KR20120121883A - 생물학적 샘플 정제 및 농축용 장치 및 방법 - Google Patents
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Abstract
필터 및 교반기를 구비한 여과 장치로 구성되는 샘플 정제 및 농축용 장치에 관한 것으로서, 상기 필터를 가로질러 샘플을 흡입하여 끌어들이고 상기 필터에 수거된 물질을 역세척에 의해 플러싱(flushing)한다. 상기 필터내에 수거된 물질의 양은 상기 흡입 및 역세척을 제어하는 압력 측정기에 의해 결정된다.
Description
본 발명은 생물학적 샘플 정제 분야에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 미량의 표적 세포(target cells)를 복수의 다른 세포 및/또는 오염물을 갖는 유체 샘플로부터 분리할 수 있는 장치 및 방법에 관한 것이다.
생물학적 샘플 내의 다양한 성분들을 효과적이고 효율적으로 분리하는 것은 다양한 영역의 연구 및 의료에 있어 필수적이다. 많은 액체 샘플들은 관심이 없거나 거의 없는 복수의 세포 및/또는 오염물, 및 추가 평가를 위해 관심을 끄는 매우 소수의 세포로 구성된다. 따라서, 소수의 표적 세포로부터 혈액 또는 상피 세포와 같은 다수의 정상-발생(normally-occurring) 세포를 분리할 수 있는 것이 요망된다.
이러한 요구를 다루기 위하여 다수의 기술이 업계에서 이용가능하다. 예를 들어 유체 샘플을 필터로 통과시켜 샘플의 특정 성분들을 정제하는 것이 알려져 있다. 미국 특허 7,494,809 B2는 유체 생물학적 샘플을 일련의 필터로 통과시키고 시약으로 처리하여 착색된(stained) 농축(enriched) 세포군을 평가를 위해 제공하도록 하는 자동화된 공정을 개시한다.
관심을 끌 수 있는 하나의 세포군(cell population)은 순환종양세포 또는 CTC이다. 이는 암환자들 중 가장 위험도가 큰 치사율이 종종 원래의 악성 종양이 아니고, 원발성 종양으로부터 거리가 있는 조직 또는 기관에 전이가 형성된 것이기 때문이다. 소수의 세포는 상기 원발성 종양을 떠나서 순환계로 들어가서 CTC가 될 수 있다. 대다수는 살아남지 못하지만, 일부는 살아남을 뿐 아니라 일부 지점에서 내피벽을 가로질러 이동하여 주변 조직에 새로운 종양을 형성한다.
CTC의 검출은 대개 항체에 기초한 양성 선택(antibody-based positive selection)에 의존해 왔다. 그러나, 이러한 기술은 공지의 종양 세포 생체지표에 대하여 이용가능한 항체로 한정된다. 이러한 단점을 처리하는 한가지 방법은 여과 기술이다. 순환 종양 세포를 샘플로부터 분리하기에 특히 적당한 필터는 예를 들어 미국 공개 특허출원 2006/0254972 A1에 개시되어 있다.
그러나 상기 이용가능한 기술에도 불구하고, 액체 생물학적 샘플에서 성분들을 효율적이고 효과적으로 정제 및 농축할 수 있는 장치 및 방법에 대한 요구는 업계에 남아 있다.
따라서 본 발명의 목적은 액체 생물학적 샘플에서 성분들을 효율적이고 효과적으로 정제 및 농축할 수 있는 장치 및 방법을 제공하는 것이다.
상기한 바와 같이, 현재의 기술을 이용함으로써 샘플을 평가하는데 있어 하나 이상의 문제점에 직면할 수 있는데, 이는 표적 세포의 낮은 밀도, 오염 및 비-고유(non-native) 세포를 관찰하기 위한 특수 훈련 또는 장비에 대한 요구를 포함한다. 또한, 기존 기술들의 단점은 값 비싸고 시간 소모적이고, 고통스러울 수 있는, 재 샘플링(re-sampling)을 요할 수 있다. 전이 가능성이 있는 CTC의 즉각적이고 정확한 검출이 생존율을 현저히 증가시킬 수 있으므로, 진단의 지연은 환자의 결과에 영향을 미칠 수 있다.
환자의 혈류로부터 CTC를 제거하는 것이 유용할 수 있지만, 상기 제거된 세포들이 분석하기에 충분히 좋은 상태에 있다면 훨씬 더 유익할 것이다. 이러한 분석은 표적 세포가 샘플에 존재하는 것을 확인할 뿐 아니라, 다른 방법, 예를 들어 질병의 잠재 경로를 예측하는 것을 돕는 것과 같이 유용할 수 있다.
본 발명은 현재의 기술이 실패한 이러한 요구를 충족하는데, 이는 표적 세포를 액체 샘플 내의 복수의 다른 세포들 및/또는 오염물로부터 분리할 뿐만 아니라, 비교적 원래 상태(native state)로 정제되고 농축된 표적 세포군을 제공함으로써 가능하다.
본 발명의 또 다른 하나의 잇점은 더 신속한 진단 정보를 제공할 수 있다는 것이다. 본 발명은 표적 세포의 신속한 분리를 가능하게 하고 그러한 세포들을 원래 상태로 제공하기 때문에, 샘플-채취에서부터 표적 세포 분석까지의 시간이 최소화된다. 본 발명의 효과는 또한 값 비싸고 시간 소모적인 반복 샘플링에 대한 요구를 감소시킬 수 있다.
교반 필터를 통한 일련의 액체 이동 단계를 포함하는 생리적 과정을 거쳐, 표적 세포는 더 큰 샘플로부터 효과적이고 효율적으로 제거되어 원래 상태로 제공된다. 본 발명의 또 다른 잇점은 샘플의 비-표적 성분들도 그들의 원래 상태로 보존된다는 것이다. 많은 경우 이러한 성분들도 또한 관심 대상이다. 따라서, 이들 성분들을 또한 관찰 및 분석하도록 하는 장치 및 방법은 업계에서 훨씬 더 큰 발전이다.
