BR112012001524B1 - uso de uma combinação de um composto de nitrato e um composto de sulfato, ração composta e suplemento de ração - Google Patents

Abstract

USO DE UMA COMBINAÇÃO DE UM COMPOSTO DE NITRATO E UM COMPOSTO DE SULFATO, RAÇÃO COMPOSTA E SUPLEMENTO DE RAÇÃOA presente invenção se refere à redução de metanogênese gastrointestinal em ruminantes com o auxílio de agentes que competem pelos átomos de hidrogênio exigidos por metanógenos durante a fermentação normal do alimento ingerido. A invenção em um aspecto reside nas revelações de que tanto vias reduzida de nitrato como vias reduzidas de sulfato superam metanogênese gastrointestinal em ruminantes e, que os efeitos de redução de metanogênese de nitrato e sulfato são completamente aditivos. Ao mesmo tempo verificou-se que a administração combinada de nitrato e sulfato é totalmente eficaz para evitar ou diminuir os problemas potenciais de intoxicação de nitrito normalmente encontrados ao utilizar nitrato sozinho, cujo efeito é adicionalmente aumentado, onde necessário, pela adição de um microorganismo probiótico que reduz nitrito. Consequentemente, os produtos são providos compreendendo elevadas quantidades de uma combinação de um composto de nitrato e um composto de sulfato e opcionalmente um microorganismo probiótico que reduz nitrito, bem como métodos de redução de metanogênese gastrointestinal em ruminantes utilizando tais composições.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere ao campo de aditivos e suplementos de ração para ruminantes. Mais particularmente, a invenção se refere à redução de metanogênese gastrointestinal nos ruminantes com o auxilio de agentes inibidores que competem pelos átomos de hidrogênio exigidos por metanógenos durante fermentação normal de alimento ingerido. A presente invenção provê, entre outros, suplementos de ração e composições de ração compreendendo os agentes inibidores e seu uso não terapêutico para reduzir metanogênese.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Metanogênese é a rota principal de eliminação de hidrogênio (H2) durante o processo de fermentação de rúmen (Beauchemin e outros, 2008). A remoção de H2 do ambiente de rúmen é essencial para a continuação eficiente de fermentação de rúmen, porém o metano resultante de metanogênese foi envolvido tanto como perda de energia de dieta para o animal (Johnson and Johnson, 1995) como um gás de estufa significativo contribuindo para o aquecimento global (Steinfeld e outros, 2006). Os dois assuntos levaram a uma pesquisa global para aditivos de ração a fim de diminuir a produção de metano de ruminantes.

Uma das opções exploradas para reduzir emissões de metano é a reorientação de H2 em excesso em processos que fornecem produtos mais benéficos para o ruminante, desse modo diminuindo a metanogênese. Os exemplos incluem a estimulação de propiogênese por adição de precursores de propionato e tentativas para introduzir acetogênese reduzida no rúmen (Joblin, 1999, Molano e outros, 2008). A indução bem sucedida desses processos no rúmen forneceria, respectivamente, propionato ou acetato como nutrientes para o animal, enquanto ao mesmo tempo reduz a disponibilidade de H2 para metanogênese. Entretanto, a introdução de precursores de propionato (malato e fumarato) forneceu efeitos variáveis sobre a produção de metano (Asanuma e outros, 1999, Ungerfeld e outros, 2007) e as tentativas para introduzir acetogênese reduzida no rúmen falharam até o presente devido a uma afinidade mais baixa para hidrogênio quando comparado com metanogênese (Le Van e outros, 1998).

Outras opções para reduzir emissões de metano foram descritas em US 5.843.498, que se refere a composições de ração de ruminantes para diminuir metanogênese de rúmen e melhorar a eficiência de ração compreendendo, como componente eficaz, cisteina e/ou seus sais.

Um pequeno número de grupos de pesquisa investigou o potencial de nitrato como aditivo de ração que reduz metano, e a adição de nitrato parece diminuir consistentemente metanogênese (Guo e outros, 2009, Sar e outros, 2005, Takahashi e outros, 1998).

A possibilidade de introduzir nitrato (NO3) como dissipador de hidrogênio alternativo para reduzir metanogênese no rúmen foi amplamente ignorada, devido a descobertas consistentes de efeitos tóxicos de nitrito que é formado como um intermediário durante a redução de nitrato em amónia no rúmen (Lewis, 1951) . Doses elevadas de nitrato em dietas de ruminantes foram relatadas como causando metemoglobinemia, reduzindo a capacidade do sangue de transportar oxigênio para os tecidos dos animais. Além disso, sabe-se que o acúmulo de nitrito no rúmen reduz a atividade microbiana no rúmen, o que, entre outras coisas, pode reduzir a ingestão de ração pelo animal.

Foi sugerido suplementar ruminantes alimentados com teor elevado de nitrato com formato, lactato ou fumarato, para aliviar o efeito inibidor de nitrito em fermentação (Iwamoto, 1999; Iwamoto, 2001). A administração simultânea de nitrato e GOS ou nisina também foi relatada como uma medida eficaz para diminuir a concentração de rúmen e nitrito de plasma e metemoglobina, enguanto mantém metanogênese de rúmen em um baixo nivel, em comparação com tratamento de nitrato sozinho (Sar, 2004).

A aceleração de redução de nitrito utilizando probiótica também foi o tema de pesquisa extensa. A patente US número 6.120.810 ensina a diminuir a intoxicação de ruminante por nitratos por administrar ao animal uma composição contendo uma quantidade eficaz do microorganismo redutor de nitrito Propionibacterium acidiproprionici. O pedido de patente européia no. 1 630 226 revela uma composição de ração para ruminantes contendo um micróbio tendo atividade de reductase de nitrito, que é selecionado de bactérias intestinais, bactérias coryneform, Bacillus subtilis, bactérias do gênero Methylophilus, Actinomyces, bactérias ruminais e combinações dos mesmos. Foi também relatado (Sar, 2005) que E. Goli W3110 poderia ser utilizado para diminuir a intoxicação quando nitrato é utilizado para inibir a metanogênese em ruminantes.

Efeitos inibidores de compostos de enxofre, cobre e tungsténio sobre a redução de nitrato foram pesquisados (Takahashi, 1989). Os autores relatam que no fluido de rúmen de carneiros castrados adaptados de nitrato (0,55 g NaNO3 / kg de peso corpóreo duas vezes por dia) a formação de nitrito não foi afetada por incubação com Sulfato-S nem por incubação com Sulfito-S. Dos aminoácidos contendo S, metionina provou ser ineficiente na inibição de redução microbiana de nitrato ao passo que cisteina diminuiu significativamente a formação de nitrito. Essa publicação não se referiu ou tratou nenhum efeito redutor de metanogênese. A eficácia de cisteina na prevenção de acúmulo de nitrito foi confirmada em estudos posteriores (Takahashi, 1991; Takahashi 1998). É o objetivo principal da presente invenção fornecer tratamentos, e as composições para uso nos mesmos, para reduzir adicionalmente metanogênese em ruminantes enquanto evita ou supera os problemas específicos associados a acúmulo de nitrito.

Sumário da invenção

A presente invenção reside, em um aspecto, nas descobertas de que tanto vias reduzidas de nitrato como vias reduzidas de sulfato superam metanogênese gastrointestinal em ruminantes e, que os efeitos redutores de metanogênese de nitrato e sulfato obtidos quando utilizados individualmente são totalmente aditivos, como será ilustrado em detalhe na parte experimental. Os efeitos individuais de nitrato e sulfato parecem ser independentes.

Verificou-se ao mesmo tempo em que a administração combinada de nitrato e sulfato é totalmente eficaz para evitar ou diminuir os problemas potenciais de intoxicação de nitrito normalmente encontrados ao utilizar nitrato sozinho, como será ilustrado em mais detalhe na parte experimental.

