KR20130106190A - 두메부추 부탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 치료 및 발모 촉진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 탈모 치료 및 발모 촉진용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 두메부추 부탄올 추출물을 유효성분으로 함유하거나 에탄올 추출, 헥산 분획, 디클로로메탄 분획, 에틸아세테이트 분획 및 부탄올 분획 단계를 거친 두메부추 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 탈모 치료 및 발모 촉진용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 두메부추 부탄올 추출물 또는 에탄올 추출, 헥산 분획, 디클로로메탄 분획, 에틸아세테이트 분획 및 부탄올 분획 단계를 거친 두메부추 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 사용할 경우, 부작용 없이 우수한 탈모 치료 및 발모 촉진 효과를 기대할 수 있다.
또한 본 발명의 조성물 제조방법에 따르면, 안정성이 높고 탈모 치료 및 발모 촉진 효과가 우수한 조성물을 제조할 수 있다.

Description

두메부추 부탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 치료 및 발모 촉진용 조성물{Composition for promoting hair growth and anti-alopecia with Allium senescens L. buthanol extract}

본 발명은 탈모 치료 및 발모 촉진용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 두메부추 부탄올 추출물을 유효성분으로 함유하거나 에탄올 추출, 헥산 분획, 디클로로메탄 분획, 에틸아세테이트 분획 및 부탄올 분획 단계를 거친 두메부추 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 탈모 치료 및 발모 촉진용 조성물에 관한 것이다.

한국성인병예방협회 조사에 따르면 국내 성인 10명 중 7명이 알로페시아, 즉 탈모를 질환으로 인식하고 사회생활에 직간접적으로 손해를 보고 있다고 생각하고 있으며 스스로 불안으로 인한 중등도 이상의 스트레스를 받고 있다.

성인의 약 23%가 탈모를 경험하고 있고 이중 탈모가 주로 시작되는 20 ~ 30대의 경우 병원치료를 통한 능동적 치료를 받고 있는 것으로 나타났다. 탈모 중 가장 큰 비중을 차지하는 것은 남성형 탈모로, 남성호르몬인 테스토스테론이 5α-환원효소(reductase)에 의해 더 강력한 남성호르몬인 디하이드로테스토스테론으로 전환되어 남자의 2차 성장발달에 작용하는 안드로겐 수용체와 만나면서 두피의 모유두 축소를 유발시키고 그로 인해 탈모로의 진행이 가속화 된다.

경제가 성장하고 사회가 노령화가 되면서 탈모는 불가항력적인 것이 아닌 질환으로 여겨지고 있다. 이러한 탈모의 원인에는 심리적인 불안감 및 스트레스, 자극적인 음식, 흡연, 자외선 등이 있다. 남성의 경우 탈모의 형태는 M자형, O자형, U자형, 원형탈모 등이 있고, 여성의 경우 대부분 머리 중앙부위에서 탈모가 발생되는 형태를 보이고 있다.

모발의 주기(cycle)는 아나겐(성장기), 카타겐(퇴행기), 텔로겐(휴지기)의 3단계로 나눌 수 있는데 이는 성장기, 퇴행기, 휴지기를 말한다.

아나겐기의 모발 수명은 2 ~ 6년 정도로 전체모발의 약 85%를 차지한다. 그리고 카타겐기는 보통 3주에 걸쳐 이루어지고 전체모발의 약 1%를 차지한다. 모발이 없어지는 텔로겐기는 대개 3개월 정도 지속되고 전체모발의 약 14%정도를 차지한다. 이런 아나겐, 카타겐, 텔로겐의 단계는 계속적으로 순환이 이루어지게 되며, 약물적인 치료과정은 효소차단작용을 통해 탈로겐기를 아나겐기로 변화시켜주어 모발의 주기를 계속 순환시켜주는데 있겠다.

현재 약물을 이용한 치료는 영구적인 치료가 아니고 탈모의 진행 단계를 지연시키거나 아니면 현 모발의 상태유지를 돕는 것으로, 현재 FDA의 승인을 받은 약물은 도포용으로 미녹시딜과 경구용으로 피나스테라이드가 있다. 미녹시딜의 경우 1977년 미국의 병원에서 고혈압치료제를 처방한 환자의 털이 갑자기 급증한 것을 계기로 탈모치료제로 개발되었다.

