KR20130129193A - 개선된 링커를 구비한 아마톡신-접합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 종양 치료법에 관한 것이다. 일 측면에서, 본 발명은, 암의 치료에 유용한, 우레아 모이어티를 포함하는 링커에 의해 연결된, 아마톡신과 표적-결합성 모이어티, 예컨대 항체의 접합체에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본 발명은 상기한 접합체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

개선된 링커를 구비한 아마톡신-접합체 {AMATOXIN-CONJUGATES WITH IMPROVED LINKERS}
본 발명은 종양 치료법에 관한 것이다. 일 측면에서, 본 발명은, 암 치료에 사용가능한, 우레아 모이어티를 포함하는 링커로 연결된, 아마톡신과 표적-결합성 모이어티, 예컨대 항체의 접합체에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본 발명은 이러한 접합체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
아마톡신은 8개의 아미노산으로 구성된 고리형 펩타이드이다. 이것은 아마니타 팔로이데스(Amanita phalloides) 버섯으로부터 분리하거나 합성을 통해 제조할 수 있다. 아마톡신은 포유류 세포의 DNA-의존적인 RNA 중합효소 II를 특이적으로 저해하며, 또한 감염된 세포의 전사와 단백질 생합성을 저해한다. 세포에서의 전사 저해는 생장과 증식의 정지를 야기한다. 아마니틴과 RNA-중합효소 II 간의 복합체는, 공유 결합으로 결합되진 않지만, 매우 견고한 편이다 (KD = 3 nM). 아마니틴이 효소로부터 해리되는 과정은 매우 느리므로, 감염된 세포는 회복되기 어렵다. 전사 저해가 매우 장기간 지속되게 되면, 세포는 프로그래밍된 세포 사멸 (세포자살)을 겪게 될 것이다.
종양 치료법에 있어, 항-Thy 1.2 항체를, 디아조 반응(diazotation)을 통해 디아조 Trp (아미노산 4; 도 1 참조)의 인돌 고리에 부착된 링커를 이용하여 α-아마니틴에 커플링함으로써, 아마톡신을 세포독성 모이어티로서 사용하는 방법이 1981년도에 이미 활용된 바 있다 (Davis & Preston, Science 1981, 213, 1385-1388).
특허 출원 EP 1 859 811 A1 (2007년 11월 28일 공개)에서는, β-아마니틴의 아미톡신 1번 아미노산 1의 γ C-원자가, 직접, 즉 링커 구조없이, 단일클론 항체 HEA125, OKT3 또는 PA-1에 커플링된, 접합체를 개시하였다. 아울러, 유방암 세포 (MCF-7), 버킷 림프종 세포 (Raji) 및 T-림프종 세포 (Jurkat)의 증식에 대한 이들 접합체의 저해 효과도 입증되었다. 아미드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설파이드, 우레아, 티오우레아, 탄화수소 모이어티 등과 같은 인자를 비롯한 링커를 포함한, 링커들을 사용하는 예가 제안되어 왔지만, 이러한 구조체들은 실제 입증된 바 없으며, 아마톡신에서의 부착 지점과 같은 보다 상세한 내용들이 제공되어 있지 않다.
아마톡신은 항체 분자와 같은 큰 생분자 담체에 결합되었을 때 상대적으로 무독성이며, 상기 생분자 담체가 절단된 후에만 이의 세포독성 활성을 발휘하는 것으로 알려져 있다. 아마톡신은, 특히 간 세포에 대한 독성 측면에서, 표적화된 종양 치료용 아마톡신 접합체들이 투여된 후 혈장에서 매우 안정적으로 유지되고, 표적 세포에 내재화된 후 아마톡신으로 방출되는 것이 가장 중요하다. 이러한 맥락에서, 접합체 안정성에 대한 최소한의 개선이 치료학적 접근을 위한 아마톡신 접합체의 치료 윈도우(therapeutic window)와 안전성에 상당한 성과를 가져다 줄 수 있다.
이에, 종래 기술 분야에서는, 혈장에서 안정적이며, 비-표적 세포에 대한 유해한 부작용이 최소화된, 표적-결합성 모이어티 아마톡신 접합체가 절실히 요구되고 있다.
제1 측면에서, 본 발명은, 링커 L을 통해 아마톡신과 연결된 표적-결합성 모이어티를 포함하며,
상기 링커 L이,
(i) 아마톡신 1번 아미노산의 γ C-원자를 통해, 특히 아미드 결합을 통해;
(ii) 아마톡신 3번 아미노산의 δ C-원자에 결합된 산소 원자를 통해, 특히 에스테르 결합, 에테르 결합 또는 우레탄 결합을 통해; 또는
(iii) 아마톡신 4번 아미노산의 6' C-원자를 통해, 특히 아마톡신 4번 아미노산의 6' C-원자에 결합된 산소 원자를 통해, 아마톡신과 연결되며,
각 경우에, 링커 L이 우레아 모이어티를 통해 표적-결합성 모이어티와 연결된, 접합체에 관한 것이다.
제2 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 접합체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은,
(i) 아마톡신 1번 아미노산의 γ C-원자를 통해, 특히 아미드 결합을 통해;
(ii) 아마톡신 3번 아미노산의 δ C-원자에 결합된 산소 원자를 통해, 특히 에스테르 결합, 에테르 결합 또는 우레탄 결합을 통해; 또는
(iii) 아마톡신 4번 아미노산의 6' C-원자를 통해, 특히 아마톡신 4번 아미노산의 6' C-원자에 결합된 산소 원자를 통해, 아마톡신과 연결된 링커 L을 포함하며,
각 경우에, 링커 L이 카르밤산 유도체 -NH-C(O)-X를 포함하며, X가 표적-결합성 모이어티의 1차 아민으로 치환될 수 있는 이탈기인, 아마톡신-접합체 분자에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 아마톡신-접합체 분자를 1차 아미노기를 포함하는 표적-결합성 모이어티와 반응시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 접합체의 합성 방법에 관한 것이다.
도 1은 여러가지 아마톡신 구조식을 나타낸 것이다. 굵은 글씨체의 숫자 (1 - 8)는 아마톡신을 구성하는 8개의 아미노산을 표준적인 방식으로 번호 지정한 것이다. 아미노산 1, 3 및 4에서 원자에 대한 표준적인 표기도 나타낸다 (각각 그리스 문자 α - γ, 그리스 문자 α - δ 및 숫자 1' - 7')
도 2는 72시간 인큐베이션한 후 BrdU 분석을 통해 SKOV-3 세포에 대한 여러가지 링커 모이어티를 이용한 여러가지 아마니틴 헤르셉틴 접합체의 세포독성 활성을 나타낸 것이다.
도 3은 72시간 인큐베이션한 후 BrdU 분석을 통해 SK-BR-3 세포에 대한 여러가지 링커 모이어티를 이용한 여러가지 아마니틴 헤르셉틴 접합체의 세포독성 활성을 나타낸 것이다.
도 4는 72시간 인큐베이션한 후 BrdU 분석을 통해 NCI-N87 세포에 대한 여러가지 링커 모이어티를 이용한 여러가지 아마니틴 헤르셉틴 접합체의 세포독성 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 72시간 인큐베이션한 후 BrdU 분석을 통해 MDA-MB231 세포에 대한 여러가지 링커 모이어티를 이용한 여러가지 아마니틴 헤르셉틴 접합체의 세포독성 활성을 나타낸 것이다.
도 6 및 도 7은 최대 14일간 혈장내에서 인큐베이션한 후 여러가지 링커 모이어티를 이용한 여러가지 아마니틴 헤르셉틴 접합체로부터 방출되는 아마니틴의 양을 나타낸 것이다.
도 8은 혈장 인큐베이션한 후 BrdU 분석을 통해 SKOV-3 세포에 대한 여러가지 링커 모이어티를 이용한 여러가지 아마니틴 헤르셉틴 접합체의 세포독성 활성을 비교하여 나타낸 것이다.
도 9는 생체내 SKOV-3 이종이식 모델에서 여러가지 링커 모이어티를 이용한 2종의 아마니틴 헤르셉틴 접합체의 활성을 비교하여 나타낸 것이다.
본 발명을 아래에서 상세하게 기술하기 전에, 본원에 기술된 특정 방법, 프로토콜 및 시약들은 변경될 수 있으므로, 본 발명이 이들로 한정되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어는 단순히 구체적인 구현예들을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하기 위한 의도가 아니며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항으로만 규정됨을 이해하여야 한다. 달리 기술되지 않은 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 당해 기술 분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다.
바람직하게는, 본원에 사용되는 용어들은 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)에 기재된 바와 같이 정의된다.
본 명세서와 후술되는 청구항 전체에서, 문맥상 다르지 않은 한, "포함한다"라는 용어와 "포함한다" 및 "포함하는" 등의 변형어는 언급된 정수, 단계, 정수들의 그룹 또는 단계들의 그룹을 포함하는 내포하는 것으로 이해되며, 임의의 다른 정수, 단계, 정수들의 그룹 또는 단계들의 그룹의 배제를 내포하는 것으로 이해되지 않을 것이다.
본 명세서 도체에서 수종의 문헌들이 인용된다. 본원에 인용된 (모든 특허, 특허 공개, 과학 관련 간행물, 제조사의 설명서, 지침서, 유전자은행 등재 번호 서열 제출을 비롯하여) 문헌들은 각각 상기 또는 하기에서, 관련 특허법에 입각하여 가능한 수준으로 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 발명은 종래 발명으로 인해 이러한 내용을 선행할 권한이 없다는 용인으로서 해석되진 않는다.
이제 본 발명을 상세하게 기술한다. 아래 내용들에서, 본 발명의 여러가지 측면들이 보다 구체적으로 규정된다. 규정된 각 측면들은 상반되게 명시되어 있지 않은 한 임의의 다른 측면 또는 측면들과 조합될 수 있다. 구체적으로, 바람직하거나 유리한 것으로 언급된 임의의 특징은 바람직하거나 또는 유리한 것으로 언급된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
제1 측면에서, 본 발명은, 링커 L을 통해 아마톡신과 연결된 표적-결합성 모이어티를 포함하며,
상기 링커 L이
(i) 아마톡신 1번 아미노산의 γ C-원자를 통해, 특히 아미드 결합을 통해;
(ii) 아마톡신 3번 아미노산의 δ C-원자에 결합된 산소 원자를 통해, 특히 에스테르 결합, 에테르 결합 또는 우레탄 결합을 통해; 또는
(iii) 아마톡신 4번 아미노산의 6' C-원자를 통해, 특히 아마톡신 4번 아미노산의 6' C-원자에 결합된 산소 원자를 통해, 아마톡신과 연결되며,
각 경우에, 링커 L이 우레아 모이어티를 통해 표적-결합성 모이어티와 연결된, 접합체에 관한 것이다.
본 발명의 내용에서, 용어 "접합체"는 공유 결합에 의해 2 이상의 다른 분자가 연결된 분자를 지칭한다.
용어 "표적-결합성 모이어티"는, 본원에서, 표적 분자 또는 표적 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자 또는 분자의 일부를 지칭한다. 본 발명에서, 바람직한 표적-결합성 모이어티는, (i) 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (ii) 항체-유사 단백질; 및 (iii) 핵산 앱타머이다. 본 발명에 사용하기 적합한 "표적-결합성 모이어티"는 전형적으로 분자량이 40 000 Da (40 kDa) 이상이다.
본원에서, 제1 화합물 (예, 항체)은, 제2 화합물에 대한 해리 상수 KD가 100 μM 미만, 바람직하게는 50 μM 미만, 바람직하게는 30 μM 미만, 바람직하게는 20 μM 미만, 바람직하게는 10 μM 미만, 바람직하게는 5 μM 미만, 더 바람직하게는 1 μM 미만, 더 바람직하게는 900 nM 미만, 더 바람직하게는 800 nM 미만, 더 바람직하게는 700 nM 미만, 더 바람직하게는 600 nM 미만, 더 바람직하게는 500 nM 미만, 더 바람직하게는 400 nM 미만, 더 바람직하게는 300 nM 미만, 더 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 더 바람직하게는 100 nM 미만, 보다 더 바람직하게는 90 nM 미만, 보다 더 바람직하게는 80 nM 미만, 보다 더 바람직하게는 70 nM 미만, 보다 더 바람직하게는 60 nM 미만, 보다 더 바람직하게는 50 nM 미만, 보다 더 바람직하게는 40 nM 미만, 보다 더 바람직하게는 30 nM 미만, 보다 더 바람직하게는 20 nM 미만, 보다 더 바람직하게는 10 nM 미만인 경우, 제2 화합물 (예, 항원, 예컨대 표적 단백질)에 "특이적으로 결합"하는 것으로 간주된다.
