KR20120129835A

KR20120129835A - 토양 메타게놈 유래의 식물병 저항성 관련 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20120129835A
Application number: KR1020120053433A
Authority: KR
Inventors: 류충민; 박효비
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2011-05-20
Filing date: 2012-05-21
Publication date: 2012-11-28
Also published as: US20140140960A1; KR101307370B1; WO2012161491A9; WO2012161491A2; WO2012161491A3; US9456608B2

Abstract

본 발명은 토양 메타게놈 유래의 식물병 저항성 관련 1B8-4-D7 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 1B8-4-D7 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물의 병 저항성을 증진시키는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 식물의 병 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 1B8-4-D7 유전자를 포함하는 식물의 병 저항성 증진용 조성물, 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 조성물을 식물체에 처리하여 유도전신저항성(induced systemic resisstance)을 유도하는 단계를 포함하는 식물병을 방제하는 방법 및 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 식물병 방제제에 관한 것이다.

Description

토양 메타게놈 유래의 식물병 저항성 관련 유전자 및 이의 용도{Plant disease resistance-related gene from soil metagenome and uses thereof}

본 발명은 토양 메타게놈 유래의 식물병 저항성 관련 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 토양 메타게놈 유래의 식물병 저항성 관련 1B8-4-D7 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 1B8-4-D7 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물의 병 저항성을 증진시키는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 식물의 병 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 1B8-4-D7 유전자를 포함하는 식물의 병 저항성 증진용 조성물, 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 조성물을 식물체에 처리하여 유도전신저항성(induced systemic resisstance)을 유도하는 단계를 포함하는 식물병을 방제하는 방법 및 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 식물병 방제제에 관한 것이다.

자연계에서 관찰되는 수많은 미생물과 배양 배지 상에서 보이는 군락의 숫자 사이에는 불일치가 존재하며 이를 '배지상-계수 예외'(plate-count anomaly)로 정의할 수 있다(Amann et al., (1995) Microbiol Rev 59: 143-169). 이미 1970년대 후반에 미생물의 DNA를 그 서식환경에서 직접 분리하여 그 유전체의 구성 유전자들을 있는 그대로 연구하자는 제안이 있었으며(Torsvik V. L. and GoksJ. (1978) Soil Biology & Biochemistry 10: 7-12), 이는 나중에 메타게놈(metagenome)이란 신조어를 탄생시키게 되었다. 메타게놈은 "주어진 어떤 환경에 존재하는 모든 미생물의 유전체의 집합"으로 정의되었고(Handelsman et al., (1998) Chem. Biol. 5: R245-249), 메타게놈 DNA를 직접 클로닝한 연구는 미국의 Pace와 DeLong 등이 선도적으로 수행하였다(Schmidt et al., (1991) J. Bacteriol. 173: 4371-4378).

미생물을 모두 배양해서 동정 및 분류를 한 후 연구를 수행한다는 것은 아주 이상적인 방향이나 현실은 그렇지 못하다. 예를 들어 SAR11이라고 명명된 세균의 경우 전 세계의 다양한 해양환경에서 우점종이지만 그 배양이 최근에야 성공하였으나, 기존의 고체 배지위에서 콜로니를 얻는 순수배양법을 따르지는 않고 있다(Morris et al., (2002) Nature 420: 806-810). 또한, "확산 공동(空洞) 실험법" (Diffusion chamber method)를 이용하여 자연상태의 생장환경을 시뮬레이션해서 기존에 배양되지 않았던 미생물 군락들을 얻을 수 있었으며, 이들은 인공적인 배지 위에서는 자라지 않으며, 다른 미생물과의 상호작용을 통해 성장을 하는 것으로 알려졌다.

메타게놈을 연구하여 미생물 및 그 다양성을 연구하는 가장 큰 장점은 첫째, 배양하지 않고도 유전자를 연구할 수 있다는 점이고 둘째, 주변 환경에 대한 심층적인 이해를 할 수 있다.

