KR20130088623A

KR20130088623A - 인체 내 활성산소 검출수단

Info

Publication number: KR20130088623A
Application number: KR1020120009981A
Authority: KR
Inventors: 윤중근; 박용애; 김태완; 강상훈
Original assignee: 주식회사 디에프아이
Priority date: 2012-01-31
Filing date: 2012-01-31
Publication date: 2013-08-08
Also published as: CN104024852A; US9194806B2; WO2013115447A1; EP2811297A4; EP2811297A1; US20140302613A1; KR101370613B1; CN104024852B

Abstract

본 발명은 소변을 검출지에 묻힘으로써 체내에 잔존하는 활성산소의 양을 정량적으로 검출하는 인체 내 활성산소 검출수단에 관한 것으로, 말론디알데하이드와 반응하여 발색변화를 일으키는 발색지시제가 묻힌 시험지가 지지대상에 부착되어 지지대의 시험지를 소변내에 침지시켜 발색변화를 통하여 활성산소의 양을 검출하는 인체내 활성산소 검출수단을 제공하는 것을 기술적 특징으로 한다. 그리고 상기시험지는 1,3-디메칠-2-티오바르비튜릭(1,3-Diethyl-2-Thiobarbituric Acid(TBA))을 발색지시제로 사용되고, 증류수에 시트릭산(Citric Acid) 10-30%, 트리소디움시트레이트(Trisodium Citrate) 20-30%를 혼합하여 제조된 1차용액에 시험지를 침지시킨 후, 약 50 내지 60℃ 정도에서 20 내지 30분 정도 건조시키고, 에틸알콜을 용매로 하여 발색지시제인 티비에이(TBA)가 2-3% 그리고 폴리머인 폴리비닐피롤리딘(PVP. Polyvinylpyrrolidone) 2-5% 를 혼합하여 제조된 2차용액에 다시 시험지를 침지시킨 후, 건조시켜 형성되도록 한다. 본 발명은 시험지를 단순히 묻히기만 하면 발색변화를 일으키므로 별도의 전문인력 및 고가의 장비도 필요하지 않아 저렴하고 간단하게 활성산소를 파악할 수 있고, 검사를 위한 특정시설이 필요하지 않으므로 언제 어디서든 간략히 검사할 수 있어 범용적인 사용이 가능한 다른 효과도 있다.

Description

인체 내 활성산소 검출수단{Means for detecting reactive oxygen species in human}

본 발명은 인체 내 유해한 요소인 활성산소 검출수단에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 소변을 검출지에 묻힘으로써 체내에 잔존하는 활성산소의 양을 정량적으로 검출해 냄으로써 보다 간편하고 신속하게 검사할 수 있도록 한 인체 내 활성산소 검출수단에 관한 것이다.

인간은 생존과 활동을 위한 충분한 에너지(ATP) 공급을 위해 탄수화물과 지방 대사에 의존하며, 이렇듯 인간은 세포 속에 산소를 공급하지 않으면 살아갈 수 없는데, 이러한 에너지 생산을 위한 인체내 산소대사의 과정에서는 부산물로서 유해 산소 또는 활성산소라고 부르는 프리 라디컬(Free radical) 이 생겨난다. 이러한 활성산소는 인체에 여러 가지 악 영향을 끼치며, 일 예를 들면 인체 조직내에 지질과산화물을 생성하는 것이다. 지질의 과산화는 세포막에서 지속적으로 일어나는 생리작용으로 불포화지질의 산화적 손상을 의미한다.

즉, 활성산소인 프리라디컬 등이 불포화지방산이 다량 함유된 세포막의 인지질을 산화시켜 세포막에 지질 과산화물이 생성된다. 즉, 활성산소의 증가는 지질의 과산화물의 생성을 증가시키며, 과도한 지질 과산화물은 뇌혈관 장애로 인한 뇌졸중, 심근경색, 알콜성 간염 등의 간장질환 등 각종 인체 질환을 일으킨다.