미녹시딜의 메커니즘은 아직 충분히 밝혀지지는 않았다. 미녹시딜은 일산화질소(nitric oxide)를 포함한 화학 구조인데 이 일산화질소가 주로 혈관 확장 등에 관여하기 때문에 혈관확장을 통해 모낭으로의 혈류량을 증가시켜 모발성장을 촉진하는 것으로 추정하고 있다. 부작용(side effect)으로는 눈의 통증이라던지 도포부위의 가려움, 붉어짐, 또한 원하지 않는 부위에 털이 자라는 것 등이 있고, 심각한 알러지 반응을 일으키는 경우도 있다. 그리고 오히려 머리카락이 더 빠지는 경우 등이 있다.

피나스테라이드의 경우는 원래 양성전립선비대증을 치료하기 위해 개발되었으나, 연구 과정에서 모발의 성장을 촉진시킬 수 있다는 점이 밝혀지면서 탈모 치료제로 쓰이게 되었다. 제2형 5α-환원효소 작용을 차단하여 남성호르몬인 테스토스테론이 디하이드로테스토스테론으로 전환되는 것을 억제시킴으로써 탈모를 반전 또는 억제시킨다. 남성호르몬이므로 남성 전용으로 사용되며, 여성이 복용하는 것은 금하고 있다. 이들의 문제점은 약물 투여를 정지하면 다시 탈모가 진행되고 발기부전 등의 부작용이 초래될 수도 있다는 점이다. 이에 따라 현재는 부작용이 적은 천연추출물을 이용한 연구가 많이 진행되고 있다.

이에, 본 발명자들은 부작용이 적은 천연추출물을 대상으로 탈모를 치료하거나 발모를 촉진하는 물질을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 이의 결과 두메부추 추출물이 탈모의 치료 또는 발모의 촉진에 효과적이고, 특히 두메부추의 부탄올 추출물 또는 에탄올 추출, 헥산 분획, 디클로로메탄 분획, 에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획 단계를 거친 두메부추 부탄올 용해성 분획물이 탈모의 치료 또는 발모의 촉진에 효과적이라는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 주된 목적은 탈모의 치료 또는 발모의 촉진에 효과적인 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 두메부추를 분쇄하고 90% 이상의 부탄올로 추출한 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 치료 및 발모 촉진용 조성물을 제공한다.

상기 추출물은 두메부추와 부탄올을 1 : 5 내지 1 : 40 중량비로 하여 혼합하고 20 ~ 60℃에서 6 ~ 48시간동안 추출하여 제조할 수 있다. 추출 후 용매인 부탄올을 제거하는 것이 바람직하며, 동결건조를 이용하여 용매를 제거하고, 추출물을 분말화 할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 a) 두메부추를 분쇄하고 20 내지 60%(v/v)의 에탄올로 추출하여 에탄올 추출물을 수득하는 단계; b) 상기 에탄올 추출물을 90%(v/v) 이상의 헥산(hexane)으로 분획하여 헥산 불용성 분획을 수득하는 단계; c) 상기 헥산 불용성 분획을 90%(v/v) 이상의 디클로로메탄(dichloromethane)으로 분획하여 디클로로메탄 불용성 분획을 수득하는 단계; d) 상기 디클로로메탄 불용성 분획을 90%(v/v) 이상의 에틸아세테이트(ethyl acetate)로 분획하여 에틸아세테이트 불용성 분획을 수득하는 단계; e) 상기 에틸아세테이트 불용성 분획을 90%(v/v) 이상의 부탄올로 분획하여 부탄올 용해성 분획을 수득하는 단계; 및 f) 상기 부탄올 용해성 분획에서 용매를 제거하는 단계;를 포함하는 탈모 치료 및 발모 촉진용 조성물의 제조방법을 제공한다.

상기 에탄올 추출물은 두메부추 분쇄물과 20 내지 60%(v/v)의 에탄올을 1 : 5 내지 1 : 40 중량비로 하여 혼합하고 20 ~ 60℃에서 6 ~ 48시간동안 추출하여 제조할 수 있다.

상기 b) 내지 e)단계에서 각 용매는 분획 대상물의 부피와 동부피로 사용할 수 있으며, 용매를 첨가한 다음 혼합하고 정치시켜 상(phase)분리가 이루어지면 원하는 상을 수득하는 방법으로 분획을 실시할 수 있다. 각 분획 단계는 반복을 통해 수율을 높일 수 있다.

상기 b)단계에서 헥산 불용성 분획은 상분리 이후 하층으로부터 수득할 수 있으며, c)단계에서 디클로로메탄 불용성 분획은 상층, d)단계에서 에틸아세테이트 불용성 분획은 하층, e)단계에서 부탄올 용해성 분획은 상층으로부터 수득할 수 있다.

