KR20130109974A - 식물체에서 dha 및 다른 lc-pufa의 생산 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 숙주 생물체에서 PUFA의 생산을 허용 및/또는 개선시키는 다중불포화 지방산(PUFA) 신타제 시스템 및 하나 이상의 보조 단백질(예: PPTase 및/또는 ACoAS)로 유전자 변형된 재조합 숙주 생물체(예: 식물)를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 생물체로부터 수득한 생성물(예: 오일 및/또는 종자) 뿐만 아니라 이러한 생물체를 제조하고 사용하는 방법(PUFA를 수득하기 위해)에 관한 것이다.
Description
본 발명은, 숙주 생물체에서 PUFA의 생산을 허용 및/또는 개선시키는 다중불포화 지방산(PUFA) 신타제 시스템 및 하나 이상의 보조 단백질로 유전자 변형된 재조합 숙주 생물체(예: 식물체)를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 생물체로부터 수득한 생성물(예: 오일 및/또는 종자) 뿐만 아니라 이러한 생물체를 제조하고 사용하는 방법(PUFA를 수득하기 위해)에 관한 것이다.
다중불포화 지방산(PUFA)은 영양 분야, 약제 분야, 산업 분야 및 기타 목적에 유용한 것으로 간주된다. 그러나, 천연 공급원(예: 어유(fish oils)) 및 화학 합성으로부터 PUFA의 현재 공급은 장기간의 상업적 요구를 위해 충분하지 않다.
식물(예: 오일 종자 작물)로부터 유래된 식물성 오일은 비교적 저렴하고, 어유와 관련된 오염 문제를 갖지 않는다. 그러나, 상업적으로 개발된 식물 및 식물유에서 발견된 PUFA는 더욱 포화된 또는 보다 장쇄의 PUFA를 통상 포함하지 않고, 리놀레산(델타 9 및 12 위치에서, 2개의 이중결합을 갖는 18개 탄소 -- 18:2 델타 9,12) 및 리놀렌산(18:3 델타 9,12,15) 등의 지방산을 통상 유일하게 포함한다.
식물체에 의해 내생적으로 생산된 지방산의 변형에 의한 식물체에서 더욱 불포화된 또는 보다 장쇄의 PUFA의 생산은 기재되어 있다. 예를 들면, 지방산 신장효소(elongase) 및/또는 탈포화효소(desaturase)를 코딩하는 다양한 개개 유전자를 사용한 식물체의 유전자 변형은 에이코사펜타엔산(EPA) 등의 보다 장쇄 및 더욱 불포화된 PUFA를 상당한 수준으로 함유하지만 혼합된 보다 단쇄 및 덜 불포화된 PUFA를 또한 상당한 수준으로 함유하는 잎 또는 종자를 생성하는 것으로 기재되어 있다[참조: Qi et al., Nature Biotech. 22:739 (2004); WO 04/071467; Abbadi et al., Plant Cell 16:1 (2004); Napier and Sayanova, Proceedings of the Nutrition Society 64:387-393 (2005); Robert et al., Functional Plant Biology 32:473-479 (2005); 미국 특허출원 공개번호 2004/0172682].
브라시카(Brassica) 속은 세계의 가장 중요한 지방종자 작물 중의 하나인 캐놀라를 포함하고, 대부분의 지방종자 작물은 적당한 지형에서 재배했다. 캐놀라는 전통적으로, 에루스산 및 글루코시놀레이트가 제거되거나 통상적인 육종을 통해 현저히 감소된, 브라시카 나푸스(Brassica napus)(브라시카 라파(Brassica rapa)와 브라시카 올레라세아(Brassica oleracea)의 종간 교잡의 결과로서 유래된 종)으로서 특성화되어 있다. 대부분의 캐놀라 오일은 인간 소비를 위해 생산된 식물유 형태이다. 또한, 산업 분야에서는 캐놀라 오일의 사용을 위한 시장이 성장하고 있다.
캐놀라 종자의 특정 품종으로부터 유래된 식용유 및 산업유의 품질은, 지방산 불포화의 유형 및 양이 식이 및 산업 분야 둘 다에 대한 관련성을 갖기 때문에, 이의 구성 지방산에 의해 결정된다. 통상의 캐놀라 오일은 약 60% 올레산(C18:1), 약 20%의 리놀레산(C18:2) 및 약 10%의 리놀렌산(18:3)을 함유한다. 통상적 캐놀라에 전형적인 다중불포화 리놀렌산의 수준은 당해 오일이 용이하게 산화되기 때문에 바람직하지 않고, 산화 속도는 산소의 존재, 광 및 열에의 노출, 및 오일 중의 천연 또는 첨가된 항산화제 및 산화촉진제의 존재를 포함하는 몇몇 인자에 의해 영향을 받는다. 산화는 반복된 프라잉(frying)(유도된 산화) 또는 장기간 저장(자동-산화)의 결과로서 불쾌한 냄새 및 악취를 유발한다. 산화는 또한 캐놀라 오일의 윤활 및 점성 특성을 변화시킬 수 있다.
통상의 캐놀라 오일과 비교하여 다중불포화 지방산의 수준 감소 및 모노불포화 올레산의 수준 증가를 나타내는 오일은 보다 높은 산화 안정성과 관련된다. 산화에 대한 개개 지방산의 감수성은 이들의 불포화도에 의존한다. 따라서, 3개의 탄소-탄소 이중결합을 보유하는 리놀렌산의 산화 속도는 단지 하나의 이중결합을 갖는 올레산 산화 속도의 25배이고, 2개의 이중결합을 갖는 리놀레산 산화 속도의 2배이다. 리놀레산 및 리놀렌산은 또한, 이들이 용이하게 과산화물을 형성하기 때문에, 냄새 및 향기에 대해 대부분의 영향을 갖는다. 높은 올레산 오일(≥70% 올레산)은 저장, 프라잉 및 정련(refining) 동안 산화에 덜 감수성이고, 발연 없이 보다 고온으로 가열하여 조리유로서 더욱 적합할 수 있다. 종자 오일(seed oil) 중의 지방산 프로파일이 올레산(C18:1) 70%(중량 기준) 초과 및 리놀렌산(C18:3) 3.5%(중량 기준) 미만을 갖는 상업적으로 판매된 캐놀라 품종의 예는 다우 아그로사이언시스 엘엘씨(Dow AgroSciences LLC)사(Indianapolis, IN)에서 판매된 NexeraTM 품종이고, 당해 품종은, 딥 프라잉(deep frying), 소테(sauteing), 베이킹, 스프레잉을 포함하는 다수의 분야 및 샐러드 드레싱에서 레스토랑 및 외식 산업에 의해 현재 사용된 "오메가-9 오일", 비수소화된, 높은 올레산, 낮은 리놀렌산 오일을 생산한다.
당해 기술분야에서는, 식물체, 식물 종자 또는 식물 오일에서 이러한 PUFA가 풍부한 지질(예: 트리아실글리세롤(TAG) 및 인지질(PL))의 양 뿐만 아니라 식물체, 식물 종자 또는 식물 오일에서 보다 장쇄 또는 더욱 불포화된 PUFA의 양(예: 상업적 양)을 효율적 및 효과적으로 생산하기 위한 비교적 저렴한 방법이 요구되고 있다. 본원에 기재된 다중불포화 지방산(PUFA) 신타제 및 하나 이상의 보조 단백질로 유전자 변형된 재조합 숙주 생물체를 제공함으로써 숙주 생물체(예: 식물체)에서 PUFA 생산을 제공하고 개선시키는 시스템은 당해 기술분야에서 상기 접근법에 대한 중요한 대안이다.
본 발명은, (i) 적어도 하나의 PUFA를 생산하는 다중불포화 지방산(PUFA) 신타제 시스템(예: 조류 PUFA 신타제 시스템)을 인코딩하는 핵산 서열 및 (ii) 포스포판테테이닐 보조인자를 PUFA 신타제 시스템(예: 조류 PUFA 신타제 시스템) ACP 도메인으로 전달하는 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제(PPTase)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 식물체(예: 브라시카), 이의 후대, 종자, 세포, 조직, 또는 부분에 관한 것이다. 일부 양태에서, 유전자 변형된 식물, 이의 후대, 종자, 세포, 조직 또는 부분은 경제적으로 중요한 브라시카 종[예: 브라시카 나푸스(Brassica napus) 또는 브라시카 준세아(Brassica juncea)로부터 유래한다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 60% 내지 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 60% 내지 99% 동일한 핵산 서열을 포함하건, 서열번호 6의 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템은 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 60% 내지 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 60% 내지 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 서열번호 7의 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 60% 내지 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 60% 내지 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 서열번호 8의 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템은 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 6, 7 또는 8의 핵산 서열 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, PPTase는 서열번호 5와 적어도 60% 내지 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, PPTase를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 60% 내지 99% 동일하거나, 서열번호 10의 핵산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 핵산 서열(i) 및 (ii)는 단일 재조합 발현 벡터에 함유되어 있다. 일부 양태에서, 핵산 서열(i) 및 (ii)는 종자 특이적 프로모터에 작동적으로 연결되어 있다. 일부 양태에서, 핵산 서열(i) 및 (ii)는 PvDlec2, PvPhaseolin, LfKCS3 및 FAE 1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 프로모터에 작동적으로 연결되어 있다.
일부 양태에서, 유전자 변형된 식물(예: 캐놀라 오일을 생산하는 브라시카 종), 이의 후대, 종자, 세포, 조직 또는 부분은 (iii) 장쇄 PUFA 유리 지방산(PFFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 아실-CoA 신타제(ACoAS)를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, ACoAS는 서열번호 4와 적어도 60% 내지 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ACoAS는 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 60% 내지 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 서열번호 9의 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ACoAS를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 34의 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 핵산 서열(i), (ii) 및/또는 (iii)은 단일 재조합 발현 벡터에 함유되어 있다.일부 양태에서, 핵산 서열(i), (ii) 및/또는 (iii)은 종자 특이적 프로모터에 작동적으로 연결되어 있다. 일부 양태에서, 핵산 서열(i), (ii) 및/또는 (iii)은 PvDlec2, LfKCS3 및 FAE 1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 프로모터에 작동적으로 연결되어 있다.
일부 양태에서, 유전자 변형된 식물(예: 브라시카), 이의 후대, 세포, 조직 또는 부분은 아세틸 CoA 카복실라제(ACCase)를 인코딩하는 핵산 서열 및/또는 타입 2 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(DGAT2)를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
본 발명은 서열번호 6 내지 10 및 서열번호 34로부터 선택된 핵산 서열, 재조합 발현 벡터 pDAB7361, 재조합 발현 벡터 pDAB7362, 재조합 발현 벡터 pDAB7363, 재조합 발현 벡터 pDAB7365, 재조합 발현 벡터 pDAB7368, 재조합 발현 벡터 pDAB7369, 재조합 발현 벡터 pDAB7370, 재조합 발현 벡터 pDAB100518, 재조합 발현 벡터 pDAB101476, 재조합 발현 벡터 pDAB9166, 재조합 발현 벡터 pDAB9167, 재조합 발현 벡터 pDAB7379, 재조합 발현 벡터 pDAB7380, 재조합 발현 벡터 pDAB9323, 재조합 발현 벡터 pDAB9330, 재조합 발현 벡터 pDAB9337, 재조합 발현 벡터 pDAB9338, 재조합 발현 벡터 pDAB9344, 재조합 발현 벡터 pDAB9396, 재조합 발현 벡터 pDAB101412, 재조합 발현 벡터 pDAB7733, 재조합 발현 벡터 pDAB7734, 재조합 발현 벡터 pDAB101493, 재조합 발현 벡터 pDAB109507, 재조합 발현 벡터 pDAB109508, 재조합 발현 벡터 pDAB109509, 재조합 발현 벡터 pDAB9151, 재조합 발현 벡터 pDAB108207, 재조합 발현 벡터 pDAB108208, 재조합 발현 벡터 pDAB108209, 재조합 발현 벡터 pDAB9159, 재조합 발현 벡터 pDAB9147, 재조합 발현 벡터 pDAB108224 또는 재조합 발현 벡터 pDAB108225를 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
일부 양태에서, 유전자 변형된 식물, 이의 후대, 종자, 세포, 조직 또는 부분으로부터 수득된 종자 오일은 검출가능한 양의 DHA(도코사헥사엔산(C22:6, n-3)) 및/또는 EPA(에이코사펜타엔산(C20:5, n-3))를 포함한다. 일부 양태에서, 종자 오일은 0.01% 내지 15% DHA, 0.05% 내지 10% DHA, 또는 0.05% 내지 5% DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 종자 오일은 0.01% 내지 5% EPA, 0.05% 내지 5% EPA, 또는 0.05% 내지 1% EPA를 포함한다. 다른 양태에서, 종자 오일에서 발견된 검출가능한 양의 DHA 및/또는 EPA는 또한 유전자 변형된 식물로부터 수득된 낟알 및/또는 굵게 빻은 가루에서 발견된다. 일부 양태에서, 검출가능한 양의 DHA 및/또는 EPA는 70중량% 이상의 올레산(C18:1) 및/또는 4중량% 이하의 리놀렌산(C18:3)을 포함하는 지방산 함량을 갖는 브라시카 종의 종자 오일에서 발견된다.
본 발명은 본원에 기재된 유전자 변형된 식물(예: 브라시카), 이의 후대, 세포, 조직 또는 부분으로부터 수득된 오일 또는 종자에 관한 것이다. 본 발명은 본원에 기재된 유전자 변형된 식물, 이의 후대, 세포, 조직 또는 부분으로부터 수득된 오일을 포함하는 식료품에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 유전자 변형된 식물, 이의 후대, 세포, 조직 또는 부분으로부터 수득된 오일, 또는 본원에 기재된 유전자 변형된 식물, 이의 후대, 세포, 조직 또는 부분으로부터 수득된 종자를 포함하는 기능성 식품에 관한 것이다. 본 발명은 본원에 기재된 유전자 변형된 식물, 이의 후대, 세포, 조직 또는 부분으로부터 수득된 오일을 포함하는 약품에 관한 것이다.
본 발명은, 본원에 기재된 유전자 변형된 식물(예: 브라시카), 이의 후대, 세포, 조직 또는 부분으로부터 또는 본원에 기재된 유전자 변형된 식물(예: 브라시카)의 종자, 이의 후대, 세포, 조직 또는 부분으로부터 오일을 회수하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 LC-PUFA를 포함하는 오일의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 본원에 기재된 유전자 변형된 식물체(예: 브라시카), 이의 후대, 세포, 조직 또는 부분을 성장시키는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 LC-PUFA를 포함하는 오일의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 유전자 변형된 식물(예: 브라시카)의 종자, 이의 후대, 세포, 조직 또는 부분으로부터 오일을 회수하는 단계를 포함하는, 종자 오일에서 적어도 하나의 LC-PUFA를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 본원에 기재된 유전자 변형된 식물(예: 브라시카), 이의 후대, 세포, 조직 또는 부분을 성장시키는 포함하는, 종자 오일에서 적어도 하나의 PUFA를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 본원에 기재된 유전자 변형된 식물(예: 브라시카), 이의 후대, 세포, 조직 또는 부분, 본원에 기재된 오일, 본원에 기재된 종자, 본원에 기재된 식료품, 본원에 기재된 기능성 식품, 또는 본원에 기재된 약품을 개체에게 제공하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 PUFA를 함유하는 보충 또는 치료 생성물을 개체에게 제공하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 이러한 양태에 함유된 PUFA는 DHA 및/또는 EPA이다.
본 발명은 또한, 식물 또는 식물 세포를, (i) 적어도 하나의 다중불포화 지방산(PUFA)을 생산하는 PUFA 신타제 시스템(예: 조류 PUFA 신타제 시스템)을 인코딩하는 핵산 서열; 및 (ii) 포스포판테테이닐 보조인자를 PUFA 신타제 시스템(예: 조류 PUFA 신타제 시스템) ACP 도메인으로 전달하는 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제(PPTase)를 인코딩하는 핵산 서열로 형질전환시킴을 포함하는, 본원에 기재된 유전자 변형된 식물(예: 브라시카), 이의 후대, 세포, 조직 또는 부분을 생산하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 식물 또는 식물 세포를 (iii) 장쇄 PUFA 유리 지방산(FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 아실-CoA 신타제(ACoAS)를 인코딩하는 핵산 서열로 형질전환시킴을 추가로 포함한다.
본 발명의 다양한 양태는, 본 발명의 일부를 형성하는, 하기 상세한 설명, 도면 및 첨부 서열 기재로부터 보다 충분히 이해될 수 있다.
도 1은 PUFA OrfA의 9개 반복 도메인 각각을 인코딩하는 재설계된 DNA 서열의 클러스털(Clustal) W(벡터 NTI에 정렬)를 도시한다.
도 2는 pDAB7361의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 3은 pDAB7362의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 4는 pDAB7363의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 5는 캐놀라 이벤트 5197[14]-032.002로부터 T1 종자의 DHA 함량의 단일 종자 분석을 나타낸다.
도 6은 Orf A, Orf B 및 Orf C 특이적 항혈청으로 탐침된 캐놀라 이벤트 5197[14]-032.002로부터의 후기(>30 DAP) 발육 T1 종자의 추출물의 SDS-PAGE 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다.
도 7a는 DHA 생성 캐놀라 이벤트 5197[14]-032.002.Sx002로부터의 수분(pollination) 후 15, 20, 25, 30, 35 및 42일에서 수집된 발육 T2 종자 시료의 지질 함량을 나타낸다.
도 7b는 웨스턴 블롯에 의해 DHA 생성 캐놀라 이벤트 5197[14]-032.002.Sx002로부터의 추출물에 OrfA, OrfB 및 OrfC 폴리펩티드의 존재를 나타낸다.
도 8은 캐놀라 이벤트 5197[14]-032.002의 온실 성장 T1 식물체로부터 호모접합성 T2 식물체의 LC-PUFA 함량을 나타낸다.
도 9는 6개 호모접합성 라인으로부터 단일 T2 종자 분석물의 LC-PUFA의 요약을 나타낸다.
도 10은 2개의 T1 라인과 비형질전환된 오메가-9 넥세라(Nexera) 710의 역교잡으로부터 수득된 모(parent) 및 F1 하이브리드 종자의 DHA 함량을 나타낸다.
도 11은 캐놀라 이벤트 5197[13]-010.001로부터 유래된 60개 개개의 T1 식물체의 pat 유전자 카피 수를 나타낸다.
도 12는 수분 후 일수(DAP)로서 나타낸 6개 시점 각각에 대한 원(raw) 강도 값을 사용하여 눌(null) 비형질전환 오메가-9 넥세라 710 라인에서 목적하는 유전자의 발현 프로파일을 나타낸다.
도 13은 DAP로서 나타낸 6개 시점 각각에 대한 표준 강도 값을 사용하여 눌 비형질전환 오메가-9 넥세라 710 라인에서 목적하는 유전자의 발현 프로파일을 나타낸다.
도 14는 DAP로서 나타낸 6개 시점 각각에 대한 원 강도 값을 사용하여 호모접합성 이벤트 5197[14]-032.002 라인에서 목적하는 유전자의 발현 프로파일을 나타낸다.
도 15는 DAP로서 나타낸 6개 시점 각각에 대한 표준 강도 값을 사용하여 호모접합성 이벤트 5197[14]-032.002 라인에서 목적하는 유전자의 발현 프로파일을 나타낸다.
도 16은 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 측정한 성숙 유전자변형 캐놀라 종자에서 PUFA 신타제 활성을 나타낸다.
도 17은 공-발현된 HetI의 존재 또는 부재하에 이. 콜라이(E. coli)에서 발현된 OrfA, 및 캐놀라 이벤트 5197[14]-032.002에서 발현된 OrfA로부터 서로에 대한 참조 펩티드의 계산된 비율을 나타낸다.
도 18은 HetI의 존재 또는 부재하에 이. 콜라이에서 발현된 OrfA, 및 유전자변형 캐놀라 이벤트 5197[14]-032.002에서 발현된 OrfA로부터 6개 참조 펩티드 각각에 대한 apo2-9 펩티드의 계산된 비율을 나타낸다.
도 19는 pDAB7365의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 20은 pDAB7368의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 21은 pDAB7369의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 22는 pDAB7370의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 23은 pDAB100518의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 24는 pDAB101476의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 25는 pDAB101477의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 26은 pDAB9166의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 27은 pDAB9167의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 28은 pDAB7379의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 29는 pDAB7380의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 30은 pDAB9323의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 31은 pDAB9330의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 32는 pDAB9337의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 33은 pDAB9338의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 34는 pDAB9344의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 35는 pDAB9396의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 36은 pDAB101412의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 37은 pDAB7733의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 38은 pDAB7734의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 39는 pDAB101493의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 40은 pDAB109507의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 41은 pDAB109508의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 42는 pDAB109509의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 43은 pDAB9151의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 44는 pDAB108207의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 45는 pDAB108208의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 46은 pDAB108209의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 47은 pDAB9159의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 48은 pDAB9147의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 49는 pDAB108224의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 50은 pDAB108225의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 51은 pDAB101493, pDAB7362, pDAB7369, pDAB101412 또는 pDAB7380로 형질전환시킨 개개의 유전자변형 아라비돕시스(Arabidopsis) 이벤트로부터 T2 종자의 DHA 및 LC-PUFA 함량을 설명한다.
도 1은 PUFA OrfA의 9개 반복 도메인 각각을 인코딩하는 재설계된 DNA 서열의 클러스털(Clustal) W(벡터 NTI에 정렬)를 도시한다.
도 2는 pDAB7361의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 3은 pDAB7362의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 4는 pDAB7363의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 5는 캐놀라 이벤트 5197[14]-032.002로부터 T1 종자의 DHA 함량의 단일 종자 분석을 나타낸다.
도 6은 Orf A, Orf B 및 Orf C 특이적 항혈청으로 탐침된 캐놀라 이벤트 5197[14]-032.002로부터의 후기(>30 DAP) 발육 T1 종자의 추출물의 SDS-PAGE 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다.
도 7a는 DHA 생성 캐놀라 이벤트 5197[14]-032.002.Sx002로부터의 수분(pollination) 후 15, 20, 25, 30, 35 및 42일에서 수집된 발육 T2 종자 시료의 지질 함량을 나타낸다.
도 7b는 웨스턴 블롯에 의해 DHA 생성 캐놀라 이벤트 5197[14]-032.002.Sx002로부터의 추출물에 OrfA, OrfB 및 OrfC 폴리펩티드의 존재를 나타낸다.
도 8은 캐놀라 이벤트 5197[14]-032.002의 온실 성장 T1 식물체로부터 호모접합성 T2 식물체의 LC-PUFA 함량을 나타낸다.
도 9는 6개 호모접합성 라인으로부터 단일 T2 종자 분석물의 LC-PUFA의 요약을 나타낸다.
도 10은 2개의 T1 라인과 비형질전환된 오메가-9 넥세라(Nexera) 710의 역교잡으로부터 수득된 모(parent) 및 F1 하이브리드 종자의 DHA 함량을 나타낸다.
도 11은 캐놀라 이벤트 5197[13]-010.001로부터 유래된 60개 개개의 T1 식물체의 pat 유전자 카피 수를 나타낸다.
도 12는 수분 후 일수(DAP)로서 나타낸 6개 시점 각각에 대한 원(raw) 강도 값을 사용하여 눌(null) 비형질전환 오메가-9 넥세라 710 라인에서 목적하는 유전자의 발현 프로파일을 나타낸다.
도 13은 DAP로서 나타낸 6개 시점 각각에 대한 표준 강도 값을 사용하여 눌 비형질전환 오메가-9 넥세라 710 라인에서 목적하는 유전자의 발현 프로파일을 나타낸다.
도 14는 DAP로서 나타낸 6개 시점 각각에 대한 원 강도 값을 사용하여 호모접합성 이벤트 5197[14]-032.002 라인에서 목적하는 유전자의 발현 프로파일을 나타낸다.
도 15는 DAP로서 나타낸 6개 시점 각각에 대한 표준 강도 값을 사용하여 호모접합성 이벤트 5197[14]-032.002 라인에서 목적하는 유전자의 발현 프로파일을 나타낸다.
도 16은 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 측정한 성숙 유전자변형 캐놀라 종자에서 PUFA 신타제 활성을 나타낸다.
도 17은 공-발현된 HetI의 존재 또는 부재하에 이. 콜라이(E. coli)에서 발현된 OrfA, 및 캐놀라 이벤트 5197[14]-032.002에서 발현된 OrfA로부터 서로에 대한 참조 펩티드의 계산된 비율을 나타낸다.
도 18은 HetI의 존재 또는 부재하에 이. 콜라이에서 발현된 OrfA, 및 유전자변형 캐놀라 이벤트 5197[14]-032.002에서 발현된 OrfA로부터 6개 참조 펩티드 각각에 대한 apo2-9 펩티드의 계산된 비율을 나타낸다.
도 19는 pDAB7365의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 20은 pDAB7368의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 21은 pDAB7369의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 22는 pDAB7370의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 23은 pDAB100518의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 24는 pDAB101476의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 25는 pDAB101477의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 26은 pDAB9166의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 27은 pDAB9167의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 28은 pDAB7379의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 29는 pDAB7380의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 30은 pDAB9323의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 31은 pDAB9330의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 32는 pDAB9337의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 33은 pDAB9338의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 34는 pDAB9344의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 35는 pDAB9396의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 36은 pDAB101412의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 37은 pDAB7733의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 38은 pDAB7734의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 39는 pDAB101493의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 40은 pDAB109507의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 41은 pDAB109508의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 42는 pDAB109509의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 43은 pDAB9151의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 44는 pDAB108207의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 45는 pDAB108208의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 46은 pDAB108209의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 47은 pDAB9159의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 48은 pDAB9147의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 49는 pDAB108224의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 50은 pDAB108225의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 51은 pDAB101493, pDAB7362, pDAB7369, pDAB101412 또는 pDAB7380로 형질전환시킨 개개의 유전자변형 아라비돕시스(Arabidopsis) 이벤트로부터 T2 종자의 DHA 및 LC-PUFA 함량을 설명한다.
본원에 사용된 용어 "다중불포화 지방산(polyunsaturated fatty acid)" 또는 "PUFA"는 적어도 3개 이상의 이중결합, 4개 이상의 이중결합, 5개 이상의 이중결합, 6개 이상의 이중결합(여기서, 모든 이중결합은 cis 배열로 존재함)와 함께 적어도 16개 탄소, 적어도 18개 탄소, 적어도 20개 탄소, 또는 22개 이상의 탄소의 탄소쇄 길이를 갖는 지방산을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "장쇄 다중 불포화 지방산" 또는 "LC-PUFA"는 3개 이상의 이중결합, 4개 이상의 이중결합, 5개 이상의 이중결합, 6개 이상의 이중결합을 함유하는, 18개 이상의 탄소쇄 길이, 20개 이상의 탄소쇄 길이의 지방산을 지칭한다. 오메가-6 시리즈의 LC-PUFA는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 감마-리놀렌산(C18:3), 디-호모-감마-리놀렌산(C20:3n-6), 아라키돈산(C20:4n-6), 아드렌산(또는 도코사테트라엔산 또는 DTA라 불리움)(C22:4n-6) 및 도코사펜타엔산(C22:5n-6)을 포함한다. 오메가-3 시리즈의 LC-PUFA는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 알파-리놀렌산(C18:3), 에이코사트리엔산(C20:3n-3), 에이코산테트라엔산(C20:4n-3), 에이코산펜타엔산(C20:5n-3), 도코사펜타엔산(C22:5n-3) 및 도코사헥사엔산(C22:6n:3)을 포함한다. LC-PUFA는 또한 22개 초과의 탄소 및 4개 이상의 이중결합을 갖는 지방산을 포함하고, 이로써 한정되지는 않지만, C28:8(n-3)을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "PUFA 신타제" 또는 "PUFA 신타제 시스템" 또는 "SzPUFA" 또는 "hSzThPUFA"는 다중불포화 지방산(PUFA) 및 특히 장쇄 PUFA(LC-PUFA) 뿐만 아니라 복합체 중의 이러한 효소의 임의의 도메인을 생산하는 효소 시스템을 지칭한다. 용어 PUFA 신타제는, 이로 한정되지 않지만, PUFA PKS 시스템 또는 PUFA 생산용 PKS-형 시스템을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "포스포판테테이닐 트랜스퍼라제" 또는 "PPTase" 또는 "NoHetl"은 보조인자(예: 4-포스포판테테인)를 보조효소 A(Coa)로부터 PUFA 신타제 시스템에 존재하는 하나 이상의 ACP 도메인으로 전달함으로써 PUFA 신타제 시스템을 활성화시키는 효소를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "아실-CoA 합성효소" 또는 "ACoAS" 또는 "SzACS-2"는 장쇄 다중불포화 유리 지방산(FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 효소를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "식물"은, 이로 한정되지 않지만, 식물의 임의의 후대, 세포, 조직 또는 부분을 포함한다.
"기능식품(Nutraceutical)"은, 향상된 수준의 이러한 생리학적 활성 성분을 함유하도록 유전자 조작된 작물로부터 생산된 식품과 함께, 이러한 생성물이 보충된 가공 식품을 포함하여, 생리학적 잇점을 제공하거나 질병으로부터의 보호를 제공하는 식물로부터 분리, 정제, 농축 또는 생산된 생성물을 의미한다.
"기능성 식품"은, (a) 통상의 식이의 일부로서 소비되는 통상의 식품과 유사하거나 통상의 식품일 수 있고 (b) 비변형 식품에 전형적으로 존재하는 성분의 비율로 변형에 기반한 향상된 영양가 및/또는 특정한 식이 잇점을 갖는 식품을 의미한다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 단일 핵산 뿐만 아니라 복수 핵산, 핵산 분자 또는 단편, 변이체 또는 이의 유도체, 또는 작제물, 예를 들면, 메신저 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 포함하는 것으로 의도된다. 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은, 비해독 5' 및 3' 서열 및 당해 인코딩 서열을 포함하는 전장 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드로 구성될 수 있고, 이는 비변형 RNA 또는 DNA이거나 변형 RNA 또는 DNA일 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 단일쇄 및 이중쇄 DNA, 단일쇄 및 이중쇄 영역의 혼합물인 DNA, 단일쇄 및 이중쇄 RNA, 단일쇄 및 이중쇄 영역의 혼합물인 RNA, 단일쇄가거나 보다 통상적으로는 이중쇄가거나 단일쇄 및 이중쇄 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로 구성될 수 있다. 이들 용어는 또한 폴리뉴클레오티드 또는 핵산의 화학적, 효소적 또는 대사적 변형된 형태를 포함한다.
폴리뉴클레오티드 또는 핵산 서열은, 이의 천연 환경으로부터 제거된 "분리된" 것으로 지칭될 수 있다. 예를 들면, 벡터에 함유된 디하이드록시-산 데하이드라타제 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 인코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 본 발명의 목적을 위해 분리된 것으로 간주된다. 분리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산의 추가의 예는 이종성 숙주 세포에 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중의 정제된(부분적 또는 실질적) 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 포함한다. 본 발명에 따르는 분리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 추가로 합성에 의해 생산된 이러한 분자를 포함한다. DNA의 폴리머 형태의 분리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA의 하나 이상의 세그먼트로 구성될 수 있다.
용어 "유전자"는, 코딩 서열을 선행(5' 비-코딩 서열) 및 후행(3' 비-코딩 서열)하는 조절 서열을 임의로 포함하는, 특이적 단백질로서 발현될 수 있는 핵산 또는 이의 단편을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "코딩 영역"은 특이적 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 지칭한다. "적합한 조절 서열"은 코딩 서열의 상류(5' 비-코딩 서열), 코딩 서열 내 또는 코딩 서열의 하류(3' 비-코딩 서열)에 위치되고 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 관련 코딩 서열의 해독에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더(translation reader) 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인지 서열, RNA 프로세싱 부위, 효과기 결합 부위 및 머리핀 구조(stem-loop structure)를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 복수의 "폴리펩티드" 및 이의 단편 뿐만 아니라 단일 "폴리펩티드"를 포함하는 것으로 의도되고, 아미드 결합(또한 펩티드 결합으로 공지됨)에 의해 선형 연결된 단량체(아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산의 임의의 쇄 또는 쇄들을 지칭하고, 생성물의 특정 길이를 지칭하지 않는다. 따라서, 2개 이상의 아미노산의 쇄 또는 쇄들을 지칭하기 위해 사용된 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, 단백질, 아미노산 쇄 또는 임의의 기타 용어는 "폴리펩티드"의 정의에 포함되고, 용어 "폴리펩티드"는 이들 임의의 용어 대신에 또는 이와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있거나 재조합 기술에 의해 생산될 수 있지만, 설계된 핵산 서열로부터 반드시 해독되는 것은 아니다. 이는 화학적 합성에 의한 것을 포함하는 임의의 방식으로 생성될 수 있다.
"분리된" 폴리펩티드 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체란 이의 자연 환경에 존재하지 않는 폴리펩티드를 의도한다. 어떠한 특정 수준의 정제는 요구되지 않는다. 예를 들면, 분리된 폴리펩티드는 이의 천연 또는 자연 환경으로부터 제거될 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합에 의해 생산된 폴리펩티드 및 단백질은 본 발명의 목적상 분리된 것으로 간주되는데, 이는 임의의 적합한 기술에 의해 분리, 분획을 위해, 또는 부분적 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드이기 때문이다.
본원에 사용된 바와 같이, "천연(native)"은, 존재하는 경우, 자체의 조절 서열과 함께 자연에서 발견된 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 폴리펩티드의 형태를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "내생적"은 생물체의 자연 위치 또는 생물체의 게놈중 천연 형태의 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 폴리펩티드를 지칭한다. "내생적 폴리펩티드"는 생물체의 게놈 중에서 이의 자연 위치의 천연 폴리뉴클레오티드를 포함한다. "내생적 유전자"는 생물체의 게놈 중에 이의 자연 위치의 천연 유전자를 포함한다. "내생적 폴리펩티드"는 생물체의 자연 위치의 천연 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "이종성"은, 숙주 생물체에서는 통상 발견되지 않지만 숙주 생물체 내로 도입된 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 폴리펩티드를 지칭한다. "이종성 폴리뉴클레오티드"는, 상응하는 천연 폴리뉴클레오티드와는 상이한 형태로 공급 생물체 내로 재도입된 천연 코딩 영역 또는 이의 부분을 포함한다. "이종성 유전자"는, 상응하는 천연 유전자와는 상이한 형태로 공급 생물체 내로 재도입된 천연 코딩 영역 또는 이의 부분을 포함한다. 예를 들면, 이종성 유전자는, 천연 숙주 내로 재도입된 비천연 조절 영역을 포함하는 키메라 유전자의 일부인 천연 코딩 영역을 포함할 수 있다. "이종성 폴리펩티드"는, 상응하는 천연 폴리펩티드와는 상이한 형태로 공급 생물체 내로 재도입된 천연 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변형(modification)"은, 당해 폴리펩티드의 감소된, 실질적으로 제거된 또는 제거된 활성을 생성하는 본원에 기재된 폴리펩티드의 변화 뿐만 아니라, 당해 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 감소되거나, 실질적으로 제거된 또는 제거된 활성을 생성하는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드의 변화를 지칭한다. 이러한 변화는 당해 기술분야에 공지된 방법으로 이루어질 수 있고, 이는, 이로 한정되지 않지만, 결실, 돌연변이화(예: 자발적 돌연변이, 랜덤 돌연변이, 돌연변이유발 유전자에 의해 유발된 돌연변이, 또는 트랜스포손 돌연변이), 치환, 삽입, 하향-조절, 세포 위치의 변화, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 상태의 변화(예: 메틸화, 포스포릴화 또는 편재단백화(ubiquitination)), 보조인자의 제거, 안티센스 RNA/DNA의 도입, 간섭 RNA/DNA의 도입, 화학적 변형, 공유 변형, UV 또는 X선의 조사, 상동성 재조합, 유사분열 재조합, 프로모터 치환 방법 및/또는 이들의 조합을 포함한다. 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 변형될 수 있는지를 측정하는 지침은 특정 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열을 상동성 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열(예: 효모 또는 박테리아)과 비교하고 고도의 상동성(보존된 영역) 또는 컨센서스 서열의 영역에서 이루어진 변형의 수를 최대화함으로써 밝혀질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유도체"는 본 발명에 기재된 서열의 변형을 지칭한다. 이러한 변형의 실례는, 오일 종자 작물 종에서 본원에 기재된 코딩 서열의 기능을 보존, 약간 변경 또는 증가시키는 본원에 기재된 코딩 서열의 핵산 서열과 관련한 하나 이상의 염기의 치환, 삽입 및/또는 결실일 수 있다. 이러한 유도체는, 예를 들면, 서열 구조를 예측 및 최적화하는 컴퓨터 모델링 기술을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 따라서, 용어 "유도체"는, 이들이 본 발명의 LC-PUFA의 생산에 사용하기 위한 개시된 기능성을 가질 수 있도록 본원에 개시된 코딩 서열과 실질적 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변이체"는, 예를 들면, 돌연변이 등의 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성한 아미노산 삽입, 결실, 돌연변이 및 치환에 의해 본 발명의 구체적으로 기재된 폴리펩티드와는 상이한 폴리펩티드를 지칭한다. 아미노산 잔기가 목적하는 활성의 소실 없이 치환, 부가 또는 결실될 수 있는지를 결정하는 지침은, 특정 폴리펩티드의 서열을 상동성 폴리펩티드의 서열과 비교하고 고도의 상동성(보존된 영역)의 영역에서 이루어진 아미노산 서열 변화의 수를 최적화하거나 아미노산을 컨센서스 서열로 치환시킴으로써 밝혀질 수 있다.
대안적으로, 이들 동일 또는 유사한 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 변이체는 유전자 코드의 "중복성"을 사용함으로써 합성 또는 선별될 수 있다. 다양한 제한 부위를 생성하는 점적 변화(silent change) 등의 다양한 코돈 치환을 도입하여, 발현을 위한 플라스미드 또는 바이러스 벡터 내로의 클로닝을 최적화시킬 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열 내의 돌연변이는 폴리펩티드의 임의 부분의 특성을 변형시키기 위해 당해 폴리펩티드에 부가된 폴리펩티드 또는 다른 펩티드의 도메인에서 반영될 수 있다.
아미노산 "치환"은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환한 결과, 즉 보존적 아미노산 치환일 수 있거나, 하나의 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환한 결과, 즉 비보존적 아미노산 치환일 수 있다. "보존적" 아미노산 치환은 관련 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 또는 양쪽성 성질의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고; 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고; 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또는, "비보존적" 아미노산 치환은 이들 임의의 아미노산의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 또는 양쪽성 성질의 차이를 선별함으로써 이루어질 수 있다. "삽입" 또는 "결실"은 재조합 단백질에 의해 구조적 또는 기능적으로 허용되는 변이 범위 내에서 이루어질 수 있다. 허용된 변이는, 재조합 DNA 기술을 사용하여 폴리펩티드 분자에서 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 시스템적으로 생기게 하고 생성 재조합 변이체를 활성에 대해 분석함으로써 실험적으로 측정할 수 있다.
용어 "프로모터"는 코딩 서열 또는 작용성 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열의 3' 위치에 위치된다. 프로모터는 이들의 전체가 천연 유전자로부터 유래될 수 있거나, 자연에서 발견된 상이한 프로모터로부터 유래된 상이한 요소로 구성될 수 있거나, 심지어 합성 DNA 세그먼트를 포함할 수 있다. 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는, 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 상이한 발단 단계에서, 또는 상이한 환경적 또는 생리학적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 유도할 수 있음을 이해할 것이다. 대부분의 대부분의 세포 유형에서 유전자를 발현시키는 프로모터는 통상 "구성 프로모터"로서 지칭된다. 추가로, 대부분의 경우에 조절 서열의 정확한 경계는 완전히 규정되지 않았기 때문에, 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있는 것으로 인정된다.
용어 "작동적으로 연결된"은, 서열의 작용이 서로에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상의 핵산 서열의 회합을 지칭한다. 예를 들면, 프로모터는, 당해 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우, 코딩 서열과 작동적으로 연결된다(예를 들면, 코딩 서열은 당해 프로모터의 전사 조절하에 있다). 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 본 발명의 핵산 단편으로부터 유래된 센스(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 지칭한다. 발현은 또한 폴리펩티드에서 mRNA의 해독을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "과발현"은, 동일한 또는 관련 유전자의 내생적 발현보다 높은 발현을 지칭한다. 이종성 유전자는, 이의 발현이 필적하는 내생적 유전자의 발현보다 높은 경우에 과발현된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "형질전환"은, 유전적으로 안정한 유전을 발생시키는, 숙주 생물체 내로 핵산 또는 단편의 전달을 지칭한다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 생물체는 "유전자변형" 또는 "재조합" 또는 "형질전환된" 생물체로서 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "플라스미드" 또는 "벡터"는, 세포의 중심 대사 부분이 아니고 통상 환형 이중쇄 DNA 분자 형태로 존재하는 유전자를 종종 포함하는 염색체외 요소를 지칭한다. 이러한 요소는, 임의로 공급원으로부터 유래된, 단일쇄 또는 이중쇄 DNA 또는 RNA의 자가 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열(선형 또는 환형)일 수 있고, 여기서 다수의 뉴클레오티드 서열은, 적절한 3' 비해독 서열을 따라 선별된 유전자 생성물에 대한 프로모터 단편 및 DNA 서열을 세포 내로 도입할 수 있는 독특한 구성으로 결합되거나 재조합된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "코돈 축퇴(degeneracy)"는, 인코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않고서, 뉴클레오티드 서열의 변이를 허용하는 유전자 코드의 성질을 지칭한다. 당업자는 소정 아미노산을 특성화하기 위해 뉴클레오티드 코돈의 사용에 있어서 특이적 숙주 세포에 의해 나타난 "코돈-바이어스"를 인식한다. 따라서, 숙주 세포에서 개선된 발현을 위해 유전자를 합성할 때, 이의 코돈 사용 빈도가 숙주 세포의 바람직한 코돈 사용 빈도에 접근하도록 유전자를 설계하는 것이 바람직하다.
다양한 숙주 세포의 형질전환을 위한 핵산 분자의 유전자 또는 코딩 영역을 지칭하는 경우의 용어 "코돈 최적화"는, DNA에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 변화시키지 않고서, 숙주 생물체의 전형적인 코돈 사용을 반영하도록 핵산 분자의 유전자 또는 코딩 영역 중의 코돈의 변화를 지칭한다. 이러한 최적화는 적어도 하나, 하나 이상 또는 상당 수의 코돈을, 당해 생물체의 유전자에서 보다 빈번히 사용되는 하나 이상의 코돈으로 치환하는 것을 포함한다.
임의의 폴리펩티드 쇄의 아미노산을 인코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 편차는 유전자를 인코딩하는 서열의 변이를 허용한다. 각각의 코돈은 3개 뉴클레오티드로 구성되고 DNA를 포함하는 뉴클레오티드가 4개 특정 염기로 제한되기 때문에, 아미노산을 인코딩하는 가능한 뉴클레오티드 조합은 61개 존재한다(나머지 3개 코돈은 해독 종결 시그널을 인코딩한다). 어떠한 코돈을 인코딩하고 어떠한 아미노산을 복제하는지를 나타내는 "유전자 코드"는 표 1로서 본원에서 제공된다. 결과적으로, 다수의 아미노산은 하나 이상의 코돈에 의해 지정된다. 예를 들면, 아미노산 알라닌 및 프롤린은 4개의 트리플릿에 의해 인코딩되고, 세린 및 아르기닌은 6개의 트리플릿으로 인코딩되는 반면, 트립토판 및 메티오닌은 하나의 트리플릿으로 인코딩된다. 이러한 축퇴는, DNA에 의해 인코딩된 단백질의 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않고서, DNA 염기 조성을 다양한 범위에 걸쳐 달라지게 한다.
표 1. 표준 유전자 코드
다수의 생물체는 성장하는 펩티드 쇄에서 특정 아미노산의 삽입용 코드에 대해 특정 코돈을 사용하기 위한 바이어스(bias)를 나타낸다. 생물체간의 코돈 사용에 있어서 차이, 코돈 선호 또는 코돈 바이어스, 유전자 코드의 축퇴에 의해 제공되고, 다수의 생물체 중에서 잘 증명되어 있다. 코돈 바이어스는 종종 메신저 RNA의 해독 효율과 관련되며, 이는 또한, 특히 해독되는 코돈의 특성 및 특정한 전이 RNA(tRNA) 분자의 능력에 의존하는 것으로 생각된다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩티드 합성에 가장 빈번히 사용된 코돈의 반영이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기반하여 소정 생성물에서 최적 유전자 발현을 위해 조정될 수 있다.
다양한 동물, 식물 및 미생물 종에 이용가능한 다수의 유전자 서열이 제공되면, 코돈 사용의 상대적 빈도를 계산할 수 있다. 코돈 사용 표는 용이하게 입수가능하고, 다수의 방식으로 적용될 수 있다[참조: Nakamura et al. Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)]. 이러한 또는 유사한 표를 사용함으로써, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 당해 빈도를 임의의 소정 폴리펩티드 서열에 적용할 수 있고, 폴리펩티드를 인코딩하지만 소정 종에 최적인 코돈을 사용하는 코돈-최적화된 코딩 영역의 핵산 단편을 생산할 수 있다. 본 발명은 본원에 추가로 기재된 바와 같이 본 발명의 OrfA, OrfB, 키메라 OrfC, PPTase 및/또는 기타 보조 단백질의 코돈 최적화된 형태에 관한 것이다.
당해 기술분야에 공지된 용어 "동일성 퍼센트(%)"는, 서열을 비교함으로써 결정되는, 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계이다. 당해 기술분야에서, "동일성"은 또한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미하고, 이 경우에는 이러한 서열 줄(string) 사이의 합치에 의해 결정될 수 있다. "동일성" 및 "유사성"은 공지된 방법으로 용이하게 계산될 수 있고, 이로 한정되는 것은 아니지만, 문헌[참조: 1) Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Ed.) Oxford University: NY (1988); 2) Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993); 3) Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., Eds.) Humania: NJ (1994); 4) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987); and 5) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., Eds.) Stockton: NY (1991)]에 기재된 것들을 포함한다.
동일성을 결정하는 방법은 시험된 서열 사이의 최고 합치를 제공하도록 설계된다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램으로 분류된다. 서열 정렬 및 동일성 퍼센트 계산은, 예를 들면, 벡터 NTI® 쉬트(suite)(Invitrogen, Carsbad, CA)의 AlignX 프로그램 또는 라세르젠(LASERGENE) 생물정보 컴퓨팅 쉬트(DNASTAR Inc., Madison, WI)의 MegAlignTM 프로그램을 사용하여 수행할 수 있다. 당해 서열의 다중 정렬은 클러스털 V로 표지된 정렬 방법(문헌[참조: Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)]에 기재됨)에 상응하는 "클러스털 V 정렬 방법"을 포함하는 몇몇 다양한 알고리즘 변형을 포함하는 "클러스털 정렬 방법"을 사용하여 수행되며, 라세르젠(LASERGENE) 생물정보 컴퓨팅 쉬트(DNASTAR Inc.)의 MegAlignTM 프로그램에서 발견된다. 다중 정렬을 위해, 디폴트 값(default value)은 GAP PENALTY = 10 및 GAP LENGTH PENALTY = 10에 상응한다. 클러스털 방법을 사용한 단백질 서열의 쌍별 정렬 및 동일성 퍼센트 계산을 위한 디폴트 파라미터는 KTUPLE = 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 및 DIAGONALS SAVED = 5이다. 핵산의 경우, 이들 파라미터는 KTUPLE = 2, GAP PENALTY =5, WINDOW = 4 및 DIAGONALS SAVED = 4이다. 클러스털 V 프로그램을 사용한 서열 정렬 후, 동일한 프로그램에서 "서열 거리" 표를 관찰함으로써 "동일성 퍼센트"를 수득할 수 있다. 추가로, "클러스털 W 정렬 방법"을 이용할 수 있고, 클러스털 W로 표지된 정렬 방법(문헌[참조: Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci. 8:189-191(1992)]에 기재됨)에 상응하고, 라세르젠 생물정보 컴퓨팅 쉬트(DNASTAR Inc.)의 MegAlignTM v6.1 프로그램에서 발견된다. 다중 정렬을 위한 디폴트 파라미터(GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0.2, Delay Divergen Seqs(%)=30, DNA Transition Weight=0.5, Protein Weight Matrix=Gonnet Series, DNA Weight Matrix=IUB). 클러스털 W 프로그램을 사용한 서열 정렬 후, 동일한 프로그램에서 "서열 거리" 표를 관찰함으로써 "동일성 퍼센트"를 수득할 수 있다.
다수 수준의 서열 동일성이, 이러한 폴리펩티드가 동일하거나 유사한 작용 또는 활성을 갖는 다른 종으로부터 폴리펩티드를 동정하는데 유용하다는 것은 당업자에게 잘 이해된다. 동일성 퍼센트의 유용한 예는, 이로써 한정되지 않지만, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%를 포함하거나, 60% 내지 100%의 임의의 정수 퍼센트, 예를 들면, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 본 발명을 기재하는데 유용할 수 있다. 적합한 핵산 단편은 상기 상동성을 가질 뿐만 아니라, 적어도 50개 아미노산, 적어도 100개 아미노산, 적어도 150개 아미노산, 적어도 200개 아미노산 및 적어도 250개 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 통상 인코딩한다.
용어 "서열 분석 소프트웨어"는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 분석에 유용한 임의의 컴퓨터 알고리즘 또는 소프트웨어 프로그램을 지칭한다. "서열 분석 소프트웨어"는 상업적으로 이용가능하거나 독립적으로 개발할 수 있다. 전형적인 서열 분석 소프트웨어는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 1.) GCG 프로그램 쉬트(Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI); 2.) BLASTP, BLASTN, BLASTX(Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)); 3.) DNASTAR(DNASTAR, Inc. Madison, WI); 4.) Sequencher(Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI); 및 5.) 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘을 도입한 FASTA 프로그램(참조: W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res ., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Plenum: New York, NY)을 포함할 것이다. 본원과 관련하여, 서열 분석 소프트웨어가 분석에 사용되는 경우, 당해 분석 결과는, 달리 명시하지 않는 한, 참조된 프로그램의 "디폴트 값"에 기반하는 것으로 이해될 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, "디폴트 값"은, 최초로 개시할 때, 당해 소프트웨어에 본래 로딩된 임의 세트의 값 또는 파라미터를 의미할 것이다.
본원에 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2000); and by Silhavy et al., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987 to present)]에 기재되어 있다.
본원에 기재된 재조합 숙주의 유전자 조작은 표준 유전자 기술 및 스크리닝을 사용하여 수행할 수 있고, 유전자 조작에 적합한 임의의 숙주 세포에서 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 재조합 숙주 세포는 유전자 변형 및 재조합체 유전자 발현에 유용한 임의의 생물체 또는 미생물 숙주일 수 있다. 일부 양태에서, 재조합체 숙주는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 쌍자엽 식물 및 단자엽 식물 둘 다를 포함하는 고등 식물, 및 작물 식물 및 이들의 오일을 위해 사용된 식물을 포함하는 소비성 식물일 수 있다. 따라서, 임의의 식물 종 또는 식물 세포가 하기 추가로 기재된 바와 같이 선택될 수 있다.
본 발명의 오일은 브라시카 종의 종자 오일에서 DHA 및/또는 EPA를 생산하는 캐놀라 재배종으로부터 수득될 수 있고, 여기서 상기 오일은 70중량% 이상의 올레산(C18:1) 및/또는 4중량% 이하의 리놀렌산(C18:3)을 포함하는 지방산 함량을 갖는다. 이러한 오일은 심장에 유익하고, 요식업 및 소비자 팩키징된 상품 적용을 위한 증가된 안정성을 갖는다. 이러한 오일은 또한 수소화 필요성을 감소시키고, 식품 산업에서 사용된 대두, 팜 및 다수의 기타 오일과 비교하여 영양상 잇점을 제공한다. 이러한 오일의 산화 안정성은 당해 기술분야에 공지된 산화방지제 및 가공 첨가제의 첨가에 의해 추가로 증가될 수 있다.
본 발명의 오일은 또한 비요식업 또는 식이 공정 및 조성물에 사용될 수 있다. 일부 이들 용도는 산업, 화장 및 의약일 수 있다. 본 발명의 오일은 또한 본 발명의 오일이 적합한 임의의 적용에 사용될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 오일은, 예를 들면, 다양한 분야에서 무기질 오일, 에스테르, 지방산 또는 동물 지방, 예를 들면, 윤활제, 윤활 첨가제, 금속 작동 유체, 유압 유체 및 내화성 유압 유체를 대체하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 오일은 또한 개질유를 생산하는 공정에서 재료로서 사용될 수 있다. 본 발명의 오일을 개질시키는 기술의 예는 분별화, 수소화, 오일의 올레산 또는 리놀렌산 함량의 변화, 및 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 기타 개질 기술을 포함한다.
본 발명의 오일에 대한 화장 용도의 예는 화장 조성물에서 연화제; 석유 젤리 대체; 비누의 구성 부분, 또는 비누 제조 공정에서의 재료; 경구 치료 용액의 구성 부분; 에이징(ageing) 처리 조성물의 구성 부분; 및 피부 및 모발 에어로졸 폼 제제의 구성 부분으로서의 용도를 포함한다.
추가로, 본 발명의 오일은 의학적 용도에 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 오일은 감염에 대한 보호벽에서 사용될 수 있고, 오메가-9 지방산이 높은 오일은 이식 그래프트(graft) 생존을 향상시키기 위해 사용될 수 있다(미국 특허 제6,210,700호).
상기는 본 발명의 오일이 적합한 비-요리(non-culinary) 용도의 비제한적 예임을 이해해야 한다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 오일 및 개질유는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 모든 적용에서, 예를 들면, 무기유, 에스테르, 지방산 또는 동물 지방을 대체하기 위해 사용될 수 있다.
PUFA
신타제
시스템
진핵 생물체에서 장쇄 PUFA(LC-PUFA)를 합성하는 "표준" 또는 "전통적" 경로는 중간쇄 길이의 포화 또는 모노불포화된 지방산의 신장 및 불포화를 수반하고, 이는 기재되어 있다. PUFA 신타제 시스템을 통한 장쇄 PUFA를 합성하는 경로는 또한 기재되어 있고, "표준" 경로와 매우 상이하다. 구체적으로, PUFA 신타제는 탄소원으로서 말로닐-CoA를 사용하고, 임의의 상당량으로 중간체를 방출하지 않고서 최종 PUFA를 생산한다. 또한, PUFA 신타제에는, 적절한 cis 이중결합이 산소를 필요로 하지 않는 메카니즘을 사용하여 합성 동안 부가된다. 일부 양태에서, NADPH가 합성 사이클 동안 환원제로서 사용된다.
본 발명은, (내생적 또는 유전자 조작에 의해) PUFA 신타제 시스템을 발현시키기 위해 유전자 변형된 숙주 생물체(예: 식물)에 관한 것이다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템을 발현시키기 위해 유전자 변형된 생물체(여기서, 당해 생물체는 이러한 시스템을 자연적으로 (내생적, 유전자 변형 없이) 발현하지 않거나, 당해 생물체가 유전적으로 변형되는 적어도 특정 PUFA 신타제 또는 이의 부분을 자연적으로 발현하지 않는다)는 PUFA 신타제 또는 당해 생물체에 의해 내생적으로 발현되지 않는 또 다른 단백질을 사용한 당해 생물체의 변형과 관련하여 본원에서 "이종성" 숙주 생물체로 지칭될 수 있다. 본 발명의 유전자 변형은 PUFA 신타제 시스템을 내생적으로 발현시키는 숙주 생물체에서 PUFA 생산을 개선시키기 위해 사용될 수 있고, 여기서 생물체는 상이한 PUFA 신타제 또는 이의 부분으로 추가로 변형되지 않는다.
본 발명에 따르는 PUFA 신타제 시스템은, 선택된 사이클에서 트랜스-시스 이성화 및 에노일 환원 반응을 포함하는 비반복성 공정 뿐만 아니라 지방산 쇄의 반복성 공정 둘 다를 수행하기 위해 함께 작용할 수 있는 몇몇 다작용성 단백질을 포함할 수 있다(특히 해양 박테리아로부터 PUFA 신타제 시스템을 단일 작용 단백질을 포함할 수 있다). 이들 단백질은 또한 본원에서 코어 PUFA 신타제 효소 복합체 또는 코어 PUFA 신타제 시스템으로서 지칭될 수 있다. 이들 단백질에 함유된 도메인 및 모티프의 일반 작용은 당해 기술분야에 개별적으로 공지되어 있고, 해양 박테리아 및 진핵 생물체로부터 다양한 PUFA 신타제 시스템과 관련하여 상세히 기재되어 있다[참조: 미국특허 제6,140,486호; 미국특허 제6,566,583호; Metz et al., Science 293:290-293 (2001); 미국 특허출원 공개번호 2002/0194641; 미국 특허출원 공개번호 2004/0235127; 미국 특허출원 공개번호 2005/0100995, 및 WO 2006/135866]. 당해 도메인은, 상기 언급한 바와 같이, 단일 단백질(예: 당해 도메인 및 단백질은 동의어임)로서 또는 단일 단백질 중의 2개 이상(다중) 도메인 중의 하나로서 발견될 수 있다. 해양 박테리아 및 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 구성원으로부터 다양한 PUFA 신타제의 도메인 구축 및 이러한 PUFA 신타제를 포함하는 유전자 및 단백질의 구조적 및 작용적 특징은 문헌[참조: 미국특허 제6,140,486호; 미국특허 제6,566,583호; Metz et al., Science 293:290-293 (2001); 미국 특허출원 공개번호 2002/0194641; 미국 특허출원 공개번호 2004/0235127; 미국 특허출원 공개번호 2005/0100995 및 WO 2006/135866]에 기재되어 있다.
PUFA 신타제 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 유전자 및 폴리펩티드의 다수의 예는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 본원에 기재된 유전자 변형된 숙주에서 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 PUFA 신타제 단백질 또는 도메인은 박테리아 및 비박테리아 PUFA 신타제 둘 다를 포함할 수 있다. 비박테리아 PUFA 신타제는 진핵생물과 같이 박테리아가 아닌 생물체로부터 기원하거나 유래되는 시스템이다. 박테리아 PUFA 신타제는, 예를 들면, 미국 특허 공개공보 제2008/0050505호에 기재되어 있다. 다른 PKS 시스템(유형 I 반복 또는 표준, 유형 II 또는 유형 III) 또는 FAS 시스템으로부터의 PUFA 신타제 작용성 도메인 또는 단백질 뿐만 아니라 박테리아 PUFA 신타제 작용성 도메인과 함께 비박테리아 PUFA 신타제 작용성 도메인을 도입한 본 발명의 유전자 변형된 식물이 생산될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 PUFA 신타제 시스템은 3개 이상의 단백질 상에 통상 함유되는 적어도 하기 생물학적 활성 도메인: (a) 적어도 하나의 에노일-ACP 리덕타제(ER) 도메인; (b) 다중 아실 캐리어 단백질(ACP) 도메인(예: 적어도 1 내지 4개, 및 바람직하게는 적어도 5개의 ACP 도메인, 및 일부 양태에서 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 10개까지의 ACP 도메인); (c) 적어도 2개의 β-케토아실-ACP 신타제(KS) 도메인; (d) 적어도 하나의 아실트랜스퍼라제(AT) 도메인; (e) 적어도 하나의 β-케토아실-ACP 리덕타제(KR) 도메인; (f) 적어도 2개의 FabA-형 β-하이드록시아실-ACP 데하이드라제(DH) 도메인; (g) 적어도 하나의 쇄 길이 인자(CLF) 도메인; (h) 적어도 하나의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제(MAT) 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명에 따르는 PUFA 신타제 시스템은 또한 데하이드라타제(DH) 보존된 활성 부위 모티브를 함유하는 적어도 하나의 영역을 포함한다.
일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템은 적어도 하기 생물학적 활성 도메인: (a) 적어도 하나의 에노일-ACP 리덕타제(ER) 도메인; (b) 적어도 5개의 아실 캐리어 단백질(ACP) 도메인; (c) 적어도 2개의 β-케토아실-ACP 신타제(KS) 도메인; (d) 적어도 하나의 아실트랜스퍼라제(AT) 도메인; (e) 적어도 하나의 β-케토아실-ACP 리덕타제(KR) 도메인; (f) 적어도 2개의 FabA-형 β-하이드록시아실-ACP 데하이드라제(DH) 도메인; (g) 적어도 하나의 쇄 길이 인자(CLF) 도메인; 및 (h) 적어도 하나의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제(MAT) 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명에 따르는 PUFA 신타제 시스템은 또한, FabA-형 DH 도메인의 일부가 아닌 데하이드라타제(DH) 보존된 활성 부위 모티브를 함유하는 적어도 하나의 영역 또는 도메인을 포함한다. 이들 도메인 각각의 구조적 및 작용적 특징은 문헌[참조: 미국 특허출원 공개번호 2002/0194641; 미국 특허출원 공개번호 2004/0235127; 미국 특허출원 공개번호 2005/0100995; 미국 특허출원 공개번호 2007/0245431 및 WO 2006/135866]에 상세히 기재되어 있다.
코어 스키조키트리움 PUFA 신타제 시스템을 형성하는 3개의 개방 판독 프레임(open reading frame)이 있고, 이는 상기 기재되어 있다[참조: 미국 특허출원 공개번호 2007/0245431]. 각 개방 판독 프레임의 도메인 구조는 다음과 같다.
스키조키트리움 개방 판독 프레임 A(OrfA 또는 Pfa1): OrfA는 2910 아미노산 서열을 인코딩하는 8730 뉴클레오티드 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)이다. OrfA 내에는 12개 도메인, (a) 하나의 β-케토 아실-ACP 신타제(KS) 도메인; (b) 하나의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제(MAT) 도메인; (c) 9개의 아실 캐리어 단백질(ACP) 도메인; 및 (d) 하나의 케토리덕타제(KR) 도메인이 있다. 스키조키트리움 종 ATCC 20888, 및 ATCC 20888의 딸 균주(스키조키트리움 종 균주 N230D로 표시됨) 둘 다로부터 OrfA를 인코딩하는 게놈 DNA 클론(플라스미드)가 분리되고 서열분석되었다.
게놈 클론 pJK1126(pJK1126 OrfA 게놈 클론으로 표시됨, 스키조키트리움 ATCC 20888로부터 "OrfA" 유전자를 함유하는 이. 콜라이 플라스미드 벡터 형태)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션[American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA]에 2006년 6월 8일자로 기탁되었고, ATCC 수탁번호 PTA-7648로 지정되었다.
게놈 클론 pJK306(pJK306 OrfA 게놈 클론으로 표시됨, 스키조키트리움 종 N230D(pJK320와 2.2kB 중첩)로부터 OrfA 유전자의 5' 부분을 함유하는 이. 콜라이 플라스미드 형태)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션[American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA]에 2006년 6월 8일자로 기탁되었고, ATCC 수탁번호 PTA-7641로 지정되었다.
게놈 클론 pJK320(pJK320 OrfA 게놈 클론으로 표시됨, 스키조키트리움 종 N230D(pJK306과 2.2kB 중첩)로부터 OrfA 유전자의 3' 부분을 함유하는 이. 콜라이 플라스미드 형태)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션[American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA]에 2006년 6월 8일자로 기탁되었고, ATCC 수탁번호 PTA-7644로 지정되었다.
스키조키트리움 개방 판독 프레임 B(OrfB or Pfa2): OrfB는 2059 아미노산 서열을 인코딩하는 6177 뉴클레오티드 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)이다. OrfB에는 4개 도메인: (a) 하나의 케토 아실-ACP 신타제(KS) 도메인; (b) 하나의 쇄 길이 인자(CLF) 도메인; (c) 하나의 아실 트랜스퍼라제(AT) 도메인; 및 (d) 하나의 에노일 ACP-리덕타제(ER) 도메인이 있다. 스키조키트리움 종 ATCC 20888, 및 ATCC 20888의 딸 균주(스키조키트리움 종 균주 N230D로서 표시됨) 둘 다로부터 OrfB를 인코딩하는 게놈 DNA 클론(플라스미드)는 분리되고 서열분석되었다.
게놈 클론 pJK1129(pJK1129 OrfB 게놈 클론으로 표시됨, 스키토키트리움 종 ATCC 20888로부터 "OrfB" 유전자를 함유하는 이. 콜라이 플라스미드 벡터 형태)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션[American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA]에 2006년 6월 8일자로 기탁되었고, 수탁번호 PTA-7649로 지정되었다.
게놈 클론 pJK324(pJK324 OrfB 게놈 클론으로 표시됨, 스키조키트리움 종 N230D로부터 OrfB 유전자 서열을 함유하는 이. 콜라이 플라스미드 형태)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션[American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA]에 2006년 6월 8일자로 기탁되었고, ATCC 수탁번호 PTA-7643로 지정되었다.
스키조키트리움 개방 판독 프레임 C(OrfC 또는 Pfa3): OrfC는 1502 아미노산 서열을 인코딩하는 4506 뉴클레오티드 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)이다. OrfC에는 3개 도메인: (a) 2개의 FabA-형 하이드록시 아실-ACP 데하이드라제(DH) 도메인; 및 (b) 하나의 에노일 ACP-리덕타제(ER) 도메인이 있다. 스키조키트리움 종 ATCC 20888, 및 ATCC 20888의 딸 균주(스키조키트리움 종 균주 N230D로 표시됨)은 분리되고 서열분석되었다.
게놈 클론 pJK1131(pJK1131 OrfC 게놈 클론으로 표시됨, 스키조키트리움 ATCC 20888로부터 "OrfC" 유전자를 함유하는 이. 콜라이 플라스미드 벡터 형태)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션[American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA]에 2006년 6월 8일자로 기탁되었고, ATCC 수탁번호 PTA-7650로 지정되었다.
게놈 클론 pBR002(pBR002 OrfC 게놈 클론으로 표시됨, 스키조키트리움 종 N230D로부터 OrfC 유전자 서열을 함유하는 이. 콜라이 플라스미드 벡터 형태)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션[American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA]에 2006년 6월 8일자로 기탁되었고, ATCC 수탁번호 PTA-7642로 지정되었다.
또한, 상기한 코어 트라우토키트리움 PUFA 신타제를 형성하는 3개의 개방 판독 프레임이 있다. 각각의 개방 판독 프레임의 도메인 구조는 다음과 같다.
트라우스토키트리움 23B 개방 판독 프레임 A(OrfA): OrfA는 2811 아미노산 서열을 인코딩하는 8433 뉴클레오티드 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)이다. 하기 도메인: (a) 하나의 β-케토아실-ACP 신타제(KS) 도메인; (b) 하나의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제(MAT) 도메인; (c) 8개의 아실 캐리어 단백질(ACP) 도메인; 및 (d) 하나의 β-케토아실-ACP 리덕타제(KR) 도메인이 Th. 23B OrfA에 존재한다.
게놈 클론 Th23BOrfA_pBR812.1(Th23BOrfA_pBR812.1 게놈 클론으로 표시됨, 트라우스토키트리움 23B로부터 OrfA 유전자 서열을 함유하는 이. 콜라이 플라스미드 벡터 형태)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션[American Type Culture Collection (ATCC), University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA]에 2007년 3월 1일자로 기탁되었고, ATCC 수탁번호 PTA-8232로 지정되었다. 게놈 클론 Th23BOrfA_pBR811(Th23BOrfA_pBR811 게놈 클론으로 표시됨, 트라우스토키트리움 23B로부터 OrfA 유전자 서열을 함유하는 이. 콜라이 플라스미드 벡터 형태)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션[American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA]에 2007년 3월 1일자로 기탁되었고, ATCC 수탁번호 PTA-8231로 지정되었다.
트라우스토키트리움 23B 개방 판독 프레임 B(OrfB): OrfB는 1935 아미노산 서열을 인코딩하는 5805 뉴클레오티드 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)이다. 하기 도메인: (a) 하나의 β-케토아실-ACP 신타제(KS) 도메인; (b) 하나의 쇄 길이 인자(CLF) 도메인; (c) 하나의 아실트랜스퍼라제(AT) 도메인; 및 (d) 하나의 에노일-ACP 리덕타제(ER) 도메인이 Th. 23B OrfB에 존재한다. 게놈 클론 Th23BOrfB_pBR800(Th23BOrfB_pBR800 게놈 클론으로 표시됨, 트라우스토키트리움 23B로부터 OrfB 유전자 서열을 함유하는 이. 콜라이 플라스미드 벡터 형태)은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션[American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA]에 2007년 3월 1일자로 기탁되었고, ATCC 수탁번호 PTA-8227로 지정되었다.
트라우키트리움 23B 개방 판독 프레임 C(OrfC): OrfC는 1470 아미노산 서열을 인코딩하는 4410 뉴클레오티드 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)이다. 하기 도메인: (a) FabA 단백질(트랜스-2-데세노일-ACP의 합성 및 시스-데세노일-ACP에 대한 이 생성물의 가역적 이성화를 촉매하는 효소)에 대해 상동성을 갖는 2개의 FabA-형 β-하이드록시아실-ACP 데하이드라제(DH) 도메인; 및 (b) 스키조키트리움 OrfB의 ER 도메인에 대해 높은 상동성을 갖는 하나의 에노일-ACP 리덕타제(ER) 도메인이 Th. 23B OrfC에 존재한다. 게놈 클론 Th23BOrfC_pBR709A(Th23BOrfC_pBR709A 게놈 클론으로 표시됨, 트라우스토키트리움 23B로부터 OrfC 유전자 서열을 함유하는 이. 콜라이 플라스미드 벡터 형태)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션[American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA]에 2007년 3월 1일자로 기탁되었고, ATCC 수탁번호 PTA-8228로 지정되었다.
키메라 또는 하이브리드 PUFA 신타제 시스템: 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템은 본원에 기재된 임의의 것들로부터 선택된 도메인을 포함하고, 여기서 당해 도메인은 본원에 기재된 최소 요건에 부합하는 완전 PUFA 신타제 시스템을 형성하기 위해 조합된다(예: 혼합 및 합치됨). 일부 양태에서, 본 발명의 유전자 변형된 생물체는 또 다른 PUFA 신타제 시스템의 적어도 하나의 도메인 또는 이의 생물학적 활성 단편으로 추가로 변형시킬 수 있다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템의 임의의 도메인은 PUFA 신타제 시스템에서 당해 도메인의 작용을 변형 또는 향상시키기 위해(예: 당해 시스템에 의해 생산된 PUFA 타입 또는 이의 비율을 변형시키기 위해) 이들의 자연 구조로부터 변형될 수 있다. 키메라 PUFA 신타제 시스템을 생산하기 위한 도메인의 이러한 혼합은 본원에 참조된 특허 및 공보에 기재되어 있다.
일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템은 스키조키트리움(Schizochytrium) PUFA 신타제 시스템을 포함하고, 여기서 스키조키트리움 PUFA 신타제 시스템의 OrfC는 트라우스토키트리움 23B의 OrfC로 대체된다. 일부 양태에서, 트라우스토키트리움 23B의 이러한 키메라 OrfC는 스키조키트리움 코돈 사용을 위해 최적화된 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 이러한 키메라 OrfC의 비제한적인 예로서, 플라스미드 pThOrfC-synPS(pThOrfC-synPS로 표시됨, 스키조키트리움 또는 기타 이종성 숙주에서 발현시키기 위해 최적화된 "완전 스티치" 합성 트라우스토키트리움 23B PUFA PKS OrfC 코돈을 함유하는 이. 콜라이 플라스미드 벡터 형태)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션[American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA]에 2007년 3월 1일자로 기탁되었고, ATCC 수탁번호 PTA-8229로 지정되었다(참조: 미국 특허출원 공개번호 2008/0022422).
본 발명의 유전자 변형된 생물체에 사용될 수 있는 PUFA 신타제 유전자 및 폴리펩티드의 다른 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 본원에 추가로 기재된 방법에 의해 형성된 하기 코돈-최적화된 서열: 서열번호 1(SzPUFA OrfA v3 단백질); 서열번호 2(SzPUFA OrfB v3 단백질); 서열번호 3(hSzThPUFA OrfC v3 단백질); 서열번호 6(SzPUFA OrfA 유전자); 서열번호 7(SzPUFA OrfB v3 유전자); 및 서열번호 8(hSzThPUFA OrfC v3 유전자), 및 이러한 서열의 활성 변이체, 부분, 단편 또는 유도체를 포함하고, 여기서, 이러한 유전자는 PUFA 신타제 활성을 인코딩하거나 이러한 폴리펩티드 또는 단백질은 PUFA 신타제 활성을 갖는다. 본 발명은 하나 이상의 이러한 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 분리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 유전자 변형된 생물체에 사용될 수 있는 PUFA 신타제 유전자 및 폴리펩티드의 다른 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 본원에 기재된 PUFA 신타제 또는 서열 중의 어느 하나와 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 PUFA 신타제 유전자 또는 폴리펩티드를 포함한다. 유용한 범위는 임의의 이들 값(예를 들면, 60% 내지 99%, 65% 내지 95%, 70% 내지 95%, 75% 내지 95%, 80% 내지 95%, 85% 내지 95%, 또는 90% 내지 99%) 사이에서 선택될 수 있다. 본 발명의 유전자 변형된 생물체에서 사용될 수 있는 PUFA 신타제 유전자 및 폴리펩티드의 또 다른 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 본원에 기재된 PUFA 신타제 또는 서열의 임의의 하나의 활성 변이체, 부분, 유도체의 단편을 포함하고, 여기서 이러한 유전자는 PUFA 신타제 활성을 인코딩하거나 이러한 폴리펩티드는 PUFA 신타제 활성을 갖는다.
일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템은 조류 PUFA 신타제일 수 있다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 60% 내지 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 60% 내지 99% 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 6의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템은 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 80% 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 7의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 80% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 8의 핵산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템은 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템은 서열번호 6, 7 또는 8의 핵산 서열 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 다른 PUFA 신타제 유전자의 서열 및/또는 폴리펩티드는 본원에 기재되고 당해 기술분야에서 이용가능한 서열을 사용하여 당업자에게 공지된 문헌 및 생물정보 데이터베이스에서 동정될 수 있다. 예를 들면, 이러한 서열은 공지된 PUFA 신타제 유전자 또는 폴리펩티드 서열과 함께 공중 이용가능한 데이터베이스의 BLAST 조사를 통해 동정될 수 있다. 이러한 방법에서, 동정은 단백질 중량 매트릭스의 GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0.1 및 Gonnet 250 시리즈의 디폴트 파라미터를 사용하는 클러스털 W 정렬 방법에 기반할 수 있다.
추가로, 본원에 기재되거나 당해 기술분야에 공지된 PUFA 신타제 유전자 또는 폴리펩티드 서열은 자연에서 다른 PUFA 신타제 동족체를 동정하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 PUFA 신타제 핵산 단편 각각은 상동성 단백질을 인코딩하는 유전자를 분리하는데 사용될 수 있다. 서열 의존성 프로토콜을 사용한 상동성 유전자의 분리는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 서열 의존성 프로토콜의 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, (1) 핵산 하이브리드화 방법; (2) 핵산 증폭 기술의 다양한 사용에 의해 예시되는 DNA 및 RNA 증폭 방법[참조: 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), Mullis et al., U.S. Patent No. 4,683,202; 리가제 연쇄 반응(LCR), Tabor, S. et al., Proc . Acad . Sci . USA 82:1074 (1985); 또는 본쇄 치환 증폭(SDA), Walker et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 89:392 (1992)]; 및 (3) 라이브러리 구성 및 상보성에 의한 스크리닝 방법을 포함한다.
이들 모든 방법은 표적 단백질을 인코딩하는 공지되거나 동정된 서열을 사용하는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 용이하게 실시될 수 있다. 일부 양태에서, 표적 PUFA 신타제 코딩 서열을 둘러싸는 DNA 서열은 또한 일부 변형 공정에 유용하고, 공중 이용가능한 데이터베이스에서 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 용이하게 발견될 수 있다. 유전자 돌연변이를 생성하는 방법은 당해 기술분야에서 통상적이고 공지되어 있으며, 돌연변이체를 생성하는 활동에 적용될 수 있다.
포스포판테티에닐
트랜스퍼라제
포스포판테티에닐 트랜스퍼라제(PPTase)는 지방산 합성, 폴리케타이드 합성 및 비리보좀 펩티드 합성으로 특징지어지는 효소 부류이다. 특히, PUFA 신타제 효소에 존재하는 ACP 도메인은 조효소 A로부터 아실 캐리어 단백질(ACP)로의 보조인자(4-포스포판테테인)의 부착에 의한 활성화를 필요로 한다. 이러한 보조인자의 부착은 PPTase에 의해 수행된다. 숙주 생물체의 내생적 PPTase는 PUFA 신타제 ACP 도메인을 활성화시킬 수 없고, 따라서 당해 작용을 수행할 수 있는 PPTase를 제공할 필요가 있다. 다수의 PPTase의 서열은 공지되어 있고, 활성에 중요한 아미노산 잔기의 돌연변이 분석[참조: Mofid et al., Biochemistry 43:4128-36 (2004)] 뿐만 아니라 결정 구조가 측정되었다[참조: Reuter et al., EMBO J. 18:6823-31 (1999)].
기질로서 본원에 기재된 OrfA ACP 도메인을 인지하는 것으로 이미 입증된 이종성 PPTase의 한 가지 예는 노스톡 종(Nostoc sp .) PPC 7120(이전에 아나바에나 종(Anabaena sp .) PPC 7120으로 불리움)의 Het I 단백질이다. Het I은 당해 생물체의 이형세포에 존재하는 당-지질 층의 성분인 장쇄 하이드록시-지방산의 합성에 관여하는 것으로 공지된 노스톡 중의 유전자 클러스터에 존재한다[참조: Black and Wolk, J. Bacteriol . 176:2282-2292 (1994); Campbell et al., Arch . Microbiol . 167:251-258 (1997)]. Het I은 당해 클러스터에 존재하는 단백질(Hgl E)의 ACP 도메인를 활성화시키는 것 같다. Hgl E의 2개 ACP 도메인은 스키조키트리움 Orf A 및 기타 PUFA 신타제에서 발견된 ACP 도메인과 고도의 서열 상동성을 갖는다.
일부 양태에서, PUFA 신타제는 적어도 하나의 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제(PPTase) 도메인을 포함하는 것으로 간주될 수 있거나, 이러한 도메인은 PUFA 신타제에 대한 보조 도메인 또는 단백질인 것으로 간주될 수 있다. PPTase의 구조적 및 작용적 특성은, 예를 들면, 문헌[참조: 미국 특허출원 공개번호 2002/0194641; 미국 특허출원 공개번호 2004/0235127; 및 미국 특허출원 공개번호 2005/0100995]에 상세히 기재되어 있다.
PPTase 활성을 갖는 유전자 및 폴리펩티드의 다수의 예는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 이들이 사용된 특정 PUFA 신타제의 ACP 도메인을 활성화시킬 수 있는 경우, 본 발명의 유전자 변형된 생물체에 사용될 수 있다. 본 발명의 유전자 변형된 생물체에 사용될 수 있는 유전자 및 폴리펩티드의 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 본원에 추가로 기재된 하기 코돈-최적화된 서열: 서열번호 5(NoHetI v3 단백질) 및 서열번호 10 (NoHetI v3 유전자)를 포함한다.
본 발명의 유전자 변형된 생물체에 사용될 수 있는 PPTase 유전자 및 폴리펩티드의 다른 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 본원에 기재된 PPTase 또는 서열 중의 어느 하나와 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 PPTase 유전자 또는 폴리펩티드를 포함한다. 유용한 범위는 이들 임의의 값 사이(예를 들면, 60% 내지 99%, 65% 내지 95%, 70% 내지 95%, 75% 내지 95%, 80% 내지 95%, 85% 내지 95%, 90% 내지 99%)에서 선택될 수 있다. 본 발명의 유전자 변형된 생물체에 사용될 수 있는 PPTase 유전자의 다른 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 이러한 유전자가 PPTase 활성을 인코딩하거나 이러한 폴리펩티드가 PPTase 활성을 갖는, 본원에 기재된 PPTase 서열 중의 어느 하나의 활성 변이체, 단편, 부분 또는 유도체를 포함한다.
일부 양태에서, PPTase는 조류 PPTase일 수 있다. 일부 양태에서, PPTase는 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 60% 내지 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, PPTase는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 조류 PPTase를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 60% 내지 99% 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 조류 PPTase를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 10의 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 양태에서, PPTase는 이종성 숙주에서 PPTase의 생산 및/또는 축적을 위해 제공될 수 있다.
일부 양태에서, PPTase를 인코딩하는 유전자 및/또는 폴리펩티드는 또 다른 PPTase 유전자 및/또는 폴리펩티드 서열을 동정하는데 사용될 수 있고/있거나, 다른 세포에서 PPTase 동족체를 동정하는데 사용될 수 있다. 이러한 PPTase 코딩 서열은, 예를 들면, 문헌 및/또는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 생물정보 데이터베이스에 동정될 수 있다. 예를 들면, 생물정보를 사용하여 또 다른 세포 유형에서 PPTase 코딩 서열의 동정은 본원에 기재된 것들과 같이 공지된 PPTase 코딩 DNA 및 폴리펩티드 서열과 함께 공중 이용가능한 데이터베이스의 BLAST(상기 기재된 바와 같음) 조사를 통해 달성할 수 있다. 동정은 단백질 중량 매트릭스의 GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0.1 및 Gonnet 250 시리즈의 디폴트 값을 사용하는 블러스탈 W 정렬 방법에 기반한다.
일부 양태에서, 유전자 변형된 식물(예: 브라시카), 이의 후대, 세포, 조직 또는 부분은 단일 재조합 발현 벡터에 핵산 서열(i) 및 (ii)를 함유한다.
아실-
CoA
신타제
본 발명은 장쇄 PUFA 유리 지방산(FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 아실-CoA 신세타제(ACoAS) 단백질을 제공한다. PUFA 신타제에 의한 PUFA의 내생적 생산자(스키조키트리움)는 이의 PUFA 신타제의 유리 지방산 생성물을 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 하나 이상의 ACoAS를 보유한다. 이는 고도의 PUFA가 이러한 생물체에서 이들 분획을 축적한다는 사실을 입증한다. 따라서, PUFA 신타제를 내생적으로 함유하는 다른 생물체(예: 다른 트라우스토키트리드) 또는 PUFA FFA를 아실-CoAs로 전환시킬 수 있는 다른 생물체(예: 탈라시오시라 슈도나나(Thalassiosira pseudonana) 또는 크립트헤코디니움 코흐니(Crypthecodinium cohnii)) 뿐만 아니라 스키조키트리움은 이종성 숙주에서 발현된 PUFA 신타제의 생성물을 허용 또는 축적시키는데 유용한 효소를 인코딩하는 유전자 공급원을 나타낼 수 있다. 다른 ACoAS 서열은 미국 특허출원 공개번호 2007/0245431에 기재되어 있다.
AcoAS 활성을 갖는 유전자 및 폴리펩티드의 다수의 예는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 본 발명의 유전자 변형된 생물체에서 사용될 수 있다. 본 발명의 유전자 변형된 생물체에서 사용될 수 있는 유전자 및 폴리펩티드의 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 본원에 추가로 기재된 하기 코돈-최적화된 서열: 서열번호 4(SzACS-2 v3 단백질) 및 서열번호 9(hSzThACS-2 v3 유전자)를 포함할 수 있다.
본 발명의 유전자 변형된 생물체에 사용될 수 있는 ACoAS 유전자 및 폴리펩티드의 다른 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 본원에 기재된 ACoAS 또는 서열 중의 어느 하나와 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 ACoAS 유전자 또는 폴리펩티드를 포함한다. 유용한 범위는 이들 임의의 값 사이(예를 들면, 60% 내지 99%, 65% 내지 95%, 70% 내지 95%, 75% 내지 95%, 80% 내지 95%, 85% 내지 95%, 90% 내지 99%)일 수 있다. 본 발명의 유전자 변형된 생물체에 사용될 수 있는 ACoAS 유전자 및 폴리펩티드의 다른 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 유전자가 ACoAS 활성을 인코딩하거나 이러한 폴리펩티드가 ACoAS 활성을 갖는, 본원에 기재된 ACoAS 서열의 어느 하나의 활성 변이체, 단편, 부분 또는 유도체를 포함한다.
일부 양태에서, ACoAS는 조류 ACoAS일 수 있다. 일부 양태에서, ACoAS는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 60% 내지 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ACoAS는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 조류 ACoAS를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 60% 내지 99% 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 조류 ACoAS를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 9의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, ACoAS를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 34의 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 양태에서, ACoAS는 내생적 숙주에서 ACoAS의 개선된 생산 및/또는 축적 뿐만 아니라 이종성 숙주에서 ACoAS의 생산 및/또는 축적을 위해 제공될 수 있다.
일부 양태에서, ACoAS를 인코딩하는 유전자 및/또는 폴리펩티드는 또 다른 ACoAS 유전자 및/또는 폴리펩티드 서열을 동정하는데 사용될 수 있고/있거나, 다른 세포에서 ACoAS 동족체를 동정하는데 사용될 수 있다. 이러한 ACoAS 코딩 서열은, 예를 들면, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 문헌 및/또는 생물정보 데이터베이스에서 동정될 수 있다. 예들 들면, 생물정보를 사용하여 또 다른 세포 유형에서 ACoAS 코딩 서열의 동정은, 본원에 기재된 것들과 같이, 공지된 ACoAS 코딩 DNA 및 폴리펩티드 서열과 함께 공중 이용가능한 데이터베이스의 BLAST(상기 기재한 바와 같음) 조사를 통해 달성될 수 있다. 동정은 단백질 중량 매트릭스의 GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY-0.1 및 Gonnet 250 시리즈의 디폴트 파라미터를 사용하는 클러스털 W 정렬 방법에 기반한다.
일부 양태에서, 유전자 변형된 식물(예: 브라시카), 이의 후대, 세포, 조직 또는 일부는 단일 재조합 발현 벡터에 함유된 핵산 서열(i), (ii) 또는 (iii) 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 핵산 서열(i), (ii) 또는 (iii) 또는 이의 임의의 조합은 하나 이상의 종자 특이적 프로모터의 조절하에 있고/있거나 단일 재조합 발현 벡터에 함유되어 있다.
유전자 변형된 생물체의 제조방법
하나 이상의 목적하는 다중 불포화 지방산을 상당한 고수율로 생산하기 위해, 생물체(예: 식물)은 PUFA 신타제를 식물 내로 도입하기 위해 유전자 변형될 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 유전자 변형의 효능을 개선 또는 향상시키고 특히 PUFA 신타제(예: PUFA)의 생산 및/또는 축적을 개선 또는 향상시키는 방법에 관한 것이다.
유전자 변형된 생물체(이로써 한정되지 않지만, 식물 포함)에서 유전자 발현 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 일부 양태에서, 발현되는 PUFA 신타제 유전자에 대한 코딩 영역은 하기에 기재된 바와 같은 표적 숙주 세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 재조합 숙주 세포(이로써 한정되지 않지만, 식물 세포 포함)에서 유전자의 발현은 목적하는 코딩 서열 및/또는 전사 터미네이터에 작동적으로 연결된 프로모터를 필요로 할 수 있다. 다수의 프로모터가 유전자용 벡터의 작제에 사용될 수 있고, 여기에는, 이로써 한정되지 않지만, 종자 특이적 프로모터(예: PvDlec2, LfKCS3 및 FAE 1)가 포함된다. 본 발명에 사용될 수 있는 프로모터의 다른 비제한적 예는 WO 1992/18634에 기재된 아실 캐리어 단백질 프로모터; 문헌[참조: Slightom et al. (Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 80:1897-1901; 1983); Sengupta-Gopalan et al. (Proc . Nat . Acad . Sci . 82:3320-3324; 1985); van der Geest et al. (Plant Mol . Biol . 33:553-557; 1997), and Bustos et al. (EMBO J. 10:1469-1479; 1991)]에 개시된 파세올루스 불라기스(Phaseolus vulgaris) 베타-파세올린 프로모터 및 절단된 버젼을 포함한다.
