KR20120100886A - 자가포식의 효능 있는 소분자 억제제 및 이의 사용 방법 - Google Patents

자가포식의 효능 있는 소분자 억제제 및 이의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 특정 측면은 소분자 자가포식(autophagy) 억제제, 및 암 및 급성 췌장염을 치료 및 예방하기 위한 이들의 용도에 관한 것이다. 본원에 개시된 대로, 자가포식의 소분자 억제제는 공지된 생물활성 라이브러리에서 이미지-기반 스크린으로부터 확인되었다. 이러한 자가포식 억제제는 자가포식을 개시하는데 필요한 타입 Ⅲ PI3 키나아제 복합체의 분해를 촉진함에 의해 작용하는 것으로 밝혀졌다. 의약 화학 연구로부터 개선된 효능과 선택성을 지닌 소분자 자가포식 억제제를 수득하였다.

Description

자가포식의 효능 있는 소분자 억제제 및 이의 사용 방법{POTENT SMALL MOLECULE INHIBITORS OF AUTOPHAGY AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원
본 출원은 2010년 1월 20일 출원된 미국 가특허출원 61/296,735호 및 2009년 7월 21일 출원된 미국 가특허출원 61/227,164호의 이익을 주장하고, 상기 두 특허의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
정부 지원
본 발명은 미국국립보건원에 의해 부여된 PO1 AG027916, R37 AG012859 및 DP1 OD000580하에 정부 지원이 이루어졌다. 정부는 본 발명의 일정 권리를 소유한다.
타입 Ⅲ PtdIns3 키나아제 (포스파티딜이노시톨 3-키나아제)인 Vps34 (액포 단백질 분리 34)는 효모에서 액포 하이드롤라제 분리의 조절제로서 최초로 확인되었다 (Herman and Emr, 1990). Vps34는 구체적으로 포스파티딜이노시톨의 이노시톨 고리상에서 D-3 위치를 인산화시켜 (PtdIns) PtdIns3P를 생산한다 (Schu, P.V., Takegawa, K., Fry, M.J., Stack, J.H., Waterfield, M.D., and Emr, S.D. (1993) Phosphatidylinositol 3-kinase encoded by yeast VPS34 gene essential for protein sorting. Science 260, 88-91). PtdIns3P는 엔도좀에서 리소좀으로 운반, 골지 트래픽으로 엔도좀 역행, 다소포체 형성 및 자가포식(autophagy)을 포함하는 다수의 중요한 세포내 막 트래피킹(trafficking) 경로의 조절에 관련되어 왔다 (Herman, P.K., and Emr, S.D. (1990). Characterization of VPS34, a gene required for vacuolar protein sorting and vacuole segregation in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 10, 6742-6754; Kihara, A., Noda, T., Ishihara, N., and Ohsumi, Y. (2001). Tow distinct Vps34 phosphatidylinositol 3-kinase complexes function in autophagy and carboxypeptidase Y sorting in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol 152, 519-530). PtdIns3P는 소기관 및 거대 단백질 복합체의 턴오버(turnover)에 수반되는 진화론적으로 보존된 이화작용 메커니즘인 자가포식의 개시에 요구된다.
Vps34는 효모에서 두 개의 복합체로 존재한다: 자가포식에 수반되는 복합체 I (Vps34, Vps15, Vps30/Atg6, 및 Atg14), 및 액포 단백질 분리 경로에서의 복합체 II (Vps34, Vps15, Vps30/Atg6, and Vps38)(Kihara et al., 2001, 상기 인용됨). 포유동물 세포에서, Vps34는 효모에서의 이들의 동종 복합체와 유사하게 기능할 수 있는 두 개 이상의 단백질 복합체, Vps34 복합체 I 및 Vps34 복합체 II에서 발견된다. 두 개의 포유동물 Vps34 복합체는 각각 효모 Vps34, Vps30/Atg6 및 Vps15와 동종인 Vps34, 베클린(Beclin)1 및 p150의 코어 성분을 공유한다. 또한, 복합체 I은 기아 동안 분리 막/포식소체에 국한되고 자가포식소체 형성에 필수적인 효모 Atg14의 포유동물 오솔로그(ortholog)인 Atg14L을 함유하는 반면, 복합체 II는 후기 엔도좀에 주로 국한된 효모의 Vps38의 호몰로그인 UVRAG을 함유한다 (Itakura, E., Kishi, C., Inoue, K., and Mizushima, N. (2008). Beclin 1 forms two distinct phosphatidylinositol 3-kinase complexes with mammalian Atg14 and UVRAG. Mol Biol Cell 19, 5360-5372; Liang, C., Feng, P., Ku, B., Dotan, I., Canaani, D., Oh, B.H., and Jung, J.U. (2006). Autophagic and tumour suppressor activity of a novel Beclin1-binding protein UVRAG. Nat Cell Biol 8, 688-699; Matsunaga, K., Saitoh, T., Tabata, K., Omori, H., Satoh, T., Kurotori, N., Maejima, I., Shirahama-Noda, K., Ichimura, T., Isobe, T., et al. (2009). Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat Cell Biol 11, 385-396.; Zhong, Y., Wang, Q.J., Li, X., Yan, Y., Backer, J.M., Chait, B.T., Heintz, N., and Yue, Z. (2009). Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex. Nat Cell Biol 11(4), 468-476). 흥미롭게도, Vps34 복합체의 상이한 성분들의 안정성은 서로에 대해 상호-의존적인데, 그 이유는 한 성분의 녹다운(knockdown)이 종종 복합체에 있는 다른 성분의 수준을 감소시키기 때문이다 (Itakura et al., 2008, 상기 인용됨). 그러나, 다수의 소포 트래피킹 경로를 조절함에 있어서 중요한 역할을 할 수 있는 Vps34 복합체의 안정성을 조절하는 메커니즘에 대해서는 여전히 어느 것도 거의 알려져 있지 않다.
자가포식은 리소좀-의존성 방식으로 세포내 구성성분들의 턴오버를 매개하는 이화작용 과정이다 (Levine, B., and Klionsky, D.J. (2004). Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev Cell 6, 463-477). 자가포식은 자가포식소체라고 명명된 이중막 소포를 형성함으로써 거대 단백질 복합체 및 결함이 있는 소기관을 포함하는 세포질의 탐식(engulf) 부분까지 연장되는 분리 막의 형성에 의해 개시된다. 자가포식소체의 내용물은 리소좀과의 융합 후 리소좀의 하이드롤라제에 의해 분해되어 자가포식소체를 형성한다. 자가포식은 기아 조건에서 살아남기 위한 전략으로서 단세포 진핵생물에서 광범하게 연구되었는데, 그 이유는 유리 아미노산, 지방산 및 뉴클레오티드와 같은 자가포식성 분해의 생성물을 세포가 빌딩 블록 또는 에너지원으로서 이용할 수 있어서 영양소 제한적인 조건하에서 살아남는데 도움이 되기 때문이다 (Levine, B., and Klionsky, D.J. (2004). Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev Cell 6, 463-477; and Levine, B., and Kroemer, G. (2008). Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell 132, 27-42).
자가포식의 코어 분자의 구조는 효모에서 포유동물로 진화론적으로 보존된 ATG 유전자의 그룹에 의해 엔코딩된 단백질 생성물에 의해 조절된다. 자가포식성 소체의 핵형성은 베클린 1 (효모 Atg6의 포유동물 호몰로그) 및 Vps34 뿐만 아니라 자가포식소체의 형성을 매개하는데 있어서 연속적으로 기능하는 두 개의 유비퀴틴-유사 분자인 Atg12 및 LC3 (Atg8의 호몰로그)을 포함하는 타입 Ⅲ PI3 키나아제 복합체의 생성물인 PtdIns3P을 필요로 한다. 첫 번째 유비퀴틴화-유사 반응에서, Atg12는 Atg5와 컨쥬게이션되어 거대 다합체 단백질 복합체를 형성하는데, 이 단백질이 자가포식소체의 핵형성을 결정하는데 중요한 역할을 한다. 두 번째 반응에서, LC3은 포스파티딜-에탄올아민과 컨쥬게이션되어 자가포식소체의 연장 및 폐쇄에 중요한 막 전위를 초래한다 (Fujita, N., Itoh, T., Omori, H., Fukuda, M., Noda, T., and Yoshimori, T. (2008). The Atg16L Complex Specifies the Site of LC3 Lipidation for Membrane Biogenesis in autophagy. Mol Biol Cell 19, 2092-2100; and Levine, B., and Kroemer, G. (2008). Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell 132, 27-42).
후생동물에서 자가포식은 기능부전, 노화 또는 손상된 단백질 및 소기관의 턴오버를 매개함에 의해 세포의 항상성에 관여하는 필수적인 세포내 이화작용 메커니즘으로서 기능한다 (Levine, B., and Kroemer, G. (2008). Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell 132, 27-42). 자가포식의 하향 조절은 미스폴딩된 단백질의 축적을 증가시킴에 의해 신경퇴행의 원인이 된다 (Hara, T., Nakamura, K., Matsui, M., Yamamoto, A., Nakahara, Y., Suzuki-Migishima, R., Yokoyama, M., Mishima, K., Saito, I., Okano, H., et al. (2006). Suppression of basal autophagy in neural cells causes neurodegenerative disease in mice. Nature 441, 885-889; and Komatsu, M., Waguri, S., Chiba, T., Murata, S., Iwata, J., Tanida, I., Ueno, T., Koike, M., Uchiyama, Y., Kominami, E., et al. (2006). Loss of autophagy in the central nervous system causes neurodegeneration in mice. Nature 441, 880-884). 자가포식은 또한 단백질 손상을 포함하는 영양소 기아, ER 스트레스 및 세포내 병원체의 침습 이외의 다수 형태의 세포 스트레스에 반응하여 활성화될 수 있고, 선천성 및 후천성 면역 둘 모두뿐 아니라 (Schmid, D., Dengjel, J., Schoor, O., Stevanovic, S., and Munz, C. (2006). Autophagy in innate and adaptive immunity against intracellular pathogens. J Mol Med 84, 194-202) 종양 억제 (Liang, X.H., Jackson, S., Seaman, M., Brown, K., Kempkes, B., Hibshoosh, H., and Levine, B. (1999). Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin 1. Nature 402, 672-676)에도 관여하는 것으로 나타났다. 포유동물 세포에서 자가포식을 조절하는 메커니즘은 이제 막 탐구되기 시작했다.
자가포식은 세포 항상성을 조절하는데 중요한 역할을 하고 세포 생존, 성장, 분화 및 숙주 방어 반응에 기여한다. 자가포식의 탈조절은 암, 신경퇴행, 염증 질환 및 감염성 질환을 포함하는 다수의 인간 질환에 관련되어 왔다. 현재 자가포식에 대한 지식의 대부분은 자가포식 "Atg" 유전자를 확인시켜준 효모에서의 정밀한 유전자 연구에서 비롯되었다. 최근의 연구들은 효모에서 포유동물로의 코어 자가포식 유전자의 진화론적 보존을 입증하였으나, 포유동물 자가포식의 메커니즘 및 조절은 여전히 극히 알려지지 않은 복잡성의 현저한 증가를 나타내었다.
자가포식은 암의 발생 및 치료에서 복잡한 역할을 담당한다고 제안되었다. 자가포식의 활성화는 대사 스트레스하에 종양 세포 생존을 촉진시키고 괴사성 세포 사멸 및 종양 성장에 유리한 후속적인 염증을 억제함에 의해 종양 억제 메커니즘으로서 기능한다 (White, E. (2008). Autophagic cell death unraveled: Pharmacological inhibition of apoptosis and autophagy enables necrosis. Autophagy 4, 399-401). 반면, 자가포식의 억제는 공지되지 않은 메커니즘을 통해 유전체 불안정성의 원인이 될 수 있는데, 이는 다수의 암 라인(line)에서의 베클린 1 이형접합성의 증가된 빈도와 (Qu, X., Yu, J., Bhagat, G., Furuya, N., Hibshoosh, H., Troxel, A., Rosen, J., Eskelinen, E.L., Mizushima, N., Ohsumi, Y., et al. (2003). Promotion of tumorigenesis by heterozygous disruption of the beclin 1 autophagy gene. J Clin Invest 112, 1809-1820; and Yue, Z., Jin, S., Yang, C., Levine, A.J., and Heintz, N. (2003). Beclin 1, an autophagy gene essential for early embryonic development, is a haploinsufficient tumor suppressor. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 15077-15082) 악성 상피 난소암에서 자가포식-관련 단백질의 감소된 발현을 설명할 수 있다 (Shen, Y., Li, D.D., Wang, L.L., Deng, R., and Zhu, X.F. (2008). Decreased expression of autophagy-related proteins in malignant epithelial ovarian cancer. Autophagy 4, 1067-8). 따라서, 자가포식의 만성 발현은 종양형성을 자극할 수 있다.
항암 요법에서 제안된 자가포식의 역할은 종양형성 동안의 역할과 반대된다. 일단 종양이 형성되면, 자가포식의 급성 억제가 방사선감작 및 화학감작을 촉진함에 의한 치료적 목적에 유리할 수 있다 (Amaravadi, R.K., and Thompson, C.B. (2007). The roles of therapy-induced autophagy and necrosis in cancer treatment. Clin Cancer Res 13, 7271-7279). 암 요법의 동물 모델에서, 주요 자가포식 유전자 ATG5에 대한 shRNA 또는 항말라리아 약물 클로로퀸을 이용한 요법-유도 자가포식의 억제는 종양 세포 사멸을 유도하기 위해 활성화된 p53 또는 알킬화 화학요법제가 사용된 Myc-유래 종양의 세포 사멸 및 종양 회귀를 향상시켰다(Amaravadi, R.K., Yu, D., Lum, J.J., Bui, T., Christophorou, M.A., Evan, G.I., Thomas-Tikhonenko, A., and Thompson, C.B. (2007). Autophagy inhibition enhances therapy-induced apoptosis in a Myc-induced model of lymphoma. J Clin Invest 117, 326-336). 클로로퀸은 거대한 자가포식성 소포의 용량 의존적 축적을 야기시키고, ATG5의 녹다운과 유사한 정도로 알킬화 요법-유래 세포 사멸을 향상시킨다. 또 다른 예에서, TRAIL에 대한 내성이 억제를 위해 베클린1 또는 Vps34와 같은 자가포식 과정의 특수한 성분들을 표적화하는 일반적인 접근법에 의해 역전되는 것으로 나타났다 (Hou, W., Han, J., Lu, C., Goldstein, L.A., and Rabinowich, H. (2008). Enhancement of tumor-TRAIL susceptibility by modulation of autophagy. Autophagy 4, 940-943). 만성 골수성 백혈병(CML)의 경우, 클로로퀸에 의한 자가포식의 억제는 이마티니브(imatinib)에 의해 유도된 CML 세포주 K562의 사멸을 현저히 향상시켰다. 또한, 이마티니브 내성 세포주 BaF3/T315I 및 BaF3/E255K는 이마티니브 및 클로로퀸을 이용한 공동치료에 의해 사멸이 유도될 수 있다. 따라서, 자가포식의 억제는 아미티니브 유도된 세포 사멸에 대해 종양 세포를 감작시킨다. 자가포식의 차단은 CML의 치료를 위한 새로운 전략으로서 제안되었다 (Mishima, Y., Terui, Y., Taniyama, A., Kuniyoshi, R., Takizawa, T., Kimura, S., Ozawa, K., and Hatake, K. (2008). Autophagy and autophagic cell death are next targets for elimination of the resistance to tyrosine kinase inhibitors. Cancer Sci 99, 2200-8). 이러한 연구들은 자가포식이 DNA-손상 요법에 대한 내성을 촉진시킬 수 있다고 제안한다. 클로로퀸이 리소좀의 차단제이기 때문에, 자가포식 과정의 상이한 단계를 표적화하는 특수한 억제제가 세포 기반 검정 및 동물 모델에서 화학요법의 효과를 향상시키는 데에도 동일한 효과를 지닐 지에 관심이 생길 것이다.
또한, 자가포식은 급성 췌장염에 의해 유도된 세포 손상을 매개하는데 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 조숙하게 활성화된 그 자신의 소화 프로테아제에 의한 췌장의 자가소화가 급성 췌장염의 발생에 중요한 것으로 생각된다. 췌장 선포세포(pancreatic acinar cell)에서 자가포식관련 (Atg) 유전자 Atg5가 결여된 조건 녹아웃(knockout) 마우스는 현저하게 감소된 세룰레인(cerulein)에 의해 유도된 급성 췌장염의 중증도를 나타내었다 (Ohmuraya, M., and Yamamura, K. (2008). 자가포식 and acute pancreatitis: a novel autophagy theory for trypsinogen activation. Autophagy 4, 1060-1062). 따라서, 자가포식은 트립시노겐의 트립신으로의 활성화에 의해 췌장 선포세포에서 유해한 효과를 발휘한다. 자가포식의 억제제는 급성 췌장염에 대한 중요한 새로운 치료제를 제공할 수 있다.
추가로, 소분자 억제제는 포유동물 세포에서 세포의 메커니즘을 탐구하는데 있어서 중요한 도구이다. 그러나, 이용가능한 자가포식의 소분자 억제제는 단지 3-메틸아데닌 (3-MA)이며, 이것은 약 10 mM의 작업 농도를 지니고 매우 비특이적이다. 따라서, 포유동물 세포에서 자가포식의 연구를 용이하게 하는데 이용될 수 있는 고도로 특이적인 소분자 도구를 개발하고자 하는 긴급한 요구가 있어 왔다.
발명의 개요
본 발명은 부분적으로 자가포식의 억제제인 화합물, 이러한 화합물을 포함하는 조성물, 및 이러한 화합물 및 조성물을 이용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 측면은 하기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 생물학적 활성 대사물, 용매화물, 수화물, 프로드럭, 거울상이성질체 또는 입체이성질체에 관한 것이다:
Figure pct00001
상기 식에서,
n은 0, 1, 2, 3 또는 4이고;
Y는 -C(R1)= 또는 -N=이고;
R은 -H, 저급 알킬, -NO2, -OH, -NH2, -NH(저급 알킬), -N(저급 알킬)2, 또는 저급 알키닐이고;
R1은 각각의 경우에 -H, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, -OH, -NH2, -NH(저급 알킬), -N(저급 알킬)2, -CH3, -CF3, -C(=O)(저급 알킬), -CN, -O(저급 알킬), -O(저급 플루오로알킬), -S(=O)(저급 알킬), -S(=O)2(저급 알킬) 및 -C(=O)O(저급 알킬)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R2 및 R3은 -H, 저급 알킬, 저급 플루오로알킬, 저급 알키닐 및 저급 히드록시알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
X는 -O-, -S-, -N(H)-, -N(저급 알킬)-, -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2- 또는 -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-이고;
Z는 페닐, 피리딜, 비닐, 모르피닐, 페난트롤리닐, 나프틸, 푸릴 또는 벤조[d]티아졸릴이고; -CH3, 저급 알킬, 플루오로알킬, -OCH3, -OCF3, 저급 플루오로알콕시, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, 저급 알키옥시, -NH(저급 알킬), -N(저급 알킬)2, -CF3, 및 3,4-메틸렌 디옥시로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되거나 치환되지 않는다.
본 발명의 또 다른 측면은 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 생물학적 활성 대사물, 용매화물, 수화물, 프로드럭, 거울상이성질체 또는 입체이성질체, 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 그러한 약학적 조성물은 전형적으로 암 또는 췌장염과 관련된 질환 및 질병의 치료 또는 예방을 위한 치료 계획의 일부로서 본 발명의 방법에 따라 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 치료적 유효량의 본 발명의 하나 이상의 화합물 또는 조성물을 이를 필요로 하는 피검체에게 투여하는 것을 포함하는, 암, 췌장염 또는 세포내 병원체에 의해 야기된 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 이미지-기반 스크린에 의한 자가포식의 소분자 억제제의 확인에 관한 것이다. A, MBCQ의 구조. B, 세포당 LC3-GFP 스폿 수 (a), 세포당 스폿 크기 (b), 세포당 세포 세기 (c)의 정량 분석. 데이터를 대조군 비히클 처리된 세포의 %로서 나타내었다. H4-LC3 세포를 96웰 플레이트에 시딩하고, 10μM의 MBCQ와 함께 또는 이것 없이, 비히클 대조군 (1% DMSO), 0.2μM 라파마이신과 함께 지시된 시간 동안 인큐베이션하고, 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI, 3㎍/ml)로 염색하였다. 각각의 화합물 처리에 대한 1000개 세포의 이미지를 20x 대물렌즈를 구비한 ArrayScan HCS 4.0 리더 (Cellomics, Pittsburgh, Pennsylvania)로 분석하였다.
