KR20130114553A

KR20130114553A - 핵산중합효소로 핵산을 검출하는데 사용되는 고민감도 핵산준비방법

Info

Publication number: KR20130114553A
Application number: KR1020120093222A
Authority: KR
Inventors: 박한오; 이준희; 김현서; 최소라; 김종훈
Original assignee: (주)바이오니아
Priority date: 2012-04-09
Filing date: 2012-08-24
Publication date: 2013-10-17
Also published as: CN104350159B; EP2837696A2; EP2837696B1; CN104350159A; US20150072351A1; WO2013154304A3; CN114410738A; KR101545848B1; EP2837696A4; WO2013154304A2

Abstract

본 발명은 고민감도 핵산준비방법에 관한 것으로, 상기 본 발명에 따른 핵산준비방법은 극미량의 핵산을 검출하기 위한 PCR 반응이나 실시간 정량 PCR 등 핵산중합반응에 앞서서 분석에 사용될 핵산들에 미리 핵산중합효소를 사용하여 터미네이터를 부가함으로써 타깃 핵산의 증폭반응과 경쟁적으로 일어나는 비특이적 프라이밍을 근본적으로 제거할 수 있어서 극미량의 타깃 핵산만을 정확하게 검출하고 타깃 핵산의 농도를 정확하게 측정할 수 있는 장점이 있다.

Description

핵산중합효소로 핵산을 검출하는데 사용되는 고민감도 핵산준비방법{High-sensitivity nucleic acid preparation methods for the detection of nucleic acid by nucleic acid polymerization}

본 발명은 핵산중합효소로 핵산을 검출하는데 사용되는 고민감도 핵산준비방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 PCR, RT-PCR,정량 PCR, 정량 RT-PCR, 전사증폭 또는 상온핵산증폭에 필요한 핵산중합효소와 프라이머를 이용한 핵산 검출에 있어서, 상기 핵산 검출에 사용되는 핵산시료의 준비방법으로 생체시료에서 추출된 핵산에 포함되어 있는 단일나선 핵산에 의한 셀프프라이밍에 의한 비특이적인 핵산중합을 방지하여 극미량의 핵산검출을 가능하게 하는 핵산준비방법에 관한 것이다.

핵산중합효소를 이용한 다양한 핵산 검출방법은 높은 민감도와 특이도로 바이러스, 병원균, 암유전자 검사 등 각종 검사에 이용되고 있다. 높은 민감도가 가능한 것은 핵산중합효소에 의해 타깃(Target)핵산을 수억개 이상으로 핵산을 증폭하여 검출할 수 있기 때문이다. 높은 특이도가 가능한 것은 타깃핵산에 특이적으로 혼성화 되는 프라이머를 이용하여 혼성화 온도에서 타깃핵산에 선택적인 혼성화를 통한 프라이밍으로 핵산중합반응을 선택적으로 시킬 수 있기 때문이다. 그런데 극미량의 핵산을 검출하기 위한 PCR 반응이나 실시간 정량 PCR 반응 등 각종 핵산중합효소를 사용하는 검출법에서, 비특이적 프라이밍과 이어지는 중합반응은 검출한계를 떨어뜨리는 주요요인으로 작용한다. 이러한 비특이적 증폭은 첨가해준 프라이머가 타깃 핵산에 혼성화되어 프라이밍 되는 반응과 경쟁적으로 많은 수로 존재하는 단일나선 핵산이 비특이적으로 부분적으로 혼성화되어 프라이밍이 됨으로써 핵산중합반응이 경쟁적으로 일어나기 때문이다.

비특이적 핵산중합반응이 많이 일어날 경우 원하는 타깃 핵산이 증폭되기 전에 핵산중합반응에 필요한 요소들을 다 소비되어, 더 이상 핵산중합 반응이 진행되지 못함으로써 타깃 핵산의 증폭 및 검출을 실패하게 된다. 특히, 비특이적 핵산중합반응은 타깃 핵산의 수가 매우 적고 단일나선 핵산을 많이 포함하고 있는 비타깃 핵산들이 아주 많은 경우에 심하게 영향을 받는다. 예를 들면 프로브를 이용하는 실시간 정량 PCR의 경우, 비타깃 핵산의 비율이 점점 증가할수록 실시간 정량 PCR 곡선의 델타 Rn 값이 점점 감소하게 되고, 결국은 일정량 이상이 되면 타깃을 검출할 수 없는 조건이 된다.

단일나선 핵산을 대부분 포함하고 있는 RNA 검출은 일반적으로 DNA 검출에 비해 민감도가 떨어진다. 일반적으로 RNA를 검출하는 방법은 역전사 반응(Reverse transcriptase; RT) 수행하고, 이어서 PCR 반응을 수행한다. 고민감도 반응을 위해서는 RT 반응을 한 개의 반응기에서 먼저 수행하고 RT 반응완료 후 이것을 가지고 별도의 반응기에서 PCR 반응을 시킨다.

그러나 이 경우 반응튜브를 다시 열고 용액을 가해주어야 하므로 번거로울 뿐만 아니라 반응튜브를 열고 조작하는 과정에서 오염의 가능성도 더 높아 일반적으로 한 튜브 내에서 역전사 반응(Reverse transcriptase; RT) 후 PCR 반응을 수행하는 역전사 중합연쇄반응(RT-PCR)법이 많이 이용하고 있다. 그러나 이 경우 별도로 반응을 시키는 것에 비해 민감도가 많이 떨어지는 문제점이 있다.

상기 역전사 중합연쇄반응(RT-PCR)은 역전사 반응 시 프라이머가 필요한데 랜덤 프라이머를 사용하는 방법과 타깃특이 프라이머인 안티센스 프라이머를 사용하는 방법이 있다.

랜덤 프라이머를 사용하는 방법은 모든 핵산에 대한 cDNA를 만들 수 있어 cDNA 라이브러리(cDNA library)나 전사체 분석을 위한 cDNA를 만드는데 많이 이용되어 왔다. 그러나 미량의 RNA를 검출할 경우에는 모든 RNA에 대한 cDNA가 합성되어 많은 수의 비타깃 cDNA가 만들어지기 때문에 비타깃 DNA의 양이 너무 많아져서 상기에 기술한 바와 같이 타깃을 검출하기 어려운 문제점이 있다. 이와 같은 경우 RNA 바이러스 진단키트와 같이 높은 민감도로 검출해야 하는 경우는 타깃 RNA에 상보적인 안티센스 프라이머를 사용하는 방법을 일반적으로 이용한다.

상기 타깃 특이적인 안티센스 프라이머는 일반적으로 검출한도를 높일 수 있다. 그러나 이러한 타깃 특이적인 프라이머를 사용을 할 경우라도 상온에서 높은 활성을 가지고 있는 역전사효소를 포함한 반응용액과 RNA들을 섞어 주는 과정에서 프라이머의 혼성화 온도 보다 낮은 온도에서 발생하는 비특이적인 프라이밍(priming), 그리고 그에 따른 역전사 반응을 막을 수 없기 때문에 많은 수의 비특이 cDNA가 생성되는 문제가 발생한다.

상기 문제를 해결하고 미량의 핵산을 검출하기 위해 개발된 기술이 핫스타트 PCR 반응이다. 핫스타트 PCR 반응은 시료 혼합과정을 포함하여 낮은 온도에서 PCR 반응이 개시되지 못하도록 제어하고, 이후 타깃특이 프라이머의 혼성화 온도 이상에서만 PCR 반응을 활성화 시키는 방법이다.

상기 방법은 프라이머가 타깃 핵산과 완전히 혼성화를 이루는 온도에 도달한 이후에만 PCR 반응이 시작됨으로써 프라이머의 혼성화 온도 보다 낮은 온도에서 비특이적으로 프라이밍 되어 PCR 반응이 진행되는 것을 방지할 수 있다. 구체적인 방법으로는 중합효소 저해제인 파이로포스페이트(Pyrophosphate)가 반응액에 포함되어 있고, 여기에 파이로포스페이트를 분해시키는 파이로포스파타제(Pyrophosphatase)가 추가적으로 포함되어 있어, 프라이머 혼성화 온도에서 일정시간을 반응시켜 파이로포스페이트를 제거함으로써 PCR 반응이 비로서 시작되므로, 저온에서의 비특이적인 핵산 합성을 억제하여 미량의 핵산을 검출할 수 있는 핫스타트 PCR 방법이 개발되었다. 상기 핫스타트 PCR 방법에 대하여, 본 출원인은 대한민국 특허등록 제10-1098764를 통해 출원한 바 있다.

그러나 타깃 RNA가 극미량 들어 있는 경우에 안티센스 프라이머 또는 핫스타트 역전사 반응을 이용하여 반응을 수행한다고 해도 타깃 RNA에 대한 cDNA만을 합성할 수 없는 것이 현실이다. 그 이유는 안티센스 프라이머가 혼성화되는 온도에서 프라이머가 아닌 다양한 RNA들이 혼성화 될 수 있기 때문이다. 이러한 비타깃의 다양한 RNA들은 역전사 반응의 프라이머로 작용할 수 있고 결국, 타깃 핵산과 혼성화되어 프라이머로 작용하여 다양한 cDNA를 만들어 내게 된다.

특히, 혈청이나 파라핀 블럭 조직에서 추출된 RNA와 같이 100 bp 염기 이하의 짧은 길이의 RNA들이 대량으로 포함되어 있는 시료들을 주형으로 하여, 역전사 반응을 수행하는 경우에는 프라이머 보다 길이가 조금 긴 RNA들이 다량으로 포함되어 있어, 역전사 반응 온도에서 다양한 RNA들이 프라이밍 되어 엄청나게 다양한 수의 cDNA를 만들어 내게 된다. 이러한 cDNA는 이어지는 PCR 반응에 참여하여 다양한 비특이적 증폭물들을 생성하게 되는 결과를 초래하게 된다.

이러한 현상은 극미량의 암세포나 RNA 바이러스 들어있는 생체 시료들을 대상으로 하는 검사를 수행하는 경우에 큰 문제가 된다. 타깃 RNA를 검출하려면 가능한 한 많은 양의 생체 시료로부터 핵산을 추출하여야 하는데, 이때 추출되는 RNA 양은 생체시료의 양과 비례하여 늘어나므로 비타깃 RNA의 양은 필연적으로 증가하게 되고 결국, 비특이적인 역전사 반응으로 무수한 cDNA들이 만들어지게 된다. 또한, 이들 중에는 타깃특이 프라이머에 부분적인 염기서열 유사성을 가진 cDNA도 포함되어 있어, 이어지는 PCR 반응단계에서 비특이적으로 증폭됨으로써 타깃 핵산의 증폭 보다 비타깃 핵산들이 먼저 증폭되어 반응이 종결되고 결국, 극미량의 암세포나 바이러스의 RNA들을 증폭 및 검출을 불가능하게 하는 주요 원인이 된다.

이러한 문제들을 해결하기 위해 현재 여러 가지 시도들이 이루어지고 있다.

첫째, 프라이머를 좀 더 특이하게 혼성화하게 하여 특정타깃의 검출한계를 높이려는 시도들이다. 프라이머의 5' 말단을 LNA로 치환하여 좀 더 강하게 타깃에 혼성화되도록 하여 결과적으로 비특이증폭을 줄일 수 있게 하는 방법이 개발되었다( Quantification of low-expressed mRNA using 5' LNA-containing real-time PCR primers. Malgoyre A, Banzet S, Mouret C, Bigard AX, Peinnequin A. Biochem Biophys Res Commun. 2007 Mar 2;354(1):246-52. Epub 2007 Jan 3.).

둘째, RT 반응단계에서 특히 낮은 온도에서 RT 반응을 수행할 때 프라이머들간의 부분적인 혼성화에 의해 중합이 진행되어 다이머 형성이 일어날 수 있고, 이것은 RT 반응에서 민감도를 급격히 떨어뜨리는 중요한 원인중의 하나이다. 이를 해결하기 위해 프라이머가 낮은 온도에서 가능한 한 부분적인 혼성화가 일어나지 않게 한 기술들이 개발되었다. 5'의 염기서열의 5 bp 염기가 헤어핀을 형성할 수 있게 더 늘려서 형성시킨 프라이머를 사용하는 것이 개발되었다(Development of a highly sensitive real-time one step RT-PCR combined complementary locked primer technology and conjugated minor groove binder probe, JiYoung Hong, Byunghak Kang, Ahyoun Kim, Seoyeon Hwang, Jinhee Ahn, Sunhwa Lee, Jonghyen Kim, Jae-Hak Park, Doo-Sung Cheon Virol J. 2011; 8: 330. Published online 2011 June 29. doi: 10.1186/1743-422X-8-330)

그러나 이러한 록프라이머 방법은 추가적으로 들어간 염기서열에 의해 높은 혼성화 온도를 가지게 되므로, 염기서열이 비슷한 비특이 타깃에 대해 비특이적인 혼성화를 유도할 수 있고, 혼성화 단계에서도 내부의 헤어핀구조에 의해 효율성이 좀 떨어지는 문제점을 가지고 있다.

또한 고온에서 혼성화하는 프라이머를 사용하고 고온에서도 작동하는 AMV 역전사효소를 이용하여 70℃와 같은 고온에서 cDNA를 합성하면 좀 더 특이적으로 증폭을 할 수 있다는 것이 발표되었다(High temperature cDNA synthesis by AMV reverse transcriptase improves the specificity of PCR. Fuchs B, Zhang K, Rock MG, Bolander ME, Sarkar G. Mol Biotechnol. 1999 Oct;12(3):237-40.) 멀티플렉스 RT-PCR 반응에서는 특이도가 더욱 중요하다.

상기 멀티플렉스 원튜브 RT-PCR 방식은 열에 의해 분해되는 포스포트리에스터를 이용하여 초기에는 프라이머로서 블로킹이 되어 있다가 순차적으로 열에 의해 가수분해되어 프라이머로 작동할 수 있는 방법이다(BMC Mol Biol. 2009 Dec 30;10:113. Selective control of primer usage in multiplex one-step reverse transcription PCR. Hidalgo Ashrafi E, Yee J, Paul N.) 이러한 방법을 이용하여 센스 프라이머에 의한 비특이적 프라이밍을 방지하여 비특이적인 cDNA 합성을 저해함으로서 멀티플렉스 RT-PCR의 특이도와 민감도를 높일 수 있었다.

