KR20130020784A - N-아세틸글루코사민-6-포스페이트를 포함하는 화장 및 약학 조성물 - Google Patents

N-아세틸글루코사민-6-포스페이트를 포함하는 화장 및 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 또는 이의 염 및, 임의로, 비타민 A 계열의 화합물을 포함하는 화장 또는 약학 조성물, 및 또한 이를 함유하는 장치에 관한 것이다.

Description

N-아세틸글루코사민-6-포스페이트를 포함하는 화장 및 약학 조성물{COSMETIC AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING N-ACETYLGLUCOSAMINE-6-PHOSPHATE}
본 발명은 화장품 및 치료학 분야에 관한 것이다.
D-글루코사민(글루코사민)은 아미노 당이며, 글리코실화 단백질 및 지질의 생화학적 합성에서 중요한 전구체이다. 이것은 이의 치료적 효용성이 전세계적으로 허용되지는 않았음에도 불구하고 골관절염의 치료에 통상 사용된다. 글루코사민은 연골 형성 및 복구를 촉진하는 것으로 여겨진다. 2001년(Reginster et al., 2001, Lancet, 357, 251-6)에 공개된, 골관절염을 가진 212명의 환자에서의 3년간의, 이중-블라인드 임상 실험에서는 글루코사민 그룹에서의 증상의 20-25% 개선 대 플라시보 그룹에서의 약간의 악화가 보고되었다. 무릎의 방사선 사진은 글루코사민을 섭취한 환자의 절반에 대해 유의한 관절 공간 좁아짐(질환 진행의 징후)을 나타냈다.
D-N-아세틸글루코사민(N-아세틸글루코사민)은 보다 나은 안정성을 가진 글루코사민 유도체이다. 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민은 생화학적 과정 중의 핵심 대사물이고, 인간 및 동물에서 구조적 중합체에 존재한다. 상기 중합체 중에서, 글리코사미노글리칸은 반복 이당류 단위로 이루어진 긴 비분지형 다당류이다. 반복 단위는 헥소사민(N-아세틸글루코사민과 같은 질소를 함유하는 6탄당)에 연결된, 헥소오스(6탄당) 또는 헥수론산이다. 글리코사미노글리칸의 예는 콘드로이틴 술페이트(탄성 연골, 히알린 연골, 뼈, 진피, 각질층), 데르마탄 술페이트(진피, 힘줄, 인대, 섬유연골), 케라틴 술페이트(연골, 각질층), 헤파인/헤파란 술페이트(간, 폐, 대동맥) 및 히알루로난(피부)이다.
글리코사미노글리칸은 결합 조직의 중요한 성분을 형성하고, 유기 물질의 30% 까지에 달할 수 있다. 글리코사미노글리칸 사슬은 단백질에 공유적으로 연결되어 프로테오글리칸을 형성할 수 있다. 당 서브유닛의 밀도 및 이들의 음이온을 끌어당기는 전하로 인해, 물이 글리코사미노글리칸에 붙어, 조직에 압력에 대한 증가된 저항성을 제공한다. 글리코사미노글리칸 용도의 예에는 항응고제로서 헤파린, 결합 조직, 연골 및 힘줄에서 발견될 수 있는 콘드로이틴, 피부의 세포외 구조의 성분 및 관저 내의 활액 윤활제인 히알루로난이 포함된다.
이들의 기계적, 구조적 및 생리학적 기능에 의해, 글리코사미노글리칸은 생명에 중요한 중합체이고 이들의 대사 조절은 인간 및 동물 건강에서 중요한 인자이다. 그러므로, 글리코사미노글리칸 생성 조절을 가능하게 하는 조성물에 대한 지속적인 필요가 있다.
흥미로운 방식으로, N-아세틸글루코사민은 히알루로난 합성을 자극하는 능력에 대해 건강 및 화장 분야에서 상이한 적용에 대해 사용되어 왔다. N-아세틸글루코사민은 새우 및 게 껍질에 함유된 키틴의 산 가수분해에 의해, 또는 발효에 의해(적어도 이후 아세틸화될 수 있는 글루코사민과 관련해) 생성된다. 특허 출원 US2008/0020997에는 N-아세틸글루코사민의 국소 제형이 기재되어 있다.
N-아세틸글루코사민-6-포스페이트는 N-아세틸글루코사민의 C6-인산화된 형태이다. N-아세틸글루코사민-6-포스페이트는 히알루로난과 같은 글리코사미노글리칸의 합성 중의 중간체인 것으로 제시된다. 상기 특이적 경로에서, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트는 N-아세틸-글루코사민-1-포스페이트로 이성질화된 후, UDP-N-아세틸글루코사민으로 활성화되고 중합체 내에 도입된다(도 1 참조). 그러므로 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트는 세포에 의해 생성되고(내인성 화합물), 세포주위 공간 내로 배출되기 위해서 합성되지 않는 중간체 대사물이다. 추가로 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트는 N-아세틸글루코사민으로부터 직접 포유류 세포에 의해 생성되지 않는 것으로 보인다.
인산화 당은 여러 대사 경로의 교차로에서 세포에 의해 사용되는 잘 알려진 높은 에너지 화합물이다. 대부분의 상기 인산화 당은 글루코오스-6-포스페이트 및 프룩토오스-6-포스페이트와 같은 세포에 의해 지속적으로 재생되는 일시적인 화합물이다. 세포 내의 중간체 대사물이기 때문에, 인산화 당은 이들을 시험하도록 하기에 합리적인 비용으로 충분한 양으로 단리하기가 어렵다. 게다가, 인산화 당은 불안정하고, 세포 및 박테리아 포스파타아제에 의해 이들의 상응하는 비-인산화 당으로 빠르게 가수분해되어, 이들의 직접 사용이 불가능하다.
1962년으로부터 단독 문헌 GB 896940에는 상처 치유를 촉진하기 위한 N-아세틸글루코사민의 유도체 중에서 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트의 사용(상기 화합물에 대해 임의의 실험 데이터를 제공하지 않으면서)을 언급하고 있지만, 우리의 지식으로는 공개 도메인 또는 이들의 잠재적인 치료적 또는 화장적 효과를 위한 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트의 평가를 기재하는 과학 단체에 접근가능한 문헌은 없다.
그러므로, 글리코사미노글리칸의 생성을 조절하는 화장 및 약학 조성물의 개발에 대한 지속적인 필요성이 있었고, 이의 사용 범위는 꽤 광대하다.
본 출원은 특히 글리코사미노글리칸 생성과 관련해 건강 및 에스테틱 상에 유리한 영향을 촉진하기 위해, 단독으로 또는 다른 화합물, 특히 비타민 A 계열의 화합물과 조합으로, 약학, 수의학 및 화장 조성물에서의 이의 유용성을 입증하는, 인간 세포 상의 외인성 화합물로서의 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트의 놀랍고도 예상치 못한 특성에 관한 것이다. 본 출원인은 또한 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트와 비타민 A 계열의 화합물의 조합의 상승 효과를 입증한다.
그러므로 본 발명은 건성 피부를 치료하기 위한 또는 피부 또는 부속물의 노화를 치료 또는 예방하기 위한, 특히 주름, 특히 깊은 주름 및/또는 미세주름을 치료 또는 예방하기 위한, 피부 탄력성 및/또는 색조를 향상시키기 위한, 피부를 팽팽하게 하기 위한, 및/또는 진피-표피 접합을 재생/강화시키기 위한 및/또는 피부 세포 증식(특히 케라틴세포 및 섬유아세포)을 향상시키기 위한 및/또는 구조적 거대분자(특히 히알루로난 및/또는 콜라겐)의 합성을 향상시키기 위한, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 또는 이의 화장품적으로 허용가능한 염 및 임의로, 비타민 A 계열의 화합물을 포함하는 화장 조성물의 용도에 관한 것이다.
더욱 특히, 본 발명은 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 또는 이의 화장품적으로 허용가능한 염을 포함하는 화장 조성물에 관한 것이다. 이것은, 바람직하게는 레티놀, 레티날 또는 레티날데히드(시스 또는 트랜스), 레티노산, 이소트레티노인, 아다팔렌, 트레티노인, 이의 염 및 유도체 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 비타민 A 계열의 화합물을 부가적으로 포함할 수 있다. 더욱 더 바람직한 구현예에서, 비타민 A 계열의 화합물은 레티놀, 이의 염, 알코올 또는 에스테르이다. 상기 조성물은 국소, 경구 또는 주사 경로에 의한 투여에 적합(특히 표피내 및/또는 피내 및/또는 경피 및/또는 피하 주사 및/또는 마이크로-주사에 적합)할 수 있다.
본 발명은 또한 건선, 아토피 피부염, 습진, 관절 장애, 연골 결손 관련 장애, 윤활액 유출의 치료에 사용하기 위한, 염증 반응의 조절을 위한, 점성보충(viscosupplementation)을 위한, 및 수술 또는 수술후 개입(특히 눈, 피부 및 복부, 바람직하게는 눈) 연관 치료에서의 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학 또는 수의학 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 이것은 바람직하게는 레티놀, 레티날 또는 레티날데히드(시스 또는 트랜스), 레티노산, 이소트레티노인, 아다팔렌, 트레티노인, 이의 염 및 유도체 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 비타민 A 계열의 화합물을 부가적으로 포함할 수 있다. 더욱 더 바람직한 구현예에서, 비타민 A 계열의 화합물은 레티놀, 이의 염 또는 알코올 또는 에스테르이다. 상기 조성물은 국소, 경구 또는 주사 경로에 의한 투여에 적합(특히 표피내 및/또는 피내 및/또는 경피 및/또는 피하 및/또는 근육내 및/또는 정맥내 및/또는 마이크로-주사 및/또는 관절내 주사에 적합)할 수 있다.
본 발명은 또한 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및, 바람직하게는 레티놀, 레티날 또는 레티날데히드(시스 또는 트랜스), 레티노산, 이소트레티노인, 아다팔렌, 트레티노인, 이의 염 및 유도체 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 비타민 A 계열의 화합물을 포함하는 약학 또는 수의학 조성물에 관한 것이다. 더욱 더 바람직한 구현예에서, 비타민 A 계열의 화합물은 레티놀, 이의 염 또는 알코올 또는 에스테르이다. 본 발명은 손상된 조직의 복구 및/또는 재생을 위한 본 구현예에 따른 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 건선, 아토피 피부염, 습진, 관절 장애, 연골 결손 관련 장애, 윤활액 유출의 치료를 위해, 염증 반응의 조절을 위해, 점성보충을 위해, 및 수술, 특히 눈 및 복부, 바람직하게는 눈의 수술과 연관된 치료에서 사용하기 위한 약학 또는 수의학 조성물 또는 의약의 제조를 위한 임의로 비타민 A 계열의 화합물과의 조합의, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도에 관한 것이다. N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 또는 이의 염이 비타민 A 계열의 화합물과 함께 조성물 또는 의약에 조합되지 않을 경우, 상기 사용은 비타민 A 계열의 화합물과 조합으로 일어날 수 있다. 본 발명은 또한 건선, 아토피 피부염, 습진, 관절 장애, 연골 결손 관련 장애, 윤활액 유출의 치료를 위해, 염증 반응의 조절을 위해, 점성보충을 위해, 및 수술, 특히 눈 및 복부의 수술과 연관된 치료에서 동시, 별도 또는 시간 간격을 두고 사용하기 위한 조합 제품으로서 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 비타민 A 계열의 화합물을 포함하는 제품에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명은 주사(바람직하게는 표피내 및/또는 피내 및/또는 경피 및/또는 피하 및/또는 마이크로-주사 및/또는 관절내 주사)에 또는 국소 투여에 적합한 장치로서, 본 발명에 따른 약학, 수의학 또는 화장 조성물, 바람직하게는 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 비타민 A 계열의 화합물을 포함하는 조성물을 포함하는 장치에 관한 것이다.
