ES2633690T3 - Composiciones para reducir la metanogénesis gastrointestinal en rumiantes - Google Patents

Abstract

Combinación de un compuesto de nitrato y un compuesto de sulfato, para usar en un método de reducción de la producción de metano gastrointestinal en un rumiante, comprendiendo dicho método administrar al rumiante una cantidad eficaz de dicha composición.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones para reducir la metanogenesis gastrointestinal en rumiantes Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al campo de los aditivos y complemented para piensos para rumiantes. Mas en particular, la invencion se refiere a la reduccion de la metanogenesis gastrointestinal en dichos rumiantes con la ayuda de agentes inhibidores que compiten por los atomos de hidrogeno necesarios para los metanogenos durante la fermentacion normal del alimento ingerido. La presente invencion proporciona, entre otros, complementos para piensos y composiciones de piensos que comprenden dichos agentes inhibidores y su uso no terapeutico para reducir la metanogenesis.

Antecedentes de la invencion

La metanogenesis es la principal ruta de eliminacion de hidrogeno (H2) durante el proceso de fermentacion ruminal (Beauchemin et al., 2008). La eliminacion de H2 del medio ruminal es esencial para la continuacion eficaz de la fermentacion ruminal, pero el metano resultante de la metanogenesis se ha implicado tanto en una perdida de energfa dietetica para el animal (Johnson y Johnson, 1995) asf como en el gas de efecto invernadero significativo que contribuye al calentamiento global (Steinfeld et al., 2006). Ambos objetos han llevado a una busqueda global de aditivos para piensos para mitigar la produccion de metano de los rumiantes.

Una de las opciones exploradas para reducir las emisiones de metano es la redireccion del exceso de H2 en procesos que den productos mas beneficiosos para el rumiante, disminuyendo asf la metanogenesis. Los ejemplos incluyen la estimulacion de la propiogenesis por la adicion de precursores del propionato y los intentos de introducir acetogenesis reductora en el rumen (Joblin, 1999, Molano et al., 2008). La induccion satisfactoria de estos procedimientos en el rumen proporcionana respectivamente propionato o acetato como nutrientes para el animal, mientras que al mismo tiempo reducina la disponibilidad del H2 para la metanogenesis. Sin embargo, la introduccion de precursores de propionato (malato y fumarato) ha dado efectos variables en la produccion de metano (Asanuma et al., 1999, Ungerfeld et al., 2007) y los intentos de introducir acetogenesis reductora en el rumen han fracasado hasta ahora debido a la menor afinidad por el hidrogeno comparado con la metanogenesis (Le Van et al., 1998).

Otras opciones para reducir las emisiones de metano se han descrito en el documento US 5.843.498, que se refiere a composiciones de piensos para rumiantes para disminuir la metanogenesis ruminal y mejorar la eficacia de los piensos que comprenden, como un componente eficaz, cistema y/o sus sales.

Un pequeno numero de grupos de investigacion han buscado el potencial del nitrato como aditivo de piensos reductor de metano, y la adicion de nitrato parece que disminuye sistematicamente la metanogenesis (Guo et al., 2009, Sar et al., 2005, Takahashi et al., 1998).

Leng ("The potential of feeding nitrate to reduce enteric methane production in ruminants", Noviembre de 2008) tambien describe el papel potencial del nitrato en la reduccion de la produccion de metano por los rumiantes. Leng tambien hacfa referencia a Tillman et al. ("Nitrate reduction studies with sheep" JOURNAL OF ANIMAL SCIENCE, n°. 24, 1965, paginas 1140-1146), que alimentaba ovejas con un complemento que comprendfa nitrato y sulfato. Sin embargo, los autores de la invencion no describfan el efecto de dicho complemento en la produccion de metano.

La posibilidad de introducir nitrato (NO3) como sumidero de hidrogeno alternativo para reducir la metanogenesis en el rumen se ha ignorado durante mucho tiempo, debido a los hallazgos continuos de efectos toxicos del nitrito que se forma como compuesto intermedio durante la reduccion de nitrato a amoniaco en el rumen (Lewis, 1951). Se han descrito dosis altas de nitrato en dietas de rumiantes para producir metahemoglobinemia, reducir la capacidad de la sangre para transportar oxfgeno a los tejidos del animal. Ademas, la acumulacion de nitrito en el rumen se sabe que reduce la actividad microbiana en el rumen, lo que, entre otras cosas, puede reducir la ingestion de pienso por el animal.

Se ha sugerido suministrar formiato, lactato o fumarato a rumiantes alimentados con alta cantidad de nitrato, con el fin de aliviar el efecto inhibidor del nitrito en la fermentacion (Iwamoto, 1999; Iwamoto, 2001). La administracion simultanea de nitrato y GOS o nisina tambien se ha descrito como una medida eficaz para disminuir la concentracion de nitrito en el rumen y el plasma y la metahemoglobina, mientras se mantiene la metanogenesis ruminal a un nivel bajo, comparado con el tratamiento con nitrato solo (Sar, 2004).

La aceleracion de la reduccion de nitrito usando probioticos tambien ha sido objeto de amplia investigacion. La patente de EE.UU. n° 6.120.810 ensena la reduccion de la intoxicacion de rumiantes por nitratos, administrando al animal una composicion que contiene una cantidad eficaz del microorganismo reductor de nitrito Propionibacterium acidiproprionici. La solicitud de patente europea 1630226 describe una composicion de pienso para rumiantes que contiene un microbio que tiene actividad de nitrito reductasa, que se selecciona de bacterias intestinales, bacterias corineformes, Bacillus subtilis, bacterias del genero Methylophilus, Actinomyces, bacterias ruminales y combinaciones de las mismas. Tambien se ha descrito (Sar, 2005) que E. Coli W3110 se podna usar para disminuir la intoxicacion cuando se usa nitrato para inhibir la metanogenesis en rumiantes.

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Se han investigado los efectos inhibidores de compuestos de azufre, cobre y tungsteno en la reduccion de nitrato (Takahashi, 1989). Los autores describen que en el fluido ruminal de carneros castrados adaptados a nitrato (0,55 g de NaNO3/kg de peso corporal dos veces al dfa) la formacion de nitrito no era afectada ni por la incubacion con S de sulfato ni por la incubacion con S de sulfito.

De los aminoacidos que contienen S, la metionina ha demostrado ser ineficaz en la inhibicion de la reduccion microbiana de nitrato mientras que la cistema disminma significativamente la formacion de nitrito. Esta publicacion no se refena o dirigfa a efectos reductores de la metanogenesis. La eficacia de la cistema para prevenir la acumulacion de nitrito se confirmo en estudios posteriores (Takahashi, 1991; Takahashi 1998).

El principal objetivo de la presente invencion es proporcionar tratamientos, y las composiciones para usar en los mismos, para reducir mas la metanogenesis en rumiantes mientras que se evita o se superan problemas particulares asociados con la acumulacion de nitrito.

Resumen de la invencion

La presente invencion se ocupa, en un aspecto, de los descubrimientos de que tanto las rutas reductoras de nitrato como tambien las rutas reductoras de sulfato compiten en la metanogenesis gastrointestinal en rumiantes y que los efectos reductores de la metanogenesis del nitrato y sulfato obtenidos cuando se usan individualmente son completamente aditivos, como se ilustrara con detalle en la parte experimental. Los efectos individuales del nitrato y sulfato parece que son independientes.

Al mismo tiempo, se encontro que la administracion combinada de nitrato y sulfato era completamente eficaz para evitar o mitigar los potenciales problemas de la intoxicacion por nitrito encontrados normalmente cuando se usa solo nitrato, como se ilustrara con mas detalle en la parte experimental.

Sorprendentemente, mientras que se encontro que la administracion de nitrato reducfa los recuentos de metanogenos entericos, la administracion de sulfato o de una combinacion de nitrato y sulfato no lo hada. Sin embargo, la administracion de la combinacion de nitrato y sulfato reduce significativamente la proporcion de metanogenos de las bacterias totales.

Aunque el alcance de la invencion no se limita o reduce por ninguna de estas teonas o hipotesis subyacentes, se cree que la reduccion de la metanogenesis (ecuacion 1) por el nitrato es causada por el uso alternativo de H2 en la reduccion del nitrato a amoniaco. La reduccion de nitrato en el rumen se cree que sigue la ruta de reduccion descrita en la ecuacion 2. Esto implica que 8 moles de H se redirigen a la reduccion de nitrato, reduciendo asf teoricamente la produccion de metano con 1 mol por cada mol de nitrato suministrado. Cada 100 g de NO3 suministrados de esta forma conducinan a una reduccion de CH4 de 25,8 g.

CO2 + 4H2 ^ CH4 + 2H2O (ecuacion 1)

NO3- + 4H2 + 2H+ ^ NH4+ + 3H2O (ecuacion 2)

La reduccion del nitrato a amoniaco da mas energfa que la reduccion de CO2 a CH4, y por lo tanto se podna esperar que fuera la ruta principal de eliminacion de H2 si hay suficiente nitrato disponible en el rumen. La reduccion completa de NO3 a NH3 consume 8 electrones y cada mol de nitrato reducido podna asf disminuir las emisiones de metano en 1 mol de metano. El producto final de la reaccion, el amoniaco, se puede considerar un nutriente valioso para los rumiantes alimentados con dietas bajas en protemas.

Como se ha indicado antes, los autores de la presente invencion encontraron que el propio sulfato tambien es un reductor fuerte eficaz en la reduccion de emisiones de metano por un mecanismo independientes de la reduccion del nitrato. La reduccion de sulfato a H2S (ecuacion 3) tambien consume 8 electrones y por lo tanto ofrece el mismo potencial pare reducir las emisiones de metano que el nitrato por mol.

SO42- + 4H2 + 2H+ ^ H2S + 4H2O (ecuacion 3)

El descubrimiento de que el sulfato tambien es eficaz en la reduccion de la metanogenesis se puede explicar por el hecho de que, desde una perspectiva termodinamica, la reduccion de sulfato probablemente tambien es mas favorable que la metanogenesis. Estequiometricamente, la reduccion completa de 100 g de sulfato a sulfuro de hidrogeno reducina la produccion de CH4 en 16,7 g.

Parece que el sulfuro de hidrogeno (H2S) tiene una funcion como donador de electrones en la reduccion del NO2 a NH4+ y el enriquecimiento de la dieta con sulfato puede, por lo tanto, producir adicionalmente el alivio de la acumulacion de nitrito en el rumen.

Se encontro ademas que los resultados se pueden potenciar incluso mas por la administracion adicional de una cantidad eficaz de microorganismos probioticos reductores de nitrito. Como se ilustrara con detalle en la parte experimental, se observa un retraso inicial en el comienzo de la reduccion de nitrito por sulfato, lo cual se puede explicar por un retraso en la disponibilidad del H2S inmediatamente despues de la ingestion de pienso. Esto a su vez

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puede producir una reduccion de la ingestion de pienso, y por lo tanto un objeto adicional de la invencion es evitar esto. Los autores de la invencion encontraron que esto podfa realizarse por la coadministracion de algunos microorganismos probioticos reductores de nitrito, como se ilustrara con mas detalle en la parte experimental.

Descripcion de los dibujos

La figura 1 es una grafica que muestra la produccion de metano (l/h) a lo largo de un periodo de 24 en corderos cruzados Texel que recibfan una dieta base o una de las tres dietas experimentales, que estaban enriquecidas con un compuesto de nitrato, un compuesto de sulfato o una combinacion de un compuesto de nitrato y un compuesto de sulfato.

