KR20130002322A - 폐암 검출용 타액 바이오마커 - Google Patents

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Abstract

본원에서는 폐암과 관련된 바이오마커를 제공한다. 본 발명에서 확인된 타액 바이오마커(CCNI, EGFR, FGF9, GREB1 단백질, LZTS, BRAF, FRS2, ANXA1, 합토글로빈 Hp2, 아연 알파2-당단백질, 칼프로텍틴, 포르피로모나스 카토니아에 16S rRNA, 캠필로박터 쇼와에 16S rRNA, 스트렙토코쿠스 살리바리우스 16S rRNA, 캠필로박터 렉터스 16S rRNA, 베이요넬라 파르불라 16S rRNA, 킹겔라 오랄리스 16S rRNA, 및 그라눌리카텔라 아디아센스 16S rRNA)는 감도 및 특이성을 갖는 폐암 검출용 생물검정법을 위한 기반을 형성한다. 소견을 입증하기 위해 복수의 바이오마커를 이용하여 생성된 데이터를 평가하는 수단 및 방법, 및 임상적, 진단적, 및 치료적 용도에 있어서의 다중화된 폐암 검정법의 추가적인 용도 또한 포함한다.

Description

폐암 검출용 타액 바이오마커{SALIVARY BIOMARKERS FOR LUNG CANCER DETECTION}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2010년 2월 10일에 출원된 가출원 USSN 61/303,205를 우선권 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
연방 정부 지원 연구 또는 개발하에 이루어진 발명의 권리에 대한 언급
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 허여된 보조금 번호 DEO16275하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대하여 일정한 권리를 갖는다.
미국 국립 암 연구소(National Cancer Institute)에 따르면, 폐암이 암 사망의 주된 원인이다(하이퍼 텍스트 프로토콜://www.cancer.gov/cancertopics/types/폐). 2008년에는 단독으로 미국에서만도 폐암 환자로 새로 진단받은 환자가 대략 215,000 여명이 된다. 이들 환자 중 대략 87%가 비소세포성 폐암(NSCLC: non-small cell lung cancer)을 앓게 될 것이다.
폐암의 주범은 단연코 흡연, 특히 담배 흡연이다. 미국에는 폐암종의 발병 위험이 있는 흡연자 중에는 현재 흡연을 하고 있는 흡연자 450만명 및 이전 흡연자 450만명이 있는 것으로 추정된다. 폐암은 적어도 향후 50년간은 주된 건강상의 문제로 남아 있을 것으로 추정된다.
위험이 있는 다수의 사람들을 스크리닝할 수 있는 실제적인 방안은 없기 때문에, 폐암 사례 중 75% 초과의 사례가 말기에 진단된다. 조기 검출되면 치유율이 개선될 가능성이 있다.
폐암이 발병될 위험이 높은 개체를 확인하고, 계층하고, 조기에 검출하고자 하는 시도가 이루어져 졌다. 초기에는 객담 세포진 검사 및 흉부 X선이 스크리닝 도구로서 사용되었다. 불행하게도, 상기와 같은 방법은 치유가능한 사례수를 증가시키지는 못했다.
상기 방법은, 흉부 X선보다 감도가 더 큰 컴퓨터 단층 촬영(CT: computerized tomography) 스캔으로 대체되었다. 불행하게도, 위험군에게 CT 스크리닝을 광범위하게 적용하는 것은 위양성(양성 폐 결절 검출)일 가능성이 높고, 중심성 종양을 확인할 수 있는 능력이 부족하다는 점을 비롯한 몇가지 단점을 가지고 있다. 50%에 달할 정도로 위양성률이 높기 때문에 CT 스크리닝에 의해 모든 폐암 사망을 예방하고자 하는 경우에는 2가지 불필요한 침습적 시술을 수행하여야 할 것으로 추정된다.
따라서, 폐암을 검출하는 데 유용한 방법, 및 특히 상기 질환을 조기 단계에 검출할 수 있으며, 대개는 비침습성인 바이오마커가 요구되고 있다.
본 발명의 일부 실시양태에 따라, 시험 피험체에서 폐암이 존재하거나, 발병될 가능성을 측정하는 방법을 제공한다. 개시된 본 방법은 타액 시료 중의, CCNI(사이클린 I)(서열 번호: 1), EGFR(표피 성장 인자 수용체: Epidermal growth factor receptor)(서열 번호: 2), FGF9(섬유아세포 성장 인자 19: Fibroblast growth factor 19)(서열 번호: 3), GREB1 단백질(서열 번호: 4), LZTS(류신 지퍼, 추정 억제인자 I)(서열 번호: 5), BRAF(v-raf 뮤린 육종 바이러스성 암유전자 상동체 B1(서열 번호: 6), FRS2(섬유아세포 성장 인자 수용체 기질 2: Fibroblast growth factor receptor substrate 2)(서열 번호: 7), ANXA1(아넥신 A1)(서열 번호: 8), Hp2(합토글로빈 2)(서열 번호: 9), 아연 알파2-당단백질(서열 번호: 10), 포르피로모나스 카토니아에(Porphyromonas catoniae) 16S rRNA, 캠필로박터 쇼와에(Campylobacter showae) 16S rRNA, 스트렙토코쿠스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 16S rRNA, 캠필로박터 렉터스(Campylobacter rectus) 16S rRNA, 베이요넬라 파르불라(Veillonella parvula) 16S rRNA, 킹겔라 오랄리스(Kingella oralis) 16S rRNA, 및 그라눌리카텔라 아디아센스(Granulicatella adiacens) 16S rRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커를 특이적으로 검출하는 검정법을 이용하여 피험체로부터의 타액 시료를 분석하는 단계를 포함한다. 바이오마커의 상대적 발생률을 측정하고, 이를 대조군과 비교함으로써 시험 피험체의 폐암 상태를 측정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 타액 시료 중 2가지 이상의 바이오마커를 검출하는 단계를 수반하는, 시험 피험체에서 폐암이 존재하거나, 발병될 가능성을 측정하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 포르피로모나스 카토니아에 16S rRNA 및 캠필로박터 쇼와에 16S rRNA를 검출하는 단계를 수반하는, 시험 피험체에서 폐암이 존재하거나, 발병될 가능성을 측정하는 방법을 제공한다. 이러한 경우, 예를 들어, 이들 바이오마커 또는 이들 바이오마커 및 기타 다른 바이오마커의 상대적 발생률을 측정하고, 이를 대조군과 비교함으로써 시험 피험체의 폐암 상태를 측정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 타액 시료 중 3가지 이상의 바이오마커를 검출하는 단계를 수반하는, 시험 피험체에서 폐암이 존재하거나, 발병될 가능성을 측정하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, GREB1, CCNI 및 FRS를 검출하는 단계를 수반하는, 시험 피험체에서 폐암이 존재하거나, 발병될 가능성을 측정하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, ~를 검출하는 단계를 수반하는, 시험 피험체에서 폐암이 존재하거나, 발병될 가능성을 측정하는 방법을 제공한다. 이러한 경우, 예를 들어, 이들 바이오마커 또는 이들 바이오마커 및 기타 다른 바이오마커의 상대적 발생률을 측정하고, 이를 대조군과 비교함으로써 시험 피험체의 폐암 상태를 측정할 수 있다.
다른 실시양태에서, 시험 피험체에서 폐암이 존재하거나, 발병될 가능성을 측정하는 방법은 1가지 이상의 바이오마커를 코딩하는 핵산을 검출하는 검정법을 포함한다. 핵산은 예를 들어, 질량 분광법, 중합효소 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction), 마이크로어레이 하이브리드화, 열적 시퀀싱, 모세관 어레이 시퀀싱, 또는 고체상 시퀀싱에 의해 검출될 수 있다.
다른 실시양태에서, 시험 피험체에서 폐암이 존재하거나, 발병될 가능성을 측정하는 방법은 1가지 이상의 바이오마커를 코딩하는 폴리펩티드를 검출하는 검정법을 포함한다. 폴리펩티드는 예를 들어, 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴 블롯, 유세포 분석법, 면역형광법, 면역조직화학법, 또는 질량 분광법에 의해 검출될 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에 따라, 요법의 효능을 평가하는 방법을 개시한다. 본 방법은 CCNI, EGFR, FGF9, GREB1 단백질, LZTS, BRAF, FRS2, ANXA1, Hp2, 아연 알파2-당단백질, 포르피로모나스 카토니아에 16S rRNA, 캠필로박터 쇼와에 16S rRNA, 스트렙토코쿠스 살리바리우스 16S rRNA, 캠필로박터 렉터스 16S rRNA, 베이요넬라 파르불라 16S rRNA, 킹겔라 오랄리스 16S rRNA, 및 그라눌리카텔라 아디아센스 16S rRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커를 특이적으로 검출하는 검정법을 이용하여 피험체로부터의 제1 타액 시료를 분석하는 단계를 포함한다. 상기 제1 분석을 통해 제1 발현 프로파일을 제공한다. 요법을 피험체에게 적용시킨다. CCNI, EGFR, FGF9, GREB1 단백질, LZTS, BRAF, FRS2, ANXA1, Hp2, 아연 알파2-당단백질, 포르피로모나스 카토니아에 16S rRNA, 캠필로박터 쇼와에 16S rRNA, 스트렙토코쿠스 살리바리우스 16S rRNA, 캠필로박터 렉터스 16S rRNA, 베이요넬라 파르불라 16S rRNA, 킹겔라 오랄리스 16S rRNA, 및 그라눌리카텔라 아디아센스 16S rRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 2가지 이상의 바이오마커를 특이적으로 검출하는 검정법을 이용하여 피험체로부터의 제2 타액 시료 분석에 착수함으로써 제2 발현 프로파일을 제공한다. 제1 및 제2 발현 프로파일을 비교함으로써 요법의 효능을 평가한다.
또 다른 실시양태에서, CCNI, EGFR, FGF9, GREB1 단백질, LZTS, BRAF, FRS2, 포르피로모나스 카토니아에 16S rRNA, 캠필로박터 쇼와에 16S rRNA, 스트렙토코쿠스 살리바리우스 16S rRNA, 캠필로박터 렉터스 16S rRNA, 베이요넬라 파르불라 16S rRNA, 킹겔라 오랄리스 16S rRNA, 및 그라눌리카텔라 아디아센스 16S rRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 2가지 이상의 바이오마커에 대해 선택적인 포획 결합 프로브를 포함하는 고체 지지체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 제1 고체 지지체는 CCNI, EGFR, FGF9, GREB1 단백질, LZTS, BRAF, FRS2, 포르피로모나스 카토니아에 16S rRNA, 캠필로박터 쇼와에 16S rRNA, 스트렙토코쿠스 살리바리우스 16S rRNA, 캠필로박터 렉터스 16S rRNA, 베이요넬라 파르불라 16S rRNA, 킹겔라 오랄리스 16S rRNA, 및 그라눌리카텔라 아디아센스 16S rRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커에 대해 선택적인 포획 결합 프로브를 포함하고, 제2 고체 지지체는 ANXA1, Hp2, 아연 알파2-당단백질, 및 칼프로텍틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커에 대해 선택적인 포획 결합 리간드를 포함하는 것인, 제1 및 제2 고체 지지체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 키트의 포획 결합 리간드는 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 CCNI, EGFR, FGF9, GREB1 단백질, LZTS, BRAF, FRS2, 포르피로모나스 카토니아에 16S rRNA, 캠필로박터 쇼와에 16S rRNA, 스트렙토코쿠스 살리바리우스 16S rRNA, 캠필로박터 렉터스 16S rRNA, 베이요넬라 파르불라 16S rRNA, 킹겔라 오랄리스 16S rRNA, 및 그라눌리카텔라 아디아센스 16S rRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커의 선택적 증폭을 위한 하나 이상의 프라이머를 제공한다. 일부 실시양태에서, 프라이머 중 하나 이상이 검출가능한 표지를 갖는다.
본 발명의 일부 실시양태에 따라, 시험 피험체에서 폐암이 존재하거나, 발병될 가능성을 측정하는 방법을 제공한다. 개시된 본 방법은 타액 시료 중 17가지 이상의 바이오마커를 특이적으로 검출하는 검정법을 이용하여 피험체로부터의 타액 시료를 분석하는 단계를 포함한다. 바이오마커는 CCNI(사이클린 I)(서열 번호: 1), EGFR(표피 성장 인자 수용체)(서열 번호: 2), FGF9(섬유아세포 성장 인자 19)(서열 번호: 3), GREB1 단백질(서열 번호: 4), LZTS(류신 지퍼, 추정 억제인자 I)(서열 번호: 5), BRAF(v-raf 뮤린 육종 바이러스성 암유전자 상동체 B1(서열 번호: 6), FRS2(섬유아세포 성장 인자 수용체 기질 2)(서열 번호: 7), ANXA1(아넥신 A1)(서열 번호: 8), Hp2(합토글로빈 2)(서열 번호: 9), 아연 알파2-당단백질(서열 번호: 10), 포르피로모나스 카토니아에 16S rRNA, 캠필로박터 쇼와에 16S rRNA, 스트렙토코쿠스 살리바리우스 16S rRNA, 캠필로박터 렉터스 16S rRNA, 베이요넬라 파르불라 16S rRNA, 킹겔라 오랄리스 16S rRNA, 및 그라눌리카텔라 아디아센스 16S rRNA로 이루어진 군으로부터 선택된다. 17가지 이상의 바이오마커의 상대적 발생률을 측정하고, 이를 대조군과 비교함으로써 시험 피험체의 폐암 상태를 측정할 수 있다.
시험 피험체에서 폐암이 존재하거나, 발병될 가능성을 측정하는 방법인 것인 상기 실시양태 중 임의의 것에서, 사용되는 바이오마커의 개수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17개 이상일 수 있다.
상기 및 기타 다른 실시양태, 특징 및 잠재된 이점들은 하기 상세한 설명 및 도면을 참고함으로써 자명해질 것이다.
도 1은 타액 수집에 대한 프로토콜을 개략적으로 나타낸 대표도이다.
도입
폐암을 조기에 검출하게 되면 치료는 보다 쉬워지고(보다 소규모의 수술, 보다 덜 빈번한 방사선 요법 또는 화학요법), 생존율은 개선될 가능성이 있다. 종래 스크리닝(CT, X선, 객담 세포진 검사)의 감도 및 특이성은 바람직한 경우의 것보다 작다. 따라서, 비침습적으로 수집된 검체를 사용하여 바이오마커를 확인하는 감도 검정법이 폐암 검출에 있어 이상적이다.
건강한 개체에 의해 생산되었건, 또는 특정의 전신 질환을 앓는 개체에 의해 생산되었건 간에 바이오마커는 건강 상태, 질환 발병, 치료 반응, 및 결과를 모니터링하기 위한 텔-테일(tell-tale) 분자로서 사용될 수 있다.
타액은 바이오마커의 공급원으로서, 그에의 접근은 쉽다. 임상 진단용 생물학적 유체로서 타액은, 시료 수집이 간단하고, 비침습적이며, 환자 일원들에게 불안감을 덜 유발한다는 점을 비롯한 많은 이점을 제공한다. 타액 사용은 또한 대규모 스크린을 위한 것으로서 비용면에서 효율적인 접근법을 제공한다.
본 발명은 7개의 박테리아 균주를 시사하는 16S rRNA 검출을 포함하는, 17개의 타액 바이오마커의 진단/예후 중요성을 개시한다. 폐암 검출에서의 이러한 바이오마커로는 CCNI(사이클린 I)(서열 번호: 1), EGFR(표피 성장 인자 수용체)(서열 번호: 2), FGF9(섬유아세포 성장 인자 19)(서열 번호: 3), GREB1 단백질(서열 번호: 4), LZTS(류신 지퍼, 추정 억제인자 I)(서열 번호: 5), BRAF(v-raf 뮤린 육종 바이러스성 암유전자 상동체 B1(서열 번호: 6), FRS2(섬유아세포 성장 인자 수용체 기질 2)(서열 번호: 7), ANXA1(아넥신 A1)(서열 번호: 8), Hp2(합토글로빈 2)(서열 번호: 9), 아연 알파2-당단백질(서열 번호: 10), 포르피로모나스 카토니아에 16S rRNA, 캠필로박터 쇼와에 16S rRNA, 스트렙토코쿠스 살리바리우스 16S rRNA, 캠필로박터 렉터스 16S rRNA, 베이요넬라 파르불라 16S rRNA, 킹겔라 오랄리스 16S rRNA, 그라눌리카텔라 아디아센스 16S rRNA, 및 그의 조합을 포함한다. 타액 중 이들 및 기타 다른 바이오마커의 검출이 폐암의 진단 및 예후에 유용하다.
타액 바이오마커(단백질 및 핵산)를 검출하는 방법으로는 ELISA, PCR, 예를 들어, RT-PCR 또는 질량 분광법과 같은 단독의 기법, 또는 다른 마커와 조합된 기법을 포함한다. 임의의 특이적인 프로브, 예로서, 항체, 수용체, 리간드, RT-PCR 등이 검출을 위해 사용될 수 있다. 질량 분광법 또한 단백질 검출을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 단독으로 사용될 수 있거나, 또는 폐암 및 다른 암 진단을 향상시키기 위해서 종래 항원 분석법에 대한 보완법으로서 사용될 수 있다.
정의
CCNI(사이클린 I)(서열 번호: 1), EGFR(표피 성장 인자 수용체)(서열 번호: 2), FGF9(섬유아세포 성장 인자 19)(서열 번호: 3), GREB1 단백질(서열 번호: 4), LZTS(류신 지퍼, 추정 억제인자 I)(서열 번호: 5), BRAF(v-raf 뮤린 육종 바이러스성 암유전자 상동체 B1(서열 번호: 6), FRS2(섬유아세포 성장 인자 수용체 기질 2)(서열 번호: 7), ANXA1(아넥신 A1)(서열 번호: 8), Hp2(합토글로빈 2)(서열 번호: 8), 아연 알파2-당단백질(서열 번호: 9), 포르피로모나스 카토니아에 16S rRNA, 캠필로박터 쇼와에 16S rRNA, 스트렙토코쿠스 살리바리우스 16S rRNA, 캠필로박터 렉터스 16S rRNA, 베이요넬라 파르불라 16S rRNA, 킹겔라 오랄리스 16S rRNA, 그라눌리카텔라 아디아센스 16S rRNA는 핵산, 예를 들어, 유전자, DNA, 프리mRNA, mRNA, 및 폴리펩티드, 참조 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드, 또는 본원에 기술된 아미노산 서열과 바람직하게는 약 25, 50, 100, 200, 500, 1,000개 이상의 아미노산으로 이루어진 영역에 걸쳐, 또는 영역에 걸쳐 약 60% 초과의 아미노산 서열 동일성, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 다형성 변이체, 대립 유전자, 돌연변이체, 및 이종간 상동체를 지칭한다. 본 발명의 핵산 및 단백질은 천연적으로 발생된 분자 또는 재조합 분자, 둘 모두를 포함한다. 핵산 또는 단백질 서열은 예를 들어, 서열 번호: 1-9로 제공된다.