도 1은 포유류 세포에서의 히알루로난 합성 경로를 나타낸다.
도 2는 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트로의 처리 후 피부 형태학 분석을 나타낸다.
도 3은 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트로의 처리 후 피부 중의 글리코사미노글리칸 생성 분석을 나타낸다.
도 4는 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트로의 처리 후 피부 중의 CD44 수용체 발현 분석을 나타낸다.
본 출원인은 처음으로, 인간 세포에 대한 외인성 화합물(즉, 인체의 임의의 성분을 포함하지 않는 기술적 방법에 의해 수득된)로서의 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트의 효과를 시험 및 확인하였다. 이들은 하기를 포함하는 상이한 메카니즘을 통해, 건강 및 에스테틱에 대해 유리한 영향을 촉진하기 위한, 단독 또는 다른 화합물, 특히 비타민 A 계열의 화합물과의 조합으로 약학, 피부과학, 수의학 및 화장 조성물에서 사용될 수 있다는 것을 보여준다:
- 글리코사미노글리칸, 예컨대 히알루로난 및 콜라겐, 특히 프로콜라겐 1을 포함하는 인체의 구조적 거대분자의 합성 촉진;
- 히알루론산 수용체인 CD44의 생성 증가;
- 세포 분열의 자극, 특히 케라틴세포 및 섬유아세포의 자극; 및,
- 진피-표피 접합의 강화.
더욱 구체적으로는, 본 출원인은 케라틴세포에 의해 또는 섬유아세포에 의해 히알루로난 생성을 증가시키는 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트의 능력을 입증하였다. 이들은 게다가 섬유아세포 세포 분열을 촉진하는 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트의 능력을 입증하였다. N-아세틸글루코사민-6-포스페이트는 또한 섬유아세포에 의해, 특히 이들이 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트와 비타민 A 계열의 화합물의 조합으로 처리된 케라틴세포의 상청액으로 처리된 경우 콜라겐, 특히 프로콜라겐 1의 합성을 향상시킨다. 최종적으로, 인간 피부 모델에서, 본 출원인은 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트로의 치료가 전체 진피에 걸쳐 잘 분포하는 방식으로 글리코사미노글리칸 합성을 자극하고, 진피-표피 접합을 자극하고, 진피 및 표피 내의 CD44 수용체의 발현을 자극한다는 것을 보였다.
본 출원인은 추가로 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트와 비타민 A 계열의 화합물, 특히 레티놀의 조합의 상승 또는 강화 효과를 증명하였다.
반대로, N-아세틸글루코사민은, 단독으로 또는 비타민 A 계열의 화합물과 조합으로, 바람직하지 않은 효과가 있거나, 효과가 없거나, 또는 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트의 것에 필적하지 못하는 효과를 갖는다.
콜라겐은 또한 체내에서 매우 큰 그룹의 구조적 중합체를 나타낸다. 콜라겐은 전신 단백질 함량의 25-35%를 구성하는, 신체 내에서 가장 풍부한 단백질이다. 이것은 결합 조직 세포에 의해 생성된다. 프로콜라겐 1은 특히 힘줄, 피부, 동맥벽, 횡문 근원섬유의 근내막, 섬유연골 및 뼈 및 치아의 기질 부분에서 발견된다. 이것은 구조적 지지 역할을 하는 진피의 세포외 매트릭스의 주요한 구성성분이다. 피부 노화는 케라틴세포 증식 둔화의 결과인 표피의 위축으로 인한 것이다. 이것은 또한 콜라겐의 감소, 및 그러므로 진피의 얇아짐을 야기하고, 이것은 일광 및 UV 노출 및 흡연에 의해 악화된다. 콜라겐 및 히알루론산은 주름 및 미세주름에 대항하여 싸우는 것으로 알려진 작용제이다.
진피-표피 접합은 또한 표피의 적합한 영양 및 피부의 탄력성에 중요하다.
이것이 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트, 임의로 비타민 A 계열의 화합물과의 조합이 피부 및 부속물, 특히 모발의 노화 영향을 방지 또는 감소시키기 위해 의도되는 화장 조성물에서 큰 관심이 있는지에 대한 이유이다. 이러한 조성물은 그러므로 주름, 특히 깊은 주름 및/또는 미세주름을 방지 또는 감소시키고, 피부 탄력성을 향상시키고, 피부를 팽팽하게 하는데 유용하다. 본 발명의 조성물이 주사되는 (특히 마이크로-주사에 의해) 구현예에서, 이것은 주름 및 미세주름을 채우기 위해, 입술 볼륨을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 본 구현예에서, 이것은 필러 제품, 특히 재흡수가능한 제품, 예컨대 히알루론산, 지방, 콜라겐 또는 단백질 또는 비-재흡수가능한 제제, 예컨대 폴리아크릴아미드 겔 또는 실리콘과 조합으로 사용되거나 이를 부가적으로 포함할 수 있다. 이것은 또한 진피-표피 접합을 재생시키거나 강화시키는데 사용될 수 있다. 이것은 예를 들어 구조적 거대분자, 특히 콜라겐 및 히알루로난의 증식 및/또는 세포 이동 및/또는 합성을 증가시킴으로써 피부 세포(특히 멜라닌세포, 케라틴세포 및/또는 섬유아세포)를 자극시키는데 사용될 수 있다. 그러므로 이러한 조성물은 진피 및/또는 표피를 유지 및/또는 강화시키는 것, 이의 두께를 유지 및/또는 향상시키는 것, 피부의 색조 및 탄력성을 유지 및/또는 강화시키는 것을 가능하게 한다. 이러한 조성물은 바디 및/또는 얼굴 및/또는 목 및/또는 모발 케어에 적합하다.
첫번째 특정 구현예에서, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트는 조성물의 유일한 유효 성분 또는 작용제일 수 있다. 두번째 특정 구현예에서, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 비타민 A 계열의 화합물은 조성물의 유일한 유효 성분 또는 작용제일 수 있다. 또다른 특정 구현예에서, 조성물은 다른 유효 성분 또는 작용제를 포함한다. 이들 다른 유효 성분 또는 작용제의 예는 하기에 기재된다. 유효 성분 또는 작용제는 생물학적 효과를 갖는 화합물을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본 출원에서, 화장 조성물은 투여 경구 경로에 대해, 피부, 두피 또는 모발에 대한 국소 경로에 대해, 또는 표피내 및/또는 피내 및/또는 경피 및/또는 피하 주사 및/또는 마이크로-주사에 대해 적합하게 제형화될 수 있다.
국소 투여를 위한 본 발명에 따른 화장 조성물은 수용액, 수성알코올성 용액, 에멀젼[수중유(O/W), 유중수(W/O) 또는 다중(예를 들어 삼중 O/W/O 또는 W/O/W)], 나노에멀젼, 수성 겔 또는 수성 상 중의 지방 상 분산액으로서 제형화될 수 있다. 이것은 다소 유체인 크림, 겔, 히드로겔, 필름-형성 제품(특히 퍼졌을 때 물을 포획하고 젤을 형성하는 특성을 갖는 고분자량 히알루론산을 함유하는), 로션, 마스크, 유액, 오일, 연고, 왁스, 포말, 페이스트, 세럼, 밤(balm), 에어로졸, 스틱, 비누 또는 샴푸로서 제형화될 수 있다.
국소 투여에 적합한 화장 조성물은 제품의 침투를 용이하게 하기 위한 기계적 및 문지름 작용을 하고 제품의 순환을 활성화시키는 기계적 성분, 예컨대 마사지-롤러 장치 또는 피부의 반응을 활성화시키거나 제품의 효과를 직접 향상시키는 파장-방출 시스템(빛, 저주파, 적외선파 등)과 조합으로 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 본 발명에 따른 화장 조성물은 사켓, 알약, 캡슐, 시럽 또는 정제의 형태일 수 있다.
주사 전달에 의한 본 발명에 따른 화장 조성물은 바람직하게는 멸균으로서 제형화된다. 이것은 또한 용매가 사용 직전 첨가되는 분말의 형태일 수 있다.
화장 조성물의 구성성분 및 이의 비율은 당업자의 일반적인 지식에 의해 쉽게 선택될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 탈이온수, 마그네슘, 알루미늄 실리케이트, 잔탄검, 나일론-12, 나트륨 PCA, 프로필렌 글리콜, 레드 산화철, 탈크, 옐로우 산화철, 블랙 산화철, 이산화티탄, 글리세롤 스테아레이트, 스테아르산, DEA-세틸 포스페이트, 메틸파라벤, 부틸파라벤, 에틸파라벤, 프로필파라벤, 이소프로필파라벤, 이소부틸파라벤, 이소스테아릴 네오펜타노에이트, 이소프로필 팔미테이트, 에틸렌/프로필렌/스티렌, 공중합체, 부틸렌/프로필렌/스티렌 공중합체, 페녹시에탄올, 토코페릴 아세테이트, 글리세린, 트리에틸아민, 스테아르산, 프로필렌 글리콜 스테아레이트, 미네랄 오일, 디아졸리디닐 우레아, 수소화된 폴리이소부텐, 옥틸 팔미테이트, 트리데실 네오펜타노에이트, 옥틸도데실 네오펜타노에이트, 향, 옥틸 메톡시신나메이트, 벤조페논, 옥틸 살리실레이트, 이소프로필 이소스테아레이트, 이소세테스-3 악테테이트 및 이의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
화장 조성물은 또한 바람직한 투여 방법에 적합한 장치에 포함될 수 있다.
이러한 장치는 국소 투여에 적합할 수 있다. 이들은 특히 패치, 폐색 드레싱, 폐색 미니-챔버 등을 포함한다. 패치는 당업자에게 공지된 임의의 유형의 패치, 특히 피부에 고정되는 경우 피부 상에 마일드한 전류를 발생시켜, 피부 내로 제품의 투과를 촉진하는 패치를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 폐색 미니-챔버는 피부에 부착되고 화장 조성물이 채워져, 내부로 확산될 제품의 양을 증가시키도록 다량의 상기 조성물이 피부와의 접촉을 유지하도록 하는 작은 포켓형 장치를 의미하는 것으로 이해될 것이다.
다른 장치는 주사에, 특히 표피내 및/또는 피내 및/또는 경피 및/또는 피하 주사 및/또는 마이크로-주사에 적합할 것이다. 이러한 장치는 바늘, 마이크로바늘 또는 바늘이 없는 주사 장치를 포함할 수 있다. 이러한 장치는 메조테라피에 잘 알려져 있다. 본 발명은 본 발명에 따른 조성물 및 주사기 또는 주사 장치를 포함하는 키트에 관한 것이다.
N-아세틸글루코사민-6-포스페이트를, 임의로 비타민 A 계열의 화합물과 조합으로 포함하는 조성물은 또한 시험관 내 또는 생체 외에서 인간 조직, 특히 합성 피부의 생성, 예를 들어 조직 공학 분야에서 유용할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트를, 임의로 비타민 A 계열의 화합물과 조합으로 포함하는 조성물로 조직 세포 또는 조직을 형성할 수 있는 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 인간 조직, 바람직하게는 피부 또는 결합 조직의 생성 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 세포는 케라틴세포 및/또는 섬유아세포를 포함한다.
