KR20130068135A

KR20130068135A - 신규 ｏ-포스포세린 설프하이드릴라아제를 이용하여 시스테인 또는 이의 유도체를 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20130068135A
Application number: KR1020110135665A
Authority: KR
Inventors: 송병철; 장진숙; 조재현; 김혜원
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2011-12-15
Filing date: 2011-12-15
Publication date: 2013-06-25
Also published as: MY164371A; MY176977A; PH12014501353B1; CA2859125C; JP2015500039A; CA2914131A1; WO2013089478A2; US20150004657A1; EP2792748B1; BR112014014762A2; EP2792748A2; PH12014501353A1; BR112014014762B1; CN104039963B; RU2579689C1; BR122019023670B1; CN104039963A; BR112014014762A8; US9243268B2; ES2634683T3

Abstract

본 발명은 신규 O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase)를 이용하여 시스테인 또는 이의 유도체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 신규 O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)를 이용하여 O-포스포세린을 기질로 하여 시스테인을 생산하는 방법을 제공함으로써, 이를 이용하여 간편한 방법으로 고수율로 친환경적인 시스테인을 용이하게 생산할 수 있다는 이점이 있다.

Description

신규 Ｏ-포스포세린 설프하이드릴라아제를 이용하여 시스테인 또는 이의 유도체를 생산하는 방법{Method of producing cysteine or derivatives thereof using novel O-phosphoserine sulfhydrylase}

본 발명은 신규 O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase)를 이용하여 시스테인 또는 이의 유도체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

시스테인은 모든 생물체의 황 대사에 있어서 중요한 아미노산으로 모발의 케라틴 등 생체 내 단백질, 글루타치온, 바이오틴, 메치오닌 및 기타 황을 함유한 대사산물의 합성에 사용될 뿐만 아니라 코엔자임A 생합성의 전구물질로 사용된다. 또한, 시스테인 생합성은 세린, 글리신, 메치오닌 등 다른 아미노산의 생합성과 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다. 산업적으로, 시스테인 및 그 유도체는 제약분야(기관지질환 치료), 화장품 분야(헤어샴푸 및 퍼머웨이브로션의 성분) 및 식품분야(항산화제, 풍미증진제 및 반죽보조제)에 사용되고 있다.

지금까지 시스테인은 주로 사람의 머리카락이나, 동물의 깃털 등을 원료로 하여 화학적인 산-가수분해공정으로 생산되어 왔다. 그러나 머리카락으로부터 추출하는 시스테인의 생성 수율은 7~8%로 매우 낮으며, 추출과정 중 사용하는 염산과 황산의 사용으로 환경오염 폐기물이 과량 생성된다. 또한 원재료로 머리카락을 이용함으로 소비자들에게 혐오감을 불러 일으킬 수 있다. 이러한 문제들로 인해 친환경적 시스테인 생산공정의 개발요구가 높아졌으며, 이에 따라 미생물을 이용하여 시스테인을 생산하는 방법이 개발되었다.

미생물을 이용하여 시스테인을 생산하는 방법으로 1) 우선, D,L-ATC에 미생물을 이용하여 생물학적으로 전환하는 방법이 알려져 있다. 하지만 이 방법은 전구체인 D,L-ATC의 용해도가 낮아 산업화에 어려움이 있다. 2) 또 다른 방법은 대장균을 이용한 직접 발효법으로 시스테인을 생산하는 방법이 알려져 있다. 이 방법은 미생물 내 시스테인이 과량 축적될 경우 세포내 독성을 나타낼 수 있어, 미생물을 이용하여 높은 농도의 시스테인을 생산하는데 한계가 있다.

미생물 및 식물의 시스테인 생합성 경로 중 하나를 살펴보면, O-아세틸세린(O-acetyl-serine, OAS)은 시스테인의 탄소골격의 중간 전구물질로서 작용한다. OAS는 sulfur donor로 황화수소(Hydrogen sulfide)를 이용하여 O-아세틸세린 설프하이드릴라아제(O-acetyl-serine sulfhydrylase, OASS)에 의해 시스테인으로 전환된다. 그리하여 OAS를 축적하는 미생물과 다양한 sulfur donor로부터 OASS를 이용하여 시스테인을 생산할 수 있다(미국등록특허 US6,579,705).

본 발명자들은 이와는 다른 새로운 시스테인 생산 방법을 모색하던 중 특정 미생물에서는 O-포스포세린 (O-phospho-serine, OPS)을 이용하여 시스테인을 합성하는 효소(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)가 존재한다는 사실을 알게 되었다. OPS는 세린(L-serine)의 중간 전구물질이므로 OAS보다 대사경로가 짧아, OPS를 이용할 경우 OAS를 이용할 때보다 전구체 생산에 유리할 수 있다. 특히, 트리코모나스 배기날리스(Trichomonas vaginalis) 유래의 OPSS는 마이코박테리움 투베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유래의 OPSS와 다르게 mec+ 및 cys0과 같이 황을 전달해주는 보조효소가 필요하지 않고, 에어로파이럼 퍼닉스 (Aeropyrum pernix)의 OPSS 와 다르게 37℃에서 최적 활성을 나타낸다는 것을 알게 되었다.