따라서 건강 예방의 지표로써 활성산소의 양을 정량적으로 체크하는 것은 상당히 중요한 의미를 가지나, 혈액속의 존재하는 유해한 활성산소는 반응성이 매우 뛰어나 직접적인 측정이 매우 어렵다. 따라서 간접적인 방식으로 활성산소에 의해 야기되는 지질의 과산화물의 양을 검출하여 활성산소의 표지자로로써 많이 사용한다. 통상 말론디알데하이드( Malondialdehyde (MDA))는 지질의 과산화 정도를 알 수 있는 측정 방법 중 하나로 혈액 조직에서 쉽게 검출하여 건강 영향 평가에 쓰이는 지표이며, 말론디알데하이드(Malondialdehyde (MDA))의 측정은 지질의 과산화 정도를 알 수 있고, 혈액, 소변에서 검출이 가능하여 이를 주로 이용하며, 그 방법으로는 HLPC법과 TBARS(thiobarbituric acid reactant substrate)법이 주로 사용된다. 두 방법 모두 정량까지 가능하나, 고가의 장비를 사용해야하는 HLPC법 보다는 TBARS법이 많이 사용된다. 하지만 이 방법 역시 샘플을 끓여야하고 유기용매로 추출하는 복잡한 과정을 거쳐야 하므로 비교적 그 작업에 많은 시간이 소요될 뿐만 아니라 전문적인 지식을 가진 특별한 사람만이 수행해야 하므로 범용적인 사용에 많은 제약이 따르는 문제점이 있다. 또한, 이 방법으로는 말론디알데하이드(MDA) 이외의 다른 물질도 반응할 수 있어서 특이성이 떨어지는 문제점이 있다.

종래의 이런 근본적인 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 간단히 소변을 묻혀 색의 발색변화만으로도 말론디알데하이드(MDA)의 정량적 검출이 가능하도록 함으로써 별도의 장비 및 전문인력이 불필요한 인체 내 활성산소 검출수단을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 가지는 본 발명은, 말론디알데하이드와 반응하여 발색변화를 일으키는 발색지시제가 묻힌 시험지가 지지대상에 부착되어 지지대의 시험지를 소변내에 침지시켜 발색변화를 통하여 활성산소의 양을 검출하는 인체내 활성산소 검출수단을 제공하는 것을 기술적 특징으로 한다.

그리고, 바람직 하기로는, 상기시험지는 1,3-디메칠-2-티오바르비튜릭(1,3-Diethyl-2-Thiobarbituric Acid(TBA))을 발색지시제로 사용되고, 증류수에 시트릭산(Citric Acid) 10-30%, 트리소디움시트레이트(Trisodium Citrate) 20-30%를 혼합하여 제조된 1차용액에 시험지를 침지시킨 후, 약 50 내지 60℃ 정도에서 20 내지 30분 정도 건조시키고, 에틸알콜을 용매로 하여 발색지시제인 티비에이(TBA)가 2-3% 그리고 폴리머인 폴리비닐피롤리딘(PVP. Polyvinylpyrrolidone) 2-5% 를 혼합하여 제조된 2차용액에 다시 시험지를 침지시킨 후, 건조시켜 형성되도록 한다.

또한, 상기 시험지는, 베이직 퓨크진(Basic fuchsine)을 발색지시제로 사용되고, 증류수에 Na-Metabisulfite를 20-30%, 그리고 NDS Acid 20-30%를 혼합하여 제조한 1차용액과, 에틸알콜을 용매로 하여 발색지시제인 Basic Fuchsine이 10-30% 혼합되어 제조된 2차용액 각각 시험지를 침지 및 건조시켜 형성되도록 하거나, 파라로사닐린 하이드로클로라이드(Pararosaniline Hydrochlpride)를 발색지시제로 사용하고 증류수에 Sulfosalicylic acid 20-40%, NDS Acid 20-40% 그리고 Urea 5-15%가 함유되어제조된 1차용액과, 증류수를 용매로 하여 Pararosaniline Hydrochloride 5-15% Sulfosalicylic acid 20-40% 그리고 NDS Acid 20-40%를 혼합하여 제조된 2차용액에 각각 시험지를 침지시켜 형성되도록 한다.