또한, 호흡기검체시료에서 다양한 바이러스들을 검사하는 키트의 민감도를 높이기 위해, 호흡기 검체에 포함되어 있는 rRNA가 역전사 반응을 하지 못하게 rRNA와 상동성이 있는 프라이머들은 배제하고, rRNA와 상보적인 염기배열이 있는 부분에 해당하는 3' 말단이 블로킹된 올리고를 RT 반응 시에 같이 넣어주어, rRNA가 역전사되어 증폭되는 것을 방지함으로써 높은 민감도로 RT-PCR 을 수행할 수 있는 방법도 개발되었다(A sensitive assay for virus discovery in respiratory clinical samples. de Vries M, Deijs M, Canuti M, van Schaik BD, Faria NR, van de Garde MD, Jachimowski LC, Jebbink MF, Jakobs M, Luyf AC, Coenjaerts FE, Claas EC, Molenkamp R, Koekkoek SM, Lammens C, Leus F, Goossens H, Ieven M, Baas F, van der Hoek L.)

또한, Taqman 방식의 실시간 정량 PCR을 사용한 on-tube RT PCR 방식은 높은 민감도와 선택성을 가지지만 혈액에서 핵산을 추출한 시료와 같이 RNA/DNA가 포함되어 있는 시료의 경우 반응 당 100 copy 이하의 시료를 검출할 수 없는 문제가 있다(Espy M. J. et al 2006 Realtime PCR in clinical microbiology:application for routine laboratory testing. Clin. Microbiol. Rev. 19:165-256). 이러한 문제들을 해결하기 위해 일차적으로 일반 PCR로 15 싸이클을 돌려서 증폭을 하고, 이것을 다시 실시간 정량 PCR을 돌리는 방법을 사용하고 있으나 번거롭고 위양성의 위험성을 항상 가지고 있는 문제점이 있다(Highly Sensitive and Broadly Reactive Quantitative Reverse Transcription-PCR Assay for High-Throughput Detection of Rift Valley Fever Virus. Brian H. Bird et al, J Clin Microbiol. 2007 November; 45(11): 35063513. Published online 2007 September 5.)

DNA의 경우도 마찬가지로, 생체시료의 분리ㅇ정제과정 및 시료의 분해를 통해 발생되는 짧은 조각의 DNA 단편들이 포함되어 핵산 추출물인 경우 PCR 반응에서 95℃에서 변성 후, 혼성화 과정에서 수많은 짧은 조각의 DNA 단일 가닥들이 프라이머로 작용한 비특이적 프라이밍으로 인해 비특이적 핵산들이 다량 증폭됨으로서 목적 타깃 핵산을 검출할 수 없는 문제점이 발생하고 있다.

정밀한 핵산검사를 수행하기 위해서는 고효율로 핵산을 추출하여 고민감도로 핵산증폭이 될 수 있게 준비하는 것이 중요하다. 이러한 핵산추출을 자동으로 수행하는 여러 종의 자동핵산추출장비가 개발되어 있음에도 불구하고, 극미량의 핵산을 검출하기 위한 PCR 반응이나 실시간 정량 PCR반응 등 핵산중합효소와 프라이머를 사용하여 핵산을 증폭하는 반응들에서 주형핵산 자체가 비특이적으로 프라이밍되어 주로 증폭됨으로 인해 위양성을 일으키거나 타깃 핵산을 검출하기 어려운 문제점이 있다.

이에, 본 발명자들은, 핵산중합효소와 프라이머를 이용하여 타깃 핵산을 검출하기 위한 PCR 반응 또는 실시간 정량 PCR 반응 등 핵산증폭반응에서, 주형핵산을 미리 중합반응을 종결시키는 핵산중합 터미네이터와 중합효소를 첨가하여 터미네이션 반응시킨 후, 핵산중합 터미네이터를 제거하여 준비된 주형핵산을 이용함으로써 타깃핵산만을 고민감도로 증폭하고 검출할 수 있는 고민감도의 핵산준비방법을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

보다 상세하게는 상기 고민감도의 핵산준비방법은 극미량의 핵산을 검출하기 위한 PCR 반응이나 실시간 정량 PCR 반응 등 핵산중합을 이용한 핵산검출에 사용되는 주형핵산에 핵산중합 터미네이터를 첨가함으로써 타깃핵산의 증폭반응을 저해하는 비특이적 셀프프라이밍과 이어지는 비특이적 증폭을 근본적으로 제거할 수 있음을 발견한 것이다.

KR 10-1098764 B1, 2011년 12월 20일

Malgoyre A et al., Biochem Biophys Res Commun. 2007 Mar 2;354(1):246-52. Epub 2007 Jan 3. Espy M. J. et al., Clin. Microbiol. Rev. 19:165-256, 2006) Brian H. Bird et al, J Clin Microbiol. 2007 November; 45(11): 35063513. Published online 2007 September 5.

본 발명의 목적은 주형핵산의 3'말단을 터미네이션(Termination)시켜 고민감도로 핵산증폭반응을 수행하는 데 필요한 핵산을 준비할 수 있는 핵산중합 터미네이터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 핵산중합 터미네이터를 이용한 고민감도의 핵산준비방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 핵산준비방법을 포함하는 핵산 증폭방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 핵산중합 터미네이터를 포함하는 핵산준비키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 핵산중합 터미네이터를 보관하는 보관부; 및 타깃 핵산을 포함하는 시료에 상기 핵산중합 터미네이터를 공급하는 공급부;를 포함하는 핵산자동정제장치를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 핵산자동정제장치가 포함되는 전자동핵산검사장비를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 3'말단에 핵산중합 터미네이터가 결합되어 비특이 핵산중합이 방지된 주형핵산을 포함하는 핵산중합용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 핵산중합반응을 이용하여 핵산을 증폭 검출하는데 사용되는 핵산 준비방법으로서, 1) 핵산, 핵산중합효소, 효소반응 완충용액 및 핵산의 3' 말단의 신장을 억제하는 핵산중합 터미네이터를 포함하는 반응혼합물을 반응시켜 핵산의 3'말단을 터미네이션시키는 단계; 및 2) 상기 반응 혼합물로부터 미반응된 유리 핵산중합 터미네이터를 불활화 또는 제거시키는 단계;를 포함하는 핵산준비방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 핵산중합반응을 이용하여 핵산을 증폭 검출하는데 사용되는 핵산 준비방법에 필요한 핵산중합효소, 효소반응 완충용액 및 핵산의 3' 말단의 신장을 억제하는 핵산중합 터미네이터를 포함하는 핵산준비키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 핵산중합효소와 핵산중합 터미네이터를 보관하는 보관부; 및 타깃 핵산을 포함하는 시료에 상기 핵산중합효소와 핵산중합 터미네이터를 공급하는 공급부; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산자동정제장치를 제공한다.

본 발명의 상기 핵산자동정제장치가 포함되는 전자동핵산검사장비를 제공한다.

본 발명은 또한, 3' 말단에 핵산중합 터미네이터가 결합되어 비특이 핵산중합이 방지된 핵산중합반응용 주형핵산을 이용하는 것을 특징으로 하는 핵산중합방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 3' 말단에 핵산중합 터미네이터가 결합되어 비특이 핵산중합이 방지된 주형핵산, Mg2+이온, 4종의 dNTP, DNA 중합효소 및 주형핵산 증폭용 프라이머를 포함하는 핵산 중합용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 핵산 중합용 조성물에 주형 핵산 증폭용 프라이머와 상보적인 염기서열을 가지며 3' 수산기가 블로킹되어 있는 블로킹 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하는 핵산 중합용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 핵산준비방법은 극미량의 핵산을 검출하기 위한 PCR 반응이나 실시간 정량 PCR 반응 등 핵산중합을 이용한 핵산검출에 사용되는 주형핵산에 핵산중합 터미네이터를 참가함으로써 타깃핵산의 증폭반응을 저해하는 비특이적 셀프프라이밍과 이어지는 비특이적 증폭을 근본적으로 제거할 수 있어, 위양성 증폭을 없애고 타깃 핵산만을 정확하게 검출할 수 있어 특히 극미량의 핵산을 정확하게 측정할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 비교예 1의 결과로서, 짧은 RNA 조각들에 의한 역전사 중합연쇄반응 산물의 전기영동 사진을 보여주는 것이고,
(A: RNA 올리고 뉴클레오티드, B: DNA 올리고 뉴클레오티드)
도 2는 본 발명에 따른 비교예 2의 결과로서, 작은 조각 RNA에 의한 비특이적 역전사 중합연쇄반응 및 PCR 반응 산물의 전기영동 사진을 보여주는 것이며,
도 3은 본 발명에 따른 실시예 1의 결과로서, Maldi-tof-mass 장비를 이용하여 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)가 반응하여 터미네이션이 된 것을 확인한 결과이고,
도 4는 본 발명에 따른 실시예 1의 결과로서, 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)로 터미네이션 된 단일가닥 RNA의 비특이 역전사 중합연쇄반응 산물의 전기영동 사진을 보여주는 것이며,
(A: 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)가 합성되지 않은 RNA 올리고 뉴클레오타이드, B: 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)가 합성된 RNA 올리고 뉴클레오타이드)
도 5는 본 발명에 따른 비교예 3의 결과로서, 인간 혈청에서 추출한 RNA에 의한 실시간 역전사 중합연쇄반응 저해 현상을 확인한 결과이고,
(A: DEPC-D.W에서 추출한 시료, B: 인간혈청 시럼에서 추출한 시료)
도 6은 본 발명에 따른 실시예 2의 결과로서, 인간혈청 내에 존재하는 RNA의 터미네이션을 통한 실시간 중합연쇄반응 저해 현상을 확인한 결과이며,
(A: 주형 RNA, B: 주형 RNA에 인간 혈청에서 일반적으로 추출된 RNA를 첨가, C: 주형 RNA에 인간 혈청에서 추출된 RNA를 터미네이션시킨 후 첨가)
도 7은 본 발명에 따른 실시예 2의 결과로서, 알칼라인 포스파타제(CIP)를 이용한 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)의 활성억제를 확인한 결과이고,
(A: RNA를 터미네이션 시킨 후, CIP를 사용하여 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)를 가수분해한 시료, B: 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)으로 RNA 터미네이션 시킨 후, 정제하지 않고 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)가 포함된 시료, C: AccuPrep PCR Purification을 사용하여 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)를 제거한 시료)
도 8은 본 발명에 따른 실시예 3의 결과로서,RNA 터미네이션을 통한 RNA 셀프프라이밍에 의한 비특이 역전사 중합연쇄반응 억제효과를 일반적인 역전사 중합연쇄반응(A 및 C) 및 핫스타트 역전사 중합연쇄반응(B 및 D)을 이용하여 확인한 결과이다.
(A: 터미네이션 시키지 않은 RNA, B: 터미네이션 시키지 않은 RNA, C: 터미네이션 시킨 RNA, D: 터미네이션 시킨 RNA)
도 9 본 발명에 따른 버퍼 카트리지를 모식화한 것이며,
도 10 상기 도 9의 버퍼 카트리지를 이용한 핵산준비방법으로, 실험 흐름도를 보여주는 것이다.
도 11은 블로킹 올리고뉴클레오티드에 의한 비특이적인 반응 억제 효과를 보여주는 도식도이다.
도 12는 블로킹 올리고뉴클레오티드를 제작할 때 사용되는 여러 변형 종류에 따른 비특이적 반응 억제 효과를 확인한 것으로서, A는 양성대조군으로 핫스타트 기능이 있는 제품을 사용한 결과이고, B 내지 G는 아민, 포스페이트, C3-space, C6-space, C12-space, C18-space로 변형시킨 경우를 나타내는 것이며, 레인 1 내지 레인 3은 각기 다른 3가지 표적 염기를 증폭한 결과를 나타낸 것이고, 레인 M은 DNA 사이즈를 구별할 수 있는 100 bp DNA Ladder를 나타낸 것이다.
도 13의 A는 실시간 PCR 반응에서 블로킹 올리고뉴클레오티드 첨가에 따른 프라이머 다이머 및 비특이적인 반응 억제 효과를 나타낸 것으로서, 가로축은 PCR 반응 주기를 나타낸 것이고 세로축은 반응 주기에 따른 측정 형광값을 나타낸 것이며, 선 Ⅰ은 대조군에 대한 형광검출 곡선 결과를 나타낸 것이고, 선 Ⅱ는 실험군에 대한 형광검출 곡선 결과를 나타낸 것이다. B는 형광측정 곡선을 이용하여 멜팅 커브를 작성한 결과를 보여주는 그래프로서, 가로축은 온도 변화를 나타낸 것이고 세로축은 온도 증가에 따른 측정 형광값을 나타낸 것이며, 선 Ⅰ은 대조군의 멜팅 커브 작성 결과를 나타낸 것이고, 선 Ⅱ는 실험군에 대한 멜팅 커브 작성 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

정밀한 핵산검사를 수행하기 위해서는 고효율로 핵산을 추출하는 것뿐만 아니라 추출된 핵산이 핵산증폭반응에서 고민감도로 증폭, 검출되는 것이 중요하다. 이러한 핵산추출을 자동으로 수행하는 여러 종의 자동핵산추출장비가 개발되어 있음에도 불구하고, PCR 반응이나 실시간 정량 PCR반응 등 핵산중합효소와 프라이머를 사용하여 핵산을 증폭하는 반응에서 극미량의 핵산을 검출하는 데에서는 위양성을 일으키거나 타깃 핵산을 검출하기 어려운 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 타깃 핵산을 검출하기 위한 PCR 반응 또는 실시간 정량 PCR 반응 등 핵산증폭검사에서, 핵산 자체가 비특이적으로 셀프프라이밍되어 주로 증폭됨으로 인해 문제가 발생되는 것에 착안하여 핵산에 중합반응을 종결시키는 물질과 핵산중합효소를 첨가하여 터미네이션 반응시킴으로써 핵산이 프라이머로 작용할 수 없게 하여 타깃 핵산만을 증폭하여 고민감도로 검출할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 일 관점에서, 핵산중합반응을 이용하여 핵산을 증폭 검출하는데 사용되는 핵산준비방법으로서,

1) 핵산중합효소, 효소반응 완충용액, 및 핵산중합 터미네이터를 포함하는 반응 혼합물을 이용하여 핵산의 3' 말단을 터미네이션(termination)시키는 단계; 및

2) 상기 반응 혼합물로부터 핵산중합 터미네이터를 불활화 또는 제거시키는 단계;

를 포함하는 핵산준비방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는 본 발명은 핵산중합반응을 이용하여 핵산을 증폭 검출하는데 사용되는 핵산준비방법으로서,

1) 핵산을 포함하는 생물학적 시료로부터 핵산을 분리 정제하는 단계;

2) 핵산중합효소, 효소반응 완충용액, 및 핵산중합 터미네이터를 포함하는 반응 혼합물을 이용하여 상기 1) 단계의 분리정제된 핵산의 3' 말단을 터미네이션(termination)시키는 단계; 및

3) 상기 3' 말단이 터미네이션(termination)된 핵산을 포함하는 반응 혼합물로부터 핵산중합 터미네이터를 불활화 또는 제거시키는 단계; 를 포함하는 핵산준비방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 핵산준비방법은 통상의 공지된 자동핵산추출장치를 사용할 수 있으며, 예를 들면 한국등록특허 148239호, US5702590, US5647994, EP 0691541, US 5336760호, US5897783호, US6187270호, 한국특허출원 10-2008-0032904호에 기재된 장치가 사용될 수 있다. 또한 바이오니아사의 ExiPrep^TM 16-fully Automated DNA/RNA/Proteins Purification System이 본 발명의 자동핵산추출장치로 바람직하게 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 시료는 폴리뉴클레오티드인 핵산을 포함하는 임의 식물, 동물, 세균 또는 바이러스로부터 유래되는 샘플로 구성될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 핵산은 RNA 또는 DNA이고, 상기 핵산중합효소는 DNA 또는 RNA의 3'말단에 더 이상 중합이 진행되지 못하게 터미네이터를 붙일 수 있는 모든 핵산중합효소를 포함하다.