상기 f)단계에서 용매를 제거할 때에는 동결건조를 실시하여 용매 제거와 동시에 분획물의 분말화를 달성할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 탈모 치료 및 발모 촉진용 조성물을 제공한다.

상기 에탄올 추출, 헥산 분획, 디클로로메탄 분획, 에틸아세테이트 분획 및 부탄올 분획을 통해 수득한 부탄올 용해성 분획 이외에도, 상기 e)단계에서 부탄올로 분획하여 수득한 부탄올 불용성 분획 또한 탈모 치료 및 발모 촉진에 효과가 있다. 이 부탄올 불용성 분획 또한 용매를 제거하여 사용하는 것이 바람직하며, 용매 제거 후 물에 용해시켜 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물 또는 조성물의 제조방법에서, 두메부추의 부위 중 잎을 사용하는 것이 보다 높은 효과를 위해 바람직하다. 이는 동물을 이용한 두메부추 부위별 추출물의 탈모 치료 및 발모 촉진 실험 결과에 따른 것으로, 전초, 뿌리, 잎으로부터 추출한 추출물 중 잎 추출물이 가장 효과가 높은 것으로 나타났다.

동물실험의 결과에 따르면, 본 발명의 조성물에는 상기 두메부추 부탄올 추출물 또는 단계적인 분획을 통해 제조되는 상기 두메부추 부탄올 용해성 물질이 1 내지 10중량%로 함유되는 것이 탈모 치료 및 발모 촉진 효과를 나타내고, 조성물 사용에 따른 피부 트러블 등의 부작용을 방지하기 위해 바람직하다.

본 발명의 조성물은 두피에 직접 바르는 방법을 적용할 수 있고, 상기 1 내지 10중량%로 함유된 조성물의 경우, 하루에 0.1 내지 2.0㎖을 1차례 이상 사용이 가능할 것으로 판단된다.

본 발명의 조성물에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함하여 두피에 적용한 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 할 수 있다.

또한 화장품학적으로 허용된 담체를 혼합하여, 화장수, 영양로션, 영양크림, 맛사지 크림, 팩, 영양 에센스 등의 형태로 제조할 수 있다.

본 발명에 따르면, 두메부추 부탄올 추출물 또는 에탄올 추출, 헥산 분획, 디클로로메탄 분획, 에틸아세테이트 분획 및 부탄올 분획 단계를 거친 두메부추 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 사용할 경우, 부작용 없이 우수한 탈모 치료 및 발모 촉진 효과를 기대할 수 있다.

또한 본 발명의 조성물 제조방법에 따르면, 안정성이 높고 탈모 치료 및 발모 촉진 효과가 우수한 조성물을 제조할 수 있다.