본 발명의 제 1 실시예에 의하면, 샘플 정제 및 농축용 장치는 제 1 면 및 제 2 면을 갖고 교반기로 구성되는 여과 장치, 상기 여과 장치의 상기 제 1 면과 선택적 유체 소통되는 샘플 입력 장치(sample input), 상기 여과 장치의 상기 제 1 면과 선택적 유체 소통되는 제 1 액체 저장소, 제 1 흡입 저장소를 갖고 상기 여과 장치의 상기 제 1 면과 선택적 유체 소통되는 제 1 흡입 수단, 상기 여과 장치의 상기 제 2 면과 선택적 유체 소통되는 제 2 액체 저장소, 상기 여과 장치의 상기 제 2 면과 유체 소통되고 유동 차단 능력(flow stop ability)을 갖는 압력 측정기, 및 상기 여과 장치의 상기 제 2 면과 선택적 유체 소통되는 제 2 흡입 수단으로 구성된다.
상기 제 2 흡입 수단은 제 2 흡입 저장소를 가질 수 있다. 상기 제 1 흡입 수단 및 상기 제 2 흡입 수단 중 적어도 하나는 연동 펌프일 수 있다. 상기 압력 측정기의 유동 차단 능력은 클램프 또는 압전막(piezo-electric membrane)과 관련될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 의하면, 본 발명의 장치에 사용하기 위한 카트리지가 제공되며, 이는 제 1 면 및 제 2 면을 갖고 필터로 구성되며 교반기에 연결가능한 여과 장치, 상기 여과 장치의 상기 제 1 면과 유체 소통되는 샘플 입력 튜브, 상기 여과 장치의 상기 제 1 면과 유체 소통되는 제 1 액체 저장소 튜브, 상기 여과 장치의 상기 제 1 면과 유체 소통되는 제 1 흡입 저장소 튜브, 상기 여과 장치의 상기 제 2 면과 유체 소통되는 제 2 액체 저장소 튜브, 및 상기 여과 장치의 상기 제 2 면과 유체 소통되는 제 2 흡입 튜브로 구성되며, 상기 카트리지는 압력 측정기에 대한 적어도 하나의 접근 지점을 갖는다.
이러한 실시예에서 상기 여과 장치는 교반기로 구성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 의하면, 샘플을 정제하는 방법이 제공되며, 이는 샘플을 필터의 제 1 면과 유체 소통되는 샘플 입력 장치(sample input)로 제공하고, 소정의(pre-determined) 압력이 측정될 때까지 상기 필터를 거쳐 상기 샘플 입력 장치로부터 유체를 끌어들이기 위하여 필터의 제 2 면에 흡입 적용하고, 상기 필터의 상기 제 2 면을 액체를 함유하는 저장소와 독점적 유체 소통되도록 배치하고, 상기 필터를 거쳐 상기 저장소로부터 유체를 끌어들이기 위하여 상기 필터의 상기 제 1면에 흡입 적용하고, 상기 필터를 거쳐 상기 저장소로부터 끌어들여진 유체를 용기에 수거하는 단계로 구성된다. 상기 필터는 상기 공정의 적어도 상당 부분 동안 교반되며, 상기 정제된 샘플은 상기 용기에 수거된다.
이러한 방법에서, 상기 소정의 압력은 물기둥(water column)을 이용하여 측정시, 약 130-150, 바람직하게는 135-145, 훨씬 더 바람직하게는 140 mm H2O 범위일 수 있다.
여기 개시된 본 발명의 잇점들은 정제 및 농축된 표적 세포가 형태(morphology)에 대하여 분석될 수 있음을 주목함으로써 종종 중단되지만, 이러한 기술과 관련된 다수의 하류 적용들(downstream applications)이 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들어, 몇 개만 나열하더라도, 전이 가능성을 평가하고, 고-위험군을 스크리닝하고, 질병을 진단하고, 질병을 예측하고, 약물 민감도 평가를 포함하여 치료 결과를 예측하고, 질병 상태를 모니터링하고, 치료에 대한 반응을 모니터링하고, 치료 요법(treatment regimens)을 최적화하고, 새로운 치료를 개발하는 것이다.
달리 표시되지 않는 한, 여기 사용된 모든 기술적 과학적 용어들은 당업자에 의해 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 대체적으로 언급된 장비 및 방법들은 당업계에 잘 공지되어 있고 흔히 이용되는 것이다.
샘플은 임의의 소스(source), 예를 들어 유기체(organism)로부터 얻을 수 있다. 샘플은 표본 추출물, 가래, 소변 또는 대변 샘플, 기관지 세척물과 같은 체내 영역 세척물, 제대혈, 골수 첨자물(bone marrow aspirates), 복수액, 또는 내부 또는 말초 혈액을 포함할 수 있다. 이는 항응고제 또는 안정화제와 같은 첨가제로 구성될 수 있다.
표적 세포는 샘플에 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 관심을 끄는 특정 유형의 세포이다. 비-표적 세포는, 그것에 대한 분석에 관심이 갈 수는 있을지라도, 바람직하게 제거되는 세포들이다.
"필터"는 특정 칫수의 하나 이상의 구멍 또는 개구로 구성되어, 상기 칫수 보다 작은 입자들이 필터의 반대 면으로 통과되도록 하면서 더 큰 입자는 상기 필터를 통과하는 것을 막는 구조이다. 그것은 임의의 재료, 예를 들어 플라스틱, 세라믹, 실리콘, 금속 또는 유리로 구성될 수 있다. 상기 필터는 미세가공되거나 미세 기계가공될 수 있으며, 또는 나일론, 폴리카보네이트, 셀룰로오스 등으로 만들어진 모노- 또는 멀티-섬유 필터와 같이 좀 더 전형적인 필터일 수 있다. 필터는 그 표면 특성을 변경하기 위하여, 예를 들어 친수성을 증가시키기 위하여 처리될 수 있다.