Surpreendentemente, embora tenha se verificado que a administração de nitrato reduza contagens de metanógeno entérico, a administração de sulfato ou de uma combinação de nitrato e sulfato não reduz. A administração da combinação de nitrato e sulfato, entretanto, reduz significativamente a proporção de metanógenos das bactérias totais.

Embora o escopo da invenção não seja limitado a ou reduzido ou qualquer tal teoria ou hipótese subjacente, acredita-se que a redução de metanogênese (equação 1) por nitrato seja causada pelo uso alternativo de H2 na redução de nitrato para amónia. Acredita-se que a redução de nitrato no rúmen siga a via de redução descrita na equação 2. Isso envolve que 8 mols de H são reorientados em direção à redução de nitrato, desse modo reduzindo teoricamente a produção de metano com 1 mol para cada mol de nitrato alimentado. Cada 100g de NO3 alimentado levaria, desse modo, a uma redução de CH4 de 25,8 g.

A redução de nitrato em amónia fornece mais energia do que a redução de CO2 em CH4< e poderia desse modo ser esperado ser a via principal de eliminação de H2 se nitrato suficiente estiver disponivel no rúmen. A redução total de NO3 em NH3 consome 8 elétrons e cada mol de nitrato reduzido poderia desse modo diminuir as emissões de metano em 1 mol de metano. O produto final da reação, amónia, pode ser considerado um nutriente valioso para ruminantes alimentados com dietas com baixo teor de proteina.

Como observado acima, os presentes inventores verificaram que o próprio sulfato também é um redutor forte eficaz na redução de emissões de metano por um mecanismo independente da redução de nitrato. A redução de sulfato para H2S (equação 3) também consome 8 elétrons e desse modo oferece o mesmo potencial de reduzir emissões de metano como nitrato por mol.

A descoberta de que sulfato também é eficaz para reduzir metanogênese pode ser explicada do fato de que, de uma perspectiva termodinâmica, a redução de sulfato também é provavelmente mais favorável do que metanogênese. Estequiometricamente, a redução total de 100 g de sulfato para sulfeto de hidrogênio reduziria a produção de CH4 em 16,7 g.

Sulfeto de hidrogênio (H2S) parece desempenhar um papel como doador de elétrons na redução de NO2 para NH4+, e a suplementação da dieta com sulfato pode,portanto, causar adicionalmente o alivio em acúmulo de nitrito no rúmen.

Verificou-se, adicionalmente, que resultados podem ser aumentados ainda mais pela administração adicional de uma quantidade eficaz de microorganismos probióticos redutores de nitrito. Como será ilustrado em detalhe na parte experimental, um retardo inicial é observado no inicio de redução de nitrito por sulfato, que pode ser explicado por um retardo em disponibilidade de H2S imediatamente após ingestão de ração. Isso pode, por sua vez, causar uma redução em ingestão de ração, e é, portanto, um objetivo adicional da invenção evitar isso. Os inventores descobriram que isso poderia ser realizado pela co-administração de certos microorganismos probióticos redutores de nitrito como será ilustrado em mais detalhe na parte experimental.

Descrição das figuras

A figura 1 é um gráfico que mostra a produção de metano (1/h) durante o curso de um periodo de 24 em cordeiros machos do cruzamento Texel que recebem uma dieta basal ou uma de três dietas experimentais, que foram suplementados com um composto de nitrato, um composto de sulfato ou uma combinação de um composto de nitrato e um composto de sulfato.

A figura 2 é um gráfico que mostra o consumo de oxigênio (1/kg MW/h) durante o curso de um periodo de 24 em cordeiros machos do cruzamento Texel que recebem uma dieta basal ou uma de três dietas experimentais, que foram suplementadas com um composto de nitrato, um composto de sulfato ou uma combinação de um composto de nitrato e um composto de sulfato.

A figura 3 é um gráfico que mostra a concentração de metamoglobina em sangue de vacas recebendo uma de quatro dietas experimentais, que foram suplementadas com nitrato, ou uma de três combinações de nitrato e quantidades crescentes de sulfato.

A figura 4 mostra a produção de gás na estimulação de rúmen com vários produtos de teste. Os painéis A a C mostram a produção cumulativa de gás em pontos de tempo indicados. As barras de erro indicam SE entre recipientes de simulação de réplica e asteriscos a diferença estatística para o controle contendo Ca(NO3)2 + MgSO4 (mencionado como "Nenhum") com o teste-t.

A figura 5 mostra produção de metano na simulação de rúmen com vários produtos de teste. O painel A mostra a produção cumulativa de metano após a simulação de 12 horas, e o painel B a proporção de metano em gás produzido total. As barras de erro indicam SE entre recipiente de simulação de réplica e asteriscos a diferença estatística para o controle contendo Ca(NO3)2 + MgSO4 (mencionado como "Nenhum") com o teste-t.

A figura 6 mostra a concentração residual de nitrato na simulação de rúmen com vários produtos de teste. Os painéis A a C mostram a concentração residual de nitrato após 21, 4 e 12 horas de fermentação, respectivamente. As barras de erro indicam SE entre recipientes de simulação de réplica e asteriscos a diferença estatística para o controle contendo Ca(NO3)2 + MgSO4 (mencionado como "Nenhum") com o teste-t.

A figura 7 mostra a concentração residual de nitrito na simulação de rúmen com vários produtos de teste. Os painéis A a C mostram a concentração residual de nitrito após 2, 4 e 12 horas de fermentação, respectivamente. As barras de erro indicam SE entre recipientes de simulação de réplica e asteriscos a diferença estatística para o controle contendo Ca(NO3)2 + MgSO4 (mencionado como "Nenhum") com o teste-t.

A figura 8 mostra a concentração residual de amónio na simulação de rúmen com vários produtos de teste. Os painéis A a C mostram a concentração residual de amónio após 2, 4 e 12 horas de fermentação, respectivamente. As barras de erro indicam SE entre recipientes de simulação de réplica e asteriscos a diferença estatística para o controle contendo Ca(NO3)2 + MgSO4 (mencionado como "Nenhum") com o teste-t.

Descrição detalhada da invenção

Um primeiro aspecto da invenção se refere a um suplemento de ração de animal compreendendo 10-100% de uma combinação de um composto de nitrato e um composto de sulfato.

Nesse documento e em suas reivindicações, o verbo "compreender" e suas conjugações é utilizado em seu sentido não limitador para significar que itens após a palavra são incluídos, porém itens não especificamente mencionados não são excluídos. Além disso, referência a um elemento pelo artigo indefinido "um" ou "uma" não exclui a possibilidade de que mais de um do elemento está presente, a menos que o contexto claramente exija que haja um e somente um dos elementos. O artigo indefinido "um" ou "uma" desse modo significa normalmente "pelo menos um".