효소라는 것은 생물체가 만들어내는 일종의 촉매로서, 생체촉매(biocatalyst)라고 불린다. 메타게놈의 연구가 최근에 각광을 받는 이유는 그 응용분야인 신물질 또는 효소의 탐색에 유용하기 때문일 것이다. 주로 산업적으로 유용한 것들이 주로 고분자물질을 가수 분해하는 키티나제, 리파제/에스터라제, 프로테아제, 아밀라제, DNAse, 자일라나제 외에 폴리케티드 합성효소(polyketide synthase), 4-히드록시뷰티레이트 DH(4-hydroxybutyrate DH), 옥시게나제(Oxygenase) 등이 있다 (Lorenz et al., (2002) Curr Opin Biotechnol 13: 572-577). 그러나, 최근의 경향은 이러한 고분자를 가수분해하던 효소에서 탈피하여, 화학 합성 공정에서 필요한 촉매반응에 미생물 및 메타게놈에서 유래한 효소를 이용하려는 노력들이 있다.

지금까지 한국등록특허 제0952754호에서는 토양 메타게놈에서 유래한 항생 활성을 암호화하는 유전자군이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제0613694호에서는 토양 메타게놈 유래 신규 리파제 유전자 및 이로부터 코딩되는 리파제 단백질이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 토양 메타게놈으로부터 분리한 신규한 유전자가 담배 식물체의 병 저항성을 증진시키는데 이용될 수 있는 내용에 관해서 밝혀진 내용은 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 토양 메타게놈 라이브러리를 이용하여 담배(Nicotiana tabacum) 식물체에 무름병을 일으키는 병원균인 어위니아 카로토보라(Erwinia carotovora subsp . carotovora)에 대한 전신유도저항성을 보이는 클론을 찾음으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 토양 메타게놈 유래의 식물병 저항성 관련 1B8-4-D7 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 1B8-4-D7 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물의 병 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 식물의 병 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 토양 메타게놈 유래의 1B8-4-D7 유전자를 포함하는, 식물의 병 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 1B8-4-D7 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 조성물을 식물체에 처리하여 유도전신저항성(induced systemic resisstance)을 유도하는 단계를 포함하는 식물병을 방제하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 1B8-4-D7 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 식물병 방제제를 제공한다.

본 발명의 토양 메타게놈으로부터 유래된 식물병 저항성 관련 1B8-4-D7 유전자로 형질전환시킨 식물체는 담배무름병(Erwinia carotovora subsp . carotovora)을 방제하는데 효과적이므로, 담배의 생산력 향상에 유용할 것이다. 또한, 본 발명의 조성물은 친환경적이며, 인체 독성이 없으므로 안전성이 높다.