본 발명의 일부 양태에서, 재조합 벡터는 선택된 핵산 서열을 조작하고 숙주 세포 내로 이러한 핵산 서열을 도입하는 도구로서 사용되는 조작된(예: 인공 생산된) 핵산 분자이다. 따라서, 재조합 벡터는, 예를 들면, 선택된 핵산 서열을 숙주 세포에서 발현 및/또는 전달하여 재조합 세포를 형성함으로써 선택된 핵산 서열을 클로닝, 서열분석 및/또는 달리는 조작하는데 사용하기에 적합하다. 이러한 벡터는 통상 이종성 핵산 서열, 즉 클로닝 또는 전달되는 핵산 서열과 인접하여 자연적으로 발견되지 않는 핵산 서열을 함유하지만, 당해 벡터는 또한 본 발명의 핵산 분자에 인접하여 자연적으로 발견되거나 본 발명의 핵산 분자의 발현에 유용한 조절 핵산 서열(예: 프로모터, 비해독된 영역)을 함유할 수 있다. 당해 벡터는 원핵생물 또는 진핵생물의 RNA 또는 DNA일 수 있고, 통상 플라스미드이다. 당해 벡터는 염색체외(extrachromosomal) 요소(예: 플라스미드)로서 유지될 수 있거나, 재조합 생물체(예: 미생물 또는 식물)의 염색체 내로 통합될 수 있다. 전체 벡터는 숙주 세포 내에 또는 특정한 조건하에 당해 위치에 잔류할 수 있고, 플라스미드 DNA를 결실시켜 본 발명의 핵산 분자의 뒤에 잔류시킬 수 있다. 통합된 핵산 분자는 염색체 프로모터 조절하에, 천연 또는 플라스미드 프로모터 조절하에 또는 몇몇 프로모터 조절의 조합하에 존재할 수 있다. 핵산 분자의 단일 또는 다중 카피는 염색체 내로 통합될 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 적어도 하나의 선별가능한 마커를 함유할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자에 사용된 재조합 벡터는 발현 벡터이다. 이러한 양태에서, 생산되는 생성물(예: PUFA 신타제)를 인코딩하는 핵산 서열은 재조합 핵산 분자를 생산하기 위해 재조합 벡터 내로 삽입된다. 생산되는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은, 재조합 숙주 세포 내에서 핵산 서열의 전사 및 해독이 가능한 벡터에서 핵산 서열을 조절 서열과 작동적으로 연결시키는 방식으로 당해 벡터 내로 삽입된다.
다양한 숙주 생물체 및 세포의 형질전환에 유용한 벡터는 통상적이고, 문헌에 개시되어 있다. 전형적으로, 당해 벡터는 목적하는 숙주에서 자가 복제 또는 염색체 통합을 가능하게 하는 선별가능한 마커 및 서열을 함유한다. 또한, 적합한 벡터는 전사 개시 조절 및 전사 종결 조절 영역을 포함하는 프로모터 영역을 포함할 수 있고, 코딩 영역 사이에 DNA 단편을 삽입하여, 삽입된 코딩 영역의 발현을 제공할 수 있다. 조절 영역 둘 다는 형질전환된 숙주 세포에 상동성인 유전자로부터 유래될 수 있지만, 이러한 조절 영역은 또한 생산 숙주로서 선택된 특이적 종에서 기원하지 않는 유전자로부터 유래될 수도 있다.
본 발명은, 단독으로 또는 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 방법과 조합[예를 들면, 코돈 최적화, 세포기관 표적화, 말로닐 CoA의 PUFA 신타제 경쟁의 향상(예: FAS의 억제에 의함) 및/또는 하나 이상의 아실트랜스퍼라제 또는 관련 효소의 발현 중의 임의의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 조합]하여 사용되는 본원에 기재된 PUFA 신타제 및 외인성 PPTase를 사용하는, 본원에 기재되고 예시된 하나 이상의 아실-CoA 신세타제의 발현을 포함하여 이종성 숙주에서 PUFA 생산 및/또는 축적을 증가시킨다.
본 발명의 일부 양태는 PUFA 신타제 효소(PPTase) 및/또는 하나 이상의 보조 단백질의 발현의 표적화 및/또는 하나 이상의 숙주 생물체에 대한 표적화 유전자 변형에 관한 것이다. 예를 들면, 일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템 및 PPTase의 발현은 식물 색소체에 대해 표적화시킬 수 있다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 및 PPTase의 발현은 시토졸에 대해 표적화된다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 및 PPTase의 발현은 식물의 색소체 및 시토졸 둘 다에 대해 표적화된다. 임의의 이들 양태에서, 다른 표적이 색소체 또는 시토졸에 대해 유도될 수 있다.
일부 양태에서, 아실-CoA 신세타제를 시토졸에서 발현시켜 DHA 및/또는 기타 LC-PUFA 유리 지방산을 아실-CoAs로 전환시키고, 이는 또한 아실트랜스퍼라제에 의해 이용할 수 있다.
한 가지 예시적 색소체 표적화 서열은 브라시카 나푸스(Brassica napus) 아실-ACP 티오에스테라제로부터 유래되고, 미국 특허출원 공개공보 2007/0245431에 기재되어 있다. 다양한 기타 색소체 표적화 서열은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 이종성 숙주가 식물 또는 식물 세포이고 색소체에 대한 표적화가 요구되는 양태에서 사용될 수 있다.
본 발명은, 단독으로 또는 본원에 기재된 하나 이상의 방법과 조합[예를 들면, 코돈 최적화, 말로닐 CoA의 PUFA 신타제 경쟁의 향상(예: FAS의 억제에 의함), 하나 이상의 아실-CoA 신세타제의 발현, 및/또는 하나 이상의 아실트랜스퍼라제 또는 관련 효소의 발현 중의 임의의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 조합]하여 사용되는 본원에 기재된 PUFA 신타제의 발현 및 외인성 PPTase를 사용하는 생물체 표적화(예: 식물에서 색소체 또는 엽록체에 대해)의 사용을 포함하여 이종성 숙주에서 PUFA 생산 및/또는 축적을 증가시킨다.
색소체 또는 엽록체에 대한 유전자 생성물의 표적화는 다양한 단백질의 아미노산 종결 말단에서 발견되고 성숙 단백질을 제공하는 도입 동안 분리되는 시그널 서열에 의해 조절된다[참조: 엽록체 표적화와 관련하여, Comai et al., J. Biol . Chem. 263:15104-15109 (1988)]. 이들 시그널 서열을 이종성 유전자 생성물과 융합시켜 엽록체 내로 이종성 생성물의 도입을 수행한다[참조: van den Broeck et al. Nature 313:358-363 (1985)]. 적절한 시그널 서열을 인코딩하는 DNA는, 엽록소 국지화되는 것으로 공지된, RUBISCO 단백질, CAB 단백질, EPSP 신타제 효소, GS2 단백질 및 다수의 기타 단백질을 인코딩하는 cDNA로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 일부 양태에서, 본 발명에 사용된 단백질의 국지화는, 예를 들면, 색소체 또는 엽록체에 대한 아세포 구획으로 유도된다. 단백질은 이들의 아미노-말단에 엽록체 통과 펩티드(CTP)를 포함시킴으로써 엽록체로 유도된다. 유사하게는, 단백질은 이들의 N-말단에 색소체 운반 또는 신호전달 펩티드를 포함시킴으로써 색소체로 유도된다.
전구체를 엽록체 도입 기구로 유도하는 아미노 말단 엽록체 표적화 펩티드를 함유하는 보다 긴 전구 단백질로서 합성된 자연 발생 엽록체 표적화 단백질은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 엽록체 표적화 펩티드는 일반적으로 엽록체 생물체 내에 위치된 특이적 엔도프로테아제에 의해 분리되고, 따라서 당해 전구체로부터 엽록체 주위로 표적화 성분 및 바람직하게는 활성 효소를 방출한다. 식물 세포의 엽록체 또는 색소체에 대해 유전자 또는 유전자 생성물의 표적화를 유도하는데 적합한 펩티드 코딩 서열의 예는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 페투니아 EPSPS CTP, 아라비돕시스 EPSPS CTP2 및 인트론 등을 포함한다. 이러한 표적화 서열은, 발현된 목적 단백질을, 목적하는 표현형 작용에 필요한 세포 프로세스가 농축되어 있는 세포 부분으로 전달함으로써, 발현된 목적 단백질을 가장 효과적으로 작용하는 세포 구조로 전달되도록 한다. 엽록체 표적화 펩티드의 구체적인 예는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 리불로스 비스포스페이트 카복실라제 소형 아단위 ats1A 운반 펩티드, 아라비돕시스 탈리아나 EPSPS 운반 펩티드, 및 제아 메이즈(Zea maize) 리불로스 비스포스페이트 카복실라제 소형 아단위 운반 펩티드를 포함한다.
최적화 운반 펩티드는, 예를 들면, 문헌[참조: van den Broeck et al., Nature, 313:358-363 (1985)]에 기재되어 있다. 원핵세포 및 진핵세포 시그널 서열은, 예를 들면, 문헌[참조: Michaelis et al., Ann. Rev. Microbiol. 36:425 (1982)]에 기재되어 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 운반 펩티드의 추가의 예는 엽록체 운반 펩티드를 포함하고, 예를 들면, 문헌[참조: Von Heijne et al., Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126 (1991); Mazur et al., Plant Physiol. 85:1110 (1987); Vorst et al., Gene 65:59 (1988). Chen & Jagendorf (J. Biol. Chem. 268:2363-2367 (1993)]에 기재된 것들은 이종성 변형유전자의 도입을 위한 엽록체 운반 펩티드를 기재하고 있다. 사용된 이러한 펩티드는 니코티아나 플룸바기니폴리아(Nicotiana plumbaginifolia)로부터의 rbsS 유전자의 운반 펩티드이다[참조: Poulsen et al. Mol. Gen. Genet. 205: 193-200 (1986)]. 본원에서 이종성 단백질을 엽록체로 국지화시키도록 작용하는 하나의 CTP는 바르시카 나푸스 아실-ACP 티오에스테라제로부터 유래된다.
유전자를 엽록체 또는 색소체로 국지화시키는 대체 수단은 엽록체 또는 색소체 형질전환을 포함한다. 엽록체 DNA만을 변화시켜, 본원에 포함된 분자를 도입한 재조합 식물을 생산할 수 있다. 엽록체에서 작용하는 프로모터는 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: Hanley-Bowden et al., Trends in Biochemical Sciences 12:67-70 (1987)]. 이종성 DNA가 삽입된 엽록체 함유 세포를 수득하는 방법 및 조성물은, 예를 들면, 문헌[참조: Daniell et al. (U.S. Patent No. 5,693,507) 및 Maliga et al. (U.S. Patent No. 5,451,513)]에 기재되어 있다.
방법의 조합
본 발명에 따라, 하나 이상의 표적 PUFA의 생산 및 축적을 위한 이종성 숙주의 생산에 있어서, 숙주에서 PUFA의 생산 및/또는 축적을 개선시키기 위해 본원에 기재된 하나 이상(임의의 조합)의 방법을 사용할 수 있다. 실제로, 다양한 방법의 조합은 부가적 또는 상승적일 수 있고 하나 이상의 이러한 방법의 부재와 비교하여 PUFA의 개선된 생산 및/또는 축적을 제공할 것으로 예상된다. 실제로, 실시예는 숙주 생물체에서 PUFA의 생산을 위한 예시적 방법을 제공한다.
본원에 기재된 변형의 이들 조합 또는 기타 변형 또는 변형의 조합을 사용한 임의의 식물 또는 식물 세포는 본 발명에 포함된다. 일부 양태에서, 이러한 식물을 추가로 유전자 변형시켜, 숙주에 의한 PUFA(또는 PUFA 신타제의 기타 생활성 생성물)의 생산 및/또는 축적을 개선시키기 위해 본원에 기재된 보조 단백질(예: ACoAS, GPAT, LPAAT, DAGAT 또는 아세틸 CoA 카복실라제(ACCase)]를 발현시킨다. 추가로, 본원에 기재된 임의의 변형 또는 변형의 조합을 사용하는 임의의 숙주 세포 또는 생물체는, 표적 PUFA를 포함하는 종자 또는 오일을 포함하는 이러한 세포 또는 생물체로부터 유도된 임의의 생성물과 같이, 본 발명에 포함된다.
일부 양태에서, 본 발명에 따라 유전자 변형시키기 위한 식물(예: 식물 숙주 세포)은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 쌍자엽 및 단자엽 식물 및 특히 소비성 식물을 포함하는 임의의 고등 식물을 포함하고, 작물 식물 및 특히 이들의 오일을 위해 사용된 식물을 포함한다. 이러한 식물은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 캐놀라, 대두, 평지씨, 아마인, 옥수수, 홍화, 해바라기 및 담배를 포함한다. 따라서, 임의의 식물 종 또는 식물 세포가 선택될 수 있다. 당해 양태에서, 본원에 사용된 식물 세포 또는 이로부터 성장하거나 유도된 식물은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 캐놀라(Brassica napus); 유채(oilseed rape)(Brassica napus); 인디안 머스타드(Brassica juncea); 에티오피안 머스타드(Brassica carinata); 순무(Brassica rapa); 양배추(Brassica oleracea); 대두(Glycine max); 아마인/아마(Linum usitatissimum); 옥수수(corn)(Zea mays); 홍화(Carthamus tinctorius); 해바라기(Helianthus annuus); 담배(Nicotiana tabacum); 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 브라질 너트(Betholettia excelsa); 아주까리콩(Ricinus communis); 코코넛(Cocus nucifera); 고수풀(Coriandrum sativum); 목면(Gossypium spp.); 땅콩(Arachis hypogaea); 조조바(Simmondsia chinensis); 오일 팜(Elaeis guineeis); 올리브(Olea eurpaea); 벼(Oryza sativa); 호박(squash)(Cucurbita maxima); 보리(Hordeum vulgare); 밀(Triticum aestivum); 및 좀개구리밥(Lemnaceae sp.)을 포함한다. 일부 양태에서, 식물 종 내의 유전자 배경은 달라질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 "식물 부분"은 식물의 임의의 부분을 포함하고, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 종자(성숙 종자 및 미성숙 종자 포함), 화분, 배아, 꽃, 과실, 발아, 잎, 뿌리, 줄기, 외식편 등을 포함한다. 일부 양태에서, 유전자 변형된 식물은, 목적하는 결과가 달성되도록(예: 증가되거나 변형된 PUFA 신타제 및/또는 PUFA 신타제를 사용한 목적 생성물의 생산 및/또는 축적), 이의 정상(예: 야생형 또는 자연 발생) 형태로부터 변형(예: 돌연변이 또는 변화)된 게놈을 갖는다. 일부 양태에서, 식물의 유전자 변형은 고전적 균주 개발 및/또는 분자 유전자 기술을 사용할 달성할 수 있다. 목적하는 아미노산 서열을 인코딩하는 재조합 핵산 분자가 식물의 게놈 내로 도입된 유전자변형 식물을 생산하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 일부 양태에서, 본 발명에 따라 유전자 변형시키기 위한 식물은 사람을 포함하여 동물에 의한 소비에 적합한 식물이다.
특히 목적하는 특질, 예를 들면, 내병성, 식물 형질전환 용이성, 오일 함량 또는 프로파일 등에 대해 최적화된 이들 식물로부터의 식물 라인이 생산, 선별 또는 동정될 수 있다. 일부 양태에서, 식물 라인은 식물 육종, 또는 판매자 지원 육종 및 경작 등의 방법을 통해 선별될 수 있다. 일부 양태에서, 식물 세포 배양물이 사용될 수 있고, 이는 예를 들면, 통상의 농업 실시를 사용하여 분화된 식물로 성장하지 않고 경작되지 않지만, 액체 배지에서 유지된다.
일부 양태에서, 식물은 오일 종자 식물일 수 있고, 여기서 오일 종자 및/또는 오일 종자 중의 오일은 PUFA 신타제에 의해 생산된 PUFA를 함유한다. 일부 양태에서, 이러한 오일은, PUFA 신타제의 생성물인, 검출가능한 양의 적어도 하나의 표적 또는 주요 PUFA를 함유한다. 일부 양태에서, 이러한 오일은, 표적 또는 주요 PUFA 생성물이 아니고 야생형 식물에서 내생적 FAS 시스템에 의해 자연적으로 생산되지 않는 중간 또는 부생성물을 실질적으로 포함하지 않을 수 있다(예를 들면, 야생형 식물은 FAS 시스템을 통해 약간 보다 단쇄 또는 중쇄 PUFA, 예를 들면, 18개 탄소 PUFA를 생산하지만, PUFA 신타제 시스템을 사용한 유전자 변형의 결과로서 식물에서 생산된 새로운 또는 추가의 지방산이 존재할 수 있다).
유전자 변형 식물의 생산과 관련하여, 식물의 유전자 조작법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 식물 형질전환을 위한 다수의 방법이 개발되었고, 이는 단자엽 식물 뿐만 아니라 쌍자엽 식물에 대한 생물학적 및 물리적 형질전환 프로토콜을 포함한다[참조: Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech 17:282-286 (1999); Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993)]. 또한, 식물 세포 또는 조직 형질전환 및 식물의 재생을 위한 벡터 및 시험관내 배양 방법은 이용가능하다[참조예: Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993)].
본 발명은, 본원에 기재된 이러한 서열의 변형 또는 돌연변이를 포함하는 분리된 핵산 분자 뿐만 아니라 서열번호 6 내지 10으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은, 본원에 기재된 이러한 서열의 변형 또는 돌연변이를 포함하는 분리된 폴리펩티드 뿐만 아니라 서열번호 1 내지 5로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB7361을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB7362을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB7363을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB7365를 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB7368을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB7369를 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB7370을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB100518을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB101476을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB9166을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB9167을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB7379을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB7380을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB9323을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB9330을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB9337을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB9338을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB9344를 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB9396을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB101412를 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB7733을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB7734를 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB101493을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB109507을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB109508을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB109509를 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB9151을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB108207을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB108208을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB108209를 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB9159를 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB9147을 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB108224를 포함한다. 본 발명은 재조합 발현 벡터 pDAB108225를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "형질감염"은 외인성 핵산 분자(예: 재조합 핵산 분자)가 세포 내로 삽입될 수 있는 임의의 방법을 지칭하기 위해 사용된다. 용어 "형질전환"은, 이러한 용어가 조류, 박테리아 및 효모 등의 미생물 세포 내로 또는 식물 세포 내로 핵산 분자의 도입을 지칭하기 위해 사용되는 경우, 용어 "형질감염"과 상호 교대로 사용될 수 있다. 미생물 및 식물 시스템에서, 용어 "형질전환"은 당해 미생물 또는 식물에 의한 외인성 핵산의 인지에 기인하는 유전형질 변화를 기재하기 위해 사용되며, 실질적으로 용어 "형질감염"과 동의어이다. 일부 양태에서, 형질감염 기술은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 형질전환, 입자 충격, 확산, 활성 수송, 배스 초음파처리, 전기천공, 미세주입, 리포펙션, 흡착, 감염 및 원형질 융합을 포함한다.
발현 벡터를 식물로 도입하는 광범위하게 사용된 방법은 아그로박테리움(Agrobacterium)의 자연 형질전환 시스템에 기반한다[참조: Horsch et al., Science 227:1229 (1985)]. 아그로박테리움 투메파시엔스(A. tumefaciens) 및 아그로박테리움 리조게네스(A. rhizogenes)는 식물 세포의 유전자 형질전환에 유용한 것으로 공지된 식물 병원성 토양 박테리아이다. 각각 에이. 투메파시엔스 및 에이. 리조게네스의 Ti 및 Ri 플라스미드는 식물의 유전자 형질전환에 관여하는 유전자를 포함한다[참조: Kado, C. I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1 (1991)]. 아그로박테리움 벡터 시스템 및 아그로박테리움 매개된 유전자 전이의 기재는 또한, 예를 들면, 문헌[참조: Gruber et al., supra, Miki et al., supra, Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989), 및 미국 특허 제4,940,838호 및 제5,464,763호]에 이용가능하다.
식물 형질전환을 위한 또 다른 공지된 방법은, DNA가 미립의 표면 상에 포함되는 미립 매개된 형질전환이다. 당해 방법에서, 발현 벡터는 식물 세포 벽 및 막을 투과하기에 충분한 속도로 미립을 가속시키는 생물학적 장치에 의해 식물 조직 내로 도입된다[참조: Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5:27 (1987), Sanford, J. C., Trends Biotech. 6:299 (1988), Sanford, J. C., Physiol. Plant 79:206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992)].
DNA를 식물로 물리적 전달하기 위한 또 다른 방법은 표적 세포의 초음파처리이다[참조: Zhang et al., Bio/Technology 9:996 (1991)]. 또한, 리포좀 또는 구형체 융합은 발현 벡터를 식물 내로 도입하기 위해 사용되어 왔다[참조: Deshayes et al., EMBO J., 4:2731 (1985), Christou et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 84:3962 (1987)]. CaCl2 침전, 폴리비닐 알콜 또는 폴리-L-오르니틴을 사용한 DNA의 원형질체로의 직접 흡수가 또한 보고되어 있다[참조: Hain et al., Mol. Gen. Genet. 199:161 (1985) and Draper et al., Plant Cell Physiol. 23:451 (1982)]. 원형질체 및 전체 세포 및 조직의 전기천공도 또한 기재되어 있다[참조: Donn et al., Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p. 53 (1990); D'Halluin et al., Plant Cell 4:1495-1505 (1992) and Spencer et al., Plant Mol. Biol. 24:51-61 (1994)]. 추가로, 실리콘 카바이드 단결정[참조: Kaepler et al., 1990, Plant Cell Reports] 및, 예를 들면, 침지 방법[참조: Clough and Bent, Plant J. 16:735-743 (1998)]를 사용한 식물내 형질전환도 사용될 수 있다. 정확한 식물 형질전환 방법은 형질전환을 위해 선택된 식물 종 및 선택된 식물 세포 유형에 다소 의존하여 달라질 수 있다(예를 들면, 배축 및 자엽 또는 배아 조직 등의 실생(seedling) 유도된 세포 유형).
유전자 작제물을 식물 세포 내로 도입한 후, 식물 세포는 성장시킬 수 있고, 분화 조직, 예를 들면, 발아 및 뿌리가 출아되면 성숙 식물이 생성될 수 있다. 일부 양태에서, 복수의 식물이 생성될 수 있다. 식물을 재생시키는 방법은 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishers and in: Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press)]에서 발견할 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 변형된 식물은 발효 배지에서 배양하거나 토양 등의 적합한 배지에서 성장시킬 수 있다. 일부 양태에서, 고등 식물에 적합한 성장 배지는 식물용의 임의의 성장 배지를 포함할 수 있고, 이는, 이로써 한정되지 않지만, 토양, 모래, 뿌리 성장을 지지하는 임의의 기타 미립자 배지(예: 버미큘라이트, 퍼라이트 등) 또는 수경 재배 뿐만 아니라 고등 식물의 성장을 최적화하는 적합한 광, 물 및 영양 보충물을 포함한다.
재조합 DNA 기술의 사용은, 예를 들면, 숙주 세포에서 핵산 분자의 카피 수를 조작함으로써 형질감염된 핵산 분자의 발현의 조절, 이들 핵산 분자가 전사되는 효율, 생성 전사체가 해독되는 효율, 및 해독후 변형 효율을 개선시킬 수 있음이 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 이해될 것이다. 추가로, 프로모터 서열을 유전자 조작하여, 천연 프로모터와 비교하여 발현 수준을 개선시킬 수 있다. 핵산 분자의 발현을 조절하는데 유용한 재조합 기술은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 하나 이상의 숙주 세포 염색체 내로 핵산 분자의 통합, 플라스미드에 벡터 안정성 서열의 부가, 전사 조절 시그널의 치환 또는 변형(예: 프로모터, 오퍼레이터, 인핸서), 해독 조절 시그널의 치환 또는 변형(예: 리보솜 결합 부위, 샤인-달가노 서열), 숙주 세포의 코돈 사용에 대응하도록 핵산 분자의 변형, 및 전사체를 불활성화시키는 서열의 결실을 포함한다.
일부 양태에서, 식물은 약제, 향미제, 영양제, 기능성 식품 성분 또는 화장품용 활성제로서 사용된 화합물을 생산하는 식물, 또는 이들 화합물/활성제를 생산하도록 유전자 조작된 식물을 포함할 수 있다.
본 발명의 이들 모든 양태는 본원에 기재된 임의의 유전자 변형된 생물체 및 이러한 생물체를 생산 및 사용하는 방법의 논의에 적용한다.
유전자 변형된 생물체로부터의 생성물
일부 양태에서, 본 발명의 유전자 변형된 생물체는 하나 이상의 다중불포화 지방산(이로써 한정되는 것은 아니지만, EPA(C20:5, n-3), DHA(C22:6, n-3), DPA(C22:5, n-6 또는 n-3), ARA(C20:4, n-6), GLA(C18:3, n-6), ALA(C18:3, n-3) 및/또는 SDA(C18:4, n-3)를 포함함), 및 일부 양태에서, 하나 이상의 보다 장쇄 PUFA(이로써 한정되는 것은 아니지만, EPA(C20:5, n-3), DHA(C22:6, n-3), DPA(C22:5, n-6 또는 n-3) 또는 DTA(C22:4, n-6)를 포함함) 또는 이들의 조합을 생산한다. 일부 양태에서, 본 발명의 유전자 변형된 식물은 하나 이상의 다중불포화 지방산(이로써 한정되는 것은 아니지만, EPA(C20:5, n-3), DHA(C22:6, n-3), 및/또는 DPA(C22:5, n-6 또는 n-3) 또는 이들의 조합을 포함함)을 생산한다.
일부 양태에서, 유전자 변형된 생물체는 본원에 기재된 바와 같이 PUFA 시낱제 시스템 및 PPTase를 재조합에 의해 발현하도록 유전자 변형된 식물이다. 일부 양태에서, 이러한 식물을 추가로 유전자 변형시켜, 숙주에 의한 PUFA(또는 PUFA 신타제의 기타 생활성 생성물)의 생산 및/또는 축적의 개선을 위해 본원에 기재된 바와 같은 보조 단백질(예: ACoAS, GPAT, LPAAT, DAGAT 또는 ACCase)을 발현시킨다.
본 발명의 일부 양태는 목적하는 수의 이중결합과 함께 목적하는 쇄 길이의 다중불포화 지방산의 생산, 및 광범위하게는 이들 PUFA를 포함하는 본원에 기재된 유전자 변형된 식물로부터 수득한 오일(예: 이러한 식물의 오일 또는 종자로부터 수득됨)을 포함한다. 본 발명에 의해 생산될 수 있는 PUFA의 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, DHA(도코사헥사엔산(C22:6, n-3)), ARA(에이코사테트라엔산 또는 아라키돈산(C20:4, n-6)), DPA(도코사펜타엔산(C22:5, n-6 or n-3)) 및 EPA(에이코사펜타엔산(C20:5, n-3)) 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 본 발명은 PUFA를 생산하는 PUFA 신타제 시스템의 사용을 통해 본 발명자들의 유전자 변형된 식물의 개발에 의해 하나 이상의 목적하는(표적 또는 주요) PUFA가 풍부한 상업적으로 유용한 지질을 생산하게 한다.
일부 양태에서, 특정 생물체로부터 유래된 소정의 PUFA 신타제 시스템은 특정 PUFA(들)을 생산할 것이고, 이에 의해 특정 생물체로부터 PUFA 신타제 시스템의 선별은 특정한 표적 또는 주요 PUFA를 생산할 것이다. 일부 양태에서, PUFA의 비율은 특정 PUFA 신타제 시스템의 선택, 및 당해 시스템이 발현되는 특정 조건에 대응하는 방법에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 트라우스토키트리움 23B(ATCC No. 20892)로부터 PUFA 신타제의 사용은 또한 표적 또는 주요 PUFA로서 DHA 및 DPAn-6을 생산할 것이지만, 트라우스토키트리움 23B의 경우에는 DHA 대 DPAn-6의 비율이 약 10:1(및 약 8:1 내지 약 40:1의 범위일 수 있음)이고, 스키조키트리움에서는 당해 비가 통상 약 2.5:1이다. 일부 양태에서, 소정의 PUFA 신타제는 상이한 PUFA 신타제로부터의 단백질 및 도메인을 상호 혼합함으로써 변형될 수 있거나, 표적 PUFA 생성물 및/또는 비율을 변화시키기 위해 소정 PUFA 신타제의 도메인 또는 단백질을 변형시킬 수 있다.
일부 양태에서, PUFA를 생산하는 효소 시스템의 "중간 생성물" 또는 "부생성물(side product)"은 임의의 생성물 및 특히, 당해 시스템의 표적 또는 주요 PUFA(들)의 생산 결과로서 효소 시스템에 의해 생산되지만 주요 또는 표적 PUFA(들)가 아닌 지방산 생성물을 지칭한다. 일부 양태에서, 중간 및 부생성물은 야생형 식물 또는 지시된 유전자 변형을 위한 수용체로서 사용된 모 식물에 의해 자연적으로 생산되는 비표적 지방산을 포함할 수 있지만, 이들은 야생형 식물 또는 지시된 유전자 변형을 위한 수용체로서 사용된 모 식물에 의해 생산된 수준과 비교하여 유전자 변형의 결과로서 보다 큰 수준으로 생산되기 때문에 이제 중간 또는 부생성물로서 분류된다. 일부 양태에서, 하나의 효소 시스템의 주요 또는 표적 PUFA는 주요 또는 표적 생성물이 상이한 PUFA인 상이한 효소 시스템의 중간생성물일 수 있다. 예를 들면, EPA를 생산하기 위해 표준 경로를 사용하는 경우, GLA, DGLA 및 SDA 등의 지방산은 상당량으로 중간 생성물로서 생산된다(예: 미국 특허출원 공개번호 2004/0172682). 유사하게는, 및 미국 특허출원 공개번호 2004/0172682에 설명된 바와 같이, DHA를 생산하기 위해 표준 경로를 사용하는 경우, 상술한 지방산 이외에, ETA 및 EPA(그 중에서도 상기 제1 예에서 표적 PUFA)가 상당량으로 생산될 수 있고, 표적 PUFA 자체보다 전체 지방산 생성물과 관련하여 현저히 큰 양으로 존재할 수 있다.
일부 양태에서, 하나 이상의 다중불포화 지방산을 현저히 높은 수율로 생산하기 위해, 식물을 유전자 조작하여 PUFA 신타제 시스템을 식물 내로 도입할 수 있다. 식물은 PUFA 신타제를 내생적으로 함유하는 것으로 공지되지 않고, 따라서 본 발명은 독특한 지방산 생산능을 갖는 식물을 생산할 기회를 나타낸다. 본 발명은 동일한 식물에서 하나 이상의 PUFA를 생산하기 위해 유전자 조작된 식물을 제공하고, 이는, 이로써 한정되지 않지만, 이들의 임의의 조합을 포함하여, EPA, DHA, DPA (n3 또는 n6), ARA, GLA, SDA 등을 포함한다. 본 발명은 다수의 "고가 오일(designer oil)" 중의 어느 하나를 다양한 비율 및 형태로 생성하는 능력을 제공한다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 특정 해양 생물체로부터 PUFA 신타제 시스템의 사용은 PUFA 생산 범위를 확장할 수 있고, 대부분의 작물 식물의 성장에 사용된 온도 범위에서 이러한 PUFA를 성공적으로 생산할 수 있다.
일부 양태에서, PUFA를 합성하는 시스템의 중간 또는 부생성물을 "실질적으로 포함하지 않는" 또는 실질량으로 존재하는 중간 또는 부생성물을 "갖지 않는"은, PUFA를 생산하는 효소 시스템의 도입 또는 존재의 결과로서 유전자 변형된 식물(및/또는 식물 부분 및/또는 종자 오일 분획)에서 생산되는 임의의 중간 또는 부생성물 지방산(비표적 PUFA)(예를 들면, 야생형 식물 또는 지시된 유전자 변형에 대한 수용체로서 사용된 모 식물에 의해 생산되지 않음)은 당해 식물에 의해 생산된 총 지방산의 약 10중량% 미만, 보다 바람직하게는 약 9중량% 미만, 보다 바람직하게는 8중량% 미만, 보다 바람직하게는 약 7중량% 미만, 보다 바람직하게는 약 6중량% 미만, 보다 바람직하게는 약 5중량% 미만, 보다 바람직하게는 약 4중량% 미만, 보다 바람직하게는 약 3중량% 미만, 보다 바라직하게는 약 2중량% 미만, 및 보다 바람직하게는 식물에 의해 생산된 총 지방산의 약 1중량% 미만, 보다 바람직하게는 식물에 의해 생산된 총 지방산의 약 0.5중량% 미만인 양으로 존재할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 유전자 변형된 식물 또는 본 발명의 유전자 변형된 식물로부터 수득된 오일 또는 종자는 검출가능한 양의 DHA(도코사헥사엔산(C22:6, n-3)) 또는 EPA(에이코사펜타엔산(C20:5, n-3))을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 유전자 변형된 식물 또는 본 발명의 유전자 변형된 식물로부터 수득된 오일 또는 종자는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 10%, 10.5%, 11%, 11.5%, 12%, 12.5%, 13%, 13.5%, 14%, 14.5% 또는 15% DHA를 포함한다. 유용한 범위는 임의의 이들 값 사이, 예를 들면, 0.01-15%, 0.05-10% 및 1-5% DHA에서 선택될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 유전자 변형된 식물 또는 본 발명의 유전자 변형된 식물로부터 수득된 오일 또는 종자는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5% 또는 10% EPA를 포함한다. 유용한 범위는 임의의 이들 값 사이, 예를 들면, 0.01-10%, 0.05-5% 및 0.1-5% EPA에서 선택될 수 있다.
일부 양태에서, PUFA 신타제 시스템의 표적 생성물이 장쇄 PUFA, 예를 들면, DHA, DPA(n-6 또는 n-3) 또는 EPA인 경우, 이러한 PUFA 신타제 시스템으로 유전자 변형된 식물의 총 지질에 실질량으로 존재하지 않는 중간 생성물 및 부생성물은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 감마-리놀렌산(GLA; 18:3, n-6); 스테아리돈산(STA 또는 SDA; 18:4, n-3); 디호모-감마-리놀렌산(DGLA 또는 HGLA; 20:3, n-6), 아라키돈산(ARA, C20:4, n-6); 에이코산트리엔산(ETA; 20:3, n-9) 및 다양한 기타 중간 또는 부생성물, 예를 들면, 20:0; 20:1(△5); 20:1(△11); 20:2(△8,11); 20:2(△11,14); 20:3(△5,11,14); 20:3(△11,14,17); 메드산(20:3; △5,8,11); 또는 20:4(△5,1,14,17)을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르는 식물의 유전자 변형은 식물에 의한 하나 이상의 PUFA를 생산할 수 있다. 일부 양태에서, 당해 식물에 의해 생산된 PUFA 프로파일 및 PUFA 비율은 PUFA 신타제가 유래된 생물체에 의해 생산된 PUFA 프로파일 또는 PUFA 비율과 반드시 동일한 것은 아니다.
일부 양태에서, 본 발명의 유전자 변형된 식물을 조작하여, PUFA 신타제의 활성에 의해 PUFA를 생산할 수 있다. 일부 양태에서, PUFA는 식물로부터 화합물을 추출하는 정제 공정을 통해 회수할 수 있다. 일부 양태에서, PUFA는 식물을 수거하여 회수할 수 있다. 일부 양태에서, PUFA는 식물로부터(예: 오일 종자로부터) 또는 식물 종자로부터 오일을 수거하여 회수할 수 있다. 일부 양태에서, 식물은 또한 자연 상태로 소비되거나, 소비가능한 제품으로 추가로 가공될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 유전자 변형된 식물은 하나 이상의 다중불포화 지방산을 생산할 수 있다. 일부 양태에서, 당해 식물은 적어도 하나의 PUFA(표적 PUFA)를 생산할 수 있고(예: 이의 성숙 종자에서, 오일 종자 식물인 경우, 또는 오일 종자 식물의 종자의 오일에서), 여기서 PUFA를 축적하는 식물 중의 전체 지방산 프로파일 또는 식물의 부분(예: 성숙 종자, 당해 식물이 오일 종자 식물인 경우, 또는 오일 종자 식물의 종자의 오일)은 검출가능한 양의 이러한 PUFA 또는 PUFA들을 포함한다. 일부 양태에서, 표적 PUFA는 적어도 20개 탄소 PUFA이고, 적어도 3개의 이중결합, 보다 바람직하게는 적어도 4개의 이중결합, 보다 바람직하게는 적어도 5개의 이중결합을 포함한다. 일부 양태에서, 표적 PUFA는 식물에 의해 자연적으로 생산되지 않는 PUFA일 수 있다. 일부 양태에서, PUFA를 축적하는 식물 또는 식물 부분(식물의 종자 오일 포함)에서 총 지방산 프로파일은 총 지방산중 적어도 0.1중량%의 표적 PUFA(들), 적어도 0.2중량%, 적어도 0.3중량%, 적어도 0.4중량%, 적어도 0.5중량%, 적어도 1중량%, 적어도 1.5중량%, 적어도 2중량%, 적어도 2.5중량%, 적어도 3중량%, 적어도 3.5중량%, 적어도 4중량%, 적어도 4.5중량%, 적어도 5중량%, 적어도 5.5중량%, 적어도 10중량%, 적어도 15중량%, 적어도 20중량%, 적어도 25중량%, 적어도 30중량%, 적어도 35중량%, 적어도 40중량%, 적어도 45중량%, 적어도 50중량%, 적어도 55중량%, 적어도 60중량%, 적어도 65중량%, 적어도 70중량%, 적어도 75중량%, 식물에 의해 생산된 총 지방산중 75중량% 이상의 적어도 하나의 다중불포화 지방산(표적 PUFA 또는 PUFA들), 또는 0.1중량% 내지 75중량% 사이의 임의의 퍼센트, 또는 75중량% 초과(100% 이하 또는 100%)의 표적 PUFA(들)(0.1% 증가량으로)을 포함한다.
본원에 일반적으로 사용된 바와 같이, PUFA 생산의 퍼센트 양은, 달리 명시되지 않는 한, 생물체(식물)에 의해 생산된 총 지방산의 중량 기준이다. 일부 양태에서, 식물에 의해 생산된 총 지방산은 지방산 메틸 에스테르(FAME) 제제의 기체 크로마토그래피(GC) 분석에 의해 측정한 중량%로서 나타내지만, 총 지방산의 측정은 이 방법으로 한정되지 않는다.
일부 양태에서, 본 발명의 식물(및/또는 식물 부분 또는 종자 오일 분획) 중의 총 지방산은 식물에 의해 생산된 총 지방산중 10중량% 미만, 9중량% 미만, 8중량% 미만, 7중량% 미만, 6중량% 미만, 5중량% 미만, 4중량% 미만, 3중량% 미만, 2중량% 미만, 1중량% 미만의, 하기 하나 이상으로부터 선택된 지방산: 감마-리놀렌산(GLA; 18:3, n-6); 스테아리돈산(STA 또는 SDA; 18:4, n-3); 디호모-감마-리놀렌산(DGLA 또는 HGLA; 20:3, n-6), 아라키돈산(ARA, C20:4, n-6); 에이코산트리엔산(ETA; 20:3, n-9) 및 다양한 기타 지방산, 예를 들면, 20:0; 20:1(△5); 20:1(△11); 20:2(△8,11); 20:2(△11,14); 20:3(△5,11,14); 20:3(△11,14,17); 메드산(20:3; △5,8,11); 또는 20:4(△5,1,14,17).
본 발명은 본원에 기재된 식물에 의해 생산된 임의의 종자 뿐만 아니라 본 발명의 식물 또는 종자에 의해 생산된 임의의 오일을 포함한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 식물, 종자 또는 오일을 사용하여 생산된 임의의 생성물을 포함한다.
본 발명의 유전자 변형된 생물체와 관련된 용도 및 생성물
본 발명은 상기 상세히 기재된 본 발명의 유전자 변형된 생물체(예: 식물)을 성장 또는 배양함으로써 PUFA를 생산하는 방법을 포함한다. 일부 양태에서, 이러한 방법은, 예를 들면, 적합한 환경(예: 토양)에서, 본원에서 상기 기재된 바와 같은 유전자 변형을 갖는 식물을 본 발명에 따라 성장시키는 단계를 포함한다.
본 발명은, 본 발명의 유전자 변형된 식물 또는 본 발명의 유전자 변형된 식물의 종자로부터 오일을 회수하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 PUFA를 포함하는 오일을 생산하는 방법을 포함한다. 본 발명은, 본 발명의 유전자 변형된 식물을 성장시키는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 PUFA를 포함하는 오일을 생산하는 방법을 포함한다. 본 발명은, 본 발명의 유전자 변형된 식물의 종자로부터 오일을 회수하는 단계를 포함하는, 종자 오일에서 적어도 하나의 PUFA를 생산하는 방법을 포함한다. 본 발명은, 본 발명의 유전자 변형된 식물을 성장시키는 단계를 포함하는, 종자 오일에서 적어도 하나의 PUFA를 생산하는 방법을 포함한다.
본 발명은, 본 발명의 유전자 변형된 식물, 본 발명의 오일, 본 발명의 종자, 본 발명의 식료품, 본 발명의 기능성 식품 또는 본 발명의 약품을 개체에게 제공하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 PUFA를 함유하는 보충 또는 치료 생성물을 개체에게 제공하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한, 식물 또는 식물 세포를 (i) 적어도 하나의 다중불포화 지방산(PUFA)를 생산하는 조류 PUFA 신타제 시스템을 인코딩하는 핵산 서열 및 (ii) 포스포판테테이닐 보조인자를 조류 PUFA 신타제 시스템 ACP 도메인으로 전달하는 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제(PPTase)를 인코딩하는 핵산 서열로 형질전환시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 유전자 변형된 식물을 생산하는 방법을 포함한다. 일부 양태에서, 당해 방법은 식물 또는 식물 세포를 (iii) 장쇄 PUFA 유리 지방산(FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 아실-CoA 신세타제(ACoAS)를 인코딩하는 핵산 서열로 형질전환시킴을 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 이러한 방법의 PUFA는 DHA 또는 EPA이다.
본 발명은 추가로, 본원에 기재된 생물체에 의해 생산된 임의의 오일 뿐만 아니라 본원에 기재된 임의의 생물체 또는 이의 부분(예: 식물, 식물 부분(예: 오일 종자) 또는 이의 제제 또는 분획)을 포함한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 생물체, 이의 부분 또는 오일을 사용하여 생산된 임의의 생성물을 포함한다.
본 발명은 본원에 기재된 본 발명에 따르는 유전자 변형된 생물체에 의해 생산된 생물체, 이의 부분 또는 오일(예: 본원에 기재된 바와 같이 유전자 변형된 식물)을 생성물에 첨가하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 지방산을 함유하는 생성물을 변형시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법에 의해 생산되거나 본원에 기재된 생물체로부터 임의의 생물체, 이의 부분 또는 오일을 일반적으로 함유하는 임의의 생성물이 또한 본 발명에 의해 포함된다.
일부 양태에서, 당해 생성물은 식품, 식이 보충물, 약제 제형, 사람화 동물 밀크, 이유식, 영양 또는 기능성 식품으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 적합한 약제학적 제형은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 소염 제형, 화학치료제, 활성 부형제, 골다공증 약물, 항우울제, 항경련제, 항-헬리코박터 필로리 약물, 신경퇴행성 질환 치료용 약물, 퇴화성 간 질환 치료용 약물, 항생제 및 콜레스테롤 저하 제형을 포함한다. 일부 양태에서, 당해 생성물은 만성 염증, 급성 염증, 위장 질환, 암, 악액질, 심장 재협착, 신경퇴행성 질환, 퇴행성 간 질환, 혈액 지질 질환, 골다공증, 골관절염, 자가면역 질환, 전자간증, 조산, 연령 관련 황반병, 폐 질환 및 퍼옥시좀 장애로 이루어진 그룹으로부터 선택된 증상을 치료하는데 사용된다.
일부 양태에서, 당해 생성물은 식료품 또는 기능성 식료품이다. 적합한 식료품은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 미세 제과품, 브레드 및 롤, 조식 시리얼, 가공 및 비가공 치즈, 조미료(케?, 마요네즈 등), 유제품(밀크, 요거트), 푸딩 및 젤라틴 디저트, 탄산 음료, 차, 분말형 음료 혼합물, 가공 어류 제품, 과일계 드링크, 츄잉 검, 경질 과자, 동결 유제품, 가공육 제품, 너트 및 너트계 스프레드, 파스타, 가공 가금 제품, 육즙 및 소스, 포테이토 칩 및 기타 칩 또는 크리스프(crips), 초콜렛 및 기타 과자류, 수프 및 수프 혼합물, 대두계 생성물(예: 밀크, 음료, 크림, 분말 크림), 식물유계 스프레드 및 식물계 음료를 포함한다.
본 발명의 일부 양태에서, 당해 생성물은 동물을 위한 사료 또는 밀(meal) 조성물 또는 사료 또는 밀 조성물용 첨가제이다. 용어 동물은 사람을 포함하는 모든 동물을 포함한다. 동물의 비제한적 예는 비반추동물(예: 돼지, 가금 또는 어류) 및 반추동물(예: 소, 양 및 말)이다. 용어 사료 및 사료 조성물은 동물에 의한 섭취에 적합하거나 이를 위해 의도된 임의의 화합물, 제제, 혼합물 또는 조성물을 의미한다.
일부 양태에서, 유전자 변형된 식물, 종자 또는 오일(예: 캐놀라)는 통상의 오일과 비교하여 감소된 수준의 다중불포화 지방산 및 증가된 수준의 일불포화된 올레산을 포함한다. 이러한 식물, 종자 또는 오일은, 예를 들면, 보다 높은 산화 안정성을 나타낼 수 있다. 일부 양태에서, 유전자 변형된 식물, 종자 또는 오일은 고도의 올레산 오일 배경(예: 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 올레산)을 포함한다. 이러한 식물, 종자 또는 오일은, 예를 들면, 저장, 프라잉 및/또는 정련 동안 산화에 대해 덜 감수성일 수 있고/있거나 발연 없이 보다 고온으로 가열될 수 있고, 이에 의해 쿠킹 오일로서 보다 적합하게 한다. 일부 양태에서, 유전자 변형된 식물, 종자 또는 오일은 본원에 기재된 소정량의 DHA 및 고도의 올레산 오일 배경(예: 70% 이상의 양, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 올레산 및 이의 임의의 범위 포함)을 포함한다. 일부 양태에서, 유전자 변형된 식물, 종자 또는 오일은 본원에 기재된 소정량의 DHA 및 낮은 리놀렌산 배경(예: 10% 이하의 양, 9.5%, 9%, 8.5%, 8%, 7.5%, 7%, 6.5%, 6%, 5.5%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, 0.05%, 0.02% 또는 0.01% 리놀렌산 및 이의 임의의 범위 포함)을 포함한다. 일부 양태에서, 유전자 변형된 식물, 종자 또는 오일은 본원에 기재된 소정량의 DHA 및 높은 올레산 오일 배경(예: 70% 이상의 양으로 존재, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 올레산 및 이의 임의의 범위 포함), 및 낮은 리놀렌산 배경(예: 10% 이하의 양, 9.5%, 9%, 8.5%, 8%, 7.5%, 7%, 6.5%, 6%, 5.5%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, 0.05%, 0.02% 또는 0.01% 리놀렌산 및 이의 임의의 범위 포함)을 포함한다. 일부 양태에서, 이러한 유전자 변형된 식물, 종자 또는 오일(예: 캐놀라)는 본원에 기재된 생성물 내로 도입될 수 있다.
본 발명의 추가적인 목적, 잇점 및 신규한 특징은, 제한하는 것으로 의도되지 않는 하기 실시예를 참조함으로써 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명백해질 것이다.
실시예
실시예
1
PUFA
신타제
OrfA
,
PUFA
신타제
OrfB
,
PUFA
신타제
OrfC
, 아실-
CoA
신세타제
및 4'
포스포판테테이닐
트랜스퍼라제
HetI
의 코돈 최적화
스키조키트리움 종 ATCC_20888(GenBank ID: AF378327, GI:158518688)로부터의 PUFA OrfA, 스키조키트리움 종 ATCC_20888(GenBank ID: AF378328, GI:158518690)로부터의 PUFA OrfB, 스키조키트리움 종 ATCC_20888 및 트라우스토키트리움(미국 특허출원 공개번호 2008/0022422)으로부터의 키메라 PUFA OrfC("키메라 OrfC" 또는 "하이브리드 OrfC"), 스키조키트리움 종 ATCC_20888(미국 특허출원 공개번호 2007/0245431)로부터의 아실-CoA 신세타제, 노스톡 종 PCC 7120(GenBank ID: P37695, GI:20141367) 코딩 영역으로부터의 4' 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 HetI을 인코딩하는 DNA 서열의 분석은, 최적 식물 발현에 유해할 수 있는 비-최적 코돈 조성을 함유하는 몇몇 서열 모티브의 존재를 나타냈다. PUFA 신타제 OrfA, PUFA 신타제 OrfB, PUFA 신타제 키메라 OrfC, 아실-CoA 신세타제 및 4' 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 HetI 단백질을 인코딩하는 유전자의 설계는, 자연에서 보다 "식물-유사"하거나 당해 서열 변형이 해독을 방해하지 않거나 비-최적 코돈 조성을 통해 mRNA 안정성을 생성하지 않는 DNA 서열을 형성하기 위해 최적화되었다.
유전자 코드의 중복/축퇴에 의해 제공된 가소성(예: 일부 아미노산은 하나 이상의 코돈에 의해 명시됨)에 기인하여, 상이한 생물체 또는 생물체 부류에서 게놈의 진화는 동의(synonymous) 코돈의 상이한 사용을 발생시켰다. 이러한 "코돈 바이어스"는 단백질 코돈 영역의 평균 염기 조성에 반영된다. 예를 들면, G+C 함량이 비교적 낮은 게놈을 갖는 생물체는 동의 코돈의 제3 위치에서 A 또는 T를 갖는 보다 많은 코돈을 이용하고, G+C 함량이 보다 높은 생물체는 제3 위치에서 G 또는 C를 갖는 보다 많은 코돈을 이용한다. 추가로, mRNA 내에 "소수(minor)" 코돈의 존재는, 특히 소수 코돈에 상응하는 하전된 tRNA의 상대적 풍부도가 낮은 경우, 당해 mRNA의 절대 해독 속도를 감소시킬 수 있다. 이러한 이유의 확장은, 개개 소수 코돈에 의한 해독 속도의 감소가 복수의 소수 코돈에 적어도 부가적일 수 있다는 것이다. 따라서, 소수 코돈의 상대 함량이 높은 mRNA는 상응하게 낮은 해독 속도를 가질 것이다. 이러한 속도는 인코딩된 단백질의 상응하게 낮은 수준에 의해 반영될 것이다.
캐놀라(또는 기타 식물, 예를 들면, 벼, 담배, 옥수수, 목면 또는 대두)에서 발현시키기 위해 PUFA 신타제 OrfA, PUFA 신타제 OrfB, PUFA 신타제 키메라 OrfC, 아실-CoA 신세타제 및 4' 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 HetI 단백질을 인코딩하는 유전자 조작에 있어서, 캐놀라용의 코돈 이용은 공중 이용가능한 데이터베이스(표 2)에 의해 입수되었다.
아미노산에 대한 잔여 코돈 선택의 배열을 계량하기 위해, 각 코돈에 대한 중량 평균 표시는 하기 식을 사용하여 계산했다(표 2):
C1의 중량 평균(%) = 1/(%C1 + %C2 + %C3 + 등) ×%C1 ×100
여기서, C1은 당해 코돈이고, %C2, %C3 등은 표 2의 잔여 동의 코돈의 캐놀라에 대한 값(%)의 평균을 나타낸다(관련 코돈에 대한 평균 % 값은 컬럼 C 및 G로부터 취함).
각 코돈에 대한 중량 평균(%)은 표 2의 컬럼 D 및 H에 제공되어 있다.
식물 발현을 위한 코딩 영역을 설계함에 있어서, 당해 식물에 의해 선호된 주요 ("제1 선택") 코돈 뿐만 아니라, 다중 선택이 존재하는 경우, 선호 코돈의 제2, 제3, 제4 등의 선택을 결정했다. 이어서, PUFA 신타제 OrfA, PUFA 신타제 OrfB, PUFA 신타제 OrfC, 아실-CoA 신세타제 및 4' 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 HetI의 동일한 아미노산 서열을 실질적으로 인코딩하지만 식물(제1 선호, 제2 선호, 제3 선호 또는 제4 선호 등) 코돈의 치환에 의해 아미노산 서열 내의 각 위치에서 아미노산을 특정함으로써 원형(original) DNA 서열(PUFA 신타제 OrfA, PUFA 신타제 OrfB, PUFA 신타제 키메라 OrfC, 아실-CoA 신세타제 및 4' 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 HetI을 인코딩함)과는 상이한 새로운 DNA 서열을 설계했다.
이어서, 새로운 서열을 당해 서열에서의 변형에 의해 생성된 제한 효소 부위에 대해 분석했다. 이어서, 동정된 부위는 당해 코돈을 제1, 제2, 제3 또는 제4 선택 선호 코돈으로 대체함으로써 변형시켰다. 이어서, 당해 서열을 추가로 분석하고, 변형시켜 TA 또는 GC 이중선의 빈도를 감소시켰다.
이들 서열의 분석은, 새로운 DNA 서열이 PUFA 신타제 OrfA, PUFA 신타제 OrfB, PUFA 신타제 키메라 OrfC, 아실-CoA 신세타제 및 4' 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 HetI 단백질의 아미노산 서열을 실질적으로 인코딩했지만, 캐놀라 유전자에서 발견된 빈번히 사용된 코돈의 계량된 코돈 분포를 사용하여 캐놀라에서 최적 발현에 대해 각각 설계되었음을 나타냈다. 특히, 새로운 DNA는 식물(제1 선호, 제2 서호, 제3 선호 또는 제4 선호) 코돈의 치환에 의해 단백질 아미노산 서열 내의 각 위치에서 적절한 아미노산을 특정함으로써 PUFA 신타제 OrfA, PUFA 신타제 OrfB, PUFA 시타제 키메라 OrfC, 아실-CoA 신세타제 및 4' 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 HetI을 인코딩하는 원형 DNA 서열과는 상이했다.
식물 최적화 DNA 서열의 설계는, 표 2로부터 구성된 캐놀라 코돈 바이러스 표, 컬럼 D 및 H를 사용하여 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 단백질 서열의 역-해독에 의해 개시했다. 아실-CoA 신세타제(서열번호 4)의 단백질 서열은 원형 서열로부터 변화되었고, 여기서 제2 아미노산 알라닌은 단백질로부터 제거되었다. 이어서, 개시 서열은, 코돈 변화(전체 중량 평균 코돈 표시를 유지하면서)를 보상하여, 제한 효소 인지 부위를 제거하거나 부가하고 고도의 안정성 쇄내 제2 구조체를 제거하고 식물에서 조작된 유전자의 클로닝 조작 또는 발현에 유해할 수 있는 다른 서열을 제거함으로써 변형되었다. 이어서, DNA 서열은, 변형에 의해 생성될 수 있는 제한 효소 인지 부위에 대해 분석했다. 동정된 부위는 관련 코돈을 제1, 제2, 제3 또는 제4 선택 선호 코돈으로 대체하여 추가로 변형시켰다. 목적하는 유전자의 전사 또는 해독에 영향을 미칠 수 있는 당해 서열 내의 다른 부위는 엑손:인트론 접합부(5' 또는 3'), 폴리 A 부가 시그널, 또는 RNA 폴리머라제 종결 시그널을 포함한다. 변형된 서열은 추가로 분석하고 추가로 변형시켜, TA 또는 CG 이중선의 빈도를 감소시키고 TG 또는 CT 이중선의 빈도를 증가시켰다. 이들 이중선 이외에, [G+C] 또는 [A+T]의 약 6개 이상의 보존적 잔기를 갖는 서열 블록은 당해 서열의 전사 또는 해독에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 이들 서열 블록은 또한 제1 또는 제2 선택 코돈을 다른 선호 선택 코돈으로 대체하여 변형시켰다. 드물게 사용된 코돈은 유전자 설계에 상당한 정도로 포함되지 않고, 코돈 조성 자체와는 상이한 설계 표준을 적용하는데 필요한 경우에만 사용된다(예: 제한 효소 인지 부위의 부가 또는 결실).
PUFA 신타제 OrfA에 의해 인코딩된 단백질은 17 내지 19개 아미노산 크기 범위의 10개 반복 "프롤린-알라닌" 도메인을 포함한다. 프롤린-알라닌 반복체 사이에는 87개 아미노산을 포함하는 9개의 보다 긴 반복 서열 도메인이 산재되어 있다. 이들 반복체의 아미노산 서열은 4개 위치에서만 상이하고, 상이한 위치 각각에서 2개의 아미노산 선택만이 존재했다. 클러스털 W 컴퓨터 프로그램을 사용한 9개 반복체의 아미노산 서열의 분석은 100%의 상동성 값 및 95.4%의 동일성 값을 생성했다. DNA 수준에서, 9개 반복체를 인코딩하는 서열은 100% 상동성 및 89.7% 동일성이 있고, 이는 각 반복체를 인코딩하는 261개 염기에서 27개 위치에서만 상이하다(27개 변화 중의 23개는 "침묵" 차이이고, 여기서 동일한 아미노산에 대한 동의 코돈은 교환됨).
표준 유전자 설계 공정은 이러한 크기의 복수 반복체에 대한 새로운 코돈 바이어스된 DNA 서열의 개발을 용이하게 수용할 수 없는데, 이는 고도 관련된 DNA 서열의 생성을 방지하기 위해, 다른 8개 반복체 중의 동일한 위치에서 이루어진 코돈 선택으로 개개 반복체에서 모든 코돈 선택을 연속적으로 대조해야 하기 때문이다. 87개 잔기 반복체 각각의 경우, 동일한 아미노산 서열을 인코딩하기 위한 4.5 × 1043개 이상의 가능한 DNA 서열이 존재한다(당해 서열에서 각 아미노산에 대한 동의 코돈 수의 곱으로 계산됨). 따라서, 동일하게 인코딩하는 DNA 서열을 생성하는데 이용가능한 매우 큰 컴퓨팅 공간이 존재한다. 하기 프로토콜은, 각각의 개개 반복체에 대한 (인 실리코) 다중 서열 디자인을 생성한 다음, 모든 서열 버젼을 대량으로 비교하여 당해 반복체를 인코딩하는 고도 분화된 서열을 나타내는 세트를 동정하는데 사용된 방법을 기재한다.
단계 1: 분리된 서열로서 각 반복된 아미노산 도메인을 인코딩하는 천연 DNA 서열을 추출한다.
단계 2: 개개 반복된 DNA 서열을 분리 서열로서 유전자 설계 프로그램(예: OPTGENETM, Ocimum Biosolutions, Hyderabad, India)에 이입한다. 단계 3 내지 5는 각각의 서열에 대해 별도로 수행된다.
단계 3: 표준 유전자 코드를 사용하여 DNA 서열을 해독한다.
단계 4: 표준 유전자 코드 및 적절한 코돈 바이어스 테이블을 사용하여 해독된 단백질 서열을 역해독시킨다. 이러한 예에서, 530 브라시카 나푸스 단백질 코딩 영역으로부터 수집한 바이어스된 코돈 테이블을 사용했고, 각각 생성된 서열은 "nap"("나푸스"의 경우) + 버젼 번호로 코드 명명되었다. 따라서, 반복체 1에 대한 제1 역-해독된, 코돈 바이어스된 서열은 "rpt1 nap1"로서 명명되었다. 이러한 실례에서, 당해 공정은 10회 수행하여, 반복체 1의 단백질 서열을 인코딩하는 10개 DNA 서열 버젼을 생성했다.
단계 5: 10개 서열 버젼을 상응하는 수의 텍스트 파일로 이출한다.
단계 6: 다른 반복된 서열 도메인의 각각에 대해 단계 3 내지 5를 반복한다. 이 실례에서, 총 90개 "nap" 서열 버젼이 생성되었다(각 반복된 요소에 대해 10개).
단계 7: 90개 서열 파일을 클러스털 W 프로그램 Mega 3.1(메가소프트웨어에서 접속됨)에 이입하고, 투입으로서 모든 90개 서열을 사용하여 다중 서열 정렬을 수행한다. 이들 서열은 단백질 코딩 영역의 세그먼트이기 때문에, 정렬은 허용된 갭 없이 수행된다. 클러스털 W 정렬 후, 근린 결합 트리(Neighbor-Joining tree)를 조립하고 가시화하고, 당해 단백질에서 9개 반복된 도메인 각각에 대해 10개 코돈 최적화 서열 중의 하나를 육안으로 골라낸다. 각각의 선택된 서열 버젼은 가장 깊이 분지된 트리 부분으로부터 선택된다.
단계 8: 각각의 반복된 도메인에 대한 선택된 서열을, 각각의 특정 반복체에 적절한 위치에서, 전체 단백질을 인코딩하는 코돈 최적화 DNA 서열 내로 도입한다.
단계9: 별도로 설계된 분화된 반복 요소를 포함하여 전체 코돈 최적화 서열의 최종 분석을 수행하여, 목적하지 않는 모티브, 제한 효소 인지 부위 등의 부재를 보장한다.
새롭게 설계된, 캐놀라 최적화 PUFA 신타제 OrfA, PUFA 신타제 OrfB, PUFA 신타제 OrfC, 아실-CoA 신타제 및 4' 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 HetI DNA 서열은 각각 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 수록되어 있다. 이들 코돈 최적화 서열은 명세서 전체에 걸쳐 버젼 3(v3)으로 간주한다. 버젼 2(v2)로서 표지된 서열은 원형 비코돈 최적화 서열을 기재한다.
생성 DNA 서열은 고도의 코돈 다양성을 갖고, 목적하는 염기 조성은 전략적으로 위치된 제한 효소 인지 부위를 함유하며, 유전자의 전자 또는 생성물 mRNA의 해독을 간섭할 수 있는 서열을 결여한다. 표 3, 표 4, 표 5, 표 6 및 표 7은 원형 유전자에서 발견된 PUFA 신타제 OrfA, PUFA 신타제 OrfB, PUFA 신타제 키메라 OrfC, 아실-CoA 신세타제 및 4' 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 HetI 단백질에 대한 코딩 서열의 코돈 조성, 식물 최적화 버젼 및 표 2, 컬럼 D 및 H로부터 계산된 식물 최적화 서열에 대한 코돈 조성 권고치를 나타낸다.
코딩 영역 서열의 코돈 최적화가 완료된 후, 추가의 뉴클레오티드 서열을 최적화 코딩 영역 서열에 부가했다. 클로닝을 촉진시키기 위한 제한 부위, 코작(Kozak) 서열 및 추가 정지 코돈을 식물 최적화 코딩 서열에 부가했다. 또한, 제2 시리즈의 PUFA 신타제 OrfA, PUFA 신타제 OrfB, PUFA 신타제 키메라 OrfC, 아실-CoA 신세타제 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 HetI 코딩 서열을 설계했고, 이는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 리불로스 비스포스페이트 카복실라제 소형 쇄 1A(GenBank ID: NM_202369.2)로부터의 엽록체 표적화 서열을 함유했다. 당해 서열 서열번호 11을 PUFA 신타제 OrfA, PUFA 신타제 OrfB, PUFA 신타제 키메라 OrfC 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 HetI에 대해 상기한 코딩 서열에 부가했다. 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 10으로부터의 최소 메티오닌을 제거하고, 엽록체 표적화 서열로 대체했다. 엽록체 표적화 서열을 함유하는 서열은 명세서 전체에 걸쳐 버젼 4(v4)로 간주한다.
제2 엽록체 통과 펩티드를 PUFA 신타제 OrfA, PUFA 신타제 OrfB, PUFA 신타제 키메라 OrfC, 아실-CoA 신세타제 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 HetI 코딩 서열에 부가했다. 이들 코딩 서열은 아실-ACP-티오에스테라제(GenBank ID: X73849.1)로부터의 엽록체 표적화 서열을 함유하도록 설계했다. 이 서열(서열번호 38)을 PUFA 신타제 OrfA, PUFA 신타제 OrfB, PUFA 신타제 키메라 OrfC 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 HetI에 대해 상기한 코딩 서열에 부가했다. 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로부터 최초 메티오닌을 제거하고, 엽록체 표적화 서열로 대체했다. 엽록체 표적화 서열을 함유하는 서열은 명세서 전체에 걸쳐 버젼 5(v5)로 간주한다.
식물 최적화 DNA 서열이 종이 또는 인 실리코 상에서 설계되면, 설계된 서열과 서열이 정확하게 상응하도록 실제 DNA 분자를 실험실에서 합성할 수 있다. 이러한 합성 DNA 분자를 클로닝하고, 달리는 이들이 자연 또는 천연 공급원으로부터 유래되는 것과 같이 정확하게 조작할 수 있다. 상기한 부가 서열을 함유하는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10을 포함하는 DNA 단편의 합성은 상업적 공급업자에 의해 수행되었다(Geneart Ag, Regensburg, Germany). 이어서, 합성 DNA를 발현 벡터 내로 클로닝하고, 실시예 2, 3 및 4에 기재된 바와 같이 아그로박테리움 및 캐놀라에 형질전환시켰다.
PUFA 신타제 OrfA 코딩 서열의 코돈 최적화와 함께 이러한 방법을 사용하는 것은, 반복된 서열 불안정성을 방지하도록 충분히 분화된 반복 프롤린-알라닌 서열의 선별을 생성했다. 이들 서열은 근린 결합 트리의 가장 깊은 분지로부터 선택되었다(즉, 이러한 서열 세트에서 서로 가장 멀리 관련됨). 스미스-와세르만 구형 정렬을 모든 쌍 조합물에 대해 수행했고, 상동성 범위는 76-77%의 가능한 중앙값과 함께 74-81%였다.
9개의 반복된 도메인에 대해 선택된 9개의 새롭게 설계된 코딩 영역의 클러스털 W 정렬(Vector NTI, Invitrogen, Carlsbad, CA)은 도 1에 제시되어 있다. 전체적으로, 당해 서열은, 100% 상동성 및 89.7% 동일성을 갖는 원형 서열과 비교하여, 93.1% 상동성 및 61.7% 동일성을 갖는다. 보다 큰 서열 분화는 10 이상의 서열 반복을 사용하고 컴퓨터 프로그램 또는 수학적 알고리즘을 사용하여 이들 서열로부터 선별(육안으로 서열을 선택하는 대신에)함으로써 달성될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 예시된 서열은 고도로 분화성이고, 뉴클레오티드를 함유하는 안정한 폴리-뉴클레오티드 단편을 생성했다.
실시예 2
pDAB7361
,
pDAB7362
,
pDAB7363
, 및 추가의
작제물을
위한 플라스미드
작제
pDAB7361
의
작제
pDAB7361 플라스미드(도 2; 서열번호 35)는 다중-부위 입구 재조합 L-R 반응(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 작제하였다. pDAB7361은 다음과 같이 3개의 PUFA 신타제 식물 전사 단위(PTU), 하나의 아실-CoA 신세타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 절단된 파세올루스 불가리스 피토헤마글루티닌-L(Phaseolus vulgaris phytohemagglutinin-L) 유전자 프로모터(PvDlec2 프로모터 v2; GenBank 수탁번호 X06336), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) AT2S3 유전자 5' 비해독 영역(2S 5' UTR; GenBank 수탁번호 NM_118850), 스키조키트리움종 다중불포화 지방산 신타제 개방 판독 프레임 A(Sz PUFA OrfA v2) 및 아라비돕시스 탈리아나 2S 알부민 유전자 3' 비해독 영역 터미네이터 v1(At2S SSP 터미네이터 v1; GenBank 수탁번호 M22035)을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, 스키조키트리움 종 다중불포화 지방산 신타제 개방 판독 프레임 B(SzPUFA OrfB v3) 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, 스키조키트리움 종 및 트라우스토키트리움 종 다중불포화 지방산 신타제 개방 판독 프레임 C(hSzThPUFA OrfC v3) 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 아실-CoA 신세타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, 스키조키트리움 종 아실-CoA 신세타제 (SzACS-2 v3) 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, 노스톡 종(Nostoc sp .) 4' 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 HetI(NoHetI v3) 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB7355, pDAB7335, pDAB7336, pDAB7339 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB7361을 형성하였다. 구체적으로, 상기한 5개의 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. pDAB7333은 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동[참조: Toro et al., PNAS 85( 22): 8558-8562; 1988] 및 T-스탠드 탑재 서열[T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B; Gardner et al., Science 231:725-727; 1986 및 WO 2001/025459 A1] 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: 카사바 정맥 모자이크 바이러스 프로모터[참조: CsVMV 프로모터 v2; Verdaguer et al., Plant Molecular Biology 31:1129-1139; 1996], 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제[참조: PAT v5; Wohlleben et al., 유전자 70:25-37; 1988] 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens ) ORF1 3' 비해독 영역[참조: AtuORF1 3' UTR v4; Huang et al., J. Bacteriol . 172:1814-1822; 1990]을 또한 함유한다. 이어서, 5개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석을 갖는 5개의 PTU의 도입에 대해 시험하였다.
pDAB7362
의
작제
pDAB7362 플라스미드(도 3; 서열번호 36)는 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제하였다. pDAB7362는 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 아실-CoA 신세타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 서열 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 아실-CoA 신세타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzACS-2 v3 유전자 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, NoHetI v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB7334, pDAB7335, pDAB7336, pDAB7339 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB7362를 형성하였다. 구체적으로, 상기한 5개의 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. pDAB7333은 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스탠드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 또한 함유한다. 이어서, 5개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석을 갖는 5개의 PTU의 도입에 대해 시험하였다.
pDAB7363
의
작제
pDAB7363(도 4; 서열번호 37)는 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제하였다. pDAB7363은 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 아실-CoA 신세타제 PTU 및 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 서열을 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v4 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfB v4 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v4 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 아실-CoA 신세타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzACS-2 v3 유전자 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, NoHetI v4 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 또한, 모든 PTU는 라벨 "v4"로 지시된 아라비돕시스 탈리아나 리불로스 비스포스페이트 카복실레이트 작은 쇄 1A 엽록체 표적화 서열을 함유한다.
플라스미드 pDAB7340, pDAB7341, pDAB7342, pDAB7344 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB7363을 형성하였다. 구체적으로, 상기한 5개의 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. pDAB7333은 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스탠드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 또한 함유한다. 이어서, 5개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석을 갖는 5개의 PTU의 도입에 대해 시험하였다.
pDAB7365
의
작제
pDAB7365는 SzPUFA OrfA v2, SzPUFA OrfB v2, hSzThPUFA OrfC v2, SzACS-2 v2 및 NoHetI v2의 천연 비코돈 최적화 버젼을 함유하도록 작제한 이원 플라스미드이다. pDAB7365 플라스미드(도 19; 서열번호 39)는 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제하였다. pDAB7365는 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 아실-CoA 신세타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v2 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfB v2 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfC v2 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 아실-CoA 신세타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzACS-2 v2 유전자 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, NoHetI v2 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB7355, pDAB7356, pDAB7357, pDAB7360 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB7365를 형성하였다. 구체적으로, 상기한 5개의 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자의 순서는 다음과 같다: SzPUFA OrfA v2, SzPUFA OrfB v2, SzPUFA OrfC v2, SzACS-2 v2, NoHetI v2. pDAB7333은, 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스탠드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3'TR v4를 또한 함유한다. 이어서, 5개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석을 갖는 6개의 PTU의 도입에 대해 시험하였다.
pDAB7368
의
작제
pDAB7368은 SzPUFA OrfA v2, SzPUFA OrfB v2, hSzThPUFA OrfC v2 및 NoHetI v2의 천연 비코돈 최적화 버젼을 함유하도록 작제한 이원 플라스미드이다. 이 작제물은 SzACS-2 코딩 서열을 함유하지 않는다. pDAB7368 플라스미드(도 20; 서열번호 40)는 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제하였다. pDAB7368은 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 아실-CoA 신세타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v2 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfB v2 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfC v2 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, NoHetI v2 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB7355, pDAB7356, pDAB7357, pDAB7359 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB7368을 형성하였다. 구체적으로, 상기한 4개의 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자의 순서는 다음과 같다: SzPUFA OrfA v2, SzPUFA OrfB v2, SzPUFA OrfC v2, NoHetI v2. pDAB7333은 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스탠드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3'TR v4를 또한 함유한다. 이어서, 5개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석을 갖는 5개의 PTU의 도입에 대해 시험하였다.
pDAB7369
의
작제
pDAB7369는 SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3 및 NoHetI v3의 재조립된 코돈 최적화 버젼을 함유하도록 작제된 이원 플라스미드이다. 이 작제물은 SzACS-2 코딩 서열 PTU를 함유하지 않는다. pDAB7369 플라스미드(도 21; 서열번호 41)는 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제하였다. pDAB7369는 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 아실-CoA 신세타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, NoHetI v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB7334, pDAB7335, pDAB7336, pDAB7338 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB7369를 형성하였다. 구체적으로, 상기한 4개의 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자의 순서는 다음과 같다: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3. pDAB7333은 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스탠드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 또한 함유한다. 이어서, 5개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석을 갖는 5개의 PTU의 도입에 대해 시험하였다.
pDAB7370
의
작제
pDAB7370은 코딩 서열의 아미노 말단에 융합된 리블로스 비스포스페이트 카복실레이트 작은 쇄 1A(SSU-TP v1로서 표지됨)를 함유하는 SzPUFA OrfA v4, SzPUFA OrfB v4, hSzThPUFA OrfC v4 및 NoHetI v4의 재조립된 코돈 최적화 버젼을 함유하도록 작제된 이원 플라스미드이다. 이 작제물은 SzACS-2 코딩 서열 PTU을 함유하지 않는다. pDAB7370 플라스미드(도 22; 서열번호 42)는 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제하였다. pDAB7370은 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 아실-CoA 신세타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v4 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfB v4 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v4 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, NoHetI v4 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB7340, pDAB7341, pDAB7342, pDAB7343 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB7370을 형성하였다. 구체적으로, 상기한 4개의 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자의 순서는 다음과 같다: SzPUFA OrfA v4, SzPUFA OrfB v4, hSzThPUFA OrfC v4, NoHetI v4. pDAB7333은 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스탠드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3'TR v4를 또한 함유한다. 이어서, 5개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석을 갖는 5개의 PTU의 도입에 대해 시험하였다.
pDAB100518
의
작제
pDAB100518은 코딩 서열의 아미노 말단에 융합된 아실-ACP-티오에스테라제로부터의 엽록체 통과 펩티드(티오에스테라제 통과 펩티드로서 표지됨)를 함유하는 SzPUFA OrfA v5, SzPUFA OrfB v5, hSzThPUFA OrfC v5 및 NoHetI v5의 재조합된 코돈 최적화 버젼을 함유하도록 작제된 이원 플라스미드이다. 또한, 당해 플라스미드는 엽록체 통과 펩티드를 포함하지 않는 SzACS-2 v3 코딩 서열 PTU를 함유한다. pDAB100518 플라스미드(도 23; 서열번호 43)는 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제하였다. pDAB100518은 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 아실-CoA 신세타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v5 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfB v5 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v5 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 아실-CoA 신세타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzACS-2 v3 유전자 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, NoHetI v5 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB100517, pDAB100514, pDAB100511, pDAB100515 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB100518을 형성하였다. 구체적으로, 상기한 5개의 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자의 순서는 다음과 같다: SzPUFA OrfA v5, SzPUFA OrfB v5, hSzThPUFA OrfC v5, SzACS-2 v3, NoHetI v5. pDAB7333은 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스탠드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 또한 함유한다. 이어서, 6개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석을 갖는 6개의 PTU의 도입에 대해 시험하였다.
pDAB101476
의
작제
pDAB101476은 SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3 및 NoHetI v3의 재조립된 코돈 최적화 버젼을 함유하도록 작제된 이원 플라스미드이다. SzACS-2 v2 유전자 서열은 천연 비코돈 최적화 버젼이다. pDAB101476 플라스미드(도 24; 서열번호 44)는 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제하였다. pDAB101476은 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 아실-CoA 신세타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 아실-CoA 신세타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzACS-2 v2 유전자 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, NoHetI v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB7334, pDAB7335, pDAB7336, pDAB101471 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB101476을 형성하였다. 구체적으로, 상기한 5개의 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자의 순서는 다음과 같다: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzACS-2 v2, NoHetI v3. pDAB7333은 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스탠드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3'UTR v4를 또한 함유한다. 이어서, 6개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석을 갖는 6개의 PTU의 도입에 대해 시험하였다.
pDAB101477
의
작제
pDAB101477은 SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3 및 NoHetI v3의 재조립된 코돈 최적화 버젼을 함유하도록 작제된 이원 플라스미드이다. pDAB101477 플라스미드(도 25; 서열번호 45)는 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제하였다. pDAB101477은 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 아실-CoA 신세타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 아실-CoA 신세타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzACS-2 v4 유전자 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, NoHetI v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB7334, pDAB7335, pDAB7336, pDAB101472 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB101477을 형성하였다. 구체적으로, 상기한 5개의 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자의 순서는 다음과 같다: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzACS-2 v4, NoHetI v3. pDAB7333은 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스탠드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3'UTR v4를 또한 함유한다. 이어서, 6개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석을 갖는 6개의 PTU의 도입에 대해 시험하였다.
실시예
3
플라스미드
pDAB7361
,
pDAB7362
,
pDAB7363
을 위한 아그로박테리움 균주 제조
pDAB7361, pDAB7362 및 pDAB7363 플라스미드를 표준 전기천공법을 사용하여 아그로박테리움 투메파시엔스로 형질전환시켰다. 구체적으로, 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 Z707S[참조: Hepburn et al. J. Gen . Microbiol. 131:2961-2969 (1985)]는 pDAB7361, pDAB7362 또는 pDAB7363 플라스미드로 전기천공시켰다. 플라스미드를 함유한 아그로박테리움의 형질전환된 콜로니를 선택하고, 제한 효소 소화를 사용하여 확인하였다. pDAB7361, pDAB7362 또는 pDAB7363을 함유하는 아그로박테리움 균주를 -80℃에서 글리세롤 스톡으로서 저장하였다.
실시예
4
캐놀라의
아그로박테리움
매개된
형질전환
아그로박테리움 제조
pDAB7361, pDAB7362 또는 pDAB7363을 함유하는 아그로박테리움 균주의 글리세롤 스톡의 루프를 사용하여 스트렙토마이신(100mg/ml) 및 스펙티노마이신(50mg/ml)을 함유하는 YEP(박토 펩톤 20.0gm/L 및 효모 추출물 10.0gm/L) 플레이트를 스트리킹하고 28℃에서 2일 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 2일 스트리킹 플레이트의 루프를 멸균 500mL 배플(baffled) 플라스크(들) 속에서 스트렙토마이신(100mg/ml) 및 스펙티노마이신(50mg/ml)을 갖는 150mL 개질된 YEP 액체 속에서 접종시키고, 28℃에서 200rpm으로 진탕시켰다. 배양액을 M- 배지(LS 염, 3% 글루코스, 개질된 B5 비타민, 1μM 키네틴, 1μM 2,4-D, pH 5.8)에 재현탁시키고, 캐놀라 배축(hypocotyl)의 형질전환 전에 적합한 밀도(50 Klett 단위)로 희석시켰다.
캐놀라
형질전환
종자 발아: 캐놀라 종자(다양한 넥세라(Nexera) 710)를 10% 클로록스에서 10분 동안 표면 멸균시키고, 멸균 증류수로 3회 세정하였다(종자는 이 공정 동안 강 여과기에 함유시킨다). 종자를 피타트레이(phytatry)에 피타트레이당 25개 종자를 함유하는 1/2 MS 캐놀라 배지(1/2 MS, 2% 수크로즈, 0.8% 한천)에서 발아를 위해 심고, 25℃에서 광주기 16시간 명, 8시간 암으로 설정된 성장 섭생으로 퍼시벌 챔버에 위치시키고, 5일 동안 발아시켰다.
전처리: 5일째에, 약 3mm 배축 세그먼트를 무균 상태로 절개하여 뿌리 및 싹 부분을 버렸다(배축의 건조는 이들을 절개 공정 동안 10ml의 멸균 밀리Q 수에 위치시킴으로써 억제하였다). 배축 세그먼트를 22 내지 23℃에서 설정된 성장 섭생(광주기 16시간 명, 8시간 암)으로 퍼시벌 챔버에서 3일 전처리하기 위한 유합조직 유도 배지 MSK1D1(MS, 1mg/l 키네틴, 1mg/l 2,4-D, 3% 수크로즈, 0.7% Phytagar) 상의 멸균 여과지 상에 수평으로 위치시켰다.
아그로박테리움과 공동 배양: 아그로박테리윰 처리 전날, 적합한 항생제를 함유하는 YEP 배지의 플라스크를 인큐베이션시켰다. 배축 세그먼트를 여과지로부터 10ml 액체 M 배지를 함유하는 빈 100x25mm 페트리 접시로 이동시켜 배축 세그먼트가 건조되지 않도록 하였다. 이 단계에서 세그먼트를 퍼내어 이동시키기 위해 주걱을 사용하였다. 액체 M 배지를 피펫으로 제거하고, 40ml의 아그로박테리움 현탁액을 페트리 접시(40ml의 아그로박테리윰 용액을 갖는 500 세그먼트)에 첨가하였다. 당해 세그먼트를 30분 동안 페트리 접시의 주기적 와동으로 처리하여 체류된 배축이 아그로박테리움 용액에 침지되도록 하였다. 처리 기간 말기에, 아그로박테리움 용액을 폐기물 비이커 속에서 피펫팅하고, 오토클레이빙하여 버렸다(아그로박테리움 용액을 완전히 제거하여 아그로박테리움의 과성장을 억제하였다). 처리된 배축을 겸자를 사용하여 여과지와 함께 MSK1D1를 함유하는 원래 플레이트로 이동시켰다(세그먼트가 건조되지 않았음을 보장하기 위해 주의를 하였다). 대조군 세그먼트과 함께 배축 세그먼트를 감소된 빛의 세기하에 퍼시벌 챔버로 반환시키고(플레이트를 알루미늄 호일로 덮어서), 처리된 배축을 아그로박테리움으로 3일 동안 공동 배양하였다.
선택 배지 상의 유합조직 유도: 공동 배양 3일 후, 배축 세그먼트를 개별적으로 겸자를 사용하여 유합조직 유도 배지 MSK1D1H1(MS, 1mg/l 키네틴, 1mg/l 2,4-D, 0.5gm/l MES, 5mg/l AgNO3, 300mg/l 티멘틴, 200mg/l 카베니실린, 1mg/l Herbiace, 3% 수크로즈, 0.7% Phytagar) 상으로 이동시켰다. 배축 세그먼트를 배지 상에 고정시키지만, 배지에 매립시키지는 않았다.
선택 및 싹 재생: 유합조직 유도 배지 상에서 7일 후, 유합조직화 배축 세그먼트를 선택 MSB3Z1H1(MS, 3mg/l BAP, 1mg/l 제아틴, 0.5gm/l MES, 5mg/l AgNO3, 300mg/l 티멘틴, 200mg/l 카베니실린, 1mg/l Herbiace, 3% 수크로즈, 0.7% Phytagar)와 함께 싹 재생 배지 1로 이동시켰다. 14일 후, 싹과 함께 배축을 증기된 선택 MSB3Z1H3(MS, 3mg/l BAP, 1mg/l 제아틴, 0.5gm/l MES, 5mg/l AgNO3, 300mg/l 티멘틴, 200mg/l 카베니실린, 3mg/l HERBIACE, 3% 수크로스, 0.7% Phytagar)와 함께 재생 배지 2로 이동시켰다.
싹 신장: 14일 후, 싹을 갖는 세그먼트를 싹 신장 배지 MSMESH5(MS, 300mg/l 티멘틴, 5mg/l Herbiace, 2% 수크로스, 0.7% TC 한천)으로 이동시켰다. 이미 신장된 싹을 분리하고, MSMESH5로 이동시켰다. 14일 후, 제1 라운드에서 신장되지 않은 잔류하는 싹을 MSMESH5 상에 위치시키고, 동일한 조성의 새로운 선택 배지로 이동시켰다. 이 단계에서, 모든 잔류하는 배축 세그먼트를 버렸다.
2주 후, MSB3Z1H3 배지 상에서 신장된 싹을 분리하고 MSMESH5 배지로 이동시켰다. MSMESH5 상의 제1 라운드에서 신장되지 않은 잔류하는 싹을 분리하고, 동일 조성의 새로운 선택 배지로 이동시켰다. 이 단게에서, 모든 자륜하는 배축 세그먼트를 버렸다.
뿌리 유도: 14일 후, 싹을 뿌리 유도용 MSMEST 배지(MS, 0.5g/l MES, 300mg/l 티멘틴, 2% 수크로즈, 0.7% TC 한천)으로 이동시켰다. MSMEST 배지 상의 제1 이동에서 뿌리박히지 않은 싹을 뿌리박힌 식물이 수득될 때까지 MSMEST 배지 상의 제2 또는 제3 주기를 위해 이동시켰다. MSMEST 배지 상의 제1 이동에서 연장되거나 뿌리 박히지 않은 싹을 뿌리박힌 식물이 수득될 때까지 MSMEST 배지 상의 제2 또는 제3 주기를 위해 이동시켰다.
PCR 분석: 싹을 MSMESH5 배지 상에서 14일 이상 동안 배양한 후, PCR용 시료를 분리시켰다. 녹색 싹으로부터 잎 조직을 PAT 선택가능한 표지 유전자의 존재에 대해 PCR로 시험하였다. 모든 식물 황백화 싹을 버리고, PAT 분석에 적용하지 않았다. PCR 반응에 양성이었던 시료를 유지시키고, 싹을 MSMEST 배지 상에 정치시켜 뿌리를 신장시키고 발달시켰다. PCR 분석에 따라 음성이었던 싹을 버렸다.
MSMESH5 또는 MSMEST 상에서 뿌리박히고, PCR-양성이었던 식물을 토양에 이식용으로 제공하였다. 경화 후, T0 캐놀라 식물을 이식유전자 PTU 카세트 모두를 함유하는 이벤트에 대해 추가로 분석한 다음, 식물을 온실로 이동시키고, 성숙하게 성장시키고, 종자를 추가의 분석을 위해 수거하였다.
실시예
5
유전자변형
캐놀라
중의 코딩 영역의 카피 수 분석 및 검출
실시예 4로부터 선택된 T0 식물을 추가로 분석하여 각각의 변형유전자 PTU 발현 카세트가 함유된 식물을 동정하였다. 유입자 및 가수분해 프로브 분석을 수행하여 추정적으로 형질전환된 T0 식물의 시료를 초기에 스크리닝하여 PAT 발현 카세트가 함유된 이벤트를 동정하였다. 후속적인 PUFA 신타제 OrfA, PUFA 신타제 OrfB, PUFA 신타제 키메라 OrfC, 아실-CoA 신세타제 및 4' 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 HetI 유전자 발현 카세트의 PCR 분석을 완료하여 식물을 형질전환시키는데 사용된 이원 벡터로부터 각각 유전자 발현 카세트 PTU가 함유된 식물을 추가로 동정하였다. 모든 PTU를 함유하는 이벤트를 T1 식물로의 발전을 위해 선택하였다.
조직 시료를 96-웰 수집 플레이트에서 수집하고, 2일 동안 동결건조시켰다. 조직 침수연(Tissue maceration)은 클레코 조직 분쇄기 및 텅스텐 비드(Kleco, Visalia, CA)를 사용하여 수행하였다. 조직 침수연, 이어서 게놈 DNA를 제조업자의 제시된 프로토콜에 따라 DNeasy 96 플랜트 키트(Qiagen, Germantown, MD)를 사용하여 고처리량 포맷으로 분리시켰다.
gDNA는 Quant-IT Pico Green DNA 분석 키트(Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA)에 의해 정량화하였다. 정량화된 gDNA를 Invader® 분석을 위해 10ng/㎕로, 가수분해 프로브 분석을 위해 2ng/㎕로 Biorobot3000 자동화 액체 취급기(Qiagen, Germantown, MD)를 사용하여 조정하였다.