또한, 상기 시험지는 글리신을 발색지시제로 사용하고 증류수를 용매로 하여 글리신(Glycine) 10-30% 그리고 소디움 설페이트(Sodium sulfate) 20-40%를 혼합하여 제조하여 제조된 용액에 시험지를 침지후, 건조시켜 형성되도록 한다.

본 발명은 시험지를 단순히 묻히기만 하면 발색변화를 일으키므로 별도의 전문인력 및 고가의 장비도 필요하지 않아 저렴하고 간단하게 활성산소를 파악할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 검사를 위한 특정시설이 필요하지 않으므로 언제 어디서든 간략히 검사할 수 있어 범용적인 사용이 가능한 다른 효과도 있다.

도 1은 활성산소 측정지표인 말론디알데하이드와 티비에이의 반응에 의한 적색 색소 형성의 반응식을 보인 도.
도 2는 본 발명에 의한 활성산소 검출수단에 의한 표준용액에 의한 말론디아데하이드의 양에 따른 색변화와 비색표에 의한 대조를 보인 사진.
도 3은 시험자의 소변내에 함유된 활성산소의 양에 따른 본 발명의 검출수단의 색변화를 보인 사진.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것으로서, 본 발명은 청구항의 기재에 의해 정의될 뿐이다. 한편, 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 특징을 설명하면, 인체 내에서 활성산소에 의해 생성된 지질 과산화물의 측정지표인 말론디알데하이드(MDA)는 소변에 함유되어 있으며, 말론디알데하이드(MDA)와 정량적으로 반응하여 색변화를 일으키는 지시제가 구비된 검출수단을 소변에 침지하고, 이의 색변화 정도에 따라 활성산소의 정량을 파악하는 것이 본 발명의 주요지이다.

즉, 도1에 도시된 바와 같이, 일반적으로 알려진 바에 따르면 1,3-Diethyl-2-Thiobarbituric Acid(이하 TBA라 칭한다.) 2분자와 말론디알데하이드(MDA)와 반응하여 적색 색소(TBA2-MDA)를 형성한다. 따라서 반응의 정도에 따라 적색색소의 양에 의한 색변화가 일어나며, 이러한 색변화 정도는 흡광계를 이용하여 정량적으로 분석하거나 또는 비색표와 대조하여 양을 검출 할 수 있게 된다.

따라서 이러한 반응시약인 티비에이(TBA) 시약이 함유된 시험지를 준비하여 이를 소변에 침지함으로써 말론디알데하이드와의 정량적 반응에 의한 발색변화만으로 활성산소의 양을 알 수 있게 됨으로서 매우 간단하게 체내의 활성산소 양의 측정이 가능하게 된다. 따라서 이러한 발색지시제를 시험지 형태로 제작하는 것이 본 발명의 필수적인 요소로써 본 발명자들은 다양한 방법을 동원하여 다양한 발색지시제를 시험지 형태로 제작할 수 있게 되었다. 이하 자세히 설명하기로 한다.

시험지 제조

일반적으로 소변 검사시험지 또는 진단용 시험지를 만들기 위하여 완충용액, 중합체/계면활성제, 측정 대상물질의 지시약의 일정 농도를 용매에 용해하고 이 용액에 종이를 침지하여 제조한다. 이는 지시약이 반응물질과 반응하기 위한 최적의 조건을 유지하고 종이에 함유된 지시약 및 기타의 다른 시약이 샘플 내에 용출되는 것을 방지하기 위해서 이다. 본 발명에서는 측정대상물질인 말론디알데하이드와 반응하여 발색을 일으키는 발색지시제로는 현재 알려진 베이직 퓨크진(Basic fuchsine), 파라로사닐린 하이드로클로라이드(Pararosaniline Hydrochlpride), 글리신(Glycine) 및 티비에이(TBA,(1) 1,3-Diethyl-2-Thiobarbituric Acid)를 사용하여 각 지시제에 적합한 다양한 완충용액 조성 및 중합체/계면면활성제 등의 용액을 제작하여 적합한 시험지를 제작할 수 있었다.