포르피로모나스 카토니아에, 캠필로박터 쇼와에, 스트렙토코쿠스 살리바리우스, 캠필로박터 렉터스, 베이요넬라 파르불라, 킹겔라 오랄리스, 그라눌리카텔라 아디아센스는 박테리아 균주를 지칭한다. 이러한 균주 및 기타 다른 균주는 예를 들어, 16S rRNA(리보핵산 또는 데오시리보핵산)의 검출, 염색체 DNA, mRNA 검출을 비롯한 임의의 많은 방법을 사용하여, 또는 적절한 성장 조건하에 적절한 성장 배지 중에서 시료로부터의 박테리아를 배양함으로써 시료 중에서 검출될 수 있다.
"암"은 인간 암 및 암종, 육종, 선암종, 림프종, 백혈병 등을 지칭하며, 이는 고형암, 림프계암, 신장암, 유방암, 폐암, 신장암, 방광암, 결장암, 난소암, 전립샘암, 췌장암, 위암, 뇌암, 두부경부암, 피부암, 자궁암, 고환암, 식도암 및 간암(간암종 포함), 림프종(비호지킨 림프종(예를 들어, 버킷 림프종, 소세포 림프종, 및 대세포 림프종) 및 호지킨 림프종 포함), 백혈병 및 다발골수종을 포함한다.
"치료적 치료법" 및 암 요법"이란 화학요법, 호르몬 요법, 방사선 요법 및 면역요법을 의미한다.
"과발현하다," "과발현" 또는 "과발현된"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되는데, 이는 정상 세포에서의 것과 비교하여 보통 암 세포에서 단백질이 검출가능한 수준보다 더 크게 전사 또는 번역된다는 것을 의미한다. 상기 용어는 전사, 전사후 프로세싱, 번역, 번역후 프로세싱, 세포 국재화(예를 들어, 소기관, 세포질, 핵, 세포 표면에의 국재화), 및 RNA 및 단백질 안정성에 기인하여 정상 세포에 비해 과발현하는 것을 포함한다. 과발현은 mRNA를 검출하는 종래 기법(즉, RT-PCR, PCR, 하이브리드화) 또는 단백질을 검출하는 종래 기법(즉, ELISA, 면역조직화학적 기법, 질량 분광법)을 사용하여 검출할 수 있다. 과발현은 정상 세포와 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상일 수 있다. 특정 경우에, 과발현은 정상 세포와 비교하여 전사 또는 번역 수준이 1배, 2배, 3배, 4배 이상으로 더 높다.
"암 관련 항원" 또는 "종양 특이 마커" 또는 "종양 마커"라는 용어는 상호교환적으로 사용되는데, 이는 세포에서 발현되거나, 암 세포의 표면 상에서 발현되거나, 또는 정상 세포와 비교하여 암 세포에 의해 분비되는 분자로서, 암을 진단하는 데, 예후를 제공하는 데, 및 약물 제제를 암 세포로 우선적으로 표적화시키는 데 유용한 분자(전형적으로 단백질, 또는 핵산, 예로서, RNA)를 의미한다. 종종, 암 관련 항원은 정상 세포와 비교하여 암 세포에서 과발현되며, 예를 들어, 정상 세포와 비교하여 약 1.2배 과발현, 약 2배 과발현, 약 3배 과발현 또는 그 초과로 과발현된다. 종종, 암 관련 항원은 암 세포에서 부적절하게 합성되는 세포 표면 분자, 예를 들어, 정상 세포에서 발현되는 분자와 비교하였을 때, 결실, 부가, 또는 돌연변이를 함유하는 것인 분자이다. 종종, 암 관련 항원은 오직 암 세포의 세포 표면 상에서만 발현될 것이며, 정상 세포의 표면 상에서는 합성되거나 발현되지는 않을 것이다. 예시되는 세포 표면 종양 마커로는 유방암의 경우, 단백질 c-erbB-2 및 인간 표피 성장 인자 수용체(HER: human epidermal growth factor receptor), 전립샘암의 경우, PSMA, 및 유방암, 난소암 및 결장직장암을 비롯한 다수의 암에서 당질 뮤신을 포함한다.
임의의 용도를 위해, 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같이, 폐암의 진단 또는 예후를 위해 마커는 단일로 또는 다른 마커와 함께 조합하여 사용될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
2가지 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 "동일하다" 또는 "동일성(%)"이라는 용어는 하기 기술하는 디폴트 파라미터를 이용하는 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용하거나, 수동 정렬 및 시각적 조사(예를 들어, NCBI 웹 사이트 하이퍼텍스트 트랜스퍼 프로토콜://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 등 참조)를 사용하여 측정된 바, 2가지 이상의 서열 또는 서브서열이 같거나, 또는 같은 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 특정 비율(즉, 비교창 또는 지정된 영역에 걸쳐 비교하고, 최대로 상응하도록 정렬하였을 때, 명시된 영역에 걸쳐 동일성이 약 60%, 바람직하게 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)로 갖는다는 것을 의미한다. 이어서, 상기 서열은 "실질적으로 동일하다"고 언급된다. 이러한 정의는 또한 상보체를 의미하거나, 또는 그에 적용될 수 있다. 상기 정의는 또한 결실 및/또는 부가를 가지는 서열 뿐만 아니라, 치환을 가지는 것도 포함한다. 하기 기술되는 바와 같이, 바람직한 알고리즘은 갭 등을 설명할 수 있다. 바람직하게, 동일성은 길이가 약 25개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐, 또는 더욱 바람직하게는, 길이가 50-100개의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로는 한 서열이 시험 서열과 비교되는 참조 서열로서의 역할을 한다. 서열 비교 알고리즘을 이용하는 경우, 시험 서열 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우, 서브서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 바람직하게, 디폴트 프로그램 파라미터를 사용할 수 있거나, 또는 대체 파라미터를 지정할 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열과의 비교를 통해 시험 서열에 대한 서열 동일성(%)을 계산한다.
본원에서 사용되는 바, "비교창"은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후, 서열이 동일 번호의 인접한 위치의 참조 서열과 비교될 수 있는 20 내지 600, 통상 약 50 내지 약 200, 보다 일반적으로 약 100 내지 약 150으로 구성된 군으로부터 선택된 인접한 위치의 번호를 갖는 어느 하나의 세그먼트에 대한 언급을 포함한다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 주지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 예를 들어, 문헌 [Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌 [Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌 [Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘(Wisconsin Genetics Software Package(미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 Genetics Computer Group) 중의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)의 컴퓨터 실행에 의해, 또는 수동 정렬 및 시각적 조사(예를 들면, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987-2005, Wiley Interscience)] 참조)에 의해 수행할 수 있다.
서열 동일성(%) 및 서열 유사성(%)을 측정하는 데 적합한 알고리즘의 예로는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있으며, 이는 각각 문헌 ([Altschul et al, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)] 및 [Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)])에 기술되어 있다. BLAST 및 BLAST 2.0은 본원에 기술된 파라미터와 함께 본 발명의 핵산 및 단백질에 대한 서열 동일성(%)을 측정하는 데 사용된다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)(하이퍼텍스트 트랜스퍼 프로토콜://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 입수할 수 있다. 이 알고리즘은 데이터베이스 서열 중 길이가 동일한 워드와 정렬되었을 때 일정한 양성값의 역치 스코어 T와 매치되거나, 상기 T를 만족시키는, 의문 서열 내의 길이 W의 짧은 워드를 확인함으로써 높은 스코어의 서열 쌍(HSP: high scoring sequence pair)을 첫번째로 확인하는 단계를 포함한다. T는 인접하는 워드 스코어 역치로서 지칭된다(문헌 [Altschul et al., 상기 문헌 동일]). 이들 초기 인접 워드 히트는 이들을 포함하는 보다 긴 HSP를 찾기 위한 검색을 개시하는 데 있어서 시드(seed)로서의 역할을 한다. 워드 히트는 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한, 각 서열을 따라 양방향으로 연장된다. 뉴클레오티드 서열의 경우, 누적 스코어는 파라미터 M(한 쌍의 매칭 잔기에 대한 보상 스코어; 항상 > 0) 및 N(미스매칭 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상 < 0)을 이용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우, 스코어링 매트릭스는 누적 스코어를 계산하는 데 사용된다. 각 방향에서의 워드 히트의 연장은 누적 정렬 스코어가 이의 최대 달성 값으로부터 양 X만큼 떨어진 경우; 누적 스코어가 1 이상의 음성 스코어링 잔기 정렬로 인해 0 이하로 된 경우; 또는 각 서열의 말단에 도달된 경우에 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X가 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 워드 길이(W)=11, 기대치(E)=10, M=5, N=-4 및 양가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 워드 길이=3 및 기대치(E)=10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(문헌 [Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)] 참조) 정렬(B)=50, 기대치(E)=10, M=5, N=-4, 및 양가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다.
"핵산"은 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체, 및 그의 보체를 의미한다.
특이적으로라는 것은 표적에 대해 비특이적인 리간드보다 1.2, 1.5, 2, 3, 5, 8, 10, 20, 50, 100, 150, 200, 500, 1,000배 이상 더 큰 친화도로 표적에 결합할 수 있는 리간드의 능력을 의미한다.
달리 명시하지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 묵시적으로는 명확하게 명시된 서열 뿐만 아니라, 보존적으로 변형된 그의 변이체(예를 들면, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보성 서열을 포함한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 세번째 위치에 있는 것이 혼합형 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되어 있는 서열을 생성시킴으로써 달성할 수 있다(문헌 ([Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)]; [Ohtsuka et al, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)]; [Rossolini et al, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)])). 핵산이라는 용어는 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드와 상호교환적으로 사용된다.
특정 핵산 서열은 또한 묵시적으로 "스플라이스 변이체" 및 절두된 형태의 암 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 유사하게, 핵산에 의해 코딩된 특정 단백질은 묵시적으로 스플라이스 변이체 또는 절두된 형태의 상기 핵산에 의해 코딩되는 임의의 단백질을 포함한다. "스플라이스 변이체"는 그 명칭이 제안하는 바와 같이, 유전자의 선택적 스플라이싱에 따른 생성물이다. 전사 후, 처음 핵산 전사체는 상이한(선택적) 핵산 스플라이스 생성물이 상이한 폴리펩티드를 코딩할 수 있도록 스플라이싱될 수 있다. 스플라이스 변이체 생산 기전은 다양하지만, 이는 엑손에 대한 선택적 스플라이싱을 포함한다. 연속(read-through) 전사에 의해 상기 핵산으로부터 유도된 대체 폴리펩티드 또한 상기 정의에 포함된다. 재조합 형태의 스플라이스 생성물을 비롯한, 스플라이싱 반응을 통해 얻은 임의의 생성물이 상기 정의에 포함된다. 핵산은 5' 말단 또는 3' 말단에서 절두된 것일 수 있다. 폴리펩티드는 N 말단 단부 또는 C 말단 단부에서 절두된 것일 수 있다. 절두된 버전의 핵산 또는 폴리펩티드 서열은 천연적으로 발생된 것이거나, 또는 재조합적으로 생성된 것일 수 있다.
"아미노산"이라는 용어는 천연적으로 발생된 아미노산 및 합성 아미노산 뿐만 아니라, 천연적으로 발생된 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 의미한다. 천연적으로 발생된 아미노산은 유전적 코드에 의해 코딩된 것 뿐만 아니라, 추후에 변형된 아미노산, 예를 들어, 히드록시프롤린, 감마-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 천연적으로 발생된 아미노산과 기본 화학적 구조가 동일한, 즉, 수소에 결합되는 탄소, 카르복실기, 아미노기 및 R 기를 가지는 화합물, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 의미한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예를 들면, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 가지지만, 천연적으로 발생된 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반 화학적 구조와는 상이한 구조를 가지지만, 천연적으로 발생된 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 화학적 화합물을 의미한다.
아미노산은 본원에서 IUPAC-IUB 생화학적 명명 위원회(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권장되는 통상적으로 공지된 3 문자 기호 또는 1 문자 기호로 언급될 수 있다. 유사하게, 뉴클레오티드도 통상적으로 허용되는 1 문자 코드로 지칭될 수 있다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일한 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 말한다. 유전적 코드의 축퇴성 때문에, 상당수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 한 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 코딩된 폴리펩티드를 변경시키지 않으면서 기술된 상응하는 코돈 중 어느 하나로 해당 코돈을 변경시킬 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 일종인 "침묵 변이"이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 해당 핵산의 모든 가능한 침묵 변이 또한 기술한다. 당업자는 핵산의 각 코돈(일반적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 일반적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각 침묵 변이는 실제 프로브 서열과는 상관없이, 발현 생성물에 대하여 각 기재된 서열에 내재되어 있다.
아미노산 서열에 대하여, 당업자는 코딩된 서열에서 하나의 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산을 변경시키거나, 부가하거나 또는 결실시키는, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개별 치환, 결실 또는 부가가 "보존적으로 변형된 변이체"(이 경우, 변경으로 인해 아미노산이 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환된다)라는 것을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 주지되어 있다. 본 발명의 다형성 변이체, 이종간 상동체, 및 대립 유전자 이외에도 상기와 같은 보존적으로 변형된 변이체가 존재하며, 본 발명의 다형성 변이체, 이종간 상동체, 및 대립 유전자를 배제하지는 않는다.
하기 8개 군은 각각 서로에 대한 보존적 치환인 아미노산을 포함한다: 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 리신(K); 5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 트레오닌(T); 및 8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예를 들어, 문헌 [Creighton, Proteins, (1984)] 참조).
"표지" 또는 "검출가능한 모이어티"는 분광분석적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적, 또는 다른 물리적 수단에 의해 검출가능한 조성물이다. 예를 들어, 유용한 표지는 형광성 염료, 고전자 밀도 시약, 효소(예를 들어, 통상 ELISA에서 사용), 비오틴, 디곡시게닌, 또는 합텐, 및 예를 들어, 방사능표지를 펩티드 내로 혼입시킴으로써 검출가능하도록 제조될 수 있거나, 펩티드와 특이적으로 반응성인 항체를 검출하는 데 사용될 수 있는 단백질을 포함한다.
예를 들어, 세포, 또는 핵산, 단백질, 또는 벡터와 관련하여 사용되는 경우, "재조합"이라는 용어는 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종성 핵산 또는 단백질의 도입에 의해, 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었거나, 또는 세포가 그렇게 변형된 세포로부터 유도된 것이라는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 천연(비재조합) 형태의 세포 내에서는 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 또는 다르게는 비정상적으로 발현되거나, 과소발현되는 천연 유전자를 발현하거나, 또는 천연 유전자를 전혀 발현하지 않는다.
"엄격한 하이브리드화 조건"이라는 어구는 프로브가 전형적으로 핵산의 복합 혼합물 중 다른 서열이 아닌 그의 표적 서브서열에만 하이브리드화하게 되는 조건을 의미한다. 엄격한 조건은 서열에 의존적이며, 이는 다른 환경하에서는 달라지게 될 것이다. 보다 장쇄의 서열은 보다 고온에서 특이적으로 하이브리드화한다. 핵산의 하이브리드화에 대한 폭넓은 가이드는 문헌 [Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)]에서 살펴볼 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도, pH에서의 특정 서열에 대한 열적 융점(Tm)보다 약 5-10℃ 더 낮은 온도가 되도록 선택된다. Tm은 표적에 대해 상보적인 프로브 중 50%가 평형 상태로 표적 서열에 하이브리드화되는 (정의된 이온 강도, pH, 및 핵산 농도하의) 온도이다(표적 서열이 과량으로 존재하는 바, Tm에서 프로브 중 50% 초과가 평형 상태로 점유화된다). 엄격한 조건은 또한 예를 들어, 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가를 통해 달성될 수도 있다. 선택적 또는 특이적인 하이브리드화의 경우, 양성 신호는 배경 하이브리드화의 2배 이상, 바람직하게는 배경 하이브리드화의 10배이다. 예시적인 엄격한 하이브리드화 조건은 하기와 같을 수 있다: 50% 포름아미드, 5x SSC, 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이션, 또는 5x SSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이션, 65℃에서 0.2x SSC, 및 0.1% SDS 중에서 세척.
핵산이 코딩하는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다면, 엄격한 조건하에서 서로 하이브리드화하지 않는 핵산도 여전히 실질적으로는 동일한 것이다. 이는 예를 들어, 핵산 카피가 유전적 코드에 의해 허용되는 최대 코돈 축퇴성을 사용하여 생성되는 경우에 발생한다. 상기와 같은 경우, 핵산은 전형적으로 중간 정도로 엄격한 하이브리드화 조건하에서 하이브리드화한다. 예시적인 "중간 정도로 엄격한 하이브리드화 조건"은 37℃에서 40% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS의 완충액 중에서의 하이브리드화, 및 45℃에서 1x SSC 중에서의 세척을 포함한다. 양성 하이브리드화는 배경의 2배 이상이다. 당업계의 숙련가는 대체적인 하이브리드화 및 세척 조건을 사용하여 유사한 엄격도의 조건을 제공할 수 있다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 하이브리드화 파라미터를 결정하는 것에 관한 추가의 라이드라인은 수많은 참조 문헌, 및 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al. 상기 문헌 동일]에서 제공된다.
PCR의 경우, 비록 어닐링 온도가 프라이머의 길이에 따라 약 32℃ 내지 48℃ 사이로 달라질 수는 있지만, 낮은 엄격도의 증폭을 위해서는 약 36℃의 온도가 전형적이다. 고도한 엄격도의 PCR 증폭의 경우, 비록 고도한 엄격도의 어닐링 온도는 프라이머 길이 및 특이성에 따라 약 50℃ 내지 약 65℃ 범위일 수 있지만, 약 62℃인 온도가 전형적이다. 고도한 및 낮은 엄격도의 증폭을 위한 전형적인 사이클 조건은 90℃-95℃에서 30 sec-2 min 동안 진행되는 변성 단계, 30 sec-2 min 동안 지속되는 어닐링 단계, 및 약 72℃에서 1-2 min 동안 진행되는 신장 단계를 포함한다. 낮은 및 고도한 엄격도의 증폭 반응을 위한 프로토콜 및 가이드라인은 예를 들어, 문헌 [Innis et al. (1990) PC Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.]에서 제공된다.
