KR20130038412A - 심혈관 증상의 치료에 지방조직-유래의 세포를 사용하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지방 유래의 재생성 세포를 사용해서 심혈관계 증상, 질환 또는 장애를 갖는 환자를 비롯한 환자들을 치료하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 환자 치료 방법은 지방조직을 처리해서 지방조직으로부터 얻어진 농축된 양의 재생성 세포, 예를 들어 줄기 및/또는 선조 세포를 환자에게 전달하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 줄기 세포를 환자에게 투여하기에 앞서 줄기 세포가 외부 환경에 노출되지 않도록 밀폐계 내에서 실시할 수 있다. 따라서, 바람직한 방법에서, 지방 유래의 재생성 세포는 치료적 심혈관 이점을 촉진시키거나, 발생시키거나 또는 지지하는데 필요한 첨가제와 함께 수용자에게 직접 배치된다.

Description

심혈관 증상의 치료에 지방조직-유래의 세포를 사용하는 방법{METHODS OF USING ADIPOSE TISSUE-DERIVED CELLS IN THE TREATMENT OF CARDIOVASCULAR CONDITIONS}

<관련 출원>

본 출원은 2004년 2월 20일 출원된 미국 출원 제10/783,957호 (발명의 영문명칭: METHODS OF USING ADIPOSE TISSUE-DERIVED CELLS IN THE TREATMENT OF CARDIOVASCULAR CONDITIONS) [2003년 2월 20일 출원된 미국 가출원 제60/449,279호 (발명의 영문명칭: METHODS OF USING ADIPOSE TISSUE DERIVED CELLS IN THE TREATMENT OF CARDIOVASCULAR CONDITIONS) 및 2003년 4월 15일 출원된 미국 가출원 제60/462,911호 (발명의 영문명칭: METHODS OF USING ADIPOSE TISSUE DERIVED CELLS IN THE TREATMENT OF CARDIOVASCULAR CONDITIONS)를 우선권으로 주장함]의 일부-계속 출원, 및 2004년 6월 25일 출원된 미국 출원 제10/877,822호 (발명의 영문명칭: SYSTEMS AND METHODS FOR SEPARATING AND CONCENTRATING REGENERATIVE CELLS FROM TISSUE) [2003년 8월 20일 출원된 미국 가출원 제60/496,467호 (발명의 영문명칭: SYSTEMS AND METHODS FOR SEPARATING CELLS FROM ADIPOSE TISSUE) 및 2003년 출원된 미국 가출원 제60/482,820호 (발명의 영문명칭: SYSTEMS AND METHODS FOR SEPARATING CELLS FROM ADIPOSE TISSUE)호를 우선권으로 주장함]의 일부-계속 출원이며, 이들 둘 다는 2002년 12월 9일 출원된 미국 출원 제10/316,127호 (발명의 영문명칭: SYSTEMS AND METHODS FOR TREATING PATIENTS WITH PROCESSED LIPOASPIRATE CELLS)[2001년 12월 7일 출원된 미국 가출원 제60/338,856호의 이익을 주장함]의 일부-계속 출원이다. 상기 언급된 모든 출원의 내용은 명시적으로 본원에 참고로 포함된다.

1. 기술 분야

본 발명은 일반적으로 지방조직으로부터 유래된 재생성 세포에 관한 것이고, 더욱 구체적으로는 지방-유래의 재생성 세포 (예, 지방 유래의 줄기 세포 및 선조 세포), 지방-유래의 재생성 세포를 사용하는 방법, 지방-유래의 재생성 세포를 함유하는 조성물, 및 지방-유래의 재생성 세포를 제조하고 사용하는 시스템에 관한 것인데, 이들은 심혈관 질환 및 장애의 치료에 사용된다.

2. 관련 기술의 설명

심혈관 질환 및 장애는 모든 산업 국가에서 사망 및 신체 장애의 주된 요인이다. 미국 한 국가에서만, 심혈관 질환은 치사율의 약 40％를 차지하고 5800만 미국인에 영향을 준다 (American-Heart-Association, 2002). 심혈관 질환을 특히 파멸적으로 만드는 가장 주된 인자 중의 하나는 손상 후 심장이 자신을 복구하는 능력을 갖지 못한다는데 있다. 심장 근육 세포, 즉, 심근세포는 손상 부위에서 분열 및 재생될 수 없어, 상해 및 질환에 기인한 심장 세포 손실은 대부분 비가역적이다 (Abbate et al., 2002; Remme, 2000).

이용가능한 치료법 형태 중에서, 인간 대 인간 심장 이식은 중증 심혈관 질환 및 장애의 치료에 가장 효과적인 것이었다. 사실, 심장 이식 수용자의 평균 1년 및 5년 생존율은 현재 70 ％가 넘는다. 그러나, 불행히도 이식은 다수의 원인, 즉 적당한 공여자의 부족, 과정의 비용 및 이식편의 높은 거부 가능성 및 합병증, 예를 들면 감염, 신부전 및 면역억제 관련 암으로 인해 매우 제한된 치료 형태이다 (American-Heart-Association, 2002).

이식 치료법의 별법은 손상된 심장 근육 세포의 복구 및 재생을 위한 재생 의학의 사용이다. 임상적으로 표적화된 방식의 재생 의학은 줄기 세포 (즉, 체내의 비특정 마스터 세포)가 무한정으로 자신을 복원하고 성숙한 특정 세포로 발생하는 능력을 이용한다. 줄기 세포는 발생의 초기 단계에서 배아에서, 태아 조직에서 및 일부 성체 기관 및 조직에서 발견된다 (Pera et al., 2000). 배아 줄기 세포 (이하 "ESC")는 전부는 아니지만 상당수의 체내 세포 및 조직형이 되는 것으로 알려졌다. ESC는 개인의 모든 유전자 정보를 포함하고 있을 뿐만 아니라, 체내의 200+ 세포 및 조직 중 어느 것이라도 될 수 있는 발생 능력을 포함한다. 따라서, 상기 세포는 재생 의학에 대한 커다란 잠재력을 가진다. 예를 들면, ESC는 특정 조직, 예를 들면 심장, 폐 또는 신장으로 성장할 수 있는데, 이는 다시 손상된 기관 및 질환을 가진 기관의 복구에 사용될 수 있다 (Assady et al., 2001; Jacobson et al., 2001; Odorico et al., 2001). 그러나, ESC 유래 조직은 임상적 제한이 있다. ESC는 또다른 개인, 즉 배아에서 필수적으로 유래되기 때문에, 수용자 면역계가 신규한 생물적 물질을 거부할 위험이 있다. 상기 거부를 예방할 면역억제 약물이 이용가능하지만, 상기 약물은 또한 바람직한 면역 반응, 예를 들면 박테리아 감염 및 바이러스에 대한 반응을 차단하는 것으로도 공지되어 있다. 더욱이, ESC의 공급원, 즉 배아에 대한 윤리적 논쟁은 잘 기록되어 있고 가까운 장래에 추가적이고 아마도 극복하기 어려운 걸림돌이 될 것이다.

성체 줄기 세포 (이하 "ASC"로도 지칭)는 ESC 사용의 별법을 제시한다. ASC는 많은 비배아 조직에 비활성적으로 존재하는데, 아마 상해된 조직을 치유할 수 있도록 외상 또는 기타 파괴적 질환 경과에 반응하기 위해 대기하고 있는 것이다 (Arvidsson et al., 2002; Bonner-Weir and Sharma, 2002; Clarke and Frisen, 2001; Crosby and Strain, 2001; Jiang et al., 2002a). 주목할 만하게, 현출되는 과학적 증거는 각 개인이 전부는 아니지만 많은 유형의 세포 및 조직이 되는 능력을 ESC와 공유할 수 있는 ASC의 풀(pool)을 보유함을 보여준다 (Young et al., 2001; Jiang et al., 2002a; Jiang et al., 2002b; Schwartz et a1. 2002). 따라서, ESC와 유사하게 ASC는 재생 의학의 임상적 응용에 커다란 잠재력이 있다.

ASC 집단은 하나 이상의 골수, 피부, 근육, 간 및 뇌에 존재하는 것으로 제시되었다 (Jiang et al., 2002b; Alison, 1998; Crosby and Strain, 2001). 그러나, 상기 조직내 ASC의 빈도는 낮다. 예를 들면, 골수내 중배엽 줄기 세포 빈도는 100,000개 유핵 세포 중 하나 내지 1,000,000개 유핵 세포 중 하나로 측정된다 (D'Ippolito et al., 1999; Banfi et al., 2001; Falla et al., 1993). 유사하게, 피부로부터의 ASC의 추출은 수주 동안의 복잡한 일련의 세포 배양 단계를 포함하고 (Toma et al., 2001) 골근육-유래 ASC의 임상적 적용은 2 내지 3주 배양 상을 필요로 한다 (Hagege et al., 2003). 따라서, 상기 조직으로부터의 ASC의 임의의 제시된 임상 적용은 증가된 세포 수, 순도, 및 세포 정제 및 세포 배양 과정에 의한 성숙도를 요구한다.

세포 배양 단계는 증가된 세포 수, 순도 및 성숙도를 제공할 수 있지만, 비용도 또한 증가시킨다. 이 비용에는 세포 노화에 따른 세포 기능 손실, 잠재적으로 유용한 비줄기 세포 집단의 손실, 환자에게 세포의 잠재적 적용의 지연, 증가된 금전적 비용 및 배양 중 주위 미생물에 의한 세포 오염의 증가된 위험 등의 기술적 난점이 하나 이상 포함될 수 있다. 골수 유래 ASC의 치료 효과를 검사하는 최근의 연구는 세포 배양과 관련된 문제점을 우회하기 위해 전체 골수를 필수적으로 사용했다 (Horwitz et al., 2001; Orlic et al., 2001; Stamm et al., 2003; Strauer et al., 2002). 그러나, 임상적 이점은 차선적이고, 성과는 거의 확실히 골수로부터 내재적으로 입수가능한 제한적인 ASC 용량 및 순도와 관련된다.

최근, 지방조직은 ASC의 공급원인 것으로 제시되었다 (Zuk et al., 2001; Zuk et al., 2002). 골수, 피부, 근육, 간 및 뇌와 달리, 지방조직은 상대적으로 다량으로 채취하기가 비교적 용이하다 (Commons et al., 2001; Katz et al., 2001b). 더욱이, 지방 유래 ASC는 시험관내에서 뼈, 지방, 연골 및 근육을 비롯한 다수의 조직을 생성하는 능력을 가진 것으로 보여졌다 (Ashjian et al., 2003; Mizuno et al., 2002; Zuk et al., 2001; Zuk et al., 2002). 따라서, 지방조직은 재생 의학에 사용하기 위한 최적의 ASC 공급원을 제시한다. 그러나, 지방 유래 ASC를 채취하는 적절한 방법은 선행기술에 없다. 기존 방법은 다수의 단점을 가진다. 예를 들면, 기존 방법은 지방조직을 제거하기 위한 흡출 장치를 최적으로 수용할 수 있는 능력이 부재하다. 기존 방법은 또한 조직 상의 처리를 통해 지방조직 상 채취의 부분적 또는 완전 자동화가 부재하다(Katz et al., 2001a). 기존 방법은 또한 100ml의 지방조직보다 큰 부피 용적이 부재하다. 기존 방법은 또한 지방조직 상 채취로부터 조직 상의 처리까지 부분 또는 완전 밀폐 시스템이 부재하다. 마지막으로, 기존 방법은 한 시료로부터의 물질이 다른 시료를 상호 오염시키는 부수적인 위험을 완화시키는 성분의 취급성이 부재하다. 요약하면, 지방조직의 ASC를 채취하기 위한 선행기술 방법은 상기 피부, 간 및 뇌의 ASC 채취와 관련된 기술적 난점을 극복하지 못한다.

따라서, ASC의 커다란 치료 잠재력을 고려하여, 증가된 수율, 농도 및/또는 순도를 갖는 ASC의 집단을 신속하고 신뢰성있게 제조할 수 있고, 그에 따라 세포의 추출후 조작의 필요성을 감소시키거나 제거할 수 있는 지방조직의 ASC 채취 장치, 시스템 또는 방법에 대한 업계의 절박한 요구가 있다. 이상적으로, 상기 장치, 시스템 또는 방법은 수용자에게 직접 제공하기에 적합한 방식으로 ASC를 수득할 것이다. 상기 장치, 시스템 또는 방법과 함께 심혈관 질환 및 장애의 치료용 지방 유래 ASC를 사용한 방법 및 조성물의 이용은 상기 장애의 치료를 혁신시킬 것이다. 심혈관 질환의 보편 및 현재 치료 선택의 부족을 고려하면, 상기 치료는 절박하게 필요하다.

<발명의 요약>

본 발명은 심혈관 증상, 질환 및 장애의 치료에 사용될 수 있는 재생성 세포, 예를 들어 성체 줄기 및 선포 세포에 관한 것이다. 또한 본 발명은 조직, 예를 들어 지방조직으로부터 재생성 세포를 분리 및 농축하는 시스템 및 방법에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 심혈관 관련 치료 용도를 위한 재생성 세포의 조성물에 관한 것이다. 따라서, 일반적인 실시양태에서, 본 발명은 치료적 심혈관 관련 이점을 촉진시키거나, 발생시키거나 또는 지지하는데 필요한 첨가제와 함께 수용자에게 직접 배치되는, 조직으로부터 유래된 재생성 세포를 사용하기 위한 조성물, 방법 및 시스템에 관한 것이다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 재생성 세포를 사용해서, 예를 들어 새로운 혈관 형성을 자극하는 성장 인자를 합성 및 분비하는 능력, 세포 생존, 증식 및/또는 다른 세포의 손상 반응의 변화를 자극하는 성장 인자를 합성 및 분비하는 능력, 새로운 혈관 형성에 직접 참여하는 세포로의 증식 및/또는 분화 능력, 손상된 심근을 이식시키고 반흔 형성 (콜라겐 침착, 콜라겐 분해 및 가교결합)을 변화시키는 능력, 심근세포 또는 심근 수축성에 기여할 수 있는 심근세포-유사 근육 세포로의 증식 및 분화 능력, 심근 세포로의 증식 및 분화 능력, 관류를 개선하고 손상된 심근을 재생시키는 능력, 및 심근 경색 후의 비대증 진행 (리모델링)을 방지하는 능력을 기초로 하는 심혈관 증상, 질환 및 장애를 치료할 수 있다.

심장 환자에게 투여되는 재생성 세포는 예를 들어 줄기 세포, 선조 세포 또는 이들의 조합물로 이루어질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 다회 투여량 투여 및/또는 유형의 재생성 세포의 투여는 치료 이점을 유도하는 데 사용될 수 있다. 또한, 하나 이상의 성장 인자와 같은 첨가제를 재생성 세포와 함께 투여할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 재생성 세포는 혈관형성, 동맥형성 및/또는 심장성 특정 성장 인자 단독과 함께 또는 상기 인자와 다른 첨가제와의 조합과 함께 투여된다. 재생성 세포는 하나 이상의 면역억제 약물과 함께 투여될 수도 있다.

재생성 세포의 투여 경로는 당업계에 공지되어 있으며, 세포를 의도된 이점 부위에 직접 투여하는 것을 포함한다. 이는 심장의 외부 표면 (심외막)을 통한 심근으로의 직접 주사, 적합한 캐뉼라의 삽입을 통한 내부 표면 (심내막)을 통한 심근으로의 직접 주사에 의해, 동맥 또는 정맥 주입 (역행(retrograde) 흐름 메카니즘 포함)에 의해 또는 본원에 개시되거나 당업계에 공지되어 있는 다른 수단, 예를 들면 심장막 주사에 의해 달성될 수 있다. 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 투여 경로로는 정맥내, 관상동맥내, 심내막, 심외막, 심실내, 역행 관상동맥동 또는 정맥내를 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

환자로의 투여에 앞서, 재생성 세포를 세포 배양으로 성장시켜, 예를 들어 심장 표현형으로 분화를 촉진시킬 수 있다. 환자로의 투여에 앞서 세포는 개질된 재생성 세포에서 하나 이상의 유전자, 예를 들어 심장 유전자의 발현이 변경되도록 유전자 전달에 의해 개질시킬 수도 있다.

또한 본 발명은 대상체로 재주입하기에 적합한 주어진 조직으로부터 재생성 세포, 예를 들어 줄기 및 선조 세포를 분리 및 농축할 수 있는 고도로 다용도인 시스템 및 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 시스템은 자동화된다. 본 발명의 시스템은 일반적으로 수집 챔버, 처리 챔버, 폐기 챔버, 배출 챔버 및 샘플 챔버 중 하나 이상을 포함한다. 상기 다양한 챔버들은 생물학적 물질을 함유하는 유체들이 하나의 챔버에서 다른 챔버로, 무균상태의 폐쇄된 유체/조직 경로를 통해서 이동할 수 있도록 하나 이상의 도관을 통하여 서로 연결된다. 몇몇 실시양태에서, 폐기 챔버, 배출 챔버 및 샘플 챔버는 선택사항이다. 한 실시양태에서, 처리를 통한 조직 추출에서 장치의 수용자로의 배치까지의 전체 절차는 모두 동일 설비에서 수행되며, 실제로는 절차를 수행하는 환자의 동일한 공간 내에서조차 수행된다.

따라서, 한 실시양태에서, 환자의 심혈관 관련 장애를 치료하는 방법은 a) 조직 제거 시스템을 제공하는 단계; b) 조직 제거 시스템을 사용해서 재생성 세포 농축물을 갖는 지방조직을 환자로부터 제거하는 단계; c) 지방조직의 적어도 일부를 처리해서 지방조직의 재생성 세포 농축물이 아닌 재생성 세포 농축물을 얻은 다음 처리하는 단계; 및 d) 환자에게 투여하기에 앞서 조직 제거 시스템으로부터 재생성 세포를 제거하지 않고 환자에게 재생성 세포를 투여하는 단계를 포함한다.

본원에 기재된 임의의 특징 또는 특징들의 조합은 본 발명의 범위 내에 포함되는데, 단 이러한 임의의 조합에 포함되는 특징들은 정황, 본원 명세서, 및 당업계의 숙련인의 지식으로부터 자명하기 때문에 상호 불일치하지 않는다. 본 발명의 추가의 이점 및 측면은 이하의 상세한 설명으로부터 분명해진다.

도 1은 필터 조립체를 1개 포함하는, 조직으로부터 재생성 세포를 분리하고 농축시키는 시스템을 예시한다.
도 2는 복수개의 필터 조립체를 직렬 구조로 포함하는, 도 1과 유사한 시스템을 예시한다.
도 3은 복수개의 필터 조립체를 일렬 구조로 포함하는, 도 1과 유사한 시스템을 예시한다.
도 4는 원심분리 챔버를 포함하는, 조직으로부터 재생성 세포를 분리하고 농축시키는 시스템을 예시한다.
도 5는 조직으로부터 재생성 세포를 분리하고 농축시키는 시스템에 이용된 미리 고정된 필터를 포함하는 수집 챔버의 단면도이다.
도 6은 침출식 여과 시스템을 이용하여 조직으로부터 재생성 세포를 분리하고 농축시키는 시스템의 프로세싱 챔버의 단면도이다.
도 7은 재생성 세포를 농축시키는 원심분리 장치를 이용하여 재생성 세포를 분리하고 농축시키는 시스템의 프로세싱 챔버의 단면도이다.
도 8은 도 7의 프로세싱 챔버의 또다른 단면도이다.
도 9.1, 9.2 및 9.3은 본 발명의 시스템에 이용되는 세정 성분을 예시한다.
도 10은 시스템을 통한 액체의 이동을 위해 진공 압력을 이용하는, 조직으로부터 재생성 세포를 분리하고 농축시키는 시스템을 예시한다. 진공 시스템은 시스템의 출구에 진공 펌프 또는 진공원을 적용함으로써 구축되어, 미리 결정된 제어된 속도로 시스템을 통해 조직 및 액체를 끌어낼 수 있으며, 시스템에 잠금꼭지, 통풍구 및 클램프를 이용하여 유동 방향 및 시기를 제어할 수 있다.
도 11은 시스템을 통한 액체의 이동을 위해 가압을 이용하는, 조직으로부터 재생성 세포를 분리하고 농축시키는 시스템을 예시한다. 가압 시스템은 연동식 펌프와 같은 기계적 수단을 이용하여, 결정된 속도로 시스템을 통해 액체 및 조직을 끌어내거나 추진시킬 수 있으며, 밸브, 잠금꼭지, 통풍구 및 클램프를 이용하여 유동 방향 및 시기를 제어할 수 있다.
도 12A는 액체의 공급물 스트림이 필터의 공극에 대해 접선방향으로 유동하는 여과 공정을 예시한다. 도 12B는 액체의 공급물 스트림이 필터의 공극에 대해 수직방향으로 유동하는 여과 공정을 예시한다.
도 13은 본 발명의 시스템을 위한 예시적인 일회용 세트를 예시한다.
도 14는 본 발명의 시스템을 위한 예시적인 재사용 가능한 성분을 예시한다.
도 15a는 도 13의 일회용 세트 및 도 14의 재사용 가능한 성분을 이용하여 조립된 본 발명의 예시적인 장치를 예시한다.
도 15b는 본 발명의 시스템의 자동화된 구현예를 제어하는, 예시적으로 미리 프로그램화된 단계 (소프트웨어 프로그램을 통해 구현됨)를 묘사하는 플로우 차트이다. 2개의 대안적인 처리 매개변수가 개시되며, 시스템의 다양한 기능을 보여준다.
도 16A 및 16B는 배양된 지방 유래 재생성 세포에 의한 VEGF (5A) 및 PIGF (5B) 단백질의 발현을 도시한다.
도 17은 지방 유래 재생성 세포 집단내 내피 선조 세포의 검출을 도시한다.
도 18A 및 18B는 정상 (7A) 및 스트렙토조토신-처리 (7B) 마우스 모두의 혈관 구조의 시험관내 발생을 도시한다.
도 19는 음성 대조군에 대비한 지방 유래 재생성 세포로 처리된 뒷다리 허혈성 마우스의 증가된 평균 혈류 회복을 도시한다.
도 20A 및 20B는 지방 유래 재생성 세포의 용량 증가가 이식편 생존 및 혈관형성을 개선함을 보여주고 (20A), 조직학적 시험편내 지방조직 구조의 유지를 도시한다 (20B).
도 21은 심근 경색 부위내 공여자 유래 지방 유래의 재생성 세포의 생착의 조직학적 시간경과를 도시한다.
도 22은 베타-갈락토시다제 및 미오신 중쇄의 이중 양성 염색을 도시한다. 강조된 세포는 공여자 지방조직 세포의 기원을 증명하는 청색 베타-갈락토시다제 염색 및 심장 근육 단백질 미오신 중쇄의 발현을 지시하는 갈색 염색 모두를 보인다. 갈색 및 청색 염색을 모두 보이는 세포 (화살표로 표시)는 심장 근육 세포의 표현형을 가진 지방조직 유래 세포이다.
도 23은 래트의 폐색/재관류 상해 후 경색된 심근 부위내 공여자 유래 지방 유래 재생성 세포의 클러스터를 예시한다.
도 24는 지방 유래의 재생성 세포로 처리된 래트의 심근 경색 후 12 주의 시점에서 유의하게 개선된 박출율(ejection fraction)을 에코 및 수축성 분석을 기초로 염수와 비교해서 나타낸다.
도 25는 지방 유래의 재생성 세포로 처리된 래트의 심근 경색 후 12 주의 시점에서 유의하게 개선된 기저선 수축성을 에코 및 수축성 분석을 기초로 염수와 비교해서 나타낸다.
도 26은 지방 유래의 재생성 세포로 처리된 래트의 심근 경색 후 12 주의 시점에서 유의하게 개선된 기저선 이완을 에코 및 수축성 분석을 기초로 염수와 비교해서 나타낸다.
도 27은 지방 유래의 재생성 세포로 처리된 래트의 심근 경색 후 12 주의 시점에서 리모델링 파라미터에서의 변화, 즉 감소된 심실중격 두께를 염수와 비교해서 나타낸다.
도 28은 ADC로 처리된 래트의 심근 경색 후 12 주의 시점에서 감소된 심실중격 두께 (수축기)에서 분명한 것으로 심실 확장의 진행의 예방을 염수와 비교해서 나타낸다.
도 29 및 30은 지방 유래의 재생성 세포로 처리된 래트의 심근 경색 후 12 주의 시점에서 이완기 (도 29) 및 수축기 (도 30)에서의 감소된 후벽 두께에서 분명한 것으로 심실 확장의 진행의 예방을 염수와 비교해서 나타낸다.
도 31은 세포 주입 군 (3.0％ ± 6.0％, 평균 ± SD) 대 대조군 (-9.0％ ± 5.0％, p=0.01)의 돼지에서 좌심실 박출율 (LVEF)의 유의한 증가를 나타낸다. 혈관영화촬영술(cineangiography)에 의한 LVEF (n=12)는 각각 3.7％ ± 5.0％ 대 -2.0％ ± 7.5％ (p=0.16)의 값을 갖는 유사한 추세를 나타냈다.

본 발명은 또한 지방-유래의 재생성 세포, 예를 들어 줄기 및 선조 세포를 이용한 심혈관 증상, 질환 및 장애의 치료를 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 본 발명의 지방 유래의 재생성 세포가 (1) PIGF, VEGF, bFGF, IGF-II, 에오탁신(Eotaxin), G-CSF, GM-CSF, IL-12 p40/p70, IL-12 p70, IL-13, IL-6, IL-9, 렙틴(Leptin), MCP-I, M-CSF, MIG, PF-4, TIMP-I, TIMP-2, TNF-α, 및 트롬보포에틴을 비롯한 혈관형성 및 동맥형성 성장 인자를 발현하고, (2) 혈관 형성에서 잘 확립된 기능을 갖는 내피 선조 세포 (EPC)를 함유하며, (3) 시험관내에서 혈관으로 발생하고, (4) 생체내에서 허혈성 조직 생존을 지지하고, (5) 뒷다리의 폐색/재관류 후 관류를 복구시키고, (6) 심장 상해 후 동물내 주입시 심장으로 향하고, (7) 심장 상해 후 동물내 주입시 심근 세포 또는 심근 세포 유사 세포로의 분화와 일치하는 마커를 발현하는 세포로 분화되고, (8) 마우스에서 뒷다리 허혈증의 수술적 모델에서 심근 경색 후 관류를 개선하고, (9) 리모델링의 진행을 예방하며, (10) 심근 경색의 소형 및 대형 동물 모델에서의 기능을 개선한다는 것을 입증한다. 따라서, 본 발명의 개시내용은 본 발명의 재생성 세포가 심혈관 질환 및 장애의 치료에 유용함을 입증한다.

본 발명이 더 쉽게 이해될 수 있도록, 일부 용어가 먼저 정의된다. 추가 정의는 상세한 설명을 통해 제시된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "재생성 세포"는 기관, 조직, 또는 생리학적 단위 또는 시스템의 구조 또는 기능의 완전 또는 부분적 재생, 복원 또는 대체를 유발하거나 이에 기여함으로써 치료상, 구조상 또는 미용상의 유익성을 제공하는 본 발명의 시스템 및 방법을 사용하여 수득된 임의의 이종 또는 동종 세포를 지칭한다. 재생성 세포의 예로는 줄기 세포, 내피 세포, 내피 전구 세포, 내피 선조 세포, 대식세포, 섬유아세포, 혈관주위세포, 평활근 세포, 지방전구세포, 분화되거나 탈분화된 지방세포, 각질세포, 단일분화성(unipotent) 및 다능성(multipotent) 선조 세포 및 전구 세포 (및 이들의 자손), 림프구, 호중구, 조직구 (조직 대식세포), 림프계 관련 세포, 신경세포, 신경세포 전구 세포 및 슈반(Schwann) 세포를 들 수 있다.

재생성 세포가 치료상, 구조상 또는 미용상의 유익성을 제공할 수 있는 한 가지 메카니즘은, 이들 또는 그의 자손을 신생의, 기존의, 또는 복구된 조직 또는 조직 성분에 혼입하는 것이다. 예를 들어, ASC 및/또는 그의 자손은 신생의 골, 근육 또는 다른 구조적 또는 기능적 조직에 혼입되어 치료성, 구조상 또는 미용상의 개선을 유발하거나 이에 기여할 수 있다. 유사하게, 내피 세포 또는 내피 전구 세포 또는 선조 세포 및 이들의 자손은 기존의, 신생의, 복구된, 또는 확장된 혈관에 혼입되어 치료상, 구조상 또는 미용상의 유익성을 유발하거나 이에 기여할 수 있다.

재생성 세포가 치료상, 구조상 또는 미용상의 유익성을 제공할 수 있는 또다른 메카니즘은, 주어진 조직 또는 조직 성분의 구조 또는 기능의 생성, 유지, 복원 및/또는 재생을 촉진시키는 분자, 예를 들어 성장 인자를 발현시키고/시키거나 분비시키는 것이다. 예를 들어, 재생성 세포는 조직 또는 세포의 성장을 향상시키는 분자를 발현하고/하거나 분비하여, 구조 또는 기능의 개선에 직접적 또는 간접적으로 참여할 수 있다. 재생성 세포는 새로운 혈관의 발달을 자극시키고, 즉 혈관형성을 촉진시키고; 혈액 운반 용량을 확대시킴으로써 기존의 소혈관 (곁가지)의 산소 공급을 개선시키고; 손상 부위로부터 먼 부위로부터의 재생성 세포의 이동을 유도함으로써 이러한 세포의 손상 부위로의 귀환 및 이동을 향상시키고; 성장을 촉진시키고/시키거나 손상 부위 내의 세포 생존을 촉진시킴으로써 기능 또는 구조의 유지를 촉진시키고; 항-세포자멸성을 갖는 분자를 전달함으로써 세포사의 속도 또는 가능성 및 기능의 영구 손실을 감소시키고; 내인성 재생성 세포 및/또는 다른 생리학적 메카니즘과 상호작용하는 기능 중 하나 이상의 기능을 수행할 수 있는, 예를 들어 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 태반 성장 인자 (PIGF), bFGF, IGF-II, 에오탁신, G-CSF, GM-CSF, IL-12 p40/p70, IL-12 p70, IL-13, IL-6, IL-9, 렙틴, MCP-1, M-CSF, MIG, PF-4, TIMP-1, TIMP-2, TNF-α, 트롬보포에틴 및 이들의 이소형(isoform)을 비롯한 성장 인자 또는 사이토카인을 발현 및/또는 분비할 수 있다.