보다 상세하게는 본 발명의 핵산중합효소는 3' → 5' 엑소뉴클리아제(exonuclease) 활성을 가지고 있지 않아서 터미네이터를 다시 가수분해하지 않는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 90℃ 이상의 고온에서 효소역가를 상실하는 것이 좋다. 상기 핵산중합효소는 RNA-의존성 RNA-중합효소, RNA-의존성 DNA-중합효소, DNA-중합효소, 및 RNA-중합효소로부터 선택되는 하나 이상인 것을 포함할 수 있다.

상기 RNA는 mRNA, 폴리-A 테일을 갖지 않는 RNA, 또는 바이러스 또는 원핵생물의 RNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 사용되는 RNA-의존성 RNA-중합효소는 바이러스에 주로 들어 있는 것으로서 RNA를 주형으로 RNA를 합성하는 일반적인 효소로서 뎅기열바이러스(dengue virus) 또는 구제역 바이러스와 같은 플래비바이러스(Flavivirus) 유래의 NS5 효소를 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 사용되는 DNA-중합효소는 주형으로서 DNA 가닥을 사용하여 새롭게 DNA 가닥을 합성하는 효소를 말한다. DNA 중합효소는 제한하는 것은 아니지만, Pol I-형 DNA 중합효소(예: 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) DNA 중합효소 I, 클레나우 단편 및 Taq DNA 중합효소), 비-α-, 비-PolI-형 DNA 중합효소(예: WO 97/24444에 기재되어 있는 DNA 중합효소)를 포함한다.

상기 RNA-의존성 DNA-중합효소는 역전사 효소로서 MMLV reverse transcriptase, AMV reverse transcriptase, HIV reverse transcriptase 등과 같은 다양한 역전사 효소를 사용할 수 있고, 또한 RNA-중합효소로는 3' 말단에 아데노신을 붙이는 poly(A) polymerase와 같은 Terminal deoxynucleotidyl transferase를 포함할 수 있다.

그것의 예시로서 HIV 역전사효소에는 HIV 치료제로 사용되고 있는 AZT(3'-azido-3'-deoxythymidine)의 생체 내에서 역전사반응의 활성화된 형태로서 인간유래의 DNA 중합효소에 비해 100배 높은 반응성을 나타내는 3'-azido-3'-deoxythymidine 5'-triphosphate를 사용하면 본 발명에서 효율적으로 사용할 수 있다(Phosphorylation of 3'-azido-3'-deoxythymidine and selective interaction of the 5'-triphosphate with human immunodeficiency virus reverse transcriptase, P A Furman, J A Fyfe, M H St Clair, K Weinhold, J L Rideout, G A Freeman, S N Lehrman, D P Bolognesi, S Broder, and H Mitsuya, PNAS November 1, 1986 vol. 83 no. 21 8333-8337).

본 발명에서 "핵산중합 터미네이터"라 함은 핵산이 더 이상 늘어나지 않게 모든 핵산 절편의 중합반응을 종결시키는 물질을 말하며, 핵산 절편의 말단에 결합되어 더 이상의 핵산 사슬 신장(chain elongation)이 일어날 수 없게 하는 물질을 말한다.

본 발명에서 "터미네이션(termination)"이라 함은 "상기 핵산중합 터미네이터"를 핵산의 3'말단에 공유결합시켜 더 이상 핵산중합반응을 진행할 수 없게 만드는 것을 의미하고 여기에 사용되는 물질을 터미네이터(terminator)라고 정의한다.

보다 상세하게는 본 발명에서 언급되는 "터미네이션(termination)"은 핵산의 3'위치에 히드록시(hydroxy)기가 없거나 또는 중합효소에 의한 중합반응을 진행시키지 못하는 화학기를 가진 물질을 핵산의 3'말단에 공유결합시켜 더 이상 핵산중합반응을 진행할 수 없게 만드는 것을 의미하고 여기에 사용되는 물질을 터미네이터(terminator)라고 정의한다.

본 발명에 있어서, 상기 핵산중합 터미네이터는 핵산중합효소에 작용할 수 있는 트리포스페이트형태로 활성화된 핵산유사 화합물로서, 핵산이 연결되는 3' 수산기가 결여되거나 다른 것으로 치환된 다양한 종류의 뉴클레오티드 트리포스페이트를 사용할 수 있으며, 각각의 핵산중합효소와 반응성이 좋은 핵산중합 터미네이터를 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 핵산유사 화합물은

2'3'-디데옥시 뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(2'3'-dideoxynucleoside 5'-triphosphate) 3'-데옥시아데노신 5'-트리포스페이트(3'-deoxyadenosine 5'-triphosphate), 3'-아지도-3'디옥시티미딘 5'-트리포스페이트 (3'-azido-3'-deoxythymidine 5'-triphosphate), 1-β-d-아라비노실뉴크레오시드 5'-트리포스페이트(1-β-d-Arabinofuranosylnucleoside 5′-Triphosphate), 아시클로 구아노신트리포스페이트(acyclo-guanosine triphosphate), 3'-아미노-3'디옥시뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(3'-amino-2'-deoxynucleoside 5'-triphosphate), 및 3'-플로르-3'디옥시뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(3'-fluoro-3'-deoxynucleoside 5'-triphosphate)로부터 선택되는 하나 이상인 것을 사용할 수 있다.

보다 상세하게는 대장균이나 내열성 세균에서 유래된 DNA-중합효소는 생거에 의해 개발된 dideoxy 염기서열 결정법에서 많이 사용되어 왔던 디데옥시 뉴클레오티드 트리포스페이트(2'3'-dideoxynuclreotide triphosphate, ddNTP)를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 디데옥시 뉴클레오티드 트리포스페이트(ddNTP)는 디데옥시 구아노신 트리포스페이트(ddGTP), 디데옥시 아데노신 트리포스페이트(ddATP), 디데옥시 티미딘 트리포스페이트(ddTTP) 및 디데옥시 시티딘 트리포스페이트(ddCTP)로부터 선택되는 하나 이상인 것을 포함할 수 있다.

상기 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP)는 구아노신, 아데노신, 티미딘, 유리딘 및 시티딘으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 포함할 수 있다.

그것의 예시로서, DNA-중합효소를 이용해서 터미네이션 반응을 시키기 위해서는 다양한 핵산중합 터미네이터들을 사용할 수 있다. 포유동물 유래의 DNA-중합효소를 사용할 경우, 이 효소에 반응성이 높은 5′-Triphosphate 1-β-d-Arabinofuranosylcytosine나 5′-Triphosphate 9-β-d-Arabinofuranosyladenine을 사용할 수 있다(Inhibition of Mammalian DNA Polymerase by the 5′-Triphosphate of 1-β-d-Arabinofuranosylcytosine and the 5′-Triphosphate of 9-β-d-Arabinofuranosyladenine, J. J. Furth, and Seymour S. Cohen, Cancer Res October 1968 28; 2061).

또한, 바이러스 유래의 DNA-중합효소들을 저해하는 항바이러스제로 많이 사용되어 왔던 아시클로비어핵산(acyclonucleoside)의 트리포스페이트도 핵산중합 터미네이터로 사용될 수 있다(Inhibition of herpes simplex virus-induced DNA polymerase activity and viral DNA replication by 9-(2-hydroxyethoxymethyl)guanine and its triphosphate. P A Furman, M H St Clair, J A Fyfe, J L Rideout, P M Keller and G B Elion, J. Virol. October 1979 vol. 32 no. 1 72-77 ).

또 다른 예시로서, RNA 중합효소인 Poly A 중합효소는 RNA의 3' 말단에 아데노신을 붙이는 효소로서 본 발명의 핵산중합 터미네이션 반응에 잘 맞는 효소이다. 상기 효소를 사용할 경우에는 poly A 중합효소의 저해제로 알려져 있는 3'-데옥시아데노신 트리포스페이트(3'-dATP, cordycepin)를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 2) 단계는 1) 단계 후, 미반응 핵산중합 터미네이터를 불활화 또는 제거하는 과정으로, 상기 핵산중합 터미네이터의 불활화는 중합에 사용되는 각종 핵산중합 터미네이터의 트리포스페이트결합을 가수분해할 수 있는 다양한 효소들을 모두 사용할 수 있다,

보다 상세하게는 핵산중합 터미네이터의 불활화는 상기의 핵산중합 터미네이터들을 가수분해하여 불활화시킨 후, 효소의 기능이 없어야 하므로 열에 의해 쉽게 활성을 잃어버리는 것이 좋다. 이는 이어지는 역전사 반응이나 PCR 반응의 뉴클레오티드 트리포스페이트를 분해하지 말아야 하기 때문이다.

예를 들면 상기 포스포결합 가수분해효소는 트리포스페이트를 분해하는 기질특성을 가지고 있는 알칼라인 포스파타제로서 BAP(Bacterial Alkaline Phosphatase)와 CIP(calf intestinal phosphatase) 등을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 열에 의해 쉽게 불활화 되는 CIP를 사용하는 것이 바람직하다.

또한 피로포스페이트와 ATP 등을 가수분해하는 다양한 생물체 즉, 대장균유래, 소의 소장유래, 새우유래의 알칼리성 포스파타제, Autotaxin(Clair T, Lee HY, Liotta LA, Stracke ML (1997). "Autotaxin is an exoenzyme possessing 5'-nucleotide phosphodiesterase/ATP pyrophosphatase and ATPase activities". J. Biol. Chem. 272 (2): 996~1001. doi:10.1074/jbc.272.2.996. PMID 8995394.)도 사용할 수 있다. 뉴클레오시트 트리포스페이트를 비특이적으로 분해하는 황색포도상구균 아데노신 합성효소(Staphylococcus aureus adenosine synthase; AdsA)를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 핵산준비방법은 핵산 분리 정제과정을 수행하고, 연속하여 핵산중합효소와 핵산중합 터미네이터를 추출된 핵산에 가함으로써 상보 핵산의 중합반응을 종결시켜 핵산에 의한 비특이 프라이밍을 제거할 수 있다. 상기 반응 후, 미반응 핵산중합 터미네이터들은 이어지는 중합연쇄반응이나 PCR 반응의 저해제로 작용하므로, 미반응 핵산중합 터미네이터의 제거단계가 필요하다.

상기 핵산중합 터미네이터의 제거는 gel filtration, 또는 caotropic agent 및 실리카비드를 이용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 핵산준비방법은 공지의 자동핵산추출장치 및 유전자 증폭장치를 통합적으로 관리하는 공지의 핵산 분석 통합 장치를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 상기 Exiprep 16 DX((주)바이오니아) 제품이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

보다 상세하게는 핵산 분리 정제과정을 수행하고, 연속하여 핵산중합효소와 핵산중합 터미네이터를 추출된 핵산에 가하여 핵산중합 터미네이션 반응을 시켜 모든 핵산들의 프라이밍의 기능을 불활화 시킬 수 있다. 반응 후에 남아있는 터미네이터들은 이어지는 역전사 반응이나 PCR 반응의 저해제로 작용하므로 이를 제거하기 위해서는 2가지 방법을 사용할 수 있다.

상기 2가지 방법은 상기 Exiprep 16 DX((주)바이오니아) 장비를 사용해서 다시 RNA 정제를 수행하는 방법과 핵산중합 터미네이터를 분해시켜 더 이상 반응을 하지 못하게 하는 방법이다.

상기 장비를 사용하여 정제를 하는 방법은 caotropic agent 존재하에 실리카자성 입자에 붙이고 다시 세척과 용출을 하는 방법으로서, 여러 단계를 거치므로 시간이 많이 들고, 이 과정에서 정제된 RNA의 손실이 발생하는 문제점이 있다. 반면에 활성화된 핵산중합 터미네이터인 뉴클레오티드 트리포스페이트를 가수분해효소로 다이 또는 모노트리뉴클레오티드로 분해하여 불활화시키는 방법은 빠르고 간단하며 수율을 떨어뜨리지 않기 때문에 장점이 많다.

상기 효소를 사용한 불활화 방법을 좀 더 자세히 기술하면 Exiprep 16 DX의 자성입자를 포집하고 있는 용출단계에 사용되는 웰은 온도가 조절가능한 웰이므로 용출버퍼로 용출시킨 후, 여기에 트리포스페이트 가수분해효소인 알칼리성 포스파타제, 오토탁신, 황색포도상구균 아데노신 합성효소(Staphylococcus aureus adenosine synthase; AdsA)를 가하여 37℃에서 반응시킴으로써 간단하게 터미네이터 제거반응을 시킬 수 있는 장점을 가지고 있다.