La figura 2 es una grafica que muestra el consumo de oxfgeno (l/kg MW/h) a lo largo de un periodo de 24 en corderos cruzados Texel que recibfan una dieta base o una de las tres dietas experimentales, que estaban enriquecidas con un compuesto de nitrato, un compuesto de sulfato o una combinacion de un compuesto de nitrato y un compuesto de sulfato.

La figura 3 es una grafica que muestra la concentracion de metahemoglobina en la sangre de vacas que recibfan una de cuatro dietas experimentales, que estaban enriquecidas con nitrato, o una de las tres combinaciones de nitrato y cantidades crecientes de sulfato.

La figura 4 muestra la produccion de gas en la simulacion ruminal con diferentes productos de ensayo. Los paneles A a C muestran la produccion de gas acumulada en los tiempos de medicion indicados. Las barras de error indican el EE entre las repeticiones de los recipientes de simulacion y los asteriscos la diferencia estadfstica respecto al control que contema Ca(NO3)2 + MgSO4 (denominado “Nada”) con la prueba t.

La figura 5 muestra la produccion de metano en la simulacion ruminal con diferentes productos de ensayo. El panel A muestra la produccion de metano acumulada despues de la simulacion de 12 h, y el panel B la proporcion de metano en el gas total producido. Las barras de error indican el EE entre las repeticiones de los recipientes de simulacion y los asteriscos la diferencia estadfstica respecto al control que contema Ca(NO3)2 + MgSO4 (denominado “Nada”) con la prueba t.

La figura 6 muestra la concentracion residual de nitrato en la simulacion ruminal con diferentes productos de ensayo. Los paneles A a C muestran la concentracion residual de nitrato despues de 2, 4 y 12 h de fermentacion, respectivamente. Las barras de error indican el EE entre las repeticiones de los recipientes de simulacion y los asteriscos la diferencia estadfstica respecto al control que contema Ca(NO3)2 + MgSO4 (denominado “Nada”) con la prueba t.

La figura 7 muestra la concentracion residual de nitrito en la simulacion ruminal con diferentes productos de ensayo. Los paneles A a C muestran la concentracion residual de nitrito despues de 2, 4 y 12 horas de fermentacion, respectivamente. Las barras de error indican el EE entre las repeticiones de los recipientes de simulacion y los asteriscos la diferencia estadfstica respecto al control que contema Ca(NO3)2 + MgSO4 (denominado “Nada”) con la prueba t.

La figura 8 muestra la concentracion residual de amoniaco en la simulacion ruminal con diferentes productos de ensayo. Los paneles A a C muestran la concentracion residual de amonio despues de 2, 4 y 12 horas de fermentacion, respectivamente. Las barras de error indican el EE entre las repeticiones de los recipientes de simulacion y los asteriscos la diferencia estadfstica respecto al control que contema Ca(NO3)2 + MgSO4 (denominado “Nada”) con la prueba t.

Descripcion detallada de la invencion

Un primer aspecto de la invencion se refiere a un complemento de pienso para animales que comprende 10-100% de una combinacion de un compuesto de nitrato y un compuesto de sulfato.

En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo “comprender” y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitante para significar que estan incluidos los elementos que siguen a la palabra, pero elementos no mencionados espedficamente no estan excluidos. Ademas, la referencia a un elemento por el artfculo indefinido “un” o “una” no excluye la posibilidad de que este presente mas de un elemento, salvo que el contexto claramente requiera que haya uno y solo uno de los elementos. Por lo tanto, el artfculo indefinido “un” o “una” normalmente significa “al menos uno”.

Como se usa en la presente memoria, la expresion “complemento de pienso para animales” se refiere a una premezcla de aditivos concentrada que comprende los ingredientes activos, cuya premezcla o complemento se pueden anadir a un pienso o racion para animales para formar un pienso enriquecido de acuerdo con la presente invencion. Las expresiones “premezcla de pienso para animales”, “complemento de pienso para animales” y “aditivo de pienso para animales” en general se considera que tienen significados similares o identicos y en general se consideran intercambiables. Tfpicamente, el complemento de pienso para animales de la presente invencion esta en forma de un polvo o solido compactado o granulado. En la practica, tfpicamente se puede dar al ganado el

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complemento de pienso para animales anadiendolo directamente en la radon, p. ej., como el llamado top-dress, o se puede usar en la preparacion o fabricacion de productos tales como piensos compuestos para animales o bloques para lamer, que se describiran con mas detalle en lo sucesivo. La invencion no esta particularmente limitada en relacion con esto. ^picamente un complemento, de acuerdo con la invencion, se suministra a un animal en una cantidad en el intervalo de 16-2500 g/animalMa.

El presente complemento de pienso para animales comprende un compuesto de nitrato, tipicamente un compuesto de nitrato fisiologicamente aceptable o tolerado. De acuerdo con la invencion, el N del nitrato tiene que estar facilmente disponible par la reduccion por los microorganismos del rumen o intestino y el compuesto de nitrato debe tener suficiente solubilidad en agua. Por lo tanto, de acuerdo con esta invencion, el compuesto de nitrato preferiblemente es un compuesto de nitrato ionico, lo mas preferiblemente una sal de nitrato inorganico, tal como nitrato sodico, nitrato potasico, nitrato de calcio, nitrato amonico, todos los cuales son facilmente solubles en agua a temperatura y presion estandar. Ademas, desde la perspectiva de salud y seguridad, tfpicamente se prefiere usar complejo de sales de nitrato inorganicas, tales como el compuesto representado por la formula 5-Ca(NO3)2'NH4NO3-10H2O, que esta disponible en el mercado en Yara con el nombre comercial “Calcinit”.

El presente complemento de pienso para animales tambien comprende un compuesto de sulfato, tfpicamente un compuesto de sulfato fisiologicamente aceptable o tolerado. De acuerdo con la invencion se prefiere que el compuesto de sulfato sea un compuesto de sulfato ionico, lo mas preferiblemente seleccionado del grupo de sales de sulfato inorganicas, muchas de las cuales son muy solubles en agua. Las excepciones incluyen sulfato de calcio. Se prefiere en particular que el presente compuesto de sulfato se seleccione del grupo de sales de sulfato inorganicas solubles, que incluyen sulfato sodico, sulfato potasico, sulfato de magnesio, sulfato de cinc, sulfato de manganeso, sulfato de cobre y sulfato ferroso.

En realizaciones preferidas de la invencion, el complemento comprende la combinacion del compuesto de nitrato y el compuesto de sulfato en una cantidad en el intervalo de 10-100% en peso, preferiblemente dicha cantidad es superior a 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97 o 99% en peso, basado en el peso seco.

Puesto que la presente invencion en parte se basa en el descubrimiento de que, para el proposito de reducir la metanogenesis gastrointestinal en el rumiante, el nitrato y el sulfato son en parte intercambiables, la relacion molar entre el nitrato y el sulfato en el complemento puede estar tfpicamente en el intervalo de 100:1-1:50, mas preferiblemente de 50:1-1:10, 25:1-1:5, o 10:1-1:2.5, y lo mas preferiblemente 5:1-1:1.

La combinacion del compuesto de nitrato y el compuesto de sulfato en el complemento del pienso de la invencion, tfpicamente proporciona una cantidad total de nitrato y sulfato superior a 50 g/kg, basado en el peso seco. En una realizacion preferida, dicha cantidad total de nitrato y sulfato es superior a 75 g/kg, mas preferiblemente 90 g/kg, lo mas preferiblemente 100 g/kg. En la practica dicha cantidad tfpicamente es inferior a 750 g/kg. En otra realizacion preferida, la cantidad de sulfato en el complemento de pienso es superior a 25 g/kg, mas preferiblemente 40 g/kg, los mas preferiblemente 50 g/kg basado en el peso seco. Tfpicamente dicha cantidad no es superior a 250 g/kg, preferiblemente no es superior a 200 g/kg, lo mas preferiblemente no es superior a 165 g/kg. En otra realizacion preferida, la cantidad de nitrato en el complemento de pienso es superior a 20 g/kg, mas preferiblemente 30 g/kg, lo mas preferiblemente 40 g/kg, basado en el peso seco. Tfpicamente, dicha cantidad es inferior a 600 g/kg, mas preferiblemente inferior a 550 g/kg, basado en el peso seco.

Todas las cantidades y/o dosificaciones de “nitrato” y/o “sulfato” usadas en la presente memoria, salvo que se indique otra cosa, se refieren al peso de nitrato y/o sulfato comprendido en o proporcionado por los compuestos de nitrato y/o sulfato, con respecto al peso seco total de la composicion, como entendera el experto en la tecnica. Esta dentro de la experiencia del profesional entrenado determinar exactamente las cantidades ideales de los componentes que se van a incluir en el complemento y las cantidades del complemento que se usan en la preparacion de la racion o el pienso compuesto para animales, etc., teniendo en cuenta el tipo espedfico de animal y las circunstancias en las que se mantiene. Las dosificaciones preferidas de cada componente se dan a continuacion.

Los complementos de piensos para animales de la presente invencion pueden comprender cualquier ingrediente adicional sin salirse del alcance de la invencion. Tfpicamente pueden comprender excipientes bien conocidos que son necesarios para preparar la forma de producto deseada y pueden comprender aditivos adicionales dirigidos a mejorar la calidad del pienso y/o mejorar el rendimiento del consumo del complemento por el animal. Los ejemplos adecuados de dichos excipientes incluyen vehnculos o cargas, tales como lactosa, sacarosa, manitol, almidon, celulosa cristalina hidrogenocarbonato sodico, cloruro sodico y similares y aglutinantes, tales como goma arabiga, goma de tragacanto, alginato sodico, almidon, PVP y derivados de celulosa, etc. Los ejemplos de aditivos de piensos conocidos para los expertos en la tecnica incluyen vitaminas, aminoacidos y oligoelementos, potenciadores de la digestibilidad y estabilizantes de la flora intestinal y similares.

En una realizacion preferida, el complemento de pienso para animales comprende adicionalmente un microorganismo probiotico reductor de nitrito. Como se usa en la presente memoria, la expresion “microorganismo probiotico de nitrito” se refiere a microorganismos vivos que cuando se administran en cantidades adecuadas confieren un beneficio a la salud del hospedante, reduciendo el nitrito que se acumula en el rumen y/o intestino a amonio, como se ha explicado en lo que antecede. Los expertos en la materia conocen muchos ejemplos de dichos

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microorganismos reductores de nitrito. Los ejemplos preferidos de microorganismos probioticos reductores de nitrito incluyen bacterias ruminales e intestinales que tienen actividad de nitrito reductasa, Propionibacterium acidiproprionici, bacterias corineformes, Bacillus subtilis, bacterias del genero Methylophilus, Actinomyces y Escherichia coli W3110. Lo mas preferiblemente, de acuerdo con la presente invencion, el microorganismo probiotico reductor de nitrito se selecciona del grupo de Megasphaera elsdenii, en particular cepas ruminales de las mismas, y Propionibacterium acidipropionici, en particular Propionibacterium acidipropionici cepa P5, registrada con el numero de acceso 55467 en la coleccion de microorganismos de the American Type Culuture Collection (ATCC) y disponible en el mercado como “Bova- Pro® concentrate” de Agtech Products Inc.