도 1은 두메부추 에탄올 추출물(1% 및 5% SAMPLE)과 미녹시딜(5% MXD)을 시료로 사용한 동물실험 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 두메부추 에탄올 추출물(5% SAMPLE)과 미녹시딜(5% MXD) 및 물(NORMAL)을 시료로 사용한 동물실험 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 두메부추의 열매(Fruits), 뿌리(Roots), 잎(Leaves)에 따른 부위별 에탄올 추출물을 시료로 사용한 동물실험 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 두메부추 에탄올 추출물(Total), 헥산 용해성 분획물(Hexane soluble), 부탄올 용해성 분획물(Bu-OH soluble), 물 용해성 분획물(DW soluble) 및 미녹시딜(3% Minoxidil)을 시료로 사용한 동물실험 결과를 나타낸 사진이다.
도 5는 두메부추 부탄올 용해성 분획물(Bu-OH soluble), 물 용해성 분획물(DW soluble) 및 미녹시딜(3% Minoxidil)을 시료로 사용한 동물실험 결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 두메부추 부탄올 용해성 분획물 및 이의 성분 분리 그룹 1 내지 4의 TLC(thin-layer chromatography) 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 두메부추 부탄올 용해성 분획물(Bu-OH soluble layer) 및 이의 성분 분리 그룹 1 내지 3(No.1 ~ No.3)과 미녹시딜(MXD)을 시료로 사용한 동물실험 결과를 나타낸 사진이다.
도 8은 두메부추 부탄올 용해성 분획물(Bu-OH soluble layer) 및 이의 성분 분리 그룹 4(Bu-OH soluble layer (No.4))과 물 용해성 분획물(DW soluble layer)을 시료로 사용한 동물실험 결과를 나타낸 사진이다.
도 9는 실험을 완료한 동물의 조직을 대상으로, IGF-1, KGF, VEGF 및 HGF의 발현 양상을 확인하기 위한 Real time PCR 결과를 나타낸 그래프이다(미녹시딜 실험동물, MXD; 음성대조군 실험동물, Normal; 물 용해성 분획물 실험동물, DW layer; 부탄올 용해성 분획물 실험동물, BuOH layer; 부탄올 용해성 분획 성분 분리 그룹 4 실험동물, BuOH layer(no.4)).
도 10은 실험을 완료한 동물의 조직을 대상으로, EGF 및 TGF-β1의 발현 양상을 확인하기 위한 Real time PCR 결과를 나타낸 그래프이다(미녹시딜 실험동물, MXD; 음성대조군 실험동물, Normal; 물 용해성 분획물 실험동물, DW layer; 부탄올 용해성 분획물 실험동물, BuOH layer; 부탄올 용해성 분획 성분 분리 그룹 4 실험동물, BuOH layer(no.4)).
도 11은 휴먼 HaCaT 세포 및 Hela 세포를 이용하여 시료의 농도에 따른 세포 생존력(cell viability)을 확인한 실험 결과를 나타낸 그래프이다(에탄올 추출물, Total; 부탄올 용해성 분획물, Bu-OH soluble layer; 물 용해성 분획물, DW soluble layer).
도 12는 A-549 세포 및 HT-29 세포를 이용하여 시료의 농도에 따른 세포 생존력을 확인한 실험 결과를 나타낸 그래프이다(부탄올 용해성 분획물, Bu-OH soluble layer; 물 용해성 분획물, DW soluble layer; 부탄올 용해성 분획 성분 분리 그룹 4, Bu-OH soluble layer(No.4)).
도 13은 MCF-7 세포를 이용하여 시료의 농도에 따른 세포 생존력을 확인한 실험 결과를 나타낸 그래프이다(부탄올 용해성 분획물, Bu-OH soluble layer; 물 용해성 분획물, DW soluble layer).
도 14는 HHDPC(Human hair dermal papilla cell) 모유두 세포를 시료의 농도에 따른 세포 생존력을 확인한 실험 결과를 나타낸 그래프이다(에탄올 추출물, Total; 부탄올 용해성 분획물, Bu-OH soluble layer; 물 용해성 분획물, DW soluble layer).
도 15는 HHDPC 모유두 세포를 시료의 농도에 따른 세포 생존력을 확인한 실험 결과를 나타낸 그래프이다(부탄올 용해성 분획 성분 분리 그룹 1, Bu-OH soluble layer(no.1); 그룹 2, Bu-OH soluble layer(no.2); 그룹 3, Bu-OH soluble layer(no.3); 그룹 4, Bu-OH soluble layer(no.4)).
도 16은 실험을 완료한 HHDPC 모유두 세포를 대상으로, IGF-1의 발현 양상을 확인하기 위한 Real time PCR 결과를 나타낸 그래프이다(물 용해성 분획물, DW soluble layer; 부탄올 용해성 분획 성분 분리 그룹 1, no.1; 그룹 2, no.2; 그룹 3, no.3; 그룹 4, no.4).
도 17은 실험을 완료한 HHDPC 모유두 세포를 대상으로, VEGF 및 KGF의 발현 양상을 확인하기 위한 Real time PCR 결과를 나타낸 그래프이다(부탄올 용해성 분획 성분 분리 그룹 1, no.1; 그룹 2, no.2; 그룹 3, no.3; 그룹 4, no.4).
도 18은 두메부추 부탄올 용해성 분획(BuOH), 부탄올 용해성 분획 성분 분리 그룹 4(BuOH(no.4)), 물 용해성 분획(DW), 음성대조군(NORMAL) 및 미녹시딜(MXD)을 시료로 사용한 동물실험 결과를 나타낸 사진이다.
도 19는 실험을 완료한 동물의 등 조직을 조직학적 염색을 실시하여 현미경을 통해 촬영한 사진이다(미녹시딜 실험동물, MXD; 음성대조군 실험동물, Normal; 물 용해성 분획물 실험동물, DW; 부탄올 용해성 분획물 실험동물, BuOH; 부탄올 용해성 분획 성분 분리 그룹 4 실험동물, BuOH(no.4)).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1.

1-1. 두메부추 에탄올 추출물 제조

분쇄한 두메부추 전초에 20배 중량의 40% 에탄올(EtOH)을 혼합하고 상온에서 24시간 추출기(기기명을 기재해 주시면 좋겠습니다.)를 이용하여 추출한 다음 여과하여 두메부추 에탄올 추출물을 제조하였다.

1-2. 동물실험을 통한 추출물 효과 확인

두메부추 에탄올 추출물의 효과를 확인하기 위하여 동물실험을 실시하였다.