구체적인 일 예로, 상기 Exiprep 16 DX((주)바이오니아) 제품을 이용하여 정제 하는 방법은 버퍼 카트리지를 이용할 수 있다. 본 발명을 위한 상기 버퍼 카트리지의 구성은 총 12개의 well과 1개의 sample tube로 이루어진다. Well ①부터 Well ⑩까지는 핵산 추출 및 정제를 위한 곳이며, 그 구성은 다음과 같다. Well ①은 시약의 혼합과 반응이 수행되는 well이고, Well ②는 핵산 추출에 필요한 효소가 들어있는 well이고, Well ③은 혈액이나 혈청, 배양 세포등을 용해시키는 세포용해용액이 들어있는 well이고, Well ④는 용출된 핵산을 실리카 비드에 결합시키기 위한 결합 용액이 들어있는 well이고, Well ⑤는 핵산을 결합시키기 위한 실리카 비드가 들어있는 well이고, Well ⑥은 핵산이 결합된 실리카 비드에 남아있는 오염물질들의 제거를 위한 1차 세척용액이 들어있는 well이다. Well ⑦은 핵산이 결합된 실리카 비드에 남아있는 오염물질들의 제거를 위한 2차 세척용액이 들어있는 well이고, Well ⑧은 핵산이 결합된 실리카 비드에 남아있는 오염물질들의 제거를 위한 3차 세척용액이 들어있는 well이고, Well ⑨는 핵산 추출과정에 사용한 팁을 깨끗이 세척하는 팁 세척용액이 들어있는 well이고, Well ⑩은 핵산이 결합된 실리카 비드로부터 핵산을 용출하기 위한 용출용액이 들어있는 well이다. 도 9를 참조한다.

보다 상세하게는 샘플튜브에 들어있는 샘플 시료를 Well ①로 옮기고 Well ③에 들어있는 세포용해용액을 취하여 Well ②에 있는 핵산 추출에 필요한 효소와 혼합한 후 샘플 시료가 들어있는 Well ①로 옮긴다. 60℃로 가온하여 세포를 모두 분해한 후 Well ①의 용액을 모두 취해 핵산 결합용액이 들어있는 Well ④로 옮기고 혼합한다. 반응 용액을 모두 취한 후 실리카 비드가 들어있는 Well ⑤로 모두 옮겨 반응 용액 내 노출된 핵산을 모두 실리카 비드에 결합시킨다. 핵산이 결합된 실리카 비드만 Well ①에 남기고 나머지 반응여액은 모두 버린다. Well ⑥에 들어있는 1차 세척용액, Well ⑦에 들어있는 2차 세척용액, Well ⑧에 들어있는 3차 세척용액으로 순차적으로 실리카 비드 표면을 세척하여 순수한 핵산만 실리카 표면에 남게 한다. 최종 핵산 추출을 위해 팁 세척용액을 이용해 핵산 추출에 사용한 팁 표면을 모두 세척한 후 핵산 용출용액이 들어있는 Well ⑩으로부터 핵산 용출용액을 취하여 핵산이 들어있는 실리카 비드와 혼합함으로써 핵산을 실리카 비드로부터 분리하여 핵산 용출용액으로 용출한다.

용출된 핵산 용액에 Well ⑪에 들어있는 Poly (A) polymerase와 3'-dATP, 반응용액을 모두 취하여 옮겨 넣은 후 37℃에서 10분간 반응시킴으로써 추출된 리보핵산의 3'-말단에 터미네이션 반응을 완료한다. 이때, 본 반응에 사용되었던3'-dATP는 역전사반응이나 PCR반응의 저해가 되므로 반드시 제거되어야 하는데 이를 해결하기 위한 방법으로 다음의 두 가지 방법을 사용할 수 있다.

도 10을 참고하여 설명하면, 먼저 RNA 추출 및 정제, RNA termination 과정에 따라 전 과정을 수행하고 RNA termination에 사용된 3'-dATP의 활성을 제거하기 위하여 다음의 두 가지 방법, RNA 정제 과정을 통한 3'-dATP의 제거과정 혹은 Phosphatase를 이용한 3'-dATP의 트리포스페이트 가수분해 과정을 수행한다.

첫 번째 방법은 핵산 추출에 사용하였던 시약들을 이용한 정제 방법으로 'RNA 정제과정을 통한 3'-dATP의 제거과정'이다. RNA termination 반응이 수행되었던 반응용액과 실리카 비드를 모두 취하여 핵산 추출과정에서 사용하였던 핵산 결합용액이 들어있는 Well ④로 옮긴다. 핵산 결합용액과 혼합한 후 핵산이 결합된 실리카 비드만 Well ①에 남기고 나머지 반응여액은 모두 버린다. Well ⑧에 들어있는 3차 세척용액을 이용하여 실리카 비드 표면을 세척하여 순수한 핵산만 실리카 표면에 남게 한 후 핵산 용출용액이 들어있는 Well ⑩으로부터 핵산 용출용액을 취하여 핵산이 들어있는 실리카 비드와 혼합함으로써 핵산을 실리카 비드로부터 분리하여 핵산 용출용액으로 용출한다.

두 번째 방법으로는 RNA termination 반응이 수행되었던 반응용액에 Alkaline phosphatase를 추가하여 3'-dATP의 5'-말단에 존재하는 트리포스페이트잔기를 제거함으로써 이후 PCR 과정에서 부반응을 일으키지 못하도록 하는 'Alkaline phosphatase를 이용한 3'-dATP의 가수분해 과정'이다. RNA termination 반응이 수행되었던 반응용액을 모두 취하여 Alkaline phosphatase가 들어있는 Well ⑫로 모두 옮기고 잘 혼합한다. 혼합된 반응용액을 취하여 다시 Well ①로 옮기고 37℃에서 10분간 반응시켜 ddATP의 5'-말단의 phosphate 잔기를 모두 제거한다. 반응에 사용된 Alkaline phosphatase를 불활성화 시키기 위하여 온도를 65℃로 올리고 10분간 반응시킨다. 반응이 완료된 후 실리카 비드만 남기고 용출된 핵산을 모두 취하여 PCR 반응에 사용한다.

또다른 관점에서, 본 발명은 또한, 3' 말단에 핵산중합 터미네이터가 결합되어 비특이 핵산중합이 방지된 핵산중합반응용 핵산을 이용하는 것을 특징으로 하는 핵산중합방법에 관한 것이다.

본 발명은 1) 핵산중합효소, 효소반응 완충용액, 및 핵산중합 터미네이터를 포함하는 반응 혼합물을 이용하여 핵산의 3'말단을 터미네이션(termination)시키는 단계; 및 2) 상기 3'말단을 터미네이션(termination)된 핵산이 포함된 반응 혼합물로부터 핵산중합 터미네이터를 불활화 또는 제거시키는 단계;를 포함하는 핵산준비방법을 포함하는 핵산 증폭방법을 제공한다.

본 발명에 있어서 증폭방법은 일반적인 PCR 반응뿐만 아니라, 핫-스타드 PCR(Hot-start PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), RT-PCR(reverse ranscriptase PCR), real time PCR, DOP(degenerate oligonucleotide primer) PCR, Quantitative RT-PCR 등에 사용할 수 있다. 또한 프라이머의 선택성과 핵산중합효소의 중합반응에 의해 특정염기서열의 시그날을 증폭하는 모든 방법에도 적용할 수 있어 롤링서클 등온증폭법, 전사를 이용한 등온증폭법 등 다양한 중합효소 증폭검사법에 이용될 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명은 핵산중합반응을 이용하여 핵산을 증폭 검출하는데 사용되는 핵산 준비방법에 필요한 핵산중합효소, 효소반응 완충용액 및 핵산의 3' 말단의 신장을 억제하는 핵산중합 터미네이터를 포함하는 핵산준비키트에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 핵산준비키트는 핵산중합효소로서 RNA-의존성 RNA-중합효소, RNA-의존성 DNA-중합효소, DNA-중합효소, 및 RNA-중합효소로부터 선택되는 하나 이상인 것을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 poly(A) polymerase을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 핵산준비키트는 효소반응 완충용액으로 Tris-HCl, KCl, (NH₄)₂SO₄ , MgSO₄, 및 Triton X-100 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 핵산준비키트는 핵산중합 터미네이터로 2'3'-디데옥시 뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(2'3'-dideoxynucleoside 5'-triphosphate), 3'-데옥시아데노신 5'-트리포스페이트(3'-deoxyadenosine 5'-triphosphate), 3'-아지도-3'디옥시티미딘 5'-트리포스페이트 (3'-azido-3'-deoxythymidine 5'-triphosphate), 1-β-d-아라비노실뉴크레오시드 5'-트리포스페이트(1-β-d-Arabinofuranosylnucleoside 5′-Triphosphate), 아시클로 구아노신트리포스페이트(acyclo-guanosine triphosphate), 3'-아미노-3'디옥시뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(3'-amino-2'-deoxynucleoside 5'-triphosphate), 및 3'-플로르-3'디옥시뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(3'-fluoro-3'-deoxynucleoside 5'-triphosphate)로부터 선택되는 하나 이상인 것을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 핵산준비키트는 핵산중합 터미네이터의 불활화시키는 트리포스페이트를 가수분해하는 포스포결합 가수분해효소를 추가로 더 포함할 수 있으며, 상기 포스포결합 가수분해효소는 대장균유래, 소의 소장유래, 새우유래의 알칼리성 포스파타제, 및 오토탁신(Autotaxin)으로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 사용할 수 있다.

상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. "안내서"는 키트 사용법, 예를 들면, 핵산준비용 시약 용액 제조 방법, 제시되는 준비 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 핵산중합효소와 핵산중합 터미네이터를 보관하는 보관부; 및 타깃 핵산을 포함하는 시료에 상기 핵산중합효소와 핵산중합 터미네이터를 공급하는 공급부;를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산자동정제장치에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 보관부는 트리포스페이트 가수분해효소 및 효소반응 완충용액을 더 포함할 수 있는 것으로, 상기 장치는 컴퓨터 제어부가 추가되어 전자동화로 이루어질 수 있다.

본 발명은 상기 핵산자동정제장치가 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 전자동핵산검사장비를 제공한다.

본 발명의 전자동핵산검사장비는 핵산추출을 자동으로 수행하는 공지의 자동핵산추출장치 및 유전자 증폭장치를 통합적으로 관리하는 공지의 핵산 분석 통합 장치를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 본 출원인들이 개발한 전자동 핵산을 정제하고 증폭분석하는 전자동핵산분석장비(10-2010-0086468, 10-2012-0013757)가 사용될 수 있다. 본 발명의 실시간 유전자 증폭장치는 공지의 실시간 유전자 증폭장치를 사용할 수 있으나 바람직하게는 한국등록특허 제 10-794703호에 기재된 장치, PCT/KR2008/064558호에 기재된 장치, 또는 바이오니아의 Exicycler 96 Real-Time Quantitative Thermal Block 제품이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또한, 3' 말단에 핵산중합 터미네이터가 결합되어 비특이 핵산중합이 방지된 핵산, Mg2+이온, 4종의 dNTP, DNA 중합효소 및 핵산 증폭용 프라이머를 포함하는 핵산 중합용 조성물에 관한 것이다.

상기 핵산중합용 조성물은 필요에 따라 프라이머, 프로브, 형광염료, 역전사효소 등을 추가로 포함해도 된다. 본 발명에 있어서, 상기 "핵산"은 증폭하고자 하는 주형핵산, DNA, RNA, DNA와 RNA의 하이브리드(hybrid), 이들의 혼합물, 핵산추출물 또는 핵산시료 등을 제한없이 포함하는 의미로 사용된다.

상기 핵산중합용 조성물은 3' 수산기가 블로킹되고 주형핵산 증폭용 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 블로킹 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다.

상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머보다 염기서열의 수가 작은 것을 특징으로 한다. 이와 같이 블로킹 올리고뉴클레오티드의 염기서열이 프라이머의 염기서열보다 작을 경우 프라이머-주형 표적 DNA 결합의 멜팅 온도(melting temperature)와 비교하여 프라이머(또는 주형핵산)-블로킹 올리고뉴클레오티드 결합의 멜팅 온도가 더 낮게 된다. 따라서, 낮은 온도에서는 프라이머와 블로킹 올리고뉴클레오티드가 이중나선으로 결합하고 있지만, 다소 낮은 변성 온도를 갖는 블로킹 올리고뉴클레오티드는 프라이머의 어닐링 온도 이전에 해리하게 되어 더 이상 이중나선을 형성하지 못하게 되므로 PCR 반응에 전혀 영향을 주지 않게 되므로, 핫스타트 PCR에 유용하게 사용될 수 있다. 이와 같은 블로킹 올리고뉴클레오티드를 이용한 방법은 프로브에도 동일한 방식으로 적용될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 프라이머보다 1℃ 이상, 바람직하게는 2℃ 이상 낮은 멜팅 온도를 갖는 것이 바람직하며, 적어도 25℃ 이상, 바람직하게는 50℃ 이상의 멜팅 온도를 갖는 것이 바람직하다.

또한, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 3' 말단의 수산기가 없거나 상기 수산기 이외의 치환기로 치환되어 있는 것을 특징으로 한다. DNA 중합 반응은 3' 말단의 수산기와 5' 말단의 포스페이트기가 결합되는 방식으로 진행되므로, 이와 같이 3' 말단의 수산기가 이와는 다른 치환기로 치환되면 더 이상의 DNA 중합 반응이 진행하지 않게 된다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 치환기로는 형광물질(dye), 소광자, 또는 하기의 표 1에 나타나는 화학식으로 표시되는 물질 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 첫 번째 염기는 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합하는 프라이머의 3' 말단의 첫 번째 염기와 상보적인 결합을 형성하거나, 상기 프라이머의 3' 말단의 두 번째 이후의 염기와 상보적인 결합을 형성함으로써, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 하나 이상의 염기가 비결합된(unpaired) 상태로 남아 있지 않도록 하는 것이 바람직하다. 즉, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 염기는 모두 상기 프라이머의 3' 말단의 염기와 상보적인 결합을 형성하고 있는 것이 바람직하다. 만일, 블로킹 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 하나 이상의 염기가 비결합된 상태로 남아 있게 되면, 프라이머의 3' 말단으로부터 시작하여 블로킹 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 첫 번째 염기까지 DNA 중합 반응이 일어나게 되어, 결과적으로 프라이머의 길이가 추가로 더 늘어날 수 있게 된다. 반응액 내에 이와 같이 길이가 늘어난 프라이머가 존재할 경우에는 종래 문제가 되고 있는 프라이머-다이머 형성에 의한 비특이적인 증폭 결과물이 더욱 많아질 수 있기 때문에 바람직하지 않다.