이러한 사실을 바탕으로, 본 발명자들은 고수율로 시스테인을 생산하는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 다양한 미생물로부터 OPS를 기질로 하여 시스테인을 합성하는 활성을 갖는 신규 OPSS를 동정하고, 상기 신규 OPSS가 기존에 알려진 트리코모나스 배기날리스의 OPSS보다 시스테인 합성 활성이 증가된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 신규 O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에, O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)을 황화물과 반응시켜 시스테인 또는 이의 유도체를 제조하는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 또는 2로 기재된 아미노산 서열을 가지는 O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에, O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)을 황화물과 반응시켜 시스테인 또는 이의 유도체를 제조하는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase, 이하 OPSS)"는 O-포스포세린(O-phosphoserine, 이하 OPS)에 티올 그룹(thiol group, SH기)을 제공함으로써, OPS를 시스테인으로 전환해주는 활성을 가지는 효소를 말한다.

본 발명에서 상기 OPSS는 서열번호 1 또는 2로 기재된 아미노산 서열일 수 있으며, 이는 본 발명자들에 의해 새롭게 동정된 OPSS이다. 상기 서열번호 1 또는 2로 기재된 아미노산 서열은 OPSS의 활성을 가지며, 그 활성을 유지하는 한 일정 정도 변형이 가능하다. 본 기술 분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성이 유지되는 아미노산 서열이 본 발명에서 목적하는 활성을 보유하는 한, 본 발명의 상기 아미노산 서열과 균등한 것임을 쉽게 이해할 것이다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 Dac-OPSS 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 Dal-OPSS를 이용하여 정제된 OPS 및 OPS 발효액을 기질로 한 시스테인 합성 활성을 평가한 결과, 대조군인 Tva-OPSS에 비하여 높은 시스테인 전환율을 보임을 확인함으로써, 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 갖는 OPSS가 고수율로 시스테인을 생산할 수 있음을 확인하였다(도 1, 도 3, 표 3 및 표 4).

본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리펩티드 모이티 사이의 서열 유사성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 유사성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열 정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 또한, 상동성은 상동 영역간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오타이드를 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.

본 발명에서 용어, "서열 유사성"은 공통 진화 기원을 공유하거나 하지 않을 수 있는 단백질의 염기 서열이나 아미노산 서열 간의 동일성이나 상응성 정도를 말한다. 하나의 구체예에서, 두 개의 아미노산 서열이 아미노산 서열의 소정의 길이에 대해 폴리펩티드 매치가 적어도 21%(바람직하게 적어도 약 50%, 가장 바람직하게 약 75%, 90%, 95%, 96%, 97% 또는 99%)일 때, "실질적으로 상동" 또는 "실질적으로 유사"하다. 실질적으로 상동인 서열은 데이터 은행에서 사용되는 표준 소프트웨어를 사용하거나, 예를 들면 특정한 시스템을 위해 정의된 엄격한 조건하에서 썼던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있다. 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이다(예. Sambrook et al., 1989,infra 참고).

본 발명에서 용어, "시스테인 전환"은 OPSS의 촉매 작용에 의해 기질인 OPS로부터 생산물인 시스테인으로 전환되는 반응, 즉 OPS를 시스테인으로 전환하여 시스테인을 수득하는 반응을 의미한다. 또한, 용어 "시스테인 전환율"은 OPS가 시스테인으로 전환된 비율을 의미한다. 최적의 반응 조건에서 OPS 1몰은 시스테인 1몰로 전환되면, 예를 들어 OPS 100몰로부터 전환반응을 거쳐 시스테인 100몰이 수득되었을 경우, 시스테인 전환율이 100%가 된다. 본 발명의 OPSS는 OPS를 시스테인으로 전환하는 과정을 거치므로 OAS를 이용하는 대사경로보다 짧아 전구체 생산에 유리할 뿐만 아니라, 기존의 OPSS와 달리 황을 전달해주는 보조효소(M. tuberculosis의 mec+ 및 cys0)의 존재 없이, OPSS 자체로 시스테인을 생산할 수 있는 이점이 있다.

본 발명의 OPSS는 서열번호 9 내지 12의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 것일 수 있다. 본 발명의 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 가지는 OPSS는 각각 서열번호 9 또는 10의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 이종 단백질을 대장균에서의 발현을 높이기 위하여 코돈 사용빈도(codon usage)가 대장균에 최적화된 서열번호 11 또는 12의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 OPSS를 발현하는 미생물은 내재적으로 본 발명의 OPSS를 발현하는 미생물 또는 본 발명의 OPSS를 암호화하는 염기서열이 벡터 형태로 또는 염색체 내에 삽입된 형태로 도입된 미생물일 수 있다. 상기 OPSS를 발현하는 미생물은 추가로 OPSS의 활성이 강화될 수 있다. OPSS 활성을 강화하는 방법으로는 OPSS를 코딩하는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 상기 미생물에 도입하는 방법에 의하여 카피수를 증가시키는 방법, 상기 염기서열의 코돈 사용빈도(coodon usage)를 상기 미생물에서 주로 이용되는 코돈 사용빈도에 따라 최적화하는 방법, 상기 OPSS를 발현하는 미생물에서 상기 OPSS를 암호화하는 유전자의 프로코터를 강한 프로모터로 교체하는 방법, 상기 프로모터에 변이를 도입하는 방법 및 상기 OPSS의 활성이 강화되도록 상기 신규 분리한 OPSS를 암호화하는 유전자에 변이를 도입하는 방법 등이 있다.

본 발명에서 용어, "벡터"는 숙주 세포를 이용하여 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다.