실시예 1)

발색 지시제로 티비에이를 사용 할 경우를 설명하기로 한다.

1) 완충용액

지시약이 반응할 수 있는 pH, 완충제의 종류 및 농도를 확정하여 지시약이 작용할 수 있는 최적의 조건을 조성할 뿐만 아니라 조성된 시약의 pH와 현저하게 다른 pH값을 가지는 샘플에 침지할 경우 지시약이 샘플의 pH에 영향을 받지 않게 한다. 이는 지시약이 pH에 의한 색상변화가 아닌 지시약의 pKa값이 이동한 결과만이 시험지의 색상변화에 영향을 주게 하기 위함이다. 선택된 지시제의 발색은 pH2-4 사이에서 음성과 양성을 구분하는데 적합함을 알 수 있었으며, pH2 이하 4이상이었을 때 발색 저하가 나타남을 알 수 있었다.

용액에서 전자를 방출하여 pH를 낮게 하는 음이온 완충제로는 시트릭산(Citric Acid), 말론산(Malonic Acid), 술포살리실산( Sulfosalicylic acid), 엔디에스산(NDS Acid(1,5-Naphthalenedisulfonic acid tetrahydrate), 타릭산(Tartaric Acid), 시트릭코닉산(Citraconic Acid), 시아노아세틱산(Cyanoacetic Acid), 사르코신(Sarcosin)등을 사용하여 임의의 농도로 시험을 하였다. 시험에 따르면, 기본 용매 100중량부에 대하여 시트릭산(Citric Acid) 10-30중량부 범위에서 발색 구분이 용이함을 알 수 있었다. 그리고 시트릭산(Citric acid) 와 같은 음이온 완충제는 금속양이온 존재시 가지고 있는 전자를 방출하게 되어 pH가 낮게 되므로, 양이온 완충제 시약인 포타지움 시트레이트(Potassium Citrate), 보락스(Borax), 포타지움포스페이트(Porassium phosphate), 트리소디움 시트레이트(Trisodium Citrate) 등을 각각 조합하여 시험한 결과 발색 구분이 안정적이었으며. 트리소디움(Trisodium Citrate) 농도 20-30중량부 범위에서 pH 조절을 하였을때 발색에서 구분이 좋음을 알 수 있었다.

2) 계면활성제

계면활성제는 분산시약으로서 시험지 구성물이 건조 상태로 유지가 되도록 하고 안정제 역할 및 색변화를 균일하게 유지시켜준다. 본 기술에서 계면활성제는 색상강화중합체로서 지시제의 색상 형성을 안정화 시키고 반응성을 증가시켜 높은 정확성을 나타낸다. 지시제의 컬러 형성 및 용량반응을 모두 증가시키고 음성결과에서의 기본컬러(basic color)를 감소시킨다고 알려진 분자량 약 400내지 약 25000인 중합체를 첨가하여 시험하였고, 첨가제가 포함된 시험지를 음성 및 양성의 시험용액에서 침지하여 색상변화정도를 확인하여 계면활성제의 종류 및 농도를 확정하였다. 사용가능한 계면활성제로는 SDS, TritonX-100, LBS(DodecybenzeneSulfonic Acid), Dioctyl Sulfosuccinate, Glycerol등의 시약을 사용한 결과 TritonX-100은 발색이 낮아지는 경향이 있고 LBS는 후반 발색을 촉진시킴을 알 수 있었으며, 다른 시약은 큰 영향이 없는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 계면활성제를 각 발색지시제에 적합한 양은 0.1-2중량부 이다.

3) 발색지시제

티비에이(TBA)의 양에 비례적으로 발색은 증가됨을 알 수 있었다. 하지만 알콜(용매)에 대한 용해도 문제로 인해 2-3중량부가 최적의 농도로 확인되었으며, 3중량부 이상에서는 발색 증가는 미비함을 알 수 있었다.