여기서, 본 발명과 관련하여 사용된 성분들 및 재료는 종종 명시적으로 또는 함축적으로, 처분가능한(disposable) 것으로 기재된다. 당업자는 이러한 종류의 장치 및 방법에 대한 무균성 및 제염(decontamination)에 대한 요구를 알 것이며, 이는 종종 처분가능한 재료에 유리하게 작용한다. 또한, 살균 및 이에 대한 서류에 대하여 요구되는 시간 및 재료, 및 오류 위험성은 일반적으로 그러한 경로를 덜 유리하도록 한다. 그러나, 이는 어떠한 경우이든 요구되고 적절한 때 재사용 가능한 재료를 사용하는 것을 배제하도록 취해져서는 안된다.
본 발명의 다양한 측면들이 첨부 도면을 참고로 예시적으로 개시될 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예를 도식적으로 도시함.
도 2는 본 발명의 또 다른 일 실시예를 도식적으로 도시함.
도 3은 미처리된 방광 세척 샘플을 보여줌.
도 4는 본 발명에 따라 처리된 후의 도 3의 샘플을 보여줌.
도 5는 미처리된 복수(ascites) 샘플을 보여줌.
도 6은 본 발명에 따라 처리된 후의 도 5의 샘플을 보여줌.
도 1은 본 발명의 일 실시예를 도식적으로 도시함.
도 2는 본 발명의 또 다른 일 실시예를 도식적으로 도시함.
도 3은 미처리된 방광 세척 샘플을 보여줌.
도 4는 본 발명에 따라 처리된 후의 도 3의 샘플을 보여줌.
도 5는 미처리된 복수(ascites) 샘플을 보여줌.
도 6은 본 발명에 따라 처리된 후의 도 5의 샘플을 보여줌.
상기한 바와 같이, 본 발명은 샘플 정제 및 농축용 장치 및 방법에 관한 것이다. 예를 들어 도 1을 참조하면, 본 발명의 장치(10)는 제 1 면(12) 및 제 2 면(13)을 갖고 교반기(도시되지 않음)로 구성되는 여과 장치(11)로 구성된다. 필터의 상기 제 1 및 제 2 면(12, 13)은 일반적으로 마주보지만, 반드시 엄격히 서로 마주보는 것은 아니다. 실제의 여과 재료, 필터의 구성 및 배치에 따라, 그들의 상대적 위치는 함께 더 가까울 수 있거나 더 떨어질 수 있다.
여과 장치(11)는 필터(도시되지 않음)로 구성되며, 이는 당업계에 알려진 임의의 적당한 필터일 수 있다. 상기 필터의 공극 크기는 관심 있는 표적 세포 및 샘플에 있을 것으로 기대되는 예상 비-표적 세포 및/또는 오염물 모두를 고려한 것에 기초하여 선택되어야 한다. 예를 들어, 혈액 세포를 포함하는 샘플로부터 CTC를 정제 및 농축하기 위하여 본 발명의 장치(10)를 사용할 경우, 10㎛ 범위의 필터 크기가 바람직하다. 필터 자체의 크기는 상기 장치 및 목적에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상업적 표준 22 mm 지름의 필터가 사용되며, 약 15,000 - 20,000 세포를 여과할 수 있다.
여과 장치(11)와 결합하여 제공되는 교반기는 상기 장치(10)의 효율성 및 정확도를 최대화하기 위하여 여과하는 동안 기계적 진동이 이용되도록 한다. (상기 장치의 전체적 방향에 대하여) 임의 방향으로의 기계적 진동이 유효할 수 있지만, 수평 방향으로의 교반이 본 발명의 장치(10) 내 생물학적 샘플과 특히 잘 작용하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 기체에 대한 헤드스페이스(headspace)를 포함하는 여과 장치를 왕복 수평 운동으로 교반하면 상기 여과 장치 내 유체가 원주 이동하면서 빙빙 돌도록(swirling) 할 수 있다. 이러한 이동은 온화하면서(gentle) 동시에 효과적인 것으로 보인다. 1000-2000 Hz 범위의 교반이 바람직할 수 있다. 이러한 범위는 일반적으로 상기 필터의 전체 표면적을 효과적으로 사용할 수 있도록 하면서, 샘플 내 성분들을 손상시키거나 파열을 유발할 정도로 강하지는 않다.
본 발명의 장치(10)에서는, 다양한 성분들이 일련의 튜브(14)를 거쳐 서로 유체 소통된다. 상기 장치의 광범위한 용도는 상업적으로 이용가능한 배관(tubing)을 상당한 정도로 선택하는 것을 수반한다. 생체 유체 및 그 성분들에 대하여 비활성인 재료를 이용하는 것이 바람직할 것이다. 또한, 배관의 길이 및 직경, 특히 내부 직경은 속도 및 압력과 같은 시스템 파라미터를 결정하는 경우 고려되어야 한다. 어떤 경우, 2 mm 범위의 내부 직경을 갖는 실리콘 배관을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
여기서는 일반적으로 가요성 원통 형태로 기재되지만, 본 발명의 튜브(14)는 비-가요성 및/또는 비-원통형 재료로 구성될 수 있다. 예를 들면, 원기둥 또는 기타의 형태로 성형된 유리 또는 금속이 있다. 상기 배관은 상기 장치의 다양한 성분들로부터 또한 다양한 성분들 사이에 액체를 전달하는 목적에 기여하며, 따라서 상당히 다양한 형태가 전체 장치의 선택된 칫수 및 구성에 따라 사용될 수 있다. 당업자라면 튜브의 내부 칫수가 샘플 내 세포를 수용하기에 충분히 클 필요가 있음을 인식할 것이며, 세포의 크기에 근접한 직경은 상기 장치 내에서의 유체 유동에 펄싱(pulsing) 또는 기타의 바람직하지 않은 효과를 유발할 수 있음을 인식할 것이다.