도 2는 기아에 의해 유도된 자가포식의 MBCQ 억제에 관한 결과를 도시한다. HCS를 이용하여 세포당 LC3-GFP 스폿 수 (a), 세포당 스폿 크기 (b) 및 세포당 스폿 세기 (c)를 정량 측정하고 대조군의 %로서 나타내었다. 3-MA (10mM) 또는 워트만닌(wortmannin) (0.1μM)을 포지티브 대조군으로서 이용하였다.
도 3은 자가포식에 대한 MBCQ의 효과의 전자 현미경 분석을 도시한다. H4 세포를 0.1% DMSO (비히클), 라파마이신 (0.2μM), MBCQ (10μM), 또는 MBCQ과 라파마이신으로 4시간 동안 처리하였다. 세포를 프로세싱하고 EM에 의해 이미지화하였다.
도 4는 MBCQ 유도체를 생성하기 위한 접근법을 도시한다.
도 5는 MBCQ의 활성 유도체가 MEF 세포에서 LC3II의 수준을 감소시킴을 나타낸 것과 관련된 결과를 도시한다. A, MEF 세포를 DMSO (1‰), 라파마이신 (0.2μM) 단독이나 MBCQ (10μM), C43 (스파우틴(spautin)) (10μM) 또는 C71 (10μM)와 함께 4시간 동안 처리하였다. 세포 용해물을 항-LC3 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅을 위해 수집하였다. B, MEF 세포 상에서 C43(스파우틴)의 자가포식 억제 효과의 전자 현미경 확인. MEF 세포를 비히클 대조군 (1‰ DMSO), 및 다른 지시된 화합물로 4시간 동안 처리하였다. 라파마이신 (0.2μM) 및 C43 (스파우틴) (10μM). 그 후, 세포를 글루타르알데히드로 고정하고 EM 검정을 위한 샘플을 제조하였다. 바(Bar), 1:11,000. 화살표는 이중 및 다중-막의 자가포식소체성 소포를 나타낸다. N：핵.
도 6은 MBCQ가 H4 세포 성장에 거의 영향을 미치지 않음을 나타내는 결과를 도시한다. A, H4 세포를 MBCQ (5μM)로 5일간 처리하고 트립판 블루의 존재하에 세포 수 계수를 위해 매일 회수하였다; B, H4 세포를 MBCQ (5μM)로 24시간 및 48시간 동안 처리한 다음, 세포를 70% 에탄올에 고정시키고, 요오드화프로피듐 (40㎍/mL)으로 염색하고, RNase (200㎍/mL) 용액과 함께 30분간 인큐베이션하였다. 세포 주기 프로파일 및 가능한 아폽토틱(apoptotic) 세포 사멸을 흐름세포측정기에 의해 분석하였다.
도 7은 MBCQ 및 C43 (스파우틴)이 에토포시드에 의해 유도된 bax/bak DKO 세포의 세포사멸을 부분적으로 억제함을 나타내는 결과를 도시한다. A-C, Bax/bak DKO 세포를 에토포시드 (8μM)의 존재 또는 부재하에 MBCQ (10μM) 또는 3-MA (10 mM)로 8시간 또는 24시간 동안 처리하였다. A, 이미지에 의해 입증된 세포 생존. B, MTT 검정에 의해 입증된 세포 생존. C, 세포를 항-LC3 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅을 위해 수집하였다. α-튜불린을 대조군으로서 이용하였다. D-F, Bax/bak DKO 세포를 스파우틴 (10μM)으로 처리하거나 에토포시드 (8μM)의 존재 또는 부재하에 8시간 동안 지시된 농도로 처리하거나 지시된 시간 동안 처리하였다. D, 이미지에 의해 입증된 세포 생존 및 E, MTT 검정에 의해 입증된 세포 생존. F, 세포를 항-LC3 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅을 위해 수집하였다. α-튜불린을 대조군으로서 이용하였다.
도 8은 MBCQ 및 C43 (스파우틴)이 FYVE-RFP 스폿을 감소시키나 FYVE-RFP의 단백질 수준에는 아무런 영향을 미치지 않음을 나타내는 결과를 도시한다. H4-FYVE 세포를 DMSO (0.1%), MBCQ (10μM) 또는 C43 (스파우틴) (10μM)으로 지시된 시간 동안 처리하였다. A, 4% 파라포름알데히드에 고정시킨 후에 이미지를 형광 현미경으로 분석하고 HCS에 의해 정량하고 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI, 3㎍/mL)로 염색하였다. 각 화합물 처리에 대한 1000개 세포의 이미지를 20x 대물렌즈가 장착된 ArrayScan HCS 4.0 리더 (Cellomics, Pittsburgh, Pennsylvania)에 의해 분석하였다. B, H4-FYVE 세포를 DMSO (0.1%), RAPA (0.2μM) 단독, RAPA (0.2uM)과 함께 또는 이것 없이 MBCQ (10μM) 또는 C43 (스파우틴) (10μM)으로 8시간 동안 처리하였다. 세포 용해물을 항-RFP 및 항-튜불린을 로딩 대조군으로서 이용하여 웨스턴 블롯팅을 위해 수집하였다.
도 9는 MBCQ 및 C43 (스파우틴)이 PtdIns3P의 세포 수준을 선택적으로 감소시킴을 나타내는 결과를 도시한다. MEF 세포를 DMSO (0.1%), RAPA (0.2μM) 단독, A, MBCQ (10μM) 또는 B, RAPA (0.2μM)와 함께 또는 이것 없이 C43 (스파우틴) (10μM)으로 3시간 동안 처리하였다. 세포의 PtdIns 종들을 추출하고 폴리비닐리덴 플루오라이드 막 상에 적용시켰다. PtdIns3P의 수준을 GST-PX 도메인 단백질 및 항-GST 항체를 이용하여 검출하였다.
도 10은 C43 (SPAYTIN) 및 이의 활성 유도체가 베클린1/Vps34/p150 복합체의 분해를 선택적으로 촉진함을 나타내는 결과를 도시한다. A, C43 (스파우틴)은 Vps34 효소 활성의 직접적인 억제제가 아니다. 293T로부터 항-HA를 이용하여 면역침전된 외인성 HA-Vps34 복합체를 32P-ATP의 존재하에 그리고 지시된 농도의 C43 (스파우틴) 및 워트만닌 (10 uM)의 존재 또는 부재하에 10분간 실온에서 PtdIns와 함께 인큐베이션하였다. 생성물을 박막 크로마토그래피 및 오토라디오그래피에 의해 분석하였다. 레인 1에서, 반응 완충제를 Vps34/베클린-1 복합체 대신 네거티브 대조군으로서 이용하였다. B, MBCQ, C29 및 C43 (스파우틴)의 처리는 외인성 Vps34 및 베클린1의 수준을 감소시켰다. 293T 세포를 HA-Vps34 및 flag-베클린1 발현 벡터로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션한 지 24시간 후에, 세포를 지시된 화합물로 12시간 동안 처리하였다. 세포 용해물을 항-HA, 항-flag 또는 항-튜불린을 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. C, MBCQ 및 C43 (스파우틴)은 GFP-P150 단백질의 수준을 감소시켰다. 293T 세포를 GFP-P150 벡터로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션한 지 24시간 후에, 세포를 MBCQ (10μM), C43 (스파우틴) (10μM)으로 추가로 4시간 동안 처리하였다. 세포 용해물을 항-GFP 또는 항-튜불린을 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. D, MBCQ 및 C43 (스파우틴)은 myc-Atg14 단백질의 수준을 감소시켰다. 293T 세포를 myc-Atg14 벡터로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션한 지 24시간 후에, 세포를 MBCQ (10μM), C43 (스파우틴) (10μM)로 추가로 4시간 동안 처리하였다. 세포 용해물을 항-myc 또는 항-튜불린을 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. E, H4 세포를 C43 (스파우틴) (10μM) 또는 3-MA(10 mM)와 함께 또는 이것 없이 라파마이신 (0.2μM)으로 4시간 동안 처리하였고, DMSO (1‰)를 네거티브 대조군으로서 이용하였다. 세포 용해물을 회수하고, 항-베클린1, 항-Atg14, 항-Vps34 및 항-UVRAG를 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 항-α 튜불린을 로딩 대조군으로서 사용하였다. F, 293T 세포를 CHX의 존재하에 MBCQ 또는 스파우틴으로 처리하여 지시된 시간 동안 단백질 합성을 억제하였고, 세포 용해물을 항-베클린1을 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. CHX (5μM), MBCQ (10μM), C43 (스파우틴) (10 μM). G, H4 세포를 스파우틴 (10μM) 또는 3-MA (10mM)와 함께 또는 이것 없이 라파마이신 (0.2μM)으로 4시간 동안 처리하였고, DMSO (1‰)를 네거티브 대조군으로서 이용하였다. 세포 용해물을 회수하고, 항-베클린1 및 항-LC3를 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 항-α-튜불린을 로딩 대조군으로서 이용하였다. H-M, 293T 세포를 지시된 벡터로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션한 지 24시간 후에, 세포를 MBCQ (10μM), C43 (스파우틴) (10μM) 또는 라파마이신 (0.2μM)으로 추가로 4시간 동안 처리하였다. 세포 용해물을 지시된 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.
도 11은 선택된 암세포주가 글루코스가 없는 조건하에 MBCQ 및 이의 활성 유도체에 민감함을 나타내는 결과를 도시한다. BT549 세포를 정상 DMEM (A) 또는 혈청이 없는 조건 (B)하에 24시간 동안 지시된 농도의 C43으로 처리하였다. 세포 생존력을 MTT에 의해 검정하거나 항-LC3 (C)을 이용한 웨스턴 블롯팅 검정을 위해 회수하였다. MCF-7 세포를 글루코스와 함께 (D) 또는 글루코스 없이 (E) DMEM에서 DMSO (1‰), C43(10μM)으로 12시간 동안 처리하였다. 세포 생존력을 MTT 또는 이미지(F)에 의해 검정하였다. 그리고 세포 용해물을 항-LC3을 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였고, α-튜불린을 로딩 대조군(G)으로서 이용하였다. Bcap-37 세포를 정상 DMEM (H) 또는 혈청이 없는 조건(I)하에 24시간 동안 지시된 농도의 C43으로 처리하였다. 세포 생존력을 MTT 또는 이미지(J)에 의해 검정하였다. 그리고 세포 용해물을 C43으로 지시된 시간 동안 처리하고 항-PARP (L) 또는 항-LC3 (M)을 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였고, α-튜불린을 로딩 대조군(K)으로서 이용하였다. C43으로 처리된 Bcap-37의 세포 주기 프로파일. Bcap-37 세포를 DMSO (0.1%) (왼쪽 도면), C43 (10μM) (오른쪽 도면)으로 12시간 동안 처리하였다. 그 후, 세포를 70% 에탄올로 고정하고, 요오드화프로피듐 (PI, 40㎍/mL)으로 염색하고, RNase 효소 (200㎍/mL) 용액으로 30분간 암실에서 처리하였다. 세포 주기 프로파일 및 가능한 아폽토틱 사멸을 흐름세포측정기에 의해 통계 분석하였다.
도 12는 스파우틴이 비-암세포에서 아폽토시스를 유도하지 않음을 나타내는 실험 결과를 도시한다. A-B, MDCK 세포를 글루코스와 함께 또는 글루코스 없이 DMEM에서 DMSO (1‰) 및 지시된 농도의 스파우틴으로 24시간 동안 처리하였다. 이미지 (A) 및 MTT 검정 (B)에 의해 입증된 세포 생존. C-D, Hs578Bst 세포를 글루코스와 함께 또는 글루코스 없이 DMEM에서 DMSO (1‰) 및 지시된 농도의 C43으로 24시간 동안 처리하였다. 이미지 (C) 및 MTT 검정 (D)에 의해 입증된 세포 생존.
도 13은 생체내에서 MBCQ 및 유도체의 효과를 나타내는 결과를 도시한다. (A) 마우스에게 라파마이신 (10 mg/kg)을 포지티브 대조군으로서 단독으로, 또는 C43 또는 MBCQ (40 mg/kg)와 함께 4시간마다 복강내 주입한 후 다섯번째 시간에 치사시켰다. 간에서의 자가포식 수준을 항-LC3 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. (B) C43은 세룰레인에 의해 유도된 자가포식의 수준을 감소시켰다. 래트에게 세룰레인 (50 ㎍/kg)을 단독으로 또는 C43 (40 mg/kg)와 함께 한 시간마다 4회 동안 복강내 주입하였다. 마지막 주입하고 한 시간 후에 래트를 치사시키고 항-LC3 및 항-튜불린 (대조군으로서)을 이용한 웨스턴 블롯팅 분석을 위해 췌장을 분리하였다.
도 14는 자가포식을 억제할 수 있는 MBCQ 유도체를 도시한다. EC50을 계산하기 위해, H4-LC3 세포를 96웰 플레이트에 시딩하고 상이한 농도의 화합물의 존재하에 24시간 동안 배양시킨 후, 폴리포르메이트로 고정시키고, 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI, 3 ㎍/ml)로 염색하였다. 20x 대물렌즈를 구비한 ArrayScan HCS 4.0 리더 (Cellomics, Pittsburgh, Pennsylvania)를 이용하여 자가포식용 마커인 DAPI 표지된 핵 및 GFP-LC3에 대해 이미지 데이터를 수집하였다. 최적화 후 스폿 디텍터 바이오-어플리케이션을 이용하여 이미지를 획득하고 분석하였다. 각각의 화합물 처리에 대한 1000개 세포의 이미지를 분석하여 필드당 평균 세포 수, 형광성 스폿 수, 면적 및 세포당 세기를 수득하였다. DMSO 및 라파마이신을 각각 네거티브 또는 포지티브 대조군으로서 이용하였다. LC3-GFP의 변화 백분율을, DMSO 처리된 샘플들의 것으로 나눔에 의해 계산하였다. 각각의 처리는 평균 및 SD를 위해 3개로 수행되었다. 또한 이미지를 시진용의 통상적인 형광 현미경을 이용하여 분석하였다. 실험을 3회 반복하였다.
도 15는 자가포식을 억제하기에 감소된 능력을 지니거나 전혀 능력이 없는 MBCQ 유도체를 도시한다. EC50을 계산하기 위해, H4-LC3 세포를 96웰 플레이트에 시딩하고 상이한 농도의 화합물의 존재하에 24시간 동안 배양시킨 후, 폴리포르메이트로 고정시키고, 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI, 3 ㎍/ml)로 염색하였다. 20x 대물렌즈를 구비한 ArrayScan HCS 4.0 리더 (Cellomics, Pittsburgh, Pennsylvania)를 이용하여 자가포식용 마커인 DAPI 표지된 핵 및 GFP-LC3에 대해 이미지 데이터를 수집하였다. 최적화 후 스폿 디텍터 바이오-어플리케이션을 이용하여 이미지를 획득하고 분석하였다. 각각의 화합물 처리에 대한 1000개 세포의 이미지를 분석하여 필드당 평균 세포 수, 형광성 스폿 수, 면적 및 세포당 세기를 수득하였다. DMSO 및 라파마이신을 각각 네거티브 또는 포지티브 대조군으로서 이용하였다. LC3-GFP의 변화 백분율을, DMSO 처리된 샘플들의 것으로 나눔에 의해 계산하였다. 각각의 처리는 평균 및 SD를 위해 3개로 수행되었다. 또한 이미지를 시진용의 통상적인 형광 현미경을 이용하여 분석하였다. 실험을 3회 반복하였다.
도 16은 스파우틴이 프로테아좀의 경로를 통해 베클린1의 분해를 촉진시킴을 나타내는 실험 결과를 도시한다. A, 293T 세포를 GFP-베클린1으로 트랜스펙션하고, 트랜스펙션한 지 24시간 후에, 세포를 지시된 화합물로 추가로 24시간 동안 처리하였다. DMSO (1‰), MBCQ (10μM), 스파우틴 (10μM), NH4Cl (10mM), MG132 (5μM). 세포 용해물을 항-GFP를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. B, 293T 세포를 GFP-베클린1 및 HA-Ub 발현 벡터로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션한 지 24시간 후에, 세포를 MG132 또는 스파우틴으로 24시간 동안 처리하였다. 세포 용해물을 항-GFP 항체로 면역침전시키고, 면역복합체를 항-HA 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.
도 17은 선택된 자가포식 단백질의 안정성에 대한 USP3, USP10, USP13, USP16 및 USP18의 siRNA 녹다운의 효과를 입증하는 실험 결과를 도시한다. H4 세포를 지시된 siRNA로 72시간 동안 트랜스펙션하거나 라파마이신 (0.2μM) 또는 스파우틴 (10μM)으로 4시간 동안 처리하였고, 비표적 siRNA (N. T. siRNA)를 네거티브 대조군으로서 이용하였다. 세포 용해물을 회수하고 (왼쪽): 지시된 단백질에 특이적인 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 항-α-튜불린을 로딩 대조군으로서 이용하였다.
도 18은 USP 단백질의 안정성에 대한 USP3, USP10, USP13, USP16 및 USP18의 siRNA 녹다운의 효과를 입증하는 실험 결과를 도시한다. H4 세포를 지시된 siRNA로 72시간 동안 트랜스펙션하거나 라파마이신 (0.2μM) 또는 스파우틴 (10μM)으로 4시간 동안 처리하였고, 비표적 siRNA (N. T. siRNA)를 네거티브 대조군으로서 이용하였다. 세포 용해물을 회수하고 (왼쪽): 지시된 단백질에 특이적인 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 항-α-튜불린을 로딩 대조군으로서 이용하였다.
도 19는 P53의 안정성에 대한 USP3, USP10, USP13, USP16, USP18 및 베클린1의 siRNA 녹다운의 효과를 입증하는 실험 결과를 도시한다. H4 세포를 지시된 siRNA로 트랜스펙션하거나 (각각의 USP에 대해 3개) 라파마이신 (0.2μM)으로 4시간 동안 처리하였고, DMSO (1%)를 네거티브 대조군으로서 이용하였다. 세포 용해물을 회수하고 항-p53 항체 또는 다른 지시된 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 항-α-튜불린을 로딩 대조군으로서 이용하였다.
도 20은 GFP-USP10 및 Myc-USP13이 실제로 상호작용할 수 있고, 상호작용이 스파우틴-처리된 세포에 의해 억제되었음을 입증하는 실험 결과를 도시한다. 293T 세포를 GFP-USP10 (레인 1-4), Myc-USP13 (레인 2-4), MG132 (레인 3-4) 및/또는 스파우틴 (레인 4)으로 트랜스펙션하였다. 용해물을 항-GFP 항체로 면역침전시키고, 면역복합체를 지시된 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.
도 21은 flag-USP10 및 GFP-베클린1이 실제로 상호작용할 수 있고, 상호작용이 스파우틴-처리된 세포에 의해 억제되었음을 입증하는 실험 결과를 도시한다. 293T 세포를 GFP-베클린1 (레인 1), GFP-베클린1 및 Flag-USP10 (레인 2-4) 플라스미드로 12시간 동안 트랜스펙션하고, 스파우틴 (10μM)과 함께 또는 이것 없이 MG132 (10μM)와 함께 4시간 동안 인큐베이션하고, 세포 용해물을 항-GFP 항체로 면역침전시키고, 면역복합체를 항-Flag 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.
도 22는 flag-USP10 및 GFP-베클린1이 실제로 상호작용할 수 있고, 상호작용이 스파우틴-처리된 세포의 영향을 거의 받지 않았음을 입증하는 실험 결과를 도시한다. 293T 세포를 GFP-베클린1 (레인 1), GFP-베클린1 및 Myc-USP13 (레인 2-4) 플라스미드로 12시간 동안 트랜스펙션하고, 스파우틴 (10μM)과 함께 또는 이것 없이 MG132 (10μM)와 함께 4시간 동안 인큐베이션하고, 세포 용해물을 항-GFP 항체로 면역침전시키고, 면역복합체를 항-Myc 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.
