의 양을 결정하도록 설정될 수 있다. 광학 유닛은 눈의 특정 영역에서 특정한 붕괴율을 갖는 광자의 평균 수를 결정하도록 설정될 수 있다. 광원은 펄스 레이저를 포함할 수 있다. 이 장치는 눈 내의 위치들에 걸쳐 광원으로부터 빛을 스캔하도록 설정된 광학 주사 유닛을 추가로 포함할 수 있다. 광학 주사 유닛은 이동 스테이지에 장착된 대물렌즈 및 갈바노미터 거울을 포함하는 스캐너를 포함할 수 있다. 광학 주사 유닛은 광원에 의한 빛을 사용하여 눈의 하나 이상의 부위를 샘플링하도록 배열될 수 있고, 상기 샘플링은 하나 이상의 부위의 하나 이상의 전체 부위의 측정, 또는 광원에 의한 빛을 사용하여 하나 이상의 부위 내에서 다른 위치의 샘플링 중 하나 이상을 수행하는 것을 포함하고, 상기 다른 위치의 샘플링은 하나 이상의 부위 내에서 점, 면 또는 체적 중 하나 이상을 비추는 것을 포함한다. 광학 주사 유닛은 눈의 하나 이상의 부위에 걸쳐 다른 위치들을 샘플링하도록 배열될 수 있다. 일 구체예에서, 광학 주사 유닛은 눈 내부로의 깊이 방향으로 확장하는 수직 축을 따른 연속적인 면에서, 광원을 사용하여 눈의 평면 스캔을 수행하도록 배열될 수 있다. 이 장치는 포토다이오드, 광전자배증관, 전하-결합 소자 (CCD) 및 강화된 전하-결합 소자 (ICCD) 중 하나 이상과 같은 눈으로부터 방출된 형광을 검출하는 광검출기 유닛; 예를 들면 애벌란시 광검출기를 추가로 포함할 수 있다.

추가의 관련 구체예들에서, 이 장치는 눈으로부터 형광(fluoresced light)의 광자 수를 나타내는 광검출기 유닛으로부터 전기적 신호를 수용하는 시간 상관 개별 광자 계수를 추가로 포함할 수 있다. 이 장치는 시간 채널 유닛의 함수로서 광자 수의 분포에 근거하여 형광의 시간 붕괴율을 결정하도록 설정된 하나 이상의 프로세서 모듈을 포함할 수 있다. 광학 유닛은 눈 조직의 백그라운드 자가형광 및 다른 비-특이적 입자들뿐만 아니라 결합되지 않은 아밀로이드-결합 화합물의 자가형광으로부터 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물을 구별하도록 설정될 수 있다. 광학 유닛은 하기 중 하나 이상의 존재 및 양 중 하나 이상을 구별하도록 설정될 수 있다: 아밀로이드-결합 화합물; 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물; 및 아밀로이드 단백질. 아밀로이드 단백질은 응집체 또는 프리-아밀로이드 단백질 응집체를 포함할 수 있다. 예컨대, 아밀로이드 단백질은 β-아밀로이드를 포함할 수 있다. 아밀로이드 형성 장애는 알츠하이머 질병을 포함할 수 있다.

추가의 관련 구체예들에서, 광학 유닛은 형광의 검출에만 근거하여 적어도 아밀로이드 단백질의 존재를 구별하도록 설정될 수 있다. 광학 유닛은 검출된 형광에 근거하여 눈으로의 아밀로이드-결합 화합물의 전달률, 눈으로 전달된 아밀로이드-결합 화합물의 공간적 분포, 및/또는 눈의 각막의 계면에서 아밀로이드-결합 화합물의 농도의 기울기를 결정하도록 설정될 수 있다. 광학 유닛은 검출된 형광에 근거하여 안구의 수양액에서 아밀로이드-결합 화합물의 시간적 분포 및 공간적 분포 중 하나 이상을 결정하도록 설정될 수 있다. 광학 유닛은 눈의 조직으로부터 방출된 자연 형광으로 인한 형광 신호의 증가에 근거하여 눈의 수정체 피막과 같은 안구 계면의 위치를 결정하도록 설정될 수 있다. 눈의 핵상의 위치는 (ⅰ) 눈 수정체 피막의 계면의 또는 각막 계면과 같은 특정한 해부학적 구조로부터 떨어진 거리 또는 (ⅱ) 강도 측정에서 변화(기울기)의 탐지에 근거하여 결정될 수 있다. 광학 유닛은 적어도 해부학적 구조 또는 하부구조의 부분의 자연 형광 여기(excitation)에 근거하여 눈의 해부학적 구조 또는 하부구조의 일차원 이상을 결정하도록 설정될 수 있고, 상기 일차원 이상을 결정하는 것은 구조 또는 하부구조의 두께를 결정하는 것, 구조 또는 하부구조의 모양을 결정하는 것, 및 눈의 하나 이상의 구조 또는 하부구조 사이의 거리를 결정하는 것 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

추가의 관련 구체예들에서, 광학 유닛은 여기된 자연 형광을 결정하고 이로 인해 눈에서 관심 있는 하나 이상의 부위를 결정하기 위해 눈 내에서 스캔하고; 광원에 의한 빛을 사용하여 눈에서 관심 있는 하나 이상의 부위를 샘플링하도록 설정될 수 있고, 상기 샘플링은 광원에 의한 빛을 사용하여 하나 이상의 부위 내에서 다른 위치의 샘플링 또는 하나 이상의 부위의 하나 이상의 전체 부위의 측정 중 하나 이상을 수행하는 것을 포함하고, 상기 다른 위치들의 샘플링은 하나 이상의 부위 내에서 점, 면 또는 체적 중 하나 이상을 비추는 것을 포함하며; 여기서 샘플링은 하나 이상의 샘플링된 부위 내에서 적어도 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광에 대해 형광의 시간 붕괴율 및 형광의 강도를 결정하기 위한 것이다. 예컨대, 광학 유닛은 눈 내부로의 깊이 방향으로 수직 스캔 (z-스캔)의 각각의 지점을 따라 여기된 자연 형광을 결정하고 이로 인해 눈에서 관심 있는 하나 이상의 부위를 결정하며; z-스캔의 방향과 수직인 연속적인 면에서, 광원을 사용하여 각각의 눈의 평면 스캔 (xy-스캔)의 세트의 각 지점에서 적어도 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광에 대해 형광의 시간 붕괴율 및 형광의 강도를 결정하도록 설정될 수 있다. 이 장치는 아밀로이드 형성 장애를 나타내는 아밀로이드 단백질에 대해 눈 내에서 실시간 서치를 가능하게 하도록 설정될 수 있다.

추가의 관련 구체예들에서, 광원은 눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 대한 형광 여기 스펙트럼의 피크 부위에 대해 적절한 파장의 빛을 방출하도록 설정될 수 있고, 광학 유닛은 눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 대한 형광 방출 스펙트럼의 피크 부위에 대해 적절한 파장의 빛을 검출하도록 설정될 수 있다. 아밀로이드-결합 화합물은 화합물 #11일 수 있다. 여기 스펙트럼은 약 470 nm의 피크를 가질 수 있고, 광원은 여기 스펙트럼의 피크의 ±약 20 nm 내에서 빛을 방출하도록 설정되며, 방출 스펙트럼은 약 580 nm의 피크를 가질 수 있고, 광학 유닛은 방출 스펙트럼의 피크의 ±약 20 nm 내에서 빛을 검출하도록 설정된다. 아밀로이드 단백질은 아밀로이드 형성 장애를 나타낼 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 포유동물, 예컨대 영장류(예컨대 인간), 개, 고양이, 양, 소 등에서 아밀로이드 형성 장애 또는 이의 소인을 진단하는 방법이 제공된다. 이 방법은 이들 각각은 아밀로이드-결합 화합물이 아밀로이드 형성 장애를 나타내는 아밀로이드 단백질에 결합될 때 적어도 아밀로이드-결합 화합물에서 형광을 생성하는 데 적절하다. 파장 성질, 편광 성질 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 갖는 광원으로 포유동물의 눈을 비추는 단계로서, 상기 아밀로이드-결합 화합물이 눈에 도입되고 특히 아밀로이드 형성 장애를 나타내는 아밀로이드 단백질에 결합되는 단계; 눈에 비춘 결과로서 생성된 형광을 포함하는 빛을 수용하는 단계; 및 적어도 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광에 대해 형광의 시간 붕괴율을 결정하는 단계로서, 상기 결정 단계가 적어도 시간 붕괴율에 근거하여 눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물의 존재를 구별하는 것을 허용하는 단계를 포함한다. 결합의 정상적인 제어 수준에 비교하면 눈에서 아밀로이드 단백질과 아밀로이드-결합 화합물과의 결합의 증가는 아밀로이드 형성 장애의 진단, 또는 포유동물에서 아밀로이드 형성 장애의 발전의 위험을 나타낸다. 아밀로이드 형성 장애는 알츠하이머 질병일 수 있다.

본 발명에 따른 또 다른 구체예에서, 포유동물의 눈의 해부학적 구조를 식별하는 방법이 제공된다. 이 방법은 이들 각각은 눈의 해부학적 구조에서 자연 형광을 생성하는 데 적절하다. 파장 성질, 편광 성질 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 갖는 광원으로 눈을 비추는 단계; 및 광원으로 빛을 비춤으로써 생성된 자연 형광의 강도의 큰 변화의 눈 내에서 위치를 결정하는 단계로서, 상기 결정하는 단계는 자연 형광의 강도의 가장 큰 변화의 위치에 근거하여 해부학적 구조를 식별하는 것을 허용하는 단계를 포함한다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 구체예에 따라 본원에 기재된 장치는 이러한 방법으로 사용된다.

추가의 관련 구체예들에서, 해부학적 구조는 눈의 전방 구역의 해부학적 구조를 포함할 수 있다. 해부학적 구조를 식별하는 것은 자연 형광의 강도의 최대 증가의 위치를 결정하는 것에 근거하여 눈의 수정체 피막의 계면의 위치를 결정하는 것과 같은, 해부학적 계면의 위치를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 해부학적 구조를 식별하는 단계는 눈에서 광원에 의해 생성된 자연 형광에 근거하여 각막 두께, 각막 모양, 수양액 깊이, 수정체 모양, 수정체 두께, 및 눈의 수정체의 하부구조 (예컨대, 수정체 피막, 피질, 핵상, 핵)의 모양 및/또는 두께 중 하나 이상을 결정하는 단계를 포함하고; 눈의 둘 이상의 해부학적 구조 사이의 안구 내 거리를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이 방법은 아밀로이드 형성 장애를 나타내는 아밀로이드 단백질을 포유동물의 눈에서 검출하기 위해 광원을 사용하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이 방법은 이들 각각은 아밀로이드-결합 화합물이 아밀로이드 형성 장애를 나타내는 아밀로이드 단백질에 결합될 때 적어도 아밀로이드-결합 화합물에서 형광을 생성하는 데 적절하다. 파장 성질, 편광 성질 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 추가로 포함하는 광원으로 포유동물의 눈을 비추는 단계로서, 상기 아밀로이드-결합 화합물이 눈에 도입되고 특히 아밀로이드 형성장애를 나타내는 아밀로이드 단백질에 결합되는 단계; 눈에 비춘 결과로서 생성된 형광을 포함하는 빛을 수용하는 단계; 및 적어도 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광에 대해 형광의 시간 붕괴율을 결정하는 단계로서, 상기 결정 단계가 적어도 시간 붕괴율에 근거하여 눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물의 존재를 구별하는 것을 허용하는 단계를 포함할 수 있다. 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물의 존재를 구별하는 단계는 눈의 조직의 백그라운드 자가형광 및 결합되지 않은 아밀로이드-결합 화합물뿐만 아니라 다른 비-특이적 입자의 자가형광으로부터 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물을 구별하는 단계를 포함할 수 있다. 이 방법은 아밀로로이드 형성 장애를 나타내는 아밀로이드 단백질의 눈 내에서 실시간 서치를 가능하게 할 수 있다. 이 방법은 눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 대한 형광 여기 스펙트럼의 피크 부위에 대한 적절한 파장의 빛으로 눈을 비추는 단계; 및 눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 대한 형광 방출 스펙트럼의 피크 부위에 대한 적절한 파장의 눈으로부터 수용된 빛을 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 아밀로이드-결합 화합물은 화합물 #11일 수 있다. 여기 스펙트럼은 약 470 nm의 피크를 갖고, 눈을 비추는 단계가 여기 스펙트럼의 피크의 ±약 20 nm 내의 파장에 있으며, 방출 스펙트럼은 약 580 nm의 피크를 가질 수 있고, 눈으로부터 수용된 빛을 검출하는 단계는 방출 스펙트럼의 피크의 ±약 20 nm 내의 파장에 있다.

추가의 관련 구체예들에서, 이 방법은 적어도 시간 붕괴율에 근거하여 눈에서 유사한 형광 스펙트럼을 갖는 둘 이상의 다른 형광체 간에 구별하는 것을 허용할 수 있고, 상기 유사한 형광 스펙트럼은 방출 스펙트럼 및 여기 스펙트럼에서 상당한 중복부(overlap) 중 하나 이상을 포함한다. 이 방법은 이차원에서 하나 이상의 형광체의 수명 감쇠 및 형광 강도 중 하나 이상의 분포를 나타내는 것을 추가로 포함할 수 있다. 더욱이, 이 방법은 하나 이상의 형광체의 수명 감쇠 및 형광 강도 중 하나 이상에 근거하여 눈에서 결합되지 않은 광자의 수 및 결합된 광자의 수를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 이 방법은 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물 및 단백질에 결합되지 않은 아밀로이드-결합 화합물의 수명 감쇠 및 형광 강도의 분포를 이차원으로 나타내는 것을 나타내는 단계를 포함할 수 있다. 이차원으로 나타내는 것은 스캐너 및 레이저 중 하나 이상으로 동시에 발생시킬 수 있다. 이 방법은 눈의 특정 영역에 걸쳐, 특정 수명 감쇠와 관련된 형광 강도를 평균내는 것에 의해 파라미터를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 게다가, 이 방법은 눈 내에서 기준점을 결정하기 위해 공초점 경로를 따라 일직선 광원과 눈을 나란히 만드는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 추가적인 구체예에서, 안구 조직에서 단백질 상에 결합된 형광체를 결정하는 방법이 제공된다. 이 방법은 이들 각각은 아밀로이드-결합 화합물이 단백질에 결합될 때 적어도 아밀로이드-결합 화합물에서 형광을 생성하기 적절하다. 파장 성질, 편광 성질 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 갖는 광원으로 안구 조직을 비추는 단계로서, 상기 아밀로이드-결합 화합물이 안구 조직에 도입되고 특히 단백질에 결합되는 단계; 눈에 비춘 결과로서 생성된 형광을 포함하는 빛을 수용하는 단계; 및 적어도 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광에 대해 형광의 시간 붕괴율을 결정하는 단계로서, 상기 결정 단계가 적어도 시간 붕괴율에 근거하여 안구 조직에서 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물의 존재를 구별하는 것을 허용하는 단계를 포함한다.