또한, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 이와 상보적인 서열을 갖는 프라이머쌍에 대하여 전방(forward) 프라이머, 후방(reverse) 프라이머 중 어느 하나에 특이적으로 결합하거나, 상기 전방 및 후방 프라이머 모두에 특이적으로 결합할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 반응용 완충용액은 10 mM TrisHCl, 40 mM KCl, pH 9.0을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 4종의 dNTP는 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP를 나타낸다. DNA 중합효소는 공지된 임의의 DNA 중합효소를 제한없이 사용할 수 있으며, 이 중에서도 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소, 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소 및 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성과 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성이 없는 중합효소를 단독으로 사용하거나, 또는 상기 DNA 중합효소들을 조합하여 사용할 수 있다. 상기 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소의 예로는 Taq DNA 중합효소, 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소의 예로는 Pfu DNA 중합효소 또는 TLA DNA 중합효소, 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성과 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성이 없는 중합효소의 예로는 Top DNA 중합효소를 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. DNA 중합효소는 PCR 조성물에 0.1 내지 10 U(unit), 바람직하게는 0.5 내지 2 U, 가장 바람직하게는 1 U의 농도로 포함시켜 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 핵산중합용 조성물은 실험상의 편의, PCR 반응 산물에 의한 오염방지, DNA 중합효소와 dNTP의 안정화 및 반응성의 향상을 위하여 핵산에 대해 비반응성인 염료 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 비반응성 염료 물질은 PCR 반응에 영향을 미치지 않는 물질로부터 선택되어야 하며, 이러한 조건을 만족시키는 물질로는 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 크실렌 시아놀(xylene cyanole), 브로모크레졸 레드(bromocresol red), 크레졸 레드(cresol red) 등의 수용성 염료를 들 수 있다. 상기 비반응성 염료 물질은 전체 조성물에 대해 0.0001 내지 0.01 중량%의 함량으로 포함될 수 있으며, 0.001 내지 0.005 중량%의 함량으로 포함되는 것이 바람직하고, 0.001 내지 0.003 중량%의 함량으로 포함되는 것이 보다 바람직하다. 만일, 상기 비반응성 염료 물질이 0.0001 중량% 미만의 함량으로 첨가되는 경우에는 PCR 반응후의 분석을 위한 아가로스젤 전기영동시 염료의 농도가 낮아 시료의 이동을 육안으로 관측하기 어렵다는 문제점이 있고, 비반응성 염료 물질이 0.01 중량% 초과의 함량으로 첨가되는 경우에는 PCR 반응시 고농도의 수용성 염료가 반응 저해제로 작용할 수 있다는 문제점이 있다. 또한, 아가로오스 겔로의 침강이 이루어진 후 전기영동시 시료의 이동을 방해할 수 있다는 문제점이 있다.

또한, 본 발명의 핵산중합용 조성물은 필요에 따라 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소를 포함할 수도 있다. 이와 같이, 역전사효소를 포함하는 역전사 PCR의 경우에는, 증폭되는 RNA의 센스 프라이머에 대한 블로킹 올리고뉴클레오티드를 본 발명의 핫스타트 PCR용 조성물에 첨가하는 것이 바람직하다.

DNA 중합효소는 5' 말단이 단일선으로 되어 있는 부분적인 이중나선 구조의 3' 말단 부분에 결합하여 중합 반응을 일으키는 효소이다. 본 발명에서는 이러한 DMA 중합효소의 특성을 고려하여 블로킹 올리고를 설계하였다. 본 발명에서는 블로킹올리고의 5' 말단이 프라이머의 3' 말단에 상보적으로 결합하도록 설계함으로써, 프라이머가 더 이상 비특이적으로 반응하는 것과, 프라이머가 다른 핵산에 혼성화되어 염기가 늘어나는 것을 방지하게 된다. 또한, 블로킹 올리고의 3' 말단은 프라이머의 5' 말단보다 길이를 작게 하여 DNA 중합효소가 잘 부착되도록 하는 것과 동시에, 블로킹 올리고가 신장되는 것을 방지하기 위하여 3' 수산기를 다른 치환기로 블로킹하였다. 그리하여 블로킹 올리고뉴클레오티드를 반응물에 첨가해 주는 것만으로도 DNA 중합효소가 프라이머와 블로킹 올리고와의 이중나선에 부착되어 더 이상 비특이적인 반응을 수행할 수 없게 됨으로서 상온에서 프라이머의 확장 반응을 저지할 수 있게 된다.

또한, 본 발명의 핫스타트 PCR용 조성물에 사용되는 블로킹 올리고뉴클레오티드는 프라이머 또는 프로브와 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로서, 상기 프라이머/프로브보다 짧은 길이를 갖고 있어 낮은 온도에서는 프라이머/프로브와 이중나선을 이루고 있어서 DNA 중합효소가 기질로서 인식하여 결합을 하게 되지만, 3' 말단이 블로킹되어 있기 때문에 DNA 중합은 일어나지 않게 된다. 그러므로, 통상의 PCR 반응에서 문제가 될 수 있는 프라이머의 비특이적인 중합을 억제함으로써 비특이적인 PCR 생성물이 생기는 것을 방지할 수 있다. 따라서, 본 발명의 핫스타트 PCR용 조성물을 이용하면, 종래 사용되는 것과 같은 항체를 이용하거나, 화학적 수식을 이용하거나, 피로포스페이트을 이용한 핫스타트 PCR 방법과는 달리, 프라이머와 표적 주형 DNA 이중나선의 멜팅 온도 이하에서 바로 중합효소가 떨어져 나가서 활성화가 되므로 활성화시키기 위한 인큐베이션시간을 소모하지 않고 바로 PCR 반응을 시킬 수 있다는 장점이 있다.

상기 블로킹 올리고뉴클레오티드의 작용 기작을 살펴보면, PCR 반응에 있어서 정방향, 역방향 프리이머는 필수 요소로 작용한다. 블로킹 올리고뉴클레오티드는 정방향, 역방향 프리이머보다 1개 내지 그보다 적은 뉴클레오티드를 갖는 상보적인 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드이므로 프라이머에 대한 특이성이 높다. 따라서, 정방향/역방향 프라이머와 블로킹 올리고뉴클레오티드를 혼합하게 되면 블로킹 올리고뉴클레오티드는 상기 정방향/역방향 프라이머와 결합하여 정방향/역방향 프라이머가 작용하지 못하도록 함으로써 프라이머 다이머 형성 및 비특이적인 반응에 참여할 수 없도록 사전에 방지할 수 있다. 적정 온도, 즉 블로킹 올리고머의 멜팅 온도에 도달하면 프라이머와 블로킹 올리고뉴클레오티드의 결합이 끊어져서 표적으로 하는 주형핵산에 프라이머가 결합하도록 함으로써 정확하고도 효과적으로 PCR 반응이 이루어지도록 할 수 있다. 즉, 블로킹 뉴클레오티드는 프라이머/프로브보다 상대적으로 짧은 길이로 제작되기 때문에, 프라이머가 주형핵산에 결합하는 적정 온도에 도달하면 블로킹 뉴클레오티드는 프라이머/프로브로부터 해리되기 때문에 프라이머가 주형에 결합할 때 영향을 미치지 않게 된다.

본 발명에서 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 블로킹 올리고 RNA이고, 핵산중합은 RT-qPCR 인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 본 발명의 블로킹 올리고뉴클레오티드를 이용하는 핫스타트 PCR 방법은 다음과 같은 경우에 유용하게 적용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

Ⅰ. 모노플렉스 PCR 반응에 있어서 비특이적인 반응에 의한 PCR 증폭 산물의 끌림 현상이 있을 때.

Ⅱ. PCR 반응에서 비특이적인 반응에 의해 다중 증폭 산물이 발생될 때.

Ⅲ. 프라이머 다이머에 의해 PCR 반응 효율이 저하될 때.

Ⅳ. 증폭률이 낮은 특정 표적에 대한 PCR 반응 효율을 높이고자 할 때.

Ⅴ. 하나 이상의 증폭 산물(Multiplex PCR)을 확인하고자 할 때.

Ⅵ. 검역 및 질병 진단 등의 분야에서 특정 표적에 대한 PCR 반응 효율을 높이고 싶을 때.

Ⅶ. 특이성을 요하는 실시간 PCR 반응을 수행할 때.

Ⅷ. 특이적으로 Tm 값이 다른 프라이머를 사용할 때.

Ⅸ. One-Step RT-PCR 반응에서 비특이적인 증폭 산물이 발생될 때.

또한, 본 발명의 핵산중합용 조성물은 종래에 보고된 여러 가지 PCR 조성물과 비교하여 다음과 같은 이점들이 있다.

1) 일반적인 PCR 방법에 따라 반응을 진행시킬 수 있으므로, 고온에서의 장시간의 전처리가 요구되지 않는다.

2) 종래 PCR용 조성물보다 경제적이다.

3) 낮은 스트린전시의 프라이밍에 의한 증폭산물의 생성을 방지하므로, 다양한 시료를 동시에 사용하는 멀티플렉스 PCR 반응에도 적용할 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

[ 비교예 1] 짧은 RNA 조각들에 의한 역전사 중합연쇄반응

RNA 주형으로부터 cDNA을 합성하는 역전사 중합연쇄반응에서, DNA 올리고 뉴클레오티드와 RNA 올리고 뉴클레오티드의 역전사 반응효율을 비교하기 위하여, 각기 다른 길이의 3 종류 단일가닥 RNA 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.

합성한 단일가닥 RNA의 염기서열은 랜덤 염기서열을 갖도록 하였다(6mer; NNN NNN, 9mer; NNN NNN NNN, 12mer; NNN NNN NNN NNN). 대조군으로 동일한 염기서열과 길이를 갖는 DNA 올리고뉴클레오티드를 합성하여 이용하였다.

합성된 단일가닥 RNA에 의한 역전사 중합연쇄반응(RT-PCR) 및 중합연쇄반응(PCR) 반응을 확인하기 위하여, AccuPower RT PreMix((주)바이오니아, 대한민국)에 Hela Cell에서 추출한 인간 전체 RNA을 10 ng이 되도록 첨가하였으며, Human GAPDH 유전자의 염기서열을 타깃으로 하였다.

역전사 중합연쇄반응(RT-PCR)에 사용되는 프라이머는 상기 합성한 단일가닥 RNA 올리고 뉴클레오티드를 각각 100 pmole을 첨가하였으며, 양성대조군으로는 단일가닥 DNA 올리고 뉴클레오티드를 동일한 양을 사용하였다. 역전사 중합연쇄반응은 Accupower　 RT Premix(㈜바이오니아, 대한민국)의 최적 온도인 42℃에서 60분 동안 1회 수행하였으며, 역전사 효소의 불활성을 위하여 95℃ 5분 1회 수행하였다.

역전사 중합연쇄반응을 통해 얻어진 산물 20 ul 중 Accupower　 Hotstart PCR Premix(㈜바이오니아, 대한민국)에 5 ul를 첨가하였으며, Human GAPDH 유전자를 타깃으로 하여, GAPDH 정방향 프라이머(GAA GGT GAA GGT CGG AGT CAA CG: 서열번호 1)와 역방향 프라이머(AGT CCT TCC ACG ATA CCA AAG TTG:서열번호 2)를 디자인 및 합성하여, PCR 반응을 수행하였다.

PCR 반응은 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초의 과정을 1회로 하여 총 30회를 수행하였고, 예비 변성과 최종 신장은 각각 95℃에서 5분, 72℃에서 5분씩 수행하였다. PCR 반응에서 수득된 생성물을 아가로스 겔에 DNA 분자량 마커와 함께 전기영동시킨 후, 에티디움브로마이드(ethidium bromide; EtBr)로 염색하였고, 디지털 카메라로 PCR 반응에 의해 증폭된 DNA 밴드를 촬영하였다.

양성대조군으로 합성된 단일가닥 DNA이 첨가되지 않은 역전사 프리믹스(RT PreMix)(㈜바이오니아, 대한민국)을 이용하여 생성된 산물을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다.

그 결과, 합성된 단일가닥 DNA 뿐 아니라 RNA에 의해서도 역전사 중합연쇄반응(RT-PCR)이 이루어진 것을 확인할 수 있었다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서, 레인 1, 2 및 3은 역전사 중합연쇄반응(RT-PCR) 수행 시 순차적으로 6mer, 9mer, 12mer의 길이를 갖는 올리고 뉴클레오티드를 100 pmole을 첨가해준 시료이다.

레인 N은 올리고 뉴클레오티드를 첨가하지 않은 공시료이다.

A는 RNA 올리고 뉴클레오티드를 첨가한 것이며, B는 대조군으로 DNA 올리고 뉴클레오티드를 첨가하여 역전사 중합연쇄반응 후, PCR 반응을 수행한 결과이다.

레인 M은 100 bp DNA Ladder(㈜바이오니아사제, 대한민국)로 PCR 산물에 대한 사이즈를 확인할 수 있다.

도 1에서도 확인할 수 있듯이, DNA 올리고 뉴클레오티드를 사용한 시료와 같이 RNA 올리고 뉴클레오티드에 의해서도 역전사 중합연쇄반응이 이루어진 것을 확인할 수 있었다.

[ 비교예 2] 작은 조각 RNA 에 의한 비특이적 역전사 중합연쇄반응 및 PCR 반응

작은 조각 RNA에 의한 비특이적 역전사 중합연쇄반응 및 PCR 반응을 확인하기 위해, 랜덤한 염기서열을 갖는 각기 다른 길이를 갖는 단일가닥 RNA의 3종을 합성하였다. 합성된 단일가닥 RNA의 염기서열은 랜덤 염기서열을 갖도록 하였다.(6mer; NNN NNN, 9mer; NNN NNN NNN, 12mer; NNN NNN NNN NNN)

합성된 단일가닥 RNA에 의한 비특이적 역전사 중합연쇄반응 및 PCR 반응을 확인하기 위하여, AccuPower RT PreMix((주)바이오니아, 대한민국)에 Hela Cell에서 추출한 인간 전체 RNA을 10 ng 이 되도록 첨가하였으며 Human beta-actin 유전자를 타깃으로 하였으며, 역전사 중합연쇄반응에 사용되는 프라이머는 타깃 염기서열을 갖는 역방향 프라이머(TAG AAG CAT TTG CGG TGG AC:서열번호 3)를 사용하였다.