En una realizacion preferida, se proporciona un complemento de pienso para animales como se ha definido en lo que antecede, que comprende adicionalmente dicho microorganismo probiotico reductor de nitrito en una cantidad de 1,0*108-1,0*1o14 ufc/kg, mas preferiblemente 1,0*109-1,0*1013 ufc/kg, lo mas preferiblemente 1,0*1010-1,0*1012 ufc/kg, por ejemplo 1,0*1011 ufc/kg, basado en el peso seco. Como conocen los expertos en la tecnica, la unidad formadora de colonia (UFC) es una medida de cifras de bacterias u hongos viables. A diferencia de los recuentos directos con microscopio donde se cuentan todas las celulas, vivas y muertas, las UFC miden las celulas viables y se determinan, por ejemplo, extendiendo una muestra (diluida) sobre una placa de agar, o agar tripticasa soya y contando las colonias asf obtenidas.

Ademas, los autores de la presente invencion han encontrado que se obtienen buenos resultados cuando se administra acido lactico o un compuesto de lactato. Sin querer estar limitado por ninguna teona particular, se cree que el complemento de acido lactico o lactato puede potenciar la eficacia de los microorganismos probioticos. Por lo tanto, en una realizacion preferida, se proporciona un pienso compuesto para animales como se ha definido en lo que antecede, que comprende adicionalmente una cantidad eficaz de lactato o un acido lactico, preferiblemente comprende acido lactico o lactato en una cantidad superior a 20 g/kg, mas preferiblemente 30 g/kg, lo mas preferiblemente 40 g/kg, basado en el peso seco.

Un aspecto adicional de la invencion se refiere a productos tales como piensos compuestos para animales y bloques para lamer, que comprenden un complemento como se define en lo que antecede.

Por lo tanto, en un aspecto, se proporciona una composicion de pienso compuesto para animales que comprende una combinacion de un compuesto de nitrato y un compuesto de sulfato, proporcionando dicha combinacion una cantidad total de nitrato y sulfato superior a 10 g/kg, basado en el peso seco.

La expresion “composicion de pienso compuesto para animales” como se usa en la presente memoria, significa una composicion que es adecuada para usar como un pienso para animales y que es una mezcla de varias bases naturales o no naturales o materias primas y/o aditivos. Por lo tanto, en particular, el termino “compuesto” se usa en la presente memoria para distinguir las presentes composiciones de piensos para animales de cualquier materia prima que se encuentra de forma natural. Estas mezclas o piensos compuestos se formulan de acuerdo con requisitos espedficos del animal objetivo. Los ingredientes principales usados en los piensos compuestos preparados comercialmente tipicamente incluyen salvado de trigo, salvado de arroz, harina de mafz, granos de cereales, tales como cebada, trigo, centeno y avena, harina de soja, harina de alfalfa, polvo de trigo y similares. Un pienso compuesto comercial comprendera tfpicamente no menos de 15% de protema bruta y no menos de 70% de nutrientes totales digeribles, aunque la invencion no esta particularmente limitada en relacion con esto. Estan abarcadas dentro del alcance de la presente invencion composiciones de piensos compuestos para animales lfquidas, solidas, asf como semisolidas, siendo particularmente preferidas las formas solidas y semisolidas. Estas composiciones tfpicamente se fabrican como tipos de harinas, pellets o desmenuzados. En la practica, el ganado se puede alimentar tfpicamente con una combinacion de pienso compuesto, tal como el de la presente invencion, y forraje ensilado o heno o similares. Tfpicamente, un pienso compuesto para animales se suministra en una cantidad en el intervalo de 0,3-10 kg/animal/dfa. Esta dentro de las habilidades del experto determinar las cantidades adecuadas de estos componentes que hay que incluir en el pienso compuesto para animales, teniendo en cuenta el tipo de animal y las circunstancias en las que se mantiene.

La combinacion de compuesto de nitrato y compuesto de sulfato en el pienso compuesto para animales de la invencion, proporciona tfpicamente una cantidad total de nitrato y sulfato superior a 10 g/kg, basado en el peso seco. En una realizacion preferida dicha cantidad total de nitrato y sulfato es superior a 15 g/kg, mas preferiblemente 17,5 g/kg, lo mas preferiblemente 20 g/kg. En la practica dicha cantidad tfpicamente es inferior a 750 g/kg, preferiblemente inferior a 500 g/kg, mas preferiblemente inferior a 250 g/kg. En otra realizacion preferida, la cantidad de sulfato en el pienso compuesto para animales es superior a 5 g/kg, mas preferiblemente 7,5 g/kg, 10 g/kg, o 12 g/kg, basado en el peso seco. Tfpicamente dicha cantidad no es superior a 200 g/kg, preferiblemente no es superior a 175 g/kg, lo mas preferiblemente no es superior a 150 g/kg. En otra realizacion preferida, la cantidad de nitrato en el pienso compuesto es superior a 5 g/kg, mas preferiblemente 7,5 g/kg, lo mas preferiblemente 10 g/kg, basado en el peso seco. Tfpicamente dicha cantidad es inferior a 600 g/kg, mas preferiblemente inferior a 500 g/kg, lo mas preferiblemente inferior a 250 g/kg, basado en el peso seco. Ademas, en una realizacion preferida, se proporciona un pienso compuesto para animales como se define en lo que antecede, que comprende adicionalmente el microorganismo probiotico reductor de nitrito en una cantidad de 1,0*108-1,0*1014 ufc/kg, mas preferiblemente 1,0*109-1,0*1013 ufc/kg, lo mas preferiblemente 1,0*1010-1,0*1012 ufc/kg. Ademas, en una realizacion preferida, se proporciona un pienso animal como se define en lo que antecede, que ademas comprende una cantidad eficaz de

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lactato o acido lactico, preferiblemente en una cantidad superior a 5 g/kg, mas preferiblemente 7,5 g/kg, lo mas preferiblemente 10 g/kg.

Las composiciones de piensos compuestos para animales de la invencion pueden comprender cualquier aditivo de pienso adicional tipicamente usado en la tecnica. Como conocen los expertos en la materia, la expresion “aditivo de pienso” en este contexto se refiere a productos usados en la nutricion animal para los fines de mejorar la calidad del pienso y la calidad de los alimentos de origen animal, o mejorar el rendimiento de los animales, p. ej., proporcionando una mayor digestibilidad de los materiales del pienso. Los ejemplos no limitantes incluyen aditivos tecnologicos tales como conservantes, antioxidantes, emulsionantes, agentes estabilizantes, reguladores de la acidez y aditivos de ensilado; aditivos sensoriales, en especial aromas y colorantes; aditivos nutricionales (adicionales), tales como vitaminas, aminoacidos y oligoelementos; y aditivos zootecnicos (adicionales), tales como potenciadores de la digestibilidad y estabilizantes de la flora intestinal.

Como estara claro para los expertos en la tecnica, las presentes composiciones de piensos compuestos para animales pueden comprender cualquier ingrediente o aditivo adicional, sin salirse del alcance de la invencion.

En un aspecto adicional, la invencion proporciona una piedra para lamer o bloque para lamer que comprende el complemento de la invencion. Como conocen los expertos en la tecnica dichas piedras o bloques para lamer son particularmente convenientes para suministrar complementos minerales (asf como protemas e hidratos de carbono) a los rumiantes que pastan tanto pastos naturales como cultivados o cualquiera de ellos. Dichos bloques para lamer o piedras para lamer de acuerdo con la presente invencion tipicamente comprenden, ademas de la combinacion del compuesto de nitrato y el compuesto de sulfato y el microorganismo probiotico reductor de nitrito optimo de la invencion, diferentes tipos de aglutinantes, p. ej., cementos, yeso, cal, fosfato calcico, carbonato y/o gelatina; y opcionalmente aditivos adicionales tales como vitaminas, oligoelementos, sales minerales, aditivos sensoriales, etc.

La combinacion del compuesto de nitrato y el compuesto de sulfato en el bloque para lamer de la invencion tipicamente proporciona una cantidad total de nitrato y sulfato superior a 15 g/kg, basado en el peso seco. En una realizacion preferida, dicha cantidad total de nitrato y sulfato es superior a 25 g/kg, mas preferiblemente 30 g/kg. En la practica dicha cantidad tfpicamente es inferior a 450 g/kg, preferiblemente inferior a 400 g/kg. En otra realizacion preferida, la cantidad de sulfato en el bloque para lamer es superior a 3 g/kg, mas preferiblemente 5 g/kg, lo mas preferiblemente 6 g/kg, basado en el peso seco. Tfpicamente dicha cantidad no es superior a 150 g/kg,

preferiblemente no es superior a 100 g/kg, lo mas preferiblemente no es superior a 75 g/kg. En otra realizacion

preferida, la cantidad de nitrato en el bloque para lamer es superior a 10 g/kg, mas preferiblemente 20 g/kg, lo mas preferiblemente 25 g/kg, basado en el peso seco. Tfpicamente dicha cantidad es inferior a 400 g/kg, mas

preferiblemente inferior a 300 g/kg, basado en el peso seco. En una realizacion preferida, se proporciona un bloque

para lamer como se define en lo que antecede, que comprende ademas el microorganismo probiotico reductor en una cantidad de 1,0*108-1,0*1014 ufc/kg, mas preferiblemente 1,0*109-1,0*1013 ufc/kg, lo mas preferiblemente 1,0*1010-1,0*1012 ufc/kg.

Un aspecto adicional de la invencion se refiere a un metodo de reduccion de la produccion de metano gastrointestinal en un rumiante, comprendiendo dicho metodo administrar al rumiante una cantidad eficaz de una combinacion del compuesto de nitrato y el compuesto de sulfato, en donde dicho metodo no es terapeutico.

La expresion “reducir la metanogenesis gastrointestinal” como se usa en la presente memoria se refiere a la reduccion de la produccion de gas metano en el tracto gastrointestinal. Como se ha explicado antes en la presente memoria, la fermentacion en el rumen y el intestino de un rumiante da lugar a la produccion de gas metano por los llamados metanogenos. La presente invencion se dirige a reducir este proceso, de modo que se reduzca la excrecion de metano directamente del tracto gastrointestinal. Esta dentro de las habilidades de los expertos en la tecnica evaluar la excrecion de metano por un animal. Como se ha explicado antes, la produccion de metano en el rumen y el intestino es un proceso que ocurre normalmente en animales sanos y la disminucion de la metanogenesis no potencia o disminuye el estado general de salud o bienestar del rumiante. No obstante, una reduccion de la formacion de metano usando la combinacion de un compuesto de nitrato y un compuesto de sulfato puede aumentar la eficacia del uso de nutrientes del animal, de modo que el presente metodo puede potenciar el crecimiento y/o productividad del animal.

