KR20130038278A - in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항인간 TROP-2 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 hTROP-2 와 특이적으로 반응하고 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항체, 당해 항체를 산생하는 하이브리도마, 당해 항체와 약제의 복합체, 종양의 진단용 또는 치료용 의약 조성물, 종양의 검출 방법, 종양의 검출용 또는 진단용 키트를 제공한다.

Description

in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항인간 TROP-2 항체{ANTI-HUMAN TROP-2 ANTIBODY HAVING ANTITUMOR ACTIVITY IN VIVO}
본 발명은 항종양 활성을 갖는 항인간 TROP-2 항체, 특히 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항인간 TROP-2 항체에 관한 것이다. 또 본 발명은 당해 항체를 산생하는 하이브리도마, 및 당해 항체의 용도에 관한 것이다.
인간 TROP-2 (Tacstd2, GA733-1, EGP-1) (이하, hTROP-2 로도 표기한다) 는, 여러 가지의 상피 세포 암종에 있어서 과잉 발현되고 있는 것이 알려진, 323 아미노산 잔기 (배열 번호 2 참조) 로 이루어지는 1 회 막관통형의 1 형 세포막 단백질이다. 이전부터, 인간 영양막 세포 (trophoblasts) 와 암 세포에 공통되는 면역 저항성에 관여하는 세포막 단백의 존재 (비특허문헌 1) 가 시사되고 있었는데, 인간 융모 암 세포주 BeWo 의 세포막 단백에 대한 마우스 모노클로날 항체 (162-25.3, 162-46.2) 에 의해 인식되는 항원 분자가 특정되어 인간 영양막 세포 (trophoblasts) 에 발현되는 분자의 하나로서 Trop-2 라고 명명되었다 (비특허문헌 2). 이후에, 동일한 분자가 다른 연구자에 의해 발견되어, 위암 세포 SW948 을 면역시켜 얻어진 마우스 모노클로날 항체 GA733 에 의해 인식되는 종양 항원 GA733-1 (비특허문헌 3), 비소세포 폐암 세포 면역에 의해 얻어진 마우스 모노클로날 항체 RS7-3G11 에 의해 인식되는 상피 당단백질 (epithelial/carcinoma antigen, EGP-1) (비특허문헌 4) 이라고도 불리었는데, 1995 년에 Trop-2 의 유전자가 클로닝되어 이들이 동일한 분자인 것이 확인되었다 (비특허문헌 5). 또, 암 세포에 있어서 세포 내 칼슘 시그널을 증폭시키는 기능이 밝혀져 (비특허문헌 6), tumor-associated calcium signal transducer 2, TACSTD2 라고도 불린다.
hTROP-2 유전자는 염색체 1p32 에 맵핑되어 약 50 ％ 의 상동성을 갖는 GA733-2 (TACSTD1, 상피 당단백질 EGP-2, EpCAM 및 Trop-1 로서도 알려져 있다) 와 함께 TACSTD 유전자 패밀리를 구성하고 있다 (비특허문헌 7). hTROP-2 단백질 (323 아미노산 잔기 ； 배열 번호 2) 은 대략 36 킬로달톤의 분자량을 가지며, 친수성의 시그널 펩티드 (제 1 ～ 26 번째의 아미노산), 세포 외 도메인 (제 27 ～ 274 번째의 아미노산), 세포막 관통 도메인 (제 275 ～ 297 번째의 아미노산) 그리고 세포 내 도메인 (제 298 ～ 323 번째의 아미노산) 으로 이루어진다. 세포 외 도메인에는 4 개의 불균질 N 결합 글리코실화 부위가 있어, 당 사슬 부가에 의해 외관상의 분자량은 11 ～ 13 킬로달톤 증가한다 (비특허문헌 5). TACSTD 유전자 패밀리에서는, 세포 외 도메인에 특징적인 thyroglobulin (TY) 반복 배열을 가지며, 암 세포의 증식이나 침윤, 전이에 관여한다고 생각되고 있다.
지금까지, hTROP-2 의 생리학적 리간드는 동정 (同定) 되어 있지 않아, 분자 기능은 분명하지 않지만, 종양 세포에 있어서 칼슘 시그널을 전달하는 것이 나타나고 (비특허문헌 6), 또, Ca2 + 의존성의 단백질 키나아제인 단백질 키나아제 C 에 의해, 세포 내 세린 303 잔기가 인산화되는 것 (비특허문헌 4) 이나, 세포 내 도메인에 PIP2 결합 배열을 갖는 점에서, 종양 세포에 있어서의 시그널 전달 기능이 시사되어 있다 (비특허문헌 8).
면역 조직 화학 (IHC) 및 플로사이토메트리 연구 등의 인비트로 진찰 연구에 의해, 위암, 폐암, 대장암, 난소암, 유방암, 전립선암, 췌암, 간암, 식도암 등의 많은 상피 유래 암종에 있어서 hTROP-2 의 과잉 발현이 보고되고 있다. 이에 대해, 정상 조직에 있어서의 발현은 상피 영역의 세포에 한정되고, 발현 레벨도 암종에 비교하여 낮은 것이 나타나 TROP-2 의 종양 형성에 대한 관여가 시사되어 있다 (특허문헌 1 ～ 3 및 9).
또, 임상 검체에 있어서의 바이오 마커로서의 hTROP-2 발현 레벨 해석에 있어서, 대장암 (비특허문헌 10 및 11), 췌장암 (비특허문헌 12) 이나 구강암 (비특허문헌 13) 의 악성도와 상관되며, hTROP-2 가 고발현되고 있는 경우에는 암의 전이나 재발이 유의하게 높은 것이 나타나 있다. 또, cDNA 마이크로 어레이 기술을 사용한 대규모 유전자 발현 분석에 있어서, 정상적인 난소 상피와 비교하여 난소의 중독인 유두상암에 가장 고도로 과잉 발현되고 있는 유전자군의 하나로서 동정되었다 (비특허문헌 14).
또한, 최근 종양 형성에 있어서의 hTROP-2 의 중요한 역할이 대장암 세포를 사용한 모델에 의해 증명되었다 (비특허문헌 15). hTROP-2 의 발현이 종양 세포의 기반 비의존적 세포 증식을 촉진하여, 면역 부전 마우스의 피하에 이식한 암세포의 종양 형성 및 증식에 필요한 점에서, 기능적인 종양 항원으로서 새로운 치료 표적이 될 가능성을 나타냈다.
지금까지, 몇가지 항 hTROP-2 항체에 대해 항종양 효과의 검토가 보고되어 있다. RS7 항체 (특허문헌 1) 에 대해, 방사 표식한 항체를 사용한 in vivo 모델에 있어서 시험되어, 누드 마우스 이종 이식 모델에 있어서의 항종양 활성이 나타나 있지만, 항체 단독 (나체 항체) 에서의 항종양 효과는 보고되지 않았다.
이 밖에, 세포 독소를 결합시킨 항 hTROP-2 모노클로날 항체 BR110 (특허문헌 2) 에 의한, 인간 암 세포주 H3619, H2987, MCF-7, H3396 및 H2981 에 대한 in vitro 실험에서의 세포 장해성이 보고되어 있지만, in vivo 데이터에서는 나체 항체 또는 면역 복합 BR110 에 대해 개시되어 있는 것은 없었다.
최근, 인간 난소암 조직을 마우스에 면역시킴으로써 얻어진 하이브리도마 세포주 AR47A6.4.2 혹은 AR52A301.5 에 의해 산생되는 단리 모노클로날 항체가 hTROP-2 와 결합하여, 나체 항체로서 처음으로 in vitro 에서의 세포 장해성에 더하여, 누드 마우스 이종 이식 모델에 있어서의 항종양 활성을 나타내는 것이 보고되었다 (특허문헌 3 및 4). 그러나, 이들 문헌 중에서는, 췌장암 세포주 BxPC-3 및 PL45, 전립선암 세포 PC-3, 유방암 세포 MCF-7 그리고 대장암 세포 Colo205 를 이식한 마우스 이종 이식 모델에 있어서 항체 단독에서의 항종양 효과가 나타나 있지만, BxPC-3 세포 이식에 있어서 치료 효과가 나타나 있는 것 이외에는, 항체의 예방적 투여에 의해 종양 형성 및 증식을 부분적으로 (약 40 ～ 60 ％) 억제하는 것이 나타나 있는 데 그치고, 또, 필요로 되는 항체량도 20 ㎎/㎏ 정도로 매우 고용량이었다.
이상의 종래의 지견으로부터, 항 hTROP-2 항체의 항종양 항체로서의 가능성이 시사되고 있지만, 동시에, 항 hTROP-2 항체의 전부가 나체 항체로서 항체 단독으로 in vivo 에 있어서 항종양 효과를 나타내는 것이 아니고, 항체의 결합 부위나 친화성, 모노클로날 항체의 프로필에 의해, hTROP-2 에 대한 기능이 상이한 것을 나타내고 있다.
미국 특허 제6653104호 미국 특허 제5840854호 미국 특허 제7420040호 미국 특허 제7420041호
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이와 같은 상황하에서, in vivo 에 있어서 높은 항종양 활성을 갖는 항인간 hTROP-2 항체 (항인간 hTROP-2 모노클로날 항체), 특히, 나체 항체로서 항체 단독으로 in vivo 에 있어서의 항종양 효과를 가지고, 게다가 저용량으로 당해 효과를 갖는 항인간 hTROP-2 항체 등의 개발이 요망되고 있었다.
본 발명은 상기 상황을 고려하여 이루어진 것으로, 이하에 나타내는 항인간 hTROP-2 항체 (항인간 hTROP-2 모노클로날 항체), 당해 항체를 산생하는 하이브리도마, 당해 항체의 단편, 당해 항체 등과 약제의 복합체 (이무노콘쥬게이트), 종양의 진단용 또는 치료용 의약 조성물, 종양의 검출 방법, 종양의 검출용 또는 진단용 키트 등을 제공하는 것이다.
(1) in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 인간 TROP-2 에 대한 항체.
상기 (1) 의 항체로서는, 예를 들어, 5 ～ 20 ㎎/㎏ 체중의 투여량으로 50 ％ 이상의 종양 성장 저해 활성을 나타내는 것, 상기 종양 성장 저해 활성을 나타내기 위한 투여 횟수가 많아도 1 주일에 1 회인 것, 10 ㎎/㎏ 체중의 단회 투여로 50 ％ 이상의 종양 성장 저해 활성을 나타내는 것, 2 종 이상의 인간 종양 세포주에 대해 항종양 활성을 갖는 것, 해리 정수 (Kd 값) 가 1.0 × 10-10 M 이하인 것 등을 들 수 있다. 여기서, 종양으로서는, 예를 들어, 인간 췌암, 인간 전립선암, 인간 대장암 및 인간 유방암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종, 특히 인간 췌암을 들 수 있고, 또 종양으로서는, 재발암 및 전이암도 들 수 있다. 또, 종양 세포주로서는, 예를 들어, 인간 췌암 세포주 PK-59, 인간 췌암 세포주 BxPC-3, 인간 췌암 세포주 KP-3L, 인간 췌암 세포주 KP-2, 인간 췌암 세포주 PK-1, 인간 췌암 세포주 PK-45H, 인간 췌암 세포주 PK-45P, 인간 췌암 세포주 TCC-PAN2, 인간 췌암 세포주 SUIT-2, 인간 대장암 세포주 CACO-2, 인간 대장암 세포주 SW480, 인간 대장암 세포주 DLD-1, 인간 대장암 세포주 HCT 116, 인간 유방암 세포주 JIMT-1, 인간 유방암 세포주 HCC1143, 인간 유방암 세포주 MCF-7, 인간 전립선암 세포주 DU145 및 인간 전립선암 세포주 PC-3 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2 종, 특히 인간 췌암 세포주 PK-59 및 인간 췌암 세포주 BxPC-3 을 들 수 있다.
상기 (1) 의 항체로서는, 예를 들어, 항체의 H 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 36 ～ 38 로 표시되는 아미노산 배열이고, 및/또는, 항체의 L 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 41 ～ 43 으로 표시되는 아미노산 배열인 것 ；
항체의 H 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 46 ～ 48 로 표시되는 아미노산 배열이고, 및/또는, 항체의 L 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 51 ～ 53 으로 표시되는 아미노산 배열인 것 ；
항체의 H 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 56 ～ 58 로 표시되는 아미노산 배열이고, 및/또는, 항체의 L 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 61 ～ 63 으로 표시되는 아미노산 배열인 것 ； 및
항체의 H 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 66 ～ 68 로 표시되는 아미노산 배열이고, 및/또는, 항체의 L 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 71 ～ 73 으로 표시되는 아미노산 배열인 것 등을 들 수 있다.
상기 (1) 의 항체로서는, 예를 들어, 모노클로날 항체를 들 수 있다.
상기 (1) 의 항체로서는, 예를 들어, 유전자 재조합 항체를 들 수 있고, 구체적으로는, 키메라 항체, 인간형화 항체 또는 인간화 항체를 들 수 있다.
여기서, 상기 키메라 항체로서는, 예를 들어, H 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 35 로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지고, 및/또는, L 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 40 으로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ；
H 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 45 로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지고, 및/또는, L 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 50 으로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ；
H 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 55 로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지고, 및/또는, L 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 60 으로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ； 및
H 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 65 로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지고, 및/또는, L 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 70 으로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 것 등을 들 수 있다.
(2) 수령 번호가 FERM BP-11251, FERM BP-11252, FERM BP-11253, FERM BP-11346 또는 FERM BP-11254 인 하이브리도마에 의해 산생되는, 인간 TROP-2 에 대한 모노클로날 항체.
상기 (1) 및 (2) 의 항체로서는, 예를 들어, 수령 번호가 FERM BP-11251, FERM BP-11252, FERM BP-11253, FERM BP-11346 또는 FERM BP-11254 인 하이브리도마에 의해 산생되는 모노클로날 항체가 결합하는 부위에 결합하는 것, 및 배열 번호 2 로 표시되는 인간 TROP-2 의 아미노산 배열 중의, 제 43 번째 ～ 제 65 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 제 152 번째 ～ 제 165 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 제 171 번째 ～ 제 183 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 제 109 번째 ～ 제 120 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 제 43 번째 ～ 제 56 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 및 제 193 번째 ～ 제 206 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종 (예를 들어 어느 1 종) 의 영역을 포함하는 부분과 결합하는 것을 들 수 있다.
(3) 상기 (1) 또는 (2) 의 항체에서 유래하는 항체 단편.
상기 (3) 의 항체 단편으로서는, 예를 들어, 배열 번호 36 ～ 38 로 표시되는 아미노산 배열, 및/또는, 배열 번호 41 ～ 43 으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 것, 예를 들어 배열 번호 35 로 표시되는 아미노산 배열, 및/또는, 배열 번호 40 으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 것 ；
배열 번호 46 ～ 48 로 표시되는 아미노산 배열, 및/또는, 배열 번호 51 ～ 53 으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 것, 예를 들어 배열 번호 45 로 표시되는 아미노산 배열, 및/또는, 배열 번호 50 으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 것 ；
배열 번호 56 ～ 58 로 표시되는 아미노산 배열, 및/또는, 배열 번호 61 ～ 63 으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 것, 예를 들어 배열 번호 55 로 표시되는 아미노산 배열, 및/또는, 배열 번호 60 으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 것 ； 및
배열 번호 66 ～ 68 로 표시되는 아미노산 배열, 및/또는, 배열 번호 71 ～ 73 으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 것, 예를 들어 배열 번호 65 로 표시되는 아미노산 배열, 및/또는, 배열 번호 70 으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 것 등을 들 수 있다.
(4) 상기 (1) 또는 (2) 의 항체를 산생하는 하이브리도마.
(5) 수령 번호가 FERM BP-11251, FERM BP-11252, FERM BP-11253, FERM BP-11346 또는 FERM BP-11254 인, 인간 TROP-2 에 대한 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마.
(6) 상기 (1) 또는 (2) 의 항체와, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 물질을 포함하는 항체-약제 복합체.
(7) 상기 (3) 의 항체 단편과, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 물질을 포함하는 항체 단편-약제 복합체.
상기 (6) 및 (7) 의 복합체에 있어서, 종양으로서는, 예를 들어, 인간 췌암, 인간 전립선암, 인간 대장암 및 인간 유방암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종, 특히 인간 췌암을 들 수 있고, 또 종양으로서는, 재발암 및 전이암도 들 수 있다.
(8) 상기 (1) 및 (2) 의 항체, 상기 (3) 의 항체 단편, 그리고 상기 (6) 및 (7) 의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 의약 조성물.
상기 (8) 의 조성물로서는, 예를 들어, 종양의 치료에 사용하는 것, 특히 체중 감소의 부작용을 가지지 않는 것을 들 수 있고, 또, 종양의 진단에 사용하는 것도 들 수 있다. 여기서, 종양으로서는, 예를 들어, 인간 췌암, 인간 전립선암, 인간 대장암 및 인간 유방암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종, 특히 인간 췌암을 들 수 있고, 또 종양으로서는, 재발암 및 전이암도 들 수 있다.
(9) 상기 (1) 및 (2) 의 항체, 상기 (3) 의 항체 단편, 그리고 상기 (6) 및 (7) 의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양 치료제.
상기 (9) 의 치료제로서는, 예를 들어, 체중 감소의 부작용을 가지지 않는 것을 들 수 있다.
(10) 상기 (1) 및 (2) 의 항체, 상기 (3) 의 항체 단편, 그리고 상기 (6) 및 (7) 의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양 진단제.
상기 (9) 의 치료제 및 상기 (10) 의 진단제에 있어서, 종양으로서는, 예를 들어, 인간 췌암, 인간 전립선암, 인간 대장암 및 인간 유방암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종, 특히 인간 췌암을 들 수 있고, 또 종양으로서는, 재발암 및 전이암도 들 수 있다.
(11) 상기 (1) 및 (2) 의 항체, 상기 (3) 의 항체 단편, 그리고 상기 (6) 및 (7) 의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종과, 생체로부터 채취된 시료를 반응시키고, 반응한 항체 및/또는 항체 단편의 시그널을 검출하는 것을 특징으로 하는 종양의 검출 방법.
상기 (11) 의 방법에 있어서, 종양으로서는, 예를 들어, 인간 췌암, 인간 전립선암, 인간 대장암 및 인간 유방암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종, 특히 인간 췌암을 들 수 있고, 또 종양으로서는, 재발암 및 전이암도 들 수 있다.
(12) 상기 (1) 및 (2) 의 항체, 상기 (3) 의 항체 단편, 그리고 상기 (6) 및 (7) 의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양의 치료용, 진단용 또는 검출용 키트.
상기 (12) 의 키트에 있어서, 종양으로서는, 예를 들어, 인간 췌암, 인간 전립선암, 인간 대장암 및 인간 유방암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종, 특히 인간 췌암을 들 수 있고, 또 종양으로서는 재발암 및 전이암도 들 수 있다.
도 1 은 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (K5-70) 의, 항원 친화성 (Kd ： 해리 정수) 측정을 나타내는 도면이다. Abt : Antibody (total), Agf : Antigen (free)
도 2 는 항 hTROP-2 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마 배양 상청의, HuH-7 세포 (TROP-2 음성) 와 HuH-7-hTROP-2 세포의 반응성을 나타내는 도면이다. 검정 칠한 히스토그램은 HuH-7 세포를 나타내고, 검정 라인의 히스토그램은 HuH-7-hTROP-2 세포를 나타낸다.
도 3 은 항 hTROP-2 모노클로날 항체의, 내재적으로 hTROP-2 를 세포 표면에 발현하고 있는, 인간 췌장암 세포주 (PK-59 세포) 와의 반응성을 나타내는 도면이다. 검정 칠한 히스토그램은 2 차 항체 (PE 표식 항마우스 IgG) 만, 검정 라인의 히스토그램은 각 항 hTROP-2 모노클로날 항체와 반응시킨 것을 나타낸다.
도 4 는 항 hTROP-2 모노클로날 항체의, 내재적으로 hTROP-2 를 세포 표면에 발현하고 있는, 인간 췌장암 세포주 (BxPC-3 세포) 와의 반응성을 나타내는 도면이다. 검정 칠한 히스토그램은 2 차 항체 (PE 표식 항마우스 IgG) 만, 검정 라인의 히스토그램은 각 항 hTROP-2 모노클로날 항체와 반응시킨 것을 나타낸다.
도 5 는 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (K5-70) 의, 인간 췌장암 세포주와의 반응성을 나타내는 도면이다. 검정 칠한 히스토그램은 2 차 항체 (PE 표식 항마우스 IgG) 만, 검정 라인의 히스토그램은 항 hTROP-2 모노클로날 항체와 반응시킨 것을 나타낸다.
도 6 은 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (K5-70) 의, 인간 대장암 세포주 (Colo320, CACO2, SW480, DLD1, CW2, HCT 116), 인간 유방암 (JIMT-1, HCC1143), 인간 전립선암 세포주 (PC-3, DU145) 와의 반응성을 나타내는 도면이다. 검정 칠한 히스토그램은 2 차 항체 (PE 표식 항마우스 IgG) 만, 검정 라인의 히스토그램은 항 hTROP-2 모노클로날 항체와 반응시킨 것을 나타낸다.
도 7 은 항 hTROP-2 모노클로날 항체의, 마우스 TROP-2 와의 교차 반응성을 조사한 도면이다. 세포는, CHO-K1 세포에, 마우스 TROP-2 유전자를 일과성 발현시킨 세포를 사용하고, 양성 대조 항체로서 마우스 TROP-2 와 교차성을 나타내는 T2-102 항체 (마우스 IgG1) 를 사용했다. 검정 칠한 히스토그램은 2 차 항체 (PE 표식 항마우스 IgG) 만, 검정 라인의 히스토그램은 각 항 hTROP-2 모노클로날 항체와 반응시킨 것을 나타낸다.
도 8 은 항 hTROP-2 모노클로날 항체의, 인간 EpCAM/TROP-1 과의 교차 반응성을 조사한 도면이다. 세포는, CHO-K1 세포에 인간 EpCAM/TROP-1 유전자를 일과성 발현시킨 세포를 사용하고, 양성 대조 항체로서 PE 표식 항인간 EpCAM 모노클로날 항체 (벡톤디킨슨) 를 사용했다. 검정 칠한 히스토그램은 2 차 항체 (PE 표식 항마우스 IgG) 만, 검정 라인의 히스토그램은 각 항 hTROP-2 모노클로날 항체와 반응시킨 것을 나타낸다.
도 9 는 항 hTROP-2 항체 (T6-16, T5-86, K5-70, K5-107) 의 인간 췌장암 세포주 (PK-59 세포) 의 세포 증식 저해 활성을 나타내는 도면이다. mIgG 는 컨트롤 항체 (마우스 IgG), YY01 : 시판되는 항 hTROP-2 항체 (Santacruz) 를 나타낸다. 흰색 칼럼 ： 0 ㎍/㎖, 회색 칼럼 ： 0.1 ㎍/㎖, 검정 칼럼 ： 1 ㎍/㎖. 항체 첨가를 하지 않은 (0 ㎍/㎖) 의 값에 대한 Ratio 로 나타냈다. 에러 바는 표준 편차를 나타낸다. *P < 0.05, **P < 0.01 (by Student's t-test)
도 10 은 항 hTROP-2 항체 (T6-16, K5-70) 의 인간 췌장암 세포주 (PK-59 세포) 의 스크래치 어세이를 나타내는 도면이다.
A. PK-59 세포의 스크래치 영역의 사진의 대표예를 나타낸다. Day 0 : 스크래치 직후의 대표예를 나타낸다. mIgG (Day 1) : 스크래치 후, 컨트롤 항체 (마우스 IgG, 1 ㎍/㎖) 를 배지에 첨가하고, 1 일 후 (24 시간 후) 의 사진. K5-70 (Day 1) : 스크래치 후, K5-70 항체 (1 ㎍/㎖) 를 배지에 첨가하고, 1 일 후 (24 시간 후) 의 사진. T6-16 (Day 1) : 스크래치 후, T6-16 항체 (1 ㎍/㎖) 를 배지에 첨가하고, 1 일 후 (24 시간 후) 의 사진. 사진 중에 나타낸 화살표는 스크래치 영역의 폭을 나타냈다.
B. 화상 해석 소프트 (Scion Image) 로 스크래치 영역의 면적을 해석하고, 그 값을 기초로, 컨트롤 mIgG 첨가군 Day0 을 기준치 1 로 하여, 다른 샘플 각종의 값을 산출했다.
*P < 0.05, **P < 0.01 (by Student's t-test)
도 11 은 인간 췌장암 세포주, PK-59 세포의 줄기 세포 마커의 FACS 의 도면이다. A : PK-59 세포의 EpCAM 의 발현을 나타내는 FACS 의 도면이다. 검정 칠한 히스토그램은 2 차 항체 (PE 표식 항마우스 IgG) 만, 검정 라인은 항인간 EpCAM 항체 (벡톤디킨슨) 와 반응시킨 경우의 히스토그램을 나타낸다. B, C : PK-59 세포의 P-glycoprotein/MCR1 (B), 또는 ABCG2 (C) 의 발현을 나타내는 FACS 의 도면이다. 청색 히스토그램은, 2 차 항체만, 적색 히스토그램이 항인간 P-glycoprotein/MDR1 항체 (BD 파민젠) (B), 항인간 ABCG2 항체 (BD 파민젠) (C) 와 반응시킨 경우를 나타낸다. D : PK-59 세포를 췌장암 줄기 세포 마커인 FITC 표식 항인간 CD24 항체 (BD 파민젠) 와 PE 표식 항인간 CD44 항체 (BD 파민젠) 로 이중 염색한 FACS 의 도면이다. D 의 도면 중의 숫자는 각각의 획분의 세포의 존재 비율을 나타낸다.
도 12 는 PK-59 세포를 사용한 Xenograft Treatment 모델에 있어서, 신규 항 hTROP-2 모노클로날 항체 클론 K5-70 (마우스 IgG2a) 의 항종양 활성을 평가한 도면이다.
A ： 컨트롤군 (마우스 IgG) 과 K5-70 투여군의 종양 성장을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. *P < 0.05, **P < 0.01 (by Student's t-test)
B ： A 의 시험에 있어서, 21 일째 (Day 21) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. 각 플롯상에 나타내는 수치는 평균치 ± 표준 편차. **P < 0.01 (by Student's t-test)
도 13 은 PK-59 세포를 사용한 Xenograft Treatment 모델에 있어서의, A. 클론 K5-107, B. 클론 T6-16, C. 클론 K5-116-2-1 의 항종양 활성을 평가한 도면이다. ● 는 컨트롤군 (마우스 IgG), ○ 는 항 hTROP-2 항체 투여군을 나타낸다. 그래프 중의 화살표는 항체 투여 기간을 나타내고, 각 플롯상에 나타내는 수치는 평균치 ± 표준 편차. *P < 0.05 (by Student's t-test)
도 14 는 PK-59 세포를 사용한 Xenograft Prevention 모델에 있어서의, A. 클론 K5-70, B. 클론 T6-16 및, C. 클론 K5-116-2-1 의 항종양 활성을 평가한 도면이다. ● 는 컨트롤군 (마우스 IgG), ○ 는 항 hTROP-2 항체 투여군을 나타낸다. 그래프 중의 화살표는 항체 투여 기간을 나타내고, 각 플롯상에 나타내는 수치는 평균치 ± 표준 편차. **P < 0.01 (by Student's t-test)
도 15 는 BxPC-3 세포를 사용한 Xenograft Prevention 및 Treatment 모델에 있어서의, 클론 K5-70 의 항종양 활성을 평가한 도면이다. A ： Prevention 모델에 있어서의 컨트롤군 (마우스 IgG) 과 K5-70 투여군의 종양 성장을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. **P < 0.01 (by Student's t-test) B ： Treatment 모델에 있어서의 컨트롤군 (마우스 IgG) 과 K5-70 투여군의 종양 성장을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. *P < 0.05 (by Student's t-test)
도 16 은 PK-59 세포를 사용한 Xenograft Prevention 모델에 있어서의, 클론 K5-70 의 용량 의존적인 항종양 활성을 나타낸 도면이다. 종양 체적은 평균치 ± 표준 편차로 나타냈다.