본 발명에서, 용어 "표적 분자" 및 "표적 에피토프"는 각각 표적-결합성 모이어티에 특이적으로 결합하는, 항원 및 항원의 에피토프 각각을 지칭한다. 바람직하게는, 표적 분자는 종양-관련 항원, 특히, 비-종양 세포의 표면에 비해, 한가지 이상 유형의 종양 세포의 표면에 증가된 농도 및/또는 다른 입체 구조로 존재하는, 항원 또는 에피토프를 지칭한다. 바람직하게는, 상기 항원 또는 에피토프는 비-종양 세포의 표면이 아닌 한가지 이상 유형의 종양 세포의 표면에 존재한다. 특정 구현예에서, 표적-결합성 모이어티는 HER-2/neu 또는 표피 부착 분자 (EpCAM)의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 상기 항원 또는 에피토프는 자가면역 질환에 관여하는 세포 상에 선호적으로 발현된다. 구체적인 이러한 구현예에서, 표적-결합성 모이어티는 IL-6 수용체 (IL-6R)의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
용어 "항체 또는 이의 항원 결합 단편"은, 본원에서, 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역 활성부, 즉, 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합부를 포함하는 분자를 지칭한다. 또한, 표적 분자, 예컨대 표적 단백질 Her-2/neu 또는 EpCAM에 특이적으로 결합하기 위해, 예컨대 파지 디스플레이 등의 기법을 통해 선별되는 면역글로불린-유사 단백질을 포함한다. 본 발명의 면역글로불린 분자는 면역글로불린의 모든 타입 (예, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 (예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 것일 수 있다. 본 발명에 사용하기 적합한 "항체 및 이의 항원 결합 단편"은 다클론, 단일클론, 일가, 2중 특이적인, 헤테로접합체, 다중 특이적인, 인간, 인간화된 (특히 CDR-그래프트형), 탈면역화된(deimmunized) 또는 키메라 항체, 단쇄 항체 (예, scFv), Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab 발현 라이브러리에서 제조되는 단편, 다이아바디(diabodiy) 또는 테트라바디 (tetrabody) (Holliger P. et al., 1993), 나노바디, 항-이디오타입(anti-idiotypic) (anti-Id) 항체 (예로, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체) 및 전술한 임의의 것의 에피토프-결합성 단편을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 항원-결합 단편은 본 발명의 인간 항원-결합 단편이며, 비제한적으로 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단쇄 Fvs (scFv), 단쇄 항체, 이황화 결합으로 연결된 Fvs (dsFv) 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편을 포함한다. 단쇄 항체를 비롯한, 항원-결합 항체 단편은, 가변 도메인(들)을 단독으로 또는 힌지부, CL, CH1, CH2, 및 CH3 도메인 전체나 힌지부, CL, CH1, CH2, 및 CH3 도메인의 일부와 조합하여 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 힌지부, CL, CH1, CH2, 및 CH3 도메인과 가변 도메인(들)의 임의 조합을 또한 포함하는, 항원-결합 단편을 포함한다.
본 발명에서 사용가능한 항체는 조류 및 포유류 등의 모든 동물 기원으로부터 유래된 것일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 인간, 설치류 (예, 마우스, 랫, 기니아피그 또는 토끼), 닭, 돼지, 양, 염소, 카멜, 소, 말, 당나귀, 고양이 또는 개 기원으로부터 유래된다. 특히 바람직하게는, 항체는 인간 또는 설치류 기원의 항체이다. 본원에서, "인간 항체"는, 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 가진 항체를 포함하며, 예컨대 Kucherlapati & Jakobovits의 미국 특허 5,939,598에 기술된 바와 같이, 내인성 면역글로불린을 발현하지 않으며, 한가지 이상의 인간 면역글로불린에 대한 형질전환 동물 또는 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 분리된 항체를 포함한다.
용어 "항체-유사 단백질"은 표적 분자에 특이적으로 결합하도록 (루프의 돌연변이 유발에 의해) 조작된 단백질을 지칭한다. 전형적으로, 이러한 항체-유사 단백질은 적어도 단백질 스캐폴드에 양 말단에서 부착된 하나 이상의 가변 펩타이드를 포함한다. 이러한 이중적인 구조 제약은 항체의 결합 친화성에 상응하는 수준으로 항체-유사 단백질의 결합 친화성을 크게 증가시킨다. 가변 펩타이드 루프의 길이는 전형적으로 아미노산 10 내지 20개로 구성된다. 스캐폴드 단백질은 용해 특성이 우수한 임의의 단백질일 수 있다. 바람직하게는, 스캐폴드 단백질은 소형 구상 단백질(globular protein)이다. 항체-유사 단백질은 비제한적으로 아피바디(affibody), 안티칼린(anticalin) 및 설계된 안키린 반복 단백질(designed ankyrin repeat protein)을 포함한다 (리뷰로서 Binz et al. 2005를 참조함). 항체-유사 단백질은 다수 돌연변이 라이브러리로부터 유래될 수 있으며, 예를 들어 다수 파지 디스플레이 라이브러리로부터 추출될 수 있으며, 레귤러 항체와 유사하게 분리할 수 있다. 또한, 항체-유사 결합 단백질은 구상 단백질에서 표면-노출형 잔기를 조합적으로 돌연변이 유발함으로써 수득할 수 있다.
용어 "핵산 앱타머"는 시험관내 선별 또는 SELEX (기하급수적인 농화에 의한 체계적인 리간드 진화)를 반복 수행하여, 표적 분자에 결합하도록 조작된 핵산 분자를 지칭한다 (리뷰로서 Brody and Gold, 2000을 참조함). 핵산 앱타머는 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 앱타머는 변형, 예컨대, 2'-플루오로-치환된 피리미딘과 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본원에서, 화합물의 "화학적 유도체" (또는 짧게, "유도체")는 화합물과 유사한 화학적 구조를 가지나, 화합물에 존재하지 않는 하나 이상의 화학적 기를 포함하거나 및/또는 화합물에 존재하는 하나 이상의 화학적 기가 결여된, 종들을 지칭한다. 유도체기 비교되는 화합물을 "모" 화합물이라고 한다. 전형적으로, "유도체"는 하나 이상의 화학 반응 단계들로 모 화합물로부터 제조될 수 있다.
본원에서, 화합물의 "유사체"는 화합물과 구조적으로 비슷하지만 동일하진 않으며, 화합물의 한가지 이상의 활성을 나타낸다. 유사체와 비교되는 화합물을 "모" 화합물이라고 한다. 전술한 활성으로는, 다른 화합물에 대한 결합 활성; 저해 활성, 예컨대 효소 저해 활성; 독성 효과; 활성화 활성, 예컨대, 효소-활성화 활성을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 유사체가 반드시 모 화합물과 동일한 수준으로 활성을 나타내는 것은 아니다. 화합물이 모 화합물의 활성에 대해 적어도 1% (더 바람직하게는 적어도 5%, 더 바람직하게는 적어도 10%, 더 바람직하게는 적어도 20%, 더 바람직하게는 적어도 30%, 더 바람직하게는 적어도 40%, 더 바람직하게는 적어도 50%) 수준의 상대적인 활성을 나타내는 경우, 이 화합물은 본 발명에서 유사체로서 간주된다. 즉, "아마톡신 유사체"는 본원에서 α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린 및 도 1에 나타낸 아마눌린산 중 임의의 것과 구조적으로 관련있으며, α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린, 및 아마눌린산 중 적어도 한가지와 비교하여, 포유류 RNA 중합효소 II에 대해 적어도 1% (더 바람직하게는 적어도 5%, 더 바람직하게는 적어도 10%, 더 바람직하게는 적어도 20%, 더 바람직하게는 적어도 30%, 더 바람직하게는 적어도 40%, 더 바람직하게는 적어도 50%)의 저해 활성을 가지는 화합물을 지칭한다. 본 발명에 사용하기 적합한 "아마톡신 유사체"는 α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린, 또는 아마눌린산 중 임의의 한가지에 비해 포유류 RNA 중합효소 II에 대해 심지어 더 우수한 저해 활성을 나타낼 수도 있다. 저해 활성은 50% 저해가 이루어지는 농도(IC50 값)를 결정함으로써 정해질 수 있다. 포유류 RNA 중합효소 II에 대한 저해 활성은 세포 증식에 대한 저해 활성을 측정함으로써 간접적으로 정할 수 있다. 세포 증식의 저해를 측정하는데 적합한 분석은 실시예들에 기술되어 있다.
"반합성 유사체"는 출발 물질로서 천연 소스 (예, 식물 물질, 박테리아 배양물 또는 세포 배양물) 유래의 화합물을 이용하여 화학 합성함으로써 수득하는 유사체를 지칭한다. 전형적으로, 본 발명의 "반합성 유사체"는 아마니타 (Amanita) 과의 버섯으로부터 분리한 화합물에서 출발하여 합성된다. 반면, "합성 유사체"는 소형 (전형적으로 석유 화학) 빌딩 블록으로부터 소위 전 합성(total synthesis)에 의해 합성한 유사체를 지칭한다. 통상적으로, 이러한 전 합성은 생물학적 공정의 보조 없이 이루어진다.
본원에서, "앱타머 접합체"는 표적-결합성 모이어티가 상기 대안적인 (iii)에 따른 핵산 앱타머인 표적-결합성 모이어티 톡신(toxin)을 지칭한다.
본 발명의 내용에서 "링커"는, 각각 링커의 한쪽 말단에 부착되며, 2가지 성분 간의 거리를 넓히고, 이들 2가지 성분, 예컨대 본 발명의 경우 표적-결합성 모이어티와 아마톡신 간의 입체적 간섭을 완화시키는, 2가지 성분을 연결하는 분자를 지칭한다. 링커가 없는 경우, 아마톡신과 표적-결합성 모이어티의 직접 연결은 아미톡신과 RNA 중합효소 II의 상호작용력을 떨어뜨릴 수 있다. 특정 구현예에서, 링커는 벡본에 1 - 30개의 원자(예, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 원자)로 구성된 연속 사슬을 가지며, 즉, 링커의 길이는, 링커 벡본의 한쪽은 아마톡신과 반응하고, 다른 한쪽은 표적-결합성 모이어티와 반응한 아마톡신 모이어티와 표적-결합성 모이어티에서, 이들 사이의 원자 또는 결합의 수로 측정되는 최단 길이의 연결로 정의된다. 본 발명의 맥락에서, 링커는, 바람직하게는, 선택적으로 치환된, C1-20-알킬렌, C1-20-헤테로알킬렌, C2-20-알케닐렌, C2-20-헤테로알케닐렌, C2-20-알키닐렌, C2-20-헤테로알키닐렌, 사이클로알킬렌, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 아랄킬렌 또는 헤테로아랄킬렌기이다. 링커는 카르복사미드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설파이드, 우레아, 티오우레아, 탄화수소 모이어티 등의 하나 이상의 구조 모이어티를 포함할 수 있다. 링커는, 또한, 이들 구조 인자들의 2 이상의 조합을 포함할 수 있다. 이들 구조 요소들은 각각 2회 이상, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6회 이상 링커에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 이황화 결합을 포함할 수 있다. 링커는 한 단계 또는 2 단계 이상의 후속적인 단계로 아마톡신 및 표적-결합성 모이어티에 결합되어야 하는 것으로 이해된다. 이를 위해, 링커는, (i) 연결시킬 성분들 중 하나에 존재하는 기, 바람직하게는 아마톡신 또는 표적 결합성-펩타이드 상의 활성화된 기와 공유 결합을 형성할 수 있거나, 또는 (ii) 아마톡신 상의 기와 공유 결합을 형성하도록 활성화되거나 활성화될 수 있는, 2개의 기를, 바람직하게는 근단부 및 원단부에 가질 것이다. 따라서, 그러한 커플링 반응, 예컨대 에스테르, 에테르, 우레탄, 펩타이드 결합 등의 결과인, 화합물 기들이, 링커의 근단부와 원단부에 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "아마톡신"은 아마니타 속으로부터 분리되고 Wieland, T. and Faulstich H. (Wieland T, Faulstich H., CRC Crit Rev Biochem. 1978 Dec;5(3):185-260)에 기술된 바와 8개의 아미노산으로 구성된 모든 환형 펩타이드를 포함하며, 아울러 이의 모든 화학적 유도체; 추가적인 이의 모든 반합성 유사체; 천연 화합물의 마스터 구조(환형, 아미노산 8개)에 따라 빌딩 블럭으로부터 구축된 추가적인 이의 전 합성 유사체, 수산화된 아미노산 대신 비-수산화된 아미노산을 포함하는 이의 추가적인 전 합성 또는 반합성 유사체, 티오에테르 설폭사이드 모이어티가 설파이드, 설폰으로 또는 황과 다른 원자, 예컨대 아마니틴의 카라-유사체에서와 같은 탄소 원자로 치환된 추가적인 전 합성 또는 반합성 유사체를 포함하며, 각 경우에 임의의 상기한 유도체 또는 유사체는 포유류 RNA 중합효소 II를 저해함으로써 기능적으로 활성을 나타낸다.