Como reconoceran facilmente los expertos en la tecnica, el presente metodo de tratamiento no sera eficaz en un estado conocido como “meteorismo”. El meteorismo es una afeccion descrita habitualmente como una distension anormal del rumen como una consecuencia de la acumulacion de gas en el rumen. El gas (dioxido de carbono, metano y otros gases) es producido normalmente durante la fermentacion ruminal y normalmente es eructado a traves del esofago, previniendo la acumulacion de gases. Durante la incidencia del meteorismo, el esofago es bloqueado por una capa de espuma. La abertura del esofago contiene receptores que bloquean el esofago si se detecta lfquido (o espuma). La espuma que se forma durante el meteorismo, procede de la rapida fermentacion de partfculas de pienso pequenas. La causa del meteorismo es la formacion de espuma y no la produccion de gases ruminales, que es un proceso que ocurre de forma natural den el rumiante. Como consecuencia, la produccion de metano no puede verse como la causa del meteorismo y la reduccion de metano no puede verse como un tratamiento para el meteorismo. El tratamiento terapeutico contra el meteorismo esta dirigido a la prevencion de la formacion de la capa de espuma en el rumen o su eliminacion, no a la prevencion de la produccion de gases

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ruminales. Ademas, el dioxido de carbono es el gas principal producido durante la fermentacion ruminal. El presente metodo, por lo tanto, tampoco esta dirigido ni es adecuado para el tratamiento del meteorismo o para aliviar los smtomas del mismo.

Por lo tanto, el presente metodo de tratamiento es un metodo de tratamiento no terapeutico, es decir, el metodo no mejora la salud de un animal que padezca una afeccion particular, no previene una enfermedad o afeccion particulares, ni tampoco afecta en ninguna medida a la salud del rumiante de ninguna otra forma, es decir, comparado con un rumiante que no recibe el presente metodo de tratamiento. Las ventajas del presente metodo estan limitadas a aspectos medioambientales y/o economicas como se ha explicado antes.

Taxonomicamente, un rumiante es un mamffero del orden Artiodactyla que digiere alimento basado en plantas ablandandolo inicialmente dentro del primer estomago del animal, conocido como el rumen, despues regurgitando la masa semidigerida, conocida ahora como bolo alimenticio, y masticandolo de nuevo. El proceso de remasticado del bolo alimenticio para romper mas la materia vegetal y estimular la digestion se llama “rumia”. Los animales rumiantes incluyen vacas, cabras, ovejas, jirafas, bisontes, yaks, bufalos de agua, ciervos, camellos, alpacas, llamas, nus, antflopes, berrentos y ciervos nilgai. La presente invencion se refiere principalmente a metodos de tratamiento de rumiantes domesticados, en especial los mantenidos para la cna de ganado comercial. Por lo tanto, en una realizacion preferida de la invencion, el rumiante se selecciona del grupo de ganado, cabras, ovejas y bufalos.

Una realizacion preferida de la invencion proporciona un metodo como se ha descrito antes, en donde se administra la combinacion del compuesto de nitrato y el compuesto de sulfato al rumiante en una cantidad que proporciona una dosificacion total de nitrato y sulfato superior a 0,05 g/kg de peso corporal al dfa. En una realizacion preferida dicha dosificacion total de nitrato y sulfato en el presente metodo esta en el intervalo de 0,05-10 g/kg de peso corporal al dfa, mas preferiblemente 0,1-5 g/kg de peso corporal al dfa, lo mas preferiblemente 0,2- 2,5 g/kg de peso corporal al dfa.

En otra realizacion preferida, se proporciona un metodo como se define en lo que antecede, en donde la dosificacion de sulfato esta en el intervalo de 0,025-1,8 g/kg de peso corporal al dfa, mas preferiblemente en el intervalo de 0,050,9 g/kg de peso corporal al dfa, lo mas preferiblemente 0,1-0,45 g/kg de peso corporal al dfa.

En otra realizacion preferida, se proporciona un metodo como se define en lo que antecede, en donde la dosificacion de nitrato esta en el intervalo de 0,025-8 g/kg de peso corporal al dfa, mas preferiblemente 0,05-4 g/kg de peso corporal al dfa, lo mas preferiblemente 0,1-2 g/kg de peso corporal al dfa.

Las dosificaciones definidas en la presente memoria como la cantidad por kg de peso corporal al dfa, se refieren a la cantidad media del respectivo compuesto durante un periodo de tratamiento dado, p. ej., durante una semana o un mes de tratamiento. Por lo tanto, los compuestos se pueden administrar cada dfa, en dfas alternos, cada dos dfas, etc., sin salirse del alcance de la invencion. Pero preferiblemente, el metodo comprende la administracion diaria de la combinacion del compuesto de nitrato y el compuesto de sulfato en las dosificaciones prescritas. Incluso mas preferiblemente, la combinacion se administra durante la alimentacion del animal cada vez que se alimenta al animal, en cantidades que dan las dosificaciones diarias anteriores.

Como se ha explicado antes, la capacidad de la microflora ruminal para reducir el nitrato a nitrito de animales no adaptados previamente al nitrato en su dieta, supera su capacidad para reducir el nitrito a amoniaco. Esto puede dar como resultado una acumulacion neta de nitrito en el rumen, que es absorbido rapidamente a traves de la pared del rumen y convierte la hemoglobina de la sangre de la forma ferrosa a la ferrica, metahemoglobina, haciendo que la molecula de hemoglobina sea incapaz de transportar oxfgeno a los tejidos. La afeccion resultante, la metahemoglobinemia, es un estado de anoxia general, que en casos leves puede deprimir el rendimiento del animal, pero en casos graves puede dar como resultado la muerte del animal. Los autores de la presente invencion han establecido que, en el presente metodo, la introduccion por pasos, cuidadosa, del nitrato en la dieta de ovejas permite que la microflora ruminal se adapte y aumente su capacidad para reducir tanto el nitrato como el nitrito. Se ha mostrado que la oveja adaptada lentamente a dietas con alto contenido en nitrato, no experimenta signos clmicos de metahemoglobinemia. Por lo tanto, en una realizacion preferida de la invencion, el metodo comprende una primera fase de adaptacion al nitrato y una segunda fase de tratamiento continuado, comprendiendo dicha primera fase dos o mas, preferiblemente tres o mas, periodos consecutivos de al menos 3 dfas, preferiblemente al menos 4 dfas, lo mas preferiblemente al menos 5 dfas, en donde la dosificacion diaria media de nitrato durante cada periodo es menor de 100% de la dosificacion diaria media administrada durante la segunda fase, y en donde la dosificacion diaria media durante cada periodo es mayor que la dosificacion diaria media durante el periodo precedente. En una realizacion preferida, el aumento de la dosificacion diaria media desde un periodo al siguiente es menor que 1 g/kg de peso corporal al dfa, preferiblemente menos de 0,5, mas preferiblemente menos de 0,25, lo mas preferiblemente menos de 0,1 g/kg de peso corporal al dfa. Preferiblemente, dicha segunda fase comprende un periodo de mas de 5, 10, 25, 50, 100, 250 o 350 dfas de administracion de la combinacion del compuesto de nitrato y el compuesto de sulfato en una dosificacion diaria media en el intervalo de 0,15-3 g/kg de peso corporal.

Los metodos definidos antes, con o sin la fase de adaptacion inicial, en una realizacion preferida, tambien comprenden la administracion al rumiante del microorganismo probiotico reductor de nitrito como se ha definido en lo que antecede. Se prefiere en particular administrar dicho microorganismo probiotico en una cantidad de 1,0*105-

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El presente metodo puede comprender la administracion de la combinacion del compuesto de nitrato, el compuesto de sulfato y, opcionalmente, el microorganismo probiotico reductor de nitrito de acuerdo con los regfmenes de dosificacion descritos antes, durante un periodo de al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250 o 350 dfas. Como se ha indicado en lo que antecede, un aspecto interesante de la invencion esta en el hecho de que el presente metodo proporciona eficacias muy persistentes en la reduccion de la metanogenesis enterica, es decir, el efecto no disminuye a lo largo de periodos prolongados de tratamiento, p. ej., como resultado de aumentar la resistencia de microorganismos del rumen o intestino, haciendo asf factible el tratamiento a largo plazo del rumiante.

Como estara claro a partir de lo anterior, el presente metodo comprende la administracion oral de la combinacion del compuesto de nitrato y el compuesto de sulfato y, opcionalmente, el microorganismo probiotico reductor de nitrito. Preferiblemente, el tratamiento comprende la administracion oral de las composiciones de piensos compuestos para animales y/o los productos de complementos de piensos para animales como se ha definido en lo que antecede, aunque se pueden usar otras composiciones ingeribles por via oral lfquidas, solidas o semisolidas, sin salirse del alcance de la invencion, como entenderan los expertos en la materia.

De acuerdo con lo anterior, un aspecto mas de la invencion se refiere al uso de una composicion que comprende una combinacion del compuesto de nitrato y el compuesto de sulfato para una reduccion no terapeutica de la produccion de metano gastrointestinal en un rumiante. Se prefiere que el uso comprenda administrar la combinacion del compuesto de nitrato y el compuesto de sulfato al rumiante en una cantidad que proporcione una dosificacion total de nitrato y sulfato superior a 0,05 g/kg de peso corporal al dfa. Preferiblemente, el compuesto de nitrato y el compuesto de sulfato se usan en las dosificaciones descritas en lo que antecede. En otra realizacion preferida, el uso comprende ademas administrar al rumiante el microorganismo probiotico reductor de nitrito en las dosificaciones descritas en lo que antecede. Todavfa mas preferiblemente, se proporciona el uso de una cualquiera de las composiciones como se define en lo que antecede para la reduccion no terapeutica de la produccion de metano gastrointestinal en un rumiante.

Otro aspecto de la invencion se refiere a tratamiento terapeuticos de rumiantes que reciben nitrato. Como se ha explicado antes, se sabe que el complemento de nitrato de los rumiantes ayudara a la disminucion de la metanogenesis gastrointestinal, pero tambien aumenta el riesgo de incidencia de la acumulacion de nitrito, el llamado “smdrome de toxicidad del nitrato” y/o de metahemoglobinemia, reduciendo la capacidad de la sangre para transportar oxfgeno al tejido del animal. Ademas, la acumulacion de nitrito en el rumen se sabe que reduce la actividad microbiana en el rumen, que, entre otras cosas, puede reducir la ingestion de pienso por el animal. Como se ha explicado antes, los autores de la presente invencion han establecido que la administracion a dichos rumiantes que reciben nitrato de un compuesto de sulfato, preferiblemente en combinacion con un microorganismo probiotico reductor de nitrito, reduce mucho o incluso previene estos efectos adversos.

Por lo tanto, un aspecto la invencion se refiere a un metodo de tratamiento o prevencion de la acumulacion de nitrito, el “smdrome de toxicidad del nitrato” y/o la metahemoglobinemia en rumiantes que reciben nitrato, que comprende la administracion a dicho rumiante de una cantidad eficaz del compuesto de sulfato, opcionalmente en combinacion con una cantidad eficaz del microorganismo probiotico reductor de nitrito.

Otro aspecto de la invencion se refiere a la preparacion que comprende el compuesto de sulfato, opcionalmente en combinacion con el microorganismo probiotico reductor de nitrito, para usar en el metodo de tratamiento o prevencion de la acumulacion de nitrito, el “smdrome de toxicidad del nitrato” y/o la metahemoglobinemia en rumiantes que reciben nitrato.

Otro aspecto mas de la invencion se refiere al uso del compuesto de sulfato opcionalmente en combinacion con el microorganismo probiotico reductor de nitrito, en la fabricacion de la preparacion para usar en un metodo para tratar o prevenir la acumulacion de nitrito, el “smdrome de toxicidad del nitrato” y/o la metahemoglobinemia en rumiantes que reciben nitrato.