"항체"란 인식되는 면역글로불린 유전자 모두 또는 그 일부에 의해서 실질적으로 코딩되는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 의미한다. 예를 들어, 인간에서의 인식되는 면역글로불린 유전자로는 카파(κ), 람다(λ) 및 중쇄 유전자좌를 포함하고, 이는 함께 미리아드 가변 영역 유전자, 및 불변 영역 유전자 뮤(μ), 델타(δ), 감마(γ), 엡실론(ε) 및 알파(α)를 구성하는데, 이는 각각 IgM, IgD, IgG, IgE, 및 IgA 이소형을 코딩한다. 본원에서 항체라는 것은 전장의 항체 및 항체 단편을 포함하는 것으로 의미되며, 임의의 유기체로부터의 천연 항체, 공학처리된 항체, 또는 하기에 추가로 정의되는 바와 같이, 실험상, 치료상, 또는 다른 목적을 위해 재조합적으로 생성된 항체를 지칭할 수 있다. 항체 단편으로는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv 또는 항체의 다른 항원 결합 서브서열을 포함하고, 전체 항체의 변형에 의해 제조된 것, 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 새로 합성된 것을 포함할 수 있다. "항체"라는 용어는 단일클론 및 다중클론 항체, 둘 모두를 의미한다. 항체는 길항제, 효현제, 중화 항체, 억제 항체, 또는 자극 항체일 수 있다.
바이오마커
바이오마커는 역학 연구, 동물 연구, 병리 생리학적 숙고 및 종말 기관으로부터 기원할 수 있다. 이상적으로, 바이오마커는 의미있는 결과 척도에 대한 높은 예측값을 가질 것이며, 적절하게 디자인된 전향적 시험에서 확인될 수 있거나, 또는 확인되고, 대용 마커 결과 상의 상응하는 변화에 의해 치료학상의 성공 여부를 반영하고, 임상적 실시에 있어서 평가는 용이하게 이루어져야 한다.
바이오마커는 다른 진단용 도구와 함께 사용될 수 있거나, 또는 단독으로 사용될 수 있다.
"대용 마커," "바이오분자 마커," "바이오마커" 또는 "마커"(때때로 이는 또한 본원에서 "표적 피분석물," "표적 종" 또는 "표적 서열"로서 언급된다)라는 용어는 그의 측정값이 피험체의 상태에 관한 정보를 제공하는 것인 분자를 의미한다. 다양한 예시적인 실시양태에서, 바이오마커를 사용하여 병적 상태를 평가한다. 바이오마커 측정값은 피험체의 상태를 결정하는 데 있어서 단독으로 사용될 수 있거나, 또는 피험체와 관련하여 얻은 다른 데이터와 함께 조합될 수 있다. 한 실시양태에서, 바이오마커는 또 다른 표현형 상태(예를 들어, 질환을 앓지 않는 상태)와 비교하여 한 표현형 상태(예를 들어, 질환을 앓는 상태)를 갖는 피험체로부터 채취된 시료 중에 "차등적으로 존재한다." 한 실시양태에서, 바이오마커는 또 다른 유형의 요법을 받은 피험체의 것과 비교하여 어떤 요법도 받지 않은 피험체 또는 한가지 유형의 요법을 받은 피험체로부터 채취된 시료 중에 "차등적으로 존재한다." 별법으로, 바이오마커는 심지어 표현형상의 차이가 없는 경우에도 "차등적으로 존재할 수 있는 바," 예를 들어, 바이오마커를 통해 무증상 위험을 검출할 수 있다.
바이오마커는 대조군과 비교하였을 때, 과발현(과다충분)되거나, 과소발현(과소충분)될 수 있다. 바이오마커는 대립 유전자 변이체, 야생형 핵산 또는 단백질의 절단된 또는 돌연변이 형태일 수 있다. 바이오마커는 스플라이스 변이체일 수 있다.
바이오마커는 상이한 군의 바이오마커의 평균 또는 중앙 수준(특히, 하기 기술하는 바와 같이, 관련된 mRNA의 발현 수준) 계산 결과 통계학상 유의하였다면, 다양한 방식으로 예를 들어, 상이한 표현형 상태 간에 "차등적으로 존재"하는 것으로 측정될 수 있다. 그 중에서도 통계적 유의성에 대한 통상의 검정으로는 t 검정, ANOVA, 크러스칼-왈리스(Kruskal-Wallis), 윌콕슨(Wilcoxon), 만-휘트니(Mann-Whitney) 및 오즈비를 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 바이오마커는 예를 들어, 소형 분자, 피분석물 또는 표적 피분석물, 핵산, 단백질, 대사산물 또는 그의 임의의 유도체, 또는 이러한 분자들의 임의의 및 모든 조합일 수 있으며, 본 발명에서는 단백질 및 핵산 특히 유용한 것으로 밝혀졌다. 당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 본 방법을 사용함으로써 다수의 피분석물이 검출될 수 있는데; 기본적으로, 하기 기술하는 바, 그에 대한 결합 리간드가 제조될 수 있는 것인 임의의 바이오마커가 본 발명의 방법의 사용을 통해 검출될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 본 발명의 패널에 사용되는 바이오마커는 임의의 조합으로서 단백질로서, 또는 핵산(예를 들어, mRNA 또는 cDNA 전사체)으로서 검출될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 단백질 형태의 바이오마커가 측정된다. 당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 표준 기법, 예를 들어, ELISA 검정법을 사용하여 단백질 검정을 수행할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 핵산 형태의 바이오마커(예를 들어, 상응하는 mRNA)가 측정된다. 다양한 예시적인 실시양태에서, 특정 패널로부터의 하나 이상의 바이오마커는 단백질 검정을 사용하여 측정하고, 같은 패널로부터의 하나 이상의 바이오마커는 핵산 검정을 사용하여 측정한다.
당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 본 발명을 사용하여 검출될 수 있는 가능성을 지닌 단백질성 표적 피분석물 및 표적 종이 다수 존재한다. "단백질," "폴리펩티드" 또는 "올리고펩티드"라는 용어는 하나 이상의 펩티드 결합에 의해 연결되어 있는 적어도 2개 이상의 펩티드 또는 아미노산을 의미한다. 단백질 또는 아미노산은 천연적으로 또는 비천연적으로 발생된 것일 수 있고, 이는 또한 유사체, 유도체 또는 펩티드 모방체 구조일 수 있다. "단백질"이라는 용어는 야생형 서열, 야생형 서열의 변이체, 및 유사체 또는 유도화된 아미노산을 포함하는 것 중 어느 하나를 의미한다. 다양한 실시양태에서, 예를 들어, 스플라이스 변이체, 결실, 부가, 치환을 포함하는 변이체, 단편, 프리프로단백질, 프로세싱된 프리프로단백질(예를 들어, 신호 전단 펩티드를 포함하지 않는 것), 프로세싱된 프로단백질(예를 들어, 활성 형태인 것을 생성), 비인간 서열 및 변이체 비인간 서열을 비롯한, 본원에 기술된 서열의 변이체가 바이오마커로서 사용될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 바이오마커는 핵산이다. 본원에서 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드"라는 용어 또는 문법상의 등가물은 함께 공유적으로 연결된 2가지 이상의 뉴클레오티드를 의미한다. 비록 하기 개략적으로 설명되는 일부 경우에 있어서는, 예를 들어, 결합 리간드 프로브의 사용에 있어서는 대체 골격을 가질 수 있는 핵산 유사체가 사용되기도 하지만, 본 발명의 핵산은 일반적으로는 포스포디에스테르 결합을 함유할 것이다.
바이오마커는 또한 박테리아 핵산 또는 단백질일 수 있다. 구강은 700가지 초과의 종 또는 계통형을 포함하는 박테리아의 큰 저장소로서, 그 중 50% 초과는 배양되지 않은 것이다. 일부 실시양태에서, 박테리아 세균총 조성 및 동적 변화를 평가하는 것이 폐암에 대한 바이오마커가 된다.
최근 개발된 16S rRNA 기반 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이(Human Oral Microbe Identification Microarray)를 통해 폐암을 앓는 환자 및 그를 앓지 않는 환자에서 구강 박테리아 세균총에 대한 프로파일을 작성할 수 있었다. 일부 실시양태에서, 시료 중 박테리아로부터의 16S rRNA이 존재, 부재, 또는 그의 수준은 질환 또는 병증과 상관관계에 있을 수 있다. "박테리아"는 비구획화된 환형 DNA와 약 70S의 리보좀을 포함하는, 작은 원핵 유기체(선형 크기는 약 1 ㎛)를 의미한다. "16S RNA"란 16S rRNA를 코딩하는 유전자 또는 16S rRNA 그 자체인 것인 원핵세포 리보솜의 30S 서브유닛의 핵산 성분을 의미한다. 종 또는 계통형의 박테리아 균주의 16S rRNA에 있어서 차이는 약 2% 미만이다. 밀접한 관계가 있는 종 또는 계통형은 일반적으로 16S rRNA에 있어서 그 차이는 약 2% 내지 약 4% 사이인 반면, 속은 자주 16S rRNA에 있어서 그 차이가 약 5% 내지 약 10% 사이이다.
박테리아 군집의 동일성을 분석하기 위해, 예를 들어, 16S rRNA 유전자의 보존되는 특징을 이용할 수 있도록 마이크로어레이 상의 프로브를 디자인할 수 있다. 예를 들어, 더욱더 보존되는 특징을 갖는 영역에 상보적인 프로브를 통해 거대 계통형 군 중의 종을 동정할 수 있는데, 상기 거대 계통형 군을 이루는 각 군은 보다 고등의 분류군(예를 들어, 도메인, 문, 강, 목, 또는 과)에 상응한다. 가변성이 보다 큰 영역에 상보적인 프로브를 통해 속 및 종이 구별될 수 있다.
바이오마커는 또한 마이크로 RNA를 포함할 수 있다. "마이크로RNA"(miR: microRNA)는 유전자 발현을 조절하는 소형의 천연적으로 발생된 비코딩 RNA 부류(18-24개의 뉴클레오티드)를 의미한다. 다수의 마이크로RNA가 종 간에 잘 보존되고 있으며, 광범위한 범위의 종: 식물, 선충, 초파리 및 인간에 존재한다. 마이크로RNA는 하나 이상의 메신저 RNA 분자(mRNA: messenger RNA)에 대해 부분적으로 또는 완벽하게 상보적인 서열을 가지며, 그의 주요 작용은 유전자의 발현을 음성적으로 조절하는 것이다. 특히, 마이크로RNA는 mRNA의 3' 비번역 영역(3-UTR: 3' untranslated region)에 결합함으로써 예를 들어, mRNA 절단, 번역 억제 및 탈아데닐화와 같은 다양한 방식으로 mRNA를 하향조절한다.
새로운 마이크로RNA를 동정하는 데 뿐만 아니라, 상이한 생물학상의 과정에서의 그의 발현 패턴을 연구하는 데 다양한 실험상의 접근법 및 상이한 기법이 사용되어 왔다. 소형 RNA 클로닝 접근법을 사용하여 크기 분별된 RNA 시료로부터 새로운 마이크로RNA를 성공적으로 클로닝하고 동정할 수 있었다. 다른 접근법으로는 다른 종에서 이미 기술된 바 있는 마이크로RNA에 대한 추정 마이크로RNA 상동체로서의 것, 또는 전산화 접근법만을 이용하거나, 또는 마이크로어레이 분석법 및 서열에 대한 클로닝과 조합된 접근법이 있다.
마이크로RNA의 검출 및 프로파일링에 사용되는 제1의 기법들 중 하나는 겔 분리 후, 상보적인 32P, 디곡시게닌으로 표지된 올리고 또는 변형된 잠금형 핵산(LNA: Locked-nucleic-acid) 올리고뉴클레오티드와의 하이브리드화가 이루어지는 것인, 노던 블롯팅이 있었다.
마이크로RNA를 특이적으로 결합할 수 있도록 개발된 다른 기법으로는 변형된 침입자 검정법(적절한 중첩형 플랩 구조의 합성 올리고뉴클레오티드인 프로브는 구조 특이적 5* 뉴클레아제에 의해 효소적으로 절단된다), 및 (화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어, LNA를 포함하는 형광 표지된 상보적 프로브를 이용하는) 계내 하이브리드화가 있다. 마이크로RNA의 검출 및 프로파일링을 위해 널리 사용되는 또 다른 기법은 DNA 포획 프로브와 함께, 또는 리보스 모이어티가 2'-0 및 4'-C 원자를 연결하는 엑스트라 브릿지로 변형된 것인 변형된 잠금형 핵산(LNA) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 기반 검출 플랫폼을 사용하는 것이다.
추가로, 정량적 실시간 PCR(Taqman 또는 SYBR 그린 기술을 사용하는 역전사 효소/중합효소 연쇄 반응)이 전구체 또는 성숙한 마이크로RNA의 검출 및 프로파일링을 위해 사용되었다. 이러한 기법은 감도가 좋으며, 개별의 성숙한 마이크로RNA의 검출을 위한 소량의 출발 물질이 요구된다. qRT-PCR의 감도를 우수히 하면서, 동시에 한 시료 중의 다른 마이크로RNA들을 동시에 검출할 수 있는 택맨(Taqman) 마이크로RNA 어레이가 개발되었다.
바이오마커는 또한 대사산물을 포함할 수 있다. "대사산물" 또는 "소형 분자"는 시료 중에 존재하는 유기 및 무기 분자를 의미한다. 상기 분자가 큰 거대분자, 예를 들어, 큰 단백질(예를 들어, 분자량이 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 또는 10,000보다 큰 단백질), 큰 핵산(예를 들어, 분자량이 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 또는 10,000보다 큰 핵산), 또는 큰 다당류(예를 들어, 분자량이 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 또는 10,000보다 큰 다당류)를 포함하지는 않는다.
일반적으로 세포의 대사산물은 용액 중에는 존재하지 않는 것으로 밝혀져 있다. "대사 프로파일,", 또는 "소형 분자 프로파일"은 표적화된 세포, 조직, 기관, 유기체, 또는 그의 분획(예를 들어, 세포 구획) 내 소형 분자의 완전한 또는 부분적인 목록을 의미한다. 목록으로는 존재하는 소형 분자의 정량 및/또는 유형을 포함할 수 있다. "소형 분자 프로파일"은 단일 기법 또는 다중의 상이한 기법을 사용하여 측정될 수 있다.
예를 들어, 기법, 예를 들어, GC-MS(기체 크로마토그래피-질량 분광분석법: gas chromatography-mass spectrometry) 및 LC-MS(액체 크로마토그래피-질량 분광분석법: liquid chromatography-mass spectrometry)를 사용하여 시료를 분석함으로써 대사 프로파일을 전개할 수 있다.
바이오마커 패널
본원에 기술된 바이오마커의 임의의 조합을 사용하여 바이오마커 패널을 조립하는데, 이는 본원에 기술된 바와 같이 검출되거나, 측정된다. 당업계에서 일반적으로 이해되는 바와 같이, 조합은 전체 세트, 또는 그의 임의의 서브세트 또는 서브조합을 의미할 수 있다. "바이오마커 패널," "바이오마커 프로파일," 또는 "바이오마커 핑거프린트"라는 용어는 바이오마커 한 세트를 의미한다. 본원에서 사용되는 바, 이러한 용어는 또한 측정되는 임의 형태의 바이오마커를 의미할 수 있다. 따라서, CCNI가 바이오마커 패널의 일부일 경우, 이때 예를 들어, CCNI mRNA, 또는 예를 들어, CCNI 단백질이 상기 패널의 일부인 것으로 간주될 수 있다. 개별 바이오마커가 진단제로서 유용한 반면, 때로는 특정 상태를 결정하는 데 있어서 단독으로 단일의 바이오마커보다는 바이오마커 조합이 더 큰 값을 제공할 수 있다. 구체적으로, 시료 중 복수개의 바이오마커를 검출하는 것이 시험의 감도 및/또는 특이성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 다양한 실시양태에서, 바이오마커 패널은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17개 이상의 바이오마커 유형을 포함할 수 있다. 다양한 예시적인 실시양태에서, 바이오마커 패널은 최소 개수의 바이오마커로 구성되어 최대량의 정보를 생성한다. 따라서, 다양한 실시양태에서, 바이오마커 패널은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17개 이상의 바이오마커 유형으로 구성된다. 바이오마커 패널이 "바이오마커 한 세트"로 구성될 경우, 상기 세트를 이루는 것 이외에는 어떤 바이오마커도 존재하지 않는다. 예시적인 실시양태에서, 바이오마커 패널은 본원에 개시된 1개의 바이오마커로 구성된다. 다양한 실시양태에서, 바이오마커 패널은 본원에 개시된 2개의 바이오마커로 구성된다. 다양한 실시양태에서, 바이오마커 패널은 본원에 개시된 3개의 바이오마커로 구성된다. 다양한 실시양태에서, 바이오마커 패널은 본원에 개시된 4개 이상의 바이오마커로 구성된다.
다양한 예시적인 실시양태에서, 바이오마커 패널은 CCNI(사이클린 I)(서열 번호: 1), EGFR(표피 성장 인자 수용체)(서열 번호: 2), FGF9(섬유아세포 성장 인자 19)(서열 번호: 3), GREB1 단백질(서열 번호: 4), LZTS(류신 지퍼, 추정 억제인자 I)(서열 번호: 5), BRAF(v-raf 뮤린 육종 바이러스성 암유전자 상동체 B1(서열 번호: 6), FRS2(섬유아세포 성장 인자 수용체 기질 2)(서열 번호: 7), ANXA1(아넥신 A1)(서열 번호: 8), Hp2(합토글로빈 2)(서열 번호: 8), 쇄 B, MHc 유사 아연 알파2-당단백질과 Pro1 사이에 형성된 복합체의 결정 구조, 포르피로모나스 카토니아에 16S rRNA, 캠필로박터 쇼와에 16S rRNA, 스트렙토코쿠스 살리바리우스 16S rRNA, 캠필로박터 렉터스 16S rRNA, 베이요넬라 파르불라 16S rRNA, 킹겔라 오랄리스 16S rRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커를 포함하거나, 그로 구성된다.
바이오마커는 또한 임상 파라미터일 수 있다. "임상 파라미터"라는 용어는 피험체의 건강 상태 또는 다른 특징들, 예를 들어, 제한없이, 연령, 인종, 성별, 가족력, 키, 및 체중을 나타내는 비시료 또는 비피분석물 바이오마커 모두를 의미한다.