전술한 내용은 다른 도면들에 걸쳐 동일한 부분들을 나타내는 기준 특징들에서처럼, 하기 수반된 도면들에서 예시한 바와 같이, 본 발명의 예시적인 구체예들의 하기의 보다 자세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 하기 도면들은 반드시 비례척일 필요는 없으며, 대신 본 발명의 구체예들을 예시하기 위해 있는 것임에 주안점을 둔다.
도1은 본 발명의 구체예에 따른 광학 시스템의 개략도 (schematic diagram)이다.
도2는 눈의 z-스캔에서 수정체 계면을 검출하기 위한 알고리즘을 실행하는 동안 측정된, 변위에 대한 형광 강도의 그래프이고, 도2b는 본 발명에 따라, 도2a의 그래프의 제1 유도체의 그래프이다.
도3a 및 3b는 본 발명에 따른 형광 붕괴 시간의 결정을 예시하는 그래프이다.
도4는 본 발명의 구체예에 따른 시간-상관 개별 광자계수의 사용을 예시하는 개략도이다.
도5는 본 발명의 구체예에 따른 형광 아밀로이드-결합 화합물로서 사용될 수 있는 화합물 #11의 구조를 도시한다.
도6은 본 발명의 구체예에 따른 장치에 의해 얻어진 형광 아밀로이드-결합 화합물인 화합물 #11의 형광 막대그래프이다.
도7은 본 발명의 구체예에 따라 얻어진, 화합물 #11의 형광 수명 영상 및 이의 상응하는 강도 영상의 도표이다.
도8a는 본 발명의 구체예에 따른 아밀로이드-결합 화합물 및 응집체 펩티드에 결합된 아밀로이드-결합 화합물을 보여주는 형광 수명 영상이다.
도8b는 본 발명의 구체예에 따른 그림 8a의 아밀로이드-결합 화합물 및 형광 수명 영상의 응집체 펩티드에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 대한 상응하는 형광 수명 막대그래프를 보여주는 도표이다.
도9a는 본 발명의 구체예에 따른, 생체 내(in vivo) 연구에서 토끼에서 측정된 형광 아밀로이드-결합 화합물 #11과 관련된 특정 붕괴율의 광자의 주파수의 플롯 (plot)이다.
도9b는 본 발명의 구체예에 따른 도9a의 연구에 상응하는 형광 막대그래프이다.
도10a 및 10b는 본 발명의 구체예에 따른 실험에서, 토끼를 연구하는 동안 베이스라인으로 아침 그리고 투여된 다음날의 종료시 측정된 형광 아밀로이드-결합 화합물인 화합물 #11과 관련된 특정 붕괴율의 광자의 주파수를 보여주는 플롯이다.
도11a 및 11b는 본 발명의 구체예에 따른 실험에서, 동물 연구의 베이스라인 및 넷째 날의 종료 이후에 취해진 두 개의 형광 수명 영상들이다.
도12는 본 발명의 구체예에 따라 470 nm에서 여기될 때의 형광 아밀로이드- 결합 화합물인 화합물 #11의 방출 스펙트럼이다.

본 발명의 예시적인 구체예의 설명은 다음과 같다.

본 발명의 구체예에 따라 응집체로 형성될 아밀로이드 단백질의 비-외과적인, 조기의, 신뢰할 만한 검출을 위한 시스템 및 방법이 제공된다. 몇몇 구체예들에서, 아밀로이드 단백질 및/또는 응집체의 검출은 아밀로이드 형성 장애를 가리킨다. 아밀로이드 형성 장애는 AD, 가족병성 (Familial) AD, 특발성 (Sporadic) AD, 크로이츠펠트야콥 질병 (Creutzfeld-Jakob disease), 변종 크로이츠펠트야콥 질병, 해면상뇌증, 프리온 질병 (Prion diseases )(스크래피, 소해면상뇌증, 및 다른 수의과의 프리온 관련 질병을 포함), 파킨슨 병, 헌팅턴 병 (및 삼핵산 반복서열 질환), 근위축성 축색 경화증, 다운증후군 (3염색체성 21), 픽 병 (Pick`s Disease)(전측두엽 치매), 루이바디 병 (Lewy Body Disease), 뇌철축형 신경퇴행 (할러포르덴-스파츠병 (Hallervorden-Spatz Disease)), 시누클레인 병 (파킨슨 질병, 다계통 위축증, 루이소체 치매, 및 그 밖의 질병들을 포함한다), 뉴런 핵내 봉입증, 타우단백질 관련 질병 (tauopathies)(진행성핵상 마비, 픽 병, 피질기저 퇴화, 유전성 전측두엽 치매 (파킨슨 증후 동반하거나 없이), 질병이 생기기 전의 신경퇴행 상태 및 괌 근위축성 측삭경화증/파킨슨성 치매 복합증을 포함한다)을 포함한다. 이러한 질병들은 단독으로 또는 다양한 조합으로 일어날 수 있다. 아밀로이드 단백질 분석은 뇌의 치명적인 스폰지폼 신경퇴행 (spongiform neurodegeneration)을 특징으로 하는 프리온-매개된 질병 (prion-mediated diseases)이고 심각하고 치명적인 신경의 징후들과 증상들과 관련된, 전염성 해면상뇌증 (TSEs)을 검출하는 데에 역시 유용하다. TSE 프리온 관련 질병은 크로이츠펠트-야콥병 (CJD); 새로운 변종, 크로이츠펠트-야콥병 (nv-CJD); 게르스트만-스트로이슬러-샤인케르 증후군 (Gertsmann-Straussler-Scheinker); 치명적 가족성 불면증; 쿠루병 (Kuru); 알퍼스 증후군 (Alpers Syndrome); 소해면상뇌증 (BSE); 스크래피; 만성 소모성 질병 (CWD)을 포함한다.

진단 방법은 포유동물, 예컨대 영장류 (예컨대, 인간), 개, 고양이, 양, 소 등의 안구 조직에 대해 수행될 수 있다. 시험될 개체들은 (예컨대, 인간 개체) 이러한 질병들로부터 고통받고 있다고 의심되는 자들 (환자들) 또는 이러한 질병들을 발생시킬 위험에 처해 있는 자들을 포함한다. 예컨대, AD의 가족력 또는 고령과 같은 다른 위험 요인들을 갖는 개체들은 본원에 기재된 기술을 사용하여 시험된다. 고통받고 있거나 이러한 질병을 발생시킬 위험이 있는 것으로 알려지지 않은 사람들도 역시 시험받을 수 있다.

진단 방법은 아밀로이드 단백질, 예컨대, β-아밀로이드 (Aβ)에 결합된 형광체 화합물과 포유동물 (예컨대, 인간 개체)의 안구 조직을 접촉시킴으로써 수행된다. "아밀로이드 단백질"은, 단백질 또는 펩티드가 아밀로이드 단백질이 (완전히 또는 부분적으로) 응집되었는지 여부와 무관하게, AD 신경염 노인성 반점과 관련 있음을 의미한다. 바람직하게, 아밀로이드 단백질은 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 또는 Aβ와 같은 APP의 (예컨대, 자연-발생적인) 단백질 가수분해 분열 생성물이다. APP 분열 생성물은 산화되거나 가교화된 Aβ뿐만 아니라, Aβ1-40, Aβ2-40, Aβ1-42를 포함한다. 형광체 화합물은 또한 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 변종을 포함하여, APP 및 Aβ의 자연-발생적인 변종에 결합될 수 있다. 형광체 화합물은 β-아밀로이드 응집체에 결합될 수 있지만, 반드시 필요한 것은 아니다. β-아밀로이드 응집체에 결합된 형광체의 논의는 골드스타인 등의, "Cytosolic β-amyloid deposition and supranuclear cataracts in lenses from people with Alzheimer`s disease," Lancet 2003; 361: 1258-65에서 찾을 수 있고, 상기 문헌의 전체 개시 내용은 본원에 참조로서 포함된다.

Aβ를 함유하는 응집체, AD에서 축적하는 병원성 단백질은 알츠하이머 질병 환자들의 뇌에서뿐만 아니라 수정체 내에서 핵상의/깊은 피질의 백내장을 형성하는 것이 발견된다. Aβ 침전물(deposit)은 수정체 피질의 섬유질 세포의 시토졸 내에서 세포내 응집체로서 모인다. 수정체 Aβ는 정상적인 성인 뇌의 수준과 비교할 만한 수준의 성인 인간 수정체 내에서 용해가능한 분명한 단량체 및 이량체로서 존재하는 것으로 나타났다. 수정체 Aβ의 상당한 부분은 과잉 수정체 구조 단백질 αB-크리스탈린을 포함하여, 다른 수정체 단백질에 결합된다. Aβ 및 αB-크리스탈린은 강한 단백질-단백질 연계를 가리키는, 체시험관 내(in vitro )의 및 포름산-처리된 인간 수정체 균질액(lens homogenates)으로부터의 공동-면역침전물 나노몰 분자내 결합 친화도를 나타냈다. 인간 Aβ1-42는 증가된 β-시트 함량을 지닌 수정체 단백질 응집을 증진시킨다. Aβ-강화된 수정체 단백질 응집은 금속 킬레트화 또는 반응성 있는 산소 종 스캐빈저에 의해 막히며, 이에 따라 금속단백질 산화환원 반응이 이러한 수정체 단백질 응집 과정 및 AD에서 핵상 백내장 형성에 수반됨을 보여준다.

이 자료는 Aβ와 수정체 단백질 간에 병리학적 상호작용이 일어남을 나타낸다. 더욱이, 이러한 수정체 내의 Aβ-매개 반응은 아밀로이드 형성 Aβ 종들, 특히 AD 병리생리학에 현저하게 관련된 인간 Aβ-42 종들이, 수정체 단백질 응집 및 핵상/피질의 백내장 형성을 발전시키는 강력한 산화 촉진제 펩타이드였음을 나타낸다. 더욱이, 단백질 응집 및 백내장 형성과 관련된 정보는 골드스타인 등의, 미국 특허 제7,107,092호에서 발견될 수 있고, 상기 문헌의 전체 교시 내용은 본원에 참조로서 포함된다.

본 발명의 구체예에 따라 결합의 정상적인 제어 수준과 비교하여, 형광체 화합물의 안구 조직 (예컨대, 수정체 세포의 세포 내 구획)에의 결합의 증가는, 포유동물이 AD로부터 고통받고 있거나 AD의 발생 위험이 있음을 나타낸다. 본원에 사용되는 것처럼, "형광체" 또는 "형광체 화합물"은 특정 파장 및/또는 편광 성질의 빛으로 비출 때 바람직한 형광 특징을 가지는 임의의 물질이다. 바람직하게, 본원에 기재된 기술에서, 형광체는 여기서 사용된 것처럼, "아밀로이드 단백질"이 상기와 같이 정의되는 경우, 본원에서 아밀로이드 단백질에 결합된 화합물을 의미하는 것으로 사용된 "아밀로이드-결합 화합물"이다. 이러한 형광체는 특정 파장 및/또는 편광 성질의 빛에 노출될 때 자연적으로 빛을 방출하는 아밀로이드-결합 화합물일 수 있다. 대안적으로 또는 추가하여, 형광체는 아밀로이드-결합 화합물 부분과 함께 형광 태그 부분을 포함하는 화합물일 수 있으며, 여기서 아밀로이드-결합 화합물 부분은 일반적으로 형광 태그의 부재 하에 원하는 형광 특징을 나타내지 않는다. 일 구체예에서, 형광체는 다음과 같은 성질을 갖는다: 형광체가 사용된 임의의 매질에서 좋은 용해성을 나타내며; 눈의 각막을 관통하고; 아밀로이드 단백질과 결합한다. 형광체는 아밀로이드에 결합될 때 그리고 결합되지 않을 때 다른 형광 특징들을 가질 수 있다. 예컨대, 형광체의 형광의 시간붕괴율 및 스펙트럼 강도는 형광체가 결합되지 않을 때와 비교하여 형광체가 아밀로이드에 결합될 때 변할 수 있다. 화합물 #11 (도5와 관련하여 하기에서 추가적으로 논의된다)은 이러한 형광체이며, 여기서 시간 붕괴율은 변한다. 형광체, 특히 화합물 #11의 이러한 성질들의 추가적인 논의는 J. 수더잔 (Sutharsan) 등의, "Rational Design of Amyloid Binding Agents Based on the Molecular Rotor Motif,"ChemMedChem 2010, 5, 56-60에서 발견될 수 있고, 상기 문헌의 전체 개시 내용은 본원에 참조로서 포함된다. 바람직하게, 형광체 화합물은 Aβ1-42 또는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 다른 조각에 결합한다. 형광체 화합물은 다른 β-병풍 시트 함유 단백질과 비교하여 아밀로이드 단백질에 우선적으로 결합할 수 있다. 상기 언급처럼, 형광체 화합물은 형광 프로브을 함유할 수 있거나 형광 프로브의 추가 없이 형광체로서 행동할 수 있다. 예컨대, 형광 프로브 또는 형광체는 크리사민 또는 ((trans, trans), -1-브로모-2,5-비스-(3-히드록시카보닐-4-히드록시)스티릴벤젠 (BSB))과 같은 크리사민 유도체 화합물이 될 수 있다. 특별한 구체예에서, 형광체는 분자의 회전자 모티프에 따라 디자인된 형광 화합물인 화합물 #11 (도5와 관련하여 하기에서 추가적으로 논의된다)일 수 있다. 본 발명의 구체예에 따라 아밀로이드-결합 화합물은 분자의 회전자, 크리사민 및/또는 크리사민 유도체일 수 있다. 예시적인 형광체는 미국 특허 제6,849,249호 (상기 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로서 포함된다)에서 논의되고, 크리사민 또는 ((trans, trans), -1-브로모-2,5-비스-(3-히드록시카보닐-4-히드록시)스티릴벤젠 (BSB))과 같은 크리사민 유도체 화합물을 포함한다. 크리사민 G 및 이들의 유도체는 해당 기술분야에 (예컨대, 미국 특허 제6,133,259호; 제6,168,776호; 제6,114,175호)에 공지되어 있다. 이러한 화합물들은 Aβ 펩티드에 결합하지만, 형광성은 아니다. 진단 방법은 눈에서 Aβ 펩티드를 검출하기 위해 형광 아밀로이드-결합 크리사민 G 유도체를 사용할 수 있다. 생물학적으로 이용가능한 형광 프로브 또한 사용될 수 있다. 이러한 형광체 및 프로브들은, 예컨대, Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR, U.S.A.)로부터 상업적으로 입수가능하다. 몇몇의 염료들, 예컨대, X-34 또는 ((trans, trans), -1-브로모-2,5-비스-(3-히드록시카보닐-4-히드록시)스티릴벤젠 (BSB)) (Styren 등, 2000, J. Histochem. 48:1223-1232; Link 등, 2001, Neurobiol. Aging 22:217-226; 및 Skrovonsksy 등, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:7609-7614)은 뇌 조직 (눈 조직은 아님)을 분석하기 위해 사용되어 왔다. 이 프로브들은 파랑-녹색 범위에서 빛을 방출하고, 따라서 진단상으로 적절한 형광의 수준은 파랑-녹색 범위에서 인간 수정체 자가형광의 양을 초과한다. 다른 유용한 화합물들은 Me-X04 (1,4-비스(4`-히드록시스티릴)-2-메톡시벤젠)과 같은 검출가능한 메톡시 제제를 포함한다. 다른 메톡시 제제는 예컨대, 크리사민 또는 )(trans, trans), -1-브로모-2,5-비스-(3-히드록시카보닐-4히드록시)스티릴벤젠 (BSB))과 같은 예컨대, 크리사민 또는 크리사민 유도체 화합물을 포함한다. 이러한 화합물들은 마티스(Mathis) 등, Curr. Pharm. Des., vol. 10(13):1469-93 (2004); 미국 특허 제6,417,178호; 제6,168,776호; 제6,133,259호; 및 제6,114,175호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본원에 이의 전체 내용이 참조로서 포함된다. 티오플라빈 T, 티오플라빈 S, 콩고 레드 염료, 전술한 것들의 유도체들, 또는 다른 유도체들과 같은 다른 아밀로이드-결합 프로브 또한 사용될 수 있다. 검출가능하게-라벨링된 (detectably-labeled) 화합물들과 관련된 추가적인 정보는 골드스타인 등의 미국 특허 제7,297,326호에서 발견될 수 있고, 상기 문헌의 전체 교시 내용은 본원에 참조로서 포함된다. 게다가, 전술한 것과 관련된 추가적인 정보는 미국 특허출원 공개공보 제2008/0088795호, 미국 특허출원 공개 제2009/0041666호, 및 미국 특허 제7,107,092호에서 발견될 수 있고, 상기 출원 및 특허의 전체 교시 내용은 본원에 참조로서 포함된다. 특별한 구체예에서, 형광체는 화합물 #11 (도5와 관련하여 하기에서 추가로 논의된다)이 될 수 있다.