통상적인 INVADER® 분석은 셋째 웨이브 기술(Madison, WI)에 의해 캐놀라 내에서 팻(pat) 분석용으로 개발되었다. gDNA 시료(7.5㎕의 10ng/㎕ gDNA)을 먼저 95℃에서 10분 동안 인큐베이션시켜 96-웰 플레이트 포맷에서 변성시킨 다음, 주위 온도로 냉각시켰다. 이어서, 7.5㎕의 마스터 믹스[팻 및 HMG 내부 참조 유전자용 3㎕의 프로브 믹스(Weng, 2005) Weng H. et al., (2005). J. AOAC Int . 88(2):577-84., 3.5㎕의 Cleavase XI FRET 믹스 및 1㎕의 Cleavase XI 효소/MgCl2 용액]를 각 웰에 첨가하고, 시료를 광유로 도포하였다. 플레이트를 밀봉시키고, 바이오라드 테트라드 써머사이클러(BioRad Tetrad thermocycler)에서 63℃에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 형광 플레이트 판독기 상에서 판독하기 전에 주위 온도로 냉각시켰다. 모든 플레이트는 1 카피, 2 카피 및 4 카피 표준 뿐만 아니라 야생형 대조군 시료 및 어떤 시료도 함유하지 않는 블랭크 웰을 함유한다.
판독치를 두 FAM(λ 485-528nm) 및 RED(λ 560-620nm) 채널에 대해 수집하고, 이들로부터 각 채널에 대해 0(즉, 배경) 이상의 중첩을 시료 원(raw) 시그널을 주형 없는 원 시그널로 나누어 각 시료에 대해 측정하였다. 이 데이터로부터, 표준 곡선을 작제하고, 최선의 적합도를 선형 회귀 분석으로 측정하였다. 이 적합도로부터 동정된 파라미터를 사용하여, 명백한 팻 카피 수를 각 시료에 대해 추산하였다.
TAQMAN® 분석과 유사한, 가수분해 프로브 분석에 의한 변형유전자 카피 수 측정을 LIGHTCYCLER® 480 시스템(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)을 사용하여 실시간 PCR로 수행하였다. 분석은 LIGHTCYCLER® 프로브 디자인 소프트웨어 2.0을 사용하는 팻 및 내부 참조 유전자 HMG용으로 고안되었다. 증폭을 위해, LIGHTCYCLERR® 480 프로브스 마스터 믹스(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)를 0.4μM의 각 프라이머 및 0.2μM의 각 프로브(표 8)를 함유하는 10μL 용적 복합 반응으로 1X 최종 농도에서 제조하였다. 2단계 증폭 반응을 형광 포착으로 60℃에서 35초 동안 확장하여 수행하였다. 모든 시료를 3회 수행하고, 평균 순환 임계(Ct) 값을 각 시료의 분석용으로 사용하였다.
실시간 PCR 데이터의 분석은 상대적 양 모듈을 사용하는 LIGHTCYCLER®소프트웨어 릴리스 1.5를 사용하여 수행하고, ΔΔCt 방법에 기초한다. 이를 위해, 단일 카피 구경측정기 및 공지된 2 카피 체크(check)로부터 gDNA의 시료를 각 작동에 포함시켰다(상기 유입자 분석용으로 사용된 것들과 동일함).
T0 식물 이벤트에 함유된 기타 유전자 발현 카세트의 존재는 개별적인 PCR 반응으로 검출되었다. 이러한 5개 PTU의 코딩 영역에 특이적인 프라이머 쌍(표 9)을 검출용으로 사용하였다.
PUFA 신타제 OrfA PCR 반응은 유전자 서열의 개방 판독 프레임을 증폭시키기 위한 2개의 개별적인 PCR 반응 및 상이한 조건(예: PCR 프라이머 및 순환 조건)을 필요로 한다. 모든 PCR 반응은 제조업자 지침당 EX-TAQ PCR 키트(TaKaRa Biotechnology Inc. Otsu, Shiga, Japan)를 사용하여 35회 순환으로 표 10에 기술된 조건을 사용하여 완료시켰다. PCR 생성물을 분해하고, TAE 아가로즈 겔 전기영동을 사용하여 동정하였다. 전체 길이 PTu의 존재를 지시하는 PCR 생성물에 대한 예상된 겔 단편 크기는 표 10에서 "예상된 크기" 컬럼에 기술된다.
총 197개 캐놀라 이벤트가 유입자 및 가수분해 프로브 실험으로부터 팻 양성으로서 동정되었다. 이러한 이벤트 중 15개는 식물을 형질전환시키는데 사용된 이원체 내에 함유된 모두 5개의 유전자 발현 카세트(PUFA 신타제 OrfA, PUFA 신타제 OrfB, PUFA 신타제 키메라 OrfC, 아실-CoA 신세타제 및 4' 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 HetI)에 대한 PCR 증폭자를 생성했다. 표 11은 도코사헥사엔산(DHA)의 생성으로부터 추가로 분석된 15개 이벤트를 제공한다. 이러한 T0 캐놀라 식물을 온실에서 성숙하게 성장시키고, 후속적으로 자체 수정시켰다. 성숙한 T1 종자를 수거하고, GC-FAME 분석을 통해 DHA에 대해 분석하였다.
실시예
6
유전자변형
캐놀라
종자 지질에서
DHA
의 검출
캐놀라 종자 시료(단일 종자 또는 벌크화 시료)을 트리아실글리세롤 내부 표준으로서 트리헵타데카노인((Nu-Chek prep)을 함유하는 헵탄 중에서 강철 볼 밀(steel ball mill)을 사용하여 균질화했다. 균질화 전에, 메탄올 중의 0.25M의 새로 제조된 나트륨 메톡사이드(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)의 용액을 첨가하였다. 추출은 40℃에서 일정하게 진탕시키면서 수행하였다. 회수는 메틸화 대체물 C17 지방산의 회수로 입증되었다. FAME(지방산 메틸 에스테르)의 추출을 3회 반복하고, 헵탄 층을 분석하기 전에 풀링하였다. 반응의 완료는 넷째 추출/유도체화에서 내생적 FAME의 존재를 체크하여 입증하였다. 생성되는 FAME를 SGE로부터 모세관 컬럼 BPX 70(15 m x 0.25 mm x 0.25μM)를 사용하는 GC-FID로 분석하였다. 각각의 FAME를 체류 시간에 의해 동정하고, 적합한 장쇄 다중불포화 지방산(Nu-Chek Prep, Elysian MN)을 첨가하면서 보정 표준으로서 Matreya LLC(Pleasant Gap, PA)로부터 평지씨 오일 참조 믹스의 주입으로 정량화하였다.
7개 이벤트로부터의 종자에 상응하는 FAME 추출물은 T1 종자의 GC-FAME 분석에 따르는 DHA 및 DPA (n-6)에 상응하는 피크를 함유하는 것으로 밝혀졌다(이하 표 12에서 표화됨). 표 12는 단일 종자에서 관찰된 DHA의 최대 함량과 같이, DHA-함유 종자의 수가 가변적이다(캐놀라 게놈에 삽입된 유전자변형 세트의 다양한 카피의 분리로부터 기대된 바와 같이)는 것을 나타낸다.
a. 검출가능한 DHA에 함유된 종자의 숫자/T1 벌크로부터 분석된 종자의 총 숫자
b. 모든 DHA-양성 종자의 평균 DHA 함량(총 지질%)
c. 모든 DHA-양성 종자의 평균 PUFA 함량(총 지질%)
d. DHAn-3/총 LC-PUFA(DHA+DPAn-6)의 평균 비율%
e. 단일 종자에서 관찰된 최고 DHA 함량
추가의 이벤트로부터의 개발 종자를 분석하고, DHA를 함유하는 것으로 밝혀졌지만, 성숙한 식물은 추가의 분석에 불충분한 T1 종자를 수득하였다. 장쇄 다중불포화 지방산(LC-PUFA) 피크 동일성은 질량 분광학 분석에 의해 확인하였고, 인증 표준(Nu-Chek Prep, Elysian MN)과 비교하였다.
하나의 이벤트(이벤트 5197[14]-032.002)로부터의 T1 종자의 DHA 함량에 대한 단일 종자 분석은 도 5에 도시한다. 단일 종자는 1% 이하의 DHA(총 FAME이 %로서)를 함유한다. DHA 수준은 DHA 생성 유전자를 함유하는 단일 서식지의 분리를 반영하는 3개의 부류(0, 약 0.4% 및 약 0.9% DHA)로 분리하는 것으로 나타난다.
이러한 데이터는 DHA가 플라스미드 pDAB7361, pDAB7362 및 pDAB7363으로 형질전환된 식물에서 생성되었음을 지시한다. pDAB7362 플라스미드는 파세올루스 불가리스 피토헤마글루티닌-L 유전자 프로모터로 구동되는 (PUFA 신타제 OrfA, PUFA 신타제 OrfB, PUFA 신타제 키메라 OrfC, 아실-CoA 신세타제 및 4' 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 HetI를 인코딩하는) 모두 5개 유전자의 식물 최적화 버젼을 함유한다. pDAB7361에서, PUFA 신타제 OrfA (SzOrfA v2)의 천연 유전자 서열은 식물 최적화 버젼(SzOrfA v3)을 대체한다. pDAB7363은 또한 아라비돕시스 탈리아나 리불로스 비스포스페이트 카복실라제 작은 쇄 1A 엽록체 통과 펩티드를 PUFA 신타제 OrfA, PUFA 신타제 OrfB, PUFA 신타제 키메라 OrfC 및 4' 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 HetI의 N-말단에 첨가하여 이들 폴리펩티드를 색소체에서 표적화한다는 것 이외에는 pDAB7362와 유사하다.
실시예
7
캐놀라
종자에서
PUFA
신타제
단백질의 검출
PUFA 신타제 폴리펩티드는 웨스턴 블롯에 의해 성숙한 유전자변형 종자 시료에서 검출시켰다. 종자는 클레코 비드 비터(Kleco Bead Beater)(Garcia Machine, Visalia, CA) 중의 2개의 스테인레스 강철 비드로 무수 종자를 열분해시켜 분석용으로 제조하였다. 추출 완충제를 첨가하고(50mM 트리스, 10 mM EDTA, 2% SDS), 시료 튜브를 30분 동안 완만하게 진동시켰다. 시료를 3000rcf에서 30분 동안 원심분리했다. 상청액을 수집하여 분석용으로 사용하였다. 종자 추출물 중의 전체 가용성 단백질의 양은 로리 분석(Lowry assay)(BioRad, Hercules, CA)으로 측정하였다. 시료는 1.55mg/ml 총 가용성 단백질로 표준화하고, 레인당 총 가용성 단백질 20㎍의 표준화 적재량에 대해 40mM DTT와 함께 LDS 시료 완충제(Invitrogen, Carlsbad, CA) 중에서 제조하였다. 시료를 3-8% 트리스 아세테이트 겔(Invitrogen, Carlsbad, CA) 중에서 전기영동시키고, 니트로셀룰로즈막으로 이동시켰다. 블롯을 블록킹 완충제로 블록킹하고, 상이한 PUFA 신타제 OrfA, OrfB 및 OrfC 폴리펩티드에 대해 항체로 탐침했다. 스키조키트리움 PUFA 신타제 아단위 A(SzPUFS-A)의 A2 영역에 대해 지시된 래빗 항-A2-A 및 스키조키트리움 PUFA 신타제 아단위 B(SzPUFS-B)의 B3 영역에 대해 지시된 래빗 항-B3-A를 사용하였다. 영역 B3은 에노일 리덕타제(ER) 영역이다. 아단위 C에 또한 ER 영역이 존재하고, 따라서 이 항혈청은 웨스턴 블롯 상에서 아단위 B 및 C 모두 인지한다. 항-래빗 형광성 표지된 2차 항체(염소 항-래빗 AF 633 (Invitrogen, Carlsbad, CA))를 검출용으로 사용하였다. 블롯을 타이푼 트리오 플러스 형광성 영상화기(Typhoon Trio Plus fluorescent imager)(GE Healthcare, New Brunswick NJ) 상에서 시각화하였다.
이벤트 5197[14]-032.002로부터 T1 종자를 개발하는 최후 단계(>30 DAP)로부터의 추출물의 SDS-PAGE 웨스턴 블롯은 OrfA, OrfB 및 OrfC 특이적 항혈청으로 탐침될 경우 적합한 크기에서 밴드를 나타냈다(도 6). 이러한 밴드들은 또한 쿠마시에 블루에 의한 직접 염색으로 제시될 수 있다. OrfA, OrfB 및 OrfC는 또한 DHA 생성 이벤트 5197[13]-010.001, 5197[21]-052.001, 5197[21]-053.001 및 5217[6]-065.002로부터 종자 시료에서 검출되었다.
DHA 생성 캐놀라 이벤트 5197[14]-032.002.Sx002로부터 (DAP) 수분 후 15, 20, 25, 30, 35, 및 42일에 수집된 개발 T2 종자 시료 세트를 지질 함량(도 7a) 및 웨스턴 블롯에 의한 OrfA, OrfB 및 OrfC 폴리펩티드의 존재(도 7b)에 대해 분석하였다.
3개의 폴리펩티드 모두의 발현은 수분작용 후 30일 및 35일에 개발 종자에서 검출되었고, 수분 후 42일에 및 성숙된 종자에서 현저하게 검출되었다(도 7a 및 도 7b).
실시예
8
T
2
캐놀라
종자에서
DHA
,
DPA
및
EPA
수준
이벤트 5197[14]-032.002로부터 T1 종자를 온실에 심고, 잎 시료를 DNA 분석을 위해 4 내지 5엽 단계에서 96개 식물로부터 취해 각 T1 분리체 식물에서 유전자변형의 카피 수를 측정했다. 이는 상기한 프로토콜을 사용하여 팻 유전자의 가수분해 프로브 분석으로 수행하고, 3개의 별개의 분리체 부류: 21개 동형접합성, 45개 이형접합성 및 30개 눌 식물을 동정했다. 모든 동형접합성 및 31개 눌 식물을 온실에서 성숙기까지 성장시키고, 종자를 수거했다. 동형접합성 및 눌 식물로부터 식물당 평균 T2 종자 수율은 각각 7.36gm 및 8.61gm이었다.
이벤트 5197[14]-032.002의 온실-성장된 T1 식물로부터 T2 종자의 장쇄 다중불포화 지방산(LC-PUFA) 함량은 상기한 바와 같이 GC-FAMA 분석에 의해 8 내지 12개 종자의 대량 추출로 측정했다. 동형접합성 식물의 LC-PUFA 함량은 도 8에 제시되어 있다. 어떠한 LC-PUFA도 임의의 눌 분리체의 종자에서 검출되지 않았다. 20개의 유전자변형 라인은 대량 종자 분석에서 0.28% 내지 0.90% DHA를 생산했고, 하나의 라인은 어떠한 LC-PUFA도 생산하지 못했다. 또한, DHA 함유 종자는 0.09 내지 0.34% DPA(n-6)을 생산했다. 총 PUFA(DHA+DPA) 중의 DHA의 평균 비율은 77%였다.
0.7% 초과의 DHA를 생산하는 4개 라인으로부터 종자의 지방산 조성은 4개 눌 분리체 라인의 조성과 비교하여 표 13에 제시되어 있다.
이들 동형접합성 T1 식물(4, 35, 63, 96, 50 및 106)의 6개 라인으로부터 48 T2 종자의 단일 종자 분석을 수행했다. GC-FAME 프로파일의 상세 분석은, 추가 피크가 DHA 및 DPA를 함유하는 종자에 일정하게 존재함을 나타냈다. 이는 인증 표준(NU-Chek)과 비교하여 C20:5(n-3) EPA로 동정되었다. 체류 시간은 인증 EPA(C20:5(n-3))의 것과 합치했고, PolarisQ에 의한 GC-MS로 측정한 공칭 분자량은 동일했다.
6개 라인으로부터 단일 T2 종자의 LC-PUFA의 요약은 도 9에 제시되어 있다. DHA 함량이 1.6% 이하인 단일 종자가 발견되었다. 또한, EPA 함량이 0.27%인 식물이 동정되었다.
상반 교잡을 2개의 T1 라인과 비형질전환 넥세라710 사이에서 수행했다. 수득된 모 종자 및 F1 하이브리드 종자를 DHA 함량에 대해 분석했다(도 10). 도 10에서, 다이아몬드는 X 축 상에 기재된 각 범주에 대한 평균을 나타낸다. 수직 막대는 당해 범주에 대한 평균을 나타내고, 다이아몬드 극단 사이의 거리는 95% 신뢰 구간이다. F1 종자(0.29% 및 0.28%)에서 평균 DHA 수준은 유전자변형 모 종자가 축적하는 것(0.51% 및 0.47%)의 절반이다. 표현형과 접합자성 수준의 정량적 상관은 이 결과로부터 추정될 수 있다.
요약하면, 이들 데이터는 5개 유전자변형에 의해 제공된 DHA 형질이 유전가능하고 2대(second generation)에서 유지됨을 나타낸다.
실시예
9
캐놀라
이벤트-10
T2
종자에서
DHA
생산
캐놀라 이벤트 5197[13]-010.001(도 11에 제시된 팻 유전자의 2 카피를 함유)로부터의 60개 T1 종자를 온실에 심었다. 팻 유전자의 가수분해 프로브 분석은 팻 유전자의 0 내지 4개 카피에 상응하는 분리체의 5개 독특한 부류를 동정했다.
유전자변형 삽입체에 상응하는 2개 유전자좌는 서던 블롯 분석(유전자좌 A 및 B를 나타냄)에 의해 구별될 수 있다. 2개의 팻 카피를 함유하는 모든 식물로부터의 DNA를 서던 블롯으로 분석하여 이들의 유전자형(유전자좌 A 또는 위치 B에 대해 동형접합성, 또는 두 위치에 대해 이형접합성)을 결정할 수 있다. 4개의 단일 카피 및 2개의 눌 대조군 식물을 대조군으로서 또한 분석했다. 종자를 수거하고, LC-PUFA 함량에 대해 대량 종자 분석으로 분석했다(표 14).
이들 데이터는 이벤트 5197[13]-010.001 유전자좌 A에서 동형접합성인 식물이 LC-PUFA의 생산을 유도하는 반면 유전자좌 B 동형접합체는 유도하지 않음을 나타낸다. 추가로, 유전자좌 B는 3-카피 식물이 생산하는 것과 같이 4-카피 이중 동형접합체가 매우 낮은 수준의 DHA를 생산하기 때문에 LC-PUFA를 간섭한다. 유사하게는, 이형접합성 단일-카피 유전자좌 A 식물은 0.47% LC-PUFA를 생산하는 반면, 이형접합성 단일-카피 유전자좌 B는 매우 낮은 수준의 LC-PUFA(0.02%)를 생산한다.
유전자좌 A(및 유전자좌 B의 경우 눌)에서 동형접합성인 이벤트 5197[13]-010.001로부터 유래된 식물로부터 대량 T2 종자의 GC-FAME 분석에 의해 측정된 완전 지방 조성은 표 15에 제시되어 있다.
실시예
10
캐놀라에서
DHA
의 필드 생산
최고 수준의 DHA를 함유하는 5197[14]-032.002의 10개 동형접합성 라인으로부터 T2 종자를 풀링하여 60gm의 종자를 수득했다. 종자는 또한 네거티브 대조군으로 사용하기 위한 47gm의 종자를 수득하기 위해 10개 눌 분리체 라인으로부터 풀링했다. 종자를, 각 구획에서 8개 플롯(plot)에 변형유전자 함유 종자, 6개 플롯에 눌 분리체 종자 및 2개 플롯에 시판 대조군(넥세라 845CL)와 함께, 2009년 5월에 노쓰 다코다(North Dakota)에서 2개 구획에 심었다. 모든 유전자변형 식물 플롯 및 4개의 눌 분리체 플롯은 개화 동안 격리 케이지로 덮었다. 나머지 2개 눌 플롯 및 넥세라 845CL 플롯은 덮지 않은 상태로 유지했다. 플롯을 감싸고, 표준 실시에 따라 9월에 수확했다. 부위 1에서, 플롯 평균 0.95kg의 종자를 유전자변형 식물 및 0.99kg을 눌 식물로부터 수득했다. 부위 2에서, 플롯 평균은 유전자변형 식물에서 0.64kg이었고, 눌 식물에서 0.73kg이었다. 각 플롯으로부터 종자의 GC-FAME를 수행하여 필드 성장 종자에서 LC-PUFA의 수준을 측정했다(표 16).
표 16의 결과는 각 플롯으로부터 3개 시료의 분석을 나타낸다. 플롯 1 내지 11로부터의 종자는 다른 부위 플롯(평균 76.7% 18:1 및 2.9% 18:3)과 비교하여 보다 낮은 수준의 18:1(65.5%) 및 보다 높은 수준의 18:3(7.6%)를 함유했고, 따라서 통상의 캐놀라로 광범위하게 오염된 것으로 간주되었다. 이 플롯은 후속 분석으로부터 배제했다. 부위 1로부터 유전자변형 식물로부터 T3 종자의 10개 종자 벌크 분석에 의한 평균 DHA 함량은 0.19%이었고, 부위 2로부터의 함량은 0.26%였다. 최고 DHA 함량은 0.38%(0.03% EPA와 함께). n-3 LC-PUFA/총 PUFA의 평균 비율(%)은 73%였다.
필드 시험에 사용된 각 T2 라인의 시료를 또한 온실에서 성장시켰다. T3 온실 종자의 10개 종자 벌크 분석에 의한 평균 DHA 함량은 0.22%였고, 각각의 식물은 0.8% 이하의 DHA를 가졌다. 이는 필드에서 생산된 DHA의 양과 상관된다.
이들 데이터는 당해 PUFA 신타제 유전자 쉬트가 필드 조건하에 DHA의 생산을 유도할 수 있음을 나타낸다.
실시예
11
마이크로어레이
기술을 사용한
DHA
유전자 발현 분석
캐놀라 종자의 발달을 수분 후 15, 20, 25, 30, 35 및 42일(DAP)에서 유전자변형 동형접합성 이벤트 5197[14]-032.002 라인 및 비형질전환된 눌 식물로부터 수집했다. 단색 구형 유전자 발현 프로파일링 설계를 사용하여, 종자 발달 동안 규정된 시점 각각에 대해 비형질전화된 눌 라인에 대한 동형접합성 형질전환 라인으로 새롭게 도입된 유전자 각각의 발현 수준을 측정했다. 개개 60-머 올리고 배열의 3개의 동일한 기술적 복사체(Agilent Technoligies Inc., Santa Clara, CA)를 각 시료로부터 증폭된, Cy3 표지된 cRNA와 하이브리드화시켰다. 통상의 설계된 (eArray, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) 60-머 포괄 전사체 전체의 캐놀라 올리고뉴클레오티드 배열을 사용하여 상기한 하이브리드화를 수행했다. 이러한 배열은 공중 데이터 공급원으로부터 수득한 37,000개 이상의 상이한 캐놀라 전사체(Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA)를 함유한다. 각 전사체의 발현 수준을 효율적으로 측정하기 위해, 당해 배열에 존재하는 올리고는 각 표적이 예상된 표적 서열과 효율적으로 하이브리드화하도록 독특하고 특이적으로 설계했다. 하나 이상의 전사체와 이중쇄를 형성하는 올리고는 당해 배열로부터 제거했다. 각 올리고는 또한 마이크로어레이 처리 전체에 걸쳐 최적 성능에 필요한 화학적 및 물리적 특성을 충족시킨다. 또한, 새롭게 도입된 유전자 뿐만 아니라 목적하는 몇몇 기타 유전자를 나타내는 특이적 및 독특한 올리고는 또한 통상의 설계된 캐놀라 올리고 배열에 제시되어 있다. 60-머 올리고는 제조업자로부터 슈어-프린트(Sure-Print) 기술을 사용하여 동일 반응계에서 합성했다.
RNA
분리 및 정제
이벤트 5197[14-032.002 및 눌 식물 대조군으로부터의 종자를 발달시키는 시료를 동결시키고, 풀링하여 RNA 분리 및 정제용 출발 물질로서 사용했다. 풀링된 시료당 종자 조직 총 500mg을 막자사발 및 공이를 사용하여 액체 질소와 함께 연마하고, 연마된 조직 약 50mg을 RNA 추출용 RNeasy 키트(Qiagen, Valencia, CA)로부터 추출 완충제 RLT 450㎕에 재현탁시켰다. 시료를 단시간 와동시켜 조직을 파쇄한 다음, 추출 프로토콜을 계속했다. 총 RNA는 RNA 추출용 RNeasy 키트(Qiagen, Valencia, CA)로부터의 지침에 따라 정제했다. 이어서, 정제된 총 RNA는 NanoQuant(TECAN, Research Triangle Park, NC) 분광계를 사용하여 정량하고, 표준 1% 아가로즈 겔 전기영동에 의해 가시화했다.
표지화를 위해, 각 시료로부터 정제된 총 RNA 총 1.0㎍을 역전사시키고, 증폭시키고, 아길런트(Agilent; Santa Clara, CA) 단색 마이크로어레이 기반 유전자 발현 QuickAmp 표지화 프로토콜에 따라 Cy3-CTP로 표지했다. 각 캐놀라 배열은 관리하의 1300개 이상의 내부 스파이크를 함유하기 때문에, 키트 내의 단색 RNA 스파이크(Agilent, Santa Clara, CA)는 또한 제조업자의 지침에 따라 표지했다. 시료는 MMLV 역전사효소를 사용하여 역전사시키고, T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 증폭시켰다. 증폭 후, cRNA는 Qiagen RNeasy 미니스핀 컬럼을 사용하여 정제하고, NanoQuant 분광계(TECAN, Research Triangle Park, NC)를 사용하여 정량했다. Cy3에 대한 특이적 활성은 하기 식에 의해 측정했다: (Cy3의 농도/(cRNA의 농도)*1000 = cRNA ㎍당 Cy3의 pmol. 하이브리드화를 위한 시료는 1.65 ㎍으로 표준화했고, 특이적 활성은 cRNA ㎍당 Cy3 9.0 pmol을 초과했다.
하이브리드화
, 스캐닝 및 특성 추출
올리고 유전자 발현 배열은 아길런트 테크놀로지(Santa Clara, CA) 유전자 발현 하이브리드화 키트 및 세정 완충제 키트를 사용하여 하이브리드화시켰다. 하이브리드화는 완전 자동화 TECAN HS4800 PRO(TECAN, Research Triangle Park, NC) 하이브리드화 스테이션에서 수행했다. 하이브리드화 혼합물을 65℃에서 주입하고, 17시간 동안 진탕과 함께 배양한 다음, 30초 동안 65℃에서 슬라이드 예비-하이브리드화 단계를 수행했다. 이어서, 슬라이드는 아길런트 GE 세정 #1을 사용하여 1분 동안 37℃에서 세정한 다음, 1분 동안 아길런트 GE 세정 #2로 30℃에서 2차 세정하고, 30℃에서 2분 30초 동안 질소 가스를 사용하여 최종 건조 단계를 수행했다. 슬라이드를 즉시 스캐닝하여, 시그널 강도에 대한 환경 산화물의 영향을 최소화했다.
배열은 SureScan 고해상도 기술(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)와 함께 아길런트 G2565CA 마이크로어레이 스캐너를 사용하여 스캐닝했다. 각 배열을 스캐닝하는 프로토콜은 염색 채널, 스캔 영역 및 해상도, TIFF 화일 동적 범위, PMT 게인 및 최종 이미지 결과용 설정에 대한 파라미터를 규정한다. 당해 배열이 스캐닝되면, 그리드 피트의 배치 및 최적화, 스폿의 발견, 분리체의 블래그, 배경 바이어스, 에러 및 비율의 연산 및 품질 조절 계량의 계산을 위해 규정된 파라미터를 사용하여 특성 추출(FE) 프로토콜을 수행했다. 스캐닝 및 특성 추출 프로토콜을 완료한 후, 품질 조절 계량 리포트 및 모든 원 데이터를 함유하는 최종 화일(TXT)와 함께 Cy3 이미지를 함유하는 TIFF 화일을 생성한다. 이미지 화일(TIFF)을 사용하여, 슬라이드의 일반 품질, 우측 위치(4개 코너)에서 관리하의 스파이크의 존재 및 강도를 검사하고 또한 하이브리드화, 세정, 스캐닝 및 특성 추출 고정이 성공적이었는지를 확인한다. FE 품질 관리(QC) 리포트는, 아길런트 테크놀로지스(Santa Clara, CA)에 의해 제공 및 설계된 포지티브 및 네거티브(원핵생물 유전자 및 인공 서열) 관리하 스파이크에 기반한 데이터의 분산을 허용하는 편차 계수의 값을 제공한다. 이 리포트는 또한 데이터 분포, 균일성, 배경, 재생능, 감도 및 데이터의 일반 품질에 대한 정보를 제공했다. 모든 원 데이터를 함유하는 TXT 파일(file)을 추가 분석을 위해 GeneSpring(Agilent, Santa Clara, CA)에 업로드했다.
데이터
표준화 및 통계학적 분석
스캐닝 및 특성 추출 후, 원 데이터 파일을 GeneSring GX 버젼 10.0.2(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)에 업로드하고, 각 배열 데이터 파일을 시료로서 한정하고 적절한 파라미터 값을 할당하는 프로젝트를 생성했다. 동일한 파라미터 값을 갖는 시료는 복사체로서 처리했다. 해석은 당해 시료가 실험 조건으로 어떻게 분리되고 데이터 가시화 및 분석에 어떻게 사용되었는지를 상술하기 위해 생성되었다. 상기 정의한 관리하 스파이크, 파라미터 및 해석에 기반한 시료에 대한 품질 관리는 분석 개시 전에 데이터의 품질을 보장하기 위해 수행했고, GeneSpring에 의한 품질 관리 계량 리포트를 생성했다.
데이터는 분류상 비생물학적 차이를 최소화하고 교차 비교용 배열을 표준화하기 위해 구형 백분위 이동 정규화 방법을 사용하여 표준화했다. 이러한 알고리즘은 시그널 강도를 밑이 2인 로그로 변환시키고, 이들을 증가하는 차수로 정렬하여, 75번째 백분위의 등급을 계산하고, 이 값을, 표준화 강도 값을 생성하는 로그 변환 시그널 강도 각각으로부터 뺐다. 데이터는 연구하의 모든 단일 시료에 존재로서 플래깅된(flagged) 속성을 선택하고 한계 또는 부재로서 플래깅된 속성을 제거하여 여과했다. 속성의 여과된 및 표준화된 리스트는 이원 ANOVA 방법을 사용하여 통계학적 분석용 투입으로 사용되었고, 여기서 p <0.05의 보정된 p-값 컷오프는 DAP 및 유전자형을 파라미터로서 한정한다. 새롭게 도입된 유전자 각각에 대한 발현 프로파일을 측정했다.
결과
표지된 및 증폭된 cRNA 뿐만 아니라 총 RNA의 농도에 대해 수득된 값은 최적이었다. 또한, 증폭후 농도에 대한 값, Cy3에 의한 표지 효율 및 일정한 및 신뢰가능한 결과에 필요한 특이적 활성은 우수했다. 스캐닝후 각 개개 배열에 대한 특성 추출 프로토콜에 의해 제공된 품질 관리(QC) 리포트는, 포지티브 및 네거티브 관리하 스파이크에 기반한 데이터의 분산을 측정하는데 사용된 편차 계수 값을 제공했다. 리포트로부터 수득된 모든 값은 데이터 분포, 균일성, 배경 및 감소의 최적 품질을 나타냈다. 이 연구 동안 사용된 시료에 대한 GeneSpring(Agilent Technologies, Santa Clara, CA) 품질 관리 계량 리포트는, 수득된 데이터의 재현성 및 신뢰성의 평가를 보조하는 유의적인 통계학적 값을 제공했다. 기술적으로 복사된 배열 그룹(시료당 3개)에 대한 보고된 값은 소정 범위내였고, 수득된 데이터가 신뢰가능함을 나타냈다(데이터는 도시하지 않음).
동형접합성(표 17)("DAP"는 수분 후 일수를 나타낸다) 및 눌(표 18) 라인에 대한 종자 발달 동안 한정된 6개 시점 각각에 대해 보고된 원 값은, 필요한 경우, 배경 뺄셈 및 곱셈 탈경향을 포함하여, 모든 특성 추출(FE) 처리 단계가 완료된 후에 잔류한 시그널 강도 값을 나타낸다. 한편, 동형접합성(표 19) 및 눌(표 20) 라인에 대한 표준화 값은, 기술적 편차를 설명하고 분류법상 비생물학적 차이를 최소화하고 교차 비교용 배열을 표준화하는 범용 백분위 이동 표준화 방법을 사용하여 처리했다.
종자 발달 동안 모든 시점에서 원 라인에 대해 수득된 표준화 값(도 12) 및 눌 라인에 대해 수득된 표준화(표 13) 값의 도식적 표시는, 이들 유전자가 오메가-9 넥세라 710 비형질전환된 라인에 존재하지 않고 따라서 현저한 발현이 검출되지 않음을 확증한다. 도 14(원) 및 도 15(표준화)에 제시된 이벤트 5197[14]-032.002 라인에서, 종자 발달이 진행됨에 따라 모든 유전자의 전사 축적을 증가시키는 일반적 경향을 관찰할 수 있다. 전사 축적의 초기 현저한 증가는 15 및 30 DAP 동안 발생하고, DAP 42에서 최대 수준에 도달한다. 도 14에 제시된 원 곡선은 당해 연구하에 유전자 각각에 대해 수득된 상대 하이브리드화 강도 값의 가시화를 제공하고, 도 15에 요약된 표준화 곡선은 최소화된 분류학상 비생물학적 변이 및 표준화 비교 교차 배열을 갖는 유전자 발현 프로파일의 일반 경향을 나타낸다.
실시예
12
대체 프로모터를 사용한 조류
PUFA
신타제
유전자 쉬트(
Suite
)
PUFA 신타제 OrfA, PUFA 신타제 OrfB, PUFA 신타제 키메라 OrfC, 아실-CoA 신세타제 및 4' 포스포판토테이닐 트랜스퍼라제 HetI 단백질을 코딩하는 유전자(들)를 발현시키기 위한 추가의 전사 조절 요소의 사용은 캐놀라에서 DHA 함량을 추가로 증가시킬 수 있다. 발달시에 조기에 및 연장된 시간 동안 발현하는 전사 조절 요소의 동정 및 사용은 종자 발달의 초기 단계(예: 15 내지 25 DAP)에서 이종성 유전자의 전사를 촉진시킴으로써 캐놀라에서 DHA 수준을 증가시킬 수 있고 따라서 DHA 생산 시간을 연장시킬 수 있다. 이러한 전사 조절 영역의 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, LfKCS3 프로모터(미국 특허 제7,253,337호) 및 FAE 1 프로모터(미국 특허 제6,784,342호) 및 ACP 프로모터(WO 1992/18634)를 포함한다. 이들 프로모터는 단독으로 또는 조합 사용되어, 하기 플라스미드에서 이미 기재된 PUFA 신타제 OrfA, PUFA 신타제 OrfB, PUFA 신타제 키메라 OrfC, 아실-CoA 신세타제 및 4' 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 HetI 발현 카세트의 발현을 유도한다; pDAB7361, pDAB7362, 및 pDAB7363. 플라스미드 내의 전사 조절 영역을 치환하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들면, PvDlec2 프로모터 v2를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 pDAB7361, pDAB7362 또는 pDAB7363(또는 선행 플라스미드는 pDAB7361, pDAB7362 또는 pDAB7363을 구성하기 위해 사용되었다)로부터 제거되고, LfKCS3 또는 FAE 1 프로모터 영역으로 대체되었다. 새롭게 작제된 플라스미드를 사용하여 캐놀라 식물을 안정하게 형질전환시킨다. 유전자변형 캐놀라 식물을 분리하고, 분자적으로 특성화한다. 수득된 LC-PUFA 축적을 측정하고, 0.01% 내지 15% DHA 또는 0.01% 내지 10% EPA를 생산하는 캐놀라 식물이 동정되었다.
pDAB9166
의
작제
pDAB9166 플라스미드(도 26; 서열번호: 46)은 다중-부위 게이트웨이 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다. pDAB9166은 3개의 PUFA 신타제 PTU, 1개의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 LfKCS3 프로모터 v1, SzPUFA OrfA v3 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 LfKCS3 프로모터 v1, SzPUFA OrfB v3 및 AtuOrf23 3' UTR v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 LfKCS3 프로모터 v1, hSzThPUFA OrfC v3 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 LfKCS3 프로모터 v1, NoHetI v3 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB9161, pDAB9162, pDAB9163, pDAB101484 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB9166을 형성했다. 구체적으로, 상기한 4개 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3였다. pDAB7333는 또한, 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 5개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
pDAB9167
의
작제
pDAB9167 플라스미드(도 27; 서열번호 47)은 다중-부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다. pDAB9167는 3개의 PUFA 신타제 PTU, 1개의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 LfKCS3 프로모터 v1, SzPUFA OrfA v3 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 BoACP 프로모터 v1, BoACP 5' UTR v1, SzPUFA OrfB v3 및 AtuOrf23 3' UTR v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 LfKCS3 프로모터 v1, hSzThPUFA OrfC v3 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 BoACP 프로모터 v1, BoACP 5' UTR v1, NoHetI v3 및 AtuORF23 3' UTR v1를 함유한다.
플라스미드 pDAB9161, pDAB9165, pDAB9163, pDAB101485 및 pDAB7333를 재조합하여 pDAB9167를 형성했다. 구체적으로, 상기한 4개 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3였다. pDAB7333는 또한, 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 5개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
pDAB7379
의
작제
pDAB7379는 재구성된, 코돈 최적화된 버젼의 SzPUFA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPUFA OrfC 및 NoHetI을 함유하도록 작제한 이원 플라스미드이다. SzACS-2 유전자 서열은 이 작제물에 포함되지 않는다. pDAB7379 플라스미드(도 28; 서열번호 48)은 다중-부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다.
pDAB7379는 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 및 AtuORF23 3' UTR v1를 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 및 AtuORF23 3' UTR v1를 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, NoHetI v3 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB7371, pDAB7372, pDAB7373, pDAB7374 및 pDAB7333를 재조합하여 pDAB7379를 형성했다. 구체적으로, 상기한 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3이었다. pDAB7333은 또한, 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 5개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
pDAB7380
의
작제
pDAB7380은 재구성된, 코돈 최적화 버젼의 SzPUFA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPUFA OrfC 및 NoHetI을 함유하도록 작제한 이원 플라스미드이다. SzACS-2 유전자 서열은 이 작제물에 함유되지 않는다. 이 작제물에 사용된 파세올린의 버젼은 문헌[참조: Bustos et al ., 1989 (The Plant Cell, Vol. 1; 839-853)]에 기재된 바와 같이 실질적으로 변형시켰고, 여기서 프로모터의 5' 부분은 절단되었고, 파세올린 5' 비해독된 영역은 완전하게 잔류했다. pDAB7380 플라스미드(도 29; 서열번호 49)는 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다.
pDAB7380은 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v4, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 및 AtuORF23 3' UTR v1를 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v4, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v4, PvPhas 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvPhas 프로모터 v5, PvPhas 5' UTR, NoHetI v3 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB7375, pDAB7376, pDAB7377, pDAB7378 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB7380을 형성했다. 구체적으로, 상기한 4개 PTU는, 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3이었다. pDAB7333는 또한, 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 5개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 5개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
pDAB9323
의
작제
pDAB9323은 천연, 비코돈 최적화된 버젼의 SzPUFA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPUFA OrfC, SzACS-2 및 NoHetI을 함유하도록 작제한 이원 플라스미드이다. pDAB9323 플라스미드(도 30; 서열번호 50)은 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다.
pDAB9323은 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 아실-CoA 신세타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfA v2, PvPhas 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)를 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfB v2, PvPhas 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)를 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfC v2, PvPhas 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)을 함유한다. 아실-CoA 신세타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, SzACS-2 v2 유전자, PvPhas 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, NoHetI v2, PvPhas 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)을 함유한다.
플라스미드 pDAB9307, pDAB9311, pDAB9315, pDAB9322 민 pDAB7333을 재조합하여 pDAB9323을 형성했다. 구체적으로, 상기한 5개의 PTU는, 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v2, SzPUFA OrfB v2, SzPUFA OrfC v2, NoHetI v2이었다. pDAB7333는 또한, 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 6개 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 6개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
pDAB9330
의
작제
pDAB9330은 재구성된, 코돈 최적화된 버젼의 SzPUFA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPUFA OrfC, SzACS-2 및 NoHetI을 함유하도록 작제한 이원 플라스미드이다. pDAB9330 플라스미드(도 31; 서열번호 51)은 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다. pDAB9330은 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 아실-CoA 신세타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfA v3, PvPhas 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)를 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfB v3, PvPhas 3' UTR 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)를 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3, PvPhas 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)를 함유한다. 아실-CoA 신세타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, SzACS-2 v3 유전자, PvPhas 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)를 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, NoHetI v3, PvPhas 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)를 함유한다.
플라스미드 pDAB9324, pDAB9325, pDAB9326, pDAB9329 및 pDAB7333를 재조합하여 pDAB9330를 형성했다. 구체적으로, 상기한 5개 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzACS-2 v3, NoHetI v3이었다. pDAB7333은 또한, 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 6개 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 6개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
pDAB9337
의
작제
pDAB9337는, 이의 발현이 파세올린 프로모터에 의해 유도되는, 재구성된, 코돈 최적화된 버젼의 SzPUFA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPUFA OrfC 및 NoHetI을 함유하도록 작제한 이원 플라스미드이다. pDAB9337 플라스미드(도 32; 서열번호 52)는 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다.
pDAB9337은 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfA v3, PvPhas 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)를 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfB v3, PvPhas 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)를 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3, PvPhas 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)를 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, NoHetI v3, PvPhas 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)를 함유한다.
플라스미드 pDAB9324, pDAB9325, pDAB9326, pDAB9328 및 pDAB7333를 재조합하여 pDAB9337을 형성한다. 구체적으로, 상기한 4개 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3이다. pDAB7333는 또한, 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 5개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
pDAB9338
의
작제
pDAB9338은 재구성된, 코돈 최적화된 버젼의 SzPUFA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPUFA OrfC 및 NoHetI을 함유하도록 작제한 이원 플라스미드이다. 파세올린 프로모터를 사용하여 SzPUFA OrfA의 발현을 유도하고, PvDlec2 프로모터를 사용하여 기타 변형유전자를 유도한다. pDAB9338 플라스미드(도 33; 서열번호 53)는 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다.
pDAB9338은 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfA v3, PvPhas 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)를 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1를 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, NoHetI v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB9324, pDAB7335, pDAB7336, pDAB7338 및 pDAB7333를 재조합하여 pDAB9338을 형성했다. 구체적으로, 상기한 4개 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3이다. pDAB7333는 또한, 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 5개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
pDAB9344
의
작제
pDAB9344는, 모두가 코딩 서열의 아미노 말단에 융합되는 리불로스 비스포스페이트 소형 쇄 1A(SSU-TP v1으로 표지됨)를 함유하는, 재구성된, 코돈 최적화된 버젼의 SzPUFA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPUFA OrfC 및 NoHetI을 함유하도록 작제한 이원 플라스미드이다. 파세올린 프로모터를 사용하여 SzPUFA OrfA의 발현을 유도하고, PvDlec2 프로모터를 사용하여 기타 변형유전자를 유도한다.
pDAB9344 플라스미드(도 34; 서열번호 54)는 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다. pDAB9344는 3개 PUFA 신타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfA v4, PvPhas 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)를 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfB v4, PvPhas 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)를 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v4, PvPhas 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)를 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, NoHetI v4, PvPhas 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)을 함유한다.
플라스미드 pDAB9343, pDAB9342, pDAB9340, pDAB9331 및 pDAB7333를 재조합하여 pDAB9344를 형성했다. 구체적으로, 상기한 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v4, SzPUFA OrfB v4, hSzThPUFA OrfC v4, NoHetI v4이다. pDAB7333는 또한, 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 6개 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 5개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
pDAB9396
의
작제
pDAB9396은 재구성된, 코돈 최적화된 버젼의 SzPUFA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPUFA OrfC, SzACS-2 및 NoHetI을 함유하도록 작제한 이원 플라스미드이다. 파세올린 프로모터를 사용하여 SzPUFA OrfA 및 SzPUFA OrfB의 발현을 유도한다. PvDlec2 프로모터를 사용하여 다른 변형유전자: hSzThPUFA OrfC, SzACS-2 및 NoHetI을 유도한다.
pDAB9396 플라스미드(도 35; 서열번호 55)는 다중 부위 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다. pDAB9396은 3개 PUFA 신타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfA v3, PvPhas 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)를 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1를 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 아실-CoA 신세타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, SzACS-2 v3 유전자, PvPhas 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)를 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, NoHetI v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB9324, pDAB7335, pDAB7336, pDAB7339 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB9338을 형성했다. 구체적으로, 상기한 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB733의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzACS-2 v3, NoHetI v3이다. pDAB7333은 또한, 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 6개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
pDAB101412
의
작제
pDAB101412는 재구성된, 코돈 최적화된 버젼의 SzPUFA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPUFA OrfC, SzACS-2 및 NoHetI을 함유하도록 작제한 이원 플라스미드이다. 이 작제물에 사용된 파세올린 프로모터의 버젼은 문헌[참조: Bustos et al ., 1989 (The Plant Cell, Vol. 1; 839-853)]에 기재된 바와 같이 실질적으로 변형시켰고, 여기서 프로모터의 5' 부분은 절단되었고, 파세올린 5' 비해독된 영역은 완전하게 잔류했다. 절단된 파세올린 프로모터 서열은 본원 전반에 걸쳐 버젼 4(v4), 버젼 5(v5) 및 버젼 6(v6)으로 동정되었다. pDAB101412 플라스미드(도 36; 서열번호 56)은 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다.
pDAB101412는 3개 PUFA 신타제 PTU, 하나의 아실-CoA 신세타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v4, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v4, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v4, PvPhas 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다. 아실-CoA 신세타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v4, PvPhas 5' UTR, 2S 5' UTR, SzACS-2 v3 유전자 및 AtuORF23 5' UTR v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvPhas 프로모터 v5, PvPhas 5' UTR, NoHetI v3 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB7375, pDAB7376, pDAB7377, pDAB7398 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB101412를 형성했다. 구체적으로, 상기한 5개 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzACS-2 v3, NoHetI v3이다. pDAB7333는 또한, 기타 조절 요소, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 6개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
종자 발달에서 조기에 발현시키는 프로모터를 사용한
캐놀라
형질전환
플라스미드를 사용하여, 상기한 프로토콜을 사용하여 캐놀라 식물을 안정하게 형질전환시킨다. 유전자변형 캐놀라 식물을 분리하고, 분자적으로 특성화한다. 대체 작제물의 사용은 보다 많은 양의 DHA 및 LC-PUFA를 함유하는 캐놀라 식물을 생성한다. 수득된 LC-PUFA 축적을 측정하고, 0.01% 내지 15% DHA 또는 0.01% 내지 15% LC-PUFA를 생산하는 캐놀라 식물을 동정한다.
실시예
13
캐놀라에서
조류
PUFA
신타제
유전자
쉬트에
의한
DGAT2
또는
ACCase
의 공-발현
캐놀라 식물 내의 오일 함량은 아세틸 CoA 카복실라제(ACCase) 또는 타입 2 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(DGAT2)를 코딩 및 발현시키는 키메라 DNA 분자의 형질전환에 의해 추가로 변형시킨다. 이들 유전자는, PUFA 신타제 유전자를 함유하는 캐놀라 식물로 ACCase 또는 DGAT2 발현 카세트를 함유하는 캐놀라 식물을 육종하거나 ACCase 또는 DGAT2 및 PUFA 신타제 유전자를 함유하는 유전자 스택(stack)으로 캐놀라 식물을 형질전환시킴으로써, 상기한 조류 PUFA 신타제 유전자로 공-발현시킨다. ACCase 또는 DGAT2 코딩 서열의 발현에 필요한 조절 요소는 상기한 것들을 포함할 수 있다. 당해 기술분야에 공지된 추가의 조절 요소 발현 서열을 또한 사용할 수 있다. ACCase 및 DGAT2 발현 카세트는 상기한 형질전환 프로토콜을 사용하여 캐놀라로 형질전환시킨다. 형질전환은 PUFA 신타제 OrfA, PUFA 신타제 OrfB, PUFA 신타제 OrfC, 아실-CoA 신세타제 및 4' 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 HetI 발현 카세트와 조합된 ACCase 또는 DGAT2 발현 카세트의 분자 스택으로서; 또는 선택가능한 마커에 연결된 다음, PUFA 신타제 OrfA, PUFA 신타제 OrfB, PUFA 신타제 OrfC, 아실-CoA 신세타제 및 4' 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 HetI 발현 카세트를 함유하는 캐놀라 식물과 가교된 독립적 ACCase 또는 DGAT2 발현 카세트로서 발생할 수 있다. 포지티브 형질전환체를 분리하고, 분자적으로 특성화한다. 비형질전환된 대조군 캐놀라 식물과 비교하여, 식물, 식물 종자 또는 식물 오일 농축물에서 LC-PUFA의 증가된 축적을 함유하는 캐놀라 식물을 동정한다. 이러한 증가는 1.2배 내지 20배 증가 범위일 수 있다.
세포질에서 ACCase의 과발현은 보다 높은 수준의 말로닐-CoA를 생산할 수 있다. 증가된 수준의 세포질 말로닐-CoA를 함유하는 캐놀라 식물 또는 종자는, 조류 PUFA 신타제 유전자가 존재하여 발현되는 경우, 후속적으로 보다 높은 수준의 장쇄 다중불포화 지방산(LC-PUFA)를 생산할 수 있다. 캐놀라 식물 내에서 발현되는 DGAT2 유전자는 상당량의 도코사헥사엔산(DHA) 및 에이코사펜타엔산(EPA)을 트리아실글리세롤 내로 우선적으로 도입할 수 있다. LC-PUFA에 대해 기질 선호를 갖는 DGAT2 유전자(예: WO 2009/085169)는 이들 지방산의 트리아실글리세롤(TAG) 내로의 도입을 증가시킬 수 있다. 이러한 DGAT 유전자는 LC-PUFA, 특히 DHA의 TAG 내로의 도입을 유도하고 식물 및 기타 생물체에서 TAG의 생산을 증가시키는데 유용하다.
실시예
14
식물에서 보다
높은 수준의 아실-
CoA
신세타제
발현을 위한 천연 아실-
CoA
신세타제 유전자 서열의 사용
스키조키트리움 종으로부터 대체 버젼의 아실-CoA 신세타제 유전자는 천연 유전자 서열을 변형시켜 과잉 개방 판독 프레임을 제거함으로써 생성했다. 이러한 버젼은 "SzACS-2 v4"로서 표지하고, 서열번호 34로서 수록했다. 당해 서열은 서비스 제공자, DNA 2.0(Menlo Park, CA)에 의해 합성했다. 코딩 서열은 프로모터 및 3' 비해독된 영역을 함유하는 식물 발현 카세트 내로 도입했고, 이는 이들 실시예에 기재되었다. 수득된 발현 카세트를 사용하여, "SzACS-2 v3", 서열번호 9로서 상기한 아실-CoA 신세타제 발현 카세트를 대체하고, 이를 PUFA 신타제 OrfA, PUFA 신타제 OrfB, PUFA 신타제 키메라 OrfC 및 4' 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 HetI 발현 카세트와 조합하여 pDAB7361, pDAB7362 및 pDAB7363을 작제했다. "SzACS-2 v4" 발현 카세트를 함유하는 새로운 플라스미드는 독특한 동정 표지를 제공했다. 새롭게 작제한 플라스미드를 사용하여 캐놀라 식물을 안정하게 형질전환시킬 수 있다. 유전자변형 캐놀라 식물을 분리하고, 분자적으로 특성화한다. 대체 버젼의 유전자, "SzACS-2 v4"는 보다 많은 양의 DHA 및 LC-PUFA를 함유하는 캐놀라 식물을 생성할 수 있다. 수득된 LC-PUFA 축적을 측정하고, 0.01% 내지 15% DHA 또는 0.01% 내지 10% EPA를 생산하는 캐놀라 식물을 동정한다.
실시예
15
성숙 유전자변형
캐놀라
종자에서
PUFA
신타제
활성
PUFA 신타제 활성은 아그로박테리움 벡터 pDAB 7361(이벤트 5197[14]-032)을 사용하여 생성한 식물로부터 성숙 T1 유전자변형 캐놀라 종자로부터의 추출물에서 검출되었다. 종자를 물에 3 내지 4시간 동안 침지시킨 다음, 종자 피막을 제거하고 추출 완충제(200 mM 포스페이트 pH 7.0, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 5% 글리세롤, 1% PVPP, 0.52 ㎍/mL 항단백독, 0.58 ㎍/mL 류펩틴, 0.83 ㎍/mL 펩스타틴 A, 12 ㎍/mL TLCK, 12 ㎍/mL TPCK, 및 6 ㎍/mL 대두 트립신 억제제)에서 드라이 아이스 상에서 연마하고, 4℃에서 10분 동안 원심분리했다. 지방 패드를 제거하고, 생성 펠렛을 보다 높은 이온 강도 완충제와 함께 배양한 다음, 재원심분리했다. 지방 패드 및 지질 층을 시료로부터 제거하고, 수성 상청액을, 50 mM 포스페이트 pH 7.2, 1 mM DTT, 10% 글리세롤 및 1 mM EDTA로 예비 평형된 제바 탈염 칼럼을 통해 통과시켰다. 비형질전환된 넥세라 710 종자를 네거티브 대조군으로서 나란히 처리했다. 두 종자 세트로부터의 시료는 HIP 추출 및 문헌[참조: Metz et al., Plant Physiol. Biochem . 47:6 (2009)]에 기재된 TLC 방법을 사용하여 분석했다(도 16). 분석 조건을 변형시켜, 2 mM NADH, NADH 재생 시스템(글루코즈 + 글루코즈 데하이드로게나제), 연속 진탕 및 최종 말로닐-CoA 농도의 100 μM(분석당 0.064 μCi/100μL)를 포함한다. 생성 상청액의 분석은 용적으로 표준화했고, FFA 제형은 60분 후에 검출될 수 있음을 나타냈다. 이는 넥세라 710 대조군에서 관찰되지 않았고, FFA 제형은 PUFA 신타제에 의해 DHA 제형으로부터 유래했음을 나타낸다.
실시예
16
공-발현된
HetI
에 의해
캐놀라에서
생산된
OrfA
의
판테테이닐화
OrfA는 9개 아실-캐리어 단백질 도메인을 함유하고, 이는 작용성이 되도록 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제(PPTase)에 의해 포스포판테테인 그룹을 사용한 유도체화를 각각 필요로 한다. 유전자변형 캐놀라 종자에서 PPTase HetI에 의한 OrfA의 판테테이닐화 정도는 다양한 OrfA 시료로부터 판테테이닐화 부위를 함유하는 트립신 펩티드의 나노-액체 크로마토그래피-질량 분광학(나노LC-MS) 평가에 의해 평가했다.
재조합 홀로 및 아포 OrfA 폴리펩티드 표준은 HetI의 존재 또는 부재하에 공-발현에 의해 이. 콜라이에서 생산했다. HetI의 부재하에 OrfA의 발현은 비-작용성 단백질을 생성하는데, 이는 이. 콜라이로부터의 내인성 PPTase가 포스포판테테인 그룹을 부가할 수 없기 때문이다[참조: Hauvermale et al., Lipids 41:739-747; 2006]. 대조적으로, HetI에 의한 발현은 고도의 판테테이닐화를 갖는 OrfA 단백질을 제공한다. 이. 콜라이 발현된 OrfA를 추출하기 위해, 재조합 세포 배양물 0.5L로부터의 동결된 세포를 20 mL의 추출 완충제: 20 mM 트리스 pH 7.0, 1 mg/mL 리소자임, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 0.52 ㎍/mL 항단백독, 0.58 ㎍/mL 류펩틴, 0.83 ㎍/mL 펩스타틴 A, 12 ㎍/mL TLCK, 12 ㎍/mL TPCK, 6 ㎍/mL 대두 트립신 억제제에서 재현탁시켰다. 용해 후, 추출물은 DNase 및 4 mM MgCl2로 처리하고, 원심분리에 의해 정화하고, 상청액을 -80℃에서 동결시켰다.
식물 생산된 OrfA는 캐놀라 생산된 PUFA 신타제의 시험관내 분석을 위해 상기한 추출 방법을 사용하여 이벤트 5197[14]-032.002의 재수화된 성숙 캐놀라 종자로부터 분리했다. 이. 콜라이 표준 및 캐놀라 시료 둘 다로부터의 OrfA 단백질을 효소에 의해 소화시키고, 아길런트 QTOF 질량 분광계(모델 6530)에 의한 MS 분석과 함께 아길런트 칩큐브 나노크로마토그래피 유입을 사용하여 나노LC-MS에 의해 분석했다. QTOF를 프로그래밍하여 자동화 MS2 분석을 사용하여 크로마토그래피 동안 펩티드 서열 데이터를 생성했다. 당해 방법의 필수 특징은, 질량 분광계를 프로그래밍하여 전체-스캔 MS 스캔을 수행한 다음 3개의 가장 풍부한 이온의 자동화 MS2를 사용하여 MS2 서열 스펙트럼을 생성하는 것이다. 이온은 후속적으로 2회 발생 후에 MS2로부터 30초의 배제 기간 동안 배제했다. 내부 기준은 나노분무 동안 연속적으로 주입하여 QTOF의 내부 교정에 대한 기준 이온을 생성했다(m/z 299.29446 및 1221.99064에서). 보정 스톡의 이월로부터 통상 발견된 이온은 배제된 이온으로서 규정하여, 이들 이온의 허수 MS2 스캔을 방지했다. MS 스캔은 m/z 295-2400의 범위에 걸쳐 이월했다. MS2 스캔은 m/z 59-3000의 범위에 걸쳐 이월했다. 자동화 MS2를 수행하여 하기 순서로 하전 상태에 대한 선호를 제공했다: +2 > +3 > (> +3) > 미공지 > +1.
직렬 질량 스펙트럼은 마스코트 증류기(Matrix Science, London UK; 버젼 2.3.2)에 의해 추출했다. 하전 상태 디컨볼루션 및 탈동위체화는 수행하지 않았다. 모든 MS/MS 스펙트럼은 마스코트(Matrix Science, London, UK; 버젼 2.2.06) 및 X! 탄뎀(Tandem)(www.thegpm.org; 버젼 2007.01.01.1)을 사용하여 분석했다. 마스코트 및 X! 탄뎀은 트립신 소화 특이성을 가정하는 OrfA 단백질의 전체 서열을 함유하는 단백질 서열 데이터베이스를 검색하도록 설정했다. 마스코트 및 X! 탄뎀은 0.30 Da의 단편 이온 질량 내성 및 10.0 ppm의 모 이온 내성으로 검색했다. 메티오닌의 산화 및 세린의 포스포판테테인은 가변 변형태로서 마스코트 및 X! 탄뎀에서 상술되었다.
스캐폴드(버젼 Scaffold_2_05_02, Proteome Software Inc., Portland, OR)를 사용하여, MS/MS 기반 펩티드 및 단백질 동정을 확증했다. 펩티드 동정은, 이들이 펩티드 프로펫 알고리즘에 의해 상세된 바와 같이 85.0% 초과의 가능성에서 확립되는 경우에 수용되었다[참조: Keller et al., Anal . Chem. 74:5383-92 (2002)]. 단백질 동정은, 이들이 99.0% 이상의 가능성에서 확립되고 적어도 2개의 동정된 펩티드를 함유하는 경우에 수용되었다. 단백질 가능성은 프로테인 프로펫 알고리즘에 의해 지정되었다[참조: Nesvizhskii, Anal Chem. 75:4646-58 (2003)]. 유사한 펩티드를 함유하고 MS/MS 분석 단독에 기반하여 차별화될 수 없는 단백질은 최절약 원리를 충족시키도록 분류되었다. 데이터베이스 검색은 판테테이닐화 부위 1(서열번호 78 TGYETDMIEADMELETELGIDSIK) 및 판테테이닐화 부위 2-9(서열번호 77 TGYETDMIESDMELETELGIDSIK)의 아포(apo) 형태에 상응하는 트립신 펩티드를 동정했다. 판테테이닐화된 펩티드에 대한 직접 증거는 관찰되지 않았다.
캐놀라로부터 분리된 OrfA에서 부위 2-9의 판테테이닐화 정도를 평가하기 위해, 아포2-9 펩티드 양을 OrfA 분자의 다른 영역으로부터 동정된 6개의 상이한 기준 펩티드와 비교하여 측정했다(표 21).
이. 콜라이 유도된 단백질(HetI 부재)에서 기준 펩티드에 대한 아포2-9 펩티드의 내부 비율은 비판테테이닐화의 평가치로서 취했고, HetI으로 발현된 이. 콜라이 유도된 단백질에서 내부 비율은 고도의 판테테이닐화의 평가치로서 취했다. 이들 내부 비율은 기준 펩티드의 몰 풍부함이 OrfA 단백질 공급원에 상관없이 동등함을 가정한다(도 17). 6개 기준 펩티드 각각에 대한 아포2-9 펩티드의 비율을 계산하고 평균했다. (3개 비율은 6개 기준 펩티드에 대해 계산되었다). 또한, 서로에 대한 6개 기준 펩티드의 3개 비율을 계산(ref1/ref2, ref3/ref4 및 ref5/ref6)하여, 기준 펩티드가 3개 OrfA 시료 사이에 유의적으로 상이하지 않고(도 17) 존재하는 아포2-9 펩티드의 상대량을 계산하는데 적합할 수 있음을 입증했다.
기준 펩티드에 대한 계산된 비율과 대조적으로, 기준 펩티드 각각에 대한 아포2-9의 비율은, HetI의 부재하에 OrfA 표준과 비교하여, OrfA/HetI 및 캐놀라 시료 둘 다에서 아포2-9 펩티드의 수준이 현저히 낮았음을 나타냈다(도 18). 이들 결과의 가장 간단한 설명은 아포2-9 펩티드에 대한 판테테이닐화 부위가 포스포판테테이닐 그룹에 의해 실질적으로 점유되고, 이에 의해 아포2-9 펩티드의 몰 풍부함을 현저히 감소시킨다는 것이다. 이는 캐놀라 발현된 PPTase, HetI이 유전자변형 캐놀라 종자에서 OrfA를 작용적으로 활성화시킬 수 있고, 캐놀라 발현된 OrfA ACP 단위가 작용적으로 활성적임을 나타낸다.
실시예
17
추가
작제물
조절 요소의 복제를 감소시키기 위한 프로모터 다양성의 도입
유전자 침묵은 유전자변형 캐놀라 이벤트의 후대에서 관찰된 현상이다. 몇몇 조사 문헌은 문헌[참조: Waterhouse et al ., 2001 (Nature 411:834-842), Vaucheret and Fagard, 2001 (Trends in Genetics 17(1):29-35, and Okamoto and Hirochika, 2001 (Trends in Plant Sci. 6 (11): 527-534]의 것과 같은 전사 유전자 침묵(TGS) 및 전사후 유전자 침묵(PTGS)를 언급한다. 식물에서, 유전자 침묵은 변형유전자 폴리뉴클레오티드 서열의 복제(탠덤 반복 변형유전자 서열, 전환 반복 변형유전자 서열, 또는 염색체 내로의 다중 삽입)에 의해, 또는 표적 유전자 사열에 상동성인 서열이 감염 식물 바이러스 또는 아그로박테리움 투멘파시엔스의 T-DNA에 의해 운반되는 경우에 유발될 수 있다.
또한, 변형유전자 폴리뉴클레오티드 서열의 복제는 작제물 불안정성에 대한 유발원으로서 작용할 수 있다. 고도의 서열 유사성을 공유하는 다중 변형유전자 서열은 서로 다시 중첩할 수 있다. 재배열은 상동성 재조합을 통해 발생할 수 있고, 여기서 DNA의 간섭 서열은 분해된다. 그 결과, 반복된 변형유전자 폴리뉴클레오티드 서열 사이에 위치된 DNA의 단편이 분해된다.
플라스미드 벡터를 설계하는데 있어서 한 가지 전략은, 각 변형유전자의 고도 발현을 유도하는 다중, 독특한 종자 특이적 프로모터를 도입함으로써 작제물 내로 프로모터 다양성을 도입하는 것이다. 플라스미드 벡터 내로 프로모터 서열 다양성의 도입은 유전자 침묵을 감소시키고 플라스미드 안정성을 개선시킬 수 있다. 다중 종자 특이적 프로모터는 PvDlec2, 파세올린 및 Napin(미국 특허 제5,608,152호)를 포함한다. 이들 프로모터는 프로모터 활성, 예를 들면, 조직 특이성, 발현 수준, 발현 기간 등에서 상대적으로 필적한다.
pDAB7733
의
작제
pDAB7733 이원 플라스미드(도 37; 서열번호 57)은 다중-부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다. pDAB7733은 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v4, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 BnaNapinC 프로모터 v1, BnaNapinC 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 및 BnaNapinC 3' UTR v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvPhas 프로모터 v5, PvPhas 5' UTR, NoHetI v3 및 AtuOrf23 3' UTR v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB7375, pDAB7731, pDAB7336, pDAB7378 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB7733을 형성했다. 구체적으로, 상기한 4개 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3이다. pDAB7333는 또한, 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 5개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
pDAB7734
의
작제
pDAB7734 이원 플라스미드(도 38; 서열번호 58)은 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다. pDAB7734는 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v4, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 BnaNapinC 프로모터 v1, BnaNapinC 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 및 BnaNapinC 3' UTR v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, NoHetI v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB7334, pDAB7376, pDAB7732, pDAB7338 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB7734를 형성했다. 구체적으로, 상기한 4개 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3이다. pDAB7333는 또한, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 5개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
pDAB101493
의
작제
pDAB101493 이원 플라스미드(도 39; 서열번호 59)는 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다. pDAB101493은 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v4, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvPhas 프로모터 v5, PvPhas 5' UTR, NoHetI v3 및 AtuOrf23 3' UTR v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB7334, pDAB7376, pDAB7336, pDAB7378 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB101493을 형성했다. 구체적으로, 상기한 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3이다. pDAB7333는 또한, 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 5개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
pDAB109507
의
작제
pDAB109507 플라스미드(도 40; 서열번호 60)는 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다. pDAB109507은 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 및 PvPhas 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)를 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 BnaNapinC 프로모터 v1, BnaNapinC 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 및 BnaNapinC 3' UTR v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 BoACP 프로모터/5' UTR v1, NoHetI v3 및 AtuOrf23 3' UTR v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB9324, pDAB7731, pDAB7336, pDAB101485 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB109507을 형성했다. 구체적으로, 상기한 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3이다. pDAB7333는 또한, 기타 조절 유소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 5개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
pDAB109508
의
작제
pDAB109508 플라스미드(도 41; 서열번호 61)은 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다. pDAB109508은 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 and 및 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)를 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 BnaNapinC 프로모터 v1, BnaNapinC 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 및 BnaNapinC 3' UTR v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, NoHetI v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB9324, pDAB7731, pDAB7336, pDAB7338 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB109508을 형성했다. 구페적으로 상기한 4개 PTU은 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3이다. pDAB7333는 또한, 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 5개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
pDAB109509
의
작제
pDAB109509 플라스미드(도 42; 서열번호 62)는 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다. pDAB109509는 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 BoACP 프로모터/5' UTR v1, NoHetI v3 및 AtuOrf23 3' UTR v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB7334, pDAB7335, pDAB7336, pDAB101485 및 pDAB7333를 재조합하여 pDAB109509를 형성했다. 구체적으로, 상기한 4개 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3이다. pDAB7333는 또한, 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 5개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
긴 유전자 서열의 단편화를 감소시키기 위한 이원
작제물
PTU
의 순서 재배열
SzPUFA OrfA PTU를 이원 작제물의 3' 말단에 위치시켜, PTU 카세트의 순서가 분리된 유전자변형 이벤트에서 단편화 및 재배열을 감소시킬 수 있는지를 시험했다. SzPUFA OrfA는 9개 탠덤 아실 캐리어 단백질 반복체를 함유하는 거대 개방 판독 프레임(~8,700 b.p.)이다. 완성된 작제물의 제1 계열에서, SzPUFA OrfA PTU은 먼저 식물 염색체 내로 통합되도록 위치시켰다. 이어서, SzPUFA OrfA PTU는 이들의 분자 크기가 저하됨에 따라, 잔류하는 PUFA 합성 관련된 유전자 PTU를 수반했다. SzPUFA OrfA 코딩 영역의 분자 분석은 일부 유전자변형 캐놀라 및 아라비돕시스 탈리아나 이벤트가 단편화된 삽입체를 함유함을 나타냈다. 대체 작제물 설계가 기재되며, 여기서 PUFA 신타제 PTU의 순서는 하기 배열로 변경되었다: hSzThPUFA OrfC PTU, SzPUFA OrfB PTU, NoHetI PTU, SzPUFA OrfA PTU 및 PAT PTU. 이원 작제물 상에서 SzPUFA OrfA PTU의 위치 변경을 완성하여 분리된 유전자변형 이벤트에서 단편화 및 재배열을 감소시킨다.
pDAB9151
의
작제
pDAB9151 플라스미드(도 43; 서열번호 63)은 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다. pDAB9151은 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, NoHetI v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 최종 PUFA 신타제 PTU는 PvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB9148, pDAB7335, pDAB9149, pDAB9150 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB9151을 형성했다. 구체적으로, 상기한 4개 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자 순서는 hSzThPUFA OrfC v3, SzPUFA OrfB v3, NoHetI v3, SzPUFA OrfA v3이다. pDAB7333는 또한, 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 5개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
작제물
다양성을 도입하기 위한 이원
작제물
PTU
의 전사 방향의 변화
대체 작제물 설계는 PUFA 신타제 PTU 순서 및 유전자 발현 카세트의 전사 방향의 변화를 포함한다. 완성된 작제물의 제1 계열에서, 각 유전자 발현 카세트는 동일한 방향으로 위치시켰다("머리 대 꼬리", 여기서 하나의 유전자 발현 카세트의 프로모터는 제2 유전자 발현 카세트의 3' UTR에 인접하여 배치된다). 하기 작제물은 유전자 발현 카세트가 상이한 방향으로 위치되고 대체 프로모터를 사용하는 전략을 기재한다. 이들 실시예에서, 유전자 발현 카세트는 제2 유전자 발현 카세트에 대해 트랜스 방향으로 배치되어, 유전자 발현 카세트 둘 다의 프로모터가 서로에 대해 인접하여 유전자 조작된다. 이러한 배열은 "머리-대-머리" 배열로 기재된다. 다른 배열은, 하나의 유전자 발현 카세트가 제2 유전자 발현 카세트에 대해 트랜스 방향으로 배치되어, 유전자 발현 카세트 둘 다의 3' UTR이 서로에 대해 인접하여 유전자 조작되는 예에서 기재된다. 이러한 배열은 "꼬리-대-꼬리" 배열로서 기재된다. 이러한 설계의 강력한 전체 판독을 완화시키기 위해, 이방향 Orf 23/24 터미네이터를 이들 2개의 PTU 사이에 위치시켰다. 이들 배열은 변형유전자의 발현을 증가시키고, 이에 의해 고농도 및 함량의 LC-PUFA 및 DHA 지방산을 생성하는 것으로 제안된다.
pDAB108207
의
작제
pDAB108207 플라스미드(도 44; 서열번호 64)를 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다. pDAB108207은 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 pvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 pvPhas 프로모터 v6, PvPhas 5' UTR, NoHetI v3, PvPhas 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)를 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 pvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3, At2S SSP 터미네이터 v1 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 pvPhas 프로모터 v6, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfB v3, PvPhas 3' UTR 및 PvPhas 3' MAR v2 (플라스미드 맵 상에 주석 없음) 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB7334, pDAB101489, pDAB108205, pDAB108206 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB108207을 형성했다. 구체적으로, SzPUFA OrfA v3 및 NoHetI v3은 꼬리-대-꼬리 배향으로 위치시키고; NoHetI v3 및 hSzThPUFA OrfC v3은 머리-대-머리 배향으로 위치시키고; hSzThPUFA OrfC v3 및 SzPUFA OrfB는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 꼬리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, NoHetI v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzPUFA OrfB v3이다. pDAB7333은 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 5개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
pDAB108208
의
작제
pDAB108208 플라스미드(도 45; 서열번호 65)를 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다. pDAB108208은 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 pvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 PvPhas 프로모터 v4, PvPhas 5' UTR, NoHetI v3 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 pvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 pvPhas 프로모터 v5, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfB v3, PvPhas 3' UTR, PvPhas 3' MAR v2 (플라스미드 맵 상에 주석 없음), 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB108200, pDAB101490, pDAB108201, pDAB108202 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB108208을 형성했다. 구체적으로, SzPUFA OrfA v3 및 NoHetI v3은 머리-대-머리 배향으로 위치시키고; NoHetI v3 및 hSzThPUFA OrfC v3은 꼬리-대-꼬리 배향으로 위치시키고; hSzThPUFA OrfC v3 및 SzPUFA OrfB는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 꼬리-대-꼬리 배향으로 위치시킨다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, NoHetI v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzPUFA OrfB v3이다. pDAB7333은 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 5개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
pDAB108209
의
작제
pDAB108209 플라스미드(도 46; 서열번호 66)를 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다. pDAB108209는 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 pvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 pvPhas 프로모터 v4, PvPhas 5' UTR, NoHetI v3 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 pvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 pvPhas 프로모터 v5, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfB v3, PvPhas 3' UTR 및 PvPhas 3' MAR v2 (플라스미드 맵 상에 주석 없음), 및 랜덤 DNA 스페이서를 함유한다.
플라스미드 pDAB108200, pDAB108204, pDAB108201, pDAB108202 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB108209를 형성한다. 구체적으로, SzPUFA OrfA v3 및 NoHetI v3은 머리-대-머리 배향으로 위치시키고; NoHetI v3 및 hSzThPUFA OrfC v3은 꼬리-대-꼬리 배향으로 위치시키고; hSzThPUFA OrfC v3 및 SzPUFA OrfB는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 꼬리-대-꼬리 배향으로 위치시킨다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, NoHetI v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzPUFA OrfB v3이다. pDAB7333은, 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 5개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
전사 간섭을 최소화하기 위한 3'
UTR
의
배수화
및
스페이서
DNA
의 포함
전사 간섭은 다수의 유전자가 일렬로 적층되어 하류 유전자의 발현을 감소시킬 겨우에 발생할 수 있다. 이 현상은 다음 프로모터 전사 장치 속에서 3' UTR 및 터미네이터의 전사 전체 판독으로부터 일어난다. 전사 간섭을 최소화하기 위한 두 전략으로 이루어진 대체 작제 설계 및 전사 간섭이 기술된다. 제1 전략은 개별적인 DHA 유전자 발현 카세트 사이에 적층되어 다음 유전자 발현 카세트 속에서 전제 판독을 제한하는 두 개의 터미네이터/3' UTR의 사용을 배치한다. 제2 전략은 유전자 발현 카세트 사이에 스페이서 DNA의 약 1천 염기 쌍을 삽입하여 전사 간섭을 최소화한다.
pDAB108207
의
작제
pDAB108207 플라스미드(도 44; 서열번호 64)를 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다. pDAB108207은 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 pvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 pvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfB v3, PvPhas 3' UTR, PvPhas 3' MAR v2 (플라스미드 맵 상에 주석 없음), 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 pvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3, At2S SSP 터미네이터 v1 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 pvPhas 프로모터 v6, PvPhas 5' UTR, NoHetI v3, PvPhas 3' UTR v1 및 PvPhas 3' MAR v2(플라스미드 맵 상에 주석 없음)를 함유한다.
플라스미드 pDAB7334, pDAB101489, pDAB108205, pDAB108206 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB108207을 형성했다. 구체적으로, SzPUFA OrfA v3 및 NoHetI v3은 꼬리-대-꼬리 배향으로 위치시키고,AtuORF23 3' UTR은 두 PTU 사이에 위치시키고; NoHetI v3 및 hSzThPUFA OrfC v3은 머리-대-머리 배향으로 위치시키고; hSzThPUFA OrfC v3 및 SzPUFA OrfB는 머리-대-꼬리 배향으로 위치시키고, AtuORF23 3' UTR은 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내의 두 PTU 사이에 위치시킨다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, NoHetI v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzPUFA OrfB v3이다. pDAB7333은, 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 5개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
pDAB108208
의
작제
pDAB108208 플라스미드(도 45; 서열번호 65)를 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다. pDAB108208은 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 아실-CoA 신세타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 pvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 pvPhas 프로모터 v5, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfB v3, PvPhas 3' UTR, PvPhas 3' MAR v2 (플라스미드 맵 상에 주석 없음) 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 pvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 pvPhas 프로모터 v4, PvPhas 5' UTR, NoHetI v3 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB108200, pDAB101490, pDAB108201, pDAB108202 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB108208을 형성했다. 구체적으로, SzPUFA OrfA v3 및 NoHetI v3은 머리-대-머리 배향으로 위치시키고; NoHetI v3 및 hSzThPUFA OrfC v3은 꼬리-대-꼬리 배향으로 위치시키고, AtuORF23 3' UTR은 두 PTU 사이에 위치시키고; hSzThPUFA OrfC v3 및 SzPUFA OrfB는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 꼬리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, NoHetI v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzPUFA OrfB v3이다. pDAB7333은 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 5개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
pDAB108209
의
작제
pDAB108209 플라스미드(도 46; 서열번호 66)를 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다. pDAB1082093개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 아실-CoA 신세타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 pvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 pvPhas 프로모터 v5, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfB v3, PvPhas 3' UTR, PvPhas 3' MAR v2 (플라스미드 맵 상에 주석 없음), 및 랜덤 DNA 스페이서를 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 pvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 pvPhas 프로모터 v4, PvPhas 5' UTR, NoHetI v3 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB108200, pDAB108204, pDAB108201, pDAB108202 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB108209를 형성했다. 구체적으로, SzPUFA OrfA v3 및 NoHetI v3은 머리-대-머리 배향으로 위치시키고; NoHetI v3 및 hSzThPUFA OrfC v3은 꼬리-대-꼬리 배향으로 위치시키고, 1천 염기 쌍 스페이서는 두 PTU 사이에 위치시키고; hSzThPUFA OrfC v3 및 SzPUFA OrfB는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 꼬리-대-꼬리 배향으로 위치시킨다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, NoHetI v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzPUFA OrfB v3이다. pDAB7333은 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 5개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
전사 전체 판독을 제한하기 위한 대체 3'
UTR
-터미네이터의 사용
제한된 수의 소유자 3' UTR-터미네이터에 기인하여, 아그로박테리움 ORF 23 3' UTR-터미네이터를 주로 사용하여 전사를 종결시킨다. 최근에, ZmLipase 3' UTR-터미네이터가 아라비돕시스 탈리아나에서 전사 전체 판독을 종결시키는데 더욱 효과적이다는 것이 제시되었다. 이와 같이, 작제물의 하나의 버젼은 이 3' UTR이 상류 유전자의 전사 전체 판독을 감소시켜 전사 간섭을 감소시킬 수 있는지의 여부를 시험하기 위해 ZmLipase 3' UTR-터미네이터를 pvDlec2 프로모터와 함께 사용한다.
pDAB9159
의
작제
pDAB9159 플라스미드(도 47; 서열번호 67)를 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다. pDAB9159는 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 pvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 및 ZmLip 3' UTR v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 pvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 및 ZmLip 3' UTR v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 pvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 및 ZmLip 3' UTR v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 pvPhas 프로모터 v3, PvPhas 5' UTR, NoHetI v3 및 ZmLip 3' UTR v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB9152, pDAB9153, pDAB9154, pDAB9155 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB9159를 형성했다. 구체적으로, 상기한 4개의 PTU는 described above 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3이다. pDAB7333은 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 5개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
pDAB9147
의
작제
pDAB9147 플라스미드(도 48; 서열번호 68)를 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다. pDAB9147은 3개의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 pvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3, At2S SSP 터미네이터 v1 및 ZmLip 3' UTR v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 pvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제3 PUFA 신타제 PTU는 pvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 pvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, NoHetI v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB9146, pDAB7335, pDAB7336, pDAB7338 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB9147을 형성했다. 구체적으로, 상기한 4개의 PTU는 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-꼬리 배향으로 위치시켰다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3이다. pDAB7333은 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 5개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
2개의 개별적 T-
DNA
상에서
DHA
유전자의 전달
대체 작제 설계는 2개의 별도의 이원 벡터, 하나의 T-DNA 상에 PUFA 신타제 유전자의 서브-세트를 함유하는 제1 벡터 및 제2 T-DNA 상에 잔류하는 PUFA 신타제 유전자를 함유하는 제2 이원 벡터를 작제함으로 이루어진다. 이러한 이원 벡터를 개별적으로 사용하여 교잡된 식물을 형질전환시키고, 이에 의해 PUFA 신타제 유전자 발현 작제물 모두를 함유하는 후대를 생성한다. 유전자변형 식물을 생성하기 위한 대체 방법은 두 이원 벡터를 캐놀라 조직속에서 공동-형질전환시키고, 두 T-스트랜드를 함유하는 단일 식물을 선택하거나 선별하는 것이다.
pDAB108224
의
작제
pDAB108224 플라스미드(도 49; 서열번호 69)를 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다. pDAB108224는 하나의 PUFA 신타제 PTU, 하나의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 pvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 PTU는 pvPhas 프로모터 v4, PvPhas 5' UTR, NoHetI v3 및 AtuORF23 3' UTR v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB108216, pDAB108221 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB108224를 형성했다. 구체적으로, SzPUFA OrfA v3 및 NoHetI v3은 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-머리 배향으로 위치시킨다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfA v3, NoHetI v3이다. pDAB7333은 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 3개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
pDAB108225
의
작제
pDAB108225 플라스미드(도 50; 서열번호 70)를 다중 부위 입구 L-R 재조합 반응을 사용하여 작제했다. pDAB108225는 두 개의 PUFA 신타제 PTU 및 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 제1 PUFA 신타제 PTU는 pvDlec2 프로모터 v2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 및 At2S SSP 터미네이터 v1을 함유한다. 제2 PUFA 신타제 PTU는 pvPhas 프로모터 v4, SzPUFA OrfB v3 및 Atu ORF23 3' UTR v1을 함유한다.
플라스미드 pDAB108217, pDAB108222 및 pDAB7333을 재조합하여 pDAB108225를 형성했다. 구체적으로, SzPUFA OrfB v3 및 hSzThPUFA OrfC v3을 식물 형질전환 이원 pDAB7333의 T-스트랜드 DNA 탑재 영역 내에 머리-대-머리 배향으로 위치시킨다. 유전자 순서는 SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3이다. pDAB7333은, 기타 조절 요소, 예를 들면, 과잉구동 및 T-스트랜드 탑재 서열(T-DNA 탑재 A 및 T-DNA 탑재 B) 이외에, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2, PAT v5, AtuORF1 3' UTR v4를 함유한다. 이어서, 5개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 분리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석으로 3개 PTU의 도입에 대해 시험했다.
대체 설계를 함유하는
작제물을
사용한
캐놀라
형질전환
이들 플라스미드를 사용하여, 상기한 프로토콜을 사용하여 캐놀라 식물을 안정하게 형질전환시킨다. 유전자변형 캐놀라 식물을 분리하고, 분자적으로 특성화한다. 대체 작제물의 사용은 보다 다량의 DHA 및 LC-PUFA를 함유하는 캐놀라 식물을 생성한다. 수득된 LC-PUFA 축적을 측정하고, 0.01% 내지 15% DHA 또는 0.01% 내지 15% LC-PUFA를 함유하는 캐놀라 식물을 동정한다.
실시예
18
아라비돕시스
탈리아나의
형질전환에 사용된 대체
작제물
설계 및
LC
-PUFA 및
DHA
의 후속 생산
아라비돕시스 탈리아나 식물을 pDAB101493, pDAB7362, pDAB7369, pDAB101412 또는 pDAB7380 이원 벡터를 함유하는 아그로박테리움 투멘파시엔스 균주로 형질전환시켰다. 문헌[참조: Clough and Bent (1998)]에 기재된 꽃 침지 형질전환 프로토콜을 형질전환에 사용했다[참조: Clough and Bent, "Floral dip: a simplified method for agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thalia," Plant J., 16:735-743, 1998]. 형질전환된 아라비돕시스 식물을 수득하고, 변형유전자 존재의 분자 확인을 완성했다. 유전자변형 아라비돕시스 이벤트로부터 T1 식물을 온실에서 성숙기까지 성장시켰다. 이들 식물을 자가 수정하고, 생성 T2 종자를 성숙기에 수확했다. 단일 종자를 FAME GC-FID에 의해 분석하여 T2 아라비돕시스 종자에서 LC-PUFA 및 DHA 함량을 측정했다. 당해 조직은 상기 실시예에 기재된 FAME GC-FID 방법을 통해 분석했다. 아라비돕시스 식물의 T1 식물로부터의 단일 T2 종자는 0.00% 내지 0.95% DHA 및 0.00% 내지 1.50% 총 LC-PUFA를 함유했다. 개개 T1 식물로부터 각 T2 종자의 LC-PUFA 및 DHA 함량은 도 51에 제시되어 있다.
실시예
19
PUFA
신타제
유전자 세트를 사용한 "비-고 올레산"
캐놀라
품종(
DH12075
)의 형질전환
브라시카 나푸스 품종 DH12075은 플라스미드 pDAB7362를 함유하는 아그로박테리움 투멘파시엔스를 사용하여 실질적으로 실시예 4에 기재된 바와 같이 배축 형질전환 방법에 의해 형질전환시켰다. 넥세라 710 유전자 배경과는 달리, DH12075는 "고올레산" 품종이 아니다. pat 유전자의 존재에 대해 포지티브인 T0 DH12075 식물을 회수하고, 실시예 5에 기재된 분자 분석 방법에 의해 DHA 유전자 세트의 5개 모두의 존재에 대해 분석했다(PUFA 신타제 OrfA, PUFA 신타제 OrfB, PUFA 신타제 키메라 OrfC, 아실-CoA 신세타제 및 4' 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 HetI). 이벤트 001-2009-006DH(이벤트 006)은 5개 모두의 DHA 유전자를 함유하는 T0 식물로서 동정되었다. 이를 성장 챔버에서 성숙기까지 성장시키고, T1 종자를 수확했다. 실시예 6에 기재된 방법에 의해 이벤트 006의 단일 T1 종자의 분석은 분석된 48개 종자 중의 31개가 0.19% 내지 0.86% DHA 사이의 수준으로 DHA를 함유함을 나타냈다. 113개 T1 종자를 심고, 성장 챔버에서 성장시키고, 잎 조직 시료를 실시예 4에 기재된 방법으로 분석하여 개개 식물의 접합자성을 측정했다. 23개 식물은 PAT 유전자에 대해 동형접합성인 것으로 qPCT 분석에 의해 측정되었고, 또한, 5개 DHA 유전자의 공분리를 나타냈고, 이는 단일 유전자좌의 존재를 나타낸다. 팻 및 OrfA 프로브를 사용한 이벤트 0006 T1 식물 조직의 서던 분석은 OrfA 유전자의 하나의 추가 카피가 존재함을 나타냈다. 동형접합성 식물을 성숙기까지 성장시키고, 종자를 수확했다. 이들 식물 각각으로부터 벌크 T2 종자 시료의 FAME 분석은 23개 동형접합성 T2 식물 중의 17개가 0.17 내지 0.72% 사이의 DHA 함량을 갖는 LC-PUFA를 생산했음을 나타냈다. 5개의 T2 종자 시료는 0.08% 내지 0.16%의 EPA를 함유했고, LP-PUFA 생산 이벤트의 총 LC-PUFA(DHA+EPA+DPA[n=6])는 0.33% 내지 1.35%였다. 표 22a는 이벤트 006의 2개 DHA 함유 벌크 T2 시료의 완전 지방산 프로파일을 나타낸다. 단일 종자 분석은 8개 동형접합성 T1 라인으로부터 48개 개개 T2 종자에 대해 수행했고, 이들 종자의 평균 DHA 함량은 표 23에 제시되어 있다. DHA 함량이 1.31% 이하인 단일 T2 종자가 검출되었다. 표 22b는 4개 DHA 함유 T2 종자의 완전 지방산 프로파일을 나타낸다. 이들 데이터는 DHA가 PUFA 신타제 유전자 세트에 의한 형질전환을 통해 올레산 함량이 72% 미만인 유전자 배경을 갖는 캐놀라에서 생산될 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 상기 기재는 설명 및 서술을 목적으로 제공되었다. 더욱이, 상기 기재는 본 발명을 본원에 기재된 형태로 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 기재된 모든 다양한 국면, 양태 및 선택사항은 임의의 및 모든 변형태로 조합될 수 있다.