기능적으로, 아마톡신은 포유류의 RNA 중합효소 II를 저해하는 펩타이드 또는 뎁시펩타이드로서 정의된다. 바람직한 아마톡신은 상기에서 정의된 바와 같이 링커 분자 또는 표적-결합성 모이어티와 반응할 수 있는 관능기 (예, 카르복실기, 아미노기, 하이드록실기, 티올기 또는 티올-포착기)를 구비한 것이다. 본 발명의 접합체에 특히 적합한 아마톡신은 α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린, 및 도 1에 도시된 아마눌린산, 뿐만 아니라 이의 화학 유도체, 반합성 유사체 및 합성 유사체이다. 본 발명에 사용하기 특히 바람직한 아마톡신은 α-아마니틴, β-아마니틴, 및 아마닌아미드이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "우레아 모이어티를 경유하여 표적-결합성 모이어티와 연결되는"은 표적-결합성 모이어티가 -NH-C(O)-NH- 기를 경유하여 링커에 직접 부착되는, 링커와 표적-결합성 모이어티 간의 연결을 의미한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 접합체는 하기 구조들 중 하나로부터 선택되는 구조를 취한다:
아마톡신-γC(O)-NH-L-NH-C(O)-NH-표적-결합성 모이어티;
아마톡신-δC-O-C(O)-L-NH-C(O)-NH-표적-결합성 모이어티;
아마톡신-δC-O-L-NH-C(O)-NH-표적-결합성 모이어티;
아마톡신-δC-O-C(O)-NH-L-NH-C(O)-NH-표적-결합성 모이어티; 및
아마톡신-6'C-O-L-NH-C(O)-NH-표적-결합성 모이어티.
본 발명의 특정 구현예에서, 표적-결합성 모이어티는 표적-결합성 모이어티에 존재하는 아미노기를 경유하여 링커 L에 연결되며, 이때 상기 아미노기는 우레아 모이어티의 일부를 형성한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 아마톡신은 α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린, 또는 아마눌린 산, 또는 이들의 염 또는 유사체로부터 선택된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 링커 L은 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 사이클로알킬렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 헤테로알키닐렌, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 아랄킬렌, 및 헤테로아랄킬렌 기로 구성된 리스트로부터 선택되되, 각각의 기가 신택적으로 독립적으로 치환되는, 하나 이상의 기, 특히 1, 2 또는 3개의 기를 포함한다.
용어 "알킬렌"은 탄소 원자 1-10개를 가지는 기를 비롯하여 탄소 원자 1-20개를 가지는 2가 직쇄 포화형 탄화수소기를 지칭한다. 임의 구현예에서, 알킬렌기는 저급 알킬렌기일 수 있다. 용어 "저급 알킬렌"은 탄소 원자 1-6개를 가지는 알킬렌기, 임의 구현예에서 탄소 원자 1-5 또는 1-4개를 가지는 알킬렌기를 지칭한다. 알킬렌기의 예로는, 메틸렌 (-CH2-), 에틸렌 (-CH2-CH2-), n-프로필렌, n-부틸렌, n-펜틸렌, 및 n-헥실렌이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
용어 "알케닐렌"은 하나 이상의 탄소-탄소 결합이 이중 결합이고 나머지 결합은 단일 결합 또는 다른 이중 결합일 수 있는, 탄소수 2-20의 2가 직쇄기를 지칭한다. 용어 "알키닐렌"은 본원에서 하나 이상의 탄소-탄소 결합이 삼중 결합이고 나머지 결합인 단일 결합, 이중 결합 또는 다른 삼중 결합일 수 있는, 탄소수 2-20의 기를 지칭한다. 알케닐렌기의 예로는 에테닐렌 (-CH=CH-), 1-프로페닐렌, 2-프로페닐렌, 1-부테닐렌, 2-부테닐렌, 3-부테닐렌 등을 포함한다. 알키닐렌기의 예로는 에티닐렌, 1-프로피닐렌, 2-프로피닐렌 등을 포함한다.
본원에서, "사이클로알킬렌"은, 고리가 이종원자가 아닌 탄소 원자를 3-12개 가지며 고리가 완전히 포화된, 임의의 적합한 단환식 또는 다환식 시스템의 일부인 2가 고리를 지칭하는 것으로 의도되며, 용어 "사이클로알케닐렌"은 고리가 이종원자가 아닌 탄소 원자를 3-12개 가지며 고리가 적어도 부분적으로 포화된, 임의의 적합한 단환식 또는 다환식 시스템의 일부인 2가 고리(모든 아릴렌 고리가 배제됨)를 지칭하는 것으로 의도된다. 사이클로알킬렌의 예로는 사이클로프로필렌, 사이클로부틸렌, 사이클로펜틸렌, 사이클로헥실렌, 및 사이클로헵틸렌이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 사이클로알케닐렌의 예로는 사이클로펜테닐렌과 사이클로헥세닐렌이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
본원에서, 용어 "헤테로사이클로알킬렌" 및 "헤테로사이클로알케닐렌"은, 3 내지 약 12개의 탄소 원자와 1개 이상의 이종원자, 특히 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 이종원자로 이루어진, 임의의 적합한 단환식 또는 다환식 고리 시스템의 일부인 2가 고리를 지칭하는 것으로 의도되며, 헤테로사이클로알킬렌은 완전히 포화된 고리를 지칭하고, 헤테로사이클로알케닐렌은 적어도 부분적으로 불포화된 고리(임의의 아릴렌 또는 헤테로아릴렌 고리는 배제됨)를 지칭한다.
용어 "아릴렌"은, 이종원자가 아닌 탄소 원자를 3-20개 포함하며, "4n+2" p 전자 규칙에 따라 정해지는, 페닐렌을 비롯하여, 방향족 모이어티로 구성되는, 임의의 적합한 단환식 또는 다환식 시스템의 일부인 2가 고리 또는 고리 시스템을 의미하는 것으로 의도된다.
본원에서, 용어 "헤테로아릴렌"은, 고리 또는 고리 시스템이 원자 3-20개를 가지며, "4n+2" p 전자 규칙에 따라 정해지는 방향족 모이어티로 구성되며, 탄소 원자와 하나 이상의 질소, 황 및/또는 산소 이종원자로 구성되는, 임의의 적합한 단환식 또는 다환식 시스템의 일부인 2가 고리 또는 고리 시스템을 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "치환된"은 링커의 벡본에 존재하는 하나 이상의 수소가 지정된 기(들)로부터 선택된 것으로 치환되되, 단, 지정된 원자의 정상 원자가 또는 기의 적절한 원자의 원자가를 넘지 않으며, 치환을 통해 안정적인 화합물이 생성되는 것을 의미한다. 용어 "선택적으로 치환된"은 링커를 본원에 정의된 바와 같이 본원에 정의된 하나 이상의 치환기로 치환 또는 비치환되는 것을 의미한다. 치환기가 케토 (또는 옥소, 즉, =O) 기, 티오기, 이미노기 등인 경우, 링커 벡본 원자 상에서 2개의 수소가 치환된다. 치환기의 예로는 예컨대, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아랄킬, 헤테로아랄킬, 아실, 아로일, 헤테로아로일, 카르복실, 알콕시, 아릴옥시, 아실옥시, 아로일옥시, 헤테로아로일옥시, 알콕시카르보닐, 할로겐, (티오)에스테르, 시아노, 포스포릴, 아미노, 이미노, (티오)아미도, 설프하이드릴, 알킬티오, 아실티오, 설포닐, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 니트로, 아지도, 할로알킬, 예컨대 퍼플루오로알킬 (예, 트리플루오로메틸), 할로알콕시, 알킬설파닐, 알킬설피닐, 알킬설포닐, 알킬설포닐아미노, 아릴설포노아미노, 포스포릴, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 알킬카르복시, 알킬카르복시아미드, 옥소, 하이드록시, 머캅토, 아미노 (선택적으로, 모노- 또는 2-치환된, 예컨대 알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴에 의한 치환), 이미노, 카르복사미드, 카르바모일 (선택적으로 모노- 또는 2-치환된, 예컨대 알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴에 의한 치환), 아미디노, 아미노설포닐, 아실아미노, 아로일아미노, (티오)우레이도, 아릴티오)우레이도, 알킬(티오)우레이도, 사이클로알킬(티오)우레이도, 아릴옥시, 아랄콕시, 또는 -O(CH2)n-OH, -O(CH2)n-NH2, -O(CH2)nCOOH, -(CH2)nCOOH, -C(O)O(CH2)nR, -(CH2)nN(H)C(O)OR, 또는 -N(R)S(O)2R을 포함하되, 상기 n은 1-4이고, R은 독립적으로 수소, -알킬, -알케닐, -알키닐, -사이클로알킬, -사이클로알케닐, -(C-연결된-헤테로사이클로알킬), -(C-연결된-헤테로사이클로알케닐), -아릴, 및 -헤테로아릴로부터 선택되고, 복수의 치환도 허용된다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 치환기, 예컨대 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬, 등 또는 관능기, 예컨대 -OH, -NHR 등이 적절한 경우 자체 치환될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 당해 기술 분야의 당업자라면, 적절한 경우 치환된 모이어티 자체가 치환될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 링커 L, 특히 [0049] 또는 [0120]에 나타낸 링커 L은 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 사이클로알킬렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 헤테로알키닐렌, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 아랄킬렌, 및 헤테로아랄킬렌 기로 구성된 리스트에서 선택되는 m개의 기들을 포함하며, 이때 각각의 기는 선택적으로 치환되며, 링커는 디설파이드 (-S-S-), 에테르 (-O-), 티오에테르 (-S-), 아민 (-NH-), 에스테르 (-O-C(=O)- 또는 -C(=O)-O-), 카르복사미드 (-NH-C(=O)- 또는 -C(=O)-NH-), 우레탄 (-NH-C(=O)-O- 또는 -O-C(=O)-NH-), 및 우레아 모이어티 (-NH-C(=O)-NH-) 모이어티들 중 하나로부터 독립적으로 선택되는 n개의 모이어티를 추가로 포함하며, 여기서 m = n+1이다. 특정 구현예에서, m은 2이고, n은 1이거나, 또는 m은 3이고 n은 2이다. 특정 구현예에서, 링커는 2 또는 3개의 비치환된 알킬렌기와, 비치환된 알킬렌기를 연결하는, 1 또는 2개의 각각 디설파이드, 에테르, 티오에테르, 아민, 에스테르, 카르복사미드, 우레탄 또는 우레아 모이어티를 포함한다.
특정 구현예에서, 링커 L, 특히 [0049]에 나타낸 링커 L은 C, O, N 및 S로부터 독립적으로 선택되는 2-20개, 특히 2-16개, 보다 구체적으로 5-14개, 보다 더 구체적으로 6-12개의 원자로 이루어진 직쇄이다. 특정 구현예에서, 직쇄의 원자들 중 적어도 60%가 C 원자이다. 특정 구현예에서, 직쇄의 원자들은 단일 결합으로 결합된다.