A ： 컨트롤군 (마우스 IgG) 과 각 용량에서의 K5-70 투여군의 종양 성장을 시간경과적으로 나타낸다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. *P < 0.05 (by Student's t-test), **P < 0.01 (by Student's t-test)
B ： A 의 시험에 있어서, 17 일째 (Day 17) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. 각 플롯상에 나타내는 수치는 평균치 ± 표준 편차. **P < 0.01 (by Student's-t-test)
도 17 은 실험에 사용한 인간/마우스 키메라 TROP-2 단백질의 모식도이다. SP ： 시그널 배열, TY domain ： 사일로 글로불린 타입 1 영역, TM ： 막 관통 영역, C ： 세포 내 영역 검정칠로 나타내고 있는 영역은 hTROP-2 유래의 폴리펩티드이다. 흰색으로 나타내고 있는 영역은 마우스 TROP-2 유래의 폴리펩티드이다. 키메라 단백질의 모식도의 상단에 나타내고 있는 숫자는 마우스 TROP-2 단백질의, 하단은 hTROP-2 단백질의 아미노산 번호를 각각 나타내고 있다.
도 18 은 인간/마우스 키메라 TROP-2 를 사용한 항 hTROP-2 모노클로날 항체 결합 영역의 동정 결과를 나타내는 도면이다. 인간/마우스 키메라 TROP2-C (hmTROP2-C) 및 마우스/인간 키메라 TROP2-D (mhTROP2-D) 단백질을 항상적으로 발현하는 HEK293 세포를 사용하여, 도면 중에 나타낸 항 hTROP-2 모노클로날 항체와의 반응성을 검토했다. 음성 컨트롤은 mouse IgG2b 를 사용했다.
도 19 는 항 hTROP-2 모노클로날 항체의 항체 결합 영역의 동정 결과를 나타내는 도면이다.
hTROP-2 유전자 및 각 인간/마우스 키메라 TROP-2 유전자를 HEK293 세포에 도입하고, 일과성으로 발현시킨 세포를 사용하여 FACS 해석을 실시했다. (A) K5-70, K5-107, T5-86, K5-116-2-1 항체에 대해, hTROP-2 (상단), hmTROP-2-A (중단) 및 hmTROP-2-B (하단) 와의 반응성을 검토했다. mouse IgG2b 는 음성 컨트롤로서 사용했다. (B) T6-4, T6-16 항체에 대해, hTROP-2 (상단), mhTROP-2-E (중단) 및 mhTROP-2-F (하단) 와의 반응성을 검토했다. mouse IgG2b 는 음성 컨트롤로서 사용했다.
도 20 은 인간 정상 조직에 있어서의 hTROP-2 의 발현을 나타내는 도면이다. 항 hTROP-2 모노클로날 항체 클론 K5-63-17 을 사용하여 인간 정상 조직 어레이의 면역 염색을 실시했다. (A) 피부, (B) 식도, (C) 신장 (피질), (D) 신장 (수질), (E) 췌장, (F) 전립선, (G) 방광, (H) 편도선, (I) 심장, (J) 간장 (배율 ： × 200)
도 21 은 암조직에서의 hTROP-2 의 발현을 나타내는 도면이다. 항 hTROP-2 모노클로날 항체 클론 K5-63-17 을 사용하여 인간 암조직 어레이의 면역 염색을 실시했다. (A) 유방암, (B) 폐암, (C) 식도암, (D) 위암, (E) 췌장암, (F) 대장암, (G) 방광암, (H) 전립선암, (I) 난소암 (배율 ： × 100)
도 22 는 PK-59 세포를 사용한 Xenograft Prevention 모델에 있어서의, 클론 K5-70 의 단회 투여에 의한 항종양 활성을 나타낸 도면이다.
A. 컨트롤군 (mouse IgG ●) 과 K5-70 투여군 (○) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타낸다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여를 나타낸다. *P < 0.05 (by Student's t-test), **P < 0.01 (by Student's t-test).
B. A 의 시험에 있어서, 28 일째 (Day 28) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. **P < 0.01 (by Student's-t-test).
C. 컨트롤군 (mouse IgG ●) 과 K5-70 투여군 (○) 의, 각 개체의 종양 형성을 시간경과적으로 나타낸다. 화살표는 항체 투여를 나타낸다.
도 23 은 인간 대장암 세포 SW480 세포를 사용한 Xenograft Treatment 모델에 있어서의, 클론 K5-70 의 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A ： 컨트롤군 (● mouse IgG) 과 K5-70 투여군 (○) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. **P < 0.01 (by Student's t-test)
B ： A 의 시험에 있어서, 44 일째 (Day 44) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. **P < 0.01 (by Student's t-test)
도 24 는 SW480 세포를 사용한 Xenograft Treatment 모델에 있어서의, 클론 K5-116-2-1 의 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A ： 컨트롤군 (● mouse IgG) 과 T6-16 투여군 (○) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. **P < 0.01 (by Student's t-test)
B ： A 의 시험에 있어서, 42 일째 (Day 42) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. **P < 0.01 (by Student's t-test)
도 25 는 SW480 세포를 사용한 Xenograft Treatment 모델에 있어서의, 클론 T6-16 의 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A ： 컨트롤군 (● mouse IgG) 과 T6-16 투여군 (○) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. *P < 0.05 (by Student's t-test)
B ： A 의 시험에 있어서, 42 일째 (Day 42) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. *P < 0.05 (by Student's t-test)
도 26 은 SW480 세포를 사용한 Xenograft Treatment 모델에 있어서의, 클론 K5-70 의 용량 의존적인 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A ： 컨트롤군 (● mouse IgG) 과 K5-70 투여군 (○ ： 1 ㎎/㎏, △ ： 5 ㎎/㎏, □ ： 10 ㎎/㎏) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. *P < 0.05 (by Student's t-test)
B ： A 의 시험에 있어서, 42 일째 (Day 42) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. *P < 0.05 (by Student's t-test)
도 27 은 SW480 세포를 사용한 Xenograft Treatment 모델에 있어서의, 클론 K5-70 의 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A : 1 주일에 1 회의 투여 간격에서의 K5-70 항체의 항종양 활성을 나타내는 도면이다. 컨트롤군 (● mouse IgG) 과 K5-70 투여군 (○ ： 10 ㎎/㎏) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살촉 (Day 10, 17, 24, 31, 38) 은 K5-70 항체의 투여를 나타낸다. *P < 0.05 by Student's t-test.
B : 10 일에 1 회 (■ : q10d), 또는 2 주일에 1 회 (● : q14d) 의 투여 간격으로의 K5-70 항체를 투여한 경우의 종양 형성을 시간경과적으로 나타낸 도면이다. 마름모꼴 (◇) 은 컨트롤군 (Mouse IgG, 10 ㎎/㎏) 을 나타낸다 (평균치 ± 표준 편차). 검정 칠한 화살촉 (▼ ； Day 9, 19, 29) 과 흰색 칠한 화살촉 (▽ ； Day 9, 23, 37) 은 K5-70 항체의 투여를 나타낸다. *P < 0.05, **P < 0.01 by Student's t-test.
도 28 은 SW480 세포를 사용한 Xenograft Treatment 모델에 있어서의, 클론 T6-16 의 용량 의존적인 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A ： 컨트롤군 (● mouse IgG) 과 T6-16 투여군 (○ ： 1 ㎎/㎏, △ ： 5 ㎎/㎏, □ ： 10 ㎎/㎏) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. **P < 0.01 (by Student's t-test)
B ： A 의 시험에 있어서, 43 일째 (Day 43) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. **P < 0.01 (by Student's t-test)
도 29 는 SW480 세포를 사용한 Xenograft Treatment 모델에 있어서의, 클론 T6-16 의 항종양 활성을 나타내는 도면이다. 컨트롤군 (● ： mouse IgG 10 ㎎/㎏), T6-16 (10 ㎎/㎏) 투여군 (○ ： q7d, △ ： q10d) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살촉 (Day 10, 17, 24, 31, 38), 및 화살표 (Day 10, 20, 30, 40) 는 T6-16 항체의 투여를 나타낸다. 컨트롤군은 3 일에 1 회 투여를 실시했다. *P < 0.05, **P < 0.01 by Student's t-test.
도 30 은 인간 전립선암 세포 DU-145 세포를 사용한 Xenograft Prevention 모델에 있어서의, 클론 K5-70 의 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A ： 컨트롤군 (● mouse IgG) 과 K5-70 투여군 (○) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. *P < 0.05 (by Student's t-test)
B ： A 의 시험에 있어서, 40 일째 (Day 40) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. *P < 0.05 (by Student's t-test)
도 31 은 PK-59 세포의 간 전이 모델을 사용한 클론 K5-70 의 전이 억제 활성을 나타내는 도면이다.
A ： 컨트롤군 (mouse IgG) 과 B ： K5-70 투여군의 세포 이식 6 주일 후의 적출 간장상을 나타낸다. 화살표는 간 전이소를 나타낸다.
도 32 는 SW480 세포를 사용한 Xenograft 모델에 있어서의 염산 이리노테칸 투여 후의 암재발 모델에 있어서의 K5-70 의 항종양 활성을 나타내는 도면이다. 무처치군 (◆) 과 염산 이리노테칸 (40 ㎎/㎏) 투여 후 K5-70 (○ ： 10 ㎎/㎏), 혹은 마우스 IgG 투여군 (● ： 10 ㎎/㎏) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타낸 도면이다 (평균치 ± 표준 편차). 화살촉 (Day 11, 14, 17) 은 염산 이리노테칸의 투여를 나타낸다. K5-70 항체 혹은 마우스 IgG 는 Day 20 부터 3 일에 1 회 투여를 실시했다. 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. *P < 0.05, **P < 0.01 by Student's t-test.
도 33 은 클론 K5-70 H 사슬 가변 영역 (VH) 의 cDNA 염기 배열 (배열 번호 34) 과 추정 아미노산 배열 (배열 번호 35) 을 나타내는 도면이다. 시그널 펩티드는 이탤릭으로 나타내고 있다. 이중 밑줄을 그은 글루타민 (Q) 은 성숙 펩티드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. CDR 배열 (밑줄 ; IYWIN, NIYPSDSYTNYNQKFKD, TSMADY) 은 Kabat 등 (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따라 결정했다. 클론 K5-70 VH 의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열은 각각 차례로 배열 번호 36 ～ 38 로 나타낸다.
도 34 는 클론 K5-70 L 사슬 가변 영역 (VL) 의 cDNA 염기 배열 (배열 번호 39) 과 추정 아미노산 배열 (배열 번호 40) 을 나타내는 도면이다. 시그널 펩티드는 이탤릭으로 나타내고 있다. 이중 밑줄을 그은 아스파르트산 (D) 은 성숙 펩티드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. CDR 배열 (밑줄 ; RASQSIGTSIH, YASESIS, QQSNSWPFT) 은 Kabat 등 (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따라 결정했다. 클론 K5-70 VL 의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열은 각각 차례로 배열 번호 41 ～ 43 으로 나타낸다.
도 35 는 클론 K5-107 H 사슬 가변 영역 (VH) 의 cDNA 염기 배열 (배열 번호 44) 과 추정 아미노산 배열 (배열 번호 45) 을 나타내는 도면이다. 시그널 펩티드는 이탤릭으로 나타내고 있다. 이중 밑줄을 그은 글루타민 (Q) 은 성숙 펩티드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. CDR 배열 (밑줄 ; SYWMH, NIYPGGGYTNYDEKFKS, SSVFDY) 은 Kabat 등 (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따라 결정했다. 클론 K5-107 VH 의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열은 각각 차례로 배열 번호 46 ～ 48 로 나타낸다.
도 36 은 클론 K5-107 L 사슬 가변 영역 (VL) 의 cDNA 염기 배열 (배열 번호 49) 과 추정 아미노산 배열 (배열 번호 50) 을 나타내는 도면이다. 시그널 펩티드는 이탤릭으로 나타내고 있다. 이중 밑줄을 그은 아스파르트산 (D) 은 성숙 펩티드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. CDR 배열 (밑줄 ; _RASQNIGTSIH, YASESIS, QQSNSWPFT) 은 Kabat 등 (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따라 결정했다. 클론 K5-107 VL 의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열은 각각 차례로 배열 번호 51 ～ 53 으로 나타낸다.
도 37 은 클론 K5-116-2-1 H 사슬 가변 영역 (VH) 의 cDNA 염기 배열 (배열 번호 54) 과 추정 아미노산 배열 (배열 번호 55) 을 나타내는 도면이다. 시그널 펩티드는 이탤릭으로 나타내고 있다. 이중 밑줄을 그은 글루타민 (Q) 은 성숙 펩티드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. CDR 배열 (밑줄 ; SYWIT, NIYPSDSYTNYNQKFRD, LFDY) 은 Kabat 등 (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따라 결정했다. 클론 K5-116-2-1 VH 의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열은 각각 차례로 배열 번호 56 ～ 58 로 나타낸다.
도 38 은 클론 K5-116-2-1 L 사슬 가변 영역 (VL) 의 cDNA 염기 배열 (배열 번호 59) 과 추정 아미노산 배열 (배열 번호 60) 을 나타내는 도면이다. 시그널 펩티드는 이탤릭으로 나타내고 있다. 이중 밑줄을 그은 아스파르트산 (D) 은 성숙 펩티드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. CDR 배열 (밑줄 ; _RASQSIGTSIH, YASESIS, QQSNSWPFT) 은 Kabat 등 (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따라 결정했다. 클론 K5-116-2-1 VL 의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열은 각각 차례로 배열 번호 61 ～ 63 으로 나타낸다.
도 39 는 클론 T6-16 H 사슬 가변 영역 (VH) 의 cDNA 염기 배열 (배열 번호 64) 과 추정 아미노산 배열 (배열 번호 65) 을 나타내는 도면이다. 시그널 펩티드는 이탤릭으로 나타내고 있다. 이중 밑줄을 그은 글루탐산 (E) 은 성숙 펩티드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. CDR 배열 (밑줄 ; DYNMH, YIYPYNGGTGYNQRFKS, EDYGSSPSYAMDY) 은 Kabat 등 (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따라 결정했다. 클론 T6-16 VH 의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열은 각각 차례로 배열 번호 66 ～ 68 로 나타낸다.
도 40 은 클론 T6-16 L 사슬 가변 영역 (VL) 의 cDNA 염기 배열 (배열 번호 69) 과 추정 아미노산 배열 (배열 번호 70) 을 나타내는 도면이다. 시그널 펩티드는 이탤릭으로 나타내고 있다. 이중 밑줄을 그은 아스파르트산 (D) 은 성숙 펩티드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. CDR 배열 (밑줄 ; _RSSQSLVHGNGNTYLH, KVSNRFS, SQTTHVPT) 은 Kabat 등 (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따라 결정했다. 클론 T6-16 VL 의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열은 각각 차례로 배열 번호 71 ～ 73 으로 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 범위는 이들의 설명에 구속되는 것이 아니고, 이하의 예시 이외에 대해서도, 본 발명의 취지를 저해하지 않는 범위에서 적절히 변경하여 실시할 수 있다.
또한, 본 명세서는 본원 우선권 주장의 기초가 되는 일본 특허출원 2010-113302 호 명세서 (2010 년 5 월 17 일 출원) 의 전체를 포함한다. 또, 본 명세서에 있어서 인용된 모든 간행물, 예를 들어 선행 기술 문헌, 및 공개 공보, 특허 공보 그 밖의 특허 문헌은 참조로서 본 명세서에 편입된다.
1. 본 발명의 개요
인간 TROP-2 (hTROP-2) 는, 전술한 바와 같이, 전체 길이 323 아미노산 잔기로 이루어지는 1 회 막관통형의 1 형 막단백질이다. 그리고, hTROP-2 유전자 및 그 유전자 산물은 여러 가지의 암 세포에 있어서 발현되고 있는 것이 알려져 있다.
전술한 바와 같이, in vivo 에 있어서 높은 항종양 활성을 갖는 항인간 hTROP-2 항체 (항인간 hTROP-2 모노클로날 항체) 등의 개발이 요망되고 있던 상황하에, 본 발명자는, 매우 다수의 클론으로부터 스크리닝을 실시함으로써, in vivo 에서 높은 항종양 활성을 갖는 클론을 취득하는 것에 성공했다. 구체적으로는, 본 발명은 in vivo 에 있어서 hTROP-2 의 세포 외 영역을 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체, 특히 피코몰 오더 (pM) 가 높은 친화성을 나타내는 모노클로날 항체를 제공하는 것이다. 본 발명의 항체는, 나체 항체의 단독 투여로, 기존의 항 hTROP-2 항체와 비교하여, 보다 적은 용량 (예를 들어 1/20 투여량) 으로 현저한 종양 성장 저해 활성을 가지고, 또한 복수의 인간 암세포를 사용한 담암 마우스 치료 모델에 있어서 현저한 종양 성장 저해 활성을 나타내는, 항 hTROP-2 모노클로날 항체인 점에서, 매우 유용한 것이다.
2. 항 hTROP-2 항체의 제조
(1) 항원의 조제
hTROP-2 의 아미노산 배열 (배열 번호 2) 의 정보는, 예를 들어, NCBI (GenBank) 의 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 에 「Accession number ： NP 002344」로서 공표되어 있다. 또한, hTROP-2 의 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열 (배열 번호 1) 의 정보는 동 웹 사이트에 「Accession number ： NM 002353」으로서 공표되어 있다.
항원으로서는, hTROP-2 의 아미노산 배열의 적어도 일부 (전부 또는 일부) 를 포함하는 폴리펩티드 또는 펩티드 (간단히 펩티드라고도 한다) 를 사용할 수 있고, 바람직하게는 hTROP-2 의 세포 외 영역의 아미노산 배열의 적어도 일부 (전부 또는 일부) 를 포함하는 펩티드를 사용할 수 있다. hTROP-2 의 세포 외 영역 (시그널 펩티드를 포함한다) 은 배열 번호 2 로 표시되는 아미노산 배열 중 제 1 번째 ～ 제 274 번째의 아미노산을 포함하는 영역 (시그널 펩티드 ： 제 1 번째 ～ 제 26 번째의 아미노산) 을 말한다. 여기서, 항원에 사용하는 펩티드에 대해, 상기 「아미노산 배열의 적어도 일부」란, 길이가 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 배열 번호 2 로 표시되는 아미노산 배열 중 제 1 번째 ～ 제 145 번째의 아미노산을 포함하는 영역이나, 당해 아미노산 배열 중 제 146 번째 ～ 제 274 번째의 아미노산을 포함하는 영역 등이 바람직하다.
항원으로 하는 펩티드의 제조 방법은 화학 합성이거나, 대장균 등을 사용하는 유전자 공학적 수법에 의한 합성이어도 되고, 당업자에게 주지인 방법을 사용할 수 있다.
펩티드의 화학 합성을 실시하는 경우에는, 펩티드 합성의 주지 방법에 의해 합성할 수 있다. 또, 그 합성은 고상 합성법 및 액상 합성법 중 어느 것이나 적용할 수 있다. 시판되는 펩티드 합성 장치 (예를 들어, 시마즈 제작소 제조 ： PSSM-8 등) 를 사용해도 된다.
펩티드를 유전자 공학적으로 합성하는 경우에는, 먼저, 당해 펩티드를 코드하는 DNA 를 설계하여 합성한다. 당해 설계 및 합성은, 예를 들어, 전체 길이 hTROP-2 유전자를 포함하는 벡터 등을 주형으로 하고, 원하는 DNA 영역을 합성할 수 있도록 설계한 프라이머를 이용하여, PCR 법에 의해 실시할 수 있다. 그리고, 상기 DNA 를 적당한 벡터에 연결함으로써 단백질 발현용 재조합 벡터를 얻고, 이 재조합 벡터를 목적 유전자가 발현될 수 있도록 숙주 중에 도입함으로써 형질 전환체를 얻는다 (Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001).
벡터에는, 숙주 미생물에서 자율적으로 증식할 수 있는 파지 또는 플라스미드가 사용된다. 또한, 동물 바이러스, 곤충 바이러스 벡터를 사용할 수도 있다. 재조합 벡터의 제조는 정제된 DNA 를 적당한 제한 효소로 절단하고, 적당한 벡터 DNA 의 제한 효소 부위 등에 삽입하여 벡터에 연결하면 된다. 형질 전환에 사용하는 숙주로서는, 목적으로 하는 유전자를 발현할 수 있는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 세균 (대장균, 고초균 등), 효모, 동물 세포 (COS 세포, CHO 세포 등), 곤충 세포 또는 곤충을 들 수 있다. 염소 등의 포유 동물을 숙주로서 사용하는 것도 가능하다. 숙주에의 재조합 벡터의 도입 방법은 공지이다.
그리고, 상기 형질 전환체를 배양하고, 그 배양물로부터 항원으로서 사용되는 펩티드를 채취한다. 「배양물」이란, (a) 배양 상청, (b) 배양 세포 혹은 배양 균체 또는 그 파쇄물 중 어느 것이나 의미하는 것이다.
배양 후, 목적 펩티드가 균체 내 또는 세포 내에 생산되는 경우에는, 균체 또는 세포를 파쇄함으로써 펩티드를 추출한다. 또, 목적 펩티드가 균체 외 또는 세포 외에 생산되는 경우에는, 배양액을 그대로 사용하거나, 원심 분리 등에 의해 균체 또는 세포를 제거한다. 그 후, 펩티드의 단리 정제에 사용되는 일반적인 생화학적 방법, 예를 들어 황산암모늄 침전, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등을 단독으로 또는 적절히 조합하여 사용함으로써, 목적으로 하는 펩티드를 단리 정제할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 무세포 합성계를 사용한 in vitro 번역에 의해 항원이 되는 펩티드를 얻을 수도 있다. 이 경우에는, RNA 를 주형으로 하는 방법과 DNA 를 주형으로 하는 방법 (전사/번역) 의 2 가지 방법을 사용할 수 있다. 무세포 합성계로서는, 시판되는 시스템, 예를 들어 ExpresswayTM 시스템 (인비트로젠사), PURESYSTEM (등록상표 ； 포스트 게놈 연구소), TNT 시스템 (등록상표 ； 프로메가사) 등을 사용할 수 있다.
상기와 같이 얻어진 펩티드는 적당한 캐리어 단백질, 예를 들어 소 혈청 알부민 (BSA), 키홀림펫 헤모시아닌 (KLH), 인간 티로글로불린, 닭 감마글로불린 등에 결합하는 것도 가능하다.
또 항원은 hTROP-2 의 아미노산 배열 (배열 번호 2) 또는 전술한 그 부분 배열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드이어도 된다. 예를 들어, hTROP-2 의 아미노산 배열 또는 그 부분 배열 중 1 또는 복수개 (바람직하게는 1 개 또는 수 개 (예를 들어 1 개 ～ 10 개, 더욱 바람직하게는 1 개 ～ 5 개)) 의 아미노산이 결실되어 있고, 1 또는 복수개 (바람직하게는 1 개 또는 수 개 (예를 들어 1 개 ～ 10 개, 더욱 바람직하게는 1 개 ～ 5 개)) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어 있고, 혹은, 1 또는 복수개 (바람직하게는 1 개 또는 수 개 (예를 들어 1 개 ～ 10 개, 더욱 바람직하게는 1 개 ～ 5 개)) 의 다른 아미노산이 부가된 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드를 사용할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 세포 등에 도입하기 위한 유전자로서는, hTROP-2 단백질 혹은 그 부분 단편 또는 이들의 변이형의 단백질 또는 단편을 코드하는 유전자를 들 수 있다. 그러한 유전자로서는, 예를 들어, 배열 번호 1 로 표시되는 염기 배열 또는 그 부분 배열을 갖는 것을 사용할 수 있다.
또, 세포 등에 도입하기 위한 유전자로서는, 배열 번호 1 로 표시되는 염기 배열에 상보적인 배열과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고 또한 hTROP-2 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 배열, 또는 그 부분 배열을 사용하는 것도 가능하다.
「스트린젠트한 조건」이란, 하이브리다이즈시킨 후의 세정시의 조건으로서, 버퍼의 염 (나트륨) 농도가 10 ～ 500 mM 이고, 온도가 42 ℃ ～ 72 ℃, 바람직하게는 상기 염 농도가 50 ～ 300 mM 이고, 온도가 55 ～ 68 ℃ 에서의 조건을 말한다.
유전자에 변이를 도입하려면, Kunkel 법이나 Gapped duplex 법 등의 공지 수법에 의해, 예를 들어 부위 특이적 돌연변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트, 예를 들어 GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System (인비트로젠사 제조), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km 등 ： 다카라 바이오사 제조) 을 이용하여 실시할 수 있다.
(2) 폴리클로날 항체의 제조
조제한 항원을 면역을 위해 포유 동물에게 투여한다. 포유 동물은 특별히 한정은 되지 않고, 예를 들어 래트, 마우스 및 토끼 등을 들 수 있고, 그 중에서도 마우스가 바람직하다.
항원의 동물 한마리당 투여량은 아쥬반트의 유무에 의해 적절히 설정할 수 있다. 아쥬반트로서는, 프로인트 완전 아쥬반트 (FCA), 프로인트 불완전 아쥬반트 (FIA), 수산화알루미늄 아쥬반트 등을 들 수 있다. 면역은 주로 정맥 내, 족척, 피하, 복강 내 등에 주입함으로써 실시할 수 있다. 또, 면역의 간격에 대해서는 특별히 한정되지 않고, 수 일 내지 수 주일 간격, 바람직하게는 1 주일 간격으로 1 ～ 10 회, 바람직하게는 2 ～ 3 회 면역을 실시한다. 그리고, 최종 면역일로부터 3 ～ 7 일 후에, 효소 면역 측정법 (ELISA 또는 EIA) 이나 방사성 면역 측정법 (RIA) 등으로 항체가를 측정하고, 원하는 항체가를 나타낸 날에 채혈하여, 항혈청을 얻을 수 있다. 상기 항체의 채취 방법에 있어서, 항체의 정제가 필요로 되는 경우에는, 유안 염석법, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등의 공지된 방법을 적절히 선택하고, 또는 이들을 조합함으로써 정제할 수 있다. 그 후에는, 항혈청 중의 폴리클로날 항체의 반응성을 ELISA 법 등으로 측정한다.