상기 1-1의 두메부추 에탄올 추출물을 동결건조하였고, 이를 농도별로 증류수에 녹인 것을 실험용 시료로 사용하였다. 증류수와 현대약품의 마이녹실(3%, 5% 용액)을 각각 대조군 시료로 사용하였다.

실험동물은 마우스를 사용하였고, 마우스의 모발 휴지기가 6주부터 11주까지 이루어지므로, 생후 6주된 수컷 C57BL/6 마우스를 1주간 순화시킨 후 실험에 이용하였다. 6주 이하이거나 11주가 지나버리면 처음 등 부분을 제모했을 때 핑크빛이 아닌 검은 피부가 나오므로 그 시기를 반드시 지켜서 시행하였다.

모두 동일한 온도(24 ~ 26 ℃), 습도(50 ~ 60%), 조명(12시간 cycle) 조건에 맞추었고 실험 전 몸무게를 측정하여 체중이 균일하도록 군을 분리한 후 사용하였습니다.

실험 개시 전날 동물용 클리퍼(clipper)를 이용하여 털을 제거한 다음, 준비된 시료를 매일 1회 0.15㎖ 씩 2주간 도포하였고 마취를 통해서 주기적으로 사진 촬영 하였다.

마취를 위해 졸레틸과 럼픈을 6:4로 혼합하여서 근육주사 하였고, 제모크림은 0.7g으로 동일하게 사용하였다.

총 14일 동안 각 시료를 비교하였다. 미녹시딜의 결과와 비교하였을 때, 추출물 1% 시료의 경우에는 털이 상대적으로 적게 자랐고, 5% 시료에서 미녹시딜과 유사한 정도로 털이 자란 것을 확인할 수 있었다(도 1 참조).

상기 추출물 1% 시료를 제외하고, 추출물 5% 시료를 5% 미녹시딜 및 음성대조군(증류수)과 함께 비교하였다. 보통의 경우 10일 정도부터 육안으로 확인이 가능하므로 10일차와 14일차에 사진을 촬영하였다.

10일차에서 5% 미녹시딜의 경우 전체적으로 푸르스름하게 등판이 변하는 것을 확인하였고 추출물 5% 시료의 경우에도 근접한 수준으로 등판에 털이 형성되었다. 14일차는 미녹시딜의 경우 검게 완전히 털이 자랐고 5% 시료의 경우도 근접한 수준으로 털이 검게 자라났다(도 2 참조).

1-3. 두메부추 부위별 추출물 제조

두메부추를 전초, 뿌리, 잎으로 나누어 상기 1-1과 동일한 방법으로 추출하였다.

1-4. 두메부추 부위별 추출물 효과

상기 1-3 추출물의 효과를 상기 1-2와 동일한 방법으로 비교하였다.

전초 및 뿌리에 비해 잎에서 더 효과적으로 발모효과가 나타났고, 따라서 이어지는 다음의 실험들은 잎 추출물을 사용하였다(도 3 참조).

1-5. 분획물 제조

상기 1-3의 잎 추출물을 n-헥산(n-hexane), 디클로로메탄(dichloromethane), 에틸아세테이트(ethyl acetate), n-부탄올(n-butyl alcohol) 및 물을 사용하여 단계적으로 분획하여 분획물을 준비하였다.

각 분획 대상과 동중량의 용매를 사용하였고, 용매를 첨가하여 상온에서 24시간 소용량 교반기(Model : PL-S20, CoreTech, 대한민국)가 장착된 반응조에서 교반 추출한 다음 1시간 동안 정치시켜 상분리를 유도하였다.

분획의 순서는 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물의 순서이며, 각각 용매에 용해성인 분획은 회수하여 동결건조하였고, 불용성 분획은 다음 단계의 분획에 사용하였다.

헥산 분획에서 헥산 용해성 분획은 상층, 불용성 분획은 하층으로 분리되며, 디클로로메탄 분획에서 디클로로메탄 용해성 분획은 하층, 불용성 분획은 상층으로 분리되고, 에틸아세테이트 분획에서 에틸아세테이트 용해성 분획은 상층, 불용성 분획은 하층으로 분리되며, 부탄올 분획에서 부탄올 용해성 분획은 상층, 불용성 분획은 하층으로 분리된다.

최종 물 분획은 부탄올 불용성 분획을 동결건조한 다음 물에 용해시켜 제조하였다.

실험을 위해서는 회수된 각 분획 동결건조물을 물에 농도별로 용해시켜 시료로 사용하였다.