도 23은 A9의 1H NMR 스펙트럼을 도시한다.
도 24는 A30의 1H NMR 스펙트럼을 도시한다.
도 25는 A36의 1H NMR 스펙트럼을 도시한다.
발명의 상세한 설명
세포의 이화작용 과정인 자가포식은 재생을 위한 세포내 구성성분의 리소좀-의존성 턴오버를 매개함에 의해 대사 스트레스 조건하에 세포 생존을 촉진하는데 중요한 역할을 한다. 자가포식의 억제는 가능한 새로운 암 요법으로서 제안되었다.
자가포식의 소분자 조절제에 대한 이미지-기반 스크린에서, 자가포식 억제제인 MBCQ가 확인되었다. MBCQ의 광범한 약효 화학 변형으로부터 C43과 같은 신규한 유도체를 동정하였다. C43은 세포 기반 검정에서 약 0.8μM의 IC50으로 자가포식을 억제한다고 기술되었다. 본원의 특정 예에서, C43을 "스파우틴(spautin)" (Specific and Potent AUtophagy Inhibitor)으로서 지칭한다. IC50이 약 30nM인 C43의 유도체가 또한 제조되었다.
또한, 본원은 MBCQ 및 스파우틴이 Vps34 복합체 (예컨대, 베클린1/Vps34/p150을 포함하는 타입 Ⅲ PtdIns3 키나아제 복합체, 이의 생성물인 PtdIns3P은 자가포식의 개시에 필요하다)의 분해를 촉진할 수 있다고 기재하고 있다. Vps34 복합체의 유비퀴틴화 및 분해가 USP3, USP10, USP13, USP16 및 USP18을 포함하는 탈유비퀴틴화 프로테아제 복합체(deubiquitinating protease complex)에 의해 조절된다고 추가로 개시된다. 본원에서는 스파우틴이 자가포식을 억제하는 메커니즘이, 포유동물 세포에서 Vps34 복합체의 턴오버를 조절하는데 관여하는 USP10 및 USP13을 포함하는 탈유비퀴틴화 프로테아제 복합체의 붕괴인 것으로 제안된다.
또한, 본원은 스파우틴이 대부분 세포독성이 아니나 기아 조건하에서 암세포의 서브셋의 아폽토시스를 유도한다고 기재한다. 추가로, 본원에서는 스파우틴이 췌장염의 동물 모델에서 자가포식을 생체내 억제한다고 기재한다.
정의
편의를 위해, 본 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에서 사용된 특정 용어들을 여기에 모아 보았다. 본원에서 정의되고 사용된 모든 정의는 사전적 정의, 참조로서 포함된 문서에서의 정의, 및/또는 정의된 용어의 일반적인 의미를 대신한다.
단수 형태는 하나 또는 하나를 초과하는 (즉, 하나 이상의) 물품의 문법상의 대상을 지칭하기 위해 본원에서 이용된다. 예로서, "엘리먼트"는 하나의 엘리먼트 또는 하나를 초과하는 엘리먼트를 의미한다.
본원 명세서 및 청구범위에서 이용된 표현 "및/또는"은 이렇게 합쳐진 엘리먼트, 즉 일부 경우에 함께 존재하고 다른 경우에 분리하여 존재하는 엘리먼트의 "어느 한 쪽 또는 둘 모두"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"으로 나열된 다수의 엘리먼트는 동일한 형식으로 해석되어야 하며, 즉 "하나 이상의" 엘리먼트가 그렇게 합쳐진 것으로 해석되어야 한다. 구체적으로 확인된 엘리먼트와 관련이 있든 또는 없든 간에 "및/또는"의 절에 의해 구체적으로 확인된 엘리먼트 이외의 다른 엘리먼트가 임의로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, "포함하는"과 같은 제한이 없는 (open-ended) 말과 함께 사용될 때 "A 및/또는 B"라 함은, 일 구체예에서, A만(B 이외의 엘리먼트를 임의로 포함함)을 지칭할 수 있거나; 또 다른 구체예에서, B만(A 이외의 엘리먼트를 임의로 포함함)을 지칭할 수 있거나; 여전히 또 다른 구체예에서, A 및 B 둘 모두 (다른 엘리먼트를 임의로 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 "또는"은 상기 정의된 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목들을 분리시킬 때, "또는"이나 "및/또는"은 포괄적인 것으로 해석될 것인데, 즉 하나 이상뿐 아니라 하나를 초과하는 엘리먼트의 수 또는 목록, 및 임의로 추가의 나열되지 않은 항목들을 포함한다. "~중의 단 하나" 또는 "정확히 ~중의 하나" 또는 청구범위에서 사용된 "구성된"과 같이 명백하게 반하는 것으로 지시된 용어들만이 엘리먼트의 수 또는 목록 중의 정확히 하나의 엘리먼트의 포함을 나타낼 것이다. 일반적으로, 본원에서 사용된 "또는"이라는 용어는 "어느 하나", "~중의 하나", "~중의 단 하나" 또는 "정확히 ~중의 하나"와 같은 배타적인 용어가 붙을 때 배타적인 대안 (즉, "하나 또는 다른 하나 그러나 둘 모두는 아닌")을 나타내는 것으로만 해석될 것이다. 청구항에서 사용된 "필수적으로 포함하는"은 특허법 분야에서 사용되는 그 일반적인 의미를 지닐 것이다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 대로, 하나 이상의 엘리먼트들의 목록에 관한 "하나 이상의"라는 표현은 엘리먼트의 목록에 있는 엘리먼트들의 하나 이상으로부터 선택된 하나 이상의 엘리먼트를 의미하나, 상기 엘리먼트의 목록내에 구체적으로 나열된 각각의 그리고 모든 엘리먼트의 하나 이상을 반드시 포함하는 것이 아니고 엘리먼트의 목록내에 있는 엘리먼트의 임의의 조합을 배제시키는 것도 아님을 이해하여야 한다. 이러한 정의는 또한 구체적으로 확인된 엘리먼트들과 관련이 있든 관련이 없든 간에, "하나 이상의"라는 표현이 지칭하는 엘리먼트의 목록내에서 그러한 구체적으로 확인된 엘리먼트 외에 엘리먼트들이 임의로 존재할 수 있도록 한다. 따라서, 비제한적인 예로서, "A 및 B 중의 하나 이상" (또는 동등하게, "A 또는 B 중의 하나 이상" 또는 동등하게 "A 및/또는 B 중의 하나 이상")은 일 구체예에서 B가 존재하지 않고 (그리고 B 이외의 엘리먼트를 임의로 포함함) 하나를 초과하는 A를 임의로 포함하는 하나 이상의 A를 지칭할 수 있고; 또 다른 구체예에서, A가 존재하지 않고 (그리고 A 이외의 엘리먼트를 임의로 포함함) 하나를 초과하는 B를 임의로 포함하는 하나 이상의 B를 지칭할 수 있고; 여전히 또 다른 구체예에서, 하나를 초과하는 A를 임의로 포함하는 하나 이상의 A 및 하나를 초과하는 B를 임의로 포함하는 하나 이상의 B (그리고 다른 엘리먼트를 임의로 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
반대되는 것으로 명백하게 지시되지 않는 한, 하나를 초과하는 단계 또는 동작을 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 동작의 순서는 언급된 방법의 단계 또는 동작의 순서로 반드시 제한되는 것을 아님을 또한 이해하여야 한다.
청구범위뿐 아니라 상기 명세서에서, "포함하는", "가지고 있는", "지니는", "함유하는", "수반하는", "보유하는", "포함한" 등과 같은 모든 번역적 표현은 제한이 없는, 즉 포함하나 이로 제한되지 않음을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "구성된" 및 "필수적으로 포함하는"의 번역적 표현만이 United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03.에 개시된 대로 각각 폐쇄적(closed)이거나 반-폐쇄적(semi-closed)인 번역적 표현일 것이다.
임의의 구조에서 알킬, m, n 등과 같은 각각의 표현이 1회를 초과하여 정의될 때, 그 정의는 동일한 구조에 있는 다른 경우의 정의와 독립적이다.
"치환" 또는 "~으로 치환"은 그러한 치환이 치환된 원자 및 치환기의 허가된 원자가에 준하고, 그 치환이 안정한 화합물, 예컨대 재배열, 고리화, 제거 또는 다른 반응에 의해서와 같은 변형을 자발적으로 진행하지 않는 화합물을 생성한다는 함축적인 단서를 포함한다는 것을 이해할 것이다.
"치환된"이라는 용어는 또한 유기 화합물의 모든 허용할 수 있는 치환기를 포함하는 것으로 고려된다. 광범한 측면에서, 허용할 수 있는 치환기로는 유기 화합물의 비고리형 및 고리형, 분지형 및 비분지형, 카르보시클릭 및 헤테로시클릭, 방향족 및 비방향족 치환기가 있다. 예시적인 치환기는, 예를 들어 하기 본원에 개시된 것들을 포함한다. 허용할 수 있는 치환기는 적합한 유기 화합물에 대해 하나 이상일 수 있고 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명을 위해, 질소와 같은 헤테로원자가 수소 치환기 및/또는 헤테로원자의 원자가를 충족하는 본원에 기재된 유기 화합물의 임의의 허용할 수 있는 치환기를 지닐 수 있다. 본 발명은 어떠한 방식으로든 유기 화합물의 허용할 수 있는 치환기에 의해 제한되지 않는다. "하나 이상의" 치환기가 지시되는 경우, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기가 존재할 수 있다.
하기 나열된 임의의 기에 추가된 "저급"이라는 용어는 해당 기가 7개 미만의 탄소 (즉, 6개 이하의 탄소)를 함유한다는 것을 나타낸다. 예를 들어, "저급 알킬"은 1-6개의 탄소를 함유하는 알킬기를 지칭한다.
본 발명의 목적을 위해, 화학적 엘리먼트는 원소 주기율표, CAS 버젼 (Handbook of Chemistry and Physics, 67th Ed., 1986-87, 커버 안쪽)에 따라 확인된다.
"알킬"이라는 용어는 1 내지 20개, 1 내지 15개, 또는 1 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 지방족 또는 시클릭 탄화수소 라디칼을 의미한다. 알킬의 대표적인 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 2차-부틸, 이소-부틸, 3차-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 2-메틸시클로펜틸, 및 1-시클로헥실에틸이 있으나, 이로 제한되지 않는다. "플루오로알킬"이라는 용어는 하나 이상의 수소가 플루오린으로 대체된 알킬을 의미한다.
"알키옥시"라는 용어는 산소를 통해 모 부분에 결합된 알킬기를 의미한다. "플루오로알콕시"라는 용어는 산소를 통해 모 부분에 결합된 플루오로알킬기를 의미한다.
선택된 자가포식 억제제
본 발명의 일 측면은 하기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 생물학적 활성 대사물, 용매화물, 수화물, 프로드럭, 거울상이성질체 또는 입체이성질체에 관한 것이다:
Figure pct00002
상기 식에서,
n은 0, 1, 2, 3 또는 4이고;
Y는 -C(R1)= 또는 -N=이고;
R은 -H, 저급 알킬, -CH3, 저급 플루오로알킬, -CH2F, -CHF2, -CF3, -NO2, -OH, -NH2, -NH(저급 알킬), -N(저급 알킬)2, 또는 저급 알키닐이고;
R1은 각각의 경우에 -H, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, -OH, -NH2, -NH(저급 알킬), -N(저급 알킬)2, -CH3, -CF3, -C(=O)(저급 알킬), -CN, -O(저급 알킬), -O(저급 플루오로알킬), -S(=O)(저급 알킬), -S(=O)2(저급 알킬) 및 -C(=O)O(저급 알킬)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R2 및 R3은 -H, 저급 알킬, 저급 플루오로알킬, 저급 알키닐 및 히드록시알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
X는 -O-, -S-, -N(H)-, -N(저급 알킬)-, -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2- 또는 -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-이고;
Z는 페닐, 피리딜, 비닐, 모르피닐, 페난트롤리닐, 나프틸, 푸릴 또는 벤조[d]티아졸릴이고; -CH3, 저급 알킬, 플루오로알킬, -OCH3, -OCF3, 저급 플루오로알콕시, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, 저급 알키옥시, -NH(저급 알킬), -N(저급 알킬)2, -CF3, 및 3,4-메틸렌 디옥시로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되거나 치환되지 않는다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 단, 화합물은
Figure pct00003
이 아니고,
상기 식에서, J는 Cl, OCHF2, OCH2CH3, OCH2CF3, O(CH2)2CH3, OCH(CH3)2, O(CH2)3CH3, 또는 O(시클로펜틸)이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 n은 0이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 n은 1이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 n은 2이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 n은 3이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 n은 4이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 Y는 -C(R1)=이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 Y는 -C(H)=이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R은 -N=이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R은 -H이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R은 저급 알킬 또는 저급 플루오로알킬이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R은 -CH3이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R은 -CH2F, -CHF2 또는 -CF3이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 하나의 R1만이 -H이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 두 개의 R1만이 -H이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 세 개의 R1만이 -H이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 하나 이상의 R1은 -NH2, -Cl, -NO2, -I, 또는 -OMe이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 하나의 R1은 -NH2, -Cl, -NO2, -I, 또는 -OMe이고; 두 개 이상의 R1은 -H이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R2는 -CH3이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R2는 -H이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R2는 히드록시알킬이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R3는 -CH3이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R3는 -H이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R3는 히드록시알킬이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R2는 -CH3이고; R3는 H이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R2는 -H이고; R3는 -H이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 X는 -O-, -S-, -N(H)-, -N(저급 알킬)- 또는 -CH2-이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 X는 -N(H)- 또는 -N(저급 알킬)-이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 X는 -N(H)-이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 n은 0 또는 1이고; X는 -N(H)-이고; R2는 -H이고; R3는 -H이고; R은 -H이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 Z는 -CH3, 저급 알킬, 플루오로알킬, -OCH3, -OCF3, 저급 플루오로알콕시, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, 저급 알키옥시, -NH(저급 알킬), -N(저급 알킬)2, -CF3, 및 3,4-메틸렌 디옥시로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되거나 치환되지 않은 4-피리딜이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 Z는 -CH3, 저급 알킬, 플루오로알킬, -OCH3, -OCF3, 저급 플루오로알콕시, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, 저급 알키옥시, -NH(저급 알킬), -N(저급 알킬)2, -CF3, 및 3,4-메틸렌 디옥시로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되거나 치환되지 않은 모르피닐이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 Z는 -CH3, 저급 알킬, 플루오로알킬, -OCH3, -OCF3, 저급 플루오로알콕시, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, 저급 알키옥시, -NH(저급 알킬), -N(저급 알킬)2, -CF3, 및 3,4-메틸렌 디옥시로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되거나 치환되지 않은 2-푸릴이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 Z는 -CH3, 저급 알킬, 플루오로알킬, -OCH3, -OCF3, 저급 플루오로알콕시, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, 저급 알키옥시, -NH(저급 알킬), -N(저급 알킬)2, -CF3, 및 3,4-메틸렌 디옥시로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되거나 치환되지 않은 1-나프틸 또는 2-나프틸이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 Z는 -CH3, 저급 알킬, 플루오로알킬, -OCH3, -OCF3, 저급 플루오로알콕시, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, 저급 알키옥시, -NH(저급 알킬), -N(저급 알킬)2, -CF3, 및 3,4-메틸렌 디옥시로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되거나 치환되지 않은 벤조[d]티아졸-5-일 또는 벤조[d]티아졸-6-일이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 Z는 -CH3, 저급 알킬, 플루오로알킬, -OCH3, -OCF3, 저급 플루오로알콕시, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, 저급 알키옥시, -NH(저급 알킬), -N(저급 알킬)2, -CF3, 및 3,4-메틸렌 디옥시로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되거나 치환되지 않은 페닐이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 n은 0 또는 1이고; Z는 -CH3, 저급 알킬, 플루오로알킬, -OCH3, -OCF3, 저급 플루오로알콕시, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, 저급 알키옥시, -NH(저급 알킬), -N(저급 알킬)2, -CF3, 및 3,4-메틸렌 디옥시로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되거나 치환되지 않은 페닐이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 n은 0 또는 1이고; X는 -N(H)-이고; Z는 -CH3, 저급 알킬, 플루오로알킬, -OCH3, -OCF3, 저급 플루오로알콕시, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, 저급 알키옥시, -NH(저급 알킬), -N(저급 알킬)2, -CF3, 및 3,4-메틸렌 디옥시로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되거나 치환되지 않은 페닐이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 n은 0 또는 1이고; X는 -N(H)-이고; R2는 -H이고; R3은 -H이고; Z는 -CH3, 저급 알킬, 플루오로알킬, -OCH3, -OCF3, 저급 플루오로알콕시, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, 저급 알키옥시, -NH(저급 알킬), -N(저급 알킬)2, -CF3, 및 3,4-메틸렌 디옥시로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되거나 치환되지 않은 페닐이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 n은 0 또는 1이고; X는 -N(H)-이고; R2는 -H이고; R3은 -H이고; R은 -H이고; Z는 -CH3, 저급 알킬, 플루오로알킬, -OCH3, -OCF3, 저급 플루오로알콕시, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, 저급 알키옥시, -NH(저급 알킬), -N(저급 알킬)2, -CF3, 및 3,4-메틸렌 디옥시로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되거나 치환되지 않은 페닐이다.
본 발명의 일 측면은 하기 화학식 (Ⅱ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 생물학적 활성 대사물, 용매화물, 수화물, 프로드럭, 거울상이성질체 또는 입체이성질체에 관한 것이다:
Figure pct00004
상기 식에서,
n은 0, 1, 2, 3 또는 4이고;
Y는 -C(R1)= 또는 -N=이고;
R은 -H, 저급 알킬, -CH3, 저급 플루오로알킬, -CH2F, -CHF2, 또는 -CF3이고;
R1은 각각의 경우에 -H, -CH3, -F, -Cl, -Br, -I 또는 -NO2로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R2 및 R3은 -H, -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3 또는 -CH(CH3)2로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R4, R5 및 R8은 -H, -CH3, -CF3, -OCH3, -OCF3, -F, -Cl, -Br 또는 -I로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R6 및 R7은 -H, -CH3, -CF3, -OCH3, -OCF3, -F, -Cl, -Br 또는 -I로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되거나; R6 및 R7은 함께 취해져 -OCH2O-이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 단, 화합물은
Figure pct00005
이 아니다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 n은 0이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 n은 1이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 n은 2이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 n은 3이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 n은 4이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 Y는 -C(R1)=이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 Y는 -C(H)=이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R은 -N=이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R은 -H이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R은 저급 알킬 또는 저급 플루오로알킬이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R은 -CH3이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R은 -CH2F, -CHF2 또는 -CF3이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R1은 -F이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R1은 -Cl이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R1은 -Br이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R1은 -I이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R1은 -NO2이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R1은 -CH3이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R2는 -H이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R2는 -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3 또는 -CH(CH3)2이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R2는 -CH3이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R3는 -H이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R3는 -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3 또는 -CH(CH3)2이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R3는 -CH3이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R4는 -H이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R4는 -F이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R4는 -Cl이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R4는 -CH3이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R4는 -OCH3이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R5는 -H이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R5는 -F이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R5는 -Cl이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R5는 -CH3이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R5는 -OCH3이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R6은 -H, -F, -Cl, -Br 또는 -I이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R6은 -H이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R6은 -F이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R6은 -Cl이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R6은 -Br이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R6은 -CH3이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R6은 -CF3이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R6은 -OCH3이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R6은 -OCF3이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R6 및 R7은 함께 취해져 -OCH2O-이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R7은 -H, -F, -Cl, -Br 또는 -I이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R7은 -H이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 R8은 -H이다.
본 발명의 일 측면은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 생물학적 활성 대사물, 용매화물, 수화물, 프로드럭, 거울상이성질체 또는 입체이성질체에 관한 것이다:
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
.
