KR20120099370A

KR20120099370A - 반추동물에서의 위장의 메탄생성반응을 감소시키기 위한 조성물

Info

Publication number: KR20120099370A
Application number: KR1020127004751A
Authority: KR
Inventors: 힌드릭 베네 페독; 산더 마트진 반 지더벨드; 존 리처드 뉴볼드; 롭 베나드 안톤 휠스호프; 데이비드 데스와이센; 월터 잔 조제프 게리츠; 잔 다익스트라; 로날드 알프레드 렝
Original assignee: 프로비미 홀딩 비.브이.
Priority date: 2009-07-23
Filing date: 2010-07-23
Publication date: 2012-09-10
Also published as: AR077424A1; HUE034179T2; AU2010275083B2; MX2012001014A; AP2012006115A0; PT2456323T; KR101808353B1; JP2012533320A; BR112012001524B1; ES2633690T3; US8771723B2; CA2768565C; WO2011010921A2; ZA201200508B; CL2012000184A1; DK2456323T3; CA2768565A1; WO2011010921A3; AU2010275083A1; UY32802A

Abstract

본 발명은 섭취한 먹이(ingested feed)의 정상적인 발효 동안의 메탄생성균(methanogen)에 의해 필요로 하는 수소 원자를 두고 경쟁하는 제제(agents)의 도움으로 반추동물(ruminants)에서의 위장의 메탄생성반응(gastro-intestinal methanogenesis)의 감소에 관한 것이다. 하나의 양상에서, 본 발명은, 질산염 환원성 경로(nitrate reductive pathways) 뿐만 아니라 황산염 환원성 경로(sulphate reductive pathways) 둘 다는 반추동물에서 위장의 메탄생성반응에서 보다 경쟁적이고(outcompete), 질산염 및 황산염의 메탄생성반응을 감소시키는 효과는 전적으로 첨가물(additive)임을 발견(findings)한 것에 있다. 동시에, 질산염 및 황산염의 복합 투여(combined administration)는, 질산염만을 사용하였을 때 일반적으로 부딪치는 아질산염 중독(nitrite intoxication)의 잠재적인 문제를 방지하거나 또는 경감시키기에 충분히 효율적임을 발견하였고, 이러한 효과는 필요한 경우에 아질산염을 환원시키는 프로바이오틱 미생물(nitrite reducing probiotic microorganism)의 첨가에 의해 추가적으로 향상된다. 이런 이유로, 생산물(products)은 높은 양의 질산염 화합물 및 황산염 화합물의 컴비네이션 및 선택적으로 아질산염을 환원시키는 프로바이오틱 미생물을 포함할 뿐만 아니라 이러한 조성물을 사용한 반추동물에서의 위장의 메탄생산반응을 감소시키는 방법을 제공한다.

Description

반추동물에서의 위장의 메탄생성반응을 감소시키기 위한 조성물{COMPOSITIONS FOR REDUCING GASTRO-INTESTINAL METHANOGENESIS IN RUMINANTS}

본 발명은 반추동물(ruminants)에 대한 사료 첨가물(feed additives) 및 보충물(supplements) 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 섭취한 사료(ingested feed)의 일반적인 발효 동안에 메탄생성균(methanogens)에 의해 요구된 수소 원자를 두고 경쟁을 벌이는 억제제(inhibitory agents)의 도움으로 상기 반추동물에서 위장의 메탄생성반응(methanogenesis)을 감소시키는 것에 관한 것이다. 본 발명은 그 밖의 것들 중에서 메탄생성반응을 감소시키기 위해 상기 억제제를 포함하는 사료 보충물 및 사료 조성물(feed compositions) 및 이들의 비치료적인 용도(non-therapeutic use)를 제공한다.

메탄생성반응은 반추 위 발효(rumen fermentation) 과정 동안에 수소(H2) 처리(hydrogen disposal)의 주요 경로(main route)이다(Beauchemin et al., 2008). 반추 위(rumen) 환경(milieu)으로부터 H2 의 제거는 반추 위 발효의 효율적인 지속을 위해 필수적인 반면에, 메탄생성반응으로부터의 메탄은 지구 온난화(global warming)에 기여하는 중요한 온실가스(greenhouse gas)(Steinfeld et al., 2006) 뿐만 아니라 동물에 대한 식이 에너지의 손실(Johnson and Johnson, 1995)로서의 원인임을 보여준다. 둘 다의 문제(subjects)로 인하여 반추동물로부터의 메탄 생산을 완화시키기 위한 사료 첨가물에 대한 세계적인 연구(global search)로 이어지고 있다.

메탄 방출(emissions)을 감소시키기 위해 탐구된 선택(options) 중의 하나는, 반추동물에 대한 보다 이로운 산물을 생산하는 과정(process) 내로 초과량의 H2의 방향변경(redirection)이고, 이로 인한 보다 낮은 메탄생산반응이다. 예는 프로피오네이트 전구체(propionate precursors)의 첨가에 의해 프로피오제네시스(propiogenesis)의 자극을 포함하고, 반추 위(rumen) 내로 환원적 초산생성(reductive acetogenesis) 도입의 시도를 포함한다(Joblin, 1999, Molano et al., 2008). 반추 위에서 이러한 과정의 성공적인 도입은, 메탄생성반응에 대한 H2 의 유효성(availability)을 감소시키는 동일한 시간 동안에, 동물에 대한 영양소(nutrients)로서 프로피오네이트(propionate) 또는 아세테이트(acetate)를 각각 생산할 수 있다. 그러나, 프로피오네이트 전구체[사과산염(malate) 및 푸마르산염(fumarate)]의 도입은 메탄 생산에서 가변적인 효과(variable effects)를 산출하였고(Asanuma et al., 1999, Ungerfeld et al., 2007), 반추 위에서의 환원적 초산생성을 도입하기 위한 시도는, 메탄생성반응과 비교하였을 때, 수소에 대한 보다 낮은 친화도(affinity) 때문에, 지금까지는 실패하였다(Le Van et al., 1998).

메탄 방출 감소에 대한 또 다른 선택은 US 5,843,498 에 기재되어 있고, 이는 효과적인 성분(effective component), 시스테인 및/또는 이의 염으로서 이를 포함하는, 반추 위의 메탄생성반응을 감소시키고 사료 효율(feed efficiency)을 증진시키는 반추동물 사료 조성물에 관한 것이다.

연구 그룹 중 소수는 메탄을 감소시키는 사료 첨가제(methane reducing feed additive)로서 질산염의 가능성을 조사하고, 질산염의 첨가는 지속적으로 보다 낮은 메탄생성반응을 보인다(Guo et al., 2009, Sar et al., 2005, Takahashi et al., 1998).

반추 위에서 질산염에서 암모니아로의 환원(reduction) 때문에 중간물질(intermediate)로서 형성된 아질산염(nitrite)으로부터의 독성 효과(toxic effect)에 대한 일관된 연구결과 때문에, 반추 위에서 메탄생성반응을 감소시키기 위한 대체 가능한 수소 싱크(hydrogen sink)로서의 질산염(NO3)을 도입하기 위한 가능성은 크게 무시되었다(Lewis, 1951). 반추동물에서 질산염의 높은 복용량(doses)은 동물의 조직에 대한 산소 수송에 대한 혈액의 능력(capacity)을 감소시켜 메트헤모글로빈혈증(methemoglobinemia)을 야기하는 것으로 보고되었다. 게다가, 반추 위에서 아질산염 축적은 반추 위에서 미생물 활성도(microbial activity)를 감소시키는 것으로 알려져있고, 그 중에서도 동물에 의한 사료 섭취를 감소시킬 수 있다.

발효에서의 아질산염의 저해 효과(inhibitory effect)를 완화시키기 위해서, 반추동물에 포름산염(formate), 락테이트(lactate) 또는 푸마르산염(fumarate)을 주어 높은 질산염을 공급하는 것을 제시하였다(Iwamoto, 1999; Iwamoto, 2001). 질산염 및 GOS 또는 니신(nisin)의 동시 투여는, 질산염을 단독 처리하였을 때와 비교하여, 낮은 수준에서 반추 위 메탄생성반응을 유지하면서 반추 위 및 플라즈마의 보다 낮은 농도의 아질산염(plasma nitrite) 및 메트헤모글로빈(methemoglobin)에 대해 효과적인 측정으로서 또한 보고되었다(Sar, 2004).

프로바이오틱스(probiotics)를 사용한 아질산염 환원(reduction)의 가속(Acceleration)은 또한 대규모 연구의 주제이다. US 특허 번호 제6,120,810호는 아질산염 환원 미생물 프로피오니박테리움 아키디프로피오니키( Propionibacterium acidipropionici)의 유효량을 포함하는 조성물을 동물에게 투여하여 질산염에 의한 반추동물의 중독(intoxication)을 감소시키는 것을 알 수 있다. 유럽 특허 출원 번호 제1 630 226호는, 장내 박테리아(intestinal bacteria), 코리네형 박테리아(coryneform bacteria), 고초균(Bacillus subtilis), 속 메틸로필루스(genus Methylophilus)의 박테리아, 방선균(Actinomyces), 반추 위 박테리아(ruminal bacteria) 및 이의 컴비네이션(combinations)으로부터 선택된, 아질산염 환원효소 활성도(nitrite reductase activity)를 갖는 미생물(microbe)을 포함하는 반추동물에 대한 사료 조성물을 나타내었다. 질산염이 반추동물에서 메탄생성반응을 저해하는데 사용되었을 때, E. Coli W3110 가 중독(intoxication)을 약화시키는데 사용될 수 있음이 또한 보고되었다(Sar, 2005).

질산염 감소에서의 황 화합물(sulphur compounds), 구리 및 텅스텐(tungsten)의 억제 효과(Inhibitory effects)가 연구되었다(Takahashi, 1989). 저자는, 거세한 숫양(wether)에 적응된 질산염으로부터의 반추 위액(rumen fluid)(매일 두 번 체중 당 0.55 g NaNO3/kg)에서의 아질산염 발효는 황산염-S(Sulphate-S) 또는 아황산염-S(sulphite-S)와 함께 배양하여도 영향을 미치지 않았다. S-함유 아미노산 중에서, 메티오닌은 질산염의 미생물적인 환원(microbial reduction)을 저해하는데 비효율적인 점을 입증하는 반면에, 시스테인은 아질산염 형성을 현저하게 낮춘다. 이러한 공개에서는 어떠한 메탄생성반응의 감소된 효과와 관련되지 않거나 다루지 않았다. 아질산염 축적(nitrite accumulation)을 예방하는 시스테인의 유효성은 나중 연구에서 확인되었다(Takahashi, 1991; Takahashi 1998).

아질산염 축적과 관련된 특정한 문제를 피하거나 또는 극복하면서 메탄생성반응을 추가적으로 감소시키는데 사용되기 위한 조성물 및 처리물(treatments)을 제공하기 위한 것이 본 발명의 주요한 목적이다.

본 발명의 요약

하나의 양상에서, 본 발명은 질산염 환원성 경로(nitrate reductive pathways) 뿐만 아니라 황산염 환원성 경로(sulphate reductive pathways) 둘 다는, 실험적인 부분에서 자세하게 나타낸 바와 같이, 반추동물에서 위장의 메탄생성반응에서 보다 경쟁적이고(outcompete), 전적으로 첨가물(additive)로 개별적으로 사용되었을 때 질산염 및 황산염의 메탄생성반응 감소 효과를 수득한 발견(findings)에 있다. 질산염 및 황산염의 개별적인 효과는 독립적인 것으로 보였다.

동시에, 질산염 및 황산염의 복합 투여(combined administration)는, 실험적인 부분에서 보다 자세하게 나타낸 바와 같이, 질산염 단독으로 사용하였을 때 일반적으로 접하는 아질산염 중독(intoxication)의 잠재적인 문제를 방지하거나 또는 완화시키는데 충분히 효과적인 사실을 발견하였다.

놀랍게도, 질산염 투여는 장의 메탄생성균(methanogen) 총계(count)를 감소시키는 것으로 발견된 반면에, 황산염의 투여 또는 질산염 및 황산염의 컴비네이션의 투여는 그렇지 않았다. 그러나, 질산염 및 황산염의 컴비네이션을 투여하는 것은 전체 박테리아의 메탄생성균의 비율을 현저하게 감소시켰다.

본 발명의 범위가 어떠한 근본적인 이론 또는 가설에 의해 한정되지 않거나 축소되지 않을지라도, 질산염에 의한 메탄생성반응의 감소[방정식 1(equation 1)]가 질산염에서 암모니아의 환원에서 H₂ 의 대체 가능한 사용에 의해 생긴 것으로 알려져 있다. 반추 위에서 질산염 환원(Nitrate reduction)은 방정식 2 에 기재된 환원경로를 따르는 것으로 믿어진다. 8 몰의 H 가 질산염 환원 쪽으로 방향을 바꾸고(redirected), 이로 인하여 공급된 질산염의 각각 몰에 대한 1몰로 메탄 생산이 감소됨을 이론상으로 시사한다. 공급된 NO3 의 100 g 은 이러한 방식으로 25.8 g의 CH₄-환원을 유도한다.

CO₂ + 4H₂ → CH₄ + 2H₂O (방정식 1)

NO₃ ^- + 4H₂ + 2H⁺ → NH₄ ⁺ + 3H₂O (방정식 2)

질산염에서 암모니아의 환원은 CO₂ 에서 CH₄ 로의 환원보다 더 많은 에너지를 생산하고, 따라서 만약 충분한 질산염이 반추 위에서 이용될 수 있다면 H₂-처리(disposal)의 주요한 경로임을 예측할 수 있다. NO₃ 에서 NH₃ 로의 완전한 환원은 8 개의 전자를 소비하고, 따라서 환원된 질산염의 각각의 몰은 1 몰의 메탄으로 메탄 방출(methane emissions)을 보다 낮출 수 있다. 반응의 최종 산물(end product)인 암모니아는 낮은 단백질 사료(low protein diets)를 공급하는 반추동물에 대한 소중한 영양소로 고려될 수 있다.