4) Polymer

발색지시제인 티비에이의 성분인 분산입자들은 실제로 구슬모양(beads)의 입자로 구성이 되어 있다. 이것의 질량밀도는 전해 용매에 충분히 조정이 되는데 입자 침전 속도는 입자의 직경뿐만 아니라 입자와 운반용액사이의 밀도차이에 달려 있다. 특히 안정한 용액은 Beads에 사용된 고분자와 함께 전해 용매의 밀도를 조화시킴으로써 안정화 되어 진다. 특히 전해용매의 밀도를 포화시키기 위해서는 물에 녹는 폴리머로 구성된 것이 좋다. 또한 안정제 시약을 포함하는 시험지는 제조 후 병에 보관을 할 때 유효기간동안 발색과 네가티브색을 유지 할 수 있도록 도와준다.

안정제로서 하이드록시 사이클로 데스트린, 폴리메틸말레익 산, 무수폴리비닐말레익산-119 를 시험하였으나 이를 포함한 시험지는 색상 전개를 막아서 농도를 구분하는데 용이하지 못함을 알 수 있었으며,

폴리비닐피로리딘(Polyvinylpyrrolidine, PVP(10,40,55))를 사용할 경우, 분자량에 별 큰 영향은 없고 적합함을 알 수 있었으며, 최적량은 2-5중량부로 확인되었다.

5) 시험지 제작

상기와 같은 실험을 바탕으로 하여 와트만 시험지를 이용하여 완충용액을 이루는 1차용액과 발색지시제를 이루는 2차용액을 각각 준비한다.

먼저 1차용액은 100중량부의 증류수를 용매로 하여 시트릭산(Citric Acid) 10-30중량부, 트리소디움시트레이트(Trisodium Citrate) 20-30중량부를 혼합하여 제조한다. 2차용액은 100중량부의 에틸알콜을 용매로 하여 발색지시제인 티비에이(TBA,1,3-Diethyl-2-Thiobarbituric Acid)가 2-3중량부, 트리톤 X-100(Triton X-100) 0.1-2중량부 그리고 폴리머인 폴리비닐피롤리딘(PVP. Polyvinylpyrrolidone) 2-5중량부 를 혼합하여 제조한다.

상기와 같이 1차 용액과 2차용액을 준비한 후, 상기 준비된 용액에 와트만 시험지(Whatman paper) 등과 같은 용액이 쉽게 흡습될 수 있는 재질의 시험지를 침지시켜 티비에이 성분이 충분히 스며들게 한다. 즉, 1차용액에 침지시킨 후, 드라이 오븐 등과 같은 기구에서 약 50 내지 60℃ 정도에서 20 내지 30분 정도 건조시켜 1차용액이 시험지체 스며들게 한 다음, 다시 2차용액에 침지시켜 드라이 오븐에서 건조하여 최종 시험지를 제작하게 된다. 상기와 같이 제작된 시험지는 말론디알데하이드와 반응하여 붉은 색으로 발색이 되며, 실온에서 안정성이 유효하고 최저 민감도도 0.5mmol/L 까지 측정이 됨을 알 수 있었다.

6) 검출수단의 제작

상기에서와 같이 티비에이 시험지를 제작한 후, 적당한 크기로 절단하여 통상 긴 직사각형 형태로 이루어진 지지대상에 부착하여 검출수단을 제작한다. 이때 지지대 자체는 티비에이 시험지와 비반응성이고, 소변의 어떠한 성분과도 반응이 일으키지 않는 재질로 이루어져야 하며, 전방부분에 티비에이 시험지가 부착되어야 하므로 이를 고려하여 준비하면 족할 것이다. 이를 위해 폴리스티렌 재질의 고분자나 또는 폴리아크릴 재질 등 통상의 고분자 재질로 이루어지면 족할 것이며, 그 형태는 필름형태 또는 막대 형태 등 여러 가지 형태로 이루어질 수 있을 것이다. 상기 지지대의 전방부분에는 상술한 티비에이 시험지가 부착되도록 한다. 이러한 시험지의 부착은 지지대 상에 양면테이프를 이용하거나 또는 접착제 등을 이용하여 부착시키면 족할 것이다.