De acuerdo con lo anterior, el metodo de tratamiento y/o prevencion de la acumulacion de nitrito, el “smdrome de toxicidad del nitrato” y/o la metahemoglobinemia, comprende tfpicamente la administracion de dichas composiciones en cantidades suficientes para proporcionar una dosificacion total de sulfato dentro del intervalo de 0,025-1,8 g/kg de peso corporal al dfa, mas preferiblemente 0,05-0,9 g/kg de peso corporal al dfa, lo mas preferiblemente 0,1-0,45 g/kg de peso corporal al dfa, y opcionalmente, una dosificacion total de dicho microorganismo probiotico de 1,0*10- 1,0*1014 ufc/kg de peso corporal al dfa, mas preferiblemente 1,0*107-1,0*1013 ufc/kg de peso corporal al dfa, lo mas preferiblemente 1,0*109-1,0*1012 ufc/kg de peso corporal al dfa. En una realizacion preferida, dicho metodo comprende administrar el microorganismo probiotico y administrar acido lactico o lactato. Se prefiere en particular administrar acido lactico o lactato en una cantidad de al menos 0,025 g/kg de peso corporal al dfa, mas

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preferiblemente 0,05-5 g/kg de peso corporal al d^a, lo mas preferiblemente 0,1-2,5 g/kg de peso corporal al d^a.

Como se usa en la presente memoria, la expresion “rumiante que recibe nitrato” se refiere a un rumiante que recibe cantidades sustanciales de nitrato, tipicamente a traves del pienso. Preferiblemente el rumiante recibe nitrato en cantidades suficientes para disminuir la metanogenesis gastrointestinal, mas preferiblemente en cantidades superiores a 0,025 g/kg de peso corporal al dfa, lo mas preferiblemente 0,05-8 g/kg de peso corporal al dfa. Como entenderan los expertos en la tecnica, el metodo puede ser igualmente adecuado para tratar o prevenir la acumulacion de nitrito, el “smdrome de toxicidad del nitrato” y/o la metahemoglobinemia en rumiantes que reciben cantidades sustanciales de nitrato para otros propositos o incluso de forma no deliberada, p. ej., como resultado de condiciones ambientales.

La invencion como se ha definido antes se ilustrara y explicara con mas detalle en la siguiente parte experimental, que no se pretende que limite el alcance de la invencion de ninguna forma.

Ejemplo I: Nitrato y sulfato en la mitigacion del metano

Material y metodos

Animales y alojamiento

En el presente experimento se evaluaron las propiedades reductoras de metano del nitrato y sulfato en la dieta. Tanto el nitrato como el sulfato se introdujeron lentamente en la dieta durante un periodo de adaptacion de 4 semanas. Se vigilaron la ingestion de pienso y el crecimiento durante el experimento. Se planteo la hipotesis de que tanto el nitrato como el sulfato de la dieta reducinan las emisiones de metano de la fermentacion enterica.

El Comite para el Cuidado y Uso de Animales del Grupo de Ciencias Animales, WUR, de Lelystad aprobo el protocolo de este experimento. El experimento se llevo a cabo en 20 corderos cruzados Texel, que pesaban 42,9 ± 4,3 kg (media ± desviacion estandar) al inicio del experimento. Durante una fase de adaptacion de 4 semanas a los aditivos de la dieta, los animales se alojaron en casetas para terneros individuales para permitir la alimentacion individual. Las ovejas se pesaron semanalmente para vigilar el crecimiento durante todo el experimento.

Despues del periodo de adaptacion, cuatro animales (un bloque) se alojo en camaras respiratorias de calorimetna indirecta durante una semana para determinar el intercambio gaseoso. En las siguientes semanas se introdujo un nuevo bloque de ovejas en las camaras cada semana. Cada camara respiratoria alojaba una oveja individual. Las camaras respiratorias de calorimetna se describen con detalle en Verstegen et al. (1987). La temperatura se mantuvo a l5°C, y la humedad relativa se fijo en 70%. La tasa de ventilacion era 70 l/min para un tipo de camaras y 90 l/min para el otro tipo.

Se analizo en el aire que entraba y salfa de las camaras el CO2, O2 y CH4 en intervalos de 9 min. La produccion neta y consumo de estos gases se calculo a partir de la diferencia en concentraciones entre el aire de entrada y de salida multiplicado por el flujo de aire y posteriormente recalculado para circunstancias estandar (0°C, 101 kPa, sin vapor de agua).

Diseno del experimento

El experimento se diseno como un diseno factorial 2x2, con nitrato y sulfato como factores. Los animales se distribuyeron en bloques por peso y posteriormente dentro de un bloque se asignaron aleatoriamente a cuatro tratamiento dieteticos: CON, NO3, SO4 o NO3+SO4.

Alimentacion

La dieta base consistfa en 74% de silaje de mafz, 16% de paja de cebada picada, 9% de harina de soja tratada con formaldetndo y 1% de una premezcla mineral, basado en la MS (materia seca). Los aditivos de la dieta se incluyeron en una mezcla (tabla 1) que se anadio a la dieta base en un 10% de MS de la dieta. Durante la alimentacion, las premezclas se mezclaron manualmente en las dietas. El agua estaba a libre disposicion durante el experimento. El nitrato se aporto de una fuente disponible en el comercio (Calcinit, Yara) y el aporte de SO4 se anadio a la dieta en forma de MgSO4 anhidro.

Durante la fase de adaptacion, se introdujo a las ovejas en las premezclas en etapas de 25% por semana. Los corderos se alimentaron una vez al dfa a las 8:30. Antes de la alimentacion de la manana, las sobras de comida se retiraban de las cestas de pienso y se pesaban para determinar la ingestion voluntaria de pienso. Durante la semana en las camaras respiratorias, la disponibilidad del pienso se restringio a 95% del pienso consumido por el animal que consumfa la menor cantidad de pienso dentro de un bloque, la semana anterior al alojamiento en las camaras respiratorias. La restriccion de pienso se aplico para evitar las interacciones entre el efecto de los aditivos en la IMS (ingestion de materia seca) y el efecto en la produccion de metano.

El nitrato en las dietas experimentales se intercambio por urea en la dieta de control para mantener las dietas isonitrogenadas. Se anadio piedra caliza a la dieta de control para asegurar la misma ingestion de Ca entre

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tratamientos. Se incluyo MgO en la dieta para obtener niveles de Mg similares entre dietas. El volumen de las diferentes adiciones a las dietas era diferente para cada tratamiento, y se uso celulosa de madera para equilibrarlo.

Tabla 1: Composicion de las mezclas que contienen los aditivos experimentales (% de MS)

CON NO3 SO4 NO3 + SO4

Harina de soja tratada con formaldelmdo

22 22 22 22

Urea

15 15

Fuente de nitrato2

38 38

MgSO4 (anhidro)

33 33

MgO

13 13

CaCO3

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Celulosa de madera

28 27 8 7

Nitrato anadido en la dieta

0 2,9 0 2,9

Sulfato anadido en la dieta

0 0 0,7 0,7

2formula qufmica 5Ca(NO3)2NH4NO3-10H2O

Toma de muestra de sangre, rumen e hngado

Se extrajo sangre los dfas d2, d8, d15, d22 y d28, 1, 3 y 5 h despues de alimentacion. Los dfas 2, 8, 15 y 22 eran todos 1 dfa despues de una etapa de aumento de 25% de la premezcla experimental en la dieta. El dfa 28, los corderos habfan estado tomando 100% de los tratamientos dieteticos durante una semana. Las muestras de sangre se recogieron en tubos de recogida que conteman heparina (Vacutainers) y se almacenaron directamente en el frigonfico despues de la extraccion. Al final del dfa de toma de muestra, las muestras se enviaron para el analisis y se analizaron al dfa siguiente. El contenido de metahemoglobina de la sangre se determino por los metodos descritos por Evelyn y Malloy (1938).

Despues de completarse el periodo en las camaras respiratorias, las ovejas se sacrificaron y se tomaron muestras de fluido ruminal (200 ml) del rumen tan pronto como fue posible despues del sacrificio. Las muestras se sumergieron en agua helada directamente despues de la toma de muestra para detener la fermentacion microbiana y se congelaron una vez que se habfan tomado todas las muestras. En el sacrificio, se tomaron muestras por duplicado del hfgado, se enfriaron y congelaron para la posterior evaluacion del estado de vitamina A.

Resultados y discusion

Contenido de metahemoglobina de la sangre durante el periodo de adaptacion

Durante el aporte en la dieta de 25% o 50% de la tasa de inclusion final de premezcla, ninguna de las ovejas tema un contenido de MetHb en sangre positivo (<2% de Hb). Cuando se incluyo 75% de la tasa de inclusion en la dieta una oveja con la dieta de NO3 dio la prueba positiva 3 h despues de alimentacion, pero el valor era solo 3% de la Hb. Cuando las ovejas estuvieron en el 100% de la tasa de inclusion durante una semana (d28), dos ovejas con el tratamiento de NO3 dieron la prueba positiva con valores de MetHb de 7% y 3% de la Hb respectivamente a las 3 h despues de alimentacion. Las ovejas en la dieta de control y en ambas dietas que conteman sulfato nunca dieron niveles de MetHb mayores que 2% de la Hb (lfmite de deteccion), indicando posiblemente que el S tiene una funcion en la reduccion de nitrito en el rumen.

El periodo de adaptacion de 4 semanas parece que era suficiente para prevenir cualquier problema significativo asociado con la toxicidad del nitrito y la metahemoglobinemia. Describieron un hallazgo similar Alaboudi y Jones (1985). Niveles de nitrato de 2,9% de MS se consideranan letales para rumiantes no adaptados, pero la adaptacion parece que permitfa que las bacterias ruminales aumentaran su capacidad de reducir el nitrito.

Ingestion de pienso y crecimiento durante la adaptacion al nitrato y sulfato de la dieta

La ingestion de pienso no era diferente como resultado de la adicion de NO3 o SO4 (tabla 2), pero tendfa a ser menor cuando se proporcionaba la dosis completa de nitrato. Sin embargo, con inclusiones de mas de 25% de la tasa de inclusion final, la ingestion de pienso se reducfa sistematicamente (aproximadamente 9% en el periodo mas alla de 1 semana) como resultado de la inclusion del NO3. El pequeno numero de animales usado en este estudio impide extraer conclusiones sobre los efectos en la ingestion de pienso, pero la menor ingestion de pienso sistematica no

debena ignorarse. Bruning-Fann y Kaneene (1993) describen que se han observado en las ovejas efectos negativos en la ingestion de pienso cuando los niveles de nitrato de la dieta superaban 3% de la MS se de la dieta. Esta reduccion de la ingestion de pienso puede estar relacionada con una depresion inducida por el nitrito de la digestion de la pared celular como demostro in vitro Marais et al. (1988).

5 El aporte de NO3 o SO4 no afecto a la ganancia de peso corporal (tabla 3).

Tabla 2: Ingestion de pienso (g/cordero/dfa) durante la etapa de adaptacion de 4 semanas a los aditivos de la dieta

Efectos principales Interaccion

Nitrato Sulfato Nitrato*Sufato

No Si P valor e.e.m. No Si P valor e.e.m. P valor e.e.m

Semana 1

2682 2686 0,995 85,7 2644 2724 0,500 84,2 0,112 118,6

Semana 2

2836 2591 0,105 100,7 2657 2770 0,425 98,9 0,156 139,3

Semana 3

2741 2526 0,177 103,8 2650 2618 0,836 102,0 0,39 143,7

Semana 4

2696 2411 0,096 104,2 2650 2457 0,216 102,3 0,136 144,1

Tabla 3: Peso corporal (PC; kg/cordero) y ganancia de peso corporal (GPC; kg/cordero/semana) durante la etapa de adaptacion a los aditivos de la dieta

Efectos principales Interaccion

Nitrato Sulfato Nitrato*Sulfato

No Si P valor e.e.m. No Si P valor e.e.m. P valor e.e.m.