재생성 세포는 존재하는 대로의 그 '천연' 형태로 사용하거나, 본 발명의 시스템 및 방법을 사용하여 조직으로부터 분리하고 농축시킬 수 있거나, 또는 이들은 성장 인자 또는 다른 생물학적 반응 변형제를 사용한 자극 또는 프라이밍(priming)에 의해, 유전자 전달 (일시적 또는 안정적인 전달)에 의해, 추가로 물성 (예를 들어 크기 또는 밀도)을 기준으로 한 생성된 집단의 준파편화, 고체상 물질에의 차동 부착, 세포 표면 또는 세포내 분자의 발현, 세포 배양 또는 다른 생체외 또는 생체내 조작, 변형, 또는 추가로 본원에 기재한 바와 같은 파편화에 의해 변형될 수 있다. 재생성 세포는 또한 추가로 본원에 기재한 바와 같이 세포의 관련 특징을 변형하거나 향상시키는 인자, 약물, 화학물질 또는 다른 작용제를 전달하는 다른 세포 또는 합성 또는 생물학적 스캐폴드(scaffold), 물질 또는 장치와 조합으로 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "재생성 세포 조성물"은 조직, 예를 들어 지방조직을 세척하고 적어도 부분적으로 해리(disaggregation)한 후에 다량의 액체에 전형적으로 존재하는 세포의 조성물을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 재생성 세포 조성물은 ASC, 내피 세포, 내피 전구 세포, 내피 선조 세포, 대식세포, 섬유아세포, 혈관주위세포, 평활근 세포, 지방전구세포, 분화되거나 미분화된 지방세포, 각질세포, 단일분화성 및 다능성 선조 세포 및 전구 세포 (및 이들의 자손) 및 림프구를 비롯한, 다양한 여러가지 종류의 재생성 세포를 포함한다. 또한, 재생성 세포 조성물은 조직 단편에 존재할 수 있는 콜라겐, 또는 본원에 기재한 조직 해리 과정에 사용되거나 이로부터 생성된 잔류의 콜라게나제 또는 다른 효소 또는 작용제와 같은 1종 이상의 오염체를 함유할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "재생 의학"은 재생성 세포를 직접적 또는 간접적으로 대상체에 배치함으로써 유래된 임의의 치료상, 구조상 또는 미용상의 유익성을 지칭한다. 본원에서 "심혈관 증상, 질환 또는 장애"는 불충분한, 바람직하지 않은 또는 비정상적 심장 기능, 예를 들면 허혈성 심장 질환, 고혈압 심장 질환 및 폐 고혈압 심장 질환, 심장판막증, 선천성 심장 질환 및 대상체에서, 특히 인간 대상체에서 선천성 심장 질환을 초래하는 임의의 증상으로 특징되는 모든 장애를 포함하려는 의도이다. 불충분한 또는 비정상적 심장 기능은 질환, 상해 및/또는 노화의 결과일 수 있다. 배경 기술에 의하면, 심근 상해에 대한 반응으로 일부 세포는 사멸하면서 다른 일부는 사멸하지는 않았으나 부전성인 동면 상태로 돌입하는 공지된 경로를 따른다. 그 후 반흔의 일부로서 콜라겐의 침착 및 염증성 세포의 침윤이 따르는데, 모두 신규한 혈관의 내부 성장 및 계속되는 세포 사멸 정도와 함께 일어난다. 본원에서 "허혈증"은 혈류 유입의 감소, 및/또는 산소 및/또는 다른 영양분의 공급 감소에 의해 유발된 임의의 조직 허혈증 (예, 국소화된 조직 허혈증 또는 일반화된 조직 허혈증 (예, 쇼크의 경우에서와 같은 허혈증))을 지칭한다. 용어 " 심근 허혈증"은 관상동맥 죽상경화증 및/또는 심근으로의 부적절한 혈액, 산소 및/또는 영양분 공급으로 기인한 순환 장애를 지칭한다. 용어 "심근 경색"은 혈류의 부족으로부터 발생하는 심근 조직에 대한 허혈성 손상을 지칭한다. 특히, 이러한 손상은 관상동맥 순환에서의 폐색성 (예, 혈전성 또는 색전성) 반응으로부터 발생하며, 심근 대사 요구가 심근 조직에 대한 산소 및/또는 영양분의 공급을 초과하는 환경을 나타낸다.

본원에서 용어 "혈관형성"은 기존의 혈관계 및 조직으로부터 신규한 혈관이 생성되는 과정을 지칭한다(Folkman, 1995). 용어 "복구"는 손상된 혈관 및 조직의 재형성을 지칭한다. 조직 허혈증의 완화는 혈관형성에 결정적으로 의존한다. 신규한 혈관의 자발적 성장은 허혈 부위내 및 주위에 부수적 순환을 제공하고, 혈류를 개선하며, 허혈증에 의한 증상들을 완화한다. 본원에서, "혈관형성 인자" 또는 "혈관형성 단백질"은 기존 혈관계로부터 신규한 혈관의 성장을 촉진할 수 있는 임의의 공지된 단백질을 지칭한다("혈관형성"). 본 발명에 사용하기 위한 적절한 혈관형성 인자는 태반 성장 인자 (Luttun et al., 2002), 대식세포 콜로니 자극 인자 (Aharinejad et al., 1995), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (Buschmann et al., 2003), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)-A, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E (Mints et al., 2002), 뉴로필린 (Wang et al., 2003), 섬유아세포 성장 인자(FGF)-1, FGF-2 (bFGF), FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6 (Botta et al., 2000), 안지오포이에틴 1, 안지오포이에틴 2 (Sundberg et al., 2002), 에리쓰로포이에틴 (Ribatti et al., 2003), BMP-2, BMP-4, BMP-7 (Carano and Filvaroff, 2003), TGF-베타 (Xiong et al., 2002), IGF-1 (Shigematsu et al., 1999), 오스테오폰틴 (Asou et al., 2001), 플레이오트로핀 (Beecken et al., 2000), 액티빈 (Lamouille et al., 2002), 엔도쎌린-1 (Bagnato and Spinella, 2003) 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 혈관형성 인자는 독립적으로 또는 서로 조합되어 작용할 수 있다. 조합시, 혈관형성 인자는 또한 상승적으로 작용하여 인자의 조합된 효과가 별도의 개개 인자의 효과의 총합보다 크게 한다. 용어 "혈관형성 인자" 또는 "혈관형성 단백질"은 또한 상기 인자의 기능적 유사체를 포함한다. 기능적 유사체는, 예를 들면 인자의 기능부를 포함한다. 기능적 유사체는 또한 인자의 수용체에 결합하여 혈관형성 및/또는 조직 리모델링을 촉진하는 인자의 활성을 모방하는 항-대상체형 항체를 포함한다. 상기 항-대상체형 항체를 생성하는 방법은 선행기술에 공지되어 있고 예를 들면, 그 내용이 본원에 참고로 인용된 WO 제97/23510호에 기술되어 있다.

본 발명에 사용된 혈관형성 인자는 적절한 공급원으로부터 생산되거나 수득될 수 있다. 예를 들면, 상기 인자는 그의 천연 공급원으로부터 정제되거나 합성적으로 또는 재조합 발현으로 생산될 수 있다. 인자는 단백질 조성물로 환자에 투여될 수 있다. 별법적으로, 인자는 인자를 코딩하는 발현 플라스미드 형태로 투여될 수 있다. 적절한 발현 플라스미드의 제작은 선행기술에 공지되어 있다. 발현 플라스미드의 제작용 적절한 벡터는 예를 들면, 아데노바이러스 벡터, 래트로바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, RNA 벡터, 리포좀, 양이온성 지질, 렌티바이러스 벡터 및 트랜스포존을 포함한다.

본원에서, "동맥형성"은 관상 동맥 및 기존 동맥 연결부의 기타 동맥의 성장을 강화하는 과정을 지칭한다 (Carmeliet, 2000; Scholz et al., 2001; Scholz et al., 2002). 더 구체적으로, 동맥형성은 허혈 조직, 종양 또는 염증 부위로 혈액을 공급하는 기존 동맥 연결부의 내피 및 평활근 세포의 증식에 의한 동맥의 원위치 (in situ) 동원 및 확장이다. 상기 혈관은 발병 조직 외부로 대부분 성장하고 허혈 경계, 종양 또는 염증 부위로의 영양분 전달에 중요하다. 동맥형성은 심근 경색에 대한 정상적 반응의 일부이다 (Mills et al., 2000; Monteiro et al., 2003). 또한, 관상동맥 우회 이식(CABG)의 보편적 수술 기법은 사실 인공적 관상 혈관의 생성일 뿐이다 (Sergeant et al., 1997). 따라서, 경색 후 동맥형성을 강화하는 과정은 허혈 조직으로의 혈류를 개선하여 감소된 세포 사멸 및 감소된 경색 크기를 초래할 것이다. 상기 개선점들은 개선된 심장 기능 및 치료 이점을 초래할 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "줄기 세포"는 다양한 다른 세포 유형으로 분화될 잠재력이 있는 다분화성 재생성 세포를 지칭하며, 이는 하나 이상의 특정 기능을 수행하고 자체-재생되는 능력을 보유한다. 본원에 개시된 줄기 세포의 일부는 다능성이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "선조 세포"는 하나 초과의 세포 유형으로 분화될 잠재력이 있는 다분화성 재생성 세포를 지칭하며, 자가 재생으로 한정되거나 또는 자가 재생 능력이 없다. 본원에서 사용된 바와 같이, "선조 세포"는 또한 단지 단일 세포 유형으로만 분화될 잠재력이 있는 단일분화성 재생성 세포를 지칭하며, 이는 하나 이상의 특정 기능을 수행하고 자체-재생되는 능력이 없거나 제한되어 있다. 특히, 본원에서 사용된 바와 같이, "내피 선조 세포"는 혈관 내피 세포로 분화될 잠재력이 있는 다분화성 또는 단일분화성 세포를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "전구 세포"는 하나의 세포 유형으로 분화될 잠재력이 있는 단일분화성 재생성 세포를 지칭한다. 전구 세포 및 그의 자손은 광범위한 증식능을 보유할 수 있고, 예를 들어 적절한 조건 하에 증식될 수 있는 림프구 및 내피 세포이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "줄기 세포수" 또는 "줄기 세포 빈도수"는 지방 유래의 세포 (ADC)를 낮은 세포 밀도 (10,000개 미만 세포/웰)에서 플레이팅하고 MSC 성장을 지지하는 성장 배지 (예를 들어, 10％ 소태아 혈청, 5％ 말 혈청 및 항생제/항진균제가 보충된 DMEM/F12 배지)에서 성장시키는 클론원성 검정에서 관찰되는 콜로니의 수를 지칭한다. 세포를 2주 동안 성장시킨 후, 배양물을 헤마톡실린으로 염색하고 50개 초과의 세포의 콜로니를 CFU-F로서 카운팅한다. 줄기 세포 빈도수를 플레이팅된 유핵 세포 100개 당 관찰된 CFU-F의 수로서 계산한다 (예를 들어, 1,000개의 유핵 재생성 세포로 개시된 플레이트에서 카운팅된 15개의 콜로니의 경우 줄기 세포 빈도수는 1.5％가 된다). 줄기 세포수는 줄기 세포 빈도수에 수득된 유핵 ADC 세포의 총 수를 곱하여 계산한다. 재생성 세포로부터 성장한 CFU-F는, 높은 비율(％) (약 100％)로 세포 표면 분자인 CD105를 발현하며, CD105는 골수 유래의 줄기 세포에 의해서도 발현되는 것이다 (문헌 [Barry et al., 1999]). CD105는 또한 지방조직 유래의 줄기 세포에 의해서도 발현된다 (문헌 [Zuk et al., 2002]).

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "지방조직"은 지방을 저장하는 결합 조직을 포함하는 지방을 지칭한다. 지방조직은 ASC 및 내피 선조 세포 및 전구 세포를 비롯한 다수의 재생성 세포 유형을 함유한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "지방조직의 단위"는 분리된 또는 측정가능한 양의 지방조직을 지칭한다. 지방조직의 단위는 단위의 중량 및/또는 부피를 결정함으로써 측정할 수 있다. 상기에서 확인된 데이타를 기초로 하여, 환자로부터 제거된 프로세싱된 지방흡인물의 단위는 세포 성분의 0.1％ 이상이 줄기 세포인, 즉 상기한 바와 같이 결정되는 줄기 세포 빈도수가 0.1％ 이상인 세포 성분을 보유한다. 본원의 개시와 관련하여, 지방조직의 단위는 환자로부터 제거한 지방조직의 전체 양 또는 환자로부터 제거한 지방조직의 전체 양 미만의 양을 지칭할 수 있다. 따라서, 지방조직의 단위는 또다른 지방조직의 단위와 조합되어, 중량 또는 부피가 개별 단위의 중량 또는 부피의 합이 되는 지방조직의 단위를 형성할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "부분"은 전체보다 적은 물질의 양을 지칭한다. 소량 부분은 50％ 미만의 양을, 다량 부분은 50％ 초과의 양을 지칭한다. 따라서 환자로부터 제거한 지방조직의 전체 양보다 적은 지방조직의 단위는 제거된 지방조직의 부분이 된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프로세싱된 지방흡인물"은 성숙된 지방세포 및 결합 조직으로부터 활성 세포 성분 (예를 들어, 재생 성분을 함유하는 성분)을 분리하도록 프로세싱된 지방조직을 지칭한다. 이 분획은 본원에서 "지방세포 유래의 세포" 또는 "ADC"로서 지칭된다. 전형적으로, ADC는 지방조직으로부터 세포를 세척 및 분리 및 농축시킴으로써 수득되는 재생성 세포의 펠렛을 지칭한다. 상기 펠렛은 전형적으로 세포의 현탁액을 원심분리하여 세포가 원심분리 챔버 또는 세포 농축기의 하부에서 응집되도록 함으로써 수득된다.

본원에서 사용되는 용어 "투여", "도입", "전달", "배치" 및 "이식"은 본원에서 상호 교환가능하게 사용되며, 원하는 부위에서 재생성 세포의 적어도 부분적 국부화를 유발하는 방법 또는 경로를 통해 본 발명의 재생성 세포를 대상체에 배치시키는 것을 지칭한다. 재생성 세포는 세포 또는 세포의 성분의 적어도 일부분이 여전히 생존하고 있는 대상체의 원하는 위치로 전달되게 하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 대상체에 투여된 후 세포의 생존 기간은 몇 시간, 예를 들면 24시간, 내지 몇 일 정도로 짧거나 수년 정도로 길 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료"는 질병 또는 장애의 증상 또는 적어도 하나 이상의 부작용을 감소 또는 경감하는 것을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "재생성 세포의 치료적 유효 투여량"은 유익한 또는 원하는 임상학적 효과를 가져오기에 충분한, 재생성 세포의 양을 말한다. 상기 투여량은 1 이상의 투여를 통해 투여될 수 있다. 그러나, 얼마가 유효 투여량인지 고려되는 것의 정확한 결정은 각 환자에 따라 개별적인 인자, 환자의 나이, 크기, 질병의 유형 또는 그 정도, 질병의 상태, 재생성 세포의 투여 경로, 사용되는 보충 처방의 유형 또는 정도, 진행중인 질환 과정 및 원하는 치료 형태 (예를 들면, 공격적 대 통상적 치료)를 포함하나 이에 한정되지 않는 인자에 기초할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 온혈 동물, 바람직하게는 인간을 비롯한 포유동물을 포함한다. 바람직한 일 실시양태에서, 대상체는 영장류이다. 보다 바람직한 일 실시양태에서, 대상체는 인간이다.

상기한 바와 같이, 재생성 세포, 예를 들면 줄기 및 선조 세포가 폭넓게 다양한 조직으로부터 수거될 수 있다. 본 발명의 시스템은 이러한 모든 조직에 대해 사용될 수 있다. 그러나, 지방조직은 재생성 세포의 특히 풍부한 공급원이다. 따라서, 본원에서는 재생성 세포의 공급원으로서 지방조직을 사용하여 본 발명의 시스템을 예시하나, 이는 단지 예를 위한 것이며 이에 제한되지 않는다.

지방조직은 통상의 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, 지방조직은 (주사기 또는 동력에 의한) 지방흡입술에 의해 또는 지방절제술에 의해, 예를 들면 흡입 조력 흡인술(suction-assisted lipoplasty), 초음파 조력 흡인술, 및 적출 지방절제술(excisional lipectomy) 또는 이들의 조합에 의해 환자로부터 제거될 수 있다. 지방조직은 본원에 개시된 발명의 시스템의 임의의 실시양태에 따라 제거되고 수집되며, 프로세싱될 수 있다. 수집된 조직의 양은 공여자의 체질량지수(body mass index) 및 연령, 수집할 수 있는 시간, 이용할 수 있는 지방조직 수거 부위의 이용성, 부수적이며 선재하는 약물처리 및 조건(예를 들면, 항응고 요법), 및 조직을 수집하는 임상적 목적을 비롯한 수많은 인자에 따라 달라진다. 예를 들면, 마른 대상체로부터 추출한 지방조직 100 ml의 재생성 세포 비율(％)은 살찐 공여자로부터 추출한 것보다 높다 (표 1). 이는 아마도 살찐 대상체의 증가된 지방 함량의 희석 효과를 반영한다. 따라서, 본 발명의 일 면에 따라, 보다 마른 환자로부터 회수될 양에 비해 과체중 공여자로부터 보다 많은 양의 조직을 수득하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 이러한 관찰 결과는 본 발명의 유용성이 다량의 지방조직을 갖는 대상체에만 제한되는 것이 아님을 나타낸다.

조직 및 세포 수율에 대한 체질량지수의 영향

체질량지수 상태	수득된 조직의 양 (g)	전체 재생성 세포 수율 (x 10 7 )
보통	641±142	2.1±0.4
비만	1,225±173	2.4±0.5
p값	0.03	0.6

지방조직이 프로세싱된 후, 생성된 재생성 세포에는 실질적으로 성숙 지방세포 및 결합 조직이 존재하지 않는다. 예를 들어, 생성된 재생성 세포는 실질적으로 콜라겐 및 세포외 매트릭스 성분이 없을 수 있지만, 결합 조직에 존재하는 섬유아세포로 구성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 시스템은 조사 및/또는 치료 목적을 위해 사용될 수 있는 이질의 복수 지방 유래 재생성 세포를 생성시킨다. 바람직한 일 실시양태에서, 세포는 수용자의 체내로의 배치 또는 재수혈에 적합하다. 다른 실시양태에서, 세포는 조사를 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 세포는 연장된 기간 동안 생존할 수 있어 추가 연구를 위해 사용될 수 있는 줄기 또는 선조 세포주를 확립하는데 사용될 수 있다.

이제, 본 발명의 바람직한 실시양태에 대해 자세히 설명할 것이며, 그 예는 첨부된 도면에 예시되어 있다. 가능한 곳이라면, 동일하거나 또는 유사한 참조 번호가 도면 및 명세서에 사용되어 동일하거나 또는 같은 부분을 지칭한다. 도면은 간소화된 형태이며 정확한 비율이 아님을 주지하여야 한다. 본원과 관련하여, 단지 편리함과 명확함을 위해, 상부, 하부, 좌, 우, 위, 아래, 넘어, 위쪽, 아래쪽, 밑, 뒤, 앞, 먼 및 인접과 같은 방향 관련 용어가 첨부된 도면에 대해서 사용된다. 이러한 방향 관련 용어가 어떠한 식으로든 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 말아야 한다.

본원은 몇몇 예시된 실시양태를 참조하지만, 이들 실시양태는 단지 예를 위해 제시된 것이며 제한을 목적으로 제시된 것이 아니라는 것을 이해하여야 한다. 하기 상세한 설명은 예시적 실시양태에 대해 논의하고 있지만 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 발명의 사상 및 범위 내일 수 있는 실시양태의 모든 변형, 대안 및 균등물을 포함하는 의도로서 해석되어야 한다. 본 발명은 당업계에서 통상적으로 사용되는 각종 의학 절차와 함께 이용될 수 있다.

이제 도면을 참조하면, 본 발명의 시스템 (10)은 일반적으로 하나 이상의 조직 수집 챔버 (20), 프로세싱 챔버 (30), 폐기물 챔버 (40), 배출 챔버 (50) 및 샘플 챔버 (60)으로 구성된다. 상기 여러 챔버는 하나 이상의 도관 (12)을 통해 서로 연결되어, 밀폐된 멸균 유체/조직 통로를 유지하면서 생물학적 물질을 함유하는 유체가 한 챔버로부터 다른 챔버로 통과할 수 있다. 도관은 본원에서 루멘(lumen) 및 튜브로 각각 상호 교환가능하게 언급되는 강성 또는 가요성 물체를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 도관은 임상적 상황(clinical setting)에서 통상적으로 사용되는 폴리에틸렌 튜브, 실리콘 또는 당업계에 알려진 기타 임의의 물질과 같은 가요성 튜브의 형태이다. 도관 (12)는 액체 또는 조직의 통과를 원하는지 여부에 따라 크기를 다양하게 할 수 있다. 도관 (12)는 또한 시스템을 순환하는 조직 또는 액체의 양에 따라 크기를 다양하게 할 수 있다. 예를 들어, 액체 통과를 위해 상기 도관은 약 0.060 내지 약 0.750 인치 범위의 직경, 및 조직 통과를 위해 상기 도관은 0.312 내지 0.750 인치 범위의 직경을 가질 수 있다. 일반적으로, 도관의 크기는 도관이 수용할 수 있는 양 및 상기 도관을 통해 조직 또는 액체를 이동하는 데 필요한 시간이 균형을 이루도록 선택된다. 시스템의 자동화된 실시양태에서, 상기 파라미터, 즉, 이동량 및 시간은 적합한 신호를 시스템의 프로세싱 장치에 보낼 수 있는지 확인되어야 한다. 이는 상기 장치가 한 챔버로부터 또다른 챔버로 액체 및 조직의 정확한 양을 이동 가능하게 한다. 사용되는 유연한 튜브는 붕괴되는 경향을 감소시키기 위해 네가티브 압력을 견딜 수 있어야 한다. 사용되는 유연한 튜브는 또한 예를 들어, 시스템에서 사용될 수 있는, 포지티브 변위 펌프에 의해 생성되는 포지티브 압력을 견딜 수 있어야 한다.

시스템의 모든 챔버는 1개 이상의 포트, 예를 들어 표준 IV를 받아들이는 배출구 (22) 또는 주입구 (21), 주사기 및 흡입 튜브 연결부로 구성될 수 있다. 포트는 밀폐된 포트, 예컨대 고무 격막으로 폐쇄된 주사기 바늘 진입 포트 (51)일 수 있다. 주입구는 도관에 의해 1개 이상의 캐뉼라 (도시하지 않음)에 연결될 수 있다. 예를 들어, 조직 주입구 (21)은 통합된 단독 사용 지방흡입 캐뉼라에 연결될 수 있고, 도관은 가요성 튜브일 수 있다. 도관은 일반적으로 시스템의 한 챔버에서 또다른 챔버로의 액체 통로를 제공하도록 위치한다. 상기 말단 쪽으로, 도관 및 포트는 예를 들면 수동 또는 자동으로 작동할 수 있는 흡입 장치 (도시하지 않음)에 연결될 수 있다. 흡입 장치는 예를 들어, 주사기 또는 전기 펌프일 수 있다. 흡입 장치는 환자로부터 조직을 흡인하기에 충분한 감압을 제공할 수 있어야 한다. 일반적으로, 당업자, 예를 들어 외과의사에게 공지된 임의의 적합한 흡입 장치를 사용할 수 있다.

도관 (12)는 시스템의 다양한 성분들 중에서 물질의 흐름을 제어하는 1개 이상의 클램프 (도시하지 않음)를 추가로 포함할 수 있다. 클램프는 시스템의 상이한 영역을 효과적으로 밀폐함으로써 시스템의 무균상태를 유지하는데 유용하다. 별법으로, 도관 (12)는 시스템을 통해 물질의 흐름을 제어하는 1개 이상의 밸브 (14)를 포함할 수 있다. 밸브 (14)는 도면에서 빈 원으로 확인된다. 바람직한 실시양태에서, 밸브는 전기화학적 핀치 밸브일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 밸브는 공기 밸브일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 밸브는 수압 밸브 또는 기계적 밸브일 수 있다. 상기 밸브는 바람직하게는 레버에 연결될 수 있는 제어 시스템으로 작동된다. 레버는 수동으로 조작되어 작동될 수 있다. 자동화 실시양태에서, 제어 시스템은 레버뿐 아니라 예정된 작동 조건에서 밸브를 작동시킬 수 있는 프로세싱 장치에 연결될 수 있다. 특정 자동화 실시양태에서, 밸브의 작동은 프로세스가 최적화될 수 있도록 부분적으로 자동화되고 부분적으로는 사용자의 선호도에 맞춰질 수 있다. 또다른 실시양태에서, 특정 밸브는 수동으로 작동되고 다른 밸브들은 프로세싱 장치를 통해 자동으로 작동될 수 있다. 밸브 (14)는 또한 1개 이상의 펌프, 예를 들어 연동 펌프 (34) 또는 용적형 펌프 (도시하지 않음)와 함께 사용될 수도 있다. 도관 (12) 및/또는 밸브 (14)는 센서 (29), 예를 들어 광학 센서, 초음파 센서, 압력 센서, 또는 시스템을 통해 흐르는 다양한 액체 성분 및 액체 수준 중에서 구별할 수 있는 당업계에 공지된 기타 모니터 형태로 구성될 수도 있다. 바람직한 실시양태에서, 센서 (29)는 광학 센서일 수 있다.

시스템은 또한 복수개의 필터 (36)을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 필터는 시스템의 챔버 (28)내에 있을 수 있다. 시스템 내의 상이한 챔버는 상이한 필터로 구성될 수 있다. 필터는 바람직하지 못한 세포 및 시스템에 따라 사용될 수 있는 해리제로부터 재생성 세포, 예를 들어 줄기 세포 및/또는 선조 세포를 분리하는데 효과적이다. 한 실시양태에서, 필터 조립체 (36)은 중공사 여과 장치를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 필터 조립체 (36)은 침강 프로세스와 함께 사용될 수 있거나 사용될 수 없는 침출식 여과 장치를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 필터 조립체 (36)은 세정 장치 및 프로세스와 함께 사용될 수 있거나 사용될 수 없는 원심분리 장치를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 시스템은 상기 필터 장치의 조합을 포함한다. 본 발명의 여과 기능은, 콜라겐, 유리 지질, 유리 지방세포 및 잔류 콜라게나제와 같은 최종 농축물로부터 제거하는 일부 필터 및 최종 생성물을 농축하는데 사용되는 기타 필터에 의해 2배가 될 수 있다. 시스템의 필터는 직경 및/또는 길이가 20 내지 800 ㎛ 범위인 복수개의 공극으로 구성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 수집 챔버 (20)은 80 내지 400 ㎛ 범위인 복수개의 공극을 갖는 앞서 고정된 필터 (28)을 갖는다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 수집 챔버 (20)은 복수개의 265 ㎛ 공극을 갖는 앞서 고정된 필터 (28)을 갖는다. 다른 실시양태에서, 필터는 분리가능하고/하거나 처치가능하다.

시스템은 또한 시스템의 1개 이상의 챔버내에 함유된 물질의 온도를 조절하도록 위치하는 1개 이상의 온도 제어 장치 (도시하지 않음)로 구성될 수도 있다. 온도 제어 장치는 가열기, 냉각기 또는 이들 둘 다일 수 있으며, 즉 가열기와 냉각기 사이에서 전환될 수 있다. 온도 장치는 조직, 해리제, 재현탁제, 헹굼제(rinsing agent), 세척제 또는 첨가제를 비롯한 시스템을 통과하는 임의의 물질의 온도를 조절할 수 있다. 예를 들어, 지방조직을 가열하는 것은 해리를 용이하게 하지만, 재생성 세포 배출물을 냉각하는 것이 생존력 유지에 바람직하다. 또한, 미리 가온된 시약이 최적의 조직 프로세싱에 필요한 경우에, 온도 장치의 역할은 온도를 상승 또는 하강시키는 것보다는 예정된 온도를 유지하는 것이다.

폐쇄된 멸균 액체/조직 경로를 유지하기 위하여, 모든 포트 및 밸브는 시스템의 밀폐된 구조를 유지하는 클로저(closure)를 포함할 수 있다. 클로저는 액체, 공기 및 기타 오염물에 불투과성인 막일 수 있거나, 당업계에 공지된 임의의 기타 적합한 클로저일 수 있다. 또한, 시스템의 모든 포트는, 시스템의 무균상태를 손상하지 않으면서 챔버내 물질을 배출하기 위해 주사기, 바늘 또는 기타 장치를 수용할 수 있도록 고안될 수 있다.