도 1은 미생물은행(Micro Bank, http://www.microbank.re.kr/)에서 분양받은 메타게놈 풀(Pool)을 나타낸다.
도 2는 토양에서 분리한 메타게놈을 분리하여 대장균에 형질전환하는 방법을 나타낸다. 분리된 유전체들은 포스미드 벡터(pCCIFOS)에 삽입시켜 대장균(EPI300)에 형질전환시켰다.
도 3은 토양 메타게놈 풀을 배양한 후, 담배 뿌리에 관주하는 과정(A) 및 7일 후 담배 잎에 병원균을 접종한 후 병징을 관찰한 결과(B)를 나타낸다. 양성 대조군 식물은 1mM BTH(benzothiadiazole)로 처리되었다.
도 4는 토양 메타게놈 라이브러리 풀로부터 단일 클론을 얻기까지의 과정을 보여준다. 605개의 풀에서 유도저항성 검정을 1차로 실시하였다. 선별된 풀에서 콜로니를 분리하여 유도저항성을 검정하는 실험을 수행하였다. 2개의 단일 클론을 선별한 후, 플라스미드에 삽입된 유전자 중 어느 부위가 유도저항성을 나타내는지에 대한 검정을 실시하였다.
도 5는 shot-gun 방법을 이용하여 염기서열을 무작위로 잘라 pUC118 벡터에 삽입하여 대장균에서 발현시킨 후 유도저항성 검증을 수행한 결과(A) 및 선별된 유전자에 대해 트란스포존 돌연변이(Transposon mutagenesis) 방법으로 인위적인 돌연변이를 일으키는 실험을 수행한 결과(B)이다.
도 6은 시험관 내에서의 메타게놈이 담배의 저항성 유전자의 발현에 미치는 영향을 조사하기 위해 병원균을 접종한 후 2일에 병징을 관찰한 것이다. 양성 대조군은 1mM BTH, 음성 대조군(control)은 멸균된 증류수로 처리되었다. (A)는 선별된 단일 클론을 대상으로 한 유도저항성의 병징을 관찰한 결과를 나타낸다. (B)는 두 가지의 단일클론을 이용한 유도저항성 실험을 나타낸다. 1B8-4-D7과 1F4-2-F7 클론에서 양성 대조군에 비해 유도저항성을 보였다. (C)는 트란스포존 돌연변이법으로 나온 클론에서는 shot gun에서 보이는 유도 저항성이 나타나지 않는 클론을 선별한 것을 보여준다.
도 7은 음성대조군(control)에 대해 M15 클론에서 유도 저항성이 약해짐을 확인하였다. (A)는 담배잎에 병원균 처리 후 0, 3 및 6시간 후 담배에서 RNA를 추출한 후 qRT-PCR한 결과를 나타낸다. 담배의 저항성 유전자인 PR1a, PR1b 및 PR1c의 발현 중 3시간째의 PR1b의 발현이 대조군보다 증가한 것을 확인하였다. (B)는 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 저항성 유전자의 발현을 나타낸다. 0 및 3시간째 모두 메타게놈 처리군에서의 발현양이 양성대조군보다 낮으며 처리구와 비슷한 양상을 보였다.
도 8은 선발된 메타게놈 클론에서 무름병원균 어위니아 카로토보라(Erwinia carotovora subsp. carotovora)에 대한 유도저항성 결과를 나타낸다. (A) 1B8-4-D7을 ORF를 중심으로 5가지의 단편으로 나누어진 클론의 이름과 위치 (B) 선발된 메타게놈 1B8-4-D7의 5개의 단편들, PS, E1266, PB, E2052, BS와 벡터 대조군 pUC19 그리고 대조군인 물처리(SDW)와 병저항성 유도 화합물 BTH 처리. * 는 ANOVA 분석을 통하여 P = 0.05 수준에서 대조군인 pUC19 처리에 비해 병 발생이 현저하게 줄어든 처리구를 표시함. 발병도(disease severity)는 0 = 병징 없음, 1 = 1개 잎에서 무름증상이 보임, 2 = 2개 잎에서 무름증상 보임, 3 = 3개 잎에서 무름증상 보임, 4 = 4개 잎에서 무름증상 보임, 5 = 식물의 줄기를 포함한 전체 식물에서 무름증상을 보임.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 토양 메타게놈(metagenome) 유래의 식물병 저항성 관련 1B8-4-D7 유전자를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 식물체의 유도전신저항성을 유도함으로써 담배 식물체의 무름병을 일으키는 병원균인 어위니아 카로토보라(Erwinia carotovora subsp . carotovora)에 대해 저항성을 나타낼 수 있다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 페투인 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

발현 벡터에서 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 열매, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 1B8-4-D7 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물의 병 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 식물의 병 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명의 식물체에서, 상기 식물 병은 어위니아 카로토보라(Erwinia carotovora subsp . carotovora)의해 발병될 수 있는 담배 무름병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있다. 바람직하게는, 상기 식물체는 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 담배이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 토양 메타게놈 유래의 1B8-4-D7 유전자를 포함하는, 식물의 병 저항성 증진용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 1B8-4-D7 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 병 저항성을 증가시킬 수 있는 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 토양 메타게놈 유래의 식물병 저항성 관련 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 조성물을 식물체에 처리하여 유도전신저항성(induced systemic resisstance)을 유도하는 단계를 포함하는 식물병을 방제하는 방법을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 포함하며, 단백질을 안정화시킬 수 있는 당업계에 공지된 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 조성물은 식물체에 유도전신저항성을 유도함으로써 담배 무름병 외에도 다양한 식물 병에 대한 저항성을 증진시킬 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 토양 메타게놈 유래의 식물병 저항성 관련 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 식물병 방제제를 제공한다. 상기 식물병 방제제는 식물체에 유도전신저항성을 유도하기 때문에 담배 무름병 외에도 다양한 식물병에 대한 방제 효과를 가질 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

시험관 내에서 ISR ( Induced systemic resistance ) 능력 검정

메타게놈 라이브러리 605개 풀(pool)로부터 ISR 능력을 검정하기 위하여, 각 라이브러리를 96 well에 든 LB 배지에서 16시간, 37℃에서 배양하였다. 상기와 같은 방법으로 식물의 뿌리에 관주 처리 후 7일 후, 담배 식물체의 무름병을 일으키는 병원균인 어위니아 카로토보라(Erwinia carotovora subsp . carotovora)를 접종한 다음 병징을 관찰하였다. 양성 대조군 식물은 1 mM BTH(benzothiadiazole)로 처리되었다. ISR의 표지자인 발병도(0 ~ 5)는 병원균 접종 후 2일째에 측정되었다(0: 증상 없음, 5: 심한 괴사 증상).