상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명자는, 황산염이 이 자체로 또한 질산염 환원의 독립된 메카니즘(mechanism)에 의한 메탄 방출을 감소시키는데 있어서 효과적인 강한 환원제(strong reductant)임을 발견하였다. H₂S 에 대한 황산염 환원(방정식 3)은 또한 8 개의 전자를 소비하고, 따라서 몰 당 질산염으로서 메탄 방출을 감소시키기 위한 동일한 포텐셜(same potential)을 제공한다.

SO₄ ² ^- + 4H₂ + 2H⁺ → H₂S + 4H₂O (방정식 3)

황산염이 메탄생성반응을 감소시키는데 또한 효과적인 사실은, 열역학적 관점(thermodynamic perspective)으로부터 황산염 환원이 메탄생성반응보다 보다 호의적인 것으로 보이는 이러한 사실로부터 설명될 수 있다. 화학량론적으로(Stochiometrically), 100 g 황산염에서 황화수소로의 완전한 환원은 16.7 g 의 CH₄-생산을 감소시킬 수 있다.

황화수소(H₂S)는 NO₂ 에서 NH₄ ⁺ 로의 환원에 있어서 전자 공여체(electron donor)로서의 역할을 하는 것으로 나타났고, 따라서 황화수소를 갖는 사료(diet)의 보충(supplementation)은 반추 위에서의 아질산염 축적의 경감을 추가적으로 야기한다.

아질산염을 환원시키는 프로바이오틱 미생물의 유효한 양의 추가적인 투여에 의해 추가적으로 향상될 수 있는 결과를 또한 발견하였다. 실험적인 부분에서 자세하게 나타낸 바와 같은, 초기의 지체(initial delay)는, 사료 섭취(feed intake) 후에 즉시 H₂S 유효성(availability)에서의 지체에 의해 설명될 수 있는, 황산염에 의한 아질산염 환원의 시작(onset)에서 관찰되었다. 이는 결과적으로(in turn) 사료 섭취에서의 환원의 원인일 수 있고, 따라서 이는 이를 방지하기 위한 본 발명의 추가적인 목적이다. 실험적인 부분에서 보다 자세하게 나타낸 바와 같이, 본 발명자는, 이는 특정한 아질산염을 환원시키는 프로바이오틱 미생물(nitrite reducing probiotic microorganisms)의 공동-투여(co-administration)에 의해 실현될 수 있음을 발견하였다.

도 1 은, 질산염 화합물, 황산염 화합물 또는 질산염 화합물 및 황산염 화합물의 컴비네이션으로 보충된, 세 가지 실험 사료(experimental diets) 중의 하나 또는 기초 사료(basal diet)를 수컷 텍셀 크로스 양(male Texel cross lambs)에게 주어서 24 시간의 코스(course) 상에서 메탄 생산(l/hr)을 나타낸 그래프이다.
도 2 는, 질산염 화합물, 황산염 화합물 또는 질산염 화합물 및 황산염 화합물의 컴비네이션으로 보충된, 세 가지 실험 사료 중의 하나 또는 기초 사료를 수컷 텍셀 크로스 양(male Texel cross lambs)에게 주어서 24 시간의 코스(course) 상에서 산소 소비(l/kg MW/hr)를 나타낸 그래프이다.
도 3 은, 질산염 또는 질산염 및 증가된 양의 황산염의 세 가지 컴비네이션 중의 하나로 보충된, 4 가지 실험 데이터 중 하나를 제공한 소(cow)의 혈액에서의 메트헤모글로빈의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 4 는, 다양한 테스트 산물로 반추 위 모의실험(rumen simulation)에서의 가스 생산을 나타낸 것이다. 패널(Panel) A 내지 C 는 나타낸 시점에서의 누적된 가스 생산을 나타낸다. 에러 바(error bar)는 반복된 시뮬레이션 혈관(simulation vessels) 사이의 SE 를 나타내고, 티-테스트(t-test)에서의 대조군["없음(none)"으로 나타냄]을 포함하는 Ca(NO3)2 + MgSO4 에 대한 통계적인 차이(statistical difference)에 별표(asterisks)를 붙였다.
도 5 는, 다양한 테스트 산물로 반추 위 모의실험에서의 메탄 생산을 나타낸 것이다. 패널 A 는 12 시간 시물레이션 후의 누적된 메탄 생산을 나타내고, 패널 B 는 전체 생산된 가스에서의 메탄의 비율을 나타낸 것이다. 에러 바는 반복된 시뮬레이션 혈관 사이의 SE 를 나타내고, 티-테스트(t-test)에서의 대조군("없음"으로 나타냄)을 포함하는 Ca(NO3)2 + MgSO4 에 대한 통계적인 차이에 별표(asterisks)를 붙였다.
도 6 은, 다양한 테스트 산물로 반추 위 모의실험에서 질산염의 잔류 농도(residual concentration)를 나타낸 것이다. 패널 A 내지 C 는 발효 2, 4 및 12 시간 후의 각각의 잔류 농도를 나타낸 것이다. 에러 바는 반복된 시뮬레이션 혈관 사이의 SE 를 나타내고, 티-테스트(t-test)에서의 대조군("없음"으로 나타냄)을 포함하는 Ca(NO3)2 + MgSO4 에 대한 통계적인 차이에 별표(asterisks)를 붙였다.
도 7 은, 다양한 테스트 산물로 반추 위 모의실험에서 아질산염의 잔류 농도를 나타낸 것이다. 패널 A 내지 C 는 발효 2, 4 및 12 시간 후의 각각의 아질산염의 잔류 농도를 나타낸 것이다. 에러 바는 반복된 시뮬레이션 혈관 사이의 SE 를 나타내고, 티-테스트(t-test)에서의 대조군("없음"으로 나타냄)을 포함하는 Ca(NO3)2 + MgSO4 에 대한 통계적인 차이에 별표(asterisks)를 붙였다.
도 8 은, 다양한 테스트 산물로 반추 위 모의실험에서 암모늄(ammonium)의 잔류 농도를 나타낸 것이다. 패널 A 내지 C 는 발효 2, 4 및 12 시간 후의 암모늄의 잔류 농도를 나타낸 것이다. 에러 바는 반복된 시뮬레이션 혈관 사이의 SE 를 나타내고, 티-테스트(t-test)에서의 대조군("없음"으로 나타냄)을 포함하는 Ca(NO3)2 + MgSO4 에 대한 통계적인 차이에 별표(asterisks)를 붙였다.

본 발명의 첫 번째 양상은 질산염 화합물 및 황산염 화합물의 컴비네이션의 10 내지 100 % 를 포함하는 동물 사료 보충물(animal feed supplement)에 관한 것이다.

본원 및 이의 청구범위에서, 동사 "포함하다(to comprise)" 및 이의 활용형(conjugations)은, 그 항목(items)은 다음의 단어를 포함하지만, 이는 분명하게 언급되지 않는 항목을 배제하지 않는 한정되지 않는 의미(non-limiting sense)로 사용되었다. 게다가, 분명하게 규정되지 않는 관사(indefinite article) "a" 또는 "an" 는, 요소(elements)의 오직 하나 및 하나임 문맥에서 분명히 요구하지 않는 한 요소의 하나 이상 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, 분명하게 규정되지 않는 관사 "a" 또는 "an" 는 "적어도 하나"를 일반적으로 의미한다.

사용된 바와 같이, 본원에서 용어 "동물 사료 보충물(animal feed supplement)"은, 예비 배합물 또는 보충물이 본 발명에 부합되게 보충된 사료를 형성하기 위한 동물의 먹이 또는 양(ration)을 첨가할 수 있는, 유효성분(active ingredients)을 포함하는 농축 예비배합 첨가제(concentrated additive premix)를 나타낸다. 용어 "동물 사료 예비 배합물(animal feed premix)", "동물 사료 보충물" 및 "동물 사료 첨가물(animal feed additive)"은 유사하거나 동일한 의미를 갖는 것으로 일반적으로 간주되고, 일반적으로 교체하여 사용할 수 있는 것으로 간주된다. 일반적으로, 본 발명의 동물 사료 보충물은 분말(powder) 또는 압축형(compacted) 또는 과립형 고체(granulated solid)의 형태이다. 특히, 가축에게 배급량(ration)에 이를 직접적으로 첨가, 예를 들어 소위 배급량에 비료를 뿌려서(top-dress) 동물 사료 보충물을 일반적으로 먹이거나, 또는 본원에서 이후에 보다 상세하게 나타낸 바와 같이, 이를 혼합 동물 사료(compounded animal feeds) 또는 릭 블록(lick blocks)과 같은 생산물의 제조(manufacture) 또는 물질(preparation)에 사용될 수 있다. 본 발명은 이러한 측면으로 특히 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 보충물을 16 내지 2500 g/동물/일의 범위의 양으로 동물에게 일반적으로 먹인다.

본 발명의 동물 사료 보충물은 질산염 화합물, 일반적으로 생리학적으로 허용가능한(physiologically acceptable) 또는 용인된(tolerated) 질산염 화합물을 포함한다. 본 발명에 따라서, 질산염-N 은 반추 위 또는 장내 미생물(gut microorganisms)에 의한 환원(reduction)에 손쉽게 이용될 필요가 있고, 질산염 화합물은 물에 충분한 용해도(solubility)를 가져야 한다. 이런 이유로, 본 발명에 따라서, 질산염 화합물은 바람직하게 이온성 질산염 화합물(ionic nitrate compound)이고, 가장 바람직하게 질산나트륨(sodium nitrate), 질산칼륨(potassium nitrate), 질산칼슘(calcium nitrate), 질산암모늄(ammonium nitrate)과 같은 무기질 질산염(inorganic nitrate salt)이고, 이들의 모두는 표준 온도 및 압력에서 물에서 쉽게 용해된다. 게다가 건강 및 안전성 관점(safety perspective)에서, 상표명 'Calcinit'의 Yara 로부터 상업적으로 입수가능한, 화학식 5·Ca(NO₃)₂·NH₄NO₃·10H₂O 에 의해 나타낸 화합물로서의 복합 무기물 질산염(complex inorganic nitrate salts)을 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다.

본 발명의 동물 사료 보충물은 또한 황산염 화합물, 일반적으로 생리학적으로 허용가능한 또는 용인된(tolerated) 황산염 화합물을 포함한다. 본 발명에 따라서, 황산염 화합물은 바람직하게 이온성 황산염 화합물이고, 가장 바람직하게 무기질 황산염(inorganic sulphate salts)으로부터 선택된 것이고, 이들은 물에 용해성이 높다. 예외(Exceptions)는 황산칼슘을 포함한다. 본 황산염 화합물은 황산소다(sodium sulphate), 황산칼륨(potassium sulphate), 황산 마그네슘(magnesium sulphate), 황산염아연(zinc sulphate), 황산망간(manganese sulphate), 황산구리(copper sulphate) 및 황산제일철(ferrous sulphate)을 포함하는 용해성 있는 무기질 황산염(soluble inorganic sulphate salts)의 군으로부터 선택된 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서, 보충물은 10 내지 100 wt% 의 범위의 양으로 질산염 화합물 및 황산염 화합물의 컴비네이션을 포함하고, 상기 양은 바람직하게 건조 무게당 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97 또는 99 wt% 을 초과한다.

부분적으로 본 발명은 반추 동물에서 위장의 메탄생성반응을 감소시키는 목적에 대한 결과를 주기 때문에, 질산염 및 황산염은 부분적으로 교체할 수 있고(interchangeable), 보충물에서 질산염 및 황산염 사이의 몰 비율(molar ratio)은 일반적으로 100:1 내지 1:50, 보다 바람직하게 50:1 내지 1:10, 25:1 내지 1:5, 또는 10:1 내지 1:2.5 및 가장 바람직하게 5:1 내지 1:1 의 범위일 수 있다.

본 발명의 사료 보충물에서의 질산염 화합물 및 황산염 화합물의 컴비네이션의 총량은 건조 무게당 50 g/kg 을 초과하는 양으로 투여된다. 바람직한 실시형태에서, 상기 질산염 및 황산염의 총량은 75 g/kg, 보다 바람직하게 90 g/kg, 가장 바람직하게 100 g/kg 을 초과한다. 특히, 상기 양은 일반적으로 750 g/kg 미만(below)이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 사료 보충물에서의 황산염의 양은 건조 무게당 25 g/kg, 보다 바람직하게 40 g/kg, 가장 바람직하게 50 g/kg 을 초과한다. 일반적으로 상기 양은 250 g/kg 을 초과하지 않고, 바람직하게 이는 200 g/kg 을 초과하지 않고, 가장 바람직하게 이는 165 g/kg을 초과하지 않는다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 사료 보충물에서의 질산염의 양은 건조 무게당 20 g/kg, 보다 바람직하게 30 g/kg, 가장 바람직하게 40 g/kg 을 초과하지 않는다. 일반적으로 상기 양은 건조 무게당 600 g/kg 미만, 보다 바람직하게 550 g/kg 미만이다.

본원에서 사용된 바와 같은 '질산염' 및/또는 '황산염'의 모든 양 및/또는 복용량(dosage)은, 달리 나타내지 않는 한 본 분야의 숙련자에 의해 이해될 수 있는 조성물의 전체 건조 중량(total dry weight)에 대해서 질산염 및/또는 황산염 화합물에 의해 제공되거나 또는 포함된 질산염 및/또는 황산염의 중량을 나타낸다. 특정한 유형의 동물 및 이를 유지하는 환경을 고려하여, 공급량(ration) 또는 혼합 동물 사료(compounded animal feed)에 사용될 수 있는 보충물의 양 및 보충물에 포함될 수 있는 성분(components)의 정확히 이상적인 양을 결정하는 것은 숙련된 전문가의 범위 내이다. 각각의 성분의 바람직한 복용량은 하기에 기재되어 있다.