본원에 기재한 바와 같이, 조직은 임의의 당업계에 인식된 방법을 통해 환자로부터 추출될 수 있다. 흡입된 조직은 가공을 위한 시스템 내에 두기 전에 추출될 수 있다. 흡인된 조직은 전형적으로 밀폐된 출입 포트, 예컨대 고무 격막으로 밀폐된 주사기 바늘 진입 포트 (수집 챔버내에 도시하지 않음)를 경유하여 도관(12)을 경유하여 수집 챔버 (20)으로 옮겨진다. 또는, 조직 추출 단계는 시스템의 일부일 수 있다. 예를 들면, 수집 챔버 (20)은 환자로 삽입된 표준 캐뉼라를 사용해서 조직 제거를 용이하게 하는 진공관 (11)으로 구성될 수 있다. 따라서, 이 실시양태에서, 전체 시스템은 환자에게 부착된다. 조직은 밀폐된 멸균 경로의 일부인 12a와 같은 도관을 거쳐 주입구 (21)를 통해 수집 챔버 (20)에 도입될 수 있다. 수집 챔버 (20)은 복수개의 가요성 또는 경질의 캐니스터 또는 실린더 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 수집 챔버 (20)은 다양한 크기의 1개 이상의 경질 캐니스터로 구성될 수 있다. 수집 챔버 (20)은 또한 1개 이상의 가요성 주머니로 구성될 수도 있다. 상기 시스템에서, 주머니는 주머니에 흡입을 적용할 때 주머니가 붕괴될 가능성을 감소시키는 것을 돕는 내부 또는 외부 프레임과 같은 지지체를 갖는 것이 바람직하다. 수집 챔버 (20)은 프로세싱 챔버 (30)에서 수행된 프로세스의 세척 및 농축 단계 이전에 조직을 적절하게 세척하고 분해하는데 필요한 양의 염수를 수용하도록 크기조절된다. 바람직하게는, 수집 챔버 (20)에 존재하는 조직 또는 액체의 부피가 맨눈으로 쉽게 확인가능하다. 예를 들어, 지방조직으로부터 재생성 세포를 얻기 위해, 적합한 수집 챔버는 지방흡인물 800 ml 및 염수 1200 ml를 수용하는 능력을 갖는다. 따라서, 한 실시양태에서, 수집 챔버 (20)은 적어도 2 리터의 보유량을 갖는다. 또다른 실시양태에서, 혈액으로부터 적혈구 세포를 해리하고 농축하기 위해, 수집 챔버 (20)은 적어도 1.5 리터의 보유량을 갖는다. 일반적으로, 수집 챔버 (20)의 크기는 환자로부터 수집된 조직의 종류 및 양에 따라 크게 달라진다. 수집 챔버 (20)은 조직을 약 5 ml 내지 최대 약 2 리터만큼 적은 양으로 수용하도록 크기조절될 수 있다. 더 작은 조직 부피, 예를 들어 5 ml 내지 100 ml를 위해, 조직은 수집 챔버 (20)으로 옮겨지기 전에 주사기에 모여질 수 있다.

수집 챔버 (20)는 멸균될 수 있는 임의의 적합한 생체적합성 물질을 사용하여 구축될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 수집 챔버 (20)는 ISO 10993 표준에 기재된 혈관내 접촉을 위한 생체적합성 요건을 충족하는 일회용 물질로 구축된다. 예를 들어, 폴리카르보네이트 아크릴 또는 ABS를 사용할 수 있다. 수집 챔버 (20)의 액체 경로에는 바람직하게는 발열원이 없으며, 즉 질환 전달의 위험 없이 혈액 사용에 적합하다. 한 실시양태에서, 수집 챔버 (20)는 사용자가 챔버 중에 존재하는 조직의 대략적인 부피를 육안으로 측정할 수 있게 하는 물질로 구축된다. 다른 실시양태에서, 수집 챔버 (20) 중의 조직 및/또는 액체의 부피는 자동화 센서 (29)에 의해 측정된다. 수집 챔버 (20)는 바람직하게는 자동화 시스템에서, 시스템이 적당한 정도의 정확성으로 챔버내에서 조직 및/또는 액체의 부피를 측정할 수 있도록 고안된다. 바람직한 실시양태에서, 시스템은 ±15％의 정확성으로 수집 챔버내의 부피를 감지한다.

예로만 제공되는 특정 실시양태에서, 수집 챔버 (20)는 경질 챔버 형태, 예를 들어 265 ㎛의 메쉬 크기를 갖는 의료 등급 폴리에스테르의 대략 원뿔형의 미리고정시킨 필터 (28)를 함유하는 의료 등급 폴리카르보네이트로 구축된 챔버이다(도 5 참조). 경질 조직 수집 용기는 높이 약 8 인치 및 직경 약 5 인치의 크기를 가지며, 벽 두께는 약 0.125 인치일 수 있다. 실린더의 내부는, 예를 들어 흡입 튜브용 1개 이상의 포트, 멸균 도킹 기술을 통한 연결용 튜브를 갖는 1개 이상의 포트 및/또는 고무 격막을 통한 바늘 구멍 평가용 1개 이상의 포트를 통해 평가될 수 있다. 수집 챔버 (20)의 내부에 미리고정시킨 필터 (28)는 바람직하게는 지방조직을 보유하고, 예를 들어, 조직이 환자로부터 제거되는 것처럼 비-지방조직을 통과시키도록 구조화된다. 더욱 구체적으로, 필터 (28)는 유리 지질, 혈액 및 염수를 통과시키는 한편, 지방조직의 초기 수거 동안, 또는 또다른 실시양태에서는 지방조직의 초기 수거 후에, 지방조직의 단편을 보유할 수 있다. 이와 관련하여, 필터 (28)는 동일하거나 상이한 크기이지만, 약 20 ㎛ 내지 5 mm 크기 범위의 복수개의 공극을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 필터 (28)는 복수개의 400 ㎛ 공극을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 필터 (28)는 약 265 ㎛의 공극 크기 및 약 47％ 개방 영역을 갖는 두께 약 200 ㎛의 의료 등급 폴리에스테르 메쉬이다. 이러한 물질은 세정 동안 조직을 보유하지만 세포를 메쉬를 통해 통과시킨 후 조직을 해리시킨다. 따라서, 조직이 환자로부터 흡인될 경우, 비-지방조직은 지방조직으부터 분리될 수 있다. 동일한 기능이 물질, 메쉬 크기 및 포트의 갯수 및 유형이 상이한 것으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 100 ㎛보다 작거나 수천 마이크로미터 만큼 큰 메쉬 공극 크기가, 지방조직 응집체 및 단편을 보유하는 동안 염수 및 혈액 세포를 통과시키는 동일한 목적을 달성할 수 있다. 유사하게, 동일한 목적이 대안적인 경질 플라스틱 물질의 사용에 의해, 또는 당업자에게 공지되어 있는 수많은 다른 변형에 의해 달성될 수 있다.

또한 시스템 (10)은 1개 이상의 용액 공급원 (22)으로 구성될 수 있다. 용액 공급원은 세척 용액 공급원(23) 및 조직 해리제 (24)의 공급원, 예컨대 콜라게나제를 포함할 수 있다. 수집 챔버(20)은 세척 및 해리 용액 또는 제제들이 조직에 멸균된 상태에서 첨가되게 하는 밀폐된 유체 통로로 구성된다.

세척 용액(23) 및 해리제 (24)용 용기는 멸균 방식으로 내용물을 보유할 수 있는 임의의 적합한 용기, 예를 들어 접을 수 있는 백, 예컨대 임상적 설치에 사용되는 IV 백일 수 있다. 이러한 용기는 세척 용액 및 해리제를 수집 챔버 (20)의 내부에 전달할 수 있도록 수집 챔버 (20)에 연결된 도관 (12), 예컨대 도관 (12e)을 갖는다. 세척 용액 및 해리제는 염수 (23) 및/또는 해리제 (24)용 용기의 외부에 적용되는 단순한 중력을 비롯한 임의의 당업계에 공지된 방식을 통해, 또는 도관, 예를 들어 도 4에서의 도관 (12d) 상에 용적형 펌프를 배치시킴으로써 수집 챔버 (20)의 내부로 전달될 수 있다. 자동화된 실시양태에서, 시스템의 프로세싱 장치는 사용자가 초기에 입력한 정보 (예를 들어, 프로세싱할 조직의 양)를 기준으로 다양한 파라미터, 예컨대 세척에 필요한 염수의 양 및 사이클 시간 또는 회수, 그리고 해리에 필요한 해리제의 농도 또는 양 및 시간을 산정한다. 또는, 상기 양, 시간 등은 사용자에 의해 수동으로 조작할 수도 있다.

수집 챔버 내부 조직 및/또는 액체는 30℃ 내지 40℃의 온도 범위에서 유지되어야 한다. 바람직한 실시양태에서, 수집 챔버 내부 현탁액의 온도는 37℃로 유지된다. 특정 실시양태에서, 수술 진행 또는 치료 용도에서 지연이 필요한 경우, 선택 조직을 이후 사용을 위해 수집 챔버 내에 저장할 수 있다. 상기 조직은 대략 실온 또는 약 4℃에서 96시간까지 저장될 수 있다.

세척 용액은 염수, 또는 다른 완충된 또는 완충되지 않은 전해질 용액을 비롯한, 당업자에게 공지된 임의의 용액일 수 있다. 프로세싱될 수 있는 조직의 유형은 사용되는 세척 용액의 유형 또는 조합을 지시할 것이다. 전형적으로, 염수 등의 세척 용액은 환자로부터 지방조직을 제거한 후에 수집 챔버 (20)에 도입한다. 그러나, 세척 용액을 수집 챔버 (20)로 전달한 후 지방조직을 추출하거나, 지방조직과 함께 수집 챔버 (20)로 전달할 수 있다. 수집 챔버 (20)에서, 세척 용액 및 추출된 지방조직을 상기 기재된 방법을 비롯한 임의의 수단에 의해 혼합할 수 있다.

예를 들면, 상기 조직은 교반하여 세척할 수 있다(이것은 세포 생존력을 최대화하고 유리 지질의 방출량을 최소화한다). 한 실시양태에서, 전체 수집 챔버 (20)를 다양한 각도의 아크(arc)를 통해 (예를 들어, 약 45도 내지 약 90도를 통해) 다양한 속도, 예를 들어 1분당 약 30 회전수로 회전시킴으로써 조직을 진탕시킨다. 다른 실시양태에서, 수집 챔버의 내부 표면에 단단하게 부착된 1개 이상의 패들 또는 돌출부로 구성된 수집 챔버 (20) 전체를 다양한 각도의 아크를 통해 (예를 들어, 약 45도 내지 약 90도를 통해) 다양한 속도, 예를 들어 1분당 약 30 회전수로 회전시킴으로써 조직을 진탕시킨다. 상기한 수집 챔버 (20)의 회전은 수집 챔버 (20)에 부착된 또는 근접한 구동 기계 장치에 의해 수행될 수 있다. 구동 기계 장치는 단순한 벨트 또는 기어 또는 당업계에 공지된 다른 구동 기계 장치일 수 있다. 회전 속도는, 예를 들어 1분당 30 회전수일 수 있다. 일반적으로, 높은 속도는 큰 부피의 유리 지질을 생성하는 것으로 알려져 있으며, 최적이 아닐 수 있다.

다른 실시양태에서, 회전되는 축으로서 혼합물을 통해 통과하는 회전축 (25)에 단단하게 부착된 1개 이상의 패들 (25a) 또는 돌출부로 구성된, 수집 챔버 (20) 내부의 회전축 (25)에 조직을 배치시킴으로써 진탕시킨다. 특정 실시양태에서, 단단하게 부착된 패들 (25a)을 갖는 회전축 (25)을 수집 챔버 (20)의 바닥에 위치시킬 수 있다. 이것은, 예를 들어 패들형 장치를 회전 자기장 (예를 들어, 자기 교반기)에 배치함으로써 수행될 수 있다. 별법으로, 조직의 진탕은 당업계에 공지된 단순한 진탕기, 즉 회전없이 위 아래로 흔드는 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 조직은 또한 임의의 공지된 수단, 예를 들면 진탕, 진동, 반전 등을 사용하여 세척할 수 있다.

소정량의 세척 사이클 후, 재생성 세포를 잔류 지방조직 성분으로부터 분리하기 위해 조직 해리제를 수집 챔버 (20)에 전달할 수 있다. 해리제는 당업자에게 공지된 임의의 해리제일 수 있다. 사용될 수 있는 해리제로는 중성 프로테아제, 콜라게나제, 트립신, 리파제, 하이알루로니다제, 데옥시리보뉴클레아제, 블렌드자임(Blendzyme) 효소 혼합물 군의 구성원, 예를 들어 리베라제(Liberase) H1, 펩신, 초음파 또는 다른 물리적 에너지, 레이저, 극초단파, 다른 기계적 장치 및/또는 이들의 조합물을 들 수 있다. 바람직한 해리제는 콜라게나제이다. 해리제는 다른 용액과 함께 첨가될 수 있다. 예를 들면, 염수(예를 들면, 상기한 염수 공급원(23)으로부터 얻은 염수)를 콜라게나제와 함께 또는 콜라게나제를 넣은 직후 첨가할 수 있다. 한 실시양태에서, 세척한 지방조직을 37℃ 또는 약 37℃에서 약 20 내지 60분 동안 콜라게나제-함유 효소 용액과 혼합시킨다. 다른 실시양태에서, 보다 고농도의 콜라게나제 또는 유사 작용제를 첨가하여 분해 시간을 감소시킬 수 있다. 세척된 지방조직 및 조직 해리제를 세척된 지방조직이 해리될 때까지 상기에 기재된 진탕 방법과 유사한 방식으로 진탕할 수 있다. 예를 들어, 세척된 지방조직 및 조직 해리제를 대략 90 도의 아크를 통해 수집 챔버 전체를 회전시키거나, 회전되는 축으로서 용액을 통해 통과하는 하나 이상의 패들로 구성된 축을 가짐으로써, 및/또는 수집 챔버의 내부 표면 상에 패들 또는 돌출부로 구성된 수집 챔버 전체를 회전시켜 진탕할 수 있다.

목적하는 바를 위해 어떤 지방세포 유래의 세포를 사용할 것인지에 따라서, 지방조직은 부분적으로 분해되거나, 또는 완벽하게 분해될 수 있다. 예를 들어, 지방세포 유래의 세포가 지방조직 단위와 조합되어 있는 실시양태에서는, 수거된 지방조직을 부분적으로 분해하고, 상기 부분 분해된 지방조직의 일부를 제거한 후, 수집 챔버 내 남아있는 지방조직의 잔여 부분을 계속하여 분해하는 것이 바람직하다. 별법으로, 세척된 지방조직의 일부를 제거하고, 임의로 분해시키기 전에 샘플 용기 내에 둔다. 또다른 실시양태에서는, 수거된 지방조직을 부분적으로 분해하여 환자에게 다시 도입하기 전에 세포를 농축시킨다. 한 실시양태에서, 지방조직을 일반적으로 약 20 분 미만의 시간 동안 조직 해리제와 혼합한다. 이어서 부분 분해된 조직의 일부를 수집 챔버로부터 제거할 수 있으며, 또다른 40 분 동안 지방조직을 조직 해리제와 혼합하여 남아있는 부분 분해된 조직을 추가로 분해할 수 있다. 지방세포 유래의 세포로서 재생성 세포의 본질적으로 순수한 집단을 사용한 경우, 지방조직은 완전히 분해될 수 있다.

소화 후, 조직 및 해리제는 용액의 부유 성분 및 비부유 성분이 수집 챔버 내에서 분리되기에 충분한 시간동안 침강시킨다. 전형적으로, 시간은 약 15초 내지 수 분의 범위일 수 있지만, 변형된 실시양태에서 다른 시간을 수행할 수 있다. 부유층은 추가 세척 및 농축이 필요한 재생성 세포로 구성되어 있다. 비부유층은 혈액, 콜라겐, 지질 및 조직의 다른 비재생성 세포 성분으로 구성되어 있다. 비부유층은 폐기 챔버로 분리하여야 한다.

따라서, 수집 챔버는 조직의 혈액 및 다른 비부유 성분이 1개 이상의 도관 (12)을 통해 1개 이상의 폐기 챔버 (40)로 배출될 수 있도록 수집 챔버의 가장 낮은 곳에 위치하는 출구 포트 (22)로 구성되는 것이 바람직하다. 수집 챔버 (20)는 일반적으로 수직으로 위치해 있거나 있을 수 있으므로 출구 포트 (22)는 수집 챔버의 바닥에 위치한다. 상기 배출은 능동적일 수도 있고 수동적일 수도 있다. 예를 들어, 상기에 기재된 비-부유 성분은 중력을 이용, 가압 또는 감압의 적용, 펌프 (34) 또는 통풍구 (32)를 사용하여 배수될 수 있다. 자동화된 실시 양태에서, 공정 장치는 특정 값을 신호로 주고/주거나 펌핑하여 비부유층이 수집 챔버 (20)에서 배출되도록 할 수 있다. 자동화된 실시양태에서, 수집 챔버는 부유액과 비-부유액 사이에 계면이 형성되는 경우 이를 검출할 수 있는 센서 (29)로 구성될 수 있다. 자동화된 실시양태는 또한 센서 (29), 예를 들면 수집 챔버의 배출 액체 통로에서 흘러 나오는 방출물이 빛 굴절을 변화시키는 것을 검출할 수 있는 광학 센서로 구성될 수도 있다. 빛 굴절의 적절한 변화는 밖으로 나가는 도관 내에 부유층이 있음, 즉 비부유층은 배출되었다는 것을 표시할 수 있다. 이어서 센서 (29)는 프로세싱 장치가 다음 단계로 진행하도록 신호화할 수 있다.

그러나 특정 실시 양태에서 상기 조직은 조직의 비재생성 세포 성분이 회복될 수 있도록 가공될 수 있다. 예를 들면, 특정 치료 또는 연구 분야에서, 콜라겐, 단백질, 기질 또는 간질 성분, 지질, 지방 세포 또는 조직의 다른 성분이 바람직할 수 있다. 이러한 실시 양태에서, 앞에서 설명하였듯이 폐기 챔버로 버려져야 할 것은 재생성 세포를 포함하는 부유층이다. 비부유층은 시스템 내에 머물면서 필요한 다음 공정을 수행한다.

비부유층이 제거되고 나면, 재생성 세포를 포함하는 부유층을 1회 이상 세척하여 잔류 오염물을 제거할 수 있다. 따라서 수집 챔버 (20)은 전형적으로 세척 용액이 챔버 내부로 전달되도록 하기 위해 1개 이상의 포트 (21), 및 폐기물 및 기타 물질이 수집 챔버 (20)으로부터 유출되도록 하기 위해 1개 이상의 포트 (22)를 포함한다. 예를 들어, 수집 챔버는 본원에 기재된 바와 같이 하나 이상의 밀봉된 입구 포트를 포함할 수 있다. 수집 챔버 (20)은 또한 세척 용액이 수집 챔버 내로 전달되고/되거나 폐기물이 유출되는 동안 시스템을 멸균 상태로 유지하기 위해 하나 이상의 캡 (도시되지 않음), 예컨대 상부 캡 및 하부 캡을 포함할 수 있다. 포트 (21)은 수집 챔버의 캡 또는 수집 챔버의 측벽에 제공될 수 있다.

신선한 세척 용액으로 세척하는 공정은 용액 내 비-부유 오염 물질의 잔류량이 사전-측정 수준에 도달할 때까지 반복될 수 있다. 즉, 지방조직 단편을 비롯한 상기에 기재된 혼합물의 부유 물질을 포함하는 수집 챔버 (20) 내 잔류 물질을, 원하지 않는 물질의 양이 원하는 사전-측정 수준에 도달할 때까지 1회 이상 추가로 세척할 수 있다. 세척의 종점을 결정하는 한가지 방법은 조직 용액 내 적혈구의 양을 측정하는 것이다. 이는 540 nm 파장에서 흡수되는 빛을 측정하여 수행할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 약 0.546 내지 약 0.842 사이의 범위가 허용되는 것으로 간주된다.

세척 및/또는 분리 동안 하나 이상의 첨가제가 필요에 따라 다양한 용기에 부가되어 결과를 향상시킬 수 있다. 첨가제의 몇몇 예는 세척 및 분리를 최적화하는 물질, 프로세싱 동안 활성 세포 집단의 생존력을 향상시키는 첨가제, 항미생물제(예, 항생제), 지방세포 및/또는 적혈구를 용해하는 첨가제, 또는 (고체 상 부분에의 차등 부착에 의해, 또는 다르게는 세포 집단의 실질적인 감소 또는 풍부를 촉진시킴으로써) 관심있는 세포 집단을 풍부하게 하는 첨가제를 포함한다. 다른 가능한 첨가제는 재생성 세포의 회복 및 생존력을 촉진시키거나(예, 카스파제 억제제), 주입 또는 설치(emplacement)에 대한 유해 반응 가능성을 감소시키는 것(예, 세포 또는 연결 조직의 재응집 억제제)을 포함한다.

충분한 침강 시간이 경과한 후, 생성된 세척된 지방조직 단편과 조직 해리제 혼합물의 비부유 분획은 재생성 세포, 예를 들어, 줄기 세포 및 기타 지방 유래된 선조 세포를 함유할 것이다. 본원에 기재된 바와 같이, 재생성 세포를 함유하는 비부유 분획은 프로세싱 챔버 (30)로 전달되고, 여기에서 관심있는 재생성 세포, 예를 들어 지방 유래된 줄기 세포가 혼합물의 비부유 분획에 존재하는 다른 세포 및 물질로부터 분리될 것이다. 이 비부유 분획은 본원에서 재생성 세포 조성물로 지칭되고, 줄기 세포, 선조 세포, 내피 전구 세포, 지방세포 및 본원에 기재된 기타 재생성 세포를 비롯한 여러 상이한 유형의 세포를 포함한다. 재생성 세포 조성물은 1종 이상의 오염물, 예를 들어, 지방조직 단편에 존재했었던 콜라겐 및 기타 연결 조직 단백질 및 그의 단편, 또는 조직 분리 과정으로부터의 잔류 콜라게나제를 함유할 수도 있다.

본 발명의 프로세싱 챔버 (30)는 바람직하게는, 재생성 세포 조성물이 관 (12), 밸브 (14) 및 펌프 (34)에 의해 수집 챔버 (20)로부터 프로세싱 챔버 (30)로 멸균 방식으로 이동하도록 시스템 내에 위치된다. 프로세싱 챔버는 10 mL 내지 1.2 L 범위의 조직/유체 혼합물을 수용하는 크기를 갖는다. 바람직한 태양에서, 상기 프로세싱 챔버는 800 mL를 수용하는 크기를 갖는다. 특정 실시양태에서, 수집 챔버 (20)으로부터의 총 재생성 세포 조성물을 프로세싱 챔버 (30)으로 보낸다. 그러나 다른 실시양태에서, 재생성 세포 조성물의 일부를 프로세싱 챔버 (30)으로 보내고, 또다른 부분은 시스템의 다른 영역, 예를 들어 샘플 챔버 (60)으로 보내어, 이후에 프로세싱 챔버 (30) 내에서 프로세싱된 세포들과 재혼합시킨다.

프로세싱 챔버 (30)은 멸균될 수 있는 임의의 적합한 친생물학적 물질을 사용하여 구축할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, ISO 10993 기준에 기재된 바와 같은 혈관내 접촉을 위한 친생물적 조건들을 만족하는 폐기가능한 물질로 프로세싱 챔버 (30)을 구축한다. 예를 들어, 폴리카르보네이트, 아크릴산, ABS, 에틸렌 비닐 아세테이트 또는 스티렌-부타디엔 공중합체 (SBC)를 사용할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 폐기가능한 프로세싱 챔버의 액체 경로에는 발열원이 부재한다. 프로세싱 챔버는 플라스틱 주머니, 예컨대 혈액은행에서 혈액을 프로세싱하는데 통상적으로 사용하는 것들의 형태로 존재할 수 있고, 또는 다른 실시양태에서는, 프로세싱 챔버가 구조적으로 고정된 것일 수 있다 (도 6). 한 실시양태에서, 프로세싱 챔버 (30)는 그의 전문이 본원에 참고로 도입된, 본원과 공동명의의 미국 출원 제10/316,127호 (2001년 12월 7일 출원) 및 동 제10/325,728호에 개시된 프로세싱 챔버와 유사할 수 있다.

프로세싱 챔버 (30)는 여과 및 원심분리 및/또는 이들의 조합을 비롯한 세포의 분리 및 농축에 적합한 임의의 방식으로 구축될 수 있다. 일정 태양에서, 수집 챔버 (20)로부터의 재생성 세포 조성물이 프로세싱 챔버 (30)로 도입되고, 여기에서 상기 조성물은 여과되어 특정 재생성 세포 집단을 분리 및/또는 농축할 수 있다. 세포 여과는 특정 성분 및 세포를 다른 상이한 성분 또는 세포 유형으로부터 분리하는 방법이다. 예를 들면, 본 발명의 재생성 세포 조성물은 줄기 세포, 선조 세포 및 지방세포를 비롯한 여러 상이한 유형의 세포, 및 1종 이상의 오염물, 예를 들어, 지방조직 단편에 존재했었던 콜라겐 또는 조직 분리 과정으로부터의 잔류 콜라게나제를 포함한다. 프로세싱 챔버 (30)에 존재하는 필터 (36)는 특정 하위집단의 재생성 세포, 예를 들어 줄기 세포 또는 내피 선조 세포 등의 분리 및 농축을 허용할 것이다.

액체로부터의 세포의 여과와 관련된 일부 변수들에는 필터 매체의 공극 크기, 공극의 형상 (형태), 필터의 표면적, 여과시키는 용액의 유동 방향, 막횡단 압력, 특정 세포 집단의 희석, 미립자 크기 및 형태 뿐만 아니라 세포 크기 및 세포 생존력이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 본원의 개시 내용에 따르면, 분리하거나 여과하길 원하는 특정 세포는 전형적으로 지방세포 유래의 줄기 세포이다. 그러나, 특정 실시양태에서, 상기 특정 세포에는 지방세포 유래의 선조 세포, 예컨대 내피 전구 세포가 단독으로 또는 줄기 세포와 조합하여 포함될 수 있다.

재생성 세포 조성물을 필터 조립체, 예컨대 필터 조립체 (36)를 통과시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 필터 조립체 (36)은 상이한 기능을 수행하여 재생성 세포 조성물을 별개의 부분 또는 성분으로 분리하도록 구성된 복수개의 필터로 구성된다. 예를 들어, 필터 중 하나는 재생성 세포 조성물로부터 콜라겐을 분리하고, 다른 하나는 재생성 세포 조성물로부터 지방세포 및/또는 지질 성분을 분리하고, 다른 하나는 재생성 세포 조성물로부터 잔류 효소들, 예컨대 조직 해리제를 분리하도록 구성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 필터 중 하나가 조성물로부터의 콜라겐 및 조직 해리제의 분리와 같은 2개의 기능을 수행할 수 있다. 복수개의 필터들은 전형적으로 직렬 배치되나, 필터의 일부 이상이 일렬로 배치될 수도 있다. 필터 조립체 (36)의 필터들의 직렬 배열을 도 2에 나타낸다. 필터 조립체 (36)의 필터들의 직렬 배열은 도 3에 나타낸다.

한 실시양태에서, 필터 조립체 (36)은 제1 필터, 제2 필터 및 제3 필터를 포함한다. 제1 필터는 재생성 세포 조성물 중에 존재하는 콜라겐 입자를 제거하도록 구성된다. 상기 콜라겐 입자는 전형적으로 직경이 대략 0.1 ㎛이고 길이는 20 ㎛까지일 수 있다. 콜라겐 입자는 분해에 따라 다양한 크기일 수 있다. 이들은 또한 피브릴일 수 있으며, 이는 이들이 꼬임과 회전을 가짐을 의미한다. 본원에 기재한 모든 필터는 폴리에테르술폰, 폴리에스테르, PTFE, 폴리프로필렌, PVDF, 또는 가능하게는 셀룰로스로부터 제조될 수 있다. 콜라겐을 필터링하기 위한 두 가지 가능성이 존재한다. 그 하나는 큰 입자를 먼저 제거하여 세포가 통과하도록 시도하는 것으로, 이는 예를 들어 아마도 10 ㎛ 범위의 필터가 요구될 것이다. 두 번째 방법은 콜라겐이 잘 분해될 것이라는 목적으로, 예컨대 4.5 ㎛의 작은 크기의 필터를 사용하여 세포를 잘 포획하고, 콜라겐이 통과되도록 하게 하는 것이다. 이에는 세포가 필터로부터 떨어져 부유하도록 하는 수단이 요구될 것이다. 또한 콜라겐 섬유를 끌어당겨 유지시키는 필터를 장치하는 가능성도 있을 수 있다.

제2 필터는 재생성 세포 조성물 중에 부유하지 않는 유리 미성숙 지방세포를 제거하도록 구성된다. 한 실시양태에서, 제2 필터는 폴리에스테르로 구축될 수 있으며, 약 30 내지 약 50 ㎛, 바람직하게는 약 40 ㎛의 공극 크기를 갖는다. 제2 필터로 지칭되었으나, 그러한 장치의 배치는 보다 큰 세포 및 입자의 초기 제거를 용이하게 하기 위해 두 번째가 아닌 첫 번째 위치일 수 있다. 제3 필터는 조성물 중에 존재하는 미사용 또는 잔류 콜라게나제 또는 다른 조직 해리제를 제거하도록 구성된다. 바람직한 실행에 있어서, 콜라게나제는 시간 경과에 따라 퇴화될 수 있다. 한 실시양태에서, 제3 필터는 직경 또는 길이가 1 ㎛ 미만인 복수개의 공극을 포함한다. 특정 실시양태에서, 공극의 직경은 1 ㎛ 미만일 수 있다. 다른 실시양태에서, 공극의 직경은 10 kD 내지 5 ㎛이다. 특정 실시양태에서, 제3 필터는 본원에 논의된 바와 같이 작은 부피의 염수 또는 다른 세척 용액으로 재생성 세포 집단을 농축시키도록 구성될 수 있다. 본 발명에서 바람직한 바와 같이, 단지 최종 필터만이 중공사 단위이다. 필터의 모두가 중공사 유형의 것일 필요는 없다. 중공사 단위는 바람직한 실행에서 최종 필터에 사용되는데, 이는 재생성 세포에 최소한의 악영향을 미치면서 콜라게나제를 제거하는 데 가장 효율적이기 때문이다. 장치가 기성품의 수집물인 실시양태에서 세 필터는 별개의 하우징에 존재한다. 중공사 단위가 제3 필터에 사용되는 경우, 제1 및 제2 필터를 하나의 하우징으로 조합하는 것이 가능하다. 최종 필터가 중공사 구조가 아닌 경우 세 필터 모두가 한 하우징 내에 존재할 수 있다.