Como utilizado aqui o termo "suplemento de ração de animal" se refere a uma pré-mistura aditiva concentrada compreendendo os ingredientes ativos, cuja pré-mistura ou suplemento pode ser adicionado à ração ou alimento de um animal para formar uma ração suplementada de acordo com a presente invenção. Os termos "pré-mistura de ração de animal", "suplemento de ração de animal" e "aditivo de ração de animal" são genericamente considerados como tendo significados similares ou idênticos e são genericamente considerados intercambiáveis. Tipicamente, o suplemento de ração de animal da presente invenção está na forma de um pó ou sólido granulado ou compactado. Na prática, livestock pode ser tipicamente alimentado com o suplemento de ração de animal por adicionar o mesmo diretamente à ração, por exemplo, como uma denominada adubação superficial, ou pode ser utilizado na preparação ou fabricação de produtos como rações compostas de animais ou um bloco de sal, que será descrito em mais detalhe a seguir. A invenção não é particularmente limitada nesse aspecto. Um suplemento, de acordo com a invenção é tipicamente alimentado a um animal em uma quantidade que varia de 16-2500 g/animal/dia. O presente suplemento de ração de animal compreende um composto de nitrato, tipicamente um composto de nitrato fisiologicamente aceitável ou tolerado. De acordo com a invenção, o nitrato-N necessita ser prontamente disponivel para redução por microorganismos do rúmen ou intestino e o composto de nitrato deve ter solubilidade suficiente em água. Conseqüentemente, de acordo com a presente invenção o composto de nitrato é preferivelmente um composto de nitrato iônico, mais preferivelmente um sal de nitrato inorgânico, como nitrato de sódio, nitrato de potássio, nitrato de cálcio, nitrato de amónio, todos os quais são prontamente solúveis em água em pressão e temperatura padrão. Além disso, a partir de uma perspectiva de saúde e segurança, é tipicamente preferido utilizar sais de nitrato inorgânico complexos, como o composto representado pela fórmula 5 . Ca (NO3) 2.NH4NO3. IOH2O, que é comercialmente disponível de Yara sob o nome comercial 'Calcinit'. O presente suplemento de ração de animal também compreende um composto de sulfato, tipicamente um composto de sulfato fisiologicamente aceitável ou tolerado. De acordo com a invenção, prefere-se que o composto de sulfato seja um composto de sulfato iônico, mais preferivelmente selecionado do grupo que sais de sulfato inorgânico, dos quais muitos são altamente solúveis em água. As exceções incluem sulfato de cálcio. É particularmente preferido que o presente composto de sulfato seja selecionado do grupo de sais de sulfato inorgânico solúveis, incluindo sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, sulfato de zinco, sulfato de manganês, sulfato de cobre e sulfato ferroso.

Em modalidades preferidas da invenção, o suplemento compreende a combinação do composto de nitrato e o composto de sulfato em uma quantidade que varia de 10100% em peso, preferivelmente a quantidade está em excesso de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97 ou 99% em peso em uma base de peso seco.

Uma vez que a presente invenção em parte reside na descoberta de que, para fins de reduzir metanogênese gastrointestinal no ruminante, nitrato e sulfato são em parte intercambiáveis, a razão molar entre nitrato e sulfato no suplemento pode variar tipicamente de 100:11:50, mais preferivelmente de 50:1-1:10, 25:1-1:5 ou 10:11:2,5, e mais preferivelmente 5:1-1:1.

A combinação de composto de nitrato e composto de sulfato no suplemento de ração da invenção fornece tipicamente uma quantidade total de nitrato e sulfato em excesso de 50 g/kg, em uma base de peso seco. Em uma modalidade preferida a quantidade total de nitrato e sulfato excede 75 g/kg, mais preferivelmente 90 g/kg, mais preferivelmente 100 g/kg. Na prática a quantidade está tipicamente abaixo de 750 g/kg. Em outra modalidade preferida, a quantidade de sulfato no suplemento de ração excede 25 g/kg, mais preferivelmente 40 g/kg, mais preferivelmente 50 g/kg em uma base de peso seco. Tipicamente, a quantidade não excede 250 g/kg, preferivelmente não excede 200 g/kg, mais preferivelmente não excede 165 g/kg. Em outra modalidade preferida, a quantidade de nitrato no suplemento de ração excede 20 g/kg, mais preferivelmente 30 g/kg, mais preferivelmente 40 g/kg em uma base de peso seco. Tipicamente a quantidade está abaixo de 600 g/kg, mais preferivelmente abaixo de 550 g/kg, em uma base de peso seco.

Todas as quantidades e/ou dosagens de 'nitrato' e/ou 'sulfato' como utilizado aqui, se referem ao peso de nitrato e/ou sulfato compreendido em ou fornecido pelos compostos de nitrato e/ou sulfato, em relação ao peso seco total da composição, como será entendido por aqueles versados na técnica. Está compreendido nos conhecimentos do profissional treinado determinar exatamente as quantidades ideais dos compostos a serem incluidas no suplemento e as quantidades do suplemento a serem utilizadas na preparação da ração ou alimento composto de animal, etc., levando em conta o tipo especifico de animal e as circunstâncias sob as quais é mantido. Dosagens preferidas de cada dos componentes são fornecidas abaixo. Os suplementos de ração de animal da presente invenção podem compreender qualquer ingrediente adicional sem se afastar do escopo da invenção. Pode compreender, tipicamente, excipientes bem conhecidos que são necessários para preparar a forma de produto desejado e pode compreender aditivos adicionais com o objetivo de melhorar a qualidade da ração e/ou melhorar o desempenho do animal que consome o suplemento. Exemplos apropriados de tais excipientes incluem veiculos ou cargas, como lactose, sacarose, manitol, amido celulose cristalina, carbonato de hidrogênio sódio, cloreto de sódio e similares e aglutinantes, como goma arábica, goma tragacanto, alginato de sódio, amido, PVP e derivados de celulose, etc. os exemplos de aditivos de ração conhecidos por aqueles versados na técnica incluem vitaminas, aminoácidos e elementos residuais, intensificadores de capacidade de digestão e estabilizadores de flora intestinal e similares.

Em uma modalidade preferida, o suplemento de ração de animal compreende adicionalmente um microorganismo probiótico redutor de nitrito. Como utilizado aqui o termo "microorganismo probiótico de nitrito" se refere a microorganismos vivos que quando administrados em quantidades adequadas conferem um beneficio à saúde do hospedeiro, por reduzir nitrito que se acumula no rúmen e/ou intestino a amónio como explicado anteriormente. Muitos exemplos de tais microorganismo redutores de nitrito são conhecidos por aqueles versados na técnica. Exemplos preferidos de microorganismos probióticos redutores de nitrito incluem bactérias intestinal e ruminai tendo atividade de reductase de nitrito, Propionibacterium acidiproprionici, bactéria coryneform, Bacillus subtilis, bactérias do gênero Methylophilus, Actinomyces e Escherichia coli W3110. Mais preferivelmente, de acordo com a presente invenção, o microorganismo probiótico redutor de nitrito é selecionado do grupo de Megasphaera elsdenii, em particular cepas ruminais do mesmo, e Propionibacterium acidipropionici, em particular Propionibacterium acidipropionici cepa P4, registrada sob o número de acessão 55467 na coleção de microorganismos da American Type Culture Collection (ATCC) e comercialmente disponível como 'concentrado Bova-Pro®' da Agtech Products Inc.

Em uma modalidade preferida, um suplemento de ração de animal como definido anteriormente é fornecido, que compreende adicionalmente o microorganismo probiótico redutor de nitrito em uma quantidade de 1,0*108-l, 0*1014 cfu/kg, mais preferivelmente 1,0*109-l, 0*1013 cfu/kg, mais preferivelmente 1,0*1010-l, 0*1012 cfu/kg, por exemplo, l,0*10n cfu/kg, em uma base de peso seco. Como é sabido por aqueles versados na técnica a unidade de formação de colônia (CFU) é uma medição de números fúngicos ou bacterianos viáveis. Ao contrário de contagens microscópicas diretas onde todas as células, mortas e vivas, são contadas, CFU mede células viáveis e é, por exemplo, determinado por expandir uma amostra (diluida) em uma placa de Agar ou Agar de soja tripticase e contagem de colônias desse modo obtidas.

Além disso, os presentes inventores verificaram que bons resultados são obtidos quando ácido láctico ou um composto de lactato é administrado. Sem desejar ser limitado por nenhuma teoria especifica, acredita-se que suplementação de lactato ou ácido láctico possa aumentar a eficácia dos microorganismos probióticos. Consequentemente, em uma modalidade preferida, uma ração composta de animal como definido anteriormente é fornecida, que compreende adicionalmente uma quantidade eficaz de lactato ou um ácido láctico, preferivelmente compreende ácido láctico ou lactato em uma quantidade que excede 20 g/kg, mais preferivelmente 30 g/kg, mais preferivelmente 40 g/kg, em uma base de peso seco.