본 발명에서 상기 OPSS를 발현하는 미생물은 상기 OPSS를 포함한 벡터를 형질전환시키는 방법에 의해 얻어진 미생물일 수 있는데, 상기 형질전환의 방법은 염기를 세포 내로 도입하는 어떠한 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 그 예로, 일렉트로포레이션 (electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전 (calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염 (retroviral infection), 미세주입법 (microinjection), DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran), 양이온 리포좀 (cationic liposome) 법 등이 있고, 이로 제한되지 않는다.

상기 OPSS를 발현하는 미생물은 원핵세포 또는 진핵세포 모두 가능하며, 바람직하게는 엔테로박테리아과 미생물 또는 코리네형 미생물 등, 더욱 바람직하게는 에스케리키아속 미생물, 세라티아속 미생물 등일 수 있으며, 가장 바람직하게는 대장균일 수 있다.

본 발명을 통해 상기의 신규 분리한 OPSS를 발현하는 미생물을 배양하여 그 배양액으로부터 OPSS를 분리시킬 수 있다. 당업계에서 통상적으로 알려져 있는 방법은 모두 사용될 수 있으며, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 pET 발현 시스템 매뉴얼(Novagen Inc.)을 이용하여 미생물을 배양하고, Ni-NTA columns으로 분리하는 방법을 이용하였다.

본 발명에 있어서, 신규 OPSS의 기질로 사용되는 OPS는 시중에 판매되는 정제된 OPS 뿐만 아니라, 발효를 통해서 제조된 OPS 발효액을 사용할 수 있다. 상기 정제된 OPS는 예를 들어 Sigma-Aldrich 사의 P0878 제품번호 또는 Wako사의 CAS407-41-0 제품번호로 구매할 수 있다. 또한, 상기 OPS 발효액은 OPS 생산능을 가지는 미생물, 예를 들어 기탁번호 KCCM 11103P(CA07-0022/pCL-prmf-serA*(G336V)-serC; 대한민국 출원특허 제10-2011-0086081호 참조)로 수탁된 미생물을 배양함으로써 제조될 수 있다.

본 발명에서 용어, "황화물(sulfide)"은 황과 그보다 양성인 원소와의 화합물을 총칭한 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 시스테인 또는 이의 유도체 제조시 사용되는 화합물이다. 상기 황화물은 당해 기술분야에서 통상적으로 사용하는 고형뿐 아니라, pH, 압력, 용해도의 차이로 인해 액체 또는 기체의 형태로 제공되어 설파이드 (sulfide, S² ^-), 티올설페이트(thiosulfate, S₂O₃ ² ^-) 등의 형태로 티올그룹 (thiol group, SH기)으로 전환될 수 있는 모든 황화물이면 이용 가능하다. 바람직하게는 Na₂S, H₂S, NaSH, (NH₄)₂S 및 S₂O₃를 이용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 Na₂S을 황 소스로 사용하였다. 본 발명의 반응은 하나의 OPS 반응기에 하나의 티올기를 제공하여 하나의 시스테인 또는 시스테인 유도체를 제조하는 반응으로, 상기 반응시 황화물의 첨가량은 이에 제한되지는 않으나 반응시 첨가되는 OPS 몰 농도의 0.1 내지 3배가 바람직하며, 1 내지 2배가 보다 바람직하다.

본 발명의 OPSS가 최적의 효소 전환이 가능하도록 하는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하다. 그 방법의 예는, 이에 제한되지는 않으나, OPSS 효소의 특성을 파악하는 방법, 바람직하게는 OPSS 효소 최적의 활성 온도, pH, 기질에 대한 저해 유무 및 농도 그리고 OPSS 효소 자체의 열 안정성 파악 등이 있으며, 효소 전환 반응의 최적 조건을 파악하는 방법, 특히 효소 전환 반응시 사용되는 최적의 OPSS 효소 농도 및 사용되는 기질들의 최적 발란스 농도, OPS 기질 외에 효소 전환 반응시 사용되는 황화물에 대한 선호도, 전환 반응시 사용되는 버퍼 선호도와 이로 인해 발생되는 이온영향성 그리고 보조효소 들의 존재 유무 및 최적 농도 파악 등이 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 Dal-OPSS를 이용하여 pH 및 온도별 시스테인 전환율을 확인한 결과, pH의 경우 7.0 내지 7.4에서 최적의 활성을 보이며(도 2), 온도의 경우 37℃에서 최적의 활성을 보임을 확인하였다(도 4).

본 발명에 있어서, 시스테인 전환 반응시 추가적인 보조인자(cofactor)로서 PLP(pyridoxal-5'-phosphate), DTT(dithiothreitol), 또는 PLP 및 DTT를 동시에 첨가할 수 있다. 상기 보조인자들은 시스테인 전환 반응에서 그 효율을 증가시킬 수 있으며, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 0.2 mM PLP, 25 mM DTT, 또는 두 보조인자를 동시에 첨가하는 경우 시스테인 전환율이 증가하였음을 확인하였다(표 5). 상기 PLP는 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 0.001 내지 2 mM 첨가할 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.01 내지 1 mM 첨가할 수 있다. 또한, 상기 DTT는 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 0.001 내지 100 mM 첨가할 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.01 내지 50 mM 첨가할 수 있다.

본 발명의 방법은 상기 반응 단계를 통하여 생산된 시스테인 또는 이의 유도체를 분리 및 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 단계에서는 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 반응액으로부터 목적하는 시스테인을 분리 및 정제하여 수집할 수 있다.