(3) 모노클로날 항체의 제조
(3-1) 항체 산생 세포의 채취
본 발명의 항 hTROP-2 항체는 한정은 되지 않지만, 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.
조제한 항원을 면역을 위해 포유 동물, 예를 들어 래트, 마우스 및 토끼 등에게 투여한다. 항원의 동물 한마리당 투여량은 아쥬반트의 유무에 의해 적절히 설정할 수 있다. 아쥬반트로서는 상기와 동일하다. 면역 수법도 상기와 동일하다. 그리고, 최종 면역일로부터 1 ～ 60 일 후, 바람직하게는 1 ～ 14 일 후에 항체 산생 세포를 채취한다. 항체 산생 세포로서는, 비장 세포, 림프절 세포 및 말초혈 세포 등을 들 수 있는데, 그 중에서도 림프절 세포 및 비장 세포가 바람직하다.
(3-2) 세포 융합
하이브리도마 (항체 산생 세포주) 를 얻기 위해, 항체 산생 세포와 미에로마 세포의 세포 융합을 실시한다. 항체 산생 세포와 융합시키는 미에로마 세포로서, 마우스 등의 동물의 일반적으로 입수 가능한 주화 세포를 사용할 수 있다. 사용하는 세포주로서는, 약제 선택성을 가지며, 미융합 상태에서는 HAT 선택 배지 (히폭산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함한다) 에서 생존할 수 없어, 항체 산생 세포와 융합한 상태에서만 생존할 수 있는 성질을 갖는 것이 바람직하다.
미에로마 세포로서는, 예를 들어, P3-X63-Ag8.653, P3-X63-Ag8 (X63), P3-X63-Ag8.U1 (P3U1), P3/NS I/1-Ag4-1 (NS1) 및 Sp2/0-Ag14 (Sp2/0) 등의 마우스 미에로마 세포주를 들 수 있다. 미에로마 세포의 선택은 항체 산생 세포와의 적합성을 적절히 고려하여 실시할 수 있다.
이어서, 미에로마 세포와 항체 산생 세포를 세포 융합시킨다. 세포 융합은, 혈청을 포함하지 않는 DMEM 및 RPMI-1640 배지 등의 동물 세포용 배지 중에서, 1 × 106 ～ 1×107 개/㎖ 의 항체 산생 세포와 2 × 105 ～ 2 × 106 개/㎖ 의 미에로마 세포를 혼합한다. 항체 산생 세포와 미에로마 세포의 세포비 (항체 산생 세포 ： 미에로마 세포) 는 한정은 되지 않지만, 통상적으로 1 ： 1 ～ 10 ： 1 로 하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 3 ： 1 이다. 다음으로, 세포 융합 촉진제의 존재하에서 융합 반응을 실시한다. 세포 융합 촉진제로서 예를 들어, 평균 분자량 1,000 ～ 6,000 달톤 (D) 의 폴리에틸렌글리콜 등을 사용할 수 있다. 또, 전기 자극 (예를 들어 일렉트로포레이션) 을 이용한 시판되는 세포 융합 장치를 사용하여, 항체 산생 세포와 미에로마 세포를 융합시킬 수도 있다.
(3-3) 하이브리도마의 선별 및 클로닝
세포 융합 처리 후의 세포로부터 목적으로 하는 하이브리도마를 선별한다. 그 방법으로서, 세포 현탁액을, 예를 들어 소 태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지 등에 적당히 희석 후, 마이크로타이터 플레이트 상에 뿌리고, 각 웰에 선택 배지를 첨가하고, 이후 적당히 선택 배지를 교환하여 배양을 실시한다. 그 결과, 선택 배지에서 배양 개시 후, 14 일 전후부터 생육되어 오는 세포를 하이브리도마로서 얻을 수 있다.
다음으로, 증식되어 온 하이브리도마의 배양 상청 중에, hTROP-2 에 반응하는 항체가 존재하는지의 여부를 스크리닝한다. 하이브리도마의 스크리닝은 통상적인 방법에 따르면 되고, 특별히 한정은 되지 않는다. 예를 들어, 하이브리도마로서 생육된 웰에 포함되는 배양 상청의 일부를 채취하여, ELISA, EIA 및 RIA 등에 의해 스크리닝할 수 있다.
융합 세포의 클로닝은 한계 희석법 등에 의해 실시할 수 있다. hTROP-2 에 강한 반응성을 나타내는 항체를 플로사이토메트리 등에 의해 판정하고, 이것을 산생하는 하이브리도마를 선택하여 클론으로서 수립한다.
(3-4) 모노클로날 항체의 채취
수립한 하이브리도마를 배양하여, 얻어지는 배양물로부터 모노클로날 항체를 채취하는 방법으로서, 통상적인 세포 배양법, 또는 복수 (腹水) 형성법 등을 채용할 수 있다. 「배양」이란, 하이브리도마를 배양 접시 또는 배양 보틀 중에서 생육시키는 것, 혹은 하이브리도마를 하기와 같이 동물의 복강 내에서 증식시키는 것을 의미한다.
세포 배양법에 있어서는, 하이브리도마를 10 ％ 소 태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지, MEM 배지 또는 무혈청 배지 등의 동물 세포 배양 배지 중에서, 통상적인 배양 조건 (예를 들어 37 ℃, 5 ％ CO2 농도) 에서 7 ～ 14 일간 배양하고, 그 배양 상청으로부터 항체를 취득할 수 있다.
복수 형성법의 경우에는, 미에로마 세포 유래의 포유 동물과 동종계 동물의 복강 내에 하이브리도마를 약 1 x 107 개 투여하여, 하이브리도마를 대량으로 증식 시킨다. 그리고, 2 ～ 3 주일 후에 복수를 채취하는 것이 바람직하다.
상기 항체의 채취 방법에 있어서, 항체의 정제가 필요하게 되는 경우에는, 유안 염석법, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과, 어피니티 크로마토그래피 등의 공지된 방법을 적절히 선택하고, 또는 이들을 조합시킴으로써 정제할 수 있다.
(3-5) 항종양 활성을 갖는 클론의 선별
본 발명의 항 hTROP-2 항체는 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항체이다.
여기서, 「항종양 활성」이란, 종양 세포 (암 세포) 를 사멸시키는 활성 또는 종양 성장을 저해하는 활성을 의미한다. 항종양 활성으로서는, 예를 들어, 암 세포의 증식 저해 활성이나 종양 혈관 신생 저해 활성을 바람직하게 들 수 있다. 또, 본 발명의 항체가 항종양 활성을 발휘할 수 있는 인간 종양 (종양 세포) 의 종류로서는, hTROP-2 의 발현이 확인되고 있는 공지된 각종 인간 종양을 들 수 있고, 특별히 한정은 되지 않지만, 예를 들어, 인간 췌암, 인간 전립선암, 인간 대장암 및 인간 유방암 중 1 종 또는 2 종 이상을 바람직하게 들 수 있고, 보다 바람직하게는 인간 췌암이다. 또한, 상기 종양의 종류로서는, 재발암이나 전이암이어도 되고, 본 발명의 항체는 이것들에게 종양에 대해서도 우수한 항종양 활성을 발휘할 수 있다.
in vivo 에서의 항종양 활성의 확인은, 예를 들어, 원하는 종양 세포를 마우스의 피하에 이식한 담암 마우스 (담암 동물 치료 모델) 를 이용하여, 이 마우스에 상기와 같이 얻어진 항체를 투여함으로써 실시할 수 있다. 이 경우, 항체의 투여는 종양 세포의 이식 직후부터 실시해도 되고 (Prevention 모델), 이식으로 종양이 소정의 체적이 된 것을 확인하고 나서 실시해도 된다 (Treatment 모델). 투여 방법은 한정은 되지 않지만, 예를 들어, 3 일, 1 주일, 10 일 또는 2 주일에 1 회 혹은 단회 (1 회만) 로, 5 ～ 20 ㎎/㎏ 체중, 복강 내 투여 등으로 할 수 있다. Prevention 모델의 경우에는, 종양 형성 빈도와 종양 체적에 의해 항종양 활성의 유무 및 레벨을 평가할 수 있다. Treatment 모델의 경우에는, 종양 체적에 의해 항종양 활성의 유무 및 레벨을 평가할 수 있다.
본 발명에 있어서, in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항 hTROP-2 항체로서는, 예를 들어, H 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 36 ～ 38 로 표시되는 아미노산 배열이고, 및/또는, L 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 41 ～ 43 으로 표시되는 아미노산 배열인 것을 바람직하게 들 수 있다. 당해 H 사슬 V 영역으로서는, 예를 들어, 배열 번호 35 로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 것이 바람직하고, 당해 L 사슬 V 영역으로서는, 예를 들어, 배열 번호 40 으로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 것이 바람직하다.
또 본 발명의 항 hTROP-2 항체의 다른 양태로서는, 예를 들어, H 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 46 ～ 48 로 표시되는 아미노산 배열이고, 및/또는, L 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 51 ～ 53 으로 표시되는 아미노산 배열인 것을 바람직하게 들 수 있다. 당해 H 사슬 V 영역으로서는, 예를 들어, 배열 번호 45 로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 것이 바람직하고, 당해 L 사슬 V 영역으로서는, 예를 들어, 배열 번호 50 으로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 것이 바람직하다.
동일하게, 본 발명의 항 hTROP-2 항체의 다른 양태로서는, 예를 들어, H 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 56 ～ 58 로 표시되는 아미노산 배열이고, 및/또는, L 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 61 ～ 63 으로 표시되는 아미노산 배열인 것을 바람직하게 들 수 있다. 당해 H 사슬 V 영역으로서는, 예를 들어, 배열 번호 55 로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 것이 바람직하고, 당해 L 사슬 V 영역으로서는, 예를 들어, 배열 번호 60 으로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 것이 바람직하다.
동일하게, 본 발명의 항 hTROP-2 항체의 다른 양태로서는, 예를 들어, H 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 66 ～ 68 로 표시되는 아미노산 배열이고, 및/또는, L 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 71 ～ 73 으로 표시되는 아미노산 배열인 것을 바람직하게 들 수 있다. 당해 H 사슬 V 영역으로서는, 예를 들어, 배열 번호 65 로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 것이 바람직하고, 당해 L 사슬 V 영역으로서는, 예를 들어, 배열 번호 70 으로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항 hTROP-2 항체로서는, 보다 구체적으로는, 예를 들어, 수령 번호가 FERM BP-11251 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (클론명 ： K5-70), 수령 번호가 FERM BP-11252 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (클론명 ： K5-107), 수령 번호가 FERM BP-11253 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (클론명 ： K5-116-2-1), 수령 번호가 FERM BP-11346 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (클론명 ： T6-16) 및 수령 번호가 FERM BP-11254 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (클론명 ： T5-86) 등을 바람직하게 들 수 있다.
여기서, 수령 번호가 FERM BP-11251 인 하이브리도마는 「Mouse-Mouse Hybridoma K5-70」이라고 칭하여 2010 년 5 월 12 일부로, 수령 번호가 FERM BP-11252 인 하이브리도마는 「Mouse-Mouse Hybridoma K5-107」이라고 칭하여 2010 년 5 월 12 일부로, 수령 번호가 FERM BP-11253 인 하이브리도마는 「Mouse-Mouse Hybridoma K5-116-2-1」이라고 칭하여 2010 년 5 월 12 일부로, 수령 번호가 FERM BP-11346 인 하이브리도마는 「Mouse-Mouse Hybridoma T6-16」이라고 칭하여 2011 년 3 월 1 일부로, 수령 번호가 FERM BP-11254 인 하이브리도마는 「Mouse-Mouse Hybridoma T5-86」이라고 칭하여 2010 년 5 월 12 일부로, 모두 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 ((우) 305-8566 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 제 6) 에 기탁된 것이다.
또한, 본 발명의 항 hTROP-2 항체로서는, 예를 들어, 수령 번호가 FERM BP-11251, FERM BP-11252, FERM BP-11253, FERM BP-11346 또는 FERM BP-11254 인 하이브리도마에 의해 산생되는 모노클로날 항체가 결합 (인식) 하는 부위 (예를 들어 에피토프) 에 결합하는 항 hTROP-2 항체도 바람직하게 들 수 있다. 에피토프로서는, 하기 (3-6) 항에 있어서 예시하는 것을 바람직하게 들 수 있다.
(3-6) 항 hTROP-2 항체의 에피토프
본 발명의 항 hTROP-2 항체의 에피토프 (항원 결정기) 는 항원인 hTROP-2 의 적어도 일부이면 되고 한정은 되지 않지만, 예를 들어, 배열 번호 2 로 표시되는 hTROP-2 의 아미노산 배열 중의, 제 252 번째 ～ 제 260 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역을 제외한 영역의 적어도 일부인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 제 1 번째 ～ 제 69 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역의 적어도 일부 또는 제 100 번째 ～ 제 274 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역 (제 252 번째 ～ 제 260 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역을 제외한다) 의 적어도 일부이고, 더욱 바람직하게는 제 27 번째 ～ 제 69 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역의 적어도 일부 또는 제 109 번째 ～ 제 206 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역의 적어도 일부이다. 상기 에피토프로서 특히 바람직하게는, 배열 번호 2 로 표시되는 hTROP-2 의 아미노산 배열 중의, 제 43 번째 ～ 제 65 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 제 152 번째 ～ 제 165 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 제 171 번째 ～ 제 183 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 제 109 번째 ～ 제 120 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 제 193 번째 ～ 제 206 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 및 제 43 번째 ～ 제 56 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 그리고 이들을 포함하는 부분이고, 그 중에서도 특히 바람직한 것은 제 43 번째 ～ 제 65 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 제 152 번째 ～ 제 165 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 제 171 번째 ～ 제 183 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 및 제 109 번째 ～ 제 120 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 그리고 이들을 포함하는 부분이다. 당해 영역을 인식하는 (당해 영역 또는 그것을 포함하는 부분과 결합한다) 항 hTROP-2 항체는, 예를 들어, 종양 세포 내에의 인터나리제이션 활성이 높아, 후술하는 이무노콘쥬게이트 등의 용도에 매우 유용한 것이다.
(3-7) 항 hTROP-2 항체의 특성
본 발명의 항 hTROP-2 항체는, 전술한 바와 같이, 저용량으로 높은 in vivo 항종양 활성을 갖는 항체이다. 구체적으로는, 담암 동물 모델에 대해 20 ㎎/㎏ 체중 이하 (바람직하게는 10 ㎎/㎏ 체중 이하, 보다 바람직하게는 5 ㎎/㎏ 체중 이하, 더욱 바람직하게는 1 ㎎/㎏ 체중 이하) 의 투여량 (나체 항체) 으로 50 ％ 이상 (바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 90 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 95 ％ 이상, 특히 바람직하게는 거의 100 ％ (예를 들어 98 ％ 이상 또는 99 ％ 이상)) 의 종양 성장 저해 활성을 나타내는 것이 바람직하다.
여기서, 종양 성장 저해 활성 (％) 은, 예를 들어, 하기 식에 의해 산출할 수 있다.
종양 성장 저해 활성 (％) = 100 －〔(항체 투여군의 종양 체적 또는 종양 중량) ÷ (대조군의 종양 체적 또는 종양 중량)〕 × 100
또, 본 발명의 항 hTROP-2 항체는 2 종 이상의 인간 종양 세포주에 대해 항종양 활성을 갖는 것이 바람직하다. 인간 종양 세포주로서는 한정은 되지 않지만, 예를 들어, 각종 인간 췌암 세포주, 인간 전립선암 세포주, 인간 대장암 세포주 및 인간 유방암 세포주로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2 종을 들 수 있고, 구체적으로는, 인간 췌암 세포주 PK-59, 인간 췌암 세포주 BxPC-3, 인간 췌암 세포주 KP-3L, 인간 췌암 세포주 KP-2, 인간 췌암 세포주 PK-1, 인간 췌암 세포주 PK-45H, 인간 췌암 세포주 PK-45P, 인간 췌암 세포주 TCC-PAN2, 인간 췌암 세포주 SUIT-2, 인간 대장암 세포주 CACO-2, 인간 대장암 세포주 SW480, 인간 대장암 세포주 DLD-1, 인간 대장암 세포주 HCT 116, 인간 유방암 세포주 JIMT-1, 인간 유방암 세포주 HCC1143, 인간 유방암 세포주 MCF-7, 인간 전립선암 세포주 DU145 및 인간 전립선암 세포주 PC-3 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2 종을 바람직하게 들 수 있다. 그 중에서도, 상기 2 종 이상의 인간 종양 세포주로서는, 인간 췌암 세포주 PK-59 및 인간 췌암 세포주 BxPC-3 을 보다 바람직하게 들 수 있다.
또한, 본 발명의 항 hTROP-2 항체는 해리 정수 (Kd 값) 가 1.0 × 10-10 M 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1.0 × 10-11 M 이하이고, 더욱 바람직하게는 1.0 × 10-12 M 이하이다. 여기서, 항체의 결합능 (친화성) 은, 예를 들어, 스캐차드 해석이나 Biacore 로 불리는 표면 플라즈몬 공명 센서에 의해, 해리 정수 (Kd 값), 해리 속도 정수 (Kdiss [1/Sec]), 결합 속도 정수 (Kass [1/M.Sec]) 로서 측정할 수 있다. Biacore 장치로서는, 예를 들어 Biacore 3000, Biacore 2000, Biacore X, Biacore J, Biacore Q (모두 Biacore 사) 등을 들 수 있다. 항체는 해리 정수 (Kd 값) 가 작은 값일수록 결합능 (친화성) 이 높다는 점에서 바람직하다. Kd 값은 Kdiss 및 Kass 의 2 개의 파라미터에 의해 결정되고, 예를 들어, 식 ： Kd[M] = Kdiss/Kass 에 의해 나타낼 수 있다. 또한, Kd 값의 산출 방법에 대해서는, 후술하는 실시예 (구체적으로는 실시예 10) 에 기재된 방법도 바람직하게 채용할 수 있다.
(4) 유전자 재조합 항체, 및 항체 단편
(4-1) 유전자 재조합 항체
본 발명의 항 hTROP-2 항체의 바람직한 양태의 하나로서, 유전자 재조합 항체를 들 수 있다. 유전자 재조합 항체로서는 한정은 되지 않지만, 예를 들어, 키메라 항체, 인간형화 항체 및 인간 항체 등을 들 수 있다.
키메라 항체 (즉 인간형 키메라 항체) 는 마우스 유래 항체의 가변 영역을 인간 유래의 정상 영역에 연결 (접합) 한 항체로 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855, (1984) 등을 참조), 키메라를 제조하는 경우에는, 그와 같이 연결한 항체가 얻어지도록, 유전자 재조합 기술에 의해 용이하게 구축할 수 있다.
인간형화 항체를 제조하는 경우에는, 마우스 항체의 가변 영역으로부터 상보성 결정 영역 (CDR) 을 인간 가변 영역에 이식하고, 프레임 워크 영역 (FR) 은 인간 유래의 것으로 CDR 은 마우스 유래의 것으로 이루어지는, 재구성한 가변 영역을 제조한다 (이른바 CDR 그래프팅 (CDR 이식)). 다음으로, 이들의 인간형화된 재구성 인간 가변 영역을 인간 정상 영역에 연결한다. 이와 같은 인간형화 항체의 제조법은 당 분야에 있어서 주지이다 (Nature, 321, 522-525 (1986) ； J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987) ； Queen C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 : 10029-10033 (1989) ； 일본 공표특허공보 평4-502408호 (특허 제2828340호 공보； 퀸 등) 등을 참조).
인간 항체 (완전 인간 항체) 는, 일반적으로 V 영역의 항원 결합 부위인 초가변 영역 (Hyper Variable region), V 영역의 그 밖의 부분 및 정상 영역의 구조가, 인간의 항체와 동일한 구조를 갖는 것이다. 단, 초가변 부위는 다른 동물 유래이어도 된다. 인간 항체를 제조하는 기술도 공지이며, 인간에게 공통의 유전자 배열에 대해서는 유전자 공학적 수법에 의해 제조하는 방법이 확립되어 있다. 인간 항체는, 예를 들어, 인간 항체의 H 사슬 및 L 사슬의 유전자를 포함하는 인간 염색체 단편을 갖는 인간 항체 산생 마우스를 사용한 방법 (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics, (1977) 16, 133-143 ; Kuroiwa, Y. et.al., Nuc. Acids Res., (1998) 26, 3447-3448 ; Yoshida, H. et.al., Animal Cell Technology : Basic and Applied Aspects, (1999) 10, 69-73 (Kitagawa, Y.,Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers ; Tomizuka, K. et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000) 97, 722-727 등을 참조) 이나, 인간 항체 라이브러리에서 선별한 파지 디스플레이 유래의 인간 항체를 취득하는 방법 (Wormstone, I.M. et.al, Investigative Ophthalmology & Visual Science., (2002) 43 (7), 2301-8 ; Carmen, S. et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics, (2002) 1 (2), 189-203 ; Siriwardena, D. et.al., Opthalmology, (2002) 109 (3), 427-431 등을 참조) 에 의해 취득할 수 있다.
상기 키메라 항체, 인간형 항체 및 인간 항체는 항체 Fc 영역에 있어서의 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬이 그 당 사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되어 있지 않는 당 사슬인 것이 바람직하고, 상세하게는, 그 푸코오스의 1 위치가 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 α 결합되어 있지 않는 당 사슬을 항체 분자의 Fc 영역에 갖는 유전자 재조합 항체 분자로 이루어지는 항체를 들 수 있다. 이와 같은 항체이면, ADCC 활성을 비약적으로 향상시킬 수 있다. 또한, 이 점 (항체 Fc 영역에 있어서의 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬의 특징) 은 전술한 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체에 대해서도 동일하게 바람직하다.
(4-2) 항체 단편
본 발명의 항 hTROP-2 항체의 단편 (부분 단편) 도 본 발명의 항체에 포함되는 것으로 한다. 여기서, 본 발명의 항체 단편은, 본 발명의 항 hTROP-2 항체와 동일하게, hTROP-2 에 대한 결합 활성을 갖는 것 (즉 hTROP-2 에 결합할 수 있는 것) 으로서 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 것이다.
당해 항체의 단편으로서는, 항 hTROP-2 폴리클로날 항체 또는 항 hTROP-2 모노클로날 항체의 일부분의 영역 (즉, 본 발명의 항 hTROP-2 항체에서 유래하는 항체 단편) 을 의미하고, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv (variable fragment of antibody), 단일 사슬 항체 (H 사슬, L 사슬, H 사슬 V 영역, 및 L 사슬 V 영역 등), scFv, diabody (scFv 2 량체), dsFv (디술파이드 안정화 V 영역), 그리고, 상보성 결정 영역 (complementarity determining region ： CDR) 을 적어도 일부에 포함하는 펩티드 등을 들 수 있다.
Fab 는, 항체 분자를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리하여 얻어지는 단편 중, H 사슬의 N 말단측 약 절반과 L 사슬 전체가 디술파이드 결합으로 결합한, 분자량 약 5 만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 또, 항체의 Fab 를 코드하는 DNA 를, 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 Fab 를 제조할 수도 있다.
F(ab')2 는, 항체 분자를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리하여 얻어지는 단편 중, Fab 가 힌지 영역의 디술파이드 결합을 통하여 결합된 것보다 약간 큰, 분자량 약 10 만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 또, 후술하는 Fab 를 티오에테르 결합 혹은 디술파이드 결합시켜 제조할 수도 있다.
Fab' 는, 상기 F(ab')2 의 힌지 영역의 디술파이드 결합을 절단한, 분자량 약 5 만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 또, 항체의 Fab' 단편을 코드하는 DNA 를, 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 Fab' 를 제조할 수도 있다.
scFv 는, 1 개의 H 사슬 V 영역 (VH) 과 1 개의 L 사슬 V 영역 (VL) 을 적당한 펩티드 링커 (P) 를 이용하여 연결한, VH-P-VL 내지는 VL-P-VH 폴리펩티드로, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. scFv 는, 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 를 취득하고, scFv 를 코드하는 DNA 를 구축하여, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.
diabody 는, scFv 가 2 량체화된 항체 단편으로, 2 가의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 2 가의 항원 결합 활성은 동일한 것일 수도 있고, 일방을 상이한 항원 결합 활성으로 할 수도 있다. diabody 는, 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 를 취득하고, scFv 를 코드하는 DNA 를 P 의 아미노산 배열의 길이가 8 잔기 이하가 되도록 구축하여, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.
dsFv 는, VH 및 VL 중의 각각 1 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩티드를, 그 시스테인 잔기간의 디술파이드 결합을 통하여 결합시킨 것을 말한다. 시스테인 잔기로 치환하는 아미노산 잔기는, Reiter 등에 의해 나타낸 방법 (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994) 에 따라, 항체의 입체 구조 예측에 기초하여 선택할 수 있다. dsFv 는, 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 를 취득하고, dsFv 를 코드하는 DNA 를 구축하여, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.
CDR 을 포함하는 펩티드는 VH 의 CDR (CDR 1 ～ 3) 및 VL 의 CDR (CDR 1 ～ 3) 중의 적어도 1 영역 이상을 포함하여 구성되고, VH 의 CDR 을 모두 포함하는 것, 및 VL 의 CDR 을 모두 포함하는 것이 보다 바람직하고, VH 및 VL 의 CDR (합계 6 영역) 을 모두 포함하는 것이 특히 바람직하다. CDR 의 아미노산 배열로서는, 예를 들어, 전술한 배열 번호 36 ～ 38, 41 ～ 43, 46 ～ 48, 51 ～ 53, 56 ～ 58, 61 ～ 63, 66 ～ 68 및 71 ～ 73 으로 표시되는 아미노산 배열을 바람직하게 들 수 있다. 복수의 CDR 을 포함하는 펩티드는 직접 또는 적당한 펩티드 링커를 통하여 결합시킬 수 있다. CDR 을 포함하는 펩티드는 항체의 VH 및 VL 의 CDR 을 코드하는 DNA 를 구축하고, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하여, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다. 또, CDR 을 포함하는 펩티드는 Fmoc 법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐법) 및 tBoc 법 (t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.
본 발명의 항체 단편으로서는, 그대로의 형상으로 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬이 그 당 사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되어 있지 않는 당 사슬인 항체 Fc 영역의 일부 또는 전부를 포함하는 항체 단편이어도 되고, 또, 상기 서술한 항체 단편과 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬이 그 당 사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되어 있지 않는 당 사슬인 항체 Fc 영역의 일부 또는 전부와의 융합 단백질이어도 된다. 이와 같은 항체 단편이면, ADCC 활성을 비약적으로 향상시킬 수 있기 때문에 바람직하다.
이하, 본 명세서 중의 설명에 있어서는, 상기 서술한 항체 단편도 본 발명의 항 hTROP-2 항체에 포함되는 것으로 한다.