본 발명의 동물 사료 보충물은 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않는 어떠한 추가적인 구성 요소(ingredient)를 포함할 수 있다. 이는 일반적으로 목적하는 생산물 형태(product form)를 제조하는데 필요한 공지된 부형제(excipient)를 포함할 수 있고, 이는 사료의 질(quality)을 개선 및/또는 보충물을 소비하는 동물의 실행(performance)을 개선시키는 것을 목표로 하는 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 부형제의 적절한 예는 담체(carrier) 또는 락토오스, 수크로스, 만니톨(mannitol), 녹말 결정질 셀룰로스(starch crystalline cellulose), 탄산수소나트륨(sodium hydrogen carbonate), 염화나트륨(sodium chloride) 등과 같은 충전제(filler) 및 아라비아고무(gum Arabic), 트래거캔스고무(gum tragacanth), 알긴산나트륨(sodium alginate), 녹말, PVP 및 셀룰로스 유도체 등과 같은 바인더(binder)를 포함한다. 본 분야의 숙련자에게 공지된 사료 첨가물의 예는 비타민, 아미노산 및 미량원소(trace elements), 소화율 개선제(digestibility enhancers) 및 장내 유익군 안정제(gut flora stabilizers) 등을 포함한다.

바람직한 실시형태에서, 동물 사료 보충물은 아질산염을 환원시키는 프로바이오틱 미생물(nitrite reducing probiotic microorganism)을 추가적으로 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은, 용어 '아질산염 프로바이오틱 미생물(nitrite probiotic microorganism)'은, 상기에 설명한 바와 같이 미생물에 충분한 양으로 투여하였을 때 반추 위 및/또는 소화관(gut)에서 누적된 아질산염을 암모늄으로 환원시켜, 숙주에 건강상의 이점을 부여하는 살아있는 미생물을 나타낸다. 이러한 아질산염을 환원시키는 미생물(nitrite reducing microorganisms)의 많은 예는 본 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 아질산염을 환원시키는 프로바이오틱 미생물의 바람직한 예는 아질산염 환원효소 활성도(nitrite reductase activity)를 갖는 반추 위 및 장 내 박테리아(intestinal bacteria), 프로피오니박테리움 아키디프로피오니키( Propionibacterium acidiproprionici ), 코리네형 박테리아(coryneform bacteria), 고초균( Bacillus subtilis ), 속 메틸로필루스(genus Methylophilus)의 박테리아, 방선균( Actinomyces ) 및 대장균( Escherichia coli ) W3110 을 포함한다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따라, 아질산염을 환원시키는 프로바이오틱 미생물은, Agtech Products Inc 로부터 'Bova-Pro^? concentrate'로서 상업적으로 입수가능하고, American Type Culuture Collection(ATCC)의 미생물 컬렉션(collection)에서의 접근 번호(accession number) 55467 하에 등록된, 메가스피라 엘스데나이( Megasphaera elsdenii ), 특히 이의 반추 위의 스트레인(ruminal strains), 및 프로피오니박테리움 아키디프로피오니키, 특히 프로피오니박테리움 아키디프로피오 니키 스트레인 P5 의 군으로부터 선택된다.

바람직한 실시형태에서, 본원에 상기에 기재된 바와 같은 동물 사료 보충물은, 건조 무게당 1.0*10⁸내지 1.0*10¹⁴ cfu/kg, 보다 바람직하게 1.0*10⁹내지 1.0*10¹³cfu/kg, 가장 바람직하게 1.0*10¹⁰내지 1.0*10¹² cfu/kg, 예를 들어 1.0*10¹¹cfu/kg 의 양으로 상기 아질산염을 환원시키는 프로바이오틱 미생물을 추가적으로 포함하는 것을 제공한다. 본 분야에서의 숙련자에게 공지된 바와 같이, 집락형성단위(colony-forming unit, CFU)는 독자 생존 가능한(viable) 박테리아 또는 진균(fungal) 수의 측정이다. 모든 세포의 사멸 및 생존을 계산하는 직접적인 현미경을 이용한 계수(direct microscopic counts)와는 달리, CFU 는 독자 생존 가능한 세포를 측정하고, 예를 들어 아가(agar) 또는 트립티케이스 대두 아가 플레이트(trypticase soy agar plate)에서의 (희석시킨) 샘플(sample)을 성장시키고(expanding), 따라서 수득된 콜로니를 계수하여 측정한다.

더욱이, 본 발명자는, 젖산 또는 락테이트 화합물(lactate compound)을 투여하였을 때, 좋은 결과를 수득할 수 있는 것을 발견하였다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이지 않고, 젖산 또는 락테이트를 보충하는 것(lactate supplementation)은 프로바이오틱 미생물의 유효성을 증진시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 이런 이유로, 바람직한 실시형태에서, 본원에 상기에 기재한 바와 같이 혼합 동물 사료(compounded animal feeds)는 유효량의 락테이트 또는 젖산을 추가적으로 포함하는 것을 제공하고, 바람직하게 이는 건조 무게당 20 g/kg, 보다 바람직하게 30 g/kg, 가장 바람직하게 40 g/kg 을 초과하는 양으로 젖산 또는 락테이트를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양상은, 본원의 상기에 나타낸 바와 같은, 보충물을 포함하는 배합된 동물 사료 및 릭 블록(lick blocks)과 같은 생산물(products)에 관한 것이다.

이런 이유로, 하나의 양상에서, 혼합 동물 사료 조성물은 질산염 화합물 및 황산염 화합물의 컴비네이션을 포함하는 것을 제공하고, 상기 컴비네이션은 건조 무게당 10 g/kg 을 초과하는 질산염 및 황산염의 전체 총량을 제공한다.

본원에서 사용된 바와 같은, 용어 '혼합 동물 사료 조성물(compounded animal feed composition)'은, 동물 사료로서 사용하는데 적절하고, 다양한 천연 또는 비-천연 기초(non-natural base) 또는 가공되지 않은 물질(raw materials) 및/또는 첨가물(additives)과 혼합한 조성물을 의미한다. 이런 이유로, 특히, 용어 '혼합(compounded)'은 어떤 자연 발생적으로 생기는 가공되지 않은 물질(any naturally occurring raw material)과 구별되어 본원에서 사용되었다. 이러한 혼합물 또는 혼합 사료는 목표 동물(target animal)의 특정한 필요조건(specific requirements)에 따라 제형화되었다. 상업적으로 제조된 혼합 사료에 사용된 주된 성분은 밀기울(wheat bran), 쌀겨(rice bran), 옥수수 가루(corn meal), 보리(barley), 밀(wheat), 호밀(rye) 및 귀리(oat)와 같은 곡물(cereal grains), 대두박(soybean meal), 알팔파가루(alfalfa meal), 밀 분말(wheat powder) 등을 일반적으로 포함한다. 상업적인 화합물 먹이(commercial compound feed)는, 본 발명이 이러한 측면에서 특히 한정되지 않을지라도, 자그마치(no less than) 15 % 의 미가공 단백질(crude protein) 및 자그마치 70 % 의 소화하기 쉬운 전체 영양소(digestible total nutrients)를 일반적으로 포함할 수 있다. 반고체(semi-solid) 뿐만 아니라 액체, 고체의 혼합 동물 사료 조성물은 본 발명의 범위 내에 포함되고, 고체 및 반고체 형태가 특히 바람직하다. 이러한 조성물은 으깬 곡물 유형(meal type), 펠렛(pellets) 또는 크럼블(crumbles)로서 일반적으로 제조될 수 있다. 실제로, 가축에게, 본 발명의 이러한 것과 같은 혼합 사료의 컴비네이션, 및 사일리지(silage) 또는 건초 등을 일반적으로 먹을 수 있다. 일반적으로 혼합 동물 사료는 0.3 내지 10 kg/동물/하루의 범위 내의 양으로 공급된다. 본 분야의 숙련자는, 동물의 유형 및 이를 저장하는 환경을 고려하여, 혼합 동물 사료에 포함될 수 있는 이러한 성분의 적절한 양을 결정할 수 있다.

본 발명의 혼합 동물 사료에서의 질산염 화합물 및 황산염 화합물의 컴비네이션은 건조 무게당 10 g/kg 을 초과하는 질산염 및 황산염의 총량을 일반적으로 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 총량의 질산염 및 황산염은 15 g/kg, 보다 바람직하게 17.5 g/kg, 가장 바람직하게 20 g/kg 을 초과한다. 실제로, 상기 양은 750 g/kg 미만, 바람직하게 500 g/kg 미만, 보다 바람직하게 250 g/kg 미만이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 혼합 동물 사료에서의 황산염의 양은 건조 무게당 5 g/kg, 보다 바람직하게 7.5 g/kg, 10 g/kg, 또는 12 g/kg 를 초과한다. 일반적으로 상기 양은 200 g/kg 을 초과하지 않고, 바람직하게 이는 175 g/kg 을 초과하지 않고, 가장 바람직하게 이는 150 g/kg 을 초과하지 않는다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 혼합 동물 사료에서의 질산염의 양은 건조 무게당 5 g/kg, 보다 바람직하게 7.5 g/kg, 가장 바람직하게 10 g/kg 을 초과한다. 일반적으로 상기 양은 건조 무게당 600 g/kg 미만, 보다 바람직하게 500 g/kg 미만, 가장 바람직하게 250 g/kg 미만이다. 게다가, 바람직한 실시형태에서, 본원에서 상기에 나타낸 바와 같은 혼합 동물 사료는 1.0*10⁸-1.0*10¹⁴ cfu/kg, 보다 바람직하게 1.0*10⁹-1.0*10¹³cfu/kg, 가장 바람직하게 1.0*10¹⁰-1.0*10¹² cfu/kg 의 양으로 아질산염을 환원시키는 프로바이오틱 미생물을 추가적으로 포함하는 것을 제공한다. 게다가 바람직한 실시형태에서, 본원에서 상기에 나타낸 바와 같은 혼합 동물 사료는 락테이트 또는 젖산의 유효량, 바람직하게 5 g/kg, 보다 바람직하게 7.5 g/kg, 가장 바람직하게 10 g/kg 을 초과하는 양으로 추가적으로 포함되는 것을 제공한다.

본 발명의 혼합 동물 사료 조성물은 본 분야에서 일반적으로 사용된 어떠한 추가적인 사료 첨가물(feed additive)을 포함할 수 있다. 본 분야의 숙련자에의해 공지된 바와 같이, 본원에서의 용어 '사료 첨가물'은 사료의 질(quality) 및 동물 기원(animal origin)으로부터의 음식의 질을 증진시키거나, 예를 들어 사료 물질(feed materials)의 증진된 소화성(digestibility)을 제공하는 동물의 수행력(animals' performance)을 증진시키기 위한 목적으로 동물 영양 처리 과정(animal nutrition)에 사용된 생산물을 나타낸다. 이로 제한되지 않은 예는 보존제(preservatives), 산화방지제(antioxidants), 유화제(emulsifiers), 안정제(stabilising agents), 산도 조절제(acidity regulators) 및 사일리지 첨가제(silage additives)와 같은 기술적인 첨가제(technological additives); 감각 작용과 관련된 첨가제(sensory additives) 특히 향미제(flavours) 및 착색제(colorants); 비타민, 아미노산 및 미량원소(trace elements)와 같은 (추가의) 영양상의 첨가제; 및 소화율 증진제 및 장내 유익균 안정제(gut flora stabilizers)와 같은 (추가적인) 축산 첨가제를 포함한다.

본 분야에서의 숙련자에 분명한 바와 같은, 본 혼합 동물 사료 조성물은 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않는, 모든 추가적인 성분(ingredient) 또는 첨가제를 포함할 수 있다.

추가적인 양상에서, 본 발명은, 본 발명의 보충물을 포함하는 릭 스톤(lick stone) 또는 릭 블록(lick block)을 제공한다. 본 분야의 숙련자에게 공지된 바와 같은, 이러한 릭 스톤 또는 블록은 자연적이고 경작된 목초지(natural and cultivated pastures) 또는 자연적이거나 경작된 목초지에 방목된 반추동물에 대한 무기질 공급제(mineral supplements)(뿐만 아니라 단백질 및 탄수화물)를 공급하기에 특히 편리하다. 본 발명에 따른 이러한 릭 블록 또는 릭 스톤은, 질산염 화합물 및 황산염 화합물의 컴비네이션 및 본 발명의 선택적인 아질산염을 환원시키는 프로바이오틱 미생물, 다양한 유형의 바인더(binders), 예를 들어 시멘트(cement), 석고(gypsum), 석회(lime), 인산칼슘, 탄산염(carbonate) 및/또는 젤라틴(gelatin); 및 비타민, 미량원소, 무기염(mineral salts), 감각 작용과 관련된 첨가제(sensory additives) 등과 같은 선택적으로 추가적인 첨가제를 일반적으로 포함한다.

본 발명의 릭 블록에서의 질산염 화합물 및 황산염 화합물의 컴비네이션은 건조 무게당 15 g/kg 을 초과한 질산염 및 황산염의 총량을 일반적으로 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 질산염 및 황산염의 상기 총량은 25 g/kg, 보다 바람직하게 30 g/kg 을 초과한다. 실제로, 상기 양은 일반적으로 450 g/kg 미만, 바람직하게 400 g/kg 미만이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 릭 블록에서 황산염의 양은 건조 무게당 3 g/kg, 보다 바람직하게 5 g/kg, 가장 바람직하게 6 g/kg 을 초과한다. 일반적으로 상기 양은 150 g/kg 을 초과하지 않고, 바람직하게 이는 100 g/kg 을 초과하지 않고, 가장 바람직하게 75 g/kg 을 초과하지 않는다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 릭 블록에서의 질산염의 양은 건조 무게당 10 g/kg, 보다 바람직하게 20 g/kg, 가장 바람직하게 25 g/kg 을 초과한다. 일반적으로 상기 양은 건조 무게당 400 g/kg 미만, 보다 바람직하게 300 g/kg 미만이다. 바람직한 실시형태에서, 본원에서 상기 나타낸 바와 같은 릭 블록은, 1.0*10⁸내지 1.0*10¹⁴ cfu/kg, 보다 바람직하게 1.0*10⁹내지1.0*10¹³cfu/kg, 가장 바람직하게 1.0*10¹⁰내지 10*10¹² cfu/kg 의 양으로 아질산염을 환원시키는 프로바이오틱 미생물을 추가적으로 포함하는 것을 제공한다.