필터 조립체 (36)의 필터는 프로세싱 챔버 (30) 내에 위치하거나, 프로세싱 챔버 (30)과는 별도 성분으로 제공될 수 있다. 또한, 필터 조립체 (36)의 필터는 다중 프로세싱 챔버에, 또는 직렬 방식으로 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, 도관 또는 튜브는 프로세싱 챔버 또는 챔버들로서 기능할 수 있다. 프로세싱 챔버는 필터들을 연결하는 도관의 내부 부피에 알맞도록 크기를 줄일 수 있다. 이러한 유형의 시스템은 조직 용액의 부피를 적절하게 크기 조절한다면 올바르게 기능할 것이다. 따라서, 도관은 액체가 필터를 통해 유동하면서 세포와 함께 액체를 함유함으로써 프로세싱 챔버로서 기능할 수 있다. 시스템을 프라이밍 및 운전하는 공정 중 세포/조직이 불필요하게 손실되지 않도록 도관의 부피를 최소화시키도록 주의해야 한다.

상기 실시양태를 참조하면, 세척된 세포 및 잔류 콜라겐, 지방세포 및/또는 분해되지 않은 조직 해리제를 함유하는 재생성 세포 조성물은 제1 필터를 통해 보내져 조성물로부터 콜라겐 입자를 적어도 일부, 바람직하게는 실질적으로 모두 제거함으로써, 여과된 용액 중에 콜라겐 입자가 더 적게, 바람직하게는 없도록 한다. 지방세포 및/또는 분해되지 않은 조직 해리제를 함유하는 여과된 재생성 세포 조성물은 이어서 제2 필터를 통해 보내져 여과된 재생성 세포 조성물로부터 유리 지방세포를 적어도 일부, 바람직하게는 실질적으로 모두를 제거할 수 있다. 이어서, 분해되지 않은 조직 해리제를 함유하는 2회 여과된 재생성 세포 조성물은 본원에 논의된 바와 같이 중공사 여과 장치와 같은 제3 필터를 통해 보내져, 재생성 세포 조성물로부터 분해되지 않은 조직 해리제를 제거하거나 감소시킬 수 있다.

3회 여과된 재생성 세포 조성물 (즉, 제1, 제2 및 제3 필터를 통과한 후에 남는 조성물)은 이어서 다중 배출구를 포함하는 프로세싱 챔버 (30)의 부분을 포함할 수 있는 다중 배출구로 보내질 수 있다. 상기 배출구는 필요한 압력을 유지할 뿐만 아니라, 도관을 통한 수집 챔버 (20), 배출 챔버 (50), 및/또는 폐기물 용기 (40)을 포함할 수 있는 다른 용기로의 연결부를 제공할 수 있다.

한 실시양태에서, 필터 조립체 (36)의 필터는 중공사 여과 부재를 포함한다. 또는, 즉, 필터는 필터 매체로 형성된 중공 튜브의 수집을 포함한다. 개시된 시스템 (10)에 사용될 수 있는 필터 매체의 예로는 폴리술폰, 폴리에테르술폰 또는 혼합 에스테르 물질 등을 들 수 있다. 상기 필터 매체의 중공사 또는 중공 튜브는 필터 조립체 (36)의 원통형 카트리지 내에 함유될 수 있다. 필터 매체의 개개의 튜브 또는 섬유는 전형적으로 내부 직경이 약 0.1 mm 내지 약 1 mm이며, 바람직한 값은 약 0.5 mm이다. 적합한 원통형 카트리지의 직경 및 길이는 카트리지의 내부에 배치될 수 있는 필터 매체의 개개의 튜브의 수를 결정할 것이다. 적합한 중공사 필터 카트리지의 일례는 파이버플로 (FiberFlo; 등록상표) 접선방향 유동 필터, 카탈로그 번호 M-C-050-K (민테크(Minntech), 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)이다. 필터 매체의 공극 크기는 약 10 kDa 내지 약 5 ㎛ 범위일 수 있으며, 바람직한 공극 크기는 약 0.5 ㎛이다.

중공사 필터에서, 각각의 중공 튜브는 제1 연부, 제2 연부, 및 몸체 내에 위치하고 제1 연부와 제2 연부 사이에서 연장되는 루멘을 갖는다. 각각의 중공 튜브의 몸체는 복수개의 공극을 포함한다. 공극은 도 12A에 나타낸 바와 같이 일반적으로 재생성 세포 조성물이 몸체의 루멘을 통해 유동함으로써 여과되고, 여과할 생성물이 공극을 접선방향으로 통과하도록 몸체 내에 배향된다. 즉, 액체 중 작은 입자는 몸체의 루멘을 통해 액체의 흐름에 대해 공극을 접선방향으로 통과한다. 재생성 세포를 함유하는 조성물은 조성물이 여과될 때 각각의 중공 튜브의 루멘을 통과한다. 바람직하게는, 조성물의 유동은 각각의 중공 튜브의 몸체의 공극에 대해 접선방향이다.

액체의 접선 방향 유동을 이용함으로써, 줄기 세포의 여과 효율은 다른 여과 기술에 비해 향상될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 여과 기술에 따라, 필터 매질의 공극은 필터가 액체의 유동에 대해 수직으로 배향되는 방식으로 위치하기 때문에, 필터 매질이 여과되는 액체의 경로를 차단하게 된다 (도 12B에 예시됨). 이러한 유형의 여과에 있어서, 재생성 세포 조성물 (예컨대, 줄기 세포)로부터 여과되는 입자는 필터의 한쪽 면에 축적되어 공극을 통한 액체의 유동을 차단하는 경향이 있다. 이러한 차단은 필터의 효율을 저하시킬 수 있다. 또한, 세포는 액체 유동의 압력, 및 필터의 상류쪽에 축적되는 세포의 중량에 의해 지속적으로 압착된다. 이는 줄기 세포의 용해를 증가시킬 수 있다. 따라서, 액체의 유동이 필터 공극의 배향과 평행한 여과 기술에서는, 액체가 공극을 통과할 때 커다란 세포 및 작은 입자 둘 다가 원치않게 필터 매질에 대항하여 이동될 수 있다. 따라서, 액체 중에서 세포와 같은 더 큰 생성물은 공극을 차단할 수 있고, 이에 따라 여과 효과를 감소시키고 세포 파쇄 또는 손상의 발생율을 증가시킬 수 있다.

이와 반대로, 본 발명의 시스템 (10)에 따른 중공사 구조에서는 여과되는 액체가 중공 튜브의 루멘 내부에서 유동하게 된다. 필터 몸체의 공극을 통과할 수 있는 액체 부분은, 상기 몸체 내부에 있는 액체의 가압 및 상기 몸체의 외부에서 가해지는 감압의 도움을 받아 상기와 같이 된다. 본 실시양태에서, 세포는 전형적으로 액체 유동의 압력 또는 다른 세포 중량의 압력을 받지 않게 되고, 이에 따라 줄기 세포에 대한 전단력이 감소된다. 따라서, 막힘(clogging) 비율의 감소 및 재생성 세포의 용해 감소에 의해 여과의 효율 및 효과가 향상될 수 있다. 염수 및 원치않는 단백질 분자의 크기로 인해, 이들 분자 및 다른 작은 성분들은 여과시에 중공 튜브 몸체의 공극을 통과해서 중공 튜브 밖으로 나가, 폐액 용기 (40)으로 이동한다. 한 실시양태에서, 중공 튜브 필터 매질 외부에 진공을 생성함으로써 여과가 향상된다. 재생성 세포 (예컨대, 줄기 세포 또는 선조 세포)의 크기로 인해, 이들 세포는 전형적으로 상기 몸체의 공극을 통과할 수 없고, 따라서 중공 튜브 필터의 내부 (예컨대, 튜브의 루멘 내)에 잔류하게 되고, 필터와 프로세싱 챔버 (30) 사이의 도관을 통해 프로세싱 챔버로 다시 이동하거나 배출 챔버 (50)으로 다시 이동한다.

한 구체적인 실시양태에서, 중공사 필터의 공극 크기는 약 0.05 ㎛이고, 중공사 필터의 표면적은 필터 매질 중 약 550 cm²이다. 각 매질 튜브의 직경은 전형적으로 약 0.5 mm이다. 재생성 세포 조성물 130 ml를 프로세싱함에 있어, 대략 120 ml의 추가 염수가 조성물에 첨가될 수 있다. 프로세싱 또는 여과 시간은 대략 8분일 수 있다. 중공사 튜브의 몸체 중 어느 한쪽의 압력차 (예컨대, 몸체 루멘 내부 및 몸체 외부의 압력)는 막-횡단 압력으로 간주된다. 막-횡단 압력은 약 1 mmHg 내지 500 mmHg의 범위일 수 있으며, 바람직한 압력은 약 200 mmHg이다. 중공사 여과를 이용한 유핵 세포의 회수율 및 생존율의 평균은 대략 생존 세포의 80％일 수 있다.

그러한 시스템에서 전형적으로 제거되는 콜라게나제의 양은 3의 대수 감소치와 동등하다. 예를 들어, 수집 챔버에서 프로세싱 챔버로 전달되는 재생성 세포 조성물 중의 초기 콜라게나제 농도가 0.078 U/ml인 경우, 최종 재생성 세포 조성물의 콜라게나제 농도는 0.00078 U/ml일 것이다. 콜라게나제는 중공사 필터에서 제거되고, 중공사 필터는 하기 논의되는 제3 필터에 해당한다.

상기 설명된 하나 이상의 세포 여과 방법을 예시하는 프로세싱 챔버는 도면 (특히, 도 1 내지 3)에 도시되어 있다. 도 1 내지 3을 참조하면, 프로세싱 챔버 (30)과 필터 조립체 (36)의 여과 챔버 사이에 펌프 (34)와 같은 펌프가 제공될 수 있다. 또한, 통풍구 (32) 및 압력 센서 (39)와 같은 통풍구 및 압력 센서가 프로세싱 챔버 (30) 및 필터 조립체 (36)과 일렬로 제공될 수 있다. 배출 챔버 (50)를 위한 부속품이 제공될 수도 있다. 이들 임의 성분 (예컨대, 펌프 (34), 통풍구 (32), 압력 센서 (39), 및 배출 챔버 (50)을 위한 부속품)은 프로세싱 챔버 (30)과 필터 조립체 (36) 사이에 제공될 수 있으며, 이에 따라 프로세싱 챔버 (30)에 함유된 액체는 이들 임의 성분으로 유동된 후에 필터 조립체 (36)을 통해 유동할 수 있다. 예를 들어, 액체는 필터 조립체 (36)으로 통과하기 전에 펌프 (34)를 통해 유동할 수 있다. 또는, 액체는 필터 조립체를 통과하기 전에, 시스템의 예비필터 액체 압력을 수득하도록 압력 센서 (39)를 통과할 수 있다. 특정 상황에서는, 하나 이상의 이들 성분이 통풍구 (32)와 같이 프로세싱 챔버 (30)의 요소로서 제공될 수도 있다 (도 6에 예시됨). 예시된 실시양태에서, 압력 센서 (39)는 재생성 세포 조성물이 필터 조립체 (36)의 여과 챔버로 들어갈 때 펌프 (34)에 의해 생성되는 상기 조성물의 압력을 측정하기 위해 일렬로 배열된다. 이러한 구성은 필터 막을 통한 막-횡단 압력의 모니터링을 용이하게 할 수 있다. 추가의 염수 또는 기타 완충액 및 세척 용액이 재생성 세포 조성물에 첨가되어, 조성물이 필터 조립체 (36)을 통해 여과될 때 원치않는 단백질의 제거를 도울 수 있다. 이러한 반복 세척을 다수회 수행하여 재생성 세포의 순도를 향상시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 염수는 여과를 향상시키는데 필요하다고 간주되는 어떠한 단계에서도 첨가될 수 있다.

본 발명을 제한하려는 의도가 아니라 단지 예로써 제공되는 한 구체적인 실시양태에서, 원치않는 단백질 및 염수 또는 기타 세척 용액은 다음과 같은 방식으로 제거된다. 재생성 세포 뿐만 아니라, 콜라겐 및 결합 조직 입자 또는 단편, 지방세포, 및 콜라게나제를 포함하는 조성물은, 최소 부피에 도달할 때까지 직렬 필터를 통해 순환된다. 최소 부피는 시스템의 총 정체(hold up) 부피와 몇몇 예정된 상수에 대한 함수이다. 정체 부피는, 모든 프로세싱 챔버가 비어있는 경우에 튜브 및 도관에 함유되어 있는 액체의 부피이다. 한 실시양태에서, 최소 부피는 15 ml이다. 최소 부피에 도달했을 때, 예정된 부피의 세척 용액이 재생성 세포 조성물과 혼합될 시스템으로 도입된다. 이어서, 세척 용액과 재생성 세포 조성물의 혼합물은, 최소 부피에 다시 도달할 때까지 필터를 통해 순환된다. 이 순환을 다수회 반복하여 재생성 세포의 순도를 향상시킬 수 있다 (즉, 조성물 중의 다른 물질에 비해 조성물 중의 재생성 세포 비율을 증가시킴). 도 10 및 11을 참조한다.

재생성 세포 조성물에서 원치않는 단백질이 제거되었고 상기 조성물이 충분히 농축 (예시적 실시양태에서는 약 1×10⁵ 내지 약 1×10⁷개 세포/ml 범위의 최소 농도가 이용될 수 있고, 바람직한 실시양태에서는 최소 농도가 약 1×10⁷개 세포/ml일 수 있음)되었다고 결정된 후에는, 배출 백과 같은 배출 챔버 (50)이 특정 실시양태에 따라 프로세싱 챔버 (30) 및/또는 필터 조립체 (36)의 배출구에 연결될 수 있다. 이어서, 통풍구 (32)와 같은 통풍구가 개방되어 농축된 재생성 세포의 배출을 용이하게 할 수 있다. 한 실시양태에서, 언제 최소 농도에 도달했는지는, 실험을 실시하여 전자 제어 장치에 프로그래밍한 후에 경험적으로 결정하였다. 이러한 결정은 얻고자하는 것이 무엇인지 (즉, 얼마나 많은 줄기/선조 세포를 원하는지), 또는 세포 농도의 범위가 얼마인지에 대한 프로세스로의 투입일 수 있다. 과학적 데이타에 근거하여, 미리 정해진 양의 지방조직을 수득하여, 원하는 결과를 달성하기 위해 시스템에 위치시킬 필요가 있다. 통풍구 (32)가 개방되면, 펌프 (34)와 같은 펌프는 농축된 재생성 세포를 배출 백으로 전달하는 기능을 할 수 있다. 한 실시양태에서, 배출 백 (50)은 한쪽 말단에 부속품이 있는 튜브가 설치된, 비어있는 혈액 백과 유사하다. 멸균 방식으로, 배출 백의 부속품은 배출구에 부착될 수 있고, 농축된 재생성 세포는 배출 백으로 전달될 수 있다.

도 1 내지 3에 예시된 바와 같이, 진공 펌프 (26)을 시스템 (10) 내에 제공하여 다른 것들 중에서 시스템 내의 압력을 변화시킬 수 있다. 예를 들면, 진공 펌프 (26)은 도관 (12b)와 같은 도관을 통해 수집 챔버 (20)으로 커플링되어 수집 챔버 (20) 내의 압력 감소를 유발할 수 있다. 또한, 진공 펌프 (26)은 도관 (12g)와 같은 도관에 의해 프로세싱 챔버 (30)으로 커플링될 수 있다. 펌프 (34)와 연결된 진공 펌프 (26)의 작동과 관련해서, 2개의 별개의 진공 펌프 또는 공급원을 사용할 수 있거나, 공정 중의 특정 지점에서 진공 인력을 필요로 하는 여러가지 도관으로 이를 향하게 하는 밸브를 이용하여 단일의 것을 사용할 수 있다. 또한, 진공 펌프 (26)은 도관 (12f)와 같은 도관을 통하여 폐기물 용기 (40)으로 커플링될 수 있다.

도 10 및 11에 대하여, 진공 펌프 (26)에 의해 발생한 압력을 이용하여 재생성 세포를 포함하는 액체의 흐름을 도관 (12)를 통하여 향하도록 할 수 있다. 상기 압력은 예를 들면, 시스템 (10) 중 하나 이상의 밸브 (14)의 위치를 자동으로 또는 수동으로 제어함으로써 여러 방향으로 공급할 수 있다. 시스템 (10)은 가압 또는 감압을 사용하거나 이의 조합을 통해 적절하게 기능하게 할 수 있다. 예를 들면, 재생성 세포를 상기 기재된 제1 및 제2 필터를 통해 제3 필터와 연결된 연질 측면의 용기로 끌어들일 수 있다. 연질 측면의 용기는 제3 필터의 앞에 일렬로 (직렬) 연결될 수 있다. 마지막 배출 챔버는 제3 필터의 다른 쪽 (예를 들어 하류쪽)에 있는 연질 측면의 용기일 수 있다. 상기 실시양태에서, 압력을 사용하여 재생성 세포를 한 연질 측면의 용기에서 제2 연질 측면의 용기로 필터를 통해 이동시킨다.

시스템 (10)의 또다른 실시양태에서, 줄기 세포 및/또는 지방세포 유래의 선조 세포의 여과는 침출식 여과 및 침강의 조합을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 이러한 시스템은 조직 재생성 세포 조성물 (예를 들어 줄기 세포 및/또는 지방세포 유래의 선조 세포를 함유하는 조성물)을 통과한 후 필터를 통과한 염수를 사용한다. 재생성 세포 조성물로부터의 세포의 침출식 여과와 연관된 변수 중 몇몇으로는 필터 매체의 공극 크기, 공극 기하 또는 형태, 필터의 표면적, 여과될 재생성 세포 조성물의 흐름 방향, 주입된 염수의 유속, 막-통과 압력, 세포 집단의 희석, 세포 크기 및 생존력이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

시스템 (10)의 한 실시양태에서, 프로세싱 챔버 (30)은 침출식 여과 및 침강을 이용하는 필터 조립체 (36)를 사용하여 재생성 세포를 분리하고 농축시킨다. 이에 제한되지 않는 예를 들면, 프로세싱 챔버 (30)은 도 6d에 나타난 바와 같이, 일반적으로 측벽 (30a), 최상부 표면 (30b) 및 최하부 표면 (30c)를 갖는 원통형체로서 정의된다. 멸균 통풍구 (32)는 최상부 표면 (30b)에 제공된다.

도 6의 실시양태에서, 프로세싱 챔버 (30)은 큰 공극 필터 (36a) 및 작은 공극 필터 (36b)와 같은 2개의 필터를 포함하는 필터 조립체 (36)를 포함하는 것으로 예시된다. 필터 (36a) 및 (36b)의 공극 크기는 전형적으로 약 0.05 ㎛ 내지 약 10 ㎛의 범위이다. 큰 공극 필터 (36a)는 직경이 약 5 ㎛인 공극을 포함할 수 있고, 작은 공극 필터 (36b)는 직경이 약 1 내지 3 ㎛인 공극을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 필터의 표면적은 약 785 mm²이다. 필터 (36a) 및 (36b)는 프로세싱 챔버 (30)의 내부를 분할하여 제1 챔버 (37a), 제2 챔버 (37b) 및 제3 챔버 (37c)를 포함한다. 도 6에 나타난 바와 같이, 제1 챔버 (37a)는 제2 챔버 (37b)와 제3 챔버 (37c) 사이에 위치한다. 또한, 제1 챔버 (37a)는 주입구 (31a) 및 배출구 (31b)를 갖는 프로세싱 챔버 (30)의 영역인 것으로 나타난다. 예시된 프로세싱 챔버 (30)는 프로세싱 챔버 (30)의 외부에서 프로세싱 챔버 (30)의 내부로 소통 통로를 제공하는 복수개의 포트, 예를 들어 포트 (31a), (31b) 및 (31c)를 포함한다. 포트 (31a), (31b) 및 (31c)는 프로세싱 챔버 (30)의 몸체의 측벽 (30a)에 위치하는 것으로 예시된다. 그러나, 포트 (31a), (31b) 및 (31c)는 또한 다른 영역에 위치할 수도 있다. 포트 (31a)는 재생성 세포를 함유하는 조성물이 프로세싱 챔버 (30)의 내부로 지나갈 수 있도록 도관에 커플링되도록 구축된 샘플 주입구로서 예시된다. 포트 (31b)는 분리되고 농축된 세포가 프로세싱 챔버 (30)의 내부로부터 제거될 수 있도록 도관으로 커플링되도록 구축된 배출구로서 예시된다. 포트 (31c)는 염수와 같은 신선한 세척 용액을 프로세싱 챔버 (30)의 내부로 전달하기 위해 도관에 커플링되도록 구축된 주입구로서 예시된다.

사용시에, 재생성 세포는 주입구 (31a)를 통해 중앙 챔버 (37a)로 도입될 수 있다. 염수 또는 다른 완충액을 주입구 (31c)를 통해 하부 챔버 (37b)로 도입한다. 염수는 약 10 ml/분의 속도로 챔버 (37a) 내의 재생성 세포 조성물을 통하여 향할 수 있다. 염수의 유속은 중력을 거스르는 정도이다. 염수의 흐름으로 인해 챔버 내의 세포는 세포의 밀도를 기준으로 분리되는 능력을 갖는다. 전형적으로, 염수를 조성물을 통해 밀어 올릴수록, 조성물 내의 보다 큰 세포들은 중앙 챔버 (37a)의 하부로 가라앉을 것이고, 보다 작은 세포 및 단백질은 제2 필터 (36b)를 통해 최상부 챔버 (37c)로 운반될 것이다. 상기 여과는 보다 큰 세포는 제자리에서 구르고, 보다 작은 입자는 자유로워져 염수와 함께 쓸려 나가도록 염수의 유속을 조정함으로써 달성된다. 멸균 통풍구 (32)는 올바른 압력 구배가 프로세싱 단위 내의 3개의 챔버 내에서 확실히 유지되도록 챔버 (30) 내에 포함된다. 상부 챔버 (37c)은 흡착 매질 (33)을 포함할 수 있다. 흡착 매질의 목적은 예를 들면 염수 유속이 감소될 때, 용액 중의 원치않는 단백질을 포획하여 이들이 다시 프로세싱 용액으로 필터 매체를 횡단하지 않도록 보장하는 것이다. 흡착 매질은 여과해 낼 물질 또는 성분을 흡착하거나 유인하는 일종의 필터 물질일 수 있다. 유출 포트를 최상부 필터의 상부에 첨가하여 폐기물 배출을 보조할 수 있다. 이의 또다른 실시양태는 최상부로부터 완만한 진공을 적용하여 폐기물 인출을 보조하는 것일 수 있다. 흡착 매질은 예시된 실시양태에서와 같이, 유속이 비교적 작은 경우 이용할 수 있다. 그 후, 과량의 염수 및 단백질을 폐기물 용기로 빼낼 수 있다.

보다 큰 세포 (예를 들어, 지방 세포 유래의 줄기 세포 및/또는 선조 세포)를 보다 작은 세포 및 단백질로부터 충분히 분리해 낸 경우, 본원에 논의된 바와 같이 분리된 세포를 함유하는 조성물은 농축될 수 있다. 조성물은 배출구 (31b)를 통해 챔버 (37a)로부터 제거된 후, 또는 챔버 (37a) 내에 있는 동안에 추가로 농축될 수 있다. 한 실시양태에서, 조성물 중 세포의 농축도는 하기의 방식으로 증가한다. 세포를 충분히 분리해 낸 후, 필터, 예컨대 필터 (36a 및 36b)는 서로 가까이 접근될 수 있다. 이러한 접근은 2개의 필터 사이의 부피 (예를 들어 챔버 (37a)의 부피)를 감소시키는 효과가 있다. 진동 부재는 또한 조성물 중 세포의 농축을 용이하게 하기 위한 프로세싱 챔버 (30)와 연결되어 제공될 수 있다. 한 실시양태에서, 진동 부재는 필터 (36b) (예를 들어 소공극 필터)에 커플링되어 있을 수 있다. 진동은 필터 내에 갇히게 되는 세포의 발생수를 감소시킬 수 있다. 조성물의 부피 감소는 과잉의 염수를 폐기물로서 제거하고, 세포를 보다 작은 부피로 농축시킨다.

또다른 실시양태에서, 재생성 세포의 농축은 하기의 방식으로 수행된다. 세포를 충분히 분리해 낸 후, 재생성 세포 조성물을 과잉의 염수를 중력을 사용하여 여과 제거하는 또다른 챔버 (도시하지 않음)로 옮길 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 침강은 침출과 동시에 발생할 수 있다. 이 침강은 공극 크기가 약 10 kD 내지 약 2 ㎛인 필터의 상부에 조성물을 도입하여 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 적합한 필터의 공극 크기는 약 1 ㎛이다. 중력은 조성물 내의 세포가 필터를 통해 흘러나가는 것을 방지하면서 염수 및 보다 작은 입자들은 필터를 통과하도록 할 것이다. 원하는 농축도의 세포를 수득한 후, 여과된 보다 작은 입자들을 필터 밑으로부터 제거하고 나서, 재생성 세포 조성물을 진탕하여 필터로부터 세포를 제거하고, 후속하여 농축된 재생성 세포를 배출 백으로 옮긴다. 보다 작은 입자들은 배출구를 통해 폐기물로서 버려질 수 있다.

특정 실시양태에서, 수집 챔버 (20)으로부터의 재생성 세포 조성물을 프로세싱 챔버 (30)으로 운반하고, 거기서 조성물을 원심분리하여 재생성 세포를 분리 및 농축할 수 있다. 원심분리의 원리는 당업계에 잘 알려져 있으므로, 간소함을 위해 본원에서는 설명하지 않을 것이다. 당업계에 알려진 표준적인 원심분리 장치, 부품 및 파라미터가 본원 발명에 사용된다. 원심분리 장치의 일부로서 사용하기 위한 예시적인 프로세싱 챔버를 도 7 및 도 8에 나타내었다. 전형적으로 원심분리 장치는 (도 7에 예시한 것 같은) 원심분리 챔버를 축 주위로 회전시켜 용액 중의 세포에 작용하는 힘을 중력보다 크게 증가시킨다. 용액 중의 더 치밀하거나 또는 더 무거운 물질은 전형적으로 원심분리 챔버의 한쪽 말단, 즉, 도 7의 배출 챔버 (50)으로 가라앉아 재생성 세포 펠렛을 형성할 것이다. 그 후에, 펠렛을 재현탁하여 원하는 세포 농도 및/또는 원하는 부피의 세포 및 매질을 갖는 용액을 얻을 수 있다. 도 7에 나타낸 프로세싱 챔버는 원심력 및 중력 모두를 사용하여 세포를 분리 및 농축하도록 구축되어 있다. 구체적으로, 원심분리 도중, 원심력은 재생성 세포 조성물의 더욱 치밀한 성분, 예를 들어 재생성 세포를 원심분리 챔버의 최외곽으로 보낸다. 원심분리 챔버가 속도를 줄이면서 마침내 멈추었을 때, 중력은 재생성 세포가 원심분리 챔버의 최외곽에 남아 세포 펠렛을 형성하도록 돕는다. 따라서, 세포 펠렛을 저해하지 않고 재생성 세포 조성물의 원치않는 성분, 즉 폐기물을 제거할 수 있다.

본 발명의 또다른 실시양태에서, 프로세싱 챔버는 회전 막 필터 형태의 세포 농축기로 구성될 수 있다. 원심분리 공정의 추가의 실시양태에서, 또한 원심 세정을 적용할 수도 있다. 본 실시양태에서, 원심분리에 의해 인가된 방향성 (예컨대 외향성) 힘이 세포 및 용질을 서로 다른 속도로 침강시키는 것과 같은 개별적인 세포 침강 속도에 근거하여 세포를 분리할 수 있다. 세정시, 표적 세포 집단의 침강 속도는 원심력과 반대 방향으로 용액을 펌핑하여 인가되는 반대 방향 (예컨대 내향성) 유속에 의해 저지된다. 역류를 조절하여 용액 내의 세포 및 입자들이 분리되도록 한다. 세정은 다양한 경우의 세포 분리에 적용되어 왔으며 (문헌 [Inoue, Carsten et al. 1981]; [Hayner, Braun et al. 1984]; [Noga 1999]), 흐름을 최적화하는 데 사용되는 원리와 실습 및 원심 파라미터는 본원 명세서에 비추어 당업자에 의해 본원에 적용가능할 수 있다.

도 9는 본 발명에 따른 세정 실행과 연관된 원리를 예시한다. 세정의 실시양태는 회전 로터를 사용하여 용액에 힘을 인가할 수 정도로 원심분리를 실행하는 것과 유사할 수 있다. 실제로 구현된 세정과 연관된 변수의 일부로는 회전 챔버의 크기 및 형태, 로터의 직경, 로터의 속도, 역류 튜브의 직경, 역류의 유속뿐만 아니라 용액으로부터 제거되는 입자 및 세포의 크기 및 밀도를 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 원심분리에 있어서, 재생성 세포를 개별적인 세포 밀도에 근거하여 분리할 수 있다.

한 실시양태에서, 도 9.1에 도시하는 바와 같이 재생성 세포 조성물, 예를 들어 재생성 세포 조성물 및 콜라게나제를 함유하는 용액을 회전하는 로터의 챔버 내로 도입한다. 용액을 챔버에 첨가한 후, 추가의 염수를 소정의 유속으로 챔버에 첨가한다. 염수의 유속은 로터의 속도, 세포 직경 및 실험적으로 수립되는 챔버 상수의 함수로서 미리 결정할 수 있다. 유속은, 예를 들어 IV 펌프와 유사한 장치로 제어될 것이다. 추가 염수의 목적은 도 9.2에 도시한 바와 같이 더 큰 입자들이 챔버의 한 쪽으로 움직이고, 더 작은 입자들이 다른 한 쪽으로 움직이는 로터 챔버의 내부 조건을 제공하기 위한 것이다. 본 출원에서는 도 9.3에 나타나있는 바와 같이 유속을 조절하여 더 작은 입자들이 챔버를 빠져 나와 폐기물 용기로 들어갈 것이다. 이러한 움직임은 실질적으로 균질한 세포, 예컨대 줄기 세포의 집단을 갖는 로터 챔버 내의 용액을 유발한다. 줄기 세포가 용액 중의 나머지 물질들(챔버로부터 제거되는 원치않는 단백질 및 유리 지질)로부터 분리되는 것으로 측정된 뒤에는 역류를 정지시킨다. 이어서, 챔버 내의 세포는 챔버의 외벽 상에 농축된 펠렛을 형성할 것이다. 역류를 역행시키고 세포 펠렛은 배출 백으로 옮긴다.