관련 방법들, 아밀로이드 형성 장애, 아밀로이드 단백질 및 형광체 화합물들에 대한 추가 정보는 골드스타인 등의 미국 특허 제7,297,326호, 골드스타인 등의 미국 특허 제7,107,092호 및 골드스타인 등의 미국 특허 제6,849,249호에서 발견될 수 있고, 상기 특허의 전체 교시 내용은 본원에 참조로서 포함된다. 게다가, 전술한 것과 관련된 추가적인 정보는 미국 특허출원 공개공보 제2008/0088795호, 미국 특허출원 공개공보 제2009/0041666호에서 발견될 수 있고, 상기 출원의 전체 교시 내용은 본원에 참조로서 포함된다.

본원에 제공된 방법들은 적절한 컨트롤 (control)에 대한 형광체 투여 이후 시험 환자 수정체 형광을 비교하는 것을 추가적으로 포함할 수 있다. 적절한 컨트롤의 예들은 비-AD 개체 (또는 개체들의 개체군)의 내생성 자가형광 또는 형광체 투여 후의 비-AD 개체 (또는 비-AD 개체들의 개체군)의 형광 수준을 포함한다.

본 발명의 구체예에 따라 본원에 개시된 기술에 근거하여 눈에 존재하는 것으로 발견된 아밀로이드 단백질의 양은, 질병 상태, 또는 질병 상태를 발생시킬 위험을 나타내는 아밀로이드 단백질의 양을 나타내는 통계적 분석과 비교될 수 있다. 이론에 의해 제한하고자 하는 것은 아니지만, 건강한 성인은 일반적으로 눈의 수정체의 핵상 부위에서 적어도 약간의 최소 수준의 아밀로이드 단백질을 갖는 것으로 사료된다. 따라서 본원에 개시된 기술은 개개인이 눈에서 아밀로이드 단백질의 제어 수준인, 정상을 넘어 통계적으로 상당한 수준인 눈에서의 아밀로이드 단백질의 양을 가지는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다. 알츠하이머 질병을 갖는 사람들의 눈에서 아밀로이드 단백질 퇴적의 연구는 골드스타인 등의, "Cytosolic β-amyloid deposition and supranuclear cataracts in lenses from people with Alzheimer`s disease," Lancet 2003; 361: 1258-65에서 발견될 수 있고, 상기 문헌의 전체 개시 내용은 본원에 참조로서 포함된다.

실험 #1과 관련하여 하기에서 추가적으로 논의된 바와 같이, 본 발명에 따른 구체예는 결합되지 않은 아밀로이드-결합 화합물과 대조적으로, 아밀로이드 단백질에 결합하는 경우 아밀로이드-결합 화합물 간을 구별할 수 있음을 보여주었다. 특히, 실험 #1의 결과는, 예컨대, 결합되지 않은 형광 아밀로이드-결합 화합물 (여기서는 화합물 #11)의 경우 1.4 nsec의 시간 붕괴율; 및 예컨대, 아밀로이드 단백질 (여기서는 응집된 β-아밀로이드 (Aβ) 펩티드)에 결합되는 경우의 아밀로이드-결합 화합물의 경우 2.25 nsec의 시간 붕괴율을 발견하였다. 본 발명의 구체예에 따라 결합되지 않은 아밀로이드-결합 화합물인 화합물 #11의 검출은 1.4 nsec의 ±0.3 nsec의 시간 붕괴율에 의해 나타내어질 수 있는 반면, 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물인 화합물 #11의 검출은 2.25 nsec의 ±0.3 nsec의 시간 붕괴율에 의해 나타내어질 수 있다. 아밀로이드 단백질로부터 아밀로이드-결합 화합물을 구별하기 위한 다른 붕괴율 및 신뢰도가 사용될 수 있다.

본 발명의 구체예에 따라 눈의 수정체에서 아밀로이드-결합 화합물-태그된 β-아밀로이드 (Aβ) 단백질의 검출 형광 영상화 방법 및 장치, 및 이들의 용도가 제공된다. 일 양태에서, 본원에서 제공된 장치는 형광 분자의 검출을 가능하게 하고 이들의 공간적 분포뿐만 아니라 이들의 환경의 성질에 대한 정보를 제공하기 위해, 수명 분광학와 결합된 형광 스캐닝 메커니즘을 사용하는 광학 영상화 장치이다.

본 발명의 구체예에 따라 이 장치, 예컨대, 다기능성 광학 스캐닝 형광 시스템은, 이들의 자연 형광 여기에 근거하여 눈의 전방 구역의 해부학적 구조의 식별을 가능하게 하고; 각막 두께 및 수정체 모양과 같은 눈의 전방 구역의 공간 정보를 제공할 수 있으며, 안구 내 거리를 제공할 수 있다.

게다가, 본 발명의 구체예와 관련하여 다기능성 광학 스캐닝 시스템은 아밀로이드 단백질에 결합됨 없이, 눈에서 외생성 형광 아밀로이드-결합 화합물에 대한 생체 내 안구 약물동력학 조사 도구를 제공한다. 예컨대, 이 시스템은 눈물 막/각막의 상피 계면과 같은, 각막의 계면에서 아밀로이드-결합 화합물의 기울기 농도를 결정할 수 있다. 더욱이, 시스템은 수양액 내에서 아밀로이드-결합 화합물의 약물동력학과 관련된 공간적 및 시간적 정보를 결정할 수 있다.

추가의 본 발명의 관련 구체예들에서, 다기능성 광학 스캐닝 시스템은 형광 분자들의 검출, 및 형광 붕괴 시간 (τ)과 같은, 이들의 광학 신호에 기초한 이들 사이의 구별을 가능하게 한다. 상기 시스템은 눈의 수정체에서 Aβ에 결합된 태그된 형광 아밀로이드-결합 화합물의 검출; 눈에서 자연 형광의 검출; 및 (ⅰ) 눈의 수정체에서 Aβ에 결합된 태그된 형광 아밀로이드-결합 화합물 및 (ⅱ) 눈 내의 자연 형광 간의 구별을 가능하게 한다. 본원에 사용된 "자연 형광"은 도입된 영상화제와는 독립적으로 발생할 수 있는 눈 내의 자연 형광을 의미한다.

도1은 본 발명의 구체예에 따른 광학 장치의 개략도이다. 형광 여기는 눈 내부로의 높은 개구수의 대물 렌즈 (101)에 의해 집속되는 펄스 레이저 빔에 의해 달성된다. 형광은 고속 애벌란시 포토다이오드 검출기 (APD) (102)를 이용한 공초점 배열을 통해 시간 상관 개별 광자 계수 (TCSPC) 기술을 사용하여 검출된다. TCSPC는 반복적으로 샘플 (눈) (103)을 여기시키기 위해 빛의 단펄스를 사용하고, 시간의 함수로서 나중의 형광 방출을 기록함으로써 수행된다. 이는 나노초 시간 척도에서 대개 일어난다.

도1의 구체예에서, 수정체의 해부학적 구조의 식별은 이동 스테이지 (104)를 사용하여 축상에 대물 렌즈 (101)을 스캔함으로써 수행된다. 신호는 각막, 수정체 피막 및 수정체의 핵상의 부위와 같은 전방 구역의 해부학적 구조를 밝히기 위해 스캔을 따라 모든 지점에서 측정된다. 게다가, 스캔은 눈에 적용된 외생성 아밀로이드-결합 화합물들의 약물동력학에 대한 정보를 제공한다. 이러한 정보는 아밀로이드-결합 화합물의 공간적 및 시간적 정보뿐만 아니라, 각막을 통해 그리고 수양액 내로 관통하는 아밀로이드-결합 화합물의 농도도 제공한다.

도1의 구체예에서, 눈에서 관심 있는 위치가 축 스캔을 따라 모든 지점에서 측정된 여기된 자연 형광으로부터 알려지면, 다른 스캔이 갈바노미터 거울 (105) 세트를 사용하여 광학 축에 수직인 면 (xy)에서 실행된다. 이-차원적 스캐닝의 상응하는 부분에 대해 측정된 형광 붕괴 곡선의 할당량을 보장하기 위해, 갈바노미터 세트 스캐닝은 레이저 펄스 및 시간-상관 개별 광자 계수를 위한 광검출과 동시에 작동한다. 이러한 xy-스캔은 각각의 부분 (픽셀)에 대한 형광 붕괴 시간 정보를 갖는 이용하여 영상을 밝힌다. 도1의 구체예에서, 하나 이상의 모듈이 전용의, 전문화된 하드웨어 모듈을 사용하고/하거나 예컨대, Frame Grabber 모듈, TSCPC 모듈, τ Calculation 모듈 및 스캐너 제어 모듈을 포함하여, 모듈의 기능을 수행하도록 특수하게-프로그램화된 일반용 컴퓨터를 사용하여 실행될 수 있다. 일반용 컴퓨터 및/또는 하나 이상의 특수화된 하드웨어 모듈은, 모듈의 기능에 적절한 데이터 케이블 및 데이터 포트를 통해 서로 데이터를 수용할 수 있다.

도1의 구체예에서, 시간-상관 개별 광자 계수의 경우, 자가형광의 붕괴 곡선은 수정체의 각각의 스캔된 위치에 등록되고 이에 따라 형광체 분포의 이-차원적 묘사는 이들의 강도뿐만 아니라 이들의 형광 붕괴 시간에 근거하여 평가되고 분석될 수 있다. 계산된 붕괴 시간의 영상은 가색상 (false color)으로 인코딩될 수 있고 더 나은 임상적 해석을 위해 강도 영상 위에 중첩될 수 있다. 형광 붕괴 시간은 각각의 형광 모듈에 대한 특징이기 때문에, 이는 여기된 형광체 (수정체의 자연 형광으로부터의 아밀로이드-결합 화합물)를 샘플 부피로 결정하고 분리할 수 있다. 형광 강도 및 수명 측정을 결합시킴으로써, 정보의 여분의 차원이 몇몇의 형광 라벨들 간에 구별하기 위해 얻어진다.

본원에 기재된 것처럼, 본 발명의 구체예에 따른 장치는 광원을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 "광원"은, 형광의 시간 붕괴율이 비춘 결과로서 수용된 형광에 근거하여 나중에 결정될 수 있는 방식으로, 아밀로이드-결합 화합물이 아밀로이드 단백질에 결합될 때 적어도 아밀로이드-결합 화합물의 형광을 생성하기 위해 적절한 빛의 파장 및 편광 중 하나 이상으로 눈을 비추기 위해 빛을 방출하도록 설정될 수 있는 임의의 광원일 수 있다.

본 발명에 따른 구체예에서, 광원은 눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 대한 형광 여기 스펙트럼의 피크 부위에 대한 적절한 파장의 빛을 방출하도록 설정될 수 있고, 광학 유닛은 눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 대한 형광 방출 스펙트럼의 피크 부위에 대한 적절한 파장의 빛을 검출하도록 설정될 수 있다. 예컨대, 아밀로이드-결합 화합물이 화합물 #11인 경우, 여기 스펙트럼은 약 470 nm의 피크를 가지며, 광원은 470 nm의 ±5 nm, ±10 nm, ±15 nm 또는 ±20 nm 내와 같이, 약 470 nm의 피크의 ± 약 20 nm 내에서 빛을 방출하도록 설정될 수 있다. 더욱이, 화합물 #11에 대한 방출 스펙트럼은 약 580 nm의 피크를 갖고, 광학 유닛은 580 nm의 ±5 nm, ±10 nm, ±15 nm, ±20 nm 내와 같이, 약 580 nm의 피크의 ± 약 20 nm 내에서 빛을 검출하도록 설정될 수 있다. 일반적으로, 형광 화합물의 방출 스펙트럼의 피크 및 여기 스펙트럼의 피크 사이에는 보통 이동(shitft)이 있다. 본 발명의 구체예에 따라, 눈의 자연적 자가형광으로부터 결합된 형광체로부터 형광을 구별하는 것을 가능하게 하기 위해, 방출 스펙트럼의 피크가 여기 스펙트럼에 대해 상당히 이동되는 화합물을 사용하는 것이 유용하다. 예컨대, 약 500 nm을 초과하는 피크를 갖는 방출 스펙트럼은 눈의 자연적 자가형광으로부터 구별하기 위해 유리하다. 화합물 #11은, 약 470 nm의 피크의 여기 스펙트럼으로부터 상당히 이동된 약 580 nm의 피크를 갖는 방출 스펙트럼을 갖는 목적에 유리한 것으로 입증되었다. 도12는 본 발명의 구체예에 따라 470 nm에서 여기될 때 형광 아밀로이드-결합 화합물인 화합물 #11의 방출 스펙트럼이다. 사용될 수 있는 다른 여기 및 방출 스펙트럼은 전술한 것에 근거하여 해당 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

본 발명의 구체예에 따라 장치는, 눈을 비춘 결과로서 생성된 형광을 포함하는 빛을 수용하고, 적어도 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광에 대한 형광의 시간 붕괴율을 결정하도록 설정될 수 있는 임의의 유닛을 의미하는 것으로 본원에서 사용된 "광학 유닛"을 사용할 수 있고, 상기 결정하는 것은 적어도 시간 붕괴율에 근거하여 눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물의 존재를 구별하는 것을 허용한다. 예컨대, 도1을 참고하여, 광학 유닛은 대물 렌즈 (101), 이동 스테이지 (104), 스캐너 (105), 광검출기 (102), 카메라, LED, 다양한 렌즈들, 조리개, 빔 스플리터, 다이크로익 (dichroic) 필터, 시간 붕괴 계산 모듈, 프레임 그래버(Frame Grabber) 모듈, TCSPC 모듈, 및 스캐너 제어 모듈 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 광학 유닛의 기능의 일부는 특수하게-프로그램화된 일반용 컴퓨터에 의해, 또는 예컨대 시간 붕괴 계산을 수행하기 위한 전용의 하드웨어에 의해 실행될 수 있다.