특정 구현예에서, 직쇄의 C 원자는 독립적으로 선택적으로 치환된 메틸렌기들(-CH2-)의 일부이다. 특히 이러한 구현예들에서, 선택적인 치환기는 독립적으로 할로겐 및 C1-6-알킬, 특히 메틸으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 링커 L, 특히 [0049] 또는 [0120]에 나타낸 링커 L은 아래 링커 군으로부터 선택된다:
아마톡신 측: -(CH2)2- 표적-결합성 모이어티 측
아마톡신 측: -(CH2)3- 표적-결합성 모이어티 측
아마톡신 측: -(CH2)4- 표적-결합성 모이어티 측
아마톡신 측: -(CH2)5- 표적-결합성 모이어티 측
아마톡신 측: -(CH2)6- 표적-결합성 모이어티 측
아마톡신 측: -(CH2)7- 표적-결합성 모이어티 측
아마톡신 측: -(CH2)8- 표적-결합성 모이어티 측
아마톡신 측: -(CH2)9- 표적-결합성 모이어티 측
아마톡신 측: -(CH2)10- 표적-결합성 모이어티 측
아마톡신 측: -(CH2)11- 표적-결합성 모이어티 측
아마톡신 측: -(CH2)12- 표적-결합성 모이어티 측
아마톡신 측: -(CH2)16- 표적-결합성 모이어티 측
아마톡신 측: -(CH2)2-S-S-(CH2)2- 표적-결합성 모이어티 측
아마톡신 측: -(CH2)3-S-S-(CH2)2- 표적-결합성 모이어티 측
아마톡신 측: -(CH2)2-S-S-(CH2)3- 표적-결합성 모이어티 측
아마톡신 측: -(CH2)3-S-S-(CH2)3- 표적-결합성 모이어티 측
아마톡신 측: -(CH2)4-S-S-(CH2)4- 표적-결합성 모이어티 측
아마톡신 측: -(CH2)2-CMe2-S-S-(CH2)2- 표적-결합성 모이어티 측
아마톡신 측: -(CH2)2-S-S-CMe2-(CH2)2- 표적-결합성 모이어티 측
아마톡신 측: -(CH2)2-O-(CH2)2- 표적-결합성 모이어티 측
아마톡신 측: -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2- 표적-결합성 모이어티 측
아마톡신 측: -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2- 표적-결합성 모이어티 측
아마톡신 측: -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2- 표적-결합성 모이어티 측
본 발명의 특정 구현예에서, 표적-결합성 모이어티는 종양 세포 상에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 표적-결합성 모이어티는 Her-2/neu 또는 상피 세포 부착 분자 (EpCAM)의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 표적-결합성 모이어티는 항체, 이의 항원-결합 단편, 항체-유사 단백질 및 핵산 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 디아바디, 테트라바디, 나노바디, 키메라 항체, 탈면역화된 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체로부터 선택된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 상기 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fd, Fv, 단쇄 Fv, 및 이황화-연결된 Fvs (dsFv)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 항체는 헤르셉틴 또는 HEA125 또는 헤르셉틴 또는 HEA125의 항원 결합 단편을 포함하는 항체 단편이다.
특정 구현예에서, 2 이상의 아마톡신 분자가 하나의 표적-결합성 모이어티에 커플링된다. 접합체 당 아마톡신의 수 증가는 또한 독성을 증가시킬 것이다. 즉, 특정 구현예에서, 아마톡신에 대한 표적-결합성 모이어티의 비율은 표적-결합성 모이어티 1에 대해 아마톡신 2-15, 특히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이다. IgG와 같은 항체 이량체의 경우, 비율 계산시, 이량체는 표적-결합성 모이어티 1개로 간주된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 접합체는 의약제로서 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 접합체는, 환자에서 췌장암, 담관암, 유방암, 결장직장암, 폐암, 전립선암, 난소암, 위암, 신장암, 악성 흑색종, 백혈병 및 악성 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암을 치료하기 위한 것이다.
본원에서, "환자"는 본원에 기술된 표적-결합성 모이어티 톡신 접합체를 이용한 치료가 유익할 수 있는 임의의 포유류 또는 조류를 의미한다. 바람직하게는, "환자"는 실험 동물 (예, 마우스 또는 랫), 가축 (예, 기니아피그, 토끼, 닭, 돼지, 양, 염소, 카멜, 소, 말, 당나귀, 고양이 또는 개) 또는 인간 등의 영장류로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히 바람직하게는 "환자"는 인간이다.
본원에서, 질환 또는 장애의 "치료한다", "치료하는" 또는 "치료"는, (a) 장애의 중증도 경감; (b) 치료 중인 장애(들)의 특징적인 증상의 발병 제한 또는 예방; (c) 치료 중인 장애(들)의 특징적인 증상들의 악화 저해; (d) 이전에 장애(들)에 걸린 적 있는 환자에서 장애(들)의 재발 제한 또는 방지; 및 (e) 장애(들)에 대해 증상을 기존에 나타내었던 환자에서 증상의 재발 제한 또는 방지 중 한가지 이상의 달성을 의미한다.
본원에서, 치료는 본 발명에 따른 접합체 또는 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 "투여"는 생체내 투여 뿐만 아니라 정맥 그래프트와 같은 조직으로의 생체외 직접 투여를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 접합체는 치료학적 유효량으로 사용된다.
"치료학적 유효량"은 의도한 목적을 달성하는데 충분한 치료제의 양이다. 해당 치료제의 유효량은 제제의 특성, 투여 경로, 치료제 복용 동물의 신체 크기와 종, 및 투여 목적과 같은 인자들에 따라 달라질 것이다. 각각의 경우의 유효량은 당해 기술 분야에서 확립된 방법에 따라 당업자가 실험을 통해 결정할 것이다.
제2 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 접합체를 포함하며, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 부형제, 충전제, 결합제, 윤활제, 활택제, 붕해제, 흡수제; 및/또는 보존제를 더 포함하는, 약학 조성물에 관한 것이다.
"약제학적으로 허용가능한"은 주정부 또는 연방 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 또는 동물, 보다 구체적으로 인간에게 사용하기 위한 용도로 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 열거된 것을 의미한다.
특정 구현예에서, 약학 조성물은 전신 투여되는 약제 형태로 사용된다. 이러한 것으로는 기타 주사제 및 주입제를 포함하는 비경구제를 포함한다. 주사제는 앰플 또는 소위 레이-포-유즈 주사제로서, 예를 들어 레티-투-유즈 시린지 또는 1회용 시린지로 제형화되며, 다회 회수(multiple withdrawal)용 천공 플라스크(puncturable flask)는 제외된다. 주사제의 투여는 피하 (s.c.), 근육내 (i.m.), 정맥내 (i.v.) 또는 피내 (i.c.) 적용 형태일 수 있다. 특히, 결정의 현탁제, 용액제, 나노입자 또는 예컨대 하이드로졸과 같은 콜로이드형의 분산 시스템으로서 각각 적절한 주사 제형으로서 제조할 수 있다.
주사용 제형은 또한 수계 등장성 희석제로 용해시키거나 분산시킬 수 있는, 농축물로서 제조할 수 있다. 또한, 주입제는 등장성 용액제, 지방성 에멀젼(fatty emulsion), 리포좀 제형 및 마이크로-에멀젼의 형태로 제조할 수 있다. 주사제와 마찬가지로, 주입 제형도 희석용 농축제 형태로 제조할 수 있다. 주사용 제형은 또한 입원 환자(in-patient)와 앰불런트 테라피(ambulant therapy) 예컨대 미니-펌프 방식으로 지속적으로 주입하는 형태로 적용할 수 있다.
비경구 약물 제형, 예컨대, 알부민, 혈장, 익스펜더(expander), 계면 활성제, 유기 희석제, pH-작용제(influencing substance), 착화성 물질 또는 중합체 물질에, 특히 본 발명의 표적-결합성 모이어티 톡신 접합체를 단백질 또는 폴리머에 흡착시키는데 영향을 주는 물질로서 첨가하는 것도 가능하며, 또는 이를, 본 발명의 표적-결합성 모이어티 톡신 접합체가 주사 장치 또는 패키징 물질, 예컨대 플라스틱 또는 유리와 같은 물질에 흡착되는 것을 낮추기 위한 목적으로 첨가할 수 있다.
본 발명의 표적-결합성 모이어티 톡신 접합체는 비경구 형태로 미세담체 또는 나노입자 등에, 예컨대 폴리(메트)아크릴레이트, 폴리락테이트, 폴리글리콜레이트, 폴리아미노산 또는 폴리에테르 우레탄 기재의 미세 분산된 입자에 결합될 수 있다. 또한, 비경구 제형은, 본 발명의 표적-결합성 모이어티 톡신 접합체를 각각 미세 분산된, 분산된 및 현탁된 형태로 도입하는 경우라면, 데포 조제물(depot preparation)로서, 예컨대 "다중 유닛 방식(multiple unit principle)"으로 변형시키거나, 또는 본 발명의 표적-결합성 모이어티 톡신 접합체를 제형에 봉입하거나 예컨대 정제 또는 이후에 이식할 로드에 봉입하는 경우라면, 의약제 또는 "단일 유닛 원칙"을 기반으로 한 결정체의 현탁물로서 변형시킬 수 있다. 단일 유닛 및 다중 유닛 제형 형태의 이들 임플란트 또는 데포 의약제는 예컨대 락트산과 글리콜산의 폴리에스테르, 폴리에테르 우레탄, 폴리아미노산, 폴리(메트)아크릴레이트 또는 다당류와 같은, 소위 생분해성 폴리머들로 대개 구성된다.
비경구제로서 제형화되는 본 발명에 따른 약학 조성물을 제조하는 동안에 첨가되는 보강제 및 담체는, 바람직하게는 아쿠아 스테릴리세이타(aqua sterilisata) (멸균수), pH 수치에 작용하는 물질, 예컨대 유기 또는 무기 산 또는 염기 뿐만 아니라 이의 염, pH 값을 조정하기 위한 완충 물질, 예컨대 소듐 클로라이드, 소듐 하이드로카보네이트, 글루코스 및 프럭토스와 같은 등장성 물질, 텐사이드(tenside) 및 계면활성제 각각, 그리고 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄의 지방산의 부분 에스테르 (예컨대, Tween®) 또는 폴리옥시에틸렌의 지방산 에스테르 (예컨대, Cremophor®)와 같은 유화제, 예컨대 땅콩 오일, 콩 오일 또는 캐스터 오일과 같은 지방 오일, 예컨대 에틸 올레이트, 이소프로필 미리스테이트 및 중성 오일과 같은 지방산의 합성 에스테르 (예컨대, Miglyol®), 뿐만 아니라 중합체 보강제, 예컨대 젤라틴, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 유기 용매의 용해성을 증가시키는 첨가제, 예컨대, 프로필렌 글리콜, 에탄올, N,N-디메틸아세트아미드, 프로필렌 글리콜 또는 착화 형성 물질, 예컨대, 사이트레이트 및 우레아, 보존제, 예컨대, 벤조산 하이드록시프로필 에스테르 및 메틸 에스테르, 벤질 알코올, 항산화제, 예컨대 소듐 설파이트 및 안정화제, 예컨대 EDTA이다.
본 발명의 약학 조성물을 현탁제로서 제형화하는 경우, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 표적-결합성 모이어티 톡신 접합체의 세팅(setting)을 방지하기 위한 증점제나, 또는 침전물(sediment)의 재현탁성을 확보하기 위한 텐사이드 및 고분자전해질 및/또는 착화 형성제, 예컨대 EDTA를 첨가한다. 또한, 활성 성분과 다양한 폴리머의 복합체를 이루는 것도 가능하다. 이러한 폴리머의 예로는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리스티렌, 카르복시메틸 셀룰로스, Pluronics® 또는 폴리에틸렌 글리콜 소르비트 지방산 에스테르가 있다. 또한, 본 발명의 표적-결합성 모이어티 접합체는, 예컨대, 사이클로덱스트린을 이용하여 포접 화합물(inclusion compound)의 형태로 액체 제형에 혼입할 수 있다. 특정 구현예에서, 분산화제를 다른 보강제로서 첨가할 수 있다. 동결건조물을 제조하기 위해, 만니트, 덱스트란, 사카로스, 인간 알부민, 락토스, PVP 또는 젤라틴 변형체와 같은 비계 형성제(scaffolding agent)를 첨가할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 접합체를 유효량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 환자에게서 췌장암, 담관암, 유방암, 결장직장암, 폐암, 전립선암, 난소암, 위암, 신장암, 악성 흑색종, 백혈병 또는 악성 림프종을 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 아마톡신-접합 분자를 하기를 통해 아마톡신과 연결시키는 링커 L을 포함하는, 본 발명의 접합체를 합성하기 위한 중간 화합물로서의, 아마톡신-접합 분자에 관한 것으로:
(i) 아마톡신 1번 아미노산의 γ C-원자, 특히 아미드 결합을 통해;
(ii) 아마톡신 3번 아미노산의 δ C-원자에 결합된 산소 원자, 특히 에스테르 결합, 에테르 결합 또는 우레탄 결합을 통해; 또는
(iii) 아마톡신 4번 아미노산의 6' C-원자, 특히 아마톡신 4번 아미노산의 6' C-원자에 결합된 산소 원자를 통해,
각 경우에, 링커 L은 카르밤산 유도체 -NH-C(O)-X를 포함하며, X는 표적-결합성 모이어티의 1차 아민으로 치환될 수 있는 이탈기이다.
일 구현예에서, 아마톡신-접합 분자는 하기 구조들 중 하나로부터 선택되는 구조를 가진다:
(i) 아마톡신-γC(O)-NH-L-NH-C(O)-X;
(ii) 아마톡신-δC-O-C(O)-L-NH-C(O)-X;
(iii) 아마톡신-δC-O-L-NH-C(O)-X;
(iv) 아마톡신-δC-O-C(O)-NH-L-NH-C(O)-X; 및
(v) 아마톡신-6'C-O-L-NH-C(O)-X.
특정한 구현예들에서, 아마톡신은 α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린 또는 아마눌린 산, 또는 이들의 염 또는 유사체로부터 선택된다.