당업자라면 공지된 화학적 합성 방법으로, 본 발명의 방법으로 제조된 시스테인으로부터 시스테인 유도체를 용이하게 합성할 수 있다. 시스테인은 아세틸레이션 에이젼트(acetylation agent)와 반응하여 NAC(N-acetylcysteine)로 쉽게 합성될 수 있으며, 염기성 조건에서는 할로아세틱 에시드(haloacetic acid)와 반응시킴으로써 SCMC(S-Carboxymetylcysteine)로 합성될 수 있다. 상기 시스테인 유도체는 주로 제약원료로써 진해제, 기침완화제, 기관지염, 기관지 천식과 인후염 등의 치료제로 사용된다.

본 발명에 따라 신규 O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)를 이용하여 O-포스포세린을 기질로 하여 시스테인을 생산하는 방법을 제공함으로써, 이를 이용하여 간편한 방법으로 고수율로 친환경적인 시스테인을 용이하게 생산할 수 있다는 이점이 있다.

도 1은 3종의 OPSS를 이용하여 10분, 30분 및 60분에 시스테인 전환율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 Dal-OPSS의 pH 민감성을 확인하기 위하여 pH별 시스테인 전환율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 OPS 발효액과 황화물을 기질로 3종의 OPSS를 이용하여 10분, 30분 및 60분에 시스테인 전환율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 Dal-OPSS의 온도별 시스테인 전환율을 측정한 결과를 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: O- 포스포세린 설프하이드릴라아제(O- phosphoserine sulfhydrylase, OPSS ) 효소 동정

Trichomonas vaginalis 유래의 OPSS는 OPSS 외에 2가지의 보조효소가 필요한 Mycobacterium tuberculosis 유래의 OPSS와는 달리 보조효소 없이도 활성을 나타내며, 60℃에서 최적 활성을 나타내는 Aeropyrum pernix의 OPSS와는 달리 37℃에서 최적 활성을 나타내는 것으로 보고되었다. 상기 사실을 바탕으로 본 발명자들은 T. vaginalis의 OPSS 아미노산 서열을 기반으로 하여 이와 단백질 서열유사성이 높은 미생물 유래의 신규 OPSS를 확보하였다. 상기 신규 OPSS는 각각 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열을 가지며, Dac-OPSS 및 Dal-OPSS로 명명하였다. 또한, 상기 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열을 갖는 신규 OPSS는 각각 서열번호 9 및 10의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.

상기 두 OPSS는 대장균 유래가 아니므로 대장균에서의 발현이 용이하지 않을 수 있다. 대장균에서의 발현을 용이하게 하기 위해 상기 신규 분리한 OPSS들의 코돈사용빈도 최적화를 진행하였으며, 이는 코돈사용빈도 최적화도구인 Jcat을 이용하였다(www.jcat.de). 이를 통해 상기 폴리뉴클레오티드에 대한 서열번호 9 및 10의 코돈사용빈도가 최적화된 서열번호 11 및 12를 획득하였다. 상기 서열번호 11 및 12의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드는 제노텍(Genotech Corp.)에 상기 염기서열들을 제공하여 합성하였으며, Topo TA cloning을 통한 벡터 형태로 공급받았다. 각각의 균주로부터 OPSS 효소를 획득하기 위하여, 통상적으로 효소 발현을 위해 이용되는 pET28a (novagen) 벡터 시스템을 제작하였다.

총 3종의 OPSS 효소 발현 벡터명과 벡터를 제작하기 위해 사용한 각각의 주형 및 프라이머는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다. 주형과 프라이머 조합을 맞추어 PCR 기법을 통해 각각의 OPSS 유전자를 증폭하여 얻은 유전자 단편과 벡터 pET28a를 NdeI과 HindIII 제한효소로 처리(37℃, 3시간 반응)하였다. 이후 통상적인 라이게이션 기법을 사용하여 pET28a 벡터에 각각의 유전자 단편을 삽입하였다. 각각의 효소 발현 벡터 제작 유무 및 유전자 서열은 시퀀싱 기법으로 모두 확인하였다. 상기 제작된 효소 발현 벡터를 DE3 유전자형을 가진 대장균에 도입하여 총 3종의 OPSS 효소를 획득할 수 있는 균주를 제작하였다.

효소명	벡터명	사용한 주형	사용한 프라이머
Tva-OPSS	pET28a-Tva-OPSS	합성 DNA	서열번호 3(F) 및 4(R)
Dac-OPSS	pET28a-Dac-OPSS	합성 DNA	서열번호 5(F) 및 6(R)
Dal-OPSS	pET28a-Dal-OPSS	합성 DNA	서열번호 7(F) 및 8(R)

효소를 발현하기 위한 방법은 pET system 매뉴얼 (novagen)을 참조하였다. 평판 LB 배지에서 각각의 균주의 단일 콜로니를 선별하여 5ml LB 액체배지에 접종하여 37℃, 200 rpm 조건으로 16시간 배양하였다. 이를 다시 새로운 25 ml LB 액체배지(250 ml 용량의 플라스크)에 250 ml 재접종하여 OD₆₀₀이 0.5~0.6가 되도록(2~3시간) 동일 배양 조건에서 키운 직후, 1 mM IPTG을 배지에 첨가하여 18℃, 120 rpm의 조건으로 18시간 배양하여 효소 발현을 유도하였다. 효소의 정제를 위한 방법은 his-tag을 이용하여 Ni-NTA columns으로 분리하였다. 정제 방법은 His spintrap(GE healthcare)을 이용하였다.