상기 장치의 다양한 성분들 사이에 선택적 유체 소통을 허용하는 복수의 선택 수단(15)이 제공된다. 선택 수단은 수동 또는 자동화된 제어를 통해 유체의 흐름을 배향시키고 차단시킬 수 있다. 예를 들어, 양방향 밸브(two-way valve)가 사용될 수 있으며, 이는 제 1 성분이 필터와 유체 소통되도록 제 1 위치로 조절될 수 있으며, 그 다음 제 2 위치로 회전되어 제 2 성분이 필터와 유체 소통되도록 할 수 있다. 상기 장치(10)의 서로 다른 영역에서 선택 수단(15)은 달라질 수 있으며, 예를 들어 일부는 수동일 수 있고 일부는 자동화될 수 있다.
샘플 입력 장치(16), 제 1 액체 저장소(17) 및 제 1 흡입 수단(18)을 포함하여, 다수의 성분들이 상기 필터의 제 1 면(12)과 유체 소통되도록 배치된다.
샘플 입력 장치(16)는 유체 샘플이 시스템에 접근되도록 하는 포트(port) 또는 기타의 수단일 수 있다. 또는, 그것은 시험관과 같은 용기 또는 홀더(holder)로 구성될 수 있다. 가장 간단한 형태로서, 그것은 단순히, 예를 들어 시험관에 제공될 수 있는 샘플과 소통되도록 배치 가능한 튜브(14)의 연장부(extension)이다. 오염 및 안전에 대한 우려로 인하여, 샘플의 내용물은 바람직하게, 예를 들어 샘플을 마개가 있는 시험관에 제공하고 샘플 입력 장치를 관 끝단에 바늘로서 구성(바늘은 마개 내로 삽입됨)함으로써, 둘러싸여질(enclosed) 수 있다.
제 1 액체 저장소(17)가 상기 장치(10)에 제공된다. 초기 사용 단계에서 액체는 제 1 액체 저장소(17)에 존재한다. 그것의 사용은 아래의 실시예에서 더 기술될 것이지만, 상기 제 1 액체 저장소의 유체는 적어도 일반적 플러싱(flushing) 또는 헹굼 목적에 기여하며 따라서 생리적으로 중성인 것이 바람직함을 유의할 수 있다. 적당한 유체는 인산 완충 식염수(PBS), 행크의 완충 식염 용액(Hank's buffered saline solution), (히드록시메틸)아미노메탄 (TRIS) 완충액, 및 생리학적 중성 pH 및 약 270-330 mOsm/kg의 오스몰 농도(osmolarity)를 갖는 기타의 완충액을 포함한다.
제 1 흡입 수단(18)은 상기 필터의 제 1 면(12)으로 흡입을 제공할 수 있어서, 상기 필터의 제 2 면(13)으로부터 상기 필터의 제 1 면(12)까지 유체를 효과적으로 끌어들인다. 제 1 흡입 수단(18)에는 유체 및 그 안에 현탁된 입자를 수거할 수 있는 제 1 흡입 저장소(도시되지 않음)가 제공된다. 가장 간단한 형태로서, 상기 제 1 흡입 수단(18)은 주사기일 수 있으며, 그것의 마개는 흡입을 위해 끌어당겨질 수 있고, 그 내부 공동(inner cavity)은 저장소를 제공한다. 또는, 상기 제 1 흡입 수단(18)은 연동 펌프일 수 있다.
제 2 액체 저장소(19), 압력 측정기(20) 및 제 2 흡입 수단(21)을 포함하여, 다수의 성분들이 또한 상기 필터의 제 2 면(13)과 유체 소통되도록 배치된다.
내부에 유체를 갖는 제 2 액체 저장소(19)는 상기 장치(10)에 초기에 공급된다. 그것의 사용은 아래에서 더 기재될 것이지만, 상기 유체는 바람직하게 생리적으로 중성이며, 그 결과 상기 제 2 액체 저장소(19)를 형성하는데 사용되는 재료는 바람직하게 비-반응성이다. 상기 제 2 액체 저장소(19)의 크기 및/또는 용량은 상기 장치(10)의 의도하는 용도에 따라 달라질 것이며, 또한 상기 제 2 액체 저장소(19)가 고정부로서 적용되는지 여부 또는 상기 장치(10)를 매번 사용한 후에 교환되는지 여부에 따라서 다를 것이다.
압력 측정기(20)는 사용자(또는 자동화된 모니터링 장치)가 상기 장치 내에 존재하는 진공 정도를 모니터링하도록 한다. 교정(calibration)을 통해, 이러한 측정은 필터가 표적 세포로 충분히 포화된 때를 결정할 수 있도록 할 것이다. 압력 측정기(20)는 시각적 디스플레이를 포함할 수 있다.
압력 측정기(20)는 또한 사용자가 샘플을 정규화(normalize)하도록 한다. 내부 시스템의 압력에 의존함으로써, 샘플 내 미립자 물질의 농도를 결정하는데 유익할 수 있는 시기 적절한 사전-스크리닝(pre-screening) 단계에 대한 요구를 회피할 수 있다. 샘플과 그것이 기원하는 유기체는 다를 것이므로, 평가되는 샘플도 그러할 것이다. 또한, 어떤 경우 사용자는 샘플을 희석하여 다수의 목적으로 사용될 수 있도록 하거나, 또는 정제 및 농축 방법이 가장 효율적으로 기능하도록 선택할 수 있다.