PC dfa 0

42,7 43,0 0,605 0,51 43,2 42,4 0,285 0,51 0,433 0,72

PC dfa 7

43,8 43,6 0,810 0,55 44,2 43,1 0,199 0,55 0,137 0,77

PC dfa 14

44,9 44,7 0,741 0,57 45,2 44,3 0,287 0,57 0,176 0,80

PC dfa 21

45,2 45,2 0,985 0,72 45,7 44,7 0,336 0,72 0,240 1,08

PC dfa 28

45,7 45,5 0,858 0,81 46,4 44,8 0,182 0,81 0,346 1,15

GPC semana 1

1,11 0,54 0,363 0,426 0,95 0,70 0,685 0,426 0,685 0,602

GPC semana 2

1,16 1,08 0,815 0,236 1,04 1,20 0,641 0,236 0,815 0,334

GPC semana 3

0,30 0,59 0,482 0,282 0,51 0,38 0,750 0,399 0,788 0,399

GPC semana 4

0,48 0,25 0,715 0,436 0,67 0,06 0,342 0,436 0,836 0,616

GPC total

3,05 2,46 0,508 0,611 3,17 2,34 0,356 0,611 0,356 0,864

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Tabla 4: Ingestion de pienso, intercambio gaseoso y produccion de calor durante la semana de medicion en las camaras respiratorias

Efectos principales Interaccion

Nitrato Sulfato Nitrato*Sulfato

No Si P valor e.e.m. No Si P valor e.e.m. P valor e.e.m.

Ingestion de pienso (g/cordero/dfa)

2,39 2,38 0,782 0,02 2,39 2,38 0,631 0,020 0,350 0,03

Produccion de metano (l/cordero/dfa)

23,5 15,4 <0,001 1,06 21,5 17,5 0,02 1,06 0,94 1,50

Produccion de metano (l/kg0,75/dfa)

1,4 0,9 <0,001 0,07 1,3 1,0 0,05 0,07 0,90 0,10

Produccion de metano (l/kg ingestion pienso/dfa)

9,85 6,53 <0,001 0,44 8,99 7,4 0,025 0,44 0,91 0,62

Produccion de CO2 (l/kg0,75/dfa)

26,1 24,9 0,03 0,345 25,0 26,1 0,043 0,345 0,487 0,49

Consumo de O2 (l/kg0,75/dfa)

26,6 25,0 0,006 0,339 25,2 26,3 0,038 0,339 0,552 0,48

Produccion de calor (kJ/ kg0,75/dfa)

558 527 0,008 6,9 531 555 0,03 6,9 0,517 9,75

Efectos del NO3 y SO4 en intercambio gaseoso

Los flujos de gases determinados en las camaras respiratorias se muestran en la tabla 4. La alimentacion racionada que se aplico durante esta parte del experimento dio como resultado la ingestion de pienso muy similar entre los tratamientos. La produccion de metano se disminuyo en 34% como resultado de la adicion de la fuente de nitrato a la dieta.

La oveja con el tratamiento de NO3 en el presente experimento consumio una media de 24,9 kg de NO3 al dfa, lo que teoricamente reducina la produccion de metano en 6,4 g. La disminucion real de la produccion de metano en el tratamiento de NO3 era 8,1 litros, que corresponde a 5,8 g de CH4 (CH4 = 0,714 g/l). Por lo tanto, la disminucion en la produccion de metano es realmente algo menor de lo que se podna explicar por la estequiometna, lo cual se puede explicar por la reduccion incompleta del nitrato a amoniaco o el uso del nitrato en otros procesos distintos de la reduccion de nitrato. La fuente de nitrato usada en este estudio era muy soluble, y por lo tanto es probable que la mayor parte del nitrato estuviera disponible para la reduccion en el rumen. Sin embargo, la mayor parte del nitrato disuelto habna estado en la fase lfquida del rumen y puede haber pasado del rumen antes de ser reducido.

La adicion de sulfato condujo a una reduccion de 19% de la produccion diaria de metano.

En el presente estudio, las ovejas con el tratamiento de SO4 consumieron una media de 27,0 g de SO^dfa, lo que corresponded a una reduccion de metano de 4,5 g. La disminucion real observada en la reduccion de metano era 4 litros o 2,9 g. La diferencia en la capacidad teorica para el SO4 como sumidero de hidrogeno y su capacidad observada para reducir la emision de metano puede estar en la solubilidad de MgSO4 en el rumen.

Las ovejas con los tratamientos de SO4 se alimentaron con una cantidad considerable de S en la dieta (7,4 g de S anadidos/kg de MS). Este nivel esta por encima de las recomendaciones maximas como indica el NRC (4 g/kg de MS). El suministro por encima de este lfmite superior aumenta el riesgo de poilioencefalomalacia, debido a altos niveles de H2S que se producen en el espacio de cabeza del rumen y la posterior inhalacion de H2S. Sin embargo, los resultados de este experimento muestran que el SO4 es eficaz en la reduccion de la produccion de metano. Cuando se suministra dentro de los niveles recomendados (2-4 kg de S/kg de MS), se espera que el SO4 todavfa tenga un efecto reductor en la produccion de metano.

El consumo de oxfgeno y la produccion de CO2 eran ambos mas bajos como consecuencia del tratamiento con el nitrato. Se ha descrito que dosis altas de nitrato en las dietas de rumiantes producen metahemoglobinemia, reduciendo la capacidad de la sangre para transportar oxfgeno a los tejidos del animal. Sin embargo, en este experimento se tomaron muestras de sangre regularmente y se encontraron niveles de MetHb ligeramente elevados solo en dos ovejas (el nivel maximo era 7% de la Hb) y no parecfa probable que explicara el menor consumo de O2. El menor consumo de O2 puede reflejar un metabolismo diferente cuando se suministra nitrato. Sar et al. (2004) tambien observaron un menor consumo de O2 y menor produccion de CO2 cuando se administraron por via intraruminal 0,9 g de NO3/kg0,75 de PC a las ovejas. En este estudio se suministro considerablemente mas nitrato (1,4 g NO3/kg0, de PC), pero los niveles de MetHb en el estudio de los autores de la invencion eran considerablemente menores (18,4% de Hb en el estudio de Sar et al.). Esto se debe probablemente a la ausencia de un periodo de adaptacion en el estudio de Sar et al. (2004) y al hecho de que el nitrato se administro como una solucion en el rumen. En otro estudio (Takahashi et al., 1998) administraron NaNO3 en el rumen de ovejas a una velocidad de 1,5 g/kg de PC0,75, que era muy similar a la concentracion usada en el estudio de los autores de la

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invencion. Se observaron concentraciones de MetHb por encima de 30% y a partir de los datos del estudio se concluyo que por cada 10% de aumento de MetHb, el consumo de ox^geno disminma en 10,3%. En el estudio de los autores de la invencion se observo una reduccion del consumo de oxfgeno de 6%. Usando la ecuacion de regresion de (Takahashi et al., 1998) esto habna significado que los animales habnan tenido niveles de MetHb de aproximadamente 5%. En dos animales se observaron realmente niveles similares (3 y 7% de Hb).

La produccion de metano en el tratamiento de control era tfpica para la alimentacion racionada de la oveja una vez al dfa. Los animales se alimentaron a las 8 am, despues de lo cual la produccion de metano aumento progresivamente hasta alcanzar la produccion maxima de metano a las 5-6 h despues de alimentacion. Puesto que los animales teman la alimentacion racionada y solo se alimentaban una vez al dfa, la produccion de metano disminma sucesivamente despues del maximo. La adicion de nitrato a la racion dio lugar a un patron de produccion de metano notablemente diferente; inmediatamente despues de la alimentacion, la tasa de produccion de metano permanecio a un nivel mucho menor y se planteo la hipotesis de que en este periodo el hidrogeno era utilizado para la reduccion de nitrato, limitando asf la disponibilidad del H2 para la metanogenesis. Diez horas despues de la alimentacion, la tasa de produccion de metano ya no era diferente de la del tratamiento de control, reflejando probablemente la ausencia de pienso que contema nitrato y una vuelta a la metanogenesis como sumidero de H. Aunque la produccion de metano era significativamente menor despues de la alimentacion, como resultado del nitrato suministrado, la produccion de metano no se redujo nunca a 0 y la reduccion del nitrato y la metanogenesis ocunian simultaneamente. El nivel basal de la produccion de metano puede explicarse, al menos parcialmente, por la produccion de metano de la fermentacion en el intestino posterior. No es probable que el nitrato alcance el intestino posterior sin ser reducido y por lo tanto, el suministro de nitrato probablemente no influina en la produccion de metano en esta parte del tracto gastrointestinal.

La tasa de produccion de metano del tratamiento con SO4 no fue nunca diferente del tratamiento de control pero era sistematicamente menor que el tratamiento de control a lo largo del periodo entero de 24 h. Se observo lo mismo cuando el tratamiento de SO4 se comparo con el tratamiento de NO3 + SO4. Claramente, los efectos del NO3 y SO4 en la produccion de metano son complementarios y el efecto del SO4 parece que es menos dependiente de la disponibilidad del pienso que contiene SO4.

Los resultados del experimento tambien se representan en la grafica de la figura 1, que muestra la produccion de metano (l/h) a lo largo del transcurso de un periodo de 24 en los grupos que recibfan o bien dieta base o una de las tres dietas experimentales.

Consumo de oxfgeno a lo largo de un periodo de 24 h

Directamente despues de la alimentacion a las 8 am, el consumo de oxfgeno era 10-18% menor para el tratamiento de NO3. La diferencia en el consumo de oxfgeno entre los tratamientos desaparecio despues de las 16 pm. Este fenomeno coincide con la produccion de metano notablemente reducida en el periodo despues de la alimentacion para el tratamiento de NO3. Se plantea la hipotesis de que en este periodo se produce una reduccion de nitrato significativa en el rumen, con produccion de nitrito como producto intermedio en el tratamiento de NO3. La presencia de nitrito durante este periodo puede explicar el menor consumo de oxfgeno del tratamiento de NO3. Aunque no se observaron nunca niveles de MetHb mas alla de 7% de la Hb para el tratamiento de NO3, se observo una reduccion definida del consumo de oxfgeno. El tiempo de almacenamiento de las muestras (las muestras se analizaron aproximadamente 24 h despues de la toma de muestra) podna explicar los niveles de MetHb menores de los esperado.

En el tratamiento de NO3+SO4, el consumo de oxfgeno era solo menor directamente despues de la alimentacion (9 am) y se recuperaba al mismo nivel que el tratamiento de control despues de este tiempo de medicion. La adicion de SO4 parece que alivia la depresion en el consumo de oxfgeno provocado por el suministro de nitrato. Posiblemente, el SO4 era reducido a H2S en el periodo directamente despues de la alimentacion y tema una funcion en la aceleracion de la reduccion del nitrito, como se ha propuesto. Anteriormente se habfa encontrado una clara aceleracion dependiente de la dosis de la reduccion del nitrito cuando se anadfa sulfuro al fluido ruminal in vitro (Takahashi et al., 1989). La aceleracion en la reduccion de nitrito era mucho menor cuando se anadfa SO4 al medio y por lo tanto parece posible que fuera el H2S el que restaurara activamente el consumo de oxfgeno en el experimento de los autores de la invencion.