실시예 2: OPSS 효소의 시스테인 합성 활성 평가

OPS를 기질로 한 시스테인의 합성 여부를 파악하기 위해 확보한 총 3종의 OPSS 효소의 시스테인 합성 활성을 측정하였다. 시스테인 합성 활성 평가 (cysM enzyme assay) 조건 및 방법은 문헌 보고(Mino K and Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003; Burns KE, Baumgart S, Dorrestein PC, Zhai H, McLafferty FW and Begley TP, J. Am. Chem. Soc., 127: 11602-11603, 2005; Westrop GD, Goodall G, Mottram JC and Coombs GH, J. Biol. Chem., 281: 25062-25075, 2006)에 기재된 방법을 인용하였다. 효소 활성을 측정하기 위한 조건은 하기 표 2와 같다.

Stock sol'n	Final Conc.	Blank	OPSS
6xhis-enzyme		-	40 (50 ㎍)
1 M HEPES(pH7.4)	100 mM HEPES	100	100
0.5 M Na2S	10 mM Na2S	20	20
10 mM PLP	0.2 mM PLP	20	20
100 mM OPS	5 mM OPS	0	50
DW		790	750
Total		1000	1000

효소를 제외한 반응액을 37℃에서 5분간 배양시킨 후, 정제된 OPSS 50 ㎍을 첨가하여 37℃에서 반응하여, 시간별로 효소 반응액 100 ml를 취하여 33.2% TCA 100 ml와 혼합하여 반응을 중지시켰다. 효소 반응액 내의 시스테인의 농도는 Gaitonde 방법으로 OD₅₆₀ 파장에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 도 1 및 하기 표 3은 3종의 OPSS들의 시스테인 합성 활성을 보여주며, 반응 시간별 시스테인 전환율을 비교하여 OPSS들의 시스테인 합성 역가를 평가하였다.

	시스테인 전환율(%)
	10분	30분	60분
Tva-OPSS	5.94	11.48	19.32
Dac-OPSS	19.47	26.47	40.26
Dal-OPSS	94.98	95.52	98.65

상기의 결과로부터, Tva-OPSS의 경우 OPS을 기질로 하여 시스테인을 합성하는 활성을 가지고 있음을 검증하였으며, 신규 OPSS인 Dac-OPSS 및 Dal-OPSS의 시스테인 합성 활성을 처음으로 확인하였다. 또한, Tva-OPSS에 비하여, Dac-OPSS 및 Dal-OPSS를 이용한 경우에 시스테인 전환율이 증가하였으며, 특히 Dal-OPSS의 경우에는 현저하게 그 활성이 높음을 확인하였다.

실시예 3: OPSS 효소의 pH 민감성

시스테인 합성 과정에서 pH가 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여, Dal-OPSS의 pH별 시스테인 전환율을 확인하였다. 100 mM 버퍼 조건에서 50 ㎍/ml 사용하여 37℃, 30분간 반응하였다. K-phosphate buffer pH 6.4 / 7.0 / 7.4 / 8.0, Tris-HCl buffer pH 7.0 / 7.4 / 8.0 / 8.5 / 8.8, Na-carbonate buffer 8.0 / 8.5 / 9.0 / 10.0 HEPES buffer 7.4, Na-citrate buffer 4.0 / 5.0 / 6.0을 사용하였다. 생성된 시스테인은 Gaitonde 방법으로 정량하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, pH 7.0~7.4 사이에서 가장 높은 활성을 보였으며, 가장 높은 활성을 보인 조건은 Tris-HCl(pH 7.0)이고, Na-citrate, Na-carbonate 버퍼에서는 활성을 거의 보이지 않았다. 또한, 버퍼별로 최적 pH는 상이하였다.

실시예 4: OPS 발효액을 기질로 OPSS 효소를 이용한 시스테인 전환 반응

대장균 W3110 균주에 serB가 결손되고, 변이형 serA*가 도입되어 OPS 생산능을 가지는 KCCM 11103P(CA07-0022/pCL-prmf-serA*(G336V)-serC; 대한민국 출원특허 제10-2011-086081호)를 MMYE 고체 배지에 도말한 후 30℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. MMYE 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 25 ml 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 30℃, 200 rpm의 배양기에서 48 시간 배양하였다. 상기 방법으로 제조된 OPS 발효액을 기질로 Tva-OPSS, Dac-OPSS 및 Dal-OPSS의 시스테인 전환율을 확인하였다. 5.4 mM OPS 발효액, 10 mM Na₂S, 0.2 mM PLP 조건에서 각 OPSS 농도를 50 ㎍/ml 조건으로 37℃에서 시스테인 전환 반응을 수행하였다. 생성된 시스테인은 Gaitonde 방법으로 정량하였다. 도 3 및 표 4는 37℃ 에서 3종의 OPSS의 시간별 시스테인 전환율을 보여주며, 상기 전환 반응 조건에서 3종의 OPSS 중 Dal-OPSS를 사용하였을 때 가장 높은 전환율을 보임을 확인하였다.