적당한 압력 측정기(20)의 예는 물기둥이다. 그러한 압력 측정기(20)가 사용될 경우, 상기 장치(10)에 대한 합리적인 작동 범위는 130-150 mm H2O 이다. 135-145 mm H2O의 범위가 바람직할 수 있다. 대략 140 mm H2O 가 특히 효과적일 수 있다.
상기 장치(10)가 적어도 부분적으로 자동화된 경우, 압력 측정기(20)는 선택 수단(15) 또는 기타의 유동 제어 수단에 연결되어, 특정의 소정 압력에 도달하면, 시스템의 측면들이 결합되거나(engaged) 해제되도록(disengaged) 할 수 있다.
특히 자동화가 요구되는 경우, 압력 측정기(20)는 물기둥에 내재하는 것과 같은 디스플레이 수단을 포함할 필요가 없다. 대신 그것은 압력을 감지하는 전자 센서로 구성될 수 있다. 상기 압력 측정기(20)에 의해 얻어진 정보는 중앙 제어 장치로 전달될 수 있으며, 이는 상기 압력 측정기(20)의 유동 차단 능력을 이용하여, 상기 장치의 선택된 영역에서 유동을 중단하거나 개시하는 지시를 보낼 수 있을 것이다.
유동 차단 능력은 예를 들어 막을 이용하여 달성될 수 있을 것이다. 일 예는 압전막이다. 결합될(engaged) 때 가요성 튜브를 물리적으로 변형시켜 상기 튜브를 통한 유동을 차단할 수 있는 크림프(crimp) 또는 클램프(clamp)와 같은 간단한 유동 차단기(flow stops)가 또한 고려된다. 상기 클램프 또는 크림프를 해제함으로써 유동은 다시 시작될 수 있다.
물리 장치가 압력 측정기(20)의 유동 차단 능력을 달성하기 위해 이용될 경우, 그것은 상기 압력 측정기(20)와 정확히 동일한 장치의 위치에 반드시 있을 필요는 없다.
압력 측정기(20)는 압력을 직접 측정하는 장치일 수 있으며; 또는 압력을 계산하기 위해 사용될 수 있는 정보를 수집할 수 있다.
압력 측정기(20)는 샘플을 여과 장치(11)로 초기 통과시킬 때의 목적에 기여하지만, 상기 장치(10)를 이용하는 이어지는 단계에서 그것은 요구되지 않을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 특히 자동화된 시스템에서, 통계 목적으로 및/또는 시스템내 오작동을 감지할 수 있는 안전 체크로서, 내부 시스템 압력을 계속 측정할 수 있다.
제 2 흡입 수단(21)은 상기 필터의 제 2 면(13)으로 흡입을 제공할 수 있어서, 상기 필터의 제 1 면(12)으로부터 상기 필터의 제 2 면(13)까지 유체를 효과적으로 끌어들인다. 유체 및 그 안에 현탁된 입자를 수거할 수 있는 선택적 제 2 흡입 저장소(도시되지 않음)가 제공될 수 있다. 상기 제 2 흡입 수단(21)은 주사기일 수 있으며, 그것의 마개는 흡입을 위해 끌어당겨질 수 있다. 상기 주사기의 내부 공동은 필요한 경우 저장소로서 기여할 수 있다. 또는, 상기 제 2 흡입 수단(21)은 펌프, 예를 들어 연동 펌프일 수 있다. 상기 장치(10)의 사용은 아래에 더 기재될 것이지만, 비-표적 세포가 관심을 끄는 경우, 상기 제 2 흡입 저장소는 바람직하게 그러한 세포를 편리하게 저장하도록 제공됨을 주의할 수 있다.
본 발명의 장치(10)의 또 다른 실시예는 도 2에 도시된다. 이 도면에서는, 예시의 편의를 위해, 배관(14)의 모든 부분이 참고 번호로 표기되지는 않았다.
도 2의 실시예에는, 복수의 선택 수단(15)이 도시되어 있다. 상기 필터의 제 1 면(12)과 유체 소통하는 상기 선택 수단(15)은 본 실시예에서 3-방향 밸브(three-way valve)인 반면, 상기 필터의 제 2 면(13)과 유체 소통하는 것은 양방향 밸브이다.
도 2의 실시예는 단일 선택 수단(15) 및 튜브(14)를 거쳐 상기 필터의 제 1 면(12)에 연결되는 모든 성분들을 그룹화한, 요소들의 대안적 구성을 갖는다. 상기 필터의 제 2 면(13)에 연결되는 성분들 또한 도 1의 실시예에 비하여 다른 구성을 가지며, 여기서 압력 측정기(20)는 선택 수단을 경유하여 연결되지 않으나, 그 대신 제 2 액체 저장소 또는 제 2 흡입 수단(21) 중 하나가 시스템과 항상 유체 소통될 수 있다.
추가의 구성들도 가능하며 그것이 본 발명의 범위에 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 또한, 복수의 장치가 순서대로 또는 동시에 제공될 수 있다.
샘플을 낮은 작동 온도에 유지하는 것이 바람직하거나 심지어 필수적인 경우, 예를 들어 추후 분석 또는 활성을 위하여 세포 활성을 중단시키는 것이 매우 바람직해지는 경우, 본 발명에 따른 전체 장치는 냉장 장치 또는 차가운 공간에 제공될 수 있다. 기타의 경우, 상기 시스템 내에서 사용되는 액체 시약들은 특정의 온도, 예를 들어 약 0-4℃에서 제공되는 것이 충분할 수 있다.