본 발명의 구체예에 따라 대물 렌즈 (101), 이동 스테이지 (104) 및 갈바노미터 거울을 갖는 스캐너 (105)의 기능은, 이들 구성요소들을 대신하여 또는 이들에 추가하여, 여러 다른 가능한 장치들을 사용하여 수행될 수 있다. 집합적으로, 이동 스테이지, 대물 렌즈 및 갈바노미터 거울을 갖는 스캐너의 기능은, 눈 내에서 베이스라인을 결정하기 위한 목적 및 눈 내에서 형광체들을 분석하기 위한 목적을 포함하여, 눈 내에서 관심 있는 원하는 부위들에 걸쳐 광빔을 스캔하는 동등한 기능을 수행하는 임의의 장치 또는 장치들의 집합을 나타낼 수 있는 "광학 스캐닝 유닛"에 의해 본원에서 실행되는 것으로 나타내어진다. 이러한 광학 주사 유닛은, 수정체의 병진 운동 또는 다차원의 운동 경로를 따른 수정체의 운동을 유도하는 기능을 수행할 수 있고; 예컨대 광빔의 광학 경로에서 다른 광학 장치 또는 거울에서 운동을 유도함으로써 관심 있는 부위에 걸쳐 빛을 스캔하는 기능, 예컨대 관심 있는 부위에 걸친 점, 면, 체적의 또는 다른 유형의 스캔을 수행하는 기능을 수행할 수 있다.

도1의 구체예에서, 공초점 배열의 사용은 딜레이션 (dilation) 제제가 사용될 필요가 없음을 의미하며, 이는 빛이 축에서 벗어나, 예컨대 45-도 각도로 눈으로 들어가는 것이 필요한 시스템에서 요구될 수 있기 때문이다. 이것은 환자들에게 편리하다.

도2a는 눈의 비추는 경로 (z-스캔)을 따른 스캔에서 수정체 계면을 탐지하기 위한 알고리즘의 수행 동안 측정된 자연 형광 강도 대 변위의 그래프이고, 도2b는 본 발명의 구체예에 따라 그림 2a의 그래프의 제 1 도함수의 그래프이다. 알고리즘에 대한 원리는 자연 형광 강도 값의 증가가 유닛 스캔 거리당 최대인 위치가, 수정체 경계가 시작되는 타당한 지표라는 가정이다. 특히, 상기 알고리즘은 형광 강도에서 최대 변곡점에 해당하는 z-스캔 시작점으로부터 거리를 결정한다. 일 구체예에서, 알고리즘은 하기와 같이 진행되고, 실시간으로 실행될 수 있다:

1) 제 1 (독립 변수)차원이 시작점으로부터의 거리, 즉 로터리 인코더를 거쳐 측정된 스캔 거리이고, 제 2 (종속 변수)차원이 광자 검출기 (APD)를 통해 측정된 형광 강도인, 이차원적 배열로 데이터를 모으시오.

2) 강도 값들을 매끄럽게 하기 위해, 즉 분화를 간섭하는 고주파수 잡음을 제거하기 위해, 평균 프로파일을 움직이는 5개 지점으로 데이터 배열을 컨볼빙 (convolve)하시오.

3) 강도 배열의 제 1 도함수를 얻기 위해 미분 프로파일(differential profile)을 이용하여 매끄러워진 데이터 배열을 컨볼빙하시오.

4) 최대 미분 강도 값에 대한 강도 제 1도함수를 찾으시오. 이것이 최대 변곡점이다. 상응하는 스캔 거리를 결정하시오.

도2a 및 2b에서 도시된 바와 같이, 수정체 피막의 위치는 상기 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 더욱이, 각막, 수양액 및 수정체와 같은 해부학적 구조들 사이의 위치, 및 거리 역시 결정될 수 있다. 오프셋(offset)은 임의의 축을 따라 특정 데이터로부터 측정의 거리를 명시하기 위해 적용될 수 있다.

도3a 및 3b는 본 발명의 구체예에 따른 형광 붕괴 시간의 결정을 예시하는 그래프이다. 형광 붕괴 시간은 강도 곡선 (여기서는 광자/초) 대 시간 (여기서는 나노초)의 곡선에 대해 싱글 또는 더블 핏 지수 (도3a)에 의해 계산될 수 있다. 이는 또한 기울기에 대해 선형 핏으로 얻어질 수도 있다(도3b). 본원에서 사용된 "형광의 시간 붕괴율"은 형광 강도의 붕괴 곡선의 특징적인 시간 상수; 예컨대, 지수 시간 상수 또는 형광 붕괴 곡선에 맞는 기울기를 의미한다.

상기 도2a, 2b 및 3a, 3b의 상기 알고리즘은. 예컨대, 전용의, 전문화된 하드웨어 모듈을 사용하고/하거나 상기 알고리즘을 수행하기 위해 특수하게-프로그램화된 일반용 컴퓨터를 사용하여 실행될 수 있다. 이러한 모듈은, 예컨대, 도1의 구체예의 TCSPC 모듈, 프레임 그래버 모듈, τ-계산 모듈로부터 데이터를 사용하거나 수용할 수 있다.

도4는 본 발명의 구체예에 따른 시간-상관 개별 광자 계수의 사용을 예시하는 개략도이다. 펄스 광원 (406)은 반복적으로 샘플 (403)을 여기시킨다. 샘플 방출은 검출기 유닛 애벌란시 포토다이오드 (APD) (402)에 의해 관찰되며, 여기 플래쉬가 동기화 모듈 (SYNC) (407)에 의해 검출된다. 일정 분획 판별기 (constant fraction discriminator)(CFD) (408)는 검출기 (402)로부터 (진폭에 무관하게) 검출된 제 1 광자에만 반응한다. 이러한 샘플 방출로부터의 이 제 1 광자는 시간-대-진폭 변환기 (TAC) (409)에 대한 정지 신호이다. 여기 펄스는 시작 신호를 작동시킨다. 다채널 분석기 (MCA) (410)는 시간 채널 유닛의 함수로서 광자 수의 막대그래프를 생성하기 위해, TAC (409)로부터 단일-광자 이벤트의 반복적인 시작-정지 신호를 기록한다. 수명은 이러한 막대그래프로부터 계산된다. MCA는 전용의, 전문화된 하드웨어 모듈을 사용하고/하거나 이러한 과제들을 수행하기 위해 특수하게-프로그램화된 일반용 컴퓨터를 사용하여 실행될 수 있으며; 특수하게-프로그램화된 일반용 컴퓨터와 데이터 소통 관계에 있을 수 있다.

본 발명에 따른 일 구체예에서, 형광 아밀로이드-결합 화합물 및 장치를 포함하는 시스템은 충분한 임상적 시험에 따라 알츠하이머-유형의 치매와 일치하는 징후 및 신호를 가진 환자들에서 가능한 알츠하이머 질병의 진단에 도움이 되고자 한다. 이 장치는 형광 수명 분광학 기술과 결합된 공초점 스캐닝 매커니즘을 사용한다. 이 장치는 눈의 전방 구역의 해부학적 구조들의 식별 및 이들의 광학적 특징에 기초한 형광성의 형광체의 구별을 가능하게 한다.

도5는 본 발명의 구체예에 따라 형광 아밀로이드-결합 화합물로서 사용될 수 있는 화합물 #11의 구조를 보여준다. 화합물 #11은 분자의 회전자 모티프에 따라 디자인된 형광 화합물이며, 응집된 β-아밀로이드 (Aβ) 펩티드에 결합된 것으로 나타났다. 이러한, 천연 형광에 결합된 것은, 화합물 #11이 알츠하이머 환자들의 수정체 조직에서 발견되는 Aβ 응집체에 대한 생체 내 마커의 좋은 후보임을 제시한다. 화합물 #11에 대한 화학명은 ((E)-2-(2-(2-메톡시에톡시)에톡시)에틸-2-시아노-3-(6-(피페리딘-1-일)나프탈렌-2-일)아크릴레이트)이다. 화합물 #11과 관련된 추가적인 정보는 J. 수더잔 (Sutharsan) 등의, "Rational Design of Amyloid Binding Agents Based on the Molecular Rotor Motif,"ChemMedChem 2010, 5, 56-60에서 발견될 수 있고, 상기 문헌의 전체 개시 내용은 본원에 참조로서 포함된다. 화합물 #11은 약 5 mg/g의 화합물 #11, 80%의 광유 및 20%의 미네랄 오일을 함유하는 안연고제 (화합물 #11 안연고제)로 제형화된다.

본 발명의 구체예에 따라 형광체 아밀로이드-결합 화합물은 임의의 여러 다른 가능 형태들로 시험될 개체의 눈에 적용될 수 있다. 예컨대, 형광체 아밀로이드-결합 화합물은 연고, 용액으로써, 콘택트 렌즈를 사용하여, 주입에 의해, 액체 형태로, 고체 형태로, 이온토포레시스에 의해, 또는 다른 기술들에 의해 적용될 수 있다.

본 발명의 구체예에 따른 장치는 공초점 검출 설계에서 높은 민감성 및 속도로 시간 영역에서 형광을 검출하도록 디자인된다. 이 장치는 두 개의 주요 기능을 갖는다: 1) 이동 스테이지 및 갈바노미터 스캐너를 사용하여, 수정체의 핵상과 같은, 눈의 전방 구역 내의 위치로의 광학 빔의 전달 및 스캐닝; 및 2) 형광 수명 측정에 기초한 형광성 형광체들의 구별 및 식별.

본 발명의 구체예에 따른 장치는 안구내 거리에 대한 정보를 얻기 위해 눈의 시축을 따라 안구 조직의 자연 형광의 레이저 여기에 기초한, 축 스캔 또는 z-스캔 을 사용하여 안구의 해부학적 구조들을 식별한다. z-스캔은 수명 측정이 수행될 위치에 대한 정보를 제공하는 깊이의 함수로서 자연 형광 강도의 플롯을 밝혀낸다. 타겟팅된 위치는, 예컨대, 인간 눈 내의 수정체의 핵상일 수 있다. 스캐닝은 눈 움직임 아티팩트(motion artifact)를 줄이기 위해 수 초 내로, 예를 들면, 약 2초 또는 그 미만, 예컨대 약 0.2초, 0.3초, 0.4 초, 0.5초, 0.6초, 0.7초, 0.8초, 0.9초, 1.0초, 1.2초, 1.4초, 1.6초, 1.8초 또는 2.0초로, 또는 눈 움직임 아티팩트를 줄이기에 적절한 다른 시간의 양으로 완성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 장치는 움직임 아티팩트를 감소하기 위해 눈-움직임 추적과 함께 사용될 수 있다. 피에조 드라이브, 선형 모터 및 다른 제어된 움직임 장치들은 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 축 스캔은 또한 수양액에서의 아밀로이드-결합 화합물 생물학적 이용가능성뿐만 아니라, 눈물 막의/각막의 상피 계면과 같은 안구 계면에서 아밀로이드-결합 화합물의 기울기 농도의 측정을 가능하게 할 수 있다.

본 발명의 구체예에 따른 장치는 샘플이 갈바노미터-구동된 장치로 래스터-스캔된 (raster-scanned), xy-스캔을 수행함으로써 형광 분자를 식별한다. 형광 수명은 인간 수정체의 스캔된 각각의 위치에 대해 등록되며, 이에 따라 형광체 분포의 이-차원적 묘사는 강도뿐만 아니라 형광에 근거하여 평가되고 분석될 수 있다. 필요할 수는 있지만 반드시 필요하지는 않은, 붕괴 수명에 기초한 형광체 분포의 이-차원적 묘사는, 본원에서 "형광 수명 영상"으로 나타내어진, 형광 강도에 기초한 이-차원적 묘사를 포함한다.

본 발명의 구체예에 따라 형광 수명 측정은 짧은 레이저 펄스로 반복하여 눈을 여기시키고 시간의 함수로서 나중의 형광 방출을 기록하는 것에 기초한다. 형광 붕괴 시간이 각각의 형광 모듈의 특징들이므로, 이는 샘플 여기된 수정체의 자연 형광으로부터 아밀로이드-결합 화합물을 샘플 부피로 결정하고 분리시킬 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 구체예에서, 형광 수명 측정은 시간 상관 개별 광자 계수 기술 (TCSPC)에 의해 얻어질 수 있다. 스캐닝 속도 및 데이터 습득은 예컨대, 임의의 눈 움직임 아티팩트를 줄이기 위해 0.5초 내로, 또는 눈 움직임 아티팩트를 줄이기에 적절한 또 다른 시간의 양 내로, 동시에 일어나고 실행될 수 있다. TCSPC 원칙은 펄스 레이저에 의해 방출된 개별 광자의 검출 및 도착하는 개개의 광자들의 검출 시간의 기록에 기초한다. 광자가 검출될 때, 상응하는 검출기 펄스의 시간이 측정된다. 이 이벤트는 많은 검출된 광자들에 대한 메모리에 수집된다. 형광 붕괴 수명은 개개의 시간 측정으로부터 막대그래프를 그림으로써 계산될 수 있다. TCSPC 모드로 작동하는 본 발명의 구체예에 따른 장치는, 예컨대 초 당 약 10⁷광자의 계수율을 달성할 수 있다. 따라서, 10⁴ 광자들은 1 ms 미만에 수집될 수 있다. 이러한 계수율은, 높은 속도가 인간 눈의 수정체에서 고속 스캐닝 정보를 습득하기 위해 필요한 경우 중요하다. 다른 계수율이 사용될 수 있다.

본 발명의 구체예에 따른 장치는 인간 눈의 수정체 내의 특정한 위치로부터 구체적인 정보를 얻기 위해 디자인될 수 있다. 이러한 위치들의 예들은 핵상, 수정체 피막, 핵, 각막 및 수양액을 포함한다.