1-6. 분획물의 효과 비교

상기 1-5 분획물의 효과를 상기 1-2와 동일한 방법으로 비교하였다.

미녹시딜은 5%와 3%가 시중에 판매되는데 본 실시예에서는 3% 미녹시딜을 구입하여 사용하였다.

분획물 대부분이 당류인 극성층에서 수율이 훨씬 높았으며, 효과도 극성층인 부탄올과 물층에서 미녹시딜과 비교 시 높은 효과를 나타냈다(도 4 및 5 참조).

1-7. 부탄올 용해성 분획물의 성분 분리

상기 1-6에서 효과가 좋았던 부탄올 분획물을 크로마토그래피에 의해 한층 더 분석하였다. TLC(Thin layer chromatography)를 통해 부탄올 분획물의 성분들을 확인 후 그룹을 크게 4단계로 나누었다.

TLC 이후 조건을 일반상(normal phase)으로 설정하고, 흡착(adsorption)에 의해서 오픈 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 일반상이므로 실리카 레진(resin)을 이용하여 위에서부터 비극성에서 극성 용매로 천천히 용매를 바꿔주면서 분획(fraction) 콜렉터를 이용해 물질을 회수하였다. 회수한 물질들은 모아서 농축한 다음 그룹 1(노랑층), 2(청색층), 3(녹색층), 4(검정색충)로 나누어 시료화 하였다(도 6 참조).

1-8. 크로마토그래피로 분리된 분획물의 효과 비교

상기 1-7에서 분리한 그룹 1 ~ 4의 시료를 상기 1-2와 동일한 방법으로 비교하였다.

그룹 1 및 2의 시료량이 너무 소량이었으므로, 등 전체 1/15 정도의 중앙 부분에만 기존 처리량의 1/15인 10마이크로의 양으로 도포하여 비교하였다.

실험결과 부탄올 전체 분획물이 그룹 1, 2, 3 단독, 그리고 그룹 1, 2, 3의 혼합물에 비해 더 좋은 효과를 보였다(도 7 참조).

또한 부탄올 전체 분획물과 물 분획물이 그룹 4에 비해 더 좋은 효과를 보였다(도 8 참조).

이에 따라 발모효과는 단일 물질보다는 부탄올 분획물 전체가 상호작용하여 나타나는 것으로 판단된다.

1-9. 모발 성장인자 발현 조사

상기 동물실험 완료 후 동일 부위의 쥐 등 조직을 절단하여 5가지 쥐 모발 성장인자(mouse hair growth factor)의 발현 레벨을 Real time PCR을 이용하여 비교하였다.

성장인자 중 IGF-1의 경우 미녹시딜 처리군과 물(DW) 분획물 처리군, 부탄올 분획물 처리군이 음성대조군(물만 처리한 군)에 비해 유의수준 0.05에서 유의적 차이를 나타냈다. 하지만 부탄올 분획물 분리 성분 그룹 4의 경우 음성대조군에 비해 발현이 증가하였지만 유의적인 차이를 나타내진 않았다. KGF의 경우 미녹시딜과 부탄올 분획물 처리군에서 음성대조군에 비해 발현이 증가했지만 유의적인 차이는 없었다. VEGF의 경우 부탄올 분획물 처리군이 미녹시딜 처리군 보다 높은 레벨을 보였지만 역시 유의적인 차이는 없었다(도 9 참조).

반면, HGF의 경우 부탄올 분획물 처리군에서 확연히 유의적인 차이를 나타내었고, EGF의 경우 부탄올 분획물 처리군에서 근소하게 가장 높았지만 그룹간의 큰 차이는 없었다. 또한 성장억제인자 TGF-β1의 발현 양상을 비교한 결과 미녹시딜 처리군과 물 분획물 처리군에서 발현 레벨이 낮아졌지만 유의적 차이는 없었다(도 9 및 10 참조).

* IGF-1: 인슐린 유사 성장인자로 인슐린과 비슷한 특성으로 혈량을 개선시키고 손상된 피부세포나 노화로 인한 혈관이 감소한 세포를 재생시킴.

* KGF : 각질 성장인자로 모발의 세포성장을 촉진 시키는 사이토카인.

* VEGF: 혈관 내피세포 성장인자로 모세혈관 내 혈관세포 이동을 촉진시켜 피부의 구성을 증가시키는 사이토카인.

* HGF : 간세포 성장인자로서 기관 재생인자임과 동시에 혈관신생인자로도 작용.

* EGF : 피부상피세포 성장인자로 피부재생 촉진시킴.