상술한 바와 같이, 프로세싱 챔버 (30) 또는 배출 챔버 (50)은 1개 이상 포트, 예를 들어 포트 (51) 또는 (52)를 포함할 수 있다. 상기 방법들의 임의의 조합을 사용하여 수득한 재생성 세포 또는 그의 일부가 도관을 통해 수술 장치, 세포 배양 장치, 세포 매리네이딩(marinading) 장치, 유전자 요법 장치 또는 정제 장치로 운반되도록 이러한 포트 1개 이상을 고안할 수 있다. 이들 포트는 또한 재생성 세포를 도관을 통해 시스템 내부의 추가적인 챔버 또는 용기로 운반하도록 고안되거나 또는 상기한 것과 동일한 목적을 위한 또다른 시스템의 일부로서 고안될 수 있다. 포트 및 도관은 또한 1 종 이상의 첨가제, 예컨대, 성장 인자, 재현탁액, 세포 배양 시약, 세포 증식 시약, 세포 보존 시약 또는 유전자를 세포로 전달하는 작용제를 비롯한 세포 변형 시약을 첨가하는데 사용될 수도 있다. 포트 및 도관은 또한 재생성 세포를 이식 물질 (예를 들어, 스캐폴드 또는 골 단편), 및 다른 수술용 이식물 및 장치와 같은 다른 표적으로 운반하는데 사용될 수도 있다.

기존 시스템의 일회용 세트간 상호연결의 재구성, 기존 시스템의 프로세싱 장치의 재-프로그래밍, 기존 시스템에 상이하거나 추가적인 용기 및/또는 챔버 제공, 하나 이상의 추가적인 시스템 또는 장치로의 세포 운반, 및/또는 이들의 임의의 조합에 의해 세포의 추가적인 프로세싱을 개시할 수도 있다. 예를 들어, 시스템을 사용하여 수득된 재생성 세포가 다음중 하나에 적용될 수 있도록 상기한 임의의 수단에 의해 시스템을 재구성할 수 있다: (하나 이상의 재생성 세포 유형의) 세포 증식 및 (세포판 세정 및 매질 변경을 비롯한) 세포 유지; 계대배양; 세포 파종; (대량 공급으로부터의 형질감염된 세포의 파종을 비롯한) 일과성 형질감염; (효소적, 비효소적 수거 및 기계적 찰과에 의한 수거를 비롯한) 수거; 세포 생존력 측정; 세포 평판배양 (예컨대, 미량 역가판을 이용함, 증식을 위한 개별 웰로부터의 세포 채집, 신선한 웰로의 세포 증식 포함); 고 처리량 스크리닝; 세포 요법 적용; 유전자 요법 적용; 조직 공학 적용; 치료 단백질 적용; 바이러스성 백신 적용; 저장 또는 선별을 위한 상청 또는 재생성 세포의 수거, 세포 성장의 측정, 용해, 접종, 감염 또는 유도; (하이브리도마 세포를 비롯한) 세포주의 발생; 투과성 연구를 위한 세포의 배양; RNAi 및 바이러스 내성 연구를 위한 세포; 유전자결손 및 유전자전환 동물 연구를 위한 세포; 친화 정제 연구; 구조 생물학 적용; 분석법 개발 및 단백질 공학 응용.

예를 들어, 특정 적용을 위해 재생성 세포 집단의 증식이 필요할 경우, 그 집단을 우세하게 증식시키는 반면, 다른 집단은 유지시키거나 (그렇게 함으로써 선택된 세포의 성장에 따라 희석되어 감소함), 또는 필수 성장 조건의 부재로 인해 소실되도록 하는 배양 조건을 사용한 접근법을 이용할 수 있다. 세키야(Sekiya) 등은 이와 관련하여 골수-유래 줄기 세포에 사용할 수 있는 조건을 기술하였다 ([Sekiya et al, 2002]). 이 접근법 (조직 배양 플라스틱에 대한 차별적 부착이 있거나 또는 없음)은 본 발명의 추가 실시양태에서 적용될 수 있다. 이 실시양태에서는, 최종 재생성 세포 펠렛을 배출 챔버로부터 제거하고, 세포 배양 성분을 제공하는 제2 시스템 내에 위치시킨다. 이것은 통상의 실험실 조직 배양 인큐베이터 또는 짜오(Tsao) 등의 미국 특허 제6,001,642호 또는 암스트롱(Armstrong) 등의 미국 특허 제6,238,908호에서 기재된 것 같은 바이오리액터(Bioreactor) 스타일의 장치의 형태일 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포 증식 또는 세포 배양 성분을 기존 시스템에, 예를 들어 배출 챔버 내에 첨가하여 지방 유래의 세포 집단의 단기 부착 및/또는 세포 배양을 허용할 수 있다. 이 다른 실시양태는 세포 배양 및/또는 세포 증식 성분을 시스템에 통합시킬 수 있게 하고, 이 시스템으로부터 세포를 제거하여 다른 시스템내에 위치시킬 필요를 없앨 것이다.

프로세싱 동안, 결과를 향상시키기 위해 필요할 경우, 여러 챔버 또는 용기에 1종 이상의 첨가제를 첨가하거나 또는 제공할 수 있다. 이러한 첨가제는 또한 기존 시스템과 연결되거나 또는 기존 시스템과 분리된 다른 시스템의 일부로서 제공될 수도 있다. 예를 들면, 특정 실시양태에서, 첨가제는 시스템으로부터 재생성 세포를 제거할 필요없이 첨가 또는 제공될 수 있다. 다른 실시양태에서, 시스템의 비사용 포트에 첨가제를 포함하는 새로운 용기 또는 챔버를 멸균 방식으로 연결함으로써 첨가제를 첨가 또는 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 시스템에 연결되지 않은 제2의 시스템 또는 장치에 첨가제를 첨가 또는 제공한다. 첨가제의 몇몇 예로는 세척 및 해리를 최적화하는 작용제, 프로세싱 동안에 활성 세포 집단의 생존력을 향상시키는 첨가제, 항균제 (예를 들어 항생제), 지방세포 및/또는 적혈구 세포를 용해하는 첨가제, 또는 관심 세포 집단을 풍부하게 하는 첨가제 (고상 부분 또는 세포 집단의 상당한 감소 또는 증가를 촉진하는 다른 것으로의 차별적 부착에 의함) 등이 있다.

예를 들어, 균일한 재생성 세포 집단을 얻기 위해, 특정 유형의 재생성 세포를 분리하는데 적합한 임의의 방법, 예를 들어 줄기 세포 또는 선조 세포 (예를 들어 내피 전구 세포)에 존재하는 항원을 인식하고 결합하는 세포-특이적 항체를 사용하는 방법을 이용할 수 있다. 이러한 방법에는 양성 선별 (표적 세포의 선별)과 음성 선별 (원치않는 세포의 선택적 제거) 둘다, 또는 이들의 조합이 포함된다. 효소 등과 같은 세포내 마커를 특정 효소에 의해 활성화될 때 형광을 내는 분자를 사용하는 선별에 사용할 수도 있다. 추가로, 최종 세포 펠렛 내의 재생성 세포 특정 집단이 차별적 부착되고(되거나) 그 집단이 용출되도록 선택된 접착성을 갖는 고상 물질을 상기 시스템의 배출 챔버에 삽입할 수도 있다.

이러한 차별적 부착 방법의 다른 실시양태는 표적 재생성 세포 및 원치않는 세포에서 차별적으로 발현되는 표면 분자를 인식하는 항체 및/또는 항체 조합물의 사용을 포함할 것이다. 특정 세포 표면 마커 (또는 이들의 조합물) 발현을 기준으로 한 선별은, 고상 지지 구조물에 항체를 부착시키는 (직접 또는 간접적 부착) 또다른 통상적 기술이다 ([Geiselhart et al., 1996], [Formanek et al., 1998], [Graepler et al., 1998], [Kobari et al., 2001], [Mohr et al., 2001]).

또다른 실시양태에서, 세포 펠렛을 재현탁하여 연속적 또는 불연속 밀도 구배가 형성된 액체 물질 위 (또는 밑)에서 층을 이루게 할 수 있으며, 원심분리기에 위치시켜 세포 밀도에 따라 세포 집단을 분리할 수 있다. 유사한 실시양태에서, 연속 유동법, 예컨대 성분채집술 [Smith, 1997] 및 세정법 (역류의 존재 또는 부재) (문헌 [Lasch et al., 2000], [Ito and Shinomiya, 2001])을 이용할 수도 있다.

첨가제의 다른 예로는 상기 논의한 바와 같이 추가적인 생물학적 또는 구조적 성분, 예를 들면, 세포 분화 인자, 성장 촉진제, 면역억제제, 의료 장치 또는 이들의 조합이 포함될 수 있다. 예를 들면, 다른 세포 (예컨대, 심장공), 조직 (예컨대, 심장 조직), 조직 단편, 성장 인자, 예컨대 VEGF 및 혈관형성 또는 동맥형성 성장 인자로 공지된 다른 것들, 생물학적으로 활성 또는 불활성인 화합물 (예컨대, 카르디오게놀 C), 재흡수가능한 플라스틱 스캐폴드, 재생성 세포 집단의 전달, 효능, 관용성 또는 기능을 향상시키기 위해 계획된 기타 첨가제를 첨가할 수 있다.

재생성 세포 집단은 또한 구조적 또는 치료적 목적의 유도를 위해 재생성 세포의 기능을 변화, 향상 또는 보충하는 방식으로 (본원에 기재되거나 당업계에 공지된 바와 같이) DNA (예컨대, Id 단백질, WNT 패밀리 단백질, 신호전달 단백질, 예컨대 RXR 패밀리 단백질 및 gp130 및/또는 성장 인자, 예컨대 IGF-1을 코딩함)를 삽입하거나 세포 배양 시스템 내에 위치시킴으로써 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 유전학적 가공은 최적 박동을 보장하기 위해 환자 내로의 재주입 전에 심근세포 또는 심근세포 유사 세포로 분화되는 재생성 세포의 속도를 커스트마이징(customize)하기 위해 사용될 수 있다.

줄기 세포용 유전자 전달 기술은 문헌 ([Morizono et al., 2003] 및 [Mosca et al., 2000])에 기재된 바와 같이 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌 [Walther and Stein, 2000] 및 [Athanasopoulos et al., 2000])에 기재된 바와 같은 바이러스 형질감염 기술, 더욱 구체적으로는 아데노-관련 바이러스 유전자 전달 기술을 포함할 수 있다. 비-바이러스 기재 기술은 또한 문헌 [Muramatsu et al., 1998]에 기재되어 있는 바와 같이 수행할 수 있다. 1종 이상의 세포 분화 인자, 예컨대 사이토카인(류) 및 성장 인자(류)를 코팅하는 유전자를 또한 첨가할 수 있다. 다양한 세포 분화제의 예는 문헌 ([Gimble et al., 1995], [Lennon et al., 1995], [Majumdar et al., 1998], [Caplan and Goldberg, 1999], [Ohgushi and Caplan, 1999], [Pittenger et al., 1999], [Caplan and Bruder, 2001], [Fukuda, 2001], [Worster et al., 2001], [Zuk et al., 2001])에 개시되어 있다. 항-세포자멸 인자 또는 작용제를 코딩하는 유전자를 또한 첨가할 수 있다. 유전자 (또는 유전자의 조합물)의 첨가는 아데노바이러스 형질도입, "유전자 총", 리포좀-매개 형질도입, 및 레트로바이러스 또는 렌티바이러스-매개 형질도입, 플라스미드, 아데노-관련 바이러스를 포함하나 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 임의의 기술에 의할 수 있다. 그 후에, 이와 같이 계내에 형질도입이 지속되거나 개시될 수 있도록 시간에 걸쳐 세포에 유전자를 방출하고/하거나 제공할 수 있는 유전자 전달 비히클을 함유한 담체 물질과 함께 재생성 세포를 이식할 수 있다.

세포 및/또는 세포를 함유하는 조직을 세포 및/또는 조직이 적출된 환자 이외의 환자에게 투여하는 경우에, 1종 이상의 면역억제제를 세포 및/또는 조직을 수여받은 환자에게 투여하여 이식의 거부 반응을 감소시키고, 바람직하게는 예방할 수 있다. 본원에서 사용된, 용어 "면역억제 약물 또는 면역억제제"는 정상 면역 기능을 억제하거나 또는 방해하는 제약 작용제를 포함하는 것을 의도한다. 본원에 개시된 방법에 적합한 면역억제제의 예로서 T-세포/B-세포 공동자극 경로를 억제하는 작용제, 예컨대 미국 특허 공보 제20020182211호에 개시된 바와 같이, CTLA4 및 B7 경로를 통해 T-세포와 B-세포의 결합(coupling)을 방해하는 작용제를 들 수 있다. 바람직한 면역억제제는 시클로스포린(cyclosporine) A이다. 다른 예로서 미오페닐레이트 모페틸(myophenylate mofetil), 라파미신(rapamicin), 및 항-흉선세포 글로불린을 들 수 있다. 한 실시양태에서, 면역억제 약물은 1종 이상의 다른 치료제와 함께 투여된다. 면역억제 약물은 투여 경로와 상용성인 제형 형태로 투여되고 원하는 치료 효과를 달성하기에 충분한 투여량으로 대상체에 투여된다. 또다른 실시양태에서, 면역억제 약물은 본 발명의 재생성 세포에 대한 내성을 유발하기 위해 충분한 시간 동안 일시적으로 투여된다.

이들 실시양태에서, 재생성 세포는 당업계에 공지된 임의의 방식, 예컨대 진탕기와 같은 장치 및 본원에 기재된 관련 방법으로 첨가제와 접촉, 배합, 혼합되거나 또는 첨가될 수 있다. 예를 들면, 진동, 반전, 압축 펄스화 롤러 또는 이동 롤러를 사용할 수 있다.

또다른 측면에서, 세포 집단을 수용자에게 배치시키고 재흡수가능한 플라스틱 쉬쓰(sheath) 또는 마크로포어 바이오서저리, 인크.(MacroPore Biosurgery, Inc.)에 의해 제조된 것과 같은 다른 물질 및 관련 성분으로 포위할 수 있다 (예를 들어 미국 특허 제6,269,716호; 제5,919,234호; 제6,673,362호; 제6,635,064호; 제6,653,146호; 제6,391,059호; 제6,343,531호; 제6,280,473호).

전술한 모든 실시양태에서, 2001년 9월 14일자로 출원된 미국 특허 가출원 제60/332,070호의 이점을 청구하며 본원과 공동 명의인, 2002년 9월 12일자로 출원된 미국 특허 출원 제10/242,094호 (발명의 영문 명칭: PRESERVATION OF NON EMBRYONIC CELLS FROM NON HEMATOPOIETIC TISSUES) (상기 문헌의 내용은 그 전문이 완전히 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있는 바와 같이, 분리 및 농축된 재생성 세포의 적어도 일부는 저온 보관할 수 있다.

프로세싱 종료시, 재생성 세포를 배출 챔버로부터 수동으로 회수할 수 있다. 세포를 주사기와 같은 전달 장치에 적재하여 수용자에게 피하 투여하거나, 근육내 투여하거나, 또는 세포를 환자의 표적 부위로 전달가능케하는 다른 기술로 투여할 수 있다. 즉, 세포를 당업자에게 공지된 임의의 수단으로 환자에게 투여할 수 있다. 바람직한 실시양태는 바늘 또는 카테터로, 또는 직접 수술 이식으로 투여하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 세포는 환자에게 세포를 투여하는데 사용될 수 있는 용기, 주사기 또는 카테터 등의 형태일 수 있는 배출 챔버로 자동적으로 운반될 수 있다. 용기는 나중에 사용하기 위해서나 냉동보관을 위해 세포를 저장하는데 사용될 수 있다. 모든 회수 방법은 멸균 방식으로 수행된다. 수술 이식의 실시양태에서, 세포는 본원에 기재된 바와 같이 미리 형성된 매트릭스 또는 스캐폴드와 같은 첨가제와 함께 적용시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서 (예를 들면, 도 4에 나타낸 실시양태에서), 시스템이 자동화된다. 또다른 실시양태에서, 상기 시스템은 자동화 부품 및 수동 부품 둘다를 갖는다. 시스템은 재사용가능한 하드웨어 부품 또는 모듈 상에 탑재된 하나 이상의 일회용 부품으로 구성될 수 있다. 본 발명의 자동화 시스템은 시스템의 적절한 조작을 촉구하는 스크린 디스플레이를 제공한다 (도 16 참조). 상기 자동화 시스템은 또한 시스템의 일회용 부품의 적절한 셋업에 따라서 절차 및/또는 단계의 상황을 단계 지시에 의해 제공하는 스크린을 제공할 수 있다. 상기 스크린은 또한 시스템에서의 문제나 고장이 발생하는 경우 이를 나타내고, 적절하다면 "문제 해결(troubleshooting)" 지침을 제공할 수 있다. 한 실시양태에서, 스크린은 사용자가 시스템에 파라미터를 입력할 수 있도록 하는 사용자 인터페이스 스크린, 예를 들면, 터치 스크린(touch screen)이다.

부분 및 완전 자동화 시스템은 프로세싱 장치 (예를 들어 마이크로프로세서 또는 개인용 컴퓨터)를 포함하고, 시스템을 위한 제어 논리를 제공하는 소프트웨어 프로그램과 연관되어 있어 사용자의 입력에 따라 하나 이상의 공정 단계를 조작하고 자동화할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 시스템의 하나 이상의 측면은 프로세싱 장치 내에 속해 있는 소프트웨어를 통해 사용자가 프로그램 가능한 것일 수 있다. 프로세싱 장치는 리드 온리 메모리(Read Only Memory) (ROM)에 있는 하나 이상의 미리 프로그램된 소프트웨어 프로그램을 가질 수 있다. 예를 들어, 프로세싱 장치는 프로세싱 혈액에 적합한 미리 프로그램된 소프트웨어, 지방조직을 프로세싱하여 적은 부피의 재생성 세포를 수득하기 위한 또다른 프로그램 및 지방조직을 프로세싱하여 보다 큰 부피의 재생성 세포를 수득하기 위한 또다른 프로그램을 가질 수 있다. 프로세싱 장치는 또한 사용자에게 적절한 파라미터를 제공하여, 요구되는 재생성 세포의 양, 프로세싱하고자 하는 조직의 유형, 프로세싱 후 요구되는 조작의 유형, 치료 방법의 유형 등과 같은, 사용자가 입력한 관련 정보에 기초하여 공정을 최적화하는 미리 프로그램된 소프트웨어를 가질 수 있다.

소프트웨어는 시스템의 펌프 및 밸브를 제어함으로써 특정 튜브 경로에 따라 액체 및 조직의 진입 및 배출을 제어하는 단계; 적절한 활성화 순서 및/또는 방향을 제어하는 단계; 압력 센서로 차단 상태를 검출하는 단계; 부피 메카니즘을 이용하여 특정 경로에 따라 이동시키고자 하는 조직 및/또는 액체의 양을 측정하는, 메카니즘과 혼용하는 단계; 열 제어 장치를 이용하여 다양한 부품의 온도를 유지하는 단계; 및 분리 및 농축 공정을 시기 설정 및 소프트웨어 메카니즘과 통합하는 단계와 같은 단계들의 자동화를 가능하게 한다. 프로세싱 장치는 프로세싱되는 조직의 유형 및/또는 수거되는 세포 집단 또는 하위-집단 및 수행되는 절차의 유형에 근거하여 원심분리 속도를 제어할 수 있다. 프로세싱 장치는 또한 표준 일렬 또는 직렬 포트, 또는 다른 컴퓨터 또는 네트워크와 연결시키는 다른 수단을 포함할 수 있다. 따라서, 프로세싱 장치는 단독 유닛일 수 있거나 또는 본원에 기재된 단추가의 프로세싱 방법을 위한 하나 이상의 추가 장치와 연결될 수 있다.

상기 소프트웨어는 예를 들어 일회용 부품의 제품 번호, 온도 및 부피 측정치, 조직 부피 및 세포수 파라미터, 사용된 효소의 양, 인큐베이션 시간, 사용자 신원, 날짜 및 시간, 환자 신원 등을 비롯한 "런 데이타(run data)"의 수집을 자동화할 수 있다. 장치의 바람직한 실시양태에서, 바 코드 판독 시스템과 같은 문자 인식 시스템은 상기 변수 데이타 (예를 들어 일회용 세트의 제품 번호 및 만기일, 콜라게나제, 환자/샘플 식별자의 제품 번호 및 만기일 등)의 프로세싱 장치로의 입력을 승인하기 위하여 프로세싱의 문서화 부분으로서 통합될 수 있다. 이는 데이타 입력 에러에 대한 기회를 감소시킨다. 이러한 바 코드 판독 시스템은 USB 또는 당업계에 공지된 다른 인터페이스 포트 및 시스템을 사용하여 프로세싱 장치로 쉽게 도입될 수 있다. 이러한 방법으로, 본 발명의 장치는 공정의 데이타 입력과 문서화의 통합된 제어를 제공한다. 인쇄되어 나온 이러한 파라미터의 보고는 시스템의 프로그램된 조작의 사용자-한정 파라미터의 부분일 수 있다. 자연적으로, 이로 인해 장치의 하드웨어에 있는 프린터용 인터페이스 출력 연결부 (예를 들어 USB 포트)에 더해진 소프트웨어에 있는 프린터 부품 (하드웨어 및 드라이버) 또는 프린터 드라이버의 통합이 요구될 것이다.

특정 실시양태에서, 상기 시스템은 완전히 자동화된 시스템이다. 예를 들어, 사용자는 초기에 프로세싱할 조직의 양을 선택하고, 시스템을 환자에게 부착시킬 수 있으며, 시스템은 사용자의 추가 입력 없이 끊기지 않고 연속적으로 필요한 조직을 빨아들이고, 재생성 세포를 분리 및 농축시킬 수 있다. 사용자는 또한 필요한 재생성 세포의 양을 입력하고, 시스템이 필요량의 조직을 빨아들여 조직을 프로세싱하도록 할 수 있다. 완전히 자동화된 시스템은 또한 사용자 입력 파라미터, 예컨대, 세척 횟수, 원심분리 속도 등의 수에 따라 (예컨대 2 이상) 재구성될 수 있는 시스템을 포함한다. 시스템은 또한 사용자 개입 없이 특정 단계를 통해 시스템이 진행되는 동안, 그러나 특정 프로세싱이 수행될 수 있기 전에, 사용자 개입이 요구되는 반자동 모드로 가동될 수도 있다. 다른 실시양태에서, 상기 시스템은 소정 시간에 소정의 조작을 수행하도록 사용자를 인도하는 지시를 나타내는 단일 통합 시스템이다. 예를 들어, 프로세싱 장치는 시스템의 튜브, 챔버 및 다른 부품의 적절한 삽입을 필요로 하는 단계를 통해 사용자를 촉진할 수 있다. 따라서, 사용자는 적절한 조작 순서가 수행되고 있는지 확인할 수 있다. 이러한 시스템은 공정에서 단계의 부주의한 활성화 및 종결을 방지하기 위해, 사용자가 각 조작 단계를 추가로 확인할 것을 요구할 수 있다. 추가 실시양태에서, 상기 시스템은 자동화 시험을 개시하여 튜브, 챔버의 올바른 삽입, 차단 상태의 부재 등을 확인할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 시스템은 다중 분리 및 농축 프로세싱을 시스템을 통한 조직 흐름의 자동화 제어를 통하여 수행하기 위해 프로그램될 수 있다. 이러한 특징은, 예를 들어, 환자 수술 동안 달리 떨어져 나오는 조직을 상기 시스템 내로 수집하고 조직으로부터의 재생성 세포를 분리하고 농축하여 환자에게 복귀시키는 데 중요할 수 있다.

상기 설명과 같이, 상기 시스템의 부품은 일회용 ("일회용 세트(들)"로 본원에서 지칭됨)일 수 있어서, 이러한 시스템의 부분은 단일 사용후에 처분될 수 있다. 이러한 구현은 환자의 조직과 접촉하게 되는 임의의 표면이 사용된 후에 확실하게 적절히 처분되도록 도울 것이다. 일회용 세트의 예는 도 13에 예시되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 시스템의 일회용 부품은 미리 멸균되고 패키징되어, 사용하기 쉽고 적재하기 쉬우며 다수의 튜브 연결의 필요성 및 튜브 연결의 복잡한 경로를 제거하는 사용가능한 "상용품(off the shelf)"이 된다. 이러한 일회용 부품은 상대적으로 저렴하게 제조되고, 따라서 이들의 폐기로 인한 실질적인 비용을 발생시키지 않는다. 한 실시양태에서, 일회용 시스템 (본원에서 "일회용 세트(들)"과 호환적으로 나타냄)은 수집 챔버 (20), 프로세싱 챔버 (30), 폐기물 챔버 (40), 배출 챔버 (50), 필터 조립체 (36), 샘플 백 (60) 및 연관된 도관 (12) 또는 튜브를 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어져 있다. 시스템의 일회용 세트의 바람직한 실시양태에서, 수집 챔버 (20) 및 프로세싱 챔버 (30)은 강성 프레임에 하우징되어 있는 도관 (12)에 의해 연결된다. 프로세싱 챔버 (30)의 회전 밀폐 네트워크 (도 7 및 8)는 또한 동일한 강성 프레임에 하우징될 수 있다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 일회용 세트의 다양한 챔버 및 용기는 시스템을 자동화하는 펌프, 밸브, 센서 및 다른 장치가 사용자 개입 없이 필요에 따라 적절하게 활성화되거나 탈활성화되도록 시스템의 프로세싱 장치와 소통될 수 있는 필수적인 인터페이스로 구성된다. 상기 인터페이스는 또한 시스템을 셋업하는 데 요구되는 시간 및 전문 지식을 감소시키고, 또한 시스템을 어떻게 적절하게 셋업할 것인지 나타내고 잘못된 셋업의 경우에 사용자를 주의시킴으로써 실수를 줄일 수 있다.

본 발명의 대부분의 일회용 세트는 다수의 통상적인 요소를 가질 것이다. 그러나, 당업계의 숙련자라면 시스템의 상이한 적용에 의해 일회용 세트의 일부일 수 있는 추가적인 부품이 시스템에 필요할 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 일회용 세트는 환자로부터 지방 또는 다른 조직을 수득하고 재생성 세포를 환자에게 되돌리는데 적합한 하나 이상의 바늘 또는 주사기를 추가로 포함할 수 있다. 포함되는 바늘 및 주사기의 종류, 개수 및 다양성은 프로세싱할 조직의 종류 및 양에 따라 달라질 것이다. 일회용 세트는 시스템에서 사용되는 세척용 액체 및 다른 프로세싱 시약을 담기 위한 하나 이상의 강성 또는 가요성 용기를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일회용 세트는 절차에 필요한 염수, 효소 및 임의의 다른 처리용 또는 대체용 액체를 담는 용기를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 시스템 및 방법과 결합하여 사용하기에 적합한 세척 용액, 재현탁액, 첨가제, 작용제 또는 이식 물질을 일회용 세트에 제공할 수 있다.

본원에 기재되었거나 또는 본 발명의 실시에 필요한 시스템 부품, 설비 또는 공급물의 임의의 조합은 키트의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 예를 들어 주사기에 의한 지방제거에 필요한 최적의 길이 및 게이지의 바늘, 및 적은 부피의 조직의 프로세싱을 허용하는 바람직한 여과 매질을 함유하는 멸균 주사기를 포함할 수 있다. 본 발명과 함께 사용할 수 있고 본 발명의 키트에 포함될 수도 있는 다른 예시적인 설비 및 공급물을 표 2 및 3에 나열하였다.

하기 표 2는 본 발명의 시스템 및 방법에 따라 지방 유래 재생성 세포를 수득하는데 사용될 수 있는 공급물의 예를 나타낸다.

설명	판매 회사	양	주
10 ml 주사기	벡톤-디킨슨(Beckton-Dickinson)	필요한 만큼	선택적, 지방흡입에 사용됨
14GA 끝이 무딘 바늘		필요한 만큼	선택적, 지방흡입에 사용됨
단일 혈액 팩 (600 ml)	백스터 펜월(Baxter Fenwal)	1	주 세포 프로세싱 백; 백에는 온라인 스파이크 아답터 및 2개의 자유 스파이크 포트가 있음
커플러(coupler)가 있는 전달 팩 (150 ml)	백스터 펜월	1	쿠아드(Quad) 백 세트
커플러가 있는 전달 팩 (1 L)	백스터 펜월	1	폐기물 백
샘플 부위 커플러	백스터 펜월	2
0.9％ 염수 (주사용)	백스터 펜월	1
14GA 날카로운 바늘	모노젝트(Monoject)	필요한 만큼	지방흡입 조직을 백에 첨가하기 위한 것
20GA 날카로운 바늘	모노젝트	3	콜라게나제 첨가 및 PLA 세포 제거용
0.2 ㎛ 스터플립(Sterflip) 필터	밀리포어(Milipore)	1	콜라게나제 여과용
테루플렉스(Teruflex) 알루미늄 밀봉 클립	테루모(Terumo)	4	임시적 관 밀봉을 위한 ME*ACS121
포비돈 요오드 프렙(prep) 패드	트리아딘(Triadine)	필요한 만큼	10-3201
리베라제(Liberase) H1 콜라게나제	로쉐(Roche)		주 1의 절차 참조
TSCD 웨이퍼	테루모	2	TSCD 멸균 관 용접기와 함께 사용하기 위한 1SC*W017

하기 표 3은 본원에 개시된 시스템 및 방법에 사용될 수 있는 설비를 나타낸다.

