JP2016517439A - 医学的状態の治療のためのクロマチン修飾因子の標的化 - Google Patents

Abstract

幹細胞自己再生の速度の低下に関連する、または幹細胞自己再生の速度の増加に反応する医学的状態の治療のための方法及び組成物が提供される。本発明の態様は、例えば、Ｈ２Ａ脱ユビキチン化酵素拮抗物質の有効量を投与することによって、細胞中のＨ２Ａ脱ユビキチン化酵素活性を阻害することを含む。幹細胞自己再生の速度の低下に関連する、または幹細胞自己再生の速度の増加に反応する医学的状態の治療のための治療薬を同定するためのスクリーンも提供される。

Description

本発明は、幹細胞自己再生の速度の減少に関連する医学的状態または幹細胞自己再生の速度の増加に反応する医学的状態の治療におけるクロマチン修飾因子の使用に関する。

ダウン症候群（ＤＳ）は、ヒトにおける最も一般的な遺伝子異常であり、大半は染色体２１の完全なまたは部分的な三染色体性の結果である。これは、心臓障害、運動機能、及び認知障害、固形腫瘍の発生率の低下、ならびにアルツハイマー病などの老化関連の事象の早期発症及びより高い発生率の両方を含める複数の病理学的状態の高リスクに関連する複雑な臨床症候群である（Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓ，Ｓ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ２１ ａｎｄ Ｄｏｗｎ’ｓ ｓｙｎｄｏｒｏｍｅ：ｆｒｏｍ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｔｏ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．５，７２５−７３８（２００４）、Ｙａｎｇ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｄｏｗｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ＵＳＡ ｆｒｏｍ １９８３ ｔｏ １９９７：ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ ３５９，１０１９−１０２５（２００２）、Ｓａｔｇe，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ Ｄｏｗｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．７８，２０７−２１６（１９９８）、Ｒｏｔｈ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ａｇｉｎｇ ｉｎ ｐｅｒｓｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｄｏｗｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＭＲ ｆｉｎｄｉｎｇｓ．ＡＪＮＲ Ａｍ Ｊ Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌ １７，１２８３−１２８９（１９９６）、Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｇｅｉｎｇ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｄｏｗｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２５６，２２１−２３１（１９９１）、Ｚｉｇｍａｎ，Ｗ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｄｏｗｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｒｉｓｋ．Ｍｅｎｔ Ｒｅｔａｒｄ Ｄｅｖ Ｄｉｓａｂｉｌ Ｒｅｓ Ｒｅｖ １３，２３７−２４６（２００７））。

米国特許出願公開第２０１２／０２５８９７５号明細書

ダウン症候群は、組織特異的幹細胞自己再生の速度における減少に関連し、及び／または組織特異的幹細胞自己再生の速度を増加させることによって治療される多くの医学的状態のうちの１つである。必要とされるのは、これらの状態の症状を緩和するためのより良い方法及び治療薬である。本開示はこれらの課題に対処する。

幹細胞自己再生の速度の低下に関連し、かつ幹細胞自己再生の速度の増加に反応する医学的状態の治療のための方法及び組成物が提供される。本方法の態様は、例えば、Ｈ２Ａ脱ユビキチン化酵素拮抗物質の有効量を投与することにより、細胞中のＨ２Ａ脱ユビキチン化酵素活性を阻害することを含む。

幹細胞自己再生の速度の低下に関連し、かつ幹細胞自己再生の速度の増加に反応する医学的状態の治療のための治療薬を同定するためのスクリーニングも提供される。

本発明は、添付の図面と併せて読み取られる場合は、以下の詳細な説明からさらに深く理解される。一般的な実践に従って、図面の種々の特徴は、スケールによらないことが強調される。一方、種々の特徴物の寸法は、明確にするために任意に拡大または縮小されている。図面内に含まれるものは以下の図である。

Ｔｓ６５Ｄｎマウスは、不完全な造血幹細胞（ＨＳＣ）を有し、マウスＤＳモデルの概要図を示す。Ｔｓ６５Ｄｎ及びＴｓ１Ｃｊｅは、双方ともに、ヒト染色体２１に相同なマウス染色体１６の領域を三染色体性で含有する。Ｔｓ６５Ｄｎマウスは、三染色体性の１３２個の遺伝子を有し、一方Ｔｓ１Ｃｊｅマウスはこれらの１つのサブセットのみを有する。 ＤＳマウスモデルからの骨髄のフローサイトメトリー分析を示す。細胞は生ＫＬＳ上にゲートされる。青色の囲み線は、ＨＳＣに対して非常に富化されている、ＫＬＳ ＣＤ１５０⁺ ＣＤ４８^- 細胞（上段）またはＫＬＳ ＣＤ３４^- Ｆｌｔ３^- 細胞（下段）の発生頻度を示す。各遺伝子型からの代表的な分析を示す。これらの結果は、少なくとも４回繰り返され、同様な結果であった。 休止状態の幹細胞に対して非常に富化されたＣＤ３４^- ＣＤ１５０⁺ ＣＤ４８^- ＫＬＳ細胞のパーセンテージを、このグラフで示す。結果は、各群当たりＦＡＣＳによって分析された少なくとも４匹のマウスの平均値である。Ｔｓ６５Ｄｎマウスは、これらの細胞の数において有意な減少を示す（ｐ＜０．００５）。 Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ中で増殖させた単一のＣＤ３４^- ＣＤ１５０⁺ ＣＤ４８^- ＫＬＳ細胞からのコロニー形成アッセイを示す。コロニーの数を１週間後に集計した。数は、平板培養された細胞の数に対する陽性細胞のパーセンテージとして示している。実験は少なくとも３回繰り返された（ｐ＜０．００５）。 ＤＳマウスモデルからの骨髄の限界希釈解析法。このグラフは、異なるマウスにおける推定された幹細胞発生頻度を視覚的に示す（データは、ＥＬＤＡソフトウェア、Ｗａｌｔｅｒ−Ｅｌｉｚａ Ｈａｌｌ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓを用いて作成された）。Ｔｓ６５ＤｎマウスはＨＳＣの減少した発生頻度を有するが、Ｔｓ１Ｃｊｅマウスは有さないことに留意されたい。右側の、上部パネルは、ＨＳＣの推定発生頻度を示し、一方、下部パネルは、差のペアワイズ検定についての計算されたｐ値（^**ｐ＜０．０１）を示す。２つの独立した実験を、遺伝子型当たり合計１５匹のマウスで行った。 骨髄細胞の二次移植を示す。一時移植動物に由来する５００万個の骨髄細胞を、二次レシピエント内に移植した。生着を毎月、末梢血液分析によって評価した。グラフは、移植後３ヶ月目のＣＤ４５．２⁺ ドナー細胞のパーセンテージを示す（ｐ＝０．０４４７）。実験は、異なるドナーマウスを用いて２回繰り返した。 ＵＳＰ１６を標的化するｓｈＲＮＡのＴｓ６５Ｄｎ造血幹細胞に及ぼす効果を示し、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて、野生型（黒）及びＴｓ６５Ｄｎ（灰色）のＣＤ３４^- ＣＤ１５０⁺ ＣＤ４８^- ＫＬＳ細胞におけるＵｓｐ１６のｍＲＮＡの発現レベルを測定した。２つの独立したプローブは同様な結果を示している。 Ｌｙｓ１１９上のＨ２Ａのユビキチン化型に対するモノクローナル抗体を用いる免疫蛍光法は、野生型（上段）ＣＤ３４^- ＣＤ１５０⁺ ＣＤ４８^- ＫＬＳ細胞と比較して、Ｔｓ６５Ｄｎ細胞（下段）中の陽性細胞増殖巣の数における減少を示している。矢印は、１つの代表的な画像における細胞増殖巣を示す。右側には、細胞当たりの観察されたユビキチンＨ２Ａ細胞増殖巣の数を示す（１００個の細胞が、２つの別々の実験で分析された）。 定量的リアルタイムＰＣＲを用いて、２つの独立したヘアピンを用いるレンチウイルス感染によって達成されるノックダウンのレベルを確認した。ＵＳＰ１６の発現は、野生型細胞のものと同様なＴｓ６５Ｄｎ細胞中のレベルを達成するように減少する。 ２つの独立したｓｈＲＮＡによるＵｓｐ１６のノックダウンは、Ｔｓ６５Ｄｎ ＨＳＣのインビトロコロニー形成の欠陥を部分的に救済する。対照またはＵＳＰ１６を標的化する２つの独立したｓｈＲＮＡで形質導入された単一のＣＤ３４^- ＣＤ１５０⁺ ＣＤ４８^- ＫＬＳ Ｔｓ６５Ｄｎ細胞のコロニー形成能力を、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ中で平板培養後１週間目に評価した。両ＵＳＰ１６ ｓｈＲＮＡは、Ｔｓ６５Ｄｎ細胞のコロニーを形成する能力を増強するが、対照ｓｈＲＮＡは増強しないことに留意されたい。実験は、３回繰り返され、同様な結果であった。 ｓｈＲＮＡによるＵＳＰ１６のノックダウンは、幹細胞及び前駆細胞の生着能力を部分的に回復する。ドナーＫＬＳ細胞の２つの異なる用量を、骨髄移植実験において使用した。左側パネルは、ｓｈＣ（黒線）またはｓｈＵＳＰ１６ヘアピン（灰色線）で形質導入されたＴｓ６５Ｄｎ ＫＬＳの生着を示す。右側パネルは、それぞれの形質導入集団の計算された幹細胞の頻度を示す（ｐ＝０．００４、ＥＬＤＡソフトウェア、Ｗａｌｔｅｒ−Ｅｌｉｚａ Ｈａｌｌ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓを用いて計算）。これらの実験は、群当たり合計１４匹のマウスで２回行い、同様な結果であった。 骨髄細胞の二次移植。移植動物由来の５００万個の骨髄細胞を、二次レシピエントに移植した。生着を毎月評価した。グラフは、移植後２ヶ月目のＣＤ４５．２⁺ ドナー細胞のパーセンテージを示す（ｐ＝０．００１５）。実験は、数匹のドナーマウスを用いて２回繰り返された。 Ｔｓ６５Ｄｎマウスは、不完全な神経前駆細胞を示すが、Ｔｓ６５Ｄｎ／Ｕｓｐ１６^het マウスは示さない。ＳＶＺに由来するＬｉｎ^- 細胞の系列希釈分析法。ＥＬＤＡ分析は、左側パネルにおいて継代１（Ｐ１）について、右側パネルにおいて継代４（Ｐ４）について示している。表は、指示された条件において推定されたＮｓｐ−ＩＣ発生頻度を示し、これはＴｓ６５Ｄｎマウスでは顕著に減少するが、Ｔｓ６５Ｄｎ／ＵＳＰ１６^het マウスでは減少しない。 連続継代後のＮｓｐ−ＩＣ発生頻度における変化。Ｔｓ６５Ｄｎ由来のニューロスフェアは、Ｔｓ６５Ｄｎ／Ｕｓｐ１６^het ニューロスフェアと比べて４継代後に発生頻度における有意な減少を示す（ｐ＝０．０２９４）。 Ｓｏｘ２のｍＲＮＡレベルの減少が、Ｐ１及びＰ４で採取されたＴｓ６５ＤｎニューロスフェアのｑＰＣＲ分析によって観察され、これはＴｓ６５Ｄｎ／ＵＳＰ１６^het 細胞において救済される。 ＳＶＺから単離されたＬｉｎ^- 細胞の限界希釈分析法であり、ＣＤ１３３⁺ ＥＧＦＲ⁺ （左）またはＣＤ１５⁺ ＥＧＦＲ⁺ （右）に分類されたものである。表は、指示された分類群についての推定発生頻度を示す。Ｔｓ６５Ｄｎマウスは、Ｎｓｐ−ＩＣの発生頻度を減少した。 ニューロスフェア形成能を、二次スフェア形成によってアッセイした。Ｔｓ６５Ｄｎマウスは、野生型またはＴｓ６５Ｄｎ／ＵＳＰ１６^het マウスと比べてニューロスフェアの継代を維持するための有意に低い能力を有した（^*** ｐ＜０．００１）。それぞれの実験は、遺伝子型当たり最小で３匹のマウスで行われた。 Ｔｓ６５Ｄｎマウスにおける乳腺変化は、Ｕｓｐ１６のレベルに依存する。定量的リアルタイムＰＣＲを用いて、ＣＤ４９^highＣＤ２４^med 細胞中のＵｓｐ１６ ｍＲＮＡのレベルを野生型（黒）及びＴｓ６５Ｄｎ（灰色）において測定した。 Ｔｓ６５Ｄｎマウスは、乳腺Ｌｉｎ^- 細胞の数において顕著な減少を有したが、Ｔｓ１Ｃｊｅマウスは示さなかった。この分析は、各群について少なくとも５匹の動物を含む（ｐ＝０．０１１８）。 サイトケラチンについての免疫蛍光染色を示す。野生型、Ｔｓ６５Ｄｎ及びＴｓ１Ｃｊｅの乳腺を、基底細胞サイトケラチンＣＫ１４（赤）及び管腔細胞サイトケラチンＣＫ８（緑）に対する抗体で染色した。 野生型、Ｔｓ６５Ｄｎ及びＴｓ１Ｃｊｅマウスから単離された１０００個のＭＲＵ細胞のインビトロ増殖を示す。Ｔｓ６５Ｄｎ細胞は、その野生型対応物と比較して有意に少ないコロニーを形成するが、Ｔｓ１Ｃｊｅは形成しない（ｗｔ／Ｔｓ６５Ｄｎについてのｐ値＝０．０００１）ことに留意されたい。この結果は、５回以上にわたって繰り返され、同様な結果を有した。 乳腺を再構築する細胞の発生頻度を示す。インビボで乳腺管を発生させることができる野生型、Ｔｓ６５Ｄｎ及びＴｓ６５Ｄｎ／Ｕｓｐ１６^het の乳腺上皮細胞の発生頻度を決定するために、限界希釈移植実験を行った。再構築細胞の顕著な減少はＴｓ６５Ｄｎマウスにおいてのみ存在することに留意されたい。発生頻度は、Ｌ−ｃａｌｃプログラム、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用いて決定した（^*** ｐ＜０．００１；^**ｐ＜０．０１）。３つの独立した実験を行い、そのうちの２つはＴｓ６５Ｄｎ／Ｕｓｐ１６^het について行った。 ｓｈＲＮＡレンチウイルス感染によるＵＳＰ１６のダウンレギュレーションは、Ｔｓ６５Ｄｎの乳腺細胞によって示されるインビボ欠損を部分的に救済する（ｐ＝０．０３）。ｓｈＣ及びｓｈＵＳＰ１６感染Ｔｓ６５Ｄｎ乳腺上皮細胞がインビボで乳管を発生させる能力を決定するために、限界希釈移植実験を行った。３つの独立した実験を行った。右側に、ＧＦＰ−ｓｈＣまたはＧＦＰ−ｓｈＵＳＰ１６レンチウイルスで形質導入されたＴｓ６５Ｄｎの乳腺上皮細胞によって形成された乳腺突出物の面積定量化が示されている（ｐ＝０．００７）。 増殖及び老化は、Ｔｓ６５Ｄｎ線維芽細胞中のＵＳＰ１６によって制御される。継代中のＭＥＦにおけるｐ１６^Ink4a 及びｐ１９^Arf ｍＲＮＡの発現を示す。発現レベルにおける変化をＰ７まで示している。 野生型及びＴｓ６５ＤＮ ＭＥＦ中のＰ４におけるＳＡ−βガラクトシダーゼ染色を示す。代表的な写真を示している。陽性細胞のパーセンテージを右側に示す。実験は、遺伝子型当たり３つの異なるＭＥＦ系で繰り返された（ｐ＝０．００１）。 ＭＥＦクロマチンサンプルのＨ２ＡＵｂ抗体による沈殿時の６つのＩｎｋ４遺伝子座上のＣｈＩＰ分析を示す。分析は、遺伝子型当たり２つの異なるＭＥＦ培養物で少なくとも２回行った。値は、投入クロマチンの量について正規化した。対照として、アクチンＢレベルを試験した。 Ｔｓ６５Ｄｎ細胞によるＩｎｋ４ａ／ＡｒｆのＵｓｐ１６正規化発現のダウンレギュレーションを示す。感染ＭＥＦ中の継代６までのｐ１６^Ink4a 及びｐ１９^Arf の発現レベルを示す。レンチウイルスダウンレギュレーション時のＵｓｐ１６のレベルも示す。 野生型、Ｔｓ６５Ｄｎ、Ｔｓ６５Ｄｎ／ＵＳＰ１６^het 、及びＵＳＰ１６^het マウスに由来するＴＴＦの増殖を示す。細胞を継代２で播種し、トリパンブルー排除法によって、隔日に計数した。Ｔｓ６５Ｄｎ ＴＴＦはインビトロで増殖することができないが、一方Ｔｓ６５Ｄｎ／ＵＳＰ１６^het ＴＴＦは増殖することができる。少なくとも３つの異なる系統を各条件について用いた。 野生型、Ｔｓ６５Ｄｎ、Ｔｓ６５Ｄｎ／ＵＳＰ１６^het 、ならびにＵＳＰ１６^het マウスに由来するＴＴＦ培養物中、またはｐ１６／ｐ１９を標的化するヘアピンで感染させた野生型ならびにＴｓ６５Ｄｎ ＴＴＦ中のＳＡ−βガラクトシダーゼ陽性細胞を示す。細胞はＰ３で分析した。野生型に比べてＴｓ６５Ｄｎ ＴＴＦにおいて陽性細胞の増加が存在するが、一方表現型はＴｓ６５／ＵＳＰ１６^het ＴＴＦにおいて回復することに留意されたい。（^*** ｐ＜０．００１；^**ｐ＜０．０１）。 ｐ１６の発現を、免疫蛍光法によって陽性とテストされた細胞のパーセンテージとして示す。ｐ１６及びｐ１９に対するショートヘアピンで同時形質導入された野生型及びＴｓ ６５ＤｎのＴＴＦは、想定通りに陰性である（^**ｐ＜０．０１；^* ｐ＜０．０５）。 ｐ１６／ｐ１９を標的化するヘアピン種で感染させたＴｓ６５ＤｎのＴＴＦの増殖。野生型のＴＴＦもまた、ｐ１６／ｐ１９のダウンレギュレーション時により多く増殖する。この実験は、３回繰り返され、同様な結果を有した。 ヒトＤＳ線維芽細胞は、ＵＳＰ１６のレベルに依存する増殖不全を示す。３つの野生型及び４つのＤＳヒト線維芽細胞（培養において１０継代未満）の増殖分析は、インビトロで増殖するためのＤＳ細胞の急激な不能性を示す（^**ｐ＜０．０１）。 ＳＡ−βガラクトシダーゼ及びｐ１６の発現を、染色された細胞のパーセンテージとして示す。全てのドットは、異なる個体から単離された線維芽細胞を表す。ＤＳ細胞は、老化マーカーのＳＡ−βガラクトシダーゼ及びｐ１６のより高い発現を呈する。 ＳＡ−βガラクトシダーゼ及びｐ１６の発現を、染色された細胞のパーセンテージとして示す。全てのドットは、異なる個体から単離された線維芽細胞を表す。ＤＳ細胞は、老化マーカーのＳＡ−βガラクトシダーゼ及びｐ１６のより高い発現を呈する。 レンチウイルス感染によるＵＳＰ１６の過発現は、２つの異なる野生型線維芽細胞系の増殖に影響を及ぼす（時間点当たり３回の繰り返しで、実験を２回繰り返した）。 ＤＳ線維芽細胞中のＵＳＰ１６のダウンレギュレーションは、増殖を促進する（時間点当たり３回の繰り返しで、実験を２回繰り返した）。 ＵＳＰ１６の過発現は、ヒト成人ＳＶＺ細胞に由来のニューロスフェアの形成を低減する。右側パネルは、第１及び第２継代におけるスフェアの数を定量化する。ｐ＝０．０００１。全ての実験は、少なくとも２回繰り返した。Ｌｕｃ、ルシフェラーゼを示す。 ＤＳマウスモデルの骨髄生着を示す。致死的照射Ｃ５７Ｂｌ６マウス（ＣＤ４５．１）に、野生型またはＴｓ６５Ｄｎマウス（Ｈ２Ｋ対立遺伝子についてマッチングさせた）５×１０⁵ 個のＣＤ４５．２骨髄細胞を移植し、これと一緒に３×１０⁵ 個のＣＤ４５．１細胞（遺伝子型当たり５匹のマウス）を移植した。キメラ性のパーセンテージを、指示した時間点ｂで評価した。骨髄移植後４ヶ月目の末梢血液分析は、５００，０００個のドナー細胞のみで、Ｔｓ６５Ｄｎマウスにおけるマルチネージ生着を示した。 Ｔｓ６５Ｄｎドナー骨髄のより低い用量は、造血幹細胞系統を再構成することに失敗した。代表的なＦＡＣＳプロットを示す。マウスは、各造血細胞系統（Ｂ細胞（Ｂ２２０⁺ ）、Ｔ細胞（ＣＤ３⁺ ）及び骨髄系細胞（Ｇｒ１⁺ Ｍａｃ１⁺ ）に対して、末梢血液の少なくとも１％がドナーに由来するとき、生着について陽性であるとみなされた。 Ｔｓ６５Ｄｎドナー骨髄のより低い用量は、造血幹細胞系統を再構成することに失敗した。代表的なＦＡＣＳプロットを示す。マウスは、各造血細胞系統（Ｂ細胞（Ｂ２２０⁺ ）、Ｔ細胞（ＣＤ３⁺ ）及び骨髄系細胞（Ｇｒ１⁺ Ｍａｃ１⁺ ）に対して、末梢血液の少なくとも１％がドナーに由来するとき、生着について陽性であるとみなされた。 Ｔｓ６５Ｄｎドナー骨髄のより低い用量は、造血幹細胞系統を再構成することに失敗した。代表的なＦＡＣＳプロットを示す。マウスは、各造血細胞系統（Ｂ細胞（Ｂ２２０⁺ ）、Ｔ細胞（ＣＤ３⁺ ）及び骨髄系細胞（Ｇｒ１⁺ Ｍａｃ１⁺ ）に対して、末梢血液の少なくとも１％がドナーに由来するとき、生着について陽性であるとみなされた。 Ｔｓ６５Ｄｎドナー骨髄のより低い用量は、造血幹細胞系統を再構成することに失敗した。代表的なＦＡＣＳプロットを示す。マウスは、各造血細胞系統（Ｂ細胞（Ｂ２２０⁺ ）、Ｔ細胞（ＣＤ３⁺ ）及び骨髄系細胞（Ｇｒ１⁺ Ｍａｃ１⁺ ）に対して、末梢血液の少なくとも１％がドナーに由来するとき、生着について陽性であるとみなされた。 失敗したＴｓ６５Ｄｎ骨髄細胞は、二次レシピエントを再構成することができない。致死的照射Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおける移植された一次レシピエントからの骨髄の移植後３ヶ月目の末梢血液の多系統分析を示す。Ｔｓ６５Ｄｎ細胞は、二次レシピエントにおいて増殖することができない。代表的なＦＡＣＳプロットを示す。 Ｔｓ６５Ｄｎマウス中のＨＳＣは、Ｈ２Ａユビキチン化のより低いレベルを有する。Ｌｙｓ１１９上のＨ２Ａのユビキチン化型に対するモノクローナル抗体を用いる免疫蛍光法は、野生型と比べてＴｓ６５Ｄｎ細胞に由来するＭＥＦ中の陽性細胞増殖巣の数における減少を示す。左側に、遺伝子型の総合的な結果を示す。右側では、各ドットは異なる細胞を表し、各カラムは異なるマウスを表す。毎群１００個の細胞を分析し、実験は２回繰り返した。 全Ｈ２ＡＵｂ＋染色の半定量化は、野生型のＭＥＦと比べてＴｓ６５Ｄｎで減少する。 ＭＥＦからのクロマチン抽出物のウェスタンブロット分析を示す。Ｈ２ＡＵｂレベルは、Ｔｓ６５Ｄｎで減少する（定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて行った）。Ｈ２Ａのウェスタンブロットは、抽出物の等しい負荷を確認するために用いられた。 ＵＳＰ１６のダウンレギュレーションは、一次及び二次移植におけるＴｓ６５ＤｎのＫＬＳの生着を改善する。骨髄移植後４ヶ月目の末梢血液分析は、ｓｈＵＳＰ１６ヘアピンで感染させたＴｓ６５ ＫＬＳからのマルチネージ生着を示した。代表的なＦＡＣＳプロットを示す。 二次レシピエント中、移植後２ヶ月目に、ｓｈＣＴｓ６５Ｄｎの骨髄細胞は、生着に失敗するが、一方ｓｈＵＳＰ１６ Ｔｓ６５Ｄｎ細胞は多系統再構成を示す。代表的なＦＡＣＳプロットを示す。 ＳＶＺ単一細胞懸濁液の分類スキーム。代表的ＦＡＣＳプロットを、ＳＶＺ調製物に由来する可視Ｌｉｎ^- 細胞について示す。上側はＣＤ１５及びＥＧＦＲの異なるＬｉｎ^- 細胞中の発現を示す。下側は、ＣＤ１３３（Ｐｒｏｍ１）及びＥＧＦＲの発現を示す。二重陽性細胞を分類し、ニューロスフェア形成能をテストするために使用した。 ＤＳマウスモデルにおける乳腺中の欠損を示す。定量的リアルタイムＰＣＲを用いて、ＣＤ４９ｈｉｇｈＣＤ２４ｍｅｄ細胞中の異なるＨｏｘのｍＲＮＡ発現レベルを野生型（白）及びＴｓ６５Ｄｎ（黒）において測定した。Ｈｏｘ１、Ｈｏｘ３及びＨｏｘ５は、Ｔｓ６５Ｄｎ細胞中でより高く発現される。 乳腺細胞の単一細胞懸濁液を、ＦＡＣＳによって分析し、生Ｌｉｎｅａｇｅ−細胞（Ｔｅｒ１１９^- 、ＣＤ４５^- 、ＣＤ３１^- ）上にゲートした（第１列）。第２列は、ＣＤ４９ｆ及びＣＤ２４について染色されたＬｉｎ−細胞を示す。Ｔｓ６５Ｄｎマウスにおいては、基底細胞及び管腔細胞（示したゲート）の減少を伴い、全ＦＡＣＳプロファイルにおける動揺を観察したが、Ｔｓ１Ｃｊｅマウスでは観察されなかった。これらの実験は、各群について少なくとも５回繰り返した。 乳腺細胞の単一細胞懸濁液を、ＦＡＣＳによって分析し、生Ｌｉｎｅａｇｅ−細胞（Ｔｅｒ１１９^- 、ＣＤ４５^- 、ＣＤ３１^- ）上にゲートした（第１列）。第２列は、ＣＤ４９ｆ及びＣＤ２４について染色されたＬｉｎ−細胞を示す。Ｔｓ６５Ｄｎマウスにおいては、基底細胞及び管腔細胞（示したゲート）の減少を伴い、全ＦＡＣＳプロファイルにおける動揺を観察したが、Ｔｓ１Ｃｊｅマウスでは観察されなかった。これらの実験は、各群について少なくとも５回繰り返した。 乳腺細胞の単一細胞懸濁液を、ＦＡＣＳによって分析し、生Ｌｉｎｅａｇｅ−細胞（Ｔｅｒ１１９^- 、ＣＤ４５^- 、ＣＤ３１^- ）上にゲートした（第１列）。第２列は、ＣＤ４９ｆ及びＣＤ２４について染色されたＬｉｎ−細胞を示す。Ｔｓ６５Ｄｎマウスにおいては、基底細胞及び管腔細胞（示したゲート）の減少を伴い、全ＦＡＣＳプロファイルにおける動揺を観察したが、Ｔｓ１Ｃｊｅマウスでは観察されなかった。これらの実験は、各群について少なくとも５回繰り返した。 乳腺細胞の単一細胞懸濁液を、ＦＡＣＳによって分析し、生Ｌｉｎｅａｇｅ−細胞（Ｔｅｒ１１９^- 、ＣＤ４５^- 、ＣＤ３１^- ）上にゲートした（第１列）。第２列は、ＣＤ４９ｆ及びＣＤ２４について染色されたＬｉｎ−細胞を示す。Ｔｓ６５Ｄｎマウスにおいては、基底細胞及び管腔細胞（示したゲート）の減少を伴い、全ＦＡＣＳプロファイルにおける動揺を観察したが、Ｔｓ１Ｃｊｅマウスでは観察されなかった。これらの実験は、各群について少なくとも５回繰り返した。 乳腺を、基底細胞サイトケラチンＣＫ１４（赤）及び管腔サイトケラチンＣＫ８（緑）に対する抗体で染色した。Ｔｓ６５Ｄｎマウスの乳腺上皮中の両方のサイトケラチンで同時染色した細胞中で顕著な増加が存在することに留意されたい。 Ｔｓ６５Ｄｎの乳腺における管腔及び基底細胞マーカーの同時染色についての富化を定量化するピアソンの相関分析（Ｌｕｍｏｓｉｔｙソフトウェア）を示す。 Ｔｓ６５Ｄｎの線維芽細胞中のＳＡ−βｇａｌ及びｐ１６の発現は、ＵＳＰ１６及びＣＤＫＮ２ａのレベルによって影響を受ける。ＴＴＦ中のＳＡ−βｇａｌ染色の代表的な写真。右側では、グラフは異なる条件におけるＳＡ−βｇａｌ⁺ 細胞のパーセンテージを示す。各ドットは、異なるマウスに由来するＴＴＦ培養物を表す。最後の２つのカラムは、ｐ１６／ｐ１９に対するヘアピンで感染させた、ＷＴ及びＴｓ６５Ｄｎの線維芽細胞を指す。 ウェスタンブロット分析は、ｐ１６のノックダウンを立証する。βアクチンは、負荷対照として働く。 ｐ１６免疫染色（左側）及び陽性細胞のパーセンテージの定量化（右側パネル）の代表的な写真である。各ドットは、異なるマウスに由来するＴＴＦ培養物を表す。ヘアピンは、ｐ１６発現を有効に除去する。 ヒト線維芽細胞培養物に関し、ヒト線維芽細胞中のＳＡ−βｇａｌ染色の代表的な写真である。右側で、グラフは異なる条件におけるＳＡ−βｇａｌ⁺ 細胞のパーセンテージを示す。各ドットは、異なる個体に由来する培養物を表す。 定量的リアルタイムＰＣＲを用いて、Ｂｍｉ１を過発現する（左）またはヒトＵｓｐ１６を標的化するヘアピンを発現する構築物によるレンチウイルス感染後のＵＳＰ１６ ｍＲＮＡの発現を測定した。 Ｂｍｉ１の過発現は、ＤＳキャリアに由来する線維芽細胞の増殖を有意に増加させる。野生型線維芽細胞に及ぼす効果は有意ではない。右側では、Ｂｍｉ１ ｍＲＮＡの発現のレベルが、定量的リアルタイムＰＣＲによって定量化された。実験は２回繰り返され、同様な結果を有した。 フリーラジカル捕捉剤のＮ−アセチルシステイン（Ｎａｃ）による処置の効果を示す。Ｎ−アセチルシステイン（Ｎａｃ）は、飲料水中に投与される１０ｕｇ／ｍｌのＮ−アセチルシステインでの母親の経口処置後のダウン症候群の胎児の胎生期生存を改善する。 治療は生後２ヶ月間継続され、乳房上皮細胞の増殖能力において有意な効果を示した。