본 발명의 바이오마커는 폐암 진단에서 통계학상 유의적인 차이를 나타낸다. 다양한 실시양태에서, 이러한 바이오마커를 단독으로, 또는 조합하여 사용하는 진단 시험은 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 및 약 100%의 감도 및 특이성을 나타낸다.
바이오마커 측정 및 검출
바이오마커는 일반적으로 당업자에게 공지된 다양한 검정법, 방법, 및 검출 시스템을 통해 측정 및 검출될 수 있다. "측정하는(measuring)," "검출하는," 또는 "측정하는(taking a measurement)"이라는 용어는 엔티티의 특성을 정량적으로 또는 정질적으로 측정하는 것, 예를 들어, 분자의 양 또는 농도, 또는 분자의 활성 수준을 정량하는 것을 의미한다. "농도" 또는 "수준"이라는 용어는 절대량 또는 상대량을 의미할 수 있다. 분자를 측정하는 것은 또한 분자의 존재 여부를 측정하는 것 또한 포함할 수 있다. 다양한 방법으로는 굴절 지수 분광법(RI: refractive index), 자외선 분광법(UV: ultra-violet), 형광 분석법, 전기화학 분석법, 방사화학 분석법, 근적외선 분광법(근 IR: near-infrared), 적외선(IR: infrared) 분광법, 핵 자기 공명 분광법(NMR: nuclear magnetic resonance), 광 산란 분석법(LS: light scattering), 질량 분광분석법, 열분해 질량 분광분석법, 네펠로법, 분산 라만 분광법, 기체 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 기체 크로마토그래피 질량 분광분석법, 액체 크로마토그래피 질량 분광분석법, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화법-비행 시간(MALDI-TOF: matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight) 질량 분광분석법, 이온 분무 분광법 질량 분광분석법, 모세관 전기영도, 비색 분석 방법 및 표면 플라즈몬 공명(예를 들어, Biacore Life Sciences가 제공하는 시스템에 따른 것)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. PCT 공개공보 WO/2004/056456 및 WO/2004/088309 또한 참조한다. 이와 관련하여, 바이오마커는 상기 언급된 검출 방법, 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 다른 바이오마커는 그를 검출하도록 특이적으로 디자인되거나 적합화된 시약을 사용함으로써 유사한 방식으로 검출될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 상이한 유형의 바이오마커 및 그의 측정법이 조합될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 단백질 형태의 바이오마커를 측정한다. 다양한 실시양태에서, 핵산 형태의 바이오마커를 측정한다. 예시적인 실시양태에서, 핵산 형태는 mRNA이다. 다양한 실시양태에서, 단백질 바이오마커의 측정값이 핵산 바이오마커의 측정값과 함께 사용된다.
mRNA를 검출하는 방법, 예를 들어, RT-PCR, 실시간 PCR, 분지 DNA, NASBA 등이 당업계에 주지되어 있다. 바이오마커 서열에 대한 데이터베이스 엔트리가 제공하는 서열 정보를 사용함으로써 당업계의 숙련가에게 주지된 기법을 이용하여 (존재하는 경우) 바이오마커 서열의 발현을 검출하고 측정할 수 있다. 예를 들어, 서열 데이터베이스 엔트리 중의 서열 또는 본원에 개시된 서열을 사용함으로써 예를 들어, 노던 블롯 하이브리드화 분석법, 또는 구체적으로, 및 바람직하게는 특이적인 핵산 서열을 정량적으로 증폭시키는 방법에서 바이오마커 RNA 서열 검출용의 프로브를 구성할 수 있다. 또 다른 일례로서, 서열을 사용하여 예를 들어, 증폭 기반 검출 방법, 예를 들어, 역전사 기반 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR: reverse-transcription based polymerase chain reaction)에서 바이오마커 서열을 특이적으로 증폭시키기 위한 프라이머를 구성할 수 있다. 유전자 발현의 변경이 유전자 증폭, 결실, 다형성, 및 돌연변이와 관련이 있는 경우, 시험 세포 군집 및 참조 세포 군집에서 조사된 DNA 서열의 상대량을 비교함으로써 시험 군집 및 참조 군집 간의 서열을 비교할 수 있다. 노던 블롯 및 RT-PCR 이외에도, RNA는 또한 예를 들어, 다른 표적 증폭 방법(예를 들어, TMA, SDA, NASBA), 신호 증폭 방법(예를 들어, bDNA), 뉴클레아제 보호 검정법, 계내 하이브리드화 등을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태는 바이오칩 검정법이다. 본원에서 "바이오칩" 또는 "칩"이란 일반적으로 포획 결합 리간드(이는 또한 흡착제, 친화성 시약 또는 결합 리간드, 또는 핵산을 측정하는 경우, 포획 프로브)가 그에 부착되어 있고, 단백질, 핵산, 또는 그 둘 모두와 결합할 수 있는 고체 지지체 또는 기판을 포함하는 조성물을 의미한다. 일반적으로, 단백질 및 핵산 바이오마커 측정을 위해 바이오칩이 사용되는 경우, 단백질 바이오마커는 핵산 바이오마커를 측정하는 데 사용된 칩과는 별개인 칩 상에서 측정된다. 핵산 측정에 유용한 추가의 플랫폼 및 방법에 대한 비제한적인 예에 대해서는 공개 US/2006/0275782, US/2005/0064469 및 DEI 0201463을 참조한다. 다양한 실시양태에서, 바이오마커를 같은 플랫폼 상에서, 예를 들어, 하나의 칩 상에서 측정한다. 다양한 실시양태에서, 바이오마커를 상이한 플랫폼 및/또는 상이한 실험 진행을 사용하여 측정한다.
본원에서 "결합 리간드," "포획 결합 리간드," "포획 결합 종," "포획 프로브" 또는 문법상의 등가물은 (모두 상호교환적으로 사용되는) 표적 피분석물, 표적 종 또는 표적 서열의 존재를 검출하거나, 또는 그를 상대적 또는 절대적으로 정량하는 데 사용되며, 표적 피분석물, 표적 종 또는 표적 서열에 결합할 수 있는 화합물을 의미한다. 일반적으로, 본원에 추가로 기술되는 바와 같이, 검출 목적으로 포획 결합 리간드 또는 포획 프로브를 통해 표적 종 또는 표적 서열을 고체 지지체에 부착시킬 수 있다. 표적 종의 포획 결합 리간드에의 부착은 직접 또는 간접적일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 표적 종은 바이오마커이다. 당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 결합 리간드의 조성은 바이오마커의 조성에 따라 달라질 것이다. 매우 다양한 바이오마커에 대한 결합 리간드가 공지되어 있거나, 또는 공지 기법을 사용하여 쉽게 찾아낼 수 있다. 예를 들어, 바이오마커가 단백질인 경우, 결합 리간드로는 단백질(특히, 하기에서 추가로 논의되는 바와 같이, 항체 또는 그의 단편(Fab 등) 포함) 또는 소형 분자를 포함한다. 결합 리간드는 또한 다른 종의 단백질과 교차 반응성을 가질 수 있다. 항원-항체 쌍, 수용체-리간드, 및 당질 및 그의 결합 파트너 또한 적합한 피분석물-결합 리간드 쌍이다. 다양한 실시양태에서, 결합 리간드는 핵산일 수 있다. 단백질이 표적일 경우, 핵산 결합 리간드는 특정의 용도를 찾아낸다; 별법으로, 일반적으로는 미국 특허 제5,270,163호; 제5,475,096호; 제5,567,588호; 제5,595,877호; 제5,637,459호; 제5,683,867호; 제5,705,337호 및 관련 특허(이들 특허는 본원에 참고로 포함된다)에 기술되어 있는 바와 같이, 핵산 "압타머"는 사실상 임의의 바이오마커에 결합하도록 개발될 수 있다. 핵산 결합 표적일 경우, 핵산 결합 리간드는 또한 특정의 용도를 찾아낸다. 조합 화학법에 기초하여 결합 파트너를 개발하는 것과 관련된 문헌은 폭넓게 존재한다. 이러한 실시양태에서, 결합 리간드가 핵산일 경우, 바람직한 조성물 및 기법은 PCR 공개공보 WO/1998/020162(이는 본원에 참고로 포함된다)에 개략적으로 설명되어 있다.
다양한 예시적인 실시양태에서, 포획 결합 리간드는 항체이다. 이러한 실시양태는 특히 단백질 형태의 바이오마커를 검출하는 데 유용하다.
수준(예를 들어, 전사 수준)을 검출 또는 측정하는 것은 바이오마커의 포획 결합 리간드에의 결합을 포함하는데, 포획 결합 리간드는 일반적으로 고체 지지체 상에서 mRNA 형태의 바이오마커를 검출하고자 하는 경우, 본원에서는 "포획 프로브"로서 지칭된다. 그러한 점에서, 바이오마커는 표적 서열이다. 본원에서 "표적 서열" 또는 "표적 핵산"이라는 용어 또는 문법상 등가물은 유전자, 조절 서열, 게놈 DNA, cDNA, mRNA 및 rRNA를 비롯한 RNA 등의 일부일 수 있는 핵산 서열을 의미한다. 본원에 개략적으로 설명되는 바와 같이, 표적 서열은 시료로부터의 표적 서열, 또는 예를 들어, PCR과 같은 증폭 반응의 생성물 등과 같은 2차 표적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 따라서, 핵산을 측정한다는 것은 핵산의 상보체를 측정하는 것을 의미할 수 있다. 서열은 임의의 길이를 가질 수 있으며, 보다 장쇄의 서열이 특이성이 더 크다는 것은 이해할 것이다.
표적 서열은 또한 상이한 표적 도메인을 포함할 수 있다; 예를 들어, 시료 표적 서열의 제1 표적 도메인은 제1 포획 프로브에 하이브리드화할 수 있고, 제2 표적 도메인은 표지 프로브(예를 들어, "샌드위치 검정법" 포맷) 등에 하이브리드화할 수 있다. 표적 도메인은 명시된 바와 같이 인접해 있을 수 있거나, 또는 별개로 분리되어 있을 수 있다. 구체적은 언급되지 않는 한, "제1" 및 "제2"라는 용어가 표적 서열의 5'-3' 배향과 관련하여 서열의 배향을 부여하는 의미를 가지는 것은 아니다. 표적 서열이 5'-3' 배향인 것으로 가정할 경우, 제1 표적 도메인은 제2 도메인에 대해 5'에, 또는 제2 도메인에 대해 3'에 위치할 수 있다.
핵산이 표적 피분석물로서 사용되는 경우, 본 발명의 검정법은 다수의 실시양태를 취할 수 있다. 한 실시양태에서, 검정법은 임의 개수의 용액 기반 포맷을 사용하여 용액 포맷으로 수행된다. 한 실시양태에서, 당업계에 주지된 바와 같이, 종점 또는 실시간 PCR 포맷이 사용된다. 이러한 검정법은 단일 튜브 또는 웰 내에서 프라이머 및 상이한 표지로 이루어진 세트를 사용하여 패널로서, 개별 튜브 또는 웰에서, 또는 다중 분석법으로서 수행될 수 있다. PCR 기반 용액 포맷 이외에도, 예를 들어, FRET 염료 쌍을 사용하는 결찰 기반 검정법을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 포맷이 사용될 수도 있다. 이러한 실시양태에서, 오직 표적 서열에 하이브리드화되는 2개(이상)의 프로브가 결찰되는 경우에만 신호가 생성된다.
많은 실시양태에서, 검정법은 표면에 결합된 포획 프로브를 사용하여 고체 지지체 상에서 수행된다. 본원에서 논의되는 바와 같이, 포획 프로브(또는 이는 종종 포획 결합 리간드로도 언급된다)는 예를 들어, 아미노기와 같은 관능기로 말단이 변형된 포획 프로브로서, 예를 들어, 실란화된 유리와 같은 변형된 표면에 부착되는 것인 포획 프로브를 사용함으로써 표면에 공유적으로 부착될 수 있다. 별법으로, 비공유 부착, 예를 들어, 정전적, 소수성/친수성 점착이 사용될 수 있다. 당업자가 이해하고, 본원에서 논의되는 바와 같이, 매우 다양한 표면 상에 다수의 부착이 이루어질 수 있다.
이러한 실시양태에서, 검정법은 다수의 포맷을 취할 수 있다. 한 실시양태에서, 표적 서열은 본원에 기술된 바와 같이, 검출가능한 표지를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 표지는 일반적으로 표지된 프라이머가 증폭 단계 동안 사용되는 방식, 또는 표지된 dNTP가 사용되는 방식(이 둘 모두 당업계에 주지되어 있다)인 2가지 방식 중 하나의 방식으로 표적 증폭 동안에 표적 서열에 첨가된다. 표지는 본원에서 논의되는 바와 같이, 1차 또는 2차 표지일 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 프라이머 및/또는 dNTP 상의 표지는 1차 표지, 예를 들어, 형광단이다. 별법으로, 표지는 2차 표지, 예를 들어, 비오틴 또는 효소일 수 있고; 예를 들어, 한 실시양태에서, 프라이머 또는 dNTP는 비오틴으로 표지된 후, 스트렙트아비딘/표지 복합체가 첨가된다. 한 실시양태에서, 스트렙트아비딘/표지 복합체는 표지, 예를 들어, 형광단을 포함한다. 대안의 실시양태에서, 스트렙트아비딘/표지 복합체는 효소 표지를 포함한다. 예를 들어, 복합체는 호스래디쉬 퍼옥시다제를 포함할 수 있으며, TMB 첨가시, 호스래디쉬 퍼옥시다제의 작용을 통해 TMB는 침전되고, 임의로는 검출가능한 이벤트가 유발된다. 이는 검출을 위한 광학이 형광계의 사용을 필요로 하지 않는다는 점에서 특별한 이점을 갖는다.
대안의 실시양태에서, 고체상 검정법은 표지된 가용성 포획 리간드의 사용에 의존하는데, 표적 피분석물이 핵산일 경우, 상기 포획 리간드는 종종 "표지 프로브" 또는 "신호 전달 프로브"로서 지칭된다. 이러한 포맷에서, 검정법은 포획 프로브가 표적 서열의 제1 도메인에 결합하고, 표지 프로브는 제2 도메인에 결합하는 것인 "샌드위치" 유형의 검정법이다. 이러한 실시양태에서, 표지 프로브는 또한 1차(예를 들어, 형광단) 또는 2차(비오틴 또는 효소) 표지일 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에서 논의되는 바와 같이, 표지 프로브는 비오틴을 포함하며, 스트렙트아비딘/효소 복합체가 사용된다. 상기와 같이, 예를 들어, 복합체는 호스래디쉬 퍼옥시다제를 포함할 수 있으며, TMB 첨가시, 호스래디쉬 퍼옥시다제의 작용을 통해 TMB는 침전되고, 임의로는 검출가능한 이벤트가 유발된다.
일부 실시양태에서, 표적 종의 검출을 위해서는 다양한 방식으로 혼입될 수 있는 (하기에서 기술되는 바와 같은) "표지" 또는 "검출가능한 마커"가 필요하다. 따라서, 다양한 실시양태에서, 조성물은 "표지" 또는 "검출가능한 마커"를 포함한다. 한 실시양태에서, 표적 종(또는 표적 피분석물 또는 표적 서열)이 표지되고; 따라서, 표적 종의 결합은 고체 지지체의 표면에 표지를 제공한다.
본원에서 특정 용도를 찾아내는 실시양태에서, 표적 종이 비표지된 샌드위치 포맷이 사용된다. 이러한 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같이, "포획" 또는 "고정" 결합 리간드는 검출 표면에 부착되고, 가용성 결합 리간드(이는 본원에서 종종 "신호 전달 프로브," "표지 프로브" 또는 "가용성 포획 리간드"로서 언급된다)는 독립적으로 표적 종에 결합하고, 직접적으로 또는 간접적으로 1가지 이상의 표지 또는 검출가능한 마커를 포함한다.
본원에서 "표지" 또는 "표지된"이란 화합물이 검출될 수 있도록 화합물에 1가지 이상의 분자, 원소, 동위원소 또는 화학 화합물이 부착되어 있다는 것을 의미한다. 일반적으로, 비록 표지가 입자, 예를 들어, 자기 입자도 또한 포함할 수 있지만, 표지는 4가지 부류: a) 동위원소 표지(이는 방사성 또는 중동위원소일 수 있다); b) 자기, 전기, 열 표지; c) 착색 염료 또는 발광 염료; 및 d) 효소로 분류된다. 염료는 발색단 또는 인광체일 수 있지만, 형광성 염료는 그의 강한 신호에 기인하여 디코딩을 위해 우수한 신호 대 노이즈 비를 제공하는 바, 형광성 염료가 바람직하다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 염료로는 형광성 란탄계 착물(유로퓸 및 테르븀의 것 포함), 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리트로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 피렌, 말라카이트 그린(Malachite green), 스틸벤, 루시퍼 엘로우(Lucifer Yellow), 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 텍사스 레드(Texas Red), 알렉사(Alexa) 염료 및 문헌 [6th Edition of the Molecular Probes Handbook by Richard P. Haugland](이 문헌은 명백하게 본원에 참고로 포함된다)에 기술되어 있는 기타 다른 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가의 표지로는 미국 특허 제6,544,732호(이 특허는 본원에 참고로 포함된다)에 기술된 바와 같은 Q 도트 또는 나노크리스탈을 포함한다.
다양한 실시양태에서, 2차 검출가능한 표지가 사용된다. 2차 표지는 간접적으로 검출되는 것인데; 예를 들어, 2차 표지는 검출용의 1차 표지에 결합하거나, 그와 반응할 수 있거나, 추가의 생성물에 작용하여 1차 표지(예를 들어, 효소)를 생성할 수 있거나, 또는 2차 표지를 포함하는 화합물이 비표지 물질로부터 분리될 수 있도록 하는 것 등을 할 수 있다. 2차 표지로는 결합 파트너 쌍 중 하나; 화학적으로 변형이 가능한 모이어티; 뉴클레아제 억제제, 효소, 예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 루시퍼라제 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 2차 표지는 또한 추가의 표지를 포함할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 2차 표지는 결합 파트너 쌍이다. 예를 들어, 표지는 합텐 또는 항원일 수 있으며, 이는 그의 결합 파트너에 결합할 것이다. 예를 들어, 적합한 결합 파트너 쌍으로는 항원(예를 들어, 단백질(펩티드 포함))과 항체(그의 단편(Fab 등) 포함); 단백질과 소형 분자(비오틴/스트렙트아비딘 포함); 효소와 기질 또는 억제제; 다른 단백질-단백질 상호작용 쌍; 수용체-리간드; 및 당질 및 그의 결합 파트너를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 핵산-핵산 결합 단백질 쌍 또한 유용하다. 일반적으로, 프라이머로의 혼입을 위해서는 쌍 중 보다 더 작은 것이 NTP에 부착된다. 바람직한 결합 파트너 쌍으로는 비오틴(또는 이미노-비오틴)과 스트렙트아비딘, 디게옥시닌과 Ab, 및 프로링스(Prolinx)™ 시약을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 샌드위치 포맷에서, 효소는 가용성 포획 리간드에 결합하는, 2차 표지로서의 역할을 한다. 일부 실시양태에서, 호스래디쉬 퍼옥시다제를 사용하는 것이 특히 유용한데, 호스래디쉬 퍼옥시다제는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)과 조합된 경우, 착색된 침전물을 형성하며, 이것이 이어서 검출된다. 일부 경우에서, 가용성 포획 리간드는 비오틴을 포함하고, 이것이 이어서 효소-스트렙트아비딘 복합체에 결합하여 TMB 첨가시 착색된 침전물을 형성한다.