그리고, 상기와 같이 제작된 검출수단은 통상적으로 습기에 민감하므로 실리카겔 등의 제습제가 구비된 곳에 넣어두고 필요시에 꺼내어 사용하면 족할 것이다.

실시예2)

발색 지시제로 베이직 퓨크신(Basic fuchsine), 파라로사닐린 하이드로클로라이드(Pararosaniline Hydrochlpride)을 사용할 경우를 간단히 설명하기로 한다.

1) 완충용액

실시예1)에서와 같이 다양한 음이온완충제와 양이온 완충제를 가지고 실험을 한 결과, 지시약이 반응할 수 있는 pH, 완충제의 종류 및 농도를 확정하여 지시약이 작용할 수 있는 최적의 조건을 조성할 수 있었다.

2) 발색지시제

지시제의 양에 비례적으로 발색은 증가됨을 알 수 있었다. 하지만 각 지시제의 물성에 따른 사용양, 그리고 용매의 선택은 다양한 실험을 통하여 확립하였다.

3) 시험지 제작

먼저 발색지시제로 베이직 푸크신(Basic Fuchsine)을 이용한 경우를 설명한다. 1차용액은 용매로 100중량부의 증류수에 Na-Metabisulfite를 20-30중량부, 그리고 NDS Acid 20-30주양부를 혼합하여 제조한다. 그리고 2차용액은 100중량부의 에틸알콜을 용매로 하여 발색지시제인 Basic Fuchsine이 10-30중량부가 혼합되도록 하여 제조되도록 한다.

상기와 같이 1차용액와 2차용액을 제조한 후, 실시예1)에서와 동일하게 와트만시험지를 1차용액에 침지후 건조하고, 다시 이를 2차용액에 침지 건조시켜 최종 시험지를 제조한다. 이 경우 붉은색으로 발색이 되지만 실온 보관이나 냉장보관시 안정성이 실시예1)에 비하여 약간 떨어짐을 알 수 있었다.

발색지시제로 파라로사닐린 하이드로클로라이드(Pararosaniline Hydrochlpride)이용한 경우를 설명한다. 1차용액은 용매로 100중량부의 증류수에 Sulfosalicylic acid 20-40중량부, NDS Acid 20-40중량부 그리고 Urea 5-15중량부가 함유되도록 하여 제작한다.

그리고 2차 용액은 100중량부의 증류수를 용매로 하여 Pararosaniline Hydrochloride 5-15중량부 Sulfosalicylic acid 20-40중량부 그리고 NDS Acid 20-40중량부를 혼합하여 제조되도록 한다. 동일하게 시험지를 제작하며, 이 경우에는 붉은색으로 발색이 되며, 실온에서 안정성이 좋지 않지만 냉장보관시 안정성이 유효함을 알 수 있었다.

실시예3)

발색 지시제로 글리신(Glycine)을 사용할 경우를 간단히 설명하기로 한다.

글리신의 경우 실시예1)과 실시예2)에서와 같이 별도의 완충용액을 제작할 필요가 없이 100중량부의 증류수를 용매로 하여 글리신(Glycine) 10-30중량부 그리고 소디움 설페이트(Sodium sulfate) 20-40중량부를 혼합하여 제조하면 족할 것이다.

이 경우에는 와트만 시험지를 혼합용액에 적신 후, 건조시켜 최종시험지를 제작하게 되며, 말론디알데하이드와 반응하여 노랑색으로 발색이 됨을 알 수 있었으며, 실온의 안정성이 유효하나, 저농도 발색의 민감도가 약간 떨어짐을 알 수 있었다.

