KR20130104763A

KR20130104763A - 간염 α형 바이러스 또는 잉어의 봄 바이러스의 분리 방법

Info

Publication number: KR20130104763A
Application number: KR1020120026586A
Authority: KR
Inventors: 김두운; 이희민; 조세영; 고상무; 오경서
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2012-03-15
Filing date: 2012-03-15
Publication date: 2013-09-25
Also published as: WO2013137527A1; KR101311741B1

Abstract

본 발명은 간염 A형 바이러스 또는 잉어의 봄 바이러스의 분리 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 다음의 단계를 포함하는 간염 A형 바이러스(Hepatitis A Virus) 또는 잉어의 봄 바이러스(Spring Viremia of Carp Virus)의 분리 방법을 제공한다: (a) 자성(magenetic)비드-결합 G 단백질을 항-간염 A형 바이러스 항체 또는 항-랍도바이러스 항체와 결합하여 바이러스 탐침자를 제조하는 단계; (b) 상기 바이러스 탐침자를 분석 시료와 접촉하여 바이러스 탐침자-바이러스 복합체를 형성하는 단계; 및 (c) 상기 바이러스 탐침자-바이러스 복합체를 분리하는 단계. 본 발명에 따르면, 본 발명은 바이러스가 혼합된 시료로부터 간염 A형 바이러스 또는 잉어의 봄 바이러스를 순수하게 분리할 수 있다.

Description

간염 Α형 바이러스 또는 잉어의 봄 바이러스의 분리 방법{Method for Separating Hepatitis A Virus or Spring Viremia of Carp Virus}

본 발명은 간염 Α형 바이러스 또는 잉어의 봄 바이러스의 분리 방법에 관한 것이다.

농수축산물 유래 식품 중 위해요소로 인해 발생한 사건사고들은 국민들의 건강에 심각하게 영향을 미치며 적절한 조기 검출방법 및 제도의 부재로 발생되는 국내 식중독 사례에 의한 경제적 손실이 한 해 1조3000억 원에 이른다. 바이러스 식중독이 전체 식중독의 34-40%를 차지한다고 계산하더라도 바이러스 식중독에 의한 손실만 4000억 원에 이르고 있기에 농수축산물 생산 현지에서부터 바이러스성 식중독의 예방차원과 소비자와 생산자에게 안전한 먹거리 생산을 목적으로 활용 가능한 바이러스 진단법 개발연구는 이러한 사회적 손실을 사전에 막을 수 있는 방법이다.

현대도시환경의 위생상태가 많이 개선되고 있음에도 불구하고 최근 청장년층에서는 간염 A형 바이러스(HAV)에 대한 항체 보유률이 낮아지고 있고 이로 인해 바이러스 간염사례가 증가하고 있는 추세가 보고되고 있다. 과일류 및 채소류를 포함한 농산물 검체에서 간염 A형 바이러스(HAV)의 검출사례 또한 국내외에서 보고되고 있으나 현재까지 개발된 간염 A형 바이러스(HAV)의 진단법은 주로 단클론 또는 다클론 항체를 이용한 효소면역법 및 분자생물학적 검사를 통한 검사법 개발에 국한되어 최종 사용자가 현장에서 사용하기에 부적합한 단계이며, 주로 지하수, 어패류 및 식육제품과 채소류 일부를 대상으로 시험방법이 이뤄지고 있고 있는 현실이다. 또한 잉어와 넙치의 주요 바이러스성 질병으로는 넙치의 바이러스성출혈성패혈증 (viral hemorrhagic septicemia, VHS), 잉어의 봄 바이러스병 (spring viremia of carp, SVC)이 있다. SVC는 봄철 수온이 7℃에서 14℃로 상승하는 시기에 잉어 양식장에서 발생되는 질병으로서 독력과 전염성이 강해 전 세계적으로 문제시되고 있다. 국내에서는 SVC 의 원인바이러스인 SVCV가 양식 잉어에서 검출되고 있으나 현재까지 SVC에 의한 큰 피해는 발생되고 있지 않다. 그러나 SVC의 확산 및 피해가 늘어날 것으로 추정되기 때문에 이에 대한 대책마련이 절실히 요구된다. 그러나 현재까지 바이러스 질병에 대한 뚜렷한 치료대책이 수립되어 있지 않으며, 바이러스 질병을 겪은 생잔어의 경우 체내에 바이러스 보유어로 남아 지속적으로 문제시 될 수 있는 바이러스 전이체로서 작용할 수 있으므로 바이러스 질병의 확산 및 피해가 늘어날 것으로 추정된다. 이에 양식장내에서의 바이러스의 감염상태의 파악을 통한 바이러스 조기진단은 넙치와 잉어등의 식량자원 확보 차원에서 절실히 요구되고 있다