본 발명의 일 측면은
Figure pct00011
또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 생물학적 활성 대사물, 용매화물, 수화물, 프로드럭, 거울상이성질체 또는 입체이성질체에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 및 부수적인 정의들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 화합물은 자가포식 억제제이고; 자가포식 억제제의 EC50은 약 100 nM 미만이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 화합물은 약 10 μM 미만의 IC50으로 자가포식을 억제한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 화합물은 약 5 μM 미만의 IC50으로 자가포식을 억제한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 화합물은 약 1 μM 미만의 IC50으로 자가포식을 억제한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 화합물은 약 750 nM 미만의 IC50으로 자가포식을 억제한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 화합물은 약 500 nM 미만의 IC50으로 자가포식을 억제한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 화합물은 약 250 nM 미만의 IC50으로 자가포식을 억제한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 화합물은 약 100 nM 미만의 IC50으로 자가포식을 억제한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 화합물은 자가포식 억제제이고; 화합물은 PDE5를 억제하지 않는다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 화합물은 자가포식 및 PDE5 둘 모두를 억제하고; 화합물의 자가포식 IC50은 약 0.001 μM 내지 약 10 μM이고; PDE5 IC50 대 자가포식 IC50의 비는 약 10 내지 약 50이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 화합물은 자가포식 및 PDE5 둘 모두를 억제하고; 화합물의 자가포식 IC50은 약 0.001 μM 내지 약 10 μM이고; PDE5 IC50 대 자가포식 IC50의 비는 약 50 내지 약 100이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 하나에 관한 것이고, 여기서 화합물은 자가포식 및 PDE5 둘 모두를 억제하고; 화합물의 자가포식 IC50은 약 0.001 μM 내지 약 10 μM이고; PDE5 IC50 대 자가포식 IC50의 비는 약 100 내지 약 1,000이다.
산성 치환기를 지니는 본 발명의 특정 화합물은 약학적으로 허용되는 염기와 염으로서 존재할 수 있다. 본 발명은 그러한 염을 포함한다. 그러한 염의 예로는 소듐 염, 포타슘 염, 리신 염 및 아르기닌 염이 있다. 이러한 염들은 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 특정 화합물 및 이들의 염은 하나를 초과하는 결정 형태로 존재할 수 있고, 본 발명은 각각의 결정 형태 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 특정 화합물 및 이들의 염은 용매화물, 예를 들어 수화물의 형태로 존재할 수 있고, 본 발명은 각각의 용매화물 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 특정 화합물은 하나 이상의 카이랄 중심을 함유할 수 있고, 광학적으로 활성인 상이한 형태로 존재할 수 있다. 화합물이 하나의 카이랄 중심을 함유할 때, 화합물은 두 개의 거울상이성질체 형태로 존재하고 본 발명은 둘 모두의 거울상이성질체 및 라세믹 혼합물과 같은 거울상이성질체들의 혼합물을 포함한다. 거울상이성질체는 당업자에게 공지된 방법에 의해 분리될 수 있고, 예를 들어 결정화에 의해 분리될 수 있는 부분입체이성질체 염의 형성; 예를 들어 결정화, 가스-액체 또는 액체 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있는 부분입체이성질체 유도체 또는 복합체의 형성; 하나의 거울상이성질체와 거울상이성질체-특이적 시약과의 선택적인 반응, 예를 들어 효소 에스테르화; 또는 카이랄 환경에서, 예를 들어 결합된 카이랄 리간드를 지니는 카이랄 지지체 예를 들어 실리카 상에서 또는 카이랄 용매의 존재하에 가스-액체 또는 액체 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다. 요망되는 거울상이성질체가 상기 기술된 분리 절차 중 하나에 의해 또 다른 화학적 실체로 전환될 때, 추가 단계를 이용하여 요망되는 거울상이성질체 형태를 유리시킬 수 있다. 대안적으로, 광학적 활성 시약, 기질, 촉매 또는 용매를 이용한 비대칭 합성, 또는 하나의 거울상이성질체를 비대칭 변형에 의해 다른 거울상이성질체로 전환시킴에 의해 특수한 거울상이성질체를 합성할 수 있다.
본 발명의 화합물이 하나를 초과하는 카이랄 중심을 함유할 때, 이것은 부분입체이성질체 형태로 존재할 수 있다. 부분입체이성질체 화합물은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 크로마토그래피 또는 결정화에 의해 분리될 수 있고, 개개의 거울상이성질체는 상기 개시된 대로 분리될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 화합물의 각각의 부분입체이성질체 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 특정 화합물은 상이한 호변이성질체 형태 또는 상이한 기하 이성질체로 존재할 수 있고, 본 발명은 본 발명의 화합물의 각각의 호변이성질체 및/또는 기하 이성질체 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 특정 화합물은 분리될 수 있는 여러 안정한 형태(conformational form)로 존재할 수 있다. 예를 들어 입체 장해 또는 고리 스트레인으로 인한 비대칭 단일 결합 주위로의 제한된 회전에 기인한 회선성 비대칭은 상이한 이형태체의 분리를 가능하게 할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 화합물의 각각의 형태 이성질체 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 특정 화합물은 양쪽성 이온 형태로 존재할 수 있고, 본 발명은 본 발명의 화합물의 각각의 양쪽성 이온 형태 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "프로드럭"은 일부 생리학적 화학적 공정에 의해 생체내에서 모 약물로 전환되는 작용제를 지칭한다 (예컨대, 생리학적 pH에 제공된 프로드럭이 요망되는 약물 형태로 전환된다). 프로드럭은 종종 유용한데, 그 이유는 이들이 일부 경우에 모 약물보다 용이하게 투여될 수 있기 때문이다. 프로드럭은 예를 들어 경구 투여에 의해 생체이용가능할 수 있는 반면, 모 약물은 그렇지 않다. 프로드럭은 또한 약리적 조성물에서 모 약물보다 개선된 용해성을 지닐 수 있다. 프로드럭의 예는 비제한적으로, 에스테르로서 투여되어 ("프로드럭") 수용성이 유리하지 않은 세포막을 가로질러 용이하게 투과된 후 일단 수용성이 유리한 세포내에서 카르복실산으로 대사적으로 가수분해되는 본 발명의 화합물일 것이다. 프로드럭은 많은 유용한 특성을 지닌다. 예를 들어, 프로드럭은 최종 약물보다 더욱 수용성이어서, 약물의 정맥내 투여를 촉진할 수 있다. 프로드럭은 또한 최종 약물보다 높은 수준의 경구 생체이용가능성을 지닐 수 있다. 투여 후, 프로드럭은 효소적 또는 화학적으로 절단되어 혈액 또는 조직에서 최종 약물을 전달한다.
예시적인 프로드럭은 본 발명의 화합물의 아민을 방출시키며, 여기서 아민의 유리 수소는 (C1-C6)알카노일옥시메틸, 1-((C1-C6)알카노일옥시)에틸, 1-메틸-1-((C1-C6)알카노일옥시)에틸, (C1-C6)알콕시카르보닐옥시메틸, N-(C1-C6)알콕시카르보닐아미노메틸, 숙시노일, (C1-C6)알카노일, α-아미노(C1-C4)알카노일, 아릴아실 및 α-아미노아실, 또는 α-아미노아실-α-아미노아실로 대체되고, 상기 α-아미노아실 부분은 독립적으로 단백질에서 발견되는 자연 발생 L-아미노산 중 어느 하나, -P(O)(OH)2, -P(O)(O(C1-C6)알킬)2 또는 글리코실이다 (라디칼은 탄수화물의 헤미아세탈의 히드록실의 분리에서 유래한다).
약학적 조성물
본 발명의 하나 이상의 화합물은 그 자체로 또는 생물학적으로 적합한 담체 또는 부형제(들)와 혼합된 약학적 조성물로 인간 환자에게 본원에 개시된 질병 또는 질환을 치료 또는 개선시키는 용량으로 투여될 수 있다. 이러한 화합물의 혼합물은 또한 단순 혼합물로서 또는 제형화된 적합한 약학적 조성물로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 측면은 치료적 유효량의 화학식 (Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 생물학적 활성 대사물, 용매화물, 수화물, 프로드럭, 거울상이성질체 또는 입체이성질체; 및 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본원에서 사용된 치료적 유효량은 본원에 개시된 질병 또는 질환의 예방 또는 약화를 초래하기에 충분한 화합물 또는 화합물들의 양을 지칭한다. 본 출원의 화합물의 제형화 및 투여 기술은 당업자에게 널리 공지된 참조문헌, 예컨대 "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, 최신본에서 찾아볼 수 있다.
적합한 투여 경로는 예를 들어 경구, 점안, 직장, 경점막, 국소 또는 장내 투여; 근내, 피하, 골수내 주입 뿐 아니라 경막내, 뇌실내에 직접, 정맥내, 복강내, 비내, 또는 안내 주입을 포함하는 비경구 전달을 포함할 수 있다.
대안적으로, 화합물은 전신적인 방식이 아니라 국소적으로, 예를 들어 종종 데포(depot) 또는 서방성 제형으로, 화합물을 부종 부위에 직접 주입함에 의해 투여될 수 있다.
더욱이, 약물을 표적화된 약물 전달 시스템으로, 예를 들어 내피 세포 특이적인 항체로 코팅된 리포솜으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정(dragee)-제조, 분말화(levigating), 에멀젼화, 캡슐화, 엔트래핑(entrapping) 또는 냉동건조 과정에 의한 것과 같은, 자체적으로 공지된 방식으로 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따라 사용되는 약학적 조성물은 약학적으로 사용될 수 있는 제조물로의 활성 화합물의 가공을 촉진하는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리적으로 허용되는 담체를 이용하여 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 적합한 제형은 선택된 투여 경로에 의존적이다.
주입을 위해, 본 발명의 작용제는, 바람직하게는 행크스 용액, 링거액, 또는 생리적 염수 완충제와 같은 생리적으로 적합한 완충제에서, 수용액으로 제형화될 수 있다. 경점막 투여를 위해, 투과하려는 장벽에 적합한 침투제를 제형에 이용한다. 그러한 침투제는 일반적으로 당 분야에 알려져 있다.
경구 투여를 위해, 활성 화합물을 당 분야에 널리 공지된 약학적으로 허용되는 담체와 조합시킴에 의해 화합물을 용이하게 제형화할 수 있다. 그러한 담체로 인해 본 발명의 화합물이 치료되는 환자에 의해 경구 섭취되는 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화될 수 있다. 경구용 약학적 제제는, 활성 화합물을 고체 부형제와 조합시키고, 생성된 혼합물을 임의로 분쇄하고, 과립의 혼합물을 가공하고, 요망되는 경우, 적합한 보조제를 첨가한 후 정제 또는 당의정 코어를 수득함에 의해 수득될 수 있다. 적합한 부형제는, 특히, 충전제, 예컨대 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 당; 셀룰로스 제제, 예컨대 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트라가칸트, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)이다. 요망되는 경우, 가교된 폴리비닐피롤리돈, 아가, 또는 알긴산 또는 이의 염, 예를 들어 소듐 알기네이트와 같은 붕해제를 첨가할 수 있다.
당의정 코어는 적합한 코팅과 함께 제공된다. 이를 위해, 임의로 아라비아 검(gum arabic), 탤크(talc), 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 티타늄 디옥사이드, 래커 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있는 농축된 당 용액이 사용될 수 있다. 활성 화합물 용량의 다양한 조합물의 확인 또는 이를 특성규명하기 위해 정제 또는 당의정 코팅에 염료 또는 안료가 첨가될 수 있다.
경구 사용될 수 있는 약학적 제조물은 젤라틴으로 제조된 푸시-핏(push-fit) 캡슐, 뿐만 아니라 젤라틴 및 가소제, 예를 들어, 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연질의 밀봉된 캡슐을 포함한다. 푸시-핏 캡슐은 충전제, 예를 들어, 락토오스, 결합제, 예를 들어, 전분, 및/또는 윤활제, 예를 들어, 탤크 또는 마그네슘 스테아레이트, 및 임의로 안정화제와 혼합된 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물은 적합한 액체, 예를 들어, 지방유, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해되거나 현탁될 수 있다. 또한, 안정화제가 첨가될 수 있다. 경구 투여를 위한 모든 제형은 상기 투여에 적합한 투여량으로 존재하여야 한다.
협측 투여를 위해, 조성물은 통상적인 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지의 형태를 취할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물은 적합한 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스의 사용과 함께 가압된 팩 또는 분무기로부터의 에어로졸 스프레이 제시 형태로 편리하게 전달된다. 가압된 에어로졸의 경우, 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 화합물 및 적합한 분말 베이스, 예를 들어, 락토오스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하는, 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 젤라틴의 캡슐 및 카트리지가 제형화될 수 있다.
화합물은 주사, 예를 들어, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 단위 투여 형태, 예를 들어, 보존제가 첨가된 앰풀 또는 다용량 용기로 제공될 수 있다. 조성물은 현탁액, 용액 또는 유중 에멀젼 또는 수성 비히클의 형태를 취할 수 있고, 이는 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화 작용제를 함유할 수 있다.
비경구 투여용 약학적 제형은 수용성 형태의 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 추가로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 오일성 주사 현탁액으로 제조될 수 있다. 적합한 친지질성 용매 또는 비히클은 지방유, 예를 들어, 참기름, 또는 지방산 에스테르, 예를 들어, 에틸 올리에이트 또는 트리글리세라이드, 또는 리포솜을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점성도를 증가시키는 물질, 예를 들어, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁액은 또한 적합한 안정화제 또는 고도로 농축된 용액의 제조를 가능케 하도록 화합물의 용해도를 증가시키는 작용제를 함유할 수 있다.
대안적으로, 활성 성분은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어, 멸균의 발열원을 함유하지 않는 물을 이용하여 재구성되는 분말 형태일 수 있다.
화합물은 또한, 예를 들어, 통상적인 좌약 베이스, 예를 들어, 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드를 함유하는 직장 조성물, 예를 들어, 좌약 또는 정체 관장제로 제형화될 수 있다.
상기 기재된 제형 외에, 화합물은 또한 데포(depot) 제조물로 제형화될 수 있다. 이러한 장기 작용 제형은 이식(예를 들어, 피하 또는 근내 이식, 또는 근내 주사에 의함)에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 화합물은 적합한 중합 물질 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용되는 오일 중의 에멀젼으로 제형화) 또는 이온 교환 수지를 이용하여 제형화되거나, 거의 용해되지 않는 유도체, 예를 들어, 거의 용해되지 않는 염으로 제형화될 수 있다.
대안적으로, 소수성 약학적 화합물에 대해 다른 전달 시스템이 사용될 수 있다. 리포솜 및 에멀젼이 소수성 약물의 전달 비히클 또는 담체의 널리 공지된 예이다. 특정 유기 용매, 예를 들어, 디메틸설폭시드가 또한 사용될 수 있으나, 이는 보통 독성이 크다. 또한, 화합물은 지속 방출 시스템, 예를 들어, 치료제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 이용하여 전달될 수 있다. 다양한 지속 방출 물질이 확립되어 있고, 당업자에게 널리 공지되어 있다. 지속 방출 캡슐은 이의 화학적 특성에 따라 수주 내지 100일 이하 동안 화합물을 방출한다. 치료 시약의 화학적 특성 및 생물학적 안정성에 따라, 단백질 안정화를 위한 추가 방법이 이용될 수 있다.
약제 조성물은 또한 적합한 고체 또는 젤 상 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 담체 또는 부형제의 예는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당, 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 및 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 화합물 중 다수는 약학적으로 양립되는 반대이온을 갖는 염(즉, 약학적으로 허용되는 염)으로 제공될 수 있다. "약학적으로 허용되는 염"은 수용체로의 투여시 본 발명의 화합물 또는 화합물의 프로드럭을 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 임의의 비독성 염을 의미한다. "약학적으로 허용되는 허용되는 반대이온"은 수용체로의 투여시 염으로부터 방출되는 경우에 비독성인 염의 이온 부분이다. 약학적으로 양립되는 염은 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 많은 산을 이용하여 형성될 수 있다. 염은 상응하는 자유 염기 형태 보다 수성 또는 다른 양성자 용매에서 더욱 가용성인 경향이 있다.
약학적으로 허용되는 염을 형성시키는데 통상적으로 사용되는 산은 무기산, 예를 들어, 하이드로겐 바이설파이드(hydrogen bisulfide), 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산 및 인산, 뿐만 아니라 유기산, 예를 들어, 파라-톨루엔설폰산, 살리실산, 타르타르산, 바이타르타르산, 아스코르브산, 말레산, 베실산, 푸마르산, 글루콘산, 글루쿠론산, 포름산, 글루탐산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, 락트산, 옥살산, 파라-브로모페닐설폰산, 탄산, 숙신산, 시트르산, 벤조산 및 아세트산, 및 관련 무기 및 유기산을 포함한다. 따라서, 이러한 약학적으로 허용되는 염은 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 포스페이트, 모노하이드로겐포스페이트, 디하이드로겐포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포르메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥신-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 히드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, .베타.-히드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말리에이트, 타르트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등의 염을 포함한다. 바람직한 약학적으로 허용되는 산 부가염은 염산 및 브롬화수소산과 같은 광산(mineral acid)으로 형성된 산 부가염, 특히 말레산과 같은 유기산으로 형성된 산 부가염을 포함한다.
산성 작용기를 갖는 약학적으로 허용되는 염을 형성시키는데 적합한 염기는 알칼리 금속, 예를 들어, 소듐, 포타슘 및 리튬의 수산화물; 알칼리토금속, 예를 들어, 칼슘 및 마그네슘의 수산화물; 다른 금속, 예를 들어, 알루미늄 및 아연의 수산화물; 암모니아, 및 유기 아민, 예를 들어, 미치환 또는 히드록시 치환 모노-, 디-, 또는 트리알킬아민; 디시클로헥실아민; 트리부틸 아민; 피리딘; N-메틸,N-에틸아민; 디에틸아민; 트리에틸아민; 모노-, 비스-, 또는 트리스-(2-히드록시-저급 알킬 아민), 예를 들어, 모노-, 비스-, 또는 트리스-(2-히드록시에틸)아민, 2-히드록시-터트-부틸아민, 또는 트리스-(히드록시메틸)메틸아민, N,N-디알킬-N-(히드록시 알킬)-아민, 예를 들어, N,N-디메틸-N-(2-히드록시에틸)아민, 또는 트리-(2-히드록시에틸)아민; N-메틸-D-글루카민; 및 아미노산, 예를 들어, 아르기닌, 리신 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 사용하기에 적합한 약제 조성물은 활성 성분이 이의 소기의 목적을 달성하기 위해 유효량으로 함유된 조성물을 포함한다. 더욱 특히, 치료적 유효량은 치료되는 피검체의 존재하는 증상의 발달을 예방하거나 상기 증상을 완화시키는데 효과적인 양을 의미한다. 유효량의 결정은 당업자의 능력에 속한다.
선택된 사용 방법
일 양태에서, 본 발명은 피검체에 본 발명의 화합물을 투여하여, 피검체의 자가포식(autophagy) 활성이 변경되고, 치료 또는 예방이 달성되는 것을 포함하는, 자가포식의 억제가 이로운 피검체에서 자가포식을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 피검체는 인간이다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하는"은 질환의 예방 또는 관리, 및/또는 치료를 제공하기 위해 피검체에 본원에 기재된 하나 이상의 화합물을 투여하고/하거나 적용하는 것을 포함한다. 본 발명의 개시의 목적 상, "치료"는 치유를 제공할 수 있으나, 반드시 이런 것은 아니며, 오히려 "치료"는 질환의 관리의 형태일 수 있다. 본원에 기재된 화합물이 암을 포함하는 원치않는 증식 세포를 치료하는데 사용되는 경우, "치료"는 정상 세포에 대해서는 최소의 파괴 영향을 미치면서 요망되지 않는 증식 세포의 부분적 또는 전체적 파괴를 포함한다. 세포 수준에서의 암 세포를 포함하는 원치않는 신속하게 증식하는 세포 치료의 요망되는 메커니즘은 아폽토시스이다.
본원에서 사용되는 용어 "예방하는"은 임상적으로 명백한 원치않는 세포 증식의 발생을 전체적으로 예방하거나 늦추는 것이거나, 위험성이 있는 개체에서 원치않는 신속한 세포 증식의 전임상적으로 명백한 단계의 발생을 예방하거나 늦추는 것을 포함한다. 또한, 악성 세포의 전이를 예방하거나 늦추거나, 악성 세포의 발달을 억제하거나 역전시키는 것이 상기 정의에 포함된다. 이는 전암 및 암이 발달할 위험이 있는 개체의 예방적 치료를 포함한다. 또한, 혈관성형술 또는 스텐트(stent) 절차를 겪은 피검체에서의 재협착을 예방하거나 늦추는 것이 상기 정의에 포함된다.