저항성 유전자의 발현 분석

담배의 병 저항성과 관련이 있는 PR1a, PR1b 및 PR1c 유전자의 발현을 qRT-PCR (quantitative real time-polymerase chain reaction)을 통해 조사하였다. 사용된 프라이머 서열은 하기와 같다; (PR1a-F: 5'--AATATCCCACTCTTGCCG-3'(서열번호 2), PR1a-R: 5'-CCTGGAGGATCATAGTTG-3'(서열번호 3), PR1b-F: 5'-ATCTCACTCTTCTCATGC-3'(서열번호 4), PR1b-R: 5'-TACCTGGAGGATCATAGT-3'(서열번호 5), PR1c-F: 5'-CTTGTCTCTACGCTTCTC-3'(서열번호 6), PR1c-R: 5'-AACACGAACCGAGTTACG-3'(서열번호 7), PR1-F: 5‘-TTCACAACCAGGCACGAGGAG-3'(서열번호 8), PR1-R: 5'-CCAGACAAGTCACCGCTACCCCAGGCTAA-3’(서열번호 9), PDF1.2-F: 5'-TCACCCTTATCTTCGCTGCTC-3'(서열번호 10), PDF1.2-R: 5'-GTTGCATGATCCATGTTTGG-3'(서열번호 11), ERF1-F: 5'-TCAGAAGACCCCAAAAGCTC-3'(서열번호 12), ERF1-R: 5'-TTGATCACCGCTCCGTGAAG-3'(서열번호 13).

담배 잎에 병원균을 접종한 후 0, 3 및 6 시간째에 담배 잎을 액체 질소에 넣어 식물을 보관하였고, 이것을 RNA 분리를 위해서 사용하였다. 담배 잎을 막자사발과 액체 질소를 이용해서 분쇄 후, TRIzol 시약 (Invitrogen Life Technologies)를 이용하여 고추 잎에서 RNA를 추출하였다. 상기 추출된 RNA는 M-MLV RT 효소(Enzynomics)를 이용하여 RT 반응을 하였다. RT 반응된 cDNA를 이용하여 qRT-PCR을 실시하였다. 상기 qRT-PCR의 조건은 95℃에서 10분의 초기 변성, 40 주기의 DNA 합성 검출(95℃에서 30초, 55℃에서 60초 및 72℃에서 30초), 그리고 최종 72℃에서 1분의 확장 반응을 포함하였다.

실시예 1: 시험관 내에서 ISR 능력 검정 결과

메타게놈은 미생물은행(Micro Bank, http://www.microbank.re.kr/)에서 분양받았으며 그 메타게놈 풀(pool)은 도 1에서 보여준다.

각 토양에서 분리한 메타게놈을 분리하여 포스미트 벡터(pCCIFOS)에 삽입하여 대장균에 형질전환된 체로 분양되었다 (도 2).

토양 메타게놈 풀을 LB 배지에서 배양한 후, 담배 뿌리에 관주하였으며, 7일 후 담배 잎에 병원균을 접종한 후 병징을 관찰하였다. 양성 대조군 식물은 1mM BTH(benzothiadiazole)로 처리되었다 (도 3).

토양 메타게놈 라이브러리 풀로부터 단일 클론을 얻기까지의 과정은 605개의 풀에서 유도저항성 검정으로부터 시작하였다. 선별된 풀에서 콜로니를 분리하여 유도저항성을 검정하는 실험을 수행하였다. 2개의 단일 클론을 선별한 후, 플라스미드에 삽입된 유전자 중 어느 부위가 유도저항성을 나타내는지에 대한 검정을 실시하였다. 605개의 메타게놈 풀(Pool)에서부터 1B8-4-D7, 1F4-2-F7인 2개의 단일 클론이 선별되었다 (도 4). 도 3에서 실시한 방법으로 유도저항성을 검정하였다. 각 클론으로 shot gun법으로 대상 유전자를 무작위로 shearing하여 클로닝된 유전체를 가지고 유도 저항성을 재검정한 후, 어느 부위의 유전자가 유도저항성을 나타내는지에 대해 밝히고자 하였다 (도 5의 A). 선별된 유전자 부위에 트란스포존을 삽입하여 인위적으로 돌연변이 유전체를 클로닝하여 유도저항성에 대한 실험을 하였으며(도 5의 B), shot gun법에서 나온 클론의 유전자부위와 비교하여 일치하는 유전자 서열을 찾을 수 있었다.