본 명세서에서 언급된 모든 공개문헌, 특허 및 특허원은, 각각의 개개 공개문헌, 특허 또는 특허원이 구체적 및 개별적으로 본원에서 참조로서 도입되는 것과 동일한 정도로 본원에서 참조로서 도입된다.
<110> Dow AgroSciences LLC
DSM IP Assets B.V.
<120> Production of DHA and Other LC-PUFAs in Plants
<130> IPA121130
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725 730 735
Lys Asp Asp Arg Ile Tyr Ala Cys Met Asp Ala Ile Val Pro Gly Asn
740 745 750
Val Pro Ser Ala Cys Leu Arg Glu Ala Leu Asp Gln Ala Arg Val Lys
755 760 765
Pro Gly Asp Ile Glu Met Leu Glu Leu Ser Ala Asp Ser Ala Arg His
770 775 780
Leu Lys Asp Pro Ser Val Leu Pro Lys Glu Leu Thr Ala Glu Glu Glu
785 790 795 800
Ile Gly Gly Leu Gln Thr Ile Leu Arg Asp Asp Asp Lys Leu Pro Arg
805 810 815
Asn Val Ala Thr Gly Ser Val Lys Ala Thr Val Gly Asp Thr Gly Tyr
820 825 830
Ala Ser Gly Ala Ala Ser Leu Ile Lys Ala Ala Leu Cys Ile Tyr Asn
835 840 845
Arg Tyr Leu Pro Ser Asn Gly Asp Asp Trp Asp Glu Pro Ala Pro Glu
850 855 860
Ala Pro Trp Asp Ser Thr Leu Phe Ala Cys Gln Thr Ser Arg Ala Trp
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Leu Lys Asn Pro Gly Glu Arg Arg Tyr Ala Ala Val Ser Gly Val Ser
885 890 895
Glu Thr Arg Ser Cys Tyr Ser Val Leu Leu Ser Glu Ala Glu Gly His
900 905 910
Tyr Glu Arg Glu Asn Arg Ile Ser Leu Asp Glu Glu Ala Pro Lys Leu
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Ile Val Leu Arg Ala Asp Ser His Glu Glu Ile Leu Gly Arg Leu Asp
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Lys Ile Arg Glu Arg Phe Leu Gln Pro Thr Gly Ala Ala Pro Arg Glu
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Glu Thr Leu Ala Gln Asp Ala Ala Ser Ser Gly Ser Gln Lys Pro Leu
980 985 990
Ala Leu Ser Leu Val Ser Thr Pro Ser Lys Leu Gln Arg Glu Val Glu
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Trp Ser Ser Pro Ala Gly Ser Arg Tyr Ala Pro Glu Pro Leu Ala
1025 1030 1035
Ser Asp Arg Val Ala Phe Met Tyr Gly Glu Gly Arg Ser Pro Tyr
1040 1045 1050
Tyr Gly Ile Thr Gln Asp Ile His Arg Ile Trp Pro Glu Leu His
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Leu Asn Ile Thr Pro Lys Ala Ala Phe Gly Leu Ser Leu Gly Glu
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Ile Ser Met Ile Phe Ala Phe Ser Lys Lys Asn Gly Leu Ile Ser
1145 1150 1155
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Ala Leu Ala Val Glu Phe Asn Ala Leu Arg Glu Ala Trp Gly Ile
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1325 1330 1335
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1340 1345 1350
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1430 1435 1440
Ser Lys Ala Asp Pro Ile Ser Ser Ala Asp Leu Ala Ser Phe Pro
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Pro Ala Asp Pro Ala Ile Glu Ala Ala Ile Ser Ser Arg Ile Met
1460 1465 1470
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Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser
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Pro Ser Pro Ala Pro Ser Ala Pro Val Gln Lys Lys Ala Ala Pro
1520 1525 1530
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1550 1555 1560
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1565 1570 1575
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1610 1615 1620
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Leu Ile Ala Ser Gly Glu Ile Asn Gln Glu Gln Ala Glu Leu Ala
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Leu
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Chimeric PUFA OrfC from Schizochytrium sp. ATCC_20888 and
Thraustochytrium
<220>
<223> hSzThPUFA OrfC v3 protein
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<302> CHIMERIC PUFA POLYKETIDE SYNTHASE SYSTEMS AND USES THEREOF
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Ile Ile Asp Val Asp Phe Glu Lys Gly Gln Asp Phe Ser Leu Asp Arg
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<300>
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<400> 4
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<211> 237
<212> PRT
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<223> NoHetI v3 protein
<300>
<308> GenBank: P37695
<309> 1994-10-01
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Met Leu Gln His Thr Trp Leu Pro Lys Pro Pro Asn Leu Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Asp Glu Val His Leu Trp Arg Ile Pro Leu Asp Gln Pro Glu Ser
20 25 30
Gln Leu Gln Asp Leu Ala Ala Thr Leu Ser Ser Asp Glu Leu Ala Arg
35 40 45
Ala Asn Arg Phe Tyr Phe Pro Glu His Arg Arg Arg Phe Thr Ala Gly
50 55 60
Arg Gly Ile Leu Arg Ser Ile Leu Gly Gly Tyr Leu Gly Val Glu Pro
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Gly Gln Val Lys Phe Asp Tyr Glu Ser Arg Gly Lys Pro Ile Leu Gly
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Asn Leu Ala Leu Cys Ala Val Asn Tyr Thr Arg Gln Ile Gly Ile Asp
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Phe Phe Leu Pro Arg Glu Tyr Glu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Asp Glu
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Gln Lys Gln Lys Ile Phe Phe Arg Tyr Trp Thr Cys Lys Glu Ala Tyr
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Leu Lys Ala Thr Gly Asp Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Ile Glu Ile
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Ala Leu Thr Pro Thr Glu Pro Ala Lys Leu Gln Thr Ala Pro Ala Trp
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<212> DNA
<213> Schizochytrium sp. ATCC_20888
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<223> SzPUFA OrfA v3 gene
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<308> GenBank: AF378327
<309> 2007-10-22
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gacccagtca agaccacaaa ggacaaaatc tactgcaaga gaggaggttt cattcctgag 240
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acctcatctg tgaagttcct gacccaagtg aggaacatgc accaagctgg tgcgagaatc 2640
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ctttcagctg ccacctatgt cagtgacaag accaagaaag tgagggatgc tgccatgaac 2940
gacggaagat gtgtcacata cctcaagggt gctgcaccac tcatcaaggc tcctgaacct 3000
gtggttgacg aagctgccaa gagggaggct gaaaggcttc agaaggagct tcaagacgct 3060
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gccgctgccc ctgccgctcc cgttgcaagt gctcctgctc ccgccgtgtc caacgagttg 3360
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aatgccatga aggctgagat agctggaggc tccgctcctg cgccggccgc tgccgctcct 3960
ggtcccgctg ccgcggctcc agctccagct gcagccgctc cggccgtctc aaacgaactc 4020
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aggacaagaa ctgtggggga agttgtcgat gcgatgaagg ctgagattgc tggaggctct 5280
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atgcacccag aagatgctgc agttgccata gttagggaga tggcgtgtgc tgacatcaga 6960
atcagagagg ttgggattgg agcaaaccag caaagatgca caatcagagc tgccaagttg 7020
gagactggga accctcagag acagatagcg aaagacgatg tgcttctggt ttctggaggt 7080
gctcgtggga tcacacctct ttgcatccgt gagatcacgc gtcagattgc tggaggcaag 7140
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actgatgaga aggctgtgca gaaagctgcc acccaagagt tgaagagggc cttcagtgct 7260
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gctcgtgaag tgagaagctc cattgctgcc attgaagctc tgggtggcaa agcgatctac 7380
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accctgcata gaaagatcag tgccaagtcc aatcccttct tggaggatca tgtcatacaa 7980
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gctgtcatag tgttgtccaa ccaaggtgct ccacctgcca atgcaaccat gcagcctccg 8280
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ccacaagaca aacccttcta catcaccctc agatccaatc agagtggtgg acatagccag 8640
cacaaacatg cacttcagtt ccacaacgaa caaggtgatc tcttcattga tgttcaagcc 8700
tctgtcattg cgacagactc acttgcgttc tga 8733
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<211> 6180
<212> DNA
<213> Schizochytrium sp. ATCC_20888
<220>
<223> SzPUFA OrfB v3 gene
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<308> GenBank: AF378328
<309> 2007-10-22
<400> 7
atggctgcaa ggaacgtgag tgcggctcat gagatgcatg acgagaagag gatagctgtt 60
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gcgctcagag aagcctgggg cattccacag tctgtcccaa aagatgagtt ctggcaaggt 3600
tacatagtga ggggaacgaa acaagacata gaagcagcca tagcaccaga ctcaaagtat 3660
gtgaggttga ccatcatcaa tgatgccaac actgctctca tcagtggaaa gcctgatgca 3720
tgcaaagctg cgattgctcg tcttggtggc aacatccctg cgcttccagt cactcaaggc 3780
atgtgtgggc attgcccaga ggtgggacct tacaccaagg acatcgcaaa gatccacgcc 3840
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cttgtgccaa gagccacggg tgccaaagat gaatgggctc cttcatcctt tggggagtat 3960
gctggacagc tctatgagaa acaagccaac ttccctcaga tagttgaaac catctacaag 4020
cagaactatg atgtgtttgt tgaagttggg ccaaacaatc acagaagcac agcagtgaga 4080
accacgcttg gaccacagag aaaccacctt gctggtgcca tagacaagca gaacgaggat 4140
gcttggacga caatagtcaa gctcgtggct tcattgaagg ctcaccttgt tcctggagtg 4200
accatcagtc cgctctacca ctccaagctc gttgcagagg ctgaggcttg ttatgctgcg 4260
ctctgtaaag gtgagaaacc caagaaaaac aagtttgtga gaaagattca gttgaatggc 4320
agattcaaca gcaaggcaga ccccatctcc tcagcagacc ttgcatcctt cccacctgcg 4380
gaccctgcga ttgaagctgc catctcttca aggatcatga agcctgtggc tccgaaattc 4440
tatgcgcgtc tcaacattga tgagcaagat gagaccagag atccgatctt gaacaaggac 4500
aatgcgcctt ccagctccag ctcttccagc agttcctctt ccagcagttc atctccgtct 4560
cctgctcctt cagctccagt tcagaagaaa gctgccccag ctgcggagac aaaagctgtt 4620
gccagtgctg atgcacttcg tagtgccctg cttgatcttg actccatgct tgcgctcagc 4680
tctgcaagtg cttctggcaa ccttgttgag actgcgccat ctgatgccag tgtcattgtc 4740
cctccgtgca acattgctga tcttggcagc agagctttca tgaaaactta tggtgtttct 4800
gcgcctctgt acaccggtgc aatggccaag ggaattgcct ctgcggactt ggtgatcgca 4860
gctggaaggc aaggaatcct tgcgtcattt ggtgctggag gccttccaat gcaagttgtg 4920
cgtgagtcca ttgaaaagat tcaagctgcc ctgcccaatg gaccatatgc tgtcaacctc 4980
atccattctc cttttgacag caaccttgag aagggaaatg ttgatctctt cttggaaaag 5040
ggtgtcactt ttgttgaggc ttcagccttc atgacgttga caccgcaagt tgtcagatac 5100
agagcggctg ggttgacgag gaatgcagat gggtcagtca acataaggaa cagaatcatt 5160
gggaaagtct ccagaactga gctggctgaa atgttcatgc gtcctgcacc tgagcatctt 5220
ttgcagaagc tcattgcttc tggggagatc aatcaagaac aagctgagtt ggccagacgt 5280
gttcctgtgg ctgatgacat tgcggttgaa gctgattctg gtggacacac tgacaaccgt 5340
ccaatccatg tcattctgcc tctgattatc aacctgaggg ataggcttca cagagagtgt 5400
ggatacccag caaacctgag ggttcgtgtt ggtgctgggg gtggcattgg gtgtccccaa 5460
gctgcgctgg caactttcaa catgggtgcc tctttcattg tcactggaac agtgaaccaa 5520
gttgccaaac aatctgggac gtgtgacaat gtgaggaaac agcttgcgaa agcaacttac 5580
tcagatgttt gcatggcacc ggcagctgac atgtttgagg aaggtgtgaa acttcaagtt 5640
ttgaagaaag gaacaatgtt cccttcaaga gccaacaaac tctatgagtt gttctgcaag 5700
tatgattctt ttgagtccat gcctccagca gagcttgcga gggttgagaa aagaatcttc 5760
agtcgtgcat tggaagaggt ctgggatgag accaagaact tctacatcaa ccgtctccac 5820
aacccagaga agatacagag ggctgagagg gaccccaaac tgaagatgtc actgtgtttc 5880
agatggtatc tgtccctggc ttcaaggtgg gccaacactg gagcttctga cagagtcatg 5940
gactaccaag tttggtgtgg tcctgccatt ggttcattca atgatttcat caaaggaact 6000
taccttgatc cggcagtggc aaatgagtac ccgtgtgttg tgcagatcaa caaacagatt 6060
cttagaggag cgtgcttctt gaggcgtctt gaaatactga gaaatgcaag gctttcagat 6120
ggtgcagctg cacttgtggc gagcattgat gacacatatg tccctgctga gaagctgtga 6180
<210> 8
<211> 4482
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Chimeric PUFA OrfC from Schizochytrium sp. ATCC_20888 and
Thraustochytrium
<220>
<223> hSzThPUFA OrfC v3 gene
<300>
<302> CHIMERIC PUFA POLYKETIDE SYNTHASE SYSTEMS AND USES THEREOF
<310> US 2008-0022422 A1
<311> 2007-05-16
<312> 2008-01-24
<400> 8
atggcgcttc gtgtcaagac caacaagaag ccatgttggg agatgaccaa ggaggaactg 60
acctctggca aaactgaggt gttcaactat gaggaactcc tggagtttgc agagggtgac 120
atagctaagg tttttggtcc ggagtttgct gtcatagaca agtaccccag aagggtgagg 180
ctgcctgctc gtgaatacct gcttgtgaca agggtcacac tcatggatgc cgaggtcaac 240
aactacagag ttggtgccag aatggtcact gagtatgatc ttccagtgaa tggcgaattg 300
tctgagggag gtgattgtcc ctgggcagtt ctggttgaga gtggacagtg cgatttgatg 360
ctgatatcat acatgggaat tgatttccag aaccaaggtg acagagttta ccgtctgctc 420
aacaccacgt tgacattcta tggggttgcc catgagggag agacccttga gtatgacatc 480
agagtgaccg gttttgccaa acgtttggat ggtggcatct ccatgttctt ctttgagtat 540
gactgctatg tcaatgggag gcttctcatt gagatgagag atggctgtgc tggcttcttc 600
acaaatgagg agcttgatgc gggaaagggt gtggtgttca caagagggga tttggctgcc 660
agagctaaga ttccaaagca agatgtttct ccctatgctg tcgctccctg ccttcacaaa 720
acaaaactca acgaaaagga gatgcagacc ttggttgaca aagattgggc ttccgttttt 780
ggctcaaaga atggcatgcc ggagatcaac tacaaactct gcgcacgtaa gatgctcatg 840
attgatagag tcaccagcat tgaccataag ggaggtgtgt acggtttggg tcagttggtt 900
ggtgagaaaa tcttggagag ggaccattgg tacttcccat gccattttgt taaggatcaa 960
gtcatggctg gatctcttgt cagcgacggt tgttcacaaa tgctcaagat gtacatgatc 1020
tggctcggtt tgcaccttac caccggacca tttgacttca gacccgtcaa cggacacccg 1080
aacaaagtta ggtgtagggg tcagatatct cctcataagg gaaagttggt ctacgtcatg 1140
gagatcaaag agatgggatt cgacgaggat aacgatccgt acgccattgc tgacgtcaac 1200
atcattgacg ttgatttcga aaagggtcaa gatttcagcc ttgatagaat cagcgactac 1260
ggaaaggggg atcttaacaa aaagatcgtc gtggacttca agggcattgc tctcaagatg 1320
cagaagagat ccacgaacaa gaacccctcc aaagttcagc ccgtttttgc taacggtgca 1380
gccactgtgg gaccggaagc gtccaaggcc agctctggtg ccagtgctag tgcttctgct 1440
gcccctgcga agcctgcttt ctcagcagat gttcttgcgc caaagccagt tgcacttcct 1500
gaacatatcc tcaagggtga cgctctcgct ccgaaagaaa tgtcctggca tcccatgtca 1560
aaacttcctg gcaacccgac gccgttcttc tcccctagtt cttaccctcc gagggcaatt 1620
tgcttcatcc ctttccctgg caacccactt gacaacaatt gcaaagctgg agaaatgcct 1680
ctgaactggt acaacatgtc agagttcatg tgtggaaaag ttagcaactg cttgggacca 1740
gagttcgcaa gatttgataa gtcaaatacg agcagaagcc ctgcttttga tttggctctt 1800
gtgactagag ttgttgaagt cacaaacatg gaacatggca agttcctgaa tgttgattgc 1860
aatcccagca aaggcacaat ggtgggggag tttgactgtc ctcaagatgc gtggttcttt 1920
gatggttctt gcaatgatgg gcacatgcct tattccatca tcatggaaat cggacttcag 1980
acatccggtg ttctcaccag tgtgttgaaa gcaccactga cgatggacaa agatgacatt 2040
ctctttagga accttgatgc aagtgctgaa atggtgaggc cagatgtgga tgtgaggggg 2100
aaaaccataa ggaatgtgac caagtgcact ggatatgcaa tgttgggaaa gatggggatt 2160
cacagattca cgtttgagtt gtctgttgat ggcgtggttt tctacaaagg aagcacttcc 2220
tttggatggt tcactccaga ggtgtttgct cagcaagctg gacttgacaa tgggaaaaag 2280
acggagcctt ggtgcaaaac taacaacacg agtgtgagaa gagttgaaat cgcatcagcc 2340
aaaggcaaag aacagctgac tgagaaactt ccagatgcaa ctaatgctca agttctcaga 2400
aggtcagaac agtgtgagta tttggattac ctcaacattg ctcctgattc tgggctgcat 2460
gggaaaggat atgcgcatgg acacaaagat gttaacccac aagactggtt cttctcttgt 2520
cacttttggt ttgatcctgt gatgcctgga tctttgggaa ttgagtcaat gttccagctc 2580
attgaggcat ttgcggtgga ccagaacata ccgggagaat acaatgtgag caatccgacc 2640
tttgcccatg cccctggaaa aacggcgtgg aagtaccgtg gtcaattgac accaaagaac 2700
cgtgcgatgg actgtgaggt gcacatagtt tcaatcacag cctctcctga aaatggaggc 2760
tacgttgaca tagtggcaga tggagcactt tgggttgatg gtctccgtgt gtatgaagcc 2820
aaagaactca gagttcgtgt tgtcagtgca aaacctcaag ccattccgga tgttcaacaa 2880
cagccaccca gcgcaaaagc ggaccctggg aaaactggag ttgcactcag tccgactcag 2940
ttgagagatg tcctgcttga agtggacaat ccattgtatc ttggtgttga aaactccaat 3000
ttggtgcagt ttgaatccaa acctgcaact tcttcaagga ttgtcagtat caaaccatgc 3060
tccataagtg atcttggtga caagtccttc atggaaacgt acaatgtgtc agcacctctg 3120
tacactggag caatggccaa gggaattgcg tctgcggacc ttgtcattgc tgctgggaag 3180
aggaagatat tgggttcttt tggagcgggt gggcttccaa tgcaccatgt gagggcagct 3240
ttggagaaga tacaagcggc tctgcctcaa ggaccatatg ctgtgaacct cattcattca 3300
ccttttgaca gcaacttgga aaaggggaat gttgatctct tcctcgaaaa gggcgttact 3360
gtggtggagg cttctgcatt catgaccctc actccccaag ttgttcgtta ccgtgcagcc 3420
ggactctcaa ggaacgctga tgggagtgtc aacatcagaa accgtatcat tggaaaagtg 3480
tccagaacag aactcgccga aatgttcatc agaccggctc cggaacacct ccttgagaaa 3540
ctcatagctt ctggtgagat aacacaagaa caagccgaac ttgcccgtcg tgttcctgtc 3600
gcagacgaca tcgctgttga agctgattct ggtggtcaca ctgacaaccg tcccatccac 3660
gtcatcttgc ctttgatcat caaccttagg aacagactgc acagagagtg tggttatcct 3720
gcgcacctta gagtcagagt tggagctgga ggcggtgttg gctgcccaca agctgctgcg 3780
gctgccctca caatgggagc tgccttcata gtgactggga ctgtcaatca agttgctaaa 3840
cagtccggga catgtgacaa cgtgagaaaa caactcagtc aagccaccta cagtgacatt 3900
tgcatggctc cagcagctga tatgtttgag gaaggtgtga aactccaagt tctcaagaag 3960
ggaacaatgt tcccatcaag agctaacaaa ttgtacgaac tcttttgcaa gtacgactct 4020
ttcgattcaa tgcctcctgc tgaacttgaa aggatcgaga agaggatctt caagagggca 4080
cttcaagagg tctgggaaga gaccaaggac ttttacatca atggtttgaa gaatccagag 4140
aagatacaga gagcggaaca tgaccccaaa ctcaagatgt ctttgtgttt cagatggtat 4200
cttggtcttg catcacgttg ggccaacatg ggtgctcctg atcgtgtcat ggactatcaa 4260
gtctggtgtg gtccagccat tggagccttc aatgacttca tcaaaggaac atatcttgat 4320
cctgctgtct ctaatgagta cccatgtgtt gtccagatca accttcagat tttgcgtggt 4380
gcatgttacc tgaggcgtct taatgctctg agaaatgatc cgaggattga tcttgagact 4440
gaagatgctg cctttgtcta tgagccaacg aatgcgcttt ga 4482
<210> 9
<211> 2343
<212> DNA
<213> Schizochytrium sp. ATCC_20888
<220>
<223> hSzThACS-2 v3 gene
<300>
<302> POLYUNSATURATED FATTY ACID PRODUCTION IN HETEROLOGOUS ORGANISMS
USING PUFA POLYKETIDE SYNTHASE SYSTEMS
<310> US 2007-0245431 A1
<311> 2007-03-15
<312> 2007-10-18
<400> 9
atgcccactc cagatgccac tgcgcctctc aacaagccgt cagactatgc tgtgtaccac 60
gaagaggatg gtcctttctg gactgctgat tcctctggtg tcagcagagt gaacttctct 120
gaaactggtg tgggatctga aggtgtcatt cctgcgctca cactgattga tgtgtttgag 180
cgtgcggtca aacgtggtgg caataggatt gcattcagaa cagagaacat gccaaccttg 240
aggcgtggag aagaggctcc tgatgctttg ccgctcaaag attggaagtc ctggtcttgg 300
aaacagtaca aagctgatgt tcacagaatt gcgagggctc tgatggattt gggagttgag 360
cagcacgatg cggtctccat ctttggcttc aactcaccag aatggttcct cagtgctgtc 420
ggtgcagttc atgctggtgc caagatcgct ggaatctacc cttcagacac tcctgctcaa 480
gtgcagtaca aagccttcca ctctgacact gctgttgcag ttgtggagaa cgaacagtgc 540
ttcaagaaat tcgcagaggt ggttgaggat ctcccttacc tcaaagccat tgtttgttgg 600
gattatgaag ccacagacat cacaagggaa gatggttcag tggttgaagt cctgaccttt 660
gctgagttcc tgaagagagg tgacactgtg gaagcagctg cacttgatga gagaatcagc 720
aagattgagc ccaccatgtg tgctgccctg atctacacca gtggcacaac tgggagaccc 780
aaagctgtca tgatctccca tgacaacctt gtctttgaag catctgctgt ggtcccgaac 840
ttgggagggg catgcacgac cactgctgag gaaaggattc tttcctacct tcctttgtct 900
catgttgctg gaatgatggt tgacatcatt gctccaatca tagcgacagc gttccacaaa 960
ggaaggatct gtgtttgttt tgccagaccg tatgatttga gaactggaac ccttgggcaa 1020
agactcaatg cagtggagcc aaccatattc cttggtgtgc cacgtgtgtg ggaaaagatc 1080
caagagaaat tgatggctgt tggtgccaaa accactggtc tcaagaagaa actcagcacg 1140
gcagccaaga aacgtgggct tgaatttcaa gaggaacaac agatagggag aagtggtgcc 1200
aaccctggct ttggaccgct tggaatctac aagaaacttt tgggcctcat caaaggaaag 1260
ttggggctga ccaaatgcaa gtttgccttt gctggcgcag ctccaatgac ccgtgaaacc 1320
cttcagtact ttggagcgct gaacatcaac atcaatgagg tctatggaat gtctgaatgc 1380
agtggggctg ccacctggtc aactgacaaa gctcatgagt ggggcactgt tggctatgag 1440
atgccctcct gtgaagtcag agtgttcaag attgcggagg atggcaccaa gacagagtgc 1500
ccaagagctg ctgacatcat gcatgccaca gaagaggaac aaggtgaagt ttgcttccgt 1560
ggaaggaaca tcatgatggg atacttggcc aacccgaaac ttggtgatga ccatgttgct 1620
gagattgaag agaagaatgc agctgccata gatagcgaag ggtggcttca ctctggtgac 1680
aagggagcaa tttccacaag gggaatgctc aagataacgg gcagatacaa ggagcttatc 1740
ataggtgctg gtggggagaa tgtggctcct gttcccattg aagatgccat caaggcgagg 1800
atgccttttg tttcaaatgc aatgatggtt ggagacaaga ggaagttcat ggctgtcctt 1860
ctgactttga aaacggttgg agcaactgga gagcttcctg gcacaaacaa gctcatggga 1920
gcagctgcgg actatggtga gaccattgag gatgcctgtg acaatgaggc gctcattgaa 1980
gagataacgc agcaactcaa agagataggt gacgatggag atgtcacgcc aagcaatgca 2040
gcccgtatac aaaagttcac gattttgcca ctcgacttca gtgtctccac agatgaactg 2100
acagcaacgt tgaaattgaa gagaagtgtg gttgcagaca agtatgagga catcatagag 2160
gctttctatg agagcaagtc tgtctttgtg ccttactcaa cagttggagc ttatgcaacg 2220
ggtggaccag ttgatgactc tgttgtggat ggatcattca aaggtgactt tagcatgatt 2280
ggggatgacg atccggatct tcagaatgtg gatgtccttg aagcaattga tgaggacaac 2340
tga 2343
<210> 10
<211> 714
<212> DNA
<213> Nostoc sp. PCC 7120
<220>
<223> NoHetI v3 gene
<300>
<308> GenBank: P37695
<309> 1994-10-01
<400> 10
atgcttcagc acacttggct tccgaagcct cccaatctga ccctcttgtc agatgaggtt 60
catctctgga ggattcctct tgaccagcct gagtcacaac ttcaagacct tgctgccacc 120
ctgagcagtg atgaattggc gagggcaaac agattctact ttccagaaca cagaaggcgt 180
ttcactgctg ggagaggcat cctcagatcc atcttgggtg gatacttggg agtggaaccg 240
ggtcaagtca agtttgatta tgagtcccgt gggaaaccga tccttggtga cagatttgct 300
gagagtggac tcctgttcaa cttgtctcac agccagaacc ttgccttgtg tgctgtcaac 360
tacacgcgtc aaataggcat tgatcttgaa tatctgcgtc caacatctga cttggagtct 420
cttgcaaaga ggttctttct cccaagagaa tatgaactct tgaggtcact ccctgatgag 480
cagaaacaga agattttctt tcgttactgg acttgcaaag aggcttatct caaagcaacg 540
ggagatggaa tagccaaact tgaagagatc gagatagcac tcaccccaac agaacctgcc 600
aagctccaaa cagctcctgc gtggtctctg ttggagcttg tgccagatga caattgtgtt 660
gcagctgtgg ctgttgcggg ttttggttgg cagcccaagt tctggcatta ctga 714
<210> 11
<211> 240
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<223> Chloroplast targeting sequence from ribulose bisphosphate
carboxylase small chain 1A
<400> 11
atggcttcct ctatgctctc ttccgctact atggttgcct ctccggctca ggccactatg 60
gtcgctcctt tcaacggact taagtcctcc gctgccttcc cagccacccg caaggctaac 120
aacgacatta cttccatcac aagcaacggc ggaagagtta actgcatgca ggtgtggcct 180
ccgattggaa agaagaagtt tgagactctc tcttaccttc ctgaccttac cgattccgaa 240
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> TQPATS primer
<400> 12
acaagagtgg attgatgatc tagagaggt 29
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> TQPATA primer
<400> 13
ctttgatgcc tatgtgacac gtaaacagt 29
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> TQPATFQ primer
<400> 14
ggtgttgtgg ctggtattgc ttacgctgg 29
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> HMGF primer
<400> 15
cctctctacc accgtctcac atg 23
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> HMGR primer
<400> 16
gatctggccg gactgtttca 20
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> HMG-HEX primer
<400> 17
cgctcctcag ctaccacctc aacca 25
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> MAS480 primer
<400> 18
cgagttcgga ctcaacatgt tcca 24
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> MAS554 primer
<400> 19
aaggttgacg ccagcgacaa cgag 24
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> MAS547 primer
<400> 20
aagtttggag ttggcttctg cagc 24
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> MAS581 primer
<400> 21
tgagtttggt ctcaacatgt tcca 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> MAS556 primer
<400> 22
gatgcacgcc aaggtggttg acat 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> MAS481 primer
<400> 23
taatgtagaa gggcttgtcc tgcg 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> MAS550 primer
<400> 24
gatgcacgca aaggtggttg acat 24
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> MAS572 primer
<400> 25
tgatgtagaa gggtttgtct tgtg 24
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> MAS482 primer
<400> 26
catgagatgc atgacgagaa gagg 24
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> MAS483
<400> 27
tggcaacttg gttcactgtt ccag 24
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> MAS488 primer
<400> 28
cgcttcgtgt caagaccaac aaga 24
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> MAS489 primer
<400> 29
gcaccacgca aaatctgaag gttg 24
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> MAS496 primer
<400> 30
gaacttctct gaaactggtg tggg 24
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> MAS497
<400> 31
tcacaggcat cctcaatggt ctca 24
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> MAS500 primer
<400> 32
tcagatgagg ttcatctctg gagg 24
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> MAS501 primer
<400> 33
atctggcaca agctccaaca gaga 24
<210> 34
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<213> Artificial sequence
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<223> SzACS-2 v4
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<212> DNA
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<223> Plasmid pDAB7361 T-strand
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aggctggtga cagaagaatc ttcatggacc ctgcttcctt tgttgctgag gaactcaatc 11460
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gtggtcccga acttgggagg ggcatgcacg accactgctg aggaaaggat tctttcctac 25080
cttcctttgt ctcatgttgc tggaatgatg gttgacatca ttgctccaat catagcgaca 25140
gcgttccaca aaggaaggat ctgtgtttgt tttgccagac cgtatgattt gagaactgga 25200
acccttgggc aaagactcaa tgcagtggag ccaaccatat tccttggtgt gccacgtgtg 25260
tgggaaaaga tccaagagaa attgatggct gttggtgcca aaaccactgg tctcaagaag 25320
aaactcagca cggcagccaa gaaacgtggg cttgaatttc aagaggaaca acagataggg 25380
agaagtggtg ccaaccctgg ctttggaccg cttggaatct acaagaaact tttgggcctc 25440
atcaaaggaa agttggggct gaccaaatgc aagtttgcct ttgctggcgc agctccaatg 25500
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cactctggtg acaagggagc aatttccaca aggggaatgc tcaagataac gggcagatac 25920
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gcgctcattg aagagataac gcagcaactc aaagagatag gtgacgatgg agatgtcacg 26220
ccaagcaatg cagcccgtat acaaaagttc acgattttgc cactcgactt cagtgtctcc 26280
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atattataaa gaggaacttg gatgagaaag acgacgatgg gcaaaagttg catggcacac 27480
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gtaatggcgt acggttagct aaactaaagt aaaaatcgat tcgcttgagt aaaattagtg 28800
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ctcaataatt aattaggagt aaatctggct tcgaattttt aaattgtcaa cttccaaaga 28920
aggattggca agactcaatc tcaattgccc aacaaacata tggctcttta caaatttgga 28980
atctcttttt gatggcaaga acgtcgtaat tcctctgtcg atctcatgta attaccaaac 29040
tcatctactt attactttct ttatatgcac ttactgatgc ggccgcttaa ttaactactg 29100
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cttgaaagaa atatagttta aatatttatt gataaaataa caagtcaggt attatagtcc 31560
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aatgtgttat taagttgtct aagcgtcaat ttga 33034
<210> 36
<211> 33003
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Plasmid pDAB7362 T-strand
<400> 36
cagtcagcat catcacacca aaagttaggc ccgaatagtt tgaaattaga aagctcgcaa 60
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agcatcaaac gtgttgaaat cttgtctgag gtccaagcta tgttgaacgt ggaggcaaaa 5700
gatgtcgatg cgctttcaag aaccagaaca gtcggtgagg tcgtggacgc catgaaggct 5760
gaaattgccg gaagctctgc tagtgcgcca gctgcagccg cacctgcacc tgctgccgcg 5820
gcacctgctc cagctgcagc cgctcctgcc gtcagcaatg agttgctgga gaaagccgaa 5880
acagttgtga tggaagtcct tgctgcaaaa actggttacg aaacggacat gattgagtca 5940
gacatggaat tggagaccga acttggaata gattccatca agagagtgga gatcctctct 6000
gaggtgcaag ccatgctcaa cgttgaggct aaagatgttg atgcactcag taggacaaga 6060
actgtggggg aagttgtcga tgcgatgaag gctgagattg ctggaggctc tgctcctgcg 6120
ccggcagctg ccgcacctgc acccgcagcc gcggcaccag ctgtcagcaa cgaattgctt 6180
gagaaggctg aaacagttgt catggaagtg ctggctgcaa aaaccggcta tgagactgac 6240
atgattgagt ctgacatgga acttgagacg gaattgggca ttgacagcat caagcgtgtt 6300
gagatcctca gtgaagtcca agcaatgctc aatgtggagg ctaaggatgt ggatgccctc 6360
tcaaggacca gaacagttgg tgaggtcgtt gatgcgatga aggcggagat cgctggaagt 6420
tccgcgcctg cgccagctgc agccgctcct gcacccgcag ccgcggcacc ggctccagct 6480
gcagccgcac cggccgtctc ctcagaactc ctggaaaagg ctgagacagt tgtgatggaa 6540
gtccttgctg cgaaaactgg ctatgagacc gacatgattg aatctgacat ggaactggag 6600
accgagcttg gaattgactc catcaaacgt gttgaaatcc tctctgaggt tcaagcgatg 6660
ttgaatgtgg aggccaaaga tgttgatgct ctttccagaa caaggacggt gggagaggtg 6720
gttgatgcca tgaaggctga gatagctggg ggttctgctc ctgcgccagc tgcagccgct 6780
cctgctcccg ctgccgcggc accagctgtc agcaacgaac tccttgaaaa agctgaaact 6840
gttgtgatgg aggttttggc tgcaaagact ggatacgaga ctgacatgat agagtcagac 6900
atggagttgg aaacagagct tgggattgat agcatcaagc gtgtggaaat cctttctgag 6960
gttcaagcca tgctgaacgt tgaggccaaa gatgtcgatg ctttgtcaag gaccagaacg 7020
gttggagaag tggtcgatgc catgaaggct gagatagctg gtggatcagc ccctgctccg 7080
gctgcagccg ctcctgcaag tgccggtgct gcaccagctg tgaagattga ttcagttcat 7140
ggtgctgact gtgacgattt gtcactgatg cacgcaaagg tggttgacat cagaaggcca 7200
gatgaactga ttctggaaag accggagaac cgtccagttc ttgtcgttga cgatggctca 7260
gagttgacac ttgctcttgt gagggtgttg ggagcctgtg cagttgtctt gacctttgag 7320
ggattgcagt tggctcagag agctggtgca gctgccattc gtcatgttct ggctaaggac 7380
ctttcagcag aatcagctga gaaggccatc aaagaggctg agcaaagatt tggagcgttg 7440
ggaggcttca taagccagca agcagaaagg tttgaaccag ctgagatact gggtttcaca 7500
ctcatgtgtg cgaagtttgc caaagcctct ctctgcactg ctgtggctgg aggtcgtcct 7560
gccttcatcg gtgtggctag gcttgacggc agacttggat tcacctctca aggcacttct 7620
gacgcactca agagagcaca gcgtggagcg atctttggac tctgcaagac aatagggttg 7680
gagtggtcag aatctgatgt gttcagccgt ggtgtggaca ttgctcaagg gatgcaccca 7740
gaagatgctg cagttgccat agttagggag atggcgtgtg ctgacatcag aatcagagag 7800
gttgggattg gagcaaacca gcaaagatgc acaatcagag ctgccaagtt ggagactggg 7860
aaccctcaga gacagatagc gaaagacgat gtgcttctgg tttctggagg tgctcgtggg 7920
atcacacctc tttgcatccg tgagatcacg cgtcagattg ctggaggcaa gtacattctg 7980
ttgggtcgta gcaaagtttc tgcgtctgaa ccagcatggt gtgctggcat cactgatgag 8040
aaggctgtgc agaaagctgc cacccaagag ttgaagaggg ccttcagtgc tggtgaagga 8100
cccaaaccca ctccaagggc tgtcacgaaa cttgtgggat ctgttcttgg tgctcgtgaa 8160
gtgagaagct ccattgctgc cattgaagct ctgggtggca aagcgatcta cagctcttgt 8220
gatgtgaact ctgctgcaga tgttgccaaa gcagttaggg atgcagagtc ccagcttggt 8280
gccagagtta gtggaatcgt tcacgcttct ggtgtgctcc gtgatcgtct catagagaag 8340
aaactccctg acgagtttga tgctgtcttt gggaccaaag tcactgggtt ggagaatctt 8400
ctggctgcag ttgatcgtgc caacctcaaa cacatggttc tcttcagctc ccttgctggt 8460
ttccacggca atgttggtca gtctgactat gcgatggcaa acgaagctct caacaagatg 8520
ggtttggaac ttgcgaagga tgtcagtgtc aagtccatct gctttggtcc ctgggatggt 8580
gggatggtga cacctcaact caagaaacag tttcaagaaa tgggagttca gatcattcct 8640
cgtgaaggag gtgctgatac agttgcgagg attgtgttgg gatcaagtcc tgctgagatc 8700
cttgttggaa actggaggac accatccaag aaagttggaa gtgacacgat caccctgcat 8760
agaaagatca gtgccaagtc caatcccttc ttggaggatc atgtcataca aggcagaagg 8820
gtgttgccaa tgacccttgc tattgggagc cttgctgaga cctgccttgg actcttccct 8880
ggctactctc tctgggccat agatgacgca cagctcttca aaggtgtcac tgttgatgga 8940
gacgtcaact gtgaagtgac cctcacaccg tccactgctc cgagtgggag ggtgaatgtc 9000
caagcgacgc tcaagacgtt ctcaagtgga aaacttgttc cagcctacag agctgtcata 9060
gtgttgtcca accaaggtgc tccacctgcc aatgcaacca tgcagcctcc gagccttgat 9120
gcagatcctg ctttgcaagg gtcagtctat gatggcaaga ctctctttca tggtcctgcg 9180
ttcagaggca ttgatgacgt tctcagctgc accaagagcc agcttgttgc caagtgttct 9240
gctgttcctg gatcagatgc agccagagga gagtttgcaa ctgacactga tgcacatgat 9300
ccctttgtca atgatcttgc ctttcaagca atgttggtct gggtgaggag aacgctggga 9360
caagctgcac tcccgaactc cattcagagg atagtccaac acagaccggt cccacaagac 9420
aaacccttct acatcaccct cagatccaat cagagtggtg gacatagcca gcacaaacat 9480
gcacttcagt tccacaacga acaaggtgat ctcttcattg atgttcaagc ctctgtcatt 9540
gcgacagact cacttgcgtt ctgagtagtt agcttaatca cttaggtcac ccagtccaag 9600
cccggcctag cacgatgatc atgagtgttg ctattgatgt atgttaatac tatacacagt 9660
catcgtgtgt gttttataaa actgtaagct taggatgttt gaggctaatg taattagcac 9720
tacaccgtaa taaatgagag gtttacttta tgttttaata atgttcttac ccttgctgct 9780
ctctaaactg taatggcgta cggttagcta aactaaagta aaaatcgatt cgcttgagta 9840
aaattagtga ccgggaaaga tcatcgacta ctactgctca gagatgtaat cggtaattaa 9900
gacttcaagc tcaataatta attaggagta aatctggctt cgaattttta aattgtcaac 9960
ttccaaagaa ggattggcaa gactcaatct caattgccca acaaacatat ggctctttac 10020
aaatttggaa tctctttttg atggcaagaa cgtcgtaatt cctctgtcga tctcatgtaa 10080
ttaccaaact catctactta ttactttctt tatatgcact tactgatgcg gccgcttaat 10140
taagatgagt gatactcagg actcaggact cactctgctg atcactagtg ctagcctcga 10200
ggtcgacaca actttgtata caaaagttgt ctagacctag gctcagcaac tcatccagtc 10260
aagttcgagt cagtgagttg ggcggccgca gcttatagta aagatttttt tgttaataaa 10320
atgaaagtta atatttatgg atttatttga acatatttac aagtttttgt taataaattt 10380
atttacagaa gtgttaaatt tgaaaatgtg ttaaatgaga gttaatattt atggatataa 10440
tattacttta tttaaaaata aaatgaattt atattaaaat atgatttggt aaaagatatt 10500
ataaagagga acttggatga gaaagacgac gatgggcaaa agttgcatgg cacaccgctt 10560
ttgttcagta acatctgcac tgtggcgcct ttttcacact caccatgcat gctgccacgt 10620
cagctttcac actatgacac cactggccat acacgttgcc acctcagctt tctcctcttc 10680
tcactatgac acgactggcc atgcatgcat gcatgctgcc acctcagctc ccgcctcttc 10740
acccgtgtct ttctctcatg tcgcagtgct gcgtgccaac ctcttctctc tataaataga 10800
gagaagagaa tgatggttaa actcaaacca aaacaagaaa acatacacaa atagcaaaac 10860
ggatccacaa ccaaaaatgg ctgcaaggaa cgtgagtgcg gctcatgaga tgcatgacga 10920
gaagaggata gctgttgtgg gcatggctgt tcagtatgct ggatgcaaaa cgaaagacga 10980
gttctgggaa gttctcatga atggaaaagt tgagagcaaa gtgatcagcg acaaacgtct 11040
tggttcaaat taccgtgctg aacactacaa agctgaaagg agcaagtatg ctgacacctt 11100
ctgcaatgag acatatggaa ctcttgatga gaacgaaata gacaatgagc atgaactcct 11160
tttgaacctt gccaaacaag ccttggctga aacatctgtc aaagattcaa caagatgtgg 11220
catagtttct ggatgcctca gcttcccgat ggacaacctc caaggtgaac tcttgaatgt 11280
gtaccagaac catgttgaga agaaacttgg tgccagagtt ttcaaagatg cctctcactg 11340
gtcagaaaga gaacagtcca acaaaccaga ggctggtgac agaagaatct tcatggaccc 11400
tgcttccttt gttgctgagg aactcaatct tggcgctctc cactactctg ttgatgctgc 11460
ctgtgccact gcgctctatg tgctcagact ggcgcaagat cacttggtct ctggtgcagc 11520
tgatgtgatg ctttgtggtg caacatgcct gccggagccg tttttcatac tctctgggtt 11580
ctcaaccttc caagccatgc ctgttggaac gggtcagaat gtgtccatgc cgctgcacaa 11640
agattctcaa ggattgaccc ctggtgaagg aggttccatc atggtcctca aacgtttgga 11700
tgacgcaatc agagatggag atcacatcta tggaacactt ttgggagcca atgtcagcaa 11760
cagtggcact ggtctgccac ttaaacccct tttgccgtca gagaaaaagt gcctcatgga 11820
cacctacaca cgtatcaatg tgcatcccca caagattcag tatgttgaat gccatgcaac 11880
tgggactcca caaggtgatc gtgtggaaat tgatgctgtg aaggcttgct ttgaaggcaa 11940
agtcccacgt tttggaacca caaaagggaa ctttggacac acattggtgg cagctgggtt 12000
tgctggcatg tgcaaagtgc ttctctccat gaagcacggg atcattccac ccactccggg 12060
aatagatgac gaaacgaaga tggaccctct ggttgtctct ggtgaggcca ttccctggcc 12120
agaaacgaat ggagaaccga agcgtgctgg tctctcagcg tttggatttg gtgggaccaa 12180
tgctcatgct gtctttgagg aacatgaccc aagcaatgct gcatgcactg gccatgactc 12240
catttctgct ctctctgcac gttgtggtgg tgagtcaaac atgagaatag caatcactgg 12300
gatggatgcc acttttggtg ctttgaaagg attggatgct tttgaaaggg ccatctacac 12360
tggtgctcat ggtgctatac cactcccaga aaagagatgg agattcctgg ggaaagacaa 12420
ggacttcctt gatctttgtg gagtcaaagc aacaccgcat ggctgttaca ttgaagatgt 12480
tgaagttgat ttccagaggc tgaggactcc aatgactcct gaagatatgc tcttgcctca 12540
acagcttctg gctgtcacca caattgatag ggccatattg gactctggca tgaagaaagg 12600
tggaaatgtg gctgtctttg tggggttggg gaccgatctt gaactctacc gtcaccgtgc 12660
aagggttgct ctcaaggaga gagtgaggcc tgaagccagc aagaaactca atgacatgat 12720
gcagtacatc aatgattgtg ggacaagcac ttcttacacc agctacatag gcaacttggt 12780
tgcaacaagg gtcagttcac aatggggctt cacgggacct tccttcacaa tcacagaagg 12840
caacaattct gtgtacagat gtgctgaact tggcaaatac ctcttggaaa cgggagaggt 12900
tgatggggtt gtggttgcgg gtgttgatct ctgtgggagt gctgagaacc tttacgtcaa 12960
gtcaaggcgt ttcaaggtgt ctacatctga caccccgaga gccagctttg atgcagctgc 13020
tgatggttac tttgttggag agggctgtgg tgcatttgtg ctcaagcgtg agacaagctg 13080
caccaaggat gacagaatct atgcttgcat ggatgccata gttcctggaa atgttccatc 13140
tgcatgtttg agagaggcat tggatcaagc cagagtcaag cctggagaca tcgagatgtt 13200
ggagctttct gctgattcag cgaggcattt gaaggacccg tctgttctcc caaaggaact 13260
cactgctgag gaagagattg gcggacttca gacgattctt cgtgacgatg acaagctccc 13320
aaggaatgtt gcaactggaa gtgtcaaggc cactgttggt gacactggtt atgcttctgg 13380
tgctgccagt ttgattaagg ctgcgctttg catctacaac cgttacctgc ccagcaatgg 13440
agatgactgg gatgaacctg cacctgaagc accctgggac agcacactct ttgcgtgcca 13500
gacctcaaga gcttggttga agaaccctgg tgagagacgt tatgcggctg tttccggagt 13560
cagtgaaacc agaagttgct acagtgtgct gctttctgaa gcagagggac actacgagag 13620
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ccatgaagag attcttggaa gattggacaa gataagggaa aggttcttgc agcccacggg 13740
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cttggtctcc actccatcca agctccagag agaggtggaa cttgcggcaa aaggcattcc 13920
gagatgtctc aagatgagac gtgattggag ttcccctgct ggaagcagat atgcgcctga 13980
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catcacacaa gacattcata ggatttggcc tgaacttcat gaggtcatca atgagaaaac 14100
aaaccgtctc tgggctgaag gtgacagatg ggtcatgcca agggccagct tcaagagtga 14160
gcttgagtca caacagcaag agtttgacag aaacatgatt gaaatgttcc gtcttggaat 14220
cctcacctca attgccttca caaacctggc gagagatgtt ctcaacatca cgcccaaagc 14280
agcctttgga ctcagtttgg gagagatttc catgatcttt gctttctcca agaaaaacgg 14340
tttgataagc gatcagttga caaaggattt gagagagtca gatgtctgga acaaagctct 14400
ggctgttgag ttcaatgcgc tcagagaagc ctggggcatt ccacagtctg tcccaaaaga 14460
tgagttctgg caaggttaca tagtgagggg aacgaaacaa gacatagaag cagccatagc 14520
accagactca aagtatgtga ggttgaccat catcaatgat gccaacactg ctctcatcag 14580
tggaaagcct gatgcatgca aagctgcgat tgctcgtctt ggtggcaaca tccctgcgct 14640
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cataaaccag aagaggcttg tgccaagagc cacgggtgcc aaagatgaat gggctccttc 14820
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ggcttgttat gctgcgctct gtaaaggtga gaaacccaag aaaaacaagt ttgtgagaaa 15180
gattcagttg aatggcagat tcaacagcaa ggcagacccc atctcctcag cagaccttgc 15240
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tgtggctccg aaattctatg cgcgtctcaa cattgatgag caagatgaga ccagagatcc 15360
gatcttgaac aaggacaatg cgccttccag ctccagctct tccagcagtt cctcttccag 15420
cagttcatct ccgtctcctg ctccttcagc tccagttcag aagaaagctg ccccagctgc 15480
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gatcaacaaa cagattctta gaggagcgtg cttcttgagg cgtcttgaaa tactgagaaa 16980
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tgctgagaag ctgtgagtag ttagcttaat cacttaggtc acccagtcca agcccggcct 17100
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atttaaaaat aaaatgaatt tatattaaaa tatgatttgg taaaagatat tataaagagg 18000
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ggctgccaga gctaagattc caaagcaaga tgtttctccc tatgctgtcg ctccctgcct 19080
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cgtcatggag atcaaagaga tgggattcga cgaggataac gatccgtacg ccattgctga 19560
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cgactacgga aagggggatc ttaacaaaaa gatcgtcgtg gacttcaagg gcattgctct 19680
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ccgcagctta tagtaaagat ttttttgtta ataaaatgaa agttaatatt tatggattta 300
tttgaacata tttacaagtt tttgttaata aatttattta cagaagtgtt aaatttgaaa 360
atgtgttaaa tgagagttaa tatttatgga tataatatta ctttatttaa aaataaaatg 420
aatttatatt aaaatatgat ttggtaaaag atattataaa gaggaacttg gatgagaaag 480
acgacgatgg gcaaaagttg catggcacac cgcttttgtt cagtaacatc tgcactgtgg 540
cgcctttttc acactcacca tgcatgctgc cacgtcagct ttcacactat gacaccactg 600
gccatacacg ttgccacctc agctttctcc tcttctcact atgacacgac tggccatgca 660
tgcatgcatg ctgccacctc agctcccgcc tcttcacccg tgtctttctc tcatgtcgca 720
gtgctgcgtg ccaacctctt ctctctataa atagagagaa gagaatgatg gttaaactca 780
aaccaaaaca agaaaacata cacaaatagc aaaacggatc cacaaccaaa aatggcttcc 840
tctatgctct cttccgctac tatggttgcc tctccggctc aggccactat ggtcgctcct 900
ttcaacggac ttaagtcctc cgctgccttc ccagccaccc gcaaggctaa caacgacatt 960
acttccatca caagcaacgg cggaagagtt aactgcatgc aggtgtggcc tccgattgga 1020
aagaagaagt ttgagactct ctcttacctt cctgacctta ccgattccga agcagcgagg 1080
ctgcaagagc agaaaggagg tgagatggac acgaggattg cgatcatagg catgagcgcc 1140
atacttcctt gtggaaccac ggtgagagag tcatgggaga ccataagggc tggcattgat 1200
tgcctgtctg atcttcctga ggatcgtgtt gatgtgactg cgtactttga cccagtcaag 1260
accacaaagg acaaaatcta ctgcaagaga ggaggtttca ttcctgagta tgactttgat 1320
gcgcgtgagt ttggtctcaa catgttccag atggaagatt ctgatgcgaa tcagaccatc 1380
tcacttctca aggtcaaaga agcacttcaa gatgctggga ttgatgcact tggaaaggag 1440
aagaaaaaca taggatgcgt gcttggcatt ggaggtggac agaagagttc acatgagttc 1500
tacagcagac tcaactatgt ggttgtggag aaagtcttga gaaagatggg gatgccagag 1560
gaagatgtca aagtggctgt ggagaagtac aaagcgaact tcccagaatg gagacttgac 1620
tctttccctg gattccttgg gaatgtcact gctggcagat gcaccaacac attcaacttg 1680
gatggcatga actgcgttgt ggatgctgca tgtgcaagct ccttgatagc agtcaaggtt 1740
gcgattgatg aactgctcta tggtgactgc gacatgatgg tcactggtgc aacctgcaca 1800
gacaactcca ttgggatgta catggctttc tcaaagacac ctgtgttcag cacggaccca 1860
agtgtgagag cgtatgatga gaaaacgaaa gggatgctca ttggtgaggg atcagccatg 1920
ttggtgctca aacgttatgc agatgcagtg agggatggtg atgagattca tgctgtgatt 1980
cgtggttgtg caagctcaag tgatggcaaa gcagctggca tctacactcc cacaatcagt 2040
ggtcaagagg aagccttgag acgtgcatac aatcgtgcct gcgttgaccc tgccactgtc 2100
actttggttg agggtcatgg gactggcact ccagttggag ataggattga gttgactgcg 2160
ttgaggaact tgtttgacaa agcgtatggt gaagggaaca cagagaaagt tgcagttgga 2220
agtatcaagt ccagtattgg tcatttgaag gctgttgctg gtcttgctgg aatgatcaag 2280
gtcatcatgg ctctcaaaca caagactttg cctggaacga tcaatgtgga caatccaccc 2340
aatctctatg acaacactcc catcaatgag tcatccctct acatcaacac gatgaacaga 2400
ccctggttcc ctccacctgg tgttccgaga cgtgctggaa tatccagctt tggctttgga 2460
ggtgccaact accatgcagt gttggaagag gctgaaccag agcacacgac agcgtacaga 2520
ctcaacaaac gtccacaacc ggtgttgatg atggctgcaa ctcctgctgc gttgcagagc 2580
ctttgtgaag ctcagctgaa agagtttgaa gctgcgatca aggagaatga gacagtcaag 2640
aatactgcct acatcaagtg tgtcaagttt ggagaacagt tcaagttccc tgggagcata 2700
cctgcgacca atgcgagact gggattcttg gtcaaagatg cggaggatgc gtgctccacg 2760
cttcgtgcta tatgtgctca gtttgccaaa gatgtgacca aagaagcgtg gaggcttccg 2820
agagaaggag tttctttccg tgccaaaggc attgccacca atggtgctgt tgctgcactc 2880
ttctctggac aaggtgctca gtacacacac atgttcagtg aagttgcgat gaactggcct 2940
cagttcagac agtccattgc tgcaatggac gctgcacagt ccaaggttgc tggaagtgac 3000
aaagactttg aaagagtctc tcaagtcctg tacccaagga aaccgtacga acgtgagcca 3060
gaacaagatc acaagaaaat ctcactcaca gcatacagcc agccgtcaac cctggcatgt 3120
gctcttggtg cctttgagat tttcaaggaa gctggattca ctccagactt tgcagctgga 3180
cacagcttgg gtgagtttgc tgcgctctat gcagctggtt gtgttgacag agatgagttg 3240
tttgaacttg tttgcagaag ggcaaggatc atgggaggca aagatgcacc tgccacaccc 3300
aaaggttgca tggcagctgt cataggaccc aacgcagaga acatcaaggt tcaagctgcc 3360
aacgtctggc ttggaaactc aaactctccg tctcagactg tcattactgg gtctgttgaa 3420
gggattcaag ctgaaagtgc cagattgcag aaggaagggt tcagagttgt gcctcttgct 3480
tgtgagtctg ccttccattc tccacagatg gaaaatgcca gctcagcttt caaagatgtc 3540
atatccaagg tttccttccg tacacccaaa gcagaaacaa agctcttcag caatgtttct 3600
ggagagacct atccgacgga tgccagagag atgctcactc aacacatgac ctcatctgtg 3660
aagttcctga cccaagtgag gaacatgcac caagctggtg cgagaatctt tgttgagttt 3720
ggaccgaaac aagttctcag caaacttgtt tctgaaaccc tcaaagatga cccgtctgtt 3780
gtcacagtgt ctgtgaaccc agcttctggc acggactctg acatacagtt gagggatgct 3840
gcagttcagc tggttgtggc tggtgtcaat cttcaagggt ttgacaagtg ggatgctcct 3900
gatgccacga ggatgcaagc catcaagaaa aagagaacca cactcagact ttcagctgcc 3960
acctatgtca gtgacaagac caagaaagtg agggatgctg ccatgaacga cggaagatgt 4020
gtcacatacc tcaagggtgc tgcaccactc atcaaggctc ctgaacctgt ggttgacgaa 4080
gctgccaaga gggaggctga aaggcttcag aaggagcttc aagacgctca gaggcagctt 4140
gacgacgcca aacgtgcagc tgcagaagcc aactccaaac ttgctgctgc caaggaggaa 4200
gccaagactg ctgcagcttc agccaagcct gcagttgaca ctgctgttgt ggagaaacat 4260
cgtgccatcc tcaagtccat gctggctgag ctggatggtt atggaagtgt tgatgcttct 4320
tcccttcagc aacagcaaca gcaacagact gctccggcgc ctgttaaagc cgctgcccct 4380
gccgctcccg ttgcaagtgc tcctgctccc gccgtgtcca acgagttgct tgagaaagct 4440
gagacagttg tgatggaggt tctcgctgcc aagactggat acgaaacaga catgattgag 4500
gcggacatgg agcttgagac tgagttggga attgacagca tcaagagggt tgaaattctt 4560
tctgaagtcc aagctatgct taacgttgag gcgaaagatg ttgatgctct ctctaggacg 4620
agaacagtgg gtgaagttgt caacgctatg aaggcagaaa tcgctggttc ttccgctccg 4680
gcgccggcag ctgccgcacc tgcaccggct aaagcggctc cagctgcagc tgcaccagct 4740
gtttctaatg agctgctcga aaaggcagaa actgttgtga tggaagtcct tgctgccaaa 4800
actggctacg aaactgacat gatagaatca gacatggagc ttgagacgga gcttggaatt 4860
gattccatca agcgtgtgga aatcctcagt gaagtccaag ccatgctcaa tgtggaagct 4920
aaggatgtgg atgctctctc aaggaccaga actgtcggtg aggttgtcaa tgccatgaag 4980
gctgagatag ctggaggctc cgctcctgcg ccggccgctg ccgctcctgg tcccgctgcc 5040
gcggctccag ctccagctgc agccgctccg gccgtctcaa acgaactcct tgaaaaagct 5100
gagaccgtcg tgatggaggt cttggcagct aaaaccggct atgagactga catgattgag 5160
tctgacatgg aattggagac agaacttggg atagacagca tcaaacgtgt tgaaatcctc 5220
agtgaggtcc aagctatgct gaacgtggaa gcgaaggatg ttgatgctct gtccagaacg 5280
aggaccgttg gtgaggttgt ggatgccatg aaggctgaaa ttgctggagg gtctgcgccc 5340
gcgccagctg cagccgctcc tgcacccgca gccgcggcac ctgctccagc tgcacctgca 5400
cctgccgttt cttcagaact cttggagaag gctgagacgg ttgtgatgga ggttttggct 5460
gcaaagactg gctatgagac cgacatgatt gaatctgata tggaattgga gacagagctt 5520
gggatcgatt ccatcaaaag agtggagatc ctgagtgaag tccaagccat gctcaatgtt 5580
gaagctaagg atgttgatgc actttcaaga acaaggacag tgggtgaggt tgtggatgcc 5640
atgaaggcgg agattgctgg agggagcgcg cctgcgccag ctgccgcggc acctgcaccg 5700
gcagccgcag ctccagctcc agctgcacca gcaccggccg cgcccgcgcc agctgtttca 5760
tccgaactcc tggaaaaggc cgagacggtt gtgatggagg tgctcgcagc taagactggt 5820
tacgagaccg acatgattga aagtgacatg gagcttgaaa ccgagttggg aatagatagc 5880
atcaaacgtg ttgaaatctt gtctgaggtc caagctatgt tgaacgtgga ggcaaaagat 5940
gtcgatgcgc tttcaagaac cagaacagtc ggtgaggtcg tggacgccat gaaggctgaa 6000
attgccggaa gctctgctag tgcgccagct gcagccgcac ctgcacctgc tgccgcggca 6060
cctgctccag ctgcagccgc tcctgccgtc agcaatgagt tgctggagaa agccgaaaca 6120
gttgtgatgg aagtccttgc tgcaaaaact ggttacgaaa cggacatgat tgagtcagac 6180
atggaattgg agaccgaact tggaatagat tccatcaaga gagtggagat cctctctgag 6240
gtgcaagcca tgctcaacgt tgaggctaaa gatgttgatg cactcagtag gacaagaact 6300
gtgggggaag ttgtcgatgc gatgaaggct gagattgctg gaggctctgc tcctgcgccg 6360
gcagctgccg cacctgcacc cgcagccgcg gcaccagctg tcagcaacga attgcttgag 6420
aaggctgaaa cagttgtcat ggaagtgctg gctgcaaaaa ccggctatga gactgacatg 6480
attgagtctg acatggaact tgagacggaa ttgggcattg acagcatcaa gcgtgttgag 6540
atcctcagtg aagtccaagc aatgctcaat gtggaggcta aggatgtgga tgccctctca 6600
aggaccagaa cagttggtga ggtcgttgat gcgatgaagg cggagatcgc tggaagttcc 6660
gcgcctgcgc cagctgcagc cgctcctgca cccgcagccg cggcaccggc tccagctgca 6720
gccgcaccgg ccgtctcctc agaactcctg gaaaaggctg agacagttgt gatggaagtc 6780
cttgctgcga aaactggcta tgagaccgac atgattgaat ctgacatgga actggagacc 6840
gagcttggaa ttgactccat caaacgtgtt gaaatcctct ctgaggttca agcgatgttg 6900
aatgtggagg ccaaagatgt tgatgctctt tccagaacaa ggacggtggg agaggtggtt 6960
gatgccatga aggctgagat agctgggggt tctgctcctg cgccagctgc agccgctcct 7020
gctcccgctg ccgcggcacc agctgtcagc aacgaactcc ttgaaaaagc tgaaactgtt 7080
gtgatggagg ttttggctgc aaagactgga tacgagactg acatgataga gtcagacatg 7140
gagttggaaa cagagcttgg gattgatagc atcaagcgtg tggaaatcct ttctgaggtt 7200
caagccatgc tgaacgttga ggccaaagat gtcgatgctt tgtcaaggac cagaacggtt 7260
ggagaagtgg tcgatgccat gaaggctgag atagctggtg gatcagcccc tgctccggct 7320
gcagccgctc ctgcaagtgc cggtgctgca ccagctgtga agattgattc agttcatggt 7380
gctgactgtg acgatttgtc actgatgcac gcaaaggtgg ttgacatcag aaggccagat 7440
gaactgattc tggaaagacc ggagaaccgt ccagttcttg tcgttgacga tggctcagag 7500
ttgacacttg ctcttgtgag ggtgttggga gcctgtgcag ttgtcttgac ctttgaggga 7560
ttgcagttgg ctcagagagc tggtgcagct gccattcgtc atgttctggc taaggacctt 7620
tcagcagaat cagctgagaa ggccatcaaa gaggctgagc aaagatttgg agcgttggga 7680
ggcttcataa gccagcaagc agaaaggttt gaaccagctg agatactggg tttcacactc 7740
atgtgtgcga agtttgccaa agcctctctc tgcactgctg tggctggagg tcgtcctgcc 7800
ttcatcggtg tggctaggct tgacggcaga cttggattca cctctcaagg cacttctgac 7860
gcactcaaga gagcacagcg tggagcgatc tttggactct gcaagacaat agggttggag 7920
tggtcagaat ctgatgtgtt cagccgtggt gtggacattg ctcaagggat gcacccagaa 7980
gatgctgcag ttgccatagt tagggagatg gcgtgtgctg acatcagaat cagagaggtt 8040
gggattggag caaaccagca aagatgcaca atcagagctg ccaagttgga gactgggaac 8100
cctcagagac agatagcgaa agacgatgtg cttctggttt ctggaggtgc tcgtgggatc 8160
acacctcttt gcatccgtga gatcacgcgt cagattgctg gaggcaagta cattctgttg 8220
ggtcgtagca aagtttctgc gtctgaacca gcatggtgtg ctggcatcac tgatgagaag 8280
gctgtgcaga aagctgccac ccaagagttg aagagggcct tcagtgctgg tgaaggaccc 8340
aaacccactc caagggctgt cacgaaactt gtgggatctg ttcttggtgc tcgtgaagtg 8400
agaagctcca ttgctgccat tgaagctctg ggtggcaaag cgatctacag ctcttgtgat 8460
gtgaactctg ctgcagatgt tgccaaagca gttagggatg cagagtccca gcttggtgcc 8520
agagttagtg gaatcgttca cgcttctggt gtgctccgtg atcgtctcat agagaagaaa 8580
ctccctgacg agtttgatgc tgtctttggg accaaagtca ctgggttgga gaatcttctg 8640
gctgcagttg atcgtgccaa cctcaaacac atggttctct tcagctccct tgctggtttc 8700
cacggcaatg ttggtcagtc tgactatgcg atggcaaacg aagctctcaa caagatgggt 8760
ttggaacttg cgaaggatgt cagtgtcaag tccatctgct ttggtccctg ggatggtggg 8820
atggtgacac ctcaactcaa gaaacagttt caagaaatgg gagttcagat cattcctcgt 8880
gaaggaggtg ctgatacagt tgcgaggatt gtgttgggat caagtcctgc tgagatcctt 8940
gttggaaact ggaggacacc atccaagaaa gttggaagtg acacgatcac cctgcataga 9000
aagatcagtg ccaagtccaa tcccttcttg gaggatcatg tcatacaagg cagaagggtg 9060
ttgccaatga cccttgctat tgggagcctt gctgagacct gccttggact cttccctggc 9120
tactctctct gggccataga tgacgcacag ctcttcaaag gtgtcactgt tgatggagac 9180
gtcaactgtg aagtgaccct cacaccgtcc actgctccga gtgggagggt gaatgtccaa 9240
gcgacgctca agacgttctc aagtggaaaa cttgttccag cctacagagc tgtcatagtg 9300
ttgtccaacc aaggtgctcc acctgccaat gcaaccatgc agcctccgag ccttgatgca 9360
gatcctgctt tgcaagggtc agtctatgat ggcaagactc tctttcatgg tcctgcgttc 9420
agaggcattg atgacgttct cagctgcacc aagagccagc ttgttgccaa gtgttctgct 9480
gttcctggat cagatgcagc cagaggagag tttgcaactg acactgatgc acatgatccc 9540
tttgtcaatg atcttgcctt tcaagcaatg ttggtctggg tgaggagaac gctgggacaa 9600
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cccttctaca tcaccctcag atccaatcag agtggtggac atagccagca caaacatgca 9720
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cgtgtgtgtt ttataaaact gtaagcttag gatgtttgag gctaatgtaa ttagcactac 9960
accgtaataa atgagaggtt tactttatgt tttaataatg ttcttaccct tgctgctctc 10020
taaactgtaa tggcgtacgg ttagctaaac taaagtaaaa atcgattcgc ttgagtaaaa 10080
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ttcaagctca ataattaatt aggagtaaat ctggcttcga atttttaaat tgtcaacttc 10200
caaagaagga ttggcaagac tcaatctcaa ttgcccaaca aacatatggc tctttacaaa 10260
tttggaatct ctttttgatg gcaagaacgt cgtaattcct ctgtcgatct catgtaatta 10320
ccaaactcat ctacttatta ctttctttat atgcacttac tgatgcggcc gcttaattaa 10380
gatgagtgat actcaggact caggactcac tctgctgatc actagtgcta gcctcgaggt 10440
cgacacaact ttgtatacaa aagttgtcta gacctaggct cagcaactca tccagtcaag 10500
ttcgagtcag tgagttgggc ggccgcagct tatagtaaag atttttttgt taataaaatg 10560
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tacagaagtg ttaaatttga aaatgtgtta aatgagagtt aatatttatg gatataatat 10680
tactttattt aaaaataaaa tgaatttata ttaaaatatg atttggtaaa agatattata 10740
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ttcagtaaca tctgcactgt ggcgcctttt tcacactcac catgcatgct gccacgtcag 10860
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cgtgtctttc tctcatgtcg cagtgctgcg tgccaacctc ttctctctat aaatagagag 11040
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ccgcaaggct aacaacgaca ttacttccat cacaagcaac ggcggaagag ttaactgcat 11280
gcaggtgtgg cctccgattg gaaagaagaa gtttgagact ctctcttacc ttcctgacct 11340
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aaattaccgt gctgaacact acaaagctga aaggagcaag tatgctgaca ccttctgcaa 11580
tgagacatat ggaactcttg atgagaacga aatagacaat gagcatgaac tccttttgaa 11640
ccttgccaaa caagccttgg ctgaaacatc tgtcaaagat tcaacaagat gtggcatagt 11700
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gaaccatgtt gagaagaaac ttggtgccag agttttcaaa gatgcctctc actggtcaga 11820
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ctttgttgct gaggaactca atcttggcgc tctccactac tctgttgatg ctgcctgtgc 11940
cactgcgctc tatgtgctca gactggcgca agatcacttg gtctctggtg cagctgatgt 12000
gatgctttgt ggtgcaacat gcctgccgga gccgtttttc atactctctg ggttctcaac 12060
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cactggtctg ccacttaaac cccttttgcc gtcagagaaa aagtgcctca tggacaccta 12300
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tgacgaaacg aagatggacc ctctggttgt ctctggtgag gccattccct ggccagaaac 12600
gaatggagaa ccgaagcgtg ctggtctctc agcgtttgga tttggtggga ccaatgctca 12660
tgctgtcttt gaggaacatg acccaagcaa tgctgcatgc actggccatg actccatttc 12720
tgctctctct gcacgttgtg gtggtgagtc aaacatgaga atagcaatca ctgggatgga 12780
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ccttgatctt tgtggagtca aagcaacacc gcatggctgt tacattgaag atgttgaagt 12960
tgatttccag aggctgagga ctccaatgac tcctgaagat atgctcttgc ctcaacagct 13020
tctggctgtc accacaattg atagggccat attggactct ggcatgaaga aaggtggaaa 13080
tgtggctgtc tttgtggggt tggggaccga tcttgaactc taccgtcacc gtgcaagggt 13140
tgctctcaag gagagagtga ggcctgaagc cagcaagaaa ctcaatgaca tgatgcagta 13200
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ttctgtgtac agatgtgctg aacttggcaa atacctcttg gaaacgggag aggttgatgg 13380
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ggatgacaga atctatgctt gcatggatgc catagttcct ggaaatgttc catctgcatg 13620
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ggccgcttaa ttaatctgat catggatgct acgtcacggc agtacaggac tatcactaga 27840
cctaggagct gtgctgggta actcacatga gtcactggtc acatcagcgg ccgcagctta 27900
tagtaaagat ttttttgtta ataaaatgaa agttaatatt tatggattta tttgaacata 27960
tttacaagtt tttgttaata aatttattta cagaagtgtt aaatttgaaa atgtgttaaa 28020
tgagagttaa tatttatgga tataatatta ctttatttaa aaataaaatg aatttatatt 28080
aaaatatgat ttggtaaaag atattataaa gaggaacttg gatgagaaag acgacgatgg 28140
gcaaaagttg catggcacac cgcttttgtt cagtaacatc tgcactgtgg cgcctttttc 28200
acactcacca tgcatgctgc cacgtcagct ttcacactat gacaccactg gccatacacg 28260
ttgccacctc agctttctcc tcttctcact atgacacgac tggccatgca tgcatgcatg 28320
ctgccacctc agctcccgcc tcttcacccg tgtctttctc tcatgtcgca gtgctgcgtg 28380
ccaacctctt ctctctataa atagagagaa gagaatgatg gttaaactca aaccaaaaca 28440
agaaaacata cacaaatagc aaaacggatc cacaaccaaa aatggcttcc tctatgctct 28500
cttccgctac tatggttgcc tctccggctc aggccactat ggtcgctcct ttcaacggac 28560
ttaagtcctc cgctgccttc ccagccaccc gcaaggctaa caacgacatt acttccatca 28620
caagcaacgg cggaagagtt aactgcatgc aggtgtggcc tccgattgga aagaagaagt 28680
ttgagactct ctcttacctt cctgacctta ccgattccga acttcagcac acttggcttc 28740
cgaagcctcc caatctgacc ctcttgtcag atgaggttca tctctggagg attcctcttg 28800
accagcctga gtcacaactt caagaccttg ctgccaccct gagcagtgat gaattggcga 28860
gggcaaacag attctacttt ccagaacaca gaaggcgttt cactgctggg agaggcatcc 28920
tcagatccat cttgggtgga tacttgggag tggaaccggg tcaagtcaag tttgattatg 28980
agtcccgtgg gaaaccgatc cttggtgaca gatttgctga gagtggactc ctgttcaact 29040
tgtctcacag ccagaacctt gccttgtgtg ctgtcaacta cacgcgtcaa ataggcattg 29100
atcttgaata tctgcgtcca acatctgact tggagtctct tgcaaagagg ttctttctcc 29160
caagagaata tgaactcttg aggtcactcc ctgatgagca gaaacagaag attttctttc 29220
gttactggac ttgcaaagag gcttatctca aagcaacggg agatggaata gccaaacttg 29280
aagagatcga gatagcactc accccaacag aacctgccaa gctccaaaca gctcctgcgt 29340
ggtctctgtt ggagcttgtg ccagatgaca attgtgttgc agctgtggct gttgcgggtt 29400
ttggttggca gcccaagttc tggcattact gagtagttag cttaatcact taggtcaccc 29460
agtccaagcc cggcctagca cgatgatcat gagtgttgct attgatgtat gttaatacta 29520
tacacagtca tcgtgtgtgt tttataaaac tgtaagctta ggatgtttga ggctaatgta 29580
attagcacta caccgtaata aatgagaggt ttactttatg ttttaataat gttcttaccc 29640
ttgctgctct ctaaactgta atggcgtacg gttagctaaa ctaaagtaaa aatcgattcg 29700
cttgagtaaa attagtgacc gggaaagatc atcgactact actgctcaga gatgtaatcg 29760
gtaattaaga cttcaagctc aataattaat taggagtaaa tctggcttcg aatttttaaa 29820
ttgtcaactt ccaaagaagg attggcaaga ctcaatctca attgcccaac aaacatatgg 29880
ctctttacaa atttggaatc tctttttgat ggcaagaacg tcgtaattcc tctgtcgatc 29940
tcatgtaatt accaaactca tctacttatt actttcttta tatgcactta ctgatgcggc 30000
cgcttaatta actactgtca ctgaggccgt agacgagtac ggactgatct aactagtgct 30060
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taaattcaat taatgcaatc ttgattttca acaacgaagg taatggcgta aaagaaaaaa 30180
tgtatgttat tgtattgatc tttcatgatg ttgaagcgtg ccataatatg atgatgtata 30240
attaaaatat taactgtcgc attttattga aatggcactg ttatttcaac catatctttg 30300
attctgttac atgacacgac tgcaagaagt aaataataga cgccgttgtt aaagaattgc 30360
tatcatatgt gcctaactag agggaatttg agcgtcagac ctaatcaaat attacaaaat 30420
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ctttgttgaa aaacaaattg cctttgggga gacggtaaag ccagttgctc ttcaataagg 30660
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ttgtattcaa gataccgcaa aaaacttatg gtttaaaccc tgcaggacta gtccagaagg 30780
taattatcca agatgtagca tcaagaatcc aatgtttacg ggaaaaacta tggaagtatt 30840
atgtaagctc agcaagaagc agatcaatat gcggcacata tgcaacctat gttcaaaaat 30900
gaagaatgta cagatacaag atcctatact gccagaatac gaagaagaat acgtagaaat 30960
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gaaaatgtaa gggcggaaag taaccttatc acaaaggaat cttatccccc actacttatc 31140
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ggcatttgtg aaaacaagaa aaaatttggt gtaagctatt ttctttgaag tactgaggat 31260
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atatcgttaa ccattacatt gagacgtcta cagtgaactt taggacagag ccacaaacac 31440
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aggttgaggg tgttgtggct ggtattgctt acgctgggcc ctggaaggct aggaacgctt 31560
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gatctacatt gtacacacat ttgcttaagt ctatggaggc gcaaggtttt aagtctgtgg 31680
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tcataatttt acatgtattt gaaaaataaa aatttatggt attcaattta aacacgtata 32400
cttgtaaaga atgatatctt gaaagaaata tagtttaaat atttattgat aaaataacaa 32460
gtcaggtatt atagtccaag caaaaacata aatttattga tgcaagttta aattcagaaa 32520
tatttcaata actgattata tcagctggta cattgccgta gatgaaagac tgagtgcgat 32580
attatggtgt aatacatagg aattcgttta aacgatctgc gtctaatttt cggtccaact 32640
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tattggagtg cggattttcg ttggcatatt attcgccacg agttagcaga cgaagagacc 33000
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cttcatttga ataagatgtt agcaattgtt tttagctttg tcttgttgtg gcagggcggc 33420
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tttggaaata atagactgcg tcttaaaatt cagatgtctg gatatagata tgattgtaaa 33540
ataacctatt taagtgtcat ttagaacata agttttatga atgttcttcc attttcgtca 33600
tcgaacgaat aagagtaaat acaccttttt taacattaca aataagttct tatacgttgt 33660
ttatacaccg ggaatcattt ccattatttt cgcgcaaaag tcacggatat tcgtgaaagc 33720
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<210> 38
<211> 105
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Acyl-ACP Thioesterase Transit Peptide
<400> 38
atgcttaagc tctcttgtaa cgttaccaat catcttcaca cattctcatt ctttagcgat 60
tctagtctgt tcatccctgt caacagaagg actcttgctg tgtct 105
<210> 39
<211> 38811
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> plasmid pDAB7365
<400> 39
cttgtacaaa gtggttgcgg ccgcttaatt aaatttaaat tcaattaatg caatcttgat 60
tttcaacaac gaaggtaatg gcgtaaaaga aaaaatgtat gttattgtat tgatctttca 120
tgatgttgaa gcgtgccata atatgatgat gtataattaa aatattaact gtcgcatttt 180
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gaagtaaata atagacgccg ttgttaaaga attgctatca tatgtgccta actagaggga 300
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tgtctttatt gtcgccgtat gtaatcggcg tcacaaaata atccccggtg actttctttt 2160
aatccaggat gaaataatat gttattataa tttttgcgat ttggtccgtt ataggaattg 2220
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ataaaaattt atggtattca atttaaacac gtatacttgt aaagaatgat atcttgaaag 2340
aaatatagtt taaatattta ttgataaaat aacaagtcag gtattatagt ccaagcaaaa 2400
acataaattt attgatgcaa gtttaaattc agaaatattt caataactga ttatatcagc 2460
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aaattcagat gtctggatat agatatgatt gtaaaataac ctatttaagt gtcatttaga 3480
acataagttt tatgaatgtt cttccatttt cgtcatcgaa cgaataagag taaatacacc 3540
ttttttaaca ttacaaataa gttcttatac gttgtttata caccgggaat catttccatt 3600
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aatgtacttt cattttataa taacgctgcg gacatctaca tttttgaatt gaaaaaaaat 4140
tggtaattac tctttctttt tctccatatt gaccatcata ctcattgctg atccatgtag 4200
atttcccgga catgaagcca tttacaattg aatatatcct gccgccgctg ccgctttgca 4260
cccggtggag cttgcatgtt ggtttctacg cagaactgag ccggttaggc agataatttc 4320
cattgagaac tgagccatgt gcaccttccc cccaacacgg tgagcgacgg ggcaacggag 4380
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caggtacaat cgagccgacg ttcacgcgga acgaccaagc aagcttggct gccatttttg 4560
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gtggacagcc cctcaaatgt caataggtgc gcccctcatc tgtcagcact ctgcccctca 4860
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agggcactta tccccaggct tgtccacatc atctgtggga aactcgcgta aaatcaggcg 4980
ttttcgccga tttgcgaggc tggccagctc cacgtcgccg gccgaaatcg agcctgcccc 5040
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tatacaggat tttgccaaag ggttcgtgta gactttcctt ggtgtatcca acggcgtcag 5400
ccgggcagga taggtgaagt aggcccaccc gcgagcgggt gttccttctt cactgtccct 5460
tattcgcacc tggcggtgct caacgggaat cctgctctgc gaggctggcc ggctaccgcc 5520
ggcgtaacag atgagggcaa gcggatggct gatgaaacca agccaaccag gaagggcagc 5580
ccacctatca aggtgtactg ccttccagac gaacgaagag cgattgagga aaaggcggcg 5640
gcggccggca tgagcctgtc ggcctacctg ctggccgtcg gccagggcta caaaatcacg 5700
ggcgtcgtgg actatgagca cgtccgcgag ctggcccgca tcaatggcga cctgggccgc 5760
ctgggcggcc tgctgaaact ctggctcacc gacgacccgc gcacggcgcg gttcggtgat 5820
gccacgatcc tcgccctgct ggcgaagatc gaagagaagc aggacgagct tggcaaggtc 5880
atgatgggcg tggtccgccc gagggcagag ccatgacttt tttagccgct aaaacggccg 5940
gggggtgcgc gtgattgcca agcacgtccc catgcgctcc atcaagaaga gcgacttcgc 6000
ggagctggta ttcgtgcagg gcaagattcg gaataccaag tacgagaagg acggccagac 6060
ggtctacggg accgacttca ttgccgataa ggtggattat ctggacacca aggcaccagg 6120
cgggtcaaat caggaataag ggcacattgc cccggcgtga gtcggggcaa tcccgcaagg 6180
agggtgaatg aatcggacgt ttgaccggaa ggcatacagg caagaactga tcgacgcggg 6240
gttttccgcc gaggatgccg aaaccatcgc aagccgcacc gtcatgcgtg cgccccgcga 6300
aaccttccag tccgtcggct cgatggtcca gcaagctacg gccaagatcg agcgcgacag 6360
cgtgcaactg gctccccctg ccctgcccgc gccatcggcc gccgtggagc gttcgcgtcg 6420
tctcgaacag gaggcggcag gtttggcgaa gtcgatgacc atcgacacgc gaggaactat 6480
gacgaccaag aagcgaaaaa ccgccggcga ggacctggca aaacaggtca gcgaggccaa 6540
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cgaactggtg tggcagcagg tgttggagta cgcgaagcgc acccctatcg gcgagccgat 6840
caccttcacg ttctacgagc tttgccagga cctgggctgg tcgatcaatg gccggtatta 6900
cacgaaggcc gaggaatgcc tgtcgcgcct acaggcgacg gcgatgggct tcacgtccga 6960
ccgcgttggg cacctggaat cggtgtcgct gctgcaccgc ttccgcgtcc tggaccgtgg 7020
caagaaaacg tcccgttgcc aggtcctgat cgacgaggaa atcgtcgtgc tgtttgctgg 7080
cgaccactac acgaaattca tatgggagaa gtaccgcaag ctgtcgccga cggcccgacg 7140
gatgttcgac tatttcagct cgcaccggga gccgtacccg ctcaagctgg aaaccttccg 7200
cctcatgtgc ggatcggatt ccacccgcgt gaagaagtgg cgcgagcagg tcggcgaagc 7260
ctgcgaagag ttgcgaggca gcggcctggt ggaacacgcc tgggtcaatg atgacctggt 7320
gcattgcaaa cgctagggcc ttgtggggtc agttccggct gggggttcag cagccagcgc 7380
tttactggca tttcaggaac aagcgggcac tgctcgacgc acttgcttcg ctcagtatcg 7440
ctcgggacgc acggcgcgct ctacgaactg ccgataaaca gaggattaaa attgacaatt 7500
gtgattaagg ctcagattcg acggcttgga gcggccgacg tgcaggattt ccgcgagatc 7560
cgattgtcgg ccctgaagaa agctccagag atgttcgggt ccgtttacga gcacgaggag 7620
aaaaagccca tggaggcgtt cgctgaacgg ttgcgagatg ccgtggcatt cggcgcctac 7680
atcgacggcg agatcattgg gctgtcggtc ttcaaacagg aggacggccc caaggacgct 7740
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ccaacgggaa tctggtggat gcgcatcttc atcctcggcg cacttaatat ttcgctattc 7920
tggagcttgt tgtttatttc ggtctaccgc ctgccgggcg gggtcgcggc gacggtaggc 7980
gctgtgcagc cgctgatggt cgtgttcatc tctgccgctc tgctaggtag cccgatacga 8040
ttgatggcgg tcctgggggc tatttgcgga actgcgggcg tggcgctgtt ggtgttgaca 8100
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ccaatcccga tgcctacagg aaccaatgtt ctcggcctgg cgtggctcgg cctgatcgga 8340
gcgggtttaa cctacttcct ttggttccgg gggatctcgc gactcgaacc tacagttgtt 8400
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ataaaatgaa agttaatatt tatggattta tttgaacata tttacaagtt tttgttaata 9960
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tataatatta ctttatttaa aaataaaatg aatttatatt aaaatatgat ttggtaaaag 10080
atattataaa gaggaacttg gatgagaaag acgacgatgg gcaaaagttg catggcacac 10140
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gcatcgtcag cggctgcctc tcgttcccca tggacaacct ccagggtgaa ctcctcaacg 20940
tgtaccaaaa ccatgtcgag aaaaagctcg gggcccgcgt cttcaaggac gcctcccatt 21000
ggtccgaacg cgagcagtcc aacaaacccg aggccggtga ccgccgcatc ttcatggacc 21060
cggcctcctt cgtcgccgaa gaactcaacc tcggcgccct tcactactcc gtcgacgcag 21120
catgcgccac ggcgctctac gtgctccgcc tcgcgcagga tcatctcgtc tccggcgccg 21180
ccgacgtcat gctctgcggt gccacctgcc tgccggagcc ctttttcatc ctttcgggct 21240
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aggacagcca gggcctcacc ccgggtgagg gcggctccat catggtcctc aagcgtctcg 21360
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acacctacac gcgcattaac gtgcacccgc acaagattca gtacgtcgag tgccacgcca 21540
ccggcacgcc ccagggtgat cgtgtggaaa tcgacgccgt caaggcctgc tttgaaggca 21600
aggtcccccg tttcggtacc acaaagggca actttggaca caccctcgtc gcagccggct 21660
ttgccggtat gtgcaaggtc ctcctctcca tgaagcatgg catcatcccg cccaccccgg 21720
gtatcgatga cgagaccaag atggaccctc tcgtcgtctc cggtgaggcc atcccatggc 21780
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atttttggct ttaactcgcc cgaatggttt ctcagtgccg tcggcgccgt gcacgcaggt 34380
gccaagattg ccggcattta cccctcagac acgcccgccc aggtccagta caaggccttc 34440
cacagtgaca ccgctgttgc cgttgtcgaa aacgagcagt gcttcaagaa gttcgccgag 34500
gtcgtcgagg accttcctta cctcaaggcc attgtttgct gggactatga agccacagac 34560
atcacgcgcg aggacggctc cgtcgtcgag gtcctcacct ttgccgagtt cctcaagcgc 34620
ggcgacaccg tcgaggcggc cgcccttgac gagcgcatct ccaagatcga gcccaccatg 34680
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cacgacaacc ttgttttcga ggccagcgcc gtcgtcccca acctcggagg agcctgtacg 34800
accactgctg aggagcgcat tctctcgtac ctgcctctct cgcacgtcgc tggtatgatg 34860
gttgatatta ttgcccccat cattgccacc gccttccaca agggccgcat ctgcgtctgc 34920