따라서 현재 사용되고 있는 농축수산물에 대한 바이러스 순수 분리방법 및 분자생물학적 진단법은 다음과 같은 한계점이 있다.

첫째, 일반적으로 바이러스의 순수분리는 숙주세포에 접종하여 계대함으로써 다른 종은 희석되고 목표로 하는 종을 다량 배양하여 분리하는 식이었다. 그러나 이와 같은 방법은 시간과 비용이 많이 소요되었다.

둘째, 식품 중에는 다양한 물질이 존재하고 이들 중 일부는 분자생물학적 특정유전자증폭방식의 반응을 방해하는 물질로 작용하므로 실제로 바이러스가 존재함에도 불구하고 유전자 증폭을 방해하여 바이러스가 오염되지 않은 것으로 잘못 판정하는 경우가 많을 수 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 간염 A형 바이러스(Hepatitis A Virus) 및 잉어의 봄 바이러스(Spring Viremia of Carp Virus)의 감염사례 및 검출사례가 증가함에 따라, 바이러스가 혼합된 시료로부터 상기 바이러스를 신속하고 정확하게 검출하기 위한 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 자성비드와 항체를 결합한 면역탐침자를 고안하여, 신속하고 정확한 분리 방법을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 간염 A형 바이러스 또는 잉어의 봄 바이러스의 분리 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 간염 A형 바이러스(Hepatitis A Virus) 또는 잉어의 봄 바이러스(Spring Viremia of Carp Virus)의 분리 방법을 제공한다.:

(a) 자성(magenetic)비드-결합 G 단백질을 항-간염 A형 바이러스 항체 또는 항-랍도바이러스 항체와 결합하여 바이러스 탐침자를 제조하는 단계;

(b) 상기 바이러스 탐침자를 분석 시료와 접촉하여 바이러스 탐침자-바이러스 복합체를 형성하는 단계; 및

(c) 상기 바이러스 탐침자-바이러스 복합체를 분리하는 단계.

본 발명자들은 간염 A형 바이러스(Hepatitis A Virus) 및 잉어의 봄 바이러스(Spring Viremia of Carp Virus)의 감염사례 및 검출사례가 증가함에 따라, 바이러스가 혼합된 시료로부터 간염 A형 바이러스 또는 잉어의 봄 바이러스를 신속하고 정확하게 검출하기 위한 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 자성비드와 항체를 결합한 면역탐침자를 고안하여, 신속하고 정확한 분리 방법을 규명하였다.

본 발명의 간염 A형 바이러스 또는 잉어의 봄 바이러스의 분리 방법을 각 단계별로 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 바이러스 탐침자의 제조

본 발명에 따르면, 자성비드-결합 프로테인 G를 항-간염 A형 바이러스 항체 또는 항-랍도바이러스 항체와 결합하여 바이러스 탐침자를 제조한다.

상기 항-간염 A형 바이러스 항체 또는 항-랍도바이러스 항체는 다양하게 준비될 수 있다.

간염 A형 바이러스 및 잉어의 봄 바이러스에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 SSEA-3 또는 TRA-1-60 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 명세서에서, 간염 A형 바이러스 및 잉어의 봄 바이러스를 언급하면서 사용되는 용어 “항체”는 간염 A형 바이러스 또는 잉어의 봄 바이러스에 대한 특이 항체로서, 간염 A형 바이러스 또는 잉어의 봄 바이러스 표면 단백질에 대해 특이적으로 결합하며, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).

항체 분자의 항원 결합 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

본 발명의 바이러스 탐침자를 제조하기 위해, 자성비드-결합 프로테인 G와 항-간염 A형 바이러스 항체 또는 항-랍도바이러스 항체를 결합하기 위한 반응을 실시한다.