특정한 구현예들에서, 링커 L은, 선택적으로 치환된, 알킬렌, 헤테로알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알케닐렌, 알키닐렌, 헤테로알키닐렌, 사이클로알킬렌, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 아랄킬렌, 또는 헤테로아랄킬렌 기이다.
특정한 구현예들에서, 링커 L은 디설파이드, 에테르, 아민, 에스테르, 카르복사미드, 우레탄 및 우레아 모이어티들 중 한가지로부터 선택되는 모이어티를 포함한다.
특정한 구현예들에서, 관능기 X는 t-부틸옥시, 숙신이미딜옥시, -1-O-숙신이미딜옥시-3-설포네이트 (-설포-NHS), -O-(4-니트로페닐옥시), O-(3-니트로페닐옥시), -O-(2,4-디니트로페닐옥시), -O-(2,4-디클로로-6-니트로페닐옥시), -펜타플루오로페닐옥시, -펜타클로로페닐옥시, -O-(2,4,5-트리클로로페닐옥시), -O-(3,4-디하이드로-3-하이드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진-3-일), -O-(엔도-1-하이드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복스이미드-1-일), -1-프탈이미도일옥시, -1-벤조트리아졸릴옥시, -1-(7-아자-벤조트리아졸릴)옥시), 및 -N-이미다졸릴로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 아마톡신-접합 분자를 1차 아미노기를 포함하는 표적-결합성 모이어티와 반응시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 아마톡신 접합체의 합성 방법에 관한 것이다.
실시예
하기에서, 본 발명을 비제한적인 실시예를 들어 보다 구체적으로 설명한다.
실시예 1
α-아마니틴 헤르셉틴 항체 접합체 Her-DSC-30.0134의 합성
1.1 6'-NH-boc-(6-아미노헥실)-α-아마니틴 HDP 30.0132의 합성
Figure pct00001
α-아마니틴 HDP 30.0132
아르곤 하, 실온에서, 진공 건조한 α-아마니틴 30.00 mg (32.6 μmol)을 건조 디메틸 설폭사이드 (DMSO) 900 ㎕에 용해하였다. 포타슘 tert.-부틸레이트 3.66 mg (32.6 μmol)과 73.18 mg (261.2 μmol, 8 eq.) NH-Boc-아미노헥실브로마이드 (Fluka 89171)를 첨가하였다. 6시간 후, 실온에서, DMSO 중의 0.33 M 아세트산 용액 50 ㎕로 반응 혼합물을 pH = 5로 산성화하였다. 진공 하에 휘발성 물질들을 증발시키고, 잔류물을 메탄올 1000 ㎕에 용해시킨 후, 디에틸 에테르 20 ml로 희석하였다. 석출물을 수집하여, 메탄올 1000 ㎕ 중에 취하였다. 이 용액을 물 1000 ㎕로 희석시키고, LaPrep-HPLC에서의 정제에 사용하였다:
(컬럼: Kromasil 100-C18, 250 mm x 20 mm, 10 ㎛, 메탄올/물 (0.05% TFA) 사용, 유속: 26 ml/min, λ = 295 nm에서 검출).
용매 A: 95% 물 : 5% 메탄올 : 0.05% 트리플루오로아세트산
용매 B: 10% 물 : 90% 메탄올 : 0.05% 트리플루오로아세트산
농도 구배: 0-5분 100% A; 5-20분 0% A; 20-40분 0% A
체류 시간 19.8분의 분획을 수집하고, 용매를 증발시켰다.
분말 15.9 mg (43%의 수율). MS: 1119 (M+H+); 1141 (M+Na+)
1.2 6'-(-6-아미노헥실)-α-아마니틴 HDP 30.0134의 합성
Figure pct00002
HDP 30.0132 HDP 30.0134
6'-NH-boc-6-아미노헥실-α-아마니틴 HDP 30.0132 9.90 mg (8.85 μmol)을 트리플루오로아세트산 250 ㎕에 용해하였다. 반응 혼합물을 아르곤 하, 주위 온도에서 교반하였다. 2분 후, 진공 하에 20℃에서 산을 제거하고, 잔류물을 건조하였다. 조산물 아마니틴 에테르를 LaPrep-HPLC에서 정제하였다:
(컬럼: Kromasil 100-C18, d = 10 mm, 10 ㎛, 메탄올/물 (0.05% TFA) 사용, 유속: 6 ml/min, λ = 295 nm에서 검출).
용매 A: 95% 물 : 5% 메탄올 : 0.05% 트리플루오로아세트산
용매 B: 10% 물 : 90% 메탄올 : 0.05% 트리플루오로아세트산
농도 구배: 0-5분 100% A; 5-25분 50% A; 25-30분 0% A; 30-35분 0% A ; 35-40분 100% A, 40-45분 100% A
동일한 체류 시간 (14.5분)의 분획을 수집하여, 용매를 증발시켰다.
9.10 mg (99%의 수율)의 백색 분말. MS: 1019 (M+H+); 1041 (M+Na+)
1.3 HDP 30.0134 항체 유도체 Her-DSC-30.0134의 합성
반응식 1
Figure pct00003
분리 안함 Her-DSC-30.0134
반응식 1 (및 실시예에 나타낸 다른 반응식들)에서, 헤르셉틴은 헤르셉틴 항체 단백질의 나머지 부분인 R3 및 R4를 구비한 라이신 측쇄를 나타낸 구조식으로 표시된다.
1.3.1 여러가지 톡신이 탑재된 6'-(-6-아미노헥실-6-하이드록시숙신이미딜)-α-아마니틴-헤르셉틴 접합체 Her-DSC-30.0134의 합성 ( 표 2 )
6'-(-6-아미노헥실)-α-아마니틴 HDP 30.0134 5.00 mg을 건조 디메틸포름아미드 (DMF) 538 ㎕에 용해하였다. 아르곤 하, 실온에서 교반하면서, DMF (2.56 mg, 100 ㎕ DMF) 중의 디하이드록시숙신이미도 카보네이트 (DSC) 용액 18.6 ㎕와 트리에틸아민 10.0 ㎕를 한번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 12시간 후, 차가운 디에틸 에테르 60 ml을 첨가하였다. α-아마니틴-6'-(-6-아미노헥실-6-하이드록시숙신이미딜 카보네이트)의 석출물을 수집하여, 디에틸 에테르로 수차례 세척하고, 진공 건조하였다. 잔류 고형물을 750 ㎕ DMF내에서 취하였다 = 용액 A.
헤르셉틴 114.0 mg을 포스페이트 완충액화된 염수 (PBS, pH = 7.4) 19.0 ml에 용해하였다 = 용액 B.
표 2
헤르셉틴 용액 샘플 3개에, α-아마니틴-6'-(-6-아미노헥실-6-하이드록시숙신이미딜 카보네이트) 용액을 여러가지 함량으로 처리하였다.
용액 A 용액 B 헤르셉틴: 아마니틴-링커 탑재 샘플명
152 ㎕ 11.0 ml 1 : 1.3 Her-DSC-30.0134 [1.3]
242 ㎕ 5.0 ml 1 : 4.3 Her-DSC-30.0134 [4.3]
290 ㎕ 3.0 ml 1 : 7.5 Her-DSC-30.0134 [7.5]
헤르셉틴 아마니틴-링커 용액 3가지를 14시간 동안 4℃에서 교반하고, 세파덱스 G-25 겔 여과 크로마토그래피 (XK-16 컬럼; 2 ml/min)으로 각각 분리하였다. G-25 컬럼을 500 ml PBS 용액, pH = 7.4로 사전 세척하였다. Her-DSC-30.0134 접합체 분획을 UV 흡광으로 검출하였다. 단백질 농도는 RotiQuant-Assay (Carl Roth; Germany)으로 측정하였다. 헤르셉틴의 아마니틴 탑재를 A = 280 nm 및 A = 310 nm에서의 UV 흡광을 측정하여 결정하였다.
실시예 2
α-아마니틴 헤르셉틴 항체 접합체 Her-DSC-30.0256의 합성
2.1 1-이소시아네이토-6-BocNH-아미노헥산 HDP 30.0247의 제조
Figure pct00004
NH-Boc-1,6-헥사메틸렌디아민 (Aldrich 79229) 2.50 g (11.56 mmol)을 디클로로메탄 35 ml에 용해하였다. NaHCO3 포화 수용액 35 ml을 첨가하였다. 비스-(트리클로로메틸 카보네이트 (트리포스젠) 1.143 g (3.85mmol)을 첨가한 후, 반응 혼합물을 0℃에서 30분간 왕성하게 교반하였다. 유기층을 분리시키고, 수층을 15 ml 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 유기상을 조합하여 MgSO4 상에서 건조하고, 증발시켰다. 오일성 잔류물을 Kugelrohr 오븐에서 150℃ 및 0.59 mbar에서 분별하였다. 2.23 g (80%)의 투명 오일 MS: 242 (M+)
2.2 δ-O-(NH-boc-6-아미노헥실카르바모일)-α-아마니틴 HDP 30.0253의 합성
Figure pct00005
α-아마니틴 HDP 30.0253
cat.: 디부틸 디라우릴스테네이트 n-Bu2Sn[OCO(CH2)10CH3]2
아르곤 분위기 하에, 진공 건조한 α-아마니틴 13.43 mg (14.6 μmol)을 건조 디메틸 포름아미드 (DMF) 1000 ㎕에 용해하였다. NH-Boc-6-이소시아네이토 아미노헥산 7.08 mg (29.2 μmol) 및 디-부틸 디라우릴스테네이트 18.46 mg (29.2 μmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 주위 온도에서 교반하였다. 23시간 후, NH-Boc-6-이소시아네이토 아미노헥산 13.43 mg (14.6 μmol)을 추가로 첨가하였다. 52시간 후, 반응 혼합물을 메탄올 200 ㎕로 가수분해하고, 증발시켜 건조하였다. 잔류물을 DMSO 1200 ㎕에 용해하고, LaPrep-HPLC 컬럼에서 정제하였다: Kromasil 100-C18, 10 ㎛, 250 mm x 20 mm, 메탄올/물 (0.05% TFA) 사용, 유속: 26 ml/min, λ = 295 nm에서 검출. 용매 A: 95% 물 : 5% 메탄올. 용매 B: 5% 물: 95% 메탄올. 농도 구배: 0-5분 100% A; 5-20분 0% A; 20-25분 0% A; 25-27분 100% A; 27-35분 100% A. 체류 시간이 동일한 분획을 수집하여, 용매를 증발시켰다.
9.06 mg (53%의 수율)의 백색 고형물. MS: 1161 (M+H+); 1183 (M+Na+)
2.3 δ-O-(6-아미노헥실카르바모일)-α-아마니틴 HDP 30.0256의 합성
Figure pct00006
HDP 30.0253 HDP 30.0256
HDP 30.0253 9.06 mg (7.8 μmol)을 트리플루오로아세트산 250 ㎕에 용해하여, 주위 온도에서 2분간 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시켜 건조하고, 잔류물을 1.5 ml 아세토니트릴을 이용하여 2회 공동-증발시켰다. 고형물을 LaPrep-HPLC에서 정제하였다:
컬럼: Kromasil 100-C18, 10 ㎛, 250 mm x 20 mm, 아세토니트릴/물 사용, 유속: 26 ml/min, λ = 295 nm에서 검출. 용매 A: 95% 물: 5% 아세토니트릴. 용매 B: 5% 물: 95% 아세토니트릴. 농도 구배: 0-5분 100% A; 5-20분 0% A; 20-25분 0% A; 25-27분 100% A; 27-35분 100% A.
체류 시간이 12-27분인 분획을 수집하여, 백색 고형물로 증발시켰다.
8.75 mg (95%의 수율). MS: (1061 M+H+); 1083 (M+Na+)
2.4 HDP 30.0256 항체 유도체 Her-DSC-30.0256의 합성
반응식 2
Figure pct00007
2.4.1 HDP-30.0256 헤르셉틴 접합체 Her-DSC-30.0256 [3.3]의 합성
HDP 30.0256 1.00 mg을 건조 디메틸포름아미드 (DMF) 108 ㎕에 용해하였다. 아르곤 하에, 실온에서 교반하면서, DMF 중의 디하이드록시숙신이미도 카보네이트 (DSC) 용액 (2.56 mg, 100 ㎕ DMF) 10.0 ㎕와 트리에틸아민 2.0 ㎕을 한번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 밤새 교반한 후, 차가운 디에틸 에테르 30 ml을 첨가하였다. 석출물을 수집하고, 디에틸 에테르로 수회 세척한 다음 진공 건조하였다. 남아있는 고형물을 DMF 143 ㎕ 중에서 취하였다 = 용액 A. 헤르셉틴 12.0 mg을 포스페이트 완충화된 염수 (PBS, pH = 7.4) 6.0 ml에 용해하였다 = 용액 B. 용액 A와 용액 B를 조합하였다. 헤르셉틴 아마니틴-링커 용액을 14시간 동안 4℃에서 교반하고, 세파덱스 G-25 겔 여과 크로마토그래피 (XK-16 컬럼; 2 ml/min)로 분리하였다. G-25 컬럼을 PBS 용액, pH = 7.4 500 ml로 미리 세척하였다. Her-DSC-30.0256 접합체 분획을 UV 흡광으로 검출하였다. RotiQuant-Assay (Carl Roth; Germany)으로 단백질 농도를 측정하였다. A = 280 nm 및 A = 310 nm에서의 UV 흡광을 측정함으로써, 헤르셉틴의 아마니틴 탑재(payload)를 확인하였다. 각 헤르셉틴 분자에서 3.3개의 아마니틴 분자의 톡신 탑재가 계산되었다.