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ctgaacatca acattaacga ggtctacggc atgtccgagt gctccggtgc cgccacctgg 35340
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acttcaagct caataattaa ttaggagtaa atctggcttc gaatttttaa attgtcaact 36660
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atcagcggcc gcagcttata gtaaagattt ttttgttaat aaaatgaaag ttaatattta 36960
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gtcgtaattc ctctgtcgat ctcatgtaat taccaaactc atctacttat tactttcttt 38760
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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caggccgcgt tgctgaaaca cacgaagcag cagatcaagg aaatgcagct ttccttgttc 6600
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cgttcggaac cgtgctgacc cgcaagtggc aacctcccgt gcctctgctc acctttaccg 8220
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gctgacaaaa gcaagagaac atagcgttgc cttggtaggt ccagcggcgg aggaactctt 9000
tgatccggtt cctgaacagg atctatttga ggcgctaaat gaaaccttaa cgctatggaa 9060
ctcgccgccc gactgggctg gcgatgagcg aaatgtagtg cttacgttgt cccgcatttg 9120
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ttgtgaaaga gacatagagg acacatgtaa ggtggaaaat gtaagggcgg aaagtaacct 1020
tatcacaaag gaatcttatc ccccactact tatcctttta tatttttccg tgtcattttt 1080
gcccttgagt tttcctatat aaggaaccaa gttcggcatt tgtgaaaaca agaaaaaatt 1140
tggtgtaagc tattttcttt gaagtactga ggatacaact tcagagaaat ttgtaagttt 1200
gtaggtacca gatctggatc ccaaaccatg tctccggaga ggagaccagt tgagattagg 1260
ccagctacag cagctgatat ggccgcggtt tgtgatatcg ttaaccatta cattgagacg 1320
tctacagtga actttaggac agagccacaa acaccacaag agtggattga tgatctagag 1380
aggttgcaag atagataccc ttggttggtt gctgaggttg agggtgttgt ggctggtatt 1440
gcttacgctg ggccctggaa ggctaggaac gcttacgatt ggacagttga gagtactgtt 1500
tacgtgtcac ataggcatca aaggttgggc ctaggatcta cattgtacac acatttgctt 1560
aagtctatgg aggcgcaagg ttttaagtct gtggttgctg ttataggcct tccaaacgat 1620
ccatctgtta ggttgcatga ggctttggga tacacagccc ggggtacatt gcgcgcagct 1680
ggatacaagc atggtggatg gcatgatgtt ggtttttggc aaagggattt tgagttgcca 1740
gctcctccaa ggccagttag gccagttacc caaatctgag tagttagctt aatcacctag 1800
agctcgatcg gcggcaatag cttcttagcg ccatcccggg ttgatcctat ctgtgttgaa 1860
atagttgcgg tgggcaaggc tctctttcag aaagacaggc ggccaaagga acccaaggtg 1920
aggtgggcta tggctctcag ttccttgtgg aagcgcttgg tctaaggtgc agaggtgtta 1980
gcgggatgaa gcaaaagtgt ccgattgtaa caagatatgt tgatcctacg taaggatatt 2040
aaagtatgta ttcatcacta atataatcag tgtattccaa tatgtactac gatttccaat 2100
gtctttattg tcgccgtatg taatcggcgt cacaaaataa tccccggtga ctttctttta 2160
atccaggatg aaataatatg ttattataat ttttgcgatt tggtccgtta taggaattga 2220
agtgtgcttg aggtcggtcg ccaccactcc catttcataa ttttacatgt atttgaaaaa 2280
taaaaattta tggtattcaa tttaaacacg tatacttgta aagaatgata tcttgaaaga 2340
aatatagttt aaatatttat tgataaaata acaagtcagg tattatagtc caagcaaaaa 2400
cataaattta ttgatgcaag tttaaattca gaaatatttc aataactgat tatatcagct 2460
ggtacattgc cgtagatgaa agactgagtg cgatattatg gtgtaataca taggaattcg 2520
tttaaacgat ctgcgtctaa ttttcggtcc aacttgcaca ggaaagacgt cgaccgcggt 2580
agctcttgcc cagcagactg ggcttccagt cctttcgctc gatcgggtcc aatgttgtcc 2640
tcagctgtga accggaagcg gacgaccaac agtggaagaa ctgaaaggaa cgagccgtct 2700
ataccttgat gatcggcctc tggtgaaggg tatcatcgca gccaagcaag ctcatgaaag 2760
gctgatgggg gaggtgtata attatgaggc ccacggcggg cttattcttt agggaggatc 2820
tatctcgttg ctcaagtgca tggcgcaaag cagttattgg agtgcggatt ttcgttggca 2880
tattattcgc cacgagttag cagacgaaga gaccttcatg aacgtggcca aggccagagt 2940
taagcagatg ttacgccctg ctgcaggcct ttctattatc caatagttgg ttgatctttg 3000
gaaagagcct cggctgaggc ccatactgaa agagatcgat ggatatcgat atgccatgtt 3060
gtttgctagc cagaaccaga tcacatccga tatgctattg cagcttgacg cagatatgga 3120
ggataagttg attcatggga tcgctcagga gtagctcatc catgcacgcc gacaagaaca 3180
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tgtttttagc tttgtcttgt tgtggcaggg cggcaagtgc ttcagacatc attctgtttt 3360
caaattttat gctggagaac agcttcttaa ttcctttgga aataatagac tgcgtcttaa 3420
aattcagatg tctggatata gatatgattg taaaataacc tatttaagtg tcatttagaa 3480
cataagtttt atgaatgttc ttccattttc gtcatcgaac gaataagagt aaatacacct 3540
tttttaacat tacaaataag ttcttatacg ttgtttatac accgggaatc atttccatta 3600
ttttcgcgca aaagtcacgg atattcgtga aagcgacata aactgcgaaa tttgcgggga 3660
gtgtcttgag tttgcctcga ggctagcgca tgcacataga cacacacatc atctcattga 3720
tgcttggtaa taattgtcat tagattgttt ttatgcatag atgcactcga aatcagccaa 3780
ttttagacaa gtatcaaacg gatgtgactt cagtacatta aaaacgtccg caatgtgtta 3840
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cagctcgatt tacaattgaa tatatcctgc cggccggccc acgcgtgtcg aggaattctg 3960
atctggcccc catttggacg tgaatgtaga cacgtcgaaa taaagatttc cgaattagaa 4020
taatttgttt attgctttcg cctataaata cgacggatcg taatttgtcg ttttatcaaa 4080
atgtactttc attttataat aacgctgcgg acatctacat ttttgaattg aaaaaaaatt 4140
ggtaattact ctttcttttt ctccatattg accatcatac tcattgctga tccatgtaga 4200
tttcccggac atgaagccat ttacaattga atatatcctg ccgccgctgc cgctttgcac 4260
ccggtggagc ttgcatgttg gtttctacgc agaactgagc cggttaggca gataatttcc 4320
attgagaact gagccatgtg caccttcccc ccaacacggt gagcgacggg gcaacggagt 4380
gatccacatg ggacttttaa acatcatccg tcggatggcg ttgcgagaga agcagtcgat 4440
ccgtgagatc agccgacgca ccgggcaggc gcgcaacacg atcgcaaagt atttgaacgc 4500
aggtacaatc gagccgacgt tcacgcggaa cgaccaagca agcttggctg ccatttttgg 4560
ggtgaggccg ttcgcggccg aggggcgcag cccctggggg gatgggaggc ccgcgttagc 4620
gggccgggag ggttcgagaa gggggggcac cccccttcgg cgtgcgcggt cacgcgcaca 4680
gggcgcagcc ctggttaaaa acaaggttta taaatattgg tttaaaagca ggttaaaaga 4740
caggttagcg gtggccgaaa aacgggcgga aacccttgca aatgctggat tttctgcctg 4800
tggacagccc ctcaaatgtc aataggtgcg cccctcatct gtcagcactc tgcccctcaa 4860
gtgtcaagga tcgcgcccct catctgtcag tagtcgcgcc cctcaagtgt caataccgca 4920
gggcacttat ccccaggctt gtccacatca tctgtgggaa actcgcgtaa aatcaggcgt 4980
tttcgccgat ttgcgaggct ggccagctcc acgtcgccgg ccgaaatcga gcctgcccct 5040
catctgtcaa cgccgcgccg ggtgagtcgg cccctcaagt gtcaacgtcc gcccctcatc 5100
tgtcagtgag ggccaagttt tccgcgaggt atccacaacg ccggcggccg cggtgtctcg 5160
cacacggctt cgacggcgtt tctggcgcgt ttgcagggcc atagacggcc gccagcccag 5220
cggcgagggc aaccagcccg gtgagcgtcg gaaagggtcg acggatcttt tccgctgcat 5280
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atacaggatt ttgccaaagg gttcgtgtag actttccttg gtgtatccaa cggcgtcagc 5400
cgggcaggat aggtgaagta ggcccacccg cgagcgggtg ttccttcttc actgtccctt 5460
attcgcacct ggcggtgctc aacgggaatc ctgctctgcg aggctggccg gctaccgccg 5520
gcgtaacaga tgagggcaag cggatggctg atgaaaccaa gccaaccagg aagggcagcc 5580
cacctatcaa ggtgtactgc cttccagacg aacgaagagc gattgaggaa aaggcggcgg 5640
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gcgtcgtgga ctatgagcac gtccgcgagc tggcccgcat caatggcgac ctgggccgcc 5760
tgggcggcct gctgaaactc tggctcaccg acgacccgcg cacggcgcgg ttcggtgatg 5820
ccacgatcct cgccctgctg gcgaagatcg aagagaagca ggacgagctt ggcaaggtca 5880
tgatgggcgt ggtccgcccg agggcagagc catgactttt ttagccgcta aaacggccgg 5940
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gagctggtat tcgtgcaggg caagattcgg aataccaagt acgagaagga cggccagacg 6060
gtctacggga ccgacttcat tgccgataag gtggattatc tggacaccaa ggcaccaggc 6120
gggtcaaatc aggaataagg gcacattgcc ccggcgtgag tcggggcaat cccgcaagga 6180
gggtgaatga atcggacgtt tgaccggaag gcatacaggc aagaactgat cgacgcgggg 6240
ttttccgccg aggatgccga aaccatcgca agccgcaccg tcatgcgtgc gccccgcgaa 6300
accttccagt ccgtcggctc gatggtccag caagctacgg ccaagatcga gcgcgacagc 6360
gtgcaactgg ctccccctgc cctgcccgcg ccatcggccg ccgtggagcg ttcgcgtcgt 6420
ctcgaacagg aggcggcagg tttggcgaag tcgatgacca tcgacacgcg aggaactatg 6480
acgaccaaga agcgaaaaac cgccggcgag gacctggcaa aacaggtcag cgaggccaag 6540
caggccgcgt tgctgaaaca cacgaagcag cagatcaagg aaatgcagct ttccttgttc 6600
gatattgcgc cgtggccgga cacgatgcga gcgatgccaa acgacacggc ccgctctgcc 6660
ctgttcacca cgcgcaacaa gaaaatcccg cgcgaggcgc tgcaaaacaa ggtcattttc 6720
cacgtcaaca aggacgtgaa gatcacctac accggcgtcg agctgcgggc cgacgatgac 6780
gaactggtgt ggcagcaggt gttggagtac gcgaagcgca cccctatcgg cgagccgatc 6840
accttcacgt tctacgagct ttgccaggac ctgggctggt cgatcaatgg ccggtattac 6900
acgaaggccg aggaatgcct gtcgcgccta caggcgacgg cgatgggctt cacgtccgac 6960
cgcgttgggc acctggaatc ggtgtcgctg ctgcaccgct tccgcgtcct ggaccgtggc 7020
aagaaaacgt cccgttgcca ggtcctgatc gacgaggaaa tcgtcgtgct gtttgctggc 7080
gaccactaca cgaaattcat atgggagaag taccgcaagc tgtcgccgac ggcccgacgg 7140
atgttcgact atttcagctc gcaccgggag ccgtacccgc tcaagctgga aaccttccgc 7200
ctcatgtgcg gatcggattc cacccgcgtg aagaagtggc gcgagcaggt cggcgaagcc 7260
tgcgaagagt tgcgaggcag cggcctggtg gaacacgcct gggtcaatga tgacctggtg 7320
cattgcaaac gctagggcct tgtggggtca gttccggctg ggggttcagc agccagcgct 7380
ttactggcat ttcaggaaca agcgggcact gctcgacgca cttgcttcgc tcagtatcgc 7440
tcgggacgca cggcgcgctc tacgaactgc cgataaacag aggattaaaa ttgacaattg 7500
tgattaaggc tcagattcga cggcttggag cggccgacgt gcaggatttc cgcgagatcc 7560
gattgtcggc cctgaagaaa gctccagaga tgttcgggtc cgtttacgag cacgaggaga 7620
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tcgacggcga gatcattggg ctgtcggtct tcaaacagga ggacggcccc aaggacgctc 7740
acaaggcgca tctgtccggc gttttcgtgg agcccgaaca gcgaggccga ggggtcgccg 7800
gtatgctgct gcgggcgttg ccggcgggtt tattgctcgt gatgatcgtc cgacagattc 7860
caacgggaat ctggtggatg cgcatcttca tcctcggcgc acttaatatt tcgctattct 7920
ggagcttgtt gtttatttcg gtctaccgcc tgccgggcgg ggtcgcggcg acggtaggcg 7980
ctgtgcagcc gctgatggtc gtgttcatct ctgccgctct gctaggtagc ccgatacgat 8040
tgatggcggt cctgggggct atttgcggaa ctgcgggcgt ggcgctgttg gtgttgacac 8100
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cctggcaact ggcggccgga ggacttctgc tcgttccagt agctttagtg tttgatccgc 8280
caatcccgat gcctacagga accaatgttc tcggcctggc gtggctcggc ctgatcggag 8340
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aattcaggag ttaaacatca tgagggaagc ggtgatcgcc gaagtatcga ctcaactatc 8580
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cggctccgca gtggatggcg gcctgaagcc acacagtgat attgatttgc tggttacggt 8700
gaccgtaagg cttgatgaaa caacgcggcg agctttgatc aacgaccttt tggaaacttc 8760
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cgacatcatt ccgtggcgtt atccagctaa gcgcgaactg caatttggag aatggcagcg 8880
caatgacatt cttgcaggta tcttcgagcc agccacgatc gacattgatc tggctatctt 8940
gctgacaaaa gcaagagaac atagcgttgc cttggtaggt ccagcggcgg aggaactctt 9000
tgatccggtt cctgaacagg atctatttga ggcgctaaat gaaaccttaa cgctatggaa 9060
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gtacagcgca gtaaccggca aaatcgcgcc gaaggatgtc gctgccgact gggcaatgga 9180
gcgcctgccg gcccagtatc agcccgtcat acttgaagct aggcaggctt atcttggaca 9240
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cgagatcacc aaggtagtcg gcaaataatg tctaacaatt cgttcaagcc gacgccgctt 9360
cgcggcgcgg cttaactcaa gcgttagaga gctggggaag actatgcgcg atctgttgaa 9420
ggtggttcta agcctcgtct tgcgatggca tttcgatcca ttcccattcc gcgctcaaga 9480
tggcttcccc tcggcagttc atcagggcta aatcaatcta gccgacttgt ccggtgaaat 9540
gggctgcact ccaacagaaa caatcaaaca aacatacaca gcgacttatt cacacgagct 9600
caaattacaa cggtatatat cctgccagtc agcatcatca caccaaaagt taggcccgaa 9660
tagtttgaaa ttagaaagct cgcaattgag gtctacaggc caaattcgct cttagccgta 9720
caatattact caccggatcc taaccggttt aattaaggcg cgccatgccc gggcaagcgg 9780
ccgcacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt ctagacctag gtggagtcat cacgcagact 9840
atctcagcat gtgcgtagca cgcggccgca gcttatagta aagatttttt tgttaataaa 9900
atgaaagtta atatttatgg atttatttga acatatttac aagtttttgt taataaattt 9960
atttacagaa gtgttaaatt tgaaaatgtg ttaaatgaga gttaatattt atggatataa 10020
tattacttta tttaaaaata aaatgaattt atattaaaat atgatttggt aaaagatatt 10080
ataaagagga acttggatga gaaagacgac gatgggcaaa agttgcatgg cacaccgctt 10140
ttgttcagta acatctgcac tgtggcgcct ttttcacact caccatgcat gctgccacgt 10200
cagctttcac actatgacac cactggccat acacgttgcc acctcagctt tctcctcttc 10260
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acccgtgtct ttctctcatg tcgcagtgct gcgtgccaac ctcttctctc tataaataga 10380
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ggatccacaa ccaaaaatgg cagcgaggct gcaagagcag aaaggaggtg agatggacac 10500
gaggattgcg atcataggca tgagcgccat acttccttgt ggaaccacgg tgagagagtc 10560
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ggaagattct gatgcgaatc agaccatctc acttctcaag gtcaaagaag cacttcaaga 10800
tgctgggatt gatgcacttg gaaaggagaa gaaaaacata ggatgcgtgc ttggcattgg 10860
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tggcagatgc accaacacat tcaacttgga tggcatgaac tgcgttgtgg atgctgcatg 11100
tgcaagctcc ttgatagcag tcaaggttgc gattgatgaa ctgctctatg gtgactgcga 11160
catgatggtc actggtgcaa cctgcacaga caactccatt gggatgtaca tggctttctc 11220
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ggatggtgat gagattcatg ctgtgattcg tggttgtgca agctcaagtg atggcaaagc 11400
agctggcatc tacactccca caatcagtgg tcaagaggaa gccttgagac gtgcatacaa 11460
tcgtgcctgc gttgaccctg ccactgtcac tttggttgag ggtcatggga ctggcactcc 11520
agttggagat aggattgagt tgactgcgtt gaggaacttg tttgacaaag cgtatggtga 11580
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tgttgctggt cttgctggaa tgatcaaggt catcatggct ctcaaacaca agactttgcc 11700
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atccctctac atcaacacga tgaacagacc ctggttccct ccacctggtg ttccgagacg 11820
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tggattcact ccagactttg cagctggaca cagcttgggt gagtttgctg cgctctatgc 12600
agctggttgt gttgacagag atgagttgtt tgaacttgtt tgcagaaggg caaggatcat 12660
gggaggcaaa gatgcacctg ccacacccaa aggttgcatg gcagctgtca taggacccaa 12720
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tcagactgtc attactgggt ctgttgaagg gattcaagct gaaagtgcca gattgcagaa 12840
ggaagggttc agagttgtgc ctcttgcttg tgagtctgcc ttccattctc cacagatgga 12900
aaatgccagc tcagctttca aagatgtcat atccaaggtt tccttccgta cacccaaagc 12960
agaaacaaag ctcttcagca atgtttctgg agagacctat ccgacggatg ccagagagat 13020
gctcactcaa cacatgacct catctgtgaa gttcctgacc caagtgagga acatgcacca 13080
agctggtgcg agaatctttg ttgagtttgg accgaaacaa gttctcagca aacttgtttc 13140
tgaaaccctc aaagatgacc cgtctgttgt cacagtgtct gtgaacccag cttctggcac 13200
ggactctgac atacagttga gggatgctgc agttcagctg gttgtggctg gtgtcaatct 13260
tcaagggttt gacaagtggg atgctcctga tgccacgagg atgcaagcca tcaagaaaaa 13320
gagaaccaca ctcagacttt cagctgccac ctatgtcagt gacaagacca agaaagtgag 13380
ggatgctgcc atgaacgacg gaagatgtgt cacatacctc aagggtgctg caccactcat 13440
caaggctcct gaacctgtgg ttgacgaagc tgccaagagg gaggctgaaa ggcttcagaa 13500
ggagcttcaa gacgctcaga ggcagcttga cgacgccaaa cgtgcagctg cagaagccaa 13560
ctccaaactt gctgctgcca aggaggaagc caagactgct gcagcttcag ccaagcctgc 13620
agttgacact gctgttgtgg agaaacatcg tgccatcctc aagtccatgc tggctgagct 13680
ggatggttat ggaagtgttg atgcttcttc ccttcagcaa cagcaacagc aacagactgc 13740
tccggcgcct gttaaagccg ctgcccctgc cgctcccgtt gcaagtgctc ctgctcccgc 13800
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tgttgtgatg gaagtccttg ctgccaaaac tggctacgaa actgacatga tagaatcaga 14220
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ggccgctgcc gctcctggtc ccgctgccgc ggctccagct ccagctgcag ccgctccggc 14460
cgtctcaaac gaactccttg aaaaagctga gaccgtcgtg atggaggtct tggcagctaa 14520
aaccggctat gagactgaca tgattgagtc tgacatggaa ttggagacag aacttgggat 14580
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gaaggatgtt gatgctctgt ccagaacgag gaccgttggt gaggttgtgg atgccatgaa 14700
ggctgaaatt gctggagggt ctgcgcccgc gccagctgca gccgctcctg cacccgcagc 14760
cgcggcacct gctccagctg cacctgcacc tgccgtttct tcagaactct tggagaaggc 14820
tgagacggtt gtgatggagg ttttggctgc aaagactggc tatgagaccg acatgattga 14880
atctgatatg gaattggaga cagagcttgg gatcgattcc atcaaaagag tggagatcct 14940
gagtgaagtc caagccatgc tcaatgttga agctaaggat gttgatgcac tttcaagaac 15000
aaggacagtg ggtgaggttg tggatgccat gaaggcggag attgctggag ggagcgcgcc 15060
tgcgccagct gccgcggcac ctgcaccggc agccgcagct ccagctccag ctgcaccagc 15120
accggccgcg cccgcgccag ctgtttcatc cgaactcctg gaaaaggccg agacggttgt 15180
gatggaggtg ctcgcagcta agactggtta cgagaccgac atgattgaaa gtgacatgga 15240
gcttgaaacc gagttgggaa tagatagcat caaacgtgtt gaaatcttgt ctgaggtcca 15300
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catcaagaga gtggagatcc tctctgaggt gcaagccatg ctcaacgttg aggctaaaga 15660
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cgatgctttg tcaaggacca gaacggttgg agaagtggtc gatgccatga aggctgagat 16680
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tgctccgagt gggagggtga atgtccaagc gacgctcaag acgttctcaa gtggaaaact 18660
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ccaacctctt ctctctataa atagagagaa gagaatgatg gttaaactca aaccaaaaca 20460
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atgctggatg caaaacgaaa gacgagttct gggaagttct catgaatgga aaagttgaga 20640
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gtgacagaag aatcttcatg gaccctgctt cctttgttgc tgaggaactc aatcttggcg 21060
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aagatcactt ggtctctggt gcagctgatg tgatgctttg tggtgcaaca tgcctgccgg 21180
agccgttttt catactctct gggttctcaa ccttccaagc catgcctgtt ggaacgggtc 21240
agaatgtgtc catgccgctg cacaaagatt ctcaaggatt gacccctggt gaaggaggtt 21300
ccatcatggt cctcaaacgt ttggatgacg caatcagaga tggagatcac atctatggaa 21360
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ttcagtatgt tgaatgccat gcaactggga ctccacaagg tgatcgtgtg gaaattgatg 21540
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cgcatggctg ttacattgaa gatgttgaag ttgatttcca gaggctgagg actccaatga 22140
ctcctgaaga tatgctcttg cctcaacagc ttctggctgt caccacaatt gatagggcca 22200
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ccttggttga caaagattgg gcttccgttt ttggctcaaa gaatggcatg ccggagatca 28800
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ccacgatcct cgccctgctg gcgaagatcg aagagaagca ggacgagctt ggcaaggtca 5880
tgatgggcgt ggtccgcccg agggcagagc catgactttt ttagccgcta aaacggccgg 5940
ggggtgcgcg tgattgccaa gcacgtcccc atgcgctcca tcaagaagag cgacttcgcg 6000
gagctggtat tcgtgcaggg caagattcgg aataccaagt acgagaagga cggccagacg 6060
gtctacggga ccgacttcat tgccgataag gtggattatc tggacaccaa ggcaccaggc 6120
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ctcatgtgcg gatcggattc cacccgcgtg aagaagtggc gcgagcaggt cggcgaagcc 7260
tgcgaagagt tgcgaggcag cggcctggtg gaacacgcct gggtcaatga tgacctggtg 7320
cattgcaaac gctagggcct tgtggggtca gttccggctg ggggttcagc agccagcgct 7380
ttactggcat ttcaggaaca agcgggcact gctcgacgca cttgcttcgc tcagtatcgc 7440
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ggagcttgtt gtttatttcg gtctaccgcc tgccgggcgg ggtcgcggcg acggtaggcg 7980
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caatgacatt cttgcaggta tcttcgagcc agccacgatc gacattgatc tggctatctt 8940
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atgaaagtta atatttatgg atttatttga acatatttac aagtttttgt taataaattt 9960
atttacagaa gtgttaaatt tgaaaatgtg ttaaatgaga gttaatattt atggatataa 10020
tattacttta tttaaaaata aaatgaattt atattaaaat atgatttggt aaaagatatt 10080
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gcttcctcta tgctctcttc cgctactatg gttgcctctc cggctcaggc cactatggtc 34560
gctcctttca acggacttaa gtcctccgct gccttcccag ccacccgcaa ggctaacaac 34620
gacattactt ccatcacaag caacggcgga agagttaact gcatgcaggt gtggcctccg 34680
attggaaaga agaagtttga gactctctct taccttcctg accttaccga ttccgaactt 34740
cagcacactt ggcttccgaa gcctcccaat ctgaccctct tgtcagatga ggttcatctc 34800
tggaggattc ctcttgacca gcctgagtca caacttcaag accttgctgc caccctgagc 34860
agtgatgaat tggcgagggc aaacagattc tactttccag aacacagaag gcgtttcact 34920
gctgggagag gcatcctcag atccatcttg ggtggatact tgggagtgga accgggtcaa 34980
gtcaagtttg attatgagtc ccgtgggaaa ccgatccttg gtgacagatt tgctgagagt 35040
ggactcctgt tcaacttgtc tcacagccag aaccttgcct tgtgtgctgt caactacacg 35100
cgtcaaatag gcattgatct tgaatatctg cgtccaacat ctgacttgga gtctcttgca 35160
aagaggttct ttctcccaag agaatatgaa ctcttgaggt cactccctga tgagcagaaa 35220
cagaagattt tctttcgtta ctggacttgc aaagaggctt atctcaaagc aacgggagat 35280
ggaatagcca aacttgaaga gatcgagata gcactcaccc caacagaacc tgccaagctc 35340
caaacagctc ctgcgtggtc tctgttggag cttgtgccag atgacaattg tgttgcagct 35400
gtggctgttg cgggttttgg ttggcagccc aagttctggc attactgagt agttagctta 35460
atcacttagg tcacccagtc caagcccggc ctagcacgat gatcatgagt gttgctattg 35520
atgtatgtta atactataca cagtcatcgt gtgtgtttta taaaactgta agcttaggat 35580
gtttgaggct aatgtaatta gcactacacc gtaataaatg agaggtttac tttatgtttt 35640
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agtaaaaatc gattcgcttg agtaaaatta gtgaccggga aagatcatcg actactactg 35760
ctcagagatg taatcggtaa ttaagacttc aagctcaata attaattagg agtaaatctg 35820
gcttcgaatt tttaaattgt caacttccaa agaaggattg gcaagactca atctcaattg 35880
cccaacaaac atatggctct ttacaaattt ggaatctctt tttgatggca agaacgtcgt 35940
aattcctctg tcgatctcat gtaattacca aactcatcta cttattactt tctttatatg 36000
cacttactga tgcggccgct taattaacta ctgtcactga ggccgtagac gagtacggac 36060
tgatctaact agtgctagcc tcgaggtcga cacccagctt tc 36102
<210> 43
<211> 39183
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> plasmid pDAB100518
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ttgtacaaag tggttgcggc cgcttaatta aatttaaatt caattaatgc aatcttgatt 60
ttcaacaacg aaggtaatgg cgtaaaagaa aaaatgtatg ttattgtatt gatctttcat 120
gatgttgaag cgtgccataa tatgatgatg tataattaaa atattaactg tcgcatttta 180
ttgaaatggc actgttattt caaccatatc tttgattctg ttacatgaca cgactgcaag 240
aagtaaataa tagacgccgt tgttaaagaa ttgctatcat atgtgcctaa ctagagggaa 300
tttgagcgtc agacctaatc aaatattaca aaatatctca ctctgtcgcc agcaatggtg 360
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ctgcctctgt attgctgatt tagtcagcct tatttgactt aagggtgccc tcgttagtga 480
caaattgctt tcaaggagac agccatgccc cacactttgt tgaaaaacaa attgcctttg 540
gggagacggt aaagccagtt gctcttcaat aaggaatgtc gaggaggcaa tgtaaccgcc 600
tctggtagta cacttctcta atccaaaaat caatttgtat tcaagatacc gcaaaaaact 660
tatggtttaa accctgcagg actagtccag aaggtaatta tccaagatgt agcatcaaga 720
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atatgcggca catatgcaac ctatgttcaa aaatgaagaa tgtacagata caagatccta 840
tactgccaga atacgaagaa gaatacgtag aaattgaaaa agaagaacca ggcgaagaaa 900
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ttgtgaaaga gacatagagg acacatgtaa ggtggaaaat gtaagggcgg aaagtaacct 1020
tatcacaaag gaatcttatc ccccactact tatcctttta tatttttccg tgtcattttt 1080
gcccttgagt tttcctatat aaggaaccaa gttcggcatt tgtgaaaaca agaaaaaatt 1140
tggtgtaagc tattttcttt gaagtactga ggatacaact tcagagaaat ttgtaagttt 1200
gtaggtacca gatctggatc ccaaaccatg tctccggaga ggagaccagt tgagattagg 1260
ccagctacag cagctgatat ggccgcggtt tgtgatatcg ttaaccatta cattgagacg 1320
tctacagtga actttaggac agagccacaa acaccacaag agtggattga tgatctagag 1380
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gcttacgctg ggccctggaa ggctaggaac gcttacgatt ggacagttga gagtactgtt 1500
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ccatctgtta ggttgcatga ggctttggga tacacagccc ggggtacatt gcgcgcagct 1680
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ggtacattgc cgtagatgaa agactgagtg cgatattatg gtgtaataca taggaattcg 2520
tttaaacgat ctgcgtctaa ttttcggtcc aacttgcaca ggaaagacgt cgaccgcggt 2580
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ggataagttg attcatggga tcgctcagga gtagctcatc catgcacgcc gacaagaaca 3180
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tgtttttagc tttgtcttgt tgtggcaggg cggcaagtgc ttcagacatc attctgtttt 3360
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aattcagatg tctggatata gatatgattg taaaataacc tatttaagtg tcatttagaa 3480
cataagtttt atgaatgttc ttccattttc gtcatcgaac gaataagagt aaatacacct 3540
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cagctcgatt tacaattgaa tatatcctgc cggccggccc acgcgtgtcg aggaattctg 3960
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atgtactttc attttataat aacgctgcgg acatctacat ttttgaattg aaaaaaaatt 4140
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aggtacaatc gagccgacgt tcacgcggaa cgaccaagca agcttggctg ccatttttgg 4560
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gggcgcagcc ctggttaaaa acaaggttta taaatattgg tttaaaagca ggttaaaaga 4740
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tggacagccc ctcaaatgtc aataggtgcg cccctcatct gtcagcactc tgcccctcaa 4860
gtgtcaagga tcgcgcccct catctgtcag tagtcgcgcc cctcaagtgt caataccgca 4920
gggcacttat ccccaggctt gtccacatca tctgtgggaa actcgcgtaa aatcaggcgt 4980
tttcgccgat ttgcgaggct ggccagctcc acgtcgccgg ccgaaatcga gcctgcccct 5040
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tgtcagtgag ggccaagttt tccgcgaggt atccacaacg ccggcggccg cggtgtctcg 5160
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cggcgagggc aaccagcccg gtgagcgtcg gaaagggtcg acggatcttt tccgctgcat 5280
aaccctgctt cggggtcatt atagcgattt tttcggtata tccatccttt ttcgcacgat 5340
atacaggatt ttgccaaagg gttcgtgtag actttccttg gtgtatccaa cggcgtcagc 5400
cgggcaggat aggtgaagta ggcccacccg cgagcgggtg ttccttcttc actgtccctt 5460
attcgcacct ggcggtgctc aacgggaatc ctgctctgcg aggctggccg gctaccgccg 5520
gcgtaacaga tgagggcaag cggatggctg atgaaaccaa gccaaccagg aagggcagcc 5580
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tgggcggcct gctgaaactc tggctcaccg acgacccgcg cacggcgcgg ttcggtgatg 5820
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gagctggtat tcgtgcaggg caagattcgg aataccaagt acgagaagga cggccagacg 6060
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gggtcaaatc aggaataagg gcacattgcc ccggcgtgag tcggggcaat cccgcaagga 6180
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accttccagt ccgtcggctc gatggtccag caagctacgg ccaagatcga gcgcgacagc 6360
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acgaccaaga agcgaaaaac cgccggcgag gacctggcaa aacaggtcag cgaggccaag 6540
caggccgcgt tgctgaaaca cacgaagcag cagatcaagg aaatgcagct ttccttgttc 6600
gatattgcgc cgtggccgga cacgatgcga gcgatgccaa acgacacggc ccgctctgcc 6660
ctgttcacca cgcgcaacaa gaaaatcccg cgcgaggcgc tgcaaaacaa ggtcattttc 6720
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caatattact caccggatcc taaccggttt aattaaggcg cgccatgccc gggcaagcgg 9780
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atttacagaa gtgttaaatt tgaaaatgtg ttaaatgaga gttaatattt atggatataa 10020
tattacttta tttaaaaata aaatgaattt atattaaaat atgatttggt aaaagatatt 10080
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acagaatcat tgggaaagtc tccagaactg agctggctga aatgttcatg cgtcctgcac 25920
ctgagcatct tttgcagaag ctcattgctt ctggggagat caatcaagaa caagctgagt 25980
tggccagacg tgttcctgtg gctgatgaca ttgcggttga agctgattct ggtggacaca 26040
ctgacaaccg tccaatccat gtcattctgc ctctgattat caacctgagg gataggcttc 26100
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gaaagttaat atttatggat ttatttgaac atatttacaa gtttttgtta ataaatttat 360
ttacagaagt gttaaatttg aaaatgtgtt aaatgagagt taatatttat ggatataata 420
ttactttatt taaaaataaa atgaatttat attaaaatat gatttggtaa aagatattat 480
aaagaggaac ttggatgaga aagacgacga tgggcaaaag ttgcatggca caccgctttt 540
gttcagtaac atctgcactg tggcgccttt ttcacactca ccatgcatgc tgccacgtca 600
gctttcacac tatgacacca ctggccatac acgttgccac ctcagctttc tcctcttctc 660
actatgacac gactggccat gcatgcatgc atgctgccac ctcagctccc gcctcttcac 720
ccgtgtcttt ctctcatgtc gcagtgctgc gtgccaacct cttctctcta taaatagaga 780
gaagagaatg atggttaaac tcaaaccaaa acaagaaaac atacacaaat agcaaaacgg 840
atccacaacc aaaaatggca gcgaggctgc aagagcagaa aggaggtgag atggacacga 900
ggattgcgat cataggcatg agcgccatac ttccttgtgg aaccacggtg agagagtcat 960
gggagaccat aagggctggc attgattgcc tgtctgatct tcctgaggat cgtgttgatg 1020
tgactgcgta ctttgaccca gtcaagacca caaaggacaa aatctactgc aagagaggag 1080
gtttcattcc tgagtatgac tttgatgcgc gtgagtttgg tctcaacatg ttccagatgg 1140
aagattctga tgcgaatcag accatctcac ttctcaaggt caaagaagca cttcaagatg 1200
ctgggattga tgcacttgga aaggagaaga aaaacatagg atgcgtgctt ggcattggag 1260
gtggacagaa gagttcacat gagttctaca gcagactcaa ctatgtggtt gtggagaaag 1320
tcttgagaaa gatggggatg ccagaggaag atgtcaaagt ggctgtggag aagtacaaag 1380
cgaacttccc agaatggaga cttgactctt tccctggatt ccttgggaat gtcactgctg 1440
gcagatgcac caacacattc aacttggatg gcatgaactg cgttgtggat gctgcatgtg 1500
caagctcctt gatagcagtc aaggttgcga ttgatgaact gctctatggt gactgcgaca 1560
tgatggtcac tggtgcaacc tgcacagaca actccattgg gatgtacatg gctttctcaa 1620
agacacctgt gttcagcacg gacccaagtg tgagagcgta tgatgagaaa acgaaaggga 1680
tgctcattgg tgagggatca gccatgttgg tgctcaaacg ttatgcagat gcagtgaggg 1740
atggtgatga gattcatgct gtgattcgtg gttgtgcaag ctcaagtgat ggcaaagcag 1800
ctggcatcta cactcccaca atcagtggtc aagaggaagc cttgagacgt gcatacaatc 1860
gtgcctgcgt tgaccctgcc actgtcactt tggttgaggg tcatgggact ggcactccag 1920
ttggagatag gattgagttg actgcgttga ggaacttgtt tgacaaagcg tatggtgaag 1980
ggaacacaga gaaagttgca gttggaagta tcaagtccag tattggtcat ttgaaggctg 2040
ttgctggtct tgctggaatg atcaaggtca tcatggctct caaacacaag actttgcctg 2100
gaacgatcaa tgtggacaat ccacccaatc tctatgacaa cactcccatc aatgagtcat 2160
ccctctacat caacacgatg aacagaccct ggttccctcc acctggtgtt ccgagacgtg 2220
ctggaatatc cagctttggc tttggaggtg ccaactacca tgcagtgttg gaagaggctg 2280
aaccagagca cacgacagcg tacagactca acaaacgtcc acaaccggtg ttgatgatgg 2340
ctgcaactcc tgctgcgttg cagagccttt gtgaagctca gctgaaagag tttgaagctg 2400
cgatcaagga gaatgagaca gtcaagaata ctgcctacat caagtgtgtc aagtttggag 2460
aacagttcaa gttccctggg agcatacctg cgaccaatgc gagactggga ttcttggtca 2520
aagatgcgga ggatgcgtgc tccacgcttc gtgctatatg tgctcagttt gccaaagatg 2580
tgaccaaaga agcgtggagg cttccgagag aaggagtttc tttccgtgcc aaaggcattg 2640
ccaccaatgg tgctgttgct gcactcttct ctggacaagg tgctcagtac acacacatgt 2700
tcagtgaagt tgcgatgaac tggcctcagt tcagacagtc cattgctgca atggacgctg 2760
cacagtccaa ggttgctgga agtgacaaag actttgaaag agtctctcaa gtcctgtacc 2820
caaggaaacc gtacgaacgt gagccagaac aagatcacaa gaaaatctca ctcacagcat 2880
acagccagcc gtcaaccctg gcatgtgctc ttggtgcctt tgagattttc aaggaagctg 2940
gattcactcc agactttgca gctggacaca gcttgggtga gtttgctgcg ctctatgcag 3000
ctggttgtgt tgacagagat gagttgtttg aacttgtttg cagaagggca aggatcatgg 3060
gaggcaaaga tgcacctgcc acacccaaag gttgcatggc agctgtcata ggacccaacg 3120
cagagaacat caaggttcaa gctgccaacg tctggcttgg aaactcaaac tctccgtctc 3180
agactgtcat tactgggtct gttgaaggga ttcaagctga aagtgccaga ttgcagaagg 3240
aagggttcag agttgtgcct cttgcttgtg agtctgcctt ccattctcca cagatggaaa 3300
atgccagctc agctttcaaa gatgtcatat ccaaggtttc cttccgtaca cccaaagcag 3360
aaacaaagct cttcagcaat gtttctggag agacctatcc gacggatgcc agagagatgc 3420
tcactcaaca catgacctca tctgtgaagt tcctgaccca agtgaggaac atgcaccaag 3480
ctggtgcgag aatctttgtt gagtttggac cgaaacaagt tctcagcaaa cttgtttctg 3540
aaaccctcaa agatgacccg tctgttgtca cagtgtctgt gaacccagct tctggcacgg 3600
actctgacat acagttgagg gatgctgcag ttcagctggt tgtggctggt gtcaatcttc 3660
aagggtttga caagtgggat gctcctgatg ccacgaggat gcaagccatc aagaaaaaga 3720
gaaccacact cagactttca gctgccacct atgtcagtga caagaccaag aaagtgaggg 3780
atgctgccat gaacgacgga agatgtgtca catacctcaa gggtgctgca ccactcatca 3840
aggctcctga acctgtggtt gacgaagctg ccaagaggga ggctgaaagg cttcagaagg 3900
agcttcaaga cgctcagagg cagcttgacg acgccaaacg tgcagctgca gaagccaact 3960
ccaaacttgc tgctgccaag gaggaagcca agactgctgc agcttcagcc aagcctgcag 4020
ttgacactgc tgttgtggag aaacatcgtg ccatcctcaa gtccatgctg gctgagctgg 4080
atggttatgg aagtgttgat gcttcttccc ttcagcaaca gcaacagcaa cagactgctc 4140
cggcgcctgt taaagccgct gcccctgccg ctcccgttgc aagtgctcct gctcccgccg 4200
tgtccaacga gttgcttgag aaagctgaga cagttgtgat ggaggttctc gctgccaaga 4260
ctggatacga aacagacatg attgaggcgg acatggagct tgagactgag ttgggaattg 4320
acagcatcaa gagggttgaa attctttctg aagtccaagc tatgcttaac gttgaggcga 4380
aagatgttga tgctctctct aggacgagaa cagtgggtga agttgtcaac gctatgaagg 4440
cagaaatcgc tggttcttcc gctccggcgc cggcagctgc cgcacctgca ccggctaaag 4500
cggctccagc tgcagctgca ccagctgttt ctaatgagct gctcgaaaag gcagaaactg 4560
ttgtgatgga agtccttgct gccaaaactg gctacgaaac tgacatgata gaatcagaca 4620
tggagcttga gacggagctt ggaattgatt ccatcaagcg tgtggaaatc ctcagtgaag 4680
tccaagccat gctcaatgtg gaagctaagg atgtggatgc tctctcaagg accagaactg 4740
tcggtgaggt tgtcaatgcc atgaaggctg agatagctgg aggctccgct cctgcgccgg 4800
ccgctgccgc tcctggtccc gctgccgcgg ctccagctcc agctgcagcc gctccggccg 4860
tctcaaacga actccttgaa aaagctgaga ccgtcgtgat ggaggtcttg gcagctaaaa 4920
ccggctatga gactgacatg attgagtctg acatggaatt ggagacagaa cttgggatag 4980
acagcatcaa acgtgttgaa atcctcagtg aggtccaagc tatgctgaac gtggaagcga 5040
aggatgttga tgctctgtcc agaacgagga ccgttggtga ggttgtggat gccatgaagg 5100
ctgaaattgc tggagggtct gcgcccgcgc cagctgcagc cgctcctgca cccgcagccg 5160
cggcacctgc tccagctgca cctgcacctg ccgtttcttc agaactcttg gagaaggctg 5220
agacggttgt gatggaggtt ttggctgcaa agactggcta tgagaccgac atgattgaat 5280
ctgatatgga attggagaca gagcttggga tcgattccat caaaagagtg gagatcctga 5340
gtgaagtcca agccatgctc aatgttgaag ctaaggatgt tgatgcactt tcaagaacaa 5400
ggacagtggg tgaggttgtg gatgccatga aggcggagat tgctggaggg agcgcgcctg 5460
cgccagctgc cgcggcacct gcaccggcag ccgcagctcc agctccagct gcaccagcac 5520
cggccgcgcc cgcgccagct gtttcatccg aactcctgga aaaggccgag acggttgtga 5580
tggaggtgct cgcagctaag actggttacg agaccgacat gattgaaagt gacatggagc 5640
ttgaaaccga gttgggaata gatagcatca aacgtgttga aatcttgtct gaggtccaag 5700
ctatgttgaa cgtggaggca aaagatgtcg atgcgctttc aagaaccaga acagtcggtg 5760
aggtcgtgga cgccatgaag gctgaaattg ccggaagctc tgctagtgcg ccagctgcag 5820
ccgcacctgc acctgctgcc gcggcacctg ctccagctgc agccgctcct gccgtcagca 5880
atgagttgct ggagaaagcc gaaacagttg tgatggaagt ccttgctgca aaaactggtt 5940
acgaaacgga catgattgag tcagacatgg aattggagac cgaacttgga atagattcca 6000
tcaagagagt ggagatcctc tctgaggtgc aagccatgct caacgttgag gctaaagatg 6060
ttgatgcact cagtaggaca agaactgtgg gggaagttgt cgatgcgatg aaggctgaga 6120
ttgctggagg ctctgctcct gcgccggcag ctgccgcacc tgcacccgca gccgcggcac 6180
cagctgtcag caacgaattg cttgagaagg ctgaaacagt tgtcatggaa gtgctggctg 6240
caaaaaccgg ctatgagact gacatgattg agtctgacat ggaacttgag acggaattgg 6300
gcattgacag catcaagcgt gttgagatcc tcagtgaagt ccaagcaatg ctcaatgtgg 6360
aggctaagga tgtggatgcc ctctcaagga ccagaacagt tggtgaggtc gttgatgcga 6420
tgaaggcgga gatcgctgga agttccgcgc ctgcgccagc tgcagccgct cctgcacccg 6480
cagccgcggc accggctcca gctgcagccg caccggccgt ctcctcagaa ctcctggaaa 6540
aggctgagac agttgtgatg gaagtccttg ctgcgaaaac tggctatgag accgacatga 6600
ttgaatctga catggaactg gagaccgagc ttggaattga ctccatcaaa cgtgttgaaa 6660
tcctctctga ggttcaagcg atgttgaatg tggaggccaa agatgttgat gctctttcca 6720
gaacaaggac ggtgggagag gtggttgatg ccatgaaggc tgagatagct gggggttctg 6780
ctcctgcgcc agctgcagcc gctcctgctc ccgctgccgc ggcaccagct gtcagcaacg 6840
aactccttga aaaagctgaa actgttgtga tggaggtttt ggctgcaaag actggatacg 6900
agactgacat gatagagtca gacatggagt tggaaacaga gcttgggatt gatagcatca 6960
agcgtgtgga aatcctttct gaggttcaag ccatgctgaa cgttgaggcc aaagatgtcg 7020
atgctttgtc aaggaccaga acggttggag aagtggtcga tgccatgaag gctgagatag 7080
ctggtggatc agcccctgct ccggctgcag ccgctcctgc aagtgccggt gctgcaccag 7140
ctgtgaagat tgattcagtt catggtgctg actgtgacga tttgtcactg atgcacgcaa 7200
aggtggttga catcagaagg ccagatgaac tgattctgga aagaccggag aaccgtccag 7260
ttcttgtcgt tgacgatggc tcagagttga cacttgctct tgtgagggtg ttgggagcct 7320
gtgcagttgt cttgaccttt gagggattgc agttggctca gagagctggt gcagctgcca 7380
ttcgtcatgt tctggctaag gacctttcag cagaatcagc tgagaaggcc atcaaagagg 7440
ctgagcaaag atttggagcg ttgggaggct tcataagcca gcaagcagaa aggtttgaac 7500
cagctgagat actgggtttc acactcatgt gtgcgaagtt tgccaaagcc tctctctgca 7560
ctgctgtggc tggaggtcgt cctgccttca tcggtgtggc taggcttgac ggcagacttg 7620
gattcacctc tcaaggcact tctgacgcac tcaagagagc acagcgtgga gcgatctttg 7680
gactctgcaa gacaataggg ttggagtggt cagaatctga tgtgttcagc cgtggtgtgg 7740
acattgctca agggatgcac ccagaagatg ctgcagttgc catagttagg gagatggcgt 7800
gtgctgacat cagaatcaga gaggttggga ttggagcaaa ccagcaaaga tgcacaatca 7860
gagctgccaa gttggagact gggaaccctc agagacagat agcgaaagac gatgtgcttc 7920
tggtttctgg aggtgctcgt gggatcacac ctctttgcat ccgtgagatc acgcgtcaga 7980
ttgctggagg caagtacatt ctgttgggtc gtagcaaagt ttctgcgtct gaaccagcat 8040
ggtgtgctgg catcactgat gagaaggctg tgcagaaagc tgccacccaa gagttgaaga 8100
gggccttcag tgctggtgaa ggacccaaac ccactccaag ggctgtcacg aaacttgtgg 8160
gatctgttct tggtgctcgt gaagtgagaa gctccattgc tgccattgaa gctctgggtg 8220
gcaaagcgat ctacagctct tgtgatgtga actctgctgc agatgttgcc aaagcagtta 8280
gggatgcaga gtcccagctt ggtgccagag ttagtggaat cgttcacgct tctggtgtgc 8340
tccgtgatcg tctcatagag aagaaactcc ctgacgagtt tgatgctgtc tttgggacca 8400
aagtcactgg gttggagaat cttctggctg cagttgatcg tgccaacctc aaacacatgg 8460
ttctcttcag ctcccttgct ggtttccacg gcaatgttgg tcagtctgac tatgcgatgg 8520
caaacgaagc tctcaacaag atgggtttgg aacttgcgaa ggatgtcagt gtcaagtcca 8580
tctgctttgg tccctgggat ggtgggatgg tgacacctca actcaagaaa cagtttcaag 8640
aaatgggagt tcagatcatt cctcgtgaag gaggtgctga tacagttgcg aggattgtgt 8700
tgggatcaag tcctgctgag atccttgttg gaaactggag gacaccatcc aagaaagttg 8760
gaagtgacac gatcaccctg catagaaaga tcagtgccaa gtccaatccc ttcttggagg 8820
atcatgtcat acaaggcaga agggtgttgc caatgaccct tgctattggg agccttgctg 8880
agacctgcct tggactcttc cctggctact ctctctgggc catagatgac gcacagctct 8940
tcaaaggtgt cactgttgat ggagacgtca actgtgaagt gaccctcaca ccgtccactg 9000
ctccgagtgg gagggtgaat gtccaagcga cgctcaagac gttctcaagt ggaaaacttg 9060
ttccagccta cagagctgtc atagtgttgt ccaaccaagg tgctccacct gccaatgcaa 9120
ccatgcagcc tccgagcctt gatgcagatc ctgctttgca agggtcagtc tatgatggca 9180
agactctctt tcatggtcct gcgttcagag gcattgatga cgttctcagc tgcaccaaga 9240
gccagcttgt tgccaagtgt tctgctgttc ctggatcaga tgcagccaga ggagagtttg 9300
caactgacac tgatgcacat gatccctttg tcaatgatct tgcctttcaa gcaatgttgg 9360
tctgggtgag gagaacgctg ggacaagctg cactcccgaa ctccattcag aggatagtcc 9420
aacacagacc ggtcccacaa gacaaaccct tctacatcac cctcagatcc aatcagagtg 9480
gtggacatag ccagcacaaa catgcacttc agttccacaa cgaacaaggt gatctcttca 9540
ttgatgttca agcctctgtc attgcgacag actcacttgc gttctgagta gttagcttaa 9600
tcacttaggt cacccagtcc aagcccggcc tagcacgatg atcatgagtg ttgctattga 9660
tgtatgttaa tactatacac agtcatcgtg tgtgttttat aaaactgtaa gcttaggatg 9720
tttgaggcta atgtaattag cactacaccg taataaatga gaggtttact ttatgtttta 9780
ataatgttct tacccttgct gctctctaaa ctgtaatggc gtacggttag ctaaactaaa 9840
gtaaaaatcg attcgcttga gtaaaattag tgaccgggaa agatcatcga ctactactgc 9900
tcagagatgt aatcggtaat taagacttca agctcaataa ttaattagga gtaaatctgg 9960
cttcgaattt ttaaattgtc aacttccaaa gaaggattgg caagactcaa tctcaattgc 10020
ccaacaaaca tatggctctt tacaaatttg gaatctcttt ttgatggcaa gaacgtcgta 10080
attcctctgt cgatctcatg taattaccaa actcatctac ttattacttt ctttatatgc 10140
acttactgat gcggccgctt aattaagatg agtgatactc aggactcagg actcactctg 10200
ctgatcacta gtgctagcct cgaggtcgac acaactttgt atacaaaagt tgtctagacc 10260
taggctcagc aactcatcca gtcaagttcg agtcagtgag ttgggcggcc gcagcttata 10320
gtaaagattt ttttgttaat aaaatgaaag ttaatattta tggatttatt tgaacatatt 10380
tacaagtttt tgttaataaa tttatttaca gaagtgttaa atttgaaaat gtgttaaatg 10440
agagttaata tttatggata taatattact ttatttaaaa ataaaatgaa tttatattaa 10500
aatatgattt ggtaaaagat attataaaga ggaacttgga tgagaaagac gacgatgggc 10560
aaaagttgca tggcacaccg cttttgttca gtaacatctg cactgtggcg cctttttcac 10620
actcaccatg catgctgcca cgtcagcttt cacactatga caccactggc catacacgtt 10680
gccacctcag ctttctcctc ttctcactat gacacgactg gccatgcatg catgcatgct 10740
gccacctcag ctcccgcctc ttcacccgtg tctttctctc atgtcgcagt gctgcgtgcc 10800
aacctcttct ctctataaat agagagaaga gaatgatggt taaactcaaa ccaaaacaag 10860
aaaacataca caaatagcaa aacggatcca caaccaaaaa tggctgcaag gaacgtgagt 10920
gcggctcatg agatgcatga cgagaagagg atagctgttg tgggcatggc tgttcagtat 10980
gctggatgca aaacgaaaga cgagttctgg gaagttctca tgaatggaaa agttgagagc 11040
aaagtgatca gcgacaaacg tcttggttca aattaccgtg ctgaacacta caaagctgaa 11100
aggagcaagt atgctgacac cttctgcaat gagacatatg gaactcttga tgagaacgaa 11160
atagacaatg agcatgaact ccttttgaac cttgccaaac aagccttggc tgaaacatct 11220
gtcaaagatt caacaagatg tggcatagtt tctggatgcc tcagcttccc gatggacaac 11280
ctccaaggtg aactcttgaa tgtgtaccag aaccatgttg agaagaaact tggtgccaga 11340
gttttcaaag atgcctctca ctggtcagaa agagaacagt ccaacaaacc agaggctggt 11400
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gatcacttgg tctctggtgc agctgatgtg atgctttgtg gtgcaacatg cctgccggag 11580
ccgtttttca tactctctgg gttctcaacc ttccaagcca tgcctgttgg aacgggtcag 11640
aatgtgtcca tgccgctgca caaagattct caaggattga cccctggtga aggaggttcc 11700
atcatggtcc tcaaacgttt ggatgacgca atcagagatg gagatcacat ctatggaaca 11760
cttttgggag ccaatgtcag caacagtggc actggtctgc cacttaaacc ccttttgccg 11820
tcagagaaaa agtgcctcat ggacacctac acacgtatca atgtgcatcc ccacaagatt 11880
cagtatgttg aatgccatgc aactgggact ccacaaggtg atcgtgtgga aattgatgct 11940
gtgaaggctt gctttgaagg caaagtccca cgttttggaa ccacaaaagg gaactttgga 12000
cacacattgg tggcagctgg gtttgctggc atgtgcaaag tgcttctctc catgaagcac 12060
gggatcattc cacccactcc gggaatagat gacgaaacga agatggaccc tctggttgtc 12120
tctggtgagg ccattccctg gccagaaacg aatggagaac cgaagcgtgc tggtctctca 12180
gcgtttggat ttggtgggac caatgctcat gctgtctttg aggaacatga cccaagcaat 12240
gctgcatgca ctggccatga ctccatttct gctctctctg cacgttgtgg tggtgagtca 12300
aacatgagaa tagcaatcac tgggatggat gccacttttg gtgctttgaa aggattggat 12360
gcttttgaaa gggccatcta cactggtgct catggtgcta taccactccc agaaaagaga 12420
tggagattcc tggggaaaga caaggacttc cttgatcttt gtggagtcaa agcaacaccg 12480
catggctgtt acattgaaga tgttgaagtt gatttccaga ggctgaggac tccaatgact 12540
cctgaagata tgctcttgcc tcaacagctt ctggctgtca ccacaattga tagggccata 12600
ttggactctg gcatgaagaa aggtggaaat gtggctgtct ttgtggggtt ggggaccgat 12660
cttgaactct accgtcaccg tgcaagggtt gctctcaagg agagagtgag gcctgaagcc 12720
agcaagaaac tcaatgacat gatgcagtac atcaatgatt gtgggacaag cacttcttac 12780
accagctaca taggcaactt ggttgcaaca agggtcagtt cacaatgggg cttcacggga 12840
ccttccttca caatcacaga aggcaacaat tctgtgtaca gatgtgctga acttggcaaa 12900
tacctcttgg aaacgggaga ggttgatggg gttgtggttg cgggtgttga tctctgtggg 12960
agtgctgaga acctttacgt caagtcaagg cgtttcaagg tgtctacatc tgacaccccg 13020
agagccagct ttgatgcagc tgctgatggt tactttgttg gagagggctg tggtgcattt 13080
gtgctcaagc gtgagacaag ctgcaccaag gatgacagaa tctatgcttg catggatgcc 13140
atagttcctg gaaatgttcc atctgcatgt ttgagagagg cattggatca agccagagtc 13200
aagcctggag acatcgagat gttggagctt tctgctgatt cagcgaggca tttgaaggac 13260
ccgtctgttc tcccaaagga actcactgct gaggaagaga ttggcggact tcagacgatt 13320
cttcgtgacg atgacaagct cccaaggaat gttgcaactg gaagtgtcaa ggccactgtt 13380
ggtgacactg gttatgcttc tggtgctgcc agtttgatta aggctgcgct ttgcatctac 13440
aaccgttacc tgcccagcaa tggagatgac tgggatgaac ctgcacctga agcaccctgg 13500
gacagcacac tctttgcgtg ccagacctca agagcttggt tgaagaaccc tggtgagaga 13560
cgttatgcgg ctgtttccgg agtcagtgaa accagaagtt gctacagtgt gctgctttct 13620
gaagcagagg gacactacga gagagagaac agaatcagtt tggatgagga agcacccaag 13680
ctcattgtgt tgagagcaga ctcccatgaa gagattcttg gaagattgga caagataagg 13740
gaaaggttct tgcagcccac gggtgctgca cccagagagt ctgaattgaa ggcgcaagcc 13800
cgtaggatct ttcttgaact ccttggtgag acccttgccc aagatgcagc ttcatctgga 13860
agtcagaagc cccttgctct cagcttggtc tccactccat ccaagctcca gagagaggtg 13920
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gctggaagca gatatgcgcc tgagcctttg gccagtgaca gagttgcctt catgtatgga 14040
gaaggaagga gcccttacta tggcatcaca caagacattc ataggatttg gcctgaactt 14100
catgaggtca tcaatgagaa aacaaaccgt ctctgggctg aaggtgacag atgggtcatg 14160
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caaggaaacc gtacgaacgt gagccagaac aagatcacaa gaaaatctca ctcacagcat 2880
acagccagcc gtcaaccctg gcatgtgctc ttggtgcctt tgagattttc aaggaagctg 2940
gattcactcc agactttgca gctggacaca gcttgggtga gtttgctgcg ctctatgcag 3000
ctggttgtgt tgacagagat gagttgtttg aacttgtttg cagaagggca aggatcatgg 3060
gaggcaaaga tgcacctgcc acacccaaag gttgcatggc agctgtcata ggacccaacg 3120
cagagaacat caaggttcaa gctgccaacg tctggcttgg aaactcaaac tctccgtctc 3180
agactgtcat tactgggtct gttgaaggga ttcaagctga aagtgccaga ttgcagaagg 3240
aagggttcag agttgtgcct cttgcttgtg agtctgcctt ccattctcca cagatggaaa 3300
atgccagctc agctttcaaa gatgtcatat ccaaggtttc cttccgtaca cccaaagcag 3360
aaacaaagct cttcagcaat gtttctggag agacctatcc gacggatgcc agagagatgc 3420
tcactcaaca catgacctca tctgtgaagt tcctgaccca agtgaggaac atgcaccaag 3480
ctggtgcgag aatctttgtt gagtttggac cgaaacaagt tctcagcaaa cttgtttctg 3540
aaaccctcaa agatgacccg tctgttgtca cagtgtctgt gaacccagct tctggcacgg 3600
actctgacat acagttgagg gatgctgcag ttcagctggt tgtggctggt gtcaatcttc 3660
aagggtttga caagtgggat gctcctgatg ccacgaggat gcaagccatc aagaaaaaga 3720
gaaccacact cagactttca gctgccacct atgtcagtga caagaccaag aaagtgaggg 3780
atgctgccat gaacgacgga agatgtgtca catacctcaa gggtgctgca ccactcatca 3840
aggctcctga acctgtggtt gacgaagctg ccaagaggga ggctgaaagg cttcagaagg 3900
agcttcaaga cgctcagagg cagcttgacg acgccaaacg tgcagctgca gaagccaact 3960
ccaaacttgc tgctgccaag gaggaagcca agactgctgc agcttcagcc aagcctgcag 4020
ttgacactgc tgttgtggag aaacatcgtg ccatcctcaa gtccatgctg gctgagctgg 4080
atggttatgg aagtgttgat gcttcttccc ttcagcaaca gcaacagcaa cagactgctc 4140
cggcgcctgt taaagccgct gcccctgccg ctcccgttgc aagtgctcct gctcccgccg 4200
tgtccaacga gttgcttgag aaagctgaga cagttgtgat ggaggttctc gctgccaaga 4260
ctggatacga aacagacatg attgaggcgg acatggagct tgagactgag ttgggaattg 4320
acagcatcaa gagggttgaa attctttctg aagtccaagc tatgcttaac gttgaggcga 4380
aagatgttga tgctctctct aggacgagaa cagtgggtga agttgtcaac gctatgaagg 4440
cagaaatcgc tggttcttcc gctccggcgc cggcagctgc cgcacctgca ccggctaaag 4500
cggctccagc tgcagctgca ccagctgttt ctaatgagct gctcgaaaag gcagaaactg 4560
ttgtgatgga agtccttgct gccaaaactg gctacgaaac tgacatgata gaatcagaca 4620
tggagcttga gacggagctt ggaattgatt ccatcaagcg tgtggaaatc ctcagtgaag 4680
tccaagccat gctcaatgtg gaagctaagg atgtggatgc tctctcaagg accagaactg 4740
tcggtgaggt tgtcaatgcc atgaaggctg agatagctgg aggctccgct cctgcgccgg 4800
ccgctgccgc tcctggtccc gctgccgcgg ctccagctcc agctgcagcc gctccggccg 4860
tctcaaacga actccttgaa aaagctgaga ccgtcgtgat ggaggtcttg gcagctaaaa 4920
ccggctatga gactgacatg attgagtctg acatggaatt ggagacagaa cttgggatag 4980
acagcatcaa acgtgttgaa atcctcagtg aggtccaagc tatgctgaac gtggaagcga 5040
aggatgttga tgctctgtcc agaacgagga ccgttggtga ggttgtggat gccatgaagg 5100
ctgaaattgc tggagggtct gcgcccgcgc cagctgcagc cgctcctgca cccgcagccg 5160
cggcacctgc tccagctgca cctgcacctg ccgtttcttc agaactcttg gagaaggctg 5220
agacggttgt gatggaggtt ttggctgcaa agactggcta tgagaccgac atgattgaat 5280
ctgatatgga attggagaca gagcttggga tcgattccat caaaagagtg gagatcctga 5340
gtgaagtcca agccatgctc aatgttgaag ctaaggatgt tgatgcactt tcaagaacaa 5400
ggacagtggg tgaggttgtg gatgccatga aggcggagat tgctggaggg agcgcgcctg 5460
cgccagctgc cgcggcacct gcaccggcag ccgcagctcc agctccagct gcaccagcac 5520
cggccgcgcc cgcgccagct gtttcatccg aactcctgga aaaggccgag acggttgtga 5580
tggaggtgct cgcagctaag actggttacg agaccgacat gattgaaagt gacatggagc 5640
ttgaaaccga gttgggaata gatagcatca aacgtgttga aatcttgtct gaggtccaag 5700
ctatgttgaa cgtggaggca aaagatgtcg atgcgctttc aagaaccaga acagtcggtg 5760
aggtcgtgga cgccatgaag gctgaaattg ccggaagctc tgctagtgcg ccagctgcag 5820
ccgcacctgc acctgctgcc gcggcacctg ctccagctgc agccgctcct gccgtcagca 5880
atgagttgct ggagaaagcc gaaacagttg tgatggaagt ccttgctgca aaaactggtt 5940
acgaaacgga catgattgag tcagacatgg aattggagac cgaacttgga atagattcca 6000
tcaagagagt ggagatcctc tctgaggtgc aagccatgct caacgttgag gctaaagatg 6060
ttgatgcact cagtaggaca agaactgtgg gggaagttgt cgatgcgatg aaggctgaga 6120
ttgctggagg ctctgctcct gcgccggcag ctgccgcacc tgcacccgca gccgcggcac 6180
cagctgtcag caacgaattg cttgagaagg ctgaaacagt tgtcatggaa gtgctggctg 6240
caaaaaccgg ctatgagact gacatgattg agtctgacat ggaacttgag acggaattgg 6300
gcattgacag catcaagcgt gttgagatcc tcagtgaagt ccaagcaatg ctcaatgtgg 6360
aggctaagga tgtggatgcc ctctcaagga ccagaacagt tggtgaggtc gttgatgcga 6420
tgaaggcgga gatcgctgga agttccgcgc ctgcgccagc tgcagccgct cctgcacccg 6480
cagccgcggc accggctcca gctgcagccg caccggccgt ctcctcagaa ctcctggaaa 6540
aggctgagac agttgtgatg gaagtccttg ctgcgaaaac tggctatgag accgacatga 6600
ttgaatctga catggaactg gagaccgagc ttggaattga ctccatcaaa cgtgttgaaa 6660
tcctctctga ggttcaagcg atgttgaatg tggaggccaa agatgttgat gctctttcca 6720
gaacaaggac ggtgggagag gtggttgatg ccatgaaggc tgagatagct gggggttctg 6780
ctcctgcgcc agctgcagcc gctcctgctc ccgctgccgc ggcaccagct gtcagcaacg 6840
aactccttga aaaagctgaa actgttgtga tggaggtttt ggctgcaaag actggatacg 6900
agactgacat gatagagtca gacatggagt tggaaacaga gcttgggatt gatagcatca 6960
agcgtgtgga aatcctttct gaggttcaag ccatgctgaa cgttgaggcc aaagatgtcg 7020
atgctttgtc aaggaccaga acggttggag aagtggtcga tgccatgaag gctgagatag 7080
ctggtggatc agcccctgct ccggctgcag ccgctcctgc aagtgccggt gctgcaccag 7140
ctgtgaagat tgattcagtt catggtgctg actgtgacga tttgtcactg atgcacgcaa 7200
aggtggttga catcagaagg ccagatgaac tgattctgga aagaccggag aaccgtccag 7260
ttcttgtcgt tgacgatggc tcagagttga cacttgctct tgtgagggtg ttgggagcct 7320
gtgcagttgt cttgaccttt gagggattgc agttggctca gagagctggt gcagctgcca 7380
ttcgtcatgt tctggctaag gacctttcag cagaatcagc tgagaaggcc atcaaagagg 7440
ctgagcaaag atttggagcg ttgggaggct tcataagcca gcaagcagaa aggtttgaac 7500
cagctgagat actgggtttc acactcatgt gtgcgaagtt tgccaaagcc tctctctgca 7560
ctgctgtggc tggaggtcgt cctgccttca tcggtgtggc taggcttgac ggcagacttg 7620
gattcacctc tcaaggcact tctgacgcac tcaagagagc acagcgtgga gcgatctttg 7680
gactctgcaa gacaataggg ttggagtggt cagaatctga tgtgttcagc cgtggtgtgg 7740
acattgctca agggatgcac ccagaagatg ctgcagttgc catagttagg gagatggcgt 7800
gtgctgacat cagaatcaga gaggttggga ttggagcaaa ccagcaaaga tgcacaatca 7860
gagctgccaa gttggagact gggaaccctc agagacagat agcgaaagac gatgtgcttc 7920
tggtttctgg aggtgctcgt gggatcacac ctctttgcat ccgtgagatc acgcgtcaga 7980
ttgctggagg caagtacatt ctgttgggtc gtagcaaagt ttctgcgtct gaaccagcat 8040
ggtgtgctgg catcactgat gagaaggctg tgcagaaagc tgccacccaa gagttgaaga 8100
gggccttcag tgctggtgaa ggacccaaac ccactccaag ggctgtcacg aaacttgtgg 8160
gatctgttct tggtgctcgt gaagtgagaa gctccattgc tgccattgaa gctctgggtg 8220
gcaaagcgat ctacagctct tgtgatgtga actctgctgc agatgttgcc aaagcagtta 8280
gggatgcaga gtcccagctt ggtgccagag ttagtggaat cgttcacgct tctggtgtgc 8340
tccgtgatcg tctcatagag aagaaactcc ctgacgagtt tgatgctgtc tttgggacca 8400
aagtcactgg gttggagaat cttctggctg cagttgatcg tgccaacctc aaacacatgg 8460
ttctcttcag ctcccttgct ggtttccacg gcaatgttgg tcagtctgac tatgcgatgg 8520
caaacgaagc tctcaacaag atgggtttgg aacttgcgaa ggatgtcagt gtcaagtcca 8580
tctgctttgg tccctgggat ggtgggatgg tgacacctca actcaagaaa cagtttcaag 8640
aaatgggagt tcagatcatt cctcgtgaag gaggtgctga tacagttgcg aggattgtgt 8700
tgggatcaag tcctgctgag atccttgttg gaaactggag gacaccatcc aagaaagttg 8760
gaagtgacac gatcaccctg catagaaaga tcagtgccaa gtccaatccc ttcttggagg 8820
atcatgtcat acaaggcaga agggtgttgc caatgaccct tgctattggg agccttgctg 8880
agacctgcct tggactcttc cctggctact ctctctgggc catagatgac gcacagctct 8940
tcaaaggtgt cactgttgat ggagacgtca actgtgaagt gaccctcaca ccgtccactg 9000
ctccgagtgg gagggtgaat gtccaagcga cgctcaagac gttctcaagt ggaaaacttg 9060
ttccagccta cagagctgtc atagtgttgt ccaaccaagg tgctccacct gccaatgcaa 9120
ccatgcagcc tccgagcctt gatgcagatc ctgctttgca agggtcagtc tatgatggca 9180
agactctctt tcatggtcct gcgttcagag gcattgatga cgttctcagc tgcaccaaga 9240
gccagcttgt tgccaagtgt tctgctgttc ctggatcaga tgcagccaga ggagagtttg 9300
caactgacac tgatgcacat gatccctttg tcaatgatct tgcctttcaa gcaatgttgg 9360
tctgggtgag gagaacgctg ggacaagctg cactcccgaa ctccattcag aggatagtcc 9420
aacacagacc ggtcccacaa gacaaaccct tctacatcac cctcagatcc aatcagagtg 9480
gtggacatag ccagcacaaa catgcacttc agttccacaa cgaacaaggt gatctcttca 9540
ttgatgttca agcctctgtc attgcgacag actcacttgc gttctgagta gttagcttaa 9600
tcacttaggt cacccagtcc aagcccggcc tagcacgatg atcatgagtg ttgctattga 9660
tgtatgttaa tactatacac agtcatcgtg tgtgttttat aaaactgtaa gcttaggatg 9720
tttgaggcta atgtaattag cactacaccg taataaatga gaggtttact ttatgtttta 9780
ataatgttct tacccttgct gctctctaaa ctgtaatggc gtacggttag ctaaactaaa 9840
gtaaaaatcg attcgcttga gtaaaattag tgaccgggaa agatcatcga ctactactgc 9900
tcagagatgt aatcggtaat taagacttca agctcaataa ttaattagga gtaaatctgg 9960
cttcgaattt ttaaattgtc aacttccaaa gaaggattgg caagactcaa tctcaattgc 10020
ccaacaaaca tatggctctt tacaaatttg gaatctcttt ttgatggcaa gaacgtcgta 10080
attcctctgt cgatctcatg taattaccaa actcatctac ttattacttt ctttatatgc 10140
acttactgat gcggccgctt aattaagatg agtgatactc aggactcagg actcactctg 10200
ctgatcacta gtgctagcct cgaggtcgac acaactttgt atacaaaagt tgtctagacc 10260
taggctcagc aactcatcca gtcaagttcg agtcagtgag ttgggcggcc gcagcttata 10320
gtaaagattt ttttgttaat aaaatgaaag ttaatattta tggatttatt tgaacatatt 10380
tacaagtttt tgttaataaa tttatttaca gaagtgttaa atttgaaaat gtgttaaatg 10440
agagttaata tttatggata taatattact ttatttaaaa ataaaatgaa tttatattaa 10500
aatatgattt ggtaaaagat attataaaga ggaacttgga tgagaaagac gacgatgggc 10560
aaaagttgca tggcacaccg cttttgttca gtaacatctg cactgtggcg cctttttcac 10620
actcaccatg catgctgcca cgtcagcttt cacactatga caccactggc catacacgtt 10680
gccacctcag ctttctcctc ttctcactat gacacgactg gccatgcatg catgcatgct 10740
gccacctcag ctcccgcctc ttcacccgtg tctttctctc atgtcgcagt gctgcgtgcc 10800
aacctcttct ctctataaat agagagaaga gaatgatggt taaactcaaa ccaaaacaag 10860
aaaacataca caaatagcaa aacggatcca caaccaaaaa tggctgcaag gaacgtgagt 10920
gcggctcatg agatgcatga cgagaagagg atagctgttg tgggcatggc tgttcagtat 10980
gctggatgca aaacgaaaga cgagttctgg gaagttctca tgaatggaaa agttgagagc 11040
aaagtgatca gcgacaaacg tcttggttca aattaccgtg ctgaacacta caaagctgaa 11100
aggagcaagt atgctgacac cttctgcaat gagacatatg gaactcttga tgagaacgaa 11160
atagacaatg agcatgaact ccttttgaac cttgccaaac aagccttggc tgaaacatct 11220
gtcaaagatt caacaagatg tggcatagtt tctggatgcc tcagcttccc gatggacaac 11280
ctccaaggtg aactcttgaa tgtgtaccag aaccatgttg agaagaaact tggtgccaga 11340
gttttcaaag atgcctctca ctggtcagaa agagaacagt ccaacaaacc agaggctggt 11400
gacagaagaa tcttcatgga ccctgcttcc tttgttgctg aggaactcaa tcttggcgct 11460
ctccactact ctgttgatgc tgcctgtgcc actgcgctct atgtgctcag actggcgcaa 11520
gatcacttgg tctctggtgc agctgatgtg atgctttgtg gtgcaacatg cctgccggag 11580
ccgtttttca tactctctgg gttctcaacc ttccaagcca tgcctgttgg aacgggtcag 11640
aatgtgtcca tgccgctgca caaagattct caaggattga cccctggtga aggaggttcc 11700
atcatggtcc tcaaacgttt ggatgacgca atcagagatg gagatcacat ctatggaaca 11760
cttttgggag ccaatgtcag caacagtggc actggtctgc cacttaaacc ccttttgccg 11820
tcagagaaaa agtgcctcat ggacacctac acacgtatca atgtgcatcc ccacaagatt 11880
cagtatgttg aatgccatgc aactgggact ccacaaggtg atcgtgtgga aattgatgct 11940
gtgaaggctt gctttgaagg caaagtccca cgttttggaa ccacaaaagg gaactttgga 12000
cacacattgg tggcagctgg gtttgctggc atgtgcaaag tgcttctctc catgaagcac 12060
gggatcattc cacccactcc gggaatagat gacgaaacga agatggaccc tctggttgtc 12120
tctggtgagg ccattccctg gccagaaacg aatggagaac cgaagcgtgc tggtctctca 12180
gcgtttggat ttggtgggac caatgctcat gctgtctttg aggaacatga cccaagcaat 12240
gctgcatgca ctggccatga ctccatttct gctctctctg cacgttgtgg tggtgagtca 12300
aacatgagaa tagcaatcac tgggatggat gccacttttg gtgctttgaa aggattggat 12360
gcttttgaaa gggccatcta cactggtgct catggtgcta taccactccc agaaaagaga 12420
tggagattcc tggggaaaga caaggacttc cttgatcttt gtggagtcaa agcaacaccg 12480
catggctgtt acattgaaga tgttgaagtt gatttccaga ggctgaggac tccaatgact 12540
cctgaagata tgctcttgcc tcaacagctt ctggctgtca ccacaattga tagggccata 12600
ttggactctg gcatgaagaa aggtggaaat gtggctgtct ttgtggggtt ggggaccgat 12660
cttgaactct accgtcaccg tgcaagggtt gctctcaagg agagagtgag gcctgaagcc 12720
agcaagaaac tcaatgacat gatgcagtac atcaatgatt gtgggacaag cacttcttac 12780
accagctaca taggcaactt ggttgcaaca agggtcagtt cacaatgggg cttcacggga 12840
ccttccttca caatcacaga aggcaacaat tctgtgtaca gatgtgctga acttggcaaa 12900
tacctcttgg aaacgggaga ggttgatggg gttgtggttg cgggtgttga tctctgtggg 12960
agtgctgaga acctttacgt caagtcaagg cgtttcaagg tgtctacatc tgacaccccg 13020
agagccagct ttgatgcagc tgctgatggt tactttgttg gagagggctg tggtgcattt 13080
gtgctcaagc gtgagacaag ctgcaccaag gatgacagaa tctatgcttg catggatgcc 13140
atagttcctg gaaatgttcc atctgcatgt ttgagagagg cattggatca agccagagtc 13200
aagcctggag acatcgagat gttggagctt tctgctgatt cagcgaggca tttgaaggac 13260
ccgtctgttc tcccaaagga actcactgct gaggaagaga ttggcggact tcagacgatt 13320
cttcgtgacg atgacaagct cccaaggaat gttgcaactg gaagtgtcaa ggccactgtt 13380
ggtgacactg gttatgcttc tggtgctgcc agtttgatta aggctgcgct ttgcatctac 13440
aaccgttacc tgcccagcaa tggagatgac tgggatgaac ctgcacctga agcaccctgg 13500
gacagcacac tctttgcgtg ccagacctca agagcttggt tgaagaaccc tggtgagaga 13560
cgttatgcgg ctgtttccgg agtcagtgaa accagaagtt gctacagtgt gctgctttct 13620
gaagcagagg gacactacga gagagagaac agaatcagtt tggatgagga agcacccaag 13680
ctcattgtgt tgagagcaga ctcccatgaa gagattcttg gaagattgga caagataagg 13740
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cgtaggatct ttcttgaact ccttggtgag acccttgccc aagatgcagc ttcatctgga 13860
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gaacttgcgg caaaaggcat tccgagatgt ctcaagatga gacgtgattg gagttcccct 13980
gctggaagca gatatgcgcc tgagcctttg gccagtgaca gagttgcctt catgtatgga 14040
gaaggaagga gcccttacta tggcatcaca caagacattc ataggatttg gcctgaactt 14100
catgaggtca tcaatgagaa aacaaaccgt ctctgggctg aaggtgacag atgggtcatg 14160
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attgaaatgt tccgtcttgg aatcctcacc tcaattgcct tcacaaacct ggcgagagat 14280
gttctcaaca tcacgcccaa agcagccttt ggactcagtt tgggagagat ttccatgatc 14340
tttgctttct ccaagaaaaa cggtttgata agcgatcagt tgacaaagga tttgagagag 14400
tcagatgtct ggaacaaagc tctggctgtt gagttcaatg cgctcagaga agcctggggc 14460
attccacagt ctgtcccaaa agatgagttc tggcaaggtt acatagtgag gggaacgaaa 14520
caagacatag aagcagccat agcaccagac tcaaagtatg tgaggttgac catcatcaat 14580
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cttggtggca acatccctgc gcttccagtc actcaaggca tgtgtgggca ttgcccagag 14700
gtgggacctt acaccaagga catcgcaaag atccacgcca accttgagtt ccctgtggtt 14760
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gccaaagatg aatgggctcc ttcatccttt ggggagtatg ctggacagct ctatgagaaa 14880
caagccaact tccctcagat agttgaaacc atctacaagc agaactatga tgtgtttgtt 14940
gaagttgggc caaacaatca cagaagcaca gcagtgagaa ccacgcttgg accacagaga 15000
aaccaccttg ctggtgccat agacaagcag aacgaggatg cttggacgac aatagtcaag 15060
ctcgtggctt cattgaaggc tcaccttgtt cctggagtga ccatcagtcc gctctaccac 15120
tccaagctcg ttgcagaggc tgaggcttgt tatgctgcgc tctgtaaagg tgagaaaccc 15180
aagaaaaaca agtttgtgag aaagattcag ttgaatggca gattcaacag caaggcagac 15240
cccatctcct cagcagacct tgcatccttc ccacctgcgg accctgcgat tgaagctgcc 15300
atctcttcaa ggatcatgaa gcctgtggct ccgaaattct atgcgcgtct caacattgat 15360
gagcaagatg agaccagaga tccgatcttg aacaaggaca atgcgccttc cagctccagc 15420
tcttccagca gttcctcttc cagcagttca tctccgtctc ctgctccttc agctccagtt 15480
cagaagaaag ctgccccagc tgcggagaca aaagctgttg ccagtgctga tgcacttcgt 15540
agtgccctgc ttgatcttga ctccatgctt gcgctcagct ctgcaagtgc ttctggcaac 15600
cttgttgaga ctgcgccatc tgatgccagt gtcattgtcc ctccgtgcaa cattgctgat 15660
cttggcagca gagctttcat gaaaacttat ggtgtttctg cgcctctgta caccggtgca 15720
atggccaagg gaattgcctc tgcggacttg gtgatcgcag ctggaaggca aggaatcctt 15780
gcgtcatttg gtgctggagg ccttccaatg caagttgtgc gtgagtccat tgaaaagatt 15840
caagctgccc tgcccaatgg accatatgct gtcaacctca tccattctcc ttttgacagc 15900
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tcagccttca tgacgttgac accgcaagtt gtcagataca gagcggctgg gttgacgagg 16020
aatgcagatg ggtcagtcaa cataaggaac agaatcattg ggaaagtctc cagaactgag 16080
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<210> 46
<211> 34862
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> plasmid pDAB9166
<400> 46
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tgagtgaagt ccaagccatg ctcaatgttg aagctaagga tgttgatgca ctttcaagaa 5400
caaggacagt gggtgaggtt gtggatgcca tgaaggcgga gattgctgga gggagcgcgc 5460
ctgcgccagc tgccgcggca cctgcaccgg cagccgcagc tccagctcca gctgcaccag 5520
caccggccgc gcccgcgcca gctgtttcat ccgaactcct ggaaaaggcc gagacggttg 5580
tgatggaggt gctcgcagct aagactggtt acgagaccga catgattgaa agtgacatgg 5640
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aagctatgtt gaacgtggag gcaaaagatg tcgatgcgct ttcaagaacc agaacagtcg 5760
gtgaggtcgt ggacgccatg aaggctgaaa ttgccggaag ctctgctagt gcgccagctg 5820
cagccgcacc tgcacctgct gccgcggcac ctgctccagc tgcagccgct cctgccgtca 5880
gcaatgagtt gctggagaaa gccgaaacag ttgtgatgga agtccttgct gcaaaaactg 5940
gttacgaaac ggacatgatt gagtcagaca tggaattgga gaccgaactt ggaatagatt 6000
ccatcaagag agtggagatc ctctctgagg tgcaagccat gctcaacgtt gaggctaaag 6060
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agattgctgg aggctctgct cctgcgccgg cagctgccgc acctgcaccc gcagccgcgg 6180
caccagctgt cagcaacgaa ttgcttgaga aggctgaaac agttgtcatg gaagtgctgg 6240
ctgcaaaaac cggctatgag actgacatga ttgagtctga catggaactt gagacggaat 6300
tgggcattga cagcatcaag cgtgttgaga tcctcagtga agtccaagca atgctcaatg 6360
tggaggctaa ggatgtggat gccctctcaa ggaccagaac agttggtgag gtcgttgatg 6420
cgatgaaggc ggagatcgct ggaagttccg cgcctgcgcc agctgcagcc gctcctgcac 6480
ccgcagccgc ggcaccggct ccagctgcag ccgcaccggc cgtctcctca gaactcctgg 6540
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tgattgaatc tgacatggaa ctggagaccg agcttggaat tgactccatc aaacgtgttg 6660
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ctgctcctgc gccagctgca gccgctcctg ctcccgctgc cgcggcacca gctgtcagca 6840
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tcgatgcttt gtcaaggacc agaacggttg gagaagtggt cgatgccatg aaggctgaga 7080
tagctggtgg atcagcccct gctccggctg cagccgctcc tgcaagtgcc ggtgctgcac 7140
cagctgtgaa gattgattca gttcatggtg ctgactgtga cgatttgtca ctgatgcacg 7200
caaaggtggt tgacatcaga aggccagatg aactgattct ggaaagaccg gagaaccgtc 7260
cagttcttgt cgttgacgat ggctcagagt tgacacttgc tcttgtgagg gtgttgggag 7320
cctgtgcagt tgtcttgacc tttgagggat tgcagttggc tcagagagct ggtgcagctg 7380
ccattcgtca tgttctggct aaggaccttt cagcagaatc agctgagaag gccatcaaag 7440
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ttggactctg caagacaata gggttggagt ggtcagaatc tgatgtgttc agccgtggtg 7740
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cgtgtgctga catcagaatc agagaggttg ggattggagc aaaccagcaa agatgcacaa 7860
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ccatctgctt tggtccctgg gatggtggga tggtgacacc tcaactcaag aaacagtttc 8640
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tgttgggatc aagtcctgct gagatccttg ttggaaactg gaggacacca tccaagaaag 8760
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aggatcatgt catacaaggc agaagggtgt tgccaatgac ccttgctatt gggagccttg 8880
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taatcactta ggtcacccta tcaaaatcta tttagaaata cacaatattt tgttgcaggc 9660
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agcggatcat tcattgtttg tttggttgcc tttgccaaca tgggagtcca aggttgcggc 10080
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attccctggc cagaaacgaa tggagaaccg aagcgtgctg gtctctcagc gtttggattt 12120
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attgaagatg ttgaagttga tttccagagg ctgaggactc caatgactcc tgaagatatg 12480
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ttcaagagtg agcttgagtc acaacagcaa gagtttgaca gaaacatgat tgaaatgttc 14160
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ttaaggatca agtcatggct ggatctcttg tcagcgacgg ttgttcacaa atgctcaaga 19260
tgtacatgat ctggctcggt ttgcacctta ccaccggacc atttgacttc agacccgtca 19320
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tctacgtcat ggagatcaaa gagatgggat tcgacgagga taacgatccg tacgccattg 19440
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tcgaggaggc aatgtaaccg cctctggtag tacacttctc taatccaaaa atcaatttgt 25440
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cgggccggga gggttcgaga agggggggca ccccccttcg gcgtgcgcgg tcacgcgcac 4680
agggcgcagc cctggttaaa aacaaggttt ataaatattg gtttaaaagc aggttaaaag 4740
acaggttagc ggtggccgaa aaacgggcgg aaacccttgc aaatgctgga ttttctgcct 4800
gtggacagcc cctcaaatgt caataggtgc gcccctcatc tgtcagcact ctgcccctca 4860
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agggcactta tccccaggct tgtccacatc atctgtggga aactcgcgta aaatcaggcg 4980
ttttcgccga tttgcgaggc tggccagctc cacgtcgccg gccgaaatcg agcctgcccc 5040
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ggagctggta ttcgtgcagg gcaagattcg gaataccaag tacgagaagg acggccagac 6060
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cacgaaggcc gaggaatgcc tgtcgcgcct acaggcgacg gcgatgggct tcacgtccga 6960
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aacccacttg acaacaattg caaagctgga gaaatgcctc tgaactggta caacatgtca 32460
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cctcatgtgc ggatcggatt ccacccgcgt gaagaagtgg cgcgagcagg tcggcgaagc 7260
ctgcgaagag ttgcgaggca gcggcctggt ggaacacgcc tgggtcaatg atgacctggt 7320
gcattgcaaa cgctagggcc ttgtggggtc agttccggct gggggttcag cagccagcgc 7380
tttactggca tttcaggaac aagcgggcac tgctcgacgc acttgcttcg ctcagtatcg 7440
ctcgggacgc acggcgcgct ctacgaactg ccgataaaca gaggattaaa attgacaatt 7500
gtgattaagg ctcagattcg acggcttgga gcggccgacg tgcaggattt ccgcgagatc 7560
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cacaaggcgc atctgtccgg cgttttcgtg gagcccgaac agcgaggccg aggggtcgcc 7800
ggtatgctgc tgcgggcgtt gccggcgggt ttattgctcg tgatgatcgt ccgacagatt 7860
ccaacgggaa tctggtggat gcgcatcttc atcctcggcg cacttaatat ttcgctattc 7920
tggagcttgt tgtttatttc ggtctaccgc ctgccgggcg gggtcgcggc gacggtaggc 7980
gctgtgcagc cgctgatggt cgtgttcatc tctgccgctc tgctaggtag cccgatacga 8040
ttgatggcgg tcctgggggc tatttgcgga actgcgggcg tggcgctgtt ggtgttgaca 8100
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gcgttcggaa ccgtgctgac ccgcaagtgg caacctcccg tgcctctgct cacctttacc 8220
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ccaatcccga tgcctacagg aaccaatgtt ctcggcctgg cgtggctcgg cctgatcgga 8340
gcgggtttaa cctacttcct ttggttccgg gggatctcgc gactcgaacc tacagttgtt 8400
tccttactgg gctttctcag cccccgagcg cttagtggga atttgtaccc cttatcgaac 8460
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acgacatcat tccgtggcgt tatccagcta agcgcgaact gcaatttgga gaatggcagc 8880
gcaatgacat tcttgcaggt atcttcgagc cagccacgat cgacattgat ctggctatct 8940
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tcaaattaca acggtatata tcctgccagt cagcatcatc acaccaaaag ttaggcccga 9660
atagtttgaa attagaaagc tcgcaattga ggtctacagg ccaaattcgc tcttagccgt 9720
acaatattac tcaccggatc ctaaccggtt taattaaggc gcgccatgcc cgggcaagcg 9780
gccgcacaag tttgtacaaa aaagcaggct tctaggatct gcttttacat gcgagacaca 9840
tcttctaaag taattttaat aatagttact atattcaaga tttcatatat caaatactca 9900
atattacttc taaaaaatta attagatata attaaaatat tactttttta attttaagtt 9960