치료 목적상 용어 "피검체"는 자가포식의 억제가 이로운 장애를 갖는 것으로 진단되거나, 이러한 장애의 증상을 갖거나, 이러한 장애가 발달할 위험이 있는 임의의 인간 또는 동물 피검체를 포함한다. 예방 방법에 대해, 피검체는 임의의 인간 또는 동물 피검체이다. 예를 들어, 예방의 목적 상, 피검체는 암과 같은 원치않는 신속한 세포 증식을 특징으로 하는 장애의 위험이 있거나, 유전적으로 이러한 장애를 갖기 쉬운 인간 피검체일 수 있다. 피검체는 발암성 작용제에 대한 노출로 인해 유전적으로 원치않는 신속한 세포 증식 등을 특징으로 하는 장애를 가질 위험이 있을 수 있다. 인간 치료에 유용한 것 외에, 본원에 기재된 화합물은 또한 개, 고양이, 말, 소, 양 및 돼지를 포함하나 이에 제한되지는 않는 반려 동물 및 사육 동물을 포함하는 포유동물의 수의학적 치료에 유용하다.
본 발명의 일 양태는 암을 치료하거나 예방할 필요가 있는 피검체에 치료적 유효량의 화학식 (Ⅰ) 또는 화학식 (Ⅱ)의 하나 이상의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 생물학적 활성 대사물, 용매화물, 수화물, 프로드럭, 거울상이성질체 또는 입체이성질체를 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다.
방사선감작 및 화학감작(chemosensitization)의 촉진에 의한 자가포식의 억제가 새로운 항암 요법으로 제안되었다. 암 요법의 동물 모델에서, 주요 자가포식 유전자 ATG5에 대한 shRNA 또는 항말라리아 약물 클로로퀸을 이용한 요법-유도 자가포식의 억제는 종양 세포 사멸을 유도하기 위해 활성화된 p53 또는 알킬화 화학요법제가 사용된 Myc-유래 종양의 세포 사멸 및 종양 회귀를 향상시켰다(Amaravadi, R.K., et al., Autophagy inhibition enhances therapy-induced apoptosis in a Myc-induced model of lymphoma. J Clin Invest, 2007. 117(2): p. 326-36). 클로로퀸은 거대한 자가포식 소포의 용량 의존적 축적을 야기시키고, ATG5의 녹다운과 유사한 정도로 알킬화 요법-유래 세포 사멸을 향상시킨다. 만성 골수성 백혈병(CML)의 경우, 클로로퀸은 이마티니브(imatinib)에 의해 유도된 CML 세포주 K562의 사멸을 현저히 향상시켰다. 또한, 이마티니브 내성 세포주 BaF3/T315I 및 BaF3/E255K는 이마티니브 및 클로로퀸을 이용한 공동치료에 의해 사멸이 유도될 수 있다. 이러한 연구는 자가포식의 억제가 통상적인 화학요법을 강화시킬 수 있는 것을 암시한다.
암의 미국립암센터(National Cancer Institute)의 알파벳에 따른 목록은 하기를 포함한다: 성인 급성 림프성 백혈병; 유년기 급성 림프성 백혈병; 성인 급성 골수성 백혈병; 부신피질암종; 유년기 부신피질암종; AIDS-관련 림프종; AIDS-관련 악성종양; 항문암; 유년기 소뇌 별아교세포종; 유년기 대뇌 별아교세포종; 간외 담관암; 방광암; 유년기 방광암; 골육종/악성 섬유성 조직구종 골암; 유년기 뇌간교종; 성인 뇌종양; 유년기 뇌간교종 뇌종양; 소뇌 별아교세포종 뇌종양; 유년기 대뇌 별아교세포종/악성 신경교종 뇌종양; 유년기 뇌실막세포종 뇌종양; 유년기 수모세포종 뇌종양; 유년기 천막위 원시신경 외배엽 종양 뇌종양; 유년기 시각 경로 및 시상하부 신경교종 뇌종양; 유년기 (기타) 뇌종양; 유방암; 유방암 및 임신; 유년기 유방암; 남성 유방암; 유년기 기관지 선종/유암종; 유년기 유암종 종양; 위장 유암종 종양; 부신피질 암종; 섬세포 암종; 원인불명의 원발성 암종; 원발성 중추신경계 림프종; 유년기 소뇌 별아교세포종; 유년기 대뇌 별아교세포종/악성 신경교종; 자궁경부암; 소아암; 만성 림프구성 백혈병; 만성 골수성 백혈병; 만성 골수증식성 장애; 건초의 투명세포 육종; 결장암; 유년기 결장직장암; 피부 T-세포 림프종; 자궁내막암; 유년기 뇌실막종; 난소 상피암; 식도암; 유년기 식도암; 종양의 유잉(Ewing)과; 유년기 두개외 생식세포 종양; 고환외 생식세포 종양; 간외 담관암; 안구내 흑색종 안구암; 망막모세포종 안구암; 담낭암; 위(복부)암; 유년기 위(복부)암; 위장 유암종 종양; 유년기 두개외 생식세포 종양; 고환외 생식세포 종양; 난소 생식세포 종양; 임신 융모 종양; 유년기 뇌간 신경교종; 유년기 시각 경로 및 시상하부 신경교종; 모발상 세포 백혈병; 두경부암; 성인(원발성) 간세포(간)암; 유년기(원발성) 간세포성(간)암; 성인 호지킨 림프종; 유년기 호지킨 림프종; 임신 동안의 호지킨 림프종; 하인두암; 유년기 시상하부 및 시각 경로 신경교종; 안구내 흑색종; 섬세포 암종(내분비성 췌장); 카포시 육종; 신장암; 후두암; 유년기 후두암; 성인 급성 림프모구성 백혈병; 유년기 급성 림프모구성 백혈병; 성인 급성 골수성 백혈병; 유년기 급성 골수성 백혈병; 만성 림프구성 백혈병; 만성 골수성 백혈병; 모발상 세포 백혈병; 입술 및 구강암; 성인(원발성) 간암; 유년기(원발성) 간암; 비소세포 폐암; 소세포 폐암; 성인 급성 림프모구성 백혈병; 유년기 급성 림프모구성 백혈병; 만성 림프구성 백혈병; AIDS-관련 림프종; 중추신경계(원발성) 림프종; 피부 T-세포 림프종; 성인 호지킨 림프종; 유년기 호지킨 림프종; 임신 동안의 호지킨 림프종; 성인 비-호지킨 림프종; 유년기 비-호지킨 림프종; 임신 동안의 비-호지킨 림프종; 원발성 중추신경계 림프종; 발덴스트롬 마크로글루불린혈증; 남성 유방암; 성인 악성 중피종; 유년기 악성 중피종; 악성 흉선종; 유년기 수모세포종; 흑색종; 안구내 흑색종; 메르켈 세포 암종; 악성 중피종; 잠재적 원발성의 전이성 편평 목암; 유년기 다발성 내분비 신생물 증후군; 다발골수종/형질 세포 신생물; 균상 식육종; 골수이형성증후군; 만성 골수성 백혈병; 유년기 급성 골수성 백혈병; 다발성 골수종; 만성 골수증식성 장애; 비강 및 부비동암; 비인두암; 유년기 비인두암; 신경모세포종; 성인 비-호지킨 림프종; 유년기 비-호지킨 림프종; 임신 동안의 비-호지킨 림프종; 비소세포 폐암; 유년기 구강암; 구강 및 입술암; 구인두암; 골의 골육종/악성 섬유성 조직구종; 유년기 난소암; 난소 상피암; 난소 생식세포 종양; 난소 저 악성 잠재성 종양; 췌장암; 유년기 췌장암; 섬세포 췌장암; 부비동 및 비강암; 부갑상선암; 음경암; 크롬친화세포종; 유년기 송과체 및 천막위 원시 신경 신경외배엽 종양; 뇌하수체 종양; 형질 세포 신생물/다발골수종; 흉막폐아세포종; 임신 및 유방암; 임신 및 호지킨 림프종; 임신 및 비-호지킨 림프종; 원발성 중추신경계 림프종; 성인 원발성 간암; 유년기 원발성 간암; 전립선암; 직장암; 신세포(신장)암; 유년기 신세포암; 신우 및 요관 이행 세포암; 망막모세포종; 유년기 횡문근육종; 타액선암; 유년기 타액선암; 종양의 유잉과 육종; 카포시 육종; 골의 육종(골육종)/악성 섬유성 조직구종; 유년기 횡문근육종 육종; 성인 연부 조직 육종; 유년기 연부 조직 육종; 세자리 증후군; 피부암; 유년기 피부암; 피부암(흑색종); 메르켈 세포 피부 암종; 소세포 폐암; 소장암; 성인 연부 조직 육종; 유년기 연부 조직 육종; 전이성 잠재성 원발성의 편평 목암; 복부(위)암; 유년기 복부(위)암; 유년기 천막위 원시 신경외배엽 종양; 피부 T-세포 림프종; 고환암; 유년기 흉선종; 악성 흉선종; 갑상선암; 유년기 갑상선암; 신우 및 요관의 이행 세포암; 임신 영양막 종양; 유년기의 원인불명의 원발성 부위 암; 유년기의 일반적이지 않은 암; 요관 및 신우 이행 세포암; 요도암; 자궁 육종; 질암; 유년기 시각 경로 및 시상하부 신경교종; 외음부암; 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 및 윌름 종양. 본 발명의 방법은 상기 유형의 암을 치료하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 급성 췌장염을 치료하거나 예방할 필요가 있는 피검체에게 치료적 유효량의 화학식 (Ⅰ) 또는 화학식 (Ⅱ)의 하나 이상의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 생물학적 활성 대사물, 용매화물, 수화물, 프로드럭, 거울상이성질체 또는 입체이성질체를 투여하는 단계를 포함하는, 급성 췌장염을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다.
췌장염은 소화 효소의 방출에 의해 매개되는 췌장의 염증이며, 이는 종국적으로 기관 자체의 파괴를 발생시킨다. 췌장염은 많은 합병증을 갖는 중증의 생명을 위협하는 질환일 수 있다. 중증의 경우, 출혈, 심장, 폐 및 신장에 대한 조직 손상, 및 감염이 발생할 수 있다. 약 80,000명의 급성 췌장염 환자가 매년 미국에서 발생하며, 이중 약 20%가 중증이다. 췌장염에 대해 공지된 치료법은 없다. 췌장암을 치료하기 위한 현재의 방법은 이러한 췌장염이 스스로 해소되기를 기다리는 것과, 심장, 폐 및 신장의 합병증이 발생한 경우 이의 치료를 포함한다.
자가포식은 급성 췌장염에 의해 유도된 세포 손상을 매개하는데 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 조숙하게 활성화된 그 자신의 소화 프로테아제에 의한 췌장의 자가소화가 급성 췌장염의 발생에 중요한 것으로 생각된다. 리소좀 가수분해효소가 췌장 트립시노겐 활성화에서 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있으나, 트립시노겐이 상기 리소좀 효소를 어디서 어떻게 만나는지에 대해서는 아직 불명료하다. 최근에, 췌장염의 동물 모델에서 췌장 소화 효소의 방출에서 자가포식이 중요한 역할을 하는 것으로 제시되었다(Hashimoto, D., et al., Involvement of autophagy in trypsinogen activation within the pancreatic acinar cells. J Cell Biol, 2008. 181(7): p. 1065-72; and Ohmuraya, M. and K. Yamamura, Autophagy and acute pancreatitis: a novel autophagy theory for trypsinogen activation. Autophagy, 2008. 4(8): p. 1060-2). 주요 자가포식 유전자 Atg5가 결여된 Atg5-/- 마우스에서, 세룰레인(cerulein)에 의해 유도된 급성 췌장염의 중증도가 트립시노겐 활성화의 현저하게 감소된 수준으로 크게 감소된다. 따라서, 자가포식의 활성화는 트립시노겐의 트립신으로의 활성화를 매개함으로써 췌장 선포세포(pancreatic acinar cell)에 유해한 효과를 미칠 수 있다. 자가포식의 억제는 급성 췌장염에서 트립시노겐 활성화를 차단하는데 있어서 유일무이한 기회를 제공할 수 있다. 자가포식 억제제의 개발은 급성 췌장염에 대한 새로운 계열(first-in-class)의 억제제를 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 세포내 병원체에 의해 야기되는 질병을 치료하거나 예방할 필요가 있는 피검체에게 치료적 유효량의 화학식 (Ⅰ) 또는 화학식 (Ⅱ)의 하나 이상의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 생물학적 활성 대사물, 용매화물, 수화물, 프로드럭, 거울상이성질체 또는 입체이성질체를 투여하는 단계를 포함하는, 세포내 병원체에 의해 야기되는 질병을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 첸 등(Chen et al.)의 미국 특허 출원 공보 2009/0111799호(이의 전체내용은 참조로서 본원에 포함됨)를 참조하라.
최근의 연구는 박테리아, 예를 들어, 미코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 시겔라 종(Shigella spp.) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 뿐만 아니라 바이러스 및 증식하는데 자가포식소체를 이용하는 원생동물을 포함하는 세포내 병원체에 대한 세포 방어에서 자가포식에 대한 역할을 확립하였다. 자가포식의 수행은 영양 상태, 성장 인자/사이토카인, 및 저산소증과 같은 주로 생리학적 요인에 의해 영향을 받는 업스트림 신호전달 시스템에 의해 조절된다. 자가포식의 약리학적 유도가 세포내 병원체에 대해 방어하기 위해 상기 선천면역의 효과기가 촉발되거나 증폭되는 치료 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 탈유비퀴틴화 프로테아제 복합체(deubiquitinating protease complex)와 화학식 (Ⅰ) 또는 화학식 (Ⅱ)의 하나 이상의 화합물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 탈유비퀴틴화 프로테아제 복합체를 비활성화시키는 방법에 관한 것으로, 상기 탈유비퀴틴화 프로테아제 복합체는 USP3 및 USP10을 포함한다. 이러한 방법은 탈유비퀴틴화 프로테아제 복합체의 활성에 의해 야기되거나 강화되는 임의의 질환을 개선시키는데 사용될 수 있다.
조합 요법
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 단독으로 사용되거나, 암 및 췌장염과 같은 질병을 치료하기 위한 또 다른 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 단독으로 사용되거나, 추가 작용제, 예를 들어, 치료제와 조합하여 사용될 수 있음이 이해되어야 하며, 상기 추가 작용제는 이의 소기의 목적상 당업자에 의해 선택된다. 예를 들어, 추가 작용제는 본 발명의 화합물에 의해 치료되는 질병 또는 질환을 치료하는데 유용한 것으로 당 분야에 인정된 치료제일 수 있다. 추가 작용제는 또한 치료 조성물에 이로운 특성을 부여하는 작용제, 예를 들어, 조성물의 점성도에 영향을 주는 작용제일 수 있다.
본 발명에 의해 고려되는 조합 요법은, 예를 들어, 단일한 약학적 제형으로서의 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 추가 작용제(들)의 투여, 뿐만 아니라 별개의 약학적 제형으로서의 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 추가 작용제(들)의 투여를 포함한다. 즉, 공동-투여는 둘 모두의 작용제의 조합의 이로운 효과를 제공하기 위한 피검체로의 두개 이상의 작용제의 투여를 의미한다. 예를 들어, 작용제는 동시에 투여되거나, 일정 기간에 걸쳐 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명에 포함되는 조합물은 이의 소기의 목적에 유용한 조합물인 것이 추가로 이해되어야 한다. 하기에 나열되는 작용제는 목적상 예시이며, 이로 제한하고자 함이 아니다. 본 발명의 일부인 조합물은 본 발명의 화합물, 및 하기 목록으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 작용제일 수 있다. 조합물은 또한, 형성된 조성물이 이의 소기의 기능을 수행할 수 있도록 조합되는 경우 하나 이상의 추가 작용제, 예를 들어, 두개 또는 세개의 추가 작용제를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 일 양태는 암의 치료를 위한 항-혈관형성 억제제와 조합된 소분자 자가포식 억제제(예를 들어, 화학식 (Ⅰ) 또는 화학식 (Ⅱ)의 화합물)의 사용에 관한 것이다. 항-혈관형성 억제제가 종양 생존 및 성장을 뒷받침하는데 필요한 종양에서의 혈관의 생성을 억제함으로써 종양 성장 억제를 기약하는 것이 공지되어 있다. 예를 들어, 혈관형성억제제 엔도스타틴 및 관련 화학물질은 혈관의 형성을 억제하고, 종양 성장을 감소시킬 수 있다. 수백개의 항-혈관형성 약물의 임상 시험이 현재 진행중이다. 환자의 시험에서, 항-혈관형성 요법은 비교적 적은 부작용으로 종양 성장을 억제할 수 있다. 그러나, 항-혈관형성 요법 단독은 환자의 생존을 연장시키기에 불충분할 수 있고, 따라서 통상적인 화학요법제와의 조합이 이로울 수 있다. 특히, 자가포식 억제제는 단독으로 작용하거나, 항-혈관형성 요법과 조합하여 작용하는 새로운 선택권을 제공할 수 있다.
엔도스타틴은 베클린 1(Beclin 1) 및 베타-카테닌 수준을 조절함으로써 내피 세포에서 자가포식을 유도하는 것으로 밝혀졌다(Nguyen, T.M., et al., Endostatin induces autophagy in endothelial cells by modulating 베클린 1 and beta-catenin levels. J Cell Mol Med, 2009). 본원에 개시된 바와 같이, 자가포식 억제제는 기아 조건하에서 암세포의 서브셋을 선택적으로 사멸시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 일반적으로 세포독성이 아닌 자가포식 억제제에 대해 암세포를 감작시키기 위해 추가 대사 스트레스를 유도시킬 수 있는 것으로 제시되었다. 따라서, 항-혈관형성 요법 및 항-자가포식 요법의 조합은 정상 세포에 대한 세포독성 없이 암의 치료를 위한 새로운 선택권을 제공할 수 있다(Ramakrishnan, S., et al., Autophagy and angiogenesis inhibition. Autophagy, 2007. 3(5): p. 512-5).
본 발명의 화합물과 조합될 수 있는 항-혈관형성 작용제의 비제한적인 예는, 예를 들어, 하기를 포함한다: 베바시주맙(bevacizumab)(Avastin®), 카르복시아미도트리아졸, TNP-470, CM101, IFN-α, IL-12, 혈소판 인자-4, 수라민(suramin), SU5416, 트롬보스폰딘(thrombospondin), VEGFR 길항제, 헤파린을 갖는 혈관형성억제 스테로이드, 연골 유래 혈관형성 억제 인자, 기질 금속단백분해효소 억제제, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 2-메톡시에스트라디올, 테코갈란(tecogalan), 트롬보스폰딘, 프롤락틴, αVβ3 억제제 및 리노마이드(linomide).
또한, 톰슨 등(Thompson et al.)의 미국 특허 출원 공보 2008/0269259호(전체내용이 참조로서 본원에 포함됨)에 기재된 바와 같이, 자가포식 억제제는 하나 이상의 자가포식 억제제와 해당 의존성 암을 해당이 불가능한 세포로 전환시키는 하나 이상의 항암 화합물을 조합시킴으로써 해당 의존성 암을 갖는 것으로 확인된 피검체를 치료하는데 사용될 수 있다. 해당 의존성 암을 해당이 불가능한 세포로 전환시키는 항암 화합물의 예는 알킬화 작용제; 니트로소우레아; 항종양 항생제; 코르티코스테로이드 호르몬; 항-에스트로겐; 아로마타아제(Aromatase) 억제제; 프로게스틴(Progestin); 항-안드로겐; LHRH 효능제; 키나아제 억제제; 및 항체 요법제; 예를 들어, 부술판(busulfan), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 다카르바진(dacarbazine)(DTIC), 메클로르에타민(mechlorethamine)(질소 머스타드), 멜팔란(melphalan), 카르무스틴(carmustine)(BCNU), 로무스틴(lomustine)(CCNU), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin)(Adriamycin), 이다루비신(idarubicin), 미톡산트론(mitoxantrone), 프레드니손(prednisone), 덱사메타손(dexamethasone), 타목시펜(tamoxifen), 풀베스트란트(fulvestrant), 아나스트로졸(anastrozole), 레트로졸(letrozole), 메게스트롤 아세테이트(megestrol acetate), 비칼루타미드(bicalutamide), 플루타미드(flutamide), 류프롤리드(leuprolide), 고세렐린(goserelin), 글리벡(gleevac), 이레싸(Iressa), 타르세바(Tarceva), 헤르셉틴(Herceptin), 아바스틴(Avastin), L-아스파라기나제(L-asparaginase) 및 트레티노인(tretinoin)을 포함한다.