Um aspecto adicional da invenção se refere a produtos como rações compostas de animais e um bloco de sal, compreendendo um suplemento como definido anteriormente.

Consequentemente, em um aspecto, uma composição de ração composta de animal é fornecida compreendendo uma combinação de um composto de nitrato e um composto de sulfato, a combinação fornecendo uma quantidade total de nitrato e sulfato em excesso de 10 g/kg, em uma base de peso seco. O termo 'composição de ração composta de animal' como utilizado aqui, significa uma composição que é apropriada para uso como uma ração de animal e que é misturada de várias matérias primas ou base natural ou não natural e/ou aditivos. Consequentemente, em particular, o termo 'composto' é utilizado aqui para distinguir as presentes composições de ração de animal de qualquer matéria prima que ocorra naturalmente. Essas misturas ou rações compostas são formuladas de acordo com as exigências especificas do animal alvo. Os ingredientes principais utilizados em rações compostas comercialmente preparadas incluem, tipicamente, farelo de trigo, farelo de arroz, farelo de milho, grãos de cereais, como cevada, trigo, centeio e aveia, farelo de soja, farelo de alfafa, pó de trigo e similar. Uma ração de composto comercial compreenderá tipicamente não menos do que 15% de proteina bruta e não menos do que 70% de nutrientes totais digeríveis, embora a invenção não seja particularmente limitada nesse aspecto. Composições de ração de animal compostas liquidas, sólidas bem como semi-sólidas são abrangidas no escopo da presente invenção, formas sólidas e semi-sólidas sendo particularmente preferidas. Essas composições são tipicamente fabricadas como tipo de farelo, pelotas ou farelos. Na prática, animais domésticos podem ser tipicamente alimentados com uma combinação de ração composta, como aquela da presente invenção, e silagem ou feno ou similar. Tipicamente, uma ração composta de animal é alimentada em uma quantidade compreendida na faixa de 0,3 - 10 kg/animal/dia. Está compreendido nos conhecimentos do profissional treinado determinar as quantidades adequadas desses componentes para serem incluídas na ração composta de animal, levando em conta o tipo de animal e as circunstâncias sob as quais é mantido.

A combinação de composto de nitrato e composto de sulfato na ração composta de animal da invenção provê tipicamente uma quantidade total de nitrato e sulfato em excesso de 10 g/kg, em uma base de peso seco. Em uma modalidade preferida a quantidade total de nitrato e sulfato excede 15 g/kg, mais preferivelmente 17,5 g/kg, mais preferivelmente 20 g/kg. Na prática, a quantidade está tipicamente abaixo de 750 g/kg, preferivelmente abaixo de 500 g/kg, mais preferivelmente abaixo de 250 g/kg. Em outra modalidade preferida, a quantidade de sulfato na ração composta de animal excede 5 g/kg, mais preferivelmente 7,5 g/kg, 10 g/kg ou 12 g/kg, em uma base de peso seco. Tipicamente a quantidade não excede 200 g/kg, preferivelmente não excede 175 g/kg, mais preferivelmente não excede 150 g/kg. Em outra modalidade preferida, a quantidade de nitrato na ração composta de animal excede 5 g/kg, mais preferivelmente 7,5 g/kg, mais preferivelmente 10 g/kg, em uma base de peso seco. Tipicamente, a quantidade está abaixo de 600 g/kg, mais preferivelmente abaixo de 500 g/kg, mais preferivelmente abaixo de 250 g/kg, em uma base de peso seco. Além disso, em uma modalidade preferida, uma ração composta de animal como definido anteriormente é fornecida, que compreende adicionalmente o microorganismo probiótico redutor de nitrito em uma quantidade de 1,0*108-l, 0*1014 cfu/kg, mais preferivelmente 1,0*109-l, 0*1013 cfu/kg, mais preferivelmente 1,0*1010-l, 0*1012 cfu/kg. Além disso, em uma modalidade preferida, uma ração composta de animal como definido anteriormente é fornecida, que compreende adicionalmente uma quantidade eficaz de lactato ou ácido láctico, preferivelmente em uma quantidade que excede 5 g/kg, mais preferivelmente 7,5 g/kg, mais preferivelmente 10 g/kg.

As composições de ração composta de animal da invenção podem compreender qualquer aditivo de ração adicional tipicamente utilizado na técnica. Como sabido por aqueles versados na técnica, o termo 'aditivo de ração' nesse contexto se refere a produtos utilizados em nutrição de animais para fins de melhorar a qualidade de ração e a qualidade de alimento de origem animal, ou melhorar o desempenho dos animais, por exemplo, fornecer capacidade de digestão aperfeiçoada dos materiais de ração. Exemplos não limitadores incluem aditivos tecnológicos como conservantes, antioxidantes, emulsificantes, agentes de estabilização, reguladores de acidez e aditivos de silagem; aditivos sensórios, especialmente sabores e substâncias corantes; aditivos nutricionais (adicionais) , como vitaminas, aminoácidos e elementos residuais; e aditivos zootécnicos (adicionais), como intensificadores de capacidade de digestão e estabilizadores de flora intestinal.

Como será evidente para aqueles versados na técnica, as presentes composições de ração composta de animal podem compreender qualquer ingrediente ou aditivo adicional, sem se afastar do escopo da invenção.

Em um aspecto adicional, a invenção provê um pedra de sal ou bloco de sal que compreende o suplemento da invenção. Como sabido por aqueles versados na técnica tais pedras ou blocos de sal são particularmente convenientes para alimentar suplementos minerais (bem como proteinas e carboidratos) a ruminantes pastando em pastos tanto naturais como cultivados. Tais blocos de sal ou pedras de sal de acordo com a presente invenção compreendem, tipicamente, além da composição de composto de nitrato e composto de sulfato e o microorganismo probiótico redutor de nitrito opcional da invenção, vários tipos de aglutinantes, por exemplo, cimentos, gesso, cal, fosfato de cálcio, carbonato, e/ou gelatina; e opcionalmente aditivos adicionais como vitaminas, elementos residuais, sais minerais, aditivos sensórios, etc.

A combinação de composto de nitrato e composto de sulfato no bloco de sal da invenção provê tipicamente uma quantidade total de nitrato e sulfato em excesso de 15 g/kg, em uma base de peso seco. Em uma modalidade preferida a quantidade total de nitrato e sulfato excede 25 g/kg, mais preferivelmente 30 g/kg. Na prática a quantidade está tipicamente abaixo de 450 g/kg, preferivelmente abaixo de 400 g/kg. Em outra modalidade preferida, a quantidade de sulfato no bloco de sal excede 3 g/kg, mais preferivelmente 5 g/kg, mais preferivelmente 6 g/kg, em uma base de peso seco. Tipicamente, a quantidade não excede 150 g/kg, preferivelmente não excede 100 g/kg, mais preferivelmente não excede 75 g/kg. Em outra modalidade preferida, a quantidade de nitrato no bloco de sal excede 10 g/kg, mais preferivelmente 20 g/kg, mais preferivelmente 25 g/kg, em uma base de peso seco. Tipicamente a quantidade está abaixo de 400 g/kg, mais preferivelmente abaixo de 300 g/kg, em uma base de peso seco. Em uma modalidade preferida, um bloco de sal como definido anteriormente é fornecido, que compreende adicionalmente o microorganismo probiótico redutor de nitrito em uma quantidade de 1,0*108-l, 0*1014 cfu/kg, mais preferivelmente 1,0*109-l, 0*1013 cfu/kg, mais preferivelmente 1, 0*1010-l, 0*1012 cfu/kg.