글리코사미노글리칸, 특히 히알루로난의 합성에 대한 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트의, 임의로 비타민 A 계열의 화합물과 조합의 효과에 의해, 이러한 유효 성분(들)을 포함하는 약학 또는 수의학 조성물은 인간 및 동물에서 관절 장애 또는 연골 결손과 관련된 장애, 예를 들어 관절염, 관절증, 골관절염 및 변형성 관절증의 치료 또는 예방을 위해, 천연 윤활제의 합성 촉진을 위해, 점성보충을 위해 및/또는 윤활액 유출의 치료를 위해 사용될 수 있다. 본 출원에서, 의문의 동물은 바람직하게는 포유류, 예를 들어 말 또는 반려 동물, 예컨대 개 및 고양이이다. 그러므로 본 발명은 인간 및 동물에서 관절 장애 또는 연골 결손과 관련된 장애, 예를 들어 관절염, 관절증, 골관절염 및 변형성 관절증의 치료 또는 예방을 위해, 천연 윤활제의 합성 촉진을 위해, 점성보충을 위해 및/또는 윤활액 유출의 치료를 위해 의도되는 약학 또는 수의학 조성물의 치료를 위한 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트의, 임의로 비타민 A 계열의 화합물과 조합의 용도에 관한 것이다. 대안적으로는, 본 발명은 또한 비타민 A 계열의 화합물과 조합의 사용 또는 투여를 위해 이전에 기재된 적용을 위해 의도되는 약학 또는 수의학 조성물을 제조하기 위한 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 유효량의 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트를, 임의로 비타민 A 계열의 화합물과 조합으로 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 인간 또는 동물에서의, 관절 장애 또는 연골 결손과 관련된 장애, 예를 들어 관절염, 관절증, 골관절염 및 변형성 관절증의 치료 방법, 윤활액 유출의 치료 방법, 점성보충 또는 천연 윤활제의 합성 촉진 방법에 관한 것이다. 본 구현예에 포함된 적용에서, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트는 임의로 비타민 A 계열의 화합물과 조합으로, 국소 또는 경구 투여 또는 주사에 적합한 형태로 투여되거나 제형화될 수 있다. 주사는 예를 들어 관절내, 피하, 근육내 경로에 의해 일어날 수 있다.
게다가, 피부에 대한 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트의 유리한 효과를 고려하면, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트를 임의로 비타민 A 계열의 화합물과 조합으로 포함하는 약학, 피부과학 또는 수의학 조성물은 건선, 습진, 아토피 피부염 또는 건성 피부의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
특히 케라틴세포 및 섬유아세포에 의한 히알루로난 생성에 대한, 섬유아세포 세포 분열에 대한 그리고 섬유아세포에 의한 콜라겐 생성에 대한 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트와 비타민 A 계열의 화합물의 조합의 이례적인 효과를 고려하여, 본 출원은 더욱 특히 상기 조성물을 포함하는 약학, 피부과학 또는 수의학 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 손상된 조직의 재생에 유용하다. 그러므로, 본 발명은 손상된 조직을 재생하기 위해 의도되는 약학, 피부과학 또는 수의학 조성물의 제조를 위한 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 비타민 A 계열의 화합물의 용도 및 유효량의 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 비타민 A 계열의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서의 손상된 조직을 재생하기 위한 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명에 따른 약학, 피부과학 또는 수의학 조성물은 눈의 수술(예를 들어 각막 이식, 녹내장, 레티날 박리 또는 백내장), 피부에 대한 수술 또는 피부과학적 시술(예를 들어 리프팅, 필러 주입, 박피, 화이트닝, 피부박리, 여드름 치료), 복부의 수술 동반 또는 후 치료에 사용될 수 있다. 본 구현에에서, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 비타민 A 계열의 화합물이 조합된 약학 또는 수의학 조성물이 바람직할 것이다.
본 출원에 기재된 모든 출원에 대해, 하기 단어가 모두 상호교환적으로 고려될 것이다:
- …에 사용하기 위한 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을, 임의로 비타민 A 계열의 화합물과 조합으로 포함하는 약학 또는 수의학 조성물,
- …에 대한 약학 또는 수의학 조성물을 제조하기 위한 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 임의로 비타민 A 계열의 화합물의 용도,
- …를 위해 동시에, 별도로 또는 시간 간격을 두고 사용하기 위한 조합 생성물로서 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 비타민 A 계열의 화합물을 포함하는 생성물,
- 유효량의 약학적으로 허용가능한 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트를, 임의로 비타민 A 계열의 화합물과 조합으로 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 …하기 위한 방법.
모든 상기 적용에 대해, 하나의 구현예는 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 비타민 A 계열의 화합물, 특히 레티놀의 조합된 용도, 및 이러한 조합을 포함하는 조성물에 근거한다.
약학 또는 수의학 조성물은 경구 경로에 의한, 흡입에 의한, 국소 경로에 의한(특히 피부, 두피, 눈 또는 점막, 예를 들어 볼내, 질 또는 비강에 대해), 직장으로, 비경구, 표피내, 피내, 경피, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 활액내, 흉골내, 기관내, 간내, 병반내 또는 두개내 주사에 의한 또는 주입 기술에 의한 투여에 적합하도록 제형화될 수 있다. 바람직하게는, 약학 또는 수의학 조성물은 경구 경로에 의한, 흡입에 의한, 국소 경로에 의한(특히 피부, 두피, 눈 또는 점막, 예를 들어 볼내, 질 또는 비강에 대해), 직장으로 또는 표피내, 피내, 경피, 피하, 관절내 또는 활액내 주사에 의한 투여에 적합하도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 약학 또는 수의학 조성물은 사켓, 정제, 캡슐, 시럽, 크림, 로션, 젤의 형태로 제형화될 수 있다. 조성물은 탈크, 락토오스, 마그네슘 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 콜로이드성 또는 침전된 이산화규소, 망상 폴리비닐 피롤리돈, 이염기성 칼슘 포스페이트 디히드레이트, 미세결정성 셀룰로오스, 전분, 포비돈, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 폴리소르베이트 80, 락트산, 카르보머, 세틸 알코올, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 글루코오스, 덱스트로오스, 트리에틸아민, 글리세린, 프룩토오스, 수크로오스, 중합체 및 나노구조를 포함하나 이에 제한되지 않는 부형제를 포함할 수 있다. 약학 또는 수의학 조성물은 또한 원하는 투여 방법에 적합한 장치에 포함될 수 있다. 화장 조성물에 대해 기재된 제형은 약학 또는 수의학 조성물에 적용가능하다.
경구 제형, 특히 정제의 경우, 담체는 종종 락토오스 및 전분을 포함한다. 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트가 또한 첨가된다. 캡슐의 경우, 희석제는 락토오스 및 전분을 포함한다. 수성 현탁액의 경우, 유효 성분이 유화제 및 현탁화제와 조합된다. 또한 감미제, 착색제 및 향을 도입하는 것이 가능하다.
직장 제형, 예컨대 좌제의 경우, 상기 제형은 유효 성분을 실온에서 고체이나 직장 온도에서는 액체인 적합한 부형제와 혼합하여 제조될 수 있다. 이러한 물질에는 코코아 버터, 비즈왁스 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.
국소 투여의 경우, 조성물은 특히 적합한 담체에 용해된 또는 현탁된 유효 성분을 함유하는 연고의 형태로 제형화될 수 있다. 이러한 담체는 미네랄 오일, 액체 바셀린, 백색 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 유화제 왁스 및 물을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 대안적으로는, 이것은 적합한 담체에 용해된 또는 현탁된 유효 성분을 함유하는 크림 또는 로션으로서 제형화될 수 있다. 이러한 담체에는 미네랄 오일, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알코올 및 물이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
안과 적용을 위해, 조성물은 조정된 pH에서 멸균 등장성 식염수 용액 중의 미분화된 현탁액으로서 또는 바람직하게는 염화벤즈알코늄과 같은 항균성 방부제와 함께 또는 없이 조정된 pH에서 멸균 등장성 식염수 용액 중의 용액으로서 제형화될 수 있다. 대안적으로는, 조성물은 또한 바셀린과 같은 물질을 함유하는 연고로서 제형화될 수 있다.
주사 형태에서, 조성물은 수성 또는 유성 현탁액일 수 있다. 이러한 현탁액은 습윤제 또는 분산제 및 현탁화제를 사용하여 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 제형화될 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 멸균 용액 또는 현탁액일 수 있다. 허용가능한 용매 및 담체에는 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 멸균 고정 오일이 종종 현탁액 매질 또는 용매에 사용된다. 이를 위해, 모노- 및 디글리세라이드와 같은 임의의 혼합된 고정 오일이 사용될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 중성 오일, 예컨대 올리브 오일, 피마자 오일, 특히 이들의 폴리옥시에틸렌화된 형태와 같이, 올레산과 같은 지방산 및 이의 글리세라이드 유도체가 또한 주사용 조성물을 제조하는데 사용된다. 상기 유성 용액은 에멀젼 및 현탁액의 형성을 위해 현탁화제 또는 희석제, 예컨대 카르복시메틸 셀룰로오스를 포함할 수 있다. 계면활성제, 예컨대 트윈(Tweens), 유화제, 생체이용능을 증가시키는 작용제가 또한 포함될 수 있다.
N-아세틸글루코사민-6-포스페이트는 대량으로 이용가능하지 않은 화합물이다. 그러므로, 이것은 바람직하게는 그 내용이 본 출원에 참조로서 인용된 특허 출원 WO08/142155에 기재된 방법(특히 실시예 1에)에 의해 제조된다. 특히, 해양 기원(새우 또는 게 키틴으로부터 유래됨)의 N-아세틸글루코사민을 물 및 염을 함유하는 반응기에서 수 시간 동안 선택된 무기 포스페이트 및 적합한 인산화 효소와 혼합한다. 상기 반응 동안, 효소는 N-아세틸글루코사민에 포스페이트기를 부가하여 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트를 생성한다. 이후 상기 혼합물을 상이한 알코올(예컨대 이소프로판올 및/또는 에탄올)을 사용하는 여러 침전 단계의 도움으로 정제할 수 있다. 최종 수용액을 이온 교환 수지에서 정제하여 잔여 이온을 제거한다. N-아세틸글루코사민-6-포스페이트는 물에 농축될 수 있고 마이크로여과(0.2 ㎛ 필터)에 의해 멸균시킨다. 최종 순도는 분석 방법에 의해 평가될 수 있다. 상기 방법은 농축된 수용액으로부터 직접 사용될 수 있거나 임의의 수성 제형에 빠르게 용해되는 결정성 분말을 수득하도록 건조될 수 있는 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트의 제조를 가능하게 한다.
N-아세틸글루코사민-6-포스페이트는 또한 본 발명의 조성물 및 제품에서 염, 특히 약학적으로 또는 화장품적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 염에는 특히 산 부가 염, 염기 부가 염, 금속 염, 및 암모늄 또는 알킬 암모늄 염, 특히 약학적으로 또는 화장품적으로 허용가능한 것이 포함된다. 산 부가 염에는 무기 염 및 유기 염이 포함된다. 적합한 무기 산의 대표예는 염산, 브롬화수소산, 요오드산, 인산 등을 포함한다. 적합한 유기 산의 대표예는 아세트산, 포름산, 프로피온산, 벤조산, 말레산, 푸마르산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산 등을 포함한다. 유기 또는 무기 산 부가 염의 기타 예는 J. Pharm Sci., 1977, 66, 2 및 "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use", P. Heinrich Stahl and Camille G. Wermuth, eds., 2002에 제시된다. 금속 염의 예에는 리튬, 나트륨, 칼륨 또는 마그네슘 염 등이 포함된다. 암모늄 또는 알킬 암모늄 염의 예에는 암모늄, 메틸-암모늄, 디메틸-암모늄, 트리메틸-암모늄, 에틸-암모늄, 히드록시에틸-암모늄, 디에틸-암모늄, 부틸-암모늄, 테트라메틸-암모늄 염 등이 포함된다. 유기 염기의 예에는 리신, 아르기닌, 구아니딘, 디에탄올아민 등이 포함된다.