이는 개체의 정확한 배열, 눈의 안구의 해부학의 지식, 및 높은 특이성 및 민감성을 가진 수정체 내에서 스캔된 영역에 형광체들의 정보를 얻는 것에 의해 달성된다. 본 발명의 구체예에 따른 광학 플랫폼의 개략도는 도1에 도시되어 있다 (상기에서도 또한 논의된다). 형광 여기는 눈 (103) 내로 높은 개구수 대물 렌즈 (101)에 의해 집속되는 펄스 레이저 빔에 의해 달성된다. 이 레이저는, 예컨대, 다른 반복률 및 펄스 폭이 사용될 수는 있지만, 약 40 MHz의 반복률에서 펄싱될 수 있고 약 200 피코초 폭의 펄스를 생성할 수 있다. 예컨대, 약 1 MHz 만큼 낮은 반복률 내지 약 240 MHz의 반복률이 사용될 수 있고, 약 40 피코초 내지 약 400 피코초의 펄스 폭이 사용될 수 있다. 그 다음 광학 빔은 한 쌍의 갈바노미터 스캐너에 비춰지고, 이동 스테이지 (104) 성에 장착된 높은 수의 대물 렌즈 (101)에 의해 집속된다. 눈의 핵상 내의 형광 측정은 첫 번째로 개체 눈을 장치에 나란하게 하고, 1) 관심 있는 부위 (ROI)의 위치를 결정하기 위한 z-스캔 및 2) 핵상 내의 영역에 걸쳐 구체적인 정보를 얻기 위한 xy-스캔을 수행함으로써 얻어진다.

본 발명의 구체예에 따라 개체 정렬은 측정의 시작점으로서 대물 렌즈의 초점 면을 식별하는 것으로 구성된다. 고정 타겟으로서도 사용되는 발광 다이오드 (LED)는 고리의 모양으로 눈 (103)의 각막 위에 대물 렌즈 (101)에 의해 집속된다. 카메라는 각막의 표면으로부터 떨어져 고리의 상을 시각화하기 위해 사용된다. 이것이 달성되면, 필요한 정보를 얻기 위해 눈의 스캐닝이 수행될 수 있다.

본 발명의 구체예에 따라 수정체의 해부학적 구조의 식별은 이동 스테이지 (104)를 사용하여 (축 상의) 광학 축을 따라 대물 렌즈 (101)을 스캔함으로써 수행된다. z-스캔은 광원을 이용한 자연 형광의 여기 및 각막, 수정체 피막 및 수정체의 핵상의 부위와 같은 전방 구역의 해부학적 구조 및 이들의 상대적인 거리의 식별을 포함한다. 게다가, 스캔은 눈에 적용된 외생성 아밀로이드-결합 화합물의 약물동력학에 대한 정보를 제공할 수 있다.

본 발명의 구체예에 따라 관심 있는 부위가 z-스캔 측정을 사용하여 눈에서 식별되면, 축 스캔에 대해 수직인 면에서 평면 스캔 (xy-스캔)이 갈바노미터 거울을 사용하여 수행된다. 이-차원적 스캐닝의 해당하는 부분에 대해 측정된 형광 붕괴 곡선의 할당량을 보장하기 위해, 갈바노미터 거울은 TCSPC 측정을 위한 데이터 습득 보드와 동시에 작동된다. xy-스캔은 예컨대, 0.5 초 내로 인간 눈의 핵상에서 50×50㎛의 부위를 스캔하는 것, 및 수명 감쇠 값을 얻는 것을 수반할 수 있다. 다른 크기 및 위치의 부위, 및 스캔의 시간이 사용될 수 있음이 이해될 것이다.

본 발명의 구체예에 따라 검출은 고속 애벌란시 포토다이오드 검출기 (APD) (102)로 공초점 배열을 통해 TCSPC로 달성된다. 여기된 분자들로부터의 형광은 여기 레이저와 같은 대물 렌즈 (101)를 사용하여 수집되고, 다이크로익 거울 이후 추가의 대역 필터로 여과되어 남아 있는 산란 레이저 빛을 거부하며, 공초점 검출을 가능하게 하기 위해 작은 조리개를 통해 통과된다. 비록 다른 타이밍 분석 및 광자 검출 효율이 사용될 수 있지만, 고속-타이밍 선택으로, APD (102), 예컨대 550 nm에서 49%의 광자 검출 효율을 갖는 50 피코초의 반치전폭 (Full Width Half Maximum) 보다 더 좋은 시간 분석을 제공한다.

TCSPC 이면의 데이터 습득 및 전자장치의 예시는 본 발명의 구체예에 따른 도4에 도시되어 있다 (상기에서도 논의되었다). 여기 펄스가 (예를 들어) 역시 40 MHz에 설정된 동기화 (SYNC) 모듈 (407)에 의해 검출되는 동안, 펄스 광원 (406)은 (예를 들어) 40 MHz 반복률에서 반복적으로 샘플 (403)을 여기시킨다. 여기 펄스는 시작 신호를 작동시킨다. 일정 분획 판별기 (CFD) (408)는 이의 진폭과는 독립적으로, 검출기로부터 검출된 제 1 광자에만 반응한다. 샘플 방출로부터의 이러한 제 1 광자는 시간-대-진폭 변환기 (TAC) (409)에 대한 정지 신호이다. APD (402)가 광자를 검출할 때, 단펄스는 PMT의 출력에서 생성된다. 펄스는 CFD (408)에 의해 "클리닝되고(cleaned)", "정지" 펄스로서 TAC (409)에 진입한다. 정지 펄스 (즉, 제 1 도착 광자)가 검출되면, 전압 램프는 정지되고, 전압 밸브 (시작 및 정지 펄스 사이의 시차와 동등하다)는 다채널 분석기 (MCA) (410)로 전송된다. MCA (410)은 TAC (409)로부터 단일-광자 이벤트의 반복적인 시작-정지 신호, 및 검출된 전압 (시간)와 통신하는 채널에서 계수 증가를 기록한다. 이러한 과정은 각각의 펄스를 사용하여 반복되고, 결국, 여러 사이클 후에, 시간 채널 유닛의 함수로서 광자 수의 막대그래프가 발생된다. 이 막대그래프는 시간의 함수로서 형광 강도를 나타내며, 이로부터 형광 붕괴 수명이 얻어진다.

본 발명의 구체예에 따라 데이터 습득은 추가의 데이터 분석을 위한 모든 검출된 광자에 대한 모든 관련 있는 정보를 저장하는, 특수한 시간-태그된 시간-분해능 모드(Time-Tagged Time-Resolved Mode)에서 작동하는 PicoHarp 300 TCSPC (독일 베를린의 PicoQuant, GmbH) PC-보드를 사용하여 수행될 수 있다. 특히, 모든 광자 도착 시간은 레이저 여기 펄스 및 샘플의 위치 및 검출 채널의 수와 동기화된 검출기에서 기록된다. 습득 보드의 싱크 비율 (sync rate)은, 예컨대, 4 피코초의 시간 분해능으로, 40 MHz 및 16 비트의 채널 수 깊이에 설정될 수 있다(다른 싱크 비율, 시간 분해 및 채널 수치 깊이가 사용될 수 있다).

본 발명의 구체예에 따라 SymPhoTime , (독일 베를린의 PicoQuant, GmbH)을 사용하여 수행될 수 있는 소프트웨어 습득은, TCP/IP 네트워크를 거쳐 제어될 수 있고 갈바노미터 스캐너 및 TTL 신호를 통한 습득 보드 둘 모두와 동기화되어, 영상의 선과 프레임을 정의할 수 있다. LSM 명령 모드의 SymPhoTime은, 예컨대, 형광 수명 및 강도 영상을 기록하고 보여줄 수 있다.

본 발명의 구체예에 따라 형광 수명은 인간 수정체 내에서 스캔된 각각의 위치에 등록될 수 있고, 따라서 형광체 분포의 이-차원적 묘사는 형광 붕괴율 및 강도에 근거하여 평가되고 분석될 수 있다. 형광 수명 감쇠에 근거하여 구성된 컬러 코딩된 영상을 임상적 해석을 용이하게 하기 위해 강도 영상 위에 겹쳐질 수 있다. 형광 수명 영상의 계산은 막대그래프 내로 하나의 픽셀에 해당하는 모든 광자들을 분류함으로써 행해질 수 있고, 그 다음 수명 정보를 추출하기 위한 지수 붕괴 함수에 맞게 된다. 이러한 절차는 그 다음 영상 내에서 모든 픽셀에 대해 반복된다. 소프트웨어 알고리즘은 수적인 재-컨벌루션 (numerical re-convolution)뿐만 아니라 테일-피팅(tail-fitting)을 사용하여 다지수 붕괴 함수에 데이터를 맞출 수 있다. 피팅 절차가 영역에 걸친 특정 형광체를 나타내는 특정 붕괴율의 광자의 꼭 맞는 주파수 계수를 위한 스캔은 영상으로부터 직접 추출될 수 있다. 전술한 알고리즘은 컴퓨터에 의해 실행될 수 있고, 컴퓨터 모니터와 같은 이-차원적 디스플레이 상에 데이터를 보여주는 것을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 일 구체예에서, 특정 수명 감쇠와 관련된 평균 강도는 아밀로이드 단백질의 응집의 척도로서 사용될 수 있다. 즉, 파라미터는 특정 영역에 걸쳐, 특정 수명 감쇠와 관련된 형광 강도를 평균 냄으로써 얻어질 수 있다. 이러한 파라미터는, 예컨대 파라미터의 변화에 근거하여 개체의 질병의 경과를 모니터링하기 위해, 응집의 척도로서 사용될 수 있다. 이러한 파라미터는 컴퓨터 또는 다른 특수화된 하드웨어에 의해 결정될 수 있다.

형광 아밀로이드-결합 화합물인 화합물 #11의 형광 막대그래프는 도6에 도시되어 있으며, 이는 본 발명의 구체예에 따른 장치에 의해 얻어진다. 단일 지수 피팅은 2 nsec의 수명 감쇠율을 초래한다.

도7은 본 발명의 구체예에 따라 얻어진, 화합물 #11의 형광 수명 영상 및 이의 상응하는 강도 영상을 보여준다. 상기 영상은 0.5초 내에 얻어진 100 ×100 픽셀이고 50×50 미크론의 스캐닝 영역을 나타낸다.

본 발명에 따른 구체예는 형광체를 이들의 수명 특징에 근거하여 검출하고 분해하기 위해 형광 시간 영역 기술을 사용한다. 형광 강도 및 수명 측정을 결합함으로써, 정보의 여분의 차원이 형광 라벨들 간을 구별하도록 얻어진다. 실험 #1에서 논의된 시험관 내 (In vitro ) 연구는 형광성 형광체들을 이들의 수명 감쇠 특징에 근거하여 구별한다는 점에서, 본 발명에 따른 구체예의 능력을 입증한다. 더욱이, 실험 #2에서 논의된 토끼 눈에 대한 약물동력학 연구는, 수정체의 핵상에서 형광 아밀로이드-결합 화합물인 화합물 #11의 검출가능한 형광 신호를 보여준다. 더 중요한, 토끼 눈의 수정체에서 검출된 신호는, 용이하게 식별되었고 아밀로이드-결합 화합물 그 자체로 지적되었다.

본원에 기재된 임의의 방법 (뿐만 아니라 이들의 개개의 단계들 및 이러한 방법들의 몇몇 나중의 단계들의 조합들), 특히 수집을 포함하는 단계, 및 임의적으로 관련 있는 데이터를 선택적으로 처리하는 단계, 이에 따라 정상 제어 값을 이용하여 얻어진 데이터의 비교, 및/또는 이러한 비교 동안 임의의 유의한 편차를 발견하는 단계를 포함하는 기술적 단계들은, 나중의 별도의 진단 단계에 앞서, 독립적으로, 준비로서, 즉 얻어진 값과 정상적인 제어 값(들) 사이의 잠재적 편차를 알츠하이머 질병 (실제의 진단)과 같은 특정 아밀로이드 형성 장애의 결과로 보기에 앞서, 수행될 수 있음은 해당 기술분야에서 통상의 기술자에게 이해될 것이다. 이러한 나중의 별도의 진단 단계에 앞서, 독립적으로, 준비로서, 수행된, 방법들 (이러한 방법들의 몇몇의 나중의 단계들의 조합뿐만 아니라 개개의 단계들을 포함한다)은 본 발명의 개별적인 구체예로서 특별히 고려될 수 있다.

본 발명의 구체예에 따라 시스템의 다양한 하위-구성요소들은 현존하는 공급자들에 의해 공급될 수 있다. 예컨대, 여기 공급원은 독일 베를린의 PicoQuant에 의해 판매되는, Picosecond Pulsed Laser, LDH 시리즈; 독일 베를린의 Becker&Hickl에 의해 판매되는, Picosecond Diode Laser, BDL 시리즈; 또는 일본 하마마츠의 Hamamatsu Photonics에 의해 판매되는, Picosecond Light Pulser, PLP 시리즈일 수 있다. 데이터 습득은 독일 베를린의 PicoQuant에 의해 판매되는 TCSPC 모듈, PicoHarp 300; 독일 베를린의 Becker&Hickl에 의해 판매되는, TCSPC 모듈, SPC 시리즈; 또는 일본 하마마츠의 Hamamatsu Photonics에 의해 판매되는, Synchronous Delay Generator, C10647을 사용하여 수행될 수 있다. 광자 계수 검출기는 독일 베를린의 PicoQuant에 의해 판매되는, 검출기 유닛 Detector Unit, PMA 시리즈; 독일 베를린의 Becker&Hickl에 의해 판매되는, Detector Unit, ID-100시리즈; Streakscope (일본 하마마츠의 Hamamatsu Photonics에 의해 판매되는, C10627)일 수 있다. 다른 여기 공급원들, 데이터 습득 모듈 및 광자 계수 검출기들이 사용될 수 있다는 것으로 인식될 것이다.

본 발명의 전술한 구체예들의 일부는 하나 이상이상의 컴퓨터 시스템을 사용하여 실행될 수 있다. 예컨대, 구체예들은 하드웨어, 소프트웨어 또는 이들의 조합을 사용하여 실행될 수 있다. 소프트웨어에서 실행될 때, 소프트웨어 코드는 단일의 컴퓨터에서 제공되거나 많은 컴퓨터에 분산되든지, 임의의 적절한 프로세서 또는 프로세서들의 집합에서 실행될 수 있다.

더욱이, 컴퓨터가 랙-장착된 (rack-mounted) 컴퓨터, 데스크탑 컴퓨터, 랩탑 컴퓨터, 태블릿 컴퓨터, 단일 회로 보드 컴퓨터 또는 칩 상의 시스템과 같은, 임의의 다양한 형태로 구현될 수 있다. 게다가, 컴퓨터는 개인 휴대정보 단말기 (PDA), 스마트폰 또는 다른 임의의 다른 적절한 휴대용 또는 고정된 전자 장치를 포함하여, 일반적으로 컴퓨터라고 간주되지는 않지만 적절한 프로세싱 능력을 가진 장치에 들어갈 수 있다.

또한, 컴퓨터는 하나 이상의 입력 및 출력 장치들을 가질 수 있다. 이들 장치들은 다른 것들 중에서도, 사용자 인터페이스를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 사용자 인터페이스를 제공하기 위해 사용될 수 있는 출력 장치의 예들은, 출력의 시각적 표시를 위한 프린터 또는 디스플레이 스크린 및 출력의 청각적 표시를 위한 스피커 또는 다른 소리 발생 장치를 포함한다. 사용자 인터페이스용으로 사용될 수 있는 입력 장치의 예들은 키보드, 및 마우스와 같은, 포인팅 장치, 터치 패드, 터치 스크린 및 디지털화 태블릿을 포함한다. 다른 예로서, 컴퓨터는 음성 인식을 통해 또는 다른 청각의 방식으로 입력 정보를 수용할 수 있다.