앞서 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 장치의 대부분 또는 모든 성분들은 처분가능(disposable)할 것으로 생각된다. 구체적으로, 처분가능한 카세트 또는 카트리지에 본 발명에 따른 장치의 성분들이 공급될 수 있을 것으로 예상된다. 그러한 카세트는 바람직하게, 샘플들의 전자 처리를 용이하게 할 수 있도록 바코드 또는 바코드를 부착하는 공간을 포함할 수 있다. 또 다른 대안은 카세트에 포함되거나 부착될 수 있는 전자 식별기이다.
본 발명에 대하여 유용한 카세트 또는 카트리지는 여과 장치로 구성되며 교반기로 구성될 수 있다. 또는, 상기 여과 장치는 단순히 교반기에 연결되거나 결합될 수 있다. 상기 여과 장치의 제 1 면 또는 제 2 면을 각각 상기 저장소 및 상기 장치의 입력 장치에 연결하는 복수의 튜브들이 또한 제공된다. 적어도 하나의 접근 지점이 압력 측정기에 대하여 제공되며, 상기 압력 측정기 자체는 상기 카세트에 포함될 수 있다. 상기 접근 지점은 단순히 센서가 삽입되는 배관 내 하나의 부위일 수 있다.
본 발명의 장치는 수동으로 작동될 수 있으며, 또는 부분적으로 또는 전체적으로 자동화될 수 있다. 참고의 편의상 도 1이 여기 언급된다.
원하는 경우, 상기 시스템 및/또는 필터는 액체로 준비될 수 있다. 샘플은 상기 여과 장치(11)와 유체 소통되는 샘플 입력 장치(16)에 제공된다. 선택적으로, 상기 샘플은 본 발명의 방법을 실행하기 전에 사전 처리될 수 있다. 예를 들어, 세포들이 구부러져서 그들의 일반 직경 보다 더 작은 구멍을 통과할 수 있도록 되는 경향을 감소시키기 위하여, 그들은 고정될 수 있다.
혈액 샘플을 분석하는 경우, 혈장(plasma)은 표준 0.37% 포름알데히드 용액으로 처리된 세포들로부터 분리될 수 있다. 그 다음 PBS 또는 다른 중성 액체가 상기 원래의 샘플 부피에 첨가될 수 있다. 이론에 구속되기를 원치는 않지만, 세포들은 상기 포름알데히드 첨가 후에 고정되거나 더 단단해져서, 그들의 직경과 좀 더 밀접하게 관련된 방식으로, 그리고 필터 구멍을 통해 구부러지는 그들의 능력과 덜 밀접하게 관련된 방식으로, 상기 필터를 통과하거나 통과하지 못하게 할 수 있는 것으로 이해된다.
관련 선택 수단(15)은 상기 제 2 흡입 수단(21)이 상기 여과 장치(11)와 유체 소통되도록 구성된다. 상기 제 2 흡입 수단(21)이 결합되어, 현탁된 입자 및 유체를 샘플 입력 장치(16)를 거쳐 상기 여과 장치(11)로 끌어들인다.
샘플의 유형 및 상기 장치의 구성에 따라, 일정 범위의 적당한 압력이 이용될 수 있다. 압력 측정기(20)를 사용함으로써, 어떻게 상기 여과 장치(11)가 표적 세포로 포화되는지를 대략적으로 계산할 수 있다. 적절한 때, 예를 들어, 압력을 표시하기 위해 사용되는 물기둥이 대략 140 mm H2O를 나타낼 때, 상기 제 2 흡입 수단(21)은 흡입하는 것을 중단하고, 상기 샘플 입력 장치(16)는 상기 여과 장치(11)와의 유체 소통이 되지 않게 된다.
이러한 단계는 상기 필터의 구멍 크기 보다 더 작은 오염원 및 비-표적 세포들을 상기 필터를 통해 끌어들여, 표적 세포들이 상기 여과 장치의 제 1 면에 남도록 하는 효과를 갖는다.
또 다른 선택적 사전 처리는 선택적 세포 용해(selective cellular lysis)를 달성하기 위한 공지의 물질 및 방법을 이용하는 것일 것이다. 이는 본 발명의 장치를 이용하여 더 빨리 또는 더 효율적으로 여과를 할 수 있도록 할 수 있다.
제 1 액체 저장소(17)는 여과 장치(11)와 유체 소통하도록 배치되고 상기 제 2 흡입 수단(21)은 다시 결합되어, 상기 제 1 액체 저장소(17)로부터 유체를 상기 여과 장치(11)를 거쳐 끌어들인다.
이러한 단계는 비-표적 세포가 잔존하는 시스템을 헹굼 또는 세척하는 효과를 갖는다. 제 1 액체 저장소(17)는 상기 여과 장치와의 유체 소통으로부터 제거되고 제 2 액체 저장소(19)는 상기 시스템과 소통하도록 놓여진다. 상기 제 1 흡입 수단(18)이 결합되어, 상기 제 2 액체 저장소(19) 밖으로 상기 여과 장치(11)를 거쳐 유체를 끌어들인다. 이렇게 끌어들여진 유체는 제 1 흡입 저장소(도시되지 않음)에 수거된다.
부분적으로 유체의 흐름으로 인하여, 또한 필터의 진동에 의해 증가되어, 상기 필터의 제 1 면(12)에 남겨진 표적 세포들은 통과하는 유체에 현탁되어 상기 제 1 흡입 저장소로 운반된다. 그 지점에서부터 이들은 직접 관찰 또는 분석, 처리 또는 착색(staining), 또는 다른 장치 또는 저장소로의 이동을 경험할 수 있다.
바람직하게, 제 2 흡입 수단(21)이 상기 제 1 유체 저장소(17)로부터 상기 여과 장치(11)를 거쳐 유체를 끌어들이기 위해 다시 이용되며, 이어서 상기 제 1 흡입 수단(18)이 상기 제 2 유체 저장소(19)로부터 추가 유체를 끌어들인다. 훨씬 더 바람직하게는, 상기 직전에 앞서 언급된 이중 유체 이동 단계는 2회 또는 3회 이상 반복된다. 이러한 교환은 샘플 내 입자들이 필터로부터 완전히 제거되도록 도우며 상기 장치(10)의 내부 성분들을 세척하는 것에 도움을 준다.