시험예1)

엠디에이가 적정 농도로 함유된 샘플을 준비한다. 적정 농도는 0.2, 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5 그리고 10mmol/L가 되도록 준비한다. 상기 샘플의 엠디에이 농도의 적합성을 테스트하기 위하여 종래 알려진 엘리사법(ELISA)으로 시험하였다.

3. 결과

상기 각 준비된 적정 농도의 샘플을 검출수단에 묻혔을 경우 검출수단의 티비에이 시험지에 함유된 티비에이 성분이 샘플 용액속의 엠디에이 성분과 반응하여 색변화를 일으키며, 엠디에이 농도가 높을 수록 색변화 역시 점차로 짙게 발색됨을 알 수 있다. 이를 도2의 사진을 참조하여 설명한다. 먼저, 도2(a)는 비색표를 나타낸 것이고, 도2(b)는 실지 발색지시제가 말론디알데하이드와 반응하여 색변화를 일으킨 모습을 나타낸 도이다. 도시된 바와 같이, 시험지의 색변화와 비색표를 비교해 보면 단순한 색변화만으로도 충분히 말론디알데하이드의 양의 검출이 어느 정도 이루어졌는지 알 수 있으므로 간단히 시각적으로 확인할 수 있음을 알 수 있다. 물론 이러한 색변화를 흡광계를 이용하여 정량적인 농도 값으로 측정하면 족할 것이며, 간단한 시험을 위해서는 비색표에 의한 시각적 색변화 구분만으로도 사용자가 확인 할 수 있으며, 농도가 0-0.3mmol/L 까지는 정상(Normal), 0.4 이상 2.5mmol/L 까지는 주의(small), 2.5 이상 6mmol/L 까지는 다소높음(Moderate) 그리고 6mmol/L 이상일 경우 높음(Large)의 네단계로 구분할 수 있었다. 그리고 비교 테스트를 위한 엘리사법과 비교한 아래 표1을 보면, 본 발명에 의한 검출수단이 엠디에이와 정량적으로 반응함을 알 수 있다.

농도 (mmol/L)	본발명검출수단	ELISA	비고
0	Normal	0.00
0.2	Normal	0.22
0.5	Small	0.47
1	Small	1.12
2.5	Moderate	2.67
5	Moderate	5.14
7.5	Large	7.41
10	Large	9.87

시험예2)

본 실시예에서는 실지 인체 내에 존재하는 활성산소의 양을 측정하기 위한 수단으로 유효한가 검증하기 위하여 20대 남성 5명 여성 5명을 임의로 선정하고, 각 시험자의 소변을 채취하여 테스트하였다. 비교실험을 위하여 종래 일반적으로 사용하는 엘리사법과 비교하였다.

대상	본 발명 검출수단	ELISA(mmol/L)	비고
1	Normal	0.19
2	Normal	0.3
3	Large	8.89
4	Moderate	4.5
5	Normal	0.28
6	Small	1.2
7	Large	8.1
8	Small	0.76
9	Small	0.82
10	Moderate	4.59

상기 표2에서 나타난 바와 같이, 실지 인체 내의 소변에서의 활성산소 양은 고가의 장비를 활용한 엘리사법과 거의 유사한 결과를 나타내고 있음을 알 수 있다. 즉, 도 3의 사진에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의한 검출수단에 소변을 묻힌 결과 다양한 색변화를 나타남을 알 수 있으며, 실험자1 내지 실험자6의 실지 검출수단의 색변화는 비색표에서 나타난 것으로 충분히 구분이 이루어지며, 이러한 색변화정도는 시험자의 소변내에 함유된 활성산소의 양에 따른 것이며, 이러한 색변화와 엘리사법은 거의 유사한 결과를 나타냄으로 본 발명은 단순히 소변내에 검출수단을 묻히고, 그 색변화를 관찰하는 것만으로도 활성산소의 정량적 측정이 가능함을 알 수 있다.