	시스테인 전환율(%)
	10분	30분	60분
Tva-OPSS	10.23	15.62	17.44
Dac-OPSS	10.87	17.43	21.11
Dal-OPSS	8.93	29.88	38.64

한편, 온도가 시스테인 합성 과정에서 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여, Dal-OPSS의 온도별 시스테인 전환율을 확인하였다. 상기 조건에서 온도 조건만을 각각 30℃, 37℃, 50℃, 65℃ 및 80℃로 변화시켜 시스테인 전환율을 측정하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, Dal-OPSS를 각 온도별로 30분간 반응하였을 때, 37℃에서 활성이 가장 높은 것을 확인하였다.

실시예 5: OPSS 의 보조인자( cofactor ) 요구성

시스테인 전환반응에 있어 조효소의 요구성을 확인하기 위하여, Dal-OPSS를 이용하여 PLP(pyridoxal-5'-phosphate) 및 DTT(dithiothreitol)의 유무에 따른 시스테인 전환율을 확인하였다. 5.4 mM OPS 발효액, 10 mM Na₂S 를 기질로 25 mM DTT 및/또는 0.2 mM PLP 조건에서 37℃에서 30분간 반응하였고 생성된 시스테인은 Gaitonde 방법으로 정량하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

Dal-OPSS	시스테인 전환율(%)
(-) PLP, (-) DTT	12.88
(+) PLP, (-) DTT	20.15
(-) PLP, (+) DTT	24.32
(+) PLP, (+) DTT	31.54

표 5에 나타난 바와 같이, PLP 및 DTT가 첨가되지 않은 대조군에 비하여, PLP 및 DTT가 첨가된 실험군에서의 시스테인 전환율이 약 2.4배 증가하였다. 또한, PLP 또는 DTT가 각각 단독으로 첨가된 실험군에서도 시스테인 전환율이 증가함을 확인하였다. 즉, 시스테인 전환시 PLP 및 DTT가 반응에 긍정적으로 작용함을 확인하였다.