幹細胞自己再生の速度の低下に関連し、かつ幹細胞自己再生の速度の増加に反応する医学的病態の治療のための方法及び組成物が提供される。本方法の態様は、例えば、Ｈ２Ａ脱ユビキチン化酵素拮抗物質の有効量を投与することにより、細胞中のＨ２Ａ脱ユビキチン化酵素活性を阻害することを含む。幹細胞自己再生の速度の低下に関連し、かつ幹細胞自己再生の速度の増加に反応する医学的状態の治療のための治療薬を同定するためのスクリーニングも提供される。本発明のこれらの目的ならびに他の目的、利点、及び特徴は、以下により完全に記述される組成物及び方法の詳細を読み取る際に当業者には明らかになるであろう。

本発明の方法及び組成物が記述される前に、本発明は記述される特定の方法または組成物に限定されるものではなく、然る故に、当然のことながら変化してもよいことを理解するべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を記述する目的のものに過ぎず、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるために、限定することを意図するものではないことも理解するべきである。

値の範囲が提供される場合、文脈上明らかに別のものを指さない限り、その範囲の上限値と下限値の間の下限値の単位の１０分の１までの間にある値も具体的に開示されることが理解される。任意の表示された値もしくは表示された範囲の間にある値から任意の他の表示された値もしくはその表示された範囲の間にある値までのそれぞれのより小さな範囲は、本発明の範囲内に包含される。これらのより小さな範囲の上限値及び下限値は、この範囲内に独立して含まれてもよくまたは含まれていなくてもよく、限界値のいずれかがより小さい範囲に含まれる、いずれも含まれない、または両方が含まれる各範囲もまた、表示された範囲内で任意の具体的に排除された限界値を対象に、本発明の範囲内に包含される。表示された範囲が限界値の一方または両方を含む場合、これらのいずれかまたは両方を排除する範囲も本発明内に含まれる。

異なる旨を特記しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同様な意味を有する。本明細書に記載されるものと同様なまたは等価な任意の方法及び材料が本発明の実践または試験において使用され得るが、いくつかの可能性がありかつ好ましい方法及び材料がここで記載される。本明細書に記述される全ての刊行物は、関連する刊行物が引用される方法及び／または材料を開示しかつ記載するために、参照により組み込まれる。本開示は、矛盾が存在しない範囲まで、組み込まれた刊行物の任意の開示に取って代わることが理解される。

本開示を読み取る際に当業者に明らかになるように、本明細書に記載されかつ例示される個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または精神から逸脱することなく他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されまたはこれらの特徴と組み合わせることができる別個の構成要素及び特徴を有する。任意の記載された方法は、記載された事項の順番で、または論理的に可能である任意の他の順番で実行することができる。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上別段の意味を明らかに示さない限り、複数の指示対象を含むことに留意されねばならない。したがって、例えば、「細胞」の言及は、複数のこうした細胞を含み、「ペプチド」の言及は１つ以上のペプチド及びその等価物、例えば当業者に既知のポリペプチド等を含む。

本明細書で考察される刊行物は、単に本出願の出願日よりもそれらの開示が先行するために提供されている。本明細書におけるいずれの刊行物も、本発明が以前の発明のためにこうした刊行物に先立つ権利を有さないとの承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行日付は、実際の刊行日付と異なる場合があり、個々に確認される必要がある場合がある。

幹細胞自己再生の速度の減少に関連するまたは幹細胞自己再生の速度の増加に反応する、すなわち、幹細胞自己再生の速度の増加によって治療される医学的状態の治療のための方法及び組成物が提供される。幹細胞自己再生の速度の減少に関連するまたは幹細胞自己再生の速度の増加に反応する医学的状態（すなわち、「主題の医学的状態」）とは、疾患、障害または他の病態を明らかにしている組織が体細胞中で欠如している（例えば、組織をもたらす組織特異的幹細胞が、増殖または分化において欠陥を有した）、あるいは追加の体細胞が病態を処置することができる（例えば、損傷を被った組織において、例えば、組織特異的幹細胞を有する組織が休止状態になった状態で、例えば成体組織において）疾患、障害、または他の医学的状態を意味する。幹細胞自己再生の速度の減少に関連するまたは幹細胞自己再生の速度の増加に反応する状態の例は、神経発達障害、例えばダウン症候群、脆弱Ｘ症候群、自閉症；脳損傷、例えば、化学療法または放射線療法誘導脳損傷、外傷性脳損傷；神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ；老化関連障害、例えば、リウマチ性関節炎；筋委縮、例えば、癌、ＡＩＤＳ、うっ血性心不全、ＣＯＰＤ（慢性障害肺疾患）、及び腎不全などの疾患または障害に関連する筋委縮；骨髄欠乏症；膵臓細胞、例えばβ膵島細胞の再生を必要とする疾患、例えば、糖尿病；肝臓再生を必要とする疾患、例えば、肝硬変；皮膚再生を必要とする病態、例えば重度熱傷等を含む。

「治療」、「治療する」等とは、所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを一般的に意味する。この効果は、疾患またはその症状を完全にもしくは部分的に予防するという点から予防的であってもよく、ならびに／または疾患及び／もしくはこの疾患に寄与し得る有害作用についての部分的または完全な治癒という点から治療的であってもよい。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物における任意の治療を包含し、（ａ）疾患の素因があり得るが、疾患を有すると未だ診断されていない対象において疾患が発症することを防止すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発生を阻止すること、または（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患を消退させることを含む。治療薬は、疾患または損傷の発症前に、発症中にまたは発症後に投与されてもよい。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化しまたは低減させる、進行中の疾患の治療には、特に関心がある。こうした治療は、冒された組織における機能の完全な喪失に先立って行われることが望ましい。主題治療法は、疾患の症状段階中に施されることが望ましく、場合によっては、疾患の症状段階後に施される。用語「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」は本明細書で互換的に用いられ、診断、治療、または治療法が望ましい任意の哺乳動物、特にヒトを指す。

本発明の態様の説明において、主題組成物が先ず初めに説明され、続いてそれらの使用のための方法が説明される。

組成物
本発明のいくつかの態様では、ヒストン脱ユビキチン化酵素の拮抗物質を含む組成物が提供される。脱ユビキチン化酵素または「デユビキチナーゼ」とは、共有結合されたユビキチンをタンパク質から除去する酵素を意味する。ヒストン脱ユビキチン化酵素とは、ヒストン、例えばＨ２Ａヒストン、Ｈ２Ｂヒストンから共有結合されたユビキチンを除去する酵素を意味する。「Ｈ２Ａ脱ユビキチン化酵素」または「Ｈ２Ａデユビキチナーゼ」とは、ヒストンＨ２Ａから共有結合されたユビキチンを除去する酵素を意味する。Ｈ２Ａ脱ユビキチン化酵素の非限定的な例は、２Ａ−ＤＵＢ／ＭＹＳＭ１、ＵＳＰ３、ＵＳＰ７、Ｕｂｐ−Ｍ／ＵＳＰ１６、ＵＳＰ２１、ＵＳＰ２２、ＢＡＰ１、及びＢＲＣＣ３６（ＢＲＣＡ−１含有複合体）を含む。「Ｈ２Ａ脱ユビキチン化酵素拮抗物質」とは、細胞中で１つ以上のＨ２Ａ脱ユビキチン化酵素の活性を減少させ、抑制し、阻害し、拮抗する等の任意の作用物質を意味する。

いくつかの実施形態では、主題組成物は、Ｈ２Ａ脱ユビキチン化酵素の拮抗物質を含む。特定の実施形態では、Ｈ２Ａ脱ユビキチン化酵素は、２Ａ−ＤＵＢ／ＭＹＳＭ１、ＵＳＰ３、ＵＳＰ７、Ｕｂｐ−Ｍ／ＵＳＰ１６、ＵＳＰ２１、ＵＳＰ２２、ＢＡＰ１、及びＢＲＣＡ−１含有複合体（ＢＲＣＣ３６）からなる群から選択される。特定の実施形態では、Ｈ２Ａ脱ユビキチン化酵素は２Ａ−ＤＵＢ／ＭＹＳＭ１である。「２Ａ−ＤＵＢ／ＭＹＳＭ１」とは、酵素ＭＹＳＭ１ Ｍｙｂ様、ＳＷＩＲＭ及びＭＰＮドメイン１を意味し、その配列はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１０８５４８７．２において見出され得る。特定の実施形態では、Ｈ２Ａ脱ユビキチン化酵素はＵＳＰ３である。「ＵＳＰ３」とは、ユビキチン特異的ペプチダーゼ３を意味し、その配列はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００６５３７．３及びＮＭ＿００１２５６７０２．１において見出され得る。特定の実施形態では、Ｈ２Ａ脱ユビキチン化酵素はＵＳＰ７である。「ＵＳＰ７」とは、ユビキチン特異的ペプチダーゼ７を意味し、その配列はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００３４７０．２、ＮＭ＿００１２８６４５７．１、及びＮＭ＿００１２８６４５８．１において見出され得る。特定の実施形態では、Ｈ２Ａ脱ユビキチン化酵素はＵｂｐ−Ｍ／ＵＳＰ１６である。「ＵＳＰ１６」とは、ユビキチン特異的ペプチダーゼ１６を意味し、その配列はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００６４４７．２（変異体１）、ＮＭ＿００１００１９９２．１（変異体２）、及びＮＭ＿００１０３２４１０．１（変異体３）において見出され得る。特定の実施形態では、Ｈ２Ａ脱ユビキチン化酵素はＵＳＰ２１である。「ＵＳＰ２１」とは、ユビキチン特異的ペプチダーゼ２１を意味し、その配列はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１２４７５．４及びＮＭ＿００１０１４４４３．２において見出され得る。特定の実施形態では、Ｈ２Ａ脱ユビキチン化酵素はＵＳＰ２２である。「ＵＳＰ２２」とは、ユビキチン特異的ペプチダーゼ２２を意味し、その配列はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１５２７６．１において見出され得る。特定の実施形態では、Ｈ２Ａ脱ユビキチン化拮抗物質はＢＡＰ１を阻害する。ＢＡＰ１とは、ＢＲＣＡ１関連タンパク質−１を意味し、その配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００４６５６．３において見出され得る。

本明細書の実施例において実証されるように、Ｈ２Ａ脱ユビキチン化酵素、例えばＨ２Ａ脱ユビキチン化酵素ＵＳＰ１６は、幹細胞増殖を調節し、造血幹細胞コンパートメント、神経幹細胞コンパートメント、及び乳腺を含む多くの組織において機能する。したがって、例えばＵＳＰ１６の拮抗物質を提供することによって、幹細胞または前駆細胞中でＨ２Ａ脱ユビキチン化酵素活性を阻害することは、神経幹細胞及び前駆細胞の増殖を促進することになり、これが新しいニューロンの生成を増加させ、神経発達障害及び神経変性疾患を有する個体における神経系機能を改善することになり、造血幹細胞及び前駆細胞の増殖を促進することになり、これが造血幹細胞の生成を増加させかつ免疫系機能を改善することになり、さらに乳腺上皮細胞の増殖を促進し、かつ乳腺上皮細胞の成長を促進することになる。

幹細胞及び前駆細胞中で、Ｈ２Ａ脱ユビキチン化酵素、例えばＵＳＰ１６を拮抗する任意の作用物質（例えば、当該技術分野で既知のもの、本明細書で記載されるもの、または本明細書で記載されるスクリーニング法を用いて同定されたもの）が、主題組成物中で使用されてもよい。主題作用物質は、例えば、細胞中の脱ユビキチン化酵素の相対量を減少させることによって、ヒストン上の脱ユビキチン化の活性部位をブロックすることによって、細胞の細胞質への脱ユビキチン化酵素の局在化を促進することによって、Ｈ２Ａヒストンの脱ユビキチン化を促進することによってなどで作用することができる。例えば、主題作用物質は、例えば、細胞中のＵＳＰ１６タンパク質の相対量を低減することによって、ＵＳＰ１６の活性を低減することができる（例えば、主題作用物質は、ＵＳＰ１６に特異的である核酸阻害物質、すなわち、これはＵＳＰ１６特異的核酸阻害物質であってもよく、例えば、アンチセンスＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲｉ等である）。「特異的」、「特異的結合」、「特異的に結合する」等とは、結合作用物質、例えば、核酸、ポリペプチド、抗体等の、細胞中の他の分子または部分と比べての標的分子に直接優先的に結合するための能力を意味する。特定の実施形態では、結合作用物質とそれが特異的に結合する標的との間の親和性は、それらが結合複合体中で互いに特異的に結合するとき、１０^-6Ｍ未満、１０^-7Ｍ未満、１０^-8未満、１０^-9Ｍ未満、１０^-10 Ｍ未満、１０^-11 Ｍ未満、１０^-12 Ｍ未満、１０^-13 Ｍ未満、１０^-14 Ｍ未満、または１０^-15 Ｍ未満のＫＤ（解離定数）によって特徴付けられる。