본 발명의 추가적인 양상은 반추동물에서의 위장의 메탄생산반응을 감소시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 질산염 화합물 및 황산염 화합물의 컴비네이션의 유효량을 반추동물에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 방법은 비치료적(non-therapeutic)이다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 '위장의 메탄생성반응 감소(reducing gastro-intestinal methanogenesis)'는 위장관(gastro-intestinal tract)에서의 메탄 가스 생산의 감소를 나타낸 것이다. 본원의 상기에 설명한 바와 같이, 반추동물의 반추 위 및 내장(gut)에서의 발효는 소위 메탄생성균에 의한 메탄 가스를 생산한다. 본 발명은 위장관으로부터 직접적으로 메탄 배출(methane excretion)되는 것을 감소시키기 위한 것과 같이, 이러한 작용을 감소시키는 것을 목표로 한다. 동물에 의한 메탄 배출을 평가하는 것은 본 분야의 숙련자의 기량(skill) 및 지식 내이다. 상기에 설명한 바와 같이, 반추 위 및 내장에서의 메탄 생산은 건강한 동물에서 일반적으로 발생하는 과정(process)이고, 메탄생성반응을 감소시키는 것은 반추동물의 건강 또는 웰빙(well-being)한 일반적인 상태를 향상 또는 약화시키지 않는다. 그럼에도 불구하고, 질산염 화합물 및 황산염 화합물의 컴비네이션을 사용한 메탄 형성의 감소는 영양소 사용의 동물의 효율성을 증가시켜, 본 방법은 동물의 성장 및/또는 생산성(productivity)을 증진시킬 수 있다.

본 분야의 숙련자에 의해 쉽게 인지될 수 있는 바와 같이, 처리(treatment)의 본원 방법은 '고창증(bloat)'으로 알려진 질환(condition)을 치료하는데 효과적이지 않다. 고창증은 반추동물에서 가스 축적의 결과로서 반추 위의 비정상적인 팽창(abnormal distension)으로서 일반적으로 기재된 증상이다. 가스(이산화탄소, 메탄 및 그 밖의 가스)는 반추 위 발효 동안에 보통 생산되고, 가스 축적을 방지하기 위해, 식도(oesophagus)를 통해 일반적으로 배출된다. 고창증의 발생 정도 동안에, 식도는 거품(foam)의 막(layer)에 의해 차단된다. 식도의 시작 부분(opening)은, 만약 액체(또는 거품)이 감지되면 식도를 차단하는 수용기(receptor)를 포함한다. 고창증 동안에 형성된 거품은 작은 사료 입자의 빠른 발효로부터 비롯된다. 고창증의 원인은 거품의 형성이고, 반추동물에게 자연적으로 발생하는 과정(naturally occurring process)인, 반추 위 가스의 생성이 아니다. 결과로서, 메탄 생성은 고창증의 원인으로 볼 수 없고, 메탄의 감소는 고창증의 치료로서 볼 수 없다. 고창증에 대한 치료상의 치료(treatment)는 반추 위에서의 거품 층의 형성을 예방 또는 이의 제거를 목표로 하고 있고, 반추 위 가스의 생산을 예방하는 것은 아니다. 게다가, 이산화탄소는 반추 위 발효 동안에 생성된 주요한 가스이다. 따라서 본 방법은 고창증 치료 또는 이의 증상을 완화시키는데 적절하지 않고 이를 의도하지 않는다.

따라서, 본원의 처리(treatment) 방법은 치료의 비치료적인 방법(non-therapeutic method)이고, 즉 상기 방법은 특정한 증상으로부터 고통받는 동물의 건강을 개선시키지 않고, 이는 특정 질병 또는 증상을 예방하지 않고, 즉 본원의 처리 방법을 받지 않는 반추동물과 비교해서 어떤 방식으로든 반추동물의 건강에 어떠한 정도로 영향을 끼치지 않았다. 본 방법의 장점은 상기에 설명한 바와 같이 환경적 및/또는 경제적인 측면으로 제한된다.

분류학상으로, 포유동물은, 반추 위로 알려진 동물의 첫 번째 위 내에서 이를 처음에 부드럽게 하고, 그 다음에 되새김질 거리(cud)로 알려진 반쯤-소화된 덩어리(semi-digested mass)를 역류시키고(regurgitating), 이를 다시 씹어서 식물-기초 음식을 소화시키는, 목(order) 우제류(Artiodactyla)의 포유동물이다. 식물 물질을 추가적으로 분해하고 소화를 자극하기 위한 되새김질 거리(cud)를 다시 씹는 과정은 "되새김질(ruminating)"이라고 불린다. 되새김질 포유동물은 소(cattle), 염소(goats), 양(sheep), 기린(giraffes), 들소(bison), 야크(yaks), 물소(water buffalo), 사슴(deer), 낙타(camels), 알파카(alpacas), 라마(llamas), 검은꼬리누(wildebeest), 영양(antelope), 가지뿔영양(pronghorn), 및 닐가이(nilgai)를 포함한다. 본 발명은 주로 길들인(domesticated) 반추동물을 처리하는 방법에 관한 것이고, 특히 이들은 상업적인 가축 사육(commercial livestock breeding)을 위해 수용되고 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 반추동물은 소, 염소, 양 및 물소(buffaloes)의 군으로부터 선택된 것이다.

본 발명의 바람직한 실시형태는 상기에 나타낸 바와 같은 방법을 제공하고, 여기에서 질산염 화합물 및 황산염 화합물의 컴비네이션은, 하루에 체중당 0.05 g/kg 을 초과하여 질산염 및 황산염의 전체 복용량(total dosage)을 제공하는 양으로 반추동물에게 투여되었다(administered). 바람직한 실시형태에서, 본 발명에서 질산염 및 황산염의 상기 전체 복용량은 하루에 체중당 0.05 내지 10 g/kg, 보다 바람직하게 하루에 체중당 0.1 내지 5 g/kg, 가장 바람직하게 하루에 체중당 0.2 내지 2.5 g/kg 의 범위 내이다.

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본원에 나타낸 바와 같은 방법은, 황산염의 복용량이 하루에 체중당 0.025 내지 1.8 g/kg 의 범위 내, 보다 바람직하게 하루에 체중당 0.05 내지 0.9 g/kg의 범위 내, 가장 바람직하게 하루에 체중당 0.1 내지 0.45 g/kg의 범위 내인 것을 제공한다.

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 방법은, 질산염의 복용량이 하루에 체중당 0.025 내지 8 g/kg의 범위, 보다 바람직하게 하루에 체중당 0.05 내지 4 g/kg 의 범위, 가장 바람직하게 하루에 체중당 0.1 내지 2 g/kg의 범위 내인 것을 제공한다.

하루에 몸무게 kg 당 양(the amount per kg body weight per day)으로서 본원에서 나타낸 바와 같은 복용량(dosages)은 주어진 처리 기간, 즉 처리한 일주일 또는 한 달 동안의 각각의 화합물의 평균 양에 관한 것이다. 따라서 화합물은 본원의 범위에서 벗어남이 없이, 매일, 이틀에 한 번(every other day), 삼일에 한 번(every other two days)씩 투여될 수 있다(administered). 바람직하게, 방법은 처방된 복용량(prescribed dosages)으로 질산염 화합물 및 황산염 화합물의 컴비네이션을 매일 투여(daily administration)하는 것을 포함한다. 보다 바람직하게, 컴비네이션은 동물에게 먹이면서 제공될 수 있고, 각각의 시점에서 동물에게 상기한 하루의 복용량(daily dosages)으로 산출된 양으로 먹인다.

상기에 설명한 바와 같이, 이들의 사료(diet)에서 사전에 질산염으로 적응시키지 않은 동물에서 질산염에서 아질산염으로의 환원시키는 반추 위 마이크로플로라(microflora)의 능력은, 아질산염을 암모니아로 환원시키기 위한 이들의 능력을 초과한다. 이는 반추 위에서 아질산염의 최종적인 축적(net accumulation)으로 야기되고, 이는 반추 위 벽을 가로질러 쉽게 흡수되고, 제1철(ferrous) 형태에서 제2철(ferric) 형태로, 조직에 산소를 수송할 수 없는 헤모글로빈 분자로 만드는 메트헤모글로빈(methemoglobin)으로 혈액 헤모글로빈을 전환시킨다. 결과적으로 생성된 증상(condition), 메트헤모글로빈혈증(methemoglobinemia)은 가벼운 경우에 동물의 수행력은 감소될 수 있지만, 심한 경우에 동물을 사망에 이르게 하는 일반적인 산소결핍증(anoxia)의 상태이다. 본 방법에서, 양(sheep)의 사료에서 세심한 질산염의 순차적인 도입(stepwise introduction)은 반추 위의 마이크로플로라가 적응되고, 질산염 및 아질산염 둘 다를 감소시키는 이들의 능력을 증가시킴을 본 발명자는 규명하였다. 높은 질산염 사료에 서서히 적응된 양(Sheep)은 메트헤모글로빈혈증(methemoglobinemia)의 임상증상(clinical signs)이 없는 것으로 나타났다. 이런 이유로, 본 발명의 바람직한 실시형태에서 방법은 질산염 적응의 첫 번째 단계(phase) 및 지속적인 처리의 두 번째 단계를 포함하고, 상기 첫 번째 단계는 둘 또는 그 이상, 바람직하게 셋 또는 그 이상, 적어도 3일, 바람직하게 적어도 4일, 가장 바람직하게 적어도 5일의 연이은 기간(consecutive periods)을 포함하고, 각각의 기간 동안의 질산염의 평균 하루의 복용량은 두 번째 단계 동안에 투여된 평균 하루의 복용량의 100 % 미만이고, 상기 각각의 기간 동안의 평균 하루의 복용량은 선행한 기간 동안의 평균 하루의 복용량 보다는 높았다. 바람직한 실시형태에서, 하나의 기간에서 다음 기간으로의 질산염의 평균 하루의 복용량에 있어서의 증가는 하루 체중당 1 g/kg 미만, 바람직하게 0.5 g/kg 미만, 보다 바람직하게 0.25 g/kg 미만, 가장 바람직하게 0.1 g/kg 미만이다. 바람직하게, 상기 두 번째 단계는, 0.15 내지 3 g/kg 체중의 범위 내의 평균 하루 복용량으로, 질산염 화합물 및 황산염 화합물의 컴비네이션을 투여하는 5, 10, 25, 50, 100, 250 또는 350 일 보다 많은 기간을 포함한다.

바람직한 실시형태에서, 초기 적응 단계를 갖거나 또는 갖지 않는 상기 나타낸 방법은 상기에 나타낸 바와 같은 아질산염을 환원시키는 프로바이오틱 미생물을 반추동물에게 투여하는(administering) 것을 또한 포함한다. 하루에 체중당 1.0*10⁵-1.0*10¹⁴ cfu/kg, 보다 바람직하게 하루에 체중당 1.0*10⁷-1.0*10¹³cfu/kg, 가장 바람직하게 하루에 체중당 1.0*10⁹-1.0*10¹² cfu/kg 의 양으로 상기 프로바이오틱 미생물을 투여하는 것이 특히 바람직하다. 바람직한 실시형태에서, 상기 방법은 젖산 또는 락테이트(lactate)의 투여(administration) 및 프로바이오틱 미생물의 투여를 포함한다. 하루에 체중당 적어도 0.025 g/kg, 보다 바람직하게 하루에 체중당 0.05 내지 5 g/kg, 가장 바람직하게 하루에 체중당 0.1 내지 2.5 g/kg 의 양으로 젖산 또는 락테이트를 투여하는 것이 특히 바람직하다.

본 방법은, 적어도 5, 10, 25, 50, 100, 250 또는 350 일 동안의 기간에 대한 상기에 기재된 투약 요법(dosage regimens)에 따른, 질산염 화합물, 황산염 화합물 및 선택적으로 아질산염을 환원시키는 프로바이오틱 미생물의 컴비네이션의 투여를 포함할 수 있다. 상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 흥미로운 측면은, 본 방법이 장의(enteric) 메탄생성반응을 감소시키는데 매우 지속적인 유효성을 제공하고, 즉 상기 효과는, 예를 들어 반추 위 또는 내장(gut) 미생물의 저항(resistance)을 증가시키는 결과로서 이에 의해 반추동물을 특히 실현가능하게 장기간 처리를 가능하게 하여, 처리의 확대된 기간 상에서 줄어들지 않는다.

상기로부터 분명히 나타낸 바와 같이, 본원의 방법은 질산염 화합물 및 황산염 화합물 및 선택적으로 아질산염을 환원시키는 프로바이오틱 미생물의 컴비네이션의 경구(oral) 투여를 포함한다. 바람직하게, 처리는 본원의 상기에 나타낸 바와 같은 혼합 동물 사료 조성물(compounded animal feed compositions) 및/또는 동물 사료 보충 생산물(animal feed supplement products)의 경구 투여를 포함하고, 그 밖의 액체, 고체 또는 반-고체의 경구적으로 삼킬 수 있는 조성물이라도 이는 본 분야의 숙련자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 범위로부터 벗어남이 없이 사용될 수 있다.

상기한 바에 따라서, 본 발명의 추가적인 양상은 반추동물에서 위장의 메탄 생산의 비치료적인 감소(non-therapeutic reduction)를 위한 질산염 및 황산염 화합물의 컴비네이션을 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다. 용도는, 하루에 체중당 0.05 g/kg 을 초과하는 질산염 및 황산염의 전체 복용량을 제공하는 양으로 반추동물에 질산염 및 황산염 화합물의 컴비네이션을 투여하는 것을 포함하는 것이 바람직하다. 바람직하게, 질산염 화합물 및 황산염 화합물은 상기 본원에 기재된 바와 같은 복용량으로 사용되었다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 용도는, 상기 본원에 기재된 바와 같은 복용량으로 아질산염을 환원시키는 프로바이오틱 미생물을 반추동물에게 투여하는 것을 추가적으로 포함한다. 여전히 보다 바람직하게, 상기 본원에 나타낸 바와 같은 조성물의 어떠한 것 중 하나의 용도는 반추동물에서 위장의 메탄 생산의 비-치료적인 감소를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양상은 질산염-보충된 반추동물의 치료상의 처리(therapeutic treatments)에 관한 것이다. 상기에 설명된 바와 같이, 반추동물의 질산염 보충(supplementation)은 위장 메탄생성반응을 낮추는데 도움이 되지만, 또한 아질산염 축적의 위험 또는 발생정도(incidence), 동물의 조직으로 산소를 수송하는 혈액의 능력을 감소시키는, 소위 '질산염 독성 증후군(nitrate toxicity syndrome)' 및/또는 '메트헤모글로빈혈증 (methemoglobinemia)'을 증가시킨다. 게다가, 반추 위에서 아질산염 축적은, 그 중에서도 동물에 의한 사료 섭취를 감소시킬 수 있는, 반추 위에서 미생물 활동도(microbial activity)를 감소시키는 것으로 알려졌다. 상기에 설명한 바와 같이, 바람직하게 아질산염을 환원시키는 프로바이오틱 미생물과 함께, 황산염 화합물의 이러한 질산염을 보충한 반추동물에 대한 투여가 이러한 부작용(adverse effect)을 서서히 감소시키거나 예방함을 본 발명자는 규명하였다.