3. 항체-약제 복합체의 제조
상기 본 발명의 항 hTROP-2 항체를 사용한 이무노콘쥬게이트 등으로서, 당해 항체와 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 물질 (화합물 등) 을 포함하는, 항체-약제 복합체를 제공할 수 있다. 또한, 미리, 당해 항체 분자와 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 물질을 각각 조제한 후, 이들을 복합화시켜 얻어진 것은 일반적으로 이무노콘쥬게이트라고 불린다. 또, 유전자 재조합 기술을 이용하여 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 물질로서의 단백질 톡신을, 유전자 상에서 항체 유전자와 연결시켜, 1 개의 단백질 (융합 단백질) 로서 발현시켜 얻어진 것은 일반적으로 이무노톡신이라고 불린다.
항종양 활성을 갖는 물질로서는, 예를 들어, 독소루비신, 칼리키아마이신, 마이토마이신 C, Auristatin E, 방사성 동위체 (RI) 등을 들 수 있다. 살세포 활성을 갖는 물질로서는, 예를 들어, 사포린, 리신, 녹농균 외독소, 디프테리아톡신, 방사성 동위체 (RI) 등을 들 수 있고, 그 중에서도 사포린 및 녹농균 외독소가 바람직하게 사용된다. 또한, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 RI 로서는 한정은 되지 않지만, 예를 들어, 90Y, 111In, 125I, 3H, 35S, 14C, 186Re, 188Re, 189Re, 177Lu, 67Cu, 212Bi, 213Bi, 211At, 198Au, 224Ac, 126I, 133I, 77Br, 113 mIn, 95Ru, 97Ru, 103Ru, 105Ru, 107Hg, 203Hg, 94 mTc, 121 mTe, 122 mTe, 125 mTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm, 111Ag, 197Pt, 109Pd, 32P, 33P, 47Sc, 153Sm, 177Lu, 105Rh, 142Pr, 143Pr, 161Tb, 166Ho, 199Au, 57Co, 58Co, 51Cr, 59Fe, 18F, 75Se, 201Tl, 225Ac, 76Br, 86Y, 169Yb, 166Dy, 212Pb 및 223 Ra 등을 들 수 있다.
항체-약제 복합체의 제조 방법으로서는 한정은 되지 않지만, 예를 들어, 디술파이드 결합이나 히드라존 결합에 의해 항체와 약제를 커플링하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 본 발명의 항 hTROP-2 항체는 hTROP-2 를 발현하는 표적 종양 세포 내에의 인터나리제이션 활성이 우수한 것이다. 그 때문에, 미리 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 물질을 복합화시켜 둠으로써, 이들 물질을 종양 세포에 직접 또한 고선택적으로 작용시킬 수 있다. 본 발명의 항체-약제 복합체는 표적 종양 세포로의 약제 송달 능력이 매우 우수한 것이다.
또한, 세포 내에의 인터나리제이션 활성은, 항체를 로다민 등에 의해 형광 표식하고, 세포 내로의 이행 거동 및 항체의 국재성 (局在性) 에 대해 형광 현미경 등을 이용하여 관찰함으로써 평가할 수 있다.
또 본 발명에 있어서는, 항체-약제 복합체에 있어서, 항체 대신에 전술한 항체 단편을 사용한 항체 단편-약제 복합체를 제공할 수도 있다. 항체 단편-약제 복합체의 상세한 것에 대해서는, 상기 서술한 항체-약제 복합체의 설명을 적절히 적용할 수 있다.
이하, 본 명세서 중의 설명에 있어서는, 항체 단편-약제 복합체도 본 발명의 항체-약제 복합체에 포함되는 것으로 한다.
4. 의약 조성물
본 발명의 항 hTROP-2 항체 및 항체-약제 복합체는 의약 조성물에 포함되는 유효 성분으로서 유용하다.
당해 의약 조성물은 종양의 치료용 및/또는 진단용의 의약 조성물로서 유용하다. 특히, 본 발명의 항 hTROP-2 항체, 및 그 항체를 포함하는 항체-약제 복합체는, 항종양 활성으로서 우수한 종양 성장 저해 활성을 갖는 것이기 때문에, 종양의 치료용으로 사용되는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명의 항 hTROP-2 항체 및 항체-약제 복합체는 종양 치료제 및 종양 진단제에 포함되는 유효 성분으로서 유용한 것이다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 종양의 치료에는, 종양의 성장 저해 및 성장 억제의 의미도 포함하는 것으로 하고, 구체적으로는, 예를 들어 종양 치료제이면, 종양의 성장 저해제 및 성장 억제제의 형태도 포함하는 것으로 한다.
본 발명의 의약 조성물은 본 발명의 항 hTROP-2 항체 및/또는 항체-약제 복합체를 유효 성분으로서 포함하고, 또한 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물의 형태로 제공하는 것이 바람직하다. 또, 본 발명의 의약 조성물은 공지된 항종양제와의 병용도 할 수 있다. 병용에 의해 더욱 높은 항종양 효과가 얻어진다.
본 발명의 의약 조성물의 적용의 대상이 되는 질환 (종양) 으로서는, hTROP-2 의 발현이 확인되고 있는 전술한 공지된 각종 인간 종양을 들 수 있다. 그 중에서도 특히, 인간 췌암, 인간 전립선암, 인간 대장암 및 인간 유방암 중 1 종 또는 2 종 이상을 바람직하게 들 수 있다. 이들 질환은 단독이어도 되고, 2 개 이상이 병발해도 된다. 또, 대상이 되는 종양은 재발암이나 전이암이어도 되고, 본 발명의 의약 조성물 (나아가서는, 본 발명의 항 hTROP-2 항체 및/또는 항체-약제 복합체) 은 재발암이나 전이암의 치료제 및 진단제로서도 유효하게 사용할 수 있다.
「약학적으로 허용될 수 있는 담체」란, 부형제, 희석제, 증량제, 붕괴제, 안정제, 보존제, 완충제, 유화제, 방향제, 착색제, 감미제, 점조제, 교미제, 용해 보조제 혹은 그 밖의 첨가제 등을 들 수 있다. 그러한 담체의 1 종 이상을 사용함으로써, 주사제, 액제, 캡슐제, 현탁제, 유제 혹은 시럽제 등의 형태의 의약 조성물을 조제할 수 있다. 이들 의약 조성물은 경구 혹은 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구 투여를 위한 그 밖의 형태로서는, 1 개 이상의 활성 물질을 포함하고, 통상적인 방법에 의해 처방되는 주사제 등이 포함된다. 주사제의 경우에는, 생리 식염수 또는 시판되는 주사용 증류수 등의 약학적으로 허용되는 담체 중에 용해 또는 현탁함으로써 제조할 수 있다.
특히, 본 발명의 항 hTROP-2 항체 유래의 항체 단편 (그 중에서도 저분자인 것) 을 생체 내에 투여하는 경우에는, 상기에 추가하여, 콜로이드 분산계를 사용할 수 있다. 콜로이드 분산계는 화합물 (항체 단편) 의 생체 내의 안정성을 높이는 효과나, 특정한 장기, 조직 또는 세포에 화합물을 효율적으로 수송하는 효과가 기대된다. 콜로이드 분산계는 통상적으로 사용되는 것이면 되고 한정은 되지 않지만, 폴리에틸렌글리콜, 고분자 복합체, 고분자 응집체, 나노 캡슐, 미크로스페어, 비즈, 및 수중유계의 유화제, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 포함하는 지질을 베이스로 하는 분산계를 들 수 있고, 바람직하게는 특정한 장기, 조직 또는 세포에 화합물을 효율적으로 수송하는 효과가 있는 복수의 리포솜, 인공막의 소포이다 (Mannino et al., Biotechniques, 1988, 6, 682 ; Blume and Cevc, Biochem.et Biophys. Acta, 1990, 1029, 91 ; Lappalainen et al., Antiviral Res., 1994, 23, 119 ; Chonn and Cullis, Current Op. Biotech., 1995, 6, 698).
본 발명의 의약 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 체중 및 증상, 치료 효과, 투여 방법, 처리 시간, 혹은 의약 조성물에 함유되는 본 발명의 항 hTROP-2 항체 및 항체-약제 복합체의 종류 등에 따라 상이하다. 통상적으로, 성인 한 명당, 1 회에 대해 600 ㎍ 내지 6000 ㎎ 의 범위로 투여할 수 있는데, 이 범위에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어 주사제에 의해 투여하는 경우에는, 인간 환자에 대해, 1 회의 투여에 있어서 1 ㎏ 체중당 100 ㎍ ～ 100 ㎎ 의 양을, 1 일 평균당 1 회 ～ 수 회 투여해도 되고, 바람직하게는 3 일, 1 주일, 10 일 또는 2 주일에 1 회 투여하거나 혹은 단회 (합계 투여 횟수가 1 회) 투여하는 양태도 채용할 수 있다. 투여의 형태로서는, 정맥 내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 근육 내 주사 혹은 복강 내 주사 등을 들 수 있는데, 바람직하게는 정맥 내 주사이다. 또, 주사제는, 경우에 따라, 비수성의 희석제 (예를 들어 폴리에틸렌글리콜, 올리브유 등의 식물유, 에탄올 등의 알코올류 등), 현탁제 혹은 유탁제로서 조제할 수도 있다. 그러한 주사제의 무균화는 필터에 의한 여과 멸균, 살균제의 배합 등에 의해 실시할 수 있다. 주사제는 용시 조제의 형태로서 제조할 수 있다. 즉, 동결 건조법 등에 의해 무균의 고체 조성물로 하여, 사용 전에 무균의 주사용 증류수 또는 다른 용매에 용해하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은, 종양을 치료 및/또는 진단하는 의약 (약제) 을 제조하기 위한, 상기 본 발명의 항 hTROP-2 항체 및/또는 항체-약제 복합체의 사용을 제공하는 것이기도 하다. 또, 본 발명은 종양을 치료용 및/또는 진단용의, 상기 본 발명의 항 hTROP-2 항체 및/또는 항체-약제 복합체를 제공하는 것이기도 하다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 항 hTROP-2 항체 및/또는 항체-약제 복합체를 사용하는 (즉 환자에게 투여하는) 것을 특징으로 하는 종양의 치료 및/또는 진단 방법을 제공하는 것이고, 또, 종양을 치료 및/또는 진단하기 위한 상기 본 발명의 항 hTROP-2 항체 및/또는 항체-약제 복합체의 사용을 제공하는 것이기도 하다.
5. 종양의 검출 방법
본 발명의 종양의 검출 방법은 상기 본 발명의 항 hTROP-2 항체와, 생체로부터 채취된 시료 (이하, 생체 시료) 를 반응시키고, 반응한 항체의 시그널을 검출하는 것을 특징으로 하는 방법이다.
전술한 바와 같이, hTROP-2 는 각종 종양 세포에 있어서 특이적으로 발현하는 것이 확인되고 있기 때문에, hTROP-2, 특히 유리 hTROP-2 (hTROP-2 의 세포 외 영역 부분) 는 각종 종양 마커로서 이용하는 것이 가능하다. 그 중에서도, 인간 췌암, 인간 전립선암, 인간 대장암 및 인간 유방암의 마커로서 이용하는 것이 바람직하다.
그래서, 본 발명의 항 hTROP-2 항체를 생체 시료와 반응시키고, 반응한 항체의 시그널을 검출함으로써 종양을 검출할 수 있다. 얻어진 항체의 시그널은 생체 시료 중의 항원량 (즉 hTROP-2 량 또는 유리 hTROP-2 량) 의 지표가 된다. 본 발명의 항체를 사용한 종양의 검출은, 먼저, 검체로서 피험자로부터 채취한 생체 시료, 예를 들어 검사 대상으로 하는 조직편 또는 혈액 등과, 본 발명의 항체를 항원 항체 반응에 의해 결합시킨다. 이어서, 결합한 항체량의 측정 결과에 기초하여, 생체 시료 중의 목적으로 하는 항원량을 측정함으로써 실시한다. 당해 측정은 공지된 면역학적 측정법에 따라 실시하면 되고, 예를 들어, 면역 침강법, 면역 응집법, 표식 면역 측정법, 면역비 현탁법, 웨스턴 블롯법, 플로사이토메트리법 등을 이용할 수 있다. 표식 면역 측정법에서는, 항체의 시그널은, 표식 항체를 사용하여 직접 검출한 표식량으로 나타내는 것 외에, 이미 알려진 농도 혹은 이미 알려진 항체가의 항체를 표준액으로서 상대적으로 나타내도 된다. 즉, 표준액과 검체를 측정계에 의해 측정하여, 표준액의 값을 기준으로 하여 생체 시료 중의 항체 시그널을 상대적으로 나타낼 수 있다. 표식 면역 측정법으로서는, 예를 들어 ELISA 법, EI 법, RIA 법, 형광 면역 측정 (FIA) 법, 화학 발광 면역 측정법 (Luminescence immunoassay) 등을 들 수 있다. 그 중에서도 특히, ELISA 법이 간편하고 고감도라는 점에서 바람직하다.
본 발명에 있어서는, 상기 검출 방법에 의해 얻어진 검출 결과를 지표로서 종양 상태를 평가 또는 진단할 수 있다. 예를 들어, 검출 결과가 소정의 기준치를 초과하는 것을 종양 양성, 소정의 기준치 이하인 것을 종양 음성으로 하고, 양성의 경우에는, 어느 종양을 발증하고 있을 가능성이 있다고 판단하여, 종양 상태를 평가할 수 있다. 여기서, 종양 상태란, 종양 이환의 유무 또는 그 진행도를 의미하고, 종양 발증의 유무, 진행도, 악성도, 전이의 유무 및 재발의 유무 등을 들 수 있다.
상기 평가에 있어서, 종양 상태로서는 1 개를 선택해도 되고, 복수개를 조합하여 선택해도 된다. 종양 유무의 평가는, 얻어진 검출 결과에 기초하여, 소정의 기준치를 경계로 하여 종양에 이환되어 있는지의 여부를 판단함으로써 실시할 수 있다. 종양의 악성도는 암이 어느 정도 진행되고 있는지를 나타내는 지표가 되는 것으로, 검출 결과에 기초하여, 병기 (Stage) 를 분류하여 평가하거나 혹은 조기 암이나 진행 암을 분류하여 평가하거나 하는 것도 가능하다. 예를 들어, 검출 결과를 지표로서 조기 암 또는 진행 암이라고 평가할 수도 있다. 종양의 전이는, 검출 결과를 지표로 하여, 원발소의 위치로부터 떨어진 부위에 신생물이 출현하고 있는지의 여부에 의해 평가할 수 있다. 재발은 간헐기 또는 관해 후에 검출 결과가 다시 소정의 기준치를 넘었는지의 여부에 의해 평가할 수 있다.
6. 종양의 검출용 또는 진단용 키트
본 발명의 항 hTROP-2 항체는 종양의 검출용 또는 진단용 키트의 형태로 제공할 수 있다. 본 발명의 키트는 항체를 포함하는데, 그 외에, 표식 물질, 혹은 항체 또는 그 표식물을 고정시킨 고상화 시약 등을 포함할 수 있다. 항체의 표식 물질이란, 효소, 방사성 동위체, 형광 화합물 및 화학 발광 화합물 등에 의해 표식된 것을 의미한다. 본 발명의 키트는, 상기의 구성 요소 외에, 본 발명의 검출을 실시하기 위한 다른 시약, 예를 들어 표식물이 효소 표식물인 경우에는, 효소 기질 (발색성 기질 등), 효소 기질 용해액, 효소 반응 정지액, 혹은 검체용 희석액 등을 포함하고 있어도 된다. 또, 각종 버퍼, 멸균수, 각종 세포 배양 용기, 각종 반응 용기 (에펜도르프튜브 등), 블로킹제 (Bovine Serum Albumin (BSA), Skim milk, Goat 혈청 등의 혈청 성분), 세정제, 계면 활성제, 각종 플레이트, 아지화나트륨 등의 방부제, 및 실험 조작 매뉴얼 (설명서) 등을 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 키트는 상기 본 발명의 검출 방법을 실시하기 위해서 유효하게 사용할 수 있어 매우 유용성이 높은 것이다
이하에, 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
〔실시예 1〕
[hTROP-2 유전자의 클로닝]
hTROP-2 유전자 전체 길이의 단리는 인간 태아 간장 (태생 10 주) 으로부터 RT-PCR 법에 의해 실시했다. 먼저 hTROP-2 유전자 (Genbank accession No. NM_ 002353) 의 배열을 기초로 이하에 나타내는 PCR 프라이머를 설계했다.
포워드측 프라이머 ： 5'-ttcctccgccccaccatggc-3' (배열 번호 3)
리버스측 프라이머 ： 5'-ctcgagcaagctcggttcctttctc-3' (배열 번호 4)
이 때, 리버스측 프라이머에는 스탑코돈을 제외하고, Xho I 에 의한 제한 효소 소화 배열을 부가했다. 이들 프라이머와 인간 태아 간장 (태생 10 주) 으로부터 조제한 전체 RNA (TAKARA) 로부터 합성한 cDNA 를 주형으로 하여 PCR 반응을 실시했다. 그 후, 아가로오스 겔 전기 영동에 의한 전개, 목적으로 하는 밴드의 추출을 실시하여, pCRⅡ 벡터 (Invitrogen) 에 클로닝했다 (pCRⅡ-hTROP2). 클로닝된 hTROP-2 의 cDNA 는 시퀀스에 의해 확인했다.
발현 벡터의 구축은, pCRⅡ-hTROP2 로부터 hTROP-2 유전자를 포함하는 Eco RI/Xho I 단편을 잘라내어, pcDNA4/myc-Hisⓒ A 벡터 (Invitrogen) 의 EcoRI/Xho I 부위에 삽입하여 실시했다 (pcDNA4-hTROP2-myc/His). 또 pcDNA4-hTROP2-myc/His 로부터 hTROP-2 유전자를 포함하는 Hind Ⅲ/Pme I 단편을 잘라내어 (Hind Ⅲ 절단 부위는 평활 말단화했다), pcDNA3.1(+) 벡터 (Invitrogen) 의 Pme I 부위에 삽입함으로써 네오마이신 내성 유전자를 갖는 발현 벡터를 구축했다 (pcDNA3.1-hTROP2-myc/His).
〔실시예 2〕
[hTROP-2 유전자 안정 세포주의 구축]
상기의 방법으로 제조한 hTROP-2 의 전체 길이 cDNA 를 코드한 발현 벡터 (pcDNA3.1-hTROP2-myc/His) 를, HEK293 세포 (RIKEN), HuH-7 세포 (HSRRB), 7E2-C 세포 (WO2005/052156 에 기재), CHO-K1 세포 (HSRRB) 에 리포펙타민 2000 시약 (Invitrogen) 을 사용하여 유전자 도입하고, 항생 물질 G418 (geneticin, GIBCO BRL) 에 의한 선택을 실시한 후, hTROP-2 를 안정적으로 발현하고 있는 세포주를 수립함으로써 얻었다.
〔실시예 3〕
[hTROP-2 세포 외 영역의 리콘비난트 단백질 제조]
hTROP-2 세포 외 영역의 일부 (구체적으로는, 배열 번호 2 로 표시되는 아미노산 배열 중 제 1 번째 ～ 제 263 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역) 를 코드하는 유전자 단편은 PCR 법에 의해 증폭했다. 증폭에 사용한 프라이머는 이하와 같다.
포워드측 프라이머 ： 5'-ttcctccgccccaccatggc-3' (배열 번호 3)
리버스측 프라이머 ： 5'-ctcgagctcgtccaggtaatagatgagcg-3' (배열 번호 5)
이 때, 리버스측 프라이머에 Xho I 에 의한 제한 효소 소화 부위를 부가했다. PCR 법에 의해 증폭한 DNA 단편은 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 전개하고, QIAquick (등록상표) Gel Extraction Kit (QIAGEN) 를 이용하여 정제했다. 정제한 DNA 단편은 pCR Blunt 벡터 (Invitrogen) 에 서브 클로닝하여 (pCRB-hTROP-2 EC), 유전자 배열을 확인했다. 다음으로 pCRB-hTROP-2 EC 로부터 hTROP-2 의 세포 외 영역을 코드하는 유전자 단편을 포함하는 Eco RI/Xho I 단편을 잘라내어, pcDNA4/myc-Hisⓒ A 벡터 (Invitrogen) 의 Eco RI/Xho I 부위에 삽입했다 (pcDNA4mH-hTROP-2 EC). 또한 pcDNA4mH-hTROP-2 EC 의 Bam HI/Eco RI 부위에 Nru I 제한 효소 절단 부위를 제조하기 위해, 이하에 나타내는 올리고 뉴클레오티드를 회합시켜 삽입했다.
올리고 뉴클레오티드 1 ： 5'-gatccactagtcgcgagtggtgg-3' (배열 번호 6)
올리고 뉴클레오티드 2 ： 5'-aattccaccactcgcgactagtg-3' (배열 번호 7)
동일하게 pcDNA4mH-hTROP-2 EC 의 Pme I 부위에 pBgl Ⅱ 링커 (TAKARA) 를 삽입했다 (pcDNA4mH-NB-hTROP-2 EC). 바큐로 바이러스를 사용한 리콘비난트 단백질 제조를 위해, pcDNA4mH-NB-hTROP-2 EC 로부터 hTROP-2 의 세포 외 영역을 코드하는 유전자 단편을 포함하는 Nru I/Bgl Ⅱ 단편을 잘라내어, pPSC8 벡터 (닛폰 농산 공업) 의 Nru I/Bgl Ⅱ 부위에 삽입했다 (pPSC8-hTROP2 EC). 바큐로 바이러스를 사용한 hTROP-2 세포 외 영역의 리콘비난트 단백질 제조는 닛폰 농산 공업에 위탁했다.
hTROP-2 세포 외 영역의 리콘비난트 단백질의 정제는 이하와 같이 실시했다. 리콘비난트 단백질을 포함하는 배양 상청에 Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare) 를 첨가하여 4 ℃, 2 시간 결합시켰다. 그 후, 에코노칼럼 (BIO RAD) 을 이용하여 20 mM 이미다졸을 포함하는 인산 완충액으로 세정, 300 mM 이미다졸을 포함하는 인산 완충액으로 용출을 실시하여 정제했다.
〔실시예 4〕
[인간 EpCAM cDNA 의 단리와 발현 벡터의 구축]
인간 EpCAM 유전자 전체 길이의 단리는 인간 태아 간장 (태생 10 주) 으로부터 RT-PCR 법에 의해 실시했다. 먼저 인간 EpCAM 유전자 (Genbank accession No. NM 002354) 의 배열을 기초로 이하에 나타내는 PCR 프라이머를 설계했다.
포워드측 프라이머 ： 5'-tcctcgtgtcccactcccgg-3' (배열 번호 8)
리버스측 프라이머 ： 5'-ctcgagtgcattgagttccctatgc-3' (배열 번호 9)
이 때, 리버스측 프라이머에는 스탑코돈을 제외하고, Xho I 에 의한 제한 효소 소화 배열을 부가했다. 이들 프라이머와 인간 태아 간장 (태생 10 주) 유래의 전체 RNA (TAKARA) 로부터 합성한 cDNA 를 주형으로 하여 PCR 반응을 실시했다. 그 후, 아가로오스 겔 전기 영동에 의한 전개, 목적으로 하는 밴드의 추출을 실시하여, pCRⅡ 벡터 (Invitrogen) 에 클로닝했다 (pCRⅡ-hEpCAM). 클로닝한 인간 EpCAM 의 cDNA 는 시퀀스에 의해 확인했다.
발현 벡터의 구축은, pCRⅡ-hEpCAM 으로부터 인간 EpCAM 유전자를 포함하는 Eco RI/Xho I 단편을 잘라내어, pcDNA4/myc-Hisⓒ A 벡터 (Invitrogen) 의 EcoRI/Xho I 부위에 삽입하여 실시했다 (pcDNA4-hEpCAM-myc/His). 또 pcDNA4-hEpCAM-myc/His 로부터 인간 EpCAM 유전자를 포함하는 Hind Ⅲ/Pme I 단편을 잘라내어 (Hind Ⅲ 절단 부위는 평활 말단화했다), pcDNA3.1(+) 벡터 (Invitrogen) 의 Pme I 부위에 삽입함으로써 네오마이신 내성 유전자를 갖는 발현 벡터를 구축했다 (pcDNA3.1-hEpCAM-myc/His).
〔실시예 5〕
[항 hTROP-2 모노클로날 항체의 제조]
면역원으로서는, hTROP-2 발현 안정 세포주 (HEK293-hTROP-2 세포, CHO-K1-hTROP-2 세포, 7 E2-C-hTROP-2 세포), 내재적으로 hTROP-2 단백질을 세포 표면에 발현하고 있는, 인간 췌장암 세포주 (PK-59, RCB1901 ; RIKEN cell bank 에서 구입), 또는 상기의 방법으로 제조한, hTROP-2 의 세포 외 영역의 리콘비난트 단백질을 사용했다.
hTROP-2 발현 안정 세포주의 경우에는 1 × 107 세포, 리콘비난트 hTROP-2 단백질의 경우에는 20 ㎍ 의 단백을, 각각 면역 보조제 TiterMax Gold (후나코시 주식회사) 와 1 ： 1 로 혼합하여 에멀션을 조제하고, 마우스 (C57/BL6, Balb/c) 의 양 족척, 또는 복강 내에 주사했다 (초회 면역). 양 족척에의 단기 면역의 경우에는, 초회 면역으로부터 3 일 후 및 10 일 후에 추가 면역을 실시하고, 최종 면역의 다음날에, 양 무릎 림프절을 채취하여 림프구를 조제했다. 복강 내에의 장기 면역의 경우에는, 초회 면역으로부터 1 주일에 1 회의 비율로 추가 면역을 실시하고 (1 ～ 2 개월간 실시), 통상적인 방법에 따라 비장에서 B 세포를 단리했다. 추가 면역은, 세포 면역에서는 5 × 106 세포의 PBS 에 의한 세포 현탁액을 사용하고, 단백질 항원의 경우에는 5 ㎍ 의 PBS 용액을 사용했다.
조제한 림프구와 마우스 미에로마 세포주 (P3-X63-Ag8.653) 를 3 ： 1 의 비율로 혼합하고, 폴리에틸렌글리콜법으로 세포 융합을 실시하여, HAT (히폭산틴, 아미노프테린, 티미딘) 를 포함하는 메틸셀룰로오스 배지 (상품명 ： ClonaCell-HY Cloning Medium D ; Stem Cell) 에서 7 ～ 28 일간 배양하고, 증식되어 온 하이브리도마의 단일 콜로니를, 하나 하나를 96 구멍 평저 플레이트에 픽업하여, HAT 를 포함하는 액체 선택 배지를 사용하여, 5 ％ CO2 인큐베이터에서 배양했다. 증식되어 온 단일 콜로니 유래의 하이브리도마의 배양 상청을, Cell ELISA (후술) 에 의한 1 차 스크리닝, HuH-7-hTROP-2 세포, PK-59 를 사용한 FACS 해석으로 2 차 스크리닝을 실시함으로써, 생세포의 세포 표면에 발현되어 있는 hTROP-2 단백질을 인식하는 항 hTROP-2 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마를 300 종류 수립했다.