主題組成物中のＨ２Ａ脱ユビキチン化酵素の拮抗物質としての使用に好適な作用物質は、低分子化合物、例えば天然起源のまたは合成の低分子化合物を含む。対象となる天然起源のまたは合成の低分子化合物は、有機分子、例えば、５０ダルトンを超え、約２，５００ダルトン未満の分子量を有する小さい有機化合物などの多くの化学物質種を含む。候補作用物質は、タンパク質との構造的相互作用のための官能基、特に水素結合を含み、典型的には、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくはこの化学官能基のうちの少なくとも２つを含む。候補作用物質は、周期性炭素もしくは複素環構造及び／または上記官能基のうちの１つ以上で置換された芳香族もしくはポリ芳香族構造を含んでもよい。候補作用物質はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、これらの誘導体、構造類似体または組み合わせを含む生体分子の間で見出される。本発明に好適な薬剤の例は、“Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，（１９９６），Ｎｉｎｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎに記載されているものである。毒素、及び生物ならびに化学戦剤も含まれ、例えば、Ｓｏｍａｎｉ，Ｓ．Ｍ．（Ｅｄ．），“Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｗａｒｆａｒｅ Ａｇｅｎｔｓ，”Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）を参照されたい。低分子化合物は、細胞が培養されている媒質、例えばＤＭＳＯまたは他の溶媒中の溶液などに直接提供することができる。

主題組成物中のＨ２Ａ脱ユビキチン化酵素の拮抗物質としての使用に好適な作用物質はまた、核酸、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡもしくはアンチセンス分子をコード化する核酸、またはポリペプチドをコード化する核酸を含む。核酸を標的細胞に移動させるために有用な多くのベクターが利用可能である。ベクターはエピソーム的に、例えば、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、例えばサイトメガロウイルス、アデノウイルス等のウイルス由来ベクターとして維持されてもよく、またはこれらは、例えば、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ−１、ＡＬＶ等のレトロウイルス由来ベクター相同的組換えもしくはランダム組込みを通して標的細胞ゲノムに組み込まれてもよい。

ベクターは、主題の細胞に直接提供されてもよい。言い換えると、ベクターが細胞によって取り込まれるように、細胞を対象となる核酸を含むベクターと接触させる。電気穿孔法、塩化カルシウムトランスフェクション、及びリポフェクチンなどの細胞を核酸ベクターと接触させるための方法は、当該技術分野において周知である。

あるいは、対象となる核酸は、主題細胞にウイルスを介して提供されてもよい。言い換えると、細胞を、対象となる核酸を含むウイルス粒子と接触させる。レトロウイルス、例えばレンチウイルスは、本発明の方法に特に好適である。通常使用されるレトロウイルスベクターは、「欠損性」であり、すなわち、増殖性感染に必要とされるウイルスタンパク質を生成することができない。むしろ、ベクターの複製は、パッケージング細胞株中の増殖を必要とする。対象となる核酸を含むウイルス粒子を作成するために、核酸を含むレトロウイルス核酸が、パッケージング細胞株によってウイルスキャプシドにパッケージ化される。異なるパッケージング細胞株は、キャプシドに組み込まれるための異なるエンベロープタンパク質を提供し、このエンベロープタンパク質は、細胞に対するウイルス粒子の特異性を決定する。エンベロープタンパク質は、少なくとも３つのタイプ、同種指向性（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）、両種指向性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）及び異種指向性（ｘｅｎｏｔｒｏｐｉｃ）のものである。同種指向性エンベロープタンパク質でパッケージ化されたレトロウイルス、例えばＭＭＬＶは、大部分のネズミ及びラット細胞型に感染することができ、ＢＯＳＣ２３などの同種指向性パッケージング細胞株を用いて生成される（Ｐｅａｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９０：８３９２−８３９６）。両種指向性エンベロープタンパク質を有しているレトロウイルス、例えば４０７０Ａ（Ｄａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．、上記参照）は、ヒト、イヌ及びマウスを含む大部分の哺乳動物の細胞株に感染することができ、ＰＡ１２（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３１−４３７）、ＰＡ３１７（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５−２９０２）、ＧＲＩＰ（Ｄａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＰＮＡＳ ８５：６４６０−６４６４）などの両種指向性パッケージング細胞株を用いて生成される。異種指向性エンベロープタンパク質でパッケージ化されたレトロウイルス、例えばＡＫＲ ｅｎｖは、ネズミ細胞を除く大部分の哺乳動物細胞に感染することができる。適切なパッケージング細胞株は、主題のＣＤ３３⁺ 分化体細胞がパッケージ化されたウイルス粒子によって標的化されることを確実にするために用いることができる。主題核酸を含むレトロウイルスベクターをパッケージング細胞株に導入する方法及びパッケージング株によって作成されたウイルス粒子を回収する方法は、当該技術分野において周知である。

対象となる核酸を主題の細胞に提供するために使用されるベクターは、典型的には、発現を導くための、すなわち、対象となる核酸の転写活性を導くための、好適なプロモータを含むであろう。言い換えると、対象となる核酸は、プロモータと動作可能に結合されることになる。これは、広範に作用するプロモータ、例えば、ＣＭＶ−ｂ−アクチンプロモータ、または特定の細胞集団中で活性であるプロモータもしくはテトラサイクリンなどの薬物の存在に応答するプロモータなどの誘導可能なプロモータを含むことができる。転写活性化とは、転写が、少なくとも約１０倍まで、少なくとも約１００倍まで、より一般には少なくとも約１０００倍まで、標的細胞中の基底レベルよりも上に増加することになることを意図する。加えて、主題核酸を細胞に提供するために使用されるベクターは、例えば、Ｃｒｅ／Ｌｏｘなどの組換え酵素システムを使用して後に除去されるべき遺伝子、または例えば、ヘルペスウイルスＴＫ、ｂｃｌ−ｘｓなどの選択的毒性を可能にする遺伝子を含むことによる、それらを破壊された状態で発現する細胞を含むことができる。

主題組成物中でＨ２Ａ脱ユビキチン化酵素の拮抗物質としての使用に好適な作用物質は、ポリペプチドも含む。こうしたポリペプチドは、任意選択的に、生成物の溶解度を増加させるポリペプチドドメインに融合されてもよい。このドメインは、定義されたプロテアーゼ開裂部位、例えば、ＴＥＶプロテアーゼによって開裂されるＴＥＶ配列を通してポリペプチドに結合することができる。リンカーもまた、１つ以上の柔軟な配列、例えば１〜１０個のグリシン残基を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の開裂は、生成物の溶解度を維持する緩衝液中で、例えば、０．５〜２Ｍの尿素の存在下で、溶解度を増加させるポリペプチド及び／またはポリヌクレオチドの存在下でなどで行われる。対象となるドメインは、エンドソーム溶解性ドメイン、例えばインフルエンザＨＡドメイン、及び生成で補助する他のポリペプチド、例えばＩＦ２ドメイン、ＧＳＴドメイン、ＧＲＰＥドメイン等を含む。

ポリペプチド剤が細胞内でデユビキチナーゼ活性を阻害するためのものである場合、ポリペプチドは、ポリペプチド浸透性ドメインに融合された対象となるポリペプチド配列を含んでもよい。多くの浸透性ドメインが当該技術分野において既知であり、ペプチド、ペプチド疑似体、及び非ペプチドキャリアを含める、本発明の非組込みポリペプチドにおいて使用されてもよい。例えば、浸透性ペプチドは、ペネトラチンと呼ばれるキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）転写因子アンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐａｅｄｉａ）の３次αへリックスから誘導され得る。別の例として、浸透性ペプチドは、ＨＩＶ−１ ｔａｔ塩基性領域アミノ酸配列を含み、これは例えば、天然起源のｔａｔタンパク質のアミノ酸４９〜５７を含むことができる。他の浸透性ドメインは、ポリ−アルギニンモチーフ、例えば、ＨＩＶ−１ ｒｅｖタンパク質のアミノ酸３４〜５６、ノナ−アルギニン、オクタ−アルギニン等を含む（例えば、Ｆｕｔａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ．２００３ Ａｐｒ；４（２）：８７−９６、及びＷｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ２０００ Ｎｏｖ．２１；９７（２４）：１３００３−８、公開された米国特許出願公開第２００３０２２０３３４号、同第２００３００８３２５６号、同第２００３００３２５９３号、ならびに同第２００３００２２８３１号（転座ペプチド及びペプトイドの教示に関して参照により本明細書に具体的に組み込まれる）を参照されたい）。ノナ−アルギニン（Ｒ９）配列は、特性評価されているより有効なＰＴＤの１つである（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．２０００、Ｕｅｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．２００２）。

ポリペプチド作用物質が細胞外でデユビキチナーゼ活性を阻害するためのものである場合、ポリペプチドは、改善された安定性のために処方され得る。例えば、ペプチドは、ペグ化されてもよく、ここではポリエチレンオキシ基は血流中の寿命の増加を提供する。ポリペプチドは、付加された機能性を提供するために、例えば、インビボ安定性を増加させるために、別のポリペプチドに融合されてもよい。一般に、こうした融合パートナーは、安定な血漿タンパク質であり、これらは、例えば、融合物として存在するとき、ポリペプチドのインビボ血漿半減期を延長させることができ、特にこうした安定な血漿タンパク質は、免疫グロブリン不変ドメインである。安定な血漿タンパク質が通常、多量体形態、例えば免疫グロブリンまたはリポタンパク質で見られ、その中で、同一のまたは異なるポリペプチド鎖は通常、ジスルフィド及び／または非共有結合され、組み立てられたマルチチェインポリペプチドを形成するほとんどの場合に、ポリペプチドを含有する本明細書の融合物が生成され、安定な血漿タンパク質前駆体と実質的に同様な構造を有する多量体として使用されることになる。これらの多量体は、これらが構成するポリペプチド作用物質に関して均質となるか、またはこれらは複数のポリペプチド作用物質を含有してもよい。

安定な血漿タンパク質は、典型的には、それらの未変性環境において循環中で延長された半減期、すなわち約２０時間を超える半減期を呈するタンパク質である。好適な安定血漿タンパク質の例は、免疫グロブリン、アルブミン、リポタンパク質、アポリポタンパク質及びトランスフェリンである。ポリペプチド作用物質は、典型的には、ポリペプチドに対して延長された半減期を付与することができる、血漿タンパク質またはその断片のＮ末端において、血漿タンパク質、例えばＩｇＧに融合される。ポリペプチドの血漿半減期に関する約１００％を超える増加が良好である。通常、ポリペプチドは、免疫グロブリンの可変領域（複数可）の代わりに免疫グロブリンの不変領域のＣ末端からＮ末端に融合されるが、Ｎ末端融合物もまた用途を見出すことができる。典型的には、こうした融合物は、免疫グロブリン重鎖の不変領域の少なくとも機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保持し、この重鎖は、通常、ＩｇＧクラス内のタンパク質の１つまたは組み合わせで、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ及びＩｇＤを含むことができる。融合物は、不変領域のＦｃ部分のＣ末端に、または重鎖のＣＨ１もしくは軽鎖の対応する領域へのＮ末端の近くにも作られる。これは、通常、適切なＤＮＡ配列を構築し、これを組換え細胞培養物中で発現させることによって達成される。あるいは、ポリペプチドが、既知の方法に従って合成されてもよい。

ポリペプチドの生物学的活性、分泌または結合特性を最適化するために、融合物がつくられる部位が選択され得る。最適部位は、ルーチン的な実験によって決定されるであろう。

いくつかの実施形態では、ハイブリッド免疫グロブリンは、単量体、またはヘテロ−もしくはホモ−多量体として、特に二量体または四量体として組み立てられる。一般に、これらの組み立てられた免疫グロブリンは、既知のユニット構造を有するであろう。基本的な４本の鎖の構造ユニットは、その中でＩｇＧ、ＩｇＤ、及びＩｇＥが存在する形態である。４本鎖ユニットは、より高い分子量の免疫グロブリン中で繰り返される（ＩｇＭは、一般的に、ジスルフィド結合によって一緒に保持される基本的な４本鎖ユニットの五量体として存在する）。ＩｇＡ免疫グロブリンは、場合によりＩｇＧ免疫グロブリンも、血清中では多量体型で存在することができる。多量体の場合、各々の４本鎖ユニットは、同一であっても異なっていてもよい。

主題方法において使用するためのポリペプチド作用物質は、原核細胞によって生成された真核細胞から生成することができ、これはアンフォールディング、例えば、熱変性、ＤＴＴ還元等によってさらに処理されてもよく、当該技術分野において既知の方法を用いてさらにリフォールディングされてもよい。

一次配列を変更しない対象となる修飾は、ポリペプチドの化学的誘導体化、例えば、アシル化、アセチル化、カルボキシル化、アミド化等を含む。グリコシル化の修飾物、例えば、ポリペプチドのグリコシル化パターンをその合成及び処理中に修飾することによって、またはさらなる処理ステップ中に修飾すること（例えば、哺乳動物グリコシル化または脱グリコシル化酵素などのグリコシル化に影響を及ぼす酵素にポリペプチドを曝すことによって）によって作成されたものも含まれる。リン酸化アミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニンも包含される。

タンパク質分解による崩壊に対するポリペプチドの抵抗性を改善するために、または溶解特性を最適化するように、あるいはそれらを治療薬としてより適切なものにするように、通常の分子生物学的技術及び合成化学を用いて修飾されたポリペプチドも本発明に含まれる。こうしたポリペプチドの類似体として、天然起源のＬアミノ酸以外の残基を含むもの、例えば、Ｄアミノ酸または非天然起源の合成アミノ酸を含む。Ｄアミノ酸は、アミノ酸残基の一部または全てに対して置換されてもよい。

主題ポリペプチドは、当該技術分野において既知の通常の方法を用いる、インビトロ合成によって調製することができる。種々の市販の合成装置が利用可能であり、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｃｋｍａｎ等による自動化シンセサイザである。シンセサイザを使用することによって、天然起源のアミノ酸は、非天然アミノ酸で置換され得る。特定の配列及び調製の方法は、便宜性、経済性、必要とされる純度等によって決定されるであろう。

所望の場合、合成中または発現中に、他の分子への結合または表面への結合を可能にする種々の基が、ペプチドに導入されてもよい。したがって、システインは、金属イオン錯体への結合のためのチオエーテル、ヒスチジンを、アミドまたはエステルを形成するためのカルボキシル基を、アミドを形成するためのアミノ基などを生成するために使用することができる。

ポリペプチドはまた、組換え体合成の従来の方法に従って単離されかつ精製され得る。細胞溶解物が発現宿主から調製することができ、この細胞溶解物は、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、または他の精製技術を用いて精製される。大抵の場合、使用される組成物は、生成物の調製及びその精製の方法に関連する汚染物質に関して、少なくとも２０重量％の所望の生成物、より一般的には少なくとも約７５重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％の生成物を含み、治療的目的では、通常少なくとも約９９．５重量％の生成物を含む。通常、パーセンテージは、総タンパク質に基づく。

主題組成物中のＨ２Ａ脱ユビキチン化酵素の拮抗物質として好適なポリペプチドの別の例は、抗体である。用語「抗体」または「抗体部分」は、エピトープに嵌合しかつエピトープを認識する特異的な形状を備える任意のポリペプチド鎖含有分子構造を含むことが意図され、ここでは１つ以上の非共有結合相互作用が、分子構造とエピトープとの間の複合体を安定化する。所定の構造とその特異的エピトープとの特異的または選択的嵌合は、時には「鍵と鍵穴」嵌合とも呼ばれる。典型的な抗体分子は免疫グロブリンであり、全ての供給源、例えば、ヒト、齧歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、他の哺乳動物、ニワトリ、他の鳥類などからの全てのタイプの免疫グロブリン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等が「抗体」であるとみなされる。用語「抗体」は、本明細書では広い意味で用いられ、具体的には、完全抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片（これらが所望の生物学的活性を呈する限り）を包含する。抗体は、典型的には、細胞が培養されている培地中に提供される。

作用物質は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む多種多様な供給源から得ることができる。例えば、ランダム化されたオリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含める、生体分子を含む広範囲の有機化合物のランダム及び直接的合成のために多くの手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であり、または容易に生成される。さらに、天然でまたは合成的に生成されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的及び生化学的手段を通して容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを生成するよう使用されてもよい。既知の薬理学的作用物質は、構造類似体を生成するために、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等の直接的またはランダムな化学修飾を受けてもよい。

Ｈ２Ａ脱ユビキチン化酵素拮抗物質である作用物質は、当該技術分野における多くの従来の方法のいずれかによって容易に検証され得る。例えば、細胞中のＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ遺伝子座におけるＨ２ＡＫ１１９ユビキチンマークの量を測定することができ、作用物質での処置後のユビキチンマークにおける増加は、この作用物質がＵＳＰ１６拮抗薬であることを示す。別の例として、細胞中のＩｎｋ４ａ ＲＮＡまたはタンパク質の量が評価されることができ、ここでは、作用物質による処置後のＩｎｋ４ａ ＲＮＡ／タンパク質の量における減少が、この作用物質がＵＳＰ１６拮抗物質であることを示す。第３番目の例として、細胞、例えばダウン症候群線維芽細胞、例えばＴｓ６５Ｄｎマウスからの線維芽細胞の増殖速度が決定されてもよく、ここでは、作用物質による処置後の増殖における増加が、この作用物質がＨ２Ａ脱ユビキチン化酵素拮抗物質であることを示す。

医薬品中の封入のために、主題作用物質は、好適な市販供給源から得られてもよい。一般的な提案として、一用量当たりの非経口投与される主題作用物質の全薬学上有効量は、用量反応曲線によって測定され得る範囲内にあるであろう。

治療的投与に使用される主題作用物質の調製物は無菌でなければならない。無菌性は、無菌濾過膜（例えば、０．２μｍの膜）を通しての濾過によって容易に達成される。治療組成物は、一般に、無菌の取り出し部を有する容器、例えば、皮下注射針によって突き通すことができる栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルの中に入れられる。主題作用物質に基づく治療薬は、単位投与または多回投与用容器、例えば密閉されたアンプルまたはバイアル中に、水溶液としてまたは再構成用の凍結乾燥製剤として保存されてもよい。凍結乾燥製剤の例として、１０ｍＬのバイアルが５ｍｌの無菌濾過された１％（ｗ／ｖ）の化合物の水溶液で充填され、得られた混合物が凍結乾燥される。注入溶液は、凍結乾燥された化合物を、注射用静菌水を用いて再構成することによって調製される。

薬学的組成物は、所望される製剤に応じて、薬学的に許容し得る、非毒性の担体または希釈剤を含むことができ、これらは動物またはヒトへの投与用の薬学的組成物を製剤化するために一般的に用いられるビヒクルとして定義される。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響を及ぼすことがないように選択される。こうした希釈剤の例は、蒸留水、緩衝化水、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル溶液、デキストロース溶液、及びハンク溶液である。加えて、薬学的組成物または製剤は、他の担体、アジュヴァント、または非毒性、非治療的、非免疫原性安定剤、賦形剤等を含むことができる。組成物はまた、ｐＨ調節剤ならびに緩衝化剤、毒性調節剤、湿潤剤及び洗浄剤などの生理学的条件に近づくための追加の物質を含むことができる。

組成物はまた、例えば抗酸化剤などの種々の安定剤のいずれかを含むことができる。薬学的組成物がポリペプチドを含有する場合、ポリペプチドは、ポリペプチドのインビボ安定性を増強させる、ないしは別の方法でその薬理特性を増強させる（例えば、ポリペプチドの半減期を増加させる、その毒性を低下させる、溶解度または取り込みを増強させる）種々の周知の化合物で錯体化され得る。こうした修飾または錯化剤は、硫酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩及びリン酸塩を含む。組成物の核酸またはポリペプチドはまた、これらのインビボ属性を増強させる分子と錯体化され得る。こうした分子は、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、マンガン）、及び脂質を含む。

主題作用物質は、種々の製剤に組み込まれることができる。より具体的には、本発明の主題作用物質は、薬学上許容し得る担体または希釈剤との組み合わせによって、薬学的組成物に製剤化され得る。

薬学的調製物は、薬学上許容し得るビヒクル中に存在する１つ以上の標的化された主題作用物質を含む組成物である。「薬学上許容し得るビヒクル」とは、連邦政府もしくは州政府の監督機関によって承認されたまたは米国薬局方もしくはヒトなどの哺乳動物のために他の一般的に認められた薬局方に列挙されたビヒクルであり得る。用語「ビヒクル」とは、哺乳動物への投与のために本発明の化合物がそれと共に製剤化される、希釈剤、アジュヴァント、賦形剤、または担体を指す。こうした薬学的ビヒクルは、脂質、例えばリポソーム（例えば、リポソームデンドリマー）；石油、動物、植物または合成起源のもの（例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等）、生理食塩水を含む水及び油などの液体；アラビアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素等であり得る。加えて、補助剤、安定剤、増粘剤、滑沢剤及び着色剤が使用されてもよい。薬学的組成物は、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、マイクロスフェア、及びエアロゾル剤などの固体、半固体、液体またはガス状形態で調製物に製剤化され得る。然る故に、主題作用物質の投与は、経口、口腔内、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内等の投与を含む種々の方法で達成され得る。活性作用物質は、投与後全身的なものであってもよく、または局所投与、壁内投与の使用によって、もしくは移植部位にて活性用量を保持するように作用する移植片の使用によって局所的なものであってもよい。活性作用物質は、即時作用のために製剤化されてもよく、またはこれは持続性放出用に製剤化されてもよい。

いくつかの病態について、特に中枢神経系病態について、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断するように作用物質を製剤化することが必要な場合がある。血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する薬剤送達のための１つの戦略は、マンニトールもしくはロイコトリエン類などの浸透圧手段によるか、またはブラジキニンなどの血管作用物質の使用による生化学的な手段のいずれかによる、ＢＢＢの破壊を伴う。脳腫瘍に対する特異的作用物質を標的とするためにＢＢＢ開口を使用することの可能性もまた選択案である。本組成物が血管内注射されるとき、ＢＢＢ破壊剤が、本発明の治療的組成物と同時に投与され得る。ＢＢＢを突き抜けるための他の戦略は、カベオリン−１仲介トランスサイトーシス、グルコースならびにアミノ酸担体などの担体仲介輸送体、インスリンもしくはトランスフェリンに関する受容体仲介トランスサイトーシス、及びｐ−糖タンパク質などの能動的汲み出し輸送体を含む内因性輸送系の使用を伴う場合がある。能動的輸送部分はまた、血管の内皮壁を横断する輸送を容易にするために、本発明において使用するための治療化合物と複合体とを形成させてもよい。あるいは、ＢＢＢの後方の治療薬の薬剤送達は、局所送達による、例えば髄内送達による（例えば、オンマヤレザバーを通して（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２２２，９８２号及び同第５，３８５，５８２号を参照））；ボーラス注射による（例えば、例えば注射器によって、硝子体内または頭蓋内など）；連続輸注による（例えば、対流を用いて、例えばカニューレ挿入による（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００７／０２５４８４２号を参照））、またはその上に作用物質が可逆的に固定されている装置を移植することによる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００８／００８１０６４号及び同第２００９／０１９６９０３号を参照）ものであってもよい。