다양한 실시양태에서, 표지 또는 검출가능한 마커는 컨쥬게이트된 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제)이다. 다양한 실시양태에서, 시스템은 반응 생성물의 침전 검출, 또는 예를 들어, 검출을 위한 전자적 특성상의 변화에 의존한다. 다양한 실시양태에서, 화합물 중 어느 것도 표지를 포함하지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "형광성 신호 생성 모이어티" 또는 "형광단"이라는 용어는 한 파장 에너지를 흡수하고, 또 다른 파장의 에너지를 재방출하는 분자 또는 분자의 일부를 의미한다. 측정가능한 형광성 특성으로는 형광 강도, 형광 수명, 방출 스펙트럼 특징, 에너지 전달 등을 포함한다.
단일 분자로부터 신호를 발생시킬 수 있고, 이는 전자 주사 현미경, 근접장 주사 광학 현미경(NSOM: near field scanning optical microscopy), 내부 전반사 형광 현미경(TIRFM: total internal reflection fluorescence microscopy) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 다수의 검출 시스템에 의해 검출될 수 있다. 하기 문헌들: ([Reimer et al., editors, Scanning Electron Microscopy : Physics of Image Formation and Microanalysis, 2nd Edition (Springer, 1998)]; [Nie et al., Anal . Chem ., 78: 1528-1534 (2006)]; [Hecht et al., Journal Chemical Physics , 112: 7761-7774 (2000)]; [Zhu et al., editors, Near - Field Optics: Principles and Applications (World Scientific Publishing, Singapore, 1999)]; PCT 공개공보 WO/2004/076683(Drmanac); [Lehr et al., Anal . Chem., 75: 2414-2420 (2003)]; [Neuschafer et al., Biosensors & Bioelectronics , 18: 489-497 (2003)]; 미국 특허 제6,289,144호(Neuschafer et al.) 등(이들 문헌은 참고로 포함된다)에 의해 입증된 바와 같이, 표면 상의 나노규모의 구조체를 분석하고 검출하기 위해 상기 기법을 적용하는 것에 관한 충분한 가이던스를 문헌에서 살펴볼 수 있다.
따라서, 형광단 검출을 위한 검출 시스템으로는 상기에서 논의된 바와 같이, 형광성 특성을 측정하는 데 사용될 수 있는 임의의 장치를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 검출 시스템으로는 여기원, 형광단, 방출 광자를 여기 광자로부터 분리하는 파장 필터 및 방출 광자를 나타내고, 일부 실시양태에서는 전자 신호 또는 사진 영상으로서 판독가능한 출력값을 도출해 내는 검출기를 포함한다. 검출 장치의 예로는 제한없이, 분광형광계 및 마이크로플레이트 판독기, 형광 현미경, 형광 주사기(예를 들어, 마이크로어레이 판독기 포함) 및 유세포 분석기를 포함한다.
다양한 예시적인 실시양태에서, 바이오마커의 리간드에의 결합은 특이적이거나, 선택적이며, 결합 리간드는 결합 쌍의 일부이다. 본원에서 바이오마커에 "특이적으로 결합한다" 또는 "선택적으로 결합한다" 또는 바이오마커"에 대해 선택적이다"라는 것은 리간드가 바이오마커와 시험 시료 중의 다른 성분들 또는 오염물질을 구별할 정도로 충분한 특이성을 가지고 바이오마커에 결합한다는 것을 의미한다.
"고체 지지체" 또는 "기판"이라는 용어는 포획 결합 리간드를 부착 또는 결합시키는 데 적절한 이산형의 개별 부위를 포함하도록 변형될 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 적합한 기판으로는 금속 표면, 예를 들어, 금, 전극, 유리 및 개질된 또는 관능화된 유리, 플라스틱(아크릴류(acrylics), 폴리스티렌 및 스티렌과 다른 물질의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리카르보네이트, 폴리우레탄, 테플론, 그의 유도체 등 포함), 다당류, 나일론 또는 니트로셀룰로스, 수지, 운모, 실리카 또는 실리카계 물질(실리콘 및 개질된 실리콘 포함), 탄소, 금속, 무기 유리, 섬유 유리, 세라믹, GETEK(폴리프로필렌 옥시드와 섬유 유리의 블렌드) 및 다양한 다른 중합체를 포함한다. 하기 기술되는 클론디아그(ClonDiag) 물질이 본 발명에서 특히 유용하다.
종종, 바이오칩의 표면은 복수개의 어드레스 가능한 위치를 포함하는데, 이들 각각은 포획 결합 리간드를 포함한다. 본원에서 "어레이 위치," "어드레스 가능한 위치," "패드" 또는 "부위"란 공유적으로 부착된 포획 결합 리간드를 포함하는 기판 상의 위치를 의미한다. 본원에서 "어레이"란 예를 들어, 매트릭스와 같이 규칙적이며 정돈된 포맷으로 존재하는 복수개의 포획 결합 리간드를 의미한다. 어레이의 크기는 어레이의 조성 및 최종 용도에 따라 달라질 것이다. 약 2개 이상에서부터 수천개의 포획 결합 리간드를 포함하는 어레이가 제작될 수 있다. 일반적으로, 어레이는 어레이의 최종 용도에 따라 3, 4, 5, 6, 7개 이상의 포획 결합 리간드 유형을 포함하게 될 것이다. 본 발명에서, 어레이는 대조군, 마커 복제물 등을 포함할 수 있다. 예시적인 범위는 약 3 내지 약 50이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 어레이 포맷으로 존재하지 않을 수 있다; 즉, 일부 실시양태의 경우, 단일의 포획 리간드를 포함하는 조성물 또한 제조될 수 있다. 추가로, 일부 어레이에서 상이하거나 동일한 조성물의 다중 기판이 사용될 수 있다. 따라서 예를 들어, 큰 어레이는 복수개의 보다 작은 기판을 포함할 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 바이오마커 패널의 각 바이오마커에 대한 포획 결합 리간드를 포함하는 고체 지지체를 포함하는 조성물을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 포획 리간드는 핵산이다. 다양한 실시양태에서, 포획 결합 리간드는 항체이다. 다양한 실시양태에서, 조성물은 추가로 바이오마커 패널의 각 바이오마커에 대한 가용성 결합 리간드를 포함한다.
당업계에 공지된 바와 같이, 다수의 상이한 바이오칩 어레이 플랫폼이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법은 어레이 플랫폼, 예를 들어, 진칩(GeneChip)®(Affymetrix), 코드링크™ 바이오어레이(CodeLink™ Bioarray))(Amersham), 발현 어레이 시스템(Expression Array System)(Applied Biosystems), 슈어프린트 마이크로어레이즈(SurePrint microarrays)(Agilent), 센트릭스® LD 비드칩(Sentrix® LD BeadChip) 또는 센트릭스® 어레이 매트릭스(Sentrix® Array Matrix)(Illumina) 및 베리진(Verigene)(Nanosphere)의 사용으로 실행될 수 있다.
다양한 예시적인 실시양태에서, 표적 피분석물 또는 표적 종의 결합을 나타내기 위해 바이오마커 검출 및 측정은 비색 분석 방법 및 시스템을 사용한다. 비색 분석 방법에서, 결합된 표적 종, 예를 들어, 바이오마커가 존재한다면 하나 이상의 파장에서 시료 또는 기질에 의해 빛의 흡광도 또는 광 투과에 변화가 일어날 것이다. 따라서, 상기 파장에서의 빛의 흡광도 또는 광 투과 검출을 통해 표적 종의 존재 여부를 나타낼 수 있다.
비색 분석 방법에 대한 검출 시스템으로는 상기에서 논의된 바와 같이, 비색 분석 특성을 측정하는 데 사용될 수 있는 임의의 장치를 포함한다. 일반적으로, 장치는 분광광도계, 비색계 또는 하나 이상의 파장에서 빛의 흡광도 또는 광 투과를 측정하는 임의의 장치를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 검출 시스템은 광원; 파장 필터 또는 단색 분광기; 시료 용기, 예를 들어, 큐벳 또는 반응 바이알; 검출기, 예를 들어, 투과 광을 나타내는 포토레지스터; 및 디스플레이 또는 촬상 소자를 포함한다.
다양한 예시적인 실시양태에서, 바이오마커의 비색 분석 검출을 위해 클론디아그 칩 플랫폼이 사용된다. 다양한 실시양태에서, 클론디아그(ClonDiag) 어레이 튜브(AT: Array Tube)가 사용된다. 어레이 튜브의 한가지 독특한 특징은 마이크로 프로브 어레이(바이오칩)와 마이크로 반응 바이알의 조합이라는 점이다. 다양한 실시양태에서, 표적 서열이 핵산일 경우, 표적 서열 검출은 시료 중에 함유되어 있는 표적 서열을 증폭시키고 비오틴화하고, 임의로 증폭 생성물을 분해함으로써 수행된다. 이어서, 증폭 생성물을 클론디아그 칩 상에 함유된 프로브와 하이브리드화시킬 수 있다. 스트렙트아비딘-효소 컨쥬게이트 용액, 예를 들어, 폴리 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP: horseradish peroxidase) 컨쥬게이트 용액을 클론디아그 칩과 접촉시킨다. 세척 후, 염료 용액, 예를 들어, o-디아니시딘 기질 용액을 칩과 접촉시킨다. 염료가 산화되면 침전이 일어나고, 이는 비색 분석 방식으로 검출될 수 있다. 클론디아그 플랫폼에 대한 추가 설명은 문헌 ([Monecke S, Slickers P, Hotzel H et al., Clin Microbiol Infect 2006, 12: 718-728]; [Monecke S, Berger-Bachi B, Coombs C et al., Clin Microbiol Infect 2007, 13: 236-249]; [Monecke S, Leube I and Ehricht R, Genome Lett 2003, 2: 106-118]; [Monecke S and Ehricht R, Clin Microbiol Infect 2005, 11: 825-833]; 독일 특허 DE 10201463; 미국 공개 US/2005/0064469 및 [ClonDiag, ArrayTube ( AT ) Experiment Guideline for DNA -Based Applications, version 1.2, 2007])(이 문헌들은 모두 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)에서 살펴볼 수 있다. 예를 들어, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)과 같은, 퍼옥시다제와 반응하는 다수의 다른 염료를 사용함으로써 비색 분석상의 변화를 일으킬 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 구체적인 검정법 프로토콜에 대한 정보에 관해서는 www.clondiag.com/technologies/publications.php를 참조한다.
다양한 실시양태에서, 표적 종이 단백질인 경우, 어레이 튜브 바이오칩은 포획 결합 리간드, 예를 들어, 항체를 포함한다. 시료를 바이오칩과 접촉시키고, 시료 중에 존재하는 임의의 표적 종이 포획 결합 리간드인 항체에 결합할 수 있도록 한다. 가용성 포획 결합 리간드 또는 검출 화합물, 예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 항체가 표적 종에 결합할 수 있도록 한다. 이어서, 염료, 예를 들어, TMB를 첨가하고, 호스래디쉬 퍼옥시다제와 반응할 수 있도록 함으로써 침전이 일어나도록 하고, 색상이 변화하도록 유발하고, 이를 적합한 검출 장치로 검출한다. 어레이 튜브를 사용하여 단백질을 검출하는 것에 관한 추가 설명은 문헌 ([Huelseweh B, Ehricht R and Marschall H-J, Proteomics, 2006, 6, 2972-2981]; 및 [ClonDiag, ArrayTube ( AT ) Experiment Guideline for Protein - Based Applications, version 1.2, 2007])(이 문헌들은 모두 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)에서 살펴볼 수 있다.
투과 검출 및 분석은 클론디아그 AT 판독기 장치를 이용하여 수행한다. 적합한 판독기 장치 및 검출 장치로는 어레이 튜브 워크스테이션(ArrayTube Workstation) ATS 및 ATR 03을 포함한다.
어레이튜브 이외에도, 클론디아그 어레이스트립(AS: ArrayStrip)이 사용될 수 있다. 어레이스트립은 다량 시험을 위해 96 웰 포맷을 제공한다. 각 어레이스트립은 마이크로어레이가 각 웰의 맨 아래 부분으로 통합되어 있는, 표적 8 웰 스트립으로 구성된다. 어레이스트립은 최대 12개까지 한 마이크로플레이트 프레임 내로 삽입될 수 있고, 이를 통해 시료를 최대 96개까지 그에 대해 동시에 다중파라미터 시험을 수행할 수 있다. 어레이스트립은, 어레이 기반 분석에서 필요한 모든 액체 처리, 인큐베이션, 및 검출 단계를 수행하는 어레이스트립 프로세서 ASP(ArrayStrip Processor)를 사용함으로써 프로세싱될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 단백질을 검출하고자 하는 경우, 단백질 검출을 위한 어레이스트립 사용 방법은 완충액 또는 차단 용액을 사용하여 AS 어레이를 조절하고; AS 웰에 시료 용액을 최대 96개까지 로딩하여 단백질이 결합될 수 있도록 하고; 3회에 걸쳐 세척하고; HRP에 연결된 2차 항체와 컨쥬게이션시키고; 3회에 걸쳐 세척하고; TMB를 이용하여 침전 염색을 실시하고; AS 어레이를 영상화하고, 임의로 데이터를 보관하는 것을 포함한다.
당업자는 본원에 개시된 방법을 수행하는 데 있어 유용할 수 있는 다수의 추가 면역검정 포맷 및 그의 변형물에 대해 잘 알고 있을 것이다. 일반적으로, 문헌 [Enzyme-Immunoassay, (CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1980)]을 참조하고; 또한 미국 특허 제4,727,022호; 제4,659,678호; 제4,376,110호; 제4,275,149호; 제4,233,402호; 및 제4,230,767호도 참조한다.
일반적으로, 본 발명에 따라 수행되는 면역검정법은 동종 검정법 또는 이종검정법일 수 있다. 동종 검정법인 경우, 면역학적 반응은 보통 특이적인 항체(예를 들어, 항바이오마커 단백질 항체), 표지된 피분석물, 및 관심의 대상이 되는 시료를 포함한다. 표지로부터 발생되는 신호는 항체가 표지된 피분석물에 결합할 때, 직접적으로 또는 간접적으로 변형된다. 면역학적 반응 및 그의 정도 검출, 이 둘 모두 동종 용액 중에서 수행될 수 있다. 사용될 수 있는 면역화학적 표지로는 자유 라디칼, 방사성동위원소, 형광성 염료, 효소, 박테리오파지, 또는 조효소를 포함한다.
이종 검중 접근법에서, 시약은 보통 시료, 항체, 및 검출가능한 신호를 생성하는 수단이다. 상기 기술된 바와 같은 시료를 사용할 수 있다. 항체를 지지체, 예를 들어, 비드(예를 들어, 단백질 A 및 단백질 G 아가로스 비드), 플레이트 또는 슬라이드 상에 고정시키고, 액체 단계에서 항원을 함유할 것으로 의심되는 검체와 접촉시킬 수 있다. 이어서, 지지체를 액상으로부터 분리하고, 지지체 상 또는 액상은 검출가능한 신호가 생성되도록 하는 수단을 사용함으로써 검출가능한 신호에 대해 조사한다. 신호는 시료 중의 피분석물의 존재 여부와 관련이 있다. 검출가능한 신호를 발생시키는 수단으로는 방사성 표지, 형광성 표지, 또는 효소 표지를 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 검출하고자 하는 항원이 제2 결합 부위를 포함한다면, 상기 부위에 결합하는 항체는 검출가능한 기에 컨쥬게이션될 수 있고, 분리 단계 이전에 액상 반응 용액에 첨가될 수 있다. 고체 지지체 상에 검출가능한 기가 존재한다면, 이는 시험 시료 중에 항원이 존재한다는 것을 나타내는 것이다. 적합한 면역검정법의 예로는 면역블롯팅, 면역형광법, 면역침전법, 화학발광법, 전기화학발광법(ECL: electrochemiluminescence) 또는 효소 결합 면역검정법을 포함한다.