taattgttga atttgtgact attgatttat tattctacta tgtttaaatt gttttataga 10020
tagtttaaag taaatataag taatgtagta gagtgttaga gtgttaccct aaaccataaa 10080
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aaccaaaaat ggcagcgagg ctgcaagagc agaaaggagg tgagatggac acgaggattg 10740
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cgtactttga cccagtcaag accacaaagg acaaaatcta ctgcaagaga ggaggtttca 10920
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atccatccag agtactacta ctctactact ataatacccc aacccaactc atattcaata 20880
ctactctagg atccacaacc aaaaatggct gcaaggaacg tgagtgcggc tcatgagatg 20940
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ttgctcaagt gcatggcgca aagcagttat tggagtgcgg attttcgttg gcatattatt 40260
cgccacgagt tagcagacga agagaccttc atgaacgtgg ccaaggccag agttaagcag 40320
atgttacgcc ctgctgcagg cctttctatt atccaatagt tggttgatct ttggaaagag 40380
cctcggctga ggcccatact gaaagagatc gatggatatc gatatgccat gttgtttgct 40440
agccagaacc agatcacatc cgatatgcta ttgcagcttg acgcagatat ggaggataag 40500
ttgattcatg ggatcgctca ggagtagctc atccatgcac gccgacaaga acagaaattc 40560
cgtcgagtta acgcagccgc ttacgacgga ttcgaaggtc atccattcgg aatgtattag 40620
tttgcaccag ctccgcgtca cacctgtctt catttgaata agatgttagc aattgttttt 40680
agctttgtct tgttgtggca gggcggcaag tgcttcagac atcattctgt tttcaaattt 40740
tatgctggag aacagcttct taattccttt ggaaataata gactgcgtct taaaattcag 40800
atgtctggat atagatatga ttgtaaaata acctatttaa gtgtcattta gaacataagt 40860
tttatgaatg ttcttccatt ttcgtcatcg aacgaataag agtaaataca ccttttttaa 40920
cattacaaat aagttcttat acgttgttta tacaccggga atcatttcca ttattttcgc 40980
gcaaaagtca cggatattcg tgaaagcgac ataaactgcg aaatttgcgg ggagtgtctt 41040
gagtttgcct cgaggctagc gcatgcacat agacacacac atcatctcat tgatgcttgg 41100
taataattgt cattagattg tttttatgca tagatgcact cgaaatcagc caattttaga 41160
caagtatcaa acggatgtga cttcagtaca ttaaaaacgt ccgcaatgtg ttattaagtt 41220
gtctaagcgt caatttgatt tacaattgaa tatatcctgc cccagccagc caacagctcg 41280
atttacaatt gaatatatcc tgccggccgg cccacgcgtg tcgaggaatt ctgatctggc 41340
ccccatttgg acgtgaatgt agacacgtcg aaataaagat ttccgaatta gaataatttg 41400
tttattgctt tcgcctataa atacgacgga tcgtaatttg tcgttttatc aaaatgtact 41460
ttcattttat aataacgctg cggacatcta catttttgaa ttgaaaaaaa attggtaatt 41520
actctttctt tttctccata ttgaccatca tactcattgc tgatccatgt agatttcccg 41580
gacatgaagc catttacaat tgaatatatc ctgccgccgc tgccgctttg cacccggtgg 41640
agcttgcatg ttggtttcta cgcagaactg agccggttag gcagataatt tccattgaga 41700
actgagccat gtgcaccttc cccccaacac ggtgagcgac ggggcaacgg agtgatccac 41760
atgggacttt taaacatcat ccgtcggatg gcgttgcgag agaagcagtc gatccgtgag 41820
atcagccgac gcaccgggca ggcgcgcaac acgatcgcaa agtatttgaa cgcaggtaca 41880
atcgagccga cgttcacgcg gaacgaccaa gcaagcttgg ctgccatttt tggggtgagg 41940
ccgttcgcgg ccgaggggcg cagcccctgg ggggatggga ggcccgcgtt agcgggccgg 42000
gagggttcga gaaggggggg cacccccctt cggcgtgcgc ggtcacgcgc acagggcgca 42060
gccctggtta aaaacaaggt ttataaatat tggtttaaaa gcaggttaaa agacaggtta 42120
gcggtggccg aaaaacgggc ggaaaccctt gcaaatgctg gattttctgc ctgtggacag 42180
cccctcaaat gtcaataggt gcgcccctca tctgtcagca ctctgcccct caagtgtcaa 42240
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tatccccagg cttgtccaca tcatctgtgg gaaactcgcg taaaatcagg cgttttcgcc 42360
gatttgcgag gctggccagc tccacgtcgc cggccgaaat cgagcctgcc cctcatctgt 42420
caacgccgcg ccgggtgagt cggcccctca agtgtcaacg tccgcccctc atctgtcagt 42480
gagggccaag ttttccgcga ggtatccaca acgccggcgg ccgcggtgtc tcgcacacgg 42540
cttcgacggc gtttctggcg cgtttgcagg gccatagacg gccgccagcc cagcggcgag 42600
ggcaaccagc ccggtgagcg tcggaaaggg tcgacggatc ttttccgctg cataaccctg 42660
cttcggggtc attatagcga ttttttcggt atatccatcc tttttcgcac gatatacagg 42720
attttgccaa agggttcgtg tagactttcc ttggtgtatc caacggcgtc agccgggcag 42780
gataggtgaa gtaggcccac ccgcgagcgg gtgttccttc ttcactgtcc cttattcgca 42840
cctggcggtg ctcaacggga atcctgctct gcgaggctgg ccggctaccg ccggcgtaac 42900
agatgagggc aagcggatgg ctgatgaaac caagccaacc aggaagggca gcccacctat 42960
caaggtgtac tgccttccag acgaacgaag agcgattgag gaaaaggcgg cggcggccgg 43020
catgagcctg tcggcctacc tgctggccgt cggccagggc tacaaaatca cgggcgtcgt 43080
ggactatgag cacgtccgcg agctggcccg catcaatggc gacctgggcc gcctgggcgg 43140
cctgctgaaa ctctggctca ccgacgaccc gcgcacggcg cggttcggtg atgccacgat 43200
cctcgccctg ctggcgaaga tcgaagagaa gcaggacgag cttggcaagg tcatgatggg 43260
cgtggtccgc ccgagggcag agccatgact tttttagccg ctaaaacggc cggggggtgc 43320
gcgtgattgc caagcacgtc cccatgcgct ccatcaagaa gagcgacttc gcggagctgg 43380
tattcgtgca gggcaagatt cggaatacca agtacgagaa ggacggccag acggtctacg 43440
ggaccgactt cattgccgat aaggtggatt atctggacac caaggcacca ggcgggtcaa 43500
atcaggaata agggcacatt gccccggcgt gagtcggggc aatcccgcaa ggagggtgaa 43560
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ccgaggatgc cgaaaccatc gcaagccgca ccgtcatgcg tgcgccccgc gaaaccttcc 43680
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cgccgtggcc ggacacgatg cgagcgatgc caaacgacac ggcccgctct gccctgttca 44040
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cgttctacga gctttgccag gacctgggct ggtcgatcaa tggccggtat tacacgaagg 44280
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cgtcccgttg ccaggtcctg atcgacgagg aaatcgtcgt gctgtttgct ggcgaccact 44460
acacgaaatt catatgggag aagtaccgca agctgtcgcc gacggcccga cggatgttcg 44520
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aatctggtgg atgcgcatct tcatcctcgg cgcacttaat atttcgctat tctggagctt 45300
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gatgcctaca ggaaccaatg ttctcggcct ggcgtggctc ggcctgatcg gagcgggttt 45720
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attcttgcag gtatcttcga gccagccacg atcgacattg atctggctat cttgctgaca 46320
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gcagtaaccg gcaaaatcgc gccgaaggat gtcgctgccg actgggcaat ggagcgcctg 46560
ccggcccagt atcagcccgt catacttgaa gctaggcagg cttatcttgg acaagaagat 46620
cgcttggcct cgcgcgcaga tcagttggaa gaatttgttc actacgtgaa aggcgagatc 46680
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cggcttaact caagcgttag agagctgggg aagactatgc gcgatctgtt gaaggtggtt 46800
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ccctcggcag ttcatcaggg ctaaatcaat ctagccgact tgtccggtga aatgggctgc 46920
actccaacag aaacaatcaa acaaacatac acagcgactt attcacacga gctcaaatta 46980
caacggtata tatcctgcca gtcagcatca tcacaccaaa agttaggccc gaatagtttg 47040
aaattagaaa gctcgcaatt gaggtctaca ggccaaattc gctcttagcc gtacaatatt 47100
actcaccgga tcctaaccgg tttaattaag gcgcgccatg cccgggcaag cggccgcaca 47160
agttt 47165
<210> 51
<211> 46978
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> plasmid pDAB9330
<400> 51
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gcgtagcacg cggccgcctc ccagtatcat tatagtgaaa gttttggctc tctcgccggt 120
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atccctacaa atttattatt tgttaaacat tttcaaaccg cataaaattt tatgaagtcc 300
cgtctatctt taatgtagtc taacattttc atattgaaat atataattta cttaatttta 360
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tatcaaatat ttttcaacca cgtaaatctc ataataataa gttgtttcaa aagtaataaa 540
atttaactcc ataatttttt tattcgactg atcttaaagc aacacccagt gacacaacta 600
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taattcccat ttgacactac ggaagtaact gaagatctgc ttttacatgc gagacacatc 780
ttctaaagta attttaataa tagttactat attcaagatt tcatatatca aatactcaat 840
attacttcta aaaaattaat tagatataat taaaatatta cttttttaat tttaagttta 900
attgttgaat ttgtgactat tgatttatta ttctactatg tttaaattgt tttatagata 960
gtttaaagta aatataagta atgtagtaga gtgttagagt gttaccctaa accataaact 1020
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tgcatggatc ttgcgcaaga aaaagacaaa gaacaaagaa aaaagacaaa acagagagac 1200
aaaacgcaat cacacaacca actcaaatta gtcactggct gatcaagatc gccgcgtcca 1260
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catctcaacc cacacacaaa cacattgcct ttttcttcat catcaccaca accacctgta 1380
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acctataaat acctctaata tcactcactt ctttcatcat ccatccatcc agagtactac 1560
tactctacta ctataatacc ccaacccaac tcatattcaa tactactcta ggatccacaa 1620
ccaaaaatgg cagcgaggct gcaagagcag aaaggaggtg agatggacac gaggattgcg 1680
atcataggca tgagcgccat acttccttgt ggaaccacgg tgagagagtc atgggagacc 1740
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tactttgacc cagtcaagac cacaaaggac aaaatctact gcaagagagg aggtttcatt 1860
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gatgcgaatc agaccatctc acttctcaag gtcaaagaag cacttcaaga tgctgggatt 1980
gatgcacttg gaaaggagaa gaaaaacata ggatgcgtgc ttggcattgg aggtggacag 2040
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gtgttcagca cggacccaag tgtgagagcg tatgatgaga aaacgaaagg gatgctcatt 2460
ggtgagggat cagccatgtt ggtgctcaaa cgttatgcag atgcagtgag ggatggtgat 2520
gagattcatg ctgtgattcg tggttgtgca agctcaagtg atggcaaagc agctggcatc 2580
tacactccca caatcagtgg tcaagaggaa gccttgagac gtgcatacaa tcgtgcctgc 2640
gttgaccctg ccactgtcac tttggttgag ggtcatggga ctggcactcc agttggagat 2700
aggattgagt tgactgcgtt gaggaacttg tttgacaaag cgtatggtga agggaacaca 2760
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cttgctggaa tgatcaaggt catcatggct ctcaaacaca agactttgcc tggaacgatc 2880
aatgtggaca atccacccaa tctctatgac aacactccca tcaatgagtc atccctctac 2940
atcaacacga tgaacagacc ctggttccct ccacctggtg ttccgagacg tgctggaata 3000
tccagctttg gctttggagg tgccaactac catgcagtgt tggaagaggc tgaaccagag 3060
cacacgacag cgtacagact caacaaacgt ccacaaccgg tgttgatgat ggctgcaact 3120
cctgctgcgt tgcagagcct ttgtgaagct cagctgaaag agtttgaagc tgcgatcaag 3180
gagaatgaga cagtcaagaa tactgcctac atcaagtgtg tcaagtttgg agaacagttc 3240
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gaggatgcgt gctccacgct tcgtgctata tgtgctcagt ttgccaaaga tgtgaccaaa 3360
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ggtgctgttg ctgcactctt ctctggacaa ggtgctcagt acacacacat gttcagtgaa 3480
gttgcgatga actggcctca gttcagacag tccattgctg caatggacgc tgcacagtcc 3540
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ccgtacgaac gtgagccaga acaagatcac aagaaaatct cactcacagc atacagccag 3660
ccgtcaaccc tggcatgtgc tcttggtgcc tttgagattt tcaaggaagc tggattcact 3720
ccagactttg cagctggaca cagcttgggt gagtttgctg cgctctatgc agctggttgt 3780
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gatgcacctg ccacacccaa aggttgcatg gcagctgtca taggacccaa cgcagagaac 3900
atcaaggttc aagctgccaa cgtctggctt ggaaactcaa actctccgtc tcagactgtc 3960
attactgggt ctgttgaagg gattcaagct gaaagtgcca gattgcagaa ggaagggttc 4020
agagttgtgc ctcttgcttg tgagtctgcc ttccattctc cacagatgga aaatgccagc 4080
tcagctttca aagatgtcat atccaaggtt tccttccgta cacccaaagc agaaacaaag 4140
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gacaagtggg atgctcctga tgccacgagg atgcaagcca tcaagaaaaa gagaaccaca 4500
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gacgctcaga ggcagcttga cgacgccaaa cgtgcagctg cagaagccaa ctccaaactt 4740
gctgctgcca aggaggaagc caagactgct gcagcttcag ccaagcctgc agttgacact 4800
gctgttgtgg agaaacatcg tgccatcctc aagtccatgc tggctgagct ggatggttat 4860
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gttaaagccg ctgcccctgc cgctcccgtt gcaagtgctc ctgctcccgc cgtgtccaac 4980
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gctggttctt ccgctccggc gccggcagct gccgcacctg caccggctaa agcggctcca 5280
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gagactgaca tgattgagtc tgacatggaa ttggagacag aacttgggat agacagcatc 5760
aaacgtgttg aaatcctcag tgaggtccaa gctatgctga acgtggaagc gaaggatgtt 5820
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gctccagctg cacctgcacc tgccgtttct tcagaactct tggagaaggc tgagacggtt 6000
gtgatggagg ttttggctgc aaagactggc tatgagaccg acatgattga atctgatatg 6060
gaattggaga cagagcttgg gatcgattcc atcaaaagag tggagatcct gagtgaagtc 6120
caagccatgc tcaatgttga agctaaggat gttgatgcac tttcaagaac aaggacagtg 6180
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cccgcgccag ctgtttcatc cgaactcctg gaaaaggccg agacggttgt gatggaggtg 6360
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gcacctgctg ccgcggcacc tgctccagct gcagccgctc ctgccgtcag caatgagttg 6660
ctggagaaag ccgaaacagt tgtgatggaa gtccttgctg caaaaactgg ttacgaaacg 6720
gacatgattg agtcagacat ggaattggag accgaacttg gaatagattc catcaagaga 6780
gtggagatcc tctctgaggt gcaagccatg ctcaacgttg aggctaaaga tgttgatgca 6840
ctcagtagga caagaactgt gggggaagtt gtcgatgcga tgaaggctga gattgctgga 6900
ggctctgctc ctgcgccggc agctgccgca cctgcacccg cagccgcggc accagctgtc 6960
agcaacgaat tgcttgagaa ggctgaaaca gttgtcatgg aagtgctggc tgcaaaaacc 7020
ggctatgaga ctgacatgat tgagtctgac atggaacttg agacggaatt gggcattgac 7080
agcatcaagc gtgttgagat cctcagtgaa gtccaagcaa tgctcaatgt ggaggctaag 7140
gatgtggatg ccctctcaag gaccagaaca gttggtgagg tcgttgatgc gatgaaggcg 7200
gagatcgctg gaagttccgc gcctgcgcca gctgcagccg ctcctgcacc cgcagccgcg 7260
gcaccggctc cagctgcagc cgcaccggcc gtctcctcag aactcctgga aaaggctgag 7320
acagttgtga tggaagtcct tgctgcgaaa actggctatg agaccgacat gattgaatct 7380
gacatggaac tggagaccga gcttggaatt gactccatca aacgtgttga aatcctctct 7440
gaggttcaag cgatgttgaa tgtggaggcc aaagatgttg atgctctttc cagaacaagg 7500
acggtgggag aggtggttga tgccatgaag gctgagatag ctgggggttc tgctcctgcg 7560
ccagctgcag ccgctcctgc tcccgctgcc gcggcaccag ctgtcagcaa cgaactcctt 7620
gaaaaagctg aaactgttgt gatggaggtt ttggctgcaa agactggata cgagactgac 7680
atgatagagt cagacatgga gttggaaaca gagcttggga ttgatagcat caagcgtgtg 7740
gaaatccttt ctgaggttca agccatgctg aacgttgagg ccaaagatgt cgatgctttg 7800
tcaaggacca gaacggttgg agaagtggtc gatgccatga aggctgagat agctggtgga 7860
tcagcccctg ctccggctgc agccgctcct gcaagtgccg gtgctgcacc agctgtgaag 7920
attgattcag ttcatggtgc tgactgtgac gatttgtcac tgatgcacgc aaaggtggtt 7980
gacatcagaa ggccagatga actgattctg gaaagaccgg agaaccgtcc agttcttgtc 8040
gttgacgatg gctcagagtt gacacttgct cttgtgaggg tgttgggagc ctgtgcagtt 8100
gtcttgacct ttgagggatt gcagttggct cagagagctg gtgcagctgc cattcgtcat 8160
gttctggcta aggacctttc agcagaatca gctgagaagg ccatcaaaga ggctgagcaa 8220
agatttggag cgttgggagg cttcataagc cagcaagcag aaaggtttga accagctgag 8280
atactgggtt tcacactcat gtgtgcgaag tttgccaaag cctctctctg cactgctgtg 8340
gctggaggtc gtcctgcctt catcggtgtg gctaggcttg acggcagact tggattcacc 8400
tctcaaggca cttctgacgc actcaagaga gcacagcgtg gagcgatctt tggactctgc 8460
aagacaatag ggttggagtg gtcagaatct gatgtgttca gccgtggtgt ggacattgct 8520
caagggatgc acccagaaga tgctgcagtt gccatagtta gggagatggc gtgtgctgac 8580
atcagaatca gagaggttgg gattggagca aaccagcaaa gatgcacaat cagagctgcc 8640
aagttggaga ctgggaaccc tcagagacag atagcgaaag acgatgtgct tctggtttct 8700
ggaggtgctc gtgggatcac acctctttgc atccgtgaga tcacgcgtca gattgctgga 8760
ggcaagtaca ttctgttggg tcgtagcaaa gtttctgcgt ctgaaccagc atggtgtgct 8820
ggcatcactg atgagaaggc tgtgcagaaa gctgccaccc aagagttgaa gagggccttc 8880
agtgctggtg aaggacccaa acccactcca agggctgtca cgaaacttgt gggatctgtt 8940
cttggtgctc gtgaagtgag aagctccatt gctgccattg aagctctggg tggcaaagcg 9000
atctacagct cttgtgatgt gaactctgct gcagatgttg ccaaagcagt tagggatgca 9060
gagtcccagc ttggtgccag agttagtgga atcgttcacg cttctggtgt gctccgtgat 9120
cgtctcatag agaagaaact ccctgacgag tttgatgctg tctttgggac caaagtcact 9180
gggttggaga atcttctggc tgcagttgat cgtgccaacc tcaaacacat ggttctcttc 9240
agctcccttg ctggtttcca cggcaatgtt ggtcagtctg actatgcgat ggcaaacgaa 9300
gctctcaaca agatgggttt ggaacttgcg aaggatgtca gtgtcaagtc catctgcttt 9360
ggtccctggg atggtgggat ggtgacacct caactcaaga aacagtttca agaaatggga 9420
gttcagatca ttcctcgtga aggaggtgct gatacagttg cgaggattgt gttgggatca 9480
agtcctgctg agatccttgt tggaaactgg aggacaccat ccaagaaagt tggaagtgac 9540
acgatcaccc tgcatagaaa gatcagtgcc aagtccaatc ccttcttgga ggatcatgtc 9600
atacaaggca gaagggtgtt gccaatgacc cttgctattg ggagccttgc tgagacctgc 9660
cttggactct tccctggcta ctctctctgg gccatagatg acgcacagct cttcaaaggt 9720
gtcactgttg atggagacgt caactgtgaa gtgaccctca caccgtccac tgctccgagt 9780
gggagggtga atgtccaagc gacgctcaag acgttctcaa gtggaaaact tgttccagcc 9840
tacagagctg tcatagtgtt gtccaaccaa ggtgctccac ctgccaatgc aaccatgcag 9900
cctccgagcc ttgatgcaga tcctgctttg caagggtcag tctatgatgg caagactctc 9960
tttcatggtc ctgcgttcag aggcattgat gacgttctca gctgcaccaa gagccagctt 10020
gttgccaagt gttctgctgt tcctggatca gatgcagcca gaggagagtt tgcaactgac 10080
actgatgcac atgatccctt tgtcaatgat cttgcctttc aagcaatgtt ggtctgggtg 10140
aggagaacgc tgggacaagc tgcactcccg aactccattc agaggatagt ccaacacaga 10200
ccggtcccac aagacaaacc cttctacatc accctcagat ccaatcagag tggtggacat 10260
agccagcaca aacatgcact tcagttccac aacgaacaag gtgatctctt cattgatgtt 10320
caagcctctg tcattgcgac agactcactt gcgttctgag tagttagctt aatcacttag 10380
gtcaccagta tgaactaaaa tgcatgtagg tgtaagagct catggagagc atggaatatt 10440
gtatccgacc atgtaacagt ataataactg agctccatct cacttcttct atgaataaac 10500
aaaggatgtt atgatatatt aacactctat ctatgcacct tattgttcta tgataaattt 10560
cctcttatta ttataaatca tctgaatcgt gacggcttat ggaatgcttc aaatagtaca 10620
aaaacaaatg tgtactataa gactttctaa acaattctaa ctttagcatt gtgaacgaga 10680
cataagtgtt aagaagacat aacaattata atggaagaag tttgtctcca tttatatatt 10740
atatattacc cacttatgta ttatattagg atgttaagga gacataacaa ttataaagag 10800
agaagtttgt atccatttat atattatata ctacccattt atatattata cttatccact 10860
tatttaatgt ctttataagg tttgatccat gatatttcta atattttagt tgatatgtat 10920
atgaaaaggt actatttgaa ctctcttact ctgtataaag gttggatcat ccttaaagtg 10980
ggtctattta attttattgc ttcttacaga taaaaaaaaa attatgagtt ggtttgataa 11040
aatattgaag gatttaaaat aataataaat aataaataac atataatata tgtatataaa 11100
tttattataa tataacattt atctataaaa aagtaaatat tgtcataaat ctatacaatc 11160
gtttagcctt gctggaacga atctcaatta tttaaacgag agtaaacata tttgactttt 11220
tggttattta acaaattatt atttaacact atatgaaatt tttttttttt atcagcaaag 11280
aataaaatta aattaagaag gacaatggtg tcccaatcct tatacaacca acttccacaa 11340
gaaagtcaag tcagagacaa caaaaaaaca agcaaaggaa attttttaat ttgagttgtc 11400
ttgtttgctg cataatttat gcagtaaaac actacacata acccttttag cagtagagca 11460
atggttgacc gtgtgcttag cttcttttat tttatttttt tatcagcaaa gaataaataa 11520
aataaaatga gacacttcag ggatgtttca acccttatac aaaaccccaa aaacaagttt 11580
cctagcaccc taccaacgaa ttcgcggccg cttaattaag atgagtgata ctcaggactc 11640
aggactcact ctgctgatca ctagtgctag cctcgaggtc gacacaactt tgtatacaaa 11700
agttgtctag acctaggctc agcaactcat ccagtcaagt tcgagtcagt gagttgggcg 11760
gccgcctccc agtatcatta tagtgaaagt tttggctctc tcgccggtgg ttttttacct 11820
ctatttaaag gggttttcca cctaaaaatt ctggtatcat tctcacttta cttgttactt 11880
taatttctca taatctttgg ttgaaattat cacgcttccg cacacgatat ccctacaaat 11940
ttattatttg ttaaacattt tcaaaccgca taaaatttta tgaagtcccg tctatcttta 12000
atgtagtcta acattttcat attgaaatat ataatttact taattttagc gttggtagaa 12060
agcataatga tttattctta ttcttcttca tataaatgtt taatatacaa tataaacaaa 12120
ttctttacct taagaaggat ttcccatttt atattttaaa aatatattta tcaaatattt 12180
ttcaaccacg taaatctcat aataataagt tgtttcaaaa gtaataaaat ttaactccat 12240
aattttttta ttcgactgat cttaaagcaa cacccagtga cacaactagc catttttttc 12300
tttgaataaa aaaatccaat tatcattgta ttttttttat acaatgaaaa tttcaccaaa 12360
caatgatttg tggtatttct gaagcaagtc atgttatgca aaattctata attcccattt 12420
gacactacgg aagtaactga agatctgctt ttacatgcga gacacatctt ctaaagtaat 12480
tttaataata gttactatat tcaagatttc atatatcaaa tactcaatat tacttctaaa 12540
aaattaatta gatataatta aaatattact tttttaattt taagtttaat tgttgaattt 12600
gtgactattg atttattatt ctactatgtt taaattgttt tatagatagt ttaaagtaaa 12660
tataagtaat gtagtagagt gttagagtgt taccctaaac cataaactat aagatttatg 12720
gtggactaat tttcatatat ttcttattgc ttttaccttt tcttggtatg taagtccgta 12780
actggaatta ctgtgggttg ccatgacact ctgtggtctt ttggttcatg catggatctt 12840
gcgcaagaaa aagacaaaga acaaagaaaa aagacaaaac agagagacaa aacgcaatca 12900
cacaaccaac tcaaattagt cactggctga tcaagatcgc cgcgtccatg tatgtctaaa 12960
tgccatgcaa agcaacacgt gcttaacatg cactttaaat ggctcaccca tctcaaccca 13020
cacacaaaca cattgccttt ttcttcatca tcaccacaac cacctgtata tattcattct 13080
cttccgccac ctcaatttct tcacttcaac acacgtcaac ctgcatatgc gtgtcatccc 13140
atgcccaaat ctccatgcat gttccaacca ccttctctct tatataatac ctataaatac 13200
ctctaatatc actcacttct ttcatcatcc atccatccag agtactacta ctctactact 13260
ataatacccc aacccaactc atattcaata ctactctagg atccacaacc aaaaatggct 13320
gcaaggaacg tgagtgcggc tcatgagatg catgacgaga agaggatagc tgttgtgggc 13380
atggctgttc agtatgctgg atgcaaaacg aaagacgagt tctgggaagt tctcatgaat 13440
ggaaaagttg agagcaaagt gatcagcgac aaacgtcttg gttcaaatta ccgtgctgaa 13500
cactacaaag ctgaaaggag caagtatgct gacaccttct gcaatgagac atatggaact 13560
cttgatgaga acgaaataga caatgagcat gaactccttt tgaaccttgc caaacaagcc 13620
ttggctgaaa catctgtcaa agattcaaca agatgtggca tagtttctgg atgcctcagc 13680
ttcccgatgg acaacctcca aggtgaactc ttgaatgtgt accagaacca tgttgagaag 13740
aaacttggtg ccagagtttt caaagatgcc tctcactggt cagaaagaga acagtccaac 13800
aaaccagagg ctggtgacag aagaatcttc atggaccctg cttcctttgt tgctgaggaa 13860
ctcaatcttg gcgctctcca ctactctgtt gatgctgcct gtgccactgc gctctatgtg 13920
ctcagactgg cgcaagatca cttggtctct ggtgcagctg atgtgatgct ttgtggtgca 13980
acatgcctgc cggagccgtt tttcatactc tctgggttct caaccttcca agccatgcct 14040
gttggaacgg gtcagaatgt gtccatgccg ctgcacaaag attctcaagg attgacccct 14100
ggtgaaggag gttccatcat ggtcctcaaa cgtttggatg acgcaatcag agatggagat 14160
cacatctatg gaacactttt gggagccaat gtcagcaaca gtggcactgg tctgccactt 14220
aaaccccttt tgccgtcaga gaaaaagtgc ctcatggaca cctacacacg tatcaatgtg 14280
catccccaca agattcagta tgttgaatgc catgcaactg ggactccaca aggtgatcgt 14340
gtggaaattg atgctgtgaa ggcttgcttt gaaggcaaag tcccacgttt tggaaccaca 14400
aaagggaact ttggacacac attggtggca gctgggtttg ctggcatgtg caaagtgctt 14460
ctctccatga agcacgggat cattccaccc actccgggaa tagatgacga aacgaagatg 14520
gaccctctgg ttgtctctgg tgaggccatt ccctggccag aaacgaatgg agaaccgaag 14580
cgtgctggtc tctcagcgtt tggatttggt gggaccaatg ctcatgctgt ctttgaggaa 14640
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tgtggtggtg agtcaaacat gagaatagca atcactggga tggatgccac ttttggtgct 14760
ttgaaaggat tggatgcttt tgaaagggcc atctacactg gtgctcatgg tgctatacca 14820
ctcccagaaa agagatggag attcctgggg aaagacaagg acttccttga tctttgtgga 14880
gtcaaagcaa caccgcatgg ctgttacatt gaagatgttg aagttgattt ccagaggctg 14940
aggactccaa tgactcctga agatatgctc ttgcctcaac agcttctggc tgtcaccaca 15000
attgataggg ccatattgga ctctggcatg aagaaaggtg gaaatgtggc tgtctttgtg 15060
gggttgggga ccgatcttga actctaccgt caccgtgcaa gggttgctct caaggagaga 15120
gtgaggcctg aagccagcaa gaaactcaat gacatgatgc agtacatcaa tgattgtggg 15180
acaagcactt cttacaccag ctacataggc aacttggttg caacaagggt cagttcacaa 15240
tggggcttca cgggaccttc cttcacaatc acagaaggca acaattctgt gtacagatgt 15300
gctgaacttg gcaaatacct cttggaaacg ggagaggttg atggggttgt ggttgcgggt 15360
gttgatctct gtgggagtgc tgagaacctt tacgtcaagt caaggcgttt caaggtgtct 15420
acatctgaca ccccgagagc cagctttgat gcagctgctg atggttactt tgttggagag 15480
ggctgtggtg catttgtgct caagcgtgag acaagctgca ccaaggatga cagaatctat 15540
gcttgcatgg atgccatagt tcctggaaat gttccatctg catgtttgag agaggcattg 15600
gatcaagcca gagtcaagcc tggagacatc gagatgttgg agctttctgc tgattcagcg 15660
aggcatttga aggacccgtc tgttctccca aaggaactca ctgctgagga agagattggc 15720
ggacttcaga cgattcttcg tgacgatgac aagctcccaa ggaatgttgc aactggaagt 15780
gtcaaggcca ctgttggtga cactggttat gcttctggtg ctgccagttt gattaaggct 15840
gcgctttgca tctacaaccg ttacctgccc agcaatggag atgactggga tgaacctgca 15900
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gagatttcca tgatctttgc tttctccaag aaaaacggtt tgataagcga tcagttgaca 16800
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ccaagagcca cgggtgccaa agatgaatgg gctccttcat cctttgggga gtatgctgga 17280
cagctctatg agaaacaagc caacttccct cagatagttg aaaccatcta caagcagaac 17340
tatgatgtgt ttgttgaagt tgggccaaac aatcacagaa gcacagcagt gagaaccacg 17400
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agtgcttctg gcaaccttgt tgagactgcg ccatctgatg ccagtgtcat tgtccctccg 18060
tgcaacattg ctgatcttgg cagcagagct ttcatgaaaa cttatggtgt ttctgcgcct 18120
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agagcatgga atattgtatc cgaccatgta acagtataat aactgagctc catctcactt 19620
cttctatgaa taaacaaagg atgttatgat atattaacac tctatctatg caccttattg 19680
ttctatgata aatttcctct tattattata aatcatctga atcgtgacgg cttatggaat 19740
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gagttggttt gataaaatat tgaaggattt aaaataataa taaataataa ataacatata 20220
atatatgtat ataaatttat tataatataa catttatcta taaaaaagta aatattgtca 20280
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acatatttga ctttttggtt atttaacaaa ttattattta acactatatg aaattttttt 20400
tttttatcag caaagaataa aattaaatta agaaggacaa tggtgtccca atccttatac 20460
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ttaatttgag ttgtcttgtt tgctgcataa tttatgcagt aaaacactac acataaccct 20580
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<211> 41726
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> plasmid pDAB9337
<400> 52
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gcgtagcacg cggccgcctc ccagtatcat tatagtgaaa gttttggctc tctcgccggt 120
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tacttgttac tttaatttct cataatcttt ggttgaaatt atcacgcttc cgcacacgat 240
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tatcaaatat ttttcaacca cgtaaatctc ataataataa gttgtttcaa aagtaataaa 540
atttaactcc ataatttttt tattcgactg atcttaaagc aacacccagt gacacaacta 600
gccatttttt tctttgaata aaaaaatcca attatcattg tatttttttt atacaatgaa 660
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tgcatggatc ttgcgcaaga aaaagacaaa gaacaaagaa aaaagacaaa acagagagac 1200
aaaacgcaat cacacaacca actcaaatta gtcactggct gatcaagatc gccgcgtcca 1260
tgtatgtcta aatgccatgc aaagcaacac gtgcttaaca tgcactttaa atggctcacc 1320
catctcaacc cacacacaaa cacattgcct ttttcttcat catcaccaca accacctgta 1380
tatattcatt ctcttccgcc acctcaattt cttcacttca acacacgtca acctgcatat 1440
gcgtgtcatc ccatgcccaa atctccatgc atgttccaac caccttctct cttatataat 1500
acctataaat acctctaata tcactcactt ctttcatcat ccatccatcc agagtactac 1560
tactctacta ctataatacc ccaacccaac tcatattcaa tactactcta ggatccacaa 1620
ccaaaaatgg cagcgaggct gcaagagcag aaaggaggtg agatggacac gaggattgcg 1680
atcataggca tgagcgccat acttccttgt ggaaccacgg tgagagagtc atgggagacc 1740
ataagggctg gcattgattg cctgtctgat cttcctgagg atcgtgttga tgtgactgcg 1800
tactttgacc cagtcaagac cacaaaggac aaaatctact gcaagagagg aggtttcatt 1860
cctgagtatg actttgatgc gcgtgagttt ggtctcaaca tgttccagat ggaagattct 1920
gatgcgaatc agaccatctc acttctcaag gtcaaagaag cacttcaaga tgctgggatt 1980
gatgcacttg gaaaggagaa gaaaaacata ggatgcgtgc ttggcattgg aggtggacag 2040
aagagttcac atgagttcta cagcagactc aactatgtgg ttgtggagaa agtcttgaga 2100
aagatgggga tgccagagga agatgtcaaa gtggctgtgg agaagtacaa agcgaacttc 2160
ccagaatgga gacttgactc tttccctgga ttccttggga atgtcactgc tggcagatgc 2220
accaacacat tcaacttgga tggcatgaac tgcgttgtgg atgctgcatg tgcaagctcc 2280
ttgatagcag tcaaggttgc gattgatgaa ctgctctatg gtgactgcga catgatggtc 2340
actggtgcaa cctgcacaga caactccatt gggatgtaca tggctttctc aaagacacct 2400
gtgttcagca cggacccaag tgtgagagcg tatgatgaga aaacgaaagg gatgctcatt 2460
ggtgagggat cagccatgtt ggtgctcaaa cgttatgcag atgcagtgag ggatggtgat 2520
gagattcatg ctgtgattcg tggttgtgca agctcaagtg atggcaaagc agctggcatc 2580
tacactccca caatcagtgg tcaagaggaa gccttgagac gtgcatacaa tcgtgcctgc 2640
gttgaccctg ccactgtcac tttggttgag ggtcatggga ctggcactcc agttggagat 2700
aggattgagt tgactgcgtt gaggaacttg tttgacaaag cgtatggtga agggaacaca 2760
gagaaagttg cagttggaag tatcaagtcc agtattggtc atttgaaggc tgttgctggt 2820
cttgctggaa tgatcaaggt catcatggct ctcaaacaca agactttgcc tggaacgatc 2880
aatgtggaca atccacccaa tctctatgac aacactccca tcaatgagtc atccctctac 2940
atcaacacga tgaacagacc ctggttccct ccacctggtg ttccgagacg tgctggaata 3000
tccagctttg gctttggagg tgccaactac catgcagtgt tggaagaggc tgaaccagag 3060
cacacgacag cgtacagact caacaaacgt ccacaaccgg tgttgatgat ggctgcaact 3120
cctgctgcgt tgcagagcct ttgtgaagct cagctgaaag agtttgaagc tgcgatcaag 3180
gagaatgaga cagtcaagaa tactgcctac atcaagtgtg tcaagtttgg agaacagttc 3240
aagttccctg ggagcatacc tgcgaccaat gcgagactgg gattcttggt caaagatgcg 3300
gaggatgcgt gctccacgct tcgtgctata tgtgctcagt ttgccaaaga tgtgaccaaa 3360
gaagcgtgga ggcttccgag agaaggagtt tctttccgtg ccaaaggcat tgccaccaat 3420
ggtgctgttg ctgcactctt ctctggacaa ggtgctcagt acacacacat gttcagtgaa 3480
gttgcgatga actggcctca gttcagacag tccattgctg caatggacgc tgcacagtcc 3540
aaggttgctg gaagtgacaa agactttgaa agagtctctc aagtcctgta cccaaggaaa 3600
ccgtacgaac gtgagccaga acaagatcac aagaaaatct cactcacagc atacagccag 3660
ccgtcaaccc tggcatgtgc tcttggtgcc tttgagattt tcaaggaagc tggattcact 3720
ccagactttg cagctggaca cagcttgggt gagtttgctg cgctctatgc agctggttgt 3780
gttgacagag atgagttgtt tgaacttgtt tgcagaaggg caaggatcat gggaggcaaa 3840
gatgcacctg ccacacccaa aggttgcatg gcagctgtca taggacccaa cgcagagaac 3900
atcaaggttc aagctgccaa cgtctggctt ggaaactcaa actctccgtc tcagactgtc 3960
attactgggt ctgttgaagg gattcaagct gaaagtgcca gattgcagaa ggaagggttc 4020
agagttgtgc ctcttgcttg tgagtctgcc ttccattctc cacagatgga aaatgccagc 4080
tcagctttca aagatgtcat atccaaggtt tccttccgta cacccaaagc agaaacaaag 4140
ctcttcagca atgtttctgg agagacctat ccgacggatg ccagagagat gctcactcaa 4200
cacatgacct catctgtgaa gttcctgacc caagtgagga acatgcacca agctggtgcg 4260
agaatctttg ttgagtttgg accgaaacaa gttctcagca aacttgtttc tgaaaccctc 4320
aaagatgacc cgtctgttgt cacagtgtct gtgaacccag cttctggcac ggactctgac 4380
atacagttga gggatgctgc agttcagctg gttgtggctg gtgtcaatct tcaagggttt 4440
gacaagtggg atgctcctga tgccacgagg atgcaagcca tcaagaaaaa gagaaccaca 4500
ctcagacttt cagctgccac ctatgtcagt gacaagacca agaaagtgag ggatgctgcc 4560
atgaacgacg gaagatgtgt cacatacctc aagggtgctg caccactcat caaggctcct 4620
gaacctgtgg ttgacgaagc tgccaagagg gaggctgaaa ggcttcagaa ggagcttcaa 4680
gacgctcaga ggcagcttga cgacgccaaa cgtgcagctg cagaagccaa ctccaaactt 4740
gctgctgcca aggaggaagc caagactgct gcagcttcag ccaagcctgc agttgacact 4800
gctgttgtgg agaaacatcg tgccatcctc aagtccatgc tggctgagct ggatggttat 4860
ggaagtgttg atgcttcttc ccttcagcaa cagcaacagc aacagactgc tccggcgcct 4920
gttaaagccg ctgcccctgc cgctcccgtt gcaagtgctc ctgctcccgc cgtgtccaac 4980
gagttgcttg agaaagctga gacagttgtg atggaggttc tcgctgccaa gactggatac 5040
gaaacagaca tgattgaggc ggacatggag cttgagactg agttgggaat tgacagcatc 5100
aagagggttg aaattctttc tgaagtccaa gctatgctta acgttgaggc gaaagatgtt 5160
gatgctctct ctaggacgag aacagtgggt gaagttgtca acgctatgaa ggcagaaatc 5220
gctggttctt ccgctccggc gccggcagct gccgcacctg caccggctaa agcggctcca 5280
gctgcagctg caccagctgt ttctaatgag ctgctcgaaa aggcagaaac tgttgtgatg 5340
gaagtccttg ctgccaaaac tggctacgaa actgacatga tagaatcaga catggagctt 5400
gagacggagc ttggaattga ttccatcaag cgtgtggaaa tcctcagtga agtccaagcc 5460
atgctcaatg tggaagctaa ggatgtggat gctctctcaa ggaccagaac tgtcggtgag 5520
gttgtcaatg ccatgaaggc tgagatagct ggaggctccg ctcctgcgcc ggccgctgcc 5580
gctcctggtc ccgctgccgc ggctccagct ccagctgcag ccgctccggc cgtctcaaac 5640
gaactccttg aaaaagctga gaccgtcgtg atggaggtct tggcagctaa aaccggctat 5700
gagactgaca tgattgagtc tgacatggaa ttggagacag aacttgggat agacagcatc 5760
aaacgtgttg aaatcctcag tgaggtccaa gctatgctga acgtggaagc gaaggatgtt 5820
gatgctctgt ccagaacgag gaccgttggt gaggttgtgg atgccatgaa ggctgaaatt 5880
gctggagggt ctgcgcccgc gccagctgca gccgctcctg cacccgcagc cgcggcacct 5940
gctccagctg cacctgcacc tgccgtttct tcagaactct tggagaaggc tgagacggtt 6000
gtgatggagg ttttggctgc aaagactggc tatgagaccg acatgattga atctgatatg 6060
gaattggaga cagagcttgg gatcgattcc atcaaaagag tggagatcct gagtgaagtc 6120
caagccatgc tcaatgttga agctaaggat gttgatgcac tttcaagaac aaggacagtg 6180
ggtgaggttg tggatgccat gaaggcggag attgctggag ggagcgcgcc tgcgccagct 6240
gccgcggcac ctgcaccggc agccgcagct ccagctccag ctgcaccagc accggccgcg 6300
cccgcgccag ctgtttcatc cgaactcctg gaaaaggccg agacggttgt gatggaggtg 6360
ctcgcagcta agactggtta cgagaccgac atgattgaaa gtgacatgga gcttgaaacc 6420
gagttgggaa tagatagcat caaacgtgtt gaaatcttgt ctgaggtcca agctatgttg 6480
aacgtggagg caaaagatgt cgatgcgctt tcaagaacca gaacagtcgg tgaggtcgtg 6540
gacgccatga aggctgaaat tgccggaagc tctgctagtg cgccagctgc agccgcacct 6600
gcacctgctg ccgcggcacc tgctccagct gcagccgctc ctgccgtcag caatgagttg 6660
ctggagaaag ccgaaacagt tgtgatggaa gtccttgctg caaaaactgg ttacgaaacg 6720
gacatgattg agtcagacat ggaattggag accgaacttg gaatagattc catcaagaga 6780
gtggagatcc tctctgaggt gcaagccatg ctcaacgttg aggctaaaga tgttgatgca 6840
ctcagtagga caagaactgt gggggaagtt gtcgatgcga tgaaggctga gattgctgga 6900
ggctctgctc ctgcgccggc agctgccgca cctgcacccg cagccgcggc accagctgtc 6960
agcaacgaat tgcttgagaa ggctgaaaca gttgtcatgg aagtgctggc tgcaaaaacc 7020
ggctatgaga ctgacatgat tgagtctgac atggaacttg agacggaatt gggcattgac 7080
agcatcaagc gtgttgagat cctcagtgaa gtccaagcaa tgctcaatgt ggaggctaag 7140
gatgtggatg ccctctcaag gaccagaaca gttggtgagg tcgttgatgc gatgaaggcg 7200
gagatcgctg gaagttccgc gcctgcgcca gctgcagccg ctcctgcacc cgcagccgcg 7260
gcaccggctc cagctgcagc cgcaccggcc gtctcctcag aactcctgga aaaggctgag 7320
acagttgtga tggaagtcct tgctgcgaaa actggctatg agaccgacat gattgaatct 7380
gacatggaac tggagaccga gcttggaatt gactccatca aacgtgttga aatcctctct 7440
gaggttcaag cgatgttgaa tgtggaggcc aaagatgttg atgctctttc cagaacaagg 7500
acggtgggag aggtggttga tgccatgaag gctgagatag ctgggggttc tgctcctgcg 7560
ccagctgcag ccgctcctgc tcccgctgcc gcggcaccag ctgtcagcaa cgaactcctt 7620
gaaaaagctg aaactgttgt gatggaggtt ttggctgcaa agactggata cgagactgac 7680
atgatagagt cagacatgga gttggaaaca gagcttggga ttgatagcat caagcgtgtg 7740
gaaatccttt ctgaggttca agccatgctg aacgttgagg ccaaagatgt cgatgctttg 7800
tcaaggacca gaacggttgg agaagtggtc gatgccatga aggctgagat agctggtgga 7860
tcagcccctg ctccggctgc agccgctcct gcaagtgccg gtgctgcacc agctgtgaag 7920
attgattcag ttcatggtgc tgactgtgac gatttgtcac tgatgcacgc aaaggtggtt 7980
gacatcagaa ggccagatga actgattctg gaaagaccgg agaaccgtcc agttcttgtc 8040
gttgacgatg gctcagagtt gacacttgct cttgtgaggg tgttgggagc ctgtgcagtt 8100
gtcttgacct ttgagggatt gcagttggct cagagagctg gtgcagctgc cattcgtcat 8160
gttctggcta aggacctttc agcagaatca gctgagaagg ccatcaaaga ggctgagcaa 8220
agatttggag cgttgggagg cttcataagc cagcaagcag aaaggtttga accagctgag 8280
atactgggtt tcacactcat gtgtgcgaag tttgccaaag cctctctctg cactgctgtg 8340
gctggaggtc gtcctgcctt catcggtgtg gctaggcttg acggcagact tggattcacc 8400
tctcaaggca cttctgacgc actcaagaga gcacagcgtg gagcgatctt tggactctgc 8460
aagacaatag ggttggagtg gtcagaatct gatgtgttca gccgtggtgt ggacattgct 8520
caagggatgc acccagaaga tgctgcagtt gccatagtta gggagatggc gtgtgctgac 8580
atcagaatca gagaggttgg gattggagca aaccagcaaa gatgcacaat cagagctgcc 8640
aagttggaga ctgggaaccc tcagagacag atagcgaaag acgatgtgct tctggtttct 8700
ggaggtgctc gtgggatcac acctctttgc atccgtgaga tcacgcgtca gattgctgga 8760
ggcaagtaca ttctgttggg tcgtagcaaa gtttctgcgt ctgaaccagc atggtgtgct 8820
ggcatcactg atgagaaggc tgtgcagaaa gctgccaccc aagagttgaa gagggccttc 8880
agtgctggtg aaggacccaa acccactcca agggctgtca cgaaacttgt gggatctgtt 8940
cttggtgctc gtgaagtgag aagctccatt gctgccattg aagctctggg tggcaaagcg 9000
atctacagct cttgtgatgt gaactctgct gcagatgttg ccaaagcagt tagggatgca 9060
gagtcccagc ttggtgccag agttagtgga atcgttcacg cttctggtgt gctccgtgat 9120
cgtctcatag agaagaaact ccctgacgag tttgatgctg tctttgggac caaagtcact 9180
gggttggaga atcttctggc tgcagttgat cgtgccaacc tcaaacacat ggttctcttc 9240
agctcccttg ctggtttcca cggcaatgtt ggtcagtctg actatgcgat ggcaaacgaa 9300
gctctcaaca agatgggttt ggaacttgcg aaggatgtca gtgtcaagtc catctgcttt 9360
ggtccctggg atggtgggat ggtgacacct caactcaaga aacagtttca agaaatggga 9420
gttcagatca ttcctcgtga aggaggtgct gatacagttg cgaggattgt gttgggatca 9480
agtcctgctg agatccttgt tggaaactgg aggacaccat ccaagaaagt tggaagtgac 9540
acgatcaccc tgcatagaaa gatcagtgcc aagtccaatc ccttcttgga ggatcatgtc 9600
atacaaggca gaagggtgtt gccaatgacc cttgctattg ggagccttgc tgagacctgc 9660
cttggactct tccctggcta ctctctctgg gccatagatg acgcacagct cttcaaaggt 9720
gtcactgttg atggagacgt caactgtgaa gtgaccctca caccgtccac tgctccgagt 9780
gggagggtga atgtccaagc gacgctcaag acgttctcaa gtggaaaact tgttccagcc 9840
tacagagctg tcatagtgtt gtccaaccaa ggtgctccac ctgccaatgc aaccatgcag 9900
cctccgagcc ttgatgcaga tcctgctttg caagggtcag tctatgatgg caagactctc 9960
tttcatggtc ctgcgttcag aggcattgat gacgttctca gctgcaccaa gagccagctt 10020
gttgccaagt gttctgctgt tcctggatca gatgcagcca gaggagagtt tgcaactgac 10080
actgatgcac atgatccctt tgtcaatgat cttgcctttc aagcaatgtt ggtctgggtg 10140
aggagaacgc tgggacaagc tgcactcccg aactccattc agaggatagt ccaacacaga 10200
ccggtcccac aagacaaacc cttctacatc accctcagat ccaatcagag tggtggacat 10260
agccagcaca aacatgcact tcagttccac aacgaacaag gtgatctctt cattgatgtt 10320
caagcctctg tcattgcgac agactcactt gcgttctgag tagttagctt aatcacttag 10380
gtcaccagta tgaactaaaa tgcatgtagg tgtaagagct catggagagc atggaatatt 10440
gtatccgacc atgtaacagt ataataactg agctccatct cacttcttct atgaataaac 10500
aaaggatgtt atgatatatt aacactctat ctatgcacct tattgttcta tgataaattt 10560
cctcttatta ttataaatca tctgaatcgt gacggcttat ggaatgcttc aaatagtaca 10620
aaaacaaatg tgtactataa gactttctaa acaattctaa ctttagcatt gtgaacgaga 10680
cataagtgtt aagaagacat aacaattata atggaagaag tttgtctcca tttatatatt 10740
atatattacc cacttatgta ttatattagg atgttaagga gacataacaa ttataaagag 10800
agaagtttgt atccatttat atattatata ctacccattt atatattata cttatccact 10860
tatttaatgt ctttataagg tttgatccat gatatttcta atattttagt tgatatgtat 10920
atgaaaaggt actatttgaa ctctcttact ctgtataaag gttggatcat ccttaaagtg 10980
ggtctattta attttattgc ttcttacaga taaaaaaaaa attatgagtt ggtttgataa 11040
aatattgaag gatttaaaat aataataaat aataaataac atataatata tgtatataaa 11100
tttattataa tataacattt atctataaaa aagtaaatat tgtcataaat ctatacaatc 11160
gtttagcctt gctggaacga atctcaatta tttaaacgag agtaaacata tttgactttt 11220
tggttattta acaaattatt atttaacact atatgaaatt tttttttttt atcagcaaag 11280
aataaaatta aattaagaag gacaatggtg tcccaatcct tatacaacca acttccacaa 11340
gaaagtcaag tcagagacaa caaaaaaaca agcaaaggaa attttttaat ttgagttgtc 11400
ttgtttgctg cataatttat gcagtaaaac actacacata acccttttag cagtagagca 11460
atggttgacc gtgtgcttag cttcttttat tttatttttt tatcagcaaa gaataaataa 11520
aataaaatga gacacttcag ggatgtttca acccttatac aaaaccccaa aaacaagttt 11580
cctagcaccc taccaacgaa ttcgcggccg cttaattaag atgagtgata ctcaggactc 11640
aggactcact ctgctgatca ctagtgctag cctcgaggtc gacacaactt tgtatacaaa 11700
agttgtctag acctaggctc agcaactcat ccagtcaagt tcgagtcagt gagttgggcg 11760
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ctatttaaag gggttttcca cctaaaaatt ctggtatcat tctcacttta cttgttactt 11880
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ttattatttg ttaaacattt tcaaaccgca taaaatttta tgaagtcccg tctatcttta 12000
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aaattaatta gatataatta aaatattact tttttaattt taagtttaat tgttgaattt 12600
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tataagtaat gtagtagagt gttagagtgt taccctaaac cataaactat aagatttatg 12720
gtggactaat tttcatatat ttcttattgc ttttaccttt tcttggtatg taagtccgta 12780
actggaatta ctgtgggttg ccatgacact ctgtggtctt ttggttcatg catggatctt 12840
gcgcaagaaa aagacaaaga acaaagaaaa aagacaaaac agagagacaa aacgcaatca 12900
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ctctaatatc actcacttct ttcatcatcc atccatccag agtactacta ctctactact 13260
ataatacccc aacccaactc atattcaata ctactctagg atccacaacc aaaaatggct 13320
gcaaggaacg tgagtgcggc tcatgagatg catgacgaga agaggatagc tgttgtgggc 13380
atggctgttc agtatgctgg atgcaaaacg aaagacgagt tctgggaagt tctcatgaat 13440
ggaaaagttg agagcaaagt gatcagcgac aaacgtcttg gttcaaatta ccgtgctgaa 13500
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cttgatgaga acgaaataga caatgagcat gaactccttt tgaaccttgc caaacaagcc 13620
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ttcccgatgg acaacctcca aggtgaactc ttgaatgtgt accagaacca tgttgagaag 13740
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aaaccagagg ctggtgacag aagaatcttc atggaccctg cttcctttgt tgctgaggaa 13860
ctcaatcttg gcgctctcca ctactctgtt gatgctgcct gtgccactgc gctctatgtg 13920
ctcagactgg cgcaagatca cttggtctct ggtgcagctg atgtgatgct ttgtggtgca 13980
acatgcctgc cggagccgtt tttcatactc tctgggttct caaccttcca agccatgcct 14040
gttggaacgg gtcagaatgt gtccatgccg ctgcacaaag attctcaagg attgacccct 14100
ggtgaaggag gttccatcat ggtcctcaaa cgtttggatg acgcaatcag agatggagat 14160
cacatctatg gaacactttt gggagccaat gtcagcaaca gtggcactgg tctgccactt 14220
aaaccccttt tgccgtcaga gaaaaagtgc ctcatggaca cctacacacg tatcaatgtg 14280
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aaagggaact ttggacacac attggtggca gctgggtttg ctggcatgtg caaagtgctt 14460
ctctccatga agcacgggat cattccaccc actccgggaa tagatgacga aacgaagatg 14520
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catgacccaa gcaatgctgc atgcactggc catgactcca tttctgctct ctctgcacgt 14700
tgtggtggtg agtcaaacat gagaatagca atcactggga tggatgccac ttttggtgct 14760
ttgaaaggat tggatgcttt tgaaagggcc atctacactg gtgctcatgg tgctatacca 14820
ctcccagaaa agagatggag attcctgggg aaagacaagg acttccttga tctttgtgga 14880
gtcaaagcaa caccgcatgg ctgttacatt gaagatgttg aagttgattt ccagaggctg 14940
aggactccaa tgactcctga agatatgctc ttgcctcaac agcttctggc tgtcaccaca 15000
attgataggg ccatattgga ctctggcatg aagaaaggtg gaaatgtggc tgtctttgtg 15060
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ttatcacaaa ggaatcttat cccccactac ttatcctttt atatttttcc gtgtcatttt 1080
tgcccttgag ttttcctata taaggaacca agttcggcat ttgtgaaaac aagaaaaaat 1140
ttggtgtaag ctattttctt tgaagtactg aggatacaac ttcagagaaa tttgtaagtt 1200
tgtaggtacc agatctggat cccaaaccat gtctccggag aggagaccag ttgagattag 1260
gccagctaca gcagctgata tggccgcggt ttgtgatatc gttaaccatt acattgagac 1320
gtctacagtg aactttagga cagagccaca aacaccacaa gagtggattg atgatctaga 1380
gaggttgcaa gatagatacc cttggttggt tgctgaggtt gagggtgttg tggctggtat 1440
tgcttacgct gggccctgga aggctaggaa cgcttacgat tggacagttg agagtactgt 1500
ttacgtgtca cataggcatc aaaggttggg cctaggatct acattgtaca cacatttgct 1560
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tccatctgtt aggttgcatg aggctttggg atacacagcc cggggtacat tgcgcgcagc 1680
tggatacaag catggtggat ggcatgatgt tggtttttgg caaagggatt ttgagttgcc 1740
agctcctcca aggccagtta ggccagttac ccaaatctga gtagttagct taatcaccta 1800
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aatagttgcg gtgggcaagg ctctctttca gaaagacagg cggccaaagg aacccaaggt 1920
gaggtgggct atggctctca gttccttgtg gaagcgcttg gtctaaggtg cagaggtgtt 1980
agcgggatga agcaaaagtg tccgattgta acaagatatg ttgatcctac gtaaggatat 2040
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tgtctttatt gtcgccgtat gtaatcggcg tcacaaaata atccccggtg actttctttt 2160
aatccaggat gaaataatat gttattataa tttttgcgat ttggtccgtt ataggaattg 2220
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ataaaaattt atggtattca atttaaacac gtatacttgt aaagaatgat atcttgaaag 2340
aaatatagtt taaatattta ttgataaaat aacaagtcag gtattatagt ccaagcaaaa 2400
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ttaagcagat gttacgccct gctgcaggcc tttctattat ccaatagttg gttgatcttt 3000
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aatgtacttt cattttataa taacgctgcg gacatctaca tttttgaatt gaaaaaaaat 4140
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agggtgaatg aatcggacgt ttgaccggaa ggcatacagg caagaactga tcgacgcggg 6240
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ccacgtcaac aaggacgtga agatcaccta caccggcgtc gagctgcggg ccgacgatga 6780
cgaactggtg tggcagcagg tgttggagta cgcgaagcgc acccctatcg gcgagccgat 6840
caccttcacg ttctacgagc tttgccagga cctgggctgg tcgatcaatg gccggtatta 6900
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caagaaaacg tcccgttgcc aggtcctgat cgacgaggaa atcgtcgtgc tgtttgctgg 7080
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ggtttacttt atgttttaat aatgttctta cccttgctgc tctctaaact gtaatggcgt 28560
acggttagct aaactaaagt aaaaatcgat tcgcttgagt aaaattagtg accgggaaag 28620
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aattaggagt aaatctggct tcgaattttt aaattgtcaa cttccaaaga aggattggca 28740
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<210> 54
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<213> Artificial sequence
<220>
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atttaactcc ataatttttt tattcgactg atcttaaagc aacacccagt gacacaacta 600
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gcagctgcac cagctgtttc taatgagctg ctcgaaaagg cagaaactgt tgtgatggaa 5580
gtccttgctg ccaaaactgg ctacgaaact gacatgatag aatcagacat ggagcttgag 5640
acggagcttg gaattgattc catcaagcgt gtggaaatcc tcagtgaagt ccaagccatg 5700
ctcaatgtgg aagctaagga tgtggatgct ctctcaagga ccagaactgt cggtgaggtt 5760
gtcaatgcca tgaaggctga gatagctgga ggctccgctc ctgcgccggc cgctgccgct 5820
cctggtcccg ctgccgcggc tccagctcca gctgcagccg ctccggccgt ctcaaacgaa 5880
ctccttgaaa aagctgagac cgtcgtgatg gaggtcttgg cagctaaaac cggctatgag 5940
actgacatga ttgagtctga catggaattg gagacagaac ttgggataga cagcatcaaa 6000
cgtgttgaaa tcctcagtga ggtccaagct atgctgaacg tggaagcgaa ggatgttgat 6060
gctctgtcca gaacgaggac cgttggtgag gttgtggatg ccatgaaggc tgaaattgct 6120
ggagggtctg cgcccgcgcc agctgcagcc gctcctgcac ccgcagccgc ggcacctgct 6180
ccagctgcac ctgcacctgc cgtttcttca gaactcttgg agaaggctga gacggttgtg 6240
atggaggttt tggctgcaaa gactggctat gagaccgaca tgattgaatc tgatatggaa 6300
ttggagacag agcttgggat cgattccatc aaaagagtgg agatcctgag tgaagtccaa 6360
gccatgctca atgttgaagc taaggatgtt gatgcacttt caagaacaag gacagtgggt 6420
gaggttgtgg atgccatgaa ggcggagatt gctggaggga gcgcgcctgc gccagctgcc 6480
gcggcacctg caccggcagc cgcagctcca gctccagctg caccagcacc ggccgcgccc 6540
gcgccagctg tttcatccga actcctggaa aaggccgaga cggttgtgat ggaggtgctc 6600
gcagctaaga ctggttacga gaccgacatg attgaaagtg acatggagct tgaaaccgag 6660
ttgggaatag atagcatcaa acgtgttgaa atcttgtctg aggtccaagc tatgttgaac 6720
gtggaggcaa aagatgtcga tgcgctttca agaaccagaa cagtcggtga ggtcgtggac 6780
gccatgaagg ctgaaattgc cggaagctct gctagtgcgc cagctgcagc cgcacctgca 6840
cctgctgccg cggcacctgc tccagctgca gccgctcctg ccgtcagcaa tgagttgctg 6900
gagaaagccg aaacagttgt gatggaagtc cttgctgcaa aaactggtta cgaaacggac 6960
atgattgagt cagacatgga attggagacc gaacttggaa tagattccat caagagagtg 7020
gagatcctct ctgaggtgca agccatgctc aacgttgagg ctaaagatgt tgatgcactc 7080
agtaggacaa gaactgtggg ggaagttgtc gatgcgatga aggctgagat tgctggaggc 7140
tctgctcctg cgccggcagc tgccgcacct gcacccgcag ccgcggcacc agctgtcagc 7200
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tatgagactg acatgattga gtctgacatg gaacttgaga cggaattggg cattgacagc 7320
atcaagcgtg ttgagatcct cagtgaagtc caagcaatgc tcaatgtgga ggctaaggat 7380
gtggatgccc tctcaaggac cagaacagtt ggtgaggtcg ttgatgcgat gaaggcggag 7440
atcgctggaa gttccgcgcc tgcgccagct gcagccgctc ctgcacccgc agccgcggca 7500
ccggctccag ctgcagccgc accggccgtc tcctcagaac tcctggaaaa ggctgagaca 7560
gttgtgatgg aagtccttgc tgcgaaaact ggctatgaga ccgacatgat tgaatctgac 7620
atggaactgg agaccgagct tggaattgac tccatcaaac gtgttgaaat cctctctgag 7680
gttcaagcga tgttgaatgt ggaggccaaa gatgttgatg ctctttccag aacaaggacg 7740
gtgggagagg tggttgatgc catgaaggct gagatagctg ggggttctgc tcctgcgcca 7800
gctgcagccg ctcctgctcc cgctgccgcg gcaccagctg tcagcaacga actccttgaa 7860
aaagctgaaa ctgttgtgat ggaggttttg gctgcaaaga ctggatacga gactgacatg 7920
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atcctttctg aggttcaagc catgctgaac gttgaggcca aagatgtcga tgctttgtca 8040
aggaccagaa cggttggaga agtggtcgat gccatgaagg ctgagatagc tggtggatca 8100
gcccctgctc cggctgcagc cgctcctgca agtgccggtg ctgcaccagc tgtgaagatt 8160
gattcagttc atggtgctga ctgtgacgat ttgtcactga tgcacgcaaa ggtggttgac 8220
atcagaaggc cagatgaact gattctggaa agaccggaga accgtccagt tcttgtcgtt 8280
gacgatggct cagagttgac acttgctctt gtgagggtgt tgggagcctg tgcagttgtc 8340
ttgacctttg agggattgca gttggctcag agagctggtg cagctgccat tcgtcatgtt 8400
ctggctaagg acctttcagc agaatcagct gagaaggcca tcaaagaggc tgagcaaaga 8460
tttggagcgt tgggaggctt cataagccag caagcagaaa ggtttgaacc agctgagata 8520
ctgggtttca cactcatgtg tgcgaagttt gccaaagcct ctctctgcac tgctgtggct 8580
ggaggtcgtc ctgccttcat cggtgtggct aggcttgacg gcagacttgg attcacctct 8640
caaggcactt ctgacgcact caagagagca cagcgtggag cgatctttgg actctgcaag 8700
acaatagggt tggagtggtc agaatctgat gtgttcagcc gtggtgtgga cattgctcaa 8760
gggatgcacc cagaagatgc tgcagttgcc atagttaggg agatggcgtg tgctgacatc 8820
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ttggagactg ggaaccctca gagacagata gcgaaagacg atgtgcttct ggtttctgga 8940
ggtgctcgtg ggatcacacc tctttgcatc cgtgagatca cgcgtcagat tgctggaggc 9000
aagtacattc tgttgggtcg tagcaaagtt tctgcgtctg aaccagcatg gtgtgctggc 9060
atcactgatg agaaggctgt gcagaaagct gccacccaag agttgaagag ggccttcagt 9120
gctggtgaag gacccaaacc cactccaagg gctgtcacga aacttgtggg atctgttctt 9180
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tcccagcttg gtgccagagt tagtggaatc gttcacgctt ctggtgtgct ccgtgatcgt 9360
ctcatagaga agaaactccc tgacgagttt gatgctgtct ttgggaccaa agtcactggg 9420
ttggagaatc ttctggctgc agttgatcgt gccaacctca aacacatggt tctcttcagc 9480
tcccttgctg gtttccacgg caatgttggt cagtctgact atgcgatggc aaacgaagct 9540
ctcaacaaga tgggtttgga acttgcgaag gatgtcagtg tcaagtccat ctgctttggt 9600
ccctgggatg gtgggatggt gacacctcaa ctcaagaaac agtttcaaga aatgggagtt 9660
cagatcattc ctcgtgaagg aggtgctgat acagttgcga ggattgtgtt gggatcaagt 9720
cctgctgaga tccttgttgg aaactggagg acaccatcca agaaagttgg aagtgacacg 9780
atcaccctgc atagaaagat cagtgccaag tccaatccct tcttggagga tcatgtcata 9840
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ggactcttcc ctggctactc tctctgggcc atagatgacg cacagctctt caaaggtgtc 9960
actgttgatg gagacgtcaa ctgtgaagtg accctcacac cgtccactgc tccgagtggg 10020
agggtgaatg tccaagcgac gctcaagacg ttctcaagtg gaaaacttgt tccagcctac 10080
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catggtcctg cgttcagagg cattgatgac gttctcagct gcaccaagag ccagcttgtt 10260
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agaacgctgg gacaagctgc actcccgaac tccattcaga ggatagtcca acacagaccg 10440
gtcccacaag acaaaccctt ctacatcacc ctcagatcca atcagagtgg tggacatagc 10500
cagcacaaac atgcacttca gttccacaac gaacaaggtg atctcttcat tgatgttcaa 10560
gcctctgtca ttgcgacaga ctcacttgcg ttctgagtag ttagcttaat cacttaggtc 10620
accagtatga actaaaatgc atgtaggtgt aagagctcat ggagagcatg gaatattgta 10680
tccgaccatg taacagtata ataactgagc tccatctcac ttcttctatg aataaacaaa 10740
ggatgttatg atatattaac actctatcta tgcaccttat tgttctatga taaatttcct 10800
cttattatta taaatcatct gaatcgtgac ggcttatgga atgcttcaaa tagtacaaaa 10860
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aagtgttaag aagacataac aattataatg gaagaagttt gtctccattt atatattata 10980
tattacccac ttatgtatta tattaggatg ttaaggagac ataacaatta taaagagaga 11040
agtttgtatc catttatata ttatatacta cccatttata tattatactt atccacttat 11100
ttaatgtctt tataaggttt gatccatgat atttctaata ttttagttga tatgtatatg 11160
aaaaggtact atttgaactc tcttactctg tataaaggtt ggatcatcct taaagtgggt 11220
ctatttaatt ttattgcttc ttacagataa aaaaaaaatt atgagttggt ttgataaaat 11280
attgaaggat ttaaaataat aataaataat aaataacata taatatatgt atataaattt 11340
attataatat aacatttatc tataaaaaag taaatattgt cataaatcta tacaatcgtt 11400
tagccttgct ggaacgaatc tcaattattt aaacgagagt aaacatattt gactttttgg 11460
ttatttaaca aattattatt taacactata tgaaattttt tttttttatc agcaaagaat 11520
aaaattaaat taagaaggac aatggtgtcc caatccttat acaaccaact tccacaagaa 11580
agtcaagtca gagacaacaa aaaaacaagc aaaggaaatt ttttaatttg agttgtcttg 11640
tttgctgcat aatttatgca gtaaaacact acacataacc cttttagcag tagagcaatg 11700
gttgaccgtg tgcttagctt cttttatttt atttttttat cagcaaagaa taaataaaat 11760
aaaatgagac acttcaggga tgtttcaacc cttatacaaa accccaaaaa caagtttcct 11820
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actcactctg ctgatcacta gtgctagcct cgaggtcgac acaactttgt atacaaaagt 11940
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gcctcccagt atcattatag tgaaagtttt ggctctctcg ccggtggttt tttacctcta 12060
tttaaagggg ttttccacct aaaaattctg gtatcattct cactttactt gttactttaa 12120
tttctcataa tctttggttg aaattatcac gcttccgcac acgatatccc tacaaattta 12180
ttatttgtta aacattttca aaccgcataa aattttatga agtcccgtct atctttaatg 12240
tagtctaaca ttttcatatt gaaatatata atttacttaa ttttagcgtt ggtagaaagc 12300
ataatgattt attcttattc ttcttcatat aaatgtttaa tatacaatat aaacaaattc 12360
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ttttttattc gactgatctt aaagcaacac ccagtgacac aactagccat ttttttcttt 12540
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ttaattagat ataattaaaa tattactttt ttaattttaa gtttaattgt tgaatttgtg 12840
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aagtaatgta gtagagtgtt agagtgttac cctaaaccat aaactataag atttatggtg 12960
gactaatttt catatatttc ttattgcttt taccttttct tggtatgtaa gtccgtaact 13020
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catgcaaagc aacacgtgct taacatgcac tttaaatggc tcacccatct caacccacac 13260
acaaacacat tgcctttttc ttcatcatca ccacaaccac ctgtatatat tcattctctt 13320
ccgccacctc aatttcttca cttcaacaca cgtcaacctg catatgcgtg tcatcccatg 13380
cccaaatctc catgcatgtt ccaaccacct tctctcttat ataataccta taaatacctc 13440
taatatcact cacttctttc atcatccatc catccagagt actactactc tactactata 13500
ataccccaac ccaactcata ttcaatacta ctctaggatc cacaaccaaa aatggcttcc 13560
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aagaagaagt ttgagactct ctcttacctt cctgacctta ccgattccga agctgcaagg 13800
aacgtgagtg cggctcatga gatgcatgac gagaagagga tagctgttgt gggcatggct 13860
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gagaacgaaa tagacaatga gcatgaactc cttttgaacc ttgccaaaca agccttggct 14100
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gaggctggtg acagaagaat cttcatggac cctgcttcct ttgttgctga ggaactcaat 14340
cttggcgctc tccactactc tgttgatgct gcctgtgcca ctgcgctcta tgtgctcaga 14400
ctggcgcaag atcacttggt ctctggtgca gctgatgtga tgctttgtgg tgcaacatgc 14460
ctgccggagc cgtttttcat actctctggg ttctcaacct tccaagccat gcctgttgga 14520
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cttttgccgt cagagaaaaa gtgcctcatg gacacctaca cacgtatcaa tgtgcatccc 14760
cacaagattc agtatgttga atgccatgca actgggactc cacaaggtga tcgtgtggaa 14820
attgatgctg tgaaggcttg ctttgaaggc aaagtcccac gttttggaac cacaaaaggg 14880
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ctggttgtct ctggtgaggc cattccctgg ccagaaacga atggagaacc gaagcgtgct 15060
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ggtgagtcaa acatgagaat agcaatcact gggatggatg ccacttttgg tgctttgaaa 15240
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cctgaagcca gcaagaaact caatgacatg atgcagtaca tcaatgattg tgggacaagc 15660
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tgggtcatgc caagggccag cttcaagagt gagcttgagt cacaacagca agagtttgac 17100
agaaacatga ttgaaatgtt ccgtcttgga atcctcacct caattgcctt cacaaacctg 17160
gcgagagatg ttctcaacat cacgcccaaa gcagcctttg gactcagttt gggagagatt 17220
tccatgatct ttgctttctc caagaaaaac ggtttgataa gcgatcagtt gacaaaggat 17280
ttgagagagt cagatgtctg gaacaaagct ctggctgttg agttcaatgc gctcagagaa 17340
gcctggggca ttccacagtc tgtcccaaaa gatgagttct ggcaaggtta catagtgagg 17400
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gagaaaccca agaaaaacaa gtttgtgaga aagattcagt tgaatggcag attcaacagc 18120
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agctccagct cttccagcag ttcctcttcc agcagttcat ctccgtctcc tgctccttca 18360
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tgatccacat gggactttta aacatcatcc gtcggatggc gttgcgagag aagcagtcga 4440
tccgtgagat cagccgacgc accgggcagg cgcgcaacac gatcgcaaag tatttgaacg 4500
caggtacaat cgagccgacg ttcacgcgga acgaccaagc aagcttggct gccatttttg 4560
gggtgaggcc gttcgcggcc gaggggcgca gcccctgggg ggatgggagg cccgcgttag 4620
cgggccggga gggttcgaga agggggggca ccccccttcg gcgtgcgcgg tcacgcgcac 4680
agggcgcagc cctggttaaa aacaaggttt ataaatattg gtttaaaagc aggttaaaag 4740
acaggttagc ggtggccgaa aaacgggcgg aaacccttgc aaatgctgga ttttctgcct 4800
gtggacagcc cctcaaatgt caataggtgc gcccctcatc tgtcagcact ctgcccctca 4860
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agggcactta tccccaggct tgtccacatc atctgtggga aactcgcgta aaatcaggcg 4980
ttttcgccga tttgcgaggc tggccagctc cacgtcgccg gccgaaatcg agcctgcccc 5040
tcatctgtca acgccgcgcc gggtgagtcg gcccctcaag tgtcaacgtc cgcccctcat 5100
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ccgggcagga taggtgaagt aggcccaccc gcgagcgggt gttccttctt cactgtccct 5460
tattcgcacc tggcggtgct caacgggaat cctgctctgc gaggctggcc ggctaccgcc 5520
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gggggtgcgc gtgattgcca agcacgtccc catgcgctcc atcaagaaga gcgacttcgc 6000
ggagctggta ttcgtgcagg gcaagattcg gaataccaag tacgagaagg acggccagac 6060
ggtctacggg accgacttca ttgccgataa ggtggattat ctggacacca aggcaccagg 6120
cgggtcaaat caggaataag ggcacattgc cccggcgtga gtcggggcaa tcccgcaagg 6180
agggtgaatg aatcggacgt ttgaccggaa ggcatacagg caagaactga tcgacgcggg 6240
gttttccgcc gaggatgccg aaaccatcgc aagccgcacc gtcatgcgtg cgccccgcga 6300
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cgtgcaactg gctccccctg ccctgcccgc gccatcggcc gccgtggagc gttcgcgtcg 6420
tctcgaacag gaggcggcag gtttggcgaa gtcgatgacc atcgacacgc gaggaactat 6480
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ccacgtcaac aaggacgtga agatcaccta caccggcgtc gagctgcggg ccgacgatga 6780
cgaactggtg tggcagcagg tgttggagta cgcgaagcgc acccctatcg gcgagccgat 6840
caccttcacg ttctacgagc tttgccagga cctgggctgg tcgatcaatg gccggtatta 6900
cacgaaggcc gaggaatgcc tgtcgcgcct acaggcgacg gcgatgggct tcacgtccga 6960
ccgcgttggg cacctggaat cggtgtcgct gctgcaccgc ttccgcgtcc tggaccgtgg 7020
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cgaccactac acgaaattca tatgggagaa gtaccgcaag ctgtcgccga cggcccgacg 7140
gatgttcgac tatttcagct cgcaccggga gccgtacccg ctcaagctgg aaaccttccg 7200
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cgattgtcgg ccctgaagaa agctccagag atgttcgggt ccgtttacga gcacgaggag 7620
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ccaacgggaa tctggtggat gcgcatcttc atcctcggcg cacttaatat ttcgctattc 7920
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gctgtgcagc cgctgatggt cgtgttcatc tctgccgctc tgctaggtag cccgatacga 8040
ttgatggcgg tcctgggggc tatttgcgga actgcgggcg tggcgctgtt ggtgttgaca 8100
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ccaatcccga tgcctacagg aaccaatgtt ctcggcctgg cgtggctcgg cctgatcgga 8340
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tgaaccagct gagatactgg gtttcacact catgtgtgcg aagtttgcca aagcctctct 18120
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gcacacggct tcgacggcgt ttctggcgcg tttgcagggc catagacggc cgccagccca 5220
gcggcgaggg caaccagccc ggtgagcgtc ggaaagggtc gacggatctt ttccgctgca 5280
taaccctgct tcggggtcat tatagcgatt ttttcggtat atccatcctt tttcgcacga 5340
tatacaggat tttgccaaag ggttcgtgta gactttcctt ggtgtatcca acggcgtcag 5400
ccgggcagga taggtgaagt aggcccaccc gcgagcgggt gttccttctt cactgtccct 5460
tattcgcacc tggcggtgct caacgggaat cctgctctgc gaggctggcc ggctaccgcc 5520
ggcgtaacag atgagggcaa gcggatggct gatgaaacca agccaaccag gaagggcagc 5580
ccacctatca aggtgtactg ccttccagac gaacgaagag cgattgagga aaaggcggcg 5640
gcggccggca tgagcctgtc ggcctacctg ctggccgtcg gccagggcta caaaatcacg 5700
ggcgtcgtgg actatgagca cgtccgcgag ctggcccgca tcaatggcga cctgggccgc 5760
ctgggcggcc tgctgaaact ctggctcacc gacgacccgc gcacggcgcg gttcggtgat 5820
gccacgatcc tcgccctgct ggcgaagatc gaagagaagc aggacgagct tggcaaggtc 5880
atgatgggcg tggtccgccc gagggcagag ccatgacttt tttagccgct aaaacggccg 5940
gggggtgcgc gtgattgcca agcacgtccc catgcgctcc atcaagaaga gcgacttcgc 6000
ggagctggta ttcgtgcagg gcaagattcg gaataccaag tacgagaagg acggccagac 6060
ggtctacggg accgacttca ttgccgataa ggtggattat ctggacacca aggcaccagg 6120
cgggtcaaat caggaataag ggcacattgc cccggcgtga gtcggggcaa tcccgcaagg 6180
agggtgaatg aatcggacgt ttgaccggaa ggcatacagg caagaactga tcgacgcggg 6240
gttttccgcc gaggatgccg aaaccatcgc aagccgcacc gtcatgcgtg cgccccgcga 6300
aaccttccag tccgtcggct cgatggtcca gcaagctacg gccaagatcg agcgcgacag 6360
cgtgcaactg gctccccctg ccctgcccgc gccatcggcc gccgtggagc gttcgcgtcg 6420
tctcgaacag gaggcggcag gtttggcgaa gtcgatgacc atcgacacgc gaggaactat 6480
gacgaccaag aagcgaaaaa ccgccggcga ggacctggca aaacaggtca gcgaggccaa 6540
gcaggccgcg ttgctgaaac acacgaagca gcagatcaag gaaatgcagc tttccttgtt 6600
cgatattgcg ccgtggccgg acacgatgcg agcgatgcca aacgacacgg cccgctctgc 6660
cctgttcacc acgcgcaaca agaaaatccc gcgcgaggcg ctgcaaaaca aggtcatttt 6720
ccacgtcaac aaggacgtga agatcaccta caccggcgtc gagctgcggg ccgacgatga 6780
cgaactggtg tggcagcagg tgttggagta cgcgaagcgc acccctatcg gcgagccgat 6840
caccttcacg ttctacgagc tttgccagga cctgggctgg tcgatcaatg gccggtatta 6900
cacgaaggcc gaggaatgcc tgtcgcgcct acaggcgacg gcgatgggct tcacgtccga 6960
ccgcgttggg cacctggaat cggtgtcgct gctgcaccgc ttccgcgtcc tggaccgtgg 7020
caagaaaacg tcccgttgcc aggtcctgat cgacgaggaa atcgtcgtgc tgtttgctgg 7080
cgaccactac acgaaattca tatgggagaa gtaccgcaag ctgtcgccga cggcccgacg 7140
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gtgattaagg ctcagattcg acggcttgga gcggccgacg tgcaggattt ccgcgagatc 7560
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cacaaggcgc atctgtccgg cgttttcgtg gagcccgaac agcgaggccg aggggtcgcc 7800
ggtatgctgc tgcgggcgtt gccggcgggt ttattgctcg tgatgatcgt ccgacagatt 7860
ccaacgggaa tctggtggat gcgcatcttc atcctcggcg cacttaatat ttcgctattc 7920
tggagcttgt tgtttatttc ggtctaccgc ctgccgggcg gggtcgcggc gacggtaggc 7980
gctgtgcagc cgctgatggt cgtgttcatc tctgccgctc tgctaggtag cccgatacga 8040
ttgatggcgg tcctgggggc tatttgcgga actgcgggcg tggcgctgtt ggtgttgaca 8100
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ccaatcccga tgcctacagg aaccaatgtt ctcggcctgg cgtggctcgg cctgatcgga 8340
gcgggtttaa cctacttcct ttggttccgg gggatctcgc gactcgaacc tacagttgtt 8400
tccttactgg gctttctcag cccccgagcg cttagtggga atttgtaccc cttatcgaac 8460
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taattcagga gttaaacatc atgagggaag cggtgatcgc cgaagtatcg actcaactat 8580
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tgaccgtaag gcttgatgaa acaacgcggc gagctttgat caacgacctt ttggaaactt 8760
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acgacatcat tccgtggcgt tatccagcta agcgcgaact gcaatttgga gaatggcagc 8880
gcaatgacat tcttgcaggt atcttcgagc cagccacgat cgacattgat ctggctatct 8940
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tcaaattaca acggtatata tcctgccagt cagcatcatc acaccaaaag ttaggcccga 9660
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acaatattac tcaccggatc ctaaccggtt taattaaggc gcgccatgcc cgggcaagcg 9780
gccgcacaag tttgtacaaa aaagcaggct tctaggatct gcttttacat gcgagacaca 9840
tcttctaaag taattttaat aatagttact atattcaaga tttcatatat caaatactca 9900
atattacttc taaaaaatta attagatata attaaaatat tactttttta attttaagtt 9960
taattgttga atttgtgact attgatttat tattctacta tgtttaaatt gttttataga 10020
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atacctataa atacctctaa tatcactcac ttctttcatc atccatccat ccagagtact 10620
actactctac tactataata ccccaaccca actcatattc aatactactc taggatccac 10680
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acatcaacac gatgaacaga ccctggttcc ctccacctgg tgttccgaga cgtgctggaa 12060
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ttgtgatgga ggttttggct gcaaagactg gctatgagac cgacatgatt gaatctgata 15120
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ctcaagggat gcacccagaa gatgctgcag ttgccatagt tagggagatg gcgtgtgctg 17640
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ctggaggtgc tcgtgggatc acacctcttt gcatccgtga gatcacgcgt cagattgctg 17820
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aagaagggaa caatgttccc atcaagagct aacaaattgt acgaactctt ttgcaagtac 32580
gactctttcg attcaatgcc tcctgctgaa cttgaaagga tcgagaagag gatcttcaag 32640
agggcacttc aagaggtctg ggaagagacc aaggactttt acatcaatgg tttgaagaat 32700
ccagagaaga tacagagagc ggaacatgac cccaaactca agatgtcttt gtgtttcaga 32760
tggtatcttg gtcttgcatc acgttgggcc aacatgggtg ctcctgatcg tgtcatggac 32820
tatcaagtct ggtgtggtcc agccattgga gccttcaatg acttcatcaa aggaacatat 32880
cttgatcctg ctgtctctaa tgagtaccca tgtgttgtcc agatcaacct tcagattttg 32940
cgtggtgcat gttacctgag gcgtcttaat gctctgagaa atgatccgag gattgatctt 33000
gagactgaag atgctgcctt tgtctatgag ccaacgaatg cgctttgagt agttagctta 33060
atcacttagg tcacctcgag tatcaaaatc tatttagaaa tacacaatat tttgttgcag 33120
gcttgctgga gaatcgatct gctatcataa aaattacaaa aaaattttat ttgcctcaat 33180
tattttagga ttggtattaa ggacgcttaa attatttgtc gggtcactac gcatcattgt 33240
gattgagaag atcagcgata cgaaatattc gtagtactat cgataattta tttgaaaatt 33300
cataagaaaa gcaaacgtta catgaattga tgaaacaata caaagacaga taaagccacg 33360
cacatttagg atattggccg agattactga atattgagta agatcacgga atttctgaca 33420
ggagcatgtc ttcaattcag cccaaatggc agttgaaata ctcaaaccgc cccatatgca 33480
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gcgccgaatt cgcggccgct taattaatca cgagtggatg actgtcacga ctgactcatg 33600
actgactact agtgctagcc tcgaggtcga cacaactttg tataataaag ttgtctagac 33660
ctaggatctg cttttacatg cgagacacat cttctaaagt aattttaata atagttacta 33720
tattcaagat ttcatatatc aaatactcaa tattacttct aaaaaattaa ttagatataa 33780
ttaaaatatt acttttttaa ttttaagttt aattgttgaa tttgtgacta ttgatttatt 33840
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tatttcttat tgcttttacc ttttcttggt atgtaagtcc gtaactggaa ttactgtggg 34020
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tgctttgccg ctcaaagatt ggaagtcctg gtcttggaaa cagtacaaag ctgatgttca 34860
cagaattgcg agggctctga tggatttggg agttgagcag cacgatgcgg tctccatctt 34920
tggcttcaac tcaccagaat ggttcctcag tgctgtcggt gcagttcatg ctggtgccaa 34980
gatcgctgga atctaccctt cagacactcc tgctcaagtg cagtacaaag ccttccactc 35040
tgacactgct gttgcagttg tggagaacga acagtgcttc aagaaattcg cagaggtggt 35100
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tgccctgatc tacaccagtg gcacaactgg gagacccaaa gctgtcatga tctcccatga 35340
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cagaccgtat gatttgagaa ctggaaccct tgggcaaaga ctcaatgcag tggagccaac 35580
catattcctt ggtgtgccac gtgtgtggga aaagatccaa gagaaattga tggctgttgg 35640
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tgtggatgga tcattcaaag gtgactttag catgattggg gatgacgatc cggatcttca 36840
gaatgtggat gtccttgaag caattgatga ggacaactga gtagttagct taatcactta 36900
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tagtagagtg ttagagtgtt accctaaacc ataaactata agatttatgg tggactaatt 37740
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catcctcaga tccatcttgg gtggatactt gggagtggaa ccgggtcaag tcaagtttga 38580
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cattgatctt gaatatctgc gtccaacatc tgacttggag tctcttgcaa agaggttctt 38760
tctcccaaga gaatatgaac tcttgaggtc actccctgat gagcagaaac agaagatttt 38820
ctttcgttac tggacttgca aagaggctta tctcaaagca acgggagatg gaatagccaa 38880