실시예 3
β-아마니틴 헤르셉틴 항체 접합체 Her-DSC-30.0304의 합성
3.1 BocNH-헥사메틸렌디아미노-β-아마니틴 아미드 HDP 30.0299
Figure pct00008
β-아마니틴 HDP 30.0299
아르곤 하에서, 진공 건조한 β-아마니틴 4.65 mg (5.05 μmol)을 건조 디메틸포름아미드 (DMF) 1000 ㎕에 용해하였다. DMF 중의 0.15 M BocNH-헥사메틸렌디아민 용액 100 ㎕과 DMF 중의 0.15 M 디이소프로필에틸아민 (DIPEA) 용액 100 ㎕를 주위 온도에서 첨가하였다. DMF 중의 0.30 M 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBOP) 100 ㎕를 최종 첨가한 후, 반응 혼합물을 20시간 교반하고, 물 100 ㎕로 가수분해하였다. 반응 혼합물을 증발시켜 진공 건조하고, 잔류물을 디메틸설폭사이드 (DMSO) 1000 ㎕에 용해하였다. LaPrep-HPLC에서 정제하였다:
컬럼: Kromasil 100-C18, 10 ㎛, 250 mm x 20 mm, 메탄올/물 (0.05% TFA) 사용, 유속: 26 ml/min, λ = 295 nm에서 검출. 용매 A: 95% 물 : 5% 메탄올. 용매 B: 5% 물 : 95% 메탄올. 농도 구배: 0-5분 100% A; 5-20분 0% A; 20-25분 0% A; 25-27분 100% A; 27-35분 100% A.
체류 시간이 동일한 분획을 수집하여, 용매를 증발시켰다.
4.45 mg (80%의 수율)의 백색 고형물. MS: 1119 M+H+; 1141 M+Na+
3.2 6`-헥사메틸렌디아미노-β-아마니틴 아미드 HDP 30.0304
Figure pct00009
HDP 30,0299 HDP 30.0304
BocNH-헥사메틸렌디아미노-β-아마니틴 아미드 HDP 30.0299 4.14 mg (3.70 μmol)을 트리플루오로아세트산 (TFA) 500 ㎕에 용해하여, 2분간 교반하였다. 진공에서 과잉의 TFA를 증발시키고, 잔류물을 2 분획의 아세토니트릴 1000 ㎕을 사용하여 공동-증발시켰다. 잔류 고형물을 LaPrep-HPLC에서 정제하였다:
컬럼: Kromasil 100-C18, 10 ㎛, 250 mm x 20 mm, 메탄올/물 (0.05% TFA) 사용, 유속: 26 ml/min, λ = 295 nm에서 검출. 용매 A: 95% 물 : 5% 메탄올. 용매 B: 5% 물 : 95% 메탄올. 농도 구배: 0-5분 100% A; 5-20분 0% A; 20-25분 0% A; 25-27분 100% A; 27-35분 100% A.
동일 체류 시간대 13.43-14.02분의 분획을 수집하여, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 물 2000 ㎕ 중에서 취하고, 용액을 액체 질소로 냉각시키고, 밤새 냉동-건조하였다.
백색 폼 4.00 mg (95%의 수율). MS: 1018 (M+H+); 1041 (M+Na+)
3.3 HDP 30.0304 항체 유도체 Her-DSC-30.0304의 합성
반응식 3
Figure pct00010
3.3.1 HDP-30.0304 헤르셉틴 접합체 Her-DSC-30.0304 [4.7]의 합성
HDP 30.0304 1.33 mg을 건조 디메틸포름아미드 (DMF) 144 ㎕에 용해하였다. 아르곤 하, 실온에서 교반하면서, DMF 중의 디하이드록시숙신이미도 카보네이트 (DSC) 용액 13.4 ㎕ (2.56 mg, 100 ㎕ DMF)과 트리에틸아민 2.6 ㎕를 한번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 12시간 후, 차가운 디에틸 에테르 30 ml을 첨가하였다. 석출물을 수집하고, 디에틸 에테르로 수차례 세척한 다음, 진공 건조하였다. 잔류 고형물을 200 ㎕의 DMF 중에 취하였다 = 용액 A. 헤르셉틴 12.0 mg을 포스페이트 완충화된 염수 (PBS, pH = 7.4) 4.0 ml에 용해하였다 = 용액 B. 용액 A와 용액 B를 조합하였다. 헤르셉틴 아마니틴-링커 용액을 14시간 동안 4℃에서 교반하고, 세파덱스 G-25 겔 여과 크로마토그래피 (XK-16 컬럼; 2 ml/min)로 분리하였다. G-25 컬럼을 PBS 용액 (pH = 7.4) 500 ml로 예비 세척하였다. Her-DSC-30.0304 접합체 분획을 UV 흡광으로 검출하였다. RotiQuant-Assay (Carl Roth; Germany)으로 단백질 농도를 측정하였다. A = 280 nm 및 A = 310 nm에서의 UV 흡광을 측정함으로써, 헤르셉틴의 아마니틴 탑재를 확인하였다. 각각의 헤르셉틴 분자에서 아마니틴 분자 4.7개의 톡신 탑재가 계산되었다.
실시예 4
아마니틴-헤르셉틴 접합체의 기타 구조체
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
실시예 5
여러가지 HER2-양성 및 HER2-음성 종양 세포주에 대한 시험관내 헤르셉틴-아마니틴 접합체의 세포독성
Her-DSC-30.0134, Her-DSC-30.0256, Her-에스테르-30.0001, Her-DCC-30.0252 및 Her-DCC-30.0127의 세포독성을 HER2-양성 종양 세포주 SKOV-3 (난소), SK-BR-3 (유방), NCI-N87 (위)와 HER2-음성 종양 세포주 MDA-MB231 (유방)에서 화학발광 BrdU 혼입 분석 (Roche Diagnostics)을 이용하여 평가하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 여러가지 농도의 헤르셉틴-아마니틴 접합체와 72 - 96시간 동안 인큐베이션한 후, BMG Labtech Optima 마이크로플레이트 리더에서 항-BrdU-HRP 항체로 고정 및 투과화된 세포를 측정함으로써, 세포 생존성을 측정하였다. 용량-반응 곡선의 EC50 값을 Graphpad Prism 4.0 소프트웨어로 계산하였다 (도 2 - 5 참조).
혈장에서의 시험관내 헤르셉틴-아마니틴 접합체의 안정성
5.1 혈장 인큐베이션 후 아마니틴의 분비
35 μM 헤르셉틴-아마니틴 접합체를 37℃ 수조에서 마우스 혈장에서 최대 14일간 인큐베이션하였다. 여러 시간대에 샘플을 채집하여, ELISA 방법에 의해 방출된 소분자 아마니틴 화합물을 분석하였다. 이를 위해, 방출된 아마니틴 및 아마니틴 대사산물을 80% EtOH로 여러 시간대에 추출하였다. 이를 5분간 10,000 g에서 원심분리하여 용액을 맑게 만들고, 상층액을 -70℃에 보관하였다. 화이트 Lumitrac (Greiner) 마이크로웰-플레이트를 토끼 항-아마니틴 항혈청으로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 PBS 중에서 3% BSA로 블록킹하고, 0.05% Tween/PBS로 3회 세척하였다. 아마니틴 샘플과 아마니틴 용액을 지정된 농도로 1% BSA/PBS 중의 1 nM 바이오티닐-아마니틴과 혼합하여, 코팅된 웰에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 웰을 0.05% Tween/PBS로 3회 세척하였다. 스트렙타비딘-HRP (Sigma-Aldrich) 스톡 용액(1 mg/ml, PBS)을 3% BSA/PBS에서 1:1000으로 희석하고, 50 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 웰을 0.05% Tween/PBS로 3회 세척하였다. 50 ㎕ 루미놀 용액 (Applichem)을 각 웰에 첨가하고, BMG Labtech Optima 리더로 발광 신호를 측정하였다. 방출된 아마니틴 화합물의 양을 선형 회귀로 계산하였다 (도 6 - 7 참조).
5.2 혈장 인큐베이션 후 세포독성 활성
헤르셉틴-아마니틴 접합체를 수조에서 37℃에서 인간 혈장에서 최대 11일간 인큐베이션하였다. 샘플을 여러 시간대에 채집하여, 시험관내 화학발광 BrdU 혼입 분석 (Roche Diagnostics)에 의해 HER2-양성 SKOV-3 세포에 대한 남아있는 세포독성 효능을 분석하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 여러가지 농도의 헤르셉틴-아마니틴 접합체와 72시간 동안 인큐베이션한 후, BMG Labtech Optima 마이크로플레이트 리더에서 항-BrdU-HRP 항체로 고정 및 투과화된 세포를 측정함으로써, 세포 생존성을 측정하였다. 용량-반응 곡선의 EC50 값을 Graphpad Prism 4.0 소프트웨어로 계산하였다 (도 8 참조).
HER2-양성 암 세포를 가진 마우스 이종이식 모델에서 헤르셉틴-아마니틴 접합체의 항종양 활성
6주령의 무손상 암컷 BALB/c nu/nu 무-흉선 마우스를 구입하여 (Janvier), 각각 8마리로 이루어진 그룹 3개로 랜덤 분할하였다. SKOV-3 세포 2.5 x 106개를 각 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. 헤르셉틴-아마니틴 접합체를 종양 접종 후 19일째에 용량 50 ㎍/kg으로 정맥내 1회 주사하였고, 음성 대조군에는 비히클 (NaCl 완충액)을 주사하였다. 생존성, 체중 및 종양 크기 등의 파라미터를 기록하였다 (도 9 참조).
실시예 6:
추가적인 α-아마니틴-링커 화합물들 HDP 30.0353, HDP 30.0354, HDP 30.0355, HDP 30.0409, HDP 30.0410, HDP 30.0411 및 HDP 30.0412의 제조
6.1 아마니틴-링커 HDP 30.0353
6.1.1 6'O-(NH-boc-6-아미노-3,4-디티아-헥실)-α-아마니틴 HDP 30.0341의 합성
Figure pct00015
α-아마니틴 HDP 30.0341
진공 건조한 α-아마니틴 6.78 mg (7.38 μmol)을 디메틸 설폭사이드 (DMSO) 500 ㎕에 용해하였다. NH-boc-아미노-3,4-디티아-헥실브로마이드 18.67 mg (59.02 μmol, 8 eq.)과 수 / DMSO (1:1) 중의 LiOH (0.1 M) 73.8 ㎕ (7.38 μmol, 1 eq.)을 아르곤 하에 첨가하였다. 1 h, 3.5 h, 4.5 h, 6.5 h 및 8 h 후, 0.1 M LiOH 용액을 추가적인 당량으로 첨가하였다. 반응 혼합물 조산물을 LaPrep-HPLC에서 정제하였다:
컬럼: Kromasil 100-C18, 10 ㎛, 250 mm x 10 mm, 메탄올 / 물 (0.05% TFA) 사용, 유속: 6.5 ml/min, λ = 295 nm에서 검출. 용매 A: 95% 물 : 5% 메탄올, 0.05% 트리플루오로아세트산. 용매 B: 10% 물 : 90% 메탄올, 0.05% 트리플루오로아세트산. 농도 구배: 0-5분 100% A; 5-20분 0% A; 20-25분 0% A; 25-27분 100% A; 27-35분 100% A.
20.8-21.4분의 체류 시간대의 분획을 수집하여, 용매를 증발시켰다.