제 2 흡입 저장소를 포함하는 본 발명에 따른 장치(10)에 관한 일 실시예에서 수행된 분석은 샘플 내 세포들의 적어도 96%가 상기 제 1 또는 제 2 흡입 저장소에 포획됨을 보여주는데, 이는 장치의 뛰어난 효율성을 시사한다.
실시예 1 적혈구로 오염된 방광 세척
방광 세척은 유기체에서 실행되고, 가능성 있는 현탁된 세포 및 오염물을 갖는 세척액이 수거된다. 착색된 샘플 방울에 대한 예비적 현미경 분석은 풍부한 수의 적혈구 및 소수의 잠재적 표적 세포의 존재를 확인시키며, 도 3을 참조하라. 잔여 샘플은 본 발명의 장치의 샘플 입력 장치에 제공되어 여과된다.
공정 시간은 대략 10분이다. 상기 필터를 거쳐 상기 샘플을 제 1 흡입하는 동안 상기 장치내에서 도달되는 최대 압력은 140 mm H2O 이다. 상기 제 1 흡입 저장소에 포획된 물질은 슬라이드 상에 놓여져서 착색된다. 현미경 검사에 의해, 정제되고 농축된 표적 세포들이 그들의 자연 상태로 용이하게 가시화되며, 도 4를 참조하라.
대조 목적으로, 제 2 흡입 저장소가 이용된다. 상기 제 2 흡입 저장소에 포획되는 물질은 슬라이드 상에 놓여져 착색된다. 현미경 검사에 의하면, 복수의 적혈구 및 상피 세포가 나타난다. 포획된 표적 세포 및 비-표적 세포를 분석한 것에 기초할 때, 표적 세포의 회수 수득율(recovery yield)은 ≥95% 인 것으로 계산된다.
실시예 2 상피 세포로 오염된 복수액
복수액의 샘플을 얻는다. 착색된 유체 방울을 현미경 검사하면, 상당량의 상피 세포 및 소수의 잠재적 표적 세포를 보여준다. 도 5를 참조하라. 10ml의 잔존 샘플을 200ml의 샘플 입력 장치 용기에 넣고 본 발명의 장치를 거쳐 여과시켰다.
공정은 대략 10분 내에 종결되었으며, 그 동안 상기 필터를 거쳐 상기 샘플을 제 1 흡입하는 동안 도달된 최대 압력은 140 mm H2O 이었다. 상기 제 1 흡입 저장소에 포획된 물질은 슬라이드 상에 놓여져서 착색되었다. 현미경 검사에 의해, 정제되고 농축된 표적 세포들이 그들의 자연 상태로 용이하게 가시화되었으며, 도 6을 참조하라.
실시예 3 이중 단계 정제 및 농축
말초혈 세포를 포함하는, 세포 함유 샘플이 제공된다. 상기 세포들은 공지의 기술에 따라 화학적으로 용해된다. 세포 내용물은 본 발명에 따른 장치의 샘플 입력 장치 용기내에 놓여진다.
제 1 공정은 대부분의 세포 이하 성분들(subcellular components)은 자유 통과시키지만 가장 큰 세포핵은 보유하는 구멍을 갖는 필터를 이용하여 수행된다. 이러한 시스템의 작동 후에, 상기 핵은 추후 사용을 위해 한쪽으로 치워 놓고 상기 제 2 흡입 저장소에 수거된 잔여 성분들은 제거된다. 시스템을 사용을 위해 다시 준비시키고 상기 제 2 흡입 저장소에 미리 수거된 성분들을 상기 샘플 입력 장치에 로딩한다.
제 2 공정은, 대부분의 세포 성분들은 자유 통과시키지만, 이 분획으로부터 큰 미토콘드리아는 보유하는 구멍이 제공된 필터로 수행된다. 이 공정에 이어서, 상기 핵, 미토콘드리아 및 상기 제 2 흡입 저장소에 수거된 잔여 성분들을 별도로 분석한다. 이러한 분석은 본 발명의 장치가 유체 샘플의 서로 다른 크기의 성분들을 신속하고 효율적인 방식으로 얻기 위한, 이 경우에는 용해된 세포의 세포 이하 성분들을 얻기 위한, 다단계 분리 계획으로 사용될 수 있음을 확인시켜 준다. 이렇게 분리된 성분들은 그들의 원래 상태였으며 대부분 방해되지 않아서, 원한다면 추가 분석이 가능하도록 한다.