본 발명의 조성물(화장, 약학, 피부과학 또는 수의학)은, 바람직하게는 화장, 약학, 피부과학 또는 수의학 분야, 각각에서 허용가능한 생리학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
본 출원의 취지에서, "비타민 A 계열의 화합물"은 레티놀(또한 비타민 A로서 알려짐), 레티날 또는 레티날데히드(시스 또는 트랜스), 레티노산(트랜스), 레티날데히드, 이소트레티노인(시스-레티노산), 아다팔렌, 트레티노인(트랜스-레티노산), 이의 염 및 유도체 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 바람직하게는, 화합물은 레티놀, 레티날 및 레티날데히드(시스 또는 트랜스), 레티노산, 레티날데히드, 이소트레티노인, 트레티노인, 이의 염 및 유도체 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 비타민 A 유도체는 비타민 A 에스테르(예를 들어 비타민 A 아세테이트, 비타민 A 프로피오네이트, 또는 비타민 A 팔미테이트), 비타민 A 포스페이트, 또는 프로-비타민 A(예를 들어, β-카로텐)일 수 있다. 특정 구현예에서, 비타민 A 계열의 화합물은 레티놀 또는 이의 염 또는 알코올 또는 에스테르이다.
본 발명의 조성물 및 생성물에 사용되는 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트의 양은 화장 또는 치료 효과에 따라 다르고 그러므로 다양할 수 있다. 특정 구현예에서, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 농도의 범위는 조성물의 대략 0.001 g/L 또는 g/kg 내지 대략 1000 g/L 또는 g/kg이고, 바람직하게는 조성물의 대략 0.01 g/L 또는 g/kg 내지 대략 100 g/L 또는 g/kg이고, 더욱 바람직하게는 조성물의 대략 0.1 g/L 또는 g/kg 내지 대략 10 g/L 또는 g/kg이고, 더욱 특히 국소 투여에 적합한 것으로 보인다.
더욱 바람직한 구현예에서, 비타민 A 계열의 화합물은 상승 또는 강화 양으로 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트와 조합된다.
특정 구현예에서, 비타민 A 계열의 화합물, 특히 레티놀, 이의 에스테르 또는 염은 조성물에 조성물의 대략 3 ㎍/L 또는 ㎍/kg 내지 대략 3 g/L 또는 g/kg, 바람직하게는 조성물의 대략 100 mg/L 또는 mg/kg 내지 대략 1.5 g/L 또는 g/kg의 농도로 존재한다.
레티놀의 단점 중 하나는 원치않는 부작용, 특히 피부 자극을 야기하는 것이다. 상승 또는 강화 효과가 저농도에서, 특히 화장품 및 요법에서 일반적으로 사용되는 것보다 낮은 농도에서 입증되었다. 그러므로, 바람직한 구현예에서, 비타민 A 계열의 화합물은 조성물의 최종 용도에 따라 무- 또는 덜 독성인 그리고 무- 또는 덜 자극적인 양으로 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트와 조합된다. 그러므로, 본 특정 구현예에서, 비타민 A 계열의 화합물, 특히 레티놀, 이의 에스테르 또는 염은 조성물에 조성물의 대략 3 ㎍/L 또는 ㎍/kg 내지 대략 50 mg/L 또는 mg/kg, 바람직하게는 조성물의 대략 3 ㎍/L 또는 ㎍/kg 내지 대략 10 mg/L 또는 mg/kg 의 농도로 존재한다.
본 발명의 조성물 및 키트는 부가적으로 다른 성분, 특히 효과를 갖는 화합물을 포함할 수 있다. 특히, 이들은 예를 들어 자유 라디칼 스캐빈저, 바람직하게는 특허 출원 US 2009/0233876에 기재된 것과 같은 안정화된 폴리페놀을 포함할 수 있다. 게다가, 이들은 또한 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트의 N-아세틸글루코사민, 예를 들어 시스테인에 의한 분해를 피하기 위해 포스파타아제 억제제를 포함할 수 있다. 이들은 또한 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트, 예를 들어 6-팔미토일-L-아스코르브산, 아스코르브산 6-헥사데카노에이트의 자극 하에 생성되는 새롭게 합성된 히알루로난의 분해를 방지 또는 감소시키는 히알루로니다아제 억제제를 포함할 수 있다. 이들은 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트에 의해 자극된 히알루로난의 합성을 가속화하고, 예를 들어 프로스타글란딘 E2, 또는 레티노산(트랜스)과 같은 에이코사노이드와 이들의 상승 작용을 갖도록 하기 위해 히알루로난 합성의 활성화제를 포함할 수 있다. 이들은 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트에 의해 자극된 히알루로난의 합성을 가속화하고, 이것과의 상승 작용을 갖도록 하기 위해 글루쿠론산 유도체, 예를 들어 글루쿠론산, 이의 염, 에스테르 및 아미드 또는 UDP-글루쿠론산을 포함할 수 있다.
본 발명은 제한되지 않는 방식으로, 본 발명의 특정 구현예 및 특정 유리한 특성만을 기술하여 설명 목적으로 제공되는 하기 실시예에서 더욱 명백해질 것이다.
실시예
실시예 1: N-아세틸글루코사민-6- 포스페이트로 처리된 인간 케라틴세포에 의한 히알루론산 생성의 자극
1. 시험 원리
정상 인간 케라틴세포를 컨플루언트 상태로 배양하였다. 세포를 시험 생성물로 48시간 동안 처리하였다. 히알루론산을 함유하는 상청액을 수집하고 즉시 어세이하였다. 히알루론산을 ELISA 마이크로타이터 플레이트로 정량하였다.
단백질 함량을 마이크로타이터 플레이트의 각각의 웰에 대해 측정하였다.
2. 시험된 생성물
N-아세틸글루코사민-6-포스페이트(NAG6P)를 20, 10 및 5 mM의 농도에서 시험하였다.
3. 세포의 준비
정상 인간 케라틴세포(NHK)의 프라이모배양을 성형 수술로부터의 피부 시편으로부터 단리된 세포로부터 수득하였다.
NHK를 24-웰 플레이트에 특정 KSFM 배양 배지(Gibco?, Invitrogen) 중의 130,000세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 플레이트를 습윤 인큐베이터(37℃, 5% CO2)에 24시간 동안 두었다.
4. 세포의 처리
각각의 농도(KSFM 배지에 희석됨, 600㎕)의 상이한 생성물을 세포와 48시간 동안 접촉시켰다. 미처리된 세포를 대조군 조건으로서 사용하였다.
각각의 처리 조건을 NHK 세포의 3개 웰에 대해 평가하였다.
5. 히알루론산 어세이
24시간의 처리 후, 상청액 220㎕의 중간 샘플을 각각의 웰로부터 제거하고, 플레이트를 인큐베이터(37℃, 5% CO2)로 되돌려놓았다.
48시간의 처리 후, 나머지 상청액(대략 350㎕)을 수집하고 원심분리하였다.
세포 상청액을 히알루로난 효소-연결 면역흡착 어세이 키트(HA-ELISA, Echelon Biosciences Inc.)에 기재된 방법에 따라 어세이하였다. 이것은 405nm에서의 분광기 검출을 하는 ELISA 어세이이다(Safire, Tecan).
각각의 웰에 대해 어세이를 이중으로 수행하였다.
6. 결과의 표현
각각의 샘플에 대해 측정된 광학 밀도(OD)를 그래프(키트 내의 특정 표준 곡선) 상에 플롯팅하였다. 히알루론산 농도를 ng/ml로 표현하였다.
7. 단백질 합성
여기에는 히알루론산을 어세이하기 위한 상청액의 세포 펠렛 내의 단백질 함량을 측정하는 것이 포함된다.
결과를 웰 당 단백질 ㎍으로서 표현하였다.
비신코닌산(BCA)방법을 사용하였고, 이것은 로우리(Lowry) 방법과 원리는 유사하다.
7.1. 원리
단백질을 용량-의존적 방식으로 Cu++에서 Cu+로 환원시킨다. 비신코닌산은 그 흡광도가 550nm에서 측정된 착색된 복합체를 형성하는 Cu+ 이온에 대해 고도로 특이적인 크로모겐이다.
7.2. 시약
2 가지 용액이 어세이에 사용되었다: 비신코닌산 및 황산구리. 상기 2 개의 시약을 혼합하는 경우, 이들은 Cu+ 이온의 존재하에서 보라색으로 환원되는 녹색 용액을 형성한다.
상기 시약은 BCA-1 어세이 키트(Sigma)에서 공급된다. 표준 단백질 용액(0.15 M NaCl 중의 BSA 1 mg/ml)이 또한 공급된다.
7.3. 단백질 어세이
48시간의 처리 후, 마이크로타이터 웰로부터의 상청액을 제거하여 히알루론산을 어세이하였다. 이후 세포층을 PBS에 취하고, 초음파분쇄에 의해 탈락시키고, 0.1 M NaOH에 용해하였다. 이후 비신코닌산 + 황산구리 혼합물을 첨가하고, 플레이트를 어둠 중의 습윤 인큐베이터(37℃, 5% CO2)에 두었다. 30분 인큐베이션 후, 550nm에서 흡광도를 측정하였다(Genios, Tecan).
동시에, 0 내지 100 ㎍/웰의 농도 범위에 대해 BSA 1 mg/ml 저장액(P-0914)을 사용하여 표준 곡선을 제작하였다.
상기 표준 곡선은 웰에 대해 측정된 광학 농도를 NHK 세포의 웰 당 단백질 ㎍으로 전환시키는데 사용되었다.
7.4. 결과의 표현
세포에 의해 방출된 히알루론산의 양을 단백질 ㎍으로서 표현된 세포 함량에 대해, 각각의 웰에 대해 그리고 각각의 처리 조건에 대해 측정하였다. 그러므로, 최종 결과를 단백질 ㎍ 당 히알루론산 ng/ml으로서 표현하였다.
동일한 농도의 시험 생성물로 처리된 웰에 대해 평균 값을 계산하였다. 상기 평균을 대조 웰에 의해 비교하였다(스튜던트 t 검정 - 평균 비교 - p<0.05*인 경우 95% 및 p<0.01*인 경우 99%에서 유의한 차이).
시험 생성물에 의해 유도된 %자극은 대조 및 처리 조건의 평균 값을 비교하여 측정되었다:
%자극 = (처리군 - 대조군) / 대조군
결과를 표 1 및 2에 제시한다(약어: NAG6P: N-아세틸글루코사민-6-포스페이트).
24시간 후 케라틴세포에 의해 생성된 히알루론산
24시간 - NAG6P 히알루론산(ng/ml) 히알루론산 합성의 %자극
대조군 789.5 ± 229
NAG6P 10 mM 1067.3 ± 111.9 35% *
* 스튜던트 검정: p<0.05 - 95%에서 유의한 결과
48시간 후 케라틴세포에 의해 생성된 히알루론산
48시간 - NAG6P 히알루론산(ng/ml) 단백질(㎍/웰) (ng/ml/㎍ 단백질) 히알루론산 합성의 %자극
대조군 1243.4 ± 232.3 17.9 ± 1.4 70.5 ± 18.4
NAG6P 20 mM 3076 ± 260.8 11.7 ± 1.9 269.6 ± 55.3 282% **
NAG6P 10 mM 2503.2 ± 552.8 15.3 ± 2.9 165.7 ± 32.4 135% **
NAG6P 5 mM 1817.9 ± 145.1 15.2 ± 2 122.1 ± 25.6 73% *
* 스튜던트 검정: p<0.05 - 95%에서 유의한 결과
** 스튜던트 검정: p<0.01 - 99%에서 유의한 결과
결론:
정상 인간 케라틴세포에 대한 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트의 첨가는 24시간의 처리 후, 용량-의존적 방식으로 상기 피부 세포에 의한 히알루론산 생성을 자극하였다. 48시간에서 자극이 확인되었고 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트로 처리되지 않은 세포와 비교하여 히알루론산 생성에서 +282% 증가가 추가로 향상되었다.