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Method of producing cysteine or derivatives thereof using novel O-phosphoserine sulfhydrylase <130> PA110907KR <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 318 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Dac-OPSS <400> 1 Met Ile Cys Asp Asn Ile Leu Lys Thr Ile Cys Asn Thr Pro Met Ile 1 5 10 15 Arg Ile Asn Arg Leu Asn Pro Asn Pro Asn Val Glu Ile Tyr Ala Lys 20 25 30 Phe Glu Gly Thr Asn Pro Gly Gly Ser Ile Lys Asp Arg Ile Ala Leu 35 40 45 Lys Met Ile Glu Gln Ala Glu Ala Glu Gly Val Leu Asn Arg Lys Lys 50 55 60 Thr Ile Ile Glu Ala Thr Ser Gly Asn Thr Gly Ile Ala Leu Ala Met 65 70 75 80 Ile Gly Ala Val Lys Asp Tyr Lys Val Glu Ile Val Met Ser Glu Ala 85 90 95 Val Ser Ile Glu Arg Arg Lys Met Ile Gln Ala Phe Gly Ala Lys Val 100 105 110 Ile Leu Thr Asp Pro Glu Phe Gly Thr Asp Gly Ala Ile Leu Lys Val 115 120 125 Arg Lys Leu Leu Glu Gln Tyr Pro Asp Arg Tyr Phe Cys Thr Asp Gln 130 135 140 Phe Thr Asn Lys Tyr Asn Lys Leu Ala His Ser Glu Ile Thr Ala Glu 145 150 155 160 Glu Ile Trp Phe Gln Thr Asn Gly Arg Val Asp Tyr Phe Val Ser Gly 165 170 175 Leu Gly Thr Ser Gly Thr Leu Met Gly Val Gly Ala Gly Leu Lys Lys 180 185 190 Tyr Asn Pro Lys Ile Lys Ile Ile Ser Ala Glu Pro Val Ala Gly His 195 200 205 Tyr Ile Gln Gly Leu Lys Asn Leu Gln Glu Ala Ile Val Pro Gly Ile 210 215 220 Tyr Asn Glu Ala Glu Leu Asp Glu Ile Ile Met Ile Glu Thr Glu Glu 225 230 235 240 Ala Phe Glu Met Ala Arg Gln Ile Val Arg Lys Glu Gly Ile Phe Val 245 250 255 Gly Met Ser Ser Gly Ala Ser Met Leu Gly Ala Val Lys Ile Ala Arg 260 265 270 Lys Leu Ser Ser Gly Val Ile Val Thr Ile Phe Pro Asp Arg Gly Glu 275 280 285 Lys Tyr Leu Ser Thr Asp Leu Phe Lys Ser Glu Ala Gly Asp Gly Lys 290 295 300 Leu Gly Arg Met Glu Ala Asp Arg Phe Cys Arg Lys Tyr Lys 305 310 315 <210> 2 <211> 314 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Dal-OPSS <400> 2 Met Lys Ala Asn Ile Leu Glu Ala Ile Gly Glu Thr Pro Leu Val Arg 1 5 10 15 Ile Asn Arg Leu His Thr Asn Pro Gln Val Thr Leu Ala Val Lys Leu 20 25 30 Glu Gly Asn Asn Pro Gly Gly Ser Val Lys Asp Arg Ile Ala Tyr Tyr 35 40 45 Met Leu Arg Lys Ala Glu Glu Lys Gly Glu Leu Thr Lys Asn Lys Ile 50 55 60 Ile Leu Glu Pro Thr Ser Gly Asn Thr Gly Ile Gly Leu Ala Met Ala 65 70 75 80 Ala Ser Val Met Gly Tyr Arg Leu Val Val Thr Met Ser Glu Lys Met 85 90 95 Ser Ser Glu Arg Arg Lys Met Leu Glu Val Phe Gly Ala Glu Leu Val 100 105 110 Leu Thr Pro Gly Glu Leu Gly Thr Asp Gly Ala Ile Met Lys Ala Arg 115 120 125 Glu Met Ile Ala Lys Asp Pro Asp Arg Tyr Tyr Met Pro Asn Gln Phe 130 135 140 Ala Asn Glu Asn Asn Tyr Met Val His Tyr Glu Thr Thr Ala Glu Glu 145 150 155 160 Ile Trp Arg Gln Thr Asp Asn Lys Val Thr His Phe Val Ala Gly Met 165 170 175 Gly Thr Thr Gly Thr Leu Met Gly Ala Ser Arg Arg Leu Lys Glu Leu 180 185 190 Asn Pro Asp Ile Lys Ile Ile Gly Val Glu Pro Tyr Met Asn His Lys 195 200 205 Ile Gln Gly Leu Lys Asn Met Glu Glu Ala Ile Lys Pro Ala Ile Tyr 210 215 220 Asp Ser Lys Arg Leu Asp Glu Lys Ile Asn Val Ser Asp Glu Asp Ala 225 230 235 240 Phe Glu Met Ala Phe Arg Leu Thr Arg Glu Glu Gly Ile Phe Ala Gly 245 250 255 Ile Ser Ala Gly Ala Ala Met His Ala Ala Ile Ser Val Ala Asn Lys 260 265 270 Leu Thr Ser Gly Phe Val Val Ala Ile Ile Pro Asp Arg Gly Asp Lys 275 280 285 Tyr Met Ser Thr Asp Leu Phe Cys Ala Glu Arg Cys Lys Arg Arg Arg 290 295 300 Pro Asp Cys Leu Leu Thr Glu Asn Leu Phe 305 310 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Tva-OPSS <400> 3 gctcatatgt tattttagcg atctcta 27 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Tva-OPSS <400> 4 gtaggatcca agtgcagatt cgaacaattt 30 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Dac-OPSS <400> 5 gctcatatga tctgcgacaa catcctg 27 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Dac-OPSS <400> 6 gtaggatcct tatttgtatt tacggcagaa acggt 35 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Dal-OPSS <400> 7 gctcatatga aagctaacat cctggaagct 30 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Dal-OPSS <400> 8 gtactcgagt tagaacaggt tttcggtcag ca 32 <210> 9 <211> 957 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dac-OPSS <400> 9 atgatttgcg ataatatact caagaccata tgcaatacgc cgatgatcag aattaatcgg 60 ctgaatccaa acccaaatgt ggagatctat gcaaaatttg aaggcacaaa tcccggagga 120 agcataaaag atcggattgc gcttaagatg atcgagcagg ccgaggccga aggtgtactt 180 aacaggaaaa aaaccatcat agaggcaact tctggcaata caggcattgc gctggcgatg 240 atcggagcgg tcaaggacta caaggtggaa attgttatga gtgaagccgt atcgatcgaa 300 aggcgcaaga tgatacaggc attcggcgcg aaggtcatcc tgaccgatcc ggaatttgga 360 acggacggtg ctattcttaa agtacgcaag ttgctggagc aatatccgga tcgctatttc 420 tgcacagatc agttcacgaa taagtacaat aaactcgccc atagtgaaat tactgccgaa 480 gagatctggt tccaaacgaa tggcagagtt gattatttcg tttcagggtt gggaacatcg 540 ggaaccttga tgggggttgg tgccggcctg aaaaagtaca atcctaaaat aaaaatcatc 600 agtgcggaac cggttgccgg gcattatatt cagggtctga aaaatcttca