시험관 내에서의 메타게놈이 담배의 저항성 유전자의 발현에 미치는 영향을 조사하기 위해 병원균을 접종한 후 2일에 병징을 관찰하였다 (도 6). 양성 대조군은 1mM BTH, 음성 대조군(control)은 멸균된 증류수로 처리되었다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 1B8-4-D7과 1F4-2-F7 클론에서 양성 대조군에 비해 유도저항성을 보였다. 트란스포존 돌연변이법 결과는 shot gun 방법에서 보이는 유도 저항성이 나타나지 않음을 알 수 있었다. 상기 결과로부터, 1B8-4-D7 유전자는 식물의 유도 저항성에 관여함을 알 수 있다.

실시예 2: 저항성 유전자의 발현 분석

시험관 내에서 담배의 저항성 유전자의 발현에 대한 메타게놈의 영향을 조사하기 위해, 담배 잎에 병원균을 접종한 후 0, 3 및 6 시간째에 담배 잎을 채취하였다. 담배 잎을 액체 질소에 넣어 식물을 보관하였고, 이것을 RNA 분리를 위해서 사용하였다. 담배 잎을 막자사발과 액체 질소를 이용해서 분쇄 후, TRIzol 시약 (Invitrogen Life Technologies)를 이용하여 고추 잎에서 RNA를 추출하였다. 담배의 병 저항성과 관련이 있는 PR1a, PR1b 및 PR1c 유전자의 발현을 qRT-PCR (quantitative real time-polymerase chain reaction)을 통해 조사하였다. 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서의 저항성 유전자인 PR1, PDF1.2 및 ERF1의 발현에는 효과가 없는 것으로 나타났다 (도 7).

실시예 3: 선발된 메타게놈 클론의 무름병원균 어위니아 카로토보라( Erwinia carotovora subsp . carotovora )에 대한 유도저항성 분석

선발된 메타게놈 클론의 무름병원균인 어위니아 카로토보라(Erwinia carotovora subsp. carotovora)에 대한 유도저항성을 알아보기 위해, 선발된 메타게놈 클론의 단편을 제작하였다. 1B8-4-D7 클론은 pUC19을 백본(backbone)으로 약 4.7kb의 삽입물을 포함한 메타지놈이다. 이 삽입물을 제한효소 EcoRI, PstI, 그리고 BamHI 등을 처리하여 5종류의 단편으로 절단한 후 pUC19 벡터에 삽입하였다. PstI 단편 클론 PS, BamHI 단편 클론 BS, PstI과 BamHI으로 절단한 클론 PB, EcoRI으로 절단한 약 2 kb 삽입물을 갖는 E2052, 그리고 약 1 kb의 EcoRI 단편을 갖는 E1266 클론을 제작하였다(도 8의 A).

대조군(control)으로 살균수(SDW)와 유도저항성 대조군으로 1mM BTH를 처리하였고, BS, PS, PB, E1266, E2052, 1B8-4-D7의 각 클론과 pUC19가 들어 있는 E. coli DH5α를 16시간 동안 LB 배지에서 배양 후 2주된 담배 유묘 뿌리에 10 ml씩 접종하였다. 1주일 후에 어위니아 카로토보라(Erwinia carotova subsp. carotovora)를 담배 잎에 접종하여 24시간 후에 무름병 병징을 관찰하였다.