이런 이유로, 본 발명의 양상은, 선택적으로 아질산염을 환원시키는 프로바이오틱 미생물의 유효량과 함께, 황산염 화합물의 유효량을 반추동물에 투여하는 것을 포함하는, 질산염이 보충된 반추동물(nitrate supplemented ruminants)에서의 아질산염 축적, '질산염 독성 증후군(nitrate toxicity syndrome)' 및/또는 메트헤모글로빈혈증을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양상은, 질산염이 보충된 반추동물(nitrate supplemented ruminants)에서 아질산염 축적, '질산염 독성 증후군' 및/또는 메트헤모글로빈혈증을 치료 또는 예방하는 방법에 사용되기 위한, 선택적으로 아질산염을 환원시키는 프로바이오틱 미생물과 함께, 황산염 화합물을 포함하는 조제용 물질(preparation)에 관한 것이다.

본 발명의 계속되는 또 다른 양상은, 질산염이 보충된 반추동물에서 아질산염 축적, '질산염 독성 증후군' 및/또는 메트헤모글로빈혈증을 치료 또는 예방하는 방법에 사용되기 위한 조제용 물질의 제조에 있어서, 선택적으로 아질산염을 환원시키는 프로바이오틱 미생물과 함께, 황산염 화합물의 용도에 관한 것이다.

상기에 나타낸 바에 따라, 아질산염 축적, '질산염 독성 증후군' 및/또는 메트헤모글로빈혈증을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법은, 황산염의 전체 복용량이 하루에 체중당 0.025 내지 1.8 g/kg, 보다 바람직하게 하루에 체중당 0.05 내지 0.9 g/kg, 가장 바람직하게 하루에 체중당 0.1 내지 0.45 g/kg 의 범위 내이고, 선택적으로 상기 프로바이오틱 미생물의 전체 복용량이 하루에 체중당 1.0*10⁵-1.0*10¹⁴ cfu/kg, 보다 바람직하게 하루에 체중당 1.0*10⁷-1.0*10¹³cfu/kg, 가장 바람직하게 하루에 체중당 1.0*10⁹-1.0*10¹² cfu/kg을 제공하는 충분한 양으로 상기 조성물을 투여하는 것을 일반적으로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 방법은 프로바이오틱의 투여 및 젖산 또는 락테이트의 투여를 포함한다. 하루에 체중당 적어도 0.025 g/kg, 보다 바람직하게 하루에 체중당 0.05 내지 5 g/kg, 가장 바람직하게 하루에 체중당 0.1 내지 2.5 g/kg 의 양으로 젖산 또는 락테이트를 투여하는 것이 특히 바람직하다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 '질산염이 보충된 반추동물(nitrate supplemented ruminant)'은 일반적으로 사료를 통해 질산염의 상당한 양을 제공받은 반추동물을 나타낸다. 바람직하게, 반추동물은, 보다 바람직하게 하루에 체중당 0.025 g/kg, 가장 바람직하게 하루에 체중당 0.05 내지 8 g/kg 의 양으로, 위장의 메탄생성반응을 낮추기에 충분한 양으로 보충된 질산염이다. 본 분야의 숙련자에 의해 이해된 바와 같이, 방법은, 그 밖의 목적, 또는 고의가 아닌(unintentionally) 예를 들어 환경 조건(environmental conditions)의 결과로서 질산염의 상당한 양을 제공받은 반추동물에서, 아질산염 축적, '질산염 독성 증후군' 및/또는 메트헤모글로빈혈증을 치료 또는 예방하는데 마찬가지로 적절할 수 있다.

상기에 나타낸 바와 같은 본 발명은, 이로 인하여 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아닌, 다음의 실험적인 부분에서 보다 상세하게 보여주고 설명될 것이다.

[ 실시예1 ]

메탄 경감( methane mitigation )에서의 질산염 및 황산염

물질 및 방법

동물 및 하우징( Housing )

현재의 실험에서, 규정식의(dietary) 질산염 및 황산염의 메탄을 감소시키는 특성(methane reducing properties)을 평가하였다. 질산염 및 황산염 둘 다를 4 주의 적응 기간 동안 사료(diet)에 서서히 도입하였다. 사료 섭취 및 성장을 실험 동안에 모니터하였다(monitored). 규정식의 질산염 및 황산염 둘 다는 장의 발효로부터 메탄 배출을 감소시키는 것으로 추측할 수 있다(hypothesized).

렐리스타트(Lelystad), WUR, Animal Care and Use Committee of the Animal Sciences Group은 이러한 실험의 실험 프로토콜(experimental protocol)을 승인하였다. 실험은 실험 시작에서 42.9 ± 4.3 kg(평균 ± 표준 편차) 무게의 20 마리 수컷 텍셀 크로스 램(Texel Cross lambs)을 사용하여 실시하였다. 규정식의 첨가물에 대한 4 주 적응기(adaptation phase) 동안에, 동물에게는 개별적으로 먹이를 먹는 것이 가능한 개별적인 새끼 우리(individual calf hutches)에 거처를 제공하였다. 양은 전체 실험 동안에 성장을 모니터하기 위한 매주 체중을 달았다.

적응 기간 후에, 4 마리의 동물[하나의 블록(one block)]을 가스의 교환(gaseous exchange)을 측정하기 위해 일주일 동안 간접적인 호흡 열량측정 체임버(indirect respiration calorimetry chambers)에 거처를 제공하였다. 그 다음 주에, 양의 새로운 블록을 각각의 주(week)의 체임버(chambers)에 넣었다. 사용된 호흡 열량측정 체임버를 Verstegen et al. (1987)에 상세하게 기재하였다. 온도를 15 ℃ 로 유지하였고, 상대 습도(relative humidity)를 70 % 에 맞추었다. 환기수(Ventilation rate)는 체임버의 하나의 유형(type)에 대해 70 l/min 이고, 그 밖의 유형에 대해 90 l/ min 이다.

체임버의 공기의 유입과 유출(air going into and out of the chambers)은 9 분 간격으로 CO₂, O₂ 및 CH₄ 에 대해 분석하였다. 이러한 가스의 순 생산(Net production) 또는 소비를 공기 흐름에 의해 증가된 유입된 공기와 유출된 공기 사이의 농도에서의 차이로부터 계산하였고, 그 뒤에 표준 상황(standard circumstances)으로 다시 계산하였다(0 ℃, 101 kPa, 수증기 없음).

실험 계획( Experimental design )

요인(factors)으로서 질산염 및 황산염을 가지고, 2 x 2 요인분석적 설계(factorial design)로서 실험을 설계하였다. 동물을 체중(weight)으로 차단하고(blocked), 그 다음에 블록(block) 내에서 4 가지의 규정식의 처리물 중 하나를 임의적으로 할당하였다: CON, NO₃, SO₄ 또는 NO₃+SO₄.

섭식( Feeding )

기초 사료(basal diet)는 DM-기준(DM-basis)으로 74 % 의 옥수수 사일리지(maize silage), 16 % 의 다져진 보리 짚(chopped barley straw), 9 %의 포름알데히드 처리된 대두박(formaldehyde treated soybean meal) 및 1 % 의 무기질 예비배합물(mineral premix)로 이루어졌다. 규정식의 첨가물은, 10 % 의 사료 DM(diet DM)으로 기초 사료에 첨가한 혼합물(표 1)에 포함되었다. 섭식하면서, 예비배합물을 사료(diet) 내로 손으로 혼합하였다(hand-mixed). 물은 실험 동안에 자유롭게 이용가능하다. 질산염은 상업적으로 이용가능한 소스(source)(Calcinit, Yara)로부터 입수가능하고, 추가된 SO₄를 무수 MgSO₄ 의 형태로 사료에 첨가하였다.

적응기(adaptation phase) 동안에, 양(sheep)을 일주일 당 25 % 의 단계에서의 실험 예비배합물(experimental premixes)에 도입하였다. 램(lambs)을 8시 30분에 하루에 한 번 먹였다. 아침 섭식 전에, 사료 빈(feed bins)으로부터 잔류사료(orts)를 제거하고, 자발적인 사료 섭취를 확인하기 위해 체중을 재었다. 호흡 체임버에서의 일주일(week) 동안은, 호흡 체임버에서 거주하기 전에 일주일 동안 블록(block) 내에 가장 작은 사료를 소비하는 동물에 의해 소비되는 사료의 95 % 로 사료 이용률(feed availability)을 제한하였다. 사료 제한은 메탄 생산에서의 효과와 DMI 에서의 첨가물의 효과 사이의 상호작용을 방지하기 위해 적용되었다.

실험 식단에서 질산염은 이소니트로겐어스 사료(isonitrogenous diets)를 유지하기 위해 조절된 사료(control diet)에서 요소에 대해 교환하였다. 석회석(Limestone) 처리(treatments) 사이의 동일한 Ca-섭취를 보장하기 위한 조절된 사료에 첨가하였다. 사료 사이의 유사한 Mg-수준(levels)을 획득하기 위해 MgO 를 사료에 포함시켰다. 사료에 대한 상이한 첨가 용량(volume)은 각각의 처리에 대해 상이하고, 목재 셀룰로스(wood cellulose)를 이에 대한 균형(balance)을 위해 사용하였다.

[표 1]

혈액, 반추 위( Rumen ) 및 간 샘플링( Liver Sampling )

혈액을 d2, d8, d15, d22 및 d28 에, 섭식 후에(post-feeding) 1, 3 및 5h 에 채취하였다(sampled). 2, 8, 15 및 22일 모두는 사료에서 실험 예비배합물(experimental premix)의 25 % 의 증가한 단계 후의 하루(1 day)이다. 28 일에, 램은 일주일 동안 100 % 의 규정식의 처리(dietary treatments)를 하였다. 혈액 샘플(Blood samples)은 헤파린을 포함하는 수집 튜브(heparin containing collection tubes)에 채취하였고, 샘플링(sampling) 후에 바로 냉장고(refrigerator)에 보관하였다. 샘플링한 날의 마지막에, 샘플을 분석하기 위해 보내고, 그 다음날 분석하였다. 혈액의 메트헤모글로빈 함량을 Evelyn and Malloy (1938)에 기재된 방법으로 측정하였다.

호흡 체임버에서 기간 완료 후에, 양을 도살하였고, 반추 위액 샘플(rumen fluid samples)(200 ml)을 도살 후에 되도록 빨리 반추 위로부터 채취하였다. 샘플을, 미생물의 발효를 정지시키기 위해 샘플링 후에 바로 얼음물에 담그고, 모든 샘플을 채취하자마자 냉동시켰다. 도살시, 간의 똑같은 샘플(duplicate samples)을 채취하고, 비타민 A 상태를 나중에 평가하기 위해 차갑게 식히고, 냉동시켰다.

결과 및 논의

적응 기간 동안의 혈액의 메트헤모글로빈 함량

최종 예비배합물 포함 비율(final premix inclusion rate)의 25 % 또는 50 % 를 갖는 사료의 보충(supplementation) 동안에, 어떠한 양도 양성 혈액 MetHb-함량(Hb 의 < 2 %)을 갖지 않았다. 75 % 의 포함 비율은 사료에 포함되었을 때, NO₃-사료(diet)에서의 한 마리의 양은 섭식 후 3h 에 양성으로 테스트되지만, 수치는 오직 3 % 의 Hb 이다. 양이 일주일(d28) 동안 100 % 의 포함 비율인 경우, NO₃-처리에서 두 마리의 양을 섭식 후에 3 h 에서 각각 7 % 의 MetHb-값 및 3 % 의 Hb를 갖는 양성으로 테스트하였다. 조절된 사료 및 사료를 포함하는 황산염 둘 다의 양(sheep)은, S 가 반추 위에서 아질산염의 환원에서 중요한 역할을 하는 것으로 가능하게 나타낸, 2 % 의 Hb[검출한계(detection limit)] 보다 높은 MetHb-수준을 갖지 않는다.

대략 4 주의 적응 기간은 아질산염 독성 및 메트헤모글로빈혈증과 연관된 어떠한 중요한 문제를 예방하는데 충분하였다. 유사한 결과(finding)는 Alaboudi and Jones (1985)에 보고되었다. DM 의 2.9 % 의 질산염 수준은 적응하지 않은 반추동물에 대한 치명적인 점을 고려한 것이지만, 적응(adaptation)은 반추 위 박테리아가 이들의 아질산염을 환원시키는 능력을 증가시킬 수 있게 한다.

규정식의 ( dietary ) 질산염 및 황산염에 대한 적응 동안의 사료 섭취 및 성장

사료 섭취는 NO₃ 또는 SO₄ 의 첨가의 결과로서 상이하지 않지만(표 2), 질산염의 모든 복용량(full dose)을 제공하였을 때, 보다 낮은 경향을 보였다. 그러나, 최종의 포함 비율(final inclusion rate)의 25 % 보다 많이 포함함에 따라, 사료 섭취는, NO₃ 의 포함의 결과로서 지속적으로 감소되었다(일주일 지난 후의 기간에 대략 9 %). 이러한 연구에서 사용된 적은 수의 동물은, 사료 섭취의 효과 상에서 결론(conclusions)을 도출하는 것(drawing)을 방해하지만, 일관되게 보다 낮은 사료 섭취는 무시되지 않아야한다. Bruning-Fann and Kaneene (1993)에는, 규정식의 질산염 수준이 3 % 의 사료 DM 을 초과하였을 때, 양(sheep)에서의 사료 섭취에서의 음성 효과를 관찰된 것에 대해 보고되었다. 사료 섭취에서의 이러한 감소는, Marais et al.(1988)에 의한 생체 외( in vitro )에서 나타낸 바와 같은, 세포벽 소화(cell wall digestion)의 아질산염-유도된 저해(nitrite-induced depression)에 관한 것일 것이다.