種々のタイプの投与に好適な製剤に関するさらなるガイダンスは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）で見出すことができる。薬剤送達のための方法の簡単な再考については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）を参照されたい。

本薬学的組成物は、予防的及び／または治療的な処置のために投与することができる。活性成分の毒性及び治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（個体数の５０％に対する致死量）及びＥＤ５０（個体数の５０％における治療的に有効な用量）を決定することを含む、細胞培養物及び／または実験動物における標準的薬剤手順に従って決定することができる。毒性と治療的有効性との間の用量比は、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す治療法が好ましい。

細胞培養及び／または動物試験から得られるデータは、ヒトに対する用量の範囲を処方することにおいて使用することができる。活性成分の用量は、典型的には、低い毒性を伴うＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内で線を引く。用量は、使用される投与形態及び利用される投与の経路に応じて、この範囲内で変化することができる。

薬学的組成物を製剤化するために使用される構成成分は、高純度であることが好ましく、潜在的に有害な汚染物質を実質的に含まない（例えば、少なくともＮａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｏｄ（ＮＦ）グレード、一般には少なくとも分析グレード、より典型的には少なくとも医薬品グレード）。さらには、インビボ使用を意図する組成物は、通常無菌である。使用前に所定の化合物が合成されねばならない限り、得られた生成物は、典型的には、合成または精製プロセス中に存在し得る任意の潜在的有毒物質、特に任意のエンドトキシンを実質的に含まないものである。ペアレンタル投与のための組成物はまた、無菌であり、実質的に等張であり、ＧＭＰ条件下で製造される。

特定の患者に投与される治療用組成物の有効量は、種々の因子に依存することになり、そのいくつかは患者間で異なるであろう。能力を有する臨床医は、疾患状態の進行を停止させまたは逆転させるために、患者に投与するための治療薬の有効量を適宜決定することができるであろう。

ＬＤ５０動物データ、及び作用物質についての使用可能な他の情報を利用して、臨床医は、投与の経路に応じて、個体に関する最大安全用量を決定することができる。例えば、静脈内投与用量は、治療組成物が投与されているより多くの体液があるという条件で、髄腔内投与用量を超え得る。同様に、身体から迅速に除去される組成物は、治療薬濃度を維持するために、より高い用量で、または反復して投与されてもよい。通常の技能を利用して、能力がある臨床医であれば、ルーチンの臨床試験の過程において特定の治療薬の用量を最適化することができるであろう。

投与される作用物質の有効量または有効用量の計算は、当業者の技術の範囲内であり、当業者にとっては日常的であろう。言うまでもなく、投与される最終量は、投与の経路に、及び治療される障害または病態の性質に応じる。

方法
主題方法の実践において、主題のＨ２Ａ脱ユビキチン化酵素の拮抗物質を、幹細胞または前駆細胞と接触させる。用語「幹細胞」は、自己再生しかつ分化細胞型を産生するための両方の能力を有する哺乳動物細胞を指すように、本明細書で使用される（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２８７−２９８を参照）。細胞個体発生に関して、形容詞「分化した」、または「分化する」は相対的用語である。「分化細胞」は、比較される細胞よりもダウンの発達経路をさらに進行させた細胞である。したがって、多能性幹細胞（以下に記載）は、さらなる制限細胞（例えば、エピブラスト幹細胞（以下に記載）、中胚葉幹細胞、間葉系幹細胞等）に分化することができ、これは、今度はさらに制限される細胞（例えば、心筋前駆細胞、神経前駆細胞等）に分化することができ、これが最終段階の細胞（すなわち、最終分化細胞、例えば、ニューロン、骨格筋細胞、心筋細胞、脂肪細胞、骨芽細胞等）に分化することができ、これらはある組織型において特徴的な役割を果たし、さらに増殖するための能力を有してもまたは有さずともよい。異なるタイプの幹細胞は、特異的マーカー（例えば、タンパク質、ＲＮＡ等）の存在及び特異的マーカーの不在の両方によって特徴付けられ得る。幹細胞はまた、インビトロ及びインビボの両方の機能的アッセイによって、具体的には、特定のタイプの分化した子孫をもたらすための幹細胞の能力に関するアッセイによって同定され得る。

幹細胞が対称的に分裂する場合、両方の得られた娘細胞は等価である。例えば、幹細胞は、自己再生する対称的な分裂を行うことができ、その中で得られた娘細胞は、母細胞のものと当量の分化能力を有する幹細胞である。しかしながら、両方の得られた娘細胞が母細胞に対して代わりに分化され得るために、対称的分裂が必ずしも自己再生分裂というわけではない。幹細胞が非対称的に分裂する場合、得られた娘細胞は、互いに異なる。例えば、幹細胞が自己再生非対称的分裂を受ける場合、今度は、得られた娘細胞の一方が母細胞と同様な分化能力の量を有する幹細胞であるが、他方の娘細胞は、母細胞に対して分化されている（例えば、より系統的に制限された前駆細胞、最終分化細胞等）。幹細胞は、直接的に分化されてもよく（すなわち、分裂なしに）、またはこの代わりに、非対称的もしくは対称的細胞分裂を通して分化細胞型を生成してもよい。

本開示における対象となる幹細胞（すなわち、細胞集団）は、多能性幹細胞（ＰＳＣ、すなわち、ＰＳＣ集団）を含む。用語「多能性幹細胞」または「ＰＳＣ」は、自己再生することができかつ生物の全ての細胞型を生成することができる（すなわち、多能性）幹細胞を意味するように本明細書で使用される。したがって、ＰＳＣは、生物の全ての胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）の細胞を生じることができる。多能性幹細胞は、２つの状態で存在し、すなわち（ｉ）マウス胚幹細胞（ＥＳＣ、以下により詳細に記載）によって集約される「ナイーブ型」状態、及び（ｉｉ）発達的により進化したマウスのエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣ、以下により詳細に記載）によって集約される「プライム型」状態で存在する。ナイーブ型状態では、ＰＳＣゲノムは、異常な開状態の立体配座を有し、最小限の制限的エピジェネティックマークを有する。これとは対照的に、プライム型状態における細胞は、胚の細胞型に向かう分化を支援する活性化されたエピジェネティック可動部分を有する。したがって、ナイーブ型からプライム型多能性への移行は、細胞分化における中心的事象を表す。ナイーブ型及びプライム型状態に関するより詳細な説明は、例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｊｕｎ ５；４（６）：４８７−９２：Ｎａｉｖｅ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔａｔｅｓを参照されたい。

本開示における対象となる幹細胞はまた、組織特異的幹細胞、例えば、エピブラスト幹細胞、中胚葉幹細胞、間葉幹細胞、神経幹細胞を含む。用語「組織特異的幹細胞」は、自己再生することができるが、制限された能力を有する細胞を意味するように本明細書で使用され、すなわち、これは人の手によるいくつかの操作なくしては体内の全ての細胞型を誘起することができない。組織特異的幹細胞は、それらが由来する組織の細胞を生じることができる。例えば、神経幹細胞は、ニューロン、乏突起膠細胞、及び星状膠細胞を生じることができる。組織特異的幹細胞は、その後さらに制限される細胞（例えば、心筋前駆細胞、神経前駆細胞等）に分化することができ、これは最終段階の細胞（すなわち、最終分化細胞、例えば、ニューロン、骨格筋細胞、心筋細胞、脂肪細胞、骨芽細胞等）に分化することができる。

本開示における対象となる細胞はまた、前駆細胞を含む。用語「前駆細胞」は、典型的に広範な自己再生能力を有さず（すなわち、自己再生分裂の数が限定される）、多くの場合限定された数の分化細胞型（例えば、これらが由来する組織で見出される細胞の特異的なサブセット）だけを生成し得る、あるタイプの幹細胞を指すように本明細書で使用される。したがって、前駆細胞は、それを生じる組織特異的幹細胞に対して分化されるが、さらに分化される細胞（例えば、最終分化細胞）も生じることができる。本発明の目的のために、前駆細胞は、対象となる系統に向かうことが約束された細胞（例えば、心筋前駆細胞、神経前駆細胞等）であるが、成熟細胞（例えば、心筋細胞、ニューロン等）までまだ分化されていないものである。

主題方法において接触された幹細胞または前駆細胞は、任意の哺乳動物種、例えば、ネズミ科、齧歯類、イヌ科、ネコ科、ウシ科、ヒツジ科、霊長類、ヒト等からのものであり得る。インビトロ試験については、細胞は、確立された細胞株からのものであってもよく、またはこれらは一次細胞であってもよく、「一次細胞」、「一次細胞株」及び「一次培養物」は、対象に由来し、限定された数の継代（すなわち、培養物の分裂）にわたってインビトロで増殖させる細胞及び細胞培養物を指すように本明細書で互換的に使用される。例えば、一次培養物は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、または１５回継代させ得るが、クライシスステージまで突き進むのには十分な時点にはない培養物である。典型的には、本発明の一次細胞株は、インビトロで１０継代よりも少ない継代で維持される。

細胞が一次細胞である場合、これらは、任意の従来の方法によって、個体から採取され得る。例えば、細胞、例えば血液細胞、例えば造血幹細胞または造血前駆細胞は、アフェレーシス、白血球吸着除去療法、密度勾配分離、骨髄生検、胎児肝臓生検、臍帯血等によって採取され得る。別の例として、固形組織からの細胞、例えば神経幹細胞または前駆細胞は、生検によって、例えば、幹細胞ニッチから、例えば脳室下帯から採取され得る。適切な溶液が、採取細胞の分散または懸濁のために使用されてもよい。こうした溶液は、一般的には、バランス塩溶液、例えば、通常、低濃度（一般的に５〜２５ｍＭ）における許容し得る緩衝液と共に、ウシ胎児血清及び／または他の因子、例えばＢ２７で補充された、正常生理食塩水、ＰＢＳ、ハンクのバランス塩溶液、イスコフ（Ｉｓｃｏｖｅｓ）等であるだろう。簡便な緩衝液は、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩緩衝液、乳酸塩緩衝液等を含む。細胞は、すぐに使用されてもよく、またはこれらは、解凍され、再利用可能な状態で、長期間にわたって凍結保存されてもよい。こうした場合、細胞は１０％のＤＭＳＯ、５０％の血清、４０％の緩衝化媒質、またはこうした凍結温度で細胞を保存するために当該技術分野において一般的に使用されるような他のこうした溶液中で凍結され、凍結培養細胞に関して当該技術分野において一般的に既知の方法で解凍される。

インビトロにおける細胞の主題組成物との接触は、任意の培地中で細胞の生存を促進する任意の培養条件の下で生じることができる。例えば、細胞は、血清（例えば、ウシ胎児血清、熱不活性化ヤギ血清（約５〜１０％）等）、または増殖を支援する合成試薬（例えば、Ｂ２７、抗生物質（例えば、ペニシリン及びストレプトマイシン）で補充された、イスコフ改変ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ １６４０などの簡便である任意の適切な栄養培地中に懸濁させることができる。培養物は、細胞が応答する増殖因子を含有してもよい。本明細書で定義される増殖因子は、膜貫通受容体に及ぼす特異的作用を通して、培養物中または無処置組織中のいずれかで、細胞の生存、増殖及び／または分化を促進することができる分子である。増殖因子は、ポリペプチド及び非ポリペプチド因子を含む。ニューロンの培養における特定の用途を見出す培地及び試薬の例は、以下の実施例の部分において見出すことができる。

主題方法の実践において、主題組成物は、細胞に１回以上、例えば、１回、２回、３回、または３回を超えて提供されてもよく、各接触事象後、細胞を主題作用物質と共にいくらかの時間にわたって、例えば１６〜２４時間、インキュベートさせて、その後培地が新鮮な培地と交換され、細胞がさらに培養される。

上記で考察されたように、主題の方法及び組成物は、幹細胞自己再生の速度の低下に関連し、幹細胞自己再生の速度の増加に反応する医学的状態を治療することにおいて用途を見出す。これらのインビボ実施形態では、主題作用物質は、個体に直接投与される。例えば、ネズミ科、齧歯類、イヌ科、ウシ科、ヒツジ科、霊長類、ヒト等の任意の哺乳動物は、主題の医学的状態を治療するために主題作用物質で投与され得る。主題作用物質は、ポリペプチド、ペプチド、小型分子または核酸の対象への投与のための多くの周知の方法のいずれか、例えば、本明細書に記載されるものまたは当該技術分野で既知のものによって投与され得る。

インビボにおける細胞の主題組成物との接触は、任意の従来の経路を介する主題組成物の個体への投与によって達成することができる。例えば、主題組成物は、経口、口腔内、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内等で投与され得る。主題組成物は、局所的にまたは全身的に、例えば、脳室内で骨髄などに投与されてもよい。活性作用物質は、投与後全身的であってもよく、または局所投与、壁内投与の使用によって、もしくは移植部位にて活性用量を保持するよう作用するに移植片の使用によって局所的なものであってもよい。

主題方法の実践において、Ｈ２Ａ脱ユビキチン化酵素拮抗物質の有効量が、典型的に提供される。生化学的に言うと、主題作用物質の「有効量」または「有効用量」は、Ｈ２Ａ脱ユビキチン化酵素の脱ユビキチン化活性を、約２０％以上まで、例えば３０％以上まで、４０％以上まで、５０％以上まで、いくつかの例では６０％以上まで、７０％以上まで、８０％以上まで、または９０％以上まで、場合によっては約１００％まで、すなわち、ごく僅かな量にまで、阻害し、拮抗し、減少させ、低下させ、または抑制する作用物質の量である。ヒストンユビキチン化の範囲を測定するための任意の従来の方法、例えば、当該技術分野で既知のものまたは本明細書で記載されるものが、有効量を決定するために使用されてもよい。

臨床的観点において、Ｈ２Ａ脱ユビキチン化酵素拮抗物質の有効量、または有効用量は、通常、少なくとも約１週間、おそらくは約２週間、もしくはそれ以上、最長で約４週間、８週間、またはそれ以上の期間の適切な期間にわたって投与される場合、医学的状態に関連する症状、例えば、神経発達障害、神経変性疾患、または脳損傷を有する個体における認知障害；高齢の個体における細胞老化に関連する認知障害及び自己免疫状態；例えば、癌、ＡＩＤＳ、うっ血性心不全、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、または腎不全に関連する筋委縮；骨髄欠乏症に関連する免疫不全；膵臓細胞再生を必要とする膵臓疾患に関連するインスリン欠乏症、例えば糖尿病；肝不全に関連する黄疸、疲労、虚弱；重度熱傷後の創傷治癒等における改変の証拠を提供する。例えば、ＣＮＳ、造血細胞コンパートメント、膵臓、肝臓、肺における改善された組織発達及び／または機能を測定するための方法は、当該技術分野において周知であり、そのいずれかを用いて、有効用量を決定し、個体が主題組成物の投与によって医学的状態に対して治療されることを決定することができる。当業者であれば、初期用量がこうした期間にわたって投与され、続いて、場合によっては低下した投与量で、維持用量が投与され得ることを理解するであろう。

例えば、有効用量は、通常、少なくとも約１週間、おそらくは約２週間、もしくはそれ以上、最長で約４週間、８週間、またはそれ以上の期間の適切な期間にわたって投与される場合、ダウン症候群などの神経発達障害、アルツハイマー病などの神経変性疾患、または脳損傷に関連する認知障害に冒されている患者において、認知機能低下を約２０％以上まで、例えば３０％以上まで、４０％以上まで、５０％以上まで、いくつかの例では６０％以上まで、７０％以上まで、８０％以上まで、または９０％以上まで、緩慢化するか、または停止させる、すなわち、認知能力を安定化させる用量である。いくつかの実施形態では、有効量または有効用量は、疾患状態の進行を緩慢化するまたは停止させることができるばかりでなく、状態の好転も誘起することができる。例えば、有効用量は、通常、少なくとも約１週間、おそらくは約２週間、もしくはそれ以上、最長で約４週間、８週間、またはそれ以上の期間の適切な期間にわたって投与される場合、例えば、ダウン症候群などの神経発達障害、アルツハイマー病などの神経変性疾患、または脳損傷に関連する認知障害を有する個体における認知を、例えば、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、いくつかの例では６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍以上まで改善するであろう。認知における改善は、例えば記憶における改善として観察することができる。記憶における改善は、当該技術分野において既知の簡便な方法を用いて、例えば、検索関連脳活性を評価することによって（Ｂｕｃｈｍａｎｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｐｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍ１２９Ｖ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｆｆｅｃｔｓ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ−ｒｅｌａｔｅｄ ｂｒａｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉａ．４６（９）：２３８９−４０２）、または例えば、馴染みがある対象及び馴染みがない対象を用いる反復プライミング後に機能核磁気共鳴断層装置（ｆＭＲＩ）による脳組織を画像撮影することによって（Ｓｏｌｄａｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｇｌｏｂａｌ ｆａｍｉｌｉａｒｉｔｙ ｏｆ ｖｉｓｕａｌ ｓｔｉｍｕｌｉ ａｆｆｅｃｔｓ ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｂｕｔ ｎｏｔ ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ ｐｒｉｍｉｎｇ．Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ．３９（１）：５１５−２６、Ｓｏｌｄａｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ａｇｉｎｇ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ａｆｆｅｃｔ ｂｒａｉｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｅｒｃｅｐｔｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｏｂｊｅｃｔｓ．Ｊ Ｃｏｇｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０（１０）：１７６２−７６）、容易に評価することができる。他の例は、認知能力、例えば、注意力及び集中力、複雑な作業及び概念を学習するための能力、記憶、情報処理能力、視覚空間機能、言語を発し、理解するための能力、問題を解き決定を行うための能力、及び遂行機能を実施するための能力を測定するための認知試験及びＩＱ試験などの試験を含み、例えば、記憶について、一般医向け認識脳評価（ＧＰＣＯＧ）試験、記憶障害スクリーン、簡易精神状態検査（ＭＭＳＥ）、カリフォルニア言語学習試験、第２版、短文式、Ｄｅｌｉｓ−Ｋａｐｌａｎ実行機能検査等を含む。

いくつかの例では、細胞を、複数の作用物質に接触させてもよい。例えば、主題組成物は、インビトロで第２の作用物質と共に細胞に提供されてもよく、または主題組成物は、インビボで第２の作用物質と共に細胞に提供されてもよい。２つ以上の異なる主題作用物質が細胞に提供される、すなわち作用物質が混合される場合、これらの作用物質は、例えば、同時に送達される２つのポリペプチドとして、同時に送達される２つの核酸ベクターとして、２つのポリペプチドに対するコード配列を含む単一の核酸ベクターとして、同時に提供される２つの小型分子としてなど、同時に提供されてもよい。あるいは、これらは連続的に提供されてもよく、例えば、第１の主題作用物質が先ず初めに提供され、その後第２の主題作用物質が提供されるなどでもよく、またその逆も可能である。

いくつかの実施形態では、主題組成物は、第２の作用物質と共に提供されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、主題組成物は、細胞中で幹細胞自己再生を促進する作用物質と共に提供されてもよい。いくつかの実施形態では、主題組成物は、例えば細胞中でヒストンユビキチン化を促進する作用物質、例えばヒストンユビキチン化酵素の拮抗物質と共に提供されてもよい。いくつかの実施形態では、主題の医学的状態を治療することが当該技術分野において立証されている作用物質と共に提供されてもよい。例えば、多くの作用物質が、アルツハイマー病の認知症状（例えば、記憶喪失、錯乱、思考及び判断に関する問題）を治療することにおいていくらかの有効性を有することが示されていて、これらは、例えば、コリンエステラーゼ阻害剤（例えば、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、タクリン）、メマンチン、及びビタミンＥである。別の例として、多くの作用物質が、アルツハイマー病の行動及び精神に現れる症状を治療することにおいていくらかの有効性を有することが示されており、これらは、例えばシタロプラム（セレクサ）、フルオキセチン（プロザック）、パロキセイン（パキシル）、セルトラリン（ゾロフト）、トラゾドン（デジレル）、ロザゼパム（アチバン）、オキサゼパム（セラクス）、アリピプラゾール（エビリファイ）、クロザピン（クロザリル）、ハロペリドール（ハルドール）、オランザピン（ジプレキサ）、クエチアピン（セロクエル）、リスペリドン（リスパダール）、及びジプラシドン（ジオドン）である。

いくつかの実施形態では、主題組成物は、抗酸化剤と共に提供されてもよい。「抗酸化剤」とは、フリーラジカルによって分子の酸化を阻害する分子を意味する。酸化とは、電子または水素を物質から酸化剤に移動させる化学反応を意味する。酸化反応は、フリーラジカル中間体を生成することができ、フリーラジカル中間体が今度は電子または水素を細胞分子、例えば、ＤＮＡ、タンパク質、脂質等に移動させ、細胞損傷または細胞死を引き起こす。抗酸化剤は、フリーラジカル及びフリーラジカル中間体を除去することによって、これらの連鎖反応の開始を妨害し、これによって、それら自体が酸化されるようになる。言い換えると、抗酸化剤は、フリーラジカル捕捉剤である。故に、抗酸化剤は、多くの場合、チオール、アスコルビン酸、またはポリフェノールなどの還元剤である。抗酸化剤の例は、ベータ−カロテン、ルテイン、リコペン、ビリルビン、セレン、亜鉛、ビタミンＡ、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＥ（α−トコフェロール）、尿酸、一酸化窒素、ニトロキシド、ピルベート、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、Ｎ−アセチルシステイン、ユビキノール（コエンザイムＱ）、ナリンゲニン、メシル酸チリラザド、エブセレン、エダラボン、ＮＸＹ−０５９を含む。

いくつかの実施形態では、主題組成物は、第２の作用物質の前に提供されてもよい。いくつかの実施形態では、主題組成物は、第２の作用物質の後に提供されてもよい。いくつかの実施形態では、主題組成物は、第２の作用物質と同時に提供されてもよい。特定のこのような実施形態では、主題組成物は、これらの追加の作用物質のうちの１つ以上を含む。