설명	판매 회사	양	주
소르발 레전드 티 이지 세트(Sorvall Legend T Easy Set) 원심분리기	피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)	1	75-004-367
로터	켄드로(Kendro)/소르발(Sorvall)	1	TTH-750 로터
로터 버킷	켄드로/소르발	4	75006441 둥근 버킷
150 ml백용 아답터	켄드로/소르발	4	00511
플라즈마 익스프레서(Plasma Expressor)	백스터 펜월	1	4R4414
관 밀봉기	세브라(Sebra)	1	모델 1060
TSCD 멸균 관 용접기	테루모	1	3ME*SC201 AD
랩라인(LabLind) 열 진동기	랩라인	1	4367
"일회용" 플라스틱 헤모스타트형	다브론(Devron)	3
밸런스 백 세트		2	원심분리기의 균형을 잡기 위한 물이 충전된 백
바이오해저드 샤프스 챔버(Biohazard Sharps Chamber)		1
바이오해저드 웨이스트 챔버(Biohazard Waste Chamber)		1

시스템의 재사용 성분은 수집 챔버용 교반 장치, 펌프, 및 밸브 및 펌프 제어를 활성화시키는 구분된 센서, 원심분리 모터, 원심분리 모터의 회전틀, 사용자 인터페이스 스크린 및 USB 포트, 및 일회용 세트가 재사용 하드웨어 성분 및 다른 관련 장치에 확실하게 부착되고 그와 접속하도록 일회용 세트를 연결하기 위한 연동 또는 도킹 장치 또는 형상을 포함하거나, 본질적으로 상기로 이루어져 있거나, 이로 이루어진다. 예시적인 재사용 성분은 도 14에 예시되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 재사용 성분은 재생성 세포 조성물로부터 재생성 세포를 분리하고 농축하기 위한 수단, 예를 들면 회전 원심분리기를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 재사용 성분은 도 15a에 나타나져 있는 바와 같이 일회용 세트의 프로세싱 챔버(원심분리 챔버 포함)의 일부분에 연결되고 그와 접속되도록 고안된다. 재사용 성분에서 재생성 세포를 분리하고 농축하기 위한 수단은 회전 원심분리기에 국한되지 않으며, 또한 본원에 기재된, 스피닝 막 필터를 비롯한 임의의 다른 형상을 포함할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 재사용 성분은 또한 여러 상이한 조직 프로세싱 절차를 수행하여 그에 따라 시스템의 여러 펌프 및 밸브를 선택적으로 활성화하기 위한 미리 프로그램된 소프트웨어를 함유하는 본원에 기재된 프로세싱 장치를 수용할 수 있다. 프로세서는 또한 후에 다운로드하거나 또는 편집하기 위해 공여자/환자 정보, 프로세싱 또는 수집 정보 및 기타 정보를 저장하기 위한 데이터 저장 역량을 포함할 수 있다. 재사용 성분은 다양한 일회용 세트와 함께 사용될 수 있다. 일회용 세트는 예를 들면 연동 장치 또는 형상을 통해 재사용 성분에 연결되며, 연동 장치 또는 형상은 재사용 성분 상에 존재하는 프로세싱 장치가 일회용 세트의 여러 성분 뿐만 아니라 재사용 성분 및 다른 관련 장치 및 시스템의 여러 성분을 제어할 수 있는 방식으로, 즉 재사용 성분 상에 존재하는 프로세싱 장치가 일회용 세트의 여러 성분 뿐만 아니라 재사용 성분 및 다른 관련 장치 및 시스템의 여러 성분으로 신호를 보내고 그로부터 신호를 받는 방식으로 일회용 세트가 재사용 하드웨어 성분에 확실하게 부착되고 접속하도록 일회용 세트를 연결한다.

한 실시양태에서, 시스템에 사용하는 1회용 세트는 조직 약 800 mL를 수용할 수 있는 수집 챔버 (20); 수집 챔버 (20)에서 세척하고 분해된 조직 약 800 mL에 의해 생성된 재생성 세포 조성물을 프로세싱할 수 있는 프로세싱 챔버 (30); 재생성 세포 0.5 mL 이상을 수용할 수 있는 배출 챔버 (50); 및 폐기물 약 10 L를 수용할 수 있는 폐기물 용기 (40)로 구성되어 있다. 이러한 실시양태에서, 하드웨어 장치는 24"L X 18"W X 36"H보다 크지 않다. 1회용 세트 뿐만 아니라 하드웨어 장치의 각종 성분의 별도 치수는 필요시 구축할 수 있고, 제한되지 않으면서 본 발명에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

시스템의 1회용 성분을 장치에 배치시키는 것은 용이하다. 상응하는 재사용 성분과 함께 조립에 사용된 1회용 세트의 예시는 도 15a에 예시되어 있다. 이러한 시스템은 바람직하게는 부당하게 적재된 1회용 성분을 검출할 수 있도록 고안된다. 예를 들어, 각 1회용 세트의 성분은 색상-표시 마크를 가져서 튜브, 챔버 등을 시스템 내 적절한 위치에 적당히 정렬시키고 삽입할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 본원에 개시된 시스템은 휴대용 장치이다. 예를 들어, 휴대용 장치는 지방조직 수거가 일어나는 한 위치에서 지방조직이 수거되는 또다른 위치로 옮길 수 있다. 특정 수행에서, 휴대용 장치는 환자의 침대 곁에서 지방조직을 수거하고 프로세싱하기에 적합하다. 이와 같이, 휴대용 장치는 환자에서 환자에게로 이동시킬 수 있는 시스템 일부일 수 있다. 따라서, 휴대용 장치는 위치에 고정시키는 바퀴를 가질 수 있어서 쉽게 위치시키고, 수술을 통해 안정하고 안전한 위치에서 편리한 위치선정에 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 휴대용 장치는 테이블 상단과 같은 평면에 설치되어 작동하도록 고안된다. 휴대용 장치는 또한 하우징 단위로 동봉될 수 있다. 휴대용 장치는 행거, 후크, 라벨, 저울 및 수술을 보조하는 기타 장치로 추가로 구성될 수 있다. 원심분리, 프로세싱 장치, 디스플레이 스크린과 같은 본원에 기재된 시스템의 모든 재사용 성분은 시스템의 휴대용 장치에 설치될 수 있다.

재생성 세포를 수득하기 위한 별도의 수동 실시양태는 또한 본 발명의 범위 내에 존재한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 지방조직은 본원에 기재한 시스템의 성분, 설비 및/또는 비품의 임의의 조합을 이용하여 프로세싱할 수 있다.

본 발명의 시스템의 수동적 실시양태는 예를 위해 제공된 것이며 제한을 위해 제공된 것이 아닌 하기 단계 및 정보에 따라 실시될 수 있다. 먼저, 지방조직을 환자로부터 수집한다. 조직 회수 라인 또는 샘플링 부위 커플러를 개방하고 스파이크(spike)를 600 ml 혈액 백의 측면구내로 삽입한다. 대략 10 ml의 지방조직을 무딘 캐뉼라를 통해 10 ml 주사기에 수집한다. 무딘 캐뉼라를 비교적 날카로운 바늘(14G)로 대체한다. 샘플링 부위를 요오드 수건으로 닦는다. 지방조직을 샘플링 부위를 통해 600 ml 백에 주입한다. 이어서, 주사기와 바늘을 샤프스 챔버에 폐기한다. 이러한 단계를 반복하여 충분한 조직을 백에 모은다. 충분한 조직을 환자 및 적용의 임상적 특이점을 근거한 각 사례에 대해 결정한다.

이어서, 흡인된 지방조직을 세척한다. 미리 가온된(37℃) 염수 백을 작업 표면 위에 건다. 청색 지혈기 클램프를 600 ml 백과 스파이크 사이의 관 위에 위치시킨다. 클램프를 닫아 관을 밀봉한다. 600 ml 백 상의 스파이크를 사용하여 염수 백에 넣었다 (이러한 세팅에서, 바늘을 삽입하기 전에 요오드로 고무 마개를 닦고, 600 ml 백 상에 바늘을 사용하여 고무 마개를 통해 염수 백에 넣는다). 청색 클램프를 풀어 대략 150 ml의 염수가 600 ml 백에 들어가도록 한다. 원하는 부피의 염수가 600 ml 백에 들어갔을 때 청색 클램프를 닫는다. 600 ml 백을 대략 15초 동안 10회 내지 15회 뒤집는다. 제2 청색 클램프를 3L 폐기물 백으로부터 스파이크로 인도하는 관에 적용한다. 3L 백 상의 스파이크를 사용하여 600 ml 백에 넣는다. 600 ml 백을 작업 표면 위에 뒤집어 걸어, 대략 1분 동안 그대로 둔다. 3L 백으로 인도하는 청색 클램프를 푼다. 폐기물 유체가 3L 백으로 흘러들어가게 한다. 조직이 관에 들어가기 전에 청색 클램프를 적용하여 흐름을 중단시킨다. 600 ml 백을 작업 표면으로 낮춘다. 이러한 단계를 2회를 초과하게 반복한다. 염수 폐기물이 여전히 두드러지게 붉게 보일 경우, 추가적인 제3 사이클이 지적된다. 열 밀봉기를 사용하여 3L 폐기물 백과 600 ml 백 사이의 관을 밀봉한다. 밀봉은 대략 관의 중간 지점에서 수행한다. 3L 폐기물 백을 제거하고 폐기한다. 600 ml 백을 작업 표면으로 되돌린다.

이어서, 세척한 지방조직을 분해한다. 염수 및 600 ml 백 사이의 관 상의 청색 클램프를 풀어 대략 150 ml의 염수가 600 ml 백에 들어가도록 한다. 600 ml 백 상의 샘플링 부위를 요오드 수건으로 닦는다. 콜라게나제를 샘플링 부위를 통해 600 ml 백에 주입한다. 콜라게나제는, 마이크로웨이빙 이외에, 37℃ 수조 또는 균등물 중에서 콜라게나제 바이얼 하나를 해동하여 제조한다. 22G 바늘이 있는 1 ml 주사기를 바이얼에 삽입한다. 콜라게나제를 바늘 안으로 빼낸다. 바늘을 제거하고 이를 0.2 ㎛ 필터 및 제2 22G 바늘로 대체한다. 이어서, 콜라게나제를 0.2 ㎛ 필터 및 바늘을 통해 주사기로부터 방출시킨다. 지방조직의 분해를 0.1 내지 0.2 분쉬(Wuensch) 단위/ml의 최종 콜라게나제 농도로 수행한다. 가열 패드를 로커(rocker) 상에 놓는다. 이러는 동안, 여전히 부착되어 있는 염수 백을 로커의 측면에 설치한다. 염수 백으로 인도하는 관이 로커(움직일 때) 상에 걸리지 않도록 상기 관이 위치하도록 주의를 기울인다. 가열 패드 제어기는 37℃로 설정한다. 600 ml 백을 로커 상에 놓는다. 로커를 최대치로 설정한다. 백이 안정하고, 대략 1시간(55±10분) 동안 흔들리도록 백을 관찰한다.

이어서, 재생성 세포 조성물을 회수한다. 백을 로커로부터 제거한다. 청색 클램프를 이전에는 폐기물 백으로 인도하는 폐쇄된 관에 적용한다. 멸균 연결 장치를 사용하여, 이전에는 폐기물 백에 부착된 관에 쿼드 백 세트(하기 지시 사항에 따라 미리 제조됨)를 부착한다. 쿼드 팩은 2개의 연결된 쿼드 팩으로 보일 수 있다. 2개의 팩으로 분할하는 관을 동정하고, 관을 자체 뒤로 접고, 접힌 관 위로(관의 두 조각 위로) 금속 루프를 놓는다. 루프를 대략 0.5 인치 아래로 미끄러지게 한다. 굴곡에서 형성된 주름은 관을 밀봉하는 역할을 한다. 지혈기를 사용하여 루프에 부분적으로 주름을 형성하여 폐쇄시킨다. 루프가 프로세싱 동안 제거될 필요가 있기 때문에 루프를 너무 단단하게 주름지게 하지 않는다. 600 ml 백을 작업 표면 위에 뒤집어 걸어 대략 3분 동안 그대로 방치한다. 쿼드 세트로 인도하는 관 상의 청색 클램프를 풀어 세포 분획(황색/주황색 지방층 아래 층)을 쿼드 세트로 배출한다. 지방층이 관으로 유입되지 않도록 주의한다. 이러한 공정 동안, 지방층이 관에 인접하였을 때 관을 수동으로 주름지게 하여 흐름을 느리게 할 수 있다. 이어서, 쿼드 백 세트로 인도하는 관을 청색 클램프로 밀봉하고, 600 ml 백을 작업 표면으로 되돌리고, 염수 백을 건다. 염수 및 600 ml 백 사이의 관 상의 청색 클램프를 풀어 대략 150 ml의 염수가 600 ml 백에 들어가도록 한다. 600 ml 백을 대략 15초 동안 대략 10회 내지 15회 뒤집는다. 이어서, 600 ml 백을 작업 표면 위에서 뒤집어 걸고 약 3 내지 5분 동안 그대로 방치한다. 쿼드 세트로 인도하는 관 상의 청색 클램프를 풀어, 세포 분획(황색/주황색 지방층 아래 층)을 쿼드 세트로 배출한다. 지방층이 관에 유입되지 않도록 주의한다. 예를 들면, 지방층이 관에 근접하였을 때 관을 수동으로 주름지게 함으로써 흐름을 느리게 할 수 있다. 쿼드 백 세트로 인도하는 관을 청색 클램프로 폐쇄시킨다. 이어서, 쿼드 세트로부터 600 ml 백으로 인도하는 관을 열로 밀봉한다. 이어서, 600 ml 백을 제거하고 폐기한다.

이어서, 재생성 세포 조성물을 세척한다. 금속 클립을 2개의 충전된 백 사이의 관 상에 위치시켜 관을 밀봉한다. 쿼드 세트를 천칭 상에 놓는다. 물을 제2 "모조" 쿼드 세트에 가하여 쿼드 세트의 균형을 잡는다. 쿼드 세트 및 균형 잡힌 세트를 원심분리기의 맞은편의 버킷 상에 놓는다. 중공 필터의 경우, 세포를 세척하고 백에 위치시키고, 관을 백과 상기한 중공사 필터 조립체 사이에서 밀봉한다. 연동 펌프를 사용하여, 유체를 필터 조립체를 통해 흐르게 하고, 세포 농축물을 하류 말단에서 백에 수집한다. 쿼드 세트 백이 압축되지 않고 직립이 되도록 주의한다. 원심분리기를 10분 동안 400 × g에서 가동한다. 쿼드 세트를 원심분리기로부터 제거하고 플라즈마 익스프레서에 위치시킨다. 백의 상부의 경질 관이 단지 뒤판의 상부에 있는 방식으로 백이 익스프레서에 위치되도록 주의한다. 백이 너무 높을 경우 너무 많은 염수가 보유될 것이고, 백이 너무 낮을 경우 관이 앞판의 폐쇄 능력을 방해하여 또한 너무 많은 염수가 보유될 것이다. 충전된 쿼드 세트로부터 빈 쿼드 세트로 인도하는 각 라인에 청색 클램프를 적용한다. 금속 루프 및 청색 클램프를 제거하여 상청액이 빈 쿼드 세트 내로 흐르도록 한다. 가능한 한 많은 염수를 급송하나, 세포 펠릿이 제거되지 않도록 주의한다. 상청액을 함유하는 각 백 내로 지나가는 관을 열로 밀봉한다. 상청액을 함유하는 폐기물 백을 제거한다. 세포를 함유하는 각 쿼드 세트 백으로 인도하는 관에 청색 클램프를 적용한다. 백을 플라즈마 익스프레서에서 제거한다. 멸균 연결 장치를 사용하여 쿼드 팩으로 인도하는 관을 염수 백에 연결한다. 쿼드 세트 백 중 하나로 인도하는 청색 클램프를 제거하여 대략 150 ml의 염수가 백 내로 흘러 들어가도록 한 후, 클램프를 재적용하여 염수의 흐름을 중단시킨다. 이어서, 충전된 쿼드 세트 백을 대략 15초 동안 대략 10회 내지 15회 뒤집는다. 이어서, 빈 쿼드 세트 백으로 인도하는 청색 클램프를 제거하고, 충전된 백의 내용물 모두를 빈 백으로 배출시킨다. 금속 루프 클램프를 재적용하여 2개의 쿼드 세트 백 사이의 관을 밀봉한다. 이어서, 관을 열로 밀봉하고 염수 백을 제거한다. 이어서, 충전된 쿼드 세트 백을 대략 15초 동안 대략 10회 내지 15회 뒤집는다. 또다른 모조 쿼드 세트를 천칭 상에 위치시키고, 세포 쿼드 세트로 다시 균형을 맞춘다. 쿼드 세트 백(충전된 것, 빈 것)이 압축되지 않고 직립되도록 쿼드 세트 백을 이어서 원심분리기 내에 위치시킨다.

원심분리기를 10분 동안 약 400 × g에서 가동한다. 이어서, 쿼드 세트를 원심분리기로부터 제거하고, 백의 상부의 경질 관이 단지 뒷판의 상부에 있도록 쿼드 세트를 플라즈마 익스프레서에 주의하여 놓는다. 백이 너무 높을 경우 너무 많은 염수가 보유될 것이고, 백이 너무 낮을 경우 관이 앞판의 폐쇄 능력을 방해하여 또한 너무 많은 염수가 보유될 것이다. 금속 루프를 제거하여, 재생성 세포 펠릿이 제거되지 않도록 주의하면서 모든 상청액을 충전된 백으로부터 빈 백으로 급송시킨다. 백 사이의 관을 밀봉하고, 충전된 (폐기물) 백을 제거하고 폐기한다. 새로운 샘플링 부위 커플러를 이어서 나머지 백에 삽입한다. 이어서, 세포 펠릿의 세포를 나머지 염수(있을 경우)에 재현탁시켜 재생성 세포의 농축물을 수득한다. 재현탁은 백의 온화한 조작(예를 들면, 스퀴징 및 러빙)으로 수행할 수 있다.

본 발명을 구현하는 시스템의 특정 예가 도 4에 나타나져 있다. 도 4는 환자 내로의 재주입에 적합한, 조직, 예를 들면 지방조직으로부터 재생성 세포를 분리하고 농축하는 자동화 시스템 및 방법을 예시한다. 도 4에 나타낸 시스템의 몇몇 실시양태에서, 시스템은 환자로부터 소정 양의 조직을 흡인하는 자동화 단계를 추가로 포함한다. 도 4에 나타낸 시스템은 도 15a에 나타낸 시스템의 자동화 실시양태에 도달하도록 도 14에 나타낸 시스템의 재사용 성분에 연결된 도 13에 나타낸 1회용 세트로 이루어져 있다. 재사용 성분 상에 존재하는 프로세싱 장치가 1회용 세트의 여러 성분 뿐만 아니라 재사용 성분 및 다른 관련 장치 및 시스템의 여러 성분을 제어하고 그와 접속할 수 있는 방식으로, 즉 재사용 성분 상에 존재하는 프로세싱 장치가 1회용 세트의 여러 성분 뿐만 아니라 재사용 성분 및 다른 관련 장치 및 시스템의 여러 성분으로 신호를 보내고 그로부터 신호를 받는 방식으로 1회용 세트가 재사용 하드웨어 성분에 확실히 부착되고 관련되도록 1회용 세트를 재사용 성분에 연결하는, 예를 들면 연동 또는 도킹 장치 또는 형상을 통해 1회용 세트는 재사용 성분에 연결된다.

사용자는 1회용 세트를 재사용 성분에 연결할 수 있고, 사용자 인터페이스를 이용하는 입력 특정 매개변수, 예를 들면 수집되는 조직의 부피는 시스템을 환자에게 부착시키고, 시스템은 미리 프로그램되고(되거나) 사용자 입력 매개변수를 사용하여 중단되지 않은 순서로 도 4에 나타낸 단계 모두를 자동으로 수행한다. 이러한 한 순서가 도 15b에 예시되어 있다. 대안으로, 조직은 수동으로 사용자에 의해 환자로부터 흡인되고, 프로세싱을 위해, 즉 재생성 세포의 분리 및 농축을 위해 시스템으로 이송될 수 있다.

구체적으로, 도 4에 나타낸 바와 같이, 조직, 예를 들면 지방조직은 도관 (12)를 사용하여 환자로부터 회수되어 수집 챔버 (20)으로 도입될 수 있다. 도 4의 수집 챔버의 상세한 예시가 도 5에 나타나져 있다. 도 5에 예시되어 있는 바와 같이, 수집 챔버 (20)은 표준 캐뉼라를 사용하여 용이하게 조직을 제거할 수 있게 하는 진공관 (11)로 이루어져 있을 수 있다. 사용자는 이때 수집 챔버 (20)으로 향하는 조직의 산정 부피를 입력할 수 있다. 조직은 조직, 염수 및 다른 작용제가 흡인 방식으로 조직에 첨가되게 하는 폐쇄된 유체 통로의 부분인 유입구 (21)을 통해 수집 챔버 (20)으로 도입된다. 시스템의 광학 센서, 예를 들면 센서 (29)는 조직의 사용자 입력 부피가 수집 챔버 (20)에 존재할 때를 감지할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 사용자 입력보다 수집 챔버내에 조직이 덜 존재할 경우, 사용자는 수집 챔버 (20)에 존재하는 조직의 부피를 프로세싱하기 시작할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 환자로부터 제거된 조직의 일부분은 사용자 인터페이스를 이용하는 사용자 입력을 통해 활성화될 수 있는, 도관을 통한, 펌프, 예를 들면 연동 펌프를 사용함으로써 샘플 챔버 (60)으로 향할 수 있다.

센서 (29)는 재사용 성분에 존재하는 프로세싱 장치에 신호를 보내, 조직을 세척하고 해리하기 위해 필요한 단계를 활성화시킬 수 있다. 예를 들면, 프로세싱 장치는 자동화 밸브 및 펌프를 사용하여 수집한 조직의 부피를 근거하여 미리 설정된 부피의 세척제를 도입할 수 있다. 이러한 사이클은 광학 센서가 유출액이 충분히 청결하고 유출액에 원하지 않는 물질이 없다고 결정할 때까지 수집 챔버에서 반복될 수 있다. 예를 들면, 수집 챔버 외부로 인도하는 도관 (12b 또는 12d)을 따라 광학 센서 (29)는 원하지 않는 물질이 제거된 것을 감지할 수 있고 프로세싱 장치에 신호를 보내 필요 밸브를 폐쇄하고 다음 단계를 개시할 수 있다.

이어서, 프로세싱 장치는 수집된 조직의 부피를 근거하여 미리 프로그램된 양의 해리제를 도입할 수 있다. 프로세싱 장치는 또한 수집된 조직의 초기 양을 근거하여, 또는 사용자 입력을 근거하여 미리 설정한 기간 동안 수집 챔버에서의 조직 교반을 활성화시킬 수 있다. 도 4에 나타낸 실시양태에서, 해리제, 예를 들면 콜라게나제가 콜라게나제 공급원 (24)을 통해 수집 챔버 (20)에 일단 첨가되면, 수집 챔버 (20) 중의 모터는 프로세싱 장치를 통해 활성화된다. 모터는 자석 교반기 및 패들형 장치로 이루어진 회전 굴대 (25)를 활성화시키며, 여기서 하나 이상의 패들 (25a)는 수집 챔버 (28)에 미리 고정된 필터의 필터 우리 (27)에 단단히 부착된다. 패들은 재생성 세포가 조직으로부터 분리되도록 해리제의 존재하에 교반한다.

수집 챔버 (20) 중의 용액은 미리 설정한 기간 동안 침강되게 한다. 용액의 부양 부분이 용액의 상부로 올라오게 한다. 미리 설정된 기간이 일단 경과되면, 필요한 밸브 및 펌프는 프로세싱 장치에 의해 활성화되어, 부양되지 않은 부분은 폐기물 챔버 (40)으로 제거된다. 폐기물 챔버 (40)으로의 이송은 수집 챔버 외부로 인도하는 도관 (12b 또는 12d)을 따라 센서 (29)가 용액의 부양 부획이 폐기물 챔버 (30)으로 막 이송되려 함을 감지할 수 있을 때까지 수행된다. 예를 들면, 수집 챔버 외부로 인도하는 도관 (12b 또는 12d)을 따라 센서 (29)는 원하지 않는 물질이 제거되었음을 감지할 수 있고 프로세싱 장치에 신호를 보내 필요 밸브를 폐쇄할 수 있다.

이때, 용액의 부양되지 않은 분획, 즉 재생성 세포 조성물은 프로세싱 챔버 (30)으로 이동한다. 이는 필요한 밸브 및 연동 펌프를 사용함으로써 달성된다. 몇몇 실시양태에서, 재생성 세포 조성물을 프로세싱 챔버 (30)으로 이송하기 전, 추가 부피의 염수를 수집 챔버 (20)에 남아 있는 용액의 부양 분획에 첨가할 수 있다. 또다른 세척 사이클을 반복할 수 있다. 이러한 사이클 후, 용액이 침강되게 하고, 부양되지 않은 분획(재생성 세포 함유)을 프로세싱 챔버 (30)으로 이송하고, 부양 분획을 폐기물 챔버 (40)으로 배출한다. 추가적인 세척 사이클을 사용하여 프로세싱 챔버 (30)으로의 모든 분리된 재생 세포의 이송을 최적화한다.

재생성 세포 조성물이 도관 (12)를 경유하여 프로세싱 챔버 (30)으로 일단 이송되면, 농축 단계를 시작하기 전에 조성물에 대해 한번 이상의 추가적인 세척 단계를 수행한다. 이는 수집 챔버 (20)으로부터 폐기물 및 잔여 오염물을 확실히 제거한다. 유사하게, 농축 단계에 이어서, 재생성 세포 조성물에 대해 한번 이상의 추가적인 세척 단계를 수행하여 잔여 오염물을 제거할 수 있다. 원하지 않는 물질을 동일한 방식으로, 즉 상기한 바와 같이 프로세싱 장치로부터의 신호를 통한 밸브 및 펌프의 제어로 프로세싱 챔버 (30)으로부터 폐기물 챔버 (40)으로 제거할 수 있다.

도 4에 나타낸 프로세싱 챔버(30)의 다양한 실시양태이 이하에서 자세히 기술된다. 도 4에 나타낸 프로세싱 챔버(30)는 원심분리 챔버 형태이다. 도 4의 프로세싱 챔버의 상세한 도해가 도 7 및 8에 나타나 있다. 이러한 프로세싱 챔버(30)는 일반적으로, 외측 하우징(30.2), 하나 이상의 시일(30.3), 하나 이상의 베어링(30.4), 및 프로세싱 챔버를 시스템의 재사용가능한 부품에 존재하는 원심분리 장치에 연결하는 결합부(30.6)를 포함하는 회전 시일 네트워크(30.1); 회전 시일 밖으로부터 연장되어 각 말단 상의 원심분리 챔버에서 끝나는 도관 형태의 하나 이상의 유체 통로(30.5) (상기 각 말단은 하나 이상의 포트(52), 및 배출 챔버(50)를 수동으로 재배치하기 위한 하나 이상의 핸들로 구성된 프레임(53)에 수용된 배출 챔버(50) 형태임)로 구성된다.

회전 시일 네트워크(30.1)는, 프로세싱 챔버의 유체 통로가 멸균 상태로 유지되는 것을 보장하기 위해 포함된다. 또한, 프로세싱 챔버의 유체 통로는 언제나, 심지어 프로세싱 챔버의 원심분리 챔버가 돌아가는 동안에도 멸균 방식으로 접근될 수 있다(예, 약품이나 세척 용액을 부가).

도 7 및 8에 나타나 있는 회전 시일 네트워크(30.1)는 2개 이상의 베어링(30.4), 3개 이상의 립 시일(30.3) 및 외측 하우징(30.2)으로 구성된 회전 샤프트를 포함한다. 이 실시양태에서, 베어링(30.4)은 본원에서 레이스로 지칭되는 외측 및 내측 샤프트(도시되지 않음)를 더 포함한다. 상기 레이스는 정밀 연삭 구에 의해 분리될 수 있다. 베어링을 포함하는 상기 레이스 및 구는 바람직하게는, 인체 유체와 접촉하기에 적합한 물질로 제조되거나, 인체 유체와 접촉하기에 적합한 물질로 코팅된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 레이스 및 구는 예를 들어 질화실리콘 또는 지르코니아를 사용하여 제조된다. 또한, 이 실시양태에서, 3개의 립 시일은 원형 "U" 모양 채널(도시되지 않음) 및 원형 스프링(도시되지 않음)으로 구성된다. 원형 "U" 모양 채널은 바람직하게는, 회전 시일 네트워크(30.1)의 회전 샤프트와의 누출 방지 접합이 형성되도록, 구부러질 수 있는 재료를 사용하여 제조된다. 또한, 상기 립 시일은 바람직하게는, 프로세싱 챔버를 통해 흐르는 재생성 세포 조성물로부터의 압력으로 인해 시일 조립체가 증가된 장력에 의해 회전 샤프트와 립 시일의 접합을 단단하게 하도록 하는 방식으로 배치된다. 상기 시일은, 회전 시일 네트워크(30.1)의 외측 하우징(30.2)의 홈을 맞물리게 하기 위해 필요에 따라 팽창하고/하거나 움츠러들 수 있는 하나 이상의 원형 클립(도시되지 않음)에 의해 제자리에 고정될 수 있다. 회전 시일 네트워크(30.1)에 의해 또는 그 근처에서 생성되는 열은, 통로를 통해 이동되는 용액 중에서의 세포 용해를 방지하도록 조절되어야 한다. 예를 들어, 이것은 회전 샤프트의 구축을 위해 경성인 물질을 선택하고, 시일과 접촉하게 되는 회전 샤프트 영역을 매끄럽게 하고, 회전 샤프트와 시일 사이의 접촉을 최소화함으로써 달성될 수 있다.