1.29 mg (15%의 수율)의 백색 고형물. MS: 1154 M+H+
6.1.2 '-O-(-6-아미노-3,4-디티아-헥실)-α-아마니틴 HDP 30.0353의 합성
Figure pct00016
HDP 30.0341 HDP 30.0353
6'-O-(-6-아미노-3,4-디티아-헥실)-α-아마니틴 HDP 30.0341 1.29 mg (1.12 μmol)을 트리플루오로아세트산 (TFA) 200 ㎕에 용해하였다. 반응 혼합물을 아르곤 하, 주위 온도에서 교반하였다. 1분 후, 트리플루오로아세트산을 톨루엔 1000 ㎕로 희석하고, 증발시켜 건조하였다. 온도는 20℃를 넘지 않아야 한다. 이 과정을 톨루엔 1000 ㎕와 아세토니트릴 1000 ㎕로 반복하였다 (2x). 조산물 α-아마니틴 에테르를 LaPrep-HPLC로 정제하였다:
컬럼: Kromasil 100-C18, 10 ㎛, 250 mm x 10 mm, 메탄올 / 물 (0.05% TFA) 사용, 유속: 6.5 ml/min, λ = 295 nm에서 검출. 용매 A: 95% 물 : 5% 메탄올, 0.05% 트리플루오로아세트산. 용매 B: 10% 물 : 90% 메탄올, 0.05% 트리플루오로아세트산. 농도 구배: 0-5분 100% A; 5-25분 50% A; 25-30분 0% A; 30-35분 0% A; 35-40분 100% A, 40-45분 100% A.
체류 시간 16.1-17.0분의 분획을 수집하여, 용매를 증발시켰다. 잔류물은 수중에서 냉동 건조하였다.
0.39 mg (30% 수율, TFA 염)의 노란색 고형물. MS: 1054 M+H+
6.2 아마니틴-링커 HDP 30.0354
6.2.1 6'O-(NH-boc-7-아미노-4,5-디티아-헵틸)-α-아마니틴 HDP 30.0349의 합성
Figure pct00017
α-아마니틴 HDP 30.0349
진공 건조한 α-아마니틴 5.67 mg (6.17 μmol)을 건조 디메틸 설폭사이드 (DMSO) 250 ㎕에 용해하였다. NH-boc-7-아미노-4,5-디티아-헵틸브로마이드 HDP 30.0345 19.00 mg (58.00 μmol, 9.3 eq.)을 실온에서 아르곤 분위에서 첨가하였다. 물 / DMSO (1:1) 중의 0.1 M LiOH 61.7 ㎕ (6.10 μmol, 1 eq.)을 한번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 3.5시간 교반하고, 추가적으로 NH-boc-7-아미노-4,5-디티아-헵틸브로마이드 HDP 30.0345 10 ㎕ (13.00 mg; 39.7 μmol; 6.3 eq.)과 물 / DMSO (1:1) 중의 0.1 M LiOH 61.7 ㎕을 첨가하였다. 8시간 후, 조산물 반응 혼합물을 LaPrep-HPLC에서 정제하였다:
컬럼: Kromasil 100-C18, 10 ㎛, 250 mm x 20 mm, 메탄올 / 물 (0.05% TFA) 사용, 유속: 26 ml/min, λ = 295 nm에서 검출. 용매 A: 95% 물 : 5% 메탄올, 0.05% 트리플루오로아세트산. 용매 B: 10% 물 : 90% 메탄올, 0.05% 트리플루오로아세트산. 농도 구배: 0-5분 100% A; 5-20분 0% A; 20-30분 0% A; 30-35분 100% A; 35-40분 100% A.
체류 시간대 19.4-21.0분의 분획을 수집하여, 실온에서 증발시켜 건조하였다.
백색 분말 4.83 mg (67%의 수율). MS: 1168 M+H+
6.2.2 6'O-(7-아미노-4,5-디티아-헵틸)-α-아마니틴 HDP 30.0354의 합성
Figure pct00018
HDP 30.0349 HDP 30.0354
6'O-(NH-boc-7-아미노-4,5-디티아-헵틸)-α-아마니틴 HDP 30.0349 4.83 mg (4.13 μmol)을 트리플루오로아세트산 (TFA) 200 ㎕에 용해하였다. 반응 혼합물을 1분간 아르곤 하에 교반하고, 주위 온도에서 증발시켜 건조하였다. 잔류물을 톨루엔 1000 ㎕ 및 아세토니트릴 1000 ㎕로 공동-증발시켰다. 잔류 고형물을 LaPrep-HPLC에서 정제하였다:
컬럼: Kromasil 100-C18, 10 ㎛, 250 mm x 10 mm, 메탄올 / 물 (0.05% TFA) 사용, 유속: 6.5 ml/min, λ = 295 nm에서 검출. 용매 A: 95% 물 : 5% 메탄올, 0.05% 트리플루오로아세트산. 용매 B: 10% 물 : 90% 메탄올, 0.05% 트리플루오로아세트산. 농도 구배: 0-5분 100% A; 5-20분 0% A; 20-25분 0% A; 25-27분 100% A; 27-35분 100% A.
체류 시간 17.1-17.5분대의 분획을 수집하여, 증발시켰다. 잔류물을 수중 냉동 건조하였다.
0.36 mg (7.0% 수율, TFA 염)의 노란색 고형물. MS: 1068 M+H+
6.3 아마니틴-링커 HDP 30.0355
6.3.1 6'O-(NH-boc-7-아미노-3,3-디메틸-4,5-디티아-헵틸)-α-아마니틴 HDP 30.0350의 합성
Figure pct00019
α-아마니틴 HDP 30.0350
진공 건조한 α-아마니틴 5.67 mg (6.17 μmol)을 건조 디메틸 설폭사이드 (DMSO) 250 ㎕에 용해하였다. 아르곤 하에, NH-boc-7-아미노-3,3-디메틸-4,5-디티아-헵틸브로마이드 HDP 30.0348 18.00 mg (51.62 μmol, 9.8 eq.)과 물 / DMSO (1:1) 중의 0.1 M LiOH 61.7 ㎕ (6.10 μmol, 1 eq.)을 첨가하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 NH-boc-7-아미노-3,3-디메틸-4,5-디티아-헵틸브로마이드 HDP 30.0345 10 ㎕ (12.00 mg; 34.4 μmol; 5.6 eq.) 및 0.1 M LiOH 61.7 ㎕로 반복 처리하였다. 8시간 후, 혼합물을 DMSO로 희석하고, LaPrep-HPLC에서 정제하였다:
컬럼: Kromasil 100-C18, 10 ㎛, 250 mm x 20 mm, 메탄올 / 물 (0.05% TFA) 사용, 유속: 26 ml/min, λ = 295 nm에서 검출. 용매 A: 95% 물 : 5% 메탄올, 0.05% 트리플루오로아세트산. 용매 B: 10% 물 : 90% 메탄올, 0.05% 트리플루오로아세트산. 농도 구배: 0-5분 100% A; 5-20분 0% A; 20-30분 0% A; 30-35분 100% A; 35-40분 100% A.
체류 시간대 20.5-21.0분의 분획을 수집하여, 용매를 증발시켰다.
0.51 mg (7% 수율; 변환된 α-아마니틴을 기준으로 수율 48%). MS: 1196 M+H+
6.3.2 6'O-(7-아미노-3,3-디메틸-4,5-디티아-헵틸)-α-아마니틴 HDP 30.0355의 합성
Figure pct00020
HDP 30.0350 HDP 30.0355
HDP 30.0350 0.51 mg (0.43 μmol)을 트리플루오로아세트산 (TFA) 200 ㎕ 에 용해하여, 주위 온도에서 1분간 교반하였다. 트리플루오로아세트산을 톨루엔 1000 ㎕으로 희석하고, 20℃에서 증발시켜 건조하였다. 이 과정을 톨루엔 1000 ㎕와 아세토니트릴 1000 ㎕로 반복하였다 (2x). 반응 혼합물을 LaPrep-HPLC에서 정제하였다:
컬럼: Kromasil 100-C18, 10 ㎛, 250 mm x 10 mm, 메탄올 / 물 (0.05% TFA) 사용, 유속: 6.5 ml/min, λ = 295 nm에서 검출. 용매 A: 95% 물 : 5% 메탄올, 0.05% 트리플루오로아세트산. 용매 B: 10% 물 : 90% 메탄올, 0.05% 트리플루오로아세트산. 농도 구배: 0-5분 100% A; 5-20분 0% A; 20-25분 0% A; 25-27분 100% A; 27-35분 100% A.
체류 시간대 18.2-18.6분의 분획을 수집하여, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 수중 냉동 건조하였다.
0.15 mg (27% 수율, TFA 염)의 노란색 고형물. MS: 1096 M+H+
6.4 아마니틴-링커 HDP 30.0409
6.4.1 6'O-(NH-boc-12-아미노-도데실)-α-아마니틴 HDP 30.0404의 합성
Figure pct00021
α-아마니틴 HDP 30.0404
진공 건조한 α-아마니틴 6.67 mg (7.26 μmol)을 건조 디메틸 설폭사이드 (DMSO) 250 ㎕에 용해하였다. NH-boc-12-아미노-도데실브로마이드 HDP 30.0383 21.00 mg (58.10 μmol, 8 eq.) 및 물 / DMSO (1:1) 중의 0.1 M LiOH 72.6 ㎕ (7.26 μmol, 1 eq.)을 첨가하였다. 6시간 후, 0.1 M LiOH 36.5 ㎕을 첨가하고, 2시간 후 DMSO 중의 0.1 M 아세트산 용액 72.6 ㎕로 혼합물을 퀀칭하였다. 조산물 반응 산물을 LaPrep-HPLC에서 정제하였다:
컬럼: Kromasil 100-C18, 10 ㎛, 250 mm x 20 mm, 메탄올 / 물 (0.05% TFA) 사용, 유속: 26 ml/min, λ = 295 nm에서 검출. 용매 A: 95% 물 : 5% 메탄올. 용매 B: 5% 물 : 95% 메탄올. 농도 구배: 0-5분 100% A; 5-20분 0% A; 20-25분 0% A; 25-27분 100% A; 27-35분 100% A.
체류 시간대 22.0-22.7분의 분획을 수집하여, 용매를 증발시켰다.
5.96 mg (68%의 수율)의 백색 고형물. MS: 1202 M+H+
6.4.2 6`-O-(12-아미노도데실)-α-아마니틴 HDP 30.0409의 합성
Figure pct00022
HDP 30.0404 HDP 30.0409
HDP 30.0404 5.96 mg (4.96 μmol)을 트리플루오로아세트산 (TFA) 200 ㎕에 용해하고, 1분간 주위 온도에서 교반하였다. 반응 혼합물을 톨루엔 1000 ㎕ 및 아세토니트릴로 공동-증발시키고, 잔류 고형물을 LaPrep-HPLC에서 정제하였다:
컬럼: Kromasil 100-C18, 10 ㎛, 250 mm x 20 mm, 아세토니트릴 / 물 사용, 유속: 26 ml/min, λ = 295 nm에서 검출. 용매 A: 95% 물 : 5% 아세토니트릴. 용매 B: 5% 물 : 95% 아세토니트릴. 농도 구배: 0-5분 100% A; 5-20분 0% A; 20-25분 0% A; 25-27분 100% A; 27-35분 100% A.
체류 시간 18.6-19.2분의 분획을 수집하여, 백색 고형물로 증발시켰다.
6.03 mg (99% 수율, TFA 염). MS: 1102 M+H+
6.5 아마니틴-링커 HDP 30.0410
6.5.1 6'O-(NH-boc-11-아미노-3,6,9-트리옥사-운데실)-α-아마니틴 HDP 30.0405의 합성
Figure pct00023
α-아마니틴 HDP 30.0405
진공 건조한 α-아마니틴 6.67 mg (7.26 μmol)을 건조 디메틸 설폭사이드 (DMSO) 250 ㎕에 용해하였다. NH-boc-11-아미노-3,6,9-트리옥사-운데실브로마이드 HDP 30.0391 20.51 mg (58.10 μmol, 8 eq.)와 물 / DMSO (1:1) 중의 0.1 M LiOH 72.6 ㎕ (7.26 μmol, 1 eq.)을 첨가하였다. 반응을 아르곤 분위기 하 주위 온도에서 수행하였다. 6시간 후, 추가적으로 LiOH 염기 (0.5 eq.)를 첨가하였다. 혼합물을 8시간 후 DMSO 중의 0.1 M 아세트산 용액 72.6 ㎕로 퀀칭하고, LaPrep-HPLC에서 정제하였다:
컬럼: Kromasil 100-C18, 10 ㎛, 250 mm x 20 mm, 메탄올 / 물 (0.05% TFA) 사용, 유속: 26 ml/min, λ = 295 nm에서 검출. 용매 A: 95% 물 : 5% 메탄올. 용매 B: 5% 물 : 95% 메탄올. 농도 구배: 0-5분 100% A; 5-20분 0% A; 20-25분 0% A; 25-27분 100% A; 27-35분 100% A.
체류 시간 18.1-18.6분대의 분획을 수집하여, 용매를 증발시켰다.