主題方法のいくつかの態様では、方法は、主題方法による治療の必要がある個体を特定するステップ、例えば、幹細胞自己再生の速度の低下に関連し、幹細胞自己再生の速度の増加に反応する医学的状態を有する個体を診断するステップをさらに含み、この医学的状態は、例えば、神経発達障害、例えば、ダウン症候群、脆弱Ｘ症候群、自閉症；脳損傷、例えば、化学療法または放射線療法誘導脳損傷、外傷性脳損傷；神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ；老化関連障害、例えば、リウマチ性関節炎；例えば、癌、ＡＩＤＳ、うっ血性心不全、ＣＯＰＤ（慢性障害肺疾患）、または腎不全などの疾患または障害に関連する筋委縮；骨髄欠乏症；膵臓細胞、例えばβ膵島細胞の再生を必要とする疾患、例えば、糖尿病；肝臓再生を必要とする疾患、例えば、肝硬変；皮膚再生を必要とする病態、例えば重度熱傷等を含む。

こうした医学的状態に関連する症状を測定するための方法は、当該技術分野において周知であり、そのいずれかを用いて、主題方法による治療について個体を特定することができる。例えば、認知障害を測定することは、標準化学習作業またはＩＱ試験を行うことと、作業／試験の結果を、基準値、例えば、個体の生涯における初期にて行われた試験の結果、または健常な、すなわち、非罹患個体からの試験の結果と比べることとを含んでもよい。認知能力及び認知障害、例えば、注意力及び集中力、複雑な作業及び概念を学習するための能力、記憶、情報処理能力、視覚空間機能、言語を発し、理解するための能力、問題を解き決定を行うための能力、及び遂行機能を実施するための能力を測定するための認知試験及びＩＱ試験は、当該技術分野において周知である。

主題方法のいくつかの態様では、方法は、例えば、本明細書に記載される方法または当該技術分野において既知の方法を用いて、治療後に医学的状態に関連する症状を測定するステップと、主題組成物が投与される前と比較して治療後の症状における減少を検出するステップとをさらに含む。いくつかの例では、決定は、評価の結果を、より早い時期に、例えば、１週間前、２週間前、１ヶ月前、２ヶ月前、３ヶ月前、６ヶ月前、９ヶ月前、１年前、２年前、５年前、１０年前、またはそれ以上前に同じ個体で行われた評価の結果と比べることによって行われる。他の例では、決定は、評価の結果を、基準の個体、例えば非罹患個体で行われた評価の結果と比べることによって行われる。

有用性
主題の方法及び組成物は、医学的治療における及び研究における多くの用途を見出す。例えば、主題の方法及び組成物は、幹細胞自己再生の速度の低下に関連し、幹細胞自己再生の速度の増加に反応する医学的状態を有する個体のインビボでの治療において使用することができる。第２番目の例として、主題の方法及び組成物は、幹細胞自己再生の速度の低下に関連し、幹細胞自己再生の速度の増加に反応する医学的状態のための新しい治療薬を同定するためのインビトロスクリーニングにおいて使用することができる。

「治療」、「治療する」等とは、一般的に、所望の薬理学的及び／または生理学的な効果を得ることを意味する。この効果は、疾患またはその症状を完全にもしくは部分的に予防するという点で予防的であってもよく、ならびに／または疾患及び／もしくはその疾患に寄与し得る有害作用に対する部分的もしくは完全な治癒という点で治療的であってもよい。本明細書で使用する「治療」は、哺乳動物における疾患の任意の治療をカバーし、（ａ）疾患の素因があり得るが、疾患を有すると未だ診断されていない対象において疾患が発症することを防止すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発生を阻止すること、または（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患を消退させることを含む。治療薬は、疾患または損傷の発症前に、発症中または発症後に投与されてもよい。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化させまたは低減させる、進行中の疾患の治療には、特に関心がある。こうした治療は、冒された組織における機能の完全な喪失に先立って行われることが望ましい。主題治療法は、疾患の症状段階中に施されることが望ましく、場合によっては、疾患の症状段階後に施される。用語「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」は本明細書で互換的に用いられ、診断、治療、または治療法が望ましい任意の哺乳動物、特にヒトを指す。

本明細書で使用される、幹細胞自己再生の速度の低下に関連し、幹細胞自己再生の速度の増加に反応する医学的状態（すなわち、「主題の状態」）とは、一般的に、疾患、障害または他の病態を明らかにしている組織が体細胞中で欠如している（例えば、組織をもたらす組織特異的幹細胞が、増殖または分化において欠陥を有した）、あるいは追加の体細胞が病態を処置することができる（例えば、損傷を被った組織において、例えば、組織特異的幹細胞を有する組織が休止状態になった状態で、例えば成体組織において）疾患、障害、または他の医学的状態を意味する。これらは、例えば、神経発達障害、例えばダウン症候群、脆弱Ｘ症候群、自閉症；脳損傷、例えば、化学療法または放射線療法誘導脳損傷、外傷性脳損傷；神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ；老化関連障害、例えば、リウマチ性関節炎；筋委縮、例えば、癌、ＡＩＤＳ、うっ血性心不全、ＣＯＰＤ（慢性障害肺疾患）、及び腎不全などの疾患または障害に関連する筋委縮；骨髄欠乏症；膵臓細胞、例えばβ膵島細胞の再生を必要とする疾患、例えば、糖尿病；肝臓再生を必要とする疾患、例えば、肝硬変；皮膚再生を必要とする病態、例えば重度熱傷等を含む。

例えば、医学的状態は、神経発達障害、脳損傷、神経変性疾患、または一般的な老化であってもよい。こうした例では、認知機能の低下の症状を含む。「認知」とは、認知能力、例えば、注意力及び集中力、複雑な作業及び概念を学習するための能力、記憶（短期間及び／または長期間において、新しい情報を獲得し、保持し、及び取り出すこと）、情報処理能力（五感によって集められた情報に対処するための）、視覚空間機能（精神的イメージを使用し、図形をコピーし、対象物または形状を生成する視覚、奥行き知覚）、言語を発し、かつ理解するための能力、言語の流暢さ（換語）、問題を解く能力、決定を行うための能力、及び遂行機能（計画作成及び優先順位）を含む。認知は、情報を処理し、知識を適用し、及び選好を変更するための能力である。「認知可塑性」とは、学習するための能力、例えば、新生児または青少年（例えば、出生の時期から思春期前のおよそ１０代のヒト）などの未分化である生物の学習する能力に類似する、複雑な作業及び概念を学習するための能力を意味する。「認知機能低下」とは、例えば、注意力及び集中力、複雑な作業及び概念を学習するための能力、記憶（短期及び／または長期において、新しい情報を獲得し、保持し、及び取り出すこと）、情報処理能力（五感によって集められた情報に対処するための）、視覚空間機能（精神的イメージを使用し、図形をコピーし、対象物または形状を生成する視覚、奥行き知覚）、言語を発し、かつ理解するための能力、言語の流暢さ（換語）、問題を解く能力、決定を行うための能力、及び遂行機能（計画作成及び優先順位）のうちの１つ以上における例えば機能低下によって立証されるような、認知能力における進行性の低下を意味する。「認知能力における障害」、「認知機能低下」、及び「認知機能障害」とは、健常な個体、例えば年齢を対応させた健常な個体に対する認知における障害を意味するか、または早い時点における、例えば、２週間前、１ヶ月前、２ヶ月前、３ヶ月前、６ヶ月前、１年前、２年前、５年前、または１０年前もしくはそれ以上前の個体の能力と比較する認知における障害を意味する。

いくつかの例では、主題方法によるまたは主題組成物を用いる治療は、主題状態を有する個体の認知能力を安定化する。例えば、主題状態に冒されている個体における認知機能低下の進行は、開示された方法による治療後に停止される。言い換えると、（さらなる）認知機能障害は観察されない。いくつかの例では、本開示の方法による治療は、例えば、主題状態に関連する認知機能低下に冒されている個体における認知能力を改善することによって観察されるように、本開示の方法による治療は、認知機能障害を低減し、または好転させる。言い換えると、開示された方法による治療後に、認知機能低下に冒されている個体の認知能力は、開示された方法による治療の前よりも良好であり、すなわち、開示された方法は治療を改善する。いくつかの例では、本開示の方法による治療は、認知機能障害を阻害する。言い換えると、主題状態に関連する認知機能低下に冒されている個体の認知能力は、例えば、主題状態に関連する認知機能低下に冒されている個体における改善された認知能力によって立証されるように、開示された方法による治療後に、より早期の年齢において経験されたレベルまで回復する。

いくつかの実施形態において、方法は、認知機能の低下を有する、または認知機能低下を経験している個体を特定することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、作用物質投与前及び作用物質投与後の記憶または認知機能を測定することをさらに含み、作用物質投与後の記憶または認知機能は、作用物質投与前の記憶または認知機能と比較すると改善される。認知機能を測定するための当該技術分野で既知のまたは本明細書に記載される任意の簡便な方法を用いて、主題方法による治療の必要がある個体を特定すること及び／または主題方法を用いる治療中／治療後の個体における認知機能の安定化または改善を測定することができる。これらは、例えば、個体に対して標準化学習作業またはＩＱ試験を行うことと、作業／試験の結果を基準値と比較することとを含む。いくつかの例では、基準値は、認知機能の低下を経験している（すなわち、陽性対照）または認知機能の低下を経験していない（すなわち、陰性対照）のいずれかの１つ以上の年齢を対応させた個体によって行われた作業／試験の結果であってもよい。いくつかの例では、基準値は、例えば、個体が認知機能低下に冒されているかを決定するために、早期の年齢で、例えば、１週間前、１ヶ月前、３ヶ月前、６ヶ月前、９ヶ月前など、同一の個体によって行われた作業／試験の結果であってもよい。

スクリーニング
本発明のいくつかの態様では、幹細胞自己再生の速度の低下に関連し、幹細胞自己再生の速度の増加に反応する状態を有する個体を治療するための、例えば本明細書に記載される治療法において使用するための能力について候補作用物質をスクリーニングすることが提供される。このために、ＵＳＰ１６デユビキチナーゼ活性が肝細胞増殖及び機能を低下させることを本明細書で示した。したがって、ＵＳＰ１６デユビキチナーゼ活性を低下させる候補作用物質のためのスクリーニングは、幹細胞増殖、より具体的には神経幹細胞増殖及び神経新生を促進する上で有用となる作用物質を特定するべきであり、このことが、転じて、幹細胞自己再生の速度の低下に関連し、幹細胞自己再生の速度の増加に反応する状態の症状を治療する。

例えば、生物学的に活性な作用物質についてのスクリーニングアッセイにおいて、ＵＳＰ１６を発現する細胞を、対象となる候補作用物質と接触させて、候補作用物質の細胞に及ぼす効果が、１つ以上の出力パラメータを監視することによって評価される。パラメータは、細胞の定量化可能な構成成分であり、特に、望ましくはハイスループットシステムにおいて正確に測定され得る構成成分である。パラメータは、細胞表面決定因子、受容体、タンパク質もしくはその立体配座あるいは翻訳後修飾体、脂質、炭水化物、有機もしくは無機分子、核酸、例えばｍＲＮＡ、ＤＮＡ等、またはこうした細胞構成成分に由来する部分またはこれらの組み合わせを含む任意の細胞構成成分または細胞生成物であり得る。大部分のパラメータは、定量的読取りを提供するであろうが、いくつかの例では、半定量的または定性的結果が許容可能となる。読取りは、単一の決定値を含んでもよく、または平均値、中央値または分散値等を含んでもよい。特徴的には、パラメータ読取り値の範囲は、複数の同一のアッセイからの各パラメータについて得られることになる。ばらつきが予想され、テストパラメータの集合のそれぞれについての値の範囲が、単一の値を提供するために用いられる一般的な統計学的手法と共に標準統計学的手法を用いて得られるであろう。したがって、例えば、１つのこうした方法は、ＵＳＰ１６を発現する細胞を候補作用物質に接触させることと、パラメータをＵＳＰ１６は発現するが候補作用物質と接触させなかった細胞中のパラメータと比較することとを含むことができ、候補作用物質と接触させた細胞中のパラメータにおける差は、候補作用物質が幹細胞自己再生の速度の低下に関連し、幹細胞自己再生の速度の増加に反応する状態による症状を治療することを示す。

神経発達障害または神経変性疾患の治療のための治療薬として使用され得るものを同定するために候補作用物質をスクリーニングする場合に定量化され得るパラメータの一例は、ＵＳＰ１６デユビキチナーゼ活性になる。ＵＳＰ１６デユビキチナーゼ活性は、例えば、本明細書に記載されるような、または当該技術分野において既知であるような任意の簡便な方法によって測定され得る。例えば、ＵＳＰ１６デユビキチナーゼ活性は、Ｈ２Ａユビキチン化を評価することによって測定されてもよく、候補作用物質と接触させなかった細胞中のＨ２Ａユビキチン化の量と比べてのＨ２Ａユビキチン化の量における増加は、候補作用物質が神経発達障害または神経変性疾患を有する個体を治療することを示す。別の例として、ＵＳＰ１６デユビキチナーゼ活性は、細胞中のＩｎｋ４ａ／ＡｒｆＲＮＡまたはタンパク質の量を測定することによって測定されてもよく、候補作用物質と接触させなかった細胞中のＩｎｋ４ａ／ＡｒｆＲＮＡまたはタンパク質の量と比べてのＩｎｋ４ａ／ＡｒｆＲＮＡまたはタンパク質の量における減少は、候補作用物質が神経発達障害または神経変性疾患を有する個体を治療することを示す。いくつかの例では、１つのパラメータが測定される。いくつかの例では、複数のパラメータが測定される。

スクリーニングに有用な細胞は、ＵＳＰ１６を発現する任意の細胞を含む。いくつかの例では、細胞はＵＳＰ１６を過発現し、例えば、細胞は野生型細胞で観察されるよりも多量のＵＳＰ１６を発現する。例えば、細胞はＵＳＰ１６について三染色体性であってもよく、例えば、細胞は染色体２１において三染色体性またはそのＵＳＰ１６含有断片を有する対象から急性的に培養されてもよい（すなわち、三染色体性２１一次細胞）。細胞は、三染色体性２１一次細胞に由来する細胞株であってもよい。細胞は、例えば、ＵＳＰ１６タンパク質をコード化する核酸を含むベクターによる形質転換または感染によって、ＵＳＰ１６ポリペプチドの細胞への直接的導入によって等、ＵＳＰ１６を過発現するように操作されてもよい。いくつかの例では、ＵＳＰ１６は、染色体外で発現される（例えば、ミニサークル、コスミド等から）。他の例では、ＵＳＰ１６は、細胞のゲノムから発現される。例えば、細胞は、ＵＳＰ１６の追加のコピーを異所性発現する、またはダウン症候群を有する個体（例えば、マウス、ラット、ヒト等）からのいずれかの例えば、神経幹細胞、造血幹細胞、乳腺幹細胞、間葉幹細胞、線維芽細胞等であってもよい。

スクリーニング用の対象となる候補作用物質は、多数の化学物質種を包含し、主として有機分子である既知及び未知の化合物を含み、これは、有機金属分子、無機分子、遺伝子配列等を含んでもよい。本発明の重要な態様は、毒性試験等を含む候補薬剤を評価することである。候補作用物質は、構造上の相互作用、特に水素結合のために必要な官能基を含み、典型的には、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を含み、頻繁にはこれらの官能化学基のうちの少なくとも２つを含む。候補作用物質は、上記官能基のうちの１つ以上を有する、周期性炭素または複素環構造及び／または芳香族もしくはポリ芳香族構造を含むことが多い。候補作用物質は、ペプチド、ポリヌクレオチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、これらの誘導体、構造類似体または組み合わせを含む生体分子の中でも見出される。薬理活性薬剤、遺伝的活性分子等も含まれる。対象となる化合物は、化学療法剤、ホルモンまたはホルモン拮抗薬等を含む。本発明に好適な薬剤の例は、“Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，（１９９６），Ｎｉｎｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎに記載されているものである。毒素、及び生物ならびに化学戦剤も含まれ、例えば、Ｓｏｍａｎｉ，Ｓ．Ｍ．（Ｅｄ．），“Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｗａｒｆａｒｅ Ａｇｅｎｔｓ，”Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）を参照されたい。

スクリーニング用の対象となる候補作用物質はまた、核酸、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス分子、ＣＲＩＳＰＲｉもしくはｍｉＲＮＡをコード化する核酸、またはポリペプチドをコード化する核酸を含む。核酸を標的細胞に移動させるために有用な多くのベクターが利用可能である。ベクターはエピソーム的に、例えば、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、例えばサイトメガロウイルス、アデノウイルス等のウイルス由来ベクターとして維持されてもよく、またはこれらは、例えば、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ−１、ＡＬＶ等のレトロウイルス由来ベクター相同的組換えもしくはランダム組込みを通して標的細胞ゲノムに組み込まれてもよい（例えば、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ−１、ＡＬＶ等のレトロウイルス由来ベクター）。ベクターは、対象の細胞に直接提供されてもよい。言い換えると、ベクターが細胞によって取り込まれるように、細胞を対象となる核酸を含むベクターと接触させる。

電気穿孔法、塩化カルシウムトランスフェクション、及びリポフェクチンなどの細胞を核酸ベクターと接触させるための方法は、当該技術分野において周知である。あるいは、対象となる核酸は、対象の細胞にウイルスを介して提供されてもよい。言い換えると、細胞を、対象となる核酸を含むウイルス粒子と接触させる。レトロウイルス、例えばレンチウイルスは、本発明の方法に特に好適である。通常使用されるレトロウイルスベクターは、「欠損性」であり、すなわち、増殖性感染に必要とされるウイルスタンパク質を生成することができない。むしろ、ベクターの複製は、パッケージング細胞株中の増殖を必要とする。関心の核酸を含むウイルス粒子を作るために、核酸を含むレトロウイルス核酸が、パッケージング細胞株によってウイルスキャプシドにパッケージ化される。異なるパッケージング細胞株は、キャプシドに組み込まれるための異なるエンベロープタンパク質を提供し、このエンベロープタンパク質は、細胞に対するウイルス粒子の特異性を決定する。主題核酸を含むレトロウイルスベクターをパッケージング細胞株に導入する方法、パッケージング株によって作成されたウイルス粒子を回収する方法、及びパッケージ化ウイルス粒子を用いて細胞を感染させる方法は、当該技術分野において周知である。

対象となる核酸を主題細胞に提供するために使用されるベクターは、典型的には、発現を導くための、すなわち、関心の核酸の転写活性を導くための、好適なプロモータを含むであろう。これは、広範に作用するプロモータ、例えば、ＣＭＶ−ｂ−アクチンプロモータ、または特定の細胞群中で活性であるプロモータもしくはテトラサイクリンなどの薬物の存在に応答するプロモータなどの誘導可能なプロモータを含むことができる。転写活性化とは、転写が、少なくとも約１０倍まで、少なくとも約１００倍まで、より一般には少なくとも約１０００倍まで、標的細胞中の基底レベルよりも上に増加することを意図する。加えて、主題核酸を細胞に提供するために使用されるベクターは、例えば、Ｃｒｅ／Ｌｏｘなどの組換え酵素システムを使用して後に除去されるべき遺伝子、または例えば、ヘルペスウイルスＴＫ、ｂｃｌ−ｘｓなどの選択的毒性を可能にする遺伝子を含むことによる、それらを破壊された状態で発現する細胞を含むことができる。

スクリーニング用の対象となる候補作用物質は、ポリペプチドも含む。こうしたポリペプチドは、任意選択的に、生成物の溶解度を増加させるポリペプチドドメインに融合されてもよい。このドメインは、定義されたプロテアーゼ開裂部位、例えば、ＴＥＶプロテアーゼによって開裂されるＴＥＶ配列を通してポリペプチドに結合することができる。リンカーもまた、１つ以上の柔軟な配列、例えば１〜１０個のグリシン残基を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の開裂は、生成物の溶解度を維持する緩衝液中で、例えば、０．５〜２Ｍの尿素の存在下で、溶解度を増加させるポリペプチド及び／またはポリヌクレオチドの存在下などで行われる。対象となるドメインは、エンドソーム溶解性ドメイン、例えばインフルエンザＨＡドメイン、及び生成で補助する他のポリペプチド、例えばＩＦ２ドメイン、ＧＳＴドメイン、ＧＲＰＥドメイン等を含む。

細胞への流入を促進するために、ポリペプチドは、ポリペプチド浸透性ドメインに融合された対象となるポリペプチド配列を含んでもよい。多くの浸透性ドメインが当該技術分野において既知であり、ペプチド、ペプチド疑似体、及び非ペプチドキャリアを含める、本発明の非組込みポリペプチドにおいて使用されてもよい。例えば、浸透性ペプチドは、ペネトラチンと呼ばれるキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）転写因子アンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐａｅｄｉａ）の３次αへリックスから誘導され得る。別の例として、浸透性ペプチドは、ＨＩＶ−１ ｔａｔ塩基性領域アミノ酸配列を含み、これは例えば、天然起源のｔａｔタンパク質のアミノ酸４９〜５７を含むことができる。他の浸透性ドメインは、ポリ−アルギニンモチーフ、例えば、ＨＩＶ−１ ｒｅｖタンパク質のアミノ酸３４〜５６、ノナ−アルギニン、オクタ−アルギニン等を含む。（例えば、Ｆｕｔａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ．２００３ Ａｐｒ；４（２）：８７−９６、及びＷｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ２０００ Ｎｏｖ．２１；９７（２４）：１３００３−８、公開された米国特許出願公開第２００３０２２０３３４号、同第２００３００８３２５６号、同第２００３００３２５９３号、ならびに２００３００２２８３１号（転座ペプチド及びペプトイドの教示に関する参照により本明細書に具体的に組み込まれる）を参照されたい）。ノナ−アルギニン（Ｒ９）配列は、特性評価されているより有効なＰＴＤの１つである（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．２０００、Ｕｅｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．２００２）。