또다른 실시양태에서, 회전 시일 네트워크(30.1)는 단일 고무 시일(30.3) 및 에어 가스켓(도시되지 않음)으로 구성된다. 이 시일 및 가스켓은 시스템의 멸균성을 손상시킬 수 있는 생물학적 물질에 비틀린 통로를 제공한다. 또다른 실시양태에서, 회전 시일 네트워크(30.1)는 개별 유체 통로를 단리시키는 여러 스프링 부하된 시일(30.3)로 구성된다. 시일(30.3)은 윤활제 없이 회전 샤프트를 밀봉할 수 있을 뿐만 아니라 멸균될 수 있는 물질로 제조된다. 또다른 실시양태에서, 회전 시일 네트워크(30.1)는, 여러 유체 통로를 생성하고 시스템의 회전에 견딜 수 있으며 세포 용해를 일으키지 않는 한 쌍의 세라믹 디스크(도시되지 않음)로 구성된다. 또다른 실시양태에서, 상기 유체 통로는 구부러질 수 있고, 프로세싱 챔버와 관련하여 휘거나 휘지 않을 수 있다. 이는 프로세싱 챔버(30)의 매 2회 회전에 대해 구부러질 수 있는 유체 통로를 1회 회전하도록 함으로써 달성된다. 이것은 회전 시일을 전혀 필요로 하지 않는다.

재생성 세포 조성물은 회전 시일 네트워크(30.1)의 회전축을 통해 유체 통로를 따라 수집 챔버(20)로부터 펌핑된 다음, 각각이 프로세싱 챔버(30)의 중심축 바깥으로 뻗어나가 프로세싱 챔버(30)의 외측 말단 근처, 즉, 배출 챔버(50)를 수용하는 원심분리 챔버 내에서 끝나는 최소 2개의 유체 통로(30.5)로 나누어진다(도 7 및 8). 따라서, 바람직한 실시양태에서, 프로세싱 챔버(30)는 도 7 및 8에 나타나 있는 바와 같이 2개 이상의 배출 챔버(50)로 구성된다. 상기 배출 챔버(50)는, 프로세싱 동안 한 방향으로 존재하고(30.7) 농축된 재생성 세포의 회복 시에 또다른 방향으로 존재하도록(30.8) 배치된다. 예를 들면, 배출 챔버는 프로세싱 동안 한 각으로 기울어지고, 세포 회복 시에 또다른 각으로 기울어진다. 세포 회복 각은 프로세싱 각보다 더 수직이다. 배출 챔버(50)의 2가지 위치는, 프로세싱 챔버(30) 밖으로 돌출된 핸들(53)을 통해 수동으로 조작될 수 있다. 재생성 세포는, 배출 챔버(50)가 회복 방향으로 존재할 때, 주사기를 사용하여 배출 챔버(50)로부터 수동으로 회복될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 상기 유체 통로(30.5)는, 이것이 프로세싱 챔버의 외측에서 나누어진 다음 프로세싱 챔버(30)의 외측 말단, 즉, 배출 챔버(50)를 수용하는 원심분리 챔버(도시되지 않음) 내에 연결되도록 구축된다. 이 실시양태에서, 큰 부피의 재생성 세포 조성물 및/또는 첨가제, 용액 등은 원심분리 챔버 및/또는 배출 챔버로 직접 전송될 수 있다.

도 4 및 7 내지 9에 있어서, 펌프(34) 및 하나 이상의 밸브(14)가 수집 챔버(20)와 프로세싱 챔버(30) 사이에 제공될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 밸브(14)는 전기 기계 밸브이다. 또한, 압력 센서(29)와 같은 센서가 프로세싱 챔버(30) 및 수집 챔버(20)와 한 줄로 제공될 수 있다. 상기 밸브, 펌프 및 센서는 재사용가능한 부품 상에 존재하는 프로세싱 장치(도 14)와 협동하여 시스템의 농축 단계를 자동화한다.

센서는 원심분리 챔버에서 재생성 세포 조성물의 존재를 탐지하고, 시스템의 프로세싱 장치와의 통신을 통해 원심분리 장치를 활성화시킨다. 이어서, 상기 재생성 세포 조성물은 최초 수집된 조직의 양 및/또는 사용자 입력에 기초하여 미리 계획된 시간 동안 미리 계획된 부하를 받는다. 일정 실시양태에서, 이 단계는 자동적으로 또는 사용자 입력을 통해 반복될 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 약 5분 동안 중력의 약 400배의 부하를 받는다. 배출 챔버(50)는, 챔버의 최외측이 조밀한 입자 및 세포에 대한 작은 저장소를 형성하도록 구축된다. 배출 챔버(50)는 '세포 펠릿'이라고 하는 조밀한 입자를 보유하는 동시에, 더 가벼운 상청액이 유체 통로, 예를 들어, 회전 시일 네트워크(30.1)의 회전축을 따라 존재하며 회전 시일 네트워크(30.1)를 통해 프로세싱 챔버(30) 중심의 저점으로부터 폐 용기(40)로 이동하는 유체 통로를 통해 제거되도록 한다. 밸브(14) 및 펌프(34)는 프로세싱 장치에 신호를 보내, 배출 챔버(50)에 존재하는 세포 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 폐 용기(40)로 제거하는 단계를 활성화시킨다.

도 4에서 보여진 시스템을 이용하여 얻어진 세포 펠렛은 본 발명의 농축된 재생성 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상청액을 제거한 후, 폐기물 용기(40)으로 전해지고, 액체 경로(30.5)가 추가적인 용액 및/또는 다른 첨가제와 원심분리된 후 형성된 세포 펠렛을 재현탁하는 데 이용될 수 있다. 이 방법에서 세포 펠렛의 재현탁은 재생성 세포를 더욱 세척시켜, 원치않는 단백질 및 화학 성분을 제거할 뿐 아니라, 세포로의 산소 흐름을 증가시킨다. 얻은 현탁액은 약 5분간의 추가 기간 동안 중력의 약 400배의 추가 하중을 받을 수 있다. 제2 세포 펠렛이 형성된 후, 얻은 상청액을 폐기물 용기(40)으로 제거하고, 상기에 기술한 방법에 따른 최종 세척은 염수 또는 기타 적절한 완충 용액으로 실시할 수 있다. 이 반복된 세척은 재생성 세포 용액의 순도를 높이기 위해 다수회 실시될 수 있다. 특정 실시양태에서, 염수가 공정을 향상시키기 위해 필요하다고 생각되는 임의의 단계에서 추가될 수 있다. 도 4에서 보여진 시스템을 이용하여 얻어진 재생성 세포의 농도는 수집된 조직, 환자 나이, 환자 프로필 등에 따라 변할 수 있다. 예시적 수율을 표 1에 제공했다.

이어서, 배출 챔버 (50)을 세포 제거에 적절한 방향으로 위치시킨 후에, 배출 챔버 (50)에 존재하는 최종 펠렛을 적절한 주사기를 사용하여 무균적 방법으로 회수할 수 있다. 다른 실시양태에서, 최종 펠렛은 배출 챔버 (50) 내 용기에 자동적으로 이동될 수 있으며, 이 용기는 필요에 따라 없애거나 넣어두거나 사용할 수 있다. 이러한 용기는 임의의 적절한 형태 또는 크기일 수 있다. 예를 들어, 용기는 주사기일 수 있다. 특정 실시양태에서, 배출 용기(50) 자체가 가열 밀폐 (자동 또는 수동으로)되고, 뒤이은 회수 및 환자에게 재-주입하는 것을 포함하는 본원에서 기술한 치료 용도의 재생성 세포의 사용을 위해, 프로세싱 챔버의 다른 요소로부터 분리될 수 있다. 세포는 또한 배출 챔버로부터의 회수 전 또는 제2 시스템 또는 장치로 이송 후에, 본원에서 기술된 추가적 프로세싱을 겪을 수 있다. 도 14에서 재사용가능한 성분은 필요에 따라 추가적인 프로세싱을 위한 1 이상의 추가적 시스템 또는 장치에 연결될 수 있는 것으로 구성된다.

본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 시스템 및 방법을 사용하여 수득한 지방 유래 재생성 세포는 하기 실시예에 기재되는 바와 같이 그의 특성을 기초로 하여 혈관 질환 및 장애의 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 본원 발명의 한 측면에 있어, 지방조직-유래 세포는 공여자의 지방조직으로부터 추출되고, 본원에서 설명되는 하나 이상의 작용기전을 통해 손상 또는 퇴화된 심근 또는 다른 심혈관조직에 치료적인 이로움을 유도하는 데 사용된다. 바람직한 실시양태에 있어, 세포는 사람에게 이식된 뒤 그의 지방조직으로부터 추출되고, 이로 인해 이식물에 항원성 및/또는 면역성 반응을 수반하는 잠재적 합병증을 감소시킨다. 환자들은 일반적으로 심근 손상 및 질환을 평가하기 위해 내과의사 또는 다른 임상 제공자에 의해 수행되는, 환자의 건강 병력, 신체 검사 및 EKG, 혈청 심장 효소 프로파일 및 심초음파 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 객관적인 정보 중 하나 이상의 절차들에 의해 평가된다.

한 실시양태에 있어서, 심근 경색 치료와 연결된 혈액 응고 감소를 위해 설계된 임의의 제품을 환자가 받아들이기 이전에 채취 절차가 수행된다. 그러나, 어떤 실시양태에서는, 환자가 채취 절차 이전에 아스피린을 받아들였을 수도 있다. 또한, 바람직한 한 방법은 임의의 재혈관화 절차의 시도 이전에 지방조직을 수집하는 것을 포함한다. 그러나, 당업자가 이해하는 것처럼, 수집의 시점이 다양할 것으로 기대되고, 다른 것들과 더불어, 환자의 안정성, 환자의 응고 프로파일, 제공자의 유용성 및 품질 관리 표준을 포함하는 여러 가지 인자에 의존할 것이다. 결국, 수집의 시점은 영향을 받는 환자로의 투여 관리에 책임 있는 의사에 의해 결정될 것이다.

환자로부터 수집된 지방조직의 부피는 약 0 cc 내지 약 2000 cc로 다양할 수 있으며 몇몇 실시양태에서는 최대 약 3000 cc일 수 있다. 제거되는 지방의 부피는 환자에 따라 다양하며, 연령, 체형, 응고 프로파일, 혈류역동학적 안정성, 경색의 격렬 정도, 동반이환률 및 신체적 우선성을 포함하나 이에 한정되지 않는 몇 가지 인자에 의존할 것이다.

세포는 심근 기능이 절충되는 임의의 세팅으로 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 세팅의 예로는, 다른 것들과 더불어, 급성 심근경색(심장마비), 울혈성 심부전증(치료요법으로서 또는 이식물에의의 다리로서) 및, 관상 동맥 우회로 이식 수술의 보충물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 세포는 사전에 추출되어 저온보존 방식으로 저장되거나, 정해진 필요 시간이나 그 근처의 시간에 추출될 수도 있다. 본원에서 개시되듯이, 상기 세포는 더 이상의 가공 또는, 더 이상의 정제, 변형, 자극 또는 다른 세포 변화를 위한 추가적 절차 없이 환자에게 투여되거나, 손상된 조직 또는 손상된 조직의 부근에 직접 적용될 수 있다. 예를 들면, 환자로부터 수득된 세포는 환자 투여 전 세포배양 없이, 필요한 환자에게 투여될 수 있다. 한 실시양태에 있어, 지방조직의 수집은 환자의 침대 옆에서 수행될 것이다. 혈류역동학적 관찰이 환자의 임상 상태를 관찰하는 데 사용될 수도 있다.

본원에 개시된 발명에 의해, 환자로부터 지방조직을 채취한 직후에, 지방-유래 세포가 전달될 수 있다. 예를 들면, 상기 세포는 지방조직의 가공 직후에 투여되어 지방-유래 줄기 세포의 조성물을 획득할 수 있다. 한 실시양태에 있어, 바람직한 전달 시점은 심장 손상 후에 존재하는 신경호르몬적 환경을 이용할 수 있도록 경색 후 수 시간 내지 수일의 순서로 일어나야 한다. 결국, 전달 시점은 환자의 유용성 및 지방조직을 가공하는 데 필요한 가공 시간에 의존할 것이다. 다른 실시양태에 있어, 본원에서 논의되는 대로, 환자로 재주입되는 세포가 추가적인 변형, 정제, 자극 또는 다른 조작을 필요로 하는 경우, 전달 시점은 비교적 더 길 수도 있다. 또한, 지방-유래 세포는 경색 후 여러 차례로 투여될 수도 있다. 예를 들면, 상기 세포는 연장된 일정 시간에 걸쳐(예를 들면, 수 시간) 연속적으로 투여되거나, 연장된 일정 시간에 걸쳐 다중 환괴 (bolus) 주입으로 투여될 수도 있다. 어떤 실시양태에서는, 세포의 초기 투여가 경색 후 약 12시간 내, 예를 들어 약 6시간 내에 투여될 것이며, 하나 이상의 세포 투여량이 12시간 간격으로 투여될 것이다.

환자에게 투여되는 세포수는, 예를 들면, 지방조직 가공 후의 세포 수율과 관련될 수 있다. 세포 총 수의 일부는 이후의 사용 또는 저온보존을 위해 보관될 수 있다. 또한, 전달되는 투여량은 환자로의 세포의 전달 경로에 의존할 것이다. 심외막 및 심내막 전달 시스템이 사용되는 경우 더 적은 세포가 필요할 수도 있는데, 이는 이러한 시스템 및 방법이 심혈관 증상을 치료하는 데 가장 직접적인 경로를 제공할 수 있기 때문이다. 본 발명의 한 실시양태에 있어, 환자에게 전달되는 세포(예를 들면 미정제 세포) 수는 약 5.5 × 10⁴ 개인 것으로 예상된다. 그러나, 이 수치는 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 크기 순서로 조절될 수 있다.

상기 세포는 의도된 치료 효과를 강화, 조절 또는 다른 식으로 유도하는 첨가제와 함께 적용될 수도 있다. 예를 들면, 한 실시양태에 있어, 그리고 본원에서 기술되었듯이, 상기 세포는 세포 대상체수를 보강하기 위한 항체-매개 양성 및/또는 음성 세포 선택의 사용에 의해 더 정제되어 효능을 향상하고 이환률을 낮추며, 또는 절차의 용이성을 촉진할 수 있다. 비슷하게, 세포는 이식된 세포의 운명을 지지 및/또는 유도함으로써 생체 내 조직 처리를 촉진하는 생체 적합성 매트릭스과 함께 적용될 수 있다. 같은 방법으로, 세포는 유전자 조작에 이어 투여될 수 있는데, 이로써 세포들은 그 세포들에 의해 제공되는 치료적 신호를 촉진하는 것으로 여겨지거나 의도되는 유전자 생성물들을 발현하게 된다. 조작의 예로는 혈관형성 또는 혈관형성을 촉진하는 인자의 발현(예를 들면 VEGF), 특정 세포 계통으로의 분화를 촉진하는 발생 유전자의 발현(예를 들면 MyoD), 또는 세포 성장 및 증식을 자극(예를 들면 bFGF-1)하는 발현을 조절(증가 또는 감소)하는 조작을 포함한다.

상기 세포는 또한, 이식되기 이전에 스캐폴드 물질 위로의 세포 배양을 필요로 할 수도 있다. 그러므로, 수용자 내부로 삽입 또는 이식하기 전, ADC를 이용하여 조직이 처리되는 밸브, 심실 패치, 심막, 혈관 및 다른 구조들이 천연 또는 합성 매트릭스 또는 스캐폴드 위에서 합성될 수 있다(문헌 [Eschenhagen et al., 2002]; [Zimmermann et al., 2004]; [Zimmermann et al., 2002]; [Nerem and Ensley, 2004]).

한 실시양태에 있어, 의도적인, 이로움이 있는 위치로의 세포의 직접 투여가 바람직하다. 이것은 심장 외부 표면(심외막)으로의 직접 주사, 적당한 캐뉼라의 삽입에 의한, 내부 표면(심내막)을 통한 심근으로의 직접 주사, 동맥 또는 정맥 주입액(퇴행성 유동 기전을 포함), 또는 본원에 개시되거나 당업계에 공지된 다른 수단들에 의해 달성될 수 있다. 당업자에게 공지된 투여 경로는 정맥내, 심장내, 심내막심근, 심외막심근, 심실내, 후동 또는 정맥내를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

위에서 언급했듯이, 세포는 정맥 또는 동맥 주입에 의한 전신 투여(퇴행성 유동 주입을 포함) 또는 심장으로의 직접 주사를 포함하는 여러 경로를 통해 적용될 수 있다. 특히 말초 정맥 접근법에 의한, 전신 투여는 심장의 자연 관류 및, 손상된 목적 위치에 대한 지방조직-유래 세포의 능력에 의존하여 최소로 침투한다는 장점이 있다. 세포는 단일 환괴 형태로, 느린 주입을 통해, 또는 여러 시간으로 분리된 적용의 파상 시리즈를 통해 주사될 수 있으며, 또는 제공된 세포들은 여러 날 또는 여러 주 동안 적절히 보관되기도 한다. 세포는 또한 도관법을 사용하여 적용될 수도 있는데, 심장을 통한 세포의 제1 경로는 심근 혈류를 조절하기 위해 풍선을 사용하여 강화될 수 있다. 말초 정맥 접근법에 있어서, 세포는 단일 환괴 또는 여러 개의 더 작은 분취량으로 도관을 통해 주사될 수 있다. 세포는 또한 심외막 주사에 의해 심근으로 직접 적용될 수 있다. 이는 개심 절차(심장 동맥 우회로 이식 수술 등)와 관련, 직접적인 기관 노출 하에서, 또는 심실 보조 장치의 장착을 통해서 사용될 수 있다. 바늘과 함께 장착되는 도관이 사용되어, 덜 침투적인 직접 적용 수단을 가능하게 하는 심외막 방식으로 심근 내에 직접 세포를 전달할 수도 있다.

한 실시양태에서, 전달 경로는 표준 말초 정맥내 도관, 중앙 정맥 도관, 또는 폐동맥 도관을 통한 정맥내 전달을 포함할 것이다. 다른 실시양태에서, 세포는 현재 허용되는 방법을 통해 접근되는 심장내 경로를 통해 전달될 수도 있다. 세포의 유동은 환자의 혈관 구조 내에 위치하는 말단 및 인접 풍선의 순차적인 팽창/수축에 의해 조절될 수 있으며, 이 때문에 세포의 혼합 또는 세포 치료 작용을 촉진하는 일시적인 무유동 영역이 형성된다. 다른 실시양태에 있어서, 세포는 상용성 도관의 사용 및 계획된 목적 조직을 형상화 또는 탐지하는 능력을 필요로 할 수 있는 심내막(심장의 안쪽 표면) 방법을 통해 전달될 수도 있다. 별법으로, 세포는 심외막(심장의 바깥쪽 표면) 방법을 통해 전달될 수도 있다. 이 전달은 개심 절차시에 직접적인 기관 노출을 통해서, 또는 특화된 세포 전달 기구를 필요로 하는 흉강경 접근법을 통해서 달성될 수 있다. 또한, 세포는 피하, 근육내, 설하, 퇴행성 심장 관류, 심장 우회로 장치, 체외 막 산화(ECMO, extracorporeal membrane oxygenation) 장치 및 심낭창 등의 경로들 단독으로, 또는 하나 이상의 상기 명시된 접근법을 통해 전달될 수 있다.

한 실시양태에서, 세포는 환자에게 혈관내 환괴 또는 적시 주입 형태로 투여된다. 다른 실시양태에서, 세포는 환자에게 투여되기 전 인공 또는 자연 배지 또는 조직 스캐폴드 내에 재현탁될 수 있다.

환자에게 투여되는 세포 투여량은 채취되는 지방조직의 양 및 공여자의 신체 질량 지수에 의존할 것이다(이용 가능한 지방조직의 양을 측정함으로써). 채취되는 조직의 양은 또한 심간 손상 또는 변성의 정도에 의해 결정될 수도 있다. 다중 조직 채취 또는 적용간에 적당한 세포 저장을 수반하는 단일 채취를 사용한 다중 치료법이 본 발명의 범위에 포함된다.

가공된 리포애스퍼레이트 부분은 환자에게 투여되기 이전 보관될 수 있다. 단기 보관(6시간 미만)을 위해서는, 세포는 영양 용액의 보충 또는 보충 없이 밀봉된 용기 내에서 상온 또는 그 미만의 온도에서 저장될 수 있다. 중기 보관(48시간 미만)은 바람직하게는 등장, 완충 용액(예를 들면 플라스마라이트(Plasmalyte, 등록상표)) 내에서, 세포 응착을 막는 물질을 포함하거나 이로 코팅된 용기 내에서, 2-8℃에서 수행된다. 더 긴 기간의 보관은 바람직하게는 공유되고 지정된 PCT 출원번호 PCT/US02/29207 (2002년 9월 13일 출원) 및 미국 가출원번호 60/322,070(2001년 9월 14일 출원)에 개시된 것 등의 적당한 저온 보존 및 세포 기능의 유지를 촉진하는 조건 하에서의 세포 저장에 의해 수행되는데, 이들 모두의 내용은 본원에 참조문헌으로 포함되었다.

본 발명의 한 측면에 따라, 환자에게 투여되는 지방조직 유래 세포는 성장 인자 전달 매체로 작용할 수 있다. 예를 들면, 심혈관 장애 또는 질환을 수반하는 현상을 완화하기에 적당한 하나 이상의 성장 인자를 발현하기 위해 세포를 처리함으로써, 세포는 환자에 투여될 수 있고 하나 이상의 성장 인자를 방출하도록 처리될 수 있다. 방출은 연장된 시간 동안 조절된 방식으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 방출은 성장 인자가 규칙적 또는 주기적 형태로 방출되어 조직의 손상 영역의 부근에 성장 인자의 국소적 상승 및/또는 성장 인자의 양의 국소적 감소가 존재할 수 있도록 조절될 수 있다.

환자에게 투여되는 세포는 손상되거나 다른 이유로 건강하지 않은 조직의 기능을 복구하는 것을 도울 뿐 아니라, 손상된 조직의 재건을 촉진하기도 한다.

세포 전달은 개인 병원, 개인 병원 오피스, 응급실, 병동, 중환자실, 수술실, 도관실 및 방사선실 등의 장소에서 일어날 수 있으나 이에 한정되지 않는다: .

한 실시양태에 있어, 세포 전달 치료법의 효과는 증가된 심장 배출 분율, 감소된 심부전증율, 감소된 경색 크기, 증가된 수축성 (dP/dT), 감소된 심실 경직 (-dP/dT에서 증가함), 감소된 수반 이환률(폐부종, 신부전, 부정맥, 표적 혈관 재형성), 개선된 운동 내성 또는 다른 생명 측정치의 우량성, 및 감소된 사망률 등의 임상 측정치들 중 하나에 의해 설명될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 세포 치료법의 효과는 상기 절차 후 수 일 내지 수 주의 경과로부터 명백할 수 있다. 그러나, 상기 절차 후 여러 시간 이내에 이로운 효과가 관찰될 수도 있고, 수 년 동안 잔존할 수도 있다.

환자들은 일반적으로 세포의 전달 이전 및 전달 중에 관찰된다. 관찰 절차는 응고 연구, 산소 포화도, 혈류역동학적 관찰 및 심장 율동 관찰 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 세포의 전달 후, 환자는 불리한 사고를 대비해 약 24시간의 관찰 기간을 필요로 할 수도 있다. 상기 절차로부터 기능적 개선을 평가하는 사후 연구는 환자 기능 용량(예를 들면, 격심한 활동시 호흡 곤란, 발작성 야간 호흡 곤란, 협심증), 초음파 심장 검진, 핵 관류 연구, 자기 공명상, 양전자 발산 해부학 및 심장 혈관 촬영 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

위에서 이미 제시하였듯이, 바람직한 실시양태에서, ADC(즉, 활성 지방 유래 줄기 세포 집단)은 환자에게 직접 투여된다. 다시 말하면, 활성 세포 집단(예를 들면, 줄기 세포 및/또는 내피 선조 세포)은 환자에게 투여되기 전 시스템으로부터 제거되거나 시스템의 외부 환경에 노출되지 않고 환자에게 투여된다. 밀폐 시스템을 제공하면 환자에게 투여되는 물질의 오염 가능성을 감소시킬 수 있다. 그러므로, 밀폐 시스템에서의 지방조직의 가공은 기존 방법에 비해 장점을 제공하는데, 이는 활성 세포 집단이 더욱 멸균되는 경향을 가지기 때문이다. 이러한 실시양태에서는, 줄기 세포 및/또는 내피 선조 세포가 외부 환경에 노출되거나 시스템에서 제거되는 유일한 때는 세포가 적용 장치 내부로 회수될 때와 환자에게로 투입될 때이다. 한 실시양태에서는, 상기 적용 장치 또한 밀폐 시스템의 일부일 수도 있다. 그러므로, 이러한 실시양태에서 사용되는 세포는 배양 또는 저온 보전을 위해 가공되지 않으며, 더 이상의 가공 없이 환자에게 투여되거나, 다른 조직 또는 세포와 혼합된 후에 환자에게 투여될 수 있다.

다른 실시양태에 있어, 적어도 일부분의 활성 세포 집단이 이후 이식/주입을 위해 보관된다. 집단은 한 분취량 또는 단위보다 많게 나누어져, 줄기 세포 및/또는 내피 선조 세포의 집단의 일부가 이후 적용을 위해 보존되고 일부는 환자에게 즉시 적용된다. 세포 은행 내에 세포의 일부 또는 전부의 중기 또는 장기 보관 역시 본 발명의 범위에 포함되는데, 이는 2002년 9월 12일에 출원되고 "PRESERVATION OF NON EMBRYONIC CELLS FROM NON HEMATOPOIETIC TISSUES"로 명명된 미국 특허출원번호 10/242,094에서 개시되었고, 이는 공통으로 지정된, 2001년 9월 14일에 출원된 미국 가출원 60/322,070의 우선권을 주장하고 있으며, 이들의 내용은 본원에서 참조문헌으로 명백히 포함되었다. 가공의 최종 단계에서, 농축된 세포는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 수용자에게로 놓아지기 위해 주사기 등의 전달 장치에 채워질 수 있다.

활성 세포 집단은 단독으로, 또는 다른 세포, 조직, 조직 단편, VEGF 및 다른 알려진 혈관형성 또는 동맥형성 성장 인자 등의 성장 인자, 생물학적으로 활성 또는 비활성인 화합물, 재흡수성 플라스틱 스캐폴드, 또는 전달, 효능, 내성, 또는 집단의 기능을 강화할 목적의 다른 첨가제들과의 조합으로 적용될 수 있다. 세포 집단은 또한, 구조적 또는 치료적 목적으로의 유도를 위해 세포 기능을 변화, 강화 또는 보충하는 방법을 통한, 세포 배양에서의 DNA의 삽입 또는 주입에 의해 변형될 수 있다. 예를 들면, 줄기 세포용 유전자 전달 기법은 문헌[Morizono et al., 2003]; [Mosca et al., 2000]에 개시된 것처럼 당업자에게 공지되어 있으며, 바이러스성 트랜스펙션 기법, 더욱 특정적으로는, 문헌[Walther and Stein, 2000] 및 문헌[Athanasopoulos et al., 2000]에 개시된 것처럼, 아데노-수반 바이러스 유전자 전달 기법을 포함할 수도 있다. 비-바이러스 기반 기법 또한, 문헌[Muramatsu et al., 1998]에 개시된 것처럼 수행될 수 있다.

또다른 측면에서, 세포는, 심장 복구 또는 재생 중에 세포를 그들 자신의 성장 인자 소스로 작용하도록 하는 혈관형성 전구성 및/또는 심근 성장 인자를 인코딩하는 유전자와 조합될 수 있다. 항-아포프토시스 인자 또는 제제를 인코딩하는 유전자 또한 적용될 수 있다.

본 발명의 특정 실시양태에 있어서, 세포들은 하나 이상의 사이토킨 및 성장 인자 같은 세포 분화제를 사용하여 환자에게 투여된다. 다양한 세포 분화제의 예들은 문헌[Gimble et al., 1995]; [Lennon et al., 1995]; [Majumdar et al., 1998]; [Caplan and Goldberg, 1999]; [Ohgushi and Caplan, 1999]; [Pittenger et al., 1999]; [Caplan and Bruder, 2001]; [Fukuda, 2001]; [Worster et al., 2001]; [Zuk et al., 2001]에 개시된다.

본 발명은 하기 실시예들에 의해 더 설명될 것인데 이 실시예들은 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다. 본원 전체를 통해 인용된, 참조 문헌, 등록 특허, 공개 특허 출원, 및 계속중인 특허 출원을 포함하는 모든 인용된 참고문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다.

<실시예>

하기 기재되는 실시예 전반에 걸쳐 사용되는 지방 유래 재생성 세포는 본원의 개시 내용에 기재되고/거나 본원에 참고로 인용되는 방법에 의해 수득하였다.

실시예 1: ADC에 의한 혈관형성 성장 인자 VEGF의 발현

혈관 내피성 성장 인자(VEGF)는 혈관형성의 핵심 조절자 중 하나이다(문헌[Nagy et al., 2003]; [Folkman, 1995]). VEGF류의 또다른 하나인 태반 성장 인자는, 평행한 혈관이 관류(perfusion) 및 전단력에 대응하여 회복 및 팽창되는 과정인, 혈관형성 및 동맥형성 모두에 있어서 유사한 역할을 한다(문헌[Nagy et al., 2003]; [Pipp et al., 2003]; [Scholz et al., 2003]). 구체적으로, 야생형(PIGF +/+) 세포를 PIFG 유전자가 결여된 마우스에게 이식하면 뒷다리 허혈증(hind limb ischemia)으로부터의 신속한 회복을 유발하는 능력이 복구된다(문헌[Scholz et al., 2003]).

재혈관화 과정에 혈관형성 및 동맥형성 모두의 중요성을 부여하면서, 지방 유래 재생성 세포에 의한 PIGF 및 VEGF 발현을 세 공여자로부터의 세포를 사용한 ELISA 분석(알 앤드 디 시스템즈(R&D Systems), 미국 미네소타주 미니애폴리스 소재)을 사용하여 조사하였다. 하나의 공여자는 과혈당증 및 제2형 당뇨병(관상 동맥 질환을 갖는 환자를 포함하는, 미세혈관 및 대혈관과 질환 고도로 연관된 증상)의 병력을 가졌다. 각각의 공여자로부터의 ADC 세포를 10％ FCS 및 5％ HS를 보충한 DMEM/F-12 배지 내의 1000 세포/㎠의 평판에서 배양하고 전면생장할 때까지 성장시켰다. 상청액 시료를 PIGF 및 VEGF 단백질의 발현을 위해 분석하였다. 도 16A 및 16B에 도시된 바와 같이, 결과는 본 발명의 지방 유래 재생성 세포에 의한 VEGF(도 16A) 및 PIGF(도 16B) 모두의 강한 발현을 설명한다.