바람직한 구현예에 따르면, 상기 반응은 1-100 ㎍/㎖의 항체 및 0.001-0.1% 트윈(tween) 20을 포함하는 PBS(Phosphate Buffered Saline) 하에 실온에서 진행한다.

단계 (b): 바이러스 탐침자 -바이러스 복합체의 형성

다음, 단계 (a)의 바이러스 탐침자를 분석 시료와 접촉하여 바이러스 탐침자-바이러스 복합체를 형성한다.

본 발명의 ‘분석 시료’는 바이러스를 포함할 수 있는 어떠한 시료도 해당된다. 예컨대, 동물 세포, 조직 세포, 혈액 및 혈장을 비롯해, 농수축산물 및 식품을 포함하며 이에 한정되지 않는다.

바람직하게는, 상기 단계 (b)는 실온에서, 1-30분 동안 반응한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 자성비드-결합 프로테인 G에 결합된 항-간염 A형 바이러스 항체는 간염 A형 바이러스 표면의 추정상(putative) VP1/P2A 연결 단백질에 결합하고, 자성비드-결합 프로테인 G에 결합된 항-랍도바이러스 항체는 잉어의 봄 바이러스 표면의 G 단백질 등에 결합하는 다가항체이다.

단계 (c): 바이러스 탐침자 -바이러스 복합체의 분리

마지막으로, 상기 단계 (b)의 결과물로부터 바이러스 탐침자-바이러스 복합체를 분리한다.

바람직하게는, 상기 단계 (c)는 단계 (b)의 결과물에 자석을 접촉하여 바이러스 탐침자-바이러스 복합체를 분리하여 실시한다.

바람직한 구현예에 따르면, 단계 (c)에서 분리된 바이러스 탐침자-바이러스 복합체를 용리하고 pH 7.5로 중화한 후, 분리된 바이러스를 확인한다.

바람직하게는, 상기 방법은 단계 (c)에서 분리된 바이러스 탐침자-바이러스 복합체의 바이러스에 대하여 유전자 증폭으로 유전자 분석(genetic analysis) 하는 단계를 추가적으로 포함한다.

본 발명이 유전자 증폭 방식으로 실시되는 경우, 바람직하게는 프라이머를 이용한 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있다.

본 발명의 방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 분석하여 진단한다. 본 발명은 본 발명의 마커 유전자의 뉴클레오티드 서열을 검출하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 지놈 DNA)에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 결정함으로써 조사하여 MS 또는 DM을 결정할 수 있다.

본 발명의 가장 바람직한 구현 예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.

본 발명의 방법에 따른 간염 A형 바이러스의 분리를 확인하기 위해, 바람직하게는, 상기 유전자증폭 방법은 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머쌍 또는 서열목록 제3서열 및 제4서열의 프라이머쌍을 이용하여 실시하여 간염 A형 바이러스를 검출하고 보다 바람직하게는, 네스티드 PCR(nested polymerase chain reaction)에 따라 실시한다.

본 발명의 방법에 따른 잉어의 봄 바이러스의 분리를 확인하기 위해, 바람직하게는, 상기 유전자증폭 방법은 서열목록 제5서열 및 제6서열의 프라이머쌍을 이용하여 실시하여 잉어의 봄 바이러스를 검출한다.]

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 신속하고 정확한 간염 A형 바이러스 및 잉어의 봄 바이러스의 분리방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 바이러스가 혼합된 시료로부터 간염 A형 바이러스 또는 잉어의 봄 바이러스를 순수하게 분리할 수 있다.

(c) 본 발명은 바이러스 특이적인 항원-항체 반응을 이용하여 적은 양의 바이러스도 검출할 수 있다.