투여량
본원에서 사용되는 용어 "치료적 유효량" 또는 "치료적 유효 용량"은 질환의 진행을 전체적 또는 부분적으로 억제하거나, 질환의 하나 이상의 증상을 적어도 부분적으로 완화시키는 본 발명의 화합물 또는 두개 이상의 상기 화합물의 조합물의 양이다. 치료적 유효량은 또한 예방적으로 효과적인 양일 수 있다. 치료적으로 유효한 양은 환자의 크기 및 성별, 치료되는 질환, 질환의 중증도 및 요망되는 결과에 좌우될 것이다. 제공된 환자에 대해, 치료적 유효량은 당업자에게 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 화합물에 대해, 치료적 유효량은 세포 검정으로부터 최초로 평가될 수 있다. 예를 들어, 용량은 세포 검정에서 결정시 IC50(즉, 최대의 절반(half-maximal) 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 혈중 농도 범위를 달성하기 위해 세포 및 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 일부 경우에, 3 내지 5%의 혈청 알부민의 존재하에서 IC50을 결정하는 것이 적절한데, 이는 이러한 결정이 화합물에 대한 혈장 단백질의 결합 효과를 어림잡기 때문이다. 이러한 정보는 인간에서의 유용한 용량을 보다 정확히 결정하는데 사용될 수 있다.
치료적 유효 용량은 환자에서 증상을 개선시키는 화합물의 양을 의미한다. 이러한 화합물의 독성 및 치료 효능은, 예를 들어, 최대 내약 용량(maximum tolerated dose, MTD) 및 ED50(최대의 50% 반응에 효과적인 용량)을 결정하기 위한 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이며, 이는 MTD와 ED50 사이의 비로 표현될 수 있다. 이러한 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터가 인간에서 사용하기 위한 투여량의 범위를 제형화하는데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 독성이 없이 ED50을 포함하는 혈중 농도 범위에 위치한다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 다양할 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태에 비추어 개개의 의사에 의해 선택될 수 있다(예를 들어, Fingl et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p1 참조). 질병의 위험기의 치료에서, MTD에 도달하는 정확한 볼루스 또는 주입의 투여가 신속한 반응을 수득하는데 필요할 수 있다.
투여량 및 간격은 키나아제 조절 효과, 또는 최소 효과 농도(MEC)를 유지하는데 충분한 활성 모이어티(moiety)의 혈장 수준을 제공하기 위해 개별적으로 조정될 수 있다. MEC는 각각의 화합물에 대해 다양할 것이나, 이는 시험관내 데이터로부터 평가될 수 있다. MEC를 달성하는데 필요한 투여량은 개별적 특징 및 투여 경로에 좌우될 것이다. 그러나, HPLC 검정 또는 생물학적 검정이 혈장 농도를 결정하는데 사용될 수 있다.
투여 간격은 또한 MEC 값을 이용하여 결정될 수 있다. 화합물은 증상의 요망되는 개선이 달성될 때까지 시간의 10-90% 동안, 바람직하게는 30-90%, 가장 바람직하게는 50-90% 동안 MEC를 초과하는 혈장 수준을 유지시키는 요법을 이용하여 투여되어야 한다. 국소 투여 또는 선택적 흡수의 경우, 약물의 효과적인 국소 농도는 혈장 농도와 관련이 없을 수 있다.
물론, 투여되는 조성물의 양은 치료되는 피검체, 피검체의 체중, 질병의 중증도, 투여 방식 및 처방을 내리는 의사의 판단에 좌우될 것이다.
키트
본 발명의 화합물 및 조성물(예를 들어, 화학식 (Ⅰ) 또는 화학식 (Ⅱ)의 화합물 및 조성물)은 요망시 키트(예를 들어, 팩 또는 분배기 장치)로 제공될 수 있다. 팩은, 예를 들어, 금속 또는 플라스틱 호일, 예를 들어, 수포 팩을 포함할 수 있다. 팩 또는 분배기 장치는 본원에 기재된 임의의 방법에서 화합물의 사용을 위한 설명서를 동봉할 수 있다. 양립되는 약학적 담체에 제형화된 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물이 또한 제조될 수 있고, 적절한 용기에 위치될 수 있고, 표시된 질환의 치료를 위해 라벨링될 수 있다. 사용 설명서가 또한 제공될 수 있다.
예시
본 발명은 이제 전반적으로 기재되며, 이는 단지 본 발명의 특정 양태 및 구체예의 예시를 위해 포함되나, 본 발명을 제한하는 것이 아닌 하기 실시예를 참조로 하여 보다 용이하게 이해될 것이다.
실시예 1: 자가포식의 소분자 억제제의 분리
자가포식의 메커니즘을 조사하고, 자가포식을 활성화시킬 수 있는 추가의 소분자를 확인하기 위해, 자가포식 조절인자에 대한 고속-처리 이미지 기반의 스크린을 개발하였다. 이러한 시스템은 자가포식의 유도시 자가포식소체막으로의 GFP에 커플링된 경쇄 3(LC3-GFP)의 국소화의 장점을 취한다(Zhang, L., Yu, J., Pan, H., Hu, P., Hao, Y., Cai, W., Zhu, H., Yu, A.D., Xie, X., Ma, D., et al. (2007). Small molecule regulators of autophagy identified by an image-based high-throughput screen. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 19023-19028). 효모 ATG8의 오솔로그(ortholog)인 포유동물 LC3는 자가포식소체막을 특별히 담당하는 것으로 밝혀졌다(Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T., Yamamoto, A., Kirisako, T., Noda, T., Kominami, E., Ohsumi, Y., and Yoshimori, T. (2000). LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J 19, 5720-5728; and Mizushima, N., and Yoshimori, T. (2007). How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy 3, 542-545). 세포 당 LC3-GFP-양성 자가포식소체의 수는 정상 성장 조건하에서 매우 낮으나, 이는 혈청 기아 또는 라파마이신의 첨가시 급속히 증가된다. 그러나, LC3-GFP의 세포 수준을 증가시키는 화합물은 자가포식의 분해 활성을 반드시 증가시킬 수 있는 것은 아니다. 대신, LC3-GFP의 증가는 세포 사멸과 관련될 수 있거나, 이는 리소좀 결함의 결과일 수 있고, 이에 따라 자가포식의 봉쇄와 관련될 수 있다.
480개의 공지된 생물활성 화합물의 스크린에서, LC3-GFP-기반의 고속 처리 이미지 스크린을 세포 손상 발생의 결과로서 또는 다운스트림 리소좀 기능을 차단함으로써 LC3-GFP의 수준을 비특이적으로 증가시키는 것으로부터 자가포식 분해를 특이적으로 유도할 수 있는 화합물의 확인을 가능케 하는 장기간(long-lived)의 단백질 분해에 대한 저속 처리 검정과 커플링시켰다. 스크린의 결과로 8개의 화합물을 확인하였고, 이중 7개가 명백한 세포 손상을 야기시킴이 없이 자가포식을 유도할 수 있고, 장기간의 단백질 분해를 촉진할 수 있는 FDA-승인 약물이었다(Zhang, L., Yu, J., Pan, H., Hu, P., Hao, Y., Cai, W., Zhu, H., Yu, A.D., Xie, X., Ma, D., et al. (2007). Small molecule regulators of autophagy identified by an image-based high-throughput screen. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 19023-19028).
이러한 스크린에서, 이전에 PDE5 억제제로 공지된, 공지된 생물활성 화합물 MBCQ(도 1a)(MacPherson, J.D., Gillespie, T.D., Dunkerley, H.A., Maurice, D.H., and Bennett, B.M. (2006). Inhibition of phosphodiesterase 5 selectively reverses nitrate tolerance in the venous circulation. J Pharmacol Exp Ther 317, 188-195)가 자가포식 억제제 활성을 갖는 것으로 확인하였다. 라파마이신(0.2 μM)을 이용한 LC3-GFP-H4 세포의 자극은 예상된 바와 같이 LC3-GFP의 수준을 증가시켰다. MBCQ의 존재는 기초 수준 뿐만 아니라 라파마이신 자극된 LC3-GFP 둘 모두를 억제하였다. 라파마이신 단독에 비해 MBCQ 및 라파마이신의 첨가 1시간 후에서 LC3-GFP 도트의 감소가 명백하였다. 고속 처리 현미경검사법을 이용한 LC3-GFP 도트의 정량적 분석(도 1b). MBCQ의 처리는 대조군 또는 라파마이신 처리 단독에 비해 LC3-GFP 도트의 수, 스폿 크기 뿐만 아니라 스폿 세기를 감소시켰다. LC3-GFP의 세기를 라파마이신 단독에 비해 라파마이신 및 MBCQ 둘 모두의 존재하에서 측정하였고, MBCQ의 IC50이 0.788 ㎛인 것으로 결정되었고, 이는 10 mM의 작업 농도를 갖는 통상적으로 사용되는 타입 Ⅲ PtdIns3P 키나아제 억제제인 3-메틸-아데닌(3-MA)보다 약 10,000배 더 효능이 있는 것이다.
MBCQ에 의한 자가포식의 억제를 확인하기 위해, H4-LC3 세포, 293T 세포 및 마우스 배아 섬유모세포를 MBCQ로 처리하였고, 내인성 LC3Ⅱ의 수준을 웨스턴 블롯으로 측정하였다. MBCQ의 억제 활성과 일치하게, LC3Ⅱ의 수준은 라파마이신 단독에 비해 MBCQ 및 라파마이신 공동 처리된 H4-LC3, 293T 및 MEF 세포에서 시종일관 감소되었다. LC3-GFP 분석(도 1b)과 일치하게, LC3Ⅱ의 수준은 라파마이신 단독에 비해 1시간 동안 라파마이신 및 MBCQ를 이용한 처리 후에 현저히 낮았다.
기아 유도 자가포식에 대한 MBCQ의 효과를 결정하기 위해, H4-LC3-GFP 세포를 1시간 동안 행크(Hanks) 완충액에서 배양하였고, 이는 LC3-GFP 도트의 수준의 증가에 의해 입증되는 바와 같이 자가포식을 유도하기에 충분하였다(도 2). MBCQ(5 μM)의 존재하에서, 기아 유도 자가포식은 LC3-GFP 스폿 수, 스폿 크기 및 스폿 세기의 정량적 측정을 현저히 감소시켰고, 이는 기아 유도 자가포식이 MBCQ (5 μM) 또는 3-MA(10 mM) 또는 워트만닌(0.1 μM)의 양성 조절에 의해 억제된 것을 입증하였다.
라파마이신으로 처리된 세포의 미세구조(ultra-structure)를 MBCQ의 존재 또는 부재하에서 결정하였다. 4시간 동안 MBCQ 단독으로 처리된 세포가 비히클(1% DMSO)로 처리된 대조군과 형태적으로 유사한 것으로 밝혀졌다. 라파마이신의 처리는 특징적인 이중막을 갖는 많은 수의 자가포식소체를 형성시켰다. 이러한 이중막 자가포식소체는 라파마이신 및 MBCQ를 함께 처리한 세포에서 명백히 부재하였다(도 3).
실시예 2: MBCQ의 구조 활성 상관관계(SAR)
MBCQ는 4-헤테로원자-치환된 퀴나졸린 화합물이다. SAR를 위해, MBCQ의 구조를 도 4a에 도시된 바와 같이 파트 A, B 및 C의 세개의 파트로 나누었다.
파트 A에서, 할로겐, 전자-결여 기(예를 들어, 니트로 및 메틸 설포닐기), 및 전자-풍부기(예를 들어, 메톡시 및 아미노기)의 다양한 치환기를 6-위치에 도입시켰고; 할로겐을 7-위치에 도입시켰고; 할로겐을 6-위치 및 8-위치 둘 모두에 도입시켰고; 메틸 또는 아미노기를 2-위치에 도입시켰다.
파트 B에 대해, 질소를 산소 또는 황 원자로 대체시켰고; 메틸렌 사슬을 연장시켰고; 브랜치 포인트(즉, 치환)를 메틸렌 사슬에 추가하였다.
파트 C에서, 4-피리디닐, 모르폴리닐, 및 치환 및 비치환된 페닐을 포함하는 다양한 방향족 고리의 효과를 연구하였다. 치환된 페닐 치환기는 전자 끄는 기(예를 들어, 할로겐, 니트로, 및 트리플루오로메틸기) 치환된 페닐 5) 및 전자 주는 기(예를 들어, 아미노, 메톡시기) 둘 모두를 포함하였다.
MBCQ 구조에 대한 상기 변형을 갖는 전체 194개의 화합물을 합성하였고, 자가포식 억제에서의 이의 활성을 분석하였다.
SAR 결과는 하기와 같이 요약될 수 있다(또한, 도 4b 참조):
(1) 퀴나졸린의 6-위치의 치환기의 특성은 활성에 중요하다. 전자 끄는 치환기(예를 들어, 니트로 또는 플루오러스(fluorous)기)는 활성을 개선시킨다(예를 들어, 도 16에서 C29). 6-위치에 전자 주는 치환기(예를 들어, 아미노기)를 갖는 화합물은 활성을 갖지 않는다(예를 들어, 도 14의 C71). 6-위치에 치환기를 갖지 않는 화합물은 중간 활성을 갖는다.
(2) 7-위치 및 8-위치의 치환기는 활성에 대해 음성 효과를 갖는다. 예를 들어, 퀴나졸린이 7-위치 및 8-위치에서 단일 치환되는 경우, 화합물은 활성을 상실하고(예를 들어, C83), 6-위치 및 8-위치 둘 모두에서 클로로기로 이중치환된 화합물도 동일하다(예를 들어, C19, C20).
(3) 파트 A에서의 입체구조적 방해는 활성을 방해한다(예를 들어, C68, C01).
(4) 파트 B에서의 헤테로원자가 O 또는 S인 경우, 활성이 검출되지 않았다(예를 들어, C101, C45).
(5) 파트 C의 벤젠이 모르폴린 또는 푸란으로 대체되는 경우 화합물은 활성을 상실한다(예를 들어, C78, C54).
(6) 파트 C에서 4-CF3, 4-NO2 또는 4-피리딘을 갖는 화합물은 활성을 나타내지 않는다(예를 들어, C15). 3-위치, 4-위치 및 5-위치에 동시에 치환기가 있는 경우, 활성이 검출되지 않았다(예를 들어, C15).
(7) 파트 B의 헤테로원자가 1-3 탄소와 연결된 질소인 경우 높은 활성이 관찰되었다(예를 들어, C16, C51 및 C13). 3개 이상의 메틸렌 단위가 파트 A와 파트 C를 연결하는 사슬 내에 존재하는 경우 활성이 검출되지 않았다(예를 들어, C30, C49). 또한, 브랜치 사슬 상의 부피가 큰 치환기는 활성을 발생시키지 않는다(예를 들어, C81, C86 및 C94). 또한, 브랜치 사슬 상의 다양한 광학 입체형상(R 또는 S)을 이용하여 활성에 대한 인지가능한 효과가 검출되지 않았다(예를 들어, C69 및 C84, C76 및 C77).
자가포식 억제 활성에 대해 합성되고 분석된 MBCQ 유도체 중에서, 44개의 화합물이 MBCQ와 유사하거나 이를 초과하는 자가포식 억제 활성을 나타내었다(도 16). 동시에, C71 및 C82와 같은 다수의 화합물을 확인하였고, 이들은 MBCQ와 구조적으로 유사하나, 자가포식 억제 활성을 갖지 않으며, 이후의 실험에서 음성 대조군으로 사용하였다(도 15).
자가포식에 대한 억제 활성을 확인하기 위해, 마우스 배아 섬유모세포(MEF)를 라파마이신의 존재 또는 부재하에서 4시간 동안 C29, C43 또는 C71로 처리하였고, 자가포식의 수준을 LC3 웨스턴 블로팅으로 결정하였다. C43 또는 C29의 처리는 라파마이신에 의해 유도된 자가포식을 억제하였으나, 음성 대조군 C71은 그렇지 않았다(도 5a). 자가포식에 대한 C29 및 C43의 효과는 전자현미경검사에 의해 추가로 확인되었다. 라파마이신 처리된 MEF 세포에서, 예상된 바와 같이 이중막을 갖는 다수의 자가포식소체 소포, 뿐만 아니라 다중막을 갖는 많은 소포가 관찰되었다(도 5b). 라파마이신 및 C29 또는 C43으로 처리된 세포에서, 비히클 처리된 세포에서와 같이 자가포식소체가 대부분 부재하였다(도 5).
실시예 3: MBCQ는 자가포식을 수반하는 선택적 세포 사멸 모델을 억제한다.
세포 활성에 대한 MBCQ의 효과를 특성규명하기 위해, 세포 생존 및 세포 주기에 대한 MBCQ의 효과를 하기 기재되는 바와 같이 결정하였다. H4 세포를 5일 동안 MBCQ(5 μM)로 처리하고, 트립판 블루의 존재하에서 세포 수 계수를 위해 매일 수거하였다. 도 6a에 도시된 바와 같이, MBCQ의 처리는 세포 증식에 대해 효과가 없었다. 24시간 및 48시간 동안 MBCQ(5 μM)로 처리된 H4 세포에서 세포 주기 프로파일 및 발생할 수 있는 아폽토시스 세포를 또한 결정하였다. 도 6b에 도시된 바와 같이, MBCQ는 세포 주기 분포에 대해 검출가능한 효과를 갖지 않았다.
자가포식은 다수의 아폽토시스 결핍 세포 유형에서 세포 사멸의 원인이 되는 것으로 제안되었다. 예를 들어, bax/bak 이중 결핍 마우스 배아 섬유모세포(DKO mefs)는 아폽토시스에 대해 매우 내성이다(Wei, M.C., Zong, W.X., Cheng, E.H., Lindsten, T., Panoutsakopoulou, V., Ross, A.J., Roth, K.A., MacGregor, G.R., Thompson, C.B., and Korsmeyer, S.J. (2001). Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science 292, 727-730). 에토포시드(etoposide)를 이용한 bax/bak DKO mefs의 자극은 자가포식 유도를 통해 부분적으로 세포 사멸을 유도하는 것으로 밝혀졌다(Shimizu, S., Kanaseki, T., Mizushima, N., Mizuta, T., Arakawa-Kobayashi, S., Thompson, C.B., and Tsujimoto, Y. (2004). Role of Bcl-2 family proteins in a non-apoptotic programmed cell death dependent on autophagy genes. Nat Cell Biol 6, 1221-1228). MBCQ가 에토포시드에 의해 유도된 bax/bak DKO 세포의 세포 사멸을 유도할 수 있는지 시험하기 위해, Bax/bak DKO 세포를 8시간 동안 MBCQ(10 μM), 또는 양성 대조군으로서 3-MA(10 mM)의 존재하에서 에토포시드로 처리하였다. 도 7a에 도시된 바와 같이, MBCQ의 존재는 bax/bak DKO MEF 세포의 세포 사멸을 현저히 감소시켰다. 또한, MBCQ에 의한 억제와 일치하게, LC3Ⅱ의 수준은 에토포시드 처리된 세포에서 증가하였으나, MBCQ의 존재하에서 감소하였다(도 7b).
실시예 4: MBCQ는 PI3P의 세포 수준을 선택적으로 감소시킨다.
MBCQ는 라파마이신 및 기아에 의해 유도된 자가포식을 억제하므로, MBCQ가 mTOR의 활성에 영향을 주는 지의 여부를 먼저 결정하였다. 웨스턴 블로팅 검정은 MBCQ가 대조군 또는 라파마이신 처리된 세포에서 mTOR 및 이의 표적 p70S6K 및 S6의 인산화에 대해 영향을 주지 않는 것을 입증하였다. MBCQ는 GSK-3α/β, AKT의 인산화에 대해 어떠한 영향도 주지 않았다. AKT의 인산화는 타입 Ⅰ PtdIns3(PI3) 키나아제에 의해 조절되므로, 이러한 결과는 또한 MBCQ가 타입 Ⅰ PI3 키나아제에 대해 영향을 주지 않는 것을 암시한다. 따라서, MBCQ는 mTOR 경로 또는 타입 Ⅰ PI3 키나아제에 대해 영향을 주지 않는 것으로 결론내려졌다.