〔실시예 6〕
[Cell ELISA 를 사용한 1 차 스크리닝]
96 구멍 배양 플레이트 (BD 팔콘) 에, CHO-K1 세포 (hTROP-2 음성 컨트롤 ： 휴먼 사이언스 진흥 사업단에서 구입) 와 CHO-K1-hTROP-2 세포 (또는, HuH-7 세포 (hTROP-2 음성 컨트롤 ： 휴먼 사이언스 진흥 사업단에서 구입) 와 HuH-7-hTROP-2 세포) 를 3 × 104 세포/웰로 교대로 파종하고, 5 ％ CO2, 37 ℃ 에서 1 ～ 2 일간 배양했다. 데칸테이션으로 세포 배양액을 제거하고, 이어서, 빙랭 PBS 로 세정 후, 4 ％ 파라포름알데히드-PBS 로 5 분간 처리함으로써 세포를 고정시키고, 빙랭 PBS 로 세정 후 ELISA 플레이트로 했다. 이후, 통상적인 방법에 따라, ELISA 법을 실시했다. 구체적으로는 이하와 같다.
먼저, 2 ％ 스킴 밀크-PBS 용액에 의한 블로킹을 실온에서 30 분 ～ 1 시간 실시했다. 다음으로, 하이브리도마 배양 상청을 첨가하여 실온에서 1 시간 반응시킨 후, 0.1 ％ Tween20-PBS 용액으로 3 회 세정했다. 2 차 항체로서 블로킹 용액으로 1000 배 희석한, Horseradish peroxidase (HRP) 표식 항마우스 IgG (GE 헬스케어 바이오 사이언스) 를 첨가하여 실온에서 1 시간 반응시킨 후, 0.1 ％ Tween20-PBS 용액으로 3 회 세정했다. TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine : SIGMA) 기질 용액을 첨가하여 발색 반응을 실시하고, 1 M 황산을 첨가하여 반응을 정지시켰다. Microplate reader Model 550 (바이오·래드) 을 이용하여, 흡광도 (405 ㎚) 를 측정했다. 음성 컨트롤에 대해, 높은 흡광도의 값을 나타낸 하이브리도마 배양 상청에 대응하는 하이브리도마를 24 구멍 평저 플레이트에 확대 배양을 실시하고, FACS 해석을 이용한 2 차 스크리닝 (후술) 으로 이행했다.
〔실시예 7〕
[FACS 해석을 이용한 2 차 스크리닝]
상기의 Cell ELISA 를 사용한 1 차 스크리닝에서 양성이었던 하이브리도마 에 대해, FACS 해석을 이용한 2 차 스크리닝을 실시했다. 세포는 hTROP-2 를 발현하고 있지 않는 인간 간암 세포주인 HuH-7 세포를 음성 컨트롤로서, hTROP-2 를 발현시킨 안정 세포주인 HuH-7-hTROP-2 세포에 대한 반응성을 지표로 평가하고, 다음에 내재적으로 hTROP-2 단백질을 세포 표면에 발현하고 있는 인간 췌장암 세포주인 PK-59 세포 (RCB1901 ; RIKEN cell bank 에서 구입) 와의 반응성으로 평가했다.
세포는 트립신 처리에 의해 배양 접시에서 벗겨내어, 세포 현탁액 (세포 밀도 2 × 106 cells/㎖) 을 조제했다. Cell ELISA 를 사용한 1 차 스크리닝에서 양성 반응을 나타낸 하이브리도마 배양 상청과 세포 현탁액 100 ㎕ 를, 4 ℃ 에서 20 분간 반응시켰다. PBS 로 세정 후, PE 표식 항마우스 IgG (BD 파민겐) (0.1 ㎍) 와 반응 (4 ℃, 30 분) 시킨 후, FACSCalibur (벡톤디킨슨) 에 의해 해석했다.
최종적으로, 생세포의 세포 표면에 발현되어 있는 hTROP-2 단백질을 인식하는 항 hTROP-2 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마를 약 300 종류 수립했다.
〔실시예 8〕
[아이소 타입의 동정]
제조한 항 hTROP-2 모노클로날 항체의 아이소 타입은, MOUSE MONOCLONAL ANTIBODY ISOTYPING TEST KIT (Serotec 사) 를 이용하여, 키트 첨부의 방법에 따라 실시했다.
〔실시예 9〕
[TROP-2 항체의 복수화 및 항체 정제]
상기 방법으로 제조한 하이브리도마의 클론을, 미리 (7 일전) 2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸 (프리스탄) 이 투여된 BALB/c 누드 마우스의 복강 내에 3 × 106 개 투여하고, 2 주일 후의 복수를 채취했다. 또한, 이 복수로부터, 카프릴산 침전, 프로테인 G 칼럼 (HiTrap protein G ； GE 헬스케어 바이오 사이언스), 또는 프로테인 A 칼럼 (HiTrap protein A ； GE 헬스케어 바이오 사이언스) 을 이용하여 어피니티 정제를 실시함으로써, 각 하이브리도마 클론이 산생하는 항 hTROP-2 모노클로날 항체를 얻었다.
〔실시예 10〕
[항원 친화성의 측정 (Kd 값의 측정)]
제조한 항 hTROP-2 모노클로날 항체의 항원 친화성 (Kd 값) 은 ELISA 를 이용한 방법으로 산출했다 (Djavadi-Ohaniance L. et al (1996), In Antibody Engineering, Chapter 4, pp77-97. IRL Press, Oxford).
구체적으로는, 96 구멍 배양 플레이트 (코닝) 에, 정제한 리콘비난트 hTROP-2 단백질 (0.1 ㎍/㎖) 을 첨가하여 항원을 고상화했다 (실온, 1 시간, 또는 4 ℃, 하룻밤). 다음에, PBS 로 3 회 세정하여, 2 ％ 스킴 밀크 (PBS 용액) 를 첨가하여 블로킹을 실시했다 (실온, 1 시간). PBS 로 2 회 세정 후, 미리 항원 용액 (정제 hTROP-2 단백질 ； 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 nM) 과 항 hTROP-2 모노클로날 항체의 각 클론 (0.5 nM) 을 혼합하여 평형화시켜 둔 항원-항체 복합체를, 상기 ELISA 플레이트에 첨가하여 반응시켰다 (실온, 1 시간). PBS 로 3 회 세정한 후, 블로킹액으로 희석한 HRP 표식 항마우스 IgG (최종 농도 1㎍/㎖) (GE 헬스케어 바이오 사이언스) 와 반응시켰다 (실온, 1 시간). 이어서, 0.1 ％ Tween20-PBS 용액으로 3 회 세정한 후에, TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine : SIGMA) 기질 용액을 첨가하여 발색 반응을 실시하고, 1 M 황산을 첨가하여 반응을 정지시켰다. Microplate reader Model 550 (바이오·래드) 을 이용하여, 흡광도를 측정했다.
해리 정수 (Kd) 의 계산식은 이하와 같이 했다.
항원 항체 반응은 질량 작용의 법칙에 의해,
Figure pct00001
(2) 식에서, Agf 는 유리 항원의 농도, Abf 는 유리 항체의 농도, Ag-Ab 는 항원-항체 복합체의 농도를 나타내고, Ag-Ab = x 로 놓으면, 유리 항체 농도는,
Figure pct00002
(2) 식은,
Figure pct00003
(4) 식의 양 항에 x/Kd × Abt 를 곱하면,
Figure pct00004
(5) 식에 있어서, X = x/Abt, Y = x/Abt × Agf 로 놓으면,
Figure pct00005
(6) 식으로부터, Kd 값을 산출했다.
상기의 방법으로, 제조한 항 hTROP-2 모노클로날 항체 300 클론의 Kd 값을 측정한 결과, 1 × 10-10 (M) 이하의 Kd 값을 나타내는 클론이 133 클론, 1 × 10-11 (M) 이하의 Kd 값을 나타내는 클론이 59 클론, 1 × 10-12 (M) 이하의 Kd 값을 나타내는 클론이 2 클론이었다.
in vivo 에서 종양 성장 저해 활성을 나타낸, 항 hTROP-2 모노클로날 항체 중, K5-70 (마우스 IgG2a), T6-16 (마우스 IgG2a), K5-107 (마우스 IgG1), K5-116-2-1 (마우스 IgG1), 및 T5-86 (마우스 IgG1) 의 Kd 값은, 각각 차례로, 6.8 × 10-12 (M), 4.3 × 10-12 (M), 4.7 × 10-12 (M), 2.69 × 10-11 (M), 및 8.49 × 10-11 (M) 이었다 (도 1, 표 1).
Figure pct00006
〔실시예 11〕
[항 hTROP-2 모노클로날 항체의 인간 암 세포주와의 반응성]
인간 암 세포주 (인간 종양 세포주) 는 휴먼 사이언스 진흥 사업단 (HSRRB), RIKEN cell bank (RIKEN), ATCC (American Type Culture Collection), ECACC (European Collection of Cell Cultures), DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) 에서 입수한 것을 사용했다. 구체적으로는, 이하에 열거한 바와 같다.
Figure pct00007
암 세포는 트립신 처리에 의해 배양 접시에서 벗겨내어, 세포 현탁액 (세포 밀도 2 × 106 cells/㎖) 을 조제했다. 세포 현탁액 100 ㎕ 에 항 hTROP-2 모노클로날 항체를 첨가하여 (0.1 ㎍), 4 ℃ 에서 20 분간 반응시켰다. PBS 로 세정 후, PE 표식 항마우스 IgG (BD 파민겐) (0.1 ㎍) 와 반응 (4 ℃, 30 분) 시킨 후, FACSCalibur (벡톤디킨슨) 에 의해 해석했다.
제조한 항 hTROP-2 항체는, 모두 내재적으로 hTROP-2 를 발현하고 있지 않는 인간 간암 세포주 HuH-7 과는 결합하지 않고, 한편 hTROP-2 유전자를 발현시킨 안정 세포주인 HuH-7-hTROP-2 세포에는 결합을 나타냈다 (도 2). 다음으로, 제조한 항 hTROP-2 모노클로날 항체의 인간 암 세포주 (내재적으로 세포 표면에 발현하고 있는 hTROP-2 단백질) 와의 반응성을 FACS 해석에 의해 검토한 결과, 제조한 300 종류의 항 hTROP-2 모노클로날 항체는 모두 인간 췌장암 세포주 (PK-59, BxPC-3) 와의 결합을 나타내고, 특히, in vivo 에서 종양 성장 저해 활성을 나타낸 K5-70, T6-16, K5-107, K5-116-2-1, T5-86 항체는, PE 표식 항마우스 IgG (BD 파민젠) 와만 반응시킨 경우와 비교하여, PK-59 세포에서는, 평균 형광 강도로 K5-70 (44 배), T6-16 (59 배), K5-107 (89 배), K5-116-2-1 (122 배), T5-86 (15 배) (도 3), BxPC-3 세포에서는, K5-70 (45 배), T6-16 (25 배), K5-107 (90 배), K5-116-2-1 (121 배), T5-86 (10 배) 로, 어느 항체나 높은 결합을 나타냈다 (도 4).
PK-59 와 BxPC-3 이외의 인간 암 세포주에서는, 췌장암 세포주 12 종류 중, KP-2, KP-3L, PK-1, PK-45H, SUIT-2, TCC-PAN2 에 결합하고, KP-1N, KP-1NL, KP-3, PANC-1, MIA-PaCa2 에는 결합하지 않았다 (도 5). 인간 대장암 세포주에서는, CACO-2, SW480, DLD-1, HCT 116 에 결합하고, COLO-320, CW-2 에는 결합하지 않았다 (도 6). 그 외, JIMT-1, HCC1143 (모두 인간 유방암 세포주), PC-3, DU145 (모두 인간 전립선암 세포주) 와 결합하고, 많은 인간 암 세포주의 세포 표면에 내재적으로 발현하고 있는 hTROP-2 단백질을 인식했다 (도 6).
〔실시예 12〕
[마우스 TROP-2 단백질, 인간 TROP-1/EpCAM 단백질과의 교차 반응성]
제조한 항 hTROP-2 모노클로날 항체의 특이성을 조사하는 목적에서, hTROP-2 단백질과 아미노산 배열에서 80 ％ 의 상동성을 나타내는 마우스 TROP-2 단백질, hTROP-2 단백질과 아미노산 배열에서 50 ％ 의 상동성을 나타내는 인간 TROP-1/EpCAM 과의 반응성을 FACS 해석으로 실시했다.
구체적으로는, 마우스 TROP-2 유전자 (GenBank accession No. NM_020047, Y08830) 의 전체 길이 cDNA 를 포함하는 발현 벡터 (마우스 TROP-2-pcDNA3.1(+), 토쿄 대학·분자 세포 생물학 연구소에서 공여), 및 인간 TROP-1/EpCAM 유전자 (GenBank accession No. NM_002354) 의 전체 길이 cDNA 를 포함하는 발현 벡터 (pcDNA3.1-hEpCAM-myc/His) 를, 각각 Lipofectamine2000 시약 (Invitrogen) 을 이용하여, 일과성으로 CHO-K1 세포에 유전자 도입을 실시하고, 24 ～ 48 시간 후에 세포를 트립신 처리로 배양 접시에서 벗겨내어 세포 현탁액을 조정하고, 제조한 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (0.1 ㎍), PE 표식 항마우스 IgG 와 순차 반응시킨 후, FACSCalibur 에 의해 해석했다.
마우스 TROP-2 유전자를 일과성으로 발현시킨 CHO-K1 세포에 있어서, 양성 대조로서 사용한 마우스 TROP-2 와 교차 반응을 나타내는 T2-102 항체 (마우스 IgG1) 는 강한 결합을 나타내고, 한편, K5-70, T6-16, K5-107, K5-116-2-1, T5-86 항체는 마우스 TROP-2 와의 교차 반응은 나타내지 않았다 (도 7).
동일하게, 인간 EpCAM/TROP-1 유전자를 일과성으로 발현시킨 CHO-K1 세포에 있어서, 양성 대조로서 사용한 항인간 EpCAM 모노클로날 항체 (BD 파민젠) 는 강한 결합을 나타내고, 한편, K5-70, T6-16, K5-107, K5-116-2-1, T5-86 항체는 인간 EpCAM/TROP-1 과의 교차 반응은 나타내지 않았다 (도 8).
이상의 결과는, 제조한 항 hTROP-2 모노클로날 항체, 특히 in vivo 에서 항종양 활성을 나타낸 K5-70, T6-16, K5-107, K5-116-2-1, T5-86 항체는 hTROP-2 에 특이적으로 결합하는 것이 나타났다.
〔실시예 13〕
[세포 증식 저해 활성의 측정]
항 hTROP-2 모노클로날 항체의 hTROP-2 의 기능 저해를 조사하는 방법의 하나로서, 내재적으로 hTROP-2 를 세포 표면에 발현하고 있는 인간 암세포의 세포 증식에 대한 영향을, 테트라칼라원 (생화학 공업) 을 사용한 생세포 수의 측정에 기초하여 평가했다. 구체적으로는, PK-59 세포를 0.5 ％ 의 소 태아 혈청 (BioWest 사 제조) 을 포함하는 RPMI1640 배지에 2 × 105 세포/㎖ 의 세포 농도가 되도록 세포 현탁액을 조제하여, 96 구멍 배양 플레이트에 100 ㎕ 씩 파종했다. 이어서, 마우스 IgG (음성 컨트롤), 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (최종 농도 0.1, 1 ㎍/㎖) 를 첨가하여, 37 ℃, 5 ％ CO2 인큐베이터에서 72 시간 배양했다. 비교 대조로서, 시판되는 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (클론 YY01, Santa Cruz) 를 사용했다. 세포에 테트라칼라원 (생화학 공업) 을 첨가하여, 5 ％ CO2 인큐베이터에서 1 ～ 2 시간 반응시켰다. 반응 후의 96 구멍 플레이트를, 그대로 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 파장 490 ㎚ (대조 파장 ： 655 ㎚) 의 흡광도를 측정했다. 각 군 3 웰로 실시하고, Student's t 검정 (Student's t-test) 으로 유의차 검정을 실시하여, P < 0.05 를 통계적으로 유의하다고 판정했다.
지금까지 자사에서 제조한 항 hTROP-2 모노클로날 항체 중, 약 160 클론에 대해, 상기의 방법으로 PK-59 세포의 세포 증식에 부여하는 효과를 조사한 결과, in vivo 에서 종양 성장 저해 활성을 나타낸 T6-16, T5-86, K5-70, K5-107 은, 마우스 IgG (음성 컨트롤) 와 비교하여, 20 ％ ～ 40 ％ 의 세포 증식 저해 활성이 확인되고, 이들 항 hTROP-2 항체는, 인간 암세포 표면에 발현하는 hTROP-2 단백질에 결합하여, hTROP-2 단백질의 기능을 중화하고, 암세포의 증식을 저해하는 활성을 갖는 것이 분명해졌다 (도 9).
〔실시예 14〕
[스크래치 어세이]
항 hTROP-2 모노클로날 항체의 인간 암세포의 이동능을 스크래치 어세이로 평가했다. PK-59 세포를 10 ％ 의 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI1640 배지에 3 × 105 cell/㎖ 의 세포 농도가 되도록 세포 현탁액을 조제하고, 96 구멍 배양 플레이트에 100 ㎕ 씩 파종했다. 세포가 콘플루엔트에 도달한 단계에서, 칩의 선단으로 세로로 선을 긋도록 하여 단층 배양한 세포의 일부를 박리했다. 항 hTROP-2 모노클로날 항체, 및 음성 컨트롤로서 마우스 IgG 를 최종 농도가 0.1, 및 1 ㎍/㎖ 가 되도록 배지에 첨가하고, 24 시간 배양을 실시하여, 항체 첨가 전 (Day 0) 과 24 시간 배양 후 (Day 1) 의 박리된 영역의 사진을 촬영하고, 세포간 거리를 측정했다. 또, 박리 영역의 면적을 Scion Image 소프트웨어로 정량화했다. 각 군 8 웰로 실시하고, Student's t-test 로 유의차 검정을 실시하여, P < 0.05 를 통계적으로 유의하다고 판정했다.
스크래치 영역에 침윤되는 세포의 운동능에 대한 hTROP-2 항체의 효과를 조사했다. 세포 증식 저해 어세이와 동일하게 약효가 있던 항체를 평가했다. 평가 방법으로서 Day 0 (항체 첨가시) 및 Day 1 (24 시간 경과 후) 의 세포를 촬영하고, 이동 거리 (㎛) 및, 스크래치 영역의 면적을 화상 해석했다. 결과, 도 10 에 나타내는 바와 같이, 세포의 운동능에 분명한 차이가 보였다. 본 시험에 사용한 T6-16 및 K5-70 은 컨트롤과 비교하여, 어느 쪽이나 유의한 증식 저해가 보이고, 재현성 시험에 있어서도 동일한 경향을 확인할 수 있었다. 특히 T6-16 에 대해서는 P < 0.01 (by Student's t-test) 로, in vivo 의 시험과의 상관성이 인정되었다.
〔실시예 15〕
[담암 마우스에서의 항 hTROP-2 모노클로날 항체의 약효 평가]
Prevention 모델
hTROP-2 를 발현하는 췌암 세포주 (PK-59, BxPC-3) 를 트립신 처리로 벗기고, PBS 로 1 × 108 cells/㎖ 의 세포 현탁액을 조제하여, 빙상에서 등량의 마트리겔 (BD 파민겐) 과 혼합했다. 6 주령의 암컷 누드 마우스 (Balb/c, nu/nu) 의 오른쪽 옆구리의 피하에 26 G 의 시린지를 사용하여 100 ㎕ (5 × 106 cell) 주사했다. 암세포 이식 당일 (Day 1) 에, 마우스를 군 분류하여, 항체의 투여 (1, 5, 또는 10 ㎎/㎏ 체중, 복강 내 투여) 를 개시했다. 이후에는, 3 일에 1 회의 간격으로 동일한 투여를 실시했다. 항종양 활성은 종양 형성 빈도 및 종양 체적에 의해 평가했다. 종양 체적의 계측은 이하의 계산식을 이용했다.
종양 체적 (㎣) = (단경)2 × (장경) × π/6
Treatment 모델
hTROP-2 를 발현하는 췌암 세포주 (PK-59, BxPC-3) 를 트립신 처리로 벗기고, PBS 로 1 × 108 cells/㎖ 의 세포 현탁액을 조제하여, 빙상에서 등량의 마트리겔 (BD 파민겐) 과 혼합했다. 6 주령의 암컷 누드 마우스 (Balb/c, nu/nu) 의 오른쪽 옆구리의 피하에 26 G 의 시린지를 사용하여 100 ㎕ (5 × 106 cells) 주사했다. 암세포 이식으로부터 5 ～ 6 일 후, 종양 체적이 50 ～ 150 ㎣ (평균치로 약 100 ㎣) 로 성장한 마우스를 군 분류하고, 군 분류한 당일을 1 일째 (Day 1) 로 하여, 항체 투여를 개시했다. 항체는 3 일에 1 회의 간격으로 복강 내 투여를 실시했다 (10 ㎎/㎏ 체중). 항종양 활성은 종양 체적을 계측함으로써 평가했다. 유의차 검정은, Student's t-test 로 실시하여, P < 0.05 를 통계적으로 유의하다고 판정했다.
〔실시예 16〕
[인간 췌암 세포 Xenograft 모델에 있어서의 항 hTROP-2 모노클로날 항체의 in vivo 에 있어서의 항종양 활성의 검토]
hTROP-2 를 표적으로 한 암치료용 항체는, Xenograft Treatment 모델에 있어서, hTROP-2 를 발현하는 종양 조직을 특이적으로 사멸시키거나, 종양의 성장을 저해하는 활성을 나타내는 것이 필수이다.
본 발명에 있어서 새롭게 제조한 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (약 160 클론) 를, 췌암 세포주 PK-59 세포의 Xenograft Treatment 모델로 평가했다. PK-59 세포는, 췌장암 줄기 세포 마커인 EpCAM 을 발현하고 (도 11A) (Chenwei Li, et al. Cancer Res 2007 ; 67 : (3). 1030-1037), 약제 내성에 관련되는 ABC 트랜스포터인 P-glycoprotein/MDR1 (도 11B), ABCG2/CDw338 (도 11C) 을 세포 표면에 발현하고 있다 (Chen, C.J. et al. Cell 47 (3), 381-389 (1986), Allikmets, R., et al. Hum. Mol. Genet. 5 (10), 1649-1655 (1996). 또, 췌장암 줄기 세포의 특징인 CD24 와 CD44 공양성의 세포 획분 (8.93 ％) (도 11D) 을 포함하여, 악성도가 높은 인간 췌장암 세포주라고 추측된다 (Chenwei Li, et al. Cancer Res 2007 ; 67 : (3). 1030-1037, Jane E. Visvader and Geoffrey J. Lindeman. Nat Rev Cancer. Vol.8(10) : 755-68, 2008).
신규로 제조한 약 160 클론 중, 대부분의 클론은 PK-59 세포 Xenograft Treatment 모델에서는 약효를 나타내지 않았지만, 그 중에서도 유의한 종양 성장 저해 활성을 나타내는 이하의 클론, 즉 클론 K5-70, T6-16, K5-107, T5-86 및 K5-116-2-1 이 얻어졌다.
클론 K5-70 (마우스 IgG2a) 투여군에서는, 종양 성장 속도가 통계적으로 유의하게 저해되어, 투여 개시 후 21 일째 (Day 21) 에 있어서, 컨트롤군 (N = 14) 의 종양 체적이 1200.8 ± 377.3 ㎣ 에 대해, 클론 K5-70 투여군에서는 748.7 ± 162.9 ㎣ (P < 0.01 by Student's t-test) 이었다 (도 12A). 항체 투여 개시 시점에서의 종양 체적을 1.0 으로 했을 때의, 21 일째 (Day 21) 에 있어서의 종양 체적은, 컨트롤군이 12.5 인데 대해, 클론 K5-70 투여군에서는 7.8 이었다 (도 12A). 적출한 종양 중량도, 컨트롤군이 0.73 ± 0.26 g 인 것에 대해, 클론 K5-70 투여군에서는 0.43 ± 0.14 g (P < 0.01 by Student's t-test) 으로, 약 60 ％ 의 저해를 나타냈다 (도 12B).
동일하게, 클론 K5-107 (마우스 IgG1) 투여군 (N = 8), 클론 T6-16 (마우스 IgG2a) 투여군 (N = 8), 클론 T5-86 (마우스 IgG1) 및 클론 K5-116-2-1 (마우스 IgG2a) 투여군 (N = 8) 에서도, 종양 성장 속도가 통계적으로 유의하게 저해되었다. 클론 K5-107 투여군 (N = 8) 그리고 클론 T6-16 투여군 (N = 8) 에서는, 투여 개시 후 17 일째 (Day 17) 에 있어서, 컨트롤군 (N = 8) 의 종양 체적이 1039.3 ± 271.6 ㎣ 에 대해, 각각 698.2 ± 175.9 ㎣ (P < 0.05 by Student's t-test), 707.2 ± 254.5 ㎣ (P < 0.05 by Student's t-test) 이었다. 동일하게, 클론 K5-116-2-1 투여군 (N = 8) 에서는, 투여 개시 후 16 일째 (Day 16) 에 있어서, 컨트롤군 (N = 8) 의 종양 체적이 797.0 ± 172.9 ㎣ 에 대해, 508.5 ± 225.2 ㎣ (P < 0.05 by Student's t-test) 이었다 (도 13).
한편, 클론 T5-86 에 대해서는, 투여 개시 후 15 일째 (Day 15) 에 있어서, 컨트롤군 (N = 8) 의 종양 체적이 1033.2 ± 319.4 ㎣ 에 대해, 클론 T5-86 투여군 (N = 8) 에서는 744.1 ± 289.1 ㎣ 이고, 종양 체적의 비교에서는 유의차는 생기지 않았지만, 동일한 날에 있어서의 종양 중량의 비교에서는, 컨트롤군이 0.62 ± 0.14 g 인 것에 대해, 클론 T5-86 투여군에서는 0.44 ± 0.13 g (P < 0.05 by Student's t-test) 으로 유의한 저해가 나타났다.
또, 하기 표 2 에, 각 클론 항체 투여군의 실험 최종일에 있어서의 컨트롤군과의 비율 (T/C) 을, 종양 체적 및 종양 중량의 각각에 대해 나타냈다. 표 2 에 나타낸 바와 같이, 각 클론 항체 투여군에 있어서, 각각 T/C = 62 ～ 72 ％ 의 유의한 저해가 얻어졌다.