5가지 단편 중에 BS 클론만이 무름병원균인 어위니아 카로토보라(Erwinia carotova subsp. carotovora)에 대하여 병 발생이 원래 메타게놈인 1B8-4-D7와 같은 수준으로 유도저항성이 발현되었다. 유도저항성 대조군인 1mM BTH 처리와도 통계학적으로 비슷한 수준의 유도저항성 능력을 보였다(도 8의 B). BS 내부에 있는 유전자 중에 다른 단편 클론과 독립적인 유전자 서열을 Blast X를 사용하여 분석한 결과, 약 1.8kb의 제한효소(restriction endonuclease)의 ORF를 코딩하고 있었다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Plant disease resistance-related gene from soil metagenome and uses thereof <130> PN12121 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4340 <212> DNA <213> soil metagenome <400> 1 acgccaacaa aatccaactt accaatcaat agtacgtttt tggtatttca tatcaaagaa 60 agtttccatt actgaacttt caaaaaatat ttccatttcg tatttgataa gttacttatc 120 cgtacgggat aataattatg ctccgttaga agacatcgta gatgatttag catttacaga 180 tatgtcatcc atagatttga cggaattaag gaaaatgcag ttatcagcaa atgcgataag 240 tggtgctaac aaattgattg aacaaatcaa tagctatact acccgttcag cgagaaagga 300 aatgttccaa gcgttggata taatgttctc atttgacaaa gttgctacta ttgataggat 360 ttgtccacaa caaaaatatc ctgatgccaa caaacgtctg aaagacattc ttaccttgta 420 ttatggctat ttctctttta gcagtctgct ctatgatgat tctattttca atataaaaaa 480 ttataaaata caagaactta tgaaccagcc ccttcaacaa atatattatg gtgcaccagg 540 cactggaaag tcctatgcaa caaaaaaagt agttgcagag tacccagaaa cagttcgtac 600 aacctttcat cctgatagcg actattcaac ttttgtcggt gcctacaaac ctacaacgac 660 taaagaagaa cgctatggat tgaacggctc aaataccgtt gctctcgttt accccgaggg 720 tgaaaagaaa ggaaagaata ttaaagatgg caagatagta tacaagcttt gttaaacaag 780 catttctgaa ggcatacata aaggcttgga aactggttta aggatagctg tgctaatggg 840 aaagaactgt taccacagtt tcttgtaata gaggaaataa accgaggaaa ctgtgctcag 900 atattcggtg atttgttcca gctacttgac cgcaaaaacg gtttctcaga ataccccatt 960 gaggcagatg aagacattca gaaagctctt ctcgaagagg atcctgaaga tggactaagt 1020 tttagcaagg atggactgaa ttttacagct gagcagatta catatataaa ccagcaatat 1080 gacattgttg gtcagccaag tcaaaaagta gcagagaaaa tcagatatgg tcaagtatta 1140 gtactacctc ccaattttta tatctgggcc actatgaaca caagcgacca gagtctgttc 1200 ccgatagatt ctgccttcaa gcgccgttgg gagtggaagt tcatgaagat caagaagggg 1260 aaagacgaga acggcaacga gctggattgg aggattgttg tgaaagacaa agacgagaac 1320 atcgtcaaga ttaacgataa ggaatcgctc tcttggtggg acttcatcag caagattaac 1380 gaaatcatcg catcaatgac ctccagtgcc gacaaacagt tgggatattt cttctgcaag 1440 gctgacaacg aaggcgtaat cagcgcagaa actatcgtaa gtaaagtcat 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aacagcagag 4020 gaagtattga agtttcgaga ttaaatggat aaactctctg cacaacaacg ctataaaata 4080 attaaaacta tatagatatg agtctaagaa tattcaagtt agaagagtat gatcatactc 4140 atgagcgcga acagtttaga aaattgtgtt caattttgaa ggatttgtat gacaagtcgg 4200 ctgaaatgca cctgctgttt gccaacatca acttcaacgg tgtgccactt gacgctttgc 4260 tcataaaacc cgatgcaatt actgtattgg agtttaagaa ctatagtggt aatgtgattg 4320 cagcagaaaa cggagattgg 4340 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 aatatcccac tcttgccg 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cctggaggat catagttg 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 atctcactct tctcatgc 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tacctggagg atcatagt 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cttgtctcta cgcttctc 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 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Claims

서열번호 1의 염기서열로 이루어진 토양 메타게놈(metagenome) 유래의 식물병 저항성 관련 유전자.
제1항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제2항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제2항의 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물의 병 저항성을 증진시키는 방법.
제4항의 방법에 의해 제조된 식물 병 저항성이 증진된 형질전환 식물체.
제5항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물체.
제5항에 있어서, 상기 식물 병은 담배 무름병인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
제5항에 따른 식물체의 종자.
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 토양 메타게놈 유래의 식물병 저항성 관련 유전자를 포함하는, 식물의 병 저항성 증진용 조성물.
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 토양 메타게놈 유래의 식물병 저항성 관련 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 조성물을 식물체에 처리하여 유도전신저항성(induced systemic resisstance)을 유도하는 단계를 포함하는 식물병을 방제하는 방법.
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 토양 메타게놈 유래의 식물병 저항성 관련 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 식물병 방제제.