候補ポリペプチド作用物質は、原核細胞によって生成された真核細胞から生成することができ、これはアンフォールディング、例えば、熱変性、ＤＴＴ還元等によってさらに処理されてもよく、当該技術分野において既知の方法を用いてさらにリフォールディングされてもよい。一次配列を変更しない対象となる修飾は、ポリペプチドの化学的誘導体化、例えば、アシル化、アセチル化、カルボキシル化、アミド化等を含む。グリコシル化の修飾物、例えば、ポリペプチドのグリコシル化パターンをその合成及び処理中に修飾することによって、またはさらなる処理ステップ中に修飾すること（例えば、哺乳動物グリコシル化または脱グリコシル化酵素などのグリコシル化に影響を及ぼす酵素にポリペプチドを曝すことによって）によって作成されたものも含まれる。リン酸化アミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニンも包含される。タンパク質分解による崩壊に対するポリペプチドの抵抗性を改善するように、または溶解特性を最適化するように、あるいはそれらを治療薬としてより適切なものにするように、通常の分子生物学的技術及び合成化学を用いて修飾されたポリペプチドも本発明に含まれる。こうしたポリペプチドの類似体として、天然起源のＬアミノ酸以外の残基を含むもの、例えば、Ｄアミノ酸または非天然起源の合成アミノ酸を含む。Ｄアミノ酸は、アミノ酸残基の一部または全てに対して置換されてもよい。

あるいは、候補ポリペプチド作用物質は、当該技術分野において既知の通常の方法を用いる、インビトロ合成によって調製することができる。種々の市販の合成装置が利用可能であり、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｃｋｍａｎ等による自動化シンセサイザである。シンセサイザを使用することによって、天然起源のアミノ酸は、非天然アミノ酸で置換され得る。特定の配列及び調製の方法は、便宜性、経済性、必要とされる純度等によって決定されるであろう。あるいは、候補ポリペプチド作用物質は、組換え体合成の従来の方法に従って単離されかつ精製され得る。溶解物が発現宿主から調製することができ、この溶解物は、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、または他の精製技術を用いて精製される。大抵の場合、使用される組成物は、生成物の調製及びその精製の方法に関連する汚染物質に関して、少なくとも２０重量％の所望の生成物、より一般的には少なくとも約７５重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％の生成物を含み、治療的目的では、通常少なくとも約９９．５重量％の生成物を含む。通常、パーセンテージは、総タンパク質に基づく。

場合によっては、スクリーニングされる候補ポリペプチド作用物質は、抗体である。用語「抗体」または「抗体部分」は、エピトープに嵌合しかつエピトープを認識する特異的な形状を備える任意のポリペプチド鎖含有分子構造を含むことが意図され、ここでは１つ以上の非共有結合相互作用が、分子構造とエピトープとの間の複合体を安定化する。所定の構造とその特異的エピトープとの特異的または選択的嵌合は、時には「鍵と鍵穴」嵌合とも呼ばれる。典型的な抗体分子は免疫グロブリンであり、全ての供給源、例えば、ヒト、齧歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、他の哺乳動物、ニワトリ、他の鳥類などからの全てのタイプの免疫グロブリン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等が「抗体」であるとみなされる。本明細書において利用される抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかであり得る。抗体は、典型的には、細胞が培養されている培地中に提供される。

候補作用物質は、合成または天然化合物のライブラリーを含む多種多様な供給源から得ることができる。例えば、ランダム化されたオリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含める、生体分子を含む広範囲の有機化合物のランダム及び直接的合成のために多くの手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であり、または容易に生成される。さらに、天然でまたは合成的に生成されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的及び生化学的手段を通して容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを生成するように使用されてもよい。既知の薬理学的作用物質は、構造類似体を生成するために、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等の直接的またはランダムな化学修飾を受けてもよい。

候補作用物質は、通常、この作用物質に接触させていない細胞と共に、この作用物質を少なくとも１つの、通常は複数の細胞試料に添加することによって、生物学的活性についてスクリーニングされる。作用物質に応答するパラメータにおける変化が測定され、結果は、基準培養物、例えば、その作用物質の存在及び非存在下で、他の作用物質で得られたものなどに対する比較によって評価される。

作用物質は、培養物中の細胞の培地に、溶液で、または容易に可溶可能な形態で都合よく添加される。作用物質は、断続的または連続的な流れとして、フロースルーシステム中で添加されてもよく、あるいは、化合物の丸剤を別の静的溶液に単独でまたは漸増的に添加する。フロースルーシステムでは、２つの流体が使用され、一方は生理学的中性溶液であり、他方は、添加された試験化合物を含む同一の溶液である。第１の流体が細胞上に流され、その後第２の流体が流される。単一溶液法では、試験化合物の丸剤が、細胞を包囲する培地の量に添加される。培養培地の成分の全体の濃度は、丸剤の添加によって、またはフロースルー法における２つの溶液間で著しく変化するべきではない。

種々の濃度に対する異なる応答を得るために、異なる作用物質濃度で、複数のアッセイが並行して行われてもよい。当該技術分野において既知であるように、作用物質の有効濃度の決定は、１：１０の希釈、または他の対数スケールの希釈から生じた濃度の範囲を使用する。濃度は、必要な場合、第２の系列希釈で調整されてもよい。典型的には、これらの濃度のうちの１つは、陰性対照、すなわち、作用物質のゼロ濃度もしくは作用物質の検出のレベルより低い濃度または表現型における検出可能な変化をきたすことがない作用物質の濃度より低い濃度におけるものとして働く。いくつかの例では、陽性対照、例えば、ＵＳＰ１６特異的ｓｈＲＮＡ、ＵＳＰ１６特異的ｓｉＲＮＡ等が使用されてもよい。

選択されたパラメータを定量化するために種々の方法が利用され得る。例えば、Ｈ２Ａユビキチン化は、例えば、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ遺伝子座のクロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ）によって測定することができる。Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ発現、すなわち、ＲＮＡまたはタンパク質レベルは、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、タンパク質アレイ等によって検出することができる。細胞増殖速度及び老化は、フローサイトメトリー、ＢｒｄＵ組込み、ｑｕｉｔフラクション等によって測定することができる。こうした方法は、当業者には周知である。

以下の実施例は、例示のために提供されるものであり、限定するために提供されるものではない。

以下の実施例は、当業者に本発明をどのように行い使用するかの完全な開示及び説明を提供するように提示されるものであり、本発明者がその発明としてみなすことの範囲を限定するように意図するものではなく、これらは以下の実験が実施される実験の全てまたは唯一のものであることを表すように意図するものでもない。用いられる数値（例えば、量、温度等）に関する正確性を保つための努力がなされているが、一部の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。特に指示しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧または大気圧に近い圧力である。

分子及び細胞生化学における一般法は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＨａＲＢｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ＆Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）、及びＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９８）などの標準教本などで見出すことができる。本開示中で言及される試薬、クローニングベクター、及び遺伝子操作用のキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、及びＣｌｏｎＴｅｃｈなどの市販ベンダーから入手可能である。

実施例１
材料及び方法
マウス。Ｔｓ６５Ｄｎ、Ｔｓ１Ｃｊｅ、及び正倍数体同腹子マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、混合背景Ｂ６ＥｉＣ３ＳｎＦ１／Ｊにおいて維持した。マウスの遺伝子型を、既報（Ｒｅｉｎｈｏｌｄｔ，Ｌ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｏｗｎ‘ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ Ｔｓ６５Ｄｎ．Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ２２，６８５−６９１（２０１１）及びＪａｃｋｓｏｎウェブサイト）の通りに、リアルタイムによってまたはＰＣＲによって特定した。対照同腹子を野生型マウスとして用いた。これらのマウスは、それらのゲノム中のＢ６及びＣ３Ｈ対立遺伝子に対してヘテロ接合型である。ＵＳＰ１６^het マウス（ＦＶＢ／Ｎ−Ｕｓｐ１６Ｔｇ（Ｔｙｒ）２４１４ＦＯｖｅ／Ｍｍｊａｘ）は、ＭＭＲＲＣから取得した。離乳年齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤ雌マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。マウスは、施設内動物実験委員会のガイドラインに従って、スタンフォード大学にて、ＳＣＯＲＥ施設において、またはＳＩＭＩ動物施設において収容した。

骨髄及び末梢血液分析。骨髄細胞の単離及び分析を、既報（Ａｋａｌａ，Ｏ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｂｙ Ｔｒｐ５３−／−ｐ１６Ｉｎｋ４ａ−／−ｐ１９Ａｒｆ−／− ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４５３，２２８−２３２（２００８））の通りに実施した。簡潔には、骨髄細胞を、２％の熱不活性化ウシ血清を含む無カルシウム及びマグネシウムＨＢＳＳ中で、長骨及び股関節を乳鉢及び乳棒を用いて破砕することによって単離した。細胞を、２５Ｇ針に数回通過させることによって取り出し、ＡＣＫで１分間処理し、４０ｍｍのナイロンメッシュで濾過した。分類前に、前駆細胞を、ａｕｔｏＭＡＣＳ ｐｒｏ Ｓｅｐａｒａｔｏｒを用いて、系統細胞枯渇キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と共に磁気単離を通して濃縮した。骨髄細胞の分析及び分類に使用された抗体は、系統マーカー（ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ８、Ｇｒ−１、Ｂ２２０、ならびにＴｅｒ１１９）、Ｓｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ１５０、ＣＤ４８、ＣＤ１３５（Ｆｌｔ３）及びＣＤ３４であった。

末梢血液分析については、赤血球を低張緩衝液で細胞溶解し、有核細胞を、ＣＤ４５．１、ＣＤ４５．２、Ｔｅｒ１１９、Ｇｒ−１、Ｍａｃ−１、ＣＤ３及びＢ２２０に対する抗体で染色した。

全ての抗体は直接接合されまたはビオチニル化され、ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、またはＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。細胞を、前方及び側方散乱プロファイルに基づいてゲートし、生／死の識別は、７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）またはＤＡＰＩで得た。分析及び分類は、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行った。

骨髄移植。レシピエントＣ５７Ｂｌ ＣＤ４５．１マウス（８〜１２週齢）を、２種の放射線量を３時間離して送達して、致死的に照射した（１，１４０ラド）。骨髄単一細胞懸濁液を、Ｔｓ６５Ｄｎ、Ｔｓ１Ｃｊｅ及び野生型マウス（８〜１２週齢）の長骨及び股関節から得て、赤血球細胞溶解用のＡＣＫで１分間処理した。主組織適合抗原に対して適合するハプロタイプを有するドナー動物だけを用いた（Ｈ２Ｋｂ／ｂ）。レシピエントマウスを、非照射のＣ５７Ｂｌ／Ｋａ−ＣＤ４５．１マウスからの放射線防護用量の３×１０⁵ 個の骨髄細胞と混合したドナーマウスからの全骨髄細胞の３つの異なる用量（５×１０⁵ 細胞、１．５×１０⁵ 細胞、０．５×１０⁵ 細胞）の後眼窩静脈洞注射によって競合的に再構成した。各群について５匹のマウスを使用した。末梢血液の再構成に関して、マウスを毎月分析した。

二次移植については、生着したレシピエントから、一時移植後少なくとも４ヶ月目に５×１０⁶ 個の骨髄細胞を採集し、致死的に照射したＣ５７Ｂｌ ＣＤ４５．１マウスに注入した。指示した時間点で、再構成を末梢血液中で測定した。

レンチウイルス感染Ｔｓ６５Ｄｎの骨髄細胞の移植については、８〜１２週齢のＴｓ６５Ｄｎ Ｈ２Ｋｂ／ｂマウスからＫＬＳ細胞を単離し、分類した。分類されたＫＬＳを、指示したレンチウイルス（ＭＯＩ＝２００）と一緒に一晩インキュベートした。翌朝、ＫＬＳを洗浄し、非照射のＣ５７Ｂｌ／Ｋａ−ＣＤ４５．１マウスからの放射線防護用量の３×１０⁵ 個の骨髄細胞と混合し、致死的に照射されたマウスに注入した。これと並行して、レンチウイルスの組込みレベルが複数の試料間で同様であることを確かめるために、感染後４８時間目に、感染細胞中のＧＦＰ発現のレベルをＦＡＣＳによって確認した。

全ての移植実験について、ドナー細胞によって再配置されたとみなされるマウスは、リンパ系サブ集団（ＣＤ３⁺ ならびにＢ２２０⁺ ）中及び骨髄系サブ集団（Ｇｒ−１⁺ 及びＭａｃ−１⁺ ）中の両方で１％を超えるドナー由来の（ＣＤ４５．２⁺ ）細胞を有するマウスであった。限界希釈実験からの長期再構成細胞の発生頻度を、ＥＬＤＡソフトウェアを用いて計算した（Ｈｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．ＥＬＤＡ：ｅｘｔｒｅｍｅ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｄｅｐｌｅｔｅｄ ａｎｄ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｓｓａｙｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３４７，７０−７８ （２００９））。

造血幹細胞のインビトロコロニー形成。Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ培養については、既報（Ａｋａｌａ，Ｏ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｂｙ Ｔｒｐ５３−／−ｐ１６Ｉｎｋ４ａ−／−ｐ１９Ａｒｆ−／− ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４５３，２２８−２３２（２００８））の通りに、単一の野生型ＨＳＣを、１００μｌのＭｅｔｈｏｃｕｌｔ ＧＦ Ｍ３４３４培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を備えるＵ底の９６−ウェルプレートで二重分類した。陽性コロニーを培養の７日目にスコア化した。

ニューロスフェアアッセイ。野生型、Ｔｓ６５Ｄｎ、Ｔｓ６５Ｄｎ／ＵＳＰ１６^het 及びＵＳＰ１６^het マウスをＣＯ₂ により殺処分し、断頭し、脳をすぐに取り出した。脳室下帯を微小切除し、さらなる処理のために氷冷ＰＢＳ中に保存した。組織を、ＴｒｙＰＬＥ ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＤＮアーゼＩ（２５０単位／ｍｌ）を用いて、３７℃で１０分間消化し、続いて滅菌ピペットを用いてトリチュレートした。消化された組織を、カルシウム、マグネシウムを含まない氷冷ＰＢＳ中で洗浄し、４０ｕｍのフィルターを通して濾過し、ニューロスフェア増殖培地中（すなわち、２％のＢ２７−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％のＮ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、マウス組換えＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）ならびにｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び２ｕｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ）で補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＤＭＥＭ Ｆ／１２（１：１））中に再懸濁した。系統細胞を、マウスＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、及びＴｅｒ１１９マイクロビーズ（ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて枯渇させ、陰性フラクションを採集した。ＦＡＣＳ分析については、細胞を、抗ＣＤ１５−ＦＩＴＣ（ＭＭＡ；ＢＤ）、抗プロミニン１−ＡＰＣ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＰＥ−Ｃｙ７−ストレプトアビジンと複合体を形成するビオチニル化ＥＧＦ（２μｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。

限界希釈分析については、ダウンの細胞をウェル当たり１つの細胞にする限界希釈で、細胞を９６ウェル中に直接播種した。各播種用量を２４ウェルで行い、ニューロスフェアを有するウェルの数を１０日後に計数した。連続継代については、各継代からのニューロスフェアを採集し、４８ウェルの皿でウェル当たり１００個の細胞として、または上記記載と同様な限界希釈様式のいずれかで再播種した。

マウス乳腺分析。野生型、Ｔｓ６５Ｄｎ、またはＴｓ１Ｃｊｅマウスのいずれかから乳腺を切除し、既報（Ｓｔｉｎｇｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｎｉｑｕｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍａｍｍａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４３９，９９３−９９７（２００６））の通りに分析した。簡潔には、乳腺をコラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ中で消化し、続いて、トリプシン、及びＤＮアーゼ／ディスパーゼでＡＣＫ細胞溶解した。その後、細胞を以下の抗体で染色した（ＣＤ４５、ＣＤ３１、Ｔｅｒ１１９、ＣＤ４９ｆ及びＣＤ２４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ））。

全ての実験について、全ての抗体は直接接合されまたはビオチニル化され、ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、またはＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。細胞を、前方及び側方散乱プロファイルに基づいてゲートし、生／死の識別は、７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）またはＤＡＰＩで得た。分析及び分類は、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行った。

インビトロ乳腺コロニー形成アッセイ。９６−ウェルの超低接着表面プレート（ＢＤ）を、ウェル当たり６０μｌの増殖因子低下マトリゲル（ＢＤ）と混合した照射Ｌ−ＷＮＴ３ａのフィーダー層で調製した。ＷＴ、Ｔｓ６５Ｄｎ、またはＴｓ１Ｃｊｅマウスからの１０００個の分類したＭＲＵを、既報（Ｄａｌｅｒｂａ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｔｕｍｏｒｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９，１１２０-１１２７（２０１１）、Ｚｅｎｇ，Ｙ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｗｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｒｅ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｍａｍｍａｒｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅｉｒ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ６，５６８-５７７（２０１０））の通りに液体培地中に播種した。１０％のＦＢＳ及び２．５％の増殖因子低下マトリゲルを、補充物として添加した。

乳腺移植片。系統^- （ＣＤ４５⁺ ＣＤ３１⁺ Ｔｅｒ１１９⁺ ）細胞集団を、染色培地中で１２週齢のマウスから単離し、既報（Ｓｔｉｎｇｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｎｉｑｕｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍａｍｍａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４３９，９９３-９９７（２００６））の通りに、生後２１〜２８日のレシピエントＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの除去した脂肪パッドに注入する前に、移植片当たり１０μｌの無菌ＰＢＳ＋３０％のマトリゲル中に再懸濁させた。分析前に、全ての移植片を、少なくとも６週間、しかし１０週間以下にわたって増殖させた。Ｕｓｐ１６系統のノックダウンについては、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ中で、対照レンチウイルスまたはＵｓｐ１６に対するｓｈＲＮＡのいずれかで一晩感染させた。その後、細胞を洗浄し、移植用に無菌ＰＢＳ＋３０％マトリゲル中に再懸濁した。

乳腺移植片突出部面積計算については、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いた。簡潔には、ＧＦＰ陽性乳腺管を、管周辺の形状を描くことによってフリーハンドで測定した。測定は、全ての試料に対して、同じ倍率で「盲検」様式で行った。陽性の突出部のみを測定で用いた。

乳腺組織の免疫蛍光法。１２週齢のマウスを殺処分し、乳腺を外科的に取り出した。乳腺をホルマリン中で一晩固定し、その後７０％のエタノール中に移した。次いで、これらをパラフィンに包埋し、組織学検査用に切片化した。染色については、スライドをキシレン中で脱パラフィン化し、段階的なアルコールで処理した。抗原の回収は、マイクロ波中で２０分間加熱することによって、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液中で行った。一次抗体ＣＫ１４（Ｃｏｖａｎｃｅ）及びＣＫ８を一晩適用した。二次抗体は、抗−ラットＤｙＬｉｇｈｔ ４８８及び抗−ウサギＤｙＬｉｇｈｔ ５９４（両者ともＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから入手）であった。次いで、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ａｎｔｉ−ｆａｄｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて切片を設置した。ＮＩＫＯＮ倒立顕微鏡で画像を取得した。

ウェスタンブロット及びクロマチン免疫沈降法。ウェスタンブロット分析については、クロマチン抽出物を、亜細胞タンパク質フラクションキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｅｉｎｔｉｆｉｃ）を用いて調製した。Ｈ２ＡＫ１１９抗体（ウサギ）は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入し、Ｈ２Ａ抗体は購入した。クロマチン免疫沈降法は、Ｈ２ＡＫ１１９についてのポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて、基本的に既報（Ｎｅｇｉｓｈｉ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｚｆｐ２７７ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｋ４ａ／ａｒｆ ｌｏｃｕｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｏｌｙｃｏｍｂ ｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅ ｃｏｍｐｌｅｘ １．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５，ｅ１２３７３（２０１０））の通りに行った。

レンチウイルス調製物。ダウンレギュレーションのために使用されたレンチウイルスベクターは、ベクターｐＳｉｃｏＲ−ＧＦＲであった（Ｖｅｎｔｕｒａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｒｅ−ｌｏｘ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｓｅ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１，１０３８０-１０３８５（２００４））。我々は以下のヘアピンをクローンした：ｓｈＣ（ＴＴＣＴＣＣＧＡＡＣＧＴＧＴＣＡＣＧＴ）ｓｈＵＳＰ１６＃１（ＣＧＡＧＴＧＣＴＧＴＡＴＴＣＣＴＴＡＴＡＴ）、ｓｈＵＳＰ１６＃２（ＴＴＣＴＣＴＧＧＡＡＡＴＡＣＡＣＣＴＡＴＧ）、ｓｈｐ１６（ＣＡＴＣＡＡＧＡＣＡＴＣＧＴＧＣＧＡＴＡＴ）、ｓｈｐ１９（ＧＣＣＡＴＣＴＡＡＡＣＧＧＴＴＣＡＧＴＴＴ）、ヒトｓｈＵＳＰ１６（）。Ｃｈｅｒｒｙ及びＢｍｉ１を発現するレンチウイルス構築物（ｐＥＩＺ−ＨＩＶ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｂｍｉ１）（Ｓｈｉｍｏｎｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲＮＡ−２００ｃ ｌｉｎｋｓ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ １３８，５９２-６０３（２００９））は、Ｙ．Ｓｈｉｍａｎｏ博士から幸いにも提供していただいた。ＵＳＰ１６過発現ベクターは、ｐＣＤＨ−ＭＳＣＶ−ＧＦＰベクター（ＳＢＩ）中でＵＳＰ１６クローン（ＡＴＣＣ）をサブクローニングすることによって得た。

ウイルスを、第２世代レンチウイルスシステムを用いて２９３Ｔ細胞内で産生した。上澄みを４８時間及び７２時間にて採集し、超遠心分離を通して濃縮した（Ｔｉｓｃｏｒｎｉａ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １，２４１−２４５（２００６））。ウイルス力価を、濃縮ウイルスの段階希釈物で感染させた２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析によって計算した。

マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）及び末端尾部先端維芽細胞（ＴＴＦ）。マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を、Ｔｓ６５Ｄｎの母体から得られたＥ１４．５胚から生成した。遺伝子型をリアルタイムＰＣＲで確認した。細胞を、ほぼ集密になったときに１：４分割比で継代させた。マウス一次尾部線維芽細胞（ＴＴＦ）を培養するために、野生型（ｎ＝４）、Ｔｓ６５Ｄｎ（ｎ＝３）、Ｔｓ６５Ｄｎ／Ｕｓｐ１６^het （ｎ＝３）、及びＵｓｐ１６^het （ｎ＝１）の８週齢マウスの尾部先端から皮膚を剥離し、ナイフで切り刻み、トリプシン中で短時間消化した。得られた切片を２０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で３週間にわたってインキュベートした。次いで、誘導された線維芽細胞を新しいプレートに継代させ、Ｐ２とみなした。ヒト線維芽細胞（ＷＴ：ＣＲＬ−２０８８、ＣＲＬ−２０７６、ＤＳ：ＣＣＬ−５４、ＣＲＬ−７０９０、ＣＲＬ−７０３１）を、ＡＴＣＣで購入した。