도 1은 바이러스 탐침자를 제조하고 간염 A형 바이러스를 검출하는 일련의 과정을 도식화하여 보여준다.
도 2는 바이러스 탐침자-바이러스 복합체로부터 분리한 간염 A형 바이러스를 용리하여 네스티드 PCR로 확인한 결과를 보여준다.
도 3은 바이러스 탐침자를 제조하고 잉어의 봄 바이러스를 검출하는 일련의 과정을 도식화하여 보여준다.
도 4는 바이러스 탐침자-바이러스 복합체로부터 분리한 잉어의 봄 바이러스를 용리하여 RT-PCR로 확인한 결과를 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 자성비드를 이용한 면역침강법

본 발명은 바이러스 진단기술로 자성체인 자성비드-결합 프로테인 G와 HAV(Hepatitis A Virus) 항체를 연결하여 바이러스 탐침자를 제조하였다. 자성비드-결합 프로테인 G를 HAV 항체와 연결한 바이러스 탐침자의 제조과정은 다음과 같다: 자성비드-결합 프로테인 G(Invitrogen, 미국)를 50 ㎕를 취하여 1.5 ㎖ 튜브에 넣고 튜브를 자석에 붙여 상층액을 제거하였다. 그 후 0.02% 트윈(Tween) 20이 포함된 PBS(Phosphate Buffered Saline) 200 ㎕에 HAV 항체(고트 항-HAV HM175 주다가항체, catalog# PAB13966, 추정상(putative) VP1/P2A 연결단백질 항원 펩타이드, ESMMSRIAAGDLESSVDDPRSEEDKRFESHIECRKPYKELRLEVGKQRLKYAQEEL, Abnova) 10 ㎍을 용해하여 상층액을 제거한 자성비드-결합 프로테인 G가 있는 튜브에 넣고 10분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 튜브에 자석을 붙여 상층액을 제거하면 자성비드-결합 프로테인 G와 항체가 결합된 바이러스 탐침자만 남게 된다. 바이러스 탐침자 이외의 불순물을 제거하기 위해 200 ㎕ 트윈 20이 포함된 PBS로 2회 세척을 한 후 상층액을 제거함으로써 바이러스 검출을 위한 자성비드-결합 프로테인 G를 연결한 바이러스 탐침자를 제조하였다.

바이러스 탐침자와 혼합된 HAV 및 HEV(Hepatitis E Virus) 반응 조건은 다음과 같다: 제조한 바이러스 탐침자가 있는 튜브에 HAV와 HEV 1 ㎖을 혼합하여 넣고 실온에서 10분 동안 반응하였다. 면역학적 반응이 끝난 후 자석을 붙여 자성비드-결합 프로테인 G에 붙어있는 바이러스 항체와 항원의 결합이 이루어진 복합체의 자성비드 부분은 자석에 붙게 된다. 결합하지 못한 여타의 바이러스가 포함된 상층액은 PCR 분석을 위해 새로운 1.5 ㎖ 튜브에 옮겼다. 프로테인 G에 붙어있는 항원-항체 결합체를 200 ㎕ PBS로 3회 씻어내어 불순물을 제거한 후, 100 ㎕ PBS로 부유시켜 새로운 1.5 ㎖ 튜브에 옮겨 상층액을 제거하였다. 새로운 튜브에 있는 프로테인 G에 붙어있는 항원-항체 결합체를 용리액(50 mM 글라이신, pH 2.8)으로 용리하여 분리하고, 100 mM 트리스(Tris) 용액으로 pH 7.5로 중화하였다. 그리고 HAV의 순수 분리 확인을 위해 네스티드 RT-PCR을 실시하여 바이러스를 확인한다(도 1).

본 발명은 바이러스 진단기술로 G 단백질에 결합된 자성체 비드와 항-랍도바이러스(rhabdovirus)를 연결하여 바이러스 탐침자를 제조하였다. G 단백질에 결합된 자성체 비드를 항-랍도바이러스와 연결한 바이러스 탐침자의 제조과정은 다음과 같다: G 단백질에 결합된 자성체 비드(Invitrogen, 미국)를 50 ㎕를 취하여 1.5 ㎖ 튜브에 넣고 튜브를 자석에 붙여 상층액을 제거하였다. 그 후 0.02% Tween 20이 포함된 PBS(Phosphate Buffered Saline) 200 ㎕에 항-랍도바이러스(항-랍도바이러스의 제조 방법은 정제된 바이러스를 마우스에 접종하여 다가항체를 수득하였다. 이러한 방법으로 제조된 항-랍도바이러스는 전남대학교 수산생명의학과 오명주교수 연구실로부터 제공받아 본 실험에 사용함) 10 ㎍을 용해하여 상층액을 제거한 자성비드-결합 프로테인 G가 있는 튜브에 넣고 10분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 튜브에 자석을 붙여 상층액을 제거하면 자성비드-결합 프로테인 G와 항체가 결합된 바이러스 탐침자만 남게 된다. 바이러스 탐침자 이외의 불순물을 제거하기 위해 200 ㎕ 트윈 20이 포함된 PBS로 2회 세척을 한 후 상층액을 제거함으로써 바이러스 검출을 위한 G 단백질에 결합된 자성체 비드를 연결한 바이러스 탐침자를 제조하였다.