acttgaagag atcgagatag cactcacccc aacagaacct gccaagctcc aaacagctcc 38940
tgcgtggtct ctgttggagc ttgtgccaga tgacaattgt gttgcagctg tggctgttgc 39000
gggttttggt tggcagccca agttctggca ttactgagta gttagcttaa tcacttaggt 39060
cacctcgagt atcaaaatct atttagaaat acacaatatt ttgttgcagg cttgctggag 39120
aatcgatctg ctatcataaa aattacaaaa aaattttatt tgcctcaatt attttaggat 39180
tggtattaag gacgcttaaa ttatttgtcg ggtcactacg catcattgtg attgagaaga 39240
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caaacgttac atgaattgat gaaacaatac aaagacagat aaagccacgc acatttagga 39360
tattggccga gattactgaa tattgagtaa gatcacggaa tttctgacag gagcatgtct 39420
tcaattcagc ccaaatggca gttgaaatac tcaaaccgcc ccatatgcag gagcggatca 39480
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gcggccgctt aattaactac tgtcactgag gccgtagacg agtacggact gatctaacta 39600
gtgctagcct cgaggtcgac acccagcttt 39630
<210> 57
<211> 36936
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> plasmid pDAB7733
<400> 57
gatctgcttt tacatgcgag acacatcttc taaagtaatt ttaataatag ttactatatt 60
caagatttca tatatcaaat actcaatatt acttctaaaa aattaattag atataattaa 120
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ttagagtgtt accctaaacc ataaactata agatttatgg tggactaatt ttcatatatt 300
tcttattgct tttacctttt cttggtatgt aagtccgtaa ctggaattac tgtgggttgc 360
catgacactc tgtggtcttt tggttcatgc atggatcttg cgcaagaaaa agacaaagaa 420
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cttaacatgc actttaaatg gctcacccat ctcaacccac acacaaacac attgcctttt 600
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tcatcatcca tccatccaga gtactactac tctactacta taatacccca acccaactca 840
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ggaggtgaga tggacacgag gattgcgatc ataggcatga gcgccatact tccttgtgga 960
accacggtga gagagtcatg ggagaccata agggctggca ttgattgcct gtctgatctt 1020
cctgaggatc gtgttgatgt gactgcgtac tttgacccag tcaagaccac aaaggacaaa 1080
atctactgca agagaggagg tttcattcct gagtatgact ttgatgcgcg tgagtttggt 1140
ctcaacatgt tccagatgga agattctgat gcgaatcaga ccatctcact tctcaaggtc 1200
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tatgtggttg tggagaaagt cttgagaaag atggggatgc cagaggaaga tgtcaaagtg 1380
gctgtggaga agtacaaagc gaacttccca gaatggagac ttgactcttt ccctggattc 1440
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gttgtggatg ctgcatgtgc aagctccttg atagcagtca aggttgcgat tgatgaactg 1560
ctctatggtg actgcgacat gatggtcact ggtgcaacct gcacagacaa ctccattggg 1620
atgtacatgg ctttctcaaa gacacctgtg ttcagcacgg acccaagtgt gagagcgtat 1680
gatgagaaaa cgaaagggat gctcattggt gagggatcag ccatgttggt gctcaaacgt 1740
tatgcagatg cagtgaggga tggtgatgag attcatgctg tgattcgtgg ttgtgcaagc 1800
tcaagtgatg gcaaagcagc tggcatctac actcccacaa tcagtggtca agaggaagcc 1860
ttgagacgtg catacaatcg tgcctgcgtt gaccctgcca ctgtcacttt ggttgagggt 1920
catgggactg gcactccagt tggagatagg attgagttga ctgcgttgag gaacttgttt 1980
gacaaagcgt atggtgaagg gaacacagag aaagttgcag ttggaagtat caagtccagt 2040
attggtcatt tgaaggctgt tgctggtctt gctggaatga tcaaggtcat catggctctc 2100
aaacacaaga ctttgcctgg aacgatcaat gtggacaatc cacccaatct ctatgacaac 2160
actcccatca atgagtcatc cctctacatc aacacgatga acagaccctg gttccctcca 2220
cctggtgttc cgagacgtgc tggaatatcc agctttggct ttggaggtgc caactaccat 2280
gcagtgttgg aagaggctga accagagcac acgacagcgt acagactcaa caaacgtcca 2340
caaccggtgt tgatgatggc tgcaactcct gctgcgttgc agagcctttg tgaagctcag 2400
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gagattttca aggaagctgg attcactcca gactttgcag ctggacacag cttgggtgag 3000
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acggatgcca gagagatgct cactcaacac atgacctcat ctgtgaagtt cctgacccaa 3480
gtgaggaaca tgcaccaagc tggtgcgaga atctttgttg agtttggacc gaaacaagtt 3540
ctcagcaaac ttgtttctga aaccctcaaa gatgacccgt ctgttgtcac agtgtctgtg 3600
aacccagctt ctggcacgga ctctgacata cagttgaggg atgctgcagt tcagctggtt 3660
gtggctggtg tcaatcttca agggtttgac aagtgggatg ctcctgatgc cacgaggatg 3720
caagccatca agaaaaagag aaccacactc agactttcag ctgccaccta tgtcagtgac 3780
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ctctcaagga ccagaactgt cggtgaggtt gtcaatgcca tgaaggctga gatagctgga 4800
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gctgcagccg ctccggccgt ctcaaacgaa ctccttgaaa aagctgagac cgtcgtgatg 4920
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tccatcaaac gtgttgaaat cctctctgag gttcaagcga tgttgaatgt ggaggccaaa 6720
gatgttgatg ctctttccag aacaaggacg gtgggagagg tggttgatgc catgaaggct 6780
gagatagctg ggggttctgc tcctgcgcca gctgcagccg ctcctgctcc cgctgccgcg 6840
gcaccagctg tcagcaacga actccttgaa aaagctgaaa ctgttgtgat ggaggttttg 6900
gctgcaaaga ctggatacga gactgacatg atagagtcag acatggagtt ggaaacagag 6960
cttgggattg atagcatcaa gcgtgtggaa atcctttctg aggttcaagc catgctgaac 7020
gttgaggcca aagatgtcga tgctttgtca aggaccagaa cggttggaga agtggtcgat 7080
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agtgccggtg ctgcaccagc tgtgaagatt gattcagttc atggtgctga ctgtgacgat 7200
ttgtcactga tgcacgcaaa ggtggttgac atcagaaggc cagatgaact gattctggaa 7260
agaccggaga accgtccagt tcttgtcgtt gacgatggct cagagttgac acttgctctt 7320
gtgagggtgt tgggagcctg tgcagttgtc ttgacctttg agggattgca gttggctcag 7380
agagctggtg cagctgccat tcgtcatgtt ctggctaagg acctttcagc agaatcagct 7440
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caagcagaaa ggtttgaacc agctgagata ctgggtttca cactcatgtg tgcgaagttt 7560
gccaaagcct ctctctgcac tgctgtggct ggaggtcgtc ctgccttcat cggtgtggct 7620
aggcttgacg gcagacttgg attcacctct caaggcactt ctgacgcact caagagagca 7680
cagcgtggag cgatctttgg actctgcaag acaatagggt tggagtggtc agaatctgat 7740
gtgttcagcc gtggtgtgga cattgctcaa gggatgcacc cagaagatgc tgcagttgcc 7800
atagttaggg agatggcgtg tgctgacatc agaatcagag aggttgggat tggagcaaac 7860
cagcaaagat gcacaatcag agctgccaag ttggagactg ggaaccctca gagacagata 7920
gcgaaagacg atgtgcttct ggtttctgga ggtgctcgtg ggatcacacc tctttgcatc 7980
cgtgagatca cgcgtcagat tgctggaggc aagtacattc tgttgggtcg tagcaaagtt 8040
tctgcgtctg aaccagcatg gtgtgctggc atcactgatg agaaggctgt gcagaaagct 8100
gccacccaag agttgaagag ggccttcagt gctggtgaag gacccaaacc cactccaagg 8160
gctgtcacga aacttgtggg atctgttctt ggtgctcgtg aagtgagaag ctccattgct 8220
gccattgaag ctctgggtgg caaagcgatc tacagctctt gtgatgtgaa ctctgctgca 8280
gatgttgcca aagcagttag ggatgcagag tcccagcttg gtgccagagt tagtggaatc 8340
gttcacgctt ctggtgtgct ccgtgatcgt ctcatagaga agaaactccc tgacgagttt 8400
gatgctgtct ttgggaccaa agtcactggg ttggagaatc ttctggctgc agttgatcgt 8460
gccaacctca aacacatggt tctcttcagc tcccttgctg gtttccacgg caatgttggt 8520
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gatgtcagtg tcaagtccat ctgctttggt ccctgggatg gtgggatggt gacacctcaa 8640
ctcaagaaac agtttcaaga aatgggagtt cagatcattc ctcgtgaagg aggtgctgat 8700
acagttgcga ggattgtgtt gggatcaagt cctgctgaga tccttgttgg aaactggagg 8760
acaccatcca agaaagttgg aagtgacacg atcaccctgc atagaaagat cagtgccaag 8820
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gctattggga gccttgctga gacctgcctt ggactcttcc ctggctactc tctctgggcc 8940
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ttctcaagtg gaaaacttgt tccagcctac agagctgtca tagtgttgtc caaccaaggt 9120
gctccacctg ccaatgcaac catgcagcct ccgagccttg atgcagatcc tgctttgcaa 9180
gggtcagtct atgatggcaa gactctcttt catggtcctg cgttcagagg cattgatgac 9240
gttctcagct gcaccaagag ccagcttgtt gccaagtgtt ctgctgttcc tggatcagat 9300
gcagccagag gagagtttgc aactgacact gatgcacatg atccctttgt caatgatctt 9360
gcctttcaag caatgttggt ctgggtgagg agaacgctgg gacaagctgc actcccgaac 9420
tccattcaga ggatagtcca acacagaccg gtcccacaag acaaaccctt ctacatcacc 9480
ctcagatcca atcagagtgg tggacatagc cagcacaaac atgcacttca gttccacaac 9540
gaacaaggtg atctcttcat tgatgttcaa gcctctgtca ttgcgacaga ctcacttgcg 9600
ttctgagtag ttagcttaat cacttaggtc acctcgagta tcaaaatcta tttagaaata 9660
cacaatattt tgttgcaggc ttgctggaga atcgatctgc tatcataaaa attacaaaaa 9720
aattttattt gcctcaatta ttttaggatt ggtattaagg acgcttaaat tatttgtcgg 9780
gtcactacgc atcattgtga ttgagaagat cagcgatacg aaatattcgt agtactatcg 9840
ataatttatt tgaaaattca taagaaaagc aaacgttaca tgaattgatg aaacaataca 9900
aagacagata aagccacgca catttaggat attggccgag attactgaat attgagtaag 9960
atcacggaat ttctgacagg agcatgtctt caattcagcc caaatggcag ttgaaatact 10020
caaaccgccc catatgcagg agcggatcat tcattgtttg tttggttgcc tttgccaaca 10080
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ctctaattga gccgtgcgct ctatctagac caattagaat tgatggagct ctaaaggttg 10320
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gtgcttcttt tggcatatgt aggttgggca aaaacgagga agattgcttc tcaatttgga 10440
agatgatgaa cagccgaaga agaaaataag aataggcagt cctgctactc aatggatctc 10500
agtctataac ggtcgtcgtc ccatgaaaca gaggtaacac attttttgca tatacacttt 10560
gatagttcct cactaactgt gtaatctttt ggtagatatc actacaatgt tggagagaca 10620
aggctgcgcc agcatataca gaagggaaat gaagatggcc ttttgattag ctgtgtagca 10680
tcagcagcta atctctgggc tctcatcatg gatgctggaa ctggattcac ttctcaagtt 10740
tatgagttgt caccggtctt cctacacaag gtaataatca gttgaagcaa ttaagaatca 10800
atctgatttg tagtaaacta agaagaactt accttatgat ttccccgcag gactggatta 10860
tggaacaatg ggaaaagaac tactatataa gctccatagc gggttcagat aacgggagct 10920
ctttagttgt tatgtcaaaa ggttagtgtt tagtgaataa taaacttatt atcaaaaagt 10980
cttcattgac ttatttatat acttgttgtg aattggtagg aactacttat tctcagcagt 11040
catacaaagt gagtgactca tttccattca agtggataaa taagaaatgg aaagaagatt 11100
ttcatgtaac ctccatgaca actgctggta atcgttgggg tgtggtaatg tcgaggaact 11160
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ttgaacacag atttggatct ttttgttttg tttccatata cataggacct gagagctttt 11520
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ctatggcagg acagtgtgct gatgatacac acttaagcat catgtgttgt gttagaaagc 11640
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acgcagtctc tttggttgaa tgtgatgaaa gggatgtgtc ttggtatgta tgtacgagta 11760
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gtttctgttt ctttctcagt gtctgaatat ctgataagtg caatgtgaga aagccacacc 11940
aaaccaaaat attcaaatct tatattttta ataatgtcga atcactcgga gttgccacct 12000
tctgtgccaa ttgtgctgaa tctatcacac taaaaaaaac atttcttcaa ggtaatgact 12060
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tcttttttga aaaatatcgt tcataagatg tcacgccagg acatgagcta cacatcacat 12180
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ctcacctata aattagaggc tcggcttcac tttttactca aaccaaaact catcactaca 12360
agatccacaa ccaaaaatgg ctgcaaggaa cgtgagtgcg gctcatgaga tgcatgacga 12420
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tggttcaaat taccgtgctg aacactacaa agctgaaagg agcaagtatg ctgacacctt 12600
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tttgaacctt gccaaacaag ccttggctga aacatctgtc aaagattcaa caagatgtgg 12720
catagtttct ggatgcctca gcttcccgat ggacaacctc caaggtgaac tcttgaatgt 12780
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tgcttccttt gttgctgagg aactcaatct tggcgctctc cactactctg ttgatgctgc 12960
ctgtgccact gcgctctatg tgctcagact ggcgcaagat cacttggtct ctggtgcagc 13020
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cacctacaca cgtatcaatg tgcatcccca caagattcag tatgttgaat gccatgcaac 13380
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agtcccacgt tttggaacca caaaagggaa ctttggacac acattggtgg cagctgggtt 13500
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agaaacgaat ggagaaccga agcgtgctgg tctctcagcg tttggatttg gtgggaccaa 13680
tgctcatgct gtctttgagg aacatgaccc aagcaatgct gcatgcactg gccatgactc 13740
catttctgct ctctctgcac gttgtggtgg tgagtcaaac atgagaatag caatcactgg 13800
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ggacttcctt gatctttgtg gagtcaaagc aacaccgcat ggctgttaca ttgaagatgt 13980
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tggaaatgtg gctgtctttg tggggttggg gaccgatctt gaactctacc gtcaccgtgc 14160
aagggttgct ctcaaggaga gagtgaggcc tgaagccagc aagaaactca atgacatgat 14220
gcagtacatc aatgattgtg ggacaagcac ttcttacacc agctacatag gcaacttggt 14280
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caacaattct gtgtacagat gtgctgaact tggcaaatac ctcttggaaa cgggagaggt 14400
tgatggggtt gtggttgcgg gtgttgatct ctgtgggagt gctgagaacc tttacgtcaa 14460
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tgatggttac tttgttggag agggctgtgg tgcatttgtg ctcaagcgtg agacaagctg 14580
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tgctgccagt ttgattaagg ctgcgctttg catctacaac cgttacctgc ccagcaatgg 14940
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catcacacaa gacattcata ggatttggcc tgaacttcat gaggtcatca atgagaaaac 15600
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gcttgagtca caacagcaag agtttgacag aaacatgatt gaaatgttcc gtcttggaat 15720
cctcacctca attgccttca caaacctggc gagagatgtt ctcaacatca cgcccaaagc 15780
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ggacttggtg atcgcagctg gaaggcaagg aatccttgcg tcatttggtg ctggaggcct 17280
tccaatgcaa gttgtgcgtg agtccattga aaagattcaa gctgccctgc ccaatggacc 17340
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gcgaccacta cacgaaattc atatgggaga agtaccgcaa gctgtcgccg acggcccgac 34260
ggatgttcga ctatttcagc tcgcaccggg agccgtaccc gctcaagctg gaaaccttcc 34320
gcctcatgtg cggatcggat tccacccgcg tgaagaagtg gcgcgagcag gtcggcgaag 34380
cctgcgaaga gttgcgaggc agcggcctgg tggaacacgc ctgggtcaat gatgacctgg 34440
tgcattgcaa acgctagggc cttgtggggt cagttccggc tgggggttca gcagccagcg 34500
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gaaaaagccc atggaggcgt tcgctgaacg gttgcgagat gccgtggcat tcggcgccta 34800
catcgacggc gagatcattg ggctgtcggt cttcaaacag gaggacggcc ccaaggacgc 34860
tcacaaggcg catctgtccg gcgttttcgt ggagcccgaa cagcgaggcc gaggggtcgc 34920
cggtatgctg ctgcgggcgt tgccggcggg tttattgctc gtgatgatcg tccgacagat 34980
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ctggagcttg ttgtttattt cggtctaccg cctgccgggc ggggtcgcgg cgacggtagg 35100
cgctgtgcag ccgctgatgg tcgtgttcat ctctgccgct ctgctaggta gcccgatacg 35160
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gccaatcccg atgcctacag gaaccaatgt tctcggcctg gcgtggctcg gcctgatcgg 35460
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ccgggagcac aggatgacgc ctaacaattc attcaagccg acaccgcttc gcggcgcggc 35640
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cgcaatgaca ttcttgcagg tatcttcgag ccagccacga tcgacattga tctggctatc 36060
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caagaagatc gcttggcctc gcgcgcagat cagttggaag aatttgttca ctacgtgaaa 36420
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gatggcttcc cctcggcagt tcatcagggc taaatcaatc tagccgactt gtccggtgaa 36660
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ctcaaattac aacggtatat atcctgccag tcagcatcat cacaccaaaa gttaggcccg 36780
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tacaatatta ctcaccggat cctaaccggt ttaattaagg cgcgccatgc ccgggcaagc 36900
ggccgcacaa gtttgtacaa aaaagcaggc ttctag 36936
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<213> Artificial sequence
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gatccacaac caaaaatggc agcgaggctg caagagcaga aaggaggtga gatggacacg 60
aggattgcga tcataggcat gagcgccata cttccttgtg gaaccacggt gagagagtca 120
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gatgctgcca tgaacgacgg aagatgtgtc acatacctca agggtgctgc accactcatc 3000
aaggctcctg aacctgtggt tgacgaagct gccaagaggg aggctgaaag gcttcagaag 3060
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gatggttatg gaagtgttga tgcttcttcc cttcagcaac agcaacagca acagactgct 3300
ccggcgcctg ttaaagccgc tgcccctgcc gctcccgttg caagtgctcc tgctcccgcc 3360
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actggatacg aaacagacat gattgaggcg gacatggagc ttgagactga gttgggaatt 3480
gacagcatca agagggttga aattctttct gaagtccaag ctatgcttaa cgttgaggcg 3540
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gcagaaatcg ctggttcttc cgctccggcg ccggcagctg ccgcacctgc accggctaaa 3660
gcggctccag ctgcagctgc accagctgtt tctaatgagc tgctcgaaaa ggcagaaact 3720
gttgtgatgg aagtccttgc tgccaaaact ggctacgaaa ctgacatgat agaatcagac 3780
atggagcttg agacggagct tggaattgat tccatcaagc gtgtggaaat cctcagtgaa 3840
gtccaagcca tgctcaatgt ggaagctaag gatgtggatg ctctctcaag gaccagaact 3900
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gccgctgccg ctcctggtcc cgctgccgcg gctccagctc cagctgcagc cgctccggcc 4020
gtctcaaacg aactccttga aaaagctgag accgtcgtga tggaggtctt ggcagctaaa 4080
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gctgaaattg ctggagggtc tgcgcccgcg ccagctgcag ccgctcctgc acccgcagcc 4320
gcggcacctg ctccagctgc acctgcacct gccgtttctt cagaactctt ggagaaggct 4380
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aaggctgaga cagttgtgat ggaagtcctt gctgcgaaaa ctggctatga gaccgacatg 5760
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atcctctctg aggttcaagc gatgttgaat gtggaggcca aagatgttga tgctctttcc 5880
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tgtgcagttg tcttgacctt tgagggattg cagttggctc agagagctgg tgcagctgcc 6540
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ggtctctggt gcagctgatg tgatgctttg tggtgcaaca tgcctgccgg agccgttttt 10980
catactctct gggttctcaa ccttccaagc catgcctgtt ggaacgggtc agaatgtgtc 11040
catgccgctg cacaaagatt ctcaaggatt gacccctggt gaaggaggtt ccatcatggt 11100
cctcaaacgt ttggatgacg caatcagaga tggagatcac atctatggaa cacttttggg 11160
agccaatgtc agcaacagtg gcactggtct gccacttaaa ccccttttgc cgtcagagaa 11220
aaagtgcctc atggacacct acacacgtat caatgtgcat ccccacaaga ttcagtatgt 11280
tgaatgccat gcaactggga ctccacaagg tgatcgtgtg gaaattgatg ctgtgaaggc 11340
ttgctttgaa ggcaaagtcc cacgttttgg aaccacaaaa gggaactttg gacacacatt 11400
ggtggcagct gggtttgctg gcatgtgcaa agtgcttctc tccatgaagc acgggatcat 11460
tccacccact ccgggaatag atgacgaaac gaagatggac cctctggttg tctctggtga 11520
ggccattccc tggccagaaa cgaatggaga accgaagcgt gctggtctct cagcgtttgg 11580
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gcttaattaa tctgacctga ccactagacc tgagtgagta cagatgtgct actagtgcta 17040
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cttgtgtata aatattctct gaaagtgctt cttttggcat atgtaggttg ggcaaaaacg 17280
aggaagattg cttctcaatt tggaagatga tgaacagccg aagaagaaaa taagaatagg 17340
cagtcctgct actcaatgga tctcagtcta taacggtcgt cgtcccatga aacagaggta 17400
acacattttt tgcatataca ctttgatagt tcctcactaa ctgtgtaatc ttttggtaga 17460
tatcactaca atgttggaga gacaaggctg cgccagcata tacagaaggg aaatgaagat 17520
ggccttttga ttagctgtgt agcatcagca gctaatctct gggctctcat catggatgct 17580
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tgatttcccc gcaggactgg attatggaac aatgggaaaa gaactactat ataagctcca 17760
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ggggtgtggt aatgtcgagg aactctggct tctctgatca ggtaggtttt tgtctcttat 18060
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atagaataac atcaatggca gcaactgcgg atcaagcagc tttcatatta agcataccaa 18240
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atgtcaaggt tggtttcttt agctttgaac acagatttgg atctttttgt tttgtttcca 18360
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agtgcaatgt gagaaagcca caccaaacca aaatattcaa atcttatatt tttaataatg 18840
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<210> 59
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<220>
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gcagatgcac caacacattc aacttggatg gcatgaactg cgttgtggat gctgcatgtg 1500
caagctcctt gatagcagtc aaggttgcga ttgatgaact gctctatggt gactgcgaca 1560
tgatggtcac tggtgcaacc tgcacagaca actccattgg gatgtacatg gctttctcaa 1620
agacacctgt gttcagcacg gacccaagtg tgagagcgta tgatgagaaa acgaaaggga 1680
tgctcattgg tgagggatca gccatgttgg tgctcaaacg ttatgcagat gcagtgaggg 1740
atggtgatga gattcatgct gtgattcgtg gttgtgcaag ctcaagtgat ggcaaagcag 1800
ctggcatcta cactcccaca atcagtggtc aagaggaagc cttgagacgt gcatacaatc 1860
gtgcctgcgt tgaccctgcc actgtcactt tggttgaggg tcatgggact ggcactccag 1920
ttggagatag gattgagttg actgcgttga ggaacttgtt tgacaaagcg tatggtgaag 1980
ggaacacaga gaaagttgca gttggaagta tcaagtccag tattggtcat ttgaaggctg 2040
ttgctggtct tgctggaatg atcaaggtca tcatggctct caaacacaag actttgcctg 2100
gaacgatcaa tgtggacaat ccacccaatc tctatgacaa cactcccatc aatgagtcat 2160
ccctctacat caacacgatg aacagaccct ggttccctcc acctggtgtt ccgagacgtg 2220
ctggaatatc cagctttggc tttggaggtg ccaactacca tgcagtgttg gaagaggctg 2280
aaccagagca cacgacagcg tacagactca acaaacgtcc acaaccggtg ttgatgatgg 2340
ctgcaactcc tgctgcgttg cagagccttt gtgaagctca gctgaaagag tttgaagctg 2400
cgatcaagga gaatgagaca gtcaagaata ctgcctacat caagtgtgtc aagtttggag 2460
aacagttcaa gttccctggg agcatacctg cgaccaatgc gagactggga ttcttggtca 2520
aagatgcgga ggatgcgtgc tccacgcttc gtgctatatg tgctcagttt gccaaagatg 2580
tgaccaaaga agcgtggagg cttccgagag aaggagtttc tttccgtgcc aaaggcattg 2640
ccaccaatgg tgctgttgct gcactcttct ctggacaagg tgctcagtac acacacatgt 2700
tcagtgaagt tgcgatgaac tggcctcagt tcagacagtc cattgctgca atggacgctg 2760
cacagtccaa ggttgctgga agtgacaaag actttgaaag agtctctcaa gtcctgtacc 2820
caaggaaacc gtacgaacgt gagccagaac aagatcacaa gaaaatctca ctcacagcat 2880
acagccagcc gtcaaccctg gcatgtgctc ttggtgcctt tgagattttc aaggaagctg 2940
gattcactcc agactttgca gctggacaca gcttgggtga gtttgctgcg ctctatgcag 3000
ctggttgtgt tgacagagat gagttgtttg aacttgtttg cagaagggca aggatcatgg 3060
gaggcaaaga tgcacctgcc acacccaaag gttgcatggc agctgtcata ggacccaacg 3120
cagagaacat caaggttcaa gctgccaacg tctggcttgg aaactcaaac tctccgtctc 3180
agactgtcat tactgggtct gttgaaggga ttcaagctga aagtgccaga ttgcagaagg 3240
aagggttcag agttgtgcct cttgcttgtg agtctgcctt ccattctcca cagatggaaa 3300
atgccagctc agctttcaaa gatgtcatat ccaaggtttc cttccgtaca cccaaagcag 3360
aaacaaagct cttcagcaat gtttctggag agacctatcc gacggatgcc agagagatgc 3420
tcactcaaca catgacctca tctgtgaagt tcctgaccca agtgaggaac atgcaccaag 3480
ctggtgcgag aatctttgtt gagtttggac cgaaacaagt tctcagcaaa cttgtttctg 3540
aaaccctcaa agatgacccg tctgttgtca cagtgtctgt gaacccagct tctggcacgg 3600
actctgacat acagttgagg gatgctgcag ttcagctggt tgtggctggt gtcaatcttc 3660
aagggtttga caagtgggat gctcctgatg ccacgaggat gcaagccatc aagaaaaaga 3720
gaaccacact cagactttca gctgccacct atgtcagtga caagaccaag aaagtgaggg 3780
atgctgccat gaacgacgga agatgtgtca catacctcaa gggtgctgca ccactcatca 3840
aggctcctga acctgtggtt gacgaagctg ccaagaggga ggctgaaagg cttcagaagg 3900
agcttcaaga cgctcagagg cagcttgacg acgccaaacg tgcagctgca gaagccaact 3960
ccaaacttgc tgctgccaag gaggaagcca agactgctgc agcttcagcc aagcctgcag 4020
ttgacactgc tgttgtggag aaacatcgtg ccatcctcaa gtccatgctg gctgagctgg 4080
atggttatgg aagtgttgat gcttcttccc ttcagcaaca gcaacagcaa cagactgctc 4140
cggcgcctgt taaagccgct gcccctgccg ctcccgttgc aagtgctcct gctcccgccg 4200
tgtccaacga gttgcttgag aaagctgaga cagttgtgat ggaggttctc gctgccaaga 4260
ctggatacga aacagacatg attgaggcgg acatggagct tgagactgag ttgggaattg 4320
acagcatcaa gagggttgaa attctttctg aagtccaagc tatgcttaac gttgaggcga 4380
aagatgttga tgctctctct aggacgagaa cagtgggtga agttgtcaac gctatgaagg 4440
cagaaatcgc tggttcttcc gctccggcgc cggcagctgc cgcacctgca ccggctaaag 4500
cggctccagc tgcagctgca ccagctgttt ctaatgagct gctcgaaaag gcagaaactg 4560
ttgtgatgga agtccttgct gccaaaactg gctacgaaac tgacatgata gaatcagaca 4620
tggagcttga gacggagctt ggaattgatt ccatcaagcg tgtggaaatc ctcagtgaag 4680
tccaagccat gctcaatgtg gaagctaagg atgtggatgc tctctcaagg accagaactg 4740
tcggtgaggt tgtcaatgcc atgaaggctg agatagctgg aggctccgct cctgcgccgg 4800
ccgctgccgc tcctggtccc gctgccgcgg ctccagctcc agctgcagcc gctccggccg 4860
tctcaaacga actccttgaa aaagctgaga ccgtcgtgat ggaggtcttg gcagctaaaa 4920
ccggctatga gactgacatg attgagtctg acatggaatt ggagacagaa cttgggatag 4980
acagcatcaa acgtgttgaa atcctcagtg aggtccaagc tatgctgaac gtggaagcga 5040
aggatgttga tgctctgtcc agaacgagga ccgttggtga ggttgtggat gccatgaagg 5100
ctgaaattgc tggagggtct gcgcccgcgc cagctgcagc cgctcctgca cccgcagccg 5160
cggcacctgc tccagctgca cctgcacctg ccgtttcttc agaactcttg gagaaggctg 5220
agacggttgt gatggaggtt ttggctgcaa agactggcta tgagaccgac atgattgaat 5280
ctgatatgga attggagaca gagcttggga tcgattccat caaaagagtg gagatcctga 5340
gtgaagtcca agccatgctc aatgttgaag ctaaggatgt tgatgcactt tcaagaacaa 5400
ggacagtggg tgaggttgtg gatgccatga aggcggagat tgctggaggg agcgcgcctg 5460
cgccagctgc cgcggcacct gcaccggcag ccgcagctcc agctccagct gcaccagcac 5520
cggccgcgcc cgcgccagct gtttcatccg aactcctgga aaaggccgag acggttgtga 5580
tggaggtgct cgcagctaag actggttacg agaccgacat gattgaaagt gacatggagc 5640
ttgaaaccga gttgggaata gatagcatca aacgtgttga aatcttgtct gaggtccaag 5700
ctatgttgaa cgtggaggca aaagatgtcg atgcgctttc aagaaccaga acagtcggtg 5760
aggtcgtgga cgccatgaag gctgaaattg ccggaagctc tgctagtgcg ccagctgcag 5820
ccgcacctgc acctgctgcc gcggcacctg ctccagctgc agccgctcct gccgtcagca 5880
atgagttgct ggagaaagcc gaaacagttg tgatggaagt ccttgctgca aaaactggtt 5940
acgaaacgga catgattgag tcagacatgg aattggagac cgaacttgga atagattcca 6000
tcaagagagt ggagatcctc tctgaggtgc aagccatgct caacgttgag gctaaagatg 6060
ttgatgcact cagtaggaca agaactgtgg gggaagttgt cgatgcgatg aaggctgaga 6120
ttgctggagg ctctgctcct gcgccggcag ctgccgcacc tgcacccgca gccgcggcac 6180
cagctgtcag caacgaattg cttgagaagg ctgaaacagt tgtcatggaa gtgctggctg 6240
caaaaaccgg ctatgagact gacatgattg agtctgacat ggaacttgag acggaattgg 6300
gcattgacag catcaagcgt gttgagatcc tcagtgaagt ccaagcaatg ctcaatgtgg 6360
aggctaagga tgtggatgcc ctctcaagga ccagaacagt tggtgaggtc gttgatgcga 6420
tgaaggcgga gatcgctgga agttccgcgc ctgcgccagc tgcagccgct cctgcacccg 6480
cagccgcggc accggctcca gctgcagccg caccggccgt ctcctcagaa ctcctggaaa 6540
aggctgagac agttgtgatg gaagtccttg ctgcgaaaac tggctatgag accgacatga 6600
ttgaatctga catggaactg gagaccgagc ttggaattga ctccatcaaa cgtgttgaaa 6660
tcctctctga ggttcaagcg atgttgaatg tggaggccaa agatgttgat gctctttcca 6720
gaacaaggac ggtgggagag gtggttgatg ccatgaaggc tgagatagct gggggttctg 6780
ctcctgcgcc agctgcagcc gctcctgctc ccgctgccgc ggcaccagct gtcagcaacg 6840
aactccttga aaaagctgaa actgttgtga tggaggtttt ggctgcaaag actggatacg 6900
agactgacat gatagagtca gacatggagt tggaaacaga gcttgggatt gatagcatca 6960
agcgtgtgga aatcctttct gaggttcaag ccatgctgaa cgttgaggcc aaagatgtcg 7020
atgctttgtc aaggaccaga acggttggag aagtggtcga tgccatgaag gctgagatag 7080
ctggtggatc agcccctgct ccggctgcag ccgctcctgc aagtgccggt gctgcaccag 7140
ctgtgaagat tgattcagtt catggtgctg actgtgacga tttgtcactg atgcacgcaa 7200
aggtggttga catcagaagg ccagatgaac tgattctgga aagaccggag aaccgtccag 7260
ttcttgtcgt tgacgatggc tcagagttga cacttgctct tgtgagggtg ttgggagcct 7320
gtgcagttgt cttgaccttt gagggattgc agttggctca gagagctggt gcagctgcca 7380
ttcgtcatgt tctggctaag gacctttcag cagaatcagc tgagaaggcc atcaaagagg 7440
ctgagcaaag atttggagcg ttgggaggct tcataagcca gcaagcagaa aggtttgaac 7500
cagctgagat actgggtttc acactcatgt gtgcgaagtt tgccaaagcc tctctctgca 7560
ctgctgtggc tggaggtcgt cctgccttca tcggtgtggc taggcttgac ggcagacttg 7620
gattcacctc tcaaggcact tctgacgcac tcaagagagc acagcgtgga gcgatctttg 7680
gactctgcaa gacaataggg ttggagtggt cagaatctga tgtgttcagc cgtggtgtgg 7740
acattgctca agggatgcac ccagaagatg ctgcagttgc catagttagg gagatggcgt 7800
gtgctgacat cagaatcaga gaggttggga ttggagcaaa ccagcaaaga tgcacaatca 7860
gagctgccaa gttggagact gggaaccctc agagacagat agcgaaagac gatgtgcttc 7920
tggtttctgg aggtgctcgt gggatcacac ctctttgcat ccgtgagatc acgcgtcaga 7980
ttgctggagg caagtacatt ctgttgggtc gtagcaaagt ttctgcgtct gaaccagcat 8040
ggtgtgctgg catcactgat gagaaggctg tgcagaaagc tgccacccaa gagttgaaga 8100
gggccttcag tgctggtgaa ggacccaaac ccactccaag ggctgtcacg aaacttgtgg 8160
gatctgttct tggtgctcgt gaagtgagaa gctccattgc tgccattgaa gctctgggtg 8220
gcaaagcgat ctacagctct tgtgatgtga actctgctgc agatgttgcc aaagcagtta 8280
gggatgcaga gtcccagctt ggtgccagag ttagtggaat cgttcacgct tctggtgtgc 8340
tccgtgatcg tctcatagag aagaaactcc ctgacgagtt tgatgctgtc tttgggacca 8400
aagtcactgg gttggagaat cttctggctg cagttgatcg tgccaacctc aaacacatgg 8460
ttctcttcag ctcccttgct ggtttccacg gcaatgttgg tcagtctgac tatgcgatgg 8520
caaacgaagc tctcaacaag atgggtttgg aacttgcgaa ggatgtcagt gtcaagtcca 8580
tctgctttgg tccctgggat ggtgggatgg tgacacctca actcaagaaa cagtttcaag 8640
aaatgggagt tcagatcatt cctcgtgaag gaggtgctga tacagttgcg aggattgtgt 8700
tgggatcaag tcctgctgag atccttgttg gaaactggag gacaccatcc aagaaagttg 8760
gaagtgacac gatcaccctg catagaaaga tcagtgccaa gtccaatccc ttcttggagg 8820
atcatgtcat acaaggcaga agggtgttgc caatgaccct tgctattggg agccttgctg 8880
agacctgcct tggactcttc cctggctact ctctctgggc catagatgac gcacagctct 8940
tcaaaggtgt cactgttgat ggagacgtca actgtgaagt gaccctcaca ccgtccactg 9000
ctccgagtgg gagggtgaat gtccaagcga cgctcaagac gttctcaagt ggaaaacttg 9060
ttccagccta cagagctgtc atagtgttgt ccaaccaagg tgctccacct gccaatgcaa 9120
ccatgcagcc tccgagcctt gatgcagatc ctgctttgca agggtcagtc tatgatggca 9180
agactctctt tcatggtcct gcgttcagag gcattgatga cgttctcagc tgcaccaaga 9240
gccagcttgt tgccaagtgt tctgctgttc ctggatcaga tgcagccaga ggagagtttg 9300
caactgacac tgatgcacat gatccctttg tcaatgatct tgcctttcaa gcaatgttgg 9360
tctgggtgag gagaacgctg ggacaagctg cactcccgaa ctccattcag aggatagtcc 9420
aacacagacc ggtcccacaa gacaaaccct tctacatcac cctcagatcc aatcagagtg 9480
gtggacatag ccagcacaaa catgcacttc agttccacaa cgaacaaggt gatctcttca 9540
ttgatgttca agcctctgtc attgcgacag actcacttgc gttctgagta gttagcttaa 9600
tcacttaggt cacccagtcc aagcccggcc tagcacgatg atcatgagtg ttgctattga 9660
tgtatgttaa tactatacac agtcatcgtg tgtgttttat aaaactgtaa gcttaggatg 9720
tttgaggcta atgtaattag cactacaccg taataaatga gaggtttact ttatgtttta 9780
ataatgttct tacccttgct gctctctaaa ctgtaatggc gtacggttag ctaaactaaa 9840
gtaaaaatcg attcgcttga gtaaaattag tgaccgggaa agatcatcga ctactactgc 9900
tcagagatgt aatcggtaat taagacttca agctcaataa ttaattagga gtaaatctgg 9960
cttcgaattt ttaaattgtc aacttccaaa gaaggattgg caagactcaa tctcaattgc 10020
ccaacaaaca tatggctctt tacaaatttg gaatctcttt ttgatggcaa gaacgtcgta 10080
attcctctgt cgatctcatg taattaccaa actcatctac ttattacttt ctttatatgc 10140
acttactgat gcggccgctt aattaagatg agtgatactc aggactcagg actcactctg 10200
ctgatcacta gtgctagcct cgaggtcgac acaactttgt atacaaaagt tgtctaggat 10260
ctgcttttac atgcgagaca catcttctaa agtaatttta ataatagtta ctatattcaa 10320
gatttcatat atcaaatact caatattact tctaaaaaat taattagata taattaaaat 10380
attacttttt taattttaag tttaattgtt gaatttgtga ctattgattt attattctac 10440
tatgtttaaa ttgttttata gatagtttaa agtaaatata agtaatgtag tagagtgtta 10500
gagtgttacc ctaaaccata aactataaga tttatggtgg actaattttc atatatttct 10560
tattgctttt accttttctt ggtatgtaag tccgtaactg gaattactgt gggttgccat 10620
gacactctgt ggtcttttgg ttcatgcatg gatcttgcgc aagaaaaaga caaagaacaa 10680
agaaaaaaga caaaacagag agacaaaacg caatcacaca accaactcaa attagtcact 10740
ggctgatcaa gatcgccgcg tccatgtatg tctaaatgcc atgcaaagca acacgtgctt 10800
aacatgcact ttaaatggct cacccatctc aacccacaca caaacacatt gcctttttct 10860
tcatcatcac cacaaccacc tgtatatatt cattctcttc cgccacctca atttcttcac 10920
ttcaacacac gtcaacctgc atatgcgtgt catcccatgc ccaaatctcc atgcatgttc 10980
caaccacctt ctctcttata taatacctat aaatacctct aatatcactc acttctttca 11040
tcatccatcc atccagagta ctactactct actactataa taccccaacc caactcatat 11100
tcaatactac tctaggatcc acaaccaaaa atggctgcaa ggaacgtgag tgcggctcat 11160
gagatgcatg acgagaagag gatagctgtt gtgggcatgg ctgttcagta tgctggatgc 11220
aaaacgaaag acgagttctg ggaagttctc atgaatggaa aagttgagag caaagtgatc 11280
agcgacaaac gtcttggttc aaattaccgt gctgaacact acaaagctga aaggagcaag 11340
tatgctgaca ccttctgcaa tgagacatat ggaactcttg atgagaacga aatagacaat 11400
gagcatgaac tccttttgaa ccttgccaaa caagccttgg ctgaaacatc tgtcaaagat 11460
tcaacaagat gtggcatagt ttctggatgc ctcagcttcc cgatggacaa cctccaaggt 11520
gaactcttga atgtgtacca gaaccatgtt gagaagaaac ttggtgccag agttttcaaa 11580
gatgcctctc actggtcaga aagagaacag tccaacaaac cagaggctgg tgacagaaga 11640
atcttcatgg accctgcttc ctttgttgct gaggaactca atcttggcgc tctccactac 11700
tctgttgatg ctgcctgtgc cactgcgctc tatgtgctca gactggcgca agatcacttg 11760
gtctctggtg cagctgatgt gatgctttgt ggtgcaacat gcctgccgga gccgtttttc 11820
atactctctg ggttctcaac cttccaagcc atgcctgttg gaacgggtca gaatgtgtcc 11880
atgccgctgc acaaagattc tcaaggattg acccctggtg aaggaggttc catcatggtc 11940
ctcaaacgtt tggatgacgc aatcagagat ggagatcaca tctatggaac acttttggga 12000
gccaatgtca gcaacagtgg cactggtctg ccacttaaac cccttttgcc gtcagagaaa 12060
aagtgcctca tggacaccta cacacgtatc aatgtgcatc cccacaagat tcagtatgtt 12120
gaatgccatg caactgggac tccacaaggt gatcgtgtgg aaattgatgc tgtgaaggct 12180
tgctttgaag gcaaagtccc acgttttgga accacaaaag ggaactttgg acacacattg 12240
gtggcagctg ggtttgctgg catgtgcaaa gtgcttctct ccatgaagca cgggatcatt 12300
ccacccactc cgggaataga tgacgaaacg aagatggacc ctctggttgt ctctggtgag 12360
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ctcaatgaca tgatgcagta catcaatgat tgtgggacaa gcacttctta caccagctac 13020
ataggcaact tggttgcaac aagggtcagt tcacaatggg gcttcacggg accttccttc 13080
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gaaacgggag aggttgatgg ggttgtggtt gcgggtgttg atctctgtgg gagtgctgag 13200
aacctttacg tcaagtcaag gcgtttcaag gtgtctacat ctgacacccc gagagccagc 13260
tttgatgcag ctgctgatgg ttactttgtt ggagagggct gtggtgcatt tgtgctcaag 13320
cgtgagacaa gctgcaccaa ggatgacaga atctatgctt gcatggatgc catagttcct 13380
ggaaatgttc catctgcatg tttgagagag gcattggatc aagccagagt caagcctgga 13440
gacatcgaga tgttggagct ttctgctgat tcagcgaggc atttgaagga cccgtctgtt 13500
ctcccaaagg aactcactgc tgaggaagag attggcggac ttcagacgat tcttcgtgac 13560
gatgacaagc tcccaaggaa tgttgcaact ggaagtgtca aggccactgt tggtgacact 13620
ggttatgctt ctggtgctgc cagtttgatt aaggctgcgc tttgcatcta caaccgttac 13680
ctgcccagca atggagatga ctgggatgaa cctgcacctg aagcaccctg ggacagcaca 13740
ctctttgcgt gccagacctc aagagcttgg ttgaagaacc ctggtgagag acgttatgcg 13800
gctgtttccg gagtcagtga aaccagaagt tgctacagtg tgctgctttc tgaagcagag 13860
ggacactacg agagagagaa cagaatcagt ttggatgagg aagcacccaa gctcattgtg 13920
ttgagagcag actcccatga agagattctt ggaagattgg acaagataag ggaaaggttc 13980
ttgcagccca cgggtgctgc acccagagag tctgaattga aggcgcaagc ccgtaggatc 14040
tttcttgaac tccttggtga gacccttgcc caagatgcag cttcatctgg aagtcagaag 14100
ccccttgctc tcagcttggt ctccactcca tccaagctcc agagagaggt ggaacttgcg 14160
gcaaaaggca ttccgagatg tctcaagatg agacgtgatt ggagttcccc tgctggaagc 14220
agatatgcgc ctgagccttt ggccagtgac agagttgcct tcatgtatgg agaaggaagg 14280
agcccttact atggcatcac acaagacatt cataggattt ggcctgaact tcatgaggtc 14340
atcaatgaga aaacaaaccg tctctgggct gaaggtgaca gatgggtcat gccaagggcc 14400
agcttcaaga gtgagcttga gtcacaacag caagagtttg acagaaacat gattgaaatg 14460
ttccgtcttg gaatcctcac ctcaattgcc ttcacaaacc tggcgagaga tgttctcaac 14520
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tctgtcccaa aagatgagtt ctggcaaggt tacatagtga ggggaacgaa acaagacata 14760
gaagcagcca tagcaccaga ctcaaagtat gtgaggttga ccatcatcaa tgatgccaac 14820
actgctctca tcagtggaaa gcctgatgca tgcaaagctg cgattgctcg tcttggtggc 14880
aacatccctg cgcttccagt cactcaaggc atgtgtgggc attgcccaga ggtgggacct 14940
tacaccaagg acatcgcaaa gatccacgcc aaccttgagt tccctgtggt tgatggtctt 15000
gatctctgga ctaccataaa ccagaagagg cttgtgccaa gagccacggg tgccaaagat 15060
gaatgggctc cttcatcctt tggggagtat gctggacagc tctatgagaa acaagccaac 15120
ttccctcaga tagttgaaac catctacaag cagaactatg atgtgtttgt tgaagttggg 15180
ccaaacaatc acagaagcac agcagtgaga accacgcttg gaccacagag aaaccacctt 15240
gctggtgcca tagacaagca gaacgaggat gcttggacga caatagtcaa gctcgtggct 15300
tcattgaagg ctcaccttgt tcctggagtg accatcagtc cgctctacca ctccaagctc 15360
gttgcagagg ctgaggcttg ttatgctgcg ctctgtaaag gtgagaaacc caagaaaaac 15420
aagtttgtga gaaagattca gttgaatggc agattcaaca gcaaggcaga ccccatctcc 15480
tcagcagacc ttgcatcctt cccacctgcg gaccctgcga ttgaagctgc catctcttca 15540
aggatcatga agcctgtggc tccgaaattc tatgcgcgtc tcaacattga tgagcaagat 15600
gagaccagag atccgatctt gaacaaggac aatgcgcctt ccagctccag ctcttccagc 15660
agttcctctt ccagcagttc atctccgtct cctgctcctt cagctccagt tcagaagaaa 15720
gctgccccag ctgcggagac aaaagctgtt gccagtgctg atgcacttcg tagtgccctg 15780
cttgatcttg actccatgct tgcgctcagc tctgcaagtg cttctggcaa ccttgttgag 15840
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agagctttca tgaaaactta tggtgtttct gcgcctctgt acaccggtgc aatggccaag 15960
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ctgcccaatg gaccatatgc tgtcaacctc atccattctc cttttgacag caaccttgag 16140
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gggtcagtca acataaggaa cagaatcatt gggaaagtct ccagaactga gctggctgaa 16320
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aatcaagaac aagctgagtt ggccagacgt gttcctgtgg ctgatgacat tgcggttgaa 16440
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tataatatta ctttatttaa aaataaaatg aatttatatt aaaatatgat ttggtaaaag 18180
atattataaa gaggaacttg gatgagaaag acgacgatgg gcaaaagttg catggcacac 18240
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aagtacccca gaagggtgag gctgcctgct cgtgaatacc tgcttgtgac aagggtcaca 18780
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gagacccttg agtatgacat cagagtgacc ggttttgcca aacgtttgga tggtggcatc 19080
tccatgttct tctttgagta tgactgctat gtcaatggga ggcttctcat tgagatgaga 19140
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cttgtcattg ctgctgggaa gaggaagata ttgggttctt ttggagcggg tgggcttcca 21780
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acagttgtga tggaagtcct tgctgcgaaa actggctatg agaccgacat gattgaatct 7380
gacatggaac tggagaccga gcttggaatt gactccatca aacgtgttga aatcctctct 7440
gaggttcaag cgatgttgaa tgtggaggcc aaagatgttg atgctctttc cagaacaagg 7500
acggtgggag aggtggttga tgccatgaag gctgagatag ctgggggttc tgctcctgcg 7560
ccagctgcag ccgctcctgc tcccgctgcc gcggcaccag ctgtcagcaa cgaactcctt 7620
gaaaaagctg aaactgttgt gatggaggtt ttggctgcaa agactggata cgagactgac 7680
atgatagagt cagacatgga gttggaaaca gagcttggga ttgatagcat caagcgtgtg 7740
gaaatccttt ctgaggttca agccatgctg aacgttgagg ccaaagatgt cgatgctttg 7800
tcaaggacca gaacggttgg agaagtggtc gatgccatga aggctgagat agctggtgga 7860
tcagcccctg ctccggctgc agccgctcct gcaagtgccg gtgctgcacc agctgtgaag 7920
attgattcag ttcatggtgc tgactgtgac gatttgtcac tgatgcacgc aaaggtggtt 7980
gacatcagaa ggccagatga actgattctg gaaagaccgg agaaccgtcc agttcttgtc 8040
gttgacgatg gctcagagtt gacacttgct cttgtgaggg tgttgggagc ctgtgcagtt 8100
gtcttgacct ttgagggatt gcagttggct cagagagctg gtgcagctgc cattcgtcat 8160
gttctggcta aggacctttc agcagaatca gctgagaagg ccatcaaaga ggctgagcaa 8220
agatttggag cgttgggagg cttcataagc cagcaagcag aaaggtttga accagctgag 8280
atactgggtt tcacactcat gtgtgcgaag tttgccaaag cctctctctg cactgctgtg 8340
gctggaggtc gtcctgcctt catcggtgtg gctaggcttg acggcagact tggattcacc 8400
tctcaaggca cttctgacgc actcaagaga gcacagcgtg gagcgatctt tggactctgc 8460
aagacaatag ggttggagtg gtcagaatct gatgtgttca gccgtggtgt ggacattgct 8520
caagggatgc acccagaaga tgctgcagtt gccatagtta gggagatggc gtgtgctgac 8580
atcagaatca gagaggttgg gattggagca aaccagcaaa gatgcacaat cagagctgcc 8640
aagttggaga ctgggaaccc tcagagacag atagcgaaag acgatgtgct tctggtttct 8700
ggaggtgctc gtgggatcac acctctttgc atccgtgaga tcacgcgtca gattgctgga 8760
ggcaagtaca ttctgttggg tcgtagcaaa gtttctgcgt ctgaaccagc atggtgtgct 8820
ggcatcactg atgagaaggc tgtgcagaaa gctgccaccc aagagttgaa gagggccttc 8880
agtgctggtg aaggacccaa acccactcca agggctgtca cgaaacttgt gggatctgtt 8940
cttggtgctc gtgaagtgag aagctccatt gctgccattg aagctctggg tggcaaagcg 9000
atctacagct cttgtgatgt gaactctgct gcagatgttg ccaaagcagt tagggatgca 9060
gagtcccagc ttggtgccag agttagtgga atcgttcacg cttctggtgt gctccgtgat 9120
cgtctcatag agaagaaact ccctgacgag tttgatgctg tctttgggac caaagtcact 9180
gggttggaga atcttctggc tgcagttgat cgtgccaacc tcaaacacat ggttctcttc 9240
agctcccttg ctggtttcca cggcaatgtt ggtcagtctg actatgcgat ggcaaacgaa 9300
gctctcaaca agatgggttt ggaacttgcg aaggatgtca gtgtcaagtc catctgcttt 9360
ggtccctggg atggtgggat ggtgacacct caactcaaga aacagtttca agaaatggga 9420
gttcagatca ttcctcgtga aggaggtgct gatacagttg cgaggattgt gttgggatca 9480
agtcctgctg agatccttgt tggaaactgg aggacaccat ccaagaaagt tggaagtgac 9540
acgatcaccc tgcatagaaa gatcagtgcc aagtccaatc ccttcttgga ggatcatgtc 9600
atacaaggca gaagggtgtt gccaatgacc cttgctattg ggagccttgc tgagacctgc 9660
cttggactct tccctggcta ctctctctgg gccatagatg acgcacagct cttcaaaggt 9720
gtcactgttg atggagacgt caactgtgaa gtgaccctca caccgtccac tgctccgagt 9780
gggagggtga atgtccaagc gacgctcaag acgttctcaa gtggaaaact tgttccagcc 9840
tacagagctg tcatagtgtt gtccaaccaa ggtgctccac ctgccaatgc aaccatgcag 9900
cctccgagcc ttgatgcaga tcctgctttg caagggtcag tctatgatgg caagactctc 9960
tttcatggtc ctgcgttcag aggcattgat gacgttctca gctgcaccaa gagccagctt 10020
gttgccaagt gttctgctgt tcctggatca gatgcagcca gaggagagtt tgcaactgac 10080
actgatgcac atgatccctt tgtcaatgat cttgcctttc aagcaatgtt ggtctgggtg 10140
aggagaacgc tgggacaagc tgcactcccg aactccattc agaggatagt ccaacacaga 10200
ccggtcccac aagacaaacc cttctacatc accctcagat ccaatcagag tggtggacat 10260
agccagcaca aacatgcact tcagttccac aacgaacaag gtgatctctt cattgatgtt 10320
caagcctctg tcattgcgac agactcactt gcgttctgag tagttagctt aatcacttag 10380
gtcaccagta tgaactaaaa tgcatgtagg tgtaagagct catggagagc atggaatatt 10440
gtatccgacc atgtaacagt ataataactg agctccatct cacttcttct atgaataaac 10500
aaaggatgtt atgatatatt aacactctat ctatgcacct tattgttcta tgataaattt 10560
cctcttatta ttataaatca tctgaatcgt gacggcttat ggaatgcttc aaatagtaca 10620
aaaacaaatg tgtactataa gactttctaa acaattctaa ctttagcatt gtgaacgaga 10680
cataagtgtt aagaagacat aacaattata atggaagaag tttgtctcca tttatatatt 10740
atatattacc cacttatgta ttatattagg atgttaagga gacataacaa ttataaagag 10800
agaagtttgt atccatttat atattatata ctacccattt atatattata cttatccact 10860
tatttaatgt ctttataagg tttgatccat gatatttcta atattttagt tgatatgtat 10920
atgaaaaggt actatttgaa ctctcttact ctgtataaag gttggatcat ccttaaagtg 10980
ggtctattta attttattgc ttcttacaga taaaaaaaaa attatgagtt ggtttgataa 11040
aatattgaag gatttaaaat aataataaat aataaataac atataatata tgtatataaa 11100
tttattataa tataacattt atctataaaa aagtaaatat tgtcataaat ctatacaatc 11160
gtttagcctt gctggaacga atctcaatta tttaaacgag agtaaacata tttgactttt 11220
tggttattta acaaattatt atttaacact atatgaaatt tttttttttt atcagcaaag 11280
aataaaatta aattaagaag gacaatggtg tcccaatcct tatacaacca acttccacaa 11340
gaaagtcaag tcagagacaa caaaaaaaca agcaaaggaa attttttaat ttgagttgtc 11400
ttgtttgctg cataatttat gcagtaaaac actacacata acccttttag cagtagagca 11460
atggttgacc gtgtgcttag cttcttttat tttatttttt tatcagcaaa gaataaataa 11520
aataaaatga gacacttcag ggatgtttca acccttatac aaaaccccaa aaacaagttt 11580
cctagcaccc taccaacgaa ttcgcggccg cttaattaag atgagtgata ctcaggactc 11640
aggactcact ctgctgatca ctagtgctag cctcgaggtc gacacaactt tgtatacaaa 11700
agttgtctag acctaggtta attaagcggc cgcagcttat ttctcttttc gatactctaa 11760
ttgagccgtg cgctctatct agaccaatta gaattgatgg agctctaaag gttgctggct 11820
gttttcttgt tcatatgatt aacttctaaa cttgtgtata aatattctct gaaagtgctt 11880
cttttggcat atgtaggttg ggcaaaaacg aggaagattg cttctcaatt tggaagatga 11940
tgaacagccg aagaagaaaa taagaatagg cagtcctgct actcaatgga tctcagtcta 12000
taacggtcgt cgtcccatga aacagaggta acacattttt tgcatataca ctttgatagt 12060
tcctcactaa ctgtgtaatc ttttggtaga tatcactaca atgttggaga gacaaggctg 12120
cgccagcata tacagaaggg aaatgaagat ggccttttga ttagctgtgt agcatcagca 12180
gctaatctct gggctctcat catggatgct ggaactggat tcacttctca agtttatgag 12240
ttgtcaccgg tcttcctaca caaggtaata atcagttgaa gcaattaaga atcaatctga 12300
tttgtagtaa actaagaaga acttacctta tgatttcccc gcaggactgg attatggaac 12360
aatgggaaaa gaactactat ataagctcca tagcgggttc agataacggg agctctttag 12420
ttgttatgtc aaaaggttag tgtttagtga ataataaact tattatcaaa aagtcttcat 12480
tgacttattt atatacttgt tgtgaattgg taggaactac ttattctcag cagtcataca 12540
aagtgagtga ctcatttcca ttcaagtgga taaataagaa atggaaagaa gattttcatg 12600
taacctccat gacaactgct ggtaatcgtt ggggtgtggt aatgtcgagg aactctggct 12660
tctctgatca ggtaggtttt tgtctcttat tgtctggtgt ttttattttc ccctgatagt 12720
ctaatatgat aaactctgcg ttgtgaaagg tggtggagct tgactttttg tacccaagcg 12780
atgggataca taggaggtgg gagaatgggt atagaataac atcaatggca gcaactgcgg 12840
atcaagcagc tttcatatta agcataccaa agcgtaagat ggtggatgaa actcaagaga 12900
ctctccgcac caccgccttt ccaagtactc atgtcaaggt tggtttcttt agctttgaac 12960
acagatttgg atctttttgt tttgtttcca tatacatagg acctgagagc ttttggttga 13020
attttttttt tttcaggaca aatgggcgaa gaatctgtac attgcatcaa tatgctatgg 13080
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caattggagc gagcctcagg gtcgtcataa taccaatcaa agacgtaaaa ccagacgcag 13200
tctctttggt tgaatgtgat gaaagggatg tgtcttggta tgtatgtacg agtaacaaaa 13260
gagaagatgc aattgagtag tagaaagatt tgagagcttt ttaaagccct tcaagtgtgt 13320
gcttttatct tattgatatc atccatttgc gttgtttaat gcgtctttag atatgtttct 13380
gtttctttct cagtgtctga atatctgata agtgcaatgt gagaaagcca caccaaacca 13440
aaatattcaa atcttatatt tttaataatg tcgaatcact cggagttgcc accttctgtg 13500
ccaattgtgc tgaatctatc acactaaaaa aaacatttct tcaaggtaat gacttgtgga 13560
ctatgttctg aattctcatt aagtttttat tttttgaagt ttaagttttt accttctttt 13620
ttgaaaaata tcgttcataa gatgtcacgc caggacatga gctacacatc acatattagc 13680
atgcagatgc ggacgatttg tcactcactt caaacaccta aaagagcttc tctctcacag 13740
cacacacaca tatgcatgca atatttacac gtgatcgcca tgcaaatctc cattctcacc 13800
tataaattag aggctcggct tcacttttta ctcaaaccaa aactcatcac tacaagatcc 13860
acaaccaaaa atggctgcaa ggaacgtgag tgcggctcat gagatgcatg acgagaagag 13920
gatagctgtt gtgggcatgg ctgttcagta tgctggatgc aaaacgaaag acgagttctg 13980
ggaagttctc atgaatggaa aagttgagag caaagtgatc agcgacaaac gtcttggttc 14040
aaattaccgt gctgaacact acaaagctga aaggagcaag tatgctgaca ccttctgcaa 14100
tgagacatat ggaactcttg atgagaacga aatagacaat gagcatgaac tccttttgaa 14160
ccttgccaaa caagccttgg ctgaaacatc tgtcaaagat tcaacaagat gtggcatagt 14220
ttctggatgc ctcagcttcc cgatggacaa cctccaaggt gaactcttga atgtgtacca 14280
gaaccatgtt gagaagaaac ttggtgccag agttttcaaa gatgcctctc actggtcaga 14340
aagagaacag tccaacaaac cagaggctgg tgacagaaga atcttcatgg accctgcttc 14400
ctttgttgct gaggaactca atcttggcgc tctccactac tctgttgatg ctgcctgtgc 14460
cactgcgctc tatgtgctca gactggcgca agatcacttg gtctctggtg cagctgatgt 14520
gatgctttgt ggtgcaacat gcctgccgga gccgtttttc atactctctg ggttctcaac 14580
cttccaagcc atgcctgttg gaacgggtca gaatgtgtcc atgccgctgc acaaagattc 14640
tcaaggattg acccctggtg aaggaggttc catcatggtc ctcaaacgtt tggatgacgc 14700
aatcagagat ggagatcaca tctatggaac acttttggga gccaatgtca gcaacagtgg 14760
cactggtctg ccacttaaac cccttttgcc gtcagagaaa aagtgcctca tggacaccta 14820
cacacgtatc aatgtgcatc cccacaagat tcagtatgtt gaatgccatg caactgggac 14880
tccacaaggt gatcgtgtgg aaattgatgc tgtgaaggct tgctttgaag gcaaagtccc 14940
acgttttgga accacaaaag ggaactttgg acacacattg gtggcagctg ggtttgctgg 15000
catgtgcaaa gtgcttctct ccatgaagca cgggatcatt ccacccactc cgggaataga 15060
tgacgaaacg aagatggacc ctctggttgt ctctggtgag gccattccct ggccagaaac 15120
gaatggagaa ccgaagcgtg ctggtctctc agcgtttgga tttggtggga ccaatgctca 15180
tgctgtcttt gaggaacatg acccaagcaa tgctgcatgc actggccatg actccatttc 15240
tgctctctct gcacgttgtg gtggtgagtc aaacatgaga atagcaatca ctgggatgga 15300
tgccactttt ggtgctttga aaggattgga tgcttttgaa agggccatct acactggtgc 15360
tcatggtgct ataccactcc cagaaaagag atggagattc ctggggaaag acaaggactt 15420
ccttgatctt tgtggagtca aagcaacacc gcatggctgt tacattgaag atgttgaagt 15480
tgatttccag aggctgagga ctccaatgac tcctgaagat atgctcttgc ctcaacagct 15540
tctggctgtc accacaattg atagggccat attggactct ggcatgaaga aaggtggaaa 15600
tgtggctgtc tttgtggggt tggggaccga tcttgaactc taccgtcacc gtgcaagggt 15660
tgctctcaag gagagagtga ggcctgaagc cagcaagaaa ctcaatgaca tgatgcagta 15720
catcaatgat tgtgggacaa gcacttctta caccagctac ataggcaact tggttgcaac 15780
aagggtcagt tcacaatggg gcttcacggg accttccttc acaatcacag aaggcaacaa 15840
ttctgtgtac agatgtgctg aacttggcaa atacctcttg gaaacgggag aggttgatgg 15900
ggttgtggtt gcgggtgttg atctctgtgg gagtgctgag aacctttacg tcaagtcaag 15960
gcgtttcaag gtgtctacat ctgacacccc gagagccagc tttgatgcag ctgctgatgg 16020
ttactttgtt ggagagggct gtggtgcatt tgtgctcaag cgtgagacaa gctgcaccaa 16080
ggatgacaga atctatgctt gcatggatgc catagttcct ggaaatgttc catctgcatg 16140
tttgagagag gcattggatc aagccagagt caagcctgga gacatcgaga tgttggagct 16200
ttctgctgat tcagcgaggc atttgaagga cccgtctgtt ctcccaaagg aactcactgc 16260
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tgttgcaact ggaagtgtca aggccactgt tggtgacact ggttatgctt ctggtgctgc 16380
cagtttgatt aaggctgcgc tttgcatcta caaccgttac ctgcccagca atggagatga 16440
ctgggatgaa cctgcacctg aagcaccctg ggacagcaca ctctttgcgt gccagacctc 16500
aagagcttgg ttgaagaacc ctggtgagag acgttatgcg gctgtttccg gagtcagtga 16560
aaccagaagt tgctacagtg tgctgctttc tgaagcagag ggacactacg agagagagaa 16620
cagaatcagt ttggatgagg aagcacccaa gctcattgtg ttgagagcag actcccatga 16680
agagattctt ggaagattgg acaagataag ggaaaggttc ttgcagccca cgggtgctgc 16740
acccagagag tctgaattga aggcgcaagc ccgtaggatc tttcttgaac tccttggtga 16800
gacccttgcc caagatgcag cttcatctgg aagtcagaag ccccttgctc tcagcttggt 16860
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tctcaagatg agacgtgatt ggagttcccc tgctggaagc agatatgcgc ctgagccttt 16980
ggccagtgac agagttgcct tcatgtatgg agaaggaagg agcccttact atggcatcac 17040
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tctctgggct gaaggtgaca gatgggtcat gccaagggcc agcttcaaga gtgagcttga 17160
gtcacaacag caagagtttg acagaaacat gattgaaatg ttccgtcttg gaatcctcac 17220
ctcaattgcc ttcacaaacc tggcgagaga tgttctcaac atcacgccca aagcagcctt 17280
tggactcagt ttgggagaga tttccatgat ctttgctttc tccaagaaaa acggtttgat 17340
aagcgatcag ttgacaaagg atttgagaga gtcagatgtc tggaacaaag ctctggctgt 17400
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ctggcaaggt tacatagtga ggggaacgaa acaagacata gaagcagcca tagcaccaga 17520
ctcaaagtat gtgaggttga ccatcatcaa tgatgccaac actgctctca tcagtggaaa 17580
gcctgatgca tgcaaagctg cgattgctcg tcttggtggc aacatccctg cgcttccagt 17640
cactcaaggc atgtgtgggc attgcccaga ggtgggacct tacaccaagg acatcgcaaa 17700
gatccacgcc aaccttgagt tccctgtggt tgatggtctt gatctctgga ctaccataaa 17760
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catctacaag cagaactatg atgtgtttgt tgaagttggg ccaaacaatc acagaagcac 17940
agcagtgaga accacgcttg gaccacagag aaaccacctt gctggtgcca tagacaagca 18000
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ccgtctccac aacccagaga agatacagag ggctgagagg gaccccaaac tgaagatgtc 19740
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cagagtcatg gactaccaag tttggtgtgg tcctgccatt ggttcattca atgatttcat 19860
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gctttcagat ggtgcagctg cacttgtggc gagcattgat gacacatatg tccctgctga 20040
gaagctgtga gtagttagct taatcactta ggtcaccatt ccaaacgaaa tatcctcgag 20100
agtgtgtata ccacggtgat atgagtgtgg ttgttgatgt atgttaacac tacatagtca 20160
tggtgtgtgt tccataaata atgtactaat gtaataagaa ctactccgta gacggtaata 20220
aaagagaagt tttttttttt actcttgcta ctttcctata aagtgatgat taacaacaga 20280
tacaccaaaa agaaaacaat taatctatat tcacaatgaa gcagtactag tctattgaac 20340
atgtcagatt ttctttttct agatgtctaa tcaagccttc aaggctagtg ataaaagatc 20400
atccaatggg atccaacaaa gactcaaatc tggttttgat cagatacttc gaaactattt 20460
ttgtatgcac taaattatgc aagtgttctt ttatttggtg aagactcttt agaagcaaag 20520
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gccgcttaat taaactagtg ctagcctcga ggtcgaccaa cttttctata caaagttgtc 20640
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cacgttgcca cctcagcttt ctcctcttct cactatgaca cgactggcca tgcatgcatg 21120
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cataagtgtt aagaagacat aacaattata atggaagaag tttgtctcca tttatatatt 10740
atatattacc cacttatgta ttatattagg atgttaagga gacataacaa ttataaagag 10800
agaagtttgt atccatttat atattatata ctacccattt atatattata cttatccact 10860
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agccgtacaa tattactcac cggatcctaa ccggtttaat taaggcgcgc catgcccggg 38220
caagcggccg cacaagttt 38239
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<211> 34850
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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gtacaaaaaa gcaggcttct agacctaggt ggagtcatca cgcagactat ctcagcatgt 60
gcgtagcacg cggccgcagc ttatagtaaa gatttttttg ttaataaaat gaaagttaat 120
atttatggat ttatttgaac atatttacaa gtttttgtta ataaatttat ttacagaagt 180
gttaaatttg aaaatgtgtt aaatgagagt taatatttat ggatataata ttactttatt 240
taaaaataaa atgaatttat attaaaatat gatttggtaa aagatattat aaagaggaac 300
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caacacgatg aacagaccct ggttccctcc acctggtgtt ccgagacgtg ctggaatatc 2040
cagctttggc tttggaggtg ccaactacca tgcagtgttg gaagaggctg aaccagagca 2100
cacgacagcg tacagactca acaaacgtcc acaaccggtg ttgatgatgg ctgcaactcc 2160
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gttccctggg agcatacctg cgaccaatgc gagactggga ttcttggtca aagatgcgga 2340
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agcgtggagg cttccgagag aaggagtttc tttccgtgcc aaaggcattg ccaccaatgg 2460
tgctgttgct gcactcttct ctggacaagg tgctcagtac acacacatgt tcagtgaagt 2520
tgcgatgaac tggcctcagt tcagacagtc cattgctgca atggacgctg cacagtccaa 2580
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gtacgaacgt gagccagaac aagatcacaa gaaaatctca ctcacagcat acagccagcc 2700
gtcaaccctg gcatgtgctc ttggtgcctt tgagattttc aaggaagctg gattcactcc 2760
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tgacagagat gagttgtttg aacttgtttg cagaagggca aggatcatgg gaggcaaaga 2880
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tactgggtct gttgaaggga ttcaagctga aagtgccaga ttgcagaagg aagggttcag 3060
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agctttcaaa gatgtcatat ccaaggtttc cttccgtaca cccaaagcag aaacaaagct 3180
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aagtgttgat gcttcttccc ttcagcaaca gcaacagcaa cagactgctc cggcgcctgt 3960
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gttgcttgag aaagctgaga cagttgtgat ggaggttctc gctgccaaga ctggatacga 4080
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gatagagtca gacatggagt tggaaacaga gcttgggatt gatagcatca agcgtgtgga 6780
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taaattcaga aatatttcaa taactgatta tatcagctgg tacattgccg tagatgaaag 27540
actgagtgcg atattatggt gtaatacata ggaattcgtt taaacgatct gcgtctaatt 27600
ttcggtccaa cttgcacagg aaagacgtcg accgcggtag ctcttgccca gcagactggg 27660
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<210> 63
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<213> Artificial sequence
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<223> plasmid pDAB9151
<400> 63
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ctttttcaca ctcaccatgc atgctgccac gtcagctttc acactatgac accactggcc 6420
atacacgttg ccacctcagc tttctcctct tctcactatg acacgactgg ccatgcatgc 6480
atgcatgctg ccacctcagc tcccgcctct tcacccgtgt ctttctctca tgtcgcagtg 6540
ctgcgtgcca acctcttctc tctataaata gagagaagag aatgatggtt aaactcaaac 6600
caaaacaaga aaacatacac aaatagcaaa acggatccac aaccaaaaat ggctgcaagg 6660
aacgtgagtg cggctcatga gatgcatgac gagaagagga tagctgttgt gggcatggct 6720
gttcagtatg ctggatgcaa aacgaaagac gagttctggg aagttctcat gaatggaaaa 6780
gttgagagca aagtgatcag cgacaaacgt cttggttcaa attaccgtgc tgaacactac 6840
aaagctgaaa ggagcaagta tgctgacacc ttctgcaatg agacatatgg aactcttgat 6900
gagaacgaaa tagacaatga gcatgaactc cttttgaacc ttgccaaaca agccttggct 6960
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gaggctggtg acagaagaat cttcatggac cctgcttcct ttgttgctga ggaactcaat 7200
cttggcgctc tccactactc tgttgatgct gcctgtgcca ctgcgctcta tgtgctcaga 7260
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atgaagcacg ggatcattcc acccactccg ggaatagatg acgaaacgaa gatggaccct 7860
ctggttgtct ctggtgaggc cattccctgg ccagaaacga atggagaacc gaagcgtgct 7920
ggtctctcag cgtttggatt tggtgggacc aatgctcatg ctgtctttga ggaacatgac 7980
ccaagcaatg ctgcatgcac tggccatgac tccatttctg ctctctctgc acgttgtggt 8040
ggtgagtcaa acatgagaat agcaatcact gggatggatg ccacttttgg tgctttgaaa 8100
ggattggatg cttttgaaag ggccatctac actggtgctc atggtgctat accactccca 8160
gaaaagagat ggagattcct ggggaaagac aaggacttcc ttgatctttg tggagtcaaa 8220
gcaacaccgc atggctgtta cattgaagat gttgaagttg atttccagag gctgaggact 8280
ccaatgactc ctgaagatat gctcttgcct caacagcttc tggctgtcac cacaattgat 8340
agggccatat tggactctgg catgaagaaa ggtggaaatg tggctgtctt tgtggggttg 8400
gggaccgatc ttgaactcta ccgtcaccgt gcaagggttg ctctcaagga gagagtgagg 8460
cctgaagcca gcaagaaact caatgacatg atgcagtaca tcaatgattg tgggacaagc 8520
acttcttaca ccagctacat aggcaacttg gttgcaacaa gggtcagttc acaatggggc 8580
ttcacgggac cttccttcac aatcacagaa ggcaacaatt ctgtgtacag atgtgctgaa 8640
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ctctgtggga gtgctgagaa cctttacgtc aagtcaaggc gtttcaaggt gtctacatct 8760
gacaccccga gagccagctt tgatgcagct gctgatggtt actttgttgg agagggctgt 8820
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gccagagtca agcctggaga catcgagatg ttggagcttt ctgctgattc agcgaggcat 9000
ttgaaggacc cgtctgttct cccaaaggaa ctcactgctg aggaagagat tggcggactt 9060
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gccactgttg gtgacactgg ttatgcttct ggtgctgcca gtttgattaa ggctgcgctt 9180
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tcatctggaa gtcagaagcc ccttgctctc agcttggtct ccactccatc caagctccag 9660
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cctgaacttc atgaggtcat caatgagaaa acaaaccgtc tctgggctga aggtgacaga 9900
tgggtcatgc caagggccag cttcaagagt gagcttgagt cacaacagca agagtttgac 9960
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gcgagagatg ttctcaacat cacgcccaaa gcagcctttg gactcagttt gggagagatt 10080
tccatgatct ttgctttctc caagaaaaac ggtttgataa gcgatcagtt gacaaaggat 10140
ttgagagagt cagatgtctg gaacaaagct ctggctgttg agttcaatgc gctcagagaa 10200
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cctgtggttg atggtcttga tctctggact accataaacc agaagaggct tgtgccaaga 10560
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ttgacgagga atgcagatgg gtcagtcaac ataaggaaca gaatcattgg gaaagtctcc 11820
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attgcttctg gggagatcaa tcaagaacaa gctgagttgg ccagacgtgt tcctgtggct 11940
gatgacattg cggttgaagc tgattctggt ggacacactg acaaccgtcc aatccatgtc 12000
attctgcctc tgattatcaa cctgagggat aggcttcaca gagagtgtgg atacccagca 12060
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actttcaaca tgggtgcctc tttcattgtc actggaacag tgaaccaagt tgccaaacaa 12180
tctgggacgt gtgacaatgt gaggaaacag cttgcgaaag caacttactc agatgtttgc 12240
atggcaccgg cagctgacat gtttgaggaa ggtgtgaaac ttcaagtttt gaagaaagga 12300
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gagtccatgc ctccagcaga gcttgcgagg gttgagaaaa gaatcttcag tcgtgcattg 12420
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tccctggctt caaggtgggc caacactgga gcttctgaca gagtcatgga ctaccaagtt 12600
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cttgtggcga gcattgatga cacatatgtc cctgctgaga agctgtgagt agttagctta 12840
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gtttgaggct aatgtaatta gcactacacc gtaataaatg agaggtttac tttatgtttt 13020
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ctcagagatg taatcggtaa ttaagacttc aagctcaata attaattagg agtaaatctg 13200
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agagttaata tttatggata taatattact ttatttaaaa ataaaatgaa tttatattaa 13740
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agggcaaaca gattctactt tccagaacac agaaggcgtt tcactgctgg gagaggcatc 14340
ctcagatcca tcttgggtgg atacttggga gtggaaccgg gtcaagtcaa gtttgattat 14400
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tggtctctgt tggagcttgt gccagatgac aattgtgttg cagctgtggc tgttgcgggt 14820
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cttgctgctc tctaaactgt aatggcgtac ggttagctaa actaaagtaa aaatcgattc 15120
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tagcctcgag gtcgacacaa ctttgtataa taaagttgtc tagacctagg tggagtcatc 15540
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aaagatatta taaagaggaa cttggatgag aaagacgacg atgggcaaaa gttgcatggc 15840
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gaccagaact gtcggtgagg ttgtcaatgc catgaaggct gagatagctg gaggctccgc 20100
tcctgcgccg gccgctgccg ctcctggtcc cgctgccgcg gctccagctc cagctgcagc 20160
cgctccggcc gtctcaaacg aactccttga aaaagctgag accgtcgtga tggaggtctt 20220
ggcagctaaa accggctatg agactgacat gattgagtct gacatggaat tggagacaga 20280
acttgggata gacagcatca aacgtgttga aatcctcagt gaggtccaag ctatgctgaa 20340
cgtggaagcg aaggatgttg atgctctgtc cagaacgagg accgttggtg aggttgtgga 20400
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tcatggccag tgcatgcagc attgcttggg tcatgttcct caaagacagc atgagcattg 26220
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cagagagagt agccagggaa gagtccaagg caggtctcag caaggctccc aatagcaagg 1560
gtcattggca acacccttct gccttgtatg acatgatcct ccaagaaggg attggacttg 1620
gcactgatct ttctatgcag ggtgatcgtg tcacttccaa ctttcttgga tggtgtcctc 1680
cagtttccaa caaggatctc agcaggactt gatcccaaca caatcctcgc aactgtatca 1740
gcacctcctt cacgaggaat gatctgaact cccatttctt gaaactgttt cttgagttga 1800
ggtgtcacca tcccaccatc ccagggacca aagcagatgg acttgacact gacatccttc 1860
gcaagttcca aacccatctt gttgagagct tcgtttgcca tcgcatagtc agactgacca 1920
acattgccgt ggaaaccagc aagggagctg aagagaacca tgtgtttgag gttggcacga 1980
tcaactgcag ccagaagatt ctccaaccca gtgactttgg tcccaaagac agcatcaaac 2040
tcgtcaggga gtttcttctc tatgagacga tcacggagca caccagaagc gtgaacgatt 2100
ccactaactc tggcaccaag ctgggactct gcatccctaa ctgctttggc aacatctgca 2160
gcagagttca catcacaaga gctgtagatc gctttgccac ccagagcttc aatggcagca 2220
atggagcttc tcacttcacg agcaccaaga acagatccca caagtttcgt gacagccctt 2280
ggagtgggtt tgggtccttc accagcactg aaggccctct tcaactcttg ggtggcagct 2340
ttctgcacag ccttctcatc agtgatgcca gcacaccatg ctggttcaga cgcagaaact 2400
ttgctacgac ccaacagaat gtacttgcct ccagcaatct gacgcgtgat ctcacggatg 2460
caaagaggtg tgatcccacg agcacctcca gaaaccagaa gcacatcgtc tttcgctatc 2520
tgtctctgag ggttcccagt ctccaacttg gcagctctga ttgtgcatct ttgctggttt 2580
gctccaatcc caacctctct gattctgatg tcagcacacg ccatctccct aactatggca 2640
actgcagcat cttctgggtg catcccttga gcaatgtcca caccacggct gaacacatca 2700
gattctgacc actccaaccc tattgtcttg cagagtccaa agatcgctcc acgctgtgct 2760
ctcttgagtg cgtcagaagt gccttgagag gtgaatccaa gtctgccgtc aagcctagcc 2820
acaccgatga aggcaggacg acctccagcc acagcagtgc agagagaggc tttggcaaac 2880
ttcgcacaca tgagtgtgaa acccagtatc tcagctggtt caaacctttc tgcttgctgg 2940
cttatgaagc ctcccaacgc tccaaatctt tgctcagcct ctttgatggc cttctcagct 3000
gattctgctg aaaggtcctt agccagaaca tgacgaatgg cagctgcacc agctctctga 3060
gccaactgca atccctcaaa ggtcaagaca actgcacagg ctcccaacac cctcacaaga 3120
gcaagtgtca actctgagcc atcgtcaacg acaagaactg gacggttctc cggtctttcc 3180
agaatcagtt catctggcct tctgatgtca accacctttg cgtgcatcag tgacaaatcg 3240
tcacagtcag caccatgaac tgaatcaatc ttcacagctg gtgcagcacc ggcacttgca 3300
ggagcggctg cagccggagc aggggctgat ccaccagcta tctcagcctt catggcatcg 3360
accacttctc caaccgttct ggtccttgac aaagcatcga catctttggc ctcaacgttc 3420
agcatggctt gaacctcaga aaggatttcc acacgcttga tgctatcaat cccaagctct 3480
gtttccaact ccatgtctga ctctatcatg tcagtctcgt atccagtctt tgcagccaaa 3540
acctccatca caacagtttc agctttttca aggagttcgt tgctgacagc tggtgccgcg 3600
gcagcgggag caggagcggc tgcagctggc gcaggagcag aacccccagc tatctcagcc 3660
ttcatggcat caaccacctc tcccaccgtc cttgttctgg aaagagcatc aacatctttg 3720
gcctccacat tcaacatcgc ttgaacctca gagaggattt caacacgttt gatggagtca 3780
attccaagct cggtctccag ttccatgtca gattcaatca tgtcggtctc atagccagtt 3840
ttcgcagcaa ggacttccat cacaactgtc tcagcctttt ccaggagttc tgaggagacg 3900
gccggtgcgg ctgcagctgg agccggtgcc gcggctgcgg gtgcaggagc ggctgcagct 3960
ggcgcaggcg cggaacttcc agcgatctcc gccttcatcg catcaacgac ctcaccaact 4020
gttctggtcc ttgagagggc atccacatcc ttagcctcca cattgagcat tgcttggact 4080
tcactgagga tctcaacacg cttgatgctg tcaatgccca attccgtctc aagttccatg 4140
tcagactcaa tcatgtcagt ctcatagccg gtttttgcag ccagcacttc catgacaact 4200
gtttcagcct tctcaagcaa ttcgttgctg acagctggtg ccgcggctgc gggtgcaggt 4260
gcggcagctg ccggcgcagg agcagagcct ccagcaatct cagccttcat cgcatcgaca 4320
acttccccca cagttcttgt cctactgagt gcatcaacat ctttagcctc aacgttgagc 4380
atggcttgca cctcagagag gatctccact ctcttgatgg aatctattcc aagttcggtc 4440
tccaattcca tgtctgactc aatcatgtcc gtttcgtaac cagtttttgc agcaaggact 4500
tccatcacaa ctgtttcggc tttctccagc aactcattgc tgacggcagg agcggctgca 4560
gctggagcag gtgccgcggc agcaggtgca ggtgcggctg cagctggcgc actagcagag 4620
cttccggcaa tttcagcctt catggcgtcc acgacctcac cgactgttct ggttcttgaa 4680
agcgcatcga catcttttgc ctccacgttc aacatagctt ggacctcaga caagatttca 4740
acacgtttga tgctatctat tcccaactcg gtttcaagct ccatgtcact ttcaatcatg 4800
tcggtctcgt aaccagtctt agctgcgagc acctccatca caaccgtctc ggccttttcc 4860
aggagttcgg atgaaacagc tggcgcgggc gcggccggtg ctggtgcagc tggagctgga 4920
gctgcggctg ccggtgcagg tgccgcggca gctggcgcag gcgcgctccc tccagcaatc 4980
tccgccttca tggcatccac aacctcaccc actgtccttg ttcttgaaag tgcatcaaca 5040
tccttagctt caacattgag catggcttgg acttcactca ggatctccac tcttttgatg 5100
gaatcgatcc caagctctgt ctccaattcc atatcagatt caatcatgtc ggtctcatag 5160
ccagtctttg cagccaaaac ctccatcaca accgtctcag ccttctccaa gagttctgaa 5220
gaaacggcag gtgcaggtgc agctggagca ggtgccgcgg ctgcgggtgc aggagcggct 5280
gcagctggcg cgggcgcaga ccctccagca atttcagcct tcatggcatc cacaacctca 5340
ccaacggtcc tcgttctgga cagagcatca acatccttcg cttccacgtt cagcatagct 5400
tggacctcac tgaggatttc aacacgtttg atgctgtcta tcccaagttc tgtctccaat 5460
tccatgtcag actcaatcat gtcagtctca tagccggttt tagctgccaa gacctccatc 5520
acgacggtct cagctttttc aaggagttcg tttgagacgg ccggagcggc tgcagctgga 5580
gctggagccg cggcagcggg accaggagcg gcagcggccg gcgcaggagc ggagcctcca 5640
gctatctcag ccttcatggc attgacaacc tcaccgacag ttctggtcct tgagagagca 5700
tccacatcct tagcttccac attgagcatg gcttggactt cactgaggat ttccacacgc 5760
ttgatggaat caattccaag ctccgtctca agctccatgt ctgattctat catgtcagtt 5820
tcgtagccag ttttggcagc aaggacttcc atcacaacag tttctgcctt ttcgagcagc 5880
tcattagaaa cagctggtgc agctgcagct ggagccgctt tagccggtgc aggtgcggca 5940
gctgccggcg ccggagcgga agaaccagcg atttctgcct tcatagcgtt gacaacttca 6000
cccactgttc tcgtcctaga gagagcatca acatctttcg cctcaacgtt aagcatagct 6060
tggacttcag aaagaatttc aaccctcttg atgctgtcaa ttcccaactc agtctcaagc 6120
tccatgtccg cctcaatcat gtctgtttcg tatccagtct tggcagcgag aacctccatc 6180
acaactgtct cagctttctc aagcaactcg ttggacacgg cgggagcagg agcacttgca 6240
acgggagcgg caggggcagc ggctttaaca ggcgccggag cagtctgttg ctgttgctgt 6300
tgctgaaggg aagaagcatc aacacttcca taaccatcca gctcagccag catggacttg 6360
aggatggcac gatgtttctc cacaacagca gtgtcaactg caggcttggc tgaagctgca 6420
gcagtcttgg cttcctcctt ggcagcagca agtttggagt tggcttctgc agctgcacgt 6480
ttggcgtcgt caagctgcct ctgagcgtct tgaagctcct tctgaagcct ttcagcctcc 6540
ctcttggcag cttcgtcaac cacaggttca ggagccttga tgagtggtgc agcacccttg 6600
aggtatgtga cacatcttcc gtcgttcatg gcagcatccc tcactttctt ggtcttgtca 6660