작은 조각 RNA에 의한 비특이적 역전사 중합연쇄반응을 확인하기 위해, 합성된 단일가닥 RNA을 각각 200 pmole이 되도록 첨가하였으며, 양성대조군으로는 합성된 단일가닥 RNA을 첨가되지 않은 시료를 사용하여 역전사 중합연쇄반응을 수행하였다. 역전사 중합연쇄반응은 Accupower　 RT Premix (㈜바이오니아, 대한민국)의 최적 온도인 42℃에서 60분 동안 1회 수행하였으며 역전사 효소의 불활성을 위하여 95℃ 5분 1회 수행하였다.

역전사 중합연쇄반응을 통해 얻어진 산물 20 ul 중 Accupower　 Hotstart PCR Premix(㈜바이오니아, 대한민국)에 5 ul를 첨가하였으며, Human Beta-actin 유전자를 타깃으로 하여 beta-actin 정방향 프라이머(AGG ATT CCT ATG TGG GCG AC:서열번호 4)와 beta-actin 역방향 프라이머(TAG AAG CAT TTG CGG TGG AC:서열번호 5)를 디자인 및 합성하여 PCR 반응을 수행하였다.

양성대조군으로 합성된 단일가닥 RNA이 첨가되지 않은 시료에 역전사 프리믹스(RT PreMix)(㈜바이오니아, 대한민국)를 이용하여 생성된 산물을 이용하여, PCR 반응을 수행하였다.

그 결과, 합성된 단일가닥 RNA가 첨가된 모든 시료에서는 비특이적 반응이 일어난 것을 확인할 수 있었다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서, 레인 1, 2 및 3은 역전사 중합연쇄반응 수행 시 합성한 단일가닥 RNA을 200 pmole을 첨가해준 시료이며, 레인 4는 합성한 단일가닥 RNA을 첨가하지 않은 시료이다.

레인 1은 6개의 램덤 염기서열을 갖는 단일가닥 RNA(6mer)이며 레인 2는 9개(9mer), 레인 3은 12개의 랜덤 염기서열을 갖는 단일가닥 RNA(12mer)을 첨가한 시료이다.

레인 4는 양성대조군으로 합성한 단일가닥 RNA 시료가 첨가되지 않고, 역전사 중합연쇄반응 후 PCR 반응을 수행한 결과이며, 레인 1, 2 및 3은 각각의 길이를 합성한 단일가닥 RNA 을 200 pmole을 첨가하여 역전사 중합연쇄반응 후 PCR 반응을 수행한 결과이다. 레인 M은 100 bp DNA Ladder(㈜바이오니아사제, 대한민국)로 PCR 산물에 대한 사이즈를 확인할 수 있다.

그 결과, 합성한 단일가닥 RNA을 첨가하지 않은 시료에 비해 단일가닥 RNA을 첨가한 시료에서는 길이와 상관없이 모두 비특이적 반응에 의해 타깃이 검출되지 않는 것을 확인할 수 있었다.

상기의 결과는 단일가닥 RNA가 역전사 중합연쇄반응 및 PCR 반응에서 타깃 프라이머 외의 프라이머로서 작용한다는 것을 의미하며, 이는 비특이적 반응이 유도 된다는 것을 확인한 결과이다.

[ 실시예 1] 3′- 데옥시아데노신 5′- 트리포스페이트(3'dATP)로 터미네이션 된 단일가닥 RNA 의 비특이 역전사 중합연쇄반응 억제효과

(1) poly (A) polymerase 와 3′- 데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)에 의한 RNA 조각의 터미네이션 반응

단일조각 RNA들의 비특이적 프라이밍 반응을 억제하기 위해 poly(A) polymerase(다카라 사제, 일본)와 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)를 이용하여 터미네이션(termination) 반응을 시켰다.

10X Reaction buffer 5 ul과 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP) 0.1 mM, poly(A) polymerase 2 유닛, 상기 비교예 1에서 합성한 12개의 램덤 염기서열을 갖는 단일가닥 RNA(12mer)을 1 nmole이 되게 첨가하여 최종 부피가 50 ul가 되도록 멸균 증류수를 첨가하여 37℃에서 15분 동안 반응하였다.

반응 후 AccuPower PCR Purification kit(바이오니아사제, 대한민국)을 이용하여 정제하였다. 정제된 산물을 Maldi-tof-mass 장비(SHIMADZU 사제, 일본)를 이용하여 분자량으로 단일가닥 RNA에 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)의 합성 유무를 확인하였다. 랜덤한 염기서열을 갖는 단일가닥 RNA의 분자량은 3408.2 ~ 3888.4 MW이며 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)의 분자량은 491.18 MW이다.

12 mer의 단일가닥 RNA에 poly(A) polymerase을 이용하여 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(dATP)를 합성한 후, 분자량을 측정한 결과 4000 ~ 4300 MW에서 분자량이 측정되었으며, 상기의 분자량을 통해 poly(A) polymerase에 의해 3′-데옥시아데노신이 부가된 것을 확인할 수 있었다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

(2) 3′- 데옥시아데노신 터미네이션 된 단일가닥 RNA 의 비특이 역전사 중합연쇄반응 억제효과

상기 비교예 1과 같이 동일한 템플레이트 RNA 및 프라이머와 상기 (1)과 동일한 방법으로 비교예 1과 동일한 RNA 올리고 뉴클레오티드에 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)로 터미네이션 된 랜덤한 염기서열을 갖는 RNA 올리고 뉴클레오티드를 사용하였다. 대조군으로 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)로 터미네이션이 반응을 시키지 않은 단일가닥 RNA 올리고 뉴클레오티드를 사용하였다.

3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)로 터미네이션된 단일가닥 RNA에 의한 역전사 중합연쇄반응의 억제 반응을 확인하기 위하여 AccuPower RT PreMix((주)바이오니아, 대한민국)에 Hela Cell에서 추출한 인간 전체 RNA을 10 ng 이 되도록 첨가하였으며, Human GATDH 유전자를 타깃으로 하였으며 역전사 중합연쇄반응에 사용되는 프라이머는 3′-데옥시아데노신이 부가된 단일가닥 RNA 올리고 뉴클레오티드를 각각 100 pmole을 첨가하였으며 양성대조군으로는 3′-데옥시아데노신을 부가시키지 않은 RNA 올리고 뉴클레오티드를 동일한 양을 사용하였다. 역전사 중합연쇄반응은 Accupower　 RT Premix(㈜바이오니아, 대한민국)의 최적 온도인 42℃에서 60분 동안 1회 수행하였으며 역전사 효소의 불활성을 위하여 95℃ 5분 1회 수행하였다.

역전사 중합연쇄반응 및 PCR 반응은 비교예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 양성대조군으로 3′-데옥시아데노신이 부가되지 않은 RNA 올리고 뉴클레오티드를 포함한 역전사 프리믹스(RT PreMix)(㈜바이오니아, 대한민국)를 이용하여 생성된 산물을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다.

그 결과, 3′-데옥시아데노신으로 터미네이션된 RNA 올리고 뉴클레오티드를 사용한 시료에서는 비특이적인 역전사 중합연쇄반응 및 PCR 반응이 억제되는 것을 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서, 레인 1, 2 및 3은 역전사 중합연쇄반응 수행 시 순차적으로 6mer, 9mer, 12mer의 길이를 갖는 단일가닥 RNA 올리고 뉴클레오타이드를 100 pmole을 첨가해준 시료를 나타낸 것이다.

A는 3′-데옥시아데노신이 부가되지 않은 RNA 올리고 뉴클레오타이드를 첨가한 것이며, B는 3′-데옥시아데노신으로 터미네이션된 RNA 올리고 뉴클레오타이드를 첨가하여 역전사 중합연쇄반응 후, PCR 반응을 수행한 결과이다.

레인 M은 100 bp DNA Ladder(㈜바이오니아사제, 대한민국)로 PCR 산물에 대한 사이즈를 확인할 수 있다

그 결과, 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)로 터미네이션 함으로서 역전사 중합연쇄반응 및 PCR 반응에서 비특이적 증폭반응이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

[ 비교예 3] 인간 혈청에서 추출한 RNA 에 의한 실시간 역전사 중합연쇄반응 저해 현상

실시간 역전사 중합연쇄 반응(real-time RT-PCR) 을 실시하기 위해, 먼저 주형 RNA를 제조하였다. 구체적으로 Hepatitis C virus 부분을 유전자 합성방법(Biochem. Biophys, Res. Commun 1998, 248, 200-203)으로 합성하고, 그 중 일부를 pGEM-T-Easy vector(Cat. A1360, Promega 사제, 미국)에 클로닝하였다.

구체적으로 2ㅧ Rapid ligation buffer(promega 사제,미국) 5 ul, T-easy vector(promega 사제, 미국) 1 ul, T4 DNA ligase 1 ul(Promega 사제, 미국), 상기 합성된 유전자 3 ul(8 ng)을 동일한 튜브에 넣어 혼합한 다음 37℃에서 1시간 정온배치하였다.

그 후, E. coli 만능세포(Competent cell) 50 ul에 상기의 정온배치한 반응액 5 ul을 넣고 얼음 상에 40분간 놓아둔 뒤, 42℃에서 40초 배양하고 다시 얼음 상에 2분 놓아두었다. 암피실린(Ampicillin), IPTG, X-gal이 포함된 LB 플레이트에 상기 반응액을 접종한 후 37℃에서 16시간 배양하였다.

하얀 색 콜로니를 취하여 LB 액체 배지에서 16시간 정도 배양한 후, 원심분리하여 상층액은 제거하고 AccuPrep Plasmid Prep kit(바이오니아 사제, 대한민국)를 사용하여 펠릿으로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다. 플라스미드 DNA는 UV 분광계(Shimazu 사제, 일본)로 농도와 순도를 측정한 다음 순도가 1.8 ~ 2.0 사이인 것을 확인하고, MAXIscript In vitro transcription kit(Ambion사제, 미국)를 사용하여 플라스미드 DNA를 전사시켰다.

전사 후 UV 분광계로 농도와 순도를 측정하여 순도가 1.8~2.0 사이에 있으면 이후의 실시간 역전사 중합연쇄반응에서 주형 RNA로 사용하였다. RNA 카피수(copy number)는 하기 식을 이용해 계산하였다.

[식 1]

6.02ㅧ1023ㅧ농도(UV 분광계로 측정된 농도 g/ml)/(3015＋150)ㅧ340

(3015 bp: T-vector의 크기, 150 bp: Hepatitis C virus 주형 RNA의 크기)

주형 RNA의 카피수를 계산한 후 1ㅧ TE buffer(10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 mM EDTA)로 10진 희석하여, 사용 시까지 -70℃에 보관하였다.

인간 혈청(SIGMA-ALDRICH 사제, 미국)에서의 RNA 추출은 AccuPrep Viral RNA Extraction kit((주)바이오니아사제, 대한민국)을 이용하였으며, 인간 혈청 200 ul를 사용하여 추출하였고, DEPC-D.W을 사용하여 최종 부피가 50 ul가 되도록 정제하였다.

대조군으로 DEPC-D.W을 200 ul를 사용하여, 인간 혈청에서 RNA 추출하는 방법과 동일한 방법으로 RNA를 추출하였다. 혈청에서 추출한 RNA는 NanoDrop 2000(Thermo Scientific사제,미국) 장비를 이용하여 RNA 정량하여 2ug을 사용하였다. 실시간 역전사 중합연쇄반응은 AccuPower HCV Quantitative RT-PCR kit((주)바이오니아사제, 대한민국)을 사용하여 수행하였다.

AccuPower HCV Quantitative RT-PCR kit에 제작된 주형 Hepatitis C virus RNA를 10³ ,10², 10¹ 카피 수가 되도록 첨가하였다. 인간 혈청과 DEPC-D.W을 사용하여 추출한 시료를 각각 주형 RNA와 함께 최종 부피가 50 ul가 되도록 넣어 주었다.

실시간 역전사 중합연쇄반응은 Exicycler 96 Real-Time Quantitative Thermal Block((주)바이오니아, 대한민국)을 이용하여 수행하였고, 반응 조건은 50℃에서 15분 동안 역전사 중합연쇄반응한 후, 95℃에서 5분 동안 사전 변성 단계를 거쳐, 95℃에서 5초 동안의 변성단계, 60℃에서 5초 동안의 어닐링 단계 및 신장 단계, 형광을 검출하는 스캔 단계의 동시 반응을 1회 반응 주기로 하여, 총 45회 반응 주기를 진행하였다. 그 결과는, 도 5에 나타내었다.

그 결과, 인간 혈청에서 추출된 RNA를 첨가한 시료에서의 C(t)는 DEPC-D.W를 추출된 산물을 첨가한 시료에 비해 C(t)가 뒤로 밀리는 현상이 나타났으며, 형광값도 현저히 떨어지는 현상을 확인하였다. C(t)가 밀리는 현상 및 형광값이 낮은 현상은 인간 혈청에서 추출한 RNA가 비특이적인 반응을 일으켜 HCV 특이적인 역전사 중합연쇄반응에서 경쟁반응을 함으로서 증폭저해를 주었다고 할 수 있다. 그러므로DEPC-D.W에서 반응시킨 비해 인간 혈청에서 추출한 RNA가 들어가면 이것에 의해 HCV의 실시간 역전사 중합연쇄반응이 저해된다는 것을 확인할 수 있었다.

도 5에서 A는 DEPC-D.W에서 추출한 시료를 첨가한 것이며, B는 인간혈청 시럼에서 추출한 시료를 첨가하여 수행한 결과이다.

[ 실시예 2] 인간혈청 내에 존재하는 RNA 터미네이션을 통한 실시간 중합연쇄반응 비특이반응 저해효과

(1) poly (A) polymerase 와 3′- 데옥시아데노신 5′- 트리포스페이트(3′-dATP)에 의한 RNA 의 터미네이션 반응

상기 실시예 1에서와 같이 인간 혈청에서 RNA을 추출한 후 3ug을 사용하여 poly(A) polymerase를 사용하여 추출 된 RNA의 3′ 말단을 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)로 터미네이션시켰다(처리구).

RNA 터미네이션 시 미반응 되고 남은 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)는 역전사 중합연쇄반응 및 PCR 반응에 저해제로 작용할 수 있어서 이를 제거하는 것은 필수적이다.