Figure pct00008
또, 클론 K5-70, 클론 T6-16, 클론 K5-116-2-1 에 대해, 각각 췌암 세포주 PK-59 세포의 Xenograft Prevention 모델에서의 항종양 활성을 검토했다. 각각의 클론에 있어서, 항체 투여 후 모든 개체에서 (N = 8) 종양 성장이 저해되고, 클론 K5-70 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중) 에서는, 투여 개시 후 18 일째 (Day 18) 에 있어서, 컨트롤군 (N = 8) 의 종양 체적이 880.8 ± 206.4 ㎣ 에 대해, 62.4 ± 80.4 ㎣ (P < 0.01 by Student's t-test) 로 92.9 ％ 의 종양 성장 저해 활성을 나타내고, 클론 T6-16 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중) 에서는, 투여 개시 후 28 일째 (Day 28) 에 있어서, 컨트롤군 (N = 8) 의 종양 체적이 992.3 ± 250.8 ㎣ 에 대해, 152.4 ± 122.3 ㎣ (P < 0.01 by Student's t-test) 로 84.6 ％ 의 종양 성장 저해 활성, 클론 K5-116-2-1 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중) 에서는, 클론 K5-116-2-1 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중) 에서는, 투여 개시 후 20 일째 (Day 20) 에 있어서, 컨트롤군 (N = 8) 의 종양 체적이 1159.4 ± 413.3 ㎣ 에 대해, 207.7 ± 319.2 ㎣ (P < 0.01 by Student's t-test) 로 82.1 ％ 의 종양 성장 저해 활성을 나타냈다 (도 14, 표 3). 또, 모든 실험에 있어서, 시험 기간을 통하여, 컨트롤군과 항 hTROP-2 항체 투여군의 사이에, 평균 체중의 변화에 유의한 차는 없었다.
하기 표 3 에, 각 클론 항체 투여군의, 실험 최종일에 있어서의 컨트롤군과의 비율 (T/C) 을, 종양 체적 및 종양 중량 각각에 대해 나타냈다. 표 3 에 나타낸 바와 같이, 각 클론 항체 투여군에 있어서, 유의한 종양 성장 저해가 보이고, 특히 클론 K5-70 투여군에서는, T/C = 10 ％ 이하의 현저한 효과가 확인되었다.
Figure pct00009
공지된 항 TROP-2 항체 AR47A6.4.2 (미국 특허 제7420041호) 는 여러 가지 인간 암세포주를 사용한 20 ㎎/㎏ 의 투여량으로, Xenograft prevention 모델에서 종양 성장 저해 효과를 나타내고 있는데, 인간 췌장암 세포주 PL45 세포에서는, 거의 100 ％ 의 종양 성장을 저해하고 있지만, 췌장암 세포주 BxPC-3 에서는 약 50 ％, 전립선암 세포주 PC-3 에서는 약 40 ％, 유방암 세포주인 MCF-7 에서는 약 60 ％, 대장암 세포주 Colo205 에서 약 40 ％ 의 종양 성장 저해 효과였던 것에 대해, 본원 발명의 항 hTROP-2 항체는 절반의 투여량 (10 ㎎/㎏) 으로 보다 강한 종양 성장 저해 효과를 발휘했다.
〔실시예 17〕
[인간 췌암 세포주 BxPC-3 세포의 Xenograft 모델 (Prevention 모델 및 Treatment 모델) 에 있어서의 항종양 활성의 검토]
상기의 인간 췌암 세포주 PK-59 세포의 Xenograft Treatment 모델을 사용한 경우와 동일하게, 인간 췌암 세포주 BxPC-3 세포의 Xenograft Prevention 모델 및 Xenograft Treatment 모델에서의 항종양 활성을, 클론 K5-70 에 대해 검토했다.
클론 K5-70 투여군 (N = 8) 에서는, 컨트롤군 (N = 8) 과 비교하여, 종양 성장이 유의하게 저해되어, 52 일째 (Day 52) 에 있어서, 컨트롤군 (N = 8) 의 종양 체적이 616.3 ± 266.8 ㎣ 인 것에 대해, 클론 K5-70 투여군 (N = 8) 에서는 236.0 ± 136.4 ㎣ 로 61.7 ％ 의 종양 성장 저해 효과를 나타냈다 (P < 0.01 by Student's t-test) (도 15).
이상의 결과에서, 항 hTROP-2 모노클로날 항체는, 적어도 2 개 이상의 복수의 암 세포종에 대해, in vivo 에서의 유의한 종양 성장 저해 활성을 나타내는 것이 분명해졌다.
〔실시예 18〕
[항 hTROP2 항체 (클론 K5-70) 의, hTROP2 발현 췌암 세포주 (PK-59 세포) Xenograft prevention 모델에 있어서의 용량 의존적인 항종양 활성]
항 hTROP-2 항체의 in vivo 에 있어서의 종양 성장 저해 활성을, 보다 상세하게 검토하는 목적에서 용량 의존성 시험을 실시했다. 도 16 에 나타낸 바와 같이, PK-59 세포의 종양의 성장은 K5-70 의 투여에 의해 용량 의존적으로 저해되어, 항체 투여 후 21 일째 (Day 21) 에 있어서, 컨트롤군 (N = 7) 의 종양 체적이 937.8 ± 295.3 ㎣ 인 것에 대해, K5-70 (1 ㎎/㎏) 투여군 (N = 8) 이 493.5 ± 305.1 ㎣ 로 50 ％ 의 저해율을 나타내고, K5-70 (5 ㎎/㎏) 투여군 (N = 8) 이 124.7 ± 89.0 ㎣ 로 90 ％ 의 저해 효과를 나타내고, 공지된 항 TROP-2 항체 AR47A6.4.2 (미국 특허 제7420041호) 와 비교하여, 20 분의 1 의 투여량에서 거의 동등한 in vivo 에 있어서의 종양 성장 저해 효과를 나타내고, 4 분의 1 의 투여량에서는, 보다 높은 90 ％ 의 저해 효과를 나타내는 것이 밝혀졌다.
〔실시예 19〕
[에피토프 어세이]
인간/마우스 키메라 TROP -2 단백질의 제조
인간/마우스 키메라 TROP-2 유전자는 PCR 법을 이용하여 제조했다. 인간 TROP-2 유전자 배열 및 마우스 TROP-2 유전자 배열 (Genbank accession No. NM_020047) 을 기초로 이하에 나타내는 PCR 프라이머를 설계했다.
인간/마우스 TROP-2-C 프라이머
Y606 (포워드측) ： 5'-cctgagcctacgctgcgacgaagtggtgcg-3' (배열 번호 10)
Y607 (리버스측) ： 5'-cgcaccacttcgtcgcagcgtaggctcagg-3' (배열 번호 11)
인간/마우스 TROP-2-A 프라이머
Y612 (포워드측) ： 5'-gactgctccacgctgacttccaagtgcctg-3' (배열 번호 12)
Y613 (리버스측) ： 5'-caggcacttggaagtcagcgtggagcagtc-3' (배열 번호 13)
인간/마우스 TROP-2-B 프라이머
Y614 (포워드측) ： 5'-ctcgtggacaacgatggcctctacgacccg-3' (배열 번호 14)
Y615 (리버스측) ： 5'-cgggtcgtagaggccatcgttgtccacgag-3' (배열 번호 15)
마우스/인간 TROP-2-D 프라이머
Y608 (포워드측) ： 5'-ccaaagcctgcgctgcgatgagctggtgcgc-3' (배열 번호 16)
Y609 (리버스측) ： 5'-gcgcaccagctcatcgcagcgcaggctttgg-3' (배열 번호 17)
마우스/인간 TROP-2-E 프라이머
Y616 (포워드측) ： 5'-agcttcctatccgcggtgcactacgagcag-3' (배열 번호 18)
Y617 (리버스측) ： 5'-ctgctcgtagtgcaccgcggataggaagct-3' (배열 번호 19)
마우스/인간 TROP-2-F 프라이머
Y618(포워드측) ： 5'-gacattaaaggcgagtctctattccagggc-3' (배열 번호 20)
Y619 (리버스측) ： 5'-gccctggaatagagactcgcctttaatgtc-3' (배열 번호 21)
마우스 TROP-2 프라이머
포워드측 ： 5-ctactccaccccaccctggcg-3' (배열 번호 22)
리버스측 ： 5'-ctcgagcaagctaggttcgcttctc-3' (배열 번호 23)
마우스 TROP-2 리버스측 프라이머에는 스탑코돈을 제외하고, Xho I 에 의한 제한 효소 소화 배열을 부가했다. 제조한 인간/마우스 키메라 TROP-2 단백질의 모식도를 도 17 에 나타낸다.
hmTROP-2-A 키메라 단백질은 hTROP-2 단백질의 N 말단으로부터 69 번째까지의 폴리펩티드와 마우스 TROP-2 단백질의 64 번째로부터 C 말단까지의 폴리펩티드로 이루어지는 키메라 단백질이다. hmTROP2-B 키메라 단백질은 hTROP-2 단백질의 N 말단으로부터 101 번째까지의 폴리펩티드와 마우스 TROP-2 단백질의 96 번째로부터 C 말단까지의 폴리펩티드로 이루어지는 키메라 단백질이다. hmTROP2-C 키메라 단백질은 hTROP-2 단백질의 N 말단으로부터 145 번째까지의 폴리펩티드와 마우스 TROP-2 단백질의 140 번째로부터 C 말단까지의 폴리펩티드로 이루어지는 키메라 단백질이다. mhTROP-2-D 키메라 단백질은 마우스 TROP-2 단백질의 N 말단으로부터 139 번째까지의 폴리펩티드와 hTROP-2 단백질의 146 번째로부터 C 말단까지의 폴리펩티드로 이루어지는 키메라 단백질이다. mhTROP-2-E 키메라 단백질은 마우스 TROP-2 단백질의 N 말단으로부터 187 번째까지의 폴리펩티드와 hTROP-2 단백질의 194 번째로부터 C 말단까지의 폴리펩티드로 이루어지는 키메라 단백질이다. mhTROP-2-F 키메라 단백질은 마우스 TROP-2 단백질의 N 말단으로부터 227 번째까지의 폴리펩티드와 hTROP-2 단백질의 234 번째로부터 C 말단까지의 폴리펩티드로 이루어지는 키메라 단백질이다.
상기 키메라 단백질을 제조하기 위한 발현 벡터는 구체적으로는 이하의 방법으로 구축했다. hmTROP-2-A 키메라 유전자를 제조하기 위해 hTROP-2 유전자를 주형으로 하여, hTROP-2 포워드측 프라이머 및 인간/마우스 TROP-2-A 프라이머 Y613 을 이용하여 PCR 을 실시했다. 동일하게 마우스 TROP-2 유전자를 주형으로 하여, 인간/마우스 TROP-2-A 프라이머 Y612 및 마우스 TROP-2 리버스측 프라이머를 이용하여 PCR 을 실시했다. PCR 에 의해 증폭한 DNA 단편은 아크릴 아미드겔을 이용하여 전개, 목적 밴드의 추출에 의해 회수했다. 다음에 추출한 2 종류의 DNA 단편을 혼합하여 주형으로 하고, hTROP-2 포워드측 프라이머 및 마우스 TROP-2 리버스측 프라이머를 이용하여 PCR 을 실시했다. PCR 산물은 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 전개하여, 목적으로 하는 DNA 단편을 추출했다. 추출한 DNA 단편은 pCR (등록상표) -Blunt 벡터 (Invitrogen) 에 클로닝하여 (pCRB-hmTROP-2-A), 유전자 배열을 확인했다. 동물 세포용 발현 벡터는, pcDNA3.1-hTROP-2-myc/His 로부터 Eco RI/Xho I 소화에 의해 hTROP-2 유전자를 제외하고, pCRB-hmTROP-2-A 로부터 조제한 hmTROP-2-A 키메라 유전자를 포함하는 Eco RI/Xho I 단편을 삽입함으로써 제조했다 (pcDNA3.1-hmTROP-2-A-myc/His). 그 밖에 hmTROP-2-B (인간 TROP-2 포워드측 프라이머, 인간/마우스 TROP-2-B 프라이머 Y615, 인간/마우스 TROP-2-B 프라이머 Y614 및 마우스 TROP-2 리버스측 프라이머를 사용), hmTROP-2-C (인간 TROP-2 포워드측 프라이머, 인간/마우스 TROP-2-C 프라이머 Y607 및 인간/마우스 TROP-2-C 프라이머 Y606, 마우스 TROP-2 리버스측 프라이머를 사용), mhTROP-2-D (마우스 TROP-2 포워드측 프라이머, 마우스/인간 TROP-2-D 프라이머 Y609 및 마우스/인간 TROP-2-D 프라이머 Y608, 인간 TROP-2 리버스측 프라이머를 사용), mhTROP-2-E (마우스 TROP-2 포워드측 프라이머, 마우스/인간 TROP-2-E 프라이머 Y617 및 마우스/인간 TROP-2-E 프라이머 Y616, 인간 TROP-2 리버스측 프라이머를 사용), mhTROP-2-F (마우스 TROP-2 포워드측 프라이머, 마우스/인간 TROP-2-F 프라이머 Y619 및 마우스/인간 TROP-2-F 프라이머 Y618, 인간 TROP-2 리버스측 프라이머를 사용) 에 대해서도 동일한 방법으로 키메라 유전자를 제조하여, 발현 벡터를 구축했다 (pcDNA3.1-hmTROP-2-B-myc/His, pcDNA3.1-hmTROP-2-C-myc/His, pcDNA3.1-hmTROP-2-D-myc/His, pcDNA3.1-hmTROP-2-E-myc/His, pcDNA3.1-hmTROP-2-F-myc/His).
hTROP -2, 인간/마우스 키메라 TROP -2-C, 및 마우스/인간 키메라 TROP -2-D 단백질을 항상적으로 발현하는 HEK293 세포주의 수립
HEK293 세포주에 상기 발현 벡터 pcDNA3.1-hTROP-2-myc/His, pcDNA3.1-hmTROP-2-C-myc/His 및 pcDNA3.1-mhTROP-2-D-myc/His 를 각각 유전자 도입했다. 항생 물질 G418 (Calbiochem) 에 의한 선택을 실시하여, hTROP-2 단백질, hmTROP-2-C 키메라 단백질 및 mhTROP-2-D 키메라 단백질을 항상적으로 발현하는 HEK293 세포주를 수립했다.
췌장암 세포주 PK-59 를 사용한 Xenograft treatment 모델에 있어서, 약효를 나타낸 항 hTROP-2 모노클로날 항체 K5-70, T5-86, K5-107, T6-4, T6-16, K5-116-2-1 에 대해 결합 영역의 동정을 실시했다. 먼저 hmTROP-2-C, mhTROP-2-D, 각각의 키메라 단백질을 항상적으로 발현하는 HEK293 세포를 이용하여, 약효를 나타낸 항 hTROP-2 모노클로날 항체의 반응성을 FACS 해석에 의해 검토했다 (도 18). 그 결과, K5-70, K5-107, T5-86, K5-116-2-1 은 hmTROP-2-C 와 반응했지만 mhTROP-2-D 와는 반응하지 않았다. 한편, T6-4, T6-16 은 mhTROP-2-D 와 반응했지만 hmTROP-2-C 와는 반응하지 않았다. 이들의 점에서 K5-70, K5-107, T5-84, K5-116-2-1 의 결합 영역은 hTROP-2 의 N 말단으로부터 145 번째의 아미노산까지의 영역, T6-4, T6-16 의 결합 영역은 hTROP-2 의 146 번째의 아미노산으로부터 274 번째의 아미노산까지의 영역에 한정되었다 (도 18).
더욱 상세하게 결합 영역의 해석을 실시하기 위해 hmTROP-2-A, hmTROP-2-B, mhTROP-2-E 및 mhTROP-2-F 키메라 단백질 발현용 벡터를 제조하고, 약효를 나타내는 항 hTROP-2 모노클로날 항체와의 반응성을 검토했다 (도 19). 새롭게 제조한 키메라 단백 발현용 벡터를 HEK293 세포에 유전자 도입하여, 일과성으로 발현시킨 세포를 이용하여 FACS 해석을 실시했다. K5-70, K5-107, T5-86, K5-116-2-1 은 hmTROP-2-A 와는 반응했지만 mhTROP-2-B 와는 반응하지 않았다. 조사한 6 종류의 모노클로날 항체는 모두 hTROP-2 와는 반응을 나타냈다. 이 점에서 K5-70, K5-107, T5-86, K5-116-2-1 의 결합 영역은 hTROP-2 의 N 말단으로부터 69 번째의 아미노산까지의 영역에 존재하는 것이 분명해졌다. 또 T6-4, T6-16 은 mhTROP-2-E, mhTROP-2-F 모두 반응하지 않은 점에서, hTROP-2 의 146 번째에서 193 번째의 아미노산까지의 영역을 인식하는 것이 시사되었다.
〔실시예 20〕
[면역 조직 화학]
＜재료·방법＞
면역 조직 염색에 사용한 정상 및 암조직 어레이는 이하와 같다.
인간 정상 조직 어레이 ：
Human, Normal organs in duplicates (Catalog No. : AB1, Super Bio Chips)
Normal tissues more than single spots (Catalog No. : A103 (VI), ISU ABXIS)
폐암 조직 어레이 ：
Human Lung cancer-metastasis-normal (Catalog No. : CCA3, Super Bio Chips)
Human lung carcinoma tissue with margin tissue, 2 location cores (Catalog No. : OD-CT-RsLug03-002, Shanghai Outdo Biotech)
췌장암 조직 어레이 ：
Human Pancreas carcinoma tissue with mono-pathological type from 60 cases, 2 location cores (Catalog No. : OD-CT-DgPan03-001, Shanghai Outdo Biotech)
간장암 조직 어레이 ：
Hepatocellular carcinoma, grade I ～ Ⅲ with normal tissue controls, 63 cases tissue arrays (Catalog No. : CS03-01-002U, Cybrdi)
Human liver carcinoma tissue with mono-pathological type from 30 cases, 2 location cores (Catalog No. : OD-CT-DgLiv02-002, Shanghai Outdo Biotech)
대장암 조직 어레이 ：
Human, Colorectal cancer (Catalog No. : CD3, Super Bio Chips)
Human colon carcinoma with margin tissue, 2 location cores (Catalog No. : OD-CT-DgCol03-002, Shanghai Outdo Biotech)
대장암 림프절 전이, 간 전이 조직 어레이 ：
Colorectal (colon and rectum) cancer with matched lymph node metastasis tissue array, 44 cases/99 cores, trial slide (Catalog No. : CO991t, Biomax us)
Colorectal (colon and rectum) cancer with matched lymph node metastasis and normal adjacent tissue array, 43 cases/99 cores (Catalog No. : CO992, Biomax us)
Colon cancer tissues liver metastasis (Catalog No. : A203 (IV), ISU ABXIS)
유방암 조직 어레이 ：
Human, Breast cancer-metastasis-normal (Catalog No. : CBA3, Super Bio Chips)
Human breast carcinoma with margin tissue, 2 location cores (Catalog No. : OD-CT-RpBre03-002, Shanghai Outdo Biotech)
위암 조직 어레이 ：
Human, Stomach cancer (Catalog No.: CQ1, Super Bio Chips)
Human gastric carcinoma with margin tissue, 2 location cores (Catalog No. : OD-CT-DgStm03-002, Shanghai Outdo Biotech)
식도암 조직 어레이 ：
Human, Esophagus cancer (Catalog No.: CR1, Super Bio Chips)
Human esophagus carcinoma with margin tissue, 2 location cores (Catalog No. : OD-CT-DgEso03-002, Shanghai Outdo Biotech)
난소암 조직 어레이 ：
Human, Ovary cancer (Catalog No. : CJ1, Super Bio Chips
전립선암 조직 어레이 ：
Human, Prostate cancer-normal (Catalog No. : CA3, Super Bio Chips)
방광암 조직 어레이 ：
Bladder carcinoma / transitional cell carcinoma, grade I ～ Ⅲ with normal tissue arrays (Catalog No. : CC12-01-001 U, Cybrdi)
상기 조직 어레이의 환자 정보 및 임상 정보는 첨부한 데이터 시트 및 각 회사의 홈 페이지에서 입수했다.
면역 조직 염색법
인간 정상 조직 및 암조직의 조직 어레이 파라핀 절편은, 탈파라핀 처리 후, 37 ℃ 에서 5 분간 펩신에 의한 프로테아제 처리를 실시하여, 항 hTROP-2 모노클로날 항체를 이용한 면역 염색에 사용했다. DAB (3,3'-디아미노벤지딘) 를 기질로 하여 발색 반응을 실시한 후, 대비 염색으로서 헤마톡실린에 의한 핵 염색을 실시했다.
이들의 조작은 보다 구체적으로는 다음과 같이 하여 실시했다. 파라핀 포매된 절편을 탈파라핀 처리한 후, 37 ℃ 에서 5 분간 펩신 (DAKO) 에 의한 프로테아제 처리를 실시했다. 항원 부활화 후, 메탄올에 최종 농도 0.3 ％ 가 되도록 과산화수소수를 첨가한 용액에 의해, 실온에서 20 분간 처리하여 내인성의 퍼옥시다아제 활성을 제거했다. PBS 로 실온 5 분간의 세정을 2 회 실시한 후, 1.5 ％ 의 정상 말 혈청 (DAKO) 을 포함하는 PBS 용액을 사용하여 실온 30 분간의 블로킹을 실시하여, 조직 중의 비특이적 결합 부위를 막는 조작을 실시했다. 다음으로 1.5 ％ 의 정상 말 혈청을 포함하는 PBS 용액에 의해 희석한 항 hTROP-2 모노클로날 항체 clone K5-63-17 (최종 농도 10 ㎍/㎖) 을 실온에서 1 시간 반응시킨 후, PBS 로 실온 5 분간의 세정을 3 회 실시하고, 계속해서 1.5 ％ 의 정상 말 혈청을 포함하는 PBS 용액에 의해 200 배로 희석한 비오틴화 항마우스 IgG 항체 (Vector) 를 실온에서 30 분간 반응시켰다. PBS 에 의한 실온 5 분간의 세정을 3 회 실시한 후, Vectastain ABC 키트 (Vector) 의 시약을 설명서와 같이 혼합하여 ABC 컴플렉스를 만들고, 이것을 실온에서 30 분간 반응시켰다. PBS 로 실온 5 분간의 세정을 3 회 실시한 후, 히스토파인 퍼옥시다아제 기질 심플스테인 DAB 용액 (니치레이 바이오 사이언스) 에 의해 발색을 실시했다. 발색을 확인한 후, 탈이온수로 5 분간 세정하고, 마이어 헤마톡실린 용액 (와코 준야쿠) 에 의해 핵을 염색하고, 그 후 알코올로 탈수, 자일렌으로 투철하여 엔테란뉴 (머크·재팬 주식회사) 로 봉입했다.
＜결과＞
인간 정상 조직에 있어서의 hTROP - 2 의 발현
인간 정상 조직에 있어서의 hTROP-2 의 발현 패턴에 대해, 항 hTROP-2 모노클로날 항체 클론 K5-63-17 을 이용하여 해석했다. 인간 정상 조직 어레이 (Catalog No. : AB1, Super Bio Chips) 를 탈파라핀, 친수화 처리를 실시한 후, 단백질 분해 효소 펩신에 의한 항원의 부활화를 실시하고, 항 hTROP-2 모노클로날 항체 클론 K5-63-17 로 면역 염색을 실시했다 (도 20). 그 결과, 피부, 식도, 신장 (피질 및 수질), 췌장, 전립선, 방광, 편도선에서 염색이 보였다. 대부분의 염색상은 세포막에의 국재를 나타내고 있었는데 (도 20A, B, C, D, F, G, H), 일부 세포질에도 발현이 보였다 (도 20. E, H). 한편, 심장, 간장, 위, 소장, 대장, 골격근, 폐, 비장, 흉선 등에서는 염색되지 않았다 (도 20. I, J).
인간 암조직에 있어서의 hTROP - 2 의 발현
인간 암조직에 있어서의 hTROP-2 의 발현 (hTROP-2 의 양성률) 을 조사하기 위해, 항 hTROP-2 모노클로날 항체 클론 K5-63-17 을 이용하여, 인간의 각 암종의 암조직 어레이의 면역 염색을 실시했다. 암세포의 10 ％ 이상이 염색되는 조직 절편을 hTROP-2 양성으로 했다. 이 염색 결과를 표 4 에 나타냈다.
Figure pct00010
또, 대표적인 염색상을 도 21 에 나타냈다. hTROP-2 의 발현을 검토한 암종에서는, 전립선암에서 가장 양성률이 높고 (92.1 ％), 폐암 (65.4 ％), 식도암 (76.7 ％), 방광암 (71.2 ％) 등에서 높은 양성률이었다. 가장 양성률이 낮았던 것은 간장암으로 7.61 ％ 이었다. 암세포에서도 정상 세포와 동일하게, hTROP-2 는 세포막에 강하게 국재되어 있는 염색상이 보였다 (도 21. A ～ F, H, I). 또 일부는 세포질에도 발현되어 있었다 (도 21. A, B, E, G).
췌장암에서의 hTROP-2 의 양성률은 41.9 ％ 이었다. 이 때의 hTROP-2 양성률과 췌장암의 그레이드 (분화도) 의 관계에 대해 검토했다. 그 결과, 그레이드가 높은, 즉 저분화 췌장암에서 고빈도로 발현되어 있었다 (표 5).
Figure pct00011
〔실시예 21〕
[K5-70 항체의 단회 투여에 의한, 인간 췌장암 세포주 PK-59 Xenograft Prevention 모델에서의 항종양 효과]
클론 K5-70 (마우스 IgG2a) 의 in vivo 에 있어서의 강한 항종양 활성은, 인간 췌암 세포주 PK-59 를 사용한 Xenograft Prevention 모델에 있어서, 10 ㎎/㎏ 체중의 투여량으로 1 회 투여한 경우에 있어서도 나타났다. 컨트롤군 (마우스 IgG 10 ㎎/㎏ 체중, N = 3) 에서는 모든 개체에 있어서 종양 형성이 관찰되고, 세포 이식 후 28 일째 (Day 28) 에 있어서의 종양 체적은 781.7 ± 74.5 ㎣ 인 것에 대해, 암세포 이식일 (Day 1) 에 1 회 K5-70 을 투여한 군에서는 (10 ㎎/㎏ 체중, N = 3), Day 28 에 있어서의 종양 체적은 144.4 ± 176.9 ㎣ (P < 0.05 by Student's t-test) 로 81.5 ％ 의 종양 성장 저해 활성을 나타냈다 (도 22 A). 종양 중량에 있어서는, Day 28 에 있어서 컨트롤군이 0.59 ± 0.06 g 인 것에 대해, 클론 K-70 투여군에서는 0.07 ± 0.10 g (P < 0.01 by Student's t-test) 으로 88 ％ 의 저해 활성을 나타냈다 (도 22B). 종양 체적, 종양 중량의 어느 것에 있어서도, K5-70 투여군에서는 3 개체 중 2 개체에서는 1 회의 10 ㎎/㎏ 체중의 투여로, 완전히 종양 형성이 저해되었다 (도 22C).