섭식(Feeding) NO₃ 또는 SO₄ 은 체중 증가에 영향을 미치지 않는다(표 3).

[표 2]

[표 3]

[표 4]

가스의 교환( gaseous exchange )에서 NO ₃ 및 SO ₄ 의 효과

호흡 체임버에서 결정된 가스의 유동(fluxes)을 표 4 에 나타내었다. 실험의 이러한 부분 동안에 적용된 제한된-섭식(limit-feeding)은 이러한 처리 사이의 매우 유사한 사료 흡수의 결과를 나타내었다. 메탄 생산은 사료에 대한 질산염의 소스(source)의 첨가의 결과로서 34 % 로 낮춘다.

본 실험에서 NO₃-처리한 양(sheep)은, 6.4 g으로 이론상으로 보다 낮은 메탄을 생산하고, 하루에 평균 24.9 g의 NO₃ 를 소비하였다. NO3-처리한 메탄 생산에서 실질적인 감소는, 5.8 g 의 CH4(CH₄ = 0.714 g/l)와 일치하는 8.1l이다. 따라서, 메탄 생산에서의 감소는, 이화적 질산염 환원(dissimilatory nitrate reduction)보다 그 밖의 과정에서의 질산염의 사용 또는 질산염에서 암모니아의 불완전한 환원(incomplete reduction)으로 설명될 수 있는, 화학량론(stoichiometry)에 의해 설명될 수 있는 것보다 실질적으로 다소 낮았다. 본 연구에서 사용된 질산염의 소스(nitrate source)는 매우 용해성이 있고, 이에 따라서, 대부분의 질산염은 반추 위에서 환원에 이용될 수 있는 것 같다. 그러나, 용해된 질산염의 대부분은 반추 위의 액체 상(liquid phase)에 있고, 이는 환원(reduced)되기 전에 반추 위에 전해지지 않을 것이다(pass out of).

황산염의 첨가는 하루의 메탄 생산에서의 19 % 의 감소(reduction)를 유도했다.

본 연구에서, SO₄-처리한 양(sheep)은 평균 27.0 g SO₄/day으로 소비되었고, 이는 4.5g 의 메탄 감소와 일치한다. 메탄 생산에서 실질적으로 관찰된 감소는 4 l 또는 2.9g 이다. 수소 싱크(hydrogen sink)로서의 SO₄에 대한 이론적인 능력에서의 차이 및 메탄 배출을 감소시키기 위한 이의 관찰된 능력은 반추 위에서 MgSO₄의 용해성에 있다.

SO₄-처리된 양(Sheep)은 사료에서 S의 상당한 양을 먹였다(feed)[7.4 g 첨가된(added) S/kg DM]. 이러한 수준은 NRC 에 의해 나타낸 바와 같은 상기 최대한의 권고(4 g/ kg DM)이다. 이러한 상한 치수(upper limit) 상의 섭식(Feeding)은, 반추 위의 상부 공간부분(headspace)에서 발생하는 H₂S 의 높은 수준 및 H₂S 의 그 다음의 흡입(inhalation) 때문에, 회백뇌연화증(polioencephalomalacia)의 위험을 증가시킨다. 그러나, 이러한 실험으로부터의 결과는, SO₄ 가 메탄 생산을 감소시키는데 효과적임을 나타낸다. 권고된 수준(2-4 g S/ kg DM) 내로 먹였을 때, 이는 SO4 는 메탄 생산에서 여전히 감소시키는 효과를 가질 것이다.

산소 소비 및 CO₂-생산은 질산염 처리의 결과로서 둘 다 보다 낮았다. 반추동물의 사료에서 질산염의 높은 복용량(doses)은, 동물의 조직에 산소를 수송하는 혈액의 능력을 감소시키는, 메트헤모글로빈혈증을 야기하는 것으로 보고되었다. 그러나, 이러한 실험에서, 혈액을 정기적으로 채취하였고, 약간의 상승된 MetHb-수준은 두 마리의 양에서만 발견되었고(최대 수준은 7 % 의 Hb임), 보다 낮은 O₂-소비를 설명하지 않는 것 같다. 보다 낮은 O₂-소비는, 질산염을 먹였을 때 상이한 대사(metabolism)를 반영할 것이다. Sar et al.(2004)는, BW 의 0.9 g NO₃/ kg⁰ ^.75 가 양에 반추 위 내로 복용되었을 때, 보다 낮은 O₂-소비 및 보다 낮은 CO₂-생산이 또한 관찰되었다. 이러한 연구에서, 상당한 보다 많은 질산염을 먹였지만(BW 의 1.4 g NO₃/ kg⁰ ^.75), 본 연구에서 MetHb-수준은 상당히 낮았다(Sar et al.의 본 연구에서18.4 % 의 Hb). 이는 아마도, 질산염이 반추 위 내에서 용액으로서 복용된 사실 및 Sar et al.(2004)의 연구에서의 적응기의 부재 때문이다. 또 다른 연구(Takahashi et al., 1998)에서, 1.5 g/ kg BW⁰ ^. ⁷⁵ 의 비율로 양의 반추 위 내에 복용된 NaNO₃ 는 본 연구에서 사용된 농도와 매우 유사하였다. 30 % 이상으로 구성된 MetHb 의 농도는 관찰되었고, 이러한 연구 데이터로부터 이는 각각의 10 % 에 대해서 MetHb 에서 증가되었고, 산소 소비는 10.3 % 로 감소되는 결론을 내렸다. 본 연구에서, 6 % 의 산소 소비에서의 감소가 관찰되었다. (Takahashi et al., 1998)에 의한 회귀방정식(regression equation)을 사용하여, 동물이 대략 5 % 의 MetHb-수준을 가짐을 의미한다. 두 마리의 동물에서, 유사한 수준(3 및 7 % 의 Hb)이 실질적으로 관찰되었다.

조절된 처리(control treatment)에서 메탄의 생산은 하루에 한 번 양의 제한된-사료(sheep limit-fed)에 대해서 일반적이다. 메탄 생산이 섭식 후 5 내지 6 h에 최대한의 메탄 생산에 도달하는 것을 계속해서 증가시킨 후 AM 8 시에 동물에게 사료를 주었다. 동물을 제한되게 먹이고(limit-fed), 하루에 한 번만 먹이기 때문에, 메탄 생산은 절정(peak) 후에 연속적으로 감소하였다. 식량(ration)에 질산염의 첨가는 현저하게 상이한 메탄 생산 패턴을 적용시켰다 ; 섭식 후 즉시 메탄 생산 비율은 보다 낮은 수준으로 남아있고, 이러한 기간 동안에 수소는 질산염 환원에 사용되고 이로 인한 메탄생성반응에 대한 H₂-유효성을 한정함을 추측할 수 있었다. 섭식 후의 10 시간에, 메탄 생산 비율은, 아마도 사료를 포함하는 질산염의 부재 및 H-싱크(H-sink)로서의 메탄생성반응의 복귀(return)를 반영하여, 조절된 처리와 더 이상은 상이하지 않았다. 메탄 생산이 질산염 섭식의 결과로서 섭식 후에 현저하게 보다 낮지만, 메탄 생산은 0 으로 결코 감소되지 않고, 질산염 환원 및 메탄생성반응이 동시에 발생하였다. 메탄 생산의 기초 수준(basal level)은 후장(hindgut) 발효로부터의 메탄 생산에 의해 최소한 부분적으로 설명될 수 있다. 질산염은 환원되지 않고 후장에 도달하고, 따라서 질산염 섭식은 위장관(gastrointestinal tract)의 이러한 부분에서 메탄 생산에 아마도 영향을 미치는 것 같다.

SO₄-처리로부터의 메탄 생산 비율은 조절된 처리(control treatment)와 상이하지 않지만, 전체 24 h-기간 상에서 조절된 처리 보다는 지속적으로 보다 낮아졌다. SO₄-처리는 NO₃ + SO₄-처리와 비교하였을 때도 마찬가지였다. 분명하게, 메탄 생산에서의 NO₃ 및 SO₄ 의 효과는 상호보완적이고(complimentary), SO₄의 효과는 SO₄ 를 포함하는 사료의 유효성(availability)에서 보다 적게 좌우되는 것처럼 보인다.

실험의 결과는, 기초 사료(basal diet) 또는 세 가지 실험 사료 중의 하나를 제공한 그룹(groups)에서의 24 시간 동안의 메탄 생산(l/hr)을 나타내는, 도 1 의 그래프에 또한 나타내었다.

24-h 기간의 코스( course ) 상의 산소 소비

AM 8 시에 섭식한 후 바로 산소 소비는 NO₃-처리에 대해서 10 내지 18 % 보다 낮았다. 처리 사이에(between) 산소 소비에서의 차이점은 PM 16시에 사라졌다. 이러한 현상은, NO₃-처리에 대해서 섭식 후의 기간에 현저하게 감소된 메탄 생산과 동시에 일치한다. 이러한 기간에서 NO₃-처리에서의 중간물질(intermediate)로서의 질산염의 생산과 함께, 현저한 질산염 감소가 발생됨을 추측할 수 있었다. 이러한 기간 동안에 아질산염의 존재는 NO₃-처리의 보다 낮은 산소 소비를 설명할 수 있다. 7 % 의 Hb 이상의 MetHb-수준은 NO₃-처리에 대해서 관찰할 수 없을지라도, 산소 소비에서의 확실한 감소가 관찰되었다. 샘플에 대한 저장 시간[샘플을 샘플링(sampling)한 후에 대략 24 h 관찰하였음]은 발견된 예상된 MetHb-수준보다 보다 낮은 것으로 설명될 수 있다.

NO₃+SO₄ 처리에서, 산소 소비는 섭식(feeding) 후에(9 AM) 즉시 보다 낮았고, 이러한 시점 후에 대조군 처리(control treatment)로서 동일한 수준으로 회복되었다. SO4의 첨가는 질산염의 섭식에 의해 적용되어 산소 소비에서의 하락(depression)을 완화하는 것 같다. 아마도, SO₄ 는 섭식 후에 바로 이러한 기간에 H₂S 로 환원되었고, 제안한 것과 같이 이는 아질산염의 환원(reduction)의 가속(acceleration)에서의 중요한 역할을 한다. 황화물(sulphide)을 생체 외에서 반추 위액에 첨가하였을 때, 아질산염 환원의 분명한 복용량-의존적인 가속(dose-dependent acceleration)은 일찍이 발견되었다(Takahashi et al., 1989). SO₄ 를 배지(medium)에 첨가하였을 때 아질산염 환원에서의 가속은 보다 적었고, 따라서 이것이, 본 실험에서 산소 소비를 적극적으로 회복시키는 H₂S 임은 타당한 것 같다.

실험의 결과를, 기초 사료(basal diet) 또는 세 가지 실험 사료를 제공받은 군에서 24 기간의 코스 상에서의 산소 소비(l/kg MW/hr)를 나타내는, 도 2 의 그래프로 또한 나타내었다.

[ 실시예 2]

질산염 보충된 소(nitrate supplemented cattle)에서의 메트헤모글로빈혈증에서의 황산염의 효과

질산염을 보충한 소의 혈액에서의 메트헤모글로빈의 농도에서의 규정식의(dietary) 황산염 섭취의 효과를 측정하였다. 규정식의 황산염은 질산염을 먹인 소의 반추 위에서 아질산염의 축적을 감소시키고, 그 결과로 혈액에서의 메트헤모글로빈의 형성을 예방하는 것으로 추측할 수 있었다.

물질 및 방법

실험 설계( Experimental design )

실험은 블록 당 4 마리와 함께 임의적으로 추출된 블록 설계(block design)이고, 상이한 황산염을 처리로서 복용하였다. 동물은 우유 생산량(milk yield) 및 그 뒤의 4 개의 규정식의 처리물(dietary treatments) 중의 하나로 임의적으로 할당된 블록 내에 의해 차단되었다 : NO₃, NO₃ + 낮은(low) SO₄, NO₃+ 중간(medium) SO₄ _, NO₃ + 높은(high) SO₄.

섭식( Feeding )

기초 사료는 DM-기준(DM-basis)에서의 45%의 사일리지 옥수수(maize silage), 7.5 % 의 알팔파(alfalfa), 4.1 % 다져진 보리 짚(chopped barley straw), 및 42 % 의 농축된 예비 배합물로 이루어져 있다. 규정식의 첨가물을 예비 배합물에 포함시켰다(표 5). 섭식 시에, 예비 배합물을 완전배합사료(Total Mixed Ration)의 부분으로서 소에게 주었다(delivered). 물은 실험 동안에 자유롭게 이용할 수 있다. 질산염은 상업적으로 입수가능한 소스(노르웨이 야라 AS 에 위치한 Calcinit)로부터 보충되었고, 추가적인 SO₄ 는 무수 MgSO₄ 의 형태로 사료에 첨가되었다.

[표 5]

적응 단계 동안에, 일주일에 25 % 의 단계로 실험 예비배합물을 소에게 도입하였다(표 6).

[표 6]

혈액 샘플링( Blood Sampling )

메트헤모글로빈의 농도를 면밀히 모니터하기 위해서, 실험 내내 일주일에 두 번 섭식 후(post-feeding) 3h 에 혈액을 채취하였다. 혈액을 헤파린이 함유된 짐공흡입튜브(evacuated tube) 내에 수집하였고, 얼음처럼 차가운 물 내에 즉시 넣고, 4 ℃ 로 냉장고(refrigerator)에 보관하였다. 각각의 샘플링한 날의 끝에, 샘플을 분석을 위해 보내고, 그 다음날 분석하였다. 혈액의 메트헤모글로빈 함량을 Evelyn and Malloy(1938)의 방법으로 결정하였다. 37일에, 질산염을 이의 최대 포함률(maximum inclusion rate)(DM-기초로 한 3 % 의 질산염)로 먹였을 때, 혈장(plasma)에서의 질산염 및 이의 다양한 대사산물의 동역학(kinetics)을 확립하기 위해 혈액 샘플링을 보다 자주 실시하였다(섭식 후 -0.5h, 0.5h, 1.5h, 3h, 5h 및 8h).