별개 연구에서, 성숙한 정상 마우스로부터 배양된 재생성 세포에 의해 분비되는 혈관형성 관련 사이토킨의 상대량을 측정하였다. 재생성 세포를 10％ FBS를 갖는 알파-MEM에서 세포 전면생장을 넘어서 5일까지 배양하였으며, 이 때 세포 배양 배지를 수확하고, 항체 어레이 분석 (레이바이오(RayBio)? 마우스 사이토킨 항체 어레이 II (Mouse Cytokine Antibody Array II)(레이바이오텍, 인크.(RayBiotech, Inc.))에 의해 평가하였다. 하기 혈관형성 관련 성장 인자를 탐지하였다: 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), bFGF, IGF-II, 에오탁신, G-CSF, GM-CSF, IL-12 p40/p70, IL-12 p70, IL-13, IL-6, IL-9, 렙틴, MCP-I, M-CSF, MIG, PF-4, TIMP-1, TIMP-2, TNF-α, 및 트롬보포에틴. 하기 혈관형성 관련 성장 인자 또는 사이토킨은 10％ FBS를 갖는 블랭크 대조군 배지와 2회 이상 비교하여 평가하였다: 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 에오탁신, G-CSF, IL-6, MCP-1 및 PF-4.

이들 데이타는 본 발명의 재생성 세포가 광범위한 혈관형성 및 동맥형성 성장 인자를 발현함을 나타낸다. 이들 데이타는 또한 정상 및 당뇨병 환자 모두로부터의 지방조직 유래 줄기 세포 및 선조 세포가 혈관형성 및 동맥형성 성장 인자를 발현한다는 것을 나타낸다. 당뇨병 환자가 심혈관 질환의 증가된 위험을 갖기 때문에 이는 중요하고 이들 데이터는 ADC 세포가 당뇨병 환경에서 그 혈관형성 능력을 보유한다는 것을 보여준다. 당뇨병 환자가 일반 환자에 비해 VEGF 및 PlGF를 동등한 수준으로 발현한다는 발견은 당뇨병 환자가 자가 지방 유래 재생성 세포에 의한 혈관형성 요법에 대한 후보자일 수 있음을 제안한다.

실시예 2: ADC는 혈관형성에 참여하는 세포 집단을 함유한다.

내피 세포 및 그의 전구 세포, 내피 선조 세포(EPC)는 혈관형성에 참여하는 것으로 공지되어 있다. EPC가 지방세포 유래의 재생성 세포에 존재하는지 여부를 결정하기 위해, 인간 지방세포 유래의 재생성 세포를 EPC 세포 표면 마커, 예를 들어 CD-34에 대해 평가하였다.

ADC를 인간 피하 지방조직의 효소 분해에 의해 단리하였다. ADC (100 ㎕)를 0.2％ 소 태아 혈청 (FBS)을 함유한 인산염 염수 완충액 (PBS)에서 인큐베이션하고, 20 내지 30분 동안 4℃에서 인간 내피 마커 CD-31 (분화된 내피 세포 마커) 및 CD-34 (EPC 마커), 뿐만 아니라 인간 ABCG2 (ATP 결합 카세트 전달체)(다능성 세포 상에서 선택적으로 발현됨)에 결합하는 형광 표지된 항체와 인큐베이션하였다. 세척 후에, 세포를 FACSAria 소터(Sorter) (벡톤-디킨슨-이뮤노사이토미터리(Beckton Dickenson-Immunocytometry)) 상에서 분석하였다. 데이타 획득 및 분석을 이어서 FACSDiva 소프트웨어 (미국 캘리포니아주 소재의 비디-이뮤노사이토미터리(BD-Immunocytometry))에 의해 수행하였다. 결과 (도시하지 않음)는 건강한 성인으로부터의 지방세포 유래의 재생성 세포가 EPC 마커 CD-34 및 ABCG2를 발현하지만, 내피 세포 마커 CD-31을 발현하지 않았음을 나타냈다. EPC 마커 CD-34 및 ABCG2를 발현하는 세포가 당뇨병 병력을 갖는 공여자로부터 유래한 재생성 세포에서 유사한 빈도수로 검출되었다.

내피 세포 분화 배지에서 인간 지방세포 유래의 재생성 세포의 배양 후에 그의 EPC의 빈도수를 측정하기 위해, 재생성 세포를 섬유결합소-코팅 플레이트 상으로 플레이팅하고, 내피 세포 배지에서 3일 동안 배양하여 성숙 내피 세포를 제거하였다. 비접착 세포를 제거하고 다시 플레이팅하였다. 14일 후에, 콜로니를 FITC-접합 울렉스 에우로파에우스 아글루티닌-1(Ulex europaeus Agglutinin-1) (미국 캘리포니아주 벌링게임 소재의 벡터 랩스(Vector Labs)) 및 DiI-표지 아세틸화 LDL (미국 오레곤주 유진 소재의 몰리큘러 프로브즈(Molecular Probes))로 염색함으로써 확인하였다. 도 17에 나타난 바와 같이, 결과는 대략 500개 EPC 세포/10⁶개 ADC 세포의 EPC 빈도수를 나타낸다.

지방조직 유래 재생성 세포 내의 EPC의 존재는 이들 세포가 새로운 혈관의 발생에 직접적으로 참여하고, 혈관형성 및 재관류를 향상시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 3: ADC 중의 혈관 구조의 시험관내 발생

당업계에 인지되는 혈관형성에 대한 검정 중 하나는 섬유아세포의 공급자층 상에서 성장한 내피 세포가 신생 모세관 네트워크의 CD31-양성 튜브 회상의 복합 네트워크를 발생시키는 것이다 [Donovan et al., 2001]. 지방세포 유래의 재생성 세포가 내피 세포, EPC 및 기타 간질 세포의 전구 세포를 함유하기 때문에, 본 발명자들은 공급자층의 부재에서 모세관-유사 구조를 형성하는 이들 재생성 세포의 능력을 시험하였다. 재생성 세포를 2주 배양 후에 모세관 네트워크 발생 정상 마우스의 사타구니 지방 패드로부터 수득하였다 (도 18A). 특히, 스트렙토조토신 (STZ)를 투여한 8주 후에 STZ-유도 제1형 당뇨병을 앓는 고혈당 마우스로부터의 재생성 세포는 정상 마우스로부터의 세포에 의해 형성되는 것과 동등한 모세관 네트워크를 형성하였다 (도 18B).

차후 연구에서, 지방세포 유래의 재생성 세포를 추가 성장 인자 없이 완전 배양 배지 (10％ FCS로 보충된 α-MEM)에서 배양하였다. 이들 재생성 세포는 또한 모세관 네트워크를 형성하였다. 또한, 혈관 구조는 내피 세포 마커 CD31, CD34, VE-카드헤린 및 폰 빌레브란트 인자/인자 VIII에 대해 염색 양성을 나타내지만, 팬(pan)-림프구 마커 CD45에 대해서는 그렇지 않았다.

청년기 마우스 대 노년기 마우스로부터의 모세관 네트워크를 형성하는 재생성 세포의 능력을 비교하기 위해, 정상 청년기 마우스 및 노년기 마우스로부터의 재생성 세포 (1, 12, 또는 18령)를 2주 동안 추가 성장 인자 없이 완전 배양 배지 (10％ FCS로 보충된 α-MEM)에서 배양하였다. 동등한 모세관-유사 네트워크를 모든 공여자로부터의 재생성 세포의 배양물에서 관찰하였다 (도시하지 않음).

상기 데이타는 정상인 및 당뇨병 환자, 뿐만 아니라 청년기 환자 및 노년기 환자로부터의 지방세포 유래의 재생성 세포가 신생 모세관 네트워크의 형성에 일치된 혈관 구조를 형성할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 재생성 세포는 혈관형성 결점을 치료하기 위해 사용할 수 있다.

실시예 4: ADC에서 혈관 구조물의 생체내 발생

시험관내 혈관형성 가능성은, 전도 유망하지만, 세포가 생체내 혈관형성 활성을 보이지 않는다면 가치가 떨어진다. 설치류 내의 위험한 사지 허혈증의 외과 유도는 동맥형성(증가한 전단력에 크게 대응하는 평행한 혈관의 회복 및 팽창) 및 혈관형성(허혈증에 대응하는 새로운 혈관의 발달)이 공동으로 작용하는 과정들이 관찰될 수 있는 널리-인식된 모델이다(문헌[Schatteman, 2000]; [Scholz, 2002]; [Takahashi, 1999]). 이 모델은 재관류를 유발할 수 있는 인간 세포의 능력이 관찰될 수 있는 면역결여(NOD-SCID) 마우스 내에서 계발하였다. 구체적으로, 동물을 케타민 및 크실라진(80 mg/kg; 7.5 mg/kg)으로 마취시키고 앙아위(supine position)로 수술 표면상에 위치시켰다. 수술 전의 혈류량의 값을 하기 설명하는 바와 같이 뒷다리 양쪽에 대해 측정하였다. 동물에 대해 베타딘을 준비하였고 통상적인 멸균 방법에 의해 멸균한 천으로 덮고 회전하는 물중탕에 위치시켰다. 뒷다리의 기시점부터 무릎의 가장 가까운 쪽까지 연장되게 일측성으로 1.5 ㎝ 절개를 하여 깊은 동맥 및 표면상의 대퇴부 동맥 내의 그 분기점에 가장 가까운 장골 동맥을 노출시켰다. 혈관계를 3-0 비단 봉합사를 사용하여 다음의 부위에서 묶었다: 1) 그 분기점에 가장 가까운 장골 동맥, 2) 깊은 대퇴부 동맥의 기시점의 말단, 3) 표면상의 대퇴부 동맥의 분지점에 가장 가까운 쪽. 봉합 후, 혈관계를 일괄적으로 제거하였다. 그 후, 봉합되고 후속하여 제거된 임의의 명백한 옆 가지를 확인하려는 시도를 하였다. 상처 및 근육 층을 4-0 흡수성 봉합사로 봉합하였고 피부를 5-0 흡수성 봉합사로 봉합하였다. 동물을 수술 후 부프레노르핀(0.5 mg/kg)으로 처리하였고 자발적으로 모로 누울 때까지 회전 물중탕 상에서 회복시켰다. 수술 후 24시간 후 동물에 5 × 10⁶ ADC 세포를 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 연구에서 NOD-SCID 마우스에 당뇨병 환자로부터의 세포를 포함하는 인간 공여자 세포를 주사하였다. 처리 후 14일 동안 흐름을 영상화하였다.

이 연구에서, ADC-처리된 동물들은 사지 구조의 보유(사지 구조; 처리되지 않은 마우스 2/3는 ADC-처리된 동물들 0/5과 비교해보면 모든 하부 뒷다리 구조를 잃었다) 및 혈류의 복구에 있어서 통계적으로 현저한 향상을 보였다(도 19). 가장 현저하게, 당뇨병을 앓고 있는 인간 공여자 세포를 받은 NOD-SCID 마우스에 있어서, 14일째의 혈류는 처리된 동물 내에서 50±11％로 복구되었고 이에 비해 처리되지 않은 동물 내에서는 10±10％로 복구되었다(p<0.05). 19일째까지 반동이 발생하여 실험 사지 내의 관류가 대조군보다 컸다(136±37％). 이 반응은 두 정상(비-당뇨병) 공여자로부터 얻은 세포로 관찰한 범위 내이다(50 내지 90％).

자가 조직 세포 전달의 효과를 측정할 수 있는 면역성 마우스(129S 마우스) 내의 유사한 실험에서 ADC 세포 처리된 마우스는 14일째에 처리되지 않은 마우스(56±4％)에 비해 80±12％의 혈류 복구를 보였다.

이 모델에서, 혈류는 평행한 혈관의 회복 및 팽창으로부터 및 하부 사지 내의 혈관형성에 의해 복구된다. 이들 과정들은 또한 심근 경색에 후속하는 심장 내에서의 혈류의 복구에 중요하다. 따라서, ADC의 이들 과정들을 자극하는 능력은 생체 내에서 강하게 ADC 세포의 심근 경색증의 환경 내에서의 응용을 지지한다. 당뇨병을 앓고 있는 공여자(심혈관 질환을 앓을 더 높은 위험을 갖는 환자 집단의 구성원)로부터 얻은 ADC 세포 또한 이 활성을 보임을 주목하는 것 역시 중요하다.

실시예 5: ADC 투여량의 증가는 향상된 이식편 생존 및 혈관형성과 관련된다.

자가 조직 지방조직의 이식은 성형 및 재건 수술에 있어서 상대적으로 통상적인 과정이다(문헌[Fulton, 1998]; [Shiffman, 2001]). 그러나, 이 과정은 지방조직편이 혈관 공급 없이 전달되고, 그 결과로서, 이식편 생존은 신생혈관 형성에 의존한다는 사실에 의해 제한된다(문헌[Coleman, 1995]; [Eppley et al., 1990]). 따라서, 제한된 방법으로, 이식된 조직은 허혈증 조직을 나타낸다.

지방조직편이 외부 허벅지 근육 위의 피하 공간으로 이식되는 피셔(Fisher) 래트의 연구를 수행하였다. 오른쪽 다리에 0.2 g의 지방조직편을 단독으로 이식하였고, 왼쪽 다리에는 0.2 g의 지방조직편을 지방 유래 줄기 세포의 첨가에 의해 보충하면서 세 가지 다른 투여량(1.7 × 10⁵ 내지 1.3 × 10⁶ 세포/이식편; 투여량 당 세 동물)으로 이식하였는데; 이 방법으로, 반대쪽 다리는 대조군으로서 작용하였다. 그 후 동물들을 한 달 동안 유지시킨 후 안락사시키고 이식편을 회수하고, 중량을 재고, 포르말린에 고정하고 조직학적 분석을 위해 파라핀에 넣었다.

도 20A에 도시된 바와 같이, 결과는 대조군 다리 내에 이식된 조직의 최소 보유 및 처리된 다리 내의 이식편 중량의 보유에 있어서의 투여량-의존적인 증가를 보여준다. 또한, 이식편의 면역 조직 화학적 분석은 지방 유래 재생성 세포 처리된 이식편 내의 상당한 신생혈관 형성 및 관류를 보여주었다(도 20B, 화살표). 이는 또한 지방조직 형태학의 보유와 관련되었다.

상기한 바와 같이, ADC 세포가 부적합하게 관류된, 허혈증 조직의 생존을 촉진한다는 설명은 심혈관 질환에 있어서 임상 가능성의 중요한 지표이다.

실시예 6: ADC에 의한 심근 생착

심근에 대한 저온상처(cryoinjury)는 심근 재생성에 있어서의 세포 치료의 역할을 조사하기 위한 잘 확립된 수술 모델이다(문헌[Marchlinski et al., 1987]). ADC 세포의 손상된 심근을 생착하고 그로 인해 상처 형성을 억제하는 능력(콜라겐 침착 및 가교 결합)을 설명하기 위해, B6129SF1/J 마우스 내에 심근 저온상처를 내었다. 상처가 난 바로 직후, lacZ 유전자에 대해 유전자 도입한 ROSA26 마우스로부터 얻은 백만(1.0 × 10⁶) ADC 세포를 심실내 경로를 통해 주사하였다. β-갈락토시다제로 착색한 수령하는 심장 조직은 파란색으로 착색하여 공여자 지방 유래 재생성 세포의 존재를 검출할 것이다. 마우스 심장을 얻었고 주사 후 다음의 다섯 시간 지점에서 처리하였다: 1일째, 7일째, 14일째, 28일째, 84일째. 도 10에 도시된 바와 같이, 결과는 상기 언급된 모든 시간 지점에서 경색된 심근 부위 내에서의 공여자 유래 지방 유래 재생성 세포의 생착을 나타낸다. 도 21은 생착의 조직학적 타임 라인을 나타낸다.

중요하게, 공여자-유래(베타 갈락토시다제-양성) 세포의 14일째의 면역 조직 화학적 분석은 많은 공여자-유래 세포들이 심근세포 표지 근절 미오신 중쇄 트로포닌 I 및 nkx2.5를 발현하였다는 것을 보여주었다(도 22). 이는 ADC 세포가 손상된 심장 내의 상처 부위로 돌아갈 수 있으며 심근세포 또는 심근세포 유사 세포로 분화할 수 있음을 보여준다. 따라서, ADC 세포는 심장마비(심근 경색증) 후에 손실된 심근세포 또는 심근세포 유사 세포를 보충할 수 있다.

종들을 넘어 이 발견을 연장하기 위해, 래트 폐색/재관류 모델에 있어서 공여자 유래 가공된 리포애스퍼레이트의 생착을 연구하였다. 이 실험 구성에 있어서, 면역성 위스타(Wistar) 래트의 좌전하행 동맥을 7-0 플라스틱제 봉합사(prolene) 및 동맥 상에서 스내어(snare)로 작용하는 작은 조각의 실라스틱(silastic) 관을 사용하여 일시적으로 폐색하였다. 1시간 후, 폐색을 해제하였고 혈액이 허혈증 심근을 재관류하도록 하였다. 이 모델은 더 가깝게 인간 임상 패러다임에 존재하는 상처 및 회복의 메카니즘을 나타낸다. 재관류 후 즉시, Rosa26 마우스로부터 얻은 약 백만(1 × 10⁶) ADC 세포를 심실내 경로를 통해 주사하였다. 주사 일주일 후 심장을 수확하였다. 도 23에 도시된 바와 같이, 결과는 공여자 유래 ADC 세포의 생착을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 재생성 세포는 임상적으로 관련되고, 관류를 개선하고, 손상된 심근을 재생하는 잠재력을 가진다.

실시예 7: ADC는 래트에서 급성 심근경색증 후 심장 기능을 개선한다.

급성 심근경색증 ("AMI")은 음성 환경 현상을 개시하는 허혈성 심근을 유발시켜 결국 울혈성 심장 부전을 유도한다. ADC를 사용하는 세포 심근성형술은 재생성 세포를 제공하여 허혈에 의해 손상된 숙주 세포를 교체/복구함으로써 그의 진행을 변경시키는 잠재력을 가진다. 본 실시예는 심근경색증의 작은 동물 모델을 설명하고, ADC의 환괴를 투여받는 이들 동물에서 기능적 개선을 입증한다.

심근경색증은 암컷 루이스(Lewis) 래트 (250 내지 300 그람)에서 좌전하행 심장 동맥 (LAD)의 60분 라이게이션에 의해 유도하였다. 18마리의 래트를 랜덤하게 2개 군으로 나누었다: (1) ADC 처리 (n = 10) 또는 (2) 염수 처리 (n = 8). ADC 처리 동물의 경우에, 5백만 ADC는 대략 15분 심장내 전달로 좌 심실 내강 내로 도입한 후에 재관류하였다. 심장초음파검사 분석을 경색 전, 및 AMI 4, 8 및 12주 후에 취하였다. 연구 완료시에, 침습 수축성 측정을 취하여 좌심실의 수축/이완을 분석하였다. 심장을 이어서 이완기에서 정지시키고, 조직학적 분석을 위해 준비하였다.

MI 12주 후의 에코 및 수축성 분석은 염수에 비해 ADC 처리한 래트가 유의하게 개선된 분율 (76.0 ± 0.9％ 대 68.3 ± 1.9％, p<0.01, 도 24); 기준선 수축성 (+dP/dT: 5494.46 ± 550.76 mmHg 대 2837.61 ± 301.19 mmHg, p<0.05, 도 25); 기준선 이완 (-dP/dT: -6326.28 ± 544.61 대 -2716.49 ± 331.83 mmHg, p<0.05, 도 26); 및 심실 중격 두께를 포함하는 리모델링 파라미터 (이완기: 1.23 ± 0.03mm 대 1.50 ± 0.11 mm, p<0.05, 도 27)를 가짐을 나타냈다. ADC 처리는 또한 심실 확장의 진행을 차단한다 (증거; 심실 중격 두께 (수축기, 도 28) 및 후방 벽 두께 (이완기 (도 29) 및 수축기 모두에서 (도 30)).

실시예 8: ADC는 AMI의 돼지 모델에서 기능을 개선한다.

상기 입증한 바와 같이, ADC는 작은 동물에서 AMI 후에 심장 기능을 개선할 수 있다. 이 연구는 이들 기능적 이점 중 일부가 큰 동물에서도 관찰될 수 있음을 나타낸다. 이 연구는 또한 좌전하행 심장 동맥 ("LAD") 내로의 ADC의 혈관내 전달이 안전하고, 실행가능함을 나타낸다.

전방-심첨 심근경색증을 중간 LAD의 풍선 패쇄에 의해 13마리 새끼 돼지에서 유도하였다. 경색 48시간 후에, 지방조직은 우측 사타구니 지방절제술을 통해 수득하고, 자가 ADC를 단리하고, 돼지를 랜덤하게 LAD에서 패쇄 부위에서 먼 곳에 염수 (대조군) 또는 40 내지 140 백만 (평규 52 x 10⁶) ADC를 심장내 주입하였다. 관상동맥 조영술, 좌심실 (LV) 혈관영화촬영술, 및 2D 심장초음파검사를 경색 전, 경색 직후 및 6개월째에 기준선에서 수행하였다.

모든 13마리 돼지 (7마리의 ADC 처리, 6마리의 대조군)는 LAD 중에서 TIMI-3 관상 혈류를 가지고, 주요 심장 부작용 없이 이후 6개월까지 생존하였다. 도 31에 나타낸 바와 같이, 심장초음파검사에 의한 좌심실 분율 ("LVEF")은 10마리 돼지에서 측정가능하였고, 대조군 (-9.0％ ± 5.0％, p=0.01)에 비해 세포 주입군 (3.0％ ± 6.0％, 평균 ± SD)에서 유의하게 증가하였다. 혈관영화촬영술 (n=12)에 의한 LVEF는 각각 3.7％ ± 5.0％ 대 -2.0％ ± 7.5％ (p=0.16)의 값으로 유사한 성향을 나타냈다. 결과를 하기 표 4에 요약한다. 요약하면, 이들 결과는 ADC가 큰 동물의 심장 기능을 유의한 개선하고, ADC의 전달이 안전하고, 심실 수축 기능 유지에 유효함을 나타낸다.

진단 방법	기준선에서의 LVEF	6개월에서의 LVEF	LVEF의 변화	표준 편차	p-값
2D 심장초음파검사
처리군	46％	49％	+ 3％	± 6％	0.01
대조군	47％	38％	- 9％	± 5％
혈관영화촬영술
처리군	51％	55％	+ 4％	± 5％	0.16
대조군	49％	47％	- 2％	± 7％

실시예 9: 급성 심장 손상의 치료

급성 심근 경색증(심장마비)은 심근에 허혈증 상처를 유발한다. 조직 손상은 손상된 조직의 초기 재관류 및 심근 조직의 재생성에 의해 최소화될 수 있다(문헌[Murry et al., 1996]; [Orlic et al., 2001]; [Orlic et al., 2003]; [Rajnoch et al., 2001]; [Strauer et al., 2002]; [Assmus et al., 2002]). 본원에 개시된 지방-유래 세포 요법은 골수 채취와 같은 비-지방-유래 세포 요법에 비해 상대적으로 더 우수한 재생 세포의 공급원을 제공하는 것을 추구하는데, 이는 예를 들면 비-지방조직 유래 요법(예를 들어, 골수 채취)와 관련된 희박한 사망률을 갖는 많은 수의 비-배양된 세포들 및 더 순수한 세포들 중 적어도 하나의 사용에 기인한다.

한 환자가 심근 경색증으로부터 고통받고 있다는 의심을 받았다. 상기 환자가 1 시간 내에 경색을 겪게 되었다. 환자에게 지방조직 유래 세포 요법을 처방하였다. 환자의 체질을 지방조직 수집에 대해 적합한 부위를 위해 검사하였다. 채취 부위는 다음의 것 중 적어도 하나에 의해 특징지워졌다: 정상 해부 구조에 의해 제한된 잠재적 공간, 손상의 위험에 처한 비-주요 혈관 또는 내장 구조, 및 용이한 접근부. 최초 채취 부위가 바람직하지만, 이전의 채취 부위는 추가적인 지방조직 채취를 배제하지 못했다. 잠재적 채취 부위는 좌우 양쪽 하부 말단의 측면 및 중간 허벅지 구역, 전방 복부 벽 판누스(pannus), 및 좌우 양쪽 옆구리 구역을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

환자는 리도카인, 염수, 및 에피네프린의 조합을 함유하는 팽창한 유체 용액의 피하 주사를 예를 들면 상이하게 표준화된 투여 처방 계획에 의해 투여되었다. 외과용 메스(예를 들면, 11-날 외과용 메스)를 사용하여, 진피를 가로지르기 위해 작은 구멍 상처를 환자의 오른쪽 및/또는 왼쪽 다리의 중간 허벅지 구역에 내었다. 상처를 완성하기 위해 날을 360° 돌렸다. 둥근 가는 캐뉼러(예를 들면, 14-게이지 캐뉼러)를 절개 상처 아래의 피하 지방조직 면에 삽입하였다. 캐뉼러를 전력 보조 흡입 장치에 연결하였다. 캐뉼러를 결합성 조직 구조를 분쇄하기 위해 지방조직면 전체에 걸쳐 이동시켰다. 약 500 cc의 흡인물을 얻었다. 지방조직의 제거 후, 표준 수술 기술을 사용하여 지혈하였고 상처를 봉합하였다.

리포애스퍼레이트를 본원에 기술된 방법에 따라 처리하여 농축된 지방유래 줄기 세포 단위를 수득하였다. 경색 후 약 6시간 후, 환자에게 줄기 세포를 투여하였다. 리포애스퍼레이트의 처리에 근거하여, 환자에게 약 5.5 × 10⁴ 줄기 세포 내지 5.5 × 10⁵ 줄기 세포 범위의 초기 투여량의 줄기 세포를 투여하는 것으로 계측되었다. 환자는 초기 투여후 12시간 간격으로 두 번의 보충 투여를 받았다. 줄기 세포를 중심 정맥 카테터를 통해 환자에게 투여하였다. 표적 구역 내에서의 세포 생착을 촉진하기 위해, 줄기 세포의 흐름을 표적 부위의 하류부에 위치한 풍선 및 표적 부위의 상류부에 위치한 풍선에 의해 조절하여 낮은 또는 최소 혈류량의 구역을 생성하였다.

세포 투여 과정 후 약 6시간 내에 환자에게서 개선이 관찰되었다. 세포 투여 과정 수일 후에 환자에게서, 증가한 심장 분율, 감소한 심부전증 비율, 감소한 경색 크기, 개선된 운동 내구력 및 기타 삶의 척도의 질에 의해 증명되는 추가의 향상이 관찰되었다.

본원에 기재된 특징 또는 특징의 조합은 이러한 모든 조합에 포함되는 특징이 상호 모순되지 않는다면 본 발명의 범위 내에 포함되고, 이는 문맥, 명세서, 및 당업자의 지식으로부터 명백할 것이다. 본 발명을 요약하기 위한 목적으로, 본 발명의 특정 측면, 이점 및 신규 특징을 본원에 기재하였다. 물론, 이러한 모든 측면, 이점 또는 특징이 본 발명의 특정 실시양태에서 반드시 구체화되는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 추가적 이점 및 측면은 하기 상세한 설명 및 청구항에서 명백하다.

상기 실시양태는 예시적으로 제공된 것이고, 본 발명은 이 실시예에 의해 제한되지 않는다. 당업자는 상기 기재를 고려하여 상호 배타적이지 않은 범위까지 개시된 실시양태에 다수의 변경 및 변형을 가할 것이다. 또한, 다른 조합, 삭제, 대체 및 변형이 본 개시를 고려하여 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명은 개시된 실시양태에 의해 한정되는 것으로 의도되지 않고, 첨부하는 청구의 범위에 의해 한정될 것이다.

다수의 간행물 및 특허가 상기에 인용되었다. 인용된 간행물 및 특허는 그 전체가 인용됨으로써 본원에 포함된다.

균등물

당업자는 더 이상의 일상적인 실험을 하지 않고도 본원에 기재한 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 여러 균등물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기하는 청구의 범위에 포함되는 것으로 한다.

Claims (13)

1. 지방조직 유래의 줄기 세포를 포함하는 농축된 세포 군을 포함하는, 심근 경색 후 심장 리모델링의 예방을 위한 의약.
2. 제1항에 있어서, 지방조직 유래의 줄기 세포를 포함하는 농축된 세포 군이 무균상태의 폐쇄된 유체 및 조직 경로를 유지하도록 설정된 시스템 내에서 단리되는 것인 의약.
3. 제1항에 있어서, 지방조직 유래의 줄기 세포를 포함하는 농축된 세포 군이 배양되지 않은 것인 의약.
4. 제1항에 있어서, 지방조직 유래의 줄기 세포를 포함하는 농축된 세포 군이 지방조직 유래의 선조 세포를 포함하는 것인 의약.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 환괴(bolus)로 투여되도록 제제화된 의약.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 다회 투여량(multiple doses)으로 투여되도록 제제화된 의약.
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관형성(angiogenic) 인자를 추가로 포함하는 의약.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 동맥형성(arteriogenic) 인자를 추가로 포함하는 의약.
9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 면역억제 약물을 추가로 포함하는 의약.
10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 심내막(endomyocardial), 심외막(epimyocardial), 심실내, 관상동맥내, 역행 관상동맥동(retrograde coronary sinus), 동맥내, 심막내 또는 정맥내 경로를 통해 투여되도록 제제화된 의약.
11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 지방조직 유래의 줄기 세포를 포함하는 농축된 세포 군이 첨가제를 더 포함하는 것인 의약.
12. 제12항에 있어서, 첨가제가 성장 인자, 면역억제제 및 세포 재응집 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 의약.
13. 제1항 내지 제4항에 있어서, 지방조직 유래의 줄기 세포가 내피 세포 또는 내피 전구 세포를 포함하는 것인 의약.

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