〔실시예 22〕
[인간 대장암 세포주 SW480 세포 Xenograft treatment 모델에 있어서의 항인간 TROP-2 모노클로날 항체의 항종양 활성]
항인간 TROP-2 모노클로날 항체 (클론 K5-70, K5-116-2-1, T6-16) 의 항종양 활성을, 인간 대장암 세포주 SW480 을 사용한 Xenograft treatment 모델에서 검토했다. 5 × 106 cells 의 SW480 세포를 6 주령 암컷의 NOD-scid 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식 (Day 1) 하고, 평균의 종양 체적이 100 ㎣ 에 도달한 단계에서 군 분류를 실시하여 (Day 7 또는 Day 10), Day 7 또는 Day 10 으로부터 3 일에 1 회의 투여 간격으로, 항체의 복강 내 투여를 개시했다. 클론 K5-70 의 항종양 활성 평가와, 클론 K5-116-2-1 및 클론 T6-16 의 항종양 활성 평가는 각각 독립된 시험으로 평가했다. K5-70 의 항종양 활성 평가 시험에 있어서는, 암세포 이식으로부터 44 일째 (Day 44) 에 있어서의 컨트롤군 (마우스 IgG (10 ㎎/㎏ 체중), N = 8) 의 종양 체적이 365.4 ± 214.6 ㎣ 인 것에 대해, K5-70 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군에서는, 27.4 ± 29.4 ㎣ (P < 0.01 by Student's t-test) 로 현저하게 종양 형성이 저해되었다 (저해율 92.5 ％) (도 23A). 종양 중량에 있어서는, 컨트롤군이 0.11 ± 0.07 g 인 것에 대해, K5-70 투여군에서는 0.005 ± 0.007 (g) (P < 0.01 by Student's t-test) 으로 95.5 ％ 의 저해율이었다 (도 23B). 특히, K5-70 투여군에서는 8 개체 중 2 개체에서는 완전히 종양 형성이 저해되어 종양의 확인을 할 수 없었다.
별도로 실시한 K5-116-2-1 과 T6-16 의 항종양 활성 평가 시험에 있어서는, Day 42 에 있어서의 컨트롤군의 종양 체적이 713.8 ± 354.5 ㎣ (N = 8) 인 것에 대해, K5-116-2-1 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중) 에서는, 188.9 ± 97.4 ㎣ (N = 8, P < 0.01 by Student's t-test) (도 24A), T6-16 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중) 에서는, 292.8 ± 199.7 ㎣ (N = 8, P < 0.01 by Student's t-test) (도 25A) 로, 각각 73.5 ％, 59.0 ％ 의 저해율이었다. 종양 중량에 대해서도 동일하게, 컨트롤군에서는 0.39 ± 0.19 g 인 것에 대해, K5-116-2-1 투여군, T6-16 투여군에서는, 0.10 ± 0.07 g (P < 0.01 by Student's t-test), 0.17±0.14 g (P < 0.05 by Student's t-test) 으로, 각각 72.2 ％, 56.4 ％ 의 저해율을 나타냈다 (도 24B, 도 25B).
〔실시예 23〕
[인간 대장암 세포주 SW480 세포 Xenograft treatment 모델에 있어서의 클론 K5-70 의 용량 의존적인 항종양 활성]
다음으로, 클론 K5-70 (마우스 IgG2a) 의 용량 의존적인 항종양 활성을, 인간 대장암 세포주 SW480 을 사용한 Xenograft treatment 모델에 있어서 검토했다. 5 × 106 cells 의 SW480 세포를 6 주령 암컷 NOD-scid 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식하고, 이식으로부터 10 일 후 (Day 10) 에 평균의 종양 체적이 100 ㎣ 에 도달한 단계에서 컨트롤군 (마우스 IgG 10 ㎎/㎏ 체중 투여군, N = 8, 104.4 ± 17.6 ㎣), K5-70 (1 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (N = 8, 104.3 ± 16.1 ㎣), K5-70 (5 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (N = 8, 104.6 ± 15.9 ㎣), K5-70 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (N = 8, 104.8 ± 14.9 ㎣) 으로 군 분류를 실시하여, 3 일에 1 회의 복강 내 투여를 실시했다. Day 42 에 있어서의 컨트롤군의 종양 체적이 713.8 ± 354.5 ㎣ 인 것에 대해, K5-70 투여군에서는 용량 의존적인 종양 형성 저해 활성이 관찰되어, 1 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는 485.0 ± 207.3 ㎣ (저해율 32.1 ％), 5 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는 339.5 ± 253.2 ㎣ (저해율 52.4％), 10 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는 355.4 ± 202.8 ㎣ (저해율 50.2 ％, P < 0.05 by Student's t-test) 이었다 (도 26A). 동일하게, Day 42 에 있어서의 종양 중량에 대해서는, 컨트롤군이 0.39 ± 0.19 g 인 것에 대해, K5-70 (1 ㎎/㎏ 체중) 투여군에서는 0.24 ± 0.11 g (저해율 37.8 ％), 5 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는 0.17 ± 0.14 g (저해율 55.8 ％, P < 0.05 by Student's t-test), 10 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는 0.20 ± 0.13 g (저해율 47.1 ％) 이 되어, 용량 의존적인 항종양 활성이 확인되었다 (도 26B).
〔실시예 24〕
[인간 대장암 세포주 SW480 세포 Xenograft treatment 모델에 있어서의 클론 K5-70 의 투여 간격의 검토]
또한, 클론 K5-70 (마우스 IgG2a) 의 지적 투여 간격을 검토하기 위해서, 주에 1 회 (7 일에 1 회) 투여를 실시했을 때의 항종양 활성을, 인간 대장암 세포주 SW480 을 사용한 Xenograft treatment 모델에 있어서 검토했다. 5 × 106 cells 의 SW480 세포를 6 주령 암컷 NOD-scid 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식하고, 이식으로부터 10 일 후 (Day 10) 에 평균의 종양 체적이 100 ㎣ 에 도달한 단계에서 컨트롤군 (마우스 IgG 10 ㎎/㎏ 체중 투여군, N = 8, 104.4 ± 17.6 ㎣), K5-70 (10 ㎎/㎏ 체중, 주 1 회) 투여군 (N = 8, 104.3 ± 16.1 ㎣) 으로 군 분류를 실시하여, 7 일에 1 회의 복강 내 투여를 실시했다. Day 42 에 있어서의 컨트롤군의 종양 체적이 713.8 ± 354.5 ㎣ 인 것에 대해, K5-70 주 1 회 투여군에서는, 323.3 ± 239.9 ㎣ (저해율 55 ％, P < 0.05 by Student's t-test) 로 되고 (도 27A), 또한, 투여 간격을 10 일에 1 회, 2 주일에 1 회로 넓힌 경우에 있어서는, Day 39 에 있어서의 컨트롤군의 종양 체적이 956.9 ± 367.8 ㎣ 인 것에 대해, K5-70 투여군 (10 일에 1 회 투여) 에서는, 525.4 ± 180.6 ㎣ (저해율 45.1 ％, P < 0.01 by Student's t-test) 로 되고, K5-70 투여군 (14 일에 1 회 투여) 에서는 459.4 ± 217.6 ㎣ (저해율 52.0 ％, P < 0.01 by Student's t-test) 로 되고 (도 27B), 선행 기술 (US 7420040, US 7420041) 이 췌장암 세포주 (BxPC-3) 를 사용한 Xenograft treatment 모델에 있어서, 20 ㎎/㎏ 체중의 투여량으로, 주에 3 회 투여 (투여 간격 2 일간) 에서, 저해율 50 - 60 ％ 의 항종양 활성을 나타내고 있는데 대해, K5-70 항체는 1 회의 투여량이 절반의 투여량 (10 ㎎/㎏ 체중), 2 주일에 1 회의 투여 (투여 간격 12 일간) 에서, 선행 기술에 필적하는 항종양 활성을 나타내어, 1 회의 투여량과 투여 간격을 고려하면, 적어도 선행 기술의 12 분의 1 의 총 투여량으로 현저한 항종양 활성을 나타내는 것이 분명해졌다.
〔실시예 25〕
[인간 대장암 세포주 SW480 세포 Xenograft treatment 모델에 있어서의 클론 T6-16 의 용량 의존적인 항종양 활성]
다음으로, 클론 T6-16 (마우스 IgG2a) 의 용량 의존적인 항종양 활성을, 인간 대장암 세포주 SW480 을 사용한 Xenograft treatment 모델에 있어서 검토했다. 5 × 106 cells 의 SW480 세포를 6 주령 암컷 NOD-scid 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식하고, 이식으로부터 10 일 후 (Day 10) 에 평균의 종양 체적이 100 ㎣ 에 도달한 단계에서 컨트롤군 (마우스 IgG 10 ㎎/㎏ 체중 투여군, N = 8, 105.8 ± 9.9 ㎣), T6-16 (1 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (N = 8, 104.4 ± 13.3 ㎣), T6-16 (5 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (N = 8, 104.7 ± 13.0 ㎣), T6-16 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (N = 8, 104.8 ± 12.4 ㎣) 으로 군 분류를 실시하여, 3 일에 1 회의 복강 내 투여를 실시했다. Day 43 에 있어서의 컨트롤군의 종양 체적이 473.5 ± 137.0 ㎣ 인 것에 대해, T6-16 투여군에서는 용량 의존적인 종양 형성 저해 활성이 관찰되어, 1 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는 397.9 ± 97.5 ㎣ (저해율 16.0 ％), 5 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는 195.9 ± 89.7 ㎣ (저해율 58.7 ％, P < 0.01 by Student's t-test), 10 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는 190.2 ± 56.5 ㎣ (저해율 59.8 ％, P < 0.01 by Student's t-test) 이었다 (도 28A). 동일하게, Day 43 에 있어서의 종양 중량에 대해서는, 컨트롤군이 0.19 ± 0.07 g 인 것에 대해, T6-16 (1 ㎎/㎏ 체중) 투여군에서는 0.20 ± 0.08 g, 5 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는 0.08 ± 0.04 g (저해율 57.9 ％, P < 0.01 by Student's t-test), 10 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는 0.09 ± 0.04 g (저해율 52.6 ％, P < 0.01 by Student's t-test) 이 되어 용량 의존적인 항종양 활성이 확인되었다 (도 28B).
〔실시예 26〕
[인간 대장암 세포주 SW480 세포 Xenograft treatment 모델에 있어서의 클론 T6-16 의 투여 간격의 검토]
또한, 클론 T6-16 (마우스 IgG2a) 의 지적 투여 간격을 검토하기 위해서, 주에 1 회 (7 일에 1 회) 및 10 일에 1 회의 투여 간격에서의 항종양 활성을, 인간 대장암 세포주 SW480 을 사용한 Xenograft treatment 모델에 있어서 검토했다. 5 × 106 cells 의 SW480 세포를 6 주령 암컷 NOD-scid 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식하고, 이식으로부터 10 일 후 (Day 10) 에 평균의 종양 체적이 100 ㎣ 에 도달한 단계에서 컨트롤군 (마우스 IgG 10 ㎎/㎏ 체중 투여군, N = 8, 105.8 ± 9.9 ㎣), T6-16 (10 ㎎/㎏ 체중, 주 1 회) 투여군 (N = 8, 105.0 ± 11.6 ㎣), T6-16 (10 ㎎/㎏ 체중, 10 일에 1 회) 투여군 (N = 5, 130.8 ± 2.4 ㎣) 으로 군 분류를 실시하여 투여를 개시했다. Day 43 에 있어서의 컨트롤군의 종양 체적이 473.5 ± 137.0 ㎣ 인 것에 대해, T6-16 (주 1 회) 투여군에서는 243.7 ± 65.3 ㎣ (저해율 48.5 ％, P < 0.01 by Student's t-test), T6-16 (10 일에 1 회) 투여군에서는 297.8 ± 54.4 ㎣ (저해율 37.1 ％, P < 0.05 by Student's t-test) 로 되고 (도 29), 선행 기술 (US 7420040, US 7420041) 이 췌장암 세포주 (BxPC-3) 를 사용한 Xenograft treatment 모델에 있어서, 20 ㎎/㎏ 체중의 투여량으로, 주에 3 회 투여 (투여 간격 2 일간) 에서, 저해율 50 - 60 ％ 의 항종양 활성을 나타내고 있는데 대해, T6-16 항체는, 1 회의 투여량이 선행 기술의 절반의 용량으로, 10 일에 1 회의 투여 (투여 간격 8 일간) 에서, 현저한 항종양 활성을 나타내는 것이 분명해져, 1 회의 투여량과 투여 간격을 고려하면, 적어도 선행 기술의 8 분의 1 의 총 투여량으로 현저한 항종양 활성을 나타내는 것이 분명해졌다.
〔실시예 27〕
[인간 전립선암 세포주 DU-145 Xenograft Prevention 모델에 있어서의 항종양 활성의 검토]
클론 K5-70 의 인간 전립선암에 대한 항종양 활성을, DU-145 세포 (RIKEN Cell Bank, RCB2143) 를 사용한 Xenograft Prevention 모델에서 평가했다. 5 × 106 세포의 DU-145 세포를 6 주령 암컷 누드 마우스 (Balb/c, nu/nu) 의 피하에 이식하고, 이식 당일을 Day 1 로 하여, 컨트롤군 (N = 8) 과 K5-70 투여군 (N = 8) 으로 군 분류를 실시하여, Day 1 부터 3 일의 1 회의 빈도로 10 ㎎/㎏ 체중의 투여량으로 복강 내 투여를 실시했다. Day 40 에 있어서, 컨트롤군에 있어서의 종양 체적이 368.2 ± 307.8 ㎣ 인 것에 대해, K5-70 투여군에서는 30.6 ± 29.6 ㎣ (P < 0.05 by Student's t-test) 로 약 90 ％ 의 종양 형성 저해 활성을 나타냈다 (도 30A). 종양 중량에 있어서는, 또한 현저한 항종양 활성이 인정되어, Day 40 에 있어서의 컨트롤군의 종양 중량이 0.18 ± 0.18 g 인 것에 대해, K5-70 투여군에서는 8 개체의 전부에 있어서 종양이 소실되어 있어 완전히 종양 형성이 저해되었다 (도 30B). 이상의 결과에서, 항인간 TROP-2 모노클로날 항체 클론 K5-70 은 인간 전립선암에 대해서도 강한 항종양 활성을 나타내는 것이 분명해졌다.
〔실시예 28〕
[인간 췌암 세포주 PK-59 세포의 간 전이 모델을 사용한 클론 K5-70 의 전이 억제 활성]
소화기암의 치료에 있어서, 암의 전이는 임상 상의 예후를 좌우하는 중요한 인자로, 전이를 컨트롤하는 것은 치료상 중요한 의미를 갖는다. TROP-2 를 표적으로 한 암치료용 항체 투여에 의해, 종양 형성의 억제뿐만 아니라, 암세포의 다른 장기로의 전이를 억제하는 것이 가능하면, 높은 임상 상의 유용성이 기대되기 때문에, 암치료 항체로서 바람직한 특성이다.
TROP-2 는 많은 암종에 있어서의 발현이 확인되고 있는데, 특히 전이소에 있어서 고발현되고 있는 것이 나타나 있다 (Br. J. Cancer (2008) ; 99 : 1290-1295, Clin. Cancer Res. (2006) ; 12 : 3057-3063, Mod. Pathol. (2008) ; 21 : 186-191). 또한, Trop-2 유전자를 도입한 암세포를 경비적 (經脾的) 혹은 경췌적 (經膵的) 으로 누드 마우스에 이식한 경우에, 간 전이의 발증률이 증가하는 것 (WO 2010/089782, Molecular Cancer (2010) ; 9 : 253) 이 보고되어 TROP-2 의 암 전이 과정에 있어서의 중요성이 시사되고 있다. 그러나, TROP-2 를 표적으로 한 항체를 이용하여 in vivo 에서 전이 억제 작용을 구체적으로 나타낸 보고는 지금까지 확인되지 않는다.
본 발명에 의해 알아낸 항 hTROP-2 마우스 모노클로날 항체 K5-70 은 췌장암 세포를 피하에 이식한 제노그래프트 모델에 있어서 높은 치료 효과가 나타나고 있는데, 암세포의 증식 억제 효과에 추가하여, 췌암 세포 PK-59 의 유주능 (遊走能) 을 억제하는 것이, in vitro 의 스크래치 어세이에서 나타나고 있어 암의 전이를 in vivo 에 있어서도 억제할 가능성이 고려되었다. 그래서, 췌암 세포 PK-59 를 누드 마우스의 비장으로부터 주입하고, 간 전이를 발생시키는 모델을 사용하여 항 hTROP-2 마우스 모노클로날 항체의 전이 억제 효과를 검증했다.
hTROP-2 를 내재적으로 발현하는 췌암 세포주 (PK-59) 를 트립신 처리로 벗기고, PBS 로 2 × 107 cells/㎖ 의 세포 현탁액을 조제했다. 세포 현탁액은 이식시까지 빙상에 보관했다. 6 ～ 7 주령의 암컷 누드 마우스 (Balb/c, nu/nu) 를 펜토바르비탈의 복강 내 투여에 의해 마취하고, 마취하에서 좌측 복부를 10 ～ 15 ㎜ 절개하고, 비장을 복강 외로 꺼내어, 26 G 의 시린지를 이용하여 50 ㎕ 의 세포 현탁액 (1 x 106 cell) 을 비장 내에 주입했다. 세포 주입 4 분 후에 비문부 (脾門部) 를 5-0 silk 로 결찰하여 비장을 적출했다. 절개한 복막을 5-0 silk 로 폐쇄하고, Wound Clips (AUTOCLIP 9 ㎜, Becton Dickinson) 를 사용하여 폐복했다. 암세포 이식의 전날에, 마우스를 군 분류하고, 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (K5-70) 혹은 대조 항체 (정제 마우스 IgG) 를 10 ㎎/㎏ 체중으로 복강 내 투여했다. 또, 암세포 이식 7 일 후에, 동일하게 항체의 투여를 실시했다. 암세포 이식으로부터 4 ～ 6 주일 후에 경추 탈구에 의해 마우스를 안락사시키고, 간장을 적출하여, 전이소의 유무를 확인했다.
컨트롤로서 사용한 마우스 IgG 를 투여한 군에 있어서는, PK-59 세포를 이식한 6 마리의 마우스 중 4 마리에 있어서, 이식 후 4 내지 6 주일 후에 간엽 (肝葉) 변연부로의 분명한 전이소 (2 ～ 7 개) 가 확인되었다 (도 31A, 전이 발생률 67 ％, 표 6). 이것에 대해, K5-70 투여군에서는, PK-59 세포를 이식한 4 마리의 마우스에 있어서, 어느 개체에서도 전혀 간장으로의 전이소가 확인되지 않아, 전이 발생률은 0 ％ 였다 (도 31B, 표 6).
Figure pct00012
이들의 결과에서, 항 hTROP-2 항체 K5-70 은 췌암 세포 PK-59 의 간 전이에 대해 매우 강한 억제 작용을 갖는 것이 분명해졌다.
〔실시예 29〕
[대장암 세포주 SW480 Xenograft 모델에 있어서의 염산 이리노테칸 투여 후의 암재발 모델에 있어서의 K5-70 항체의 항종양 활성]
암 치료제로서 최근, 암세포의 증식을 억제하는 화학 요법제가 많이 개발되어 일정한 치료 성적을 올리고 있지만, 암세포 이외의 정상 세포에 대한 증식 억제 작용에 수반되는 부작용과 치료 중지 후의 암의 재발이 큰 문제가 되고 있다. 따라서, TROP-2 를 표적으로 한 암 치료용 항체 투여에 의해, 화학 요법제에 의한 치료 후의 종양 재발을 억제하는 것이 가능하면, 높은 임상 상의 유용성이 기대되기 때문에, 암치료 항체로서 바람직한 특성이다.
대장암의 치료제로서는 5-FU, 백금 제제에 추가하여, 토포이소머라아제 저해 효과를 갖는 염산 이리노테칸 (토포테신, 다이이치 산쿄 주식회사) 이 최근 임상 적응되어 동물 모델에 있어서도, 대장암을 비롯한 여러 가지의 인간 종양 세포를 이식한 마우스 모델에 있어서의 항종양 효과가 보고되어 있다 (Cancer Chemother Pharmacol. (1991) ; 28 (3) : 192-8). 그래서, 염산 이리노테칸 투여 후의 종양 재발에 대한 항 hTROP-2 항체 클론 K5-70 (마우스 IgG2a) 의 재발 예방 효과에 대해, 인간 대장암 세포주 SW480 을 사용한 Xenograft 모델에 있어서 검토했다. 5 × 106 cells 의 SW480 세포를 8 주령 암컷 NOD-scid 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식하고, 이식으로부터 11 일 후 (Day 11) 에 평균의 종양 체적이 100 ㎣ 이상에 도달한 단계에서 무처치군 (생리 식염수 투여군, N = 8, 130.7 ± 16.2 ㎣), 염산 이리노테칸 (CPT-11, 토포테신, 다이이치 산쿄 주식회사) 투여군 (N = 16, 123.0 ± 21.4 ㎣) 으로 군 분류를 실시하여, 염산 이리노테칸을 40 ㎎/㎏ 체중으로 3 일에 1 회, 합계 3 회 (Day 11, 14, 17) 복강 내 투여했다. 염산 이리노테칸의 최종 투여로부터 3 일째 (Day 20) 에, 무처치군의 종양 체적은 232.1 ± 21.1 ㎣ 에 도달한 것에 대해, 염산 이리노테칸 투여군은 126.6 ± 26.6 ㎣ (P < 0.01 by Student's t-test) 로, 분명한 종양 억제 효과가 인정되었다. 이 단계에서 종양 사이즈에 기초하여 염산 이리노테칸 투여군을 2 군으로 나누어, 한쪽 군은 K5-70 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (N = 8, Day 20 의 종양 체적 126.0 ± 28.0 ㎣) 으로 하고, 또 한쪽 군은 마우스 IgG (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (N = 8, Day 20 의 종양 사이즈 127.2 ± 27.0 ㎣) 으로 하고, 각각 3 일에 1 회의 복강 내 투여와 종양 체적의 측정을 실시하여 종양의 재발을 평가했다 (도 32). 마우스 IgG 투여군에서는, 염산 이리노테칸의 최종 투여로부터 18 일째 (Day 35) 부터 종양 체적이 300 ㎣ 를 초과하는 분명한 재발 종양을 갖는 개체가 복수 확인되고, 염산 이리노테칸의 최종 투여로부터 30 일째 (Day 47) 에 있어서는, 8 개 예 중 5 개 예에서 300 ㎣ 를 초과하는 종양이 확인되었다 (종양 평균 체적 401.7 ± 172.7 ㎣). 이것에 대해, K5-70 투여군에서는 현저하게 종양 재발이 억제되어 종양 평균 체적은 180.5 ± 142.1 ㎣ (P < 0.05 by Student's t-test) 이었다 (도 32). 특히, K5-70 투여군에서는, Day 47 에 있어서의 종양 체적이 군 분류시 (126.0 ± 28.0 ㎣) 보다 퇴축되어, 100 ㎣ 미만이 된 개체가 8 개 예 중 4 개 예 확인되었다. 이들의 결과에서, 항 hTROP-2 항체 K5-70 은 염산 이리노테칸 투여 후의 종양 재발에 대해서도 매우 강한 억제 작용을 갖는 것이 분명해졌다.
〔실시예 30〕
[CLIPS 기술을 이용한 에피토프 맵핑]
＜재료와 방법＞
펩티드 합성
본 실험에서 사용한 직사슬형 15-mer 및 30-mer 의 TROP-2 세포 외 영역에서 유래하는 펩티드는 Fmoc (9-Fluorenylmethoxycarbonyl) 법에 의한 고상 합성에 의해 취득했다. 또 불연속 에피토프 해석을 위해, 양단에 시스테인 잔기를 부가한 TROP-2 세포 외 영역에서 유래하는 17-mer 의 펩티드를 합성하고, CLIPS 기술 (Chemically Linked Peptides on Scaffolds technology) 에 의해 루프 구조를 1 개 또는 2 개 갖는 입체 구조를 재구축했다. 부가한 시스테인 잔기 근방에 다른 시스테인 잔기가 존재하는 경우, 알라닌으로 치환했다.
에피토프 스크리닝 ELISA
5034 종류의 합성된 펩티드를 PEPSCAN 카드 (445 펩티드/카드) 에 공유 결합시켜, ELISA 법에 의해 합성 펩티드와 항체의 결합을 검증했다. PEPSCAN 카드는 블로킹 버퍼 (4 ％ 말 혈청, 5 ％ 난백 알부민, 1 ％ Tween 을 포함하는 인산 완충액) 로 1 ㎍/㎖ 에 희석한 항인간 TROP-2 모노클로날 항체 (K5-70, K5-107, K5-116-2-1, T5-86, T6-16) 와 반응시켰다. 세정 후, 1000 배 희석한 퍼옥시다아제-2 차 항체 복합체와 25 ℃, 1 시간 반응시켰다. 세정 후, 기질 용액 (2,2'-azino-di-3-ethylbenzthiazoline sulfonate (ABTS) 와 2 ㎕ 의 3 ％ 과산화수소수를 함유하는 용액) 을 첨가하여 1 시간 발색 반응을 실시했다. 항체 결합 활성은 CCD 카메라로 촬영하고, 화상 해석을 실시하여 정량했다.
＜결과＞
약효를 나타낸 항인간 TROP-2 모노클로날 항체 K5-70, K5-107, K5-116-2-1, T5-86, T6-16 에 대해 CLIPS (Chemically Linked Peptides on Scaffolds) 기술을 이용하여 에피토프 해석을 실시했다. 또한, 이하, 본 실시예에 있어서 「아미노산 번호」란, 배열 번호 2 로 표시되는 아미노산 배열 (hTROP-2 단백질 (323 아미노산 잔기)) 중의 아미노산 번호를 의미한다.
K5-70 항체에 대한 해석 결과를 하기 표 7 에 나타낸다. 그 결과, 33 펩티드가 K5-70 항체와 강한 결합을 나타내는 것이 분명해졌다. 이들 33 펩티드 중에서, VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD (아미노산 번호 43-65) 를 포함하는 배열 (표 7 중 펩티드 No. 1-7, 9), HHILIDLRHRPTAG (아미노산 번호 152-165) 를 포함하는 배열 (표 7 중 펩티드 No. 14, 22-25, 28, 29, 31, 33), VHYEQPTIQIELRQ (아미노산 번호 193-206) 를 포함하는 배열 (표 7 중 펩티드 No. 8, 10, 12, 13, 15, 18, 20, 21, 23, 26, 28, 30, 32), DAELRRLFRER (아미노산 번호 171-183) 을 포함하는 배열 (표 7 중 펩티드 No. 11, 12, 14, 16, 18, 19, 21, 22, 25, 29, 31) 은 반복하여 출현했다. K5-70 항체는 특히 VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD 를 포함하는 배열에 강하게 결합했다. 이들의 결과에서, hTROP-2 단백질 중, 상기 4 종류의 펩티드 배열 영역이 K5-70 항체의 에피토프일 가능성이 시사되었다.
Figure pct00013
K5-107 에 대한 해석 결과를 하기 표 8 에 나타낸다. 그 결과, VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD (아미노산 번호 43-65) 를 포함하는 배열이 20 펩티드 중 10 펩티드 (표 8 중 펩티드 No. 1-6, 8, 13, 14, 17) 에 포함되어 있었다 (표 8).