Los resultados del experimento tambien se representan en la grafica de la figura 2, que muestra el consumo de oxfgeno (l/kg MW/h) a lo largo del transcurso de un periodo de 24 h en los grupos que recibfan la dieta base o una de las tres dietas experimentales.

Ejemplo II: Efecto del sulfato en la metahemoglobinemia en ganado que recibe nitrato

Se evaluo el efecto de la ingestion de sulfato en la dieta en la concentracion de la metahemoglobina en la sangre de vacas que recibfan nitrato. Se planteo la hipotesis de que el sulfato de la dieta reducina la acumulacion de nitrito en el rumen de las vacas alimentadas con nitrato y por consiguiente prevendna la formacion de metahemoglobina en la sangre.

Material y metodos Diseno experimental

El experimento era un diseno de bloques aleatorizados, con 4 animales por bloque y diferentes dosis de sulfato como tratamientos. Los animales se distribuyeron en los bloques por la produccion de leche y posteriormente dentro 5 de un bloque se asignaron aleatoriamente a uno de los cuatro tratamientos dieteticos: NO3, NO3 + contenido bajo de SO4, NO3 + contenido medio de SO4, NO3 + contenido alto de SO4.

Alimentacion

La dieta base consistfa en 45% de silaje de mafz, 7,5% de alfalfa seca, 4,1% de paja de cebada picada, y 42% de una premezcla concentrada, basado en la MS. Los aditivos de la dieta se incluyeron en una premezcla (tabla 5). En 10 la alimentacion, las premezclas se suministraron a las vacas como parte de una racion mixta total. El agua estaba a libre disposicion durante el experimento. El nitrato se aporto de una fuente disponible en el mercado (Calcinit, Yara AS, Noruega) y el aporte de SO4 se anadio a la dieta en forma de MgSO4 anhidro.

Tabla 5. Composicion de las mezclas que conteman aditivos experimentales (% de la MS)

Tratamiento

Descripcion % basado en MS

NO3

Producto anadido SO4 Producto anadido

A

NO3 3 3,96 0,15 0,00

B

NO3 + contenido bajo de SO4 3 3,96 0,23 0,32

C

NO3 + contenido medio de SO4 3 3,96 0,32 0,63

D

NO3 + contenido alto de SO4 3 3,96 0,40 0,95

15 Durante la fase de adaptacion, se introdujeron en las vacas las premezclas experimentales en etapas del 25% por semana (tabla 6).

Tabla 6: Composicion de las combinaciones de concentrados experimentales durante la fase de adaptacion

Alimentacion

%

Concentrado de control

Premezcla de concentrado A, B, C o D

Dfa 8-14

75 25

Dfa 15-21

50 50

Dfa 22-28

25 75

Dfa 29-35

0 100

Extraccion de sangre

20 Se extrajo sangre 3 h despues de la alimentacion dos veces por semana a lo largo del experimento para vigilar de cerca la concentracion de metahemoglobina. La sangre se recogio en tubos en los que se hizo el vado, que conteman heparina, se sumergieron inmediatamente en agua enfriada con hielo y se almacenaron en el frigonfico a 4°C. Al final de cada dfa de toma de muestra, las muestras se enviaron para el analisis y se analizaron al dfa siguiente. El contenido de metahemoglobina en la sangre se determino por el metodo de Evelyn y Malloy (1938). El 25 dfa 37, cuando se suministro nitrato con su maxima tasa de inclusion (3% de nitrato basado en la MS), la extraccion de sangre se realizo con mas frecuencia (-0,5 h, 0,5 h, 1,5 h, 3 h, 5 h y 8 h) con el fin de establecer la cinetica del nitrato y sus diferentes metabolitos en el plasma.

Resultados y discusion

Contenido de metahemoglobina de la sangre durante el periodo de adaptacion

30 Ninguna de las vacas tema metahemoglobina detectable en la sangre durante el enriquecimiento de la dieta con 25% o 50% de la tasa de inclusion final de nitrato. Cuando el nitrato se anadio a la dieta en el 75% de la tasa de inclusion final, las vacas que no recibieron sulfato presentaron nivel elevado de hemoglobina en la sangre 3 h despues de la alimentacion. En cambio, las vacas a las que se dio sulfato en la dieta dieron la prueba para la metahemoglobina negativa, independientemente de la cantidad de S suministrado. Con la tasa de inclusion de 100% 35 del nitrato, todos los tratamientos presentaban un aumento de la metahemoglobina en la sangre, aunque la elevacion era mas pronunciada para las vacas que tomaban solo nitrato, comparado con aquellas a las que se les daba nitrato y sulfato. Entre las vacas que recibfan sulfato, no era posible distinguir un efecto de la dosis de sulfato (vease la tabla 7). Se concluyo que el sulfato podfa contrarrestar la acumulacion de nitrito en el rumen, previniendo asf (con adicion de nitrato moderada) o reduciendo (con adicion de nitrato alta) la formacion de metahemoglobina en 40 la sangre.

Tabla 7: Metahemoglobina en la sangre (% de hemoglobina)

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NO3 NO3 + contenido bajo de SO4 NO3 + contenido medio de SO4 NO3 + contenido alto de SO4 P valor

Metahemoglobina en la sangre (% de hemoglobina)

13,1a 2,6b 6,0b 4,8b 0,063

Las medias con diferentes supermdices son significativamente diferentes (P<0,1)

Los resultados del experimento tambien se representan en la grafica de la figura 3, que muestra la concentracion de metahemoglobina en la sangre de vacas que recibfan una de las cuatro dietas experimentales.

Ejemplo III: Efecto de Megasphaera elsdenii y Selenomonas ruminantium en la velocidad de reduccion de nitrato y 5 nitrito en el modelo de fermentacion ruminal

En el presente experimento, se estudiaron las cineticas de reduccion del nitrato en un sistema de fermentacion ruminal in vitro y los efectos en las mismas de M. elsdenii y S. ruminantium.

Materiales y metodos

El pienso usado en la simulacion ruminal era 1 gramo de materia seca y compuesto de silaje de pasto (0,5 g de 10 materia seca) y pienso compuesto comercial, 0,5 g de materia seca. Los tratamientos eran como se indican en la siguiente tabla:

Tratamiento

Modificaciones

1.

Sin modificacion

2.

57 mg de Calcinit/40 ml *'

3.

57 mg de Calcinit + 10 pl de M. elsdenii /40 ml*'

4.

57 mg de Calcinit + 100 pl de M. elsdenii /40 ml*'

5.

57 mg de Calcinit + 1000 de pl M. elsdenii /40 ml*'

6.

57 mg de Calcinit + 10 pl de M. elsdenii + 100 mg de lactato-Na/40 ml *'

7.

57 mg de Calcinit + 100 pl de M. elsdenii + 100 mg de lactato-Na/40 ml*'

8.

57 mg de Calcinit + 1000 pl de M. elsdenii + 100 mg de lactato-Na/40 ml*'

9.

57 mg de Calcinit + 10 pl de M. elsdenii + 200 mg de lactato-Na/40 ml*'

10.

57 mg de Calcinit + 100 pl de M. elsdenii + 200 mg de lactato-Na/40 ml*'

11.

57 mg de Calcinit + 1000 pl de M. elsdenii + 200 mg de lactato-Na/40 ml*'

12.

57 mg de Calcinit + 100 mg de lactato-Na/40 ml*'

13.

57 mg de Calcinit + 200 mg de lactato-Na/40 ml*'

14.

57 mg de Calcinit +10 pl de S. ruminantium/40 ml*'

15.

57 mg de Calcinit + 100 pl de S. ruminantium/40 ml*'

16.

57 mg de Calcinit + 1000 pl de S. ruminantium/40 ml*'

17.

57 mg de Calcinit /40 ml*'

18.

Sin modificaciones

*'Los tratamientos 2 a 17 contienen 7,52 mg de MgSO4 /40 ml

Todos los tratamientos se llevaron a cabo por cuadruplicado, siendo el numero total de recipientes de simulacion 72.

Los componentes del pienso seco y Calcinit se pesaron en botellas de suero, las botellas se purgaron con CO2 que 15 se paso a traves de un catalizador de cobre caliente para la depuracion de O2, y se sellaron con tapones de caucho de butilo gruesos. Se introdujeron 36,5 ml de solucion tampon anaerobia, reducida, ajustada a temperatura ambiente

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(+37°C), en cada recipiente de simulacion bajo flujo de CO2 exento de ox^geno. Se anadieron los cultivos bacterianos desarrollados durante la noche, solucion de MgSO4, solucion de lactato y solucion tampon para igualar el volumen de ffquido total a 1,5 ml/recipiente. Finalmente, se anadieron 2 ml de fluido ruminal colado reciente en las botellas de suero, siendo el volumen final 40 ml. Esta inoculacion empezo la simulacion ruminal real. Se registro el tiempo de inoculacion para cada recipiente y se tuvo en cuenta el tiempo de toma de muestra y de detencion de la fermentacion.

La simulacion de fermentacion ruminal continuo durante 12 h a 37°C. Durante la fermentacion la produccion de gas total se midio despues de 2, 4, 6, 9 y 12 horas de simulacion para hacerse una idea de la actividad metabolica general de los microbios ruminales.

Todo el gas producido durante las 12 horas en cada recipiente de simulacion se recogio individualmente de cada uno de los 72 recipientes en botellas de infusion de 2 litros a las que se ha hecho el vado, y en las que se habfa introducido previamente etano como un patron interno. Se analizo el metano de estas muestras para ver el efecto de los tratamientos en el metano total producido por bacterias ruminales durante las 12 h. El analisis se llevo a cabo por cromatograffa de gases usando un detector de ionizacion de llama y metano y etano puros como patrones.

A las 4 y 12 horas se analizo en todos los recipientes de simulacion los acidos grasos volatiles (VFA) y acido lactico (denominados colectivamente SCFA). Los acidos se analizaron por cromatograffa de gases usando una columna empaquetada para el analisis de acidos libres. Los SCFA cuantificados eran los acidos acetico, propionico, butffico, isobutffico, 2-metilbuffrico, valerico, isovalerico y lactico.

Se analizaron el NO3 y NO2 de todos los recipientes de simulacion a las 0, 2, 4 y 12 horas. El metodo era espectrofotometrico y basado en la reduccion de nitrato con vanadio (III) combinado con la deteccion de la reaccion de Griess acida.

Se analizo el NH4 de todos los recipientes de simulacion a las 0, 2, 4 y 12 horas. El metodo era colorimetrico y basado en la reaccion de fenol-hipoclorito.

El analisis estadfstico consisffa en pruebas t bilaterales para los todos los parametros medidos. Las pruebas se realizaron frente al tratamiento con modificacion con Calcinit y MgSO4 (tratamientos 2 y 17). La prueba t se eligio para dejar que los tratamientos individuales fueran independientes de los otros tratamientos ensayados simultaneamente. Los resultados estan indicados en las figuras, en donde 0,01 < p valor < 0,05 se indica como: *; 0,001 < p valor < 0,01 se indica como: **; 0,0001 < p valor < 0,001 se indica como: ***; y p valor < 0,0001 se indica como:****.