* TGF-β1 : 최근 논문에 의하면 각질 형성세포의 분화억제와 각질 형성세포의 세포자멸 유도체로서 모낭의 각질형성세포의 분화를 억제하고 세포 자멸을 유도함으로써 퇴행기를 유도하는 것으로 추측되고 있다.

1-10. 안정성 조사

본 발명의 조성물이 혹시 피부에 문제가 되지 않을지를 확인하기 위해, 케라틴세포(cell type keratinocyte)인 휴먼 HaCaT 세포를 이용한 세포 생존력(cell viability)을 확인하였다.

본 발명의 조성물을 처리한 모든 농도에서 90% 이상의 생존력을 나타냈다. 따라서 피부세포에 안전한 물질임이 확인되었다(도 11 참조).

최근에는 특정 발모제가 암세포를 증식시킬 수 있다는 결과로 인해, 제품이 문제시 되는 경우도 있다. 따라서 암세포들을 이용하여 본 발명의 조성물이 어떠한 영향을 미치는지 확인해 보았다.

먼저 자궁경부암 세포인 Hela의 경우 부탄올 분획물 처리군에서 예상치 못하게 100㎍/㎖에서부터 암세포의 증식을 크게 억제하는 것으로 나타났다. 그리고 물 분획물 처기군의 경우는 별다른 차이를 보이지 않았고 암세포의 증식률의 차이도 크지 않아 암세포 증식 촉진에는 영향이 없는 것으로 나타났다(도 11 참조).

폐암 세포인 A-549의 경우에는 물 분획물 처리군에서는 별다른 차이를 보이지 않았지만 부탄올 분획물 처리군의 100㎍/㎖에서부터 증식률이 크게 감소하였다. 또한 부탄올 분획물 분리 성분 그룹 4의 경우도 서서히 감소하는 경향을 나타냈다. 결장암 세포인 HT-29의 경우에도 부탄올 분획물 처리군에서 암세포의 증식이 감소하는 것으로 나타났다(도 12 참조).

유방암세포인 MCF-7의 경우 부탄올 분획물 처리군과 물 분획물 처리군 모두 암세포의 증식작용은 없었다(도 13 참조).

1-11. 모유두 세포에 대한 효과 조사

본 발명의 조성물이 HHDPC(Human hair dermal papilla cell) 모유두 세포에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해 각 시료 처리에 따른 세포 성장률을 조사하였다.

두메부추 에탄올 추출물(상기 1-1의 추출물)의 경우는 눈에 띄는 증식의 차이는 없었으나, 물 분획물의 경우 세포의 성장이 증가함을 확인하였다(도 14 참조).

부탄올 분획물 분리 성분 그룹의 처리에 따른 세포 성장률은 그룹 1, 2, 3 및 4를 비교하였을 때 그룹 4에서 세포 성장률이 가장 높게 증가함을 확인하였다(도 15 참조).

1-12. 모유두 세포의 모발 성장인자 발현 조사

본 발명의 조성물의 처리에 따른 HHDPC 모유두 세포의 모발 성장인자의 발현 레벨을 Real time PCR을 이용하여 비교하였다.

물 분획물에서 IGF-1의 경우 시료의 농도가 증가할수록 수치가 증가함을 확인하였고, 부탄올 분획물 분리 성분 그룹 1, 2, 3 및 4의 최적 농도(상기 1-11에서 가장 효과가 좋았던 농도; 그룹 1, 1㎍/㎖; 그룹 2, 1㎍/㎖; 그룹 3, 10㎍/㎖; 그룹 4, 10㎍/㎖) 처리군을 비교한 결과, 그룹 4(10㎍/㎖)에서 가장 효과가 좋은 것으로 나타났으며, 그룹 2(1㎍/㎖)에서 다음으로 효과가 좋은 것으로 나타났다(도 16 참조).

VEGF의 경우에도 그룹 4(10㎍/㎖)에서 가장 효과가 좋았고 그룹 2(1㎍/㎖)에서 다음으로 효과가 좋았으며, KGF의 경우에는 그룹 2(1㎍/㎖)에서 가장 효과가 좋았고 그룹 4(10㎍/㎖)가 다음으로 효과가 좋았다(도 17 참조).

따라서 부탄올 분획물 분리 성분의 경우 그룹 4(10㎍/㎖)와 그룹 2(1㎍/㎖)의 모발세포 성장촉진 효과가 높다고 판단되며, 서로 복합적인 시너지를 부여할 것으로 판단된다.