결과 및 논의

적응 기간 동안의 혈액의 메트헤모글로빈 함량

25 % 또는 50 % 의 최종 질산염 포함 비율(inclusion rate)로 사료에 보충하는 동안 어떠한 소도 검출가능한 혈액 메트헤모글로빈을 갖지 않았다. 질산염을 75 % 의 최종 포함 비율로 사료에 첨가하였을 때, 황산염으로 보충되지 않은 소는 섭식 후 3 h 에 증가된 혈액 헤모글로빈을 나타내었다. 이와 대조적으로, 이들의 사료에 황산염이 주어진 소는, 공급된 S 의 양에도 불구하고 메트헤모글로빈에 대해 음성으로 테스트되었다. 질산염의 100 % 포함 비율에서, 질산염 및 황산염이 주어진 것과 비교하여, 질산염만 주어진 소에 대해서 혈액의 메트헤모글로빈이 보다 증가되었을지라도, 모든 처리(all treatments)에서 혈액의 메트헤모글로빈의 증가가 나타났다. 황산염으로 보충된 소 중에서, 황산염 복용량의 효과와 구별될 가능성은 없다(표 7 참고). 황산염은 반추 위에서 질산염의 축적에 대응할 수 있고, 이런 이유로 혈액에서의 메트헤모글로빈 형성을 예방[적당한 질산염 첨가로(moderate nitrate addition)]하거나 또는 감소(높은 질산염 첨가로)시킬 수 있을 것이라는 결론이 내려졌다.

[표 7]

실험의 결과를, 4 개의 실험 사료 중의 하나를 제공받은 소의 혈액에서의 메트헤모글로빈의 농도를 나타내는, 도 3 의 그래프에 또한 나타내었다.

[ 실시예 3]

반추 위 발효 모델에서의 질산염 및 아질산염 감소 비율에서의 메가스피라 엘스데나이( Megasphaera elsdenii ) 및 셀레노모나스 루미난티움( Selenomonas ruminantium) 의 효과

본 실험에서, 생체 외(in vitro) 반추 위 발효 시스템(rumen fermentation system)에서의 질산염 감소의 동역학을 연구하였고, M. 엘스테나이 및 S. 루미난티움에 의한 그것에 대한 효과를 연구하였다.

물질 및 방법

반추 위 모의실험(simulation)에서 사용된 먹이는 1그램(gram)의 건조물(dry matter)이고, 목초 사일리지(grass silage)(0.5 g 건조물) 및 상업적인 화합물 먹이(commercial compound feed), 0.5 g 건조물로 구성되어 있다. 처리물을 다음의 표에 나타내었다 :

모든 처리물을 네 번씩 진행하여, 모의 혈관(simulation vessels)의 총 수가 72 이다.

건조 사료 성분(Dry feed components) 및 Calcinit을 혈청 병(serum bottles)에서 무게를 측정하고, 병을 O₂ 스캐빈저(O₂ scavenging)에 대한 뜨거운 구리 촉매(hot copper catalyst)를 통과한 CO₂ 로 씻고, 두꺼운 부틸 고무 마개(thick butyl rubber stoppers)로 봉인하였다. 산소 유리 CO₂ 흐름(oxygen free CO₂ flow) 하에서 36.5 ml의 혐기성(anaerobic), 환원된(reduced), 온도 조절된(temperature adjusted)(+ 37 ℃) 완충용액을 각각의 모의 혈관 내로 넣었다. 전체 액체 부피가 1.5 ml/혈관을 동등하게 하기 위해, 밤새 성장한 세균배양물(bacterial cultures), MgSO₄ 용액, 락테이트 용액(lactate solution) 및 완충 용액을 첨가하였다. 최종적으로, 2 ml 의 신선한, 스트레인된(strained) 반추 위액을, 최종 부피가 40 ml 로, 혈청 병(serum bottles)에 첨가하였다. 이러한 접종(inoculation)은 실질적인 반추 위 모의실험(actual rumen simulation)을 개시하였다. 각각의 혈관에 대한 접종 시간을 기록하고, 샘플링(sampling) 및 발효가 정지하였을 때를 계산하였다.

반추 위 발효 모의실험을 37 ℃ 에서 12 시간 동안 지속하였다. 발효 동안에, 반추 위 미생물(rumen microbes)의 일반적인 대사활성(metabolic activity)에서의 발상(idea)을 얻기 위해, 전체 가스 생산을 모의실험의 2, 4, 6, 9 및 12 시간 후에 측정하였다.

각각의 모의 혈관에서 12 시간 동안 생산된 모든 가스는, 내부 표준으로서 예비-도입된 에탄(pre-introduced ethane)을 갖는, 진공흡입된 2 리터 투입병(evacuated 2 litre infusion bottles) 내에 각각의 72 혈관(vessels)으로부터 각각 수집되었다. 12 시간 동안 반추 위 박테리아에 의해 생산된 전체 메탄에서의 처리의 효과를 보기 위해 메탄에 대해서 이러한 샘플을 분석하였다. 수소불꽃이온화검출기(flame ionisation detector) 및 표준으로서 순수한 메탄 및 에탄을 사용한 가스 크로마토그래피(gas chromatography)에 의해 분석을 실시하였다.

4 및 12 시간에, 휘발성 지방산(volatile fatty acids, VFAs) 및 젖산(SCFAs 로서 총괄적으로 나타냄)에 대해서 모든 모의 혈관을 분석하였다. 유리 산(free acids)의 분석을 위해 충진탑(packed column)을 사용한 가스 크로마토그래피로 산을 분석하였다. 수량화된(quantified) SCFAs 는 아세트산, 프로피온산, 뷰티르산(butyric acids), 이소-부티르산(iso-butyric acids), 2-에틸-부티르산(2-methyl-butyric acids), 발레르산(valeric acids), 이소-발레르산(iso-valeric acids) 및 젖산(lactic acids)이다.

NO₃ 및 NO₂ 은 0, 2, 4 및 12 시간에 모든 모의 혈관으로부터 분석하였다. 방법은 분광 광도법이고(spectrophotometric), 산성 그리스 반응(acidic Griess reaction)에 의한 탐지(detection)와 결합된 바나듐(vanadium)(III)과 함께 질산염 감소에 근거한다.

NH₄ 는 0, 2, 4 및 12 시에 모든 모의 혈관으로부터 분석하였다. 방법은 비색법(colorimetric)이고, 페놀-하이포아염소산염 반응(phenol-hypochlorite reaction)에 근거한다.

통계 분석은 모든 측정된 파라미터에 대해서 양쪽 꼬리 t-테스트(two-tailed t-tests)로 구성되어 있다. 테스트를 Calcinit 및 MgSO₄ 수정(amendment)(처리물 2 및 17)을 갖는 처리물(treatments)에 대비하여 실시하였다. t-테스트는 개별적인 처리물이 동시에 테스트된 그 밖의 처리물로부터 독립되도록 선택되었다. 결과는 도에서 표시하였고, 여기에서 0.01 = p-값 < 0.05 는 * 으로 나타내었고; 0.001 = p-값 < 0.01 은 ** 으로 나타내었고; 0.0001 = p-값 < 0.001 은 *** 으로 나타내었고; p-값 < 0.0001 은 **** 으로 나타내었다.

결과

전체 가스 생산에서 처리의 효과

이러한 작업에서, 본 발명자는 5 % 의 반추 위액(rumen fluid)을 갖는 모든 혈관을 배양하였지만, 게다가 몇몇의 혈관은 셀레노모나스 루미난티움( Selenomonas ruminantium ) 또는 메가스피라 엘스데나이 (Megasphaera elsdenii)의 복용량(dose)을 받았다. 이러한 박테리아는 반추 위에서 주요한 락테이트 이용자(major lactate utilisers)이고, 뿐만 아니라 이들이 질산염 및/또는 아질산염을 감소시키기 위한 능력을 갖는 것으로 알려져 있다. M. 엘스데나이는 젖산과 결합하여 또한 테스트되었고, 젖산이 박테리아에 대한 기질이고, 이는 반추 위 축소판(rumen microcosm)에서 이의 경쟁력(competitiveness)에서 긍정적인 효과를 가질 수 있는 근거(rationale)이다. 도 4 에서 나타낸 바와 같이, NO₃ 및 MgSO₄의 첨가는 가스 생산의 의미있는 억제(suppression)를 초래한다. 이러한 효과는 시간이 지나갔을 때 보다 분명해졌다 ; 누적된 가스 생산의 거의 25 % 저해는 12 h 시점에서 측정되었다.

질산염이 풍부한 처리(nitrate enriched treatment)과 비교하였을 때, S. 루미난티움 접종물(inoculum)은 첫 번째 4 시간 동안 가스 생산에서의 양성 효과(positive effect)를 나타내었다. 이러한 효과는 복용량(dose) 100 및 1000 ㎕/40 ml에서 통계상으로 중요하다. 초기의 가스 생산은 M. 엘스데나이에 의해 또한 활성화되었지만, 오직 가장 높은 1000 ㎕ 복용량에서만 활성화되었다. 젖산이 제공되었을 때, 반추 위 미생물(rumen microbiotics)의 대사에서의 이의 직접적인 저해 효과(inhibitory effect)때문에 가스 생산을 저해하였다. S. 루미난티움의 자극 효과(stimulatory effect)는 나중의 시점에서 발견되지 않았다. 그러나, M. 엘스데나이의 가장 높은 복용량은 누적된 가스 생산의 증가가 계속되었고(continued), 상대적인 양성 효과는 나중의 시점(later time points)에서 보다 중요하였다. 젖산 첨가는 배양(incubation)의 전체의 지속시간(entire duration)에 대해서 의존적으로 가스 생산 양(gas production dose)의 억제를 지속하였다. 그러나, 락테이트(lactate)와 결합하여, M. 엘스데나이의 높은 복용량(high dose)은 물질 대사의 억제(metabolic suppression)를 무효화하고, 사실은 이는 가스 생산의 자극(stimulation)으로 변하게 했다. M. 엘스데나이가 높은 투여량으로 전반적인 가스 생산을 자극한다는 사실에도 불구하고, 이는 질산염의 음성 효과를 완전히 극복할 수 없었다.

메탄 생산에서의 처리물(treatments)의 효과

본 발명자는 전체 가스 생산 뿐만 아니라 생산된 CH₄ 를 수량화하였다. 이러한 발효 연구에서, 전체 생산된 메탄의 비율은, 분명히 10 % 미만에 있어, 상대적으로 낮았다(도 5B). 메탄 생산의 수준은 사료에 의존하고, 소의 생리적인 상태(physiological status)는 반추 위액 기증자(rumen fluid donor)로서 사용되었다. 이러한 경우에, 동물은 높은 에너지 사료를 먹는 착유우(milking cow)이다. 사료에서의 질산염은 거의 80 % 의 완전한 메탄 생산을 억제하였다(도 5A).

질산염 감소에서의 처리물의 효과

질산염의 고정된 양(Fixed amount)은, 생산물의 'Calcinit'의 형태(14 mM 질산염의 최종 농도로)로 이러한 표지된 "수정 없음(No amendments)"을 제외하고, 모든 모의 혈관에 첨가하였다. 이러한 발효 연구에서, 전체 생산된 메탄은 질산염의 부재에서 7 내지 8 ml 이고, 질산염이 제공되었을 때 이는 1.5 ml 로 감소되었다.

질산염의 농도 및 이의 환원의 산물 아질산염 및 암모늄을 접종(inoculation)으로부터 2, 4 및 12 시간 후에 분석하였다. 14 mM 의 아질산염을 0 시에 제공하는 동안에, 오직 약 10 mM 의 농도의 질산염을 2 시간에 모든 혈관에서의 여과액(filtrate)에서 발견되었다. 더욱이, 용액에서 측정된 질산염은 동일하거나 2 시간 후에 아주 조금 높았다. 이는, 질산염이 고체 매트릭스(solid matrix)에 의해 신속하게 흡수되거나 또는 장내 미생물균체(microbiota)에 의해 흡수됨을 시사한다. 박테리아에 의한 질산염 소비가 좋은 속도로 도달할 때까지, 분할(partitioning)에서의 이러한 평형(equilibrium)을 유지한다. 본 연구에서, 최종의 샘플링은 4 및 12 시간 사이에 질산염 수준에서의 붕괴(collapse)를 나타낸다(도 6). M. 엘스데나이 수정(amendment)의 높은 투여량의 효과는, 질산염 감소가 이러한 박테리아의 높은 복용량으로 현저하게 둔화됨을 제시한다.

2 및 4 시간(hour) 시점에서의 아질산염의 분석은 질산염 데이터와 일관된다. 2 시간에, 아질산염 농도는, 질산염 감소의 비율이 낮음을 제시하는 모든 처리물과 함께 0.05 mM 미만이었다(도 7A). 4 시간에, 아질산염의 수준은 증가되기 시작하였지만, 이는 여전히 0.2 mM 미만이었다. S. 루미난티움이 아질산염을 의존적으로 증가시키는 것처럼 보인 반면에, M. 엘스데나이는 이를 의존적으로 감소시킴을 언급할 가치가 있다(도 7B). 12 시간 후에, M. 엘스데나이의 효과는 이의 부재 때문에 보다 명확해졌고, 박테리아를 첨가하였을 때 아질산염의 농도는 8 mM 으로 증가하였고, 복용량(dose)은 의존적으로 감소하였다. 순수한 M. 엘스데나이와 함께 수정(amendment) 100 ㎕ 복용량은 아질산염의 완전한 제거를 필요로 한다. 그러나, 락테이트와 함께 이미 100 ㎕ 의 복용량은 검출 한계(detection limit)로 아질산염 농도를 떨어뜨렸다(도 7C). S. 루미난티움의 아질산염-증가시키는 효과(nitrite-increasing effect)는 12 시간에 이미 측정할 수 없었고, 이는 반추 위 모델의 축소판(microcosm)에서 이의 물질대사 역할은 무시해도 될 정도임을 제시한다.