그러므로 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트는 피부 세포에 의한 히알루론산 생성의 우수한 자극제이다. 그러므로 NAG6P는 주름 및 미세주름의 형성을 제한하도록, 또는 이들의 쇠퇴를 촉진하도록, 그리고 피부의 수화를 촉진 및 유지하도록 하는(히알루론산의 높은 수분-유지 능력에 기인함), 피부의 표피 세포외 매트릭스의 재생을 자극하기 위한 관심대상이다.
실시예 2: 비타민 A 프로피오네이트와 상승으로 N-아세틸글루코사민-6- 포스 페이트로 처리된 인간 케라틴세포에 의한 히알루론산 생성의 자극.
N-아세틸글루코사민-6-포스페이트와 조합으로 비타민 A 프로피오네이트를 사용하는, 실시예 1에 기재된 조건 하에서 연구를 실시하였다. 비타민 A 프로피오네이트를 DMSO에 용해하였다.
비타민 A 프로피오네이트 +/- NAG6P의 본 시험을 위해, %자극은 대조군 대신에 DMSO 대조군(실제 존재하는 DMSO의 양에 상응하는 1:10,000 희석)에 대해 표현되었다.
결과를 표 3 및 4에 제시한다(약어: NAG6P: N-아세틸글루코사민-6-포스페이트).
24시간 후 케라틴세포에 의해 생성된 히알루론산
24시간 - 상승작용 히알루론산(ng/ml) 히알루론산 합성의 %자극
대조군 789.5 ± 229
NAG6P 10 mM 1067.3 ± 111.9 35% *
비타민 A 프로피오네이트
1μM		 1056 ± 186.5 34% *
NAG6P 10mM +
비타민 A 프로피오네이트 1μM		 1569.6 ± 193 99% **
* 스튜던트 검정: p<0.05 - 95%에서 유의한 결과
** 스튜던트 검정: p<0.01 - 99%에서 유의한 결과
48시간 후 케라틴세포에 의해 생성된 히알루론산
48시간 - 상승작용 히알루론산(ng/ml) 단백질(㎍/웰) (ng/ml/㎍ 단백질) 히알루론산 합성의 %자극
대조군 1243.4 ± 232.3 17.9 ± 1.4 70.5 ± 18.4 /
NAG6P 10 mM 2503.2 ± 552.8 15.3 ± 2.9 165.7 ± 32.4 135% **
DMSO 대조군a 1028.9 ± 122.8 15.6 ± 3.3 66.9 ± 7.7 /
비타민 A 프로피오네이트 1μM 1944.8 ± 393.2 14.3 ± 1 137.1 ± 32.2 105% *
NAG6P 10mM + 비타민 A 프로피오네이트 1μM 3833.3 ± 216.3 13.5 ± 2 287.4 ± 35.7 330% **
a DMSO 대조군: 비타민 A 프로피오네이트 및 NAG 10mM + 비타민 A 프로피오네이트 1μM의 조합에 의한 처리에 존재하는 DMSO의 양에 상응하는 1:10,000 희석.
* 검정 스튜던트: p<0.05 - 95%에서 유의한 결과
** 검정 스튜던트: p<0.01 - 99%에서 유의한 결과
결론:
현저한 방식으로, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트와 비타민 A 프로피오네이트를 조합함으로써, 케라틴세포에 의한 히알루론산 생성의 상승적 자극이 24시간으로부터 시작하여 일어났다는 것을 관찰하였다. 심지어 더욱 현저하게는, 상기 효과는 별도로 시험된 각각의 화합물의 효과의 합보다 컸다(비타민 A 프로피오네이트 단독 및 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 단독으로는 각각 +34% 및 +35%에 대비하여, 두 화합물로는 24시간에서 히알루론산 수준의 +99% 증가).
상기 상승 효과는 48시간 후에 확인되고 향상되었는데, 이 시간에 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 비타민 A 프로피오네이트의 조합이 비타민 A 프로피오네이트 단독 및 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 단독으로는 각각 +105% 및 +135%에 대비하여, 케라틴세포에 의해 히알루론산 생성에서 +330% 증가를 유도하였다.
그러므로 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트와 비타민 A 유도체의 조합은 피부 세포에 의해 히알루론산 생성을 자극하는데 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트의 유효성을 향상시켰다. 그러므로 비타민 A 프로피오네이트와 상승적으로 작용하는 NAG6P는 주름 및 미세주름의 형성을 제한하도록, 또는 이들의 쇠퇴를 촉진하도록, 그리고 피부의 수화를 촉진 및 유지하도록 하는(히알루론산의 높은 수분-유지 능력에 기인함), 피부의 표피 세포외 매트릭스의 재생을 자극하기 위한 관심대상이다.
실시예 3: N-아세틸글루코사민-6- 포스페이트 단독으로 또는 비타민 A 프로피오네이트와 조합으로 - N-아세틸글루코사민과 비교하여, 정상 인간 섬유아세포에 의한 히알루론산 생성의 간접적 자극( 케라틴세포에 의해 매개됨 ).
1. 시험 원리
정상 인간 진피 섬유아세포를 컨플루언트 상태로 배양하였다. 시험 생성물의 존재 하에 미리 성장된 정상 인간 케라틴세포의 상청액으로 세포를 48시간 동안 처리하였다. 히알루론산을 함유하는 섬유아세포 상청액을 수집하고 즉시 어세이하였다. 히알루론산을 ELISA 마이크로타이터 플레이트로 정량하였다. 단백질 함량을 마이크로타이터 플레이트의 각각의 웰에 대해 측정하였다.
2. 시험된 생성물
* 10 또는 5 mM 농도의 N-아세틸글루코사민(NAG) 또는 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트(NAG6P)를 정상 인간 케라틴세포 상에 48시간 동안 적용하였고, 이후 상청액을 정상 인간 섬유아세포로 옮겼다.
* 비타민 A 프로피오네이트 1μM을 정상 인간 케라틴세포 상에 48시간 동안 적용하였고, 이후 상청액을 정상 인간 섬유아세포로 옮겼다.
* NAG 10mM + 비타민 A 프로피오네이트 1μM의 조합을 정상 인간 케라틴세포 상에 48시간 동안 적용하였고, 이후 상청액을 정상 인간 섬유아세포로 옮겼다.
* NAG6P 10mM + 비타민 A 프로피오네이트 1μM의 조합을 정상 인간 케라틴세포 상에 48시간 동안 적용하였고, 이후 상청액을 정상 인간 섬유아세포로 옮겼다.
3. 세포의 준비
정상 인간 케라틴세포(NHK)의 프라이모배양을 성형 수술로부터의 피부 시편으로부터 단리된 세포로부터 수득하였다.
NHK를 24-웰 플레이트에 특정 KSFM 배양 배지(Gibco?, Invitrogen) 중의 130,000세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 플레이트를 습윤 인큐베이터(37℃, 5% CO2)에 24시간 동안 두었다.
정상 인간 섬유아세포(NHF)의 프라이모배양을 성형 수술로부터의 피부 시편으로부터 단리된 세포로부터 수득하였다.
NHF를 24-웰 플레이트에 0.5% FCS가 보충된 E-199 배양 배지(Gibco?, Invitrogen) 중의 90,000세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 플레이트를 습윤 인큐베이터(37℃, 5% CO2)에 24시간 동안 두었다.
2개의 세포 유형-NHK 및 NHF-를 48시간 간격으로 플레이팅하였다.
4. 세포의 처리
각각의 농도(KSFM 배지에 희석됨, 600㎕)의 상이한 생성물을 NHK 세포와 48시간 동안 접촉시켰다. 미처리된 세포를 대조군 조건으로서 사용하였다. 한편으로는 NAG, 및 NAG + 비타민 A 프로피오네이트, 및 다른 한편으로는 NAG6P, 및 NAG6P + 비타민 A 프로피오네이트를 분리하여 시험하기 위해 2 개의 플레이트를 사용하였다.
각각의 처리 조건을 NHK 세포의 3개 웰에 대해 평가하였다.
48시간 후, NHK 세포 상청액의 분획(300㎕/웰)을 제거하고 NHF 세포 상청액 (300㎕ E-199/웰- FCS가 없는 신선한 배지)내로 충분히 옮겼다.
이것은 48시간 동안 NHF 세포 상에 남아있는 600㎕/웰(50:50 비의 KSFM/E-199 배지)의 최종 부피를 산출하였다.
5. 히알루론산 어세이
48시간의 처리 후, NHF 세포 상청액을 수집하고 원심분리하였다.
히알루론산을 실시예 1에 기재된 바와 같이 세포 상청액에서 어세이하였다.
각각의 웰에 대해 어세이를 이중으로 수행하였다.
6. 결과의 표현
각각의 샘플에 대해 측정된 광학 밀도(OD)를 그래프(키트 내의 특정 표준 곡선) 상에 플롯팅하였다. 히알루론산 농도를 ng/ml로 표현하였다.
7. 단백질 합성
여기에는 히알루론산을 어세이하기 위한 상청액의 세포 펠렛 내의 단백질 함량을 측정하는 것이 포함된다.
실시예 1에 기재된 바와 같이 실시하고, 결과를 웰 당 단백질 ㎍으로 표현하였다.
세포에 의해 방출된 히알루론산의 양을 단백질 ㎍으로서 표현된 세포 함량에 대해, 각각의 웰에 대해 그리고 각각의 처리 조건에 대해 측정하였다. 그러므로, 최종 결과를 단백질 ㎍ 당 히알루론산 ng/ml으로서 표현하였다.
동일한 농도의 시험 생성물로 처리된 웰에 대해 평균 값을 계산하였다. 상기 평균을 대조 웰에 의해 비교하였다(스튜던트 t 검정 - 평균 비교 - p<0.05*인 경우 95% 및 p<0.01**인 경우 99%에서 유의한 차이).
시험 생성물에 의해 유도된 %자극은 대조 및 처리 조건의 평균 값을 비교하여 측정되었다:
%자극 = (처리군 - 대조군) / 대조군
비타민 A 프로피오네이트 +/- NAG 또는 NAG6P(옮겨짐)의 조건의 경우, %자극을 대조군 대신 DMSO 대조군(실제로 존재하는 DMSO의 양에 상응하는 1:10,000 희석)에 대해 표현하였다.
결과를 표 5 및 6에 제시하고, 이는 3 개의 웰의 평균에 상응한다.
48시간 후 섬유아세포에 의해 생성된 히알루론산 - NAG 단독 또는 비타민 A 프로피오네이트와의 조합의 효과
48시간 - NAG 히알루론산(ng/ml) 단백질(㎍/웰) (ng/ml/㎍ 단백질) 히알루론산 합성의 %자극
대조군 3559.3 ± 374 8.4 ± 0.8 429.9 ± 78.4 /
NAG 10 mM 4056.1 ± 315.5 15.7 ± 0.6 258.8 ± 8.1 - 40% **
NAG 5 mM 4277.6 ± 488 12.2 ± 2.7 358.9 ± 81.8 - 17%
DMSO 대조군a 3001.7 ± 354.6 8 ± 2.3 387.3 ± 73.4 /
비타민 A 프로피오네이트 1μM 3645.6 ± 667.8 12 ± 3.7 316.6 ± 68 - 18%
NAG 10mM +비타민 A 프로피오네이트 1μM 4439.4 ± 445.9 10 ± 1.2 443.4 ± 15.2 15%
a DMSO 대조군: 비타민 A 프로피오네이트 및 NAG 10mM + 비타민 A 프로피오네이트 1μM의 조합에 의한 처리에 존재하는 DMSO의 양에 상응하는 1:10,000 희석.