3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)로 터미네이션 된 RNA는 AccuPrep PCR Purification kit((주)바이오니아사제, 대한민국)을 이용하여 정제하였다. RNA의 3′을 터미네이션 시키지 않은 RNA(무처리구) 역시, 상기와 동일한 방법으로 정제하였으며, 처리구와 무처리구는 RNA를 상기 실시예 1과 같이 정량하여 동일하게 2 ug을 사용하였으며, 터미네이션 한 것 외에 모든 조건은 동일하게 수행하였다.

실시간 역전사 중합연쇄반응은 AccuPower HCV Quantitative RT-PCR kit((주)바이오니아사제, 대한민국)을 사용하였다. AccuPower HCV Quantitative RT-PCR kit에 제작된 주형 Hepatitis C virus RNA 가 10⁴ ,10³ ,10² 카피 수가 되도록 첨가하였다.

터미네이션 시킨 RNA(처리구)와 일반적으로 추출된 RNA(무처리구)을 각각 사용하여, 각각 주형 RNA와 함께 최종 부피가 50 ul가 되도록 넣어 주었다.

실시간 역전사 중합연쇄반응은 Exicycler 96 Real-Time Quantitative Thermal Block((주)바이오니아, 대한민국)을 이용하여 수행하였고, 반응 조건은 50℃에서 15분 동안 역전사 중합연쇄반응한 후, 95℃ 5분 동안 사전 변성 단계를 거쳐, 95℃에서 5초 동안의 변성단계, 60℃에서 5초 동안의 어닐링 단계 및 신장 단계, 형광을 검출하는 스캔 단계의 동시 반응을 1회 반응 주기로 하여, 총 45회 반응 주기를 진행하였다. 그 결과는, 도 6 에 나타내었다.

그 결과, 터미네이션 시킨 RNA(도6-C)을 사용한 시료에서 터미네이션 시키지 않은 RNA(도6-B) 시료 보다 실시간 역전사 중합연쇄반응에서 반응에 대한 저해 현상이 현저히 줄어든 것을 확인하였다.

상기의 결과는 RNA가 역전사 중합연쇄반응 및 PCR 반응에서 프라이머로 작용할 수 있고, 상기 RNA가 프라이머로 작용하는 것을 사전에 차단함으로써 비특이적인 증폭을 억제하여 역전사 중합연쇄반응 및 PCR 반응을 향상시킬 수 있음을 확인한 결과이다.

도 6에서 A는 템플레이트로 주형 RNA만을 첨가하여 수행한 결과이며, B는 주형 RNA에 인간 혈청에서 일반적으로 추출된 RNA를 첨가한 것, C는 주형 RNA에 인간 혈청에서 추출된 RNA를 터미네이션 시킨 후 첨가한 결과이다.

(2) 알칼라인 포스파타제(CIP)를 이용한 3′- 데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′- dATP ) 가수분해제거

상기 (1)에서 RNA 을 터미네이션할 때 사용되는 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)는 터미네이션 반응 이후에도 잔존하게 되는 데 이것은 역전사 중합연쇄반응 및 PCR 반응에 억제제로 작용하게 되므로 RNA 터미네이션 이후 제거해 주는 것이 바람직하다.

실시예 1과 상기(1)에서는 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)의 제거방법으로 AccuPrep PCR Purification kit((주)바이오니아사제, 대한민국)을 사용하였다.

상기 정제키트를 사용하지 않고, 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)의 활성을 억제하기 위해 CIP(시그마 알드리치사)를 이용하였다.

상기 (1)과 동일한 방법으로 RNA을 터미네이션 시킨 후, CIP를 처리하여 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)를 억제한 시료와, 대조군으로 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)으로 RNA 터미네이션 시킨 후 정제하지 않고 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)가 포함된 시료와, AccuPrep PCR Purification 키트를 사용하여 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)를 제거한 시료를 사용하였다.

CIP는 고온과 pH 변화로 불활성 시켜 역전사 중합연쇄반응 및 PCR 반응에서는 불활성화 되어 반응을 최소화 시켰다. 이후, 실시간 역전사 중합연쇄반응은 상기 (1)의 조건과 동일하게 수행하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에서 A는 조각 RNA을 터미네이션 시킨 후, CIP를 사용하여 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)를 가수분해한 시료를 첨가하여 수행한 결과이며, B 와 C는 대조군으로 B는 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)으로 RNA 터미네이션 시킨 후, 정제하지 않고 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(dATP)가 포함된 시료로 수행한 결과이며, C는 AccuPrep PCR Purification을 사용하여 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)를 제거한 시료를 사용하여 수행한 결과이다.

그 결과, 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)가 존재할 시 역전사 중합연쇄반응 및 PCR 반응이 저해되는 것을 확인할 수 있었다.

반면, AccuPrep PCR Purification kit 와 CIP에 의해 잔존하는 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)를 제거한 시료에서는 역전사 중합연쇄반응 및 PCR 반응이 저해되지 않는 것을 확인할 수 있었다.

상기의 결과들로부터 정제된 핵산에 상기 실시예의 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)을 처리함으로써 많은 양의 RNA에 포함되어 있는 자체 RNA에 의한 비특이 셀프프라이밍을 제거할 수 있었고. 이는 높은 민감도로 타깃 핵산을 검출할 수 있는 핵산을 수득할 수 있음을 확인한 결과이다.

또한, 상기의 결과는 극미량의 핵산을 검출하기 위한 PCR 반응이나 실시간 정량 PCR 반응에서 타깃 핵산의 증폭반응을 저해하는 주형핵산의 셀프프라이밍을 근본적으로 제거함으로써 타깃 핵산만을 정확하게 증폭하여 검출하거나 타깃 핵산만의 농도를 정확하게 측정할 수 있음을 확인한 결과이다.

[ 실시예 3] RNA 터미네이션을 통한 RNA 셀프프라이밍에 의한 비특이 역전사 중합연쇄반응 억제 효과

상기 실시예 1에서와 같은 RNA 추출 키트를 이용하여 인간 세포 종인 휄라 C세포에서 RNA을 추출하였다. poly(A) polymerase와 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)를 사용하여 추출된 RNA의 3′말단을 터미네이션시켰다(C, D).

잔류 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)를 제거하기 위해 터미네이션된 RNA를 AccuPrep PCR Purification kit((주)바이오니아사제, 대한민국)을 이용하여 정제하였다. RNA의 3′을 터미네이션 시키지 않은 RNA(A 및 B)도 같은 조건에서 비교를 위해 상기와 동일한 방법으로 정제하였다. 핫스타트 역전사 중합연쇄반응의 영향을 비교하기 위해, 핫스타트 기능이 있는 역전사 중합연쇄반응(B 및 D)과 핫스타트 기능이 없는 역전사 중합연쇄반응(A 및 C)으로 수행하였다.

각각의 RNA 5 ug을 각각 사용하였으며, 일반 중합연쇄반응은 AccuPower RocketScript RT Premix((주)바이오니아사제, 대한민국)를 사용하였고, 핫스타트 역전사 중합연쇄반응은 AccuPower RocketScript RT Premix((주)바이오니아사제, 대한민국)에 피로포스페이트와 포스파타제(대한민국 특허등록 제10-1098764)를 첨가하고, 최종 볼륨이 20 ul가 되도록 증류수를 첨가하여 핫스타트 역전사 중합연쇄반응을 수행하였다. RNA 셀프 프라이밍의 효과를 확인하기 위해 역전사 중합연쇄반응에 필요한 어떠한 종류의 프라이머도 첨가하지 않았다.

역전사 중합연쇄반응은 Mygenie 96 Gradient Thermal Block((주)바이오니아, 대한민국)을 이용하여 수행하였고, 반응 혼합과정 상의 RNA 셀프프라이밍 효과를 보기 위해 25℃에서 20분 동안 인큐베이션을 하였다.

이후 RNA 셀프 프라이밍에 의한 역전사 중합연쇄반응의 진행유무를 확인하기 위해, 각각의 역전사 중합연쇄반응물을 주형 템플레이트로 사용하고 AccuPower Dualstar qPCR Premix((주)바이오니아사제,대한민국)을 이용하여 인간 GAPDH를 표적 유전자에 대한 실시간 중합연쇄반응을 수행하였다.(정방향 프라이머 5'-CGTGGAAGGACTCATGACCACA-3':서열번호 6, 역방향 프라이머 GCCTTGGCAGCGCCAGTAGA-3':서열번호 7, 및 GAPDH 탐침 프로브 5'-CTGTGGATGGCCCCTCCGGGAAA-3':서열번호 8 ,각 10 nM 농도로 사용)

실시간 PCR은 Exicycler 96 Real-Time Quantitative Thermal Block ((주)바이오니아, 대한민국)을 이용하여 수행하였고, 반응 조건은 95℃ 5분 동안 사전 변성 단계를 거쳐, 95℃에서 5초 동안의 변성단계, 60℃에서 5초 동안의 어닐링 단계 및 신장 단계, 형광을 검출하는 스캔 단계의 동시 반응을 1회 반응 주기로 하여, 총 45회 반응 주기를 진행하였다.

그 결과는, 도 8 에 나타내었다. 터미네이션 시키지 않은 RNA(A 및 B)에서는 어떤 프라이머를 넣어 주기 않아도 cDNA가 만들어지는 것을 인간 GAPDH 유전자가 검출되는 것으로서 확인할 수 있었다. 상기의 결과는 셀프 프라이밍에 의해 cDNA가 합성되었기 때문에 PCR에서 증폭이 된 것이다.

그리고 핫스타트 역전사 중합연쇄반응으로도 비특이적인 cDNA 합성과 이어지는 PCR 증폭을 막는다고 해도 완벽하게 저해할 수 없고 부분적으로만 RNA 셀프프라이밍에 의한 역전사 중합연쇄반응을 저해시킬 수 있어서 Ct 값이 약 5정도 늦추어져 1/30 정도로 반응을 저해시킬 수 있었다.

그러나 RNA의 3' 말단을 터미네이션한 시료(C 및 D)에서 모든 역전사 중합연쇄반응에서 45 cycle까지 증폭되지 않음으로써 전혀 cDNA가 합성되지 않음을 확인하였다.

상기의 결과는 역전사 중합연쇄반응물 혼합시에 많은 비특이 역전사 중합연쇄반응들이 일어나고, 이로 인해 많은 비특이 cDNA들이 만들어 진다는 것을 알 수 있다. 그리고 상기 결과로부터 원하지 않는 반응들은 핫스타트 역전사 중합연쇄반응만으로 억제할 수 없다는 것을 확인할 수 있었으며 결국, 이러한 RNA 셀프프라이밍에 의한 비특이 역전사 중합연쇄반응은 본 발명의 터미네이션 반응을 이용하여 차단함으로써 완벽하게 억제시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

도 8에서 A와 B는 터미네이션 시키지 않은 RNA을 사용한 것이고, C와 D는 터미네이션반응을 한 RNA를 사용한 것이다. A와 C는 일반적인 역전사 반응을 수행하였고, B와 D는 핫스타트 역전사 반응을 수행한 것이다.

[ 실시예 4] 여러 종류의 변형 블로킹 올리고뉴클레오티드에 의한 비특이적 반응 억제 효과

블로킹 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 여러 종류의 치환기를 적용한 후 블로킹 올리고뉴클레오티드의 핫스타트 효과를 확인하였다. 사용된 치환기는 하기 표 2에 나타내었으며, PCR 반응은 95℃에서 20초, 55℃에서 40초, 72℃에서 60초의 과정을 1회로 하여 총 30회를 수행하였고, 예비 변성과 최종 신장은 각각 94℃에서 5분, 72℃에서 5분씩 수행하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에서, 레인 1, 2 및 3은 각각 표 1의 P55/P63(447 bp), P55/P73(1,082 bp) 및 P55/P83(1,29 6bp)의 염기서열은 갖는 프라이머쌍을 사용한 결과이다. 또한, A는 양성대조군으로 핫스타트 기능을 갖는 핫스타트 PCR 프리믹스를 사용한 결과이고, B, C, D, E, F 및 G는 음성대조군으로 핫스타트 기능이 없는 PCR 프리믹스에 표 2의 순서 대로 각 인스턴트 블로킹올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR 반응을 수행한 결과이다. 레인 M은 DNA 사이즈를 구별할 수 있는 100 bp DNA Ladder를 나타낸 것이다.

그 결과, 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 블로킹 올리고뉴클레오티드의 3' 쪽에 DNA 중합효소를 블로킹시킬 수 있는 어떤 종류의 화학물질이 오더라도 비특이적인 증폭 반응을 억제할 수 있음을 확인하였다 (도 12).

[ 실시예 5]. 실시간 PCR 반응에서 블로킹 올리고뉴클레오티드에 의한 프라이머 다이머 억제 효과

실시간 PCR 검출법에서 블로킹 올리고뉴클레오티드를 포함하는 PCR 조성물에 의한 핫스타트 효과를 확인하기 위하여, 2x PCR Premix 용액(10 mM TrisHCl pH 9.0, 50 mM KCl, 2.0 mM MgCl₂, 각각 250 μM의 4종류의 dNTP, 1U Taq. DNA 중합효소, 0.01% Tween 20 및 안정화제를 포함)에 20 ㎕ 반응당 0.3X가 되도록 형광물질(Greenstar™, 바이오니아사)을 첨가하고, 정방향 프라이머와 동일한 농도인 20 pmole의 블로킹 올리고뉴클레오티드가 첨가되어 있는 조성물을 제조하였다. 대조군으로는 상기 2x PCR Premix 용액에 20 ㎕ 반응당 0.25x가 되도록 상기 형광물질을 첨가하였다. 상기 형광물질은 주형 DNA 증폭시 생성하는 이중가닥의 DNA 사이에 끼어들어(intercalation) 발생하는 형광량을 측정함으로써 특이적 염기서열의 형광 프로브 없이도 간편하게 분석할 수 있는 형광물질이다. 주형 DNA로는 인간 세포에서 추출한 총 RNA를 AccuPower CycleScript RT PreMix((주) 바이오니아)에 100 ng이 되도록 첨가하여 42℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 95℃에서 5분 동안 역전사효소를 불활성화시킨 cDNA 5 ㎕를 사용하였고, 표 3에 기재되는 프라이머 및 블로킹 올리고뉴클레오티드를 20 ㎕ 반응당 각각 20 pmole의 농도로 사용하였다.