Um aspecto adicional da invenção se refere a um método de reduzir produção de metano gastrointestinal em um ruminante, o método compreendendo administrar ao ruminante uma quantidade eficaz de uma combinação do composto de nitrato e o composto de sulfato em que o método é não terapêutico.

O termo "reduzir metanogênese gastrointestinal " como utilizado aqui se refere à redução de produção de gás metano no trato gastrointestinal. Como explicado anteriormente, a fermentação no rúmen e intestino de um ruminante origina a produção de gás metano pelos denominados metanógenos. A presente invenção tem como objetivo reduzir esse processo, como reduzir a excreção de metano diretamente a partir do trato gastrointestinal. Está compreendido nos conhecimentos daqueles treinados na técnica avaliar a excreção de metano por um animal. Como explicado anteriormente, a produção de metano no rúmen e intestino é um processo que ocorre normalmente em animais saudáveis e diminuir a metanogênese não aumenta ou diminui o estado geral de saúde ou bem estar do ruminante. Não obstante, uma redução de formação de metano utilizando a combinação de um composto de nitrato e um composto de sulfato poderia aumentar a eficiência de uso de nutriente pelo animal, de tal modo que o presente método poderia aumentar o crescimento e/ou produtividade do animal.

Como será prontamente reconhecido por aqueles versados na técnica, o presente método de tratamento não serão eficaz no tratamento de uma condição conhecida como 'inchaço'. Inchaço é uma condição comumente descrita como uma distensão anormal do rúmen como consequência de acúmulo de gás no rúmen. Gás (dióxido de carbono, metano e outros gases) é normalmente produzido durante fermentação de rúmen e não é normalmente submetido à erucção através do esôfago, evitando acúmulo de gases. Durante a incidência de inchaço, o esôfago é bloqueado por uma camada de espuma. A abertura do esôfago contém receptores que bloqueiam o esôfago se liquido (ou espuma) for sentido. A espuma que é formada durante inchaço origina da fermentação rápida de pequenas partículas de ração. A causa de inchaço é a formação de espuma e não a produção de gases ruminais, que é um processo de ocorrência natural no ruminante. Como consequência, a produção de metano não pode ser vista como causa de inchaço e a redução de metano não pode ser vista como tratamento de inchaço. O tratamento terapêutico contra inchaço é direcionado à prevenção de formação da camada de espuma no rúmen ou sua remoção, não a prevenção de produção de gases ruminais. Além disso, dióxido de carbono é o principal gás produzido durante fermentação de rúmen. O presente método não é portanto destinado nem adequado para tratar inchaço ou para aliviar os sintomas do mesmo.

Desse modo, o presente método de tratamento é um método de tratamento não terapêutico, isto é, o método não melhora a saúde de um animal que sofre de uma condição especifica, nem evita uma doença ou condição especifica, nem até qualquer ponto afeta a saúde do ruminante de qualquer outro modo, isto é, em comparação com um ruminante que não recebe o presente método de tratamento. As vantagens do presente método são limitadas a aspectos ambientais e/ou econômicos como explicado anteriormente.

Taxonomicamente, um ruminante é um mamifero da ordem Artiodátila que digere alimento à base de planta por amolecer o mesmo inicialmente no primeiro estômago do animal, conhecido como rúmen, a seguir regurgitar a massa semi-digerida, agora conhecida como alimento de ruminantes, e ruminar a mesma novamente. O processo de ruminar o alimento para quebrar adicionalmente a matéria de planta e estimular digestão é chamado "ruminação". Mamiferos ruminantes incluem gado, cabras, carneiros, girafas, bisões, iaques, búfalo da índia, veados, camelos, alpacas, lhamas, gnu, antilope, antilocapro e nilgó. A presente invenção se refere principalmente a métodos de tratar ruminantes domesticados, especialmente aqueles mantidos para criação comercial de animais domésticos. Desse modo, em uma modalidade preferida da invenção, o ruminante é selecionado do grupo de gado, cabras, carneiros e búfalos.

Uma modalidade preferida da invenção provê um método como definido acima, em que a combinação de composto de nitrato e composto de sulfato é administrada ao ruminante em uma quantidade que fornece uma dosagem total de nitrato e sulfato em excesso de 0,05 g/kg de peso corpóreo por dia. Em uma modalidade preferida a dosagem total de nitrato e sulfato no presente método está compreendida na faixa de 0,05 - 10 kg/kg de peso corpóreo por dia, mais preferivelmente 0,1-5 g/kg de peso corpóreo por dia, mais preferivelmente 0,2 - 2,5 g/kg de peso corpóreo por dia.

Em outra modalidade preferida um método como definido anteriormente é fornecido, em que a dosagem de sulfato está compreendida na faixa de 0,025 - 1,8 g/kg de peso corpóreo por dia, mais preferivelmente compreendida na faixa de 0,05 - 0,9 g/kg de peso corpóreo por dia, mais preferivelmente 0,1 - 0,45 g/kg de peso corpóreo por dia.

Em outra modalidade preferida um método como definido anteriormente é fornecido, em que a dosagem de nitrato está compreendida na faixa de 0,025 - 8 g/kg de peso corpóreo por dia, mais preferivelmente 0,05 - 4 g/kg de peso corpóreo por dia, mais preferivelmente 0,1-2 g/kg de peso corpóreo por dia.

As dosagens definidas aqui como a quantidade por kg de peso corpóreo por dia se referem à quantidade média do composto respectivo durante um dado periodo de tratamento, por exemplo, durante uma semana ou um mês de tratamento. Os compostos podem ser desse modo administrados todo dia, em dias alternados, a cada dois dias, etc., sem se afastar do escopo da invenção. Embora preferivelmente, o método compreenda administração diária da combinação do composto de nitrato e composto de sulfato nas dosagens prescritas. Ainda mais preferivelmente a combinação é administrada durante alimentação do animal toda vez que o animal é alimentado, em quantidades que fornecem as dosagens diárias acima. Como explicado anteriormente, a capacidade de microflora de rúmen reduzir nitrato em nitrito de animais não adaptados anteriormente a nitrato em sua dieta excede sua capacidade de reduzir nitrito em amónia. Isso pode resultar em um acúmulo liquido de nitrito no rúmen, que é prontamente absorvido através da parede do rúmen e converte a hemoglobina de sangue da forma ferrosa em férrica, metemoglobina, tornando a molécula de hemoglobina incapaz de transportar oxigênio para os tecidos. A condição resultante, methemoglobinemia, é um estado de anoxia geral, que em casos brancos pode diminuir o desempenho do animal, porém em casos graves pode resultar em morte do animal. Os presentes inventores estabeleceram que, no presente método, introdução em etapas, cuidadosa de nitrato na dieta de carneiros permitem que a microflora de rúmen se adapte e aumente sua capacidade de reduzir tanto nitrato como nitrito. Os carneiros lentamente adaptados a dietas com teor elevado de nitrato, mostraram não experimentar sinais clinicos de methemoglobinemia. Consequentemente em uma modalidade preferida da invenção, o método compreende uma primeira fase de adaptação de nitrato e uma segunda fase de tratamento continuado, a primeira fase compreendendo dois ou mais, preferivelmente três ou mais, periodos consecutivos de pelo menos 3 dias, preferivelmente pelo menos 4 dias, mais preferivelmente pelo menos 5 dias, em que a dosagem diária média de nitrato durante cada periodo é menor do que 100% da dosagem diária média administrada durante a segunda fase e em que a dosagem diária média durante cada periodo é mais elevada do que a dosagem diária média durante o periodo que o precede. Em uma modalidade preferida o aumento em dosagem diária média de nitrato a partir de um periodo para o seguinte é menor do que 1 g/kg de peso corpóreo por dia, preferivelmente menor do que 0,5 , mais preferivelmente menor do que 0,25, mais preferivelmente menor do que 0,1 g/kg de peso corpóreo por dia. Preferivelmente, a segunda fase compreende um periodo de mais de 5, 10, 25, 50, 100, 250 ou 350 dias de administrar a combinação do composto de nitrato e o composto de sulfato em uma dosagem diária média compreendida na faixa de 0,15 - 3 g/kg de peso corpóreo.