* 스튜던트 검정: p<0.05 - 95%에서 유의한 결과
** 스튜던트 검정: p<0.01 - 99%에서 유의한 결과
48시간 후 섬유아세포에 의해 생성된 히알루론산 - NAG6P 단독 또는 비타민 A 프로피오네이트와의 조합의 효과
48시간 - NAG6P 히알루론산(ng/ml) 단백질(㎍/웰) (ng/ml/㎍ 단백질) 히알루론산 합성의 %자극
대조군 3351 ± 287.4 8.9 ± 0.9 375.9 ± 13.5 /
NAG6P 10 mM 3507.6 ± 213.3 9.2 ± 0.3 382.9 ± 20.5 2%
NAG6P 5 mM 3524.1 ± 198.6 8.8 ± 0.5 401.7 ± 38.3 7%
DMSO 대조군a 3058 ± 552 8.4 ± 0.7 364.3 ± 54.2 /
비타민 A 프로피오네이트 1μM 3358.8 ± 615.3 8.8 ± 0.9 389.2 ± 108.3 7%
NAG6P 10mM +비타민 A 프로피오네이트 1μM 4075.4 ± 433.4 7.9 ± 0.2 517.6 ± 28.2 42% **
a DMSO 대조군: 비타민 A 프로피오네이트 및 NAG6P 10mM + 비타민 A 프로피오네이트 1μM의 조합에 의한 처리에 존재하는 DMSO의 양에 상응하는 1:10,000 희석.
* 스튜던트 검정: p<0.05 - 95%에서 유의한 결과
** 스튜던트 검정: p<0.01 - 99%에서 유의한 결과
결론:
NAG 단독 또는 비타민 A 프로피오네이트 단독의 존재 하에 48시간 동안 케라틴세포를 인큐베이션한 후, 세포 상청액을 섬유아세포 상으로 옮기면, 상기 섬유아세포에 의한 히알루론산 합성 감소가 관찰되었다(상기 감소는 10mM NAG로 유의하였다). NAG와 비타민 A 프로피오네이트의 조합으로 실시한 동일한 실험은 케라틴세포 배양 상청액으로 처리된 섬유아세포에 의한 히알루론산 생성의 약한 15% 자극을 야기하였다.
놀라운 방식으로, 동일한 조건에서 케라틴세포를 NAG6P 단독 또는 비타민 A 프로피오네이트 단독으로 인큐베이션한 다음, 상기 세포의 상청액을 섬유아세포 내로 옮김으로써, 상기 섬유아세포에 의한 히알루론산 생성의 적은 자극이 관찰되었다. NAG6P와 비타민 A 프로피오네이트의 조합으로 실시한 동일한 실험은 케라틴세포 배양 상청액으로 처리된 섬유아세포에 의한 히알루론산 생성의 큰 42% 증가를 산출하였다.
효과가 없었던 N-아세틸글루코사민과는 달리, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트는 비타민 A 프로피오네이트와 조합으로 케라틴세포의 중재를 통해 진피 세포에 의한 히알루론산 생성을 자극할 수 있었다. 그러므로 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트와 비타민 A 프로피오네이트의 조합은 진피에 자연적으로 위치한 세포에서 히알루론산 생성을 자극한다.
그러므로 비타민 A 프로피오네이트와 상승적으로 작용하는 NAG6P는 주름 및 미세주름의 형성을 제한하도록, 또는 이들의 쇠퇴를 촉진하도록, 그리고 피부의 수화를 촉진 및 유지하도록 하는(히알루론산의 높은 수분-유지 능력에 기인함), 피부의 진피 세포외 매트릭스의 재생을 자극하기 위한 관심대상이다.
실시예 4: N-아세틸글루코사민-6- 포스페이트 단독으로 또는 비타민 A 프로피 오네이트와 조합으로 - N-아세틸글루코사민과 비교하여, 정상 인간 섬유아세포 휴메인( humain )에 의한 프로콜라겐 1 생성의 간접적 자극( 케라틴세포에 의해 매개됨 ).
1. 원리
본 실험을 실시예 3에 기재된 방법에 따라 실시하였다. 프로콜라겐 1을 함유하는 섬유아세포 상청액을 수집하고 ELISA 마이크로타이터 플레이트에 의해 프로콜라겐 1에 대해 즉시 어세이하였다.
2. 프로콜라겐 1 어세이
48시간의 처리 후, NHF 세포 상청액을 수집하고 원심분리하였다.
프로콜라겐 1을 프로콜라겐 유형 1 C-펩티드 EIA 키트(MK101, Takara)에 기재된 방법에 의해 세포 상청액에서 어세이하였다. 이것은 450nm에서의 분광기 검출을 하는 EIA 어세이이다(Safire, Tecan).
2 개의 웰의 경우 이중 검출을 실시한 반면, 세번째 웰은 오직 1회만 어세이하였다.
3. 결과의 표현
각각의 샘플에 대해 측정된 광학 밀도(OD)를 그래프(키트 내의 특정 표준 곡선) 상에 플롯팅하였다. 프로콜라겐 1 농도를 ng/ml로 표현하였다.
실시예 3에서와 같이, 단백질 함량을 프로콜라겐 1이 어세이되는 상청액의 세포 펠렛에서 측정하였다.
그러므로, 최종 결과를 단백질 ㎍ 당 프로콜라겐 1 ng/ml으로서 표현하였다.
동일한 농도의 시험 생성물로 처리된 웰에 대해 평균 값을 계산하였다. 상기 평균을 대조 웰에 의해 비교하였다(스튜던트 t 검정 - 평균 비교, p<0.05*인 경우 95% 및 p<0.01**인 경우 99%에서 유의한 차이).
시험 생성물에 의해 생성된 %자극은 대조 및 처리 조건의 평균 값을 비교하여 측정되었다:
%자극 = (처리군 - 대조군) / 대조군
비타민 A 프로피오네이트 +/- NAG 또는 NAG6P(옮겨짐)의 조건의 경우, %자극을 대조군 대신 DMSO 대조군(실제로 존재하는 DMSO의 양에 상응하는 1:10,000 희석)에 대해 표현하였다.
결과를 표 7 및 8에 제시하고, 3 개의 웰의 평균에 상응하였다.
48시간 후 섬유아세포에 의해 생성된 프로콜라겐 1 - NAG 단독 또는 비타민 A 프로피오네이트와의 조합의 효과
48시간 - NAG 프로콜라겐 1
(ng/ml)		 단백질(㎍/웰) (ng/ml/㎍ 단백질) %자극
대조군 767.4 ± 94.3 8.4 ± 0.8 91.4 ± 20.6 /
NAG 10 mM 700.9 ± 32.7 15.7 ± 0.6 44.9 ± 1.3 - 51% **
NAG 5 mM 685.9 ± 38.6 12.2 ± 2.7 57.3 ± 10.5 - 37% *
DMSO 대조군a 611.7 ± 78.7 8 ± 2.3 75.7 ± 13.7 /
비타민 A 프로피오네이트 1μM 706.1 ± 73.8 12 ± 3.7 64.3 ± 20.1 15%
NAG 10mM +비타민 A 프로피오네이트 1μM 715 ± 26.3 10 ± 1.2 72.4 ± 9.6 -4%
a DMSO 대조군: 비타민 A 프로피오네이트 및 NAG 10mM + 비타민 A 프로피오네이트 1μM의 조합에 의한 처리에 존재하는 DMSO의 양에 상응하는 1:10,000 희석
* 스튜던트 검정: p<0.05 - 95%에서 유의한 결과
** 스튜던트 검정: p<0.01 - 99%에서 유의한 결과
48시간 후 섬유아세포에 의해 생성된 프로콜라겐 1 - NAG6P 단독 또는 비타민 A 프로피오네이트와의 조합의 효과
48시간 - NAG6P 프로콜라겐 1 (ng/ml) 단백질(㎍/웰) (ng/ml/㎍ 단백질) %자극
대조군 675.5 ± 81.8 8.9 ± 0.9 73.2 ± 4.4 /
NAG6P 10 mM 677.7 ± 64.6 9.2 ± 0.3 72.7 ± 4.4 - 1%
NAG6P 5 mM 653.4 ± 36.6 8.8 ± 0.5 74.6 ± 5.3 2%
DMSO 대조군a 672.4 ± 67.5 8.4 ± 0.7 78.0 ± 2.0 /
비타민 A 프로피오네이트 1μM 704.4 ± 38.6 8.8 ± 0.9 81.9 ± 13.0 5%
NAG6P 10mM +비타민 A 프로피오네이트 1μM 744.7 ± 74.9 7.9 ± 0.2 94.7 ± 3.5 21% **
a DMSO 대조군: 비타민 A 프로피오네이트 및 NAG 10mM + 비타민 A 프로피오네이트 1μM의 조합에 의한 처리에 존재하는 DMSO의 양에 상응하는 1:10,000 희석.
* 검정 스튜던트 : p<0.05 - 95%에서 유의한 결과
** 검정 스튜던트 : p<0.01 - 99%에서 유의한 결과
결론:
NAG 단독 또는 비타민 A 프로피오네이트 단독의 존재 하에 48시간 동안 케라틴세포를 인큐베이션한 후, 세포 상청액을 섬유아세포 상으로 옮기면, 상기 섬유아세포에 의한 프로콜라겐 1 합성 감소가 관찰되었다(상기 감소는 10mM NAG로 유의하였다). NAG와 비타민 A 프로피오네이트의 조합으로 실시한 동일한 실험은 상기 섬유아세포에 의한 프로콜라겐 1의 감소를 야기하는 것으로 보였다.
놀라운 방식으로, 동일한 조건에서 케라틴세포를 NAG6P와 비타민 A 프로피오네이트와 함께 인큐베이션한 다음, 상기 세포의 상청액을 섬유아세포 상으로 옮김으로써, 상기 섬유아세포에 의한 프로콜라겐 1 합성의 자극이 관찰되었다. NAG6P와 비타민 A 프로피오네이트를 조합함으로써 수득된 상기 자극 효과는 개별적으로 시험된 각각의 화합물의 효과의 합보다 컸다.
효과가 없었던 N-아세틸글루코사민과는 달리, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트는 비타민 A 프로피오네이트와 조합으로 케라틴세포의 중재를 통해 진피 세포에 의한 프로콜라겐 1 생성을 자극할 수 있었다. 그러므로 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트와 비타민 A 프로피오네이트의 조합은 진피에 자연적으로 위치한 세포에서 프로콜라겐 1 생성을 자극한다.
그러므로 NAG6P는 비타민 A 프로피오네이트와 상승적으로, 케라틴세포를 통해 섬유아세포에 의한 프로콜라겐 1 생성을 유도할 수 있고, 그러므로 상기 조합은 주름 및 미세주름의 형성을 제한하도록, 또는 이들의 쇠퇴를 촉진하도록, 그리고 피부의 수화를 깊이 촉진 및 유지하도록 하는(히알루론산의 높은 수분-유지 능력에 기인함), 피부의 세포외 매트릭스의 재생을 자극하기 위한 관심대상이다.
실시예 5: N-아세틸글루코사민 단독으로 또는 비타민 A 프로피오네이트와 조합으로 정상 인간 섬유아세포 증식의 간접적 자극( 케라틴세포에 의해 매개됨 ).
상기 실험은 인간 케라틴세포로부터 옮겨진 상청액에 의한 처리 48시간 후 정상 인간 섬유아세포(진피 프라이모배양)의 증식을 평가하였다.