ctgacatagg tggcagctga aagtctgagt gtggttctct ttttcttgat ggcttgcatc 6720
ctcgtggcat caggagcatc ccacttgtca aacccttgaa gattgacacc agccacaacc 6780
agctgaactg cagcatccct caactgtatg tcagagtccg tgccagaagc tgggttcaca 6840
gacactgtga caacagacgg gtcatctttg agggtttcag aaacaagttt gctgagaact 6900
tgtttcggtc caaactcaac aaagattctc gcaccagctt ggtgcatgtt cctcacttgg 6960
gtcaggaact tcacagatga ggtcatgtgt tgagtgagca tctctctggc atccgtcgga 7020
taggtctctc cagaaacatt gctgaagagc tttgtttctg ctttgggtgt acggaaggaa 7080
accttggata tgacatcttt gaaagctgag ctggcatttt ccatctgtgg agaatggaag 7140
gcagactcac aagcaagagg cacaactctg aacccttcct tctgcaatct ggcactttca 7200
gcttgaatcc cttcaacaga cccagtaatg acagtctgag acggagagtt tgagtttcca 7260
agccagacgt tggcagcttg aaccttgatg ttctctgcgt tgggtcctat gacagctgcc 7320
atgcaacctt tgggtgtggc aggtgcatct ttgcctccca tgatccttgc ccttctgcaa 7380
acaagttcaa acaactcatc tctgtcaaca caaccagctg catagagcgc agcaaactca 7440
cccaagctgt gtccagctgc aaagtctgga gtgaatccag cttccttgaa aatctcaaag 7500
gcaccaagag cacatgccag ggttgacggc tggctgtatg ctgtgagtga gattttcttg 7560
tgatcttgtt ctggctcacg ttcgtacggt ttccttgggt acaggacttg agagactctt 7620
tcaaagtctt tgtcacttcc agcaaccttg gactgtgcag cgtccattgc agcaatggac 7680
tgtctgaact gaggccagtt catcgcaact tcactgaaca tgtgtgtgta ctgagcacct 7740
tgtccagaga agagtgcagc aacagcacca ttggtggcaa tgcctttggc acggaaagaa 7800
actccttctc tcggaagcct ccacgcttct ttggtcacat ctttggcaaa ctgagcacat 7860
atagcacgaa gcgtggagca cgcatcctcc gcatctttga ccaagaatcc cagtctcgca 7920
ttggtcgcag gtatgctccc agggaacttg aactgttctc caaacttgac acacttgatg 7980
taggcagtat tcttgactgt ctcattctcc ttgatcgcag cttcaaactc tttcagctga 8040
gcttcacaaa ggctctgcaa cgcagcagga gttgcagcca tcatcaacac cggttgtgga 8100
cgtttgttga gtctgtacgc tgtcgtgtgc tctggttcag cctcttccaa cactgcatgg 8160
tagttggcac ctccaaagcc aaagctggat attccagcac gtctcggaac accaggtgga 8220
gggaaccagg gtctgttcat cgtgttgatg tagagggatg actcattgat gggagtgttg 8280
tcatagagat tgggtggatt gtccacattg atcgttccag gcaaagtctt gtgtttgaga 8340
gccatgatga ccttgatcat tccagcaaga ccagcaacag ccttcaaatg accaatactg 8400
gacttgatac ttccaactgc aactttctct gtgttccctt caccatacgc tttgtcaaac 8460
aagttcctca acgcagtcaa ctcaatccta tctccaactg gagtgccagt cccatgaccc 8520
tcaaccaaag tgacagtggc agggtcaacg caggcacgat tgtatgcacg tctcaaggct 8580
tcctcttgac cactgattgt gggagtgtag atgccagctg ctttgccatc acttgagctt 8640
gcacaaccac gaatcacagc atgaatctca tcaccatccc tcactgcatc tgcataacgt 8700
ttgagcacca acatggctga tccctcacca atgagcatcc ctttcgtttt ctcatcatac 8760
gctctcacac ttgggtccgt gctgaacaca ggtgtctttg agaaagccat gtacatccca 8820
atggagttgt ctgtgcaggt tgcaccagtg accatcatgt cgcagtcacc atagagcagt 8880
tcatcaatcg caaccttgac tgctatcaag gagcttgcac atgcagcatc cacaacgcag 8940
ttcatgccat ccaagttgaa tgtgttggtg catctgccag cagtgacatt cccaaggaat 9000
ccagggaaag agtcaagtct ccattctggg aagttcgctt tgtacttctc cacagccact 9060
ttgacatctt cctctggcat ccccatcttt ctcaagactt tctccacaac cacatagttg 9120
agtctgctgt agaactcatg tgaactcttc tgtccacctc caatgccaag cacgcatcct 9180
atgtttttct tctcctttcc aagtgcatca atcccagcat cttgaagtgc ttctttgacc 9240
ttgagaagtg agatggtctg attcgcatca gaatcttcca tctggaacat gttgagacca 9300
aactcacgcg catcaaagtc atactcagga atgaaacctc ctctcttgca gtagattttg 9360
tcctttgtgg tcttgactgg gtcaaagtac gcagtcacat caacacgatc ctcaggaaga 9420
tcagacaggc aatcaatgcc agcccttatg gtctcccatg actctctcac cgtggttcca 9480
caaggaagta tggcgctcat gcctatgatc gcaatcctcg tgtccatctc acctcctttc 9540
tgctcttgca gcctcgctgc catttttggt tgtggatccg ttttgctatt tgtgtatgtt 9600
ttcttgtttt ggtttgagtt taaccatcat tctcttctct ctatttatag agagaagagg 9660
ttggcacgca gcactgcgac atgagagaaa gacacgggtg aagaggcggg agctgaggtg 9720
gcagcatgca tgcatgcatg gccagtcgtg tcatagtgag aagaggagaa agctgaggtg 9780
gcaacgtgta tggccagtgg tgtcatagtg tgaaagctga cgtggcagca tgcatggtga 9840
gtgtgaaaaa ggcgccacag tgcagatgtt actgaacaaa agcggtgtgc catgcaactt 9900
ttgcccatcg tcgtctttct catccaagtt cctctttata atatctttta ccaaatcata 9960
ttttaatata aattcatttt atttttaaat aaagtaatat tatatccata aatattaact 10020
ctcatttaac acattttcaa atttaacact tctgtaaata aatttattaa caaaaacttg 10080
taaatatgtt caaataaatc cataaatatt aactttcatt ttattaacaa aaaaatcttt 10140
actataagct gcggccgctt aattaagatg agtgatactc aggactcagg actcactctg 10200
ctgatcacta gtgctagcct cgaggtcgac acaactttgt atacaaaagt tgtctaggat 10260
ctgcttttac atgcgagaca catcttctaa agtaatttta ataatagtta ctatattcaa 10320
gatttcatat atcaaatact caatattact tctaaaaaat taattagata taattaaaat 10380
attacttttt taattttaag tttaattgtt gaatttgtga ctattgattt attattctac 10440
tatgtttaaa ttgttttata gatagtttaa agtaaatata agtaatgtag tagagtgtta 10500
gagtgttacc ctaaaccata aactataaga tttatggtgg actaattttc atatatttct 10560
tattgctttt accttttctt ggtatgtaag tccgtaactg gaattactgt gggttgccat 10620
gacactctgt ggtcttttgg ttcatgcatg gatcttgcgc aagaaaaaga caaagaacaa 10680
agaaaaaaga caaaacagag agacaaaacg caatcacaca accaactcaa attagtcact 10740
ggctgatcaa gatcgccgcg tccatgtatg tctaaatgcc atgcaaagca acacgtgctt 10800
aacatgcact ttaaatggct cacccatctc aacccacaca caaacacatt gcctttttct 10860
tcatcatcac cacaaccacc tgtatatatt cattctcttc cgccacctca atttcttcac 10920
ttcaacacac gtcaacctgc atatgcgtgt catcccatgc ccaaatctcc atgcatgttc 10980
caaccacctt ctctcttata taatacctat aaatacctct aatatcactc acttctttca 11040
tcatccatcc atccagagta ctactactct actactataa taccccaacc caactcatat 11100
tcaatactac tctaggatcc acaaccaaaa atgcttcagc acacttggct tccgaagcct 11160
cccaatctga ccctcttgtc agatgaggtt catctctgga ggattcctct tgaccagcct 11220
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agattctact ttccagaaca cagaaggcgt ttcactgctg ggagaggcat cctcagatcc 11340
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gggaaaccga tccttggtga cagatttgct gagagtggac tcctgttcaa cttgtctcac 11460
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tatctgcgtc caacatctga cttggagtct cttgcaaaga ggttctttct cccaagagaa 11580
tatgaactct tgaggtcact ccctgatgag cagaaacaga agattttctt tcgttactgg 11640
acttgcaaag aggcttatct caaagcaacg ggagatggaa tagccaaact tgaagagatc 11700
gagatagcac tcaccccaac agaacctgcc aagctccaaa cagctcctgc gtggtctctg 11760
ttggagcttg tgccagatga caattgtgtt gcagctgtgg ctgttgcggg ttttggttgg 11820
cagcccaagt tctggcatta ctgagtagtt agcttaatca cttaggtcac cagtatgaac 11880
taaaatgcat gtaggtgtaa gagctcatgg agagcatgga atattgtatc cgaccatgta 11940
acagtataat aactgagctc catctcactt cttctatgaa taaacaaagg atgttatgat 12000
atattaacac tctatctatg caccttattg ttctatgata aatttcctct tattattata 12060
aatcatctga atcgtgacgg cttatggaat gcttcaaata gtacaaaaac aaatgtgtac 12120
tataagactt tctaaacaat tctaacttta gcattgtgaa cgagacataa gtgttaagaa 12180
gacataacaa ttataatgga agaagtttgt ctccatttat atattatata ttacccactt 12240
atgtattata ttaggatgtt aaggagacat aacaattata aagagagaag tttgtatcca 12300
tttatatatt atatactacc catttatata ttatacttat ccacttattt aatgtcttta 12360
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ttgaactctc ttactctgta taaaggttgg atcatcctta aagtgggtct atttaatttt 12480
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ttattattta acactatatg aaattttttt tttttatcag caaagaataa aattaaatta 12780
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tttatgcagt aaaacactac acataaccct tttagcagta gagcaatggt tgaccgtgtg 12960
cttagcttct tttattttat ttttttatca gcaaagaata aataaaataa aatgagacac 13020
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gtgcatataa agaaagtaat aagtagatga gtttggtaat tacatgagat cgacagagga 13800
attacgacgt tcttgccatc aaaaagagat tccaaatttg taaagagcca tatgtttgtt 13860
gggcaattga gattgagtct tgccaatcct tctttggaag ttgacaattt aaaaattcga 13920
agccagattt actcctaatt aattattgag cttgaagtct taattaccga ttacatctct 13980
gagcagtagt agtcgatgat ctttcccggt cactaatttt actcaagcga atcgattttt 14040
actttagttt agctaaccgt acgccattac agtttagaga gcagcaaggg taagaacatt 14100
attaaaacat aaagtaaacc tctcatttat tacggtgtag tgctaattac attagcctca 14160
aacatcctaa gcttacagtt ttataaaaca cacacgatga ctgtgtatag tattaacata 14220
catcaatagc aacactcatg atcatcgtgc taggccgggc ttggactggg tgacctaagt 14280
gattaagcta actactcaaa gcgcattcgt tggctcatag acaaaggcag catcttcagt 14340
ctcaagatca atcctcggat catttctcag agcattaaga cgcctcaggt aacatgcacc 14400
acgcaaaatc tgaaggttga tctggacaac acatgggtac tcattagaga cagcaggatc 14460
aagatatgtt cctttgatga agtcattgaa ggctccaatg gctggaccac accagacttg 14520
atagtccatg acacgatcag gagcacccat gttggcccaa cgtgatgcaa gaccaagata 14580
ccatctgaaa cacaaagaca tcttgagttt ggggtcatgt tccgctctct gtatcttctc 14640
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cctcttgaag atcctcttct cgatcctttc aagttcagca ggaggcattg aatcgaaaga 14760
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cttgagaact tggagtttca caccttcctc aaacatatca gctgctggag ccatgcaaat 14880
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ctcaaggagg tgttccggag ccggtctgat gaacatttcg gcgagttctg ttctggacac 15300
ttttccaatg atacggtttc tgatgttgac actcccatca gcgttccttg agagtccggc 15360
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tgccctcaca tggtgcattg gaagcccacc cgctccaaaa gaacccaata tcttcctctt 15600
cccagcagca atgacaaggt ccgcagacgc aattcccttg gccattgctc cagtgtacag 15660
aggtgctgac acattgtacg tttccatgaa ggacttgtca ccaagatcac ttatggagca 15720
tggtttgata ctgacaatcc ttgaagaagt tgcaggtttg gattcaaact gcaccaaatt 15780
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cacttctgta aataaattta ttaacaaaaa cttgtaaata tgttcaaata aatccataaa 19320
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aggatgaaat aatatgttat tataattttt gcgatttggt ccgttatagg aattgaagtg 29340
tgcttgaggt cggtcgccac cactcccatt tcataatttt acatgtattt gaaaaataaa 29400
aatttatggt attcaattta aacacgtata cttgtaaaga atgatatctt gaaagaaata 29460
tagtttaaat atttattgat aaaataacaa gtcaggtatt atagtccaag caaaaacata 29520
aatttattga tgcaagttta aattcagaaa tatttcaata actgattata tcagctggta 29580
cattgccgta gatgaaagac tgagtgcgat attatggtgt aatacatagg aattcgttta 29640
aacgatctgc gtctaatttt cggtccaact tgcacaggaa agacgtcgac cgcggtagct 29700
cttgcccagc agactgggct tccagtcctt tcgctcgatc gggtccaatg ttgtcctcag 29760
ctgtgaaccg gaagcggacg accaacagtg gaagaactga aaggaacgag ccgtctatac 29820
cttgatgatc ggcctctggt gaagggtatc atcgcagcca agcaagctca tgaaaggctg 29880
atgggggagg tgtataatta tgaggcccac ggcgggctta ttctttaggg aggatctatc 29940
tcgttgctca agtgcatggc gcaaagcagt tattggagtg cggattttcg ttggcatatt 30000
attcgccacg agttagcaga cgaagagacc ttcatgaacg tggccaaggc cagagttaag 30060
cagatgttac gccctgctgc aggcctttct attatccaat agttggttga tctttggaaa 30120
gagcctcggc tgaggcccat actgaaagag atcgatggat atcgatatgc catgttgttt 30180
gctagccaga accagatcac atccgatatg ctattgcagc ttgacgcaga tatggaggat 30240
aagttgattc atgggatcgc tcaggagtag ctcatccatg cacgccgaca agaacagaaa 30300
ttccgtcgag ttaacgcagc cgcttacgac ggattcgaag gtcatccatt cggaatgtat 30360
tagtttgcac cagctccgcg tcacacctgt cttcatttga ataagatgtt agcaattgtt 30420
tttagctttg tcttgttgtg gcagggcggc aagtgcttca gacatcattc tgttttcaaa 30480
ttttatgctg gagaacagct tcttaattcc tttggaaata atagactgcg tcttaaaatt 30540
cagatgtctg gatatagata tgattgtaaa ataacctatt taagtgtcat ttagaacata 30600
agttttatga atgttcttcc attttcgtca tcgaacgaat aagagtaaat acaccttttt 30660
taacattaca aataagttct tatacgttgt ttatacaccg ggaatcattt ccattatttt 30720
cgcgcaaaag tcacggatat tcgtgaaagc gacataaact gcgaaatttg cggggagtgt 30780
cttgagtttg cctcgaggct agcgcatgca catagacaca cacatcatct cattgatgct 30840
tggtaataat tgtcattaga ttgtttttat gcatagatgc actcgaaatc agccaatttt 30900
agacaagtat caaacggatg tgacttcagt acattaaaaa cgtccgcaat gtgttattaa 30960
gttgtctaag cgtcaatttg atttacaatt gaatatatcc tgccccagcc agccaacagc 31020
tcgatttaca attgaatata tcctgccggc cggcccacgc gtgtcgagga attctgatct 31080
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actttcattt tataataacg ctgcggacat ctacattttt gaattgaaaa aaaattggta 31260
attactcttt ctttttctcc atattgacca tcatactcat tgctgatcca tgtagatttc 31320
ccggacatga agccatttac aattgaatat atcctgccgc cgctgccgct ttgcacccgg 31380
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cacatgggac ttttaaacat catccgtcgg atggcgttgc gagagaagca gtcgatccgt 31560
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gcagccctgg ttaaaaacaa ggtttataaa tattggttta aaagcaggtt aaaagacagg 31860
ttagcggtgg ccgaaaaacg ggcggaaacc cttgcaaatg ctggattttc tgcctgtgga 31920
cagcccctca aatgtcaata ggtgcgcccc tcatctgtca gcactctgcc cctcaagtgt 31980
caaggatcgc gcccctcatc tgtcagtagt cgcgcccctc aagtgtcaat accgcagggc 32040
acttatcccc aggcttgtcc acatcatctg tgggaaactc gcgtaaaatc aggcgttttc 32100
gccgatttgc gaggctggcc agctccacgt cgccggccga aatcgagcct gcccctcatc 32160
tgtcaacgcc gcgccgggtg agtcggcccc tcaagtgtca acgtccgccc ctcatctgtc 32220
agtgagggcc aagttttccg cgaggtatcc acaacgccgg cggccgcggt gtctcgcaca 32280
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ctgcttcggg gtcattatag cgattttttc ggtatatcca tcctttttcg cacgatatac 32460
aggattttgc caaagggttc gtgtagactt tccttggtgt atccaacggc gtcagccggg 32520
caggataggt gaagtaggcc cacccgcgag cgggtgttcc ttcttcactg tcccttattc 32580
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tatcaaggtg tactgccttc cagacgaacg aagagcgatt gaggaaaagg cggcggcggc 32760
cggcatgagc ctgtcggcct acctgctggc cgtcggccag ggctacaaaa tcacgggcgt 32820
cgtggactat gagcacgtcc gcgagctggc ccgcatcaat ggcgacctgg gccgcctggg 32880
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aggccgagga atgcctgtcg cgcctacagg cgacggcgat gggcttcacg tccgaccgcg 34080
ttgggcacct ggaatcggtg tcgctgctgc accgcttccg cgtcctggac cgtggcaaga 34140
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tggcatttca ggaacaagcg ggcactgctc gacgcacttg cttcgctcag tatcgctcgg 34560
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taaggctcag attcgacggc ttggagcggc cgacgtgcag gatttccgcg agatccgatt 34680
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cggcgagatc attgggctgt cggtcttcaa acaggaggac ggccccaagg acgctcacaa 34860
ggcgcatctg tccggcgttt tcgtggagcc cgaacagcga ggccgagggg tcgccggtat 34920
gctgctgcgg gcgttgccgg cgggtttatt gctcgtgatg atcgtccgac agattccaac 34980
gggaatctgg tggatgcgca tcttcatcct cggcgcactt aatatttcgc tattctggag 35040
cttgttgttt atttcggtct accgcctgcc gggcggggtc gcggcgacgg taggcgctgt 35100
gcagccgctg atggtcgtgt tcatctctgc cgctctgcta ggtagcccga tacgattgat 35160
ggcggtcctg ggggctattt gcggaactgc gggcgtggcg ctgttggtgt tgacaccaaa 35220
cgcagcgcta gatcctgtcg gcgtcgcagc gggcctggcg ggggcggttt ccatggcgtt 35280
cggaaccgtg ctgacccgca agtggcaacc tcccgtgcct ctgctcacct ttaccgcctg 35340
gcaactggcg gccggaggac ttctgctcgt tccagtagct ttagtgtttg atccgccaat 35400
cccgatgcct acaggaacca atgttctcgg cctggcgtgg ctcggcctga tcggagcggg 35460
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caggagttaa acatcatgag ggaagcggtg atcgccgaag tatcgactca actatcagag 35700
gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc tggccgtaca tttgtacggc 35760
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atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat ttggagaatg gcagcgcaat 36000
gacattcttg caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca ttgatctggc tatcttgctg 36060
acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag cggcggagga actctttgat 36120
ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa ccttaacgct atggaactcg 36180
ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta cgttgtcccg catttggtac 36240
agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg ccgactgggc aatggagcgc 36300
ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt gaagctaggc aggcttatct tggacaagaa 36360
gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg ttcactacgt gaaaggcgag 36420
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gcgcggctta actcaagcgt tagagagctg gggaagacta tgcgcgatct gttgaaggtg 36540
gttctaagcc tcgtcttgcg atggcatttc gatccattcc cattccgcgc tcaagatggc 36600
ttcccctcgg cagttcatca gggctaaatc aatctagccg acttgtccgg tgaaatgggc 36660
tgcactccaa cagaaacaat caaacaaaca tacacagcga cttattcaca cgagctca 36718
<210> 66
<211> 36517
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> plasmid pDAB108209
<400> 66
aattacaacg gtatatatcc tgccagtcag catcatcaca ccaaaagtta ggcccgaata 60
gtttgaaatt agaaagctcg caattgaggt ctacaggcca aattcgctct tagccgtaca 120
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gatgagtttg gtaattacat gagatcgaca gaggaattac gacgttcttg ccatcaaaaa 360
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ccggtcacta attttactca agcgaatcga tttttacttt agtttagcta accgtacgcc 600
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aaacacacac gatgactgtg tatagtatta acatacatca atagcaacac tcatgatcat 780
cgtgctaggc cgggcttgga ctgggtgacc taagtgatta agctaactac tcagaacgca 840
agtgagtctg tcgcaatgac agaggcttga acatcaatga agagatcacc ttgttcgttg 900
tggaactgaa gtgcatgttt gtgctggcta tgtccaccac tctgattgga tctgagggtg 960
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gggagtgcag cttgtcccag cgttctcctc acccagacca acattgcttg aaaggcaaga 1080
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tcaatgcctc tgaacgcagg accatgaaag agagtcttgc catcatagac tgacccttgc 1260
aaagcaggat ctgcatcaag gctcggaggc tgcatggttg cattggcagg tggagcacct 1320
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cagagagagt agccagggaa gagtccaagg caggtctcag caaggctccc aatagcaagg 1560
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ccactaactc tggcaccaag ctgggactct gcatccctaa ctgctttggc aacatctgca 2160
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ccaacggtcc tcgttctgga cagagcatca acatccttcg cttccacgtt cagcatagct 5400
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tccatgtcag actcaatcat gtcagtctca tagccggttt tagctgccaa gacctccatc 5520
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gctatctcag ccttcatggc attgacaacc tcaccgacag ttctggtcct tgagagagca 5700
tccacatcct tagcttccac attgagcatg gcttggactt cactgaggat ttccacacgc 5760
ttgatggaat caattccaag ctccgtctca agctccatgt ctgattctat catgtcagtt 5820
tcgtagccag ttttggcagc aaggacttcc atcacaacag tttctgcctt ttcgagcagc 5880
tcattagaaa cagctggtgc agctgcagct ggagccgctt tagccggtgc aggtgcggca 5940
gctgccggcg ccggagcgga agaaccagcg atttctgcct tcatagcgtt gacaacttca 6000
cccactgttc tcgtcctaga gagagcatca acatctttcg cctcaacgtt aagcatagct 6060
tggacttcag aaagaatttc aaccctcttg atgctgtcaa ttcccaactc agtctcaagc 6120
tccatgtccg cctcaatcat gtctgtttcg tatccagtct tggcagcgag aacctccatc 6180
acaactgtct cagctttctc aagcaactcg ttggacacgg cgggagcagg agcacttgca 6240
acgggagcgg caggggcagc ggctttaaca ggcgccggag cagtctgttg ctgttgctgt 6300
tgctgaaggg aagaagcatc aacacttcca taaccatcca gctcagccag catggacttg 6360
aggatggcac gatgtttctc cacaacagca gtgtcaactg caggcttggc tgaagctgca 6420
gcagtcttgg cttcctcctt ggcagcagca agtttggagt tggcttctgc agctgcacgt 6480
ttggcgtcgt caagctgcct ctgagcgtct tgaagctcct tctgaagcct ttcagcctcc 6540
ctcttggcag cttcgtcaac cacaggttca ggagccttga tgagtggtgc agcacccttg 6600
aggtatgtga cacatcttcc gtcgttcatg gcagcatccc tcactttctt ggtcttgtca 6660
ctgacatagg tggcagctga aagtctgagt gtggttctct ttttcttgat ggcttgcatc 6720
ctcgtggcat caggagcatc ccacttgtca aacccttgaa gattgacacc agccacaacc 6780
agctgaactg cagcatccct caactgtatg tcagagtccg tgccagaagc tgggttcaca 6840
gacactgtga caacagacgg gtcatctttg agggtttcag aaacaagttt gctgagaact 6900
tgtttcggtc caaactcaac aaagattctc gcaccagctt ggtgcatgtt cctcacttgg 6960
gtcaggaact tcacagatga ggtcatgtgt tgagtgagca tctctctggc atccgtcgga 7020
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gcagactcac aagcaagagg cacaactctg aacccttcct tctgcaatct ggcactttca 7200
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tgtccagaga agagtgcagc aacagcacca ttggtggcaa tgcctttggc acggaaagaa 7800
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taggcagtat tcttgactgt ctcattctcc ttgatcgcag cttcaaactc tttcagctga 8040
gcttcacaaa ggctctgcaa cgcagcagga gttgcagcca tcatcaacac cggttgtgga 8100
cgtttgttga gtctgtacgc tgtcgtgtgc tctggttcag cctcttccaa cactgcatgg 8160
tagttggcac ctccaaagcc aaagctggat attccagcac gtctcggaac accaggtgga 8220
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ttcatgccat ccaagttgaa tgtgttggtg catctgccag cagtgacatt cccaaggaat 9000
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tgctcttgca gcctcgctgc catttttggt tgtggatccg ttttgctatt tgtgtatgtt 9600
ttcttgtttt ggtttgagtt taaccatcat tctcttctct ctatttatag agagaagagg 9660
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gcagcatgca tgcatgcatg gccagtcgtg tcatagtgag aagaggagaa agctgaggtg 9780
gcaacgtgta tggccagtgg tgtcatagtg tgaaagctga cgtggcagca tgcatggtga 9840
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ttgcccatcg tcgtctttct catccaagtt cctctttata atatctttta ccaaatcata 9960
ttttaatata aattcatttt atttttaaat aaagtaatat tatatccata aatattaact 10020
ctcatttaac acattttcaa atttaacact tctgtaaata aatttattaa caaaaacttg 10080
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gagatagcac tcaccccaac agaacctgcc aagctccaaa cagctcctgc gtggtctctg 11760
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cagcccaagt tctggcatta ctgagtagtt agcttaatca cttaggtcac ctcgagtatc 11880
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tcataaaaat tacaaaaaaa ttttatttgc ctcaattatt ttaggattgg tattaaggac 12000
gcttaaatta tttgtcgggt cactacgcat cattgtgatt gagaagatca gcgatacgaa 12060
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aattgatgaa acaatacaaa gacagataaa gccacgcaca tttaggatat tggccgagat 12180
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gccaatcctt ctttggaagt tgacaattta aaaattcgaa gccagattta ctcctaatta 13740
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ggttgccatg acactctgtg gtcttttggt tcatgcatgg atcttgcgca agaaaaagac 11280
aaagaacaaa gaaaaaagac aaaacagaga gacaaaacgc aatcacacaa ccaactcaaa 11340
ttagtcactg gctgatcaag atcgccgcgt ccatgtatgt ctaaatgcca tgcaaagcaa 11400
cacgtgctta acatgcactt taaatggctc acccatctca acccacacac aaacacattg 11460
cctttttctt catcatcacc acaaccacct gtatatattc attctcttcc gccacctcaa 11520
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tgcatgttcc aaccaccttc tctcttatat aatacctata aatacctcta atatcactca 11640
cttctttcat catccatcca tccagagtac tactactcta ctactataat accccaaccc 11700
aactcatatt caatactact ctaggatcca caaccaaaaa tggctgcaag gaacgtgagt 11760
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gatgagagat ggctgtgctg gcttcttcac aaatgaggag cttgatgcgg gaaagggtgt 19740
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atggtgatga gattcatgct gtgattcgtg gttgtgcaag ctcaagtgat ggcaaagcag 1800
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gtgcctgcgt tgaccctgcc actgtcactt tggttgaggg tcatgggact ggcactccag 1920
ttggagatag gattgagttg actgcgttga ggaacttgtt tgacaaagcg tatggtgaag 1980
ggaacacaga gaaagttgca gttggaagta tcaagtccag tattggtcat ttgaaggctg 2040
ttgctggtct tgctggaatg atcaaggtca tcatggctct caaacacaag actttgcctg 2100
gaacgatcaa tgtggacaat ccacccaatc tctatgacaa cactcccatc aatgagtcat 2160
ccctctacat caacacgatg aacagaccct ggttccctcc acctggtgtt ccgagacgtg 2220
ctggaatatc cagctttggc tttggaggtg ccaactacca tgcagtgttg gaagaggctg 2280
aaccagagca cacgacagcg tacagactca acaaacgtcc acaaccggtg ttgatgatgg 2340
ctgcaactcc tgctgcgttg cagagccttt gtgaagctca gctgaaagag tttgaagctg 2400
cgatcaagga gaatgagaca gtcaagaata ctgcctacat caagtgtgtc aagtttggag 2460
aacagttcaa gttccctggg agcatacctg cgaccaatgc gagactggga ttcttggtca 2520
aagatgcgga ggatgcgtgc tccacgcttc gtgctatatg tgctcagttt gccaaagatg 2580
tgaccaaaga agcgtggagg cttccgagag aaggagtttc tttccgtgcc aaaggcattg 2640
ccaccaatgg tgctgttgct gcactcttct ctggacaagg tgctcagtac acacacatgt 2700
tcagtgaagt tgcgatgaac tggcctcagt tcagacagtc cattgctgca atggacgctg 2760
cacagtccaa ggttgctgga agtgacaaag actttgaaag agtctctcaa gtcctgtacc 2820
caaggaaacc gtacgaacgt gagccagaac aagatcacaa gaaaatctca ctcacagcat 2880
acagccagcc gtcaaccctg gcatgtgctc ttggtgcctt tgagattttc aaggaagctg 2940
gattcactcc agactttgca gctggacaca gcttgggtga gtttgctgcg ctctatgcag 3000
ctggttgtgt tgacagagat gagttgtttg aacttgtttg cagaagggca aggatcatgg 3060
gaggcaaaga tgcacctgcc acacccaaag gttgcatggc agctgtcata ggacccaacg 3120
cagagaacat caaggttcaa gctgccaacg tctggcttgg aaactcaaac tctccgtctc 3180
agactgtcat tactgggtct gttgaaggga ttcaagctga aagtgccaga ttgcagaagg 3240
aagggttcag agttgtgcct cttgcttgtg agtctgcctt ccattctcca cagatggaaa 3300
atgccagctc agctttcaaa gatgtcatat ccaaggtttc cttccgtaca cccaaagcag 3360
aaacaaagct cttcagcaat gtttctggag agacctatcc gacggatgcc agagagatgc 3420
tcactcaaca catgacctca tctgtgaagt tcctgaccca agtgaggaac atgcaccaag 3480
ctggtgcgag aatctttgtt gagtttggac cgaaacaagt tctcagcaaa cttgtttctg 3540
aaaccctcaa agatgacccg tctgttgtca cagtgtctgt gaacccagct tctggcacgg 3600
actctgacat acagttgagg gatgctgcag ttcagctggt tgtggctggt gtcaatcttc 3660
aagggtttga caagtgggat gctcctgatg ccacgaggat gcaagccatc aagaaaaaga 3720
gaaccacact cagactttca gctgccacct atgtcagtga caagaccaag aaagtgaggg 3780
atgctgccat gaacgacgga agatgtgtca catacctcaa gggtgctgca ccactcatca 3840
aggctcctga acctgtggtt gacgaagctg ccaagaggga ggctgaaagg cttcagaagg 3900
agcttcaaga cgctcagagg cagcttgacg acgccaaacg tgcagctgca gaagccaact 3960
ccaaacttgc tgctgccaag gaggaagcca agactgctgc agcttcagcc aagcctgcag 4020
ttgacactgc tgttgtggag aaacatcgtg ccatcctcaa gtccatgctg gctgagctgg 4080
atggttatgg aagtgttgat gcttcttccc ttcagcaaca gcaacagcaa cagactgctc 4140
cggcgcctgt taaagccgct gcccctgccg ctcccgttgc aagtgctcct gctcccgccg 4200
tgtccaacga gttgcttgag aaagctgaga cagttgtgat ggaggttctc gctgccaaga 4260
ctggatacga aacagacatg attgaggcgg acatggagct tgagactgag ttgggaattg 4320
acagcatcaa gagggttgaa attctttctg aagtccaagc tatgcttaac gttgaggcga 4380
aagatgttga tgctctctct aggacgagaa cagtgggtga agttgtcaac gctatgaagg 4440
cagaaatcgc tggttcttcc gctccggcgc cggcagctgc cgcacctgca ccggctaaag 4500
cggctccagc tgcagctgca ccagctgttt ctaatgagct gctcgaaaag gcagaaactg 4560
ttgtgatgga agtccttgct gccaaaactg gctacgaaac tgacatgata gaatcagaca 4620
tggagcttga gacggagctt ggaattgatt ccatcaagcg tgtggaaatc ctcagtgaag 4680
tccaagccat gctcaatgtg gaagctaagg atgtggatgc tctctcaagg accagaactg 4740
tcggtgaggt tgtcaatgcc atgaaggctg agatagctgg aggctccgct cctgcgccgg 4800
ccgctgccgc tcctggtccc gctgccgcgg ctccagctcc agctgcagcc gctccggccg 4860
tctcaaacga actccttgaa aaagctgaga ccgtcgtgat ggaggtcttg gcagctaaaa 4920
ccggctatga gactgacatg attgagtctg acatggaatt ggagacagaa cttgggatag 4980
acagcatcaa acgtgttgaa atcctcagtg aggtccaagc tatgctgaac gtggaagcga 5040
aggatgttga tgctctgtcc agaacgagga ccgttggtga ggttgtggat gccatgaagg 5100
ctgaaattgc tggagggtct gcgcccgcgc cagctgcagc cgctcctgca cccgcagccg 5160
cggcacctgc tccagctgca cctgcacctg ccgtttcttc agaactcttg gagaaggctg 5220
agacggttgt gatggaggtt ttggctgcaa agactggcta tgagaccgac atgattgaat 5280
ctgatatgga attggagaca gagcttggga tcgattccat caaaagagtg gagatcctga 5340
gtgaagtcca agccatgctc aatgttgaag ctaaggatgt tgatgcactt tcaagaacaa 5400
ggacagtggg tgaggttgtg gatgccatga aggcggagat tgctggaggg agcgcgcctg 5460
cgccagctgc cgcggcacct gcaccggcag ccgcagctcc agctccagct gcaccagcac 5520
cggccgcgcc cgcgccagct gtttcatccg aactcctgga aaaggccgag acggttgtga 5580
tggaggtgct cgcagctaag actggttacg agaccgacat gattgaaagt gacatggagc 5640
ttgaaaccga gttgggaata gatagcatca aacgtgttga aatcttgtct gaggtccaag 5700
ctatgttgaa cgtggaggca aaagatgtcg atgcgctttc aagaaccaga acagtcggtg 5760
aggtcgtgga cgccatgaag gctgaaattg ccggaagctc tgctagtgcg ccagctgcag 5820
ccgcacctgc acctgctgcc gcggcacctg ctccagctgc agccgctcct gccgtcagca 5880
atgagttgct ggagaaagcc gaaacagttg tgatggaagt ccttgctgca aaaactggtt 5940
acgaaacgga catgattgag tcagacatgg aattggagac cgaacttgga atagattcca 6000
tcaagagagt ggagatcctc tctgaggtgc aagccatgct caacgttgag gctaaagatg 6060
ttgatgcact cagtaggaca agaactgtgg gggaagttgt cgatgcgatg aaggctgaga 6120
ttgctggagg ctctgctcct gcgccggcag ctgccgcacc tgcacccgca gccgcggcac 6180
cagctgtcag caacgaattg cttgagaagg ctgaaacagt tgtcatggaa gtgctggctg 6240
caaaaaccgg ctatgagact gacatgattg agtctgacat ggaacttgag acggaattgg 6300
gcattgacag catcaagcgt gttgagatcc tcagtgaagt ccaagcaatg ctcaatgtgg 6360
aggctaagga tgtggatgcc ctctcaagga ccagaacagt tggtgaggtc gttgatgcga 6420
tgaaggcgga gatcgctgga agttccgcgc ctgcgccagc tgcagccgct cctgcacccg 6480
cagccgcggc accggctcca gctgcagccg caccggccgt ctcctcagaa ctcctggaaa 6540
aggctgagac agttgtgatg gaagtccttg ctgcgaaaac tggctatgag accgacatga 6600
ttgaatctga catggaactg gagaccgagc ttggaattga ctccatcaaa cgtgttgaaa 6660
tcctctctga ggttcaagcg atgttgaatg tggaggccaa agatgttgat gctctttcca 6720
gaacaaggac ggtgggagag gtggttgatg ccatgaaggc tgagatagct gggggttctg 6780
ctcctgcgcc agctgcagcc gctcctgctc ccgctgccgc ggcaccagct gtcagcaacg 6840
aactccttga aaaagctgaa actgttgtga tggaggtttt ggctgcaaag actggatacg 6900
agactgacat gatagagtca gacatggagt tggaaacaga gcttgggatt gatagcatca 6960
agcgtgtgga aatcctttct gaggttcaag ccatgctgaa cgttgaggcc aaagatgtcg 7020
atgctttgtc aaggaccaga acggttggag aagtggtcga tgccatgaag gctgagatag 7080
ctggtggatc agcccctgct ccggctgcag ccgctcctgc aagtgccggt gctgcaccag 7140
ctgtgaagat tgattcagtt catggtgctg actgtgacga tttgtcactg atgcacgcaa 7200
aggtggttga catcagaagg ccagatgaac tgattctgga aagaccggag aaccgtccag 7260
ttcttgtcgt tgacgatggc tcagagttga cacttgctct tgtgagggtg ttgggagcct 7320
gtgcagttgt cttgaccttt gagggattgc agttggctca gagagctggt gcagctgcca 7380
ttcgtcatgt tctggctaag gacctttcag cagaatcagc tgagaaggcc atcaaagagg 7440
ctgagcaaag atttggagcg ttgggaggct tcataagcca gcaagcagaa aggtttgaac 7500
cagctgagat actgggtttc acactcatgt gtgcgaagtt tgccaaagcc tctctctgca 7560
ctgctgtggc tggaggtcgt cctgccttca tcggtgtggc taggcttgac ggcagacttg 7620
gattcacctc tcaaggcact tctgacgcac tcaagagagc acagcgtgga gcgatctttg 7680
gactctgcaa gacaataggg ttggagtggt cagaatctga tgtgttcagc cgtggtgtgg 7740
acattgctca agggatgcac ccagaagatg ctgcagttgc catagttagg gagatggcgt 7800
gtgctgacat cagaatcaga gaggttggga ttggagcaaa ccagcaaaga tgcacaatca 7860
gagctgccaa gttggagact gggaaccctc agagacagat agcgaaagac gatgtgcttc 7920
tggtttctgg aggtgctcgt gggatcacac ctctttgcat ccgtgagatc acgcgtcaga 7980
ttgctggagg caagtacatt ctgttgggtc gtagcaaagt ttctgcgtct gaaccagcat 8040
ggtgtgctgg catcactgat gagaaggctg tgcagaaagc tgccacccaa gagttgaaga 8100
gggccttcag tgctggtgaa ggacccaaac ccactccaag ggctgtcacg aaacttgtgg 8160
gatctgttct tggtgctcgt gaagtgagaa gctccattgc tgccattgaa gctctgggtg 8220
gcaaagcgat ctacagctct tgtgatgtga actctgctgc agatgttgcc aaagcagtta 8280
gggatgcaga gtcccagctt ggtgccagag ttagtggaat cgttcacgct tctggtgtgc 8340
tccgtgatcg tctcatagag aagaaactcc ctgacgagtt tgatgctgtc tttgggacca 8400
aagtcactgg gttggagaat cttctggctg cagttgatcg tgccaacctc aaacacatgg 8460
ttctcttcag ctcccttgct ggtttccacg gcaatgttgg tcagtctgac tatgcgatgg 8520
caaacgaagc tctcaacaag atgggtttgg aacttgcgaa ggatgtcagt gtcaagtcca 8580
tctgctttgg tccctgggat ggtgggatgg tgacacctca actcaagaaa cagtttcaag 8640
aaatgggagt tcagatcatt cctcgtgaag gaggtgctga tacagttgcg aggattgtgt 8700
tgggatcaag tcctgctgag atccttgttg gaaactggag gacaccatcc aagaaagttg 8760
gaagtgacac gatcaccctg catagaaaga tcagtgccaa gtccaatccc ttcttggagg 8820
atcatgtcat acaaggcaga agggtgttgc caatgaccct tgctattggg agccttgctg 8880
agacctgcct tggactcttc cctggctact ctctctgggc catagatgac gcacagctct 8940
tcaaaggtgt cactgttgat ggagacgtca actgtgaagt gaccctcaca ccgtccactg 9000
ctccgagtgg gagggtgaat gtccaagcga cgctcaagac gttctcaagt ggaaaacttg 9060
ttccagccta cagagctgtc atagtgttgt ccaaccaagg tgctccacct gccaatgcaa 9120
ccatgcagcc tccgagcctt gatgcagatc ctgctttgca agggtcagtc tatgatggca 9180
agactctctt tcatggtcct gcgttcagag gcattgatga cgttctcagc tgcaccaaga 9240
gccagcttgt tgccaagtgt tctgctgttc ctggatcaga tgcagccaga ggagagtttg 9300
caactgacac tgatgcacat gatccctttg tcaatgatct tgcctttcaa gcaatgttgg 9360
tctgggtgag gagaacgctg ggacaagctg cactcccgaa ctccattcag aggatagtcc 9420
aacacagacc ggtcccacaa gacaaaccct tctacatcac cctcagatcc aatcagagtg 9480
gtggacatag ccagcacaaa catgcacttc agttccacaa cgaacaaggt gatctcttca 9540
ttgatgttca agcctctgtc attgcgacag actcacttgc gttctgagta gttagcttaa 9600
tcacttaggt cacccagtcc aagcccggcc tagcacgatg atcatgagtg ttgctattga 9660
tgtatgttaa tactatacac agtcatcgtg tgtgttttat aaaactgtaa gcttaggatg 9720
tttgaggcta atgtaattag cactacaccg taataaatga gaggtttact ttatgtttta 9780
ataatgttct tacccttgct gctctctaaa ctgtaatggc gtacggttag ctaaactaaa 9840
gtaaaaatcg attcgcttga gtaaaattag tgaccgggaa agatcatcga ctactactgc 9900
tcagagatgt aatcggtaat taagacttca agctcaataa ttaattagga gtaaatctgg 9960
cttcgaattt ttaaattgtc aacttccaaa gaaggattgg caagactcaa tctcaattgc 10020
ccaacaaaca tatggctctt tacaaatttg gaatctcttt ttgatggcaa gaacgtcgta 10080
attcctctgt cgatctcatg taattaccaa actcatctac ttattacttt ctttatatgc 10140
acttactgat gcggccgctt aattaagatg agtgatactc aggactcagg actcactctg 10200
ctgatcacta gtggtcgcag cgtgtgcgtg tccgtcgtac gttctggccg gccgggcctt 10260
gggcgcgcga tcagaagcgt tgcgttggcg tgtgtgtgct tctggtttgc tttaatttta 10320
ccaagtttgt ttcaaggtgg atcgcgtggt caaggcccgt gtgctttaaa gacccaccgg 10380
cactggcagt gagtgttgct gcttgtgtag gctttggtac gtatgggctt tatttgcttc 10440
tggatgttgt gtactacttg ggtttgttga attattatga gcagttgcgt attgtaattc 10500
agctgggcta cctggacatt gttatgtatt aataaatgct ttgctttctt ctaaagatct 10560
ttaagtgctg tcgacacaac tttgtataca aaagttgtct agacctaggc tcagcaactc 10620
atccagtcaa gttcgagtca gtgagttggg cggccgcagc ttatagtaaa gatttttttg 10680
ttaataaaat gaaagttaat atttatggat ttatttgaac atatttacaa gtttttgtta 10740
ataaatttat ttacagaagt gttaaatttg aaaatgtgtt aaatgagagt taatatttat 10800
ggatataata ttactttatt taaaaataaa atgaatttat attaaaatat gatttggtaa 10860
aagatattat aaagaggaac ttggatgaga aagacgacga tgggcaaaag ttgcatggca 10920
caccgctttt gttcagtaac atctgcactg tggcgccttt ttcacactca ccatgcatgc 10980
tgccacgtca gctttcacac tatgacacca ctggccatac acgttgccac ctcagctttc 11040
tcctcttctc actatgacac gactggccat gcatgcatgc atgctgccac ctcagctccc 11100
gcctcttcac ccgtgtcttt ctctcatgtc gcagtgctgc gtgccaacct cttctctcta 11160
taaatagaga gaagagaatg atggttaaac tcaaaccaaa acaagaaaac atacacaaat 11220
agcaaaacgg atccacaacc aaaaatggct gcaaggaacg tgagtgcggc tcatgagatg 11280
catgacgaga agaggatagc tgttgtgggc atggctgttc agtatgctgg atgcaaaacg 11340
aaagacgagt tctgggaagt tctcatgaat ggaaaagttg agagcaaagt gatcagcgac 11400
aaacgtcttg gttcaaatta ccgtgctgaa cactacaaag ctgaaaggag caagtatgct 11460
gacaccttct gcaatgagac atatggaact cttgatgaga acgaaataga caatgagcat 11520
gaactccttt tgaaccttgc caaacaagcc ttggctgaaa catctgtcaa agattcaaca 11580
agatgtggca tagtttctgg atgcctcagc ttcccgatgg acaacctcca aggtgaactc 11640
ttgaatgtgt accagaacca tgttgagaag aaacttggtg ccagagtttt caaagatgcc 11700
tctcactggt cagaaagaga acagtccaac aaaccagagg ctggtgacag aagaatcttc 11760
atggaccctg cttcctttgt tgctgaggaa ctcaatcttg gcgctctcca ctactctgtt 11820
gatgctgcct gtgccactgc gctctatgtg ctcagactgg cgcaagatca cttggtctct 11880
ggtgcagctg atgtgatgct ttgtggtgca acatgcctgc cggagccgtt tttcatactc 11940
tctgggttct caaccttcca agccatgcct gttggaacgg gtcagaatgt gtccatgccg 12000
ctgcacaaag attctcaagg attgacccct ggtgaaggag gttccatcat ggtcctcaaa 12060
cgtttggatg acgcaatcag agatggagat cacatctatg gaacactttt gggagccaat 12120
gtcagcaaca gtggcactgg tctgccactt aaaccccttt tgccgtcaga gaaaaagtgc 12180
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gaaggcaaag tcccacgttt tggaaccaca aaagggaact ttggacacac attggtggca 12360
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actccgggaa tagatgacga aacgaagatg gaccctctgg ttgtctctgg tgaggccatt 12480
ccctggccag aaacgaatgg agaaccgaag cgtgctggtc tctcagcgtt tggatttggt 12540
gggaccaatg ctcatgctgt ctttgaggaa catgacccaa gcaatgctgc atgcactggc 12600
catgactcca tttctgctct ctctgcacgt tgtggtggtg agtcaaacat gagaatagca 12660
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atctacactg gtgctcatgg tgctatacca ctcccagaaa agagatggag attcctgggg 12780
aaagacaagg acttccttga tctttgtgga gtcaaagcaa caccgcatgg ctgttacatt 12840
gaagatgttg aagttgattt ccagaggctg aggactccaa tgactcctga agatatgctc 12900
ttgcctcaac agcttctggc tgtcaccaca attgataggg ccatattgga ctctggcatg 12960
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caccgtgcaa gggttgctct caaggagaga gtgaggcctg aagccagcaa gaaactcaat 13080
gacatgatgc agtacatcaa tgattgtggg acaagcactt cttacaccag ctacataggc 13140
aacttggttg caacaagggt cagttcacaa tggggcttca cgggaccttc cttcacaatc 13200
acagaaggca acaattctgt gtacagatgt gctgaacttg gcaaatacct cttggaaacg 13260
ggagaggttg atggggttgt ggttgcgggt gttgatctct gtgggagtgc tgagaacctt 13320
tacgtcaagt caaggcgttt caaggtgtct acatctgaca ccccgagagc cagctttgat 13380
gcagctgctg atggttactt tgttggagag ggctgtggtg catttgtgct caagcgtgag 13440
acaagctgca ccaaggatga cagaatctat gcttgcatgg atgccatagt tcctggaaat 13500
gttccatctg catgtttgag agaggcattg gatcaagcca gagtcaagcc tggagacatc 13560
gagatgttgg agctttctgc tgattcagcg aggcatttga aggacccgtc tgttctccca 13620
aaggaactca ctgctgagga agagattggc ggacttcaga cgattcttcg tgacgatgac 13680
aagctcccaa ggaatgttgc aactggaagt gtcaaggcca ctgttggtga cactggttat 13740
gcttctggtg ctgccagttt gattaaggct gcgctttgca tctacaaccg ttacctgccc 13800
agcaatggag atgactggga tgaacctgca cctgaagcac cctgggacag cacactcttt 13860
gcgtgccaga cctcaagagc ttggttgaag aaccctggtg agagacgtta tgcggctgtt 13920
tccggagtca gtgaaaccag aagttgctac agtgtgctgc tttctgaagc agagggacac 13980
tacgagagag agaacagaat cagtttggat gaggaagcac ccaagctcat tgtgttgaga 14040
gcagactccc atgaagagat tcttggaaga ttggacaaga taagggaaag gttcttgcag 14100
cccacgggtg ctgcacccag agagtctgaa ttgaaggcgc aagcccgtag gatctttctt 14160
gaactccttg gtgagaccct tgcccaagat gcagcttcat ctggaagtca gaagcccctt 14220
gctctcagct tggtctccac tccatccaag ctccagagag aggtggaact tgcggcaaaa 14280
ggcattccga gatgtctcaa gatgagacgt gattggagtt cccctgctgg aagcagatat 14340
gcgcctgagc ctttggccag tgacagagtt gccttcatgt atggagaagg aaggagccct 14400
tactatggca tcacacaaga cattcatagg atttggcctg aacttcatga ggtcatcaat 14460
gagaaaacaa accgtctctg ggctgaaggt gacagatggg tcatgccaag ggccagcttc 14520
aagagtgagc ttgagtcaca acagcaagag tttgacagaa acatgattga aatgttccgt 14580
cttggaatcc tcacctcaat tgccttcaca aacctggcga gagatgttct caacatcacg 14640
cccaaagcag cctttggact cagtttggga gagatttcca tgatctttgc tttctccaag 14700
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ccaaaagatg agttctggca aggttacata gtgaggggaa cgaaacaaga catagaagca 14880
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ctcatcagtg gaaagcctga tgcatgcaaa gctgcgattg ctcgtcttgg tggcaacatc 15000
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tggactacca taaaccagaa gaggcttgtg ccaagagcca cgggtgccaa agatgaatgg 15180
gctccttcat cctttgggga gtatgctgga cagctctatg agaaacaagc caacttccct 15240
cagatagttg aaaccatcta caagcagaac tatgatgtgt ttgttgaagt tgggccaaac 15300
aatcacagaa gcacagcagt gagaaccacg cttggaccac agagaaacca ccttgctggt 15360
gccatagaca agcagaacga ggatgcttgg acgacaatag tcaagctcgt ggcttcattg 15420
aaggctcacc ttgttcctgg agtgaccatc agtccgctct accactccaa gctcgttgca 15480
gaggctgagg cttgttatgc tgcgctctgt aaaggtgaga aacccaagaa aaacaagttt 15540
gtgagaaaga ttcagttgaa tggcagattc aacagcaagg cagaccccat ctcctcagca 15600
gaccttgcat ccttcccacc tgcggaccct gcgattgaag ctgccatctc ttcaaggatc 15660
atgaagcctg tggctccgaa attctatgcg cgtctcaaca ttgatgagca agatgagacc 15720
agagatccga tcttgaacaa ggacaatgcg ccttccagct ccagctcttc cagcagttcc 15780
tcttccagca gttcatctcc gtctcctgct ccttcagctc cagttcagaa gaaagctgcc 15840
ccagctgcgg agacaaaagc tgttgccagt gctgatgcac ttcgtagtgc cctgcttgat 15900
cttgactcca tgcttgcgct cagctctgca agtgcttctg gcaaccttgt tgagactgcg 15960
ccatctgatg ccagtgtcat tgtccctccg tgcaacattg ctgatcttgg cagcagagct 16020
ttcatgaaaa cttatggtgt ttctgcgcct ctgtacaccg gtgcaatggc caagggaatt 16080
gcctctgcgg acttggtgat cgcagctgga aggcaaggaa tccttgcgtc atttggtgct 16140
ggaggccttc caatgcaagt tgtgcgtgag tccattgaaa agattcaagc tgccctgccc 16200
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aatgttgatc tcttcttgga aaagggtgtc acttttgttg aggcttcagc cttcatgacg 16320
ttgacaccgc aagttgtcag atacagagcg gctgggttga cgaggaatgc agatgggtca 16380
gtcaacataa ggaacagaat cattgggaaa gtctccagaa ctgagctggc tgaaatgttc 16440
atgcgtcctg cacctgagca tcttttgcag aagctcattg cttctgggga gatcaatcaa 16500
gaacaagctg agttggccag acgtgttcct gtggctgatg acattgcggt tgaagctgat 16560
tctggtggac acactgacaa ccgtccaatc catgtcattc tgcctctgat tatcaacctg 16620
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gggggtggca ttgggtgtcc ccaagctgcg ctggcaactt tcaacatggg tgcctctttc 16740
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aaactctatg agttgttctg caagtatgat tcttttgagt ccatgcctcc agcagagctt 16980
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ttcaatgatt tcatcaaagg aacttacctt gatccggcag tggcaaatga gtacccgtgt 17280
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ctgagaaatg caaggctttc agatggtgca gctgcacttg tggcgagcat tgatgacaca 17400
tatgtccctg ctgagaagct gtgagtagtt agcttaatca cttaggtcac ccagtccaag 17460
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catcgtgtgt gttttataaa actgtaagct taggatgttt gaggctaatg taattagcac 17580
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gacttcaagc tcaataatta attaggagta aatctggctt cgaattttta aattgtcaac 17820
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aaatttggaa tctctttttg atggcaagaa cgtcgtaatt cctctgtcga tctcatgtaa 17940
ttaccaaact catctactta ttactttctt tatatgcact tactgatgcg gccgcttaat 18000
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tttacagaag tgttaaattt gaaaatgtgt taaatgagag ttaatattta tggatataat 18300
attactttat ttaaaaataa aatgaattta tattaaaata tgatttggta aaagatatta 18360
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cagtgcgatt tgatgctgat atcatacatg ggaattgatt tccagaacca aggtgacaga 19140
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gacaaagatg acattctctt taggaacctt gatgcaagtg ctgaaatggt gaggccagat 20820
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ggaaagatgg ggattcacag attcacgttt gagttgtctg ttgatggcgt ggttttctac 20940
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cctgaaaatg gaggctacgt tgacatagtg gcagatggag cactttgggt tgatggtctc 21540
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ccggatgttc aacaacagcc acccagcgca aaagcggacc ctgggaaaac tggagttgca 21660
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gtcacacctg tcttcatttg aataagatgt tagcaattgt ttttagcttt gtcttgttgt 29220
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<210> 69
<211> 22042
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> plasmid pDAB108224
<400> 69
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tgtgatcttg ttctggctca cgttcgtacg gtttccttgg gtacaggact tgagagactc 7620
tttcaaagtc tttgtcactt ccagcaacct tggactgtgc agcgtccatt gcagcaatgg 7680
actgtctgaa ctgaggccag ttcatcgcaa cttcactgaa catgtgtgtg tactgagcac 7740
cttgtccaga gaagagtgca gcaacagcac cattggtggc aatgcctttg gcacggaaag 7800
aaactccttc tctcggaagc ctccacgctt ctttggtcac atctttggca aactgagcac 7860
atatagcacg aagcgtggag cacgcatcct ccgcatcttt gaccaagaat cccagtctcg 7920
cattggtcgc aggtatgctc ccagggaact tgaactgttc tccaaacttg acacacttga 7980
tgtaggcagt attcttgact gtctcattct ccttgatcgc agcttcaaac tctttcagct 8040
gagcttcaca aaggctctgc aacgcagcag gagttgcagc catcatcaac accggttgtg 8100
gacgtttgtt gagtctgtac gctgtcgtgt gctctggttc agcctcttcc aacactgcat 8160
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gagggaacca gggtctgttc atcgtgttga tgtagaggga tgactcattg atgggagtgt 8280
tgtcatagag attgggtgga ttgtccacat tgatcgttcc aggcaaagtc ttgtgtttga 8340
gagccatgat gaccttgatc attccagcaa gaccagcaac agccttcaaa tgaccaatac 8400
tggacttgat acttccaact gcaactttct ctgtgttccc ttcaccatac gctttgtcaa 8460
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cctcaaccaa agtgacagtg gcagggtcaa cgcaggcacg attgtatgca cgtctcaagg 8580
cttcctcttg accactgatt gtgggagtgt agatgccagc tgctttgcca tcacttgagc 8640
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gtcacctcga gtatcaaaat ctatttagaa atacacaata ttttgttgca ggcttgctgg 13140
agaatcgatc tgctatcata aaaattacaa aaaaatttta tttgcctcaa ttattttagg 13200
attggtatta aggacgctta aattatttgt cgggtcacta cgcatcattg tgattgagaa 13260
gatcagcgat acgaaatatt cgtagtacta tcgataattt atttgaaaat tcataagaaa 13320
agcaaacgtt acatgaattg atgaaacaat acaaagacag ataaagccac gcacatttag 13380
gatattggcc gagattactg aatattgagt aagatcacgg aatttctgac aggagcatgt 13440
cttcaattca gcccaaatgg cagttgaaat actcaaaccg ccccatatgc aggagcggat 13500
cattcattgt ttgtttggtt gcctttgcca acatgggagt ccaaggttgg cgcgccgaat 13560
tcgcggccgc ttaattaact actgtcactg aggccgtaga cgagtacgga ctgatctaac 13620
tagtgctagc ctcgaggtcg acacccagct ttcttgtaca aagtggttgc ggccgcttaa 13680
ttaaatttaa attcaattaa tgcaatcttg attttcaaca acgaaggtaa tggcgtaaaa 13740
gaaaaaatgt atgttattgt attgatcttt catgatgttg aagcgtgcca taatatgatg 13800
atgtataatt aaaatattaa ctgtcgcatt ttattgaaat ggcactgtta tttcaaccat 13860
atctttgatt ctgttacatg acacgactgc aagaagtaaa taatagacgc cgttgttaaa 13920
gaattgctat catatgtgcc taactagagg gaatttgagc gtcagaccta atcaaatatt 13980
acaaaatatc tcactctgtc gccagcaatg gtgtaatcag cgcagacaaa tggcgtaaag 14040
atcgcggaaa aacctccccg agtggcatga tagctgcctc tgtattgctg atttagtcag 14100
ccttatttga cttaagggtg ccctcgttag tgacaaattg ctttcaagga gacagccatg 14160
ccccacactt tgttgaaaaa caaattgcct ttggggagac ggtaaagcca gttgctcttc 14220
aataaggaat gtcgaggagg caatgtaacc gcctctggta gtacacttct ctaatccaaa 14280
aatcaatttg tattcaagat accgcaaaaa acttatggtt taaaccctgc aggactagtc 14340
cagaaggtaa ttatccaaga tgtagcatca agaatccaat gtttacggga aaaactatgg 14400
aagtattatg taagctcagc aagaagcaga tcaatatgcg gcacatatgc aacctatgtt 14460
caaaaatgaa gaatgtacag atacaagatc ctatactgcc agaatacgaa gaagaatacg 14520
tagaaattga aaaagaagaa ccaggcgaag aaaagaatct tgaagacgta agcactgacg 14580
acaacaatga aaagaagaag ataaggtcgg tgattgtgaa agagacatag aggacacatg 14640
taaggtggaa aatgtaaggg cggaaagtaa ccttatcaca aaggaatctt atcccccact 14700
acttatcctt ttatattttt ccgtgtcatt tttgcccttg agttttccta tataaggaac 14760
caagttcggc atttgtgaaa acaagaaaaa atttggtgta agctattttc tttgaagtac 14820
tgaggataca acttcagaga aatttgtaag tttgtaggta ccagatctgg atcccaaacc 14880
atgtctccgg agaggagacc agttgagatt aggccagcta cagcagctga tatggccgcg 14940
gtttgtgata tcgttaacca ttacattgag acgtctacag tgaactttag gacagagcca 15000
caaacaccac aagagtggat tgatgatcta gagaggttgc aagatagata cccttggttg 15060
gttgctgagg ttgagggtgt tgtggctggt attgcttacg ctgggccctg gaaggctagg 15120
aacgcttacg attggacagt tgagagtact gtttacgtgt cacataggca tcaaaggttg 15180
ggcctaggat ctacattgta cacacatttg cttaagtcta tggaggcgca aggttttaag 15240
tctgtggttg ctgttatagg ccttccaaac gatccatctg ttaggttgca tgaggctttg 15300
ggatacacag cccggggtac attgcgcgca gctggataca agcatggtgg atggcatgat 15360
gttggttttt ggcaaaggga ttttgagttg ccagctcctc caaggccagt taggccagtt 15420
acccaaatct gagtagttag cttaatcacc tagagctcga tcggcggcaa tagcttctta 15480
gcgccatccc gggttgatcc tatctgtgtt gaaatagttg cggtgggcaa ggctctcttt 15540
cagaaagaca ggcggccaaa ggaacccaag gtgaggtggg ctatggctct cagttccttg 15600
tggaagcgct tggtctaagg tgcagaggtg ttagcgggat gaagcaaaag tgtccgattg 15660
taacaagata tgttgatcct acgtaaggat attaaagtat gtattcatca ctaatataat 15720
cagtgtattc caatatgtac tacgatttcc aatgtcttta ttgtcgccgt atgtaatcgg 15780
cgtcacaaaa taatccccgg tgactttctt ttaatccagg atgaaataat atgttattat 15840
aatttttgcg atttggtccg ttataggaat tgaagtgtgc ttgaggtcgg tcgccaccac 15900
tcccatttca taattttaca tgtatttgaa aaataaaaat ttatggtatt caatttaaac 15960
acgtatactt gtaaagaatg atatcttgaa agaaatatag tttaaatatt tattgataaa 16020
ataacaagtc aggtattata gtccaagcaa aaacataaat ttattgatgc aagtttaaat 16080
tcagaaatat ttcaataact gattatatca gctggtacat tgccgtagat gaaagactga 16140
gtgcgatatt atggtgtaat acataggaat tcgtttaaac gatctgcgtc taattttcgg 16200
tccaacttgc acaggaaaga cgtcgaccgc ggtagctctt gcccagcaga ctgggcttcc 16260
agtcctttcg ctcgatcggg tccaatgttg tcctcagctg tgaaccggaa gcggacgacc 16320
aacagtggaa gaactgaaag gaacgagccg tctatacctt gatgatcggc ctctggtgaa 16380
gggtatcatc gcagccaagc aagctcatga aaggctgatg ggggaggtgt ataattatga 16440
ggcccacggc gggcttattc tttagggagg atctatctcg ttgctcaagt gcatggcgca 16500
aagcagttat tggagtgcgg attttcgttg gcatattatt cgccacgagt tagcagacga 16560
agagaccttc atgaacgtgg ccaaggccag agttaagcag atgttacgcc ctgctgcagg 16620
cctttctatt atccaatagt tggttgatct ttggaaagag cctcggctga ggcccatact 16680
gaaagagatc gatggatatc gatatgccat gttgtttgct agccagaacc agatcacatc 16740
cgatatgcta ttgcagcttg acgcagatat ggaggataag ttgattcatg ggatcgctca 16800
ggagtagctc atccatgcac gccgacaaga acagaaattc cgtcgagtta acgcagccgc 16860
ttacgacgga ttcgaaggtc atccattcgg aatgtattag tttgcaccag ctccgcgtca 16920
cacctgtctt catttgaata agatgttagc aattgttttt agctttgtct tgttgtggca 16980
gggcggcaag tgcttcagac atcattctgt tttcaaattt tatgctggag aacagcttct 17040
taattccttt ggaaataata gactgcgtct taaaattcag atgtctggat atagatatga 17100
ttgtaaaata acctatttaa gtgtcattta gaacataagt tttatgaatg ttcttccatt 17160
ttcgtcatcg aacgaataag agtaaataca ccttttttaa cattacaaat aagttcttat 17220
acgttgttta tacaccggga atcatttcca ttattttcgc gcaaaagtca cggatattcg 17280
tgaaagcgac ataaactgcg aaatttgcgg ggagtgtctt gagtttgcct cgaggctagc 17340
gcatgcacat agacacacac atcatctcat tgatgcttgg taataattgt cattagattg 17400
tttttatgca tagatgcact cgaaatcagc caattttaga caagtatcaa acggatgtga 17460
cttcagtaca ttaaaaacgt ccgcaatgtg ttattaagtt gtctaagcgt caatttgatt 17520
tacaattgaa tatatcctgc cccagccagc caacagctcg atttacaatt gaatatatcc 17580
tgccggccgg cccacgcgtg tcgaggaatt ctgatctggc ccccatttgg acgtgaatgt 17640
agacacgtcg aaataaagat ttccgaatta gaataatttg tttattgctt tcgcctataa 17700
atacgacgga tcgtaatttg tcgttttatc aaaatgtact ttcattttat aataacgctg 17760
cggacatcta catttttgaa ttgaaaaaaa attggtaatt actctttctt tttctccata 17820
ttgaccatca tactcattgc tgatccatgt agatttcccg gacatgaagc catttacaat 17880
tgaatatatc ctgccgccgc tgccgctttg cacccggtgg agcttgcatg ttggtttcta 17940
cgcagaactg agccggttag gcagataatt tccattgaga actgagccat gtgcaccttc 18000
cccccaacac ggtgagcgac ggggcaacgg agtgatccac atgggacttt taaacatcat 18060
ccgtcggatg gcgttgcgag agaagcagtc gatccgtgag atcagccgac gcaccgggca 18120
ggcgcgcaac acgatcgcaa agtatttgaa cgcaggtaca atcgagccga cgttcacgcg 18180
gaacgaccaa gcaagcttgg ctgccatttt tggggtgagg ccgttcgcgg ccgaggggcg 18240
cagcccctgg ggggatggga ggcccgcgtt agcgggccgg gagggttcga gaaggggggg 18300
cacccccctt cggcgtgcgc ggtcacgcgc acagggcgca gccctggtta aaaacaaggt 18360
ttataaatat tggtttaaaa gcaggttaaa agacaggtta gcggtggccg aaaaacgggc 18420
ggaaaccctt gcaaatgctg gattttctgc ctgtggacag cccctcaaat gtcaataggt 18480
gcgcccctca tctgtcagca ctctgcccct caagtgtcaa ggatcgcgcc cctcatctgt 18540
cagtagtcgc gcccctcaag tgtcaatacc gcagggcact tatccccagg cttgtccaca 18600
tcatctgtgg gaaactcgcg taaaatcagg cgttttcgcc gatttgcgag gctggccagc 18660
tccacgtcgc cggccgaaat cgagcctgcc cctcatctgt caacgccgcg ccgggtgagt 18720
cggcccctca agtgtcaacg tccgcccctc atctgtcagt gagggccaag ttttccgcga 18780
ggtatccaca acgccggcgg ccgcggtgtc tcgcacacgg cttcgacggc gtttctggcg 18840
cgtttgcagg gccatagacg gccgccagcc cagcggcgag ggcaaccagc ccggtgagcg 18900
tcggaaaggg tcgacggatc ttttccgctg cataaccctg cttcggggtc attatagcga 18960
ttttttcggt atatccatcc tttttcgcac gatatacagg attttgccaa agggttcgtg 19020
tagactttcc ttggtgtatc caacggcgtc agccgggcag gataggtgaa gtaggcccac 19080
ccgcgagcgg gtgttccttc ttcactgtcc cttattcgca cctggcggtg ctcaacggga 19140
atcctgctct gcgaggctgg ccggctaccg ccggcgtaac agatgagggc aagcggatgg 19200
ctgatgaaac caagccaacc aggaagggca gcccacctat caaggtgtac tgccttccag 19260
acgaacgaag agcgattgag gaaaaggcgg cggcggccgg catgagcctg tcggcctacc 19320
tgctggccgt cggccagggc tacaaaatca cgggcgtcgt ggactatgag cacgtccgcg 19380
agctggcccg catcaatggc gacctgggcc gcctgggcgg cctgctgaaa ctctggctca 19440
ccgacgaccc gcgcacggcg cggttcggtg atgccacgat cctcgccctg ctggcgaaga 19500
tcgaagagaa gcaggacgag cttggcaagg tcatgatggg cgtggtccgc ccgagggcag 19560
agccatgact tttttagccg ctaaaacggc cggggggtgc gcgtgattgc caagcacgtc 19620
cccatgcgct ccatcaagaa gagcgacttc gcggagctgg tattcgtgca gggcaagatt 19680
cggaatacca agtacgagaa ggacggccag acggtctacg ggaccgactt cattgccgat 19740
aaggtggatt atctggacac caaggcacca ggcgggtcaa atcaggaata agggcacatt 19800
gccccggcgt gagtcggggc aatcccgcaa ggagggtgaa tgaatcggac gtttgaccgg 19860
aaggcataca ggcaagaact gatcgacgcg gggttttccg ccgaggatgc cgaaaccatc 19920
gcaagccgca ccgtcatgcg tgcgccccgc gaaaccttcc agtccgtcgg ctcgatggtc 19980
cagcaagcta cggccaagat cgagcgcgac agcgtgcaac tggctccccc tgccctgccc 20040
gcgccatcgg ccgccgtgga gcgttcgcgt cgtctcgaac aggaggcggc aggtttggcg 20100
aagtcgatga ccatcgacac gcgaggaact atgacgacca agaagcgaaa aaccgccggc 20160
gaggacctgg caaaacaggt cagcgaggcc aagcaggccg cgttgctgaa acacacgaag 20220
cagcagatca aggaaatgca gctttccttg ttcgatattg cgccgtggcc ggacacgatg 20280
cgagcgatgc caaacgacac ggcccgctct gccctgttca ccacgcgcaa caagaaaatc 20340
ccgcgcgagg cgctgcaaaa caaggtcatt ttccacgtca acaaggacgt gaagatcacc 20400
tacaccggcg tcgagctgcg ggccgacgat gacgaactgg tgtggcagca ggtgttggag 20460
tacgcgaagc gcacccctat cggcgagccg atcaccttca cgttctacga gctttgccag 20520
gacctgggct ggtcgatcaa tggccggtat tacacgaagg ccgaggaatg cctgtcgcgc 20580
ctacaggcga cggcgatggg cttcacgtcc gaccgcgttg ggcacctgga atcggtgtcg 20640
ctgctgcacc gcttccgcgt cctggaccgt ggcaagaaaa cgtcccgttg ccaggtcctg 20700
atcgacgagg aaatcgtcgt gctgtttgct ggcgaccact acacgaaatt catatgggag 20760
aagtaccgca agctgtcgcc gacggcccga cggatgttcg actatttcag ctcgcaccgg 20820
gagccgtacc cgctcaagct ggaaaccttc cgcctcatgt gcggatcgga ttccacccgc 20880
gtgaagaagt ggcgcgagca ggtcggcgaa gcctgcgaag agttgcgagg cagcggcctg 20940
gtggaacacg cctgggtcaa tgatgacctg gtgcattgca aacgctaggg ccttgtgggg 21000
tcagttccgg ctgggggttc agcagccagc gctttactgg catttcagga acaagcgggc 21060
actgctcgac gcacttgctt cgctcagtat cgctcgggac gcacggcgcg ctctacgaac 21120
tgccgataaa cagaggatta aaattgacaa ttgtgattaa ggctcagatt cgacggcttg 21180
gagcggccga cgtgcaggat ttccgcgaga tccgattgtc ggccctgaag aaagctccag 21240
agatgttcgg gtccgtttac gagcacgagg agaaaaagcc catggaggcg ttcgctgaac 21300
ggttgcgaga tgccgtggca ttcggcgcct acatcgacgg cgagatcatt gggctgtcgg 21360
tcttcaaaca ggaggacggc cccaaggacg ctcacaaggc gcatctgtcc ggcgttttcg 21420
tggagcccga acagcgaggc cgaggggtcg ccggtatgct gctgcgggcg ttgccggcgg 21480
gtttattgct cgtgatgatc gtccgacaga ttccaacggg aatctggtgg atgcgcatct 21540
tcatcctcgg cgcacttaat atttcgctat tctggagctt gttgtttatt tcggtctacc 21600
gcctgccggg cggggtcgcg gcgacggtag gcgctgtgca gccgctgatg gtcgtgttca 21660
tctctgccgc tctgctaggt agcccgatac gattgatggc ggtcctgggg gctatttgcg 21720
gaactgcggg cgtggcgctg ttggtgttga caccaaacgc agcgctagat cctgtcggcg 21780
tcgcagcggg cctggcgggg gcggtttcca tggcgttcgg aaccgtgctg acccgcaagt 21840
ggcaacctcc cgtgcctctg ctcaccttta ccgcctggca actggcggcc ggaggacttc 21900
tgctcgttcc agtagcttta gtgtttgatc cgccaatccc gatgcctaca ggaaccaatg 21960
ttctcggcct ggcgtggctc ggcctgatcg gagcgggttt aacctacttc ctttggttcc 22020
gggggatctc gcgactcgaa cctacagttg tttccttact gggctttctc agcccccgag 22080
cgcttagtgg gaatttgtac cccttatcga accgggagca caggatgacg cctaacaatt 22140
cattcaagcc gacaccgctt cgcggcgcgg cttaattcag gagttaaaca tcatgaggga 22200
agcggtgatc gccgaagtat cgactcaact atcagaggta gttggcgtca tcgagcgcca 22260
tctcgaaccg acgttgctgg ccgtacattt gtacggctcc gcagtggatg gcggcctgaa 22320
gccacacagt gatattgatt tgctggttac ggtgaccgta aggcttgatg aaacaacgcg 22380
gcgagctttg atcaacgacc ttttggaaac ttcggcttcc cctggagaga gcgagattct 22440
ccgcgctgta gaagtcacca ttgttgtgca cgacgacatc attccgtggc gttatccagc 22500
taagcgcgaa ctgcaatttg gagaatggca gcgcaatgac attcttgcag gtatcttcga 22560
gccagccacg atcgacattg atctggctat cttgctgaca aaagcaagag aacatagcgt 22620
tgccttggta ggtccagcgg cggaggaact ctttgatccg gttcctgaac aggatctatt 22680
tgaggcgcta aatgaaacct taacgctatg gaactcgccg cccgactggg ctggcgatga 22740
gcgaaatgta gtgcttacgt tgtcccgcat ttggtacagc gcagtaaccg gcaaaatcgc 22800
gccgaaggat gtcgctgccg actgggcaat ggagcgcctg ccggcccagt atcagcccgt 22860
catacttgaa gctaggcagg cttatcttgg acaagaagat cgcttggcct cgcgcgcaga 22920
tcagttggaa gaatttgttc actacgtgaa aggcgagatc accaaggtag tcggcaaata 22980
atgtctaaca attcgttcaa gccgacgccg cttcgcggcg cggcttaact caagcgttag 23040
agagctgggg aagactatgc gcgatctgtt gaaggtggtt ctaagcctcg tcttgcgatg 23100
gcatttcgat ccattcccat tccgcgctca agatggcttc ccctcggcag ttcatcaggg 23160
ctaaatcaat ctagccgact tgtccggtga aatgggctgc actccaacag aaacaatcaa 23220
acaaacatac acagcgactt attcacacga gctca 23255
<210> 71
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ORFA Reference Protein 1
<400> 71
Leu Asn Tyr Val Val Val Glu Lys
1 5
<210> 72
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ORFA Reference Protein 2
<400> 72
Phe Gly Ala Leu Gly Gly Phe Ile Ser Gln Gln Ala Glu Arg
1 5 10
<210> 73
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ORFA Reference Protein 3
<400> 73
Ala Glu Ile Ala Gly Gly Ser Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro
1 5 10 15
Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Val
20 25 30
Ser Ser Glu Leu Leu Glu Lys
35
<210> 74
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ORFA Reference Protein 4
<400> 74
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Val Ser Asn Glu Leu Leu Glu
1 5 10 15
Lys
<210> 75
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ORFA Reference Protein 5
<400> 75
Ile Val Gln His Arg Pro Val Pro Gln Asp Lys Pro Phe Tyr Ile Thr
1 5 10 15
Leu Arg
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ORFA Reference Protein 6
<400> 76
Ile Phe Val Glu Phe Gly Pro Lys
1 5
<210> 77
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> apo form of pantetheinylation sites 2-9
<400> 77
Thr Gly Tyr Glu Thr Asp Met Ile Glu Ser Asp Met Glu Leu Glu Thr
1 5 10 15
Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys
20
<210> 78
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> apo form of pantetheinylation site 1
<400> 78
Thr Gly Tyr Glu Thr Asp Met Ile Glu Ala Asp Met Glu Leu Glu Thr
1 5 10 15
Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys
20
Claims (68)
- (i) 적어도 하나의 다중불포화 지방산(polyunsaturated fatty acid; PUFA)을 생산하는 PUFA 신타제(synthase) 시스템을 인코딩하는 핵산 서열 및
(ii) 포스포판테테이닐 보조인자를 PUFA 신타제 시스템 ACP 도메인으로 전달하는 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제(PPTase)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 브라시카(Brassica) 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분. - 제1항에 있어서, 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분이 브라시카 나푸스(Brassica napus)인, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항에 있어서, 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분이 브라시카 준세아(Brassica juncea)인, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제 시스템이 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제 시스템이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제 시스템을 인코딩하는 핵산 서열이, 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 80% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제 시스템을 인코딩하는 핵산 서열이 서열번호 6의 핵산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제 시스템이 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제 시스템이 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제 시스템을 인코딩하는 핵산 서열이, 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 80% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제 시스템을 인코딩하는 핵산 서열이 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제 시스템이 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제 시스템이 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제 시스템을 인코딩하는 핵산 서열이, 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 80% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제 시스템을 인코딩하는 핵산 서열이 서열번호 8의 핵산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제 시스템이 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제 시스템을 인코딩하는 핵산 서열이 서열번호 6 내지 8의 핵산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, PPTase가 서열번호 5와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, PPTase가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, PPTase를 인코딩하는 핵산 서열이 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 80% 동일한, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, PPTase를 인코딩하는 핵산 서열이 서열번호 10의 핵산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, (i) 및 (ii)의 핵산 서열이 단일 재조합 발현 벡터에 함유되어 있는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서, (i) 및 (ii)의 핵산 서열이 종자 특이적 프로모터에 작동적으로 연결되어 있는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, (i) 및 (ii)의 핵산 서열이 PvDlec2, LfKCS3 및 FAE 1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 프로모터에 작동적으로 연결되어 있는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 있어서,
(iii) 장쇄 PUFA 유리 지방산(FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 아실-CoA 신세타제(ACoAS)를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분. - 제25항에 있어서, ACoAS가 서열번호 4와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제25항에 있어서, ACoAS가 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제25항에 있어서, ACoAS를 인코딩하는 핵산 서열이 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 80% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제25항에 있어서, ACoAS를 인코딩하는 핵산 서열이 서열번호 9의 핵산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제25항에 있어서, ACoAS를 인코딩하는 핵산 서열이 서열번호 34의 핵산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제25항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, (i), (ii) 및 (iii)의 핵산 서열이 단일 재조합 발현 벡터에 함유되어 있는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제25항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 있어서, (i), (ii) 및 (iii)의 핵산 서열이 종자 특이적 프로모터에 작동적으로 연결되어 있는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제25항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 있어서, (i), (ii) 및 (iii)의 핵산 서열이 PvDlec2, LfKCS3 및 FAE 1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 프로모터에 작동적으로 연결되어 있는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제33항 중의 어느 한 항에 있어서, 아세틸 CoA 카복실라제(ACCase)를 인코딩하는 핵산 서열 및/또는 타입 2 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(DGAT2)를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 서열번호 6 내지 10으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
- 재조합 발현 벡터 pDAB7361.
- 재조합 발현 벡터 pDAB7362.
- 재조합 발현 벡터 pDAB7363.
- 제1항 내지 제34항 중의 어느 한 항에 있어서, 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분이 검출가능한 양의 DHA(도코사헥사엔산(C22:6, n-3)), DPA(C22:5, n-6 또는 n-3), 또는 EPA(에이코사펜타엔산(C20:5, n-3))를 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제34항 및 제39항 중의 어느 한 항에 있어서, 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분이 0.01% 내지 15% DHA를 포함하는, 유전자 변형된 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제34항, 제39항 및 제40항 중의 어느 한 항에 있어서, 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분이 0.05% 내지 10% DHA를 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 있어서, 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분이 0.05% 내지 5% DHA를 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제42항 중의 어느 한 항에 있어서, 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분이 0.01% 내지 5% EPA를 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제43항 중의 어느 한 항에 있어서, 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분이 0.05% 내지 5% EPA를 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제44항 중의 어느 한 항에 있어서, 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분이 0.05% 내지 1% EPA를 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제45항 중의 어느 한 항에 있어서, 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분이 0.01% 내지 5% DPA를 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제46항 중의 어느 한 항에 있어서, 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분이 0.05% 내지 5% DPA를 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제47항 중의 어느 한 항에 있어서, 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분이 0.05% 내지 1% DPA를 포함하는, 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분.
- 제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분으로부터 수득된 오일.
- 제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직 또는 부분으로부터 수득된 종자,.
- 제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분으로부터 수득된 종자 오일 (seed oil).
- 제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분으로부터 수득된 오일, 또는 제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직 또는 부분으로부터 수득된 종자를 포함하는 식료품(food product).
- 제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분으로부터 수득된 오일, 또는 제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직 또는 부분으로부터 수득된 종자를 포함하는 기능성 식품(functional food).
- 제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제45항 중의 어느 한 항의 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분으로부터 수득된 오일, 또는 제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직 또는 부분으로부터 수득된 종자를 포함하는 약품(pharmaceutical product).
- 제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제45항 중의 어느 한 항의 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분으로부터, 또는 제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직 또는 부분의 종자로부터 오일을 회수하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 PUFA를 포함하는 오일을 생산하는 방법.
- 제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분을 성장시키는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 PUFA를 포함하는 오일을 생산하는 방법.
- 제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직 또는 부분의 종자로부터 오일을 회수하는 단계를 포함하는, 종자 오일에서 적어도 하나의 PUFA를 생산하는 방법.
- 제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분을 성장시키는 단계를 포함하는, 종자 오일에서 적어도 하나의 PUFA를 생산하는 방법.
- 제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분, 제49항의 오일, 제50항의 종자, 제51항의 종자 오일, 제52항의 식료품, 제53항의 기능성 식품 또는 제54항의 약품을 개체에게 제공하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 PUFA를 함유하는 보충 또는 치료 생성물을 개체에게 제공하는 방법.
- 제55항 내지 제59항 중의 어느 한 항에 있어서, PUFA가 DHA인 방법.
- 제55항 내지 제59항 중의 어느 한 항에 있어서, PUFA가 EPA인 방법.
- 브라시카 식물 또는 식물 세포를,
(i) 적어도 하나의 다중불포화 지방산(PUFA)을 생산하는 조류 PUFA 신타제를 인코딩하는 핵산 서열 및 (ii) 포스포판테테이닐 보조인자를 조류 PUFA 신타제 ACP 도메인으로 전달하는 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제(PPTase)를 인코딩하는 핵산 서열로 형질전환시키는 단계를 포함하는,
제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직 또는 부분을 생산하는 방법. - 제62항에 있어서, 브라시카 식물 또는 식물 세포를, (iii) 장쇄 PUFA 유리 지방산(FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 아실-CoA 신세타제(ACoAS)를 인코딩하는 핵산 서열로 형질전환시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 약 0.05% 내지 5% DHA를 포함하는 브라시카 식물의 종자로부터의 오일 조성물.
- 약 0.05% 내지 5% DHA를 포함하고 70% 초과 올레산(중량 기준)의 지방산 프로파일을 갖는 브라시카 식물의 종자로부터의 오일 조성물.
- 약 0.05% 내지 5% DHA를 포함하고 3.5% 미만 알파-리놀렌산(중량 기준)의 지방산 프로파일을 갖는 브라시카 식물의 종자로부터의 오일 조성물.
- 약 0.05% 내지 5% DHA를 포함하며 70% 초과 올레산 및 3.5% 미만 알파-리놀렌산(중량 기준)의 지방산 프로파일을 갖는 브라시카 식물의 종자로부터의 오일 조성물.
- 브라시카 식물 또는 식물 세포를,
(i) 적어도 하나의 다중불포화 지방산(polyunsaturated fatty acid; PUFA)을 생산하는 PUFA 신타제 시스템을 인코딩하는 핵산 서열 및 (ii) 장쇄 PUFA 유리 지방산(FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 아실-CoA 신세타제(ACoAS)를 인코딩하는 핵산 서열, 및 (iii) PUFA 신타제 시스템 ACP 도메인을 활성화시키는 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제(PPTase)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트로 형질전환시키는 단계를 포함하는,
제1항 내지 제34항 및 제39항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 유전자 변형된 브라시카 식물, 이의 후대, 세포, 조직, 종자 또는 부분을 생산하는 방법.
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