항체는 공지된 기법, 예를 들어, 수동 결합에 따라 진단 검정법에 적합한 고체 지지체(예를 들어, 비드, 예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 아가로스, 예를 들어, 라텍스 또는 폴리스티렌과 같은 물질로부터 형성된 마이크로스피어, 플레이트, 슬라이드 또는 웰)에 컨쥬게이션될 수 있다. 본원에 기술된 바, 항체는 공지 기법에 따라 검출가능한 표지 또는 기, 예를 들어, 방사능표지(예를 들어, 35S, 225I, 131I), 효소 표지(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제), 및 형광성 표지(예를 들어, 플루오레세인, 알렉사, 녹색 형광성 단백질, 로다민)에 유사하게 컨쥬게이션될 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 조성물 중 임의의 것을 사용하여 시료를 검정함으로써 바이오마커 패널의 수준을 측정할 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 환자로부터의 시료를 검정하여 시료 중 바이오마커 패널의 농도를 측정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 바이오마커 패널의 각 바이오마커에 대한 포획 결합 리간드 또는 포획 프로브를 포함하는 고체 지지체를 포함하는 조성물과 시료를 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 추가로 다수의 의료상(진단 및 치료 포함), 산업적, 법의학적 및 연구상 적용을 위해 폐의 건강 또는 폐암 상태를 측정하는 데 사용하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 하나 이상의 용기, 예를 들어, 바이알, 튜브, 앰플, 병, 파우치, 인벨럽 등이 그 안에 단단히 유폐되어 있는 것이 캐리어, 예를 들어, 박스, 카톤, 튜브 등을 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 키트는 본원에 개시된 각종 바이오마커 및 바이오마커 패널의 측정을 위한 하나 이상의 매체 또는 매체 성분들 및 시약으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 또한 동일하거나 상이한 용기 중에 하나 이상의 DNA 폴리머라제, 하나 이상의 프라이머, 하나 이상의 적합한 완충액, 하나 이상의 뉴클레오티드(예를 들어, 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP: deoxynucleoside triphosphate) 및 바람직하게 형광 표지된 dNTP) 및 표지화 성분을 포함할 수 있다. 하나 이상의 성분들이 같은 용기 내에 함유되어 있을 수 있거나, 또는 사용 이전에 혼합되도록 별개의 용기에 함유되어 있을 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 본 발명의 방법을 수행하기 위한 하나 이상의 설명서 또는 프로토콜을 포함할 수 있다. 키트는 또한 컴퓨터 또는 컴퓨터 구성 요소, 예를 들어, 컴퓨터 판독형 기억 매체 또는 장치를 포함할 수 있다. 기억 매체의 예로는 제한없이, 광디스크, 예를 들어, CD, DVD 및 블루레이 디스크(BD: Blu-ray Disc); 광자기 디스크; 자기 매체, 예를 들어, 자기 테이프 및 내장 하드 디스크 및 분리가능 디스크; 반도체 메모리 장치, 예를 들어, EPROM, EEPROM 및 플래시 메모리; 및 RAM을 포함한다. 컴퓨터 판독형 기억 매체는 본원에서 개시된 각종 요법 및 치료 요법에 대한 참조 문헌을 코딩하는 소프트웨어를 포함할 수 있다. 소프트웨어는 컴퓨터에 의해 해석될 수 있고, 이를 통해 의사에게 본원에서 제공하는 바와 같이, 바이오마커의 다양한 측정 농도에 따른 치료법을 제공할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 키트는 위험 역치 검출을 이용하는 측방 유동 기반의 신속한 현장 검사를 포함하는 바이오마커 검정법, 또는 구성 바이오마커에 대한 정량적 검정법을 이용하는 바이오칩을 포함한다.
진단 및 치료 방법
본 발명의 조성물 및 방법은 피험체에서의 예후, 진단 및 치료에 사용될 수 있다. 본 발명은 피험체로부터의 시료 중 바이오마커를 측정하는 실험실 시험 및 현장 검사용 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 일반적으로 다수의 상이한 지환에 적용될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 질환은 폐암이다.
본원에 개시된 바이오마커 및 바이오마커 패널은 질환을 앓거나, 앓지 않거나, 또는 앓을 위험이 있는 피험체를 진단, 확인, 또는 스크리닝하는 방법에; 질환에 대한 요법을 받고 있는 피험체를 모니터링하는 방법; 새로운 요법 또는 요법의 변화를 결정하거나 제안하는 방법; 상기 질환과 관련된 질환 상태를 다른 질환으로부터 또는 상기 질환의 하위 부류 내에서 차등적으로 진단하는 방법; 환자의 상기 질환에 대한 중증도 또는 중증도의 변화를 평가하는 방법; 질환을 앓는 피험체를 병기 분류하는 방법; 및 질환을 앓는 피험체를 치료하는 데 사용하기 위한 요법 또는 개입을 선택하거나 변형시키는 방법에 사용될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 방법은 질환에 대해 무증상이거나, 또는 증상 전인 피험체를 확인 및/또는 진단하는 데 사용된다. 이와 관련하여, "무증상" 또는 "증상 전"이라는 것은 질환에 대한 전통적 증상 또는 충분한 이상을 보이지는 않는다는 것을 의미한다.
다양한 실시양태에서, 피험체에서 질환의 예후를 결정하거나, 피험체에서 질환을 진단하거나, 또는 피험체에서 질환을 치료하는 방법은 피험체로부터의 시료 중 바이오마커 패널을 측정하는 단계를 포함한다. 다양한 예시적인 실시양태에서, 바이오마커 패널은 CCNI(사이클린 I)(서열 번호: 1), EGFR(표피 성장 인자 수용체)(서열 번호: 2), FGF9(섬유아세포 성장 인자 19)(서열 번호: 3), GREB1 단백질(서열 번호: 4), LZTS(류신 지퍼, 추정 억제인자 I)(서열 번호: 5), BRAF(v-raf 뮤린 육종 바이러스성 암유전자 상동체 B1(서열 번호: 6), FRS2(섬유아세포 성장 인자 수용체 기질 2)(서열 번호: 7), ANXA1(아넥신 A1)(서열 번호: 8), Hp2(합토글로빈 2)(서열 번호: 8), 쇄 B, MHc 유사 아연 알파2-당단백질과 Pro1 사이에 형성된 복합체의 결정 구조, 포르피로모나스 카토니아에, 캠필로박터 쇼와에, 스트렙토코쿠스 살리바리우스, 캠필로박터 렉터스, 베이요넬라 파르불라, 킹겔라 오랄리스 중 2개 이상으로 구성된다.
"질환 상태"라는 용어는 비질환인 것을 비롯한, 질환의 임의의 구별가능한 소견을 포함한다. 예를 들어, 질환 상태는 제한없이, 질환의 존부, 질환이 발병될 위험, 질환의 병기, 질환의 진행 상태(예를 들어, 시간 경과에 따른 질환의 진행, 질환와 완화), 질환의 중증도, 및 질환 치료에 대한 유효성 또는 반응을 포함한다.
본 발명과 관련하여 "피험체"는 동물, 바람직하게, 포유동물이다. 포유동물은 인간, 비인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말, 또는 소일 수 있으며, 상기의 예로 제한되는 것으로 아니다. 다양한 예시적인 실시양태에서, 피험체는 인간이며, 이는 환자로서 언급될 수 있다. 질환의 동물 모델을 나타내거나, 수의 적용을 위한 피험체로서 인간을 제외한 포유동물을 사용하는 것이 이로울 수 있다. 피험체는 이전에 질환을 앓는 것으로 진단을 받았거나 확인되고, 임의로는 질환에 대한 치료적 개입을 이미 받은 바 있거나, 또는 받고 있는 개체일 수 있다. 별법으로, 피험체는 또한 이전에 질환을 앓는 것으로 진단을 받은 적이 없는 개체일 수도 있다. 예를 들어, 피험체는 질환에 대한 위험 인자를 하나 이상 보이는 개체, 또는 질환 위험 인자를 보이지 않는 개체, 또는 질환에 대해 무증상인 개체일 수 있다. 피험체는 또한 질환을 앓고 있는 개체 또는 질환의 발병 위험이 있는 개체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 피험체는 이미 요법을 받고 있는 중일 수 있거나, 또는 요법에 대한 후보일 수 있다.
당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 바이오마커는 예측가능성이 더 큰 피험체 및 보다 큰 분석적 가변성을 달성하도록 디자인된 수개의 기법으로 측정될 수 있다.
"시료"라는 용어는 피험체로부터 수득된 검체 또는 배양물을 지칭하며, 이는 체액, 가스 및 예를 들어, 조직을 비롯한 고형물을 포함한다. 다양한 예시적인 실시양태에서, 시료는 타액을 포함한다. 당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 사실상 임의의 실험 조작 또는 시료 준비 단계가 시료에 대해 수행될 수 있다. 예를 들어, 세척 단계 및/또는 발효가 시료에 적용될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 환자로부터 별도의 시료를 수득할 필요없이 피험체에서 직접 바이오마커 패널을 측정한다.
한 측면에서, 본 발명은 바이오마커 패널을 측정하는 단계; 및 측정값과 질환의 상관관계를 보여주는 단계를 포함하는, 질환에 대하여 피험체를 진단하는 방법을 제공한다. "상관관계를 보여준다"라는 용어는 일반적으로 한가지 데이터 유형과 또 다른 것 또는 상태와의 관계를 결정짓는 것을 의미한다. 다양한 실시양태에서, 측정값과 질환의 상관관계를 보여주는 단계는 측정값을 참조 바이오마커 프로파일 또는 일부 다른 참조값과 비교하는 것을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 측정값과 질환의 상관관계를 보여주는 단계는 피험체가 현재 질환 상태에 있는지 여부를 결정짓는 것을 포함한다.
바이오마커 패널의 정량 또는 활성 측정값을 참조값과 비교할 수 있다. 이어서, 참조값과의 비교를 통해 피험체 시료 중 바이오마커 측정값의 차이를 확인한다. 예시적인 실시양태에서, 참조값은 하기에서 추가로 기술하는 바와 같이, 위험 카테고리에 의해 제공된다.
다양한 실시양태에서, 참조값은 기준치 값이다. 기준치 값은 질환을 앓지 않거나, 질환에 대해 무증상이거나, 또는 특정 수준으로 질환을 앓는 하나 이상의 피험체로부터의 유효량의 바이오마커의 복합 시료이다. 기준치 값은 또한 치료법 또는 요법의 결과로서 질환의 위험 인자가 개선된 것으로 나타난 피험체로부터 유래된 시료 중의 바이오마커의 양을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 피험체로부터 유래된 시료 비교를 위해, 유사한 방식으로 바이오마커의 양을 계산한다. 참조값 또한 침습적 또는 비침습적 기법을 통해 질환을 앓는 것으로 확인되었거나, 질환이 발병될 위험이 높은 피험체로부터 유래된 바이오마커의 양을 포함할 수 있다. 임의로, 질환 진행을 저속화시키거나, 질환이 발병될 위험을 감소시키거나 막기 위한 치료적 요법을 받도록 질환을 앓는 것으로 확인되었거나, 질환이 발병될 위험이 증가된 것으로 확인된 피험체를 선택한다. 참조값과 비교하였을 때 바이오마커의 양이 시간 경과에 따라 변화한 경우, 질환은 진행성인 것으로 간주(또는 별법으로는 치료법이 진행을 막지 못한 것으로 간주)되는 반면, (참조 군집, 또는 본원에서 사용되는 바, "상수"와 비교하였을 때) 바이오마커의 양이 시간 경과에 따라 일정하게 유지되었다면, 질환은 진행성이 아닌 것이다. 본 발명과 관련하여 사용되는 바, "상수"라는 용어는 참조값과 관련하여 시간 경과에 따른 변화를 포함하는 것으로 해석된다.
본 발명의 바이오마커는 특정의 역치에 따라 질환을 앓지 않거나, 질환을 앓을 위험이 없거나, 질환이 발병될 것으로 예상되지 않는 피험체의 "참조 바이오마커 프로파일"을 작성하는 데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 바이오마커는 또한 질환을 앓거나, 질환을 앓을 위험이 있는 피험체로부터 얻은 "피험체 바이오마커 프로파일"을 작성하는 데 사용될 수 있다. 피험체 바이오마커 프로파일을 참조 바이오마커 프로파일과 비교하여 질환이 발병될 위험이 있는 피험체를 진단 또는 확인할 수 있고, 질환의 진행 상태 뿐만 아니라, 질환의 진행 속도를 모니터링할 수 있고, 질환 치료 기법의 유효성을 모니터링할 수 있다. 본 발명의 참조 및 피험체 바이오마커 프로파일은 특히 기계 판독 매체, 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, VCR을 통해 판독가능한 것과 같은 아날로그 테이프; 광학 매체, 예를 들어, CD-ROM, DVD-ROM 등; 및 고체 상태 메모리에 포함되어 있을 수 있다.
본 발명의 바이오마커 패널 측정을 통해 의사가 피험체와 관련된 요법에 영향을 미치도록 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명은 피험체로부터의 시료 중 바이오마커 패널을 측정하는 단계, 및 피험체와 관련된 요법에 영향을 미치는 단계를 포함하는, 피험체에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다. "요법" 및 "치료법"이라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 요법은 제한없이, 개시 요법, 연속 요법, 수정 요법 또는 종결 요법로부터 선택될 수 있다. 요법은 또한 질환을 예방하기 위해 취할 수 있는 임의의 예방 조치를 포함한다.
특정 실시양태에서, 치료법은 질환 조절 약물을 피험체에게 투여하는 것을 포함한다. 약물은 질환을 앓는 것으로, 또는 질환을 앓을 위험이 있는 것으로 진단받았거나, 확인된 피험체에서 사용되는 치료제 또는 예방제일 수 있다. 특정 실시양태에서, 수정 요법이란 요법의 지속 기간, 빈도 또는 강도를 변경하는, 예를 들어, 투여량 수준을 변경하는 것을 의미한다.
다양한 실시양태에서, 요법을 실시하는 단계는 피험체가 예를 들어, 운동을 많이 하거나, 섭식에 변화를 주거나, 흡연을 줄이거나 금연하는 것 등과 같은 생활방식에 변화를 주도록 하거나, 또는 그러한 필요성을 피험체에게 전달하는 것을 포함한다. 요법은 또한 수술, 예를 들어, 유방 절제술을 포함할 수 있다.
바이오마커 수준을 측정함으로써 질환의 치료 과정을 모니터링할 수 있다. 시간 경과에 따라 피험체로부터 수득된 시료로부터의 유효량의 하나 이상의 바이오마커를 검출하고, 바이오마커의 검출량을 비교함으로써 질환에 대한 치료 요법의 유효성을 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 제1 시료는 피험체가 치료를 받기 이전에 수득할 수 있고, 하나 이상의 후속 시료는 피험체가 치료를 받은 후 또는 치료를 받은 동안에 채취한다. 시료 간의 바이오마커 수준의 변화가 요법의 유효성을 나타낼 수 있다.
특정 피험체에게 적절한 치료제 또는 약물을 확인하기 위해서는 피험체로부터의 시험 시료를 또한 치료제 또는 약물에 노출시킬 수 있고, 하나 이상의 바이오마커의 수준을 측정할 수 있다. 치료제 또는 약물을 사용한 치료 또는 그에의 노출 이전 및 이후에 피험체로부터 유래된 시료에 대해 바이오마커 수준을 비교할 수 있거나, 또는 상기와 같은 치료 또는 노출의 결과로서 질환이 개선된 것으로 나타난 하나 이상의 피험체로부터 유래된 시료에 대해 바이오마커 수준을 비교할 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 피험체로부터의 제1 시료 중 바이오마커 패널을 1차로 측정하는 단계; 피험체와 관련하여 요법을 실시하는 단계; 피험체로부터의 제2 시료 중 바이오마커 패널을 2차로 측정하는 단계; 및 제1 및 제2 측정값을 비교함으로써 요법의 효능을 평가하는 단계를 포함하는, 피험체와 관련하여 요법의 효능을 평가하는 방법을 제공한다.
추가로, 특정 피험체에게 투여하기에 적합한 치료제 또는 예방제는 피험체로부터 수득된 시료로부터의 유효량의 (2개 이상일 수 있는) 바이오마커를 검출하고, 피험체로부터 유래된 시료를 시험 화합물에 노출시켜 피험체로부터 유래된 시료 중의 바이오마커(들)의 양을 측정함으로써 확인할 수 있다. 따라서, 질환을 앓는 피험체 또는 질환이 발병될 위험이 있는 피험체에서 사용하기 위한 치료법 또는 치료 요법은 피험체로부터 수득되고, 참조값과 비교된 시료 중의 바이오마커의 양에 기초하여 선택될 수 있다. 질환의 발병을 지연시키거나, 질환 진행을 저속화시키는 데 있어서 어떤 치료법 또는 치료 요법이 피험체에서 사용하기에 가장 유효한지를 결정하기 위해 2가지 이상의 치료법 또는 치료 요법을 동시에 평가할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 질환에 대한 치료법을 개시할지 또는 계속 수행할지 여부를 권고할 수 있다.
약물 치료법
다양한 예시적인 실시양태에서, 요법을 실시하는 단계는 질환 조절 약물을 피험체에게 투여하는 것을 포함한다. 바이오마커의 변경된 수준이 질환을 앓은 적이 없거나, 중증도가 덜한 병기 또는 형태의 질환을 앓았거나, 또는 질환 조절 약물을 사용하는 치료법을 받은 결과, 질환 바이오마커가 개선된 것으로 나타난 군집에서 측정된 기준치 값으로 되돌아 올 때까지 피험체는 하나 이상의 질환 조절 약물로 치료받을 수 있다. 추가로, 바이오마커 또는 임상 파라미터의 수준 변경과 관련된 개선은 질환 조절 약물을 사용하는 치료법을 받은 결과일 수 있다.
예를 들어, 질환 조절 약물과 같은 다수의 화합물을 사용하여 피험체를 치료할 수 있고, 본 발명의 방법을 사용하여 진행 상태를 모니터링할 수 있다. 특정 실시양태에서, 질환 조절 약물은 포함한다.
이들 및 기타 다른 약물의 유익한 효능은 임상 및 실험실 바이오마커의 평가에 의해 시각화될 수 있다.
질환 치료를 위해 본원에 개시된 임의의 약물 또는 약물 조합이 피험체에게 투여될 수 있다. 본원의 약물은 임의의 많은 방식으로, 종종 당업계에 공지된 다양한 제법에 따라, 또는 본원에서 개시되거나 참조된 바와 같이 제제화될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 질환 치료를 위해 본원에 개시된 임의의 약물 또는 약물 조합은 피험체에게 투여되지 않는다. 이러한 실시양태에서, 의사는 약물 또는 약물 조합의 투여를 삼가할 수 있거나, 피험체가 약물 또는 약물 조합을 투여받지 못하도록 권고할 수 있거나, 또는 피험체가 약물 또는 약물 조합을 투여받지 못하도록 막을 수 있다.
다양한 실시양태에서, 권고되거나, 투여되어 온 약물 이외에 하나 이상의 추가의 약물이 추가로 투여될 수 있다. 추가 약물은 전형적으로는 권고되지 않은 것이거나, 피해야 하는 임의의 약물은 아닐 것이다. 예시적인 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 약물은 하나 이상의 포도당 강하 약물을 포함한다.
의사결정 매트릭스
시료 중 측정되는 바이오마커의 농도에 따라서 의사는 요법을 선택할 수 있다. 다양한 예시적인 실시양태에서, 각 바이오마커에 특별한 카테고리 범위로부터 어떤 카테고리에 각 바이오마커의 측정 농도가 속하게 되는지에 따라 요법은 달라진다. 다양한 예시적인 실시양태에서, 바이오마커 패널이 나타내는 상이한 증상 또는 질환의 위험 수준의 조합에 따라 요법은 달라진다.
바이오마커의 농도 측정값과 관련하여, "카테고리"라는 용어는 바이오마커가 가질 수 있는 가능한 농도를 분할한 서브세트를 의미한다. 각 카테고리는 의사가 선택한 표지 또는 분류와 연관시킬 수 있다. 표지가 질환 상태를 앓거나, 피험체가 질환 상태에 있는 개체의 위험 수준을 나타낼 수 있다. 카테고리 및 표지는 현 문헌으로부터, 또는 의사의 관찰 소견에 따라 도출될 수 있다.