1-13. 고효과 시료의 재확인

상기 실험을 통해 높은 효과를 나타낸 시료를 이용하여 재차 비교 실험하였다. 부탄올 분획물, 부탄올 분획물 분리 성분 그룹 4, 물 분획물이 음성대조군(물만 처리한 군)에 비해서 확실히 높은 효과를 나타냈다(도 18 참조).

1-14. 실험동물의 체중변화

상기 동물실험 2주 동안의 마우스 체중변화를 확인하였다.

0, 10, 14일에 체중변화를 측정한 결과 실험군 간의 큰 차이가 없이 거의 유사한 것으로 나타났다. 이는 두메부추 추출물이 마우스의 성장에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다.

그룹	처리후 경과일
	0	10	14
음성대조군	18.94±0.761)	20.65±0.83	21.51±0.91
미녹시딜	18.73±0.58	21.95±0.45	22.92±0.44
부탄올 용해성 분획	18.63±0.63	21.21±0.97	21.68±0.89
부탄올 용해성 분획 성분 분리 그룹 4	18.49±0.51	20.35±0.52	21.19±0.26
물 용해성 분획	18.62±0.72	21.09±0.69	22.22±0.68

1-15. 조직학적 염색

상기 마우스 등 조직을 이용하여 블록을 만들고, 조직학적 염색을 시행하여 변화량을 확인하였다.

10% 포르말린(formalin)에 조직을 고정하고, 하루 동안 수세과정을 거친 다음, 조직 내 수분 제거를 위하여 에탄올을 처리하였고, 에탄올을 파라핀의 용매인 자일렌으로 치환하여 다음 단계인 파라핀이 조직 내로 잘 스며들게 하기 위하여 자일렌(xylene)을 처리하였으며, 조직 고정화를 위해 파라핀(paraffin)을 처리하였다.

에탄올 처리 과정은 70%, 80%, 90%, 99%의 순서로 각 농도에서 각 농도별로 1시간씩 진행하였으며, 자일렌 처리 과정은 에탄올 3 : 자일렌 1, 에탄올 1 : 자일렌 1, 에탄올 1 : 자일렌 3, 100% 자일렌의 순서로 각 농도별로 10분씩 진행하였고, 파라핀 처리 과정은 파라핀 1 : 자일렌 3, 파라핀 1 : 자일렌 1, 파라핀 3 : 자일렌 1, 100% 파라핀의 순서로 각 농도별로 40분씩 수행하였다.

마이크로톰(microtome)으로 5㎛의 절편을 제작하고, 다시 에탄올과 자일렌으로 파라핀을 제거한 다음 염색하였다.

조직학적 염색 후 슬라이스를 광학 현미경으로 비교하였다.

확실히 음성대조군(물만 처리한 군)의 마우스 등 조직에 비하여 두메부추 추출물의 부탄올 분획물, 물 분획물과 미녹시딜을 처리한 등 조직에서 거의 유사한 수준으로 모발의 증가를 확인할 수 있었다(도 19 참조).

Claims (5)

1. 두메부추를 분쇄하고 90% 이상의 부탄올로 추출한 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 치료 및 발모 촉진용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 추출에 사용하는 두메부추의 부위가 잎인 것을 특징으로 하는 탈모 치료 및 발모 촉진용 조성물.
3. a) 두메부추를 분쇄하고 20 내지 60%(v/v)의 에탄올로 추출하여 에탄올 추출물을 수득하는 단계;
   b) 상기 에탄올 추출물을 90%(v/v) 이상의 헥산(hexane)으로 분획하여 헥산 불용성 분획을 수득하는 단계;
   c) 상기 헥산 불용성 분획을 90%(v/v) 이상의 디클로로메탄(dichloromethane)으로 분획하여 디클로로메탄 불용성 분획을 수득하는 단계;
   d) 상기 디클로로메탄 불용성 분획을 90%(v/v) 이상의 에틸아세테이트(ethyl acetate)로 분획하여 에틸아세테이트 불용성 분획을 수득하는 단계;
   e) 상기 에틸아세테이트 불용성 분획을 90%(v/v) 이상의 부탄올로 분획하여 부탄올 용해성 분획을 수득하는 단계; 및
   f) 상기 부탄올 용해성 분획에서 용매를 제거하는 단계;를 포함하는 탈모 치료 및 발모 촉진용 조성물의 제조방법.
4. 제 3항에 있어서, 추출에 사용하는 두메부추의 부위가 잎인 것을 특징으로 하는 탈모 치료 및 발모 촉진용 조성물의 제조방법.
5. 제 3항 또는 제 4항의 제조방법으로 제조된 탈모 치료 및 발모 촉진용 조성물.
   

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