"세포 증식 ELISA, BrdU" 시험은 DNA 합성 동안 브로모데옥시우리딘(BrdU) 의 혼입을 측정한 후 발광 검출에 의해 세포 증식을 정량한다. 이것은 방사능을 사용하지 않는([H3] 티미딘 혼입에 대한 대안으로서) 민감한 방법이다.
1. 원리
세포를 특정 시간 동안의 처리 존재 하에 두었다(37℃, 5% CO2 에서의 인큐베이터). 이후 피리미딘 유사체 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU)을 첨가하고, 세포를 추가로 최소 2시간 동안 인큐베이션시키고(37℃, 5% CO2), 이 시간 동안 증식하는 세포의 DNA내로 티미딘 대신에 BrdU가 혼입된다.
배양 배지를 제거한 다음, 세포를 고정하고, 동시에 DNA를 변성시켰다(항체 접근능). 항-BrdU-POD (퍼옥시다아제) 항체를 첨가하였다; 상기 항체는 새롭게 합성된 DNA에서 BrdU에 결합한다. 이후 면역 복합체를 발광 측정과 함께 루미놀 기질의 첨가에 의해 검출하였다(Genios, Tecan).
2. 시험 생성물
N-아세틸글루코사민-6-포스페이트(NAG6P)을 정상 인간 케라틴세포 상에 48시간 동안 10 및 5 u%의 농도로 적용하고, 이후 상청액을 정상 인간 섬유아세포로 옮겼다.
비타민 A 프로피오네이트를 정상 인간 케라틴세포 상에 48시간 동안 1μM 농도로 적용하고, 이후 상청액을 정상 인간 섬유아세포로 옮겼다.
NAG6P 10mM + 비타민 A 프로피오네이트 1μM의 조합을 정상 인간 케라틴세포 상에 48시간 동안 적용하고, 이후 상청액을 정상 인간 섬유아세포로 옮겼다.
3. 세포의 준비
정상 인간 케라틴세포(NHK)의 프라이모배양을 성형 수술로부터의 피부 시편으로부터 단리된 세포로부터 수득하였다.
NHK를 24-웰 플레이트에 특정 KSFM 배양 배지(Gibco?, Invitrogen) 중의 130,000세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 플레이트를 습윤 인큐베이터(37℃, 5% CO2)에 24시간 동안 두었다.
정상 인간 섬유아세포(NHF)의 프라이모배양을 성형 수술로부터의 피부 시편으로부터 단리된 세포로부터 수득하였다.
NHF를 96-웰 Optilux 백색 플레이트(BD Falcon 353947)에 E-199 배양 배지(Gibco?, Invitrogen) 중의 5,000세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 플레이트를 습윤 인큐베이터(37℃, 5% CO2)에 24시간 동안 두었다.
2개의 세포 유형-NHK 및 NHF-를 48시간 간격으로 플레이팅하였다.
4. 세포의 처리
각각의 농도(KSFM 배양 배지에 희석됨, 600㎕)의 상이한 생성물을 NHK 세포와 48시간 동안 접촉시켰다. 대조군 세포를 미처리된 채로 남겼다. 각각의 처리 조건을 NHK 세포의 3개 웰에 대해 평가하였다.
48시간 후, NHK 세포 상청액의 분획을 제거하였다. NHK 플레이트(24웰) 상의 웰로부터 상청액(2 배 100㎕)의 각각의 샘플을 웰 당 100㎕의 E-199 배지를 이미 함유하고 있는 NHF 플레이트 내의 2개의 웰로 옮겼다. 이것은 48시간 동안 NHF 세포 상에 남아있는 200㎕/웰(50:50 비의 KSFM/E-199 배지)의 최종 부피를 산출하였다.
5. 증식의 측정
세포 증식을 "세포 증식 ELISA, BrdU" 키트(Roche Applied Science No. 11669915001)에 기재된 방법에 의해 정량하였다. 이것은 발광 검출을 하는 면역학적 어세이이다(Genios, Tecan).
6. 결과의 표현
동일한 처리 조건으로 6개의 웰의 발광 값(RLU/s)의 평균을 측정하였다. 상기 평균을 6개의 대조 웰에 대한 평균과 비교하였다(스튜던트 t 검정 - 평균 비교 - p<0.05*인 경우 95% 및 p<0.01**인 경우 99%에서 유의한 차이).
처리된 세포의 증식을 대조군의 %로서 표현하였다(미처리된 세포 - 100%) (OD 처리군/OD 대조군 x 100).
조건 비타민 A 프로피오네이트 +/- NAG6P(옮겨짐)의 경우, %증식을 대조군 대신 DMSO 대조군(실제로 존재하는 DMSO의 양에 상응하는 1:10,000 희석)에 대해 표현하였다.
하기 표 9에 제시되는 결과는 6개의 NHK 상청액이 옮겨진 6개의 웰의 평균에 상응하였다.
48시간 후 섬유아세포 증식 - NAG6P 단독 또는 비타민 A 프로피오네이트와의 조합의 효과
RLU %증식
대조군 4121 ± 205 /
NAG6P 10 mM 4903 ± 377 119% **
NAG6P 5 mM 4985 ± 184 121% **
DMSO 대조군* 4240 ± 187 100%
비타민 A 프로피오네이트 1μM 4640 ± 267 109% **
NAG6P 10mM + 비타민 A 프로피오네이트 1μM 5693 ± 391 134% **
a DMSO 대조군: 비타민 A 프로피오네이트 및 NAG 10mM + 비타민 A 프로피오네이트 1μM의 조합에 의한 처리에 존재하는 DMSO의 양에 상응하는 1:10,000 희석.
* 스튜던트 검정: p<0.05 - 95%에서 유의한 결과
** 스튜던트 검정: p<0.01 - 99%에서 유의한 결과
결론:
NAG6P 단독의 존재 하에 48시간 동안 케라틴세포를 인큐베이션한 후, 상기 세포의 상청액을 섬유아세포 상으로 옮기면, 놀라운 방식으로 섬유아세포 증식에서의 유의한 증가가 있는 것이 관찰되었다. 심지어 더욱 놀랍게는, 상기 증가는 케라틴세포 전-인큐베이션에서 사용되는 NAG6P 농도와 연관되지 않았으며, 이것은 아마도 섬유아세포 증식에 직접적으로 작용할 수 있는 NAG6P가 아닌 것 같다고 여겨진다. 그러므로, NAG6P는 가장 분명히 상기 화합물의 영향 하에서, 상청액 내로 하나 이상의 분자(아마도 상이한 크기의 히알루론산)를 분비하고, 이것이 섬유아세포 증식을 활성화시키는 케라틴세포의 반응을 유도한다.
놀라운 방식으로, NAG6P와 비타민 A 프로피오네이트의 조합은 시험된 생성물 개별적으로 보다 섬유아세포 증식의 자극을 더 크게 야기하였다.
그러므로 NAG6P는 단독으로 또는 비타민 A 프로피오네이트와 상승적으로 케라틴세포의 중재를 통해 섬유아세포 증식을 유도할 수 있고, 그러므로 피부 세포 재생을 자극하기 위한 관심대상이다.
실시예 6: 인간 피부에 대한 N-아세틸글루코사민-6- 포스페이트의 효과 시험
본 연구에서, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트의 효과를 살아있는 인간 피부에 대해 평가하고, 레티놀(0.02 내지 0.05%)을 함유하는 시판 "RetinOx + 데이" 크림의 효과와 비교하였다. 특히, 하기 파라미터를 평가하였다:
- 메손 트리크롬(Masson trichrome)으로 염색 후 일반적인 피부 형태학,
- 알시안 블루 염색 후 산 글리코사미노글리칸(GAG) 함량,
- 히알루론산 CD44 수용체의 면역표지 후 상기 수용체의 발현 수준.
1. 시험된 생성물
시험된 생성물: 1%(P1), 0.1%(P2) 및 0.01 %(P3) 농도(w/v)의 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트(NAG6P).
2. 생물학적 모델
33개의 외식편(직경 대략 10mm)을 복강형성술을 받은 36세 백인 여성(P712AB36)으로부터 채취하였다. 외식편을 3가지 외식편의 11개 그룹으로 나누고, 특별 피부 외식편 생존 배지에 두었다.
Figure pct00001
3. 처리
RetinOx + 데이 크림을 날짜 D0, D2, D3, D6 및 D8에 1mg/cm²으로 외식편 상에 적용하였다.
D0, D2, D3, D6 및 D8에, 30㎕의 제품 P1, P2 및 P3을 외식편 상에 놓인 필터 종이 디스크 상에 두었다.
대조군에는 임의의 처리를 하지 않았다.
4. 샘플
D0에, 그룹 C0 내의 3개의 외식편을 샘플링하고, 둘로 절단하였다. 절반을 통상의 보우인(Bouin) 용액으로 고정하고 나머지 절반을 -80℃에 저장하였다.
D6 및 D10에, 각각의 그룹으로부터의 3개의 외식편을 샘플링하고 동일한 방식으로 처리하였다.
5. 조직학
보우인(Bouin) 용액에서 48시간 고정 후, 샘플을 건조하고 Leica 1020 자동화 조직 프로세서를 사용하여 파라핀에 함침시킨 다음, Leica EG 1160 포매 스테이션을 사용하는 작업 절차 MO-H-153에 따라 포매시켰다. 5 ㎛ 섹션을 Leica RM 2125 Minot 마이크로톰을 사용하여 작업 절차 MO-H-173에 따라 조제하고, Superfrost? 조직학 유리 현미경 슬라이드 상에 고정시켰다.
5.1 일반적 형태학
일반적 형태학을 작업 절차 MO-H-157에 따라 메손 트리크롬(Masson trichrome), 골드너(Goldner) 변형체로 염색된 파라핀 섹션 상에 연구하였다.
5.2 산 GAG 의 가시화
산 GAG를 알시안 블루 염색으로 가시화하였다. 이들은 유두진피 도처에 존재하였다.
본 구역에서, 연구 하의 GAG는 블루로 염색되었고 산 GAG에 상응하였다.
염색의 강도는 이미지 분석에 의해 정량하였다.
5.3 CD44 면역표지
동결 섹션을 FITC와 비오틴/스트렙트아비딘 증폭기 시스템으로 실온에서 1시간 동안 인큐베이션된 1:100 희석된 마우스 항-CD44 단일클론 항체(Invitrogen MHC D4400)를 사용하여 CD44 수용체에 대해 표지하였다. 핵을 프로피듐 요오다이드로 반대염색하였다.
결과
일반적 형태학
날짜 D0 에서:
외식편의 각질층은 적당히 비후되었고, 더욱 적당히 층화되었고, 이의 표면 및 기저에서 완전히 각질화되었다. 표피는 양호한 형태학을 가진 5 내지 6 개의 세포 단층을 가졌다. 진피-표피 접합은 적당히 뚜렷하였다. 유두진피는 양호한 세포질을 갖는, 다소 밀집한 네트워크를 형성하는 상당히 두꺼운 콜라겐 섬유를 가졌다.
날짜 D10 에서(도 2 참조):
대조군 외식편의 표피 및 진피의 구조는 각질층 및 경미한 부전각화증에 근거하는 현저한 각질화와 함께, 약간 변경되었다. 기저층은 경미한 해면화를 보였다.
RetinOx + 데이 참조 크림의 적용은 매우 현저한 표피 극세포증(5 내지 6 개의 세포 단층/19 내지 20)과의 매우 현저한 레티노 유형의 반응을 야기하였다. 유두진피는 빽빽하였다.