상기 기재 및 실시예는 본 발명을 단지 예시하기 위하여 기술된 것이며 제한하고자 하는 의도는 없다. 본 발명의 정신 및 본질을 포함하는 상기 기재된 실시예들의 변경이 당업자에게 일어날 수 있으므로, 본 발명은 첨부하는 특허청구범위 및 그것의 균등물 범위 내의 모든 변경을 넓게 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
10: 본 발명의 장치
11: 여과 장치
12: 여과 장치의 제 1 면
13: 여과 장치의 제 2 면
14: 튜브
15: 선택 수단
16: 샘플 입력 장치
17: 제 1 액체 저장소
18: 제 1 흡입 수단
19: 제 2 액체 저장소
20: 압력 측정기
21: 제 2 흡입 수단
11: 여과 장치
12: 여과 장치의 제 1 면
13: 여과 장치의 제 2 면
14: 튜브
15: 선택 수단
16: 샘플 입력 장치
17: 제 1 액체 저장소
18: 제 1 흡입 수단
19: 제 2 액체 저장소
20: 압력 측정기
21: 제 2 흡입 수단
Claims (16)
- 제 1 면 및 제 2 면을 갖고 교반기로 구성되는 여과 장치;
상기 여과 장치의 상기 제 1 면과 선택적 유체 소통되는 샘플 입력 장치;
상기 여과 장치의 상기 제 1 면과 선택적 유체 소통되는 제 1 액체 저장소;
상기 여과 장치의 상기 제 2 면과 선택적 유체 소통되는 제 2 액체 저장소; 및
상기 여과 장치의 상기 제 2 면과 선택적 유체 소통되는 제 2 흡입 수단으로 구성되며,
제 1 흡입 저장소를 갖고 상기 여과 장치의 상기 제 1 면과 선택적 유체 소통되는 제 1 흡입 수단; 및
상기 여과 장치의 상기 제 2 면과 유체 소통되고 유동 차단 능력(flow stop ability)을 갖는 압력 측정기가 있는 것을 특징으로 하는, 샘플 정제 및 농축용 장치. - 청구항 1에 있어서, 상기 제 2 흡입 수단은 제 2 흡입 저장소를 갖는 것을 특징으로 하는, 샘플 정제 및 농축용 장치.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 제 1 흡입 수단 및 상기 제 2 흡입 수단 중 적어도 하나는 연동 펌프인 것을 특징으로 하는, 샘플 정제 및 농축용 장치.
- 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 압력 측정기는 상기 장치의 적어도 일 부분에서 유동을 차단 또는 개시할 수 있는 클램프 또는 압전막 중 적어도 하나로 구성되는 것을 특징으로 하는, 샘플 정제 및 농축용 장치.
- 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 교반기는 수평 방향으로 기계적 진동하도록 배치되는 것을 특징으로 하는, 샘플 정제 및 농축용 장치.
- 상기 청구항 중 어느 한 항에 의한 장치에 사용하기 위한 카트리지로서,
제 1 면 및 제 2 면을 갖고 필터로 구성되며 교반기에 연결가능한 여과 장치;
상기 여과 장치의 상기 제 1 면과 유체 소통되는 샘플 입력 튜브;
상기 여과 장치의 상기 제 1 면과 유체 소통되는 제 1 액체 저장소 튜브;
상기 여과 장치의 상기 제 1 면과 유체 소통되는 제 1 흡입 저장소 튜브;
상기 여과 장치의 상기 제 2 면과 유체 소통되는 제 2 액체 저장소 튜브; 및
상기 여과 장치의 상기 제 2 면과 유체 소통되는 제 2 흡입 튜브로 구성되며,
상기 카트리지는 압력 측정기에 대한 적어도 하나의 접근 지점을 갖는 것을 특징으로 하는 카트리지. - 청구항 6에 있어서, 상기 여과 장치는 교반기로 구성되는 것을 특징으로 하는 카트리지.
- 청구항 7에 있어서, 상기 교반기는 수평 방향으로 기계적 진동하도록 배치되는 것을 특징으로 하는 카트리지.
- 샘플을 필터의 제 1 면과 유체 소통되는 샘플 입력 장치로 제공하고;
소정의(pre-determined) 압력이 측정될 때까지 상기 필터를 거쳐 상기 샘플 입력 장치로부터 유체를 끌어들이기 위하여 필터의 제 2 면에 흡입 적용하고;
상기 필터의 상기 제 2 면을 액체를 함유하는 저장소와 독점적 유체 소통되도록 배치하고;
상기 필터를 거쳐 상기 저장소로부터 유체를 끌어들이기 위하여 상기 필터의 상기 제 1 면에 흡입 적용하고;
상기 필터를 거쳐 상기 저장소로부터 끌어들여진 유체를 용기에 수거하는 단계로 구성되는 샘플을 정제하는 방법으로서,
상기 필터는 상기 공정의 적어도 상당 부분 동안 교반되며,
상기 정제된 샘플은 상기 용기에 수거되는, 샘플 정제 방법. - 청구항 9에 있어서, 상기 소정의 압력은 물기둥을 이용하여 측정시, 약 130-150, 바람직하게는 135-145 mm H2O 범위인 것을 특징으로 하는 샘플 정제 방법.
- 청구항 10에 있어서, 상기 소정의 압력은 물기둥을 이용하여 측정시, 약 140 mm H2O 인 것을 특징으로 하는 샘플 정제 방법.
- 청구항 9 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 교반은 수평 방향으로의 기계적 진동인 것을 특징으로 하는 샘플 정제 방법.
- 청구항 9 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수거 단계 이후에 아래의 이중 유체 이동 단계:
상기 필터의 상기 제 1 면을 액체를 함유하는 제 1 유체 저장소와 독점적 유체 소통되도록 배치하고;
상기 필터를 거쳐 상기 제 1 유체 저장소로부터 유체를 끌어들이기 위하여 필터의 상기 제 2 면에 흡입 적용하고;
상기 필터의 상기 제 2 면을 액체를 함유하는 제 2 저장소와 독점적 유체 소통되도록 배치하고;
상기 필터를 거쳐 상기 제 2 저장소로부터 유체를 끌어들이기 위하여 상기 필터의 상기 제 1 면에 흡입 적용하고;
상기 필터를 거쳐 상기 제 2 저장소로부터 끌어들여진 유체를 용기에 수거하는, 이중 유체 이동 단계가 적어도 한 번 이어지는 것을 특징으로 하는 샘플 정제 방법. - 청구항 9 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 생물학적 샘플인 것을 특징으로 하는 샘플 정제 방법.
- 청구항 14에 있어서, 상기 샘플은 순환종양세포로 구성되는 것을 특징으로 하는 샘플 정제 방법.
- 청구항 9 내지 15 중 어느 한 항의 방법에 의하여 정제된 샘플로서, 상기 샘플은 소정 압력에 의하여 정규화되는 것을 특징으로 하는 샘플.
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