Os métodos acima definidos com ou sem fase de adaptação inicial, em uma modalidade preferida, também compreendem administrar ao ruminante o microorganismo probiótico redutor de nitrito como definido anteriormente. É particularmente preferido administrar o microorganismo probiótico em uma quantidade de 1,0*105-l, 0*1014 cfu/kg de peso corpóreo por dia, mais preferivelmente 1,0*107-l, 0*1013 cfu/kg de peso corpóreo por dia, mais preferivelmente 1,0*109-l, 0*10112 cfu/kg de peso corpóreo por dia. Em uma modalidade preferida, os métodos compreendem administração de microorganismo probiótico e administração de ácido láctico ou lactato. É particularmente preferido administrar ácido láctico ou lactato em uma quantidade de pelo menos 0,025 g/kg de peso corpóreo por dia, mais preferivelmente 0,05 - 5 g/kg de peso corpóreo por dia, mais preferivelmente 0,1 - 2,5 g/kg de peso corpóreo por dia. O presente método pode compreender a administração da combinação do composto de nitrato, composto de sulfato e, opcionalmente, o microorganismo probiótico redutor de nitrito de acordo com os regimes de dosagem acima descritos por um periodo de pelo menos 5, 10, 25, 50, 100, 250 ou 350 dias. Como observado anteriormente, um aspecto interessante da invenção reside no fato de que o presente método provê eficácia muito persistente na redução de metanogênese entérica, isto é, o efeito não diminui durante periodos prolongados de tratamento, por exemplo, como um resultado de aumentar a resistência de microorganismos de intestino ou rúmen, desse modo tornando o tratamento do ruminante em longo prazo, particularmente exeqüivel.

Como será evidente a partir do acima, o presente método compreende administração oral da combinação do composto de nitrato e composto de sulfato e, opcionalmente, o microorganismo probiótico redutor de nitrito. Preferivelmente, o tratamento compreende a administração oral das composições de ração composta de animal e/ou os produtos de suplemento de ração de animal como definido anteriormente, embora outras composições ingeriveis por via oral liquidas, sólidas ou semi-sólidas possam ser utilizadas sem se afastar do escopo da invenção, como será entendido por aqueles versados na técnica.

De acordo com o acima, ainda um aspecto adicional da invenção se refere ao uso de uma composição que compreende uma combinação do composto de nitrato e composto de sulfato para redução não terapêutica de produção de metano gastrointestinal em um ruminante. Prefere-se que o uso compreenda a administração da combinação do composto de nitrato e composto de sulfato ao ruminante em uma quantidade que fornece uma dosagem total de nitrato e sulfato que excede 0,05 g/kg de peso corpóreo por dia. Preferivelmente, o composto de nitrato e composto de sulfato são utilizados nas dosagens como descritas anteriormente. Em outra modalidade preferida o uso compreende adicionalmente administrar ao ruminante o microorganismo probiótico redutor de nitrito nas dosagens como descrito anteriormente. Ainda mais preferivelmente, o uso de quaisquer das composições como definidas anteriormente é fornecido para redução não terapêutica de produção de metano gastrointestinal em um ruminante.

Outro aspecto da invenção se refere a tratamentos terapêuticos de ruminantes suplementados com nitrato. Como explicado acima, é sabido que a suplementação de nitrato em ruminantes auxiliará a diminuir a metanogênese gastrointestinal porém também aumenta o risco de incidência de acúmulo de nitrito, a denominada 'sindrome de toxicidade de nitrato7 e/ou methemoglobinemia, reduzindo a capacidade do sangue de transportar oxigênio para os tecidos dos animais. Além disso, o acúmulo de nitrito no rúmen é conhecido por reduzir a atividade microbiana no rúmen, que entre outras coisas pode reduzir a ingestão de ração pelo animal. Como explicado anteriormente, os presentes inventores estabeleceram que a administração a tais ruminantes suplementados com nitrato de um composto de sulfato, preferivelmente em combinação com um microorganismos probiótico redutor de nitrito, reduz grandemente ou mesmo evita esses efeitos adversos.

Consequentemente, um aspecto da invenção se refere a um método de tratar ou evitar acúmulo de nitrito, 'sindrome de toxicidade de nitrato' e/ou methemoglobinemia em ruminantes suplementados com nitrato compreendendo a administração ao ruminante de uma quantidade eficaz do composto de sulfato, opcionalmente em combinação com uma quantidade eficaz do microorganismo probiótico redutor de nitrito.

Outro aspecto da invenção se refere a um preparado que compreende o composto de sulfato, opcionalmente em combinação com o microorganismo probiótico redutor de nitrito, para uso no método de tratar ou evitar acúmulo de nitrito, 'sindrome de toxicidade de nitrato' e/ou methemoglobinemia em ruminantes suplementados com nitrato.

Ainda outro aspecto da invenção se refere ao uso do composto de sulfato, opcionalmente em combinação com o microorganismo probiótico redutor de nitrito, na fabricação do preparado para uso em um método de tratar ou evitar acúmulo de nitrito, 'sindrome de toxicidade de nitrato' e/ou methemoglobinemia em ruminantes suplementados com nitrato.

De acordo com o acima, o método de tratar e/ou evitar acúmulo de nitrito, 'sindrome de toxicidade de nitrato' e/ou methemoglobinemia compreende tipicamente administrar as composições em quantidades suficientes para fornecer uma dosagem total de sulfato compreendida na faixa de 0,025 - 1,8 g/kg de peso corpóreo por dia, mais preferivelmente 0,05 - 0,9 g/kg de peso corpóreo por dia, mais preferivelmente 0,1 - 0,45 g/kg de peso corpóreo por dia, e, opcionalmente, uma dosagem total do microorganismo probiótico de 1,0*105-l, 0*1014 cfu/kg de peso corpóreo por dia, mais preferivelmente 1,0*107-l, 0*1013 cfu/kg de peso corpóreo por dia, mais preferivelmente 1,0*109-l, 0*1012 cfu/kg de peso corpóreo por dia. Em uma modalidade preferida, o método compreende a administração de microorganismo probiótico e a administração de ácido láctico ou lactato. É particularmente preferido administrar ácido láctico ou lactato em uma quantidade de pelo menos 0,025 g/kg de peso corpóreo por dia, mais preferivelmente 0,05 - 5 g/kg de peso corpóreo por dia, mais preferivelmente 0,1 - 2,5 g/kg de peso corpóreo por dia.

Como utilizado aqui, o termo 'ruminante suplementado com nitrato' se refere a um ruminante que recebe quantidades substanciais de nitrato, tipicamente através de alimentação. Preferivelmente, o ruminante é suplementado com nitrato em quantidades suficientes para diminuir a metanogênese gastrointestinal, mais preferivelmente em quantidades em excesso de 0,025 g/kg de peso corpóreo por dia, mais preferivelmente 0,05 - 8 g/kg de peso corpóreo por dia. Como será entendido por aqueles versados na técnica, o método pode ser igualmente apropriado para tratar ou evitar acúmulo de nitrito, 'sindrome de toxicidade de nitrato' e/ou methemoglobinemia em ruminantes que recebem quantidades substanciais de nitrato para outras finalidades ou mesmo não intencionalmente, por exemplo, como resultado de condições ambientais.

A invenção como descrito acima será ilustrada e explicada em mais detalhe na seguinte parte experimental, que não pretende de modo algum limitar o escopo da invenção.