Resultados

Efecto de los tratamientos en la produccion de gas total

En este trabajo se inoculo en todos los recipientes 5% de fluido ruminal, pero ademas algunos recipientes recibieron una dosis de Selenomonas ruminantium o Megasphaera elsdenii. Estas bacterias eran los principales utilizadores de lactato en el rumen, y ademas, se cree que tienen la capacidad de reducir el nitrato y/o nitrito. M. elsdenii se ensayo tambien en combinacion con acido lactico, siendo el fundamento que el acido lactico es un sustrato para la bacteria y podna tener un efecto positivo en su competitividad en el microcosmo ruminal. Como se muestra en la figura 4, la adicion de NO3 y MgSO4 produjo una supresion significativa de la produccion de gas. Este efecto era mas pronunciado cuando pasaba el tiempo; casi 25% de la supresion de la produccion acumulativa de gas se midio en el tiempo de medicion de 12 h.

Cuando se comparo con el tratamiento enriquecido con nitrato, el inoculo de S. ruminantium tema un efecto positivo en la produccion de gas durante las primeras 4 horas. Este efecto era estadfsticamente significativo con dosis de 100 y 1000 pl/40 ml. La produccion de gas inicial tambien era estimulada por M. elsdenii, pero solo con la dosis mas alta de 1000 pl. Cuando se proporciono acido lactico, se suprimio la produccion de gas, lo cual puede deberse a su efecto inhibidor directo en el metabolismo de los microbioticos ruminales. El efecto estimulador de S. ruminantium no se detecto en los tiempos de medicion posteriores. Sin embargo, la dosis mas alta de M. elsdenii continuo aumentando la produccion acumulativa de gas, siendo el efecto positivo relativo incluso mas significativo en los tiempos de medicion posteriores. La adicion de acido lactico continuo suprimiendo la produccion de gas de forma dependiente de la dosis durante toda la incubacion. Sin embargo, en combinacion con el lactato, la dosis alta de M. elsdenii anulo la supresion metabolica y, de hecho, se convirtio en estimulacion de la produccion de gas. A pesar del hecho de que M. elsdenii estimulaba la produccion de gas general con dosis alta, no pudo superar completamente el efecto negativo del nitrato.

Efecto de los tratamientos en la produccion de metano

Los autores de la invencion cuantificaron el CH4 producido ademas de la produccion total de gas. En este estudio de fermentacion, la proporcion de metano del total producido era relativamente baja, quedando claramente por debajo de 10% (figura 5B). El nivel de produccion de metano depende de la dieta y del estado fisiologico de la vaca usada como donadora de fluido ruminal. En este caso, el animal era una vaca lechera que tomaba una dieta de alta

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ene^a. El nitrato en la dieta supriirna la produccion de metano absoluta en casi 80% (figura 5A).

Efecto de los tratamientos en la reduccion de nitrato

Se anadio una cantidad fija de nitrato en todos los recipientes de simulacion, excepto para los marcados “Sin modificaciones”, en forma del producto “Calcinit” (hasta una concentracion final de nitrato 14 mM). En este estudio de fermentacion, el metano total producido era de 7 a 8 ml en ausencia de nitrato y se redujo a 1,5 ml cuando se proporciono nitrato.

La concentracion de nitrato y los productos de su reduccion, nitrito y amonio, se analizaron despues de 2, 4 y 12 horas desde la inoculacion. Aunque se proporciono nitrato 14 mM a las 0 horas, se encontro solo aproximadamente una concentracion 10 mM de nitrato en el filtrado en todos los recipientes a las 2 horas. Ademas, el nitrato medido en solucion era el mismo o ligeramente mayor 2 horas mas tarde. Esto sugiere que el nitrato es absorbido rapidamente por la matriz solida o absorbido por la microbiota. Este equilibrio en el reparto se mantendna hasta que el consumo de nitrato por las bacterias alcanzara buena velocidad. En el presente estudio la toma de muestra final indicaba un colapso en el nivel de nitrato entre 4 y 12 horas (figura 6). El efecto de la dosis alta de la modificacion con M. elsdenii sugena que la reduccion de nitrato era desacelerada significativamente por la dosis alta de esta bacteria.

El analisis del nitrito en los tiempos de medicion de 2 y 4 horas estaba de acuerdo con los datos del nitrato. A las 2 horas, la concentracion de nitrito era inferior a 0,05 mM con todos los tratamientos, sugiriendo que la velocidad de reduccion del nitrato era baja (figura 7A). A las 4 horas, el nivel de nitrito habfa empezado a elevarse pero era todavfa inferior a 0,2 mM. Es importante destacar que aunque pareda que S. ruminantium aumentaba el nitrito de forma dependiente de la dosis, M. elsdenii lo reduda de forma dependiente de la dosis (figura 7B). Despues de 12 horas, el efecto de M. elsdenii estaba mas claro, puesto que en su ausencia la concentracion de nitrito habfa aumentado a 8 mM y se reduda de forma dependiente de la dosis cuando se anadfa la bacteria. Con la modificacion de M. elsdenii puro, era necesaria la dosis de 1000 pl para eliminar completamente el nitrito. Sin embargo, cuando se combinaba con el lactato, ya una dosis de 100 pl disminma la concentracion de nitrito al lfmite de deteccion (figura 7C). El efecto de aumento de nitrito de S. ruminantium ya no se detectaba mas a las 12 horas, sugiriendo que su funcion metabolica en el microcosmo del modelo ruminal era despreciable.

El amonio es el producto de reduccion final del nitrato/nitrito. Sin embargo, no es un producto que se pudiera esperar que se acumulara cuantitativamente en el sistema microbiano porque es una forma de nitrogeno que es asimilada facilmente por los microbios cuando no estan disponibles fuentes de nitrogeno organico, preferidas. Esta funcion transitoria del amonio hace imposible hacer calculos de equilibrio estequiometrico precisos. Pero, era obvio que cuando se anadfa nitrato 14 mM en el sistema de fermentacion, la concentracion residual de amonio 12 h mas tarde aumentaba de 10 a 18 mM. Cuando se anadfa tambien M. elsdenii en el medio de fermentacion, el nivel de amonio alcanzaba una concentracion de 23 a 31 mM dependiendo de la dosis de sustrato lactato adicional proporcionada (figura 8C). Estos datos muestran indiscutiblemente que la modificacion de nitrato conduce a la elevada produccion o acumulacion de amonio. Estos datos tambien sugieren fuertemente que M. elsdenii fortalece ademas este proceso metabolico. La concentracion residual de amonio alcanza el maximo con la dosis de 100 pl de M. elsdenii, y con la dosis de 1000 pl mostraba un descenso claro.

Conclusiones

Los datos presentados aqrn confirmaban una vez mas que el nitrato en la dieta reduce la produccion de metano. Tambien mostraban que el nitrato se reduce a nitrito y ademas a amonio. Este proceso pareda estar directamente conectado a la produccion de metano, puesto que las condiciones que preveman la reduccion cuantitativa del nitrato tambien redudan el grado de inhibicion de metanogenesis.

La modificacion con M. elsdenii no aceleraba la reduccion de nitrato sino que, de hecho, pareda que la inhibfa. En cambio, la bacteria reduda de forma dependiente de la dosis la concentracion residual de nitrito y, simultaneamente, aumentaba la concentracion de su producto de reduccion, el amoniaco. Estos datos sugenan que esta cepa no expresa nitrato reductasa funcional, pero cuandoquiera que alguna otra bacteria cataliza la reduccion de nitrato a nitrito, la cepa de M. elsdenii reduce facilmente el nitrito mas a amonio. Esta caractenstica hace que M. elsdenii sea un agente de prevencion ideal del envenenamiento por nitrito como resultado de la rapida produccion y acumulacion de nitrito por bacterias reductoras de nitrato.

De acuerdo con el conocimiento previo de los autores de la invencion, M. elsdenii no es un utilizador principal de lactato en las vacas lecheras. Sin embargo, en ganado vacuno que se ha estado alimentando con dietas con alto contenido de cereales las condiciones de M. elsdenii son favorables. La razon es que este utilizador de lactato es muy competitivo solo cuando el nivel de acido lactico en el rumen es alto. Esta caractenstica de la bacteria es la razon por la que se ensayo aqrn solo el efecto del acido lactico en la combinacion de M. elsdenii - acido lactico. Los efectos de M. elsdenii en diferentes parametros eran en la misma direccion estuviera o no incluido el acido lactico, pero cuando se proporcionaba acido lactico los efectos eran mas fuertes. Esto sugiere que la competitividad de M. elsdenii mejoraba mediante el lactato.

^Por que la dosis alta de M. elsdenii inhibfa la reduccion de nitrato? Aqu solo se pueden hacer conjeturas y la respuesta final solo podna venir de un estudio disenado espedficamente. Una posible explicacion es que M. elsdenii compite por algunos nutrientes vitales o cofactores con una bacteria reductora de nitrato principal. Puesto que el crecimiento de M. elsdenii no depende de la reduccion de nitrito y compite con el reductor de nitrato. Otra posible 5 explicacion es una inhibicion del producto final. La dosis alta de M. elsdenii conduce al aumento de la concentracion de amonio, lo que puede servir como un retroinhibidor de la reduccion de nitrato.

Referencias

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Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   REIVINDICACIONES

   1. Combinacion de un compuesto de nitrato y un compuesto de sulfato, para usar en un metodo de reduccion de la produccion de metano gastrointestinal en un rumiante, comprendiendo dicho metodo administrar al rumiante una cantidad eficaz de dicha composicion.
2. 2. Combinacion para usar segun la reivindicacion 1, en donde la combinacion del compuesto de nitrato y el compuesto de sulfato se administra al rumiante en una cantidad que proporciona una dosificacion total de nitrato y sulfato superior a 0,05 g/kg de peso corporal al dfa.
3. 3. Combinacion para usar segun la reivindicacion 2, en donde el compuesto de nitrato se administra al rumiante en una cantidad que proporciona una dosificacion de nitrato de 0,025-8 g/kg de peso corporal al dfa, y en donde el compuesto de sulfato se administra al rumiante en una cantidad que proporciona una dosificacion de sulfato de 0,025-1,8 g/kg de peso corporal al dfa.
4. 4. Combinacion para usar segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende ademas administrar al rumiante un microorganismo probiotico reductor de nitrito en una cantidad de 1*105-1*1014 ufc/kgMa.
5. 5. Combinacion para usar segun la reivindicacion 6, que ademas comprende administrar al rumiante una cantidad eficaz de un compuesto de lactato.
6. 6. Pienso compuesto para animales que comprende una combinacion de un compuesto de nitrato y un compuesto de sulfato, proporcionando dicha combinacion una cantidad total de nitrato y sulfato superior a 10 g/kg, en donde la cantidad de sulfato es superior a 7,5 g/kg basado en el peso seco.
7. 7. Pienso compuesto para animales segun la reivindicacion 6, en donde la cantidad de nitrato es superior a 7,5 g/kg basado en el peso seco.
8. 8. Pienso compuesto para animales segun la reivindicacion 6 o 7, que comprende adicionalmente un microorganismo probiotico reductor de nitrito, preferiblemente seleccionado del grupo de Megasphaera elsdenii y Propionibacterium acidipropionici.
9. 9. Complemento de pienso para animales que comprende 10-100% de una combinacion de un compuesto de nitrato y un compuesto de sulfato, en donde la cantidad de sulfato en el complemento de pienso para animales, basado en el peso seco, es superior a 25 g/kg.

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