이러한 컴퓨터는 기업 네트워크 또는 인터넷과 같은, 로컬 영역 네트워크 또는 광역 네트워크로서 포함되는, 임의의 적절한 형태의 하나 이상의 네트워크에 의해 서로 연결될 수 있다. 이러한 네트워크는 임의의 적절한 기술에 기초될 수 있고, 임의의 적절한 프로토콜에 따라 작동할 수 있으며, 무선 네트워크, 유선 네트워크 또는 광섬유 네트워크를 포함할 수 있다.

또한, 본원에서 설명된 다양한 방법들 또는 프로세스들은 여러 작동 시스템 또는 플랫폼 중 어느 하나를 사용하는 하나 이상의 프로세서에서 실행가능한 소프트웨어로서 코딩될 수 있다. 게다가, 이러한 소프트웨어는 많은 적절한 프로그래밍 언어 및/또는 프로그래밍 또는 스크립팅 도구 중 임의의 것을 사용하여 쓰일 수 있고, 프레임워크 또는 가상 기계에서 실행되는 실행가능한 기계 언어 코드 또는 중간 코드로서 번역될 수 있다.

이러한 면에서, 본 발명의 적어도 일부는 하나 이상의 컴퓨터 또는 다른 프로세서들에서 실행될 때, 상기에서 논의된 본 발명의 다양한 구체예들의 적어도 일부를 실행하는 방법을 수행하는, 하나 이상의 프로그램으로 인코딩된 컴퓨터 판독 가능 매체 (또는 다수의 컴퓨터 판독가능 매체) (예컨대, 컴퓨터 메모리, 하나 이상의 플로피 디스크, 컴팩트 디스크, 광학 디스크, 자기장 테이프, 플래쉬 메모리, FPGA (Field Programmable Gate Arrays)의 회로 배열 또는 다른 반도체 장치의 회로 배열, 또는 다른 실재하는 컴퓨터 저장 매체)로서 구현될 수 있다. 컴퓨터 판독가능 매체 또는 매체들은 운반가능하며, 이에 따라 매체상에 저장된 프로그램 또는 프로그램들은 상기에서 논의된 바와 같이 본 발명의 다양한 양태들을 실행하기 위해 하나 이상의 다른 컴퓨터들 또는 다른 프로세서들 상에 로딩될 수 있다.

이러한 면에서, 적어도 전술한 구체예들의 적어도 일부의 일 싱행은, 프로세서에서 실행될 때, 이들 구체예들의 전술한 기능의 일부 또는 전부를 수행하는, 컴퓨터 프로그램 (예컨대, 복수 개의 지시들)으로 인코딩된 하나 이상의 컴퓨터-판독가능 매체를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "컴퓨터-판독가능 매체"는 기계 또는 제품 (즉, 제품의 물품)인 것으로 고려될 수 있는 컴퓨터-판독가능 매체를 오직 포함한다. 컴퓨터-판독가능 매체는, 예컨대, 컴퓨터-판독가능 정보가 인코딩되거나 저장될 수 있는 존재하는 매체, 컴퓨터-판독가능 정보가 인코딩되거나 저장될 수 있는 저장 매체, 및/또는 컴퓨터-판독가능 정보가 인코딩되거나 저장될 수 있는 비-일시적 매체일 수 있다. 컴퓨터-판독가능 매체의 다른 제한 없는 예들은 컴퓨터 메모리 (예컨대, ROM, RAM, 플래쉬 메모리, 또는 다른 유형의 컴퓨터 메모리), 자기장 디스크 또는 테이프, 광학 디스크, 및/또는 기계나 제품인 것으로 고려될 수 있는 다른 유형의 컴퓨터-판독가능 매체를 포함한다.

용어 "프로그램" 또는 "소프트웨어"는 상기 논의된 바와 같이 본 발명의 다양한 양태를 실행하기 위해 컴퓨터 또는 다른 프로세서를 프로그램화하기 위해 사용될 수 있는 임의의 유형의 컴퓨터 코드 또는 일련의 컴퓨터-실행가능한 지시를 나타내는 총칭의 의미로서 본원에서 사용된다. 게다가, 이러한 구체예의 일 양태에 따라, 실행될 때 본 발명의 방법을 수행하는 하나 이상의 컴퓨터 프로그램이 단일의 컴퓨터 또는 프로세서에 있을 필요가 없지만, 본 발명의 여러 양태들을 실행하기 위해 많은 다른 컴퓨터들 또는 프로세서들 중 모듈식 방식으로 분배될 수 있는 것으로 이해될 수 있다.

컴퓨터-실행가능한 지시들은 하나 이상의 컴퓨터들 또는 다른 장치들에 의해 실행되는, 프로그램 모듈과 같은, 다양한 형태일 수 있다. 일반적으로, 프로그램 모듈은 특정한 과제를 수행하거나 특정한 관념적 데이터 유형들을 실행하는 루틴, 프로그램, 물건, 구성요소, 데이터 구조 등을 포함한다. 일반적으로 프로그램 모듈의 기능은 다양한 구체예들에서 원하는 것과 결합되거나 분배될 수 있다.

실험 #1 - β 아밀로이드 펩티드 (1-42)를 갖는 뉴롭틱스 형광 리간드의 시험관 내 연구 :

본 발명의 구체예에 따라 화합물 #11에 결합된 응집된 Aβ 펩티드에 대한 시험관 내 연구를 수행하였다. 응집된 Aβ 펩티드를 갖는 화합물 #11의 형광 수명 측정은 본 발명의 구체예에 따른 장치를 사용하여 수행하였다. 도8a는 본 발명의 구체예에 따라 도8b에 도시된 이들의 상응하는 형광 수명 막대그래프와 함께, 화합물 #11 및 응집된 Aβ 펩티드에 결합된 화합물 #11을 보여주는 형광 수명 영상이다. 수명 막대그래프를 맞춤으로써, 붕괴율을 결정하였다. 그 결과는 낮은 수준의 광자 검출로 0.85 nsec만큼 낮은 수명 차이의 형광체들 사이를 구별할 수 있는 본 발명에 따른 구체예의 우수한 성능을 설명한다. 실험적 설명은 하기와 같다.

이러한 시험관 내 연구의 목적은 화합물 #11 아밀로이드-결합 화합물의 광학 특징을 식별하고, 응집된 Aβ 펩티드에 결합될 때 이의 형광 특징을 특징화하기 위함이었다. 특히, 연구의 목적은 다음과 같았다: 1) 화합물 #11 수명 감쇠율의 특징화; 및 2) β 아밀로이드 (Aβ) 펩티드에 결합된 및 결합되지 않은 화합물 #11 사이를 검출하고 구별하는 능력.

장치:

Neuroptix SAPPHIRE II 장치 (미국 매사추세츠 액튼의 Neuroptix Corporation)는 이러한 실험에 대한 시험관 내 측정에 맞추어진, 인간에서의 임상적 연구를 위해 특별한 목적을 위해 만들어진 장치이다. 이는 형광체들의 구별을 허용하는 형광 수명 분광학과 결합된 공초점 스캐닝 매커니즘을 사용한다. 이 장치는, 1) 핵상과 같은 눈의 전방 구역에서 특정 위치에 대한 광학 빔의 스캐닝, 및 2) 형광 수명 측정에 근거하여 형광성의 형광체의 식별을 허용한다.

방법 - 응집된 Aβ 펩티드의 준비:

응집된 Aβ 펩티드는 pH 7.4의 PBS에서 Aβ(1-42)를 100μM의 최종 농도로 용해시킴으로써 준비하였다. 이 용액을 실온에서 3일간 1200 rpm에서 자기 교반시켰다. PBS 중의 100μM의 Aβ(1-42) 저장액 (stock solution)을 부분 표본화시키고(aliquoted), 이의 성질의 인식할만한 변화 없이 최대 4주 동안 -80℃에서 냉각시켰다. 150μL의 미리-응집된 Aβ(1-42)를 5μM의 Aβ(1-42) 및 4μM의 화합물 #11의 최종 농도를 얻기 위해 2.85mL의 화합물 #11에 첨가하였다. 이 용액을 5mL 유리병으로 옮기고 25℃에서 형광 측정을 수행하였다.

실험 및 결과

화합물 #11을 구성하는 샘플은 Neuroptix SAPPHIRE II 장치 앞에 위치시켰다. 샘플에서 스캔의 위치가 결정되면, 형광 수명 측정값을 얻기 위해 래스터 스캔을 수행하였다. 도8a는 1초의 습득 시간에 얻어진 100㎛×100㎛의 스캔 범위를 갖는 영상 (200×200 픽셀)을 보여준다. 영상은 수명 감쇠를 나타내기 위해 음영이 들어갔다. 대부분의 영상 백그라운드를 만드는 음영은 형광 아밀로이드-결합 화합물의 수명 감쇠에 상응하는, 1.4 nsec의 수명 감쇠를 나타낸다. 영상에서 검출된 지점은 2.25 nsec의 수명 감쇠를 나타내는 응집된 Aβ펩티드의 지점이다. 도8b에서 플롯은 화합물 #11 및 응집된 Aβ펩티드에 결합된 화합물 #11의 형광 붕괴율 모두에 대해 계산된 형광 붕괴율을 보여준다.

결론

응집된 Aβ 펩티드를 갖는 화합물 #11의 시험관 내 형광 수명 측정은 Neuroptix SAPPHIRE II 장치로 수행하였다. 형광 수명 감쇠율에 근거하여, 화합물 #11에 결합된 및 결합되지 않은 펩티드를 분석할 수 있다. 그 결과는 단지 수백 개의 광자들의 검출 수준에 의해 형광체들 간에 0.85 nsec의 수명의 차이를 구별할 수 있는 SAPPHIRE II 장치의 우수한 성능을 입증한다.

실험 #2 - 네덜란드- 검정띠 토끼(Dutch-Belted Rabbits)에서의 안구의 약물동력학 연구 :

본 발명의 구체예에 따라, 토끼 눈에서 화합물 #11의 생체 내 약물동력학 연구를 본 발명의 구체예에 따른 장치를 사용하여 수행하였다. 도9a는 콘트롤 토끼와 함께 아밀로이드-결합 화합물이 투여된 두 마리의 토끼에 대해 측정된 특정 붕괴율의 광자의 주파수 계수의 플롯이다. 형광 아밀로이드-결합 화합물 (화합물 #11)과 관련된 특정 붕괴율의 광자의 주파수 계수를 본 발명의 구체예에 따른 형광 막대그래프 (도9b)로부터 계산하였다. 그 결과는 각막을 관통하고 토끼 눈의 수정체에서 장치에 의해 검출되는 아밀로이드-결합 화합물의 성능을 입증한다. 실험적 설명은 하기와 같다.

서론

형광 아밀로이드-결합 화합물의 국소 투여를 통한 투여 반응의 안구의 약물동태학 조사를 네덜란드-검은띠 토끼들에서 수행하였다. 토끼들은 화합물 #11 아밀로이드-결합 화합물 연고를 사용하여 4일의 기간에 걸쳐 매일 시험하였다. 두 마리의 동물들을 연고의 형태의 화합물 #11 (0.5%)로 오른쪽 눈에 투여하였다. 한 동물은 처리되지 않았고 콘트롤 동물로서 사용하였다. 동물들은 4일 동안 특정 시점에 투여되었으며, 각 날의 시작과 종료에 형광 강도 및 수명 측정을 위해 SAPPHIRE II 시스템으로 시험하였다.

그 결과는 다음을 설명한다:

1) 검출가능한 형광 신호는 반복적인 국소 투여 후에 연고 형태의 5mg/g의 화합물 #11 농도로 달성되었다.

2) 각 날의 시작과 종료에, 그리고 4일의 기간에 걸쳐 수행된 형광 측정은 토끼 눈의 수정체 핵에서 화합물 #11 형광의 증가를 보여준다.

방법:

안구 측정은 주기적으로 수행하였으며, 투여 농도는 하기 표에 명시하였다.

그룹	처리	동물들의 #	톡시큰( Toxiko n)에 의한 투여량	스폰서에 의한 안구의 측정
1	5 mg/g (연고)	2	830, 1130 및 1430에서 4일 간 투여된 연고	각각의 날의 시작과 종료에 SAPPHIRE II 시험
콘트롤 (control)	-	1		각각의 날의 시작과 종료에 SAPPHIRE II 시험

표 1: 시험된 동물 그룹, 투여된 투여량, 및 측정 시간

연구는 4일에 걸쳐 시차를 두었고 한 위치에서 하나의 기구 상에서 수행하였다. 시험은 연구 전용을 위한 불빛이 어둑한 룸에서 수행하였다.

모든 동물들을 국소 안구 적용을 거쳐 화합물 #11로 투여하였고, 오른쪽 눈에 시험하였다. 동물들을 마취하였으며, Neuroptix SAPPHIRE II 장치 앞에 플랫폼에 수동으로 고정시켰다. 총체적 포지션(gross position)을 동물 조련사에 의해 행했으며, 측정 위치의 미세 조정을 Neuroptix SAPPHIRE II 작동자에 의해 행했다. 정렬되면, SAPPHIRE II 작동자가 측정 순서를 착수시켰다. 기준치 측정을 투여 전, 및 그 다음 각 날의 시작과 종료에 동물에 대해 이루어졌다 (표 1).

실험 설계 및 투여량:

형광 수명 및 강도 측정을 각 날의 시작과 종료에 눈에서 수행하였다. 측정은 안구-내 정보를 얻기 위해 축 방향으로 (z-스캔) 토끼 눈을 스캔하는 것 및 이 경우 수정체 핵인, 눈의 특정 부위에서 수명 감쇠 측정을 수행하기 위해 평면적 스캔 (xy-스캔)을 수반하였다.

관심 있는 위치가 식별되면, 시간 상관 개별 광자 계수 (TCSPS)를 xy-스캔을 수행하는 동안 개시하였다. 그 다음 형광 수명 영상은 붕괴 수명 막대그래프가 각각의 픽셀 위치에 대해 얻어졌던 곳에서 얻어졌다. 계산된 붕괴 시간을 형광 수명 영상에서 컬러 코딩시켰다. 각각의 측정을 3번 수행하였다. 특정 붕괴율의 광자의 주파수 계수를 xy-스캔에서 얻어진 화합물 #11 특징의 붕괴율 주파수로부터 계산하였고 3번 측정에 걸쳐 평균냈다. 캘리브레이션 (Calibration) 측정을 형광 염료상에서 하루에 한 번씩 행했으며, 연구를 통해 명백한 이동이 없이 반복가능한 수행을 보여주었다. 장치는 인간 사용을 위해 특별히 디자인하였으나 플랫폼은 토끼를 고정시키기 위해 약간 수정하였다.

투여는 각각의 동물의 오른쪽 눈 내부로의 국소 안구 적용을 통해 톡시큰 (Toxikon) 스태프에 의해 수행하였다.