Exemplo 1: nitrato e sulfato em diminuição de metano Materiais e métodos Animais e alojamento

No experimento atual as propriedades de reduzir metano de sulfato e nitrato de dieta foram avaliadas. Tanto nitrato como sulfato foram lentamente introduzidos na dieta durante um periodo de adaptação de 4 semanas. A ingestão de alimento e crescimento foram monitorados durante o experimento. Foi levantada a hipótese de que tanto nitrato como sulfato de dieta reduziria as emissões de metano da fermentação entérica.

O Animal Care and use Committee of the Animal Sciences Group, WUR, Lelystad aprovou o protocolo experimental desse experimento. O experimento foi realizado com 20 cordeiros de cruzamento Texel machos, pesando 42,9 ± 4,3 kg (média ± desvio padrão) no inicio do experimento. Durante uma fase de adaptação de quatro semanas até os aditivos de dieta, os animais foram alojados em gaiolas de filhotes individuais para permitir alimentação individual. Os carneiros foram pesados semanalmente para monitorar crescimento durante todo o experimento.

Após o periodo de adaptação quatro animais (um bloco) foram alojados em câmaras de calorimetria de respiração indireta por uma semana para determinar troca gasosa. Nas semanas seguintes um novo bloco de carneiros foi introduzido nas câmaras semanalmente. Cada câmara de respiração alojou um carneiro individual. As câmaras de calorimetria de respiração utilizadas são descritas em detalhe em Verstegen e outros (1987). A temperatura foi mantida a 15°C, e umidade relativa foi ajustada em 70%. A taxa de ventilação era de 70 1/min. para um tipo de câmara e 90 1/min. para outro tipo.

Ar entrando e saindo das câmaras foi analisado em relação a CO2, O2 e CH4 em intervalos de 9 min. a produção liquida ou consumo desses gases foi calculada a partir da diferença em concentrações entre ar de entrada e saida multiplicado por fluxo de ar e subsequentemente recalculado para circunstâncias padrão (0°C, 101 kPa, sem vapor de água).

Projeto experimental

O experimento foi projetado como um desenho fatorial de 2x2, com nitrato e sulfato como fatores. Os animais foram dispostos em blocos por peso e subsequentemente um bloco aleatoriamente distribuído para um de quatro tratamentos de dieta: CON, NO3, SO4 ou NO3+SO4.

Alimentação

A dieta basal consistiu em 74% de silagem de milho, 16% de palha de cevada cortada, 9% de farelo de soja tratado com formaldeído e 1% de pré-mistura mineral em uma base DM. Os aditivos de dieta foram incluidos em uma mistura (tabela 1) que foi adicionada à dieta basal a 10% de DM de dieta. Na alimentação, as pré-misturas foram misturadas com a mão nas dietas. Água estava disponível livremente durante o experimento. Nitrato foi suplementado de uma fonte comercialmente disponível (Calcinit, Yara) e SO4 suplementar foi adicionado à dieta na forma de MgSO4 anidro.

Durante a fase de adaptação, os carneiros foram introduzidos às pré-misturas experimentais em etapas de 25% por semana. Os cordeiros foram alimentados uma vez por dia às 8h30. Antes da alimentação de manhã, residues foram removidos dos recipientes de ração e pesados para determinar ingestão voluntária de ração. Durante a semana nas câmaras de respiração, a disponibilidade de ração foi limitada a 95% da ração consumida pelo animal consumindo o mínimo de ração em um bloco na semana antes do alojamento nas câmaras de respiração. A restrição de alimentação foi aplicada para evitar interações entre o efeito dos aditivos em DM1 e o efeito sobre a produção de metano.

Nitrato nas dietas experimentais foi trocado para uréia na dieta de controle para manter dietas isonitrogenosas. Calcário foi adicionado à dieta de controle para assegurar ingestão igual de Ca entre tratamentos. MgO foi incluído na dieta para obter níveis similares de Mg entre dietas. O volume das adições diferentes às dietas foi diferente para cada tratamento, e celulose de madeira foi utilizado para equilibrar isso.Tabela 1: composição das misturas contendo os aditivos experimentais (% de DM)

2 fórmula química 5Ca (NO3) 2.NH4NO3. IOH2O

Amostragem de sangue, rúmen e fígado

O sangue foi amostrado em d2, d8, dl5, d22 e d28 em 1, 3 e 5 h após alimentação. Os dias 2, 8, 15 e 22 foram todos 1 dia após uma etapa incremental de 25% da pré- mistura experimental na dieta. No dia 28, os cordeiros estavam em 100% dos tratamentos de dieta por uma semana. Amostras de sangue foram tiradas em tubos de coleta contendo heparina (Vacutainers) e armazenadas no refrigerador diretamente após amostragem. Ao término do dia de amostragem, as amostras foram despachadas para análise e foram analisadas no dia seguinte. O teor de metemoglobina do sangue foi determinado pelos métodos descritos em Evelyn e Malloy (1938) .

Após término do periodo nas câmaras de respiração, os carneiros foram abatidos e amostras de fluido de rúmen (200 ml) foram tiradas do rúmen assim que possível após abate. As amostras foram imersas em água gelada diretamente após amostragem para parar fermentação microbiana e congeladas após tirar todas as amostras. No abate, amostras duplicatas de figado foram tiradas, resfriadas e congeladas para avaliação posterior de estado de vitamina A.

Resultados e discussão Teores de metemoglobina de sangue durante periodo de adaptação

Durante suplementação da dieta com 25% ou 50% da taxa de inclusão de pré-mistura final nenhum dos carneiros teve um teor de MetHb de sangue positivo (<2% de Hb) . Quando 75% da taxa de inclusão foram incluídos na dieta um carneiro na dieta NO3 testou positivo 3 h após alimentação, porém o valor era somente 3% de Hb. Quando os carneiros estavam na taxa de inclusão de 100% por uma semana (d28) dois carneiros no tratamento NO3 testaram positivos com valores de metHb de 7% e 3% de Hb respectivamente em 3 h após alimentação. Os carneiros na dieta de controle e dietas contendo sulfato nunca tiveram niveis de MetHb mais elevados do que 2% de Hb (limite de detecção) , possivelmente indicando que S desempenha um papel na redução de nitrito no rúmen. O periodo de adaptação de 4 semanas aparentemente foi suficiente para evitar quaisquer problemas significativos associados à toxicidade de nitrito e methemoglobinemia. Uma descoberta similar foi relatada por Alaboudi e Jones (1985). Niveis de nitrato de 2,9% de DM seriam considerados letais para ruminantes não adaptados, porém a adaptação aparentemente permitiu gue as bactérias de rumem aumentassem sua capacidade de reduzir nitrito.

Crescimento e ingestão de ração durante a adaptação a sulfato e nitrato de dieta

A ingestão de ração não foi diferente como resultado da adição de NO3 ou SO4 (tabela 2), porém tendeu ser mais baixa quando a dose total de nitrato foi fornecida. Entretanto, com inclusões maiores do que 25% da taxa de inclusão final, a ingestão de ração foi compativelmente reduzida (aproximadamente 9% no periodo além de semana 1) como resultado da inclusão de NO3a. O número baixo de animais utilizados nesse estudo impede tirar conclusões sobre os efeitos na ingestão de ração, porém a ingestão de ração mais baixa compatível não deve ser ignorada. Bruning-Fann e Kaneene (1993) relatam que em carneiros efeitos negativos sobre a ingestão de ração foram observados quando os niveis de nitrato de dieta excederam 3% de DM de dieta. Essa redução em ingestão de ração pode ser relacionada à uma diminuição induzida por nitrito de ingestão de parede de célula como foi demonstrado in vitro por Marais e outros (1988).Alimentação de NO3 ou SO4 não afetou o ganho do peso corpóreo (tabela 3). Tabela 2: ingestão de ração (g/carneiro/dia) durante o estágio de adaptação de semanas aos aditivos de dieta

Tabela 3: peso corpóreo (BW; kg/carneiro) e ganho de peso corpóreo (BWG; kg/carneiro/semana) durante o estágio de adaptação aos aditivos de dieta

Tabela 4: ingestão de ração, permuta gasosa e produção de calor durante a semana de medição nas câmaras de respiração

Efeitos de NO3 e SO4 em permuta gasosa

Os fluxos de gases determinados nas câmaras de respiração são mostrados na tabela 4. A alimentação de limite gue foi aplicada durante essa parte do experimento resultou em ingestão de ração muito similar entre tratamentos. A produção de metano foi diminuida em 34% como resultado da adição da fonte de nitrato à dieta.