따라서, 바이오마커 패널을 이루는 각 바이오마커는 카테고리, 예를 들어, 위험 카테고리의 개별 세트와 연관시킬 수 있다. 각 바이오마커로부터 한 카테고리를 조합하면 "결정점"이 형성된다. 다양한 예시적인 실시양태에서, 결정점의 완전한 세트는 모든 가능한 n-튜플 카테고리를 포함한다(여기서, n은 바이오마커 패널 중 바이오마커의 개수이다). 이러한 완전한 세트는 m 1 x m 2 ...... m n 인 가능한 결정점을 가지게 될 것이다(여기서, m i 는 바이오마커 i 에 대한 카테고리의 개수이다).
모든 결정점을 병증 또는 질환 상태와 연관시킬 수 있는데, 이는 반드시 유일무이한 것은 아니다. 즉, 하나 이상의 결정점이 같은 질환 상태와 연관될 수 있다. 모든 가능한 결정점을 병증 또는 질환 상태와 연관시키는 것을 "질환 분류 매트릭스" 또는 "질환 분류 트리"로 지칭할 수 있다. 따라서, 바이오마커 패널의 측정값과 결정점의 상관관계를 보여줌으로써 의사는 환자의 병증 또는 질환 상태를 분류할 수 있다.
모든 결정점을 또한 특정 요법과 연관시킬 수 있는데, 이는 반드시 유일무이한 것은 아니다. 즉, 하나 이상의 결정점이 같은 요법과 연관될 수 있다. 모든 가능한 결정점을 하나 이상의 이상과 연관시키는 것을 "요법 의사결정 매트릭스" 또는 "요법 의사결정 트리"로 지칭할 수 있다.
모든 결정점을 1 초과의 정보 유형과 연관시킬 수 있다. 예를 들어, 결정점이 질환 상태 및 요법, 둘 모두를 나타낼 수 있다.
본원에서 사용되는 "하나(부정관사 a, an)" 및 "그(정관사 the)"는 문맥상 명백하게 달리 명시되지 않는 한, 복수개의 지시 대상을 배제하지 않는다. "또는"이라는 접속사는 문맥상 명백하게 달리 명시되지 않는 한, 서로 상호간에 배타적인 것은 아니다. "포함한다"라는 용어는 비제한적인 예를 언급할 때 사용된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위해 제공되는 것이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1 : 타액 전사체 프로파일링 및 분석
타액 수집
이전에 확립된 프로토콜을 이용하여 자극을 받지 않은 전체 타액 시료를 수집하였다. 수집하기 적어도 30분 전에는 식사, 음용, 흡연, 또는 구강 위생 시술을 삼가할 것을 피험체에게 당부하였다. 립스틱을 지우고, 피험체는 맹물로 1회에 걸쳐 구강을 세정하였다. 전형적으로, 환자는 대략 5-10 ml의 타액을 기증하였다. 이어서, 시료를 2,600 g, 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 이어서, 사용시까지 상청액을 -80℃에서 보관하였다. 그 중에서도 특히, 타액 시료 각 1 ml당, 1 ㎕ 아프로티닌, 10 ㎕ PMSF(페닐메탄술포닐 플루오라이드), 및 3 ㎕ 나트륨 오르토 바나데이트(이들 모두 Sigma(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 입수)를 함유하는 프로테아제 억제제 칵테일을 첨가하였다.
mRNA 단리 및 분석
매그맥스™ 바이러스 RNA 단리용 키트(MagMax™ Viral RNA Isolation Kit)(미국 텍사스주 오스틴 소재의 Ambion)를 사용하여 330 ㎕의 타액 상청액으로부터 RNA를 단리시켰다. 이 공정은 킹피셔® mL(KingFisher® mL) 기술(미국 매사추세츠주 월섬 소재의 Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 자동화시킨 후, 터보™(TURBO™) DN아제(미국 텍사스주 오스틴 소재의 Ambion)로 처리하여 오염성 DNA는 제거하였다. (100 ㎕ 중) 90 ㎕의 추출된 RNA를 11 ㎕로 농축시키고, 리보Amp®(RiboAmp®) RNA 증폭용 키트(미국 캘리포니아주 써니베일 소재의 Molecular Devices)를 사용하여 선형으로 증폭시켰다. 정제한 후, cDNA를 전사시키고, 시험관내 전사 표지화용의 진칩® 발현 3'-증폭 시약(GeneChip® Expression 3'-Amplification Reagents)(미국 캘리포니아주 산타클라라 소재의 Affymetrix)을 사용하여 비오틴화시켰다. 이어서, 애피메트릭스 인간 게놈 U133 플러스 2.0 어레이(Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)를 사용한 진칩®을 통해 대략 20 ㎍의 표지화된 RNA를 분석하였다. 칩 하이브리드화 및 스캐닝을 수행하였다.
유전자 어레이에 대한 통계학적 분석
바이오컨덕터 2.2(Bioconductor 2.2)(하이퍼텍스트 트랜스퍼 프로토콜://www.bioconductor.org)를 사용하여 모든 데이터베이스로부터의 CEL 파일을 통계 R 2.7.0(하이퍼텍스트 트랜스퍼 프로토콜://www.r-project.org)으로 불러 들였다. 각 마이크로어레이 데이터세트에 대한 배경 보정 및 분위수 정규화 후, 프로브 로그 강도 오차 추정(PLIER: Probe Logarithmic Intensity Error Estimation) 발현 측정값을 계산하였다. 모든 시료 간에 걸쳐 프로브세트 수준 분위수 정규화를 수행함으로써 모든 데이터세트 간의 효과 크기가 유사하도록 만들었다. 최종적으로, 모든 프로브세트에 대해 2 시료 t 검정을 적용시켜 차등적 발현을 확인하였다. 각 프로브세트에 대한 추정값 및 p 값을 수득한 후, 각 프로브세트의 p 값을 오류 발견률(FDR: false discovery rate)에 대해 보정하였다. FDR 수준이 0.05인 경우에 유전자를 선택하였으며, 암 효과 크기의 변화는 암 및 정상 시료 사이에 2배보다 컸다.
바이오마커 후보 물질의 스크리닝
마이크로어레이 프로파일링에 의해 생성된 바이오마커 후보 물질을 마이크로어레이 분석을 위해 사용된 것과 같은 시료 세트 상에서 실시간의 정량적 RT-PCR(qPCR)에 의해 추가로 스크리닝하였다. 이를 완수하기 위해, 역전사 효소 및 유전자 특이 프라이머를 사용하고, 60℃에서 1 min, 50℃에서 30 min, 95℃에서 2 min, 이어서, 95℃에서 15 s, 50℃에서 30 s, 72℃에서 10 s로 15회 사이클인 열 사이클 조건을 이용함으로써 전체 RNA를 역전사시켰다. 이 단계를 수행한 후, 72℃에서 5 min인 최종의 신장 단계를 수행하고, 이어서, 4℃로 냉각시켰다. 엑소SAP-IT(ExoSAP-IT)(USB Corporation)를 사용하여 사전에 증폭시킨 생성물을 세정하고, 이를 물 중에 1/40으로 희석시켰다. qPCR을 위해 2 ㎕의 cDNA를 사용하였다.
최초 변성을 위해 ABI 7500HT 고속 실시간 PCR 시스템(ABI 7500HT Fast Real Time PCR system)(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems)에서 95℃에서 15 min 동안, 이어서, 95℃에서 30 s 및 60℃에서 30 s로 40회 사이클을 수행함으로써 파워 SYBR®-그린 마스터 믹스(power SYBR®-Green Master Mix)(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems)를 이용하여 10 ㎕의 반응 부피로 96 웰 플레이트 중에서 qPCR을 수행하였다. 모든 qPCR은 모든 후보 mRNA에 대해 이중으로 수행하였다. 각 유전자의 용융 곡선에 따라 PCR의 특이성을 확인하고, 평균 역치 사이클(Ct: threshold cycle)을 조사하였다.
사전 증폭에 사용된 외부 프라이머 쌍에 대한 앰플리콘 길이는 약 100-130 bp이고, qPCR에 사용된 내부 프라이머 쌍에 대한 앰플리콘 길이는 약 60-80 bp였다. 프라이머 익스프레스 3.0 소프트웨어(Primer Express 3.0 software)(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems)를 이용하여 RT-qPCR 프라이머를 디자인하였다. 모든 프라이머는 시그마-게노시스(미국 텍사스주 우드랜즈 소재의 Sigma-Genosys)가 합성한 것이었고, 앰플리콘은 가능할 때마다 인트론에 걸쳐져 있었다.
바이오마커 Ct 값으로부터 GAPDH Ct 값을 감산하여 ΔCt를 얻음으로써 원시 데이터를 정규화시켰다. 군간의 바이오마커 비교를 위해 만-휘트니 순위 합 검정(Mann-Whitney rank sum test)을 사용하였다.
GAPDH가 참조 유전자로서 사용되는 2- Ct 방법을 사용하여 qPCR에 대한 데이터 분석을 수행하였다. 비모수 윌콕슨 검정을 사용하여 양 군간의 qPCR 기반 유전자 발현 값을 비교하였다. RNA 입력값에 대해 정규화하기 위해 GAPDH에 대해서도 또한 qPCR을 수행하였다. 마커 Ct 값으로부터 GAPDH Ct 값을 감산하여 ΔCt를 제공함으로써 원시 데이터를 정규화한 후, R 2.7.0(월드 와이드 웹.r-project.org)으로부터의 유틸러티 패키지, 및 바이오컨덕터 2.2(월드 와이드 웹.bioconductor.org)로부터의 ROC 패키지를 사용하여 분석하였다. 대조군 및 췌장암 군에 대하여 상이한 두 분포를 고려하여 만-휘트니 U 검정을 사용함으로써 통계학적으로 비교하였다. 피험체군들 간에 차등적으로 나타나는 바이오마커(P 값<0.05)를 확인하고, 곡선하 면적(AUC: Area Under Curve) 값에 의해 비교하였다. AUC는 (감도) 대 (1-특이성 값)을 플롯하는 수신자 조작 특성(ROC: receiver operating characteristic) 곡선을 구성하는 것에 기초한다. ROC 곡선의 수치 적분법에 의해 AUC 값을 전산화한다. 상기 값의 범위는 0.5 내지 1.0일 수 있다. 0.5라는 값은 바이오마커가 동전 던지기(coin toss)보다 우수한 것은 아님을 나타내는 반면, 1.0이라는 값은 상대적으로 최고로 큰 진단학상의 정확성을 나타낸다.
7개의 mRNA 바이오마커가 폐암 피험체와 대조군 피험체 간에 차등적으로 발현되는 것으로 확인되었다. 3개의 mRNA 바이오마커(GREB1, CCNI, 및 FRS2)와 조합하여 로지스틱 회귀 모델이 대조군 피험체로부터 폐암 환자를 구별지었으며, ROC-플롯 AUC 값은 대략 0.91이었는데, 감도는 대략 91%이고, 특이성 값은 대략 88%였다.
실시예 2: 타액 프로테옴 프로파일링 및 분석
단백질 단리 및 분석
10명의 건강한 대조군 피험체 및 10명의 폐암 피험체로부터 타액을 수집하고, 2,600 g, 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 10명의 건강한 대조군 피험체 및 10명의 폐암 피험체로부터 얻은 타액 상청액을 풀링하여 프로테옴 프로파일링을 위한 대조군 시료 및 암 시료를 제조하였다. 풀링된 타액 시료 중의 250 ㎍의 단백질은 메탄올에 의해 침전시킨 후, 2D 세포 용해 완충액(7 M 우레아, 2 M 티오우레아 및 4% CHAPS 계면활성제를 함유하는 30 mM 트리스 HCl(pH 8.8)) 중에 재현탁시켰다. 각각의 풀링된 폐암 및 대조군 시료의 전체 단백질을 각각 시아닌 염료 Cy2 및 Cy5로 표지하였다. 이어서, 표지된 두 시료 세트를 조합하고, 2차원 차이 겔 전기영동하였다. 표지된 시료를 로딩한 후, 아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences)가 제공하는 프로토콜에 따라 등전 초점화(IEF: isoelectric focusing)(pH 3-10)를 진행시켰다. 13.5% SDS 겔로 옮기기 전에 SDS 겔 전개 완충액 중에서 IPG 스트립을 세정하였다. 염료 프론트에서 겔이 고갈될 때까지 SDS 겔을 전개시켰다. SDS-PAGE 수행 직후 타이푼 트리오(Typhoon TRIO)™(Amersham Biosciences)를 사용하여 겔 영상을 스캐닝하였다. 겔내 데사이더(DeCyder)™ 분석으로부터 단백질 발현 수준의 변화 배수를 수득하였다.
겔 상의 변화 배수가 1.5보다 큰 스폿을 절단한 후, 다회에 걸쳐 세척함으로써 염색 염료 및 다른 화학물질을 제거하였다. 분해 완충액을 최대 부피로 흡수할 수 있도록 겔 스폿을 건조시켰다. 시퀀싱 등급의 변형된 트립신(미국 소재의 Promega)을 함유하는 분해 완충액 중에서 건조된 2D 겔 스폿을 재수화시켰다. 37℃에서 밤새도록 겔내에서 단백질을 분해하였다. 진탕시키면서, TFA 추출 완충액을 사용하여 분해된 펩티드를 겔로부터 추출하였다. C-18 집-팁스(C-18 Zip-tips)(Millipore)를 사용하여 분해된 트립틱 펩티드를 탈염시켰다. 탈염된 펩티드를 CHCA 매트릭스(α-시아노-4-히드록시신남산)와 혼합하고, MALDI-TOF MS(ABI4800) 확인을 위해 MALDI 플레이트의 웰 내로 스폿팅하였다. 단백질 확인은 펩티드 핑거프린트 질량 지도화(MS 스펙트럼 사용) 및 펩티드 단편화 지도화(MS/MS 스펙트럼 사용)에 기초하였다. MASCOT 검색 엔진이 장착된 GPS 익스플로러(Explorer) 소프트웨어를 사용하여 조합된 MS 및 MS/MS 스펙트럼에 대한 데이터베이스 검색을 실행함으로써 1차 서열 데이터베이스로부터 단백질을 확인하였다.
바이오마커 후보물질 스크리닝
4가지 단백질(아넥신 A1, 합토글로빈 HP2, 인터루킨 1 수용체 길항제, 아연 알파2-당단백질). 칼프로텍틴은 시판용 ELISA 키트에 의해 확인하였다. 암군과 대조군에서 합토글로빈 HP2, 아연 알파2-당단백질 및 칼프로텍틴의 분포는 유의적인 차이를 보였는데, p 값은 각각은 0.00903, 0.05, 및 0.048이었다.
(상기) 2D 겔 분석에서 확인된 4가지 단백질을 원 시료 세트 상에서 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 10% 비스-트리스 겔 상에 환원된 단백질 시료(래인당 15 ㎍의 전체 단백질)를 로딩하고, 1시간 동안 MES SDS 전개 완충액 중 150 V에서 전개시켰다. 미리 염색된 단백질 표준(Invitrogen)을 사용하여 단백질 이동을 추적하였다. i블롯(iBlot)®(Invitrogen)을 사용하여 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 이어서, 10 mM 트리스 HCl(pH 7.6), 150 mM NaCl, 및 0.1% (v/v) 트윈(Tween)®-20(Sigma-Aldrich)을 함유하는 세척 완충액 중에서 막을 세척한 후, 5% 탈지 분유를 함유하는 세척 완충액 중에서 1시간 동안 차단시켰다. 세척 완충액 중에서 추가로 세척한 후, 1차 항체(마우스 항아넥신 A1(Abeam), 마우스 항합토글로빈(Lifespan Bioscience), 마우스 항ZAG(Santa Cruz Biotech), 마우스 항액틴(Sigma-Aldrich)은 모두 제조사의 설명서에 따라 실온하에 2 h 동안 차단 완충액 중에서 막과 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 막을 세척한 후, 제조사의 설명서에 따라 실온에서 1시간 동안 2차 항체(양으로부터의 것인, 항마우스 IgG 퍼옥시다제 결합 종 특이 전체 항체, GE Healthcare)를 적용시켰다. 마지막으로, 막을 세척하고, ECL 플러스(ECL Plus)™ 검출용 키트(GE Healthcare)를 사용하여 시각화하였다. 이미지 J(Image J) 소프트웨어(미국 메릴랜드주 베데스다 소재의 NIH)를 사용하여 밴드의 신호 강도를 측정하였다. 정규화시키기 위해 관심의 대상이 되는 단백질을 나타내는 밴드의 강도를 같은 블롯 상의 β-액틴 발현에 상응하는 그의 강도로 나누었다.
제조사의 설명서(Cell Sciences)에 따라 칼프로텍틴에 대한 ELISA를 수행하였다. 시료 희석제 중에서 모든 타액 시료를 100배로 희석시켰다. 모든 시료를 이중으로 로딩하였다.
실시예 3: 타액 미생물 바이오마커
10명의 건강한 대조군 피험체 및 10명의 폐암 피험체로부터 타액을 수집하고, 2,600 g, 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. DNA 단리를 위해 상청액을 버리고, 펠릿을 사용하였다.
제조사의 설명서에 따라 울트라클린® 마이크로비얼 DNA 단리용 키트(UltraClean® Microbial DNA Isolation Kit)(MO Bio Laboratories)를 사용하여 펠릿으로부터 DNA를 추출하였다. 이어서, 그의 인간 구강 미생물 확인 마이크로어레이(Human Oral Microbe Identification Microarray) 서비스를 사용한 미생물 분석을 위해 포시스 인스티튜트(미국 매사추세츠주 케임브리지 소재의 Forsyth Institute)에 단리된 DNA를 제출하였다. 대조군 및 폐암 피험체로부터 얻은 마이크로어레이 프로파일에 기초하여, 11개의 미생물이 두 피험체 군 간에 차등적으로 존재하는 것으로 확인되었다.
실시간 PCR을 사용하여 원래의 DNA 시료 중 박테리아 균주의 정량을 측정하였다. 모든 종을 위한 특이적인 프라이머를 디자인하고, 실시간 PCR을 수행하여 폐암 시료와 대조군 시료 간의 박테리아 정량을 정량화하였다. 실시간 PCR에 의해 7개의 박테리아가 시료 군 간에 차등적으로 존재하는 것으로 확인되었다. 두 박테리아, 포르피로모나스 카토니아에 및 캠필로박터 쇼와에는 대조군과 비교하였을 때, 폐암 피험체에서 보다 풍부하게 존재하는 것으로 확인되었다.