이름	프라이머	길이	Tm(℃)	서열	서열번호
GM501 qPCR	전방 프라이머	20mer	55.2	GAC GTC CGC ATC TTG AAT TG	9
	후방 프라이머	20mer	55.2	TTC CCA CGA TTA GGA GCA CA	10
	F-블로킹 올리고	17mer	45.8	CAA TTC AAG ATG CGG AC	11

실시간 PCR 반응은 Exicycler 96 Real-Time Quantitative Thermal Block((주) 바이오니아)을 이용하여 수행하였고, 반응 조건은 94℃에서 5분 동안 사전 변성 단계를 진행한 후, 95℃에서 10초 동안의 변성 단계, 60℃에서 15초 동안의 어닐링 단계 및 신장 단계의 동시 반응을 1 반응 주기로 하여 총 45회 반응 주기를 진행하였다. 이후, 분리 단계(dissociation step)를 진행하여 증폭 산물에 대한 멜팅 커브를 작성함으로써 PCR 증폭 산물에 대한 PCR 반응성 및 특이성을 확인하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.

그 결과, 선 Ⅰ과 선 Ⅱ에 대한 역치 사이클수(threshold cycle)(Ct)는 선 Ⅰ 23.89 C(t), 선 Ⅱ 29.5C(t)인 것으로 나타났다(도 13). 선 Ⅱ 보다 선 Ⅰ에서 C(t)가 당겨진 것은 멜팅 커브에서 나타난 바와 같이 블로킹 올리고뉴클레오티드가 포함된 선 Ⅱ에서는 정확한 증폭 산물만이 생성되었다는 하나의 형광피크만이 나타난 반면, 블로킹 올리고뉴클레오티드가 포함되지 않은 선 Ⅰ은 두개의 증폭 산물이 생성되었다는 두개의 형광 피크가 나타났기 때문이다. 이는 목적하는 PCR 증폭 산물 이외에 그보다 작은 크기의 프라이머 다이머 증폭 산물 또는 비특이적인 증폭 산물이 생성되었음을 의미한다. 또한, 정확한 PCR 증폭 산물에 대한 멜팅 온도(Tm)는 실험군(선 Ⅱ) 및 대조군(선 Ⅰ)에서 공히 85.5℃로 확인되었고, 프라이머 다이머 또는 비특이적인 증폭 산물에 대한 멜팅 온도(Tm)는 이보다 낮은 75.5℃로 확인되었다.

상기 결과로부터, 대조군의 경우에는 증폭 산물 이외에도 프라이머 다이머가 생성되어 낮은 특이성을 보이는 것과 대조적으로, 본 발명에 사용되는 인스턴트 핫스타트 PCR 방법은 실시간 PCR 반응에서도 낮은 온도 및 PCR 반응 중에 나타나는 비특이적인 반응을 억제시킨 PCR 반응을 효과적으로 복구시켜 핫스타트 방법의 장점인 비특이적 PCR 증폭 산물의 생성을 억제시키고, 정확한 결과를 확인할 수 있음을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Bioneer <120> High-sensitivity nucleic acid preparation methods for the detection of nucleic acid by nucleic acid polymerization <130> P12-B195 <150> 10-2012-0036978 <151> 2012-04-09 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gaaggtgaag gtcggagtca acg 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agtccttcca cgataccaaa gttg 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tagaagcatt tgcggtggac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aggattccta tgtgggcgac 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tagaagcatt tgcggtggac 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cgtggaagga ctcatgacca ca 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gccttggcag cgccagtaga 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ctgtggatgg cccctccggg aaa 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gacgtccgca tcttgaattg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ttcccacgat taggagcaca 20 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 caattcaaga tgcggac 17

Claims

핵산중합반응을 이용하여 핵산을 증폭 검출하는데 사용되는 핵산 준비방법으로서,
(1) 핵산, 핵산중합효소, 효소반응 완충용액 및 핵산의 3' 말단의 신장을 억제하는 핵산중합 터미네이터를 포함하는 반응혼합물을 반응시켜 핵산의 3'말단을 터미네이션시키는 단계; 및
(2) 상기 반응 혼합물로부터 미반응된 유리 핵산중합 터미네이터를 불활화 또는 제거시키는 단계;
를 포함하는 핵산준비방법.
제1항에 있어서, 상기 핵산중합반응은 프라이밍에 의해 중합반응이 개시되는 것을 특징으로 하는 핵산준비방법.
제2항에 있어서, 상기 핵산중합반응은 RNA의존성 RNA중합반응, DNA의존성 RNA중합반응, RNA 의존성 DNA중합반응, 및 DNA의존성 DNA중합반응으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핵산준비방법.
제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 핵산은 터미네이션 반응이 가능하게 분리정제된 것임을 특징으로 하는 핵산준비방법.
제1항에 있어서, 상기 핵산은 RNA 또는 DNA이고, 상기 핵산중합효소는 RNA-의존성 RNA-중합효소, RNA-의존성 DNA-중합효소, DNA-중합효소, 및 RNA-중합효소로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핵산준비방법.
제5항에 있어서, 상기 RNA-의존성 RNA-중합효소는 플레비바이러스(flavivirus) 유래의 NS5 효소인 것을 특징으로 하는 핵산준비방법.
제5항에 있어서, 상기 RNA-의존성 DNA 중합효소는 MMLV 또는 AMV 또는 HIV 역전사 효소인 것을 특징으로 하는 핵산준비방법.
제5항에 있어서, 상기 RNA 중합효소는 3'terminal transferase 로서 Poly(A) polymerase인 것을 특징으로 하는 핵산준비방법.
제1항에 있어서, 상기 핵산중합 터미네이터는 상기 핵산중합효소에 작용할 수 있는 트리포스페이트 형태로 활성화된 핵산유사 화합물로서 핵산의 3'위치의 수산기에 해당하는 위치에 수산기를 가지고 있지 않은 핵산유사 화합물인 것을 특징으로 하는 핵산준비방법.
제9항에 있어서, 상기 핵산유사 화합물은 2'3'-디데옥시 뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(2'3'-dideoxynucleoside 5'-triphosphate) 3'-데옥시아데노신 5'-트리포스페이트(3'-deoxyadenosine 5'-triphosphate), 3'-아지도-3'디옥시티미딘 5'-트리포스페이트 (3'-azido-3'-deoxythymidine 5'-triphosphate), 1-β-d-아라비노실뉴크레오시드 5'-트리포스페이트(1-β-d-Arabinofuranosylnucleoside 5′-Triphosphate), 아시클로 구아노신트리포스페이트(acyclo-guanosine triphosphate), 3'-아미노-3'디옥시뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(3'-amino-2'-deoxynucleoside 5'-triphosphate), 및 3'-플로르-3'디옥시뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(3'-fluoro-3'-deoxynucleoside 5'-triphosphate)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핵산준비방법.
제10항에 있어서, 상기 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP)는 구아노신, 아데노신, 티미딘, 유리딘 및 시티딘으로 구성된 군에서 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핵산유사 화합물을 포함하는 핵산준비방법.
제9항에 있어서, 상기 2) 단계의 핵산중합 터미네이터의 불활화는 트리포스페이트를 가수분해하는 포스포결합 가수분해효소로 처리하는 것을 특징으로 하는 핵산준비방법.
제12항에 있어서, 상기 포스포결합 가수분해효소는 대장균유래, 소의 소장유래, 새우유래의 알칼리성 포스파타제 및 오토탁신(Autotaxin)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 효소를 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산준비방법.
제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 핵산중합 터미네이터의 제거는 gel filteration 또는 caotropic agent를 이용하는 것을 특징으로 하는 핵산준비방법.
핵산중합효소, 효소반응 완충용액 및 핵산의 3' 말단의 신장을 억제하는 핵산중합 터미네이터를 포함하는, 핵산중합반응을 이용하여 핵산을 증폭 검출하는데 사용되는 핵산 준비방법에 필요한 핵산준비키트.
제16항에 있어서, 상기 핵산중합효소는 RNA-의존성 RNA-중합효소, RNA-의존성 DNA-중합효소, DNA-중합효소, 및 RNA-중합효소로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산준비키트.
제16항에 있어서, 상기 RNA-의존성 RNA-중합효소는 플레비바이러스(flavivirus) 유래의 NS5 효소인 것을 특징으로 하는 핵산준비키트.
제16항에 있어서, 상기 RNA-의존성 DNA 중합효소는 MMLV 또는 AMV 역전사 효소인 것을 특징으로 하는 핵산준비키트.
제16항에 있어서, 상기 RNA 중합효소는 3'terminal transferase 로서 Poly(A) polymerase인 것을 특징으로 하는 핵산준비키트.
제15항에 있어서, 상기 핵산중합 터미네이터는 상기 핵산중합효소에 작용할 수 있는 트리포스페이트 형태로 활성화된 핵산유사 화합물로서 핵산의 3'위치의 수산기에 해당하는 위치에 수산기를 가지고 있지 않은 핵산유사 화합물인 것을 특징으로 하는 핵산준비키트.
제20항에 있어서, 상기 핵산유사 화합물은 2'3'-디데옥시 뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(2'3'-dideoxynucleoside 5'-triphosphate) 3'-데옥시아데노신 5'-트리포스페이트(3'-deoxyadenosine 5'-triphosphate), 3'-아지도-3'디옥시티미딘 5'-트리포스페이트 (3'-azido-3'-deoxythymidine 5'-triphosphate), 1-β-d-아라비노실뉴크레오시드 5'-트리포스페이트(1-β-d-Arabinofuranosylnucleoside 5′-Triphosphate), 아시클로 구아노신트리포스페이트(acyclo-guanosine triphosphate), 3'-아미노-3'디옥시뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(3'-amino-2'-deoxynucleoside 5'-triphosphate), 및 3'-플로르-3'디옥시뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(3'-fluoro-3'-deoxynucleoside 5'-triphosphate)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핵산준비키트.
제21항에 있어서, 상기 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP)는 구아노신, 아데노신, 티미딘, 유리딘 및 시티딘으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핵산유사 화합물을 포함하는 핵산준비키트.
제20항에 있어서, 상기 키트는 핵산중합 터미네이터의 불활화시키는 트리포스페이트를 가수분해하는 포스포결합 가수분해효소를 추가로 더 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 핵산준비키트.
제23항에 있어서, 상기 포스포결합 가수분해효소는 대장균유래, 소의 소장유래, 새우유래의 알칼리성 포스파타제, 및 오토탁신(Autotaxin)으로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산준비키트.
핵산중합효소와 핵산중합 터미네이터를 보관하는 보관부; 및
타깃 핵산을 포함하는 시료에 상기 핵산중합효소와 핵산중합 터미네이터를 공급하는 공급부;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산자동정제장치.
제25항에 있어서, 상기 보관부는 트리포스페이트 가수분해효소 및 효소반응 완충용액을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산자동정제장치.
제25항 또는 제 26항에 있어서, 상기 장치는 컴퓨터 제어부가 추가되어 전자동화 되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산자동정제장치.
제27항에 따른 핵산자동정제장치가 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 전자동핵산검사장비.
3' 말단에 핵산중합 터미네이터가 결합되어 비특이 핵산중합이 방지된 핵산중합반응용 주형핵산을 이용하는 것을 특징으로 하는 핵산중합방법.
제29항에 있어서, 상기 핵산중합 터미네이터는 핵산중합효소에 작용할 수 있는 트리포스페이트 형태로 활성화되고, 3'에 수산기이외의 다른 잔기를 가지는 핵산유사 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
제29항에 있어서, 상기 핵산 유사 화합물은 2'3-디데옥시 뉴클레오티드 5' 트리포스페이트, 3-데옥시아데노신, 5-트리포스페이트, 3'아지도-3디옥시티미딘 5'-트리포스페이트, 1-β-d-아라비노실뉴크레오시드 5' -트리포스페이트, 아시클로 구아노신트리포스페이트, 3' 아미노-3'-디옥시뉴클레오시드 5'-트리포스페이트 및 3'프로르-3'디옥시뉴클레오시드 5' 트리포스페이트로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제29항에 있어서, 핵산중합반응은 RNA 의존성 RNA 중합반응, DNA 의존성 RNA 중합반응, RNA 의존성 DNA 중합반응 및 DNA의존성 DNA 중합반응으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
3' 말단에 핵산중합 터미네이터가 결합되어 비특이 핵산중합이 방지된 주형핵산, Mg2+이온, 4종의 dNTP, DNA 중합효소 및 주형핵산 증폭용 프라이머를 포함하는 핵산 중합용 조성물.
제33항에 있어서, 상기 핵산중합 터미네이터는 핵산중합효소에 작용할 수 있는 트리포스페이트 형태로 활성화되고, 3'에 수산기 이외의 다른 잔기를 가지는 핵산유사 화합물인것을 특징으로 하는 핵산 중합용 조성물.
제34항에 있어서, 상기 핵산 유사 화합물은 2'3-디데옥시 뉴클레오티드 5' 트리포스페이트, 3-데옥시아데노신, 5-트리포스페이트, 3'아지도-3디옥시티미딘 5'-트리포스페이트, 1-β-d-아라비노실뉴크레오시드 5' -트리포스페이트, 아시클로 구아노신트리포스페이트, 3' 아미노-3'-디옥시뉴클레오시드 5'-트리포스페이트 및 3'프로르-3'디옥시뉴클레오시드 5' 트리포스페이트로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핵산 중합용 조성물.
제33항에 있어서, 3' 말단의 수산기가 블로킹되고 상기 주형핵산 증폭용 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 블로킹 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 중합용 조성물.
제36항에 있어서, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머보다 염기서열 수가 적고, 5bp이상인 것을 특징으로 하는 핵산 중합용 조성물.
제36항에 있어서, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머보다 1℃ 이상 낮은 멜팅온도를 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 중합용 조성물.
제33항에 있어서, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 25℃ 이상의 멜팅온도를 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 중합용 조성물.
제33항에 있어서, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 3' 말단의 수산기가 상기 수산기 이외의 치환기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산 중합용 조성물.
제40항에 있어서, 상기 치환기는 형광물질(dye), 소광자 및 다음 화학식 1 내지 화학식 16으로 표시되는 치환기 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 중합용 조성물:
[화학식 1]
-H

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

[화학식 11]

[화학식 12]

[화학식 13]

[화학식 14]

[화학식 15]

[화학식 16]

.
제36항 내지 제41항 중 어느 한항에 있어서, 블로킹 올리고뉴클레오티드는 블로킹 올리고 RNA이고, 핵산중합은 RT-qPCR 인 것을 특징으로 하는 핵산중합용 조성물.