4.68 mg (54%의 수율)의 고형물. MS: 1194 M+H+
6.5.2 6'O-(11-아미노-3,6,9-트리옥사-운데실)-α-아마니틴 HDP 30.0410의 합성
Figure pct00024
HDP 30.0405 HDP 30.0410
HDP 30.0405 4.68 mg (3.92 μmol)을 트리플루오로아세트산 (TFA) 200 ㎕에 용해하여, 주위 온도에서 1분간 교반하였다. 반응 혼합물을 톨루엔과 아세토니트릴로 공동-증발시키고, 조산물 고형물을 LaPrep-HPLC에서 정제하였다:
컬럼: Kromasil 100-C18, 10 ㎛, 250 mm x 20 mm, 메탄올 / 물 (0.05% TFA) 사용, 유속: 26 ml/ min, λ = 295 nm에서 검출. 용매 A: 95% 물 : 5% 메탄올. 용매 B: 5% 물 : 95% 메탄올. 농도 구배: 0-5분 100% A; 5-20분 0% A; 20-25분 0% A; 25-27분 100% A; 27-35분 100% A.
체류 시간 18.6-19.2분의 분획을 수집하여, 증발시켰다. 잔류 고형물을 수중 냉동 건조하였다.
2.44 mg (52% 수율, TFA 염). 백색 분말. MS: 1102 M+H+
6.6 아마니틴-링커 HDP 30.0411
6.6.1 6'O-(NH-boc-16-아미노-헥사데실)-α-아마니틴 HDP 30.0406의 합성
Figure pct00025
α-아마니틴 HDP 30.0406
진공 건조한 α-아마니틴 6.67 mg (7.26 μmol)을 건조 디메틸 설폭사이드 (DMSO) 750 ㎕에 용해하였다. NH-boc-16-아미노-헥사데실브로마이드 HDP 30.0398 24.00 mg (58.10 μmol, 8 eq.)을 실온에서 아르곤 하에 첨가하였다. 물 / DMSO (1:1) 중의 0.1 M LiOH 72.6 ㎕ (7.26 μmol, 1 eq.)를 첨가하고, 반응 혼합물을 50℃로 가열하였다. 6시간 후, LiOH 염기 (36.5 ㎕)를 첨가하고, 반응 혼합물을 8시간 후 DMSO 중의 0.1 M 아세트산 용액 72.6 ㎕로 퀀칭하였다. 고형화된 반응 혼합물을 DMSO로 희석하고, LaPrep-HPLC에서 정제하였다:
컬럼: Kromasil 100-C18, 10 ㎛, 250 mm x 20 mm, 메탄올 / 물 (0.05% TFA) 사용, 유속: 26 ml/ min, λ = 295 nm에서 검출. 용매 A: 95% 물 : 5% 메탄올. 용매 B: 5% 물 : 95% 메탄올. 농도 구배: 0-5분 100% A; 5-20분 0% A; 20-25분 0% A; 25-27분 100% A; 27-35분 100% A.
체류 시간 23.4-24.1분대의 분획을 수집하여, 용매를 증발시켰다.
4.41 mg (48%의 수율)의 백색 고형물. MS: 1258 M+H+
6.6.2 6'O-(16-아미노-헥사데실)-α-아마니틴 HDP 30.0411의 합성
Figure pct00026
HDP 30.0406 HDP 30.0411
HDP 30.0406 4.41 mg (3.50 μmol)을 트리플루오로아세트산 (TFA) 200 ㎕에 용해하여, 2분간 주위 온도에서 교반하였다. 반응 혼합물을 톨루엔 1000 ㎕과 아세토니트릴 1000 ㎕을 사용하여 공동-증발시키고, 고형 잔류물을 LaPrep-HPLC에서 정제하였다:
컬럼: Kromasil 100-C18, 10 ㎛, 250 mm x 20 mm, 메탄올 / 물 (0.05% TFA) 사용, 유속: 26 ml/min, λ = 295 nm에서 검출. 용매 A: 95% 물 : 5% 메탄올. 용매 B: 5% 물 : 95% 메탄올. 농도 구배: 0-5분 100% A; 5-20분 0% A; 20-25분 0% A; 25-27분 100% A; 27-35분 100% A.
체류 시간 20.5-21.2분의 분획을 수집하여, 증발시켰다. 잔류물을 수중 냉동 건조하였다.
2.44 mg (52% 수율, TFA 염). MS: 1102 M+H+
6.7 아마니틴-링커 HDP 30.0412
6.7.1 6'O-(NH-boc-2-아미노-에틸)-α-아마니틴 HDP 30.0317의 합성
Figure pct00027
α-아마니틴 HDP 30.0317
진공 건조한 α-아마니틴 20.00 mg (21.8 μmol)을 건조 디메틸 설폭사이드 (DMSO) 900 ㎕에 용해하였다. DMSO 중의 0.218M 포타슘-t-부틸레이트 용액 100.0 ㎕ (21.8 μmol, 1 eq.)과 NH-boc-2-아미노에틸브로마이드 (Fluka) 39.00 mg (174.1 μmol, 8 eq.)을 실온에서 첨가하였다. 4시간 및 6시간 후, 포타슘-t-부틸레이트 및 NH-boc-2-아미노에틸브로마이드를 1 및 2의 추가 당량으로 첨가하였다. 혼합물을 23시간 후 DMSO 중의 0.1 M 아세트산 용액 72.6 ㎕로 퀀칭하고, LaPrep-HPLC에서 정제하였다:
컬럼: Kromasil 100-C18, 10 ㎛, 250 mm x 20 mm, 메탄올 / 물 (0.05% TFA) 사용, 유속: 26 ml/min, λ = 295 nm에서 검출. 용매 A: 95% 물 : 5% 메탄올. 용매 B: 5% 물 : 95% 메탄올. 농도 구배: 0-5분 100% A; 5-20분 0% A; 20-25분 0% A; 25-27분 100% A; 27-35분 100% A.
체류 시간 13.2-14.5분의 분획을 수집하여, 용매를 증발시켰다.
3.86 mg (16%의 수율)의 백색 고형물. MS: 1062 M+H+
6.7.2 6'O-(2-아미노-에틸)-α-아마니틴 HDP 30.0412의 합성
Figure pct00028
HDP 30.0317 HDP 30.0412
HDP 30.0317 3.86 mg (3.36 μmol)을 트리플루오로아세트산 (TFA) 200 ㎕에 용해하고, 2분간 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 톨루엔 1000 ㎕ 및 아세토니트릴 1000 ㎕로 공동-증발시키고, 고형물을 LaPrep-HPLC에서 정제하였다:
컬럼: Kromasil 100-C18, 10 ㎛, 250 mm x 20 mm, 메탄올 / 물 (0.05% TFA) 사용, 유속: 26 ml/min, λ = 295 nm에서 검출. 용매 A: 95% 물 : 5% 메탄올. 용매 B: 5% 물 : 95% 메탄올. 농도 구배: 0-5분 100% A; 5-20분 0% A; 20-25분 0% A; 25-27분 100% A; 27-35분 100% A.
체류 시간 20.5-21.2분의 분획을 수집하여, 증발시켰다. 잔류물을 수중 냉동 건조하였다.
1.54 mg (44% 수율, TFA 염)의 백색 고형물. MS: 962 M+H+

Claims (16)

  1. 링커 L을 통해 아마톡신(amatoxin)과 연결된 표적-결합성 모이어티를 포함하는 접합체로서,
    상기 링커 L이,
    (i) 아마톡신 1번 아미노산의 γ C-원자를 통해, 특히 아미드 결합을 통해;
    (ii) 아마톡신 3번 아미노산의 δ C-원자에 결합된 산소 원자를 통해, 특히 에스테르 결합, 에테르 결합 또는 우레탄 결합을 통해; 또는
    (iii) 아마톡신 4번 아미노산의 6' C-원자를 통해, 특히 아마톡신 4번 아미노산의 6' C-원자에 결합된 산소 원자를 통해, 아마톡신과 연결되며,
    각 경우에, 상기 링커 L이 우레아 모이어티를 통해 상기 표적-결합성 모이어티에 연결되는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 접합체가 하기 구조들로부터 선택되는 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 접합체:
    (i) 아마톡신-γC(O)-NH-L-NH-C(O)-NH-표적-결합성 모이어티;
    (ii) 아마톡신-δC-O-C(O)-L-NH-C(O)-NH-표적-결합성 모이어티;
    (iii) 아마톡신-δC-O-L-NH-C(O)-NH-표적-결합성 모이어티;
    (iv) 아마톡신-δC-O-C(O)-NH-L-NH-C(O)-NH-표적-결합성 모이어티; 및
    (v) 아마톡신-6'C-O-L-NH-C(O)-NH-표적-결합성 모이어티.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 표적-결합성 모이어티가 표적-결합성 모이어티에 존재하는 아미노기를 통해 링커 L에 연결되며,
    상기 아미노기가 상기 우레아 모이어티의 일부를 형성하는 것을 특징으로 하는 접합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 아마톡신이 α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린 또는 아마눌린 산, 또는 이들의 염 또는 유사체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 상기 링커 L이, 선택적으로 치환된, 알킬렌, 헤테로알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알케닐렌, 알키닐렌, 헤테로알키닐렌, 사이클로알킬렌, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 아랄킬렌 또는 헤테로아랄킬렌 기인 것을 특징으로 하는 접합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서, 상기 링커 L이 디설파이드, 에테르, 아민, 에스테르, 카르복사미드, 우레탄 및 우레아 모이어티로부터 선택되는 하나의 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 접합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 표적-결합성 모이어티가 종양 세포 상에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하며,
    특히, 상기 표적-결합성 모이어티가 상피 세포 부착 분자 (EpCAM)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 접합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 표적-결합성 모이어티가
    (i) 항체 또는 이의 항원-결합성 단편;
    (ii) 항체-유사 단백질; 및
    (iii) 핵산 앱타머(aptamer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합성 단편이 다이아바디(diabody), 테트라바디 (tetrabody), 나노바디, 키메라 항체, 탈면역화된 항체(deimmunized antibody), 인간화된 항체(humanized antibody) 또는 인간 항체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 항원-결합성 단편이 Fab, F(ab')2, Fd, Fv, 단쇄 Fv 및 이황화-연결된 Fvs (dsFv)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 있어서, 의약제로서 사용하기 위한 것인 것을 특징으로 하는 접합체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한항에 있어서, 환자에게서 췌장암, 담관암, 유방암, 결장직장암, 폐암, 전립선암, 난소암, 위암, 신장암, 악성 흑색종, 백혈병 및 악성 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암을 치료하기 위한 것인 것을 특징으로 하는 접합체.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 따른 접합체를 포함하며,
    하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 부형제, 충전제, 결합제, 윤활제, 활택제, 붕해제, 흡착제 및/또는 보존제를 더 포함하는, 약학 조성물.
  14. 아마톡신-접합 분자로서,
    (i) 아마톡신 1번 아미노산의 γ C-원자를 통해, 특히 아미드 결합을 통해;
    (ii) 아마톡신 3번 아미노산의 δ C-원자에 결합된 산소 원자를 통해, 특히 에스테르 결합, 에테르 결합 또는 우레탄 결합을 통해; 또는
    (iii) 아마톡신 4번 아미노산의 6' C-원자를 통해, 특히 아마톡신 4번 아미노산의 6' C-원자에 결합된 산소 원자를 통해, 아마톡신과 연결된 링커 L을 포함하며,
    각 경우에, 상기 링커 L이 카르밤산 유도체 -NH-C(O)-X를 포함하며,
    상기 X는 표적-결합성 모이어티의 1차 아민에 의해 치환될 수 있는 이탈기인 것을 특징으로 하는, 아마톡신-접합 분자.
  15. 제14항에 있어서, 상기 X가 t-부틸옥시, -숙신이미딜옥시, -1-O-숙신이미딜옥시-3-설포네이트 (-설포-NHS), -O-(4-니트로페닐옥시), -O-(3-니트로페닐옥시), -O-(2,4-디니트로페닐옥시), -O-(2,4-디클로로-6-니트로페닐옥시), -펜타플루오로페닐옥시, -펜타클로로페닐옥시, -O-(2,4,5-트리클로로페닐옥시), -O-(3,4-디하이드로-3-하이드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진-3-일), -O-(엔도-1-하이드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복스이미드-1-일), -1-프탈이미도일옥시, -1-벤조트리아졸릴옥시, -1-(7-아자-벤조트리아졸릴)옥시), 및 -N-이미다졸릴로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 아마톡신-접합 분자.
  16. 제14항 또는 제15항의 아마톡신-접합 분자를 1차 아미노기를 포함하는 표적-결합성 모이어티와 반응시키는 단계를 포함하는,
    제1항 내지 제12항 중 어느 한항에 따른 접합체의 합성 방법.
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