Claims

말론디알데하이드와 반응하여 발색변화를 일으키는 발색지시제가 묻힌 시험지가 지지대상에 부착되어 지지대의 시험지를 소변내에 침지시켜 발색변화를 통하여 활성산소의 양을 검출하는 것을 특징으로 하는 인체 내 활성산소 검출수단.
제 1항에 있어서,
상기시험지는,
1,3-디메칠-2-티오바르비튜릭(1,3-Diethyl-2-Thiobarbituric Acid(TBA))을 발색지시제로 사용됨을 특징으로 하는 인체 내 활성산소 검출수단.
제2항에 있어서,
상기 시험지는,
100중량부의 증류수를 용매로 하여 시트릭산(Citric Acid) 10-30중량부, 트리소디움시트레이트(Trisodium Citrate) 20-30중량부를 혼합하여 제조된 1차용액과, 100중량부 에틸알콜을 용매로 하여 발색지시제인 티비에이(TBA)가 2-3중량부, Triton X-100 가 0.1-2중량부 그리고 폴리머인 폴리비닐피롤리딘(PVP. Polyvinylpyrrolidone) 2-5중량부를 혼합하여 제조된 2차용액에 각각 시험지를 침지시켜 형성됨을 특징으로 하는 인체 내 활성산소 검출수단.
제3항에 있어서,
상기 시험지는,
1차용액에 침지시킨 후, 약 50 내지 60℃ 정도에서 20 내지 30분 정도 건조시키고, 다시 2차용액에 침지시킨 후, 건조하여 형성됨을 특징으로 하는 인체 내 활성산소 검출수단.
제1항에 있어서,
상기 시험지는,
베이직 퓨크진(Basic fuchsine)을 발색지시제로 사용됨을 특징으로 하는 인체 내 활성산소 검출수단.
제5항에 있어서,
상기 시험지는,
용매로 100중량부의 증류수에 Na-Metabisulfite를 20-30중량부, 그리고 NDS Acid 20-30중량부를 혼합하여 제조한 1차용액과, 에틸알콜을 용매로 하여 발색지시제인 Basic Fuchsine이 10-30중량부 혼합되어 제조된 2차용액 각각 시험지를 침지시켜 형성됨을 특징으로 하는 인체 내 활성산소 검출수단.
제6항에 있어서,
상기 시험지는,
1차용액에 침지시킨 후, 약 50 내지 60℃ 정도에서 20 내지 30분 정도 건조시키고, 다시 2차용액에 침지시킨 후, 건조하여 형성됨을 특징으로 하는 인체 내 활성산소 검출수단.
제1항에 있어서,
상기 시험지는,
파라로사닐린 하이드로클로라이드(Pararosaniline Hydrochlpride)를 발색지시제로 사용됨을 특징으로 하는 인체 내 활성산소 검출수단.
제8항에 있어서,
상기 시험지는,
용매로 100중량부의 증류수에 Sulfosalicylic acid 20-40중량부, NDS Acid 20-40중량부 그리고 Urea 5-15중량부가 함유되어 제조된 1차용액과,
100중량부의 증류수를 용매로 하여 Pararosaniline Hydrochloride 5-15중량부 Sulfosalicylic acid 20-40중량부 그리고 NDS Acid 20-40중량부를 혼합하여 제조된 2차용액에 각각 시험지를 침지시켜 형성됨을 특징으로 하는 인체 내 활성산소 검출수단.
제9항에 있어서,
상기 시험지는,
1차용액에 침지시킨 후, 약 50 내지 60℃ 정도에서 20 내지 30분 정도 건조시키고, 다시 2차용액에 침지시킨 후, 건조하여 형성됨을 특징으로 하는 인체 내 활성산소 검출수단.
제1항에 있어서,
상기 시험지는,
글리신을 발색지시제로 사용됨을 특징으로 하는 인체 내 활성산소 검출수단.
제11항에 있어서,
상기 시험지는,
100중량부의 증류수를 용매로 하여 글리신(Glycine) 10-30중량부 그리고 소디움 설페이트(Sodium sulfate) 20-40중량부를 혼합하여 제조하여 제조된 용액에 시험지를 침지후, 건조시켜 형성됨을 특징으로 하는 인체 내 활성산소 검출수단.