그룹 1: 동물들을 덱스도미터(Dexdomitor) (0.5mg/kg), 케타민 (Ketamine) (5mg/kg)의 피하 주사로 마취시켰다. 그 다음 대략 ½ 인치 길이의 연고의 리본을 4일 동안 하루에 세 번씩 시험 그룹에서 각각의 동물의 하부 오른쪽 눈꺼풀에 적용하였다.

콘트롤: 콘트롤 그룹에 대해, 한 동물을 연고 또는 용액이 눈에 투여되지 않은 것만 제외하고 시험 그룹의 동물들과 동일한 방법으로 처리하였다.

결과 요약:

눈에서 아밀로이드-결합 화합물의 형광 강도 및 수명 측정은 각 날의 시작 (아침) 및 종료 (저녁)에 수행하였다. 도10a 및 10b는 다섯 마리 토끼의 수정체 핵에서 4일의 연구 기간 동안 투여된 이후 날의 종료 및 베이스라인을 위해 아침에 측정된 화합물 #11과 관련된 특정 붕괴율의 광자의 주파수 계수를 보여주는 플롯이다. 도10a는 아침 측정에 대한 플롯이고, 도10b는 저녁 측정에 대한 플롯이며, 상기 둘 모두 화합물 #11 안연고제가 투여된 두 마리의 토끼들에 대한 것이다. 화합물 #11 안연고제가 투여된, 두 마리의 토끼들 (1002 및 1003)에 대한 측정은, 눈의 핵에서 형광 신호의 상당한 증가를 보여준다. 도10a 및 10b는 세 시간의 분리로 매일의 세 번 복용 후, 누적 형광 신호가 4일의 연구 기간을 따라 측정되었음을 보여준다.

도11a 및 11b는 동물 (1003)으로 연구의 넷째 날의 종료 후 및 베이스라인에서 얻은 두 개의 형광 수명 영상이다. 검정 영상으로 나타난 베이스라인 측정은 눈의 수정체에서 화합물 #11의 부존재를 나타낸다. 4일 후, xy-스캔은 형광 수명의 특징인 2 nsec의 붕괴율 (회색으로 나타냄)을 갖는 수명 영상을 드러냈다. 두 토끼 사이에서 수집된 신호의 차이는 기술자에 의한 투여량 변화 및 동물에 의한 눈깜빡거림의 탓으로 돌려질 수 있다.

결론

주된 목적은 5mg/g의 농도의 화합물 #11 안연고제로 달성되었다. 화합물 #11의 반복적인 국소 투여는 시간의 적용 이후 핵에서 축적되는 경향이 있었으며, 12시간 이상 동안 그 곳에 머물러 있는 경향이 있었다.

본원에 인용된 전체 특허, 공개된 출원 및 참고 문헌들은 그들 전체에서 본원에 참조로서 포함된다.

본 발명은 특히 본 발명의 구체예들을 예시하기 위해 참고 문헌과 함께 도시되고 설명되었지만, 하기 청구된 청구항들로 포함된 본 발명의 범위로부터 벗어남 없이 형태 및 상세한 내용의 다양한 변화들이 그 안에서 이루어질 수 있음은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 이해될 것이다.