외식편 상의 NAG6P의 적용은 표피 형태학의 상당한 개질을 야기하였다. 특히, 0.01% NAG6P(제품 P3)의 적용은 일반적인 형태학의 변화 및 진피-표피 접합의 명확한 재조직화/보강을 야기하였다. 유두진피는 다소 빽빽하였다.
산 GAG 의 가시화/정량
가시적 분석
날짜 D0 에서:
산 GAG는 유두진피 전반적으로 적정하였고, 섬유아세포에서 명확하게 보였다.
날짜 D6 에서(도 3 참조):
미처리된 외식편 상에서, GAG는 C0에 보다 약간 큰 범위로 발현되었다.
RetinOx + 데이 크림으로는, 이들은 적정하였고, 진피-표피 접합 (DEJ)을 따라 그리고 유두진피의 나머지에 상당히 빽빽하였다.
NAG6P로는, 용량-의존적 방식으로, 이들은 DEJ를 따라 적정하였고, 유두진피 전반적으로 존재하였다: 산 GAG는 0.01%보다 1% NAG6P로 빽빽하였다.
날짜 D10 에서:
미처리된 외식편 상에서, GAG는 D6에 관찰된 것과 유사하였다.
참조 RetinOx + 데이 크림으로는, 이들은 뚜렷하였고, 진피-표피 접합(DEJ)을 따라 그리고 유두진피의 나머지에 상당히 빽빽하였다.
NAG6P로는, D6에서 제시된 효과가 확인되었다: 용량-의존적 방식으로, 산 GAG는 DEJ를 따라, 유두진피 전반적으로 적정하게 존재하였다: 산 GAG는 0.01%보다 1% NAG6P로 빽빽하였다.
정량 분석
이미지 분석에 의해 산 GAG를 정량하였다. 결과를 하기 표 10에 분석된 영역의 %로서 표현한다.
유두진피에서 산 GAG에 의해 점유된 면적의 %
분석된 영역의 % D0 D10
평균 SD 평균 SD
대조군 외식편 37.9 11.6 11.4 5.7
RetinOx+데이 크림으로 처리된 외식편 / / 23.8 8.7
NAG6P 1%로 처리된 외식편 / / 21.0 3.4
NAG6P 0.1%로 처리된 외식편 / / 16.3 6.3
NAG6P 0.01%로 처리된 외식편 / / 14.0 4.0
히알루론산 CD44 수용체의 발현
날짜 D0 에서:
CD44 발현은 외식편에서 명확하고 매우 규칙적이었다.
표피에서, CD44는 모든 살아있는 층에서 과립 층까지 막 및 세포주변 위치가 있는 다소 점모양이었다. 유두진피에서, 이것은 섬유아세포 및 미세 섬유에 대해 매우 뚜렷했다.
날짜 D6 에서:
미처리된 외식편에서, CD44 발현은 표피 및 유두진피 모두에서 감소하였다.
RetinOx + 데이 크림으로 처리된 그룹에서, CD44는 적당히 과발현되었다.
CD44는 1% 및 0.1% NAG6P로 처리된 그룹에서 약간 과발현되었다; 상기 과발현은 0.01% NAG6P로 매우 적정하였다.
날짜 D10 에서(도 4 참조):
미처리된 외식편에서, CD44는 특히 기저 표피 및 유두진피에서 약간 과발현되었다.
RetinOx + 데이 크림으로 처리된 그룹에서, CD44는 약간 과발현되었다.
상기 과발현은 표피 및 유두진피 모두에서 0.01% NAG6P로 매우 명확하였다.
결론
본 연구는 놀라운 방식으로, 인간 피부 상에 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트의 적용은 여러 현상을 유도하였다는 것을 보여줬다:
- RetinOx + 데이 크림과는 반대로, 극세포증 없이 진피-표피 접합의 명확한 강화가 있는 진피-표피 구조의 가시적인 재조직화;
- 산 GAG 함량의 증가(그러므로, 주로 피부 내 주요 산 GAG인 히알루론산), RetinOx + 데이 크림과 같이 진피-표피 접합에서 뿐 아니라, 유두진피 전체에 잘 분포됨;
- 히알루론산 합성 활성 및 피부 세포의 활성화를 나타내는 히알루론산 CD44 수용체 수준의 증가.
특히, 상기 화합물 단독은 시판 레티놀 크림 정도로 효과적이거나 심지어 이보다 더욱 효과적이었다(예를 들어, 시판 크림과는 달리, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 극세포증을 야기하지 않음).
그러므로 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트는 피부에서 여러 현상을 자극하기 위한 관심대상이다:
- 피부의 3차원 지지체 매트릭스의 구성성분인 GAG의 합성 자극에 의한 피부의 리플럼핑(replumping),
- 진피-표피 접합의 향상에 의한 표피와 진피 사이의 영양물 교환 개선,
- 진피-표피 접합의 향상 및 GAG 합성의 자극에 의한 피부의 스무딩(smoothing) 및 견고화,
- CD44 수용체의 자극에 의해 피부 재생을 촉진함.
실시예 7: N-아세틸글루코사민-6- 포스페이트(NAG6P)를 함유하는 스킨 케어 조성물의 예
6.1 성숙 피부의 재생 크림
A- 수성상
글리세린 2.0 %
헥실렌 글리콜 3.0 %
잔탄 검 0.5 %
방부제 qs
카르보머 0.35 %
NAG6P 0.1 %
물 qsp.100 %
B- 지방상
스쿠알란 15 %
세틸 알코올 2 %
아라키딜 알코올/베헤닐 알코올/아라키딜글루코시드) 1 %
글리세롤 스테아레이트 5 %
물 1.5 %
NaOH 0.35 %
방부제+향(fragrance) qs
6.2. 모이스처라이징 및 에몰리언트 에멀젼
A- 지방상
세테아레스-2 3.5 %
세테아레스-21 2 내지 4 %
맥아유 3 %
시클로메티콘 7 %
옥틸 팔미테이트 8 %
B- 수성상
물 qsp.100 %
글리세린 7.0 %
헥실렌 글리콜 3.0 %
NAG6P 0.1%
방부제 qs
C- 40℃ 미만의 온도에서 에멀젼에 첨가되는 성분.
나트륨 히알루로네이트 0.1 %
물 5 %
토코페롤 0.05 %
비타민 A 팔미테이트 0.1 %
인지질 0.5 %
세라마이드 3 0.1 %
폴리아크릴아미드 및 C14 -13 이소파라핀 및 라우레스-7 2 내지 3.5 %
6.3. 광노화된 피부에 대한 선크림
A- 지방상
글리세롤 모노스테아레이트 2%
PEG-100 스테아레이트 3%
C12-C15 알킬 벤조에이트 10 %
디메티콘 5%
토코페롤 아세테이트 1 %
옥틸-트리아존(Uvinul T150) 1.5 %
부틸 메톡시 디벤조일 메탄(Eusolex 9020) 2.0 %
세토스테아릴 알코올 1%
B- 수성상
물 qsp.100 %
방부제 0.6 %
글리세린 7 %
헥실렌 글리콜 3.0 %
카르보머 0.5 %
테트라나트륨 EDTA 0.2 %
NAG6P 0.1%
나트륨 히알루로네이트 HMW 0.1 %
물 5 %
NaOH 0.5%
방부제 + 향 qs.
6.4. 주름방지 크림, 주사 후 ≪ 필러 ≫
A- 지방상
스쿠알란 5 %
세틸 알코올 2 %
디메티콘 5 %
옥틸 팔미테이트 5 %
B- 수성상
부틸렌 글리콜 0.5 - 4 %
물 qsp.100 %
NAG6P 0.1%
글리세린 2.0 %
헥실렌 글리콜 3.0 %
잔탄 검 0.5 %
방부제 qs
C- 40℃ 미만의 온도에서 에멀젼에 첨가되는 성분
토코페롤 아세테이트 0.1 내지 1 %
피리독신 0.01 내지 0.05 %
비타민 A 팔미테이트 0.01 내지 1 %
d-판테놀 0.1 내지 1 %
시트르산 0.1 내지 0.5 %
아연 글루코네이트 0.1 내지 1 %
트리나트륨 시트레이트 1 내지 2.5 %
물 5%
6.5. 성숙 피부를 위한 메이크업 리무버 로션
폴리소르베이트 20 1.0 %
카프릴릴/카프릴 글루코시드(Oramix CG110) 2.0 %
NAG6P 0.1 %
PEG-7 글리세릴 코코에이트 0.5 %
헥실렌 글리콜 4-5 %
d-판테놀 0.1 %
만니톨 0.02 %
방부제 qs
물 qsp.100 %

Claims (12)

  1. 건성 피부를 치료하기 위한 또는 피부 및 부속물의 노화를 치료 또는 예방하기 위한, 특히 주름, 특히 깊은 주름 및/또는 미세주름을 치료 또는 예방하기 위한, 피부 탄력성 및/또는 색조를 향상시키기 위한, 피부를 팽팽하게 하기 위한, 및/또는 진피-표피 접합을 재생/강화시키기 위한 및/또는 피부 세포(특히 케라틴세포 및 섬유아세포) 증식을 향상시키기 위한 및/또는 구조적 거대분자(특히 히알루로난 및/또는 콜라겐)의 합성을 향상시키기 위한, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 또는 이의 화장품적으로 허용가능한 염, 및 임의로 비타민 A 계열의 화합물을 포함하는 화장 조성물의 용도.
  2. 제1항에 있어서,
    바람직하게는 레티놀, 레티날 또는 레티날데히드(시스 또는 트랜스), 레티노산, 이소트레티노인, 아다팔렌, 트레티노인, 이의 염 및 유도체 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 비타민 A 계열의 화합물을 부가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    레티놀, 이의 염 또는 알코올 또는 에스테르를 부가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 국소 또는 경구 투여 또는 주사에 적합한(특히 표피내 및/또는 피내 및/또는 경피 및/또는 피하 주사 및/또는 마이크로-주사에 적합한) 것을 특징으로 하는 용도.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 조성물은 국소 투여에 적합한 것을 특징으로 하는 용도.
  6. 건선, 아토피 피부염, 습진, 관절 장애, 연골 결손 관련 장애, 윤활액 유출을 치료하기 위한, 염증 반응을 조절하기 위한, 점성보충을 위한, 또는 눈 수술 연관 치료를 위한, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학 또는 수의학 조성물.
  7. N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 또는 이의 화장품적으로 허용가능한 염, 및 바람직하게는 레티놀, 레티날 또는 레티날데히드(시스 또는 트랜스), 레티노산, 이소트레티노인, 아다팔렌, 트레티노인, 이의 염 및 유도체 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 비타민 A 계열의 화합물을 포함하는 화장 조성물.
  8. N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 바람직하게는 레티놀, 레티날 또는 레티날데히드(시스 또는 트랜스), 레티노산, 이소트레티노인, 아다팔렌, 트레티노인, 이의 염 및 유도체 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 비타민 A 계열의 화합물을 포함하는 약학 또는 수의학 조성물.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    레티놀, 이의 염 또는 알코올 또는 에스테르를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    건선, 아토피 피부염, 습진, 관절 장애, 연골 결손 관련 장애, 및 윤활액 유출을 치료하기 위한, 염증 반응을 조절하기 위한, 점성보충을 위한, 또는 수술, 특히 눈 및 복부 수술 연관 치료를 위한 조성물.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    국소 또는 경구 투여 또는 주사에 적합한(특히 표피내 및/또는 피내 및/또는 경피 및/또는 피하 주사 및/또는 마이크로-주사에 적합한) 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 주사, 바람직하게는 표피내 및/또는 피내 및/또는 경피 및/또는 피하 및/또는 마이크로-주사 및/또는 관절내 주사에 적합한, 또는 국소 투여에 적합한, 제7항 또는 제8항에 따른 조성물을 포함하는 장치.
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