따라서, hTROP-2 단백질 중, 상기 VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD 의 펩티드 배열 영역이 K5-107 항체의 에피토프인 것이 시사되었다.
Figure pct00014
K5-116-2-1 항체에 대한 해석 결과를 하기 표 9 에 나타낸다. 당해 해석에서는, VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD (아미노산 번호 43-65) 를 포함하는 배열 (표 9 중의 펩티드 No. 1-7, 15, 25), HHILIDLRHRPTAG (아미노산 번호 152-165) 를 포함하는 배열 (표 9 중의 펩티드 No. 8-11, 16, 17, 19, 20, 22-24, 27-29), DLDAELRRLFRER (아미노산 번호 171-183) 을 포함하는 배열 (표 9 중의 펩티드 No. 11-14, 17, 19, 21, 23, 29) 의 3 종류의 펩티드 배열이 복수회 출현했다 (표 9). 따라서, hTROP-2 단백질 중, 이들 3 종류의 펩티드 배열 영역이 K5-116-2-1 항체의 에피토프인 것이 시사되었다.
Figure pct00015
T5-86 및 T6-16 항체에 대한 해석 결과를 하기 표 10 및 표 11 에 나타낸다. 당해 해석에서는, DPEGRFKARQCN (아미노산 번호 109-120) 의 배열을 포함하는 펩티드와 강하게 결합했다. T5-86 항체에 대해서는 결합하는 26 펩티드 중 22 펩티드 (표 10 중의 펩티드 No. 1-3, 5-8, 10-13, 15-19, 21-26) 에, T6-16 항체에 대해서는 결합하는 26 펩티드 중 4 펩티드 (표 11 중의 펩티드 No. 1, 2, 9, 13) 에, 상기 펩티드 배열이 포함되어 있었다 (표 10 및 표 11). 또 T5-86 항체에 대한 해석에서는, DPEGRFKARQCN (아미노산 번호 109-120) 을 포함하는 배열 이외에도 VCSPDGPGGRCQCR (아미노산 번호 43-56) 을 포함하는 배열 (표 10 중의 펩티드 No. 4, 14, 20) 이 복수회 출현했다. 또한, T6-16 항체에 대한 해석에서도, 다른 배열로서 HHILIDLRHRPTAG (아미노산 번호 152-165) 를 포함하는 배열 (표 11 중의 펩티드 No. 4-8, 10-12, 19, 21, 23, 25, 26) 이 복수회 확인되었다. 따라서, T5-86 항체의 에피토프로서는, hTROP-2 단백질 중, DPEGRFKARQCN (아미노산 번호 109-120), VCSPDGPGGRCQCR (아미노산 번호 43-56) 의 2 종류의 펩티드 배열 영역이 시사되고, T6-16 항체의 에피토프로서는, hTROP-2 단백질 중, DPEGRFKARQCN (아미노산 번호 109-120), HHILIDLRHRPTAG (아미노산 번호 152-165) 의 2 종류의 펩티드 배열 영역이 시사되었다.
Figure pct00016
Figure pct00017
〔실시예 31〕
[마우스 항인간 TROP-2 항체 (클론 K5-70, K5-107, K5-116-2-1, T6-16) 의 항체 유전자의 가변 영역의 배열 결정]
3 × 106 개의 마우스 항 TROP-2 모노클로날 항체 산생 하이브리도마로부터, TRIzol 시약 (Invitrogen) 을 사용하여 전체 RNA 를 추출했다. 클론 K5-70, 클론 K5-107, 클론 K5-116-2-1 에 대해서는, SMARTerTM RACE cDNA Amplification kit (Clontech) 를 이용하여, 키트 첨부의 방법에 따라 마우스 IgG 의 H 사슬 특이적 프라이머 (5'-TCCAKAGTT-3' (배열 번호 24)) 와, L 사슬 특이적 프라이머 (5'-GCTGTCCTGATC-3' (배열 번호 25)) 를 이용하여 cDNA 를 합성했다. 클론 T6-16 에 대해서는, GeneRacer Kit (Invitrogen) 를 이용하여, 키트 첨부의 방법에 따라 올리고 dT 프라이머를 이용하여 cDNA 를 합성했다. 클론 K5-70 (마우스 IgG2a), 클론 K5-107 (마우스 IgG1), 및 클론 K5-116-2-1 (마우스 IgG2a) 의 H 사슬 및 L 사슬의 가변 영역 (VH, VL) 을 코드하는 유전자는, 상기 합성 후의 cDNA 를 주형으로 하여, PCR 법을 이용하여 클로닝했다. 이 때, 5'-프라이머는 SMARTerTM RACE cDNA Amplification kit 에 첨부되어 있는 10 × Universal Primer A Mix (UPM) 를 사용했다. 한편, 3'-프라이머는, VH 증폭용 3'-프라이머로서는 마우스 IgG H 사슬에 특이적인 배열을 갖는 것을 사용하고, VL 증폭용 3'-프라이머로서는 마우스 IgG L 사슬에 특이적인 배열을 갖는 것을 사용했다.
5'-프라이머 (10 × Universal Primer A Mix (UPM)) ：
Long (0.4 μM)
5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' (배열 번호 26)
Short (2 μM)
5'- CTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (배열 번호 27)
3'-프라이머 (R 프라이머) ：
VH ： 5'-GGGAARTARCCCTTGACCAGGCA-3' (배열 번호 28)
5'-GGGAARTAGCCTTTGACAAGGCA-3' (배열 번호 29)
VL ： 5'-CACTGCCATCAATVTTCCACTTGACA-3' (배열 번호 30)
상기 각 프라이머를 사용한 PCR 은 이하의 반응액 조성 및 반응 조건으로 실시했다. 또 VH 의 cDNA 증폭의 R 프라이머는 상기의 2 배열을 동일 몰수씩 혼합하여 사용했다.
＜반응액 조성＞
주형 cDNA : 2.5 ㎕
5 × PrimeSTAR 버퍼 (Mg2 + plus) : 10 ㎕
2.5 mM dNTP : 4 ㎕
PrimeSTAR HS DNA 폴리머라아제 (2.5 U/㎕) : 0.5 ㎕
10 × Universal Primer A Mix (UPM) : 5 ㎕
R 프라이머 (10 μM) : 1 ㎕
멸균수 ： 27 ㎕
합계 ： 50 ㎕
＜반응 조건＞
94 ℃ (10 sec) 반응시킨 후, 「열변성·해리 ： 98 ℃ (10 sec) → 어닐링 ： 60 ℃ (5 sec) → 합성·신장 ： 72 ℃ (60 sec)」를 1 사이클로 하여 합계 30 사이클 반응시킨 후, 최후에 72 ℃ (3 min) 반응시켰다.
합성한 VH 및 VL 의 cDNA 를, pMD20-T vector (다카라 바이오) 에 서브 클로닝하여 염기 배열을 결정했다. 복수의 VH 클론 및 VL 클론의 염기 배열을 해독하여, 마우스 H 사슬 및 L 사슬의 가변 영역에 전형적인 염기 배열을 동정했다. 도 33 및 도 34 에, K5-70 의 VH 및 VL 의 콘센서스 cDNA 염기 배열, 그리고 추정 아미노산 배열을 나타냈다. 도 35 및 도 36 에, K5-107 의 VH 및 VL 의 콘센서스 cDNA 염기 배열, 그리고 추정 아미노산 배열을 나타냈다. 도 37 및 도 38 에, K5-116-2-1 의 VH 및 VL 의 콘센서스 cDNA 염기 배열, 그리고 추정 아미노산 배열을 나타냈다.
클론 T6-16 의 H 사슬 및 L 사슬의 가변 영역 (VH, VL) 을 코드하는 유전자는 상기 합성 후의 cDNA 를 주형으로 하여 PCR 법을 이용하여 클로닝했다. 이 때, 5'-프라이머는 GeneRacer Kit 에 첨부되어 있는 것을 사용했다. 한편, 3'-프라이머는 VH 증폭용 3'-프라이머로서는 마우스 IgG H 사슬에 특이적인 배열을 갖는 것을 사용하고, VL 증폭용 3'-프라이머로서는 마우스 IgG L 사슬에 특이적인 배열을 갖는 것을 사용했다.
5'-프라이머 (F 프라이머) ：
5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3' (배열 번호 31)
3'-프라이머 (R 프라이머) ：
VH : 5'-GCCAGTGGATAGACAGATGG-3' (배열 번호 32)
VL : 5'-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3' (배열 번호 33)
상기 각 프라이머를 사용한 PCR 은 이하의 반응액 조성 및 반응 조건으로 실시했다.
＜반응액 조성＞
주형 cDNA ： 1.0 ㎕
5 × PrimeSTAR 버퍼 (Mg2 + plus) ： 10 ㎕
2.5 mM dNTP ： 4 ㎕
PrimeSTAR HS DNA 폴리머라아제 (2.5 U/㎕)： 0.5 ㎕
F 프라이머 (10 μM) ： 3 ㎕
R 프라이머 (10μM) ： 1.0 ㎕
멸균수 ： 30.5 ㎕
합계 ： 50 ㎕
＜반응 조건＞
「열변성·해리 ： 98 ℃ (10 sec) → 어닐링 ： 57 ℃ (10 sec) → 합성·신장 ： 72 ℃ (60 sec)」를 1 사이클로 하여 합계 35 사이클.
합성한 VH 및 VL 의 cDNA 를, pCR4Blunt-TOPO vector (Invitrogen) 에 서브 클로닝하여, 염기 배열을 결정했다. 복수의 VH 클론 및 VL 클론의 염기 배열을 해독하여, 마우스 H 사슬 및 L 사슬의 가변 영역에 전형적인 염기 배열을 동정했다. 도 39 및 도 40 에, T6-16 의 VH 및 VL 의 콘센서스 cDNA 염기 배열, 그리고 추정 아미노산 배열을 나타냈다.
산업상 이용가능성
본 발명에 의하면, hTROP-2 와 특이적으로 반응하고, in vivo 에 있어서 높은 항종양 활성을 갖는 항체, 특히, 저용량으로 in vivo 에서의 높은 항종양 활성을 갖는 모노클로날 항체를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 당해 항체를 산생하는 하이브리도마, 당해 항체의 단편, 당해 항체 등과 각종 약제의 복합체, 종양의 진단용 또는 치료용 의약 조성물, 종양의 검출 방법, 종양의 검출용 또는 진단용 키트를 제공할 수 있다.
배열표 프리 텍스트
배열 번호 3 ： 합성 DNA
배열 번호 4 ： 합성 DNA
배열 번호 5 ： 합성 DNA
배열 번호 6 ： 합성 DNA
배열 번호 7 ： 합성 DNA
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배열 번호 20 ： 합성 DNA
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배열 번호 22 ： 합성 DNA
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배열 번호 27 ： 합성 DNA
배열 번호 28 ： 합성 DNA
배열 번호 29 ： 합성 DNA
배열 번호 30 ： 합성 DNA
배열 번호 31 ： 합성 DNA
배열 번호 32 ： 합성 DNA
배열 번호 33 ： 합성 DNA
독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 FERMBP-11251 20100512 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 FERMBP-11252 20100512 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 FERMBP-11253 20100512 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 FERMBP-11254 20100512 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 FERMBP-11346 20110301
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100 105 110 tat tac tgt aca aga tca tcc gtt ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc 384 Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Ser Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 act ctc aca gtc tcc tca 402 Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 <210> 45 <211> 134 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg His Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asp 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Ser Lys Gly Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Ser Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 46 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 47 <211> 17 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 47 Asn Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 48 <211> 6 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 48 Ser Ser Val Phe Asp Tyr 1 5 <210> 49 <211> 381 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(381) <400> 49 atg gta tcc aca cct cag ttc ctt gta ttt ttg ctt ttc tgg att cca 48 Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro 1 5 10 15 gcc tcc aga ggt gac atc ttg ctg act cag tct cca gcc atc ctg tct 96 Ala Ser Arg Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser 20 25 30 gtg agt cca gga gaa aga gtc agt ttc tcc tgc agg gcc agt cag aac 144 Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn 35 40 45 att ggc aca agc ata cac tgg ttt cag caa aga aca aat ggt tct cca 192 Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Phe Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro 50 55 60 agg ctt ctc ata aag tat gct tct gag tct atc tct ggg atc cct tcc 240 Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 agg ttt agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttt act ctt agc atc aac 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn 85 90 95 agt gtg gag tct gaa gat att gca gat tat tac tgt caa caa agt aat 336 Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 100 105 110 agc tgg cca ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 381 Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 50 <211> 127 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 50 Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro 1 5 10 15 Ala Ser Arg Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser 20 25 30 Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn 35 40 45 Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Phe Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn 85 90 95 Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 100 105 110 Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 51 Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser Ile His 1 5 10 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 52 Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 53 Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Phe Thr 1 5 <210> 54 <211> 396 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(396) <400> 54 atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca gct aca ggt 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 gtc cac tcc cag gtc caa ctg cag cag cct ggg gct gag ctg gtg agg 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg 20 25 30 cct ggg gct tca gtg aag ctg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 acc agc tac tgg ata acc tgg gtg aag cag agg cct gga caa ggc ctt 192 Thr Ser Tyr Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg atc gga aat att tat cct tct gat agt tat act aac tac aat 240 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 caa aag ttc agg gac aag gcc aca ttg act gta gac aaa tcc tcc agt 288 Gln Lys Phe Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 aca gcc tac atg cag ctc agc agc ccg aca tct gag gac tct gcg gtc 336 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat tac tgt tca gcc ctc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc act ctc 384 Tyr Tyr Cys Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 115 120 125 aca gtc tcc tca 396 Thr Val Ser Ser 130 <210> 55 <211> 132 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 55 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 56 <211> 5 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 56 Ser Tyr Trp Ile Thr 1 5 <210> 57 <211> 17 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 57 Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 Asp <210> 58 <211> 4 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 58 Leu Phe Asp Tyr 1 <210> 59 <211> 381 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(381) <400> 59 atg gta tcc aca cct cag ttc ctt gta ttt ttg ctt ttc tgg att cca 48 Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro 1 5 10 15 gcc tcc aga ggt gac atc ttg ctg act cag tct cca gcc atc ctg tct 96 Ala Ser Arg Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser 20 25 30 gtg agt cca gga gaa aga gtc agt ttc tcc tgc agg gcc agt cag agc 144 Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 att ggc aca agc ata cac tgg tat cag caa aga aca aat ggt tct cca 192 Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro 50 55 60 agg ctt ctc ata aag tat gct tct gag tct atc tct ggg atc cct tcc 240 Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 agg ttt agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttt att ctt agc atc aac 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Ser Ile Asn 85 90 95 agt gtg gag tct gaa gat att gca gat tat tac tgt caa caa agt aat 336 Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 100 105 110 agc tgg cca ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 381 Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 60 <211> 127 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 60 Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro 1 5 10 15 Ala Ser Arg Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser 20 25 30 Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Ser Ile Asn 85 90 95 Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 100 105 110 Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 61 <211> 11 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 61 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser Ile His 1 5 10 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 62 Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 63 Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Phe Thr 1 5 <210> 64 <211> 423 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(423) <400> 64 atg gga tgg agc tgg atc ttt ctc ttc ctc ctg tca gga act gca ggc 48 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 gtc cac tct gag gtc cag ctt cag cag tca gga cct gag ctg gtg aaa 96 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 cct ggg gcc tca gtg aag att tcc tgc aag gct tct gga tac aca ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 act gac tac aat atg cac tgg gtg aag cag agc cat gga aag aac ctt 192 Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu 50 55 60 gaa tgg att gga tat att tat cct tac aat ggt ggt act ggc tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 cag agg ttc aag agc agg gcc aca atg act gta gac aaa tcc tcc agc 288 Gln Arg Phe Lys Ser Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 aca gcc tac atg gag ctc cgc agc ctg aca tct gat gac tct gca gtc 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca aga gaa gac tac ggt agt agc ccc tct tat gct atg 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Pro Ser Tyr Ala Met 115 120 125 gac tat tgg ggt caa gga acc tca gtc atc gtc tcc tca 423 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Ile Val Ser Ser 130 135 140 <210> 65 <211> 141 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 65 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Arg Phe Lys Ser Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Pro Ser Tyr Ala Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Ile Val Ser Ser 130 135 140 <210> 66 <211> 5 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 66 Asp Tyr Asn Met His 1 5 <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 67 Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Arg Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 68 <211> 13 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 68 Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Pro Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 69 <211> 390 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(390) <400> 69 atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct 48 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 tcc agc agt gat gtt gtg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 agt ctt gga gat cag gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc ctt 144 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 gta cac ggt aat gga aac acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca 192 Val His Gly Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg acg gat ttc aca 288 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc 336 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 tct caa act aca cat gtt ccc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa 384 Ser Gln Thr Thr His Val Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125 ata aaa 390 Ile Lys 130 <210> 70 <211> 130 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 70 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Val His Gly Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 Ser Gln Thr Thr His Val Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125 Ile Lys 130 <210> 71 <211> 16 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 71 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Gly Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 72 <211> 7 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 72 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 73 <211> 8 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 73 Ser Gln Thr Thr His Val Pro Thr 1 5

Claims (68)

  1. in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 인간 TROP-2 에 대한 항체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    5 ～ 20 ㎎/㎏ 체중의 투여량으로 50 ％ 이상의 종양 성장 저해 활성을 나타내는 것인 항체.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 종양 성장 저해 활성을 나타내기 위한 투여 횟수가 많아도 1 주일에 1 회인 항체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    10 ㎎/㎏ 체중의 단회 투여로 50 ％ 이상의 종양 성장 저해 활성을 나타내는 것인 항체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    2 종 이상의 인간 종양 세포주에 대해 항종양 활성을 갖는 항체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해리 정수 (Kd 값) 가 1.0 × 10-10 M 이하인 항체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 모노클로날 항체인 항체.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양이 인간 췌암, 인간 전립선암, 인간 대장암 및 인간 유방암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 항체.
  9. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양이 인간 췌암인 항체.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양이 재발암 또는 전이암인 항체.
  11. 제 5 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양 세포주가 인간 췌암 세포주 PK-59, 인간 췌암 세포주 BxPC-3, 인간 췌암 세포주 KP-3L, 인간 췌암 세포주 KP-2, 인간 췌암 세포주 PK-1, 인간 췌암 세포주 PK-45H, 인간 췌암 세포주 PK-45P, 인간 췌암 세포주 TCC-PAN2, 인간 췌암 세포주 SUIT-2, 인간 대장암 세포주 CACO-2, 인간 대장암 세포주 SW480, 인간 대장암 세포주 DLD-1, 인간 대장암 세포주 HCT 116, 인간 유방암 세포주 JIMT-1, 인간 유방암 세포주 HCC1143, 인간 유방암 세포주 MCF-7, 인간 전립선암 세포주 DU145 및 인간 전립선암 세포주 PC-3 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2 종인 항체.
  12. 제 5 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양 세포주가 인간 췌암 세포주 PK-59 및 인간 췌암 세포주 BxPC-3 인 항체.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체의 H 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 36 ～ 38 로 표시되는 아미노산 배열이고, 및/또는, 항체의 L 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 41 ～ 43 으로 표시되는 아미노산 배열인 항체.
  14. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체의 H 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 46 ～ 48 로 표시되는 아미노산 배열이고, 및/또는, 항체의 L 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 51 ～ 53 으로 표시되는 아미노산 배열인 항체.
  15. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체의 H 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 56 ～ 58 로 표시되는 아미노산 배열이고, 및/또는, 항체의 L 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 61 ～ 63 으로 표시되는 아미노산 배열인 항체.
  16. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체의 H 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 66 ～ 68 로 표시되는 아미노산 배열이고, 및/또는, 항체의 L 사슬 V 영역의 CDR 1 ～ 3 의 아미노산 배열이 각각 차례로 배열 번호 71 ～ 73 으로 표시되는 아미노산 배열인 항체.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 유전자 재조합 항체인 항체.
  18. 제 17 항에 있어서,
    유전자 재조합 항체가 키메라 항체, 인간형화 항체 또는 인간화 항체인 항체.
  19. 제 18 항에 있어서,
    키메라 항체는 H 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 35 로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지고, 및/또는, L 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 40 으로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 것인 항체.
  20. 제 18 항에 있어서,
    키메라 항체는 H 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 45 로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지고, 및/또는, L 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 50 으로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 것인 항체.
  21. 제 18 항에 있어서,
    키메라 항체는 H 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 55 로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지고, 및/또는, L 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 60 으로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 것인 항체.
  22. 제 18 항에 있어서,
    키메라 항체는 H 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 65 로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지고, 및/또는, L 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 70 으로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 것인 항체.
  23. 수령 번호가 FERM BP-11251 인 하이브리도마에 의해 산생되는, 인간 TROP-2 에 대한 모노클로날 항체.
  24. 수령 번호가 FERM BP-11252 인 하이브리도마에 의해 산생되는, 인간 TROP-2 에 대한 모노클로날 항체.
  25. 수령 번호가 FERM BP-11253 인 하이브리도마에 의해 산생되는, 인간 TROP-2 에 대한 모노클로날 항체.
  26. 수령 번호가 FERM BP-11346 인 하이브리도마에 의해 산생되는, 인간 TROP-2 에 대한 모노클로날 항체.
  27. 수령 번호가 FERM BP-11254 인 하이브리도마에 의해 산생되는, 인간 TROP-2 에 대한 모노클로날 항체.
  28. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    수령 번호가 FERM BP-11251, FERM BP-11252, FERM BP-11253, FERM BP-11346 또는 FERM BP-11254 인 하이브리도마에 의해 산생되는 모노클로날 항체가 결합하는 부위에 결합하는 항체.
  29. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    배열 번호 2 로 표시되는 인간 TROP-2 의 아미노산 배열 중의, 제 43 번째 ～ 제 65 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 제 152 번째 ～ 제 165 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 제 171 번째 ～ 제 183 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 제 109 번째 ～ 제 120 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 제 43 번째 ～ 제 56 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 및 제 193 번째 ～ 제 206 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 영역을 포함하는 부분과 결합하는 것인 항체.
  30. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    배열 번호 2 로 표시되는 인간 TROP-2 의 아미노산 배열 중의, 제 43 번째 ～ 제 65 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역을 포함하는 부분과 결합하는 것인 항체.
  31. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    배열 번호 2 로 표시되는 인간 TROP-2 의 아미노산 배열 중의, 제 152 번째 ～ 제 165 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역을 포함하는 부분과 결합하는 것인 항체.
  32. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    배열 번호 2 로 표시되는 인간 TROP-2 의 아미노산 배열 중의, 제 171 번째 ～ 제 183 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역을 포함하는 부분과 결합하는 것인 항체.
  33. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    배열 번호 2 로 표시되는 인간 TROP-2의 아미노산 배열 중의, 제 109 번째 ～ 제 120 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역을 포함하는 부분과 결합하는 것인 항체.
  34. 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 기재된 항체에서 유래하는 항체 단편.
  35. 제 34 항에 있어서,
    배열 번호 36 ～ 38 로 표시되는 아미노산 배열, 및/또는, 배열 번호 41 ～ 43 으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 것인 항체 단편.
  36. 제 35 항에 있어서,
    배열 번호 35 로 표시되는 아미노산 배열, 및/또는, 배열 번호 40 으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 것인 항체 단편.
  37. 제 34 항에 있어서,
    배열 번호 46 ～ 48 로 표시되는 아미노산 배열, 및/또는, 배열 번호 51 ～ 53 으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 것인 항체 단편.
  38. 제 37 항에 있어서,
    배열 번호 45 로 표시되는 아미노산 배열, 및/또는, 배열 번호 50 으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 것인 항체 단편.
  39. 제 34 항에 있어서,
    배열 번호 56 ～ 58 로 표시되는 아미노산 배열, 및/또는, 배열 번호 61 ～ 63 으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 것인 항체 단편.
  40. 제 38 항에 있어서,
    배열 번호 55 로 표시되는 아미노산 배열, 및/또는, 배열 번호 60 으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 것인 항체 단편.
  41. 제 34 항에 있어서,
    배열 번호 66 ～ 68 로 표시되는 아미노산 배열, 및/또는, 배열 번호 71 ～ 73 으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 것인 항체 단편.
  42. 제 41 항에 있어서,
    배열 번호 65 로 표시되는 아미노산 배열, 및/또는, 배열 번호 70 으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 것인 항체 단편.
  43. 제 1 항 내지 제 22 항 및 제 28 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 산생하는 하이브리도마.
  44. 수령 번호가 FERM BP-11251 인, 인간 TROP-2 에 대한 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마.
  45. 수령 번호가 FERM BP-11252 인, 인간 TROP-2 에 대한 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마.
  46. 수령 번호가 FERM BP-11253 인, 인간 TROP-2 에 대한 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마.
  47. 수령 번호가 FERM BP-11346 인, 인간 TROP-2 에 대한 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마.
  48. 수령 번호가 FERM BP-11254 인, 인간 TROP-2 에 대한 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마.
  49. 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 기재된 항체와, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 물질을 포함하는 항체-약제 복합체.
  50. 제 34 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 단편과, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 물질을 포함하는 항체 단편-약제 복합체.
  51. 제 49 항 또는 제 50 항에 있어서,
    종양이 인간 췌암, 인간 전립선암, 인간 대장암 및 인간 유방암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 복합체.
  52. 제 49 항 또는 제 50 항에 있어서,
    종양이 인간 췌암인 복합체.
  53. 제 49 항 또는 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양이 재발암 또는 전이암인 복합체.
  54. 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 제 34 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 단편, 및 제 49 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 의약 조성물.
  55. 제 54 항에 있어서,
    종양의 치료에 사용하는 것인 조성물.
  56. 제 55 항에 있어서,
    체중 감소의 부작용을 가지지 않는 것인 조성물.
  57. 제 54 항에 있어서,
    종양의 진단에 사용하는 것인 조성물.
  58. 제 54 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양이 인간 췌암, 인간 전립선암, 인간 대장암 및 인간 유방암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 조성물.
  59. 제 55 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양이 재발암 또는 전이암인 조성물.
  60. 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 제 34 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 단편, 및 제 49 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양 치료제.
  61. 제 60 항에 있어서,
    체중 감소의 부작용을 가지지 않는 것인 치료제.
  62. 제 60 항 또는 제 61 항에 있어서,
    종양이 인간 췌암, 인간 전립선암, 인간 대장암 및 인간 유방암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 치료제.
  63. 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 제 34 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 단편, 및 제 49 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양 진단제.
  64. 제 63 항에 있어서,
    종양이 인간 췌암, 인간 전립선암, 인간 대장암 및 인간 유방암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 진단제.
  65. 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 제 34 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 단편, 및 제 49 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종과, 생체로부터 채취된 시료를 반응시키고, 반응한 항체 및/또는 항체 단편의 시그널을 검출하는 것을 특징으로 하는 종양의 검출 방법.
  66. 제 65 항에 있어서,
    종양이 인간 췌암, 인간 전립선암, 인간 대장암 및 인간 유방암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 방법.
  67. 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 제 34 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 단편, 및 제 49 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양의 치료용, 진단용 또는 검출용 키트.
  68. 제 67 항에 있어서,
    종양이 인간 췌암, 인간 전립선암, 인간 대장암 및 인간 유방암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 키트.
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