바이러스 탐침자와 혼합된 VHSV(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus) 및 SVCV(Spring Viraemia of Carp Virus) 반응 조건은 다음과 같다: 제조한 바이러스 탐침자가 있는 튜브에 VHSV와 SVCV 1 ㎖을 혼합하여 넣고 실온에서 10분 동안 반응하였다. 면역학적 반응이 끝난 후 자석을 붙여 G 단백질에 결합된 자성체 비드에 붙어있는 바이러스 항체와 항원의 결합이 이루어진 복합체의 자성비드 부분은 자석에 붙게 된다. 결합하지 못한 여타의 바이러스가 포함된 상층액은 PCR 분석을 위해 새로운 1.5 ㎖ 튜브에 옮겼다. G 단백질에 붙어있는 항원-항체 결합체를 200 ㎕ PBS로 3회 씻어내어 불순물을 제거한 후, 100 ㎕ PBS로 부유시켜 새로운 1.5 ㎖ 튜브에 옮겨 상층액을 제거하였다. 새로운 튜브에 있는 프로테인 G에 붙어있는 항원-항체 결합체를 용리액(50 mM 글라이신, pH 2.8)으로 용리하여 분리하고, 100 mM 트리스(Tris) 용액으로 pH 7.5로 중화하였다. 그리고 SVCV의 순수 분리 확인을 위해 RT-PCR을 실시하여 바이러스를 확인한다(도 3).

실시예 2: 간염 A형 바이러스의 순수분리 확인

자성비드를 이용한 면역침강법으로 바이러스 혼합물로부터 목적하는 바이러스의 분리 여부를 확인하고자 용리된 산물을 네스티드 RT-PCR을 실시하여 바이러스를 검출하였다. 바이러스를 동정하기 위해, HAV 및 HEV에 특이적인 프라이머를 이용하여 중합연쇄반응(PCR) 하였다. 프라이머 서열은 다음과 같다: HAV의 동정을 위해 HAV_2949F(5'-TAT TTG TCT GTC ACA GAA CAA TCA G-3') 및 HAV_3192R(5'-AGG AGG TGG AAG CAC TTC ATT TGA-3')를 사용하였고, HEV의 동정을 위해, HEV_EX_F(5'-CAT GGT AAA GTG GGT CAG GGT AT-3') 및 HEV_EX_R(5'-AGG GTG CCG GGC TCG CCG GA-3')를 사용하였다. 네스티드 PCR을 위해, HAV는 HAV_dkA24_F(5'-CTT CCT GAG CAT ACT TGA GTC-3') 및 HAV_dkA25_R(5'-CCA GAG CTC CAT TGA ACT C-3') 프라이머를 사용하였고, HEV는 HEV_IN_F(5'-GTA TTT CGG CCT GGA GTA AGA C-3') 및 HEV_IN_R(5'TCA CCG GAG TGY TTC TTC CAG AA-3')를 사용하였다.

바이러스 확인을 위한 PCR 조건은 다음과 같다: HAV의 PCR 조건은 변성(denaturation)단계(94℃/30초), 어닐링(annealing)단계(60℃/1분) 및 신장(extension)단계(72℃/1분)를 40 사이클 실시하고 최종 신장은 72℃로 10분 동안 실시하였다. 네스티드 PCR 조건은 변성단계는 94℃/30초, 어닐링단계는 50℃/1분 및 신장단계는 72℃/1분으로 40 사이클을 실시하고 최종 신장은 72℃ 10분 동안 실시하였다. HEV의 PCR 조건은 변성 단계(94℃/30초), 어닐링 단계(61℃/30초) 및 신장 단계(72℃/30초)를 40 사이클을 실시하고 최종 신장은 72℃로 10분 동안 실시하였으며, HEV의 네스티드 PCR 조건은 HEV의 PCR 조건과 동일한 반응온도/반응시간 조건에서 35 사이클 실시하였다. 그 결과 HAV 항체에 결합하지 않은 HEV와 일부 HAV는 제거되고, HAV 항체에 결합한 HAV는 용리액에 의해 항체 특이적으로 순수하게 분리되었음을 확인하였다(도 2).