Claims

각각의 아밀로이드-결합 화합물이 아밀로이드 단백질에 결합될 때 적어도 아밀로이드-결합 화합물에서 형광 (fluorescence)을 생성하는데 적절한, 빛의 파장, 빛의 편광 또는 이들의 조합 중 하나 이상으로 눈을 비추기 위해 빛을 방출하도록 구성되는 광원으로서, 상기 아밀로이드-결합 화합물이, 눈에 도입되고 특히 아밀로이드 형성 장애를 나타내는 아밀로이드 단백질에 결합되는, 광원; 및
눈의 비춘 결과로서 생성된 형광을 포함하는 빛을 수용하고 적어도 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광에 대해 형광의 시간 붕괴율을 결정 (determination)하도록 구성되는 광학 유닛 (optical unit)으로서, 상기 결정이 적어도 시간 붕괴율에 근거하여 눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물의 존재를 구별하는 것을 허용하는, 광학 유닛을 포함하는,
포유동물의 눈에서 아밀로이드 단백질을 검출하는 장치.
제 1항에 있어서, 광학 유닛이 분자 회전자 (rotor) 아밀로이드-결합 화합물; 콩고 레드 (Congo red) 또는 콩고 레드 유도체 아밀로이드-결합 화합물; 크리사민 (Chrysamine) 아밀로이드-결합 화합물; 크리사민 유도체 아밀로이드-결합 화합물, 크리사민 G 또는 크리사민 G 유도체 아밀로이드-결합 화합물; 티오플라빈 (Thioflavin) T 또는 티오플라빈 T 유도체 아밀로이드-결합 화합물; 및 티오플라빈 S 또는 티오플라빈 S 유도체 아밀로이드-결합 화합물 중 하나 이상에 대해 시간 붕괴율을 결정하도록 구성되는 장치.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 광학 유닛이 적어도 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광에 대해 형광의 강도를 결정하는 장치.
제 3항에 있어서, 광학 유닛이 강도 및 시간 붕괴율 중 하나 이상에 근거하여, 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물의 양을 결정하도록 구성되는 장치.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 광학 유닛이 눈의 특정 영역에서 특정한 붕괴율을 갖는 광자의 평균 수를 결정하도록 구성되는 장치.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 광원이 펄스 레이저 (pulsed laser)를 포함하는 장치.
제 6항에 있어서, 펄스 레이저가 약 1 MHz 내지 약 240 MHz의 반복률 (repetition rate)에서 빛을 방출하도록 구성되는 장치.
제 6항 또는 제 7항에 있어서, 펄스 레이저가 약 40 피코초 내지 약 400 피코초 폭의 펄스 폭을 갖는 빛을 방출하도록 구성되는 장치.
제 6항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 펄스 레이저가 약 40 MHz의 반복률에서, 약 200 피코초 폭의 펄스 폭을 갖는 빛을 방출하도록 구성되는 장치.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 눈 내의 위치에 걸쳐 광원으로부터 빛을 스캔하도록 구성된 광학 주사 유닛(optical scanning unit)을 추가로 포함하는 장치.
제 10항에 있어서, 광학 주사 유닛이 이동 스테이지 (translation stage)에 장착된 대물 렌즈 및 갈바노미터 거울 (galvanometric mirror)을 포함하는 스캐너를 포함하는 장치.
제 10항 또는 제 11항에 있어서, 광학 주사 유닛이 광원에 의한 빛을 사용하여 눈에서 관심 있는 하나 이상의 부위를 샘플링하도록 배열되고, 상기 샘플링은 상기 하나 이상의 부위 내에서 점 또는 점들, 면 또는 면들, 또는 체적 (volume) 또는 체적들 중 하나 둘 이상에서 비추는 것 및 형광 방출을 검출하는 것을 포함하는, 장치.
제 10항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 광학 주사 유닛이 눈의 하나 이상의 부위에 걸쳐 다른 위치들을 샘플링하도록 배열되는 장치.
제 10항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 광학 주사 유닛이 눈 내부로의 깊이 방향으로 확장하는 수직 축을 따라 연속적인 면에서 광원을 사용하여 눈의 평면 스캔을 수행하도록 배열되는 장치.
제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 눈으로부터 방출된 형광을 검출하기 위한 광검출기 유닛을 추가로 포함하는 장치.
제 15항에 있어서, 광검출기 유닛이 포토다이오드, 광전자배증관, 전하-결합 소자 및 강화된 전하-결합 소자 중 하나 이상을 포함하는 장치.
제 15항에 있어서, 광검출기 유닛이 애벌란시 (avalanche) 광검출기를 포함하는 장치.
제 15항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 눈으로부터 형광을 내는 빛의 광자 계수 (photon counts)를 나타내는 광검출기 유닛으로부터 전자적 신호를 수용하는 시간 상관 개별 광자 계수 모듈을 추가로 포함하는 장치.
제 18항에 있어서, 시간 채널 유닛 (time channel units)의 함수로서 광자 계수의 분포 (distribution)에 근거하여 형광의 시간 붕괴율을 결정하도록 구성되는 하나 이상의 프로세서 모듈 (processor module)을 추가로 포함하는 장치.
제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 광학 유닛이, 눈의 조직의 백그라운드 자가형광으로부터 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물, 다른 비-특이적 입자들의 자가형광 및 결합되지 않은 아밀로이드-결합 화합물을 구별하도록 구성되는 장치.
제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 광학 유닛이, 아밀로이드-결합 화합물; 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물; 및 아밀로이드 단백질 중 하나 이상의 존재 또는 하나 이상의 양을 구별하도록 구성되는 장치.
제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드 단백질이 응집체 (aggregate)를 포함하는 장치.
제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드 단백질이 프리-아밀로이드 (pre-amyloid) 단백질 응집체를 포함하는 장치.
제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드 단백질이 β-아밀로이드를 포함하는 장치.
제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드 형성 장애가 알츠하이머 질병을 포함하는 장치.
제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 광학 유닛이 적어도 검출된 형광에만 근거하여 아밀로이드 단백질의 존재를 구별하도록 구성되는 장치.
제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 광학 유닛이 검출된 형광에 근거하여 아밀로이드-결합 화합물의 눈으로의 전달률을 결정하도록 구성되는 장치.
제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 광학 유닛이 검출된 형광에 근거하여 눈으로 전달된 아밀로이드-결합 화합물의 공간적 분포를 결정하도록 구성되는 장치.
제 1항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 광학 유닛이 검출된 형광에 근거하여 눈의 각막의 계면에서 아밀로이드-결합 화합물 농도의 기울기를 결정하도록 구성되는 장치.
제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 광학 유닛이 검출된 형광에 근거하여 눈의 수양액에서 아밀로이드-결합 화합물의 공간적 분포 및 아밀로이드-결합 화합물의 시간적 분포 중 하나 이상을 결정하도록 구성되는 장치.
제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 광학 유닛이 눈의 조직으로부터 방출된 자연 형광으로 인한 형광 신호의 증가에 근거하여 눈의 안구 계면의 위치를 결정하도록 구성되는 장치.
제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 광학 유닛이 (ⅰ) 눈의 해부학적 구조로부터 떨어진 거리, 및 (ⅱ) 강도 측정에서 변화의 검출 중 하나 이상에 근거하여 눈의 핵상 (supranucleus)의 위치를 결정하도록 구성되는 장치.
제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 광학 유닛이 해부학적 구조 또는 하부구조의 일부 또는 전부의 자연 형광 여기 (excitation)에 근거하여 눈의 해부학적 구조 또는 하부구조의 일 차원 이상을 결정하도록 구성되는 장치.
제 33항에 있어서, 일 차원 이상을 결정하는 것이 구조 또는 하부구조의 두께를 결정하는 것, 구조 또는 하부구조의 모양을 결정하는 것, 및 눈의 하나 이상의 구조 또는 하부구조 사이의 거리를 결정하는 것 중 하나 이상을 포함하는 장치.
제 1항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 광학 유닛이,
여기된 자연 형광을 결정하고 이로 인해 눈에서 관심 있는 하나 이상의 부위를 결정하기 위해 눈 내에서 스캔하도록 구성되고;
광원에 의한 빛을 사용하여 눈에서 관심 있는 하나 이상의 부위를 샘플링하도록 구성되며; 상기 샘플링은 하나 이상의 부위 중 하나 이상의 전체 부위의 측정, 또는 광원에 의한 빛을 사용한 하나 이상의 부위 내의 다른 위치들의 샘플링 중 하나 이상을 수행하는 것을 포함하고, 상기 다른 위치들의 샘플링은 하나 이상의 부위 내에 점, 면 또는 체적 중 하나 이상에 빛을 비추는 것을 포함하며;
상기 샘플링은 하나 이상의 샘플링된 부위 내에서 적어도 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광에 대해 형광의 시간 붕괴율 및 형광의 강도를 결정하는 장치.
제 1항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 광학 유닛이 눈 내부로의 깊이 방향으로 축 스캔의 각각의 지점을 따라 여기된 자연 형광을 결정하고 이로 인해 눈에서 관심 있는 하나 이상의 위치를 결정하도록 구성되고;
광학 유닛이 축 스캔의 방향과 수직인 연속적인 면에서, 광원을 사용하여 눈의 각각의 일련의 평면 스캔의 각각의 세트의 각각의 지점에서 적어도 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광에 대해 형광의 시간 붕괴율 및 형광의 강도를 결정하도록 구성되는 장치.
제 1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드 형성 장애를 나타내는 아밀로이드 단백질에 대해 눈 내에서 실시간 서치를 가능하게 하도록 구성되는 장치.
제 1항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 광원이 눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 대한 형광 여기 스펙트럼의 피크 (peak) 부위에 대해 적절한 파장의 빛을 방출하도록 구성되고, 광학 유닛이 눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 대한 형광 방출 스펙트럼의 피크 부위에 대해 적절한 파장의 빛을 검출하도록 구성되는 장치.
제 1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드-결합 화합물이 화합물 #11인 장치.
제 38항 또는 제 39항에 있어서, 여기 스펙트럼이 약 470 nm의 피크를 갖고, 광원은 여기 스펙트럼의 피크의 ± 약 20 nm 내에서 빛을 방출하도록 구성되며, 방출 스펙트럼이 약 580 nm의 피크를 갖고, 광학 유닛이 방출 스펙트럼의 피크의 ± 약 20 nm 내에서 빛을 검출하도록 구성되는 장치.
제 1항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드 단백질이 아밀로이드 형성 장애를 나타내는 장치.
각각의 아밀로이드-결합 화합물이 아밀로이드 단백질에 결합될 때 적어도 아밀로이드-결합 화합물에서 형광을 생성하는데 적절한, 파장 성질, 편광 성질 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 갖는 광원으로 눈을 비추는 단계로서, 상기 아밀로이드-결합 화합물이 눈에 도입되고 특히 아밀로이드 형성 장애를 나타내는 아밀로이드 단백질에 결합되는, 단계;
눈의 비춘 결과로서 생성된 형광을 포함하는 빛을 수용하는 단계; 및
적어도 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광에 대해 형광의 시간 붕괴율을 결정하는 단계로서, 상기 결정 단계가 적어도 시간 붕괴율에 근거하여 눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물의 존재를 구별하는 것을 허용하는, 단계를 포함하는,
포유동물의 눈에서 아밀로이드 단백질을 검출하는 방법.
제 42항에 있어서, 적어도 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광에 대해 형광의 강도를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 43항에 있어서, 강도 및 시간 붕괴율 중 하나 이상에 근거하여, 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물의 양을 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 44항 중 어느 한 항에 있어서, 광원으로 눈을 비추는 단계가 펄스 레이저로 눈을 비추는 것을 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 MHz 내지 약 240 MHz의 반복률에서 빛으로 눈을 비추는 것을 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, 약 40 피코초 내지 약 400 피코초 폭의 펄스 폭을 포함하는 빛으로 눈을 비추는 것을 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 47항 중 어느 한 항에 있어서,약 40 MHz의 반복률에서, 약 200 피코초 폭의 펄스 폭을 갖는 빛으로 눈을 비추는 것을 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 48항 중 어느 한 항에 있어서, 눈의 조직으로부터 방출된 자연 형광으로 인한 형광 신호의 증가에 근거하여 눈의 안구 계면의 위치를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 광원에 의한 빛을 사용하여 눈에서 관심 있는 하나 이상의 부위를 샘플링하는 단계로서, 상기 샘플링은 하나 이상의 부위 내에서 점 또는 점들, 면 또는 면들, 또는 체적 또는 체적들 중 하나 이상을 비추는 것 및 형광 방출을 검출하는 것을 포함하는, 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 50항에 있어서, 샘플링이 눈의 하나 이상의 부위를 가로질러 다른 위치들을 샘플링하는 것을 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 51항 중 어느 한 항에 있어서, 눈 내부로의 깊이 방향으로 확장하는 수직 축을 따라 연속적인 면에서, 광원을 사용하여 눈의 평면 스캔을 수행하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 52항 중 어느 한 항에 있어서, (ⅰ) 눈의 해부학적 구조로부터 떨어진 거리, 및 (ⅱ) 강도 측정에서 변화의 검출 중 하나 이상에 근거하여 눈의 핵상의 위치를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 53항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물의 존재를 구별하는 것이, 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물을 눈 조직의 백그라운드 자가형광, 다른 비-특이적 입자들 및 결합되지 않은 아밀로이드-결합 화합물의 자가형광으로부터 구별하는 것을 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 54항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드-결합 화합물; 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물; 및 아밀로이드 단백질 중 하나 이상의 존재 및 하나 이상의 양을 구별하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 55항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드 단백질이 응집체를 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 56항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드 단백질이 프리-아밀로이드 단백질 응집체를 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 57항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드 단백질이 β-아밀로이드를 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 58항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드 형성 장애가 알츠하이머 질병을 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 59항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드-결합 화합물이 분자 회전자를 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 59항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드-결합 화합물이 콩고 레드 또는 콩고 레드 유도체 아밀로이드-결합 화합물; 크리사민 아밀로이드-결합 화합물; 크리사민 유도체 아밀로이드-결합 화합물; 크리사민 G 또는 크리사민 G 유도체 아밀로이드-결합 화합물; 티오플라빈 T 또는 티오플라빈 T 유도체 아밀로이드-결합 화합물; 및 티오플라빈 S 또는 티오플라빈 S 유도체 아밀로이드-결합 화합물 중 하나 이상을 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 61항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 검출된 형광에만 근거하여 아밀로이드 단백질의 존재를 구별하는 것을 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 62항 중 어느 한 항에 있어서, 검출된 형광 발광에 근거하여 아밀로이드-결합 화합물의 눈으로의 전달률을 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 63항 중 어느 한 항에 있어서, 눈의 특정 영역에서 특정한 붕괴율을 갖는 광자의 평균 수를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 64항 중 어느 한 항에 있어서, 검출된 형광에 근거하여 눈에 전달된 아밀로이드-결합 화합물의 공간적 분포를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 65항 중 어느 한 항에 있어서, 검출된 형광에 근거하여 눈의 각막의 계면에서 아밀로이드-결합 화합물의 농도의 기울기를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 66항 중 어느 한 항에 있어서, 검출된 형광에 근거하여 눈의 수양액에서 아밀로이드-결합 화합물의 공간적 분포 및 아밀로이드-결합 화합물의 시간적 분포 중 하나 이상을 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 있어서, 해부학적 구조 또는 하부구조의 일부 또는 전부의 자연 형광 여기에 근거하여 눈의 해부학적 구조 또는 하부구조의 일 차원 이상을 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 68항에 있어서, 일 차원 이상을 결정하는 단계가 구조 또는 하부구조의 두께를 결정하는 것, 구조 또는 하부구조의 모양을 결정하는 것, 및 눈의 하나 이상의 구조 또는 하부구조 사이의 거리를 결정하는 것 중 하나 이상을 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 69항 중 어느 한 항에 있어서, 광검출기 장치를 사용하여 눈에 의해 생성된 형광을 검출하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 70항에 있어서, 광검출기 장치가 포토다이오드, 광전자배증광, 전하-결합 소자, 및 강화된 전하-결합 소자 중 하나 이상을 포함하는 방법.
제 71항에 있어서, 광검출기 장치가 고속 애벌란시 포토다이오드 검출기를 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 72항 중 어느 한 항에 있어서, 눈에 의해 생성된 형광의 시간 상관 개별 광자 계수를 수행하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 73항에 있어서, 시간 상관 개별 광자 계수를 수행하는 단계가, 시간 채널 유닛의 함수로서 광자 계수의 분포에 근거하여 형광의 시간 붕괴율 및 광원을 펄싱 (pulsing)하는 것을 결정하는 것을 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 74항 중 어느 한 항에 있어서,
여기된 자연 형광을 결정하고 이로 인해 눈에서 관심 있는 하나 이상의 부위를 결정하기 위해 눈 내에서 스캔하는 단계; 및
광원에 의한 빛을 사용하여 눈에서 관심 있는 하나 이상의 부위를 샘플링하는 단계로서, 상기 샘플링이 하나 이상의 부위 내에서 점 또는 점들, 면 또는 면들, 또는 체적 또는 체적들 중 하나 이상에 비추는 것을 포함하는, 단계를 포함하고,
상기 샘플링 단계는 하나 이상의 샘플링된 부위 내에서 적어도 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광에 대해 형광의 강도 및 형광의 시간 붕괴율을 결정하기 위한 것인, 방법.
제 42항 내지 제 75항 중 어느 한 항에 있어서,
축 스캔의 각각의 지점을 따라 여기된 자연 형광을 결정하고 이로 인해 눈에서 관심 있는 하나 이상의 위치를 결정하기 위해 눈 내부로의 깊이 방향으로 축 스캔을 수행하는 단계; 및
축 스캔의 방향과 수직인 연속적인 면에서, 광원을 사용하여 눈의 평면 스캔을 수행하여, 각각의 평면 스캔의 각각의 지점에서 적어도 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광에 대해 형광의 강도 및 형광의 시간 붕괴율을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 76항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드 형성 장애를 나타내는 아밀로이드 단백질에 대해 눈 내에서 실시간 서치를 가능하게 하는 방법.
제 42항 내지 제 77항 중 어느 한 항에 있어서, 눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 대한 형광 여기 스펙트럼의 피크 부위에 대해 적절한 파장의 빛으로 눈을 비추는 단계; 및
눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 대한 형광 방출 스펙트럼의 피크 부위에 대해 적절한 파장의 눈으로부터 수용된 빛을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 78항에 있어서, 아밀로이드-결합 화합물이 화합물 #11인 방법.
제 78항 또는 제 79항에 있어서, 여기 스펙트럼이 약 470 nm의 피크를 갖고, 눈을 비추는 단계가 여기 스펙트럼의 피크의 ± 약 20 nm 내의 파장에 있으며, 방출 스펙트럼이 약 580 nm의 피크를 갖고, 눈으로부터 수용된 빛을 검출하는 단계가 방출 스펙트럼의 피크의 ± 약 20 nm 내의 파장에 있는 방법.
제 42항 내지 제 80항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드 단백질이 아밀로이드 형성 장애를 나타내는 방법.
눈에 도입되고 특히 아밀로이드 형성 장애를 가리키는 아밀로이드 단백질에 결합된, 아밀로이드-결합 화합물이 아밀로이드 형성 장애를 가리키는 아밀로이드 단백질에 결합될 때 각각의 아밀로이드-결합 화합물 이상으로 형광 발광을 생성하는데 적절한, 파장 성질, 편광 성질 또는 이들의 조합 중 어느 하나 이상을 추가로 포함하는, 광원으로 포유동물의 눈을 비추는 단계;
눈의 빛을 비춘 결과로서 생성된 형광 발광을 포함하는 빛을 받는 것; 및
아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광 발광 이상으로 형광 발광의 시간 붕괴율을 결정하는, 여기서 결정하는 것은 시간 붕괴율 이상에 근거하여 눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물의 존재를 구별하는 것을 허용하는 단계;
여기서 결합의 정상적인 제어 수준에 비교하면 눈에서 아밀로이드 단백질에의 아밀로이드-결합 화합물의 결합의 증가는 아밀로이드 형성 장애의 진단, 또는 포유 동물에서 아밀로이드 형성 장애를 발생시킬 위험을 나타내는 단계를 포함하는,
포유 동물에서 아밀로이드 형성 장애 또는 이의 소인 (predisposition)을 진단하는 방법.
제 82항에 있어서, 아밀로이드 형성 장애가 알츠하이머 질병인 방법.
각각의 눈의 해부학적 구조에서 자연 형광을 생성하는데 적절한, 파장 성질, 편광 성질 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 갖는 광원으로 눈을 비추는 단계; 및
광원으로 비춤에 의해 생성되는 자연 형광의 강도의 최대 변화가 있는 눈 내의 위치를 결정하는 단계로서, 상기 결정 단계가 자연 형광의 강도의 최대 변화가 있는 위치에 근거하여 해부학적 구조를 식별하는 것을 허용하는 단계를 포함하는,
포유동물의 눈의 해부학적 구조를 식별 (identifying)하는 방법.
제 84항에 있어서, 해부학적 구조는 눈의 전방 구역의 해부학적 구조를 포함하는 방법.
제 84항 또는 제 85항에 있어서, 해부학적 구조를 식별하는 것은 해부학적 계면의 위치를 결정하는 것을 포함하는 방법.
제 86항에 있어서, 해부학적 계면의 위치를 결정하는 것은 자연 형광의 강도의 최대 증가가 있는 위치를 결정하는 것에 근거하여 눈의 수정체 피막의 계면의 위치를 결정하는 것을 포함하는 방법.
제 84항 내지 제 87항 중 어느 한 항에 있어서, 해부학적 구조를 식별하는 것이, 눈에서 광원에 의해 생성된 자연적 형광 발광에 근거하여 눈의 수정체의 하나 이상의 하부구조의 두께와 모양 중 하나 이상, 각막 두께, 각막 모양, 수양액 깊이, 수정체 모양, 및 수정체 두께 중 하나 이상을 결정하는 것을 포함하는 방법.
제 88항에 있어서, 렌즈의 하나 이상의 하부구조가 눈의 수정체 피막, 피질, 핵상 및 핵 중 하나 이상을 포함하는 방법.
제 84항 내지 제 89항 중 어느 한 항에 있어서, 해부학적 구조를 식별하는 것이 눈의 둘 이상의 해부학적 구조 사이의 안구 내 거리를 결정하는 것을 포함하는 방법.
제 84항 내지 제 90항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물의 눈에서 아밀로이드 형성 장애를 나타내는 아밀로이드 단백질을 검출하기 위해 광원을 사용하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 91항에 있어서,
눈에 도입되고 특히 아밀로이드 형성 장애를 가리키는 아밀로이드 단백질에 결합된, 아밀로이드-결합 화합물이 아밀로이드 형성 장애를 가리키는 아밀로이드 단백질에 결합될 때 각각의 아밀로이드-결합 화합물 이상으로 형광 발광을 생성하는데 적절한, 파장 성질, 편광 성질 또는 이들의 조합 중 어느 하나 이상을 추가로 포함하는, 광원으로 포유동물의 눈을 비추는 단계;
눈을 비춘 결과로 생성된 형광 발광을 포함하는 빛을 수용하는 단계; 및
아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광 발광 이상으로 형광 발광의 시간 붕괴율을 결정하는, 여기서 결정하는 것은 시간 붕괴율 이상에 근거하여 눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물의 존재를 구별하는 것을 허용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 92항에 있어서, 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물의 존재를 구별하는 것이, 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물을 눈 조직의 백그라운드 자가형광, 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물, 다른 비-특이적 입자들 및 결합되지 않은 아밀로이드-결합 화합물의 자가형광으로부터 구별하는 것을 포함하는 방법.
제 84항 내지 제 93항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드 형성 장애를 나타내는 아밀로이드 단백질에 대해 눈 내에서 실시간 서치를 가능하게 하는 방법.
제 84항 내지 제 94항 중 어느 한 항에 있어서,
눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 대한 형광 여기 스펙트럼의 피크 부위에 대해 적절한 파장의 빛으로 눈을 비추는 단계; 및
눈에서 아밀로이드 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 대한 형광 방출 스펙트럼의 피크 부위에 대해 적절한 파장의 눈으로부터 수용된 빛을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 95항에 있어서, 아밀로이드-결합 화합물이 화합물 #11인 방법.
제 95항 또는 제 96항에 있어서, 여기 스펙트럼은 약 470 nm의 피크를 갖고, 눈을 비추는 단계가 여기 스펙트럼의 피크의 ± 약 20 nm 내의 파장에 있으며, 방출 스펙트럼은 약 580 nm의 피크를 갖고, 눈으로부터 수용된 빛을 검출하는 단계가 방출 스펙트럼의 피크의 ± 약 20 nm 내의 파장에 있는 방법.
제 42항 내지 제 81항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 시간 붕괴율에 근거하여 유사한 형광 스펙트럼을 지닌 두 개 이상의 다른 형광체들 간에 구별하는 것을 허용하는 방법으로서, 상기 유사한 형광 스펙트럼이 방출 스펙트럼 및 여기 스펙트럼에 하나 이상의 유효한 중복부를 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 81항 중 어느 한 항에 있어서, 2차원에서 하나 이상의 형광체의 형광 강도 및 수명 감쇠 (lifetime decay) 중 하나 이상의 분포를 나타내는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 81항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 형광체의 형광 강도 및 수명 감쇠 중 하나 이상에 근거하여, 결합된 광자의 수 및 결합되지 않은 광자의 수를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 100항에 있어서, 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물 및 단백질에 결합되지 않은 아밀로이드-결합 화합물의 형광 강도 및 수명 감쇠의 분포를 2차원으로 나타내는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 101항에 있어서, 스캐너 및 레이저 중 하나 이상으로 2차원으로 나타내는 것을 동시에 발생시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 81항 중 어느 한 항에 있어서, 눈의 특정 영역에 걸쳐, 특정 수명 감쇠와 관련된, 형광 강도를 평균 냄으로써 파라미터를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 42항 내지 제 81항 중 어느 한 항에 있어서, 눈 내에서 기준점을 결정하기 위해 공초점 경로를 따라 일직선 광원과 눈을 나란히 만드는 것을 추가로 포함하는 방법.
안구 조직에 도입되고 특히 단백질에 결합된, 아밀로이드-결합 화합물이 단백질에 결합될 때 각각의 아밀로이드-결합 화합물 이상으로 형광 발광을 생성하는 데 적절한, 파장 성질, 편광 성질 또는 이들의 조합 중 어느 하나 이상을 가지는, 광원으로 안구 조직을 비추는 단계;
눈을 비춘 결과로 생성된 형광 발광을 포함하는 빛을 수용하는 단계; 및
단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물에 의해 생성된 형광 발광 이상의 형광 발광의 시간 붕괴율을 결정하는, 여기서 결정하는 것은 시간 붕괴율 이상에 근거하여 안구 조직에서 단백질에 결합된 아밀로이드-결합 화합물의 존재를 구별하는 단계를 허용하는 것을 포함하는,
안구 조직에서 단백질 상에 결합된 형광체를 결정하는 방법.