마커로서 EEA1의 면역염색을 이용한 초기 엔도좀, 마커로서 lamp2 또는 리소트래커(lysotracker)의 면역염색을 이용한 리소좀, 마커로서 GalT-YFP를 이용한 트랜스-골지(trans-Golgi)에 대한 MBCQ의 효과를 결정하였다. 상기 실험 중 어느 실험에서도 MBCQ의 효과가 검출되지 않았다. 따라서, MBCQ는 주요 세포내 소기관에 영향을 주지 않은 것으로 결론내려졌다.
또한, 단생(short-lived) 펩티드와의 GFP 융합체인 pEGFP-CL1을 이용한 프로테아좀 분해 경로에 대한 MBCQ의 효과를 결정하였다(Bence, N.F., Sampat, R.M., and Kopito, R.R. (2001). Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science 292, 1552-1555). MBCQ가 pEGFP-CL1의 수준에 영향을 주지 않는 것으로 밝혀졌고, 이는 MBCQ가 프로테아좀 경로에 대해 일반적으로 영향을 주지 않는 것을 암시한다(데이터는 제시되지 않음). 또한, MBCQ의 처리는 폴리유비퀴틴화(polyubiquitination)의 일반적 수준에 대해 영향을 주지 않는다. 따라서, MBCQ는 유비퀴틴-프로테아좀 분해 경로에 일반적으로 영향을 주지 않는 것으로 결론내려졌다.
PtdIns3P(PI3P)의 수준은 자가포식을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있다(Levine, B., and Klionsky, D.J. (2004). Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev Cell 6, 463-477). MBCQ가 PI3P에 영향을 주는지 확인하기 위해, FYVE-RFP를 발현하는 H4 세포를 사용하였다. FYVE는 PI3P에 특이적으로 결합하고, PI3P에 대한 세포 수준에 대한 마커로 널리 사용된다(Gaullier, J.M., Simonsen, A., D'Arrigo, A., Bremnes, B., Stenmark, H., and Aasland, R. (1998). FYVE fingers bind PtdIns(3)P. Nature 394, 432-433). 흥미롭게도, MBCQ의 처리는 기본 H4 세포 및 라파마이신 처리된 H4 세포 둘 모두에서 FYVE-RFP 스폿의 수준을 신속하고 효과적으로 감소시킨 반면, 웨스턴 블로팅에 의해 검출된 FYVE-RFP의 수준은 변화되지 않았다(도 8).
PtdIns3P의 세포 수준에 대한 MBCQ의 효과를 추가로 결정하기 위해, 지질 도트 블롯 검정을 이용하였다. 세포 PtdIns 종을 추출하고, 폴리비닐리덴 플루오라이드 막에 적용시켰다. GST-PX 도메인 단백질 및 항-GST 항체를 이용하여 PtdIns3P의 수준을 검출하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, MBCQ 및 C43의 처리는 기본 세포 및 라파마이신 처리된 세포 둘 모두에서 PtdIns3P의 세포 수준을 선택적으로 감소시켰다. 종합적으로, MBCQ가 PtdIns3P의 수준을 감소시키는 것으로 결론내려졌다.
실시예 5: MBCQ 및 이의 활성 유도체는 Vps34의 복합체의 분해를 선택적으로 촉진한다.
타입 Ⅲ PtdIns3 키나아제 복합체 Vps34/베클린1/p150은 PtdIns3P를 생성시키는 PtdIns의 인산화를 책임지므로, Vps34 복합체의 키나아제 활성에 대한 MBCQ 억제 활성을 결정하였다. 293T 세포를 HA-Vps34/GFP-베클린1으로 트랜스펙션시켰다. 항-HA를 이용하여 면역침전된 Vps34 복합체를 γ-32P-ATP의 존재하에서 PtdIns와 인큐베이션시켰다. 인산화 생성물을 박층 크로마토그래피, 및 이후 자가방사선술로 분석하였다. 도 10a에 도시된 바와 같이, PtdIns의 인산화는 워트만닌에 의해 억제되나, MBCQ에 의해 억제되지 않는다. 따라서, MBCQ는 Vps34 효소 활성의 직접적인 억제인자가 아닌 것으로 결론내려졌다.
다른 한편으로, flag-태깅된 베클린1 및 HA-Vps34의 수준이 비활성 유사체인 C82 보다 MBCQ, C29 또는 C43 처리된 세포에서 상당히 낮은 것으로 인지되었다(도 10b). MBCQ, C29 및 C43의 처리는 또한 GFP-p150 및 Atg14L의 수준을 감소시켰으나, C82는 그렇지 않았다(도 10c-d).
또한, MBCQ 및 C43이 H4 세포 및 293T 세포(도 10f)에서 내인성 베클린1, Vps34 및 Atg14L(도 10e)의 수준을 감소시킬 수 있는 것으로 밝혀진 반면, 공지된 자가포식 억제제 3-MA는 H4 세포에서 내인성 베클린1에 영향을 주지 않았다(도 10g).
MBCQ 및 C43이 내인성 베클린1에 유사한 영향을 주는지 결정하기 위해, 293T 세포를 CHX의 존재하에서 MBCQ 또는 C43으로 처리하여 단백질 합성을 억제시켰다. 베클린1의 수준은 6시간의 처리 후에 CHX 단독보다 MBCQ 또는 C43의 존재하에서 현저히 낮았다(도 10e). 따라서, MBCQ 및 C43 둘 모두가 내인성 베클린1의 분해를 촉진할 수 있는 것으로 결론내릴 수 있다.
MBCQ 및 C43이 Vsp34 복합체의 수준을 감소시키는 메커니즘을 조사하기 위해, 293T 세포를 프로테아좀 억제제 MG132 또는 NH4Cl와 함께 C43으로 처리하여 리소좀 분해를 억제시켰다. MG132의 존재는 GFP-베클린1의 감소를 억제하였으나, NH4Cl은 그렇지 않은 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 C43의 처리가 프로테아좀 경로를 통해 베클린1의 분해를 촉진하는 것을 암시한다. 따라서, C43이 Vps34/베클린1/p150/Atg14L/UVRAG를 포함하는 타입 Ⅲ PI3 키나아제 복합체의 분해를 선택적으로 촉진함으로써 자가포식을 억제하는 것으로 결론내려졌다.
실시예 6: MBCQ 및 이의 활성 유도체는 기아-유도 아폽토시스를 향상시킨다.
자가포식은 세포 생존을 뒷받침하기 위해 대사 스트레스 조건하에서 활성화되므로, 화합물이 기아 조건하에서 세포 사멸을 촉진하는지 결정하기 위해 화합물을 시험하였다. 게다가, C43이 혈청 비함유 조건하에서 MDA-MB-231 세포(도 11a) 및 글루코스 비함유 조건하에서 MCF-7 세포(도 11b)의 생존을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 웨스턴 블롯 분석은 C43의 처리가 기본 조건 및 글루코스 비함유 조건 둘 모두에서 MCF-7 세포에서 자가포식을 억제한 것을 입증하였다.
또한, C43이 10% 우 혈청의 존재하에서 유방암 세포주인 Bcap-37 세포의 증식을 억제한 것으로 밝혀졌다(도 11c). 추가로, Mcap-37 세포는 글루코스 비함유 조건하에서 C43에 대해 매우 민감화되었다(도 11d). 대조 조건 및 글루코스 비함유 조건 하에서 배양된 Bcap-37 세포의 웨스턴 블롯 분석은 C43의 처리가 기본 조건 및 글루코스 비함유 조건 둘 모두에서 자가포식을 억제한 것을 입증하였다.
C43이 Bcap-37 세포의 사멸을 유도하는 메커니즘을 조사하기 위해, FACS로 DNA 함량을 분석하였다. 글루코스 비함유 조건하에서 Bcap-37 세포의 처리가 아폽토시스 DNA 분획화와 일치하는 서브-디플로이드(sub-diploid) DNA의 피크를 유도한 것으로 밝혀졌다(도 11e). 또한, 카스파제 활성화의 특징인 PARP의 분해가 또한 6시간 동안 글루코스 비함유 조건하에서 C43으로 처리된 Bcap-37 세포에서 검출되었다(도 11f). 또 다른 유방암 세포주 BT549는 또한 C43의 처리에 대한 유사한 반응을 입증하였다.
분석되는 상기 암 세포주와는 대조적으로, 글루코스 비함유 조건하에서 스파우틴(spautin)을 이용한 Madin-Darby 개 신장(Madin-Darby canine kidney)으로부터 유래된 MDCK 세포의 처리는 아폽토시스를 유도하지 않았고, 48시간 동안 10 μM의 스파우틴으로 처리되는 경우 약 ~25%의 성장 억제가 관찰되었다(도 12a 및 12b). 종양 주위의 정상 조직으로부터 확립되고, 근육상피세포 기원인 Hs578Bst 세포는 또한 스파우틴에 대해 민감하지 않았다(도 12c 및 12d). 이러한 결과는 암세포가 증가된 대사 압력하에 있을 수 있고, 이에 따라 비-암세포보다 자가포식의 억제에 더욱 민감할 수 있는 가능성과 일치한다.
아폽토시스 결핍 조건하에서 자가포식의 증가된 활성화가 세포 사멸을 매개하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 가능성을 시험하기 위해, Bax-Bak 이중 녹아웃(DKO) 세포를 스파우틴의 존재 또는 부재하에서 DNA 손상 반응을 유도하는 에토포시드로 시험하였고, C43, MBCQ 및 3-MA가 Bax-Bak DKO 세포의 에토포시드 유도 사멸을 억제한 것으로 밝혀졌다.
따라서, 암세포의 서브셋이 자가포식의 억제에 선택적으로 민감할 수 있는 것으로 결론내려졌다.
실시예 7: 생체내에서의 MBCQ 유도체의 효과
생체내에서의 MBCQ 유도체의 효과를 시험하는 것을 개시하기 위해, 라파마이신이 주사된 마우스에서 자가포식을 억제하는 MBCQ 유도체의 능력을 연구하였다. 마우스를 4시간 동안 매 시간마다 양성 대조군으로서 라파마이신(10 mg/kg) 단독, 또는 C43 또는 MBCQ(40 mg/kg)를 복막내 주사한 후, 5시간에서 희생시켰다. 이후, 간에서의 자가포식 수준을 항-LC3 항체를 이용한 웨스턴 블로팅에 의해 분석하였다. 도 13A에 도시된 바와 같이, C43 또는 MBCQ의 투여는 LC3Ⅱ의 수준을 현저히 감소시켰다. 따라서, C43 및 MBCQ 둘 모두가 자가포식을 억제하는데 있어서 생체내에서 활성인 것으로 결정되었다.
자가포식은 췌장염에서 조직 손상의 원인이 되는 것으로 제안되었으므로, MBCQ 유도체가 세룰레인 주사에 의해 유도된 조직 손상을 감소시킬 수 있는지 확인하기 위해 췌장염의 널리 확립된 동물 모델에서 MBCQ 유도체를 시험하였다(Hashimoto, D., Ohmuraya, M., Hirota, M., Yamamoto, A., Suyama, K., Ida, S., Okumura, Y., Takahashi, E., Kido, H., Araki, K., et al. (2008). Involvement of autophagy in trypsinogen activation within the pancreatic acinar cells. J Cell Biol 181, 1065-1072; and Ohmuraya, M., and Yamamura, K. (2008). Autophagy and acute pancreatitis: a novel autophagy theory for trypsinogen activation. Autophagy 4, 1060-1062). 래트에 세룰레인(50 ng/kg) 단독 또는 C43(40 mg/kg)을 매시간마다 4회로 복막내 주사하였다. 래트를 마지막 주사 1시간 후에 희생시키고, 췌장을 웨스턴 블로팅 분석을 위해 분리시켰다. 도 13B에 도시된 바와 같이, 세룰레인의 주사는 보고된 바와 같이 자가포식을 유도하였고; C43의 공동 주사는 세룰레인 주사에 의해 유도된 자가포식의 수준을 현저히 감소시켰다. 종합적으로, C43은 세룰레인 유도 췌장염에서 유도된 자가포식을 감소시키는데 효과적인 것으로 결론내렸다.
실시예 8: 화합물의 제조
화학식 (Ⅰ) 및 화학식 (Ⅱ)의 화합물을 합성하기 위한 하나의 일반적 방법이 하기 반응식 1에 도시된다.
Figure pct00012
반응식 1
[1] 단계 1은 퀴나졸린-4-케톤(또는 8-아자-퀴나졸린-4-케톤)의 형성이다.
한 방법에서, 안트라닐산 메틸 에스테르(또는 메틸 2-아미노니코티네이트)는 1:15-20의 몰 비로 포름아미드와 혼합되고, 약 170-190℃에서 가열된다. 반응이 완료된 후, 혼합물은 냉각되고, 걸러지고, 세척되고, 건조된다. 생성된 미정제 생성물이 추가 처리 없이 다음 반응에 사용된다.
[2] 단계 2는 4-클로로퀴나졸린(또는 8-아자-4-클로로퀴나졸린)의 형성이다.
한 방법에서, 단계 1로부터의 미정제 생성물은 1:8.7-10의 몰 비로 포스포러스 옥시클로라이드와 혼합된 후, 약 100-115℃에서 가열된다. 반응이 완료된 후, 약 10-12시간에서 혼합물이 냉각되고, 과량의 포스포러스 옥시클로라이드가 회전 증발에 의해 제거된다. 유기 용매, 예를 들어, 디클로로메탄이 첨가되어 고체가 용해된 후, 암모니아의 첨가에 의해 생성된 용액이 약 7-8로 pH 조정된다. 생성된 혼합물은 디클로로메탄으로 추출되고, 건조되고, 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된다.
또 다른 방법에서, 단계 1로부터의 미정제 생성물은 촉매량의 무수 DMF(예를 들어, 0.5-1 mL)와 함께 1:15-20의 몰 비로 티오닐 디클로라이드와 혼합된 후, 약 80-90℃에서 가열된다. 반응이 완료된 후, 약 10-12시간에서 혼합물이 냉각되고, 과량의 티오닐 디클로라이드가 회전 증발기에 의해 제거되었다. 유기 용매, 예를 들어, 디클로로메탄이 첨가되어 고체가 용해된 후, 암모니아의 첨가에 의해 생성된 용액이 약 7-8로 pH 조정된다. 생성된 혼합물은 디클로로메탄으로 추출되고, 건조되고, 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된다.
또 다른 방법에서, 단계 1로부터의 미정제 생성물은 아르곤 하에서 옥살릴 클로라이드와 혼합되고, 무수 DMF가 적가되어, 1:1.5:1.5의 몰 비로 단계 1의 생성물:옥살릴 클로라이드:DMF의 혼합물이 형성된 후, 약 85-95℃로 가열된다. 약 7-10시간 후, 반응이 포화 디소듐 하이드로겐 포스페이트로 켄칭된다. 이후, 반응 혼합물은 컬럼 크로마토그래피에 의해 유기 용매, 예를 들어, 디클로로메탄으로 추출된다.
[3] 단계 3은 N-치환된-4-아미노-퀴나졸린(또는 8-아자-N-치환된-4-아미노-4-퀴나졸린)의 형성이다.
아르곤 하에서, 단계 2의 생성물 HXC(R2)(R3)(CH2)nZ(본원에 정의됨) 및 트리에틸아민이 유기 용매, 예를 들어, 테트라히드로푸란 중에서 1:1.25:1.68의 몰비로 조합되고, 약 75-80℃로 가열된다. 약 12-18시간 후, 유기 용매가 회전 증발에 의해 제거된다. 생성된 미정제 생성물은 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된다.
추가 예시를 위해, 화합물 A9, A30 및 A36의 합성이 하기에 보다 상세히 기재된다. 상기 기재된 바와 같이, 추가 화합물은 치환되거나 비치환된 4-클로로퀴나졸린(예를 들어, 하기 도시된 9-3)으로 커플링되는 아민을 다양화시킴으로써 제조될 수 있다.
A9 의 제조
Figure pct00013
반응식 2
디에틸 에테르(5 mL) 중의 AgNO2(448.5 mg, 2.92 mmol)의 현탁액에 아르곤 하에서 얼음-염 배쓰(bath) 중에서 화합물 9-1(500 mg, 2.65 mmol)을 적가하였다. 혼합물을 RT로 가온시키고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 여과시키고, 여과액을 진공하에서 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피(EA:PE, 1:100)로 정제하여 3개의 화합물을 생성시켰다. 1H NMR에 의해, 요망되는 화합물 9-2였는지 판단하는 것이 어려웠다.
CH3CN/H2O (1 mL/1 mL) 중의 화합물 9-2(150 mg, 0.967 mmol, MC0449-41-2) 및 KOH(81.4 mg, 1.451 mmol)를 함유하는 혼합물을 RT에서 2시간 동안 교반하였다. 이후, 셀렉트플루오르(selectfluor)(514.0 mg, 1.451 mmol)를 한번에 첨가하였다. 혼합물을 RT에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물(10 mL)에 붓고, 에틸 아세테이트(2 x 20 mL)로 추출하였다. 조합된 유기물을 염수(10 mL)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피(PE)로 정제하여, 무색 오일로 화합물 9-3(70 mg, 수율: 42%)을 생성시켰다.
이소프로필 알코올(5 mL) 중의 화합물 9-3(50 mg, 0.27 mmol) 및 (4-클로로페닐)메탄아민(47 mg, 0.33 mmol)의 용액에 Et3N(46 ㎕, 0.33 mmol)을 첨가하였다. 용액을 150℃에서 20분 동안 마이크로파 처리하였다. TLC는 반응이 완료된 것을 나타내었다. 혼합물을 농축시키고, 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 밝은 황색 고체로 A9(52 mg, 수율: 67%, 1H NMR, 및 LC-MS에 의해 확인됨)를 생성시켰다. 1H NMR은 도 23에 도시된다.
A30 의 제조
Figure pct00014
반응식 3
이소프로판올(4 mL) 중의 화합물 9-3(105 mg, 0.573 mmol), 30-9(94 mg, 0.573 mmol) 및 NEt3(0.22 mL, 1.64 mmol)의 용액을 20분 동안 150℃에서 마이크로파 처리하였다. 컬럼 크로마토그래피에 의한 농축 및 정제로 화합물 A30(80 mg, 수율: 45%, 1H NMR에 의해 확인)을 황색 고체로 생성시켰다. 1H NMR이 도 24에 도시된다.
A36 의 제조
Figure pct00015
반응식 4
DMSO (10 mL) 중의 화합물 36-1(1.0 g, 5.3 mmol) 및 NaCN(520 mg, 10.6 mmol)의 용액을 밤새 30℃에서 교반하였다. TLC는 반응이 완료된 것을 나타내었다. 혼합물을 물(30 mL)로 희석시키고, 에틸 아세테이트(50 mL)로 추출하였다. 유기층을 물(10 mL x 5) 및 NaHCO3(포화, 20 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔여물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일로 화합물 36-2(360 mg, 수율: 50%)를 생성시켰다.
THF(10 mL) 중의 화합물 36-2(346 mg, 2.56 mmol)의 용액에 라니 Ni를 첨가하였다. 이후, 혼합물을 농축된 수성 암모니아를 이용하여 PH=10으로 조정하고, 밤새 30℃에서 교반하였다. TLC는 반응이 완료된 것을 나타내었다. 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고, 여과액을 농축시켜 황색 오일로 화합물 36-3(120 mg, 수율: 34%)을 생성시켰다.
이소프로필 알코올(5 mL) 중의 화합물 9-3(50 mg, 0.27 mmol) 및 36-3(46 mg, 0.33 mmol)의 용액에 Et3N(46 uL, 0.33 mmol)을 첨가하였다. 용액을 150℃에서 20분 동안 마이크로파 처리하였다. TLC는 반응이 완료된 것을 나타내었다. 플래시 크로마토그래피에 의한 농축 및 정제로 백색 고체로 화합물 A36(48.4 mg, 수율: 63%, DMSO 중의 400 MHz에서 1H NMR, 및 MS에 의해 확인)을 생성시켰다. 1H NMR이 도 25에 도시된다.