암모늄은 질산염/아질산염의 최종의 환원산물(ultimate reduction product)이다. 그러나, 우선되고(preferred), 유기적인 질소 근원(sources)이 가능하지 않을 때, 미생물(microbes)에 의해 쉽게 동화될 수 있는 질소의 형태이기 때문에, 미생물 시스템(microbial system)에서 정량적으로 축적될 것으로 예상될 수 있는 산물이 아니다. 암모늄의 이러한 일시적인 역할은 이를 정확한 화학량적인 균형 계산(balance calculations)을 하는 것을 불가능하게 한다. 그럼에도, 14 mM 질산염은 발효 시스템에 첨가하였을 때, 12 시간 후의 암모늄의 잔여 농도는 10 에서 18 mM 로 증가됨은 분명하다. M. 엘스데나이가 발효 배지(fermentation medium)에 첨가되었을 때, 암모늄의 수준은 제공된 추가적인 락테이트 기질의 복용량에 따라 23 내지 31 mM 농도에 이르렀다(도 8c). 이러한 데이터는, 질산염 수정(nitrate amendment)이 암모늄 생산 또는 축적을 증가시키는 것으로 이어짐을 명백하게 나타낸다. M. 엘스데나이는 이러한 대사 과정을 보다 강화시킴을 이러한 데이터는 또한 강하게 시사한다. 암모늄의 잔여 농도는 100 ㎕ 복용량의 M. 엘스데나이에서 절정에 달하였고, 1000 ㎕ 복용량은 분명한 감소를 나타내었다.

결론

본원에 나타낸 데이터를 통해, 사료에서의 질산염이 메탄 생산을 감소시킴을 또 다시 확인하였다. 질산염이 아질산염으로 환원되고 더 나아가 암모늄으로 환원됨을 또한 나타내었다. 질산염의 양적인 감소를 예방하는 조건은 또한 메탄생성반응 저해의 정도를 감소시키기 때문에, 이러한 과정은 메탄 생산과 직접적으로 연관된 것처럼 보인다.

M. 엘스데나이 수정(amendment)은 질산염 환원을 가속화하지 않고, 사실 이를 저해하는 것처럼 보인다. 이와 대조적으로, 박테리아 복용량은 아질산염의 잔여 농도를 의존적으로 감소시키고, 이와 수반되어 이의 환원 산물, 암모늄의 농도를 증가시킨다. 이러한 스트레인(strain)이 기능적인 질산염 환원효소를 발현시키지 않지만, 몇몇 그 밖의 박테리아는 질산염에서 아질산염으로의 환원을 촉매할 때마다, M. 엘스데나이의 스트레인은 아질산염을 암모늄으로 쉽게 환원시킴을 이러한 데이타는 시사한다. 이러한 특징은, M. 엘스데나이가 질산염을 환원시키는 박테리아에 의한 질산염의 빠른 생산 및 축척에 의한 아질산염 중독(poisoning)의 이상적인 예방자(preventer)가 되게 한다.

우리의 사전 지식(previous knowledge)에 따라, M. 엘스데나이는 젖소(dairy cows)에서 주요한 락테이트 이용자(major lactate utiliser)가 아니다. 그러나, 높은 곡물 사료(high grain diets)를 먹인 육우(beef cattle)에서 M. 엘스데나이에 대한 조건은 유리하다. 이러한 이유는 반추 위에서 젖산의 수준이 높을 때만, 이러한 락테이트 이용자가 매우 경쟁적이다. 박테리아의 이러한 특징은, 젖산 및 M. 엘스데나이 - 젖산 컴비네이션(combination)의 효과 또한 본원에서 테스트한 이유이다. 다양한 파라미터(parameters)에서의 M. 엘스데나이 효과는, 젖산이 포함하는지 포함하지 아닌지는 같은 방향이지만, 젖산을 제공하였을 때, 효과는 보다 강하였다. 이는, M. 엘스데나이의 경쟁력(competitiveness)이 락테이트에 의해 개선됨을 시사한다.

M. 엘스데나이의 높은 복용량이 질산염 환원을 왜 감소시킬까요? 이는 본원에서만 추측될 수 있고, 최종 대답은 분명하게 계획된 연구로부터만 도달할 수 있다. M. 엘스데나이가 주요한 질산염을 환원시키는 박테리아와 함께 몇몇의 필수적인 영양소(vital nutrients) 또는 보조인자(cofactors)를 두고 경쟁하는 것이 하나의 가능한 설명이다. M. 엘스데나이의 성장이 아질산염 환원에 의존적이지 않기 때문에, 질산염 환원제(nitrate reducer)와 보다 우월하게 경쟁한다(outcompetes). 또 다른 가능한 설명은 최종 산물 저해(end product inhibition)이다. M. 엘스데나이의 높은 복용량은, 질산염 환원에 대한 피드백 저해제(feedback inhibitor)로서 역할할 수 있는, 암모늄 농도에서의 증가로 이어진다.

참조문헌

Alaboudi, A. R. and G. A. Jones. 1985. Effect of Acclimation to High Nitrate Intakes on Some Rumen Fermentation Parameters in Sheep. Canadian Journal of Animal Science 65:841-849.

Asanuma, N., M. Iwamoto, and T. Hino. 1999. Effect of the Addition of Fumarate on Methane Production by Ruminal Microorganisms In Vitro. J. Dairy Sci. 82(4):780-787.

Beauchemin, K. A., M. Kreuzer, F.

, and T. A. McAllister. 2008. Nutritional management for enteric methane abatement: a review. Australian Journal of Experimental Agriculture 48(2):21-27.

Bruning-Fann, C. S. and J. B. Kaneene. 1993. The effects of nitrate, nitrite, and N-nitroso compounds on animal health. Vet Hum Toxicol 35(3):237-253.

Evelyn, K. A. and H. T. Malloy. 1938. MICRODETERMINATION OF OXYHEMOGLOBIN, METHEMOGLOBIN, AND SULFHEMOGLOBIN IN A SINGLE SAMPLE OF BLOOD journal of biological chemistry 126:655-663.

Guo, W. S., D. M. Schafer, X. X. Guo, L. P. Ren, and Q. X. Meng. 2009. Use of nitrate-nitrogen as a sole dietary nitrogen source to inhibit ruminal methanogenesis and to improve microbial nitrogen synthesis in vitro. Asian-Australian Journal of Animal Science 22(4):542-549.

Iwamoto, M., Asanuma N., and Hino, T. 1999 Effects of nitrate combined with fumarate on methanogenesis, fermentation, and cellulose digestion by mixed ruminal microbes in vitro. Animal Science Journal 70(6):471-478.

Iwamoto, M., Asanuma N., and Hino, T. 2001. Effects of pH and electron donors on nitrate and nitrite reduction in ruminal microbiotica. Animal Science Journal 72(2):117-125.

Joblin, K. N. 1999. Ruminal acetogens and their potential to lower ruminant methane emissions. Australian Journal of Agricultural Research 50(8):1307-1314.

Johnson, K. A. and D. E. Johnson. 1995. Methane emissions from cattle. J Anim Sci 73(8):2483-2492.

Le Van, T. D., J. A. Robinson, J. Ralph, R. C. Greening, W. J. Smolenski, J. A. Z. Leedle, and D. M. Schaefer. 1998. Assessment of Reductive Acetogenesis with Indigenous Ruminal Bacterium Populations and Acetitomaculum ruminis. Appl. Environ. Microbiol. 64(9):3429-3436.

Lewis, D. 1951. The metabolism of nitrate and nitrite in the sheep; the reduction of nitrate in the rumen of the sheep. Biochem. J. 48(2):175-170.

Marais, J. P., J. J. Therion, R. I. Mackie, A. Kistner, and C. Dennison. 1988. Effect of nitrate and its reduction products on the growth and activity of the rumen microbial population. British Journal of Nutrition 59(02):301-313.

Molano, G., T. W. Knight, and H. Clark. 2008. Fumaric acid supplements have no effect on methane emissions per unit of feed intake in wether lambs. Australian Journal of Experimental Agriculture 48(2):165-168.

Sar, C., B. Mwenya, B. Santoso, K. Takaura, R. Morikawa, N. Isogai, Y. Asakura, Y. Toride, and J. Takahashi. 2005. Effect of Escherichia coli wild type or its derivative with high nitrite reductase activity on in vitro ruminal methanogenesis and nitrate/nitrite reduction. J. Anim Sci. 83(3):644-652.

Sar, C., B. Santoso, B. Mwenya, Y. Gamo, T. Kobayashi, R. Morikawa, K. Kimura, H. Mizukoshi, and J. Takahashi. 2004. Manipulation of rumen methanogenesis by the combination of nitrate with [beta]1-4 galacto-oligosaccharides or nisin in sheep. Animal Feed Science and Technology 115(1-2):129-142.

Steinfeld, H., P. Gerber, T. Wassenaar, V. Castel, M. Rosales, and C. De Haan. 2006. Livestock's Long Shadow. Food and Agriculture Organization of the United Nations.

Takahashi, J., M. Ikeda, S. Matsuoka, and H. Fujita. 1998. Prophylactic effect of L-cysteine to acute and subclinical nitrate toxicity in sheep. Animal Feed Science and Technology 74(3):273-280.

Takahashi, J., and Young, B.A. 1991. Prophylactic effect of L-cysteine on nitrate-induced alterations in respiratory exchange and metabolic rate in sheep. Animal Feed Science and Technology 35:105-113.

Takahashi, J., N. Johchi, and H. Fujita. 1989. Inhibitory effects of sulphur compounds, copper and tungsten on nitrate reduction by mixed rumen micro-organisms. British Journal of Nutrition 61(03):741-748.

Ungerfeld, E. M., R. A. Kohn, R. J. Wallace, and C. J. Newbold. 2007. A meta-analysis of fumarate effects on methane production in ruminal batch cultures. J. Anim Sci. 85(10):2556-2563.

Verstegen, M. W. A., W. Van der Hel, H. A. Brandsma, A. M. Henken, and A. M. Bransen. 1987. The Wageningen respiration unit for animal production research: A description of the equipment and its possibilities. Energy Metabolism in Farm Animals: Effects of Housing, Stress and Disease. Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, The Netherlands.　

Claims

반추동물(ruminant)에서의 위장의 메탄 생산(gastro-intestinal methane production)을 감소시키는 비치료적(non-therapeutic) 방법으로서, 질산염 화합물(nitrate compound) 및 황산염(sulphate) 화합물의 컴비네이션(combination)의 유효량을 반추동물에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
　
제1항에 있어서,
상기 질산염 화합물 및 황산염 화합물의 컴비네이션을, 질산염 및 황산염의 총 복용량(dosage)이 하루에 몸무게 당 0.05 g/kg을 초과하는 양으로 제공되도록 반추동물에 투여하는 반추동물에서의 위장의 메탄 생산을 감소시키는 비치료적 방법.
제2항에 있어서,
상기 질산염 화합물은 하루에 몸무게 당 0.025 내지 8 g/kg 의 질산염의 복용량을 제공하는 양으로 반추동물에 투여하고, 상기 황산염 화합물은 하루에 몸무게 당 0.025 내지 1.8 g/kg 의 황산염의 복용량을 제공하는 양으로 반추동물에 투여하는 반추동물에서의 위장의 메탄 생산을 감소시키는 비치료적 방법.
　
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
1*10⁵ 내지 1*10¹⁴ cfu/kg/day의 양으로 아질산염을 환원시키는 프로바이오틱 미생물(nitrite reducing probiotic microorganism)을 반추동물에 투여하는 것을 추가적으로 포함하는 반추동물에서의 위장의 메탄 생산을 감소시키는 비치료적 방법.
　
제4항에 있어서,
락테이트 화합물(lactate compound)의 유효량을 반추동물에게 투여하는 것을 추가적으로 포함하는 반추동물에서의 위장의 메탄 생산을 감소시키는 비치료적 방법.
반추동물에서의 위장의 메탄 생산을 비치료적으로 감소시키기 위한 질산염 화합물 및 황산염 화합물의 컴비네이션을 포함하는 조성물의 용도.
　
제6항에 있어서,
상기 용도는 하루에 몸무게 당 0.05 g/kg 을 초과하는 질산염 및 황산염의 전체 복용량(dosage)을 제공하는 양으로 반추동물에 질산염 화합물 및 황산염 화합물의 컴비네이션을 투여하는 것을 포함하는 용도.
　
제5항 또는 제6항에 있어서,
상기 용도는 1*10⁵ 내지 1*10¹⁴ cfu/kg/day의 양으로 아질산염을 환원시키는 프로바이오틱 미생물을 반추동물에서 투여하는 것을 추가적으로 포함하는 용도.
질산염 화합물 및 황산염 화합물의 컴비네이션을 포함하는 혼합 동물 사료(Compounded animal feed)로서, 상기 컴비네이션은 10 g/kg 를 초과하는 질산염 및 황산염의 전체 양을 제공하고, 상기 황산염의 양은 건조 무게당(dry weight basis) 7.5 g/kg 을 초과하는 혼합 동물 사료.
제9항에 있어서,
상기 질산염의 양은 건조 무게당 7.5 g/kg 을 초과하는 혼합 동물 사료.
제9항 또는 제10항에 있어서,
메가스페라 엘스데나이 ( Megasphaera elsdenii ) 및 프로피오니박테리움 아키디프로피오니키( Propionibacterium acidipropionici)의 군으로부터 바람직하게 선택된 아질산염을 환원시키는 프로바이오틱 미생물을 추가적으로 포함하는 혼합 동물 사료.
질산염 화합물 및 황산염 화합물의 컴비네이션의 10 내지 100 % 를 포함하는 동물 사료 보충물(Animal feed supplement)로서, 상기 동물 사료 보충물에서의 황산염의 양은 건조 무게당 25 g/kg 을 초과하는 동물 사료 보충물.