線維芽細胞増殖、ＳＡ−βＧａｌ及びｐ１６染色。５×１０³ 個の線維芽細胞を、２４−ウェルプレートに播種し、生細胞をトリパンブルー排除によって示した時間点で計数した。

老化細胞のＳＡ−βＧａｌ染色については、老化検出キット（Ａｂｃａｍ、ａｂ６５３５１）を、製造業者のプロトコルに従って用いた。

ｐ１６染色については、線維芽細胞を０．２％のトリトン−ＰＢＳで透過性にし、３％のＢＳＡ−ＰＢＳ中でブロックし、マウス抗−ヒトｐ１６（ＪＣ８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ）またはウサギ抗−マウスｐ１６で染色した。特異的二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ 抗−マウス及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗−ウサギ）を１：１０００で用いた。

ＳＡ−βＧａｌ及びｐ１６染色を、顕微鏡によって１０倍で検出し、陽性細胞を、ウェル当たり３つの異なる視野で評価した。３回の技術的反復実験を行った。

感染細胞による実験では、細胞をＧＦＰまたはＣｈｅｒｒｙ発現に基づいて分類し、構築物の発現をリアルタイムＰＣＲによって確認した。

ＲＮＡ発現分析。リアルタイム分析については、細胞をトリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で採集し、ＲＮＡを製造業者のプロトコルに従って抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｃＤＮＡを得た。

リアルタイム反応を、Ｔａｑｍａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて、製造業者の指示に従って組み立てた。発現データをハウスキーピング遺伝子ＡｃｔＢ及びＧＡＰＤＨの発現によって正規化した。本試験で使用されたプローブは、ＵＳＰ１６（Ｍｍ＿００４７０３９３、Ｍｍ＿００４７０４０６）、ｐ１６Ｉｎｋ（Ｍｍ＿０１２５７３４８、Ｍｍ＿００４９４４４９）、ｐ１９Ａｒｆ（Ｍｍ＿００４８６９４３）、ＡｃｔＢ（Ｍｍ＿００６０７９３９）、ＧＡＰＤＨ（Ｍｍ＿９９９９９９１５）、Ｈｏｘａ１（Ｍｍ００４３９３５９＿ｍ１）、Ｈｏｘａ３（Ｍｍ０１３２６４０２＿ｍ１）、Ｈｏｘａ５（Ｍｍ０１３２６４０２＿ｍ１）であった。

ＭＥＦ及びＨＳＣ中のヒストンの免疫蛍光法。細胞を４８時間培養し（ＭＥＦについて）、またはスライドガラス上で直接サイトスピン処理した（ＨＳＣについて）。細胞をＰＦＡ（２％）中で１０分間固定し、ＰＢＳ−トリトン（０．１％）中で洗浄した。細胞を、ＰＢＳ中、ロバ血清（１０％）で、室温にて１時間ブロックし、その後一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。二次抗体と共にインキュベーションを行い、ＤＡＰＩ染色を室温にて４５分間行った。あるいは、抗体染色をＺｅｎｏｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、製造業者の指示に従って行った。その後試料を設置し、画像撮影した。

画像撮影は、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｏｒｃａ−ＥＲカメラまたはＺｅｉｓｓ共焦点システムＬＳＭ ７１０（Ｚｅｉｓｓ）を装備したＺｅｉｓｓ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｚ１蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて行った。データ取得及び焦点測定を、Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ Ｖｏｌｏｃｉｔｙソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて行った。

本試験で使用した一次抗体は、抗ユビキチル−ヒストンＨ２Ａ Ｄ２７Ｃ４（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）であった。二次抗体はＡｌｅｘａ ４８８及び５９４であった。

結果
Ｔｓ６５Ｄｎマウスは、欠損造血幹細胞を有するが、Ｔｓ１Ｃｊｅマウスは有さない。
既報は、（Ｈｓａ２１のほぼ完全な、自由に分離するコピーを含有する）Ｔｓ６５Ｄｎ、Ｔｓ１Ｃｊｅ及びＴｃ１マウスが、大球性貧血を示し、Ｔｓ１Ｃｊｅマウス以外は、高年齢において巨核球の数の増加及び骨髄外造血作用を示すことを認めている（Ｋｉｒｓａｍｍｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈｌｙ ｐｅｎｅｔｒａｎｔ ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｓ６５Ｄｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｄｏｗｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｂｌｏｏｄ １１１，７６７-７７５（２００８）、Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，Ｃ．ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｓ１Ｃｊｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｄｏｗｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｂｌｏｏｄ １１３，１９２９-１９３７（２００９）、Ａｌｆｏｒｄ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｃ１ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｄｏｗｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｂｌｏｏｄ １１５，２９２８-２９３７（２０１０））。しかしながら、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、成体Ｔｓ６５ＤｎまたはＴｓ１Ｃｊｅマウスにおいては完全に特性評価されなかった。

Ｔｓ６５Ｄｎマウスモデルにおいて造血幹細胞欠損を評価するために、我々は、Ｔｓ６５Ｄｎの骨髄単核細胞による移植を行った。先の観察（Ｌｏｒｅｎｚｏ，ｌ．Ｐ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ cｅｌｌ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｓ６５Ｄｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｄｏｗｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ．Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．１５，２０８３−２０９４（２０１１））と一致して、我々は、５×１０⁵ 個のＣＤ４５．２⁺ Ｔｓ６５Ｄｎ細胞の移植が、野生型の骨髄細胞の移植と比べて、レシピエントマウスにおけるより低い造血キメラ性をもたらすことを見出した（図７ａ）。

Ｔｓ６５Ｄｎ骨髄細胞の損なわれた移植細胞定着能力の原因である三染色体遺伝子を解明するために、野生型、Ｔｓ６５Ｄｎ及びＴｓ１Ｃｊｅ骨髄の免疫表現型の組成物をプロファイリングした。正常なマウスにおいてＨＳＣを富化するＣＤ１５０⁺ ＣＤ４８^- ＫＬＳ細胞のフラクション（Ｋｉｅｌ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．ＳＬＡＭ ｆａｍｉｌｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｒｅｖｅａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｉｃｈｅｓ ｆｏｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ １２１，１１０９−１１２１（２００５））は、Ｔｓ６５Ｄｎマウスにおいて３倍を超えるまで減少した。これとは対照的に、ＣＤ１５０⁺ ＣＤ４８^- ＫＬＳ細胞の発生頻度は、Ｔｓ１Ｃｊｅマウスにおいて正常であった（図１ｂ）。このことは、造血幹細胞自己再生能力の低下がＴｓ６５Ｄｎマウスにおいて特異的であることを示唆した。幹細胞富化集団（ＣＤ３４及びＦｌｔ３）を単離するための異なる表面マーカーを用いるさらなる分析（Ｃｈａｏ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｏｒｍａｌ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｎｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｈｉｅｒａｒｃｈｙ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．７３，４３９−４４９（２００８））もまた、Ｔｓ６５Ｄｎの骨髄中にＨＳＣ欠損があるが、Ｔｓ１Ｃｊｅマウスにおいてはないこと示唆した（図１ｂ）。注目すべきことに、ＣＤ３４^- ＣＤ１５０⁺ ＣＤ４８^- ＫＬＳフラクションは、静止状態の幹細胞について富化されることが知られていて（Ｗｉｌｓｏｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｄｏｒｍａｎｔ ａｎｄ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗｉｎｇ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｎｉｃｈｅｓ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１０６，６４−７５（２００７）、Ｗｉｌｓｏｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ ｓｗｉｔｃｈ ｆｒｏｍ ｄｏｒｍａｎｃｙ ｔｏ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ ｄｕｒｉｎｇ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｒｅｐａｉｒ．Ｃｅｌｌ １３５，１１１８−１１２９（２００８））、これは、Ｔｓ６５Ｄｎマウスにおいて著しく低下する（図１ｃ）。

Ｔｓ６５Ｄｎ及びＴｓ１ＣｊｅのＨＳＣ細胞のインビトロでのコロニー形成能力を評価するために、単一のＣＤ３４^- ＣＤ１５０⁺ ＣＤ４８^- ＫＬＳ細胞を、単一のＨＳＣの増殖をロバストに支援する条件を用いて、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ中で平板培養した（Ｐａｒｋ，Ｉ．−Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｂｍｉ−１ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗｉｎｇ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４２３，３０２−３０５（２００３）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔａｂｌｅ ｂｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １，６６１-６７３（１９９４）、Ａｋａｌａ，Ｏ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｂｙ Ｔｒｐ５３−／−ｐ１６Ｉｎｋ４ａ−／−ｐ１９Ａｒｆ−／− ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４５３，２２８-２３２（２００８））。播種後１週間でコロニーを生成する能力は、Ｔｓ６５ＤｎマウスからのＨＳＣにおいて著しく低下し、Ｔｓ１Ｃｊｅマウスからのものは低下しなかった（図１ｄ）。

ＤＳ中のＨＳＣの特性を、決定的に評価するために、我々は、野生型、Ｔｓ６５Ｄｎ及びＴｓ１Ｃｊｅ細胞による段階的希釈骨髄移植を行った。野生型及びＴｓ１Ｃｊｅの骨髄細胞は、ＨＳＣで計算された発生頻度と同様な程度に致死的に照射されたレシピエントマウスの骨髄を再構成した（それぞれ、１／８０，３３８及び１／１０３，５５３、ｐ＝０．６６８）。逆に、Ｔｓ６５Ｄｎの幹細胞の発生頻度において三倍の低下が存在した（１／３０７，４３１、ｐ＝０．０２９４）（図１ｅ及び図７ｂ）。さらに、Ｔｓ６５Ｄｎ骨髄細胞の多系統生着は、３ヶ月後の二次移植においては観察されず（図１ｆ及び図８）、Ｔｓ６５Ｄｎの造血幹細胞の自己再生能力における重度の欠陥をさらに確認した。したがって、Ｔｓ６５Ｄｎマウスは、ＨＳＣの自己再生、再構成能力及びインビトロコロニー形成において欠損を有するが、Ｔｓ１Ｃｊｅマウスは有さない。

Ｕｓｐ１６のダウンレギュレーションは、Ｔｓ６５ＤｎマウスにおけるＨＳＣの自己再生不全を緩和する。Ｕｓｐ１６は、既報の脱ユビキチン化酵素であり、Ｔｓ６５Ｄｎマウス中で特徴的に三重化されるが、Ｔｓ１Ｃｊｅマウス中では三重化されないことが当該技術分野において既知である遺伝子のうちの１つである。この遺伝子は、ヒストンＨ２Ａ上のポリコーム複合体ＰＲＣ１によるユビキチン修飾の消去を含む、クロマチン再構築に関与することが示されている（Ｊｏｏ，Ｈ．−Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ Ｈ２Ａ ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ４４９，１０６８−１０７２（２００７））。Ｂｍｉ１を含むＰＲＣ１が、複数の組織において幹細胞の自己再生に必須であることが示されているために（Ｍｏｌｏｆｓｋｙ，Ａ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｂｍｉ−１ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ ｆｒｏｍ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ４２５，９６２−９６７（２００３）、Ｐａｒｋ，Ｉ．−Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｂｍｉ−１ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗｉｎｇ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４２３，３０２−３０５（２００３）、Ｌｉｕ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｈｅｄｇｅｈｏｇ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ Ｂｍｉ−１ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｍａｍｍａｒｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６，６０６３−６０７１（２００６）、Ｐｉｅｔｅｒｓｅｎ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｂｍｉ１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍａｍｍａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１８，１０９４−１０９９（２００８）、ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｕｇｔ，Ｎ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ，ａｎｄ ｓｅｖｅｒｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ａ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｍｉ−１ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．８，７５７−７６９（１９９４））、我々は、ＰＲＣ１媒介Ｈ２Ａユビキチン化の既知の修飾因子であるＵｓｐ１６の過剰コピーがＴｓ６５Ｄｎマウスにおける幹細胞の自己再生能力を害するのではないかと考えた。

Ｔｓ６５Ｄｎマウスの造血幹細胞におけるＵｓｐ１６の機能を理解するために、我々は、先ず初めに、Ｕｓｐ１６ ｍＲＮＡが、野生型ＨＳＣと比べてＴｓ６５ＤｎのＨＳＣにおいて１．５倍高く発現されることを確認した（図２ａ）。次に、Ｈ２ＡＫ１１９ユビキチン化のレベルを測定した。免疫蛍光試験は、Ｔｓ６５ＤｎのＣＤ３４^- ＣＤ１５０⁺ ＣＤ４８^- ＫＬＳ細胞中のユビキチン化クロマチン増殖細胞巣の数における２倍の減少を示した（図２ｂ）。免疫蛍光及びウェスタンブロット分析の両方ともに、ＭＥＦ細胞中のＨ２ＡＫ１１９ユビキチンのレベルにおける減少を立証した（図９）。

Ｕｓｐ１６の上昇値が、Ｔｓ６５ＤｎのＨＳＣの異常性に寄与するかどうかを決定するために、我々は、ＧＦＰ及びＵＳＰ１６に対して向けられるｓｈＲＮＡ（ｓｈＵＳＰ１６＃１及びｓｈＵＳＰ１６＃２）もしくはスクランブルｓｈＲＮＡ（ｓｈＣ）をコード化する２つのレンチウイルス構築物を作成した。これらのＵｓｐ１６ヘアピンは、Ｕｓｐ１６の発現を完全には除去せず、これを４０〜５０％まで低減し（図２ｃ）、野生型マウスにおいて観察されるものと同様なＵＳＰ１６の最終発現レベルをもたらす。ｓｈＵＳＰ１６レンチウイルスに感染させた単一のＣＤ３４^- ＣＤ１５０⁺ ＣＤ４８^- ＫＬＳ Ｔｓ６５Ｄｎの骨髄細胞のおよそ４０％が、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ中においてインビトロで増殖することができたが、一方、ｓｈＣ感染細胞のわずか２０％のみがコロニーを形成した（図２ｄ）（ｐ値＜０．０４）。

インビボでのＵｓｐ１６の効果を評価するために、Ｔｓ６５Ｄｎ ＫＬＳ細胞を、ｓｈＵＳＰ１６またはｓｈＣレンチウイルスベクターに感染させて、次いでレシピエントの致死的に照射されたＣ５７Ｂｌ６マウスに注入した。ｓｈＵｓｐ１６感染細胞は、レシピエントマウスにおいて有意に生着されたが、ｓｈＣ細胞は生着されなかった（図２ｅ及び図１０ａ）。対照レンチウイルスで処理されたＴｓ６５Ｄｎの骨髄細胞とは異なり、ｓｈＵｓｐ１６レンチウイルスで形質導入された細胞もまた、累代移植の際に多能性分化を引き起こすことができた（図２ｆ及び図１０ｂ）。これらの結果は、Ｔｓ６５Ｄｎ ＨＳＣの自己再生不全は、Ｕｓｐ１６単独のダウンレギュレーションによって実質的に救済され得ることを立証している。

ＵＳＰ１６は、Ｔｓ６５Ｄｎの神経前駆細胞の増殖不全において役割を果たす。Ｕｓｐ１６は、Ｈ２ＡＫ１１９ユビキチンマークの除去によって、ポリコーム活性に影響を及ぼし得るために、我々は、Ｔｓ６５ＤｎマウスにおけるＵｓｐ１６の過剰コピーが、造血幹細胞においてのみならず、脳を含む他の組織においても役割を有すると仮定した。実際、ＰＲＣ１は、神経前駆細胞の維持に対して特に重要であることが知られている（Ｍｏｌｏｆｓｋｙ，Ａ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｂｍｉ−１ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ ｆｒｏｍ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ４２５，９６２−９６７（２００３）、Ｍｏｌｏｆｓｋｙ，Ａ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｂｍｉ−１ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ ｆｒｏｍ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ４２５，９６２-９６７（２００３）、Ｃａｏ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｂｍｉ−１ ａｂｓｅｎｃｅ ｃａｕｓｅｓ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｂｒａｉｎ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７，ｅ３２０１５（２０１２））。

Ｕｓｐ１６三染色体性もまた、Ｔｓ６５Ｄｎマウスの神経前駆細胞において役割を果たすかどうかを理解するために、成体の神経細胞新生の主要部位のうちの１つである脳室下帯（ＳＶＺ）に由来する、野生型及びＴｓ６５Ｄｎマウスの神経前駆細胞のインビトロ増殖をテストした。８週齢のマウスの脳からＳＶＺを微小切除し、ＣＤ２４^- ＣＤ３１^- ＣＤ４５^- ＣＤ１１９^- （Ｌｉｎ^- ）細胞をフローサイトメトリーによって濃縮させた。これらの細胞を、ニューロスフェアを形成するための及びインビトロで連続的に継代するためのそれらの能力についてテストした。Ｔｓ６５Ｄｎマウスの神経前駆細胞中の欠損の存在を示唆する他の報告（Ｍｏｌｄｒｉｃｈ，Ｒ．Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｄｏｗｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｇｅｎｅ ｄｏｓａｇｅ ｉｍｂａｌａｎｃｅ ｏｎ ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．８２，８７−９４（２００７）、Ｌｏｒｅｎｚｉ，Ｈ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｈｙｐｏｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｓ６５Ｄｎ ｍｏｕｓｅ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ ｅａｒｌｙ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１１０４，１５３−１５９（２００６））と一致して、Ｔｓ６５Ｄｎ細胞によって形成されたクローン形成性ニューロスフェア開始細胞（Ｎｓｐ−Ｉｃ）の発生頻度は、野生型細胞によるものと比べて半減した（図３ａ）。この発生頻度は、野生型細胞においては第４継代までに２倍から４倍まで増加したが、一方Ｔｓ６５Ｄｎ Ｌｉｎ^- 細胞は、この時期までにニューロスフェアを形成するそれらの能力を完全に喪失した（図３ａ〜ｂ）。神経前駆細胞の増殖におけるＵＳＰ１６の過剰コピーの役割を明らかにするために、Ｔｓ６５Ｄｎマウスを、正常なＵｓｐ１６対立遺伝子のうちの１つを突然変異させた（Ｕｓｐ１６^het ）マウスと繁殖させた。子孫は、Ｕｓｐ１６の正常な二倍体遺伝子量を有したが、Ｔｓ６５Ｄｎの親系統において存在する他の遺伝子の３つのコピーを保持する（Ｔｓ６５Ｄｎ／Ｕｓｐ１６^het マウス）。Ｔｓ６５Ｄｎ／Ｕｓｐ１６^het の神経前駆細胞中のＵｓｐ１６の過剰対立遺伝子の喪失は、Ｌｉｎ^- 細胞がニューロスフェアを形成するための及び継代されるための能力を回復した（図３ａ〜ｂ）。Ｓｏｘ２（神経前駆細胞マーカーとして知られる）（Ｅｌｌｉｓ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．ＳＯＸ２，ａ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏ ｏｒ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ．Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２６，１４８−１６５（２００４））の発現もテストし、これは、野生型Ｌｉｎ^- 神経細胞の４連続継代後に、２倍まで増加した（図３ｅ及び図１０ｃ）。これとは対照的に、４継代において、Ｌｉｎ^- Ｔｓ６５Ｄｎ神経細胞によるＳｏｘ２の検出可能な発現は存在しなかった。Ｔｓ６５Ｄｎ／Ｕｓｐ１６^het 細胞は、４継代において野生型細胞に匹敵するレベルのＳｏｘ２を発現する（図３ｃ）。

神経前駆細胞の増殖特性をさらに検討するために、ＣＤ１３３⁺ ＥＧＦＲ⁺ Ｌｉｎ^- （Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｓｕｂｅｐｅｎｄｙｍａｌ ｚｏｎｅ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ６，１９８１−１９８９（２０１１）、Ｐａｓｔｒａｎａ，Ｅ． ｅｔ ａｌ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｇｅｎｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０６，６３８７−６３９２（２００９））及びＣＤ１５⁺ ＥＧＦＲ⁺ Ｌｉｎ^- （Ｃａｐｅｌａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．ＬｅＸ／ｓｓｅａ−１ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ａｄｕｌｔ ｍｏｕｓｅ ＣＮＳ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅｍ ａｓ ｎｏｎｅｐｅｎｄｙｍａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ ３５，８６５−８７５（２００２））細胞を分析し、ＳＶＺから単離した（図１１）。ＣＤ１３３⁺ ＥＧＦＲ⁺ Ｌｉｎ^- 細胞またはＣＤ１５⁺ ＥＧＦＲ⁺ Ｌｉｎ^- 細胞のいずれかのスフェアの限界希釈分析は、野生型マウスと比べてまたはＴｓ６５Ｄｎ／Ｕｓｐ１６^het マウスと比べて、Ｔｓ６５ＤｎマウスにおけるＮｓｐ−Ｉｃの発生頻度における著しい減少を明らかにした（図３ｄ）。さらに、二次スフェア形成アッセイは、神経前駆細胞がスフェアを形成するためのＴｓ６５Ｄｎの能力における著しい減少を示したが、Ｔｓ６５Ｄｎ／Ｕｓｐ１６^het では示さなかった（図３ｅ）。まとめると、これらのデータは、Ｔｓ６５Ｄｎマウスは、神経前駆細胞の増殖における欠損を有し、これは、Ｕｓｐ１６の過剰対立遺伝子を簡単に排除することによって、少なくとも部分的に救済され得ることを示している。