실시예 9: PDE5-억제 활성으로부터의 자가포식-억제 활성의 분리
자가포식 억제에서의 MBCQ 유도체의 활성이 이의 PDE5 억제 활성으로부터 분리될 수 있는지 결정하기 위해 MBCQ 유도체의 구조 활성 관계(SAR)를 연구하였다. 상기 기재된 바와 같이 합성되고, 자가포식 억제 활성에 대해 분석된 MBCQ 유도체 중에서, 일부 화합물은 MBCQ와 유사하거나 이를 초과하는 자가포식 억제 활성을 나타내었고, 나머지는 항-자가포식 활성을 갖지 않았고, 이에 따라 이들은 음성 대조군으로 제공할 수 있다.
14개의 MBCQ 유도체를 선택하고, 이의 PDE5에 대한 활성을 스크리닝하였다(Wang, H., Yan, Z., Yang, S., Cai, J., Robinson, H., and Ke, H. (2008). Kinetic and structural studies of phosphodiesterase-8A and implication on the inhibitor selectivity. Biochemistry 47, 12760-12768). 이들 중에서, MBCQ와 동등한 0.87 μM의 IC50를 갖는 효과적인 자가포식 억제제인 C43(6-플루오로-N-(4-플루오로벤질)퀴나졸린-4-아민)이 PDE5 및 다른 PDE에 대해 훨씬 감소된 억제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 따라서, MBCQ의 PDE5 억제 활성은 자가포식 억제 활성으로부터 화학적으로 분리될 수 있다.
표 1. PDE5 활성의 억제% 결정의 요약
Figure pct00016
이러한 결론과 일치하게, MY-5445, 디피리다몰(dipyridamole), IBMX 및 실데나필(sildenafil)을 포함하는 스크리닝된 생물활성 라이브러리 중의 다수의 다른 공지된 PDE5 억제제가 존재하였으나, 이들은 자가포식 억제제로 회수되지 않았다. 이러한 결론을 추가로 확인하기 위해, 양성 대조군으로서 MBCQ를 이용하여 라파마이신 및 MY-5445(30 μM), 디피리다몰(80 μM), IBMX(100 μM) 또는 실데나필(10 μM)을 포함하는 다른 PDE5 억제제로 처리하였다. PDE5에 대해 2.5 nM의 EC50을 갖는 가장 효능있는 PDE5 억제제인 실데나필(Viagra)을 포함하는 시험된 PDE5 억제제 중 어느것도 자가포식에 대해 어떠한 활성을 갖지 않았다. 이러한 데이터로부터, MBCQ의 자가포식 억제제 활성이 이의 PDE5 억제 활성과 관련이 없는 것으로 결로내려졌다.
실시예 10: Vps34 복합체 Ⅰ에 대한 탈유비퀴틴화 프로테아제 복합체의 확인
유비퀴틴화는 프로테아좀 분해 매개에서 필수적인 중요 단계이다. 따라서, 베클린1의 유비퀴틴화가 C43로 처리된 세포에서 증가되는지 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 도 16에 도시된 바와 같이, C43이 베클린1의 유비퀴틴화를 촉진하는 것으로 밝혀졌다.
따라서, C43이 Vps34 복합체 Ⅰ의 유비퀴틴화를 음성적으로 조절하는 것으로 일반적으로 작용하는 탈유비퀴틴화 프로테아제 복합체(DUB)를 표적으로 하는 것으로 가정되었다. 이는 소분자가 활성인자이기 보다 억제제일 가능성이 가장 높다는 일반적인 발견을 따른다. 이러한 가정을 직접적으로 시험하기 위해, 다르마콘(Dharmacon) 라이브러리 SMART 푸울(pool)로부터의 인간 탈유비퀴틴화 효소를 표적으로 하는 127 siRNA의 집합물을, 녹다운되는 경우에 검정으로서 LC3-GFP-H4 세포를 이용한 자가포식의 억제를 발생시키는 DUB에 대해 스크리닝하였다.
siPLK1을 트랜스펙션 효율의 확인에 사용하였고, siVps34를 양성 대조군에 포함시켰다. 트랜스펙션 72시간 후, 세포를 추가 8시간 동안 DMSO, 자가포식을 유도하기 위한 라파마이신(200 nM), 또는 라파마이신(200 nM) 및 스파우틴(10 μM)을 각각 이중으로 처리하였다. 세포를 Hoechst 33342(0.5 μM)으로 대조염색시키고, 3.8% PFA에서 고정시켰다. 형광 이미지를 획득하였고, CellWoRx 고함량 세포 분석 시스템을 이용하여 정량하였다.
스크린은 기본 조건 뿐만 아니라 라파마이신의 존재하에서 녹다운되는 경우에 자가포식의 수준을 플레이트 메디안(plate median)으로부터 1.5 이상의 표준 편차까지 감소시키는 5개의 유전자로서 USP10, USP13, USP3, USP16 및 USP18을 확인하였다. H4 세포에서 Vps34 복합체에서의 단백질 발현 수준에 대한 상기 5개의 USP의 녹다운의 효과를 분석하였다. 5개의 USP 중 임의의 것의 녹다운이 내인성 Vps34, 베클린1, Atg14L 및 UVRAG의 수준을 감소시키는 것으로 밝혀졌다(도 17). 또한, 5개의 USP 중 임의의 것의 녹다운은 또한 다른 4개의 USP의 단백질 수준을 감소시켰다(도 18). 흥미롭게도, C43의 처리는 또한 상기 5개의 USP의 수준을 감소시켰다(도 18). 스파우틴의 처리는 또한 293T 세포 및 Bcap-37 세포에서 USP13 및 USP10의 수준을 감소시킬 수 있으나, USP44 및 관련되지 않은 USP의 수준에 대해서는 거의 영향을 주지 않는다.
이러한 결과는 USP3, USP10, USP13, USP16 및 USP18의 안정성이, 이들이 거대한 복합체로 존재하는 경우에 발생할 수 있는 서로에 대해 동반-의존적(co-dependent) 안정성인 것을 암시한다. 이러한 가능성을 시험하기 위해, GFP-USP10 및 Myc-USP13 플라스미드를 293T 세포로 트랜스펙션시키고, GFP-USP10 상호작용 및 Myc-USP13 면역침전에 의해 시험하였다. GFP-USP10 및 Myc-USP13이 확실히 상호작용하고, 중요하게는 이러한 상호작용이 스파우틴 처리 세포에서 억제된 것으로 밝혀졌다(도 19). 따라서, 스파우틴이 Vps34 복합체의 유비퀴틴화 상태를 조절하기 위해 탈유비퀴틴화 프로테아제 복합체를 적절히 표적으로 하는데 필요할 수 있는 USP10 및 USP13 상호작용을 붕괴시키는 것으로 결론내렸다.
USP10은 p53의 DUB로 공지되었음로, 이러한 p53에 대한 USP를 녹다운시키는 것의 효과를 또한 연구하였다. 5개의 USP 중 임의의 것의 녹다운이 p53의 감소를 발생시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다(도 20). 이러한 데이터는 USP3, USP10, USP13, USP16 및 USP18가 모두 p53의 조절인자인 것을 암시한다.
USP10 및 USP13이 Vps34 복합체의 탈유비퀴틴화 프로테아제인 것을 추가로 확인하기 위해, 293T 세포에서의 Flag-USP10/GFP-베클린1 및 Myc-USP13/GFP-베클린1의 상호작용을 면역침전을 이용하여 검정하였다. Flag-USP10 및 Myc-USP13 둘 모두가 GFP-베클린1과 상호작용할 수 있고, 흥미롭게도, 스파우틴의 처리가 Flag-USP10와 GFP-베클린1의 상호작용을 손상시킬 수 있으나, Myc-USP13과 GFP-베클린1의 상호작용을 손상시킬 수 없는 것으로 밝혀졌다(도 21B). 이러한 결과는 스파우틴이 USP10과 베클린1의 상호작용을 붕괴시키기 위해 USP10 또는 이의 업스트림을 표적으로 할 수 있음을 암시한다. 중요하게는, 베클린1 또는 Vps34의 녹다운이 USP10 및 USP10의 기질로 공지된 p53의 내인성 수준을 감소시킬 수 있는 것으로 또한 밝혀졌다(도 21C). 이는 Vps34 복합체가 USP10 및 USP13을 포함하는 이의 탈유비퀸화 프로테아제를 안정화시킴으로써 이의 자체 수준을 조절할 수 있는 것을 암시한다. 또한, 이는 베클린1의 손실이 이의 탈유비퀴틴화 프로테아제를 억제함으로써 p53의 감소를 발생시킬 수 있음에 따라 베클린1이 많은 종류의 암에서 종종 손실되는 이유를 설명하는 메커니즘을 제공할 수 있다.
참조의 포함
본원에 인용된 미국 특허 및 미국 공개 특허 출원 모두는 참조로서 본원에 포함된다.
동등부
본 발명의 여러 구체예가 본원에 기재되고 예시되었으나, 당업자는 본원에 기재된 기능을 수행하고/하거나 본원에 기재된 결과 및/또는 장점 중 하나 이상을 수득하기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 용이하게 계획할 것이며, 이러한 변화 및/또는 변형 각각은 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주된다. 더욱 일반적으로, 당업자는 본원에 기재된 모든 파라미터, 치수, 물질 및 형태는 예시적인 것을 의미하며, 실제 파라미터, 치수, 물질 및/또는 형태는 본 발명의 교시가 이용되는 특정 응용분야 또는 응용분야들에 좌우되는 것을 용이하게 인지할 것이다. 당업자는 통상적인 실험을 벗어나지 않는 실험을 이용하여 본원에 기재된 본 발명의 특정 구체예에 대한 다수의 동등부를 인지하거나, 이를 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 상기 구체예가 단지 예로서 제시되며, 첨부된 청구항 및 이에 대한 동등부의 범위 내에서 본 발명이 특별히 기재된 청구된 것과 달리 실시될 수 있음이 이해되어야 한다. 본 발명은 본원에 기재된 각각의 개별적 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 두개 이상의 상기 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법의 임의의 조합물은 이러한 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법이 상호 비양립되지 않는 경우에 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims (57)

  1. 하기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 생물학적 활성 대사물, 용매화물, 수화물, 프로드럭, 거울상이성질체 또는 입체이성질체:
    Figure pct00017

    상기 식에서,
    n은 0, 1, 2, 3 또는 4이고;
    Y는 -C(R1)= 또는 -N=이고;
    R은 -H, 저급 알킬, -CH3, 저급 플루오로알킬, -CH2F, -CHF2, -CF3, -NO2, -OH, -NH2, -NH(저급 알킬), -N(저급 알킬)2, 또는 저급 알키닐이고;
    R1은 각각의 경우에 -H, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, -OH, -NH2, -NH(저급 알킬), -N(저급 알킬)2, -CH3, -CF3, -C(=O)(저급 알킬), -CN, -O(저급 알킬), -O(저급 플루오로알킬), -S(=O)(저급 알킬), -S(=O)2(저급 알킬) 및 -C(=O)O(저급 알킬)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    R2 및 R3은 -H, 저급 알킬, 저급 플루오로알킬, 저급 알키닐 및 히드록시알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    X는 -O-, -S-, -N(H)-, -N(저급 알킬)-, -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2- 또는 -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-이고;
    Z는 페닐, 피리딜, 비닐, 모르피닐, 페난트롤리닐, 나프틸, 푸릴 또는 벤조[d]티아졸릴이고; -CH3, 저급 알킬, 플루오로알킬, -OCH3, -OCF3, 저급 플루오로알콕시, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, 저급 알키옥시, -NH(저급 알킬), -N(저급 알킬)2, -CF3, 및 3,4-메틸렌 디옥시로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되거나 치환되지 않으며,
    단, 화합물은
    Figure pct00018
    이 아니고, 여기서, J는 Cl, OCHF2, OCH2CH3, OCH2CF3, O(CH2)2CH3, OCH(CH3)2, O(CH2)3CH3, 또는 O(시클로펜틸)이다.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 Y가 -C(R1)=인 화합물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 Y가 -N=인 화합물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R이 -H인 화합물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 R1이 -NH2, -Cl, -NO2, -I, 또는 -OMe인 화합물.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나의 R1이 -NH2, -Cl, -NO2, -I, 또는 -OMe이고; 두 개 이상의 R1이 -H인 화합물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R2가 -CH3인 화합물.
  8. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R2가 -H인 화합물.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R3가 -CH3인 화합물.
  10. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R3가 -H인 화합물.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X가 -O-, -S-, -N(H)-, -N(저급 알킬)- 또는 -CH2-인 화합물.
  12. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X가 -N(H)- 또는 -N(저급 알킬)-인 화합물.
  13. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X가 -N(H)-인 화합물.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Z가 -CH3, 저급 알킬, 플루오로알킬, -OCH3, -OCF3, 저급 플루오로알콕시, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, 저급 알키옥시, -NH(저급 알킬), -N(저급 알킬)2, -CF3, 및 3,4-메틸렌 디옥시로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되거나 치환되지 않은 페닐인 화합물.
  15. 하기 화학식 (Ⅱ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 생물학적 활성 대사물, 용매화물, 수화물, 프로드럭, 거울상이성질체 또는 입체이성질체:
    Figure pct00019

    상기 식에서,
    n은 0, 1 또는 2이고;
    Y는 -C(R1)= 또는 -N=이고;
    R은 -H, 저급 알킬, -CH3, 저급 플루오로알킬, -CH2F, -CHF2, 또는 -CF3이고;
    R1은 각각의 경우에 -H, -CH3, -F, -Cl, -Br, -I 또는 -NO2로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    R2 및 R3은 -H, -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3 또는 -CH(CH3)2로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    R4, R5 및 R8은 -H, -CH3, -CF3, -OCH3, -OCF3, -F, -Cl, -Br 또는 -I로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    R6 및 R7은 -H, -CH3, -CF3, -OCH3, -OCF3, -F, -Cl, -Br 또는 -I로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되거나; R6 및 R7은 함께 취해져 -OCH2O-이며,
    단, 화합물은
    Figure pct00020
    이 아니다.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 Y가 -C(R1)=인 화합물.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 Y가 -N=인 화합물.
  18. 제 15항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R이 -H, -CH3, -CH2F, -CHF2 또는 -CF3인 화합물.
  19. 제 15항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R이 H인 화합물.
  20. 제 15항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R이 -CH2F, -CHF2 또는 -CF3인 화합물.
  21. 제 15항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R1이 -F, -Cl, -Br 또는 -I인 화합물.
  22. 제 15항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R1이 -CH3인 화합물.
  23. 제 15항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R1이 -NO2인 화합물.
  24. 제 15항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R2가 -H인 화합물.
  25. 제 15항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R2가 -CH3인 화합물.
  26. 제 15항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R3가 -H인 화합물.
  27. 제 15항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R3가 -CH3인 화합물.
  28. 제 15항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R4가 -H인 화합물.
  29. 제 15항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R4가 -F, -Cl, -CH3 또는 -OCH3인 화합물.
  30. 제 15항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R5가 -H인 화합물.
  31. 제 15항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R5가 -F, -Cl, -CH3 또는 -CF3인 화합물.
  32. 제 15항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R6이 -H인 화합물.
  33. 제 15항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R6이 -F, -Cl 또는 -Br인 화합물.
  34. 제 15항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R6이 -CH3 또는 -CF3인 화합물.
  35. 제 15항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R6이 -OCH3 또는 -OCF3인 화합물.
  36. 제 15항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R6 및 R7이 함께 취해져 -OCH2O-인 화합물.
  37. 제 15항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R7이 -H인 화합물.
  38. 제 15항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R8이 -H인 화합물.
  39. 하기로 구성된 군으로부터 선택된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00021

    Figure pct00022

    Figure pct00023

    Figure pct00024

    Figure pct00025

    Figure pct00026

    Figure pct00027

    Figure pct00028
  40. 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 생물학적 활성 대사물, 용매화물, 수화물, 프로드럭, 거울상이성질체 또는 입체이성질체; 및 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  41. 치료적 유효량의 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항의 하나 이상의 화합물 또는 제 40항의 약학적 조성물을 암, 췌장염, 신경퇴행, 염증 질병, 감염성 질병, 또는 세포내 병원체에 의해 야기된 감염을 치료하는 것이 필요한 피검체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암, 췌장염, 신경퇴행, 염증 질병, 감염성 질병, 또는 세포내 병원체에 의해 야기된 감염을 치료하는 방법.
  42. 제 41항에 있어서, 상기 방법이 암을 치료하기 위한 것인 방법.
  43. 제 42항에 있어서, 상기 암이 백혈병, 비소세포 폐암, 결장암, 중추신경계암, 흑색종, 난소암, 신장암, 전립선암 및 유방암으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  44. 제 41항에 있어서, 상기 방법이 췌장염을 치료하기 위한 것인 방법.
  45. 제 41항에 있어서, 상기 방법이 신경퇴행을 치료하기 위한 것인 방법.
  46. 제 41항에 있어서, 상기 방법이 혈관치매, 조기성치매, 다운증후군에서의 신경퇴행, 및 HIV-관련 치매로 구성된 군으로부터 선택된 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 것인 방법.
  47. 제 41항에 있어서, 상기 방법이 신경퇴행을 치료하기 위한 것이고; 상기 방법이 이러한 신경퇴행성 질환에 걸린 피검체에서 인지능을 개선시키거나 인지저하를 억제하는 방법.
  48. 제 41항에 있어서, 상기 방법이 세포내 병원체에 의해 야기된 감염을 치료하기 위한 것인 방법.
  49. 제 48항에 있어서, 상기 감염이 박테리아 또는 바이러스에 의해 야기된 것인 방법.
  50. 제 41항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  51. 제 50항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 치료제가 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항의 하나 이상의 화합물 또는 제 40항의 약학적 조성물과 동시에 투여되는 방법.
  52. 제 50항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 치료제가 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항의 하나 이상의 화합물 또는 제 40항의 약학적 조성물과 순차적으로 투여되는 방법.
  53. 제 51항 또는 제 52항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 치료제가 항-혈관형성 작용제인 방법.
  54. 제 53항에 있어서, 상기 항-혈관형성 작용제가 베바시주맙(bevacizumab)(Avastin®), 카르복시아미도트리아졸, TNP-470, CM101, IFN-α, IL-12, 혈소판 인자-4, 수라민(suramin), SU5416, 트롬보스폰딘(thrombospondin), VEGFR 길항제, 헤파린을 갖는 혈관형성억제 스테로이드, 연골 유래 혈관형성 억제 인자, 기질 금속단백분해효소 억제제, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 2-메톡시에스트라디올, 테코갈란(tecogalan), 트롬보스폰딘, 프롤락틴, αVβ3 억제제 및 리노마이드(linomide)로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  55. 제 51항 또는 제 52항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 치료제가, 해당 의존성 암을 해당이 불가능한 세포로 전환시키는 항암 화합물인 방법.
  56. 제 55항에 있어서, 해당 의존성 암을 해당이 불가능한 세포로 전환시키는 상기 항암 화합물이 부술판(busulfan), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 다카르바진(dacarbazine)(DTIC), 메클로르에타민(mechlorethamine)(질소 머스타드), 멜팔란(melphalan), 카르무스틴(carmustine)(BCNU), 로무스틴(lomustine)(CCNU), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin)(Adriamycin), 이다루비신(idarubicin), 미톡산트론(mitoxantrone), 프레드니손(prednisone), 덱사메타손(dexamethasone), 타목시펜(tamoxifen), 풀베스트란트(fulvestrant), 아나스트로졸(anastrozole), 레트로졸(letrozole), 메게스트롤 아세테이트(megestrol acetate), 비칼루타미드(bicalutamide), 플루타미드(flutamide), 류프롤리드(leuprolide), 고세렐린(goserelin), 글리벡(gleevac), 이레싸(Iressa), 타르세바(Tarceva), 헤르셉틴(Herceptin), 아바스틴(Avastin), L-아스파라기나제(L-asparaginase) 및 트레티노인(tretinoin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  57. 탈유비퀴틴화 프로테아제 복합체(deubiquitinating protease complex)를 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항의 하나 이상의 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 탈유비퀴틴화 프로테아제 복합체를 비활성화시키는 방법으로서, 상기 탈유비퀴틴화 프로테아제 복합체가 USP3, USP10, USP13, USP16 및 USP18을 포함하는, 방법.
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