ggaagcgatt 660 gttccgggca tttataatga agctgaactg gatgaaatta ttatgatcga aactgaggaa 720 gccttcgaga tggcccgtca gattgtccgc aaggaaggga tctttgtcgg catgagcagt 780 ggtgcgtcca tgttaggagc ggttaaaatt gcccgcaagc tttcttcagg tgtaattgtt 840 actatttttc ctgatcgtgg agaaaaatat ttaagcacgg atctcttcaa gtctgaggca 900 ggtgatggaa aattaggacg gatggaggca gacagatttt gccgcaaata caaataa 957 <210> 10 <211> 945 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dal-OPSS <400> 10 atgaaagcta atattctgga agccattggc gaaacgcctt tggtacgaat caatcgttta 60 cataccaatc cacaggttac cctggctgta aagctggagg gcaacaatcc gggcggaagt 120 gttaaggacc ggattgccta ctacatgctg cgaaaagctg aagaaaaagg tgaactgacc 180 aaaaataaaa ttatcctgga gcccaccagc ggcaacaccg gcatcggcct ggccatggct 240 gcctcggtga tgggctatcg cctggtggtg accatgtctg aaaagatgag cagtgagcga 300 cgcaaaatgc tggaggtgtt tggcgccgaa ttagtactga ctccaggcga gttgggcacc 360 gatggtgcca ttatgaaggc ccgggaaatg atagccaagg acccggaccg ctactatatg 420 cctaaccaat ttgccaatga aaacaactat atggtacact atgaaacaac cgctgaagaa 480 atctggcgac aaaccgataa taaggtaaca cactttgtgg ccggtatggg gaccaccggc 540 acattaatgg gcgcttctag acgcctcaaa gaactgaatc ccgacattaa gattatcggt 600 gtagagcctt atatgaacca taaaatccag ggactcaaga acatggaaga ggccattaaa 660 ccggccatat atgattccaa acgactggat gaaaaaataa atgtcagcga tgaagatgct 720 tttgaaatgg ccttccgtct cacccgggaa gaaggaatct ttgccggaat ttctgcagga 780 gcagccatgc atgcagcaat cagtgtggcc aataaactca cctcaggctt tgtggttgcc 840 attattccag accgcggtga taagtatatg tccaccgatt tattctgtgc tgaacgttgc 900 aaaaggcgca gacccgactg cctgttgacg gagaatctct tttaa 945 <210> 11 <211> 957 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dac-OPSS codon usage optimize <400> 11 atgatctgcg acaacatcct gaaaaccatc tgcaacaccc cgatgatccg tatcaaccgt 60 ctgaacccga acccgaacgt tgaaatctac gctaaattcg aaggtaccaa cccgggtggt 120 tctatcaaag accgtatcgc tctgaaaatg atcgaacagg ctgaagctga aggtgttctg 180 aaccgtaaaa aaaccatcat cgaagctacc tctggtaaca ccggtatcgc tctggctatg 240 atcggtgctg ttaaagacta caaagttgaa atcgttatgt ctgaagctgt ttctatcgaa 300 cgtcgtaaaa tgatccaggc tttcggtgct aaagttatcc tgaccgaccc ggaattcggt 360 accgacggtg ctatcctgaa agttcgtaaa ctgctggaac agtacccgga ccgttacttc 420 tgcaccgacc agttcaccaa caaatacaac aaactggctc actctgaaat caccgctgaa 480 gaaatctggt tccagaccaa cggtcgtgtt gactacttcg tttctggtct gggtacctct 540 ggtaccctga tgggtgttgg tgctggtctg aaaaaataca acccgaaaat caaaatcatc 600 tctgctgaac cggttgctgg tcactacatc cagggtctga aaaacctgca ggaagctatc 660 gttccgggta tctacaacga agctgaactg gacgaaatca tcatgatcga aaccgaagaa 720 gctttcgaaa tggctcgtca gatcgttcgt aaagaaggta tcttcgttgg tatgtcttct 780 ggtgcttcta tgctgggtgc tgttaaaatc gctcgtaaac tgtcttctgg tgttatcgtt 840 accatcttcc cggaccgtgg tgaaaaatac ctgtctaccg acctgttcaa atctgaagct 900 ggtgacggta aactgggtcg tatggaagct gaccgtttct gccgtaaata caaataa 957 <210> 12 <211> 945 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dal-OPSS codon usage optimize <400> 12 atgaaagcta acatcctgga agctatcggt gaaaccccgc tggttcgtat caaccgtctg 60 cacaccaacc cgcaggttac cctggctgtt aaactggaag gtaacaaccc gggtggttct 120 gttaaagacc gtatcgctta ctacatgctg cgtaaagctg aagaaaaagg tgaactgacc 180 aaaaacaaaa tcatcctgga accgacctct ggtaacaccg gtatcggtct ggctatggct 240 gcttctgtta tgggttaccg tctggttgtt accatgtctg aaaaaatgtc ttctgaacgt 300 cgtaaaatgc tggaagtttt cggtgctgaa ctggttctga ccccgggtga actgggtacc 360 gacggtgcta tcatgaaagc tcgtgaaatg atcgctaaag acccggaccg ttactacatg 420 ccgaaccagt tcgctaacga aaacaactac atggttcact acgaaaccac cgctgaagaa 480 atctggcgtc agaccgacaa caaagttacc cacttcgttg ctggtatggg taccaccggt 540 accctgatgg gtgcttctcg tcgtctgaaa gaactgaacc cggacatcaa aatcatcggt 600 gttgaaccgt acatgaacca caaaatccag ggtctgaaaa acatggaaga agctatcaaa 660 ccggctatct acgactctaa acgtctggac gaaaaaatca acgtttctga cgaagacgct 720 ttcgaaatgg ctttccgtct gacccgtgaa gaaggtatct tcgctggtat ctctgctggt 780 gctgctatgc acgctgctat ctctgttgct aacaaactga cctctggttt cgttgttgct 840 atcatcccgg accgtggtga caaatacatg tctaccgacc tgttctgcgc tgaacgttgc 900 aaacgtcgtc gtccggactg cctgctgacc gaaaacctgt tctaa 945

Claims

서열번호 1 또는 2로 기재된 아미노산 서열을 가지는 O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS), 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에, O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)을 황화물과 반응시켜 시스테인 또는 이의 유도체를 제조하는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 OPSS는 서열번호 9 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 OPS는 정제된 OPS 또는 OPS를 포함하는 미생물의 발효액인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 황화물은 Na₂S, H₂S, NaSH, (NH₄)₂S 및 S₂O₃로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 황화물의 첨가량은 반응시 첨가되는 OPS 몰 농도의 0.1 내지 3배인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 반응시 보조인자로서 0.001 내지 2 mM의 PLP(pyridoxal-5'-phosphate) 또는 0.001 내지 100 mM의 DTT(dithiothreitol)를 추가로 첨가하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 시스테인 또는 이의 유도체를 분리 및 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.