ＵＳＰ１６は、Ｔｓ６５Ｄｎマウスの乳腺中の上皮細胞増殖の制御において役割を果たす。ＰＲＣ１は、乳腺において重要な役割を果たし、Ｂｍｉ１の損失は、重篤な上皮細胞増殖不全をもたらす（Ｐｉｅｔｅｒｓｅｎ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｂｍｉ１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍａｍｍａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１８，１０９４−１０９９（２００８））。したがって、我々は、Ｔｓ６５ＤｎマウスにおけるＵｓｐ１６の過剰コピーが乳腺上皮細胞の増殖に影響を及ぼすかどうかを求めた。予想通りに、Ｕｓｐ１６ ｍＲＮＡ発現は、Ｔｓ６５Ｄｎ ＣＤ４９ｆ⁺ ＣＤ２４^med Ｌｉｎ^- 細胞（これは、乳腺再構築単位またはＭＲＵが富化されている）（Ｓｔｉｎｇｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｎｉｑｕｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍａｍｍａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４３９，９９３−９９７（２００６）、Ｓｈａｃｋｌｅｔｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ ｆｒｏｍ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４３９，８４−８８（２００６））において、野生型と比べて、およそ１．５倍増加した（図４ａ）。さらに、通常ポリコーム複合体ＰＲＣ１によって抑制される、いくつかのＨｏｘ遺伝子が、Ｔｓ６５Ｄｎ細胞中で高く発現された（図１２ａ）。脳組織の免疫表現型分析は、Ｔｓ６５Ｄｎの乳腺管組織化における変更を示したが、Ｔｓ１Ｃｊｅマウスでは示さなかった（図１２ｂ）。特に、ＣＤ３１^- ＣＤ４５^- ＴＥＲ１１９^- （Ｌｉｎ^- ）細胞の全体の数の顕著な減少が存在した（図４ｂ）。さらには、Ｔｓ６５Ｄｎマウスにおけるサイトケラチン染色は、野生型と比べて、Ｔｓ６５Ｄｎマウスが、管腔細胞サイトケラチンＣＫ８及び基底細胞サイトケラチンＣＫ１４を同時発現する細胞の増加した数を有するが、Ｔｓ１Ｃｊｅマウスは有さないことを示した。（図４ｃ及び図１２ｃ〜ｄ）。

次に、ＣＤ４９ｆ⁺ ＣＤ２４^med Ｌｉｎ^- 細胞（移植能力を強化された集団）（Ｓｔｉｎｇｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｎｉｑｕｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍａｍｍａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４３９，９９３−９９７（２００６）、Ｓｈａｃｋｌｅｔｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ ｆｒｏｍ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４３９，８４−８８（２００６））を、３Ｄ培養条件においてインビトロで増殖するためのそれらの能力についてテストした。Ｔｓ６５Ｄｎ培養物は、コロニーの数の減少を示したが、Ｔｓ１Ｃｊｅ培養物は示さなかった（図４ｄ）。Ｔｓ６５Ｄｎの乳腺上皮細胞の特性をさらに評価するために、Ｌｉｎ^- 細胞を用いる乳腺移植アッセイを行った。乳腺突出部を形成することができるＴｓ６５Ｄｎ Ｌｉｎ^- 細胞の発生頻度における著しい減少が存在した（図４ｅ）。注目すべきことに、Ｕｓｐ１６の２つのコピーのみを発現するＬｉｎ^- Ｔｓ６５Ｄｎ／Ｕｓｐ１６^het 細胞の乳腺を形成するための能力は、野生型のものに匹敵した。

Ｔｓ６５Ｄｎの乳腺上皮細胞におけるＵｓｐ１６の過剰コピーの役割をさらに評価するために、Ｔｓ６５Ｄｎ Ｌｉｎ^- 細胞中のＵｓｐ１６のレンチウイルスによるダウンレギュレーションを行った（図４ｆ）。ｓｈＵＳＰ１６感染Ｌｉｎ^- Ｔｓ６５Ｄｎ細胞中のＭＲＵの計算された発生頻度において２倍の増加が存在し、派生した突出部は、対照ｓｈＲＮＡで感染させた細胞と比べて大きかった（図４ｆ）。しかしながら、Ｔｓ６５Ｄｎ／Ｕｓｐ１６^het 乳腺上皮細胞の二次移植においては、乳腺を発生させることができず、このことは、Ｔｓ６５Ｄｎマウスにおけるこれらの細胞の増殖に影響を及ぼす他の遺伝子が存在し得ることを示唆している。

Ｔｓ６５Ｄｎ細胞中のＵｓｐ１６によるＩｎｋ４ａ／Ａｒｆの調節。ＨＳＣ、神経前駆細胞、乳腺上皮細胞及び線維芽細胞中で特性が十分に明かされているＰＲＣ１標的遺伝子座のうちの１つがＣＤＫＮ２ａであり、これは、２つの別個の腫瘍抑制因子、ｐ１６^Ink4a 及びｐ１９^Arf をコード化する。ｐ１６^Ink4a 及びｐ１９^Arf の発現は、通常、齧歯類及びヒト組織の両方で、年齢と共に増加する（Ｌｉｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ１６（ＩＮＫ４ａ）ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ Ｔ−ｃｅｌｌｓ ｉｓ ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｇｉｎｇ．Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ ８，４３９−４４８（２００９）、Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｏｆ ａｇｉｎｇ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４，１２９９−１３０７（２００４）、Ｊａｎｚｅｎ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ−ｓｅｌｌ ａｇｅｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐ１６ＩＮＫ４ａ．Ｎａｔｕｒｅ ４４３，４２１−４２６（２００６））。Ｔｓ６５Ｄｎマウスに由来するＭＥＦで、我々は、連続継代中（４継代から７継代まで）に、野生型ＭＥＦと比べて両遺伝子のＲＮＡ発現のレベルにおけるより速い増加を観察した（図５ａ）。また、Ｔｓ６５Ｄｎ ＭＥＦ中のＳＡ−βＧａｌ陽性細胞についての明確な富化が、それらの野生型対応物と比べて存在し、このことは、加速された老化のプロセスを示唆している（図５ｂ）。Ｔｓ６５Ｄｎ ＭＥＦにおいて観察されたＨ２ＡＫ１１９ユビキチン化のレベルの低下と一致して（図８ｃ）、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）分析は、Ｔｓ６５Ｄｎ ＭＥＦ中のＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ遺伝子座のＨ２ＡＫ１１９ユビキチンにおける減少を立証している（Ｎｅｇｉｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｚｆｐ２７７ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｋ４ａ／ａｒｆ ｌｏｃｕｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｏｌｙｃｏｍｂ ｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅ ｃｏｍｐｌｅｘ １．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５，ｅ１２３７３（２０１０））（図５ｃ）。最後に、Ｔｓ６５Ｄｎ ＭＥＦ培養物中の２つの異なるヘアピンを用いるＵｓｐ１６のレンチウイルスによるダウンレギュレーションは、ｐ１６^Ink4a 及びｐ１９^Arf のより低いレベルを回復し、このことは、Ｕｓｐ１６が、老化プロセスに寄与していることを示唆している（図５ｄ）。

次に、野生型、Ｔｓ６５Ｄｎ、及びＴｓ６５Ｄｎ／Ｕｓｐ１６^het マウス細胞からの成体末端尾部線維芽細胞（ＴＴＦ）もまた検討した。Ｔｓ６５Ｄｎの線維芽細胞は、ＳＡ−βＧａｌ染色によってかつｐ１６発現によって示されるように、顕著な増殖障害（図５ｅ）及び高レベルの老化を示した（図５ｆ〜ｇ及び図１３）。しかしながら、Ｕｓｐ１６の単一の正常な対立遺伝子の喪失は、これらの細胞の増殖欠損及び早期老化を著しく救済した（図５ｅ〜ｇ）。Ｂｍｉ１の枯渇は、Ｔｓ６５Ｄｎの線維芽細胞においてみられるものと非常に類似する増殖欠損をもたらす。Ｂｍｉ１^- ／^- ＭＥＦにおいては、これは、Ｃｄｋｎ２ａのＰＲＣ１媒介抑制の喪失にある程度起因する（Ｊａｃｏｂｓ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｎｄ Ｐｏｌｙｃｏｍｂ−ｇｒｏｕｐ ｇｅｎｅ ｂｍｉ−１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｉｎｋ４ａ ｌｏｃｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ ３９７，１６４−１６８（１９９９））。Ｂｍｉ１の突然変異と同様に、Ｔｓ６５Ｄｎの線維芽細胞の老化及び増殖欠損は、Ｃｄｋｎ２ａを標的とするｓｈＲＮＡによって救済された（図５ｆ〜ｈ及び図１３ｂ〜ｃ）。

ヒトのダウン症候群におけるＵＳＰ１６の潜在的な役割。４人のヒトダウン症候群患者から単離された線維芽細胞を、ＵＳＰ１６がそれらの増殖を制限し得るかを確認するためにテストした。既報（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｇｅｉｎｇ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｄｏｗｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ．２５６，２２１−２３１（１９９１）、Ｃｏｎｔｅｓｔａｂｉｌｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｏｎａｔｅ Ｔｓ６５Ｄｎ ｍｏｕｓｅ，ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｄｏｗｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆ．４２，１７１−１８１（２００９）、Ｋｉｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ Ｄｏｗｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｓｕｂｊｅｃｔｓ．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．３９，３７４−３８０（２００５））と一致して、ＤＳの線維芽細胞の増殖は、野生型と比べて阻害された（図６ａ）。これは、ＳＡ−βＧａｌ及びｐ１６^Ink4a の発現によって測定されるように、老化の増加に関連付けられた（図６ｂ〜ｃ及び図１４）。ＵＳＰ１６の過発現が増殖欠損に寄与し得るかどうかを決定するために、我々は、正常な線維芽細胞において機能獲得実験を行い、ダウン症候群の線維芽細胞において機能喪失実験を行った。ＵＳＰ１６による正常包皮線維芽細胞の形質導入は、正常な野生型線維芽細胞の増殖を示した（図６ｄ及び図１４ｂ）。逆に、ＵＳＰ１６のｓｈＲＮＡ媒介ダウンレギュレーションまたはＢＭＩ１の過発現は、ＤＳ線維芽細胞の増殖能力の増加をもたらした（図１４ｂ〜ｃ）。興味深いことに、ヒト神経前駆細胞の２つの異なる培養物（１つが小児患者からのもので、もう１つが成人患者からのもの）中のＵＳＰ１６の過発現は、それらのインビトロ増殖能力及びニューロスフェアの形成を低下させた（図６ｆ）。これらの実験は、ＵＳＰ１６の第３のコピーがダウン症候群を有する患者に関連する病理において役割を有することを示唆している。

考察
我々のデータは、ダウン症候群のＴｓ６５Ｄｎマウスモデルに関連する病理の一部が、組織ホメオスタシスにおける広範な欠損及び体幹細胞ならびに前駆細胞における自己再生の欠損に起因することを示している。ＤＳについての２つの異なるマウスモデル（Ｔｓ６５Ｄｎ及びＴｓ１Ｃｊｅ）間でのＨＳＣコンパートメントの比較は、制限された数の遺伝子がこの欠損において重要な役割を果たし得ることを示している。ＨＳＣ及び神経前駆細胞の自己再生における変更、ならびにＴｓ６５Ｄｎマウス中の乳腺上皮細胞及び線維芽細胞の増殖不全は、Ｕｓｐ１６の三染色体性、ポリコーム抑制複合体１（ＰＲＣ１）活性の陰性修飾因子に一部は関わっている（Ｊｏｏ，Ｈ．−Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｈｉｏｎ ｂｙ Ｈ２Ａ ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ４４９，１０６８−１０７２（２００７））。ＰＲＣ１は、複数の体幹細胞の老化及び自己再生を調節することが知られている。この考えを裏付けるように、Ｔｓ６５ＤｎマウスにおけるＵｓｐ１６の傍生理学的レベルへのダウンレギュレーションは、ＨＳＣ、神経前駆細胞、乳腺上皮細胞及び線維芽細胞の増殖能力を回復する。

明確に、他の遺伝子もまた、ダウン症候群で見られる脳顔面頭蓋異常及び先天性心臓欠陥などの多数の形質で役割を果たす（Ａｒｒｏｎ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．ＮＦＡＴ ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｄｏｓａｇｅ ｏｆ ＤＳＣＲ１ ａｎｄ ＤＹＲＫ１Ａ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ２１．Ｎａｔｕｒｅ ４４１，５９５−６００（２００６））。さらに、Ｕｓｐ１６の喪失が、乳腺ＭＲＵが連続的に移植される能力において救済することを我々は裏付けできていないが、これは、他の遺伝子（複数可）もまた、Ｔｓ６５Ｄｎ幹細胞コンパートメントの自己再生欠損に寄与することができたことを示唆している。しかしながら、Ｕｓｐ１６三染色体性がこれらのマウスの体細胞において重要な役割を果たしていることを示しつつ、ＨＳＣ及び神経前駆細胞の救済は重要である。最終的に、ヒトダウン症候群の線維芽細胞中のＵＳＰ１６の阻害が増殖を増加させるという観察は、この遺伝子がまた、ダウン症候群を有する患者における組織ホメオスタシス欠損において役割を果たすことを示している。

ダウン症候群は、小児白血病の発現率増大及び成人固形腫瘍の発現率低下と関連付けられている（Ｙａｎｇ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｄｏｗｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ＵＳＡ ｆｒｏｍ １９８３ ｔｏ １９９７：ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ ３５９，１０１９−１０２５（２００２）、Ｓａｔｇｅ Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ Ｄｏｗｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．７８，２０７−２１６（１９９８））。ファンコニ貧血などの骨髄不全を引き起こす他の症候群は、白血病に罹患しやすい。ダウン症候群患者におけるリンパ性白血病は、ＣＤＫＮ２ａの突然変異に頻繁に関与する（Ｎｏｖａｒａ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｃａｕｓｉｎｇ ９ｐ２１ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｏｆ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１２６，５１１−５２０（２００９））。Ｃｄｋｎ２ａは、Ｕｓｐ１６の三染色体性によって生じる増殖不全において役割を果たすと思われるために、ＣＤＫＮ２Ａの突然変異は、ＤＳ ＨＳＣに強力な選択有利性を供与することができる。

幹細胞のＰＲＣ１調節は、Ｈ２Ａのユビキチン化を介してのＣｄｋｎ２ａ遺伝子座の阻害によって一部には影響を受ける（Ｍｏｌｏｆｓｋｙ，Ａ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｂｍｉ−１ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ ｆｒｏｍ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ４２５，９６２−９６７（２００３）、Ｊａｃｏｂｓ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｎｄ Ｐｏｌｙｃｏｍｂ−ｇｒｏｕｐ ｇｅｎｅ ｂｍｉ−１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｉｎｋ４ａ ｌｏｃｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ ３９７，１６４−１６８（１９９９）、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ，Ｓ．Ｗ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｋ４ａ ａｎｄ Ａｒｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ａｆｆｅｃｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ ｉｎ Ｂｍｉ１−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９，１４３８−１４４３（２００５））。我々は、Ｕｓｐ１６の三染色体性が、ヒストンＨ２Ａユビキチン化の減少ならびにｐ１６^Ink4a 及びｐ１９^Arf の高レベルをもたらすことを見出している。したがって、Ｕｓｐ１６は、ＰＲＣ１とは反対の生化学的及び機能的作用を有する。実際、Ｔｓ６５Ｄｎマウスの発育不全は、ＰＲＣ１成分のＢｍｉ１に対するマウス変異体のハイポモルフに似ている。これは、ＨＳＣ、乳腺発達、神経前駆細胞中の欠損、及び線維芽細胞の早期老化を含む（Ｐａｒｋ，Ｉ．−Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｂｍｉ−１ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗｉｎｇ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４２３，３０２−３０５（２００３）、Ｐｉｅｔｅｒｓｅｎ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｂｍｉ１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍａｍｍａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１８，１０９４−１０９９（２００８）、Ｍｏｌｏｆｓｋｙ，Ａ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｍｉ−１ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｕｔ ｎｏｔ ｍｏｕｓｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｂｙ ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐ１６Ｉｎｋ４ａ ａｎｄ ｐ１９Ａｒｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９，１４３２−１４３７（２００５））。Ｃｄｋｎ２ａの突然変異は、部分的に、しかしながら不完全に、Ｂｍｉ１変異体マウスで見られる体細胞不全を矯正する（Ｊａｃｏｂｓ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｎｄ Ｐｏｌｙｃｏｍｂ−ｇｒｏｕｐ ｇｅｎｅ ｂｍｉ−１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｉｎｋ４ａ ｌｏｃｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ ３９７，１６４−１６８（１９９９）、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ，Ｓ．Ｗ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｋ４ａ ａｎｄ Ａｒｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ａｆｆｅｃｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ ｉｎ Ｂｍｉ１−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９，１４３８−１４４３（２００５）、Ｊａｃｏｂｓ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｎｄ Ｐｏｌｙｃｏｍｂ−ｇｒｏｕｐ ｇｅｎｅ ｂｍｉ−１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｉｎｋ４ａ ｌｏｃｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ ３９７，１６４−１６８（１９９９）、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ，Ｓ．Ｗ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｋ４ａ ａｎｄ Ａｒｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ａｆｆｅｃｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ ｉｎ Ｂｍｉ１−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９，１４３８−１４４３（２００５））。同様に、ｐ１６^Ink4a のダウンレギュレーション、またはＢＭＩ１の過発現は、ＵＳＰ１６に関して三染色体性のネズミ及びヒト線維芽細胞中の増殖不全を部分的に救済する。これらの結果は、Ｕｓｐ１６の三染色体が、Ｈ２Ａユビキチンの除去の増加に起因するＴｓ６５Ｄｎマウスにおいてみられる細胞性不全症に寄与することを示している。

我々のデータは、複数の組織における自己再生の調節の新しい主軸を裏付けている。我々は、Ｕｓｐ１６の正常な発現が正常な組織ホメオスタシスにとって重要であり、このバランスの動揺が異常な組織ホメオスタシスに寄与することを示した。我々の研究は、ヒトにおける最も一般的な遺伝子異常のうちの１つであるダウン症候群を理解するために幅広い影響をもたらすと考える。さらに、Ｕｓｐ１６の役割及びその作用のメカニズムに関する研究は、この症候群に関連する幹細胞病理を緩和する治療的手段の開発に導く可能性があり得る。

前述の内容は、本発明の原理を単に例示するものである。当業者であれば、本明細書に明示的に記載されずまたは示されていないが、種々の構成を考案し、本発明の原理を具体化することが可能であり、これらは本発明の精神及び範囲内に含まれることを理解されるであろう。さらに、本明細書に列挙された全ての実施例及び条件付き言語は、読者が本発明の原理及び本技術を促進するために本発明者によって寄与される概念を理解する上で補助するよう意図するものである。さらに、本発明の原理、態様、及び実施形態ならびに具体的実施例を示す全ての記述は、それらの構造的及び機能的等価物の両方を包含することを意図している。加えて、こうした等価物は、現在既知の等価物及び将来開発される等価物、すなわち、構造とは無関係に、同一の機能を遂行する任意の開発される要素の両方を含む。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示されかつ記載された例示の実施形態に限定されることを意図するものではない。むしろ、本発明の範囲及び精神は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。

政府の権利
本発明は、合衆国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって裁定された契約番号ＣＡ１００２２５の下、ならびに国防省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｆｅｎｓｅ）によって裁定された契約番号Ｗ８１ＸＷＨ−１３−１−０２８１の下、政府の支援によりなされたものである。政府は本発明において特定の権利を有する。

関連出願の相互参照
米国特許法第１１９条（ｅ）項に従って、本出願は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７８８，７９５号の出願日に対する優先権を主張するものである。

Claims (18)

1. 幹細胞自己再生の速度の低下に関連する、または幹細胞自己再生の速度の増加に反応する医学的状態の治療方法であって、
   Ｈ２Ａ脱ユビキチン化酵素拮抗物質の有効量を個体に投与することを含むことを特徴とする方法。
2. 作用物質が核酸であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記Ｈ２Ａ脱ユビキチン化酵素はＵＳＰ１６であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 作用物質が、前記細胞中のＵＳＰ１６タンパク質の量を低減することを特徴とする請求項３に記載の方法。
5. 前記作用物質はＵＳＰ１６特異的核酸阻害物質であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. 抗酸化剤を投与することをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 前記状態は、神経発達障害、外傷性脳損傷、神経変性疾患、老化関連障害、筋委縮に関連する状態、膵臓細胞の再生を必要とする疾患、肝臓再生を必要とする疾患、または皮膚再生を必要とする状態であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
8. 前記状態は、神経発達障害、外傷性脳損傷、または神経変性疾患であり、前記治療は認知機能における改善を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
9. 認知機能における前記改善は、記憶における改善を含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
10. 作用物質の投与前と前記作用物質の投与後とに、記憶を測定することをさらに含み、前記作用物質の投与後の記憶は、前記作用物質の投与前の記憶に対して改善されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
11. 前記神経発達障害は、ダウン症候群、脆弱Ｘ症候群、または自閉症であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
12. 前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、またはＡＬＳであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
13. 前記アルツハイマー病が、ダウン症候群に関連付けられることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. 前記アルツハイマー病が、外傷性脳損傷に関連付けられることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
15. 幹細胞自己再生の速度の低下に関連する、または幹細胞自己再生の速度の増加に反応する状態を有する個体を治療する能力について候補作用物質をスクリーニングするための方法であって、
    ＵＳＰ１６を発現する細胞を候補作用物質と接触させることと、
    ＵＳＰ１６デユビキチナーゼ活性を測定することと
    を含み、
    候補作用物質と接触させていない細胞中のものと比べての前記細胞中のＵＳＰ１６デユビキチナーゼ活性における低減は、前記候補作用物質が前記状態を治療することを示すことを特徴とする方法。
16. ＵＳＰ１６デユビキチナーゼ活性が、Ｈ２Ａユビキチン化を評価することによって測定され、
    候補作用物質と接触させていない細胞中のＨ２Ａユビキチン化の量と比べてのＨ２Ａユビキチン化の量における増加は、前記候補作用物質が前記個体を治療することを示すことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
17. Ｈ２Ａユビキチン化が、ｐ１６^Ink4a 遺伝子座におけるＨ２ＡＫ１１９ユビキチンマークを検出することによって測定されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
18. ＵＳＰ１６デユビキチナーゼ活性が、前記細胞中のｐ１６^Ink4a 及び／またはｐ１９^Arf のＲＮＡもしくはタンパク質の量を測定することによって測定され、
    候補作用物質と接触させていない細胞中のｐ１６^Ink4a 及び／またはｐ１９^Arf もしくはタンパク質の前記量と比べての前記細胞中のｐ１６^Ink4a 及び／またはｐ１９^Arf のＲＮＡもしくはタンパク質の量における減少は、前記候補作用物質が前記個体を治療することを示すことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
    

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