실시예 3: 잉어의 봄 바이러스( Spring Viremia of Carp Virus ; SVCV )의 순수분리 확인

자성비드를 이용한 면역침강법을 통해 혼합된 바이러스로부터 목적하는 바이러스의 분리 여부를 확인하고자 용리된 산물을 RT-PCR을 통해 바이러스를 검출하였다. 바이러스를 동정하기 위해 중합연쇄반응에 사용된 SVCV에 특이적인 프라이머로 SVCV_F1(5'-TCT TGG AGC CAA ATA GCT CAR RTC G-3') 및 SVCV_R4(5'-CTG GGG TTT CCN CCT CAA AGY TGY-3')를 사용하였다. VHSV에 특이적인 프라이머로 VHSV_F(5'-CAG GTC CTG GAA GCA GGA AAA A-3') 및 VHSV_R(5'-CCC AGA ATG ACC CCG AAT AGG-3')를 사용하였다.

SVCV 및 VHSV의 바이러스 확인을 위한 PCR 조건은 다음과 같다: SVCV는 변성 단계(95℃/1분), 어닐링 단계(55℃/1분) 및 신장 단계(72℃/1분)를 30 사이클 동안 실시하고 최종 신장은 72℃에서 10분 동안 실시하였다. VHSV의 PCR 조건은 변성 단계(95℃/1분), 어닐링 단계(58℃/1분) 및 신장 단계(72℃/1분)를 30 사이클을 실시하고 최종 신장은 72℃에서 5분 동안 실시하였다. 그 결과 SVCV 밴드가 확인되어 SVCV가 순수하게 분리되었음을 확인 하였다(도 4).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Method for Separating Hepatitis A Virus or Spring Viremia of Carp Virus <130> PN120065 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> HAV_2949F <400> 1 tatttgtctg tcacagaaca atcag 25 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> HAV_3192R <400> 2 aggaggtgga agcacttcat ttga 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> HAV_dkA24_F <400> 3 cttcctgagc atacttgagt c 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> HAV_dkA25_R <400> 4 ccagagctcc attgaactc 19 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> SVCV_F1 <400> 5 tcttggagcc aaatagctca rrtcg 25 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> SVCV_R4 <400> 6 ctggggtttc cncctcaaag ytgy 24

Claims

다음의 단계를 포함하는 간염 A형 바이러스(Hepatitis A Virus) 또는 잉어의 봄 바이러스(Spring Viremia of Carp Virus)의 분리 방법:
(a) 자성(magenetic)비드-결합 프로테인 G를 항-간염 A형 바이러스 항체 또는 항-랍도바이러스 항체와 결합하여 바이러스 탐침자를 제조하는 단계;
(b) 상기 바이러스 탐침자를 분석 시료와 접촉하여 바이러스 탐침자-바이러스 복합체를 형성하는 단계; 및
(c) 상기 바이러스 탐침자-바이러스 복합체를 분리하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 실온에서, 1-30분 동안 반응하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 단계 (b)의 결과물에 자석을 접촉하여 바이러스 탐침자-바이러스 복합체를 분리하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (c)에서 분리된 바이러스 탐침자-바이러스 복합체의 바이러스에 대하여 유전자 증폭으로 유전자 분석(genetic analysis) 하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 유전자증폭 방법은 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머쌍 또는 서열목록 제3서열 및 제4서열의 프라이머쌍을 이용하여 실시하여 간염 A형 바이러스를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 유전자증폭은 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머쌍 및 서열목록 제3서열 및 제4서열의 프라이머쌍을 이용하여 네스티드 PCR(nested polymerase chain reaction)에 따라 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 유전자증폭 방법은 서열목록 제5서열 및 제6서열의 프라이머쌍을 이용하여 실시하여 잉어의 봄 바이러스를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.