실시예 4: 스크리닝 방법
일상적 치아 관리를 받고 있는 환자는 방문시에 스크리닝하였다. 예를 들어, 이전에 흡연자였던 62세의 여성 환자에게 구강 검사를 하기 전에 타액 시료를 제공할 것으로 요청하였다. 타액 시료를 수집하고, 현장에서 분석하거나, 또는 표준 실험실에 제출하였다. 타액 시료를 본 발명의 바이오마커, 및 임의로 다른 바이오마커에 대해 시험하였다. 분석을 통해 얻은 결과를 치과 의사에게 제공하고, 환자는 본인이 폐암에 걸렸는지 여부에 대해 통보받았다.
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임의의 첨부물에 있는 것을 비롯한, 본원에서 인용된 모든 참고 문헌, 간행물, 특허 출원, 등록 특허, 등록 대장 및 데이터베이스는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> The Regents of the University of California Wong, David T.W. Zhang, Lei Xiao, Hua Zhou, Hui <120> SALIVARY BIOMARKERS FOR LUNG CANCER DETECTION <130> 008074-5034WO <140> PCT/US11/24415 <141> 2011-02-10 <150> US 61/303,205 <151> 2010-02-10 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2811 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ccatttcaat agtcgcggga tacttgaact gcaagaacag ccgccgctcc ggcgggctgc 60 tcgctgcatc tctgggcgtc tttggctcgc cacgctgggc agtgcctgcc tgcgcctttc 120 gcaacctcct cggccctgcg tggtctcgag ctgggtgagc gagcgggcgg gctggtaggc 180 tggcctgggc tgcgaccggc ggctacgact attctttggc cgggtcggtg cgagtggtcg 240 gctgggcaga gtgcacgctg cttggcgccg caggctgatc ccgccgtcca ctcccgggag 300 cagtgatgtt gggcaactct gcgccggggc ctgcgacccg cgaggcgggc tcggcgctgc 360 tagcattgca gcagacggcg ctccaagagg accaggagaa tatcaacccg gaaaaggcag 420 cgcccgtcca acaaccgcgg acccgggccg cgctggcggt actgaagtcc gggaacccgc 480 ggggtctagc gcagcagcag aggccgaaga cgagacgggt tgcacccctt aaggatcttc 540 ctgtaaatga tgagcatgtc accgttcctc cttggaaagc aaacagtaaa cagcctgcgt 600 tcaccattca tgtggatgaa 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ttaattaaaa taaaaccttg ttgtatatgt aacaacataa ttttccctct atcccttccc 6180 accctttgtt ctctatttct ccctatcagt gccaacttca tacattttgt agcatggcaa 6240 taaaatataa cttttacact gaggccgagt gtggcttttt ggaggaagtg gggatgggac 6300 gattgccctc tagttgtcct ttgcatatga ctgttttttg ccatataagc catgtcatca 6360 ggcatgaaaa gttttctcat atatgatgta aacttgcttt taaggacaag tgtgaatgtg 6420 ctttttaagc ttaatttttg tcatgacaac taattttttt tatctttgga gaagtcagag 6480 ttctttacaa tcaaacgttt attaactgga gtacttagaa taagctagta attgaattta 6540 gttcaagggc taagcaacac atttttaaat ccttatttat tgtagagtat tagtatactg 6600 tcctacaaat tatgtaaaat atggtttaat attagatgac tttggatttt gcaatgcctt 6660 actgttgtca ttctagcata aatatccata atgaggtact caagttgata ctggaagctg 6720 agctgatcat acactgacct gaagcattca tgaaaagctg ctttattgaa taaagtctga 6780 ttggagttct tttcatgctc actttcccct tattgctgaa agtagattgc aataaaaccc 6840 caataaaacg tttggtcgga taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 6880 <210> 8 <211> 346 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ala Met Val Ser Glu Phe Leu Lys Gln Ala Trp Phe Ile Glu Asn 1 5 10 15 Glu Glu Gln Glu Tyr Val Gln Thr Val Lys Ser Ser Lys Gly Gly Pro 20 25 30 Gly Ser Ala Val Ser Pro Tyr Pro Thr Phe Asn Pro Ser Ser Asp Val 35 40 45 Ala Ala Leu His Lys Ala Ile Met Val Lys Gly Val Asp Glu Ala Thr 50 55 60 Ile Ile Asp Ile Leu Thr Lys Arg Asn Asn Ala Gln Arg Gln Gln Ile 65 70 75 80 Lys Ala Ala Tyr Leu Gln Glu Thr Gly Lys Pro Leu Asp Glu Thr Leu 85 90 95 Lys Lys Ala Leu Thr Gly His Leu Glu Glu Val Val Leu Ala Leu Leu 100 105 110 Lys Thr Pro Ala Gln Phe Asp Ala Asp Glu Leu Arg Ala Ala Met Lys 115 120 125 Gly Leu Gly Thr Asp Glu Asp Thr Leu Ile Glu Ile Leu Ala Ser Arg 130 135 140 Thr Asn Lys Glu Ile Arg Asp Ile Asn Arg Val Tyr Arg Glu Glu Leu 145 150 155 160 Lys Arg Asp Leu Ala Lys Asp Ile Thr Ser Asp Thr Ser Gly Asp Phe 165 170 175 Arg Asn Ala Leu Leu Ser Leu Ala Lys Gly Asp Arg Ser Glu Asp Phe 180 185 190 Gly Val Asn Glu Asp Leu Ala Asp Ser Asp Ala Arg Ala Leu Tyr Glu 195 200 205 Ala Gly Glu Arg Arg Lys Gly Thr Asp Val Asn Val Phe Asn Thr Ile 210 215 220 Leu Thr Thr Arg Ser Tyr Pro Gln Leu Arg Arg Val Phe Gln Lys Tyr 225 230 235 240 Thr Lys Tyr Ser Lys His Asp Met Asn Lys Val Leu Asp Leu Glu Leu 245 250 255 Lys Gly Asp Ile Glu Lys Cys Leu Thr Ala Ile Val Lys Cys Ala Thr 260 265 270 Ser Lys Pro Ala Phe Phe Ala Glu Lys Leu His Gln Ala Met Lys Gly 275 280 285 Val Gly Thr Arg His Lys Ala Leu Ile Arg Ile Met Val Ser Arg Ser 290 295 300 Glu Ile Asp Met Asn Asp Ile Lys Ala Phe Tyr Gln Lys Met Tyr Gly 305 310 315 320 Ile Ser Leu Cys Gln Ala Ile Leu Asp Glu Thr Lys Gly Asp Tyr Glu 325 330 335 Lys Ile Leu Val Ala Leu Cys Gly Gly Asn 340 345 <210> 9 <211> 347 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Ser Ala Leu Gly Ala Val Ile Ala Leu Leu Leu Trp Gly Gln Leu 1 5 10 15 Phe Ala Val Asp Ser Gly Asn Asp Val Thr Asp Ile Ala Asp Asp Gly 20 25 30 Cys Pro Lys Pro Pro Glu Ile Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val 35 40 45 Arg Tyr Gln Cys Lys Asn Tyr Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly 50 55 60 Val Tyr Thr Leu Asn Asn Glu Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly 65 70 75 80 Asp Lys Leu Pro Glu Cys Glu Ala Val Cys Gly Lys Pro Lys Asn Pro 85 90 95 Ala Asn Pro Val Gln Arg Ile Leu Gly Gly His Leu Asp Ala Lys Gly 100 105 110 Ser Phe Pro Trp Gln Ala Lys Met Val Ser His His Asn Leu Thr Thr 115 120 125 Gly Ala Thr Leu Ile Asn Glu Gln Trp Leu Leu Thr Thr Ala Lys Asn 130 135 140 Leu Phe Leu Asn His Ser Glu Asn Ala Thr Ala Lys Asp Ile Ala Pro 145 150 155 160 Thr Leu Thr Leu Tyr Val Gly Lys Lys Gln Leu Val Glu Ile Glu Lys 165 170 175 Val Val Leu His Pro Asn Tyr Ser Gln Val Asp Ile Gly Leu Ile Lys 180 185 190 Leu Lys Gln Lys Val Ser Val Asn Glu Arg Val Met Pro Ile Cys Leu 195 200 205 Pro Ser Lys Asp Tyr Ala Glu Val Gly Arg Val Gly Tyr Val Ser Gly 210 215 220 Trp Gly Arg Asn Ala Asn Phe Lys Phe Thr Asp His Leu Lys Tyr Val 225 230 235 240 Met Leu Pro Val Ala Asp Gln Asp Gln Cys Ile Arg His Tyr Glu Gly 245 250 255 Ser Thr Val Pro Glu Lys Lys Thr Pro Lys Ser Pro Val Gly Val Gln 260 265 270 Pro Ile Leu Asn Glu His Thr Phe Cys Ala Gly Met Ser Lys Tyr Gln 275 280 285 Glu Asp Thr Cys Tyr Gly Asp Ala Gly Ser Ala Phe Ala Val His Asp 290 295 300 Leu Glu Glu Asp Thr Trp Tyr Ala Thr Gly Ile Leu Ser Phe Asp Lys 305 310 315 320 Ser Cys Ala Val Ala Glu Tyr Gly Val Tyr Val Lys Val Thr Ser Ile 325 330 335 Gln Asp Trp Val Gln Lys Thr Ile Ala Glu Asn 340 345 <210> 10 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gln Asp Asn Thr Arg Lys Ile Ile Ile Lys Asn Phe Asp Ile Pro Lys 1 5 10 15 Ser Val Arg Pro Asn Asp Glu Val Thr Ala Val Leu Ala Val Gln Thr 20 25 30 Glu Leu Lys Glu Cys Met Val Val Lys Thr Tyr Leu Ile Ser Ser Ile 35 40 45 Pro Leu Gln Gly Ala Phe Asn Tyr Lys Tyr Thr Cys Leu Cys Asp Asp 50 55 60 Asn Pro Lys Thr Phe Tyr Trp Asp Phe Tyr Thr Asn Arg Thr Val Gln 65 70 75 80 Ile Ala Ala Val Val Asp Val Ile Arg Glu Leu Gly Ile Cys Pro Asp 85 90 95 Asp Ala Ala Val Ile Pro Ile Lys Asn Asn Arg Phe Tyr Thr Ile Glu 100 105 110 Ile Leu Lys Val Glu 115 <210> 11 <211> 93 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Leu Thr Glu Leu Glu Lys Ala Leu Asn Ser Ile Ile Asp Val Tyr 1 5 10 15 His Lys Tyr Ser Leu Ile Lys Gly Asn Phe His Ala Val Tyr Arg Asp 20 25 30 Asp Leu Lys Lys Leu Leu Glu Thr Glu Cys Pro Gln Tyr Ile Arg Lys 35 40 45 Lys Gly Ala Asp Val Trp Phe Lys Glu Leu Asp Ile Asn Thr Asp Gly 50 55 60 Ala Val Asn Phe Gln Glu Phe Leu Ile Leu Val Ile Lys Met Gly Val 65 70 75 80 Ala Ala His Lys Lys Ser His Glu Glu Ser His Lys Glu 85 90

Claims (14)

  1. a) CCNI, EGFR, FGF9, GREB1 단백질, LZTS, BRAF, FRS2, ANXA1, 합토글로빈 Hp2, 아연 알파2-당단백질, 칼프로텍틴, 포르피로모나스 카토니아에(Porphyromonas catoniae) 16S rRNA, 캠필로박터 쇼와에(Campylobacter showae) 16S rRNA, 스트렙토코쿠스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 16S rRNA, 캠필로박터 렉터스(Campylobacter rectus) 16S rRNA, 베이요넬라 파르불라(Veillonella parvula) 16S rRNA, 킹겔라 오랄리스(Kingella oralis) 16S rRNA, 및 그라눌리카텔라 아디아센스(Granulicatella adiacens) 16S rRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커를 특이적으로 검출하는 검정법을 이용하여 피험체로부터의 타액 시료를 분석하는 단계; 및
    b) 바이오마커가 시료 중에서 대조군에 비하여 차등적으로 발현되는지 여부를 결정함으로써 폐암 상태를 제공하는 단계
    를 포함하는, 피험체에서 폐암 상태를 진단하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 2가지 이상의 바이오마커를 측정하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 2가지 이상의 바이오마커 중 하나가 포르피로모나스 카토니아에 16S rRNA이고, 2가지 이상의 바이오마커 중 하나가 캠필로박터 쇼와에 16S rRNA인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 3가지 이상의 바이오마커를 측정하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 3가지 이상의 바이오마커 중 하나가 GREB1이고, 3가지 이상의 바이오마커 중 하나가 CCNI이며, 3가지 이상의 바이오마커 중 하나가 FRS2인 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 3가지 이상의 바이오마커 중 하나가 합토글로빈 2이고, 3가지 이상의 바이오마커 중 하나가 아넥신 A1이며, 3가지 이상의 바이오마커 중 하나가 아연 알파2-당단백질인 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 검정법이 1가지 이상의 바이오마커를 코딩하는 핵산을 검출하고, 여기서, 핵산이 질량 분광법, PCR, 마이크로어레이 하이브리드화, 열적 시퀀싱, 모세관 어레이 시퀀싱, 또는 고체상 시퀀싱에 의해 검출되는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 검정법이 1가지 이상의 바이오마커의 폴리펩티드를 검출하고, 여기서, 폴리펩티드가 ELISA, 웨스턴 블롯, 유세포 분석법, 면역형광법, 면역조직화학법, 또는 질량 분광법에 의해 검출되는 것인 방법.
  9. (a) CCNI, EGFR, FGF9, GREB1 단백질, LZTS, BRAF, FRS2, ANXA1, 합토글로빈 Hp2, 아연 알파2-당단백질, 칼프로텍틴, 포르피로모나스 카토니아에 16S rRNA, 캠필로박터 쇼와에 16S rRNA, 스트렙토코쿠스 살리바리우스 16S rRNA, 캠필로박터 렉터스 16S rRNA, 베이요넬라 파르불라 16S rRNA, 킹겔라 오랄리스 16S rRNA, 및 그라눌리카텔라 아디아센스 16S rRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커를 특이적으로 검출하는 검정법을 이용하여 피험체로부터의 제1 타액 시료를 분석함으로써, 제1 발현 프로파일을 제공하는 단계;
    (b) 피험체에 대해 요법을 실시하는 단계;
    (c) CCNI, EGFR, FGF9, GREB1 단백질, LZTS, BRAF, FRS2, ANXA1, 합토글로빈 Hp2, 아연 알파2-당단백질, 칼프로텍틴, 포르피로모나스 카토니아에 16S rRNA, 캠필로박터 쇼와에 16S rRNA, 스트렙토코쿠스 살리바리우스 16S rRNA, 캠필로박터 렉터스 16S rRNA, 베이요넬라 파르불라 16S rRNA, 킹겔라 오랄리스 16S rRNA, 및 그라눌리카텔라 아디아센스 16S rRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 2가지 이상의 바이오마커를 특이적으로 검출하는 검정법을 이용하여 피험체로부터의 제2 타액을 분석함으로써 제2 발현 프로파일을 제공하는 단계; 및
    (e) 제1 및 제2 발현 프로파일을 비교함으로써 요법의 효능을 평가하는 단계
    를 포함하는, 피험체에 대한 요법의 효능을 평가하는 방법.
  10. 고체 지지체를 포함하는 키트로서, 고체 지지체가 CCNI, EGFR, FGF9, GREB1 단백질, LZTS, BRAF, FRS2, 포르피로모나스 카토니아에 16S rRNA, 캠필로박터 쇼와에 16S rRNA, 스트렙토코쿠스 살리바리우스 16S rRNA, 캠필로박터 렉터스 16S rRNA, 베이요넬라 파르불라 16S rRNA, 킹겔라 오랄리스 16S rRNA, 및 그라눌리카텔라 아디아센스 16S rRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커에 대해 선택적인 포획 결합 프로브를 포함하는 것인 키트.
  11. 제1 및 제2 고체 지지체를 포함하는 키트로서, 제1 고체 지지체가 CCNI, EGFR, FGF9, GREB1 단백질, LZTS, BRAF, FRS2, 포르피로모나스 카토니아에 16S rRNA, 캠필로박터 쇼와에 16S rRNA, 스트렙토코쿠스 살리바리우스 16S rRNA, 캠필로박터 렉터스 16S rRNA, 베이요넬라 파르불라 16S rRNA, 킹겔라 오랄리스 16S rRNA, 및 그라눌리카텔라 아디아센스 16S rRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 2가지 이상의 바이오마커에 대해 선택적인 포획 결합 프로브를 포함하고, 제2 고체 지지체가 ANXA1, 합토글로빈 Hp2, 아연 알파2-당단백질, 칼프로텍틴에 대한 포획 결합 리간드를 포함하는 것인 키트.
  12. 제11항에 있어서, 포획 결합 리간드가 항체인 것인 키트.
  13. CCNI, EGFR, FGF9, GREB1 단백질, LZTS, BRAF, FRS2, 포르피로모나스 카토니아에 16S rRNA, 캠필로박터 쇼와에 16S rRNA, 스트렙토코쿠스 살리바리우스 16S rRNA, 캠필로박터 렉터스 16S rRNA, 베이요넬라 파르불라 16S rRNA, 킹겔라 오랄리스 16S rRNA, 및 그라눌리카텔라 아디아센스 16S rRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 2가지 이상의 바이오마커의 선택적 증폭을 위한 하나 이상의 프라이머를 포함하는 키트로서, 각각의 프라이머는 임의로 검출가능한 표지를 포함하는 것인 키트.
  14. a) 타액 시료 중 17가지 이상의 바이오마커를 특이적으로 검출하는 검정법을 이용하여 피험체로부터의 타액 시료를 분석하는 단계로서, 17가지 이상의 바이오마커는 CCNI, EGFR, FGF9, GREB1 단백질, LZTS, BRAF, FRS2, ANXA1, 합토글로빈 Hp2, 아연 알파2-당단백질, 칼프로텍틴, 포르피로모나스 카토니아에 16S rRNA, 캠필로박터 쇼와에 16S rRNA, 스트렙토코쿠스 살리바리우스 16S rRNA, 캠필로박터 렉터스 16S rRNA, 베이요넬라 파르불라 16S rRNA, 킹겔라 오랄리스 16S rRNA, 및 그라눌리카텔라 아디아센스 16S rRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
    b) 17가지 이상의 바이오마커가 시료 중에서 대조군에 비하여 차등적으로 발현되는지 여부를 결정함으로써 폐암 상태를 제공하는 단계
    를 포함하는, 피험체에서 폐암 상태를 진단하는 방법.
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