Os carneiros no tratamento de NO3 no experimento dos requerentes consumiram em média 24,9 g de NO3 por dia, o que teoricamente diminuiria a produção de metano em 6,4 g. a diminuição efetiva em produção de metano no tratamento com NO3 foi de 8,11, o que corresponde a 5,8 g de CH4 (CH4 = 0,714 g/1) . Desse modo, a diminuição em produção de metano é efetivamente de certo modo mais baixa do que pode ser explicado por estequiometria, o que pode ser explicado por redução incompleta de nitrato em amónia ou uso de nitrato em outros processos do que redução dissimuladora de nitrato. A fonte de nitrato utilizada nesse estudo era altamente solúvel e portanto é provável que a maior parte do nitrato fosse disponível para redução no rúmen. Entretanto, grande parte do nitrato dissolvido teria estado na fase liquida do rúmen e pode ter passado para fora do rúmen antes de ser reduzida.

A adição de sulfato levou a uma redução de 19% em produção diária de metano.

No estudo dos requerentes, carneiros no tratamento com SO4 consumiram em média 27,0 g de SCú/dia, o que corresponderia a uma redução de metano de 4,5 g. a diminuição observada efetiva em redução de metano foi de 4 1, ou 2,9 g. a diferença na capacidade teórica para SO4 como um dissipador de hidrogênio e sua capacidade observada em reduzir emissão de metano pode estar na solubilidade de MgSÜ4 no rúmen.

Os carneiros nos tratamentos com SO4 foram alimentados com uma quantidade considerável de S na dieta (7,4 g adicionado S/kg DM) . Esse nivel está bem acima das recomendações máximas como indicado por NRC (4 g/k DM) . A alimentação acima desse limite superior aumenta o risco de polioencefalomalacia, devido a niveis elevados de H2S que ocorrem no espaço superior de rúmen e a inalação subsequente de H2S. os resultados a partir desse experimento, mostram efetivamente, entretanto, que SO4 é eficaz na redução de produção de metano. Quando alimentado nos niveis recomendados (2-4 g S/kg DM), espera-se que SO4 tenha um efeito de redução sobre a produção de metano. O consumo de oxigênio e produção de CO2 foram ambos mais baixo como consequência no tratamento com nitrato. Doses elevadas de nitrato em dietas de ruminantes foram relatadas como causando methemoglobinemia, reduzindo a capacidade do sangue de transportar oxigênio para os tecidos dos animais. Entretanto, nesse experimento o sangue foi amostrado em uma base regular e niveis de MetHb levemente elevados foram somente encontrados em dois carneiros (nivel máximo era 7% de Hb) e parece improvável explicar o consumo mais baixo de O2. O consumo mais baixo de O2 pode refletir um metabolismo diferente quando nitrato é alimentado. Sar e outros (2004) também observaram um consumo mais baixo de O2 e produção mais baixa de CO2 quando 0,9 g de NCb/kg0'75 de BW foi dosado de forma intra- ruminal para carneiros. Nesse estudo consideravelmente mais nitrato foi alimentado (1,4 g de NCb/kg0'75 de BW) porém os niveis de MetHb no estudo dos requerentes foram consideravelmente mais baixos (18,4% de Hb no estudo de Sar e outros) . Isso se deve provavelmente à ausência de um periodo de adaptação no estudo de Sar e outros (2004) e o fato de que nitrato foi dosado como uma solução no rúmen.

Em outro estudo (Takahashi e outros, 1998) foi dosado NaNCh no rúmen de carneiros em uma taxa de 1,5 g/kg BW0'75, que era muito similar à concentração utilizada no estudo dos requerentes. As concentrações de MetHb até mais de 30% foram observadas e dos dados do estudo foi concluido que para cada 10% de aumento em MetHb, o consumo de oxigeno diminui em 10,3%. No estudo dos requerentes uma redução em consumo de oxigênio de 6% foi observada. Utilizando a equação de regressão por (Takahashi e outros, 1998), isso significaria que os animais teriam tido niveis de MetHb de aproximadamente 5%. Em dois animais niveis similares (3 e 7% de Hb) foram na realidade observados.

A produção de metano no tratamento de controle era tipica para carneiros alimentados no limite uma vez por dia. Os animais foram alimentados às 8h da manhã, após o que a produção de metano aumentou progressivamente para atingir a produção máxima de metano em 5-6 h após a alimentação. Uma vez que os animais foram alimentados no limite e somente alimentados uma vez por dia, a produção de metano declinou sucessivamente após o pico. A adição de nitrato à ração invocou um padrão de produção de metano acentuadamente diferente; imediatamente após a alimentação a taxa de produção de metano permaneceu em um nivel bem mais baixo e foi levantada a hipótese de que nesse periodo hidrogênio foi utilizado para redução de nitrato, desse modo limitando a disponibilidade de H2 para metanogênese. Dez horas após a alimentação, a taxa de produção de metano não era mais diferente do tratamento de controle, provavelmente refletindo a ausência de ração contendo nitrato e um retorno a metanogênese como dissipador-H. embora a produção de metano fosse significativamente mais baixa após alimentação como resultado do nitrato alimentado, a produção de metano nunca foi reduzida a 0 e a redução de nitrato e metanogênese ocorreu simultaneamente. O nivel basal de produção de metano pode pelo menos ser parcialmente explicado por produção de metano a partir de fermentação de intestino grosso. É improvável que nitrato atinja o intestino grosso sem ser reduzido e a alimentação de nitrato provavelmente portanto não influenciaria a produção de metano nessa parte do trato gastrointestinal.

A taxa de produção de metano a partir do tratamento de SO4 nunca foi diferente do tratamento de controle porém era consistentemente mais baixa do que o tratamento de controle durante todo o periodo de 24 h. o mesmo foi observado quando o tratamento com SO4 foi comparado com o tratamento com NO3 + SO4. Evidentemente, os efeitos de NO3 e SO4 sobre a produção de metano são complementares e o efeito de SO4 parece ser menos dependente da disponibilidade de ração contendo SO4.

Os resultados do experimento são também representados no gráfico da figura 1, mostrando a produção de metano (1/h) durante o curso de um periodo de 24 nos grupos que recebem a dieta basal ou uma das três dietas experimentais.

Consumo de oxigênio durante o curso de um periodo de 24 h

Diretamente após alimentação às 8h da manhã, o consumo de oxigênio era 10-18% mais baixo para o tratamento com NO3. Esse fenômeno coincide com a produção de metano acentuadamente reduzida no periodo após alimentação para o tratamento com NO3. É levantada a hipótese de que nesse periodo a redução significativa de nitrato ocorreu no rúmen, com a produção de nitrito como intermediário no tratamento com NO3. A presença de nitrito durante esse periodo poderia explicar o consumo mais baixo de oxigeno do tratamento com NO3. Embora os niveis de MetHb além de 7% de

Hb nunca fosse observados para o tratamento com NO3, uma redução definitiva em consumo de oxigênio foi observada. O tempo de armazenagem das amostras (amostras foram analisadas aproximadamente 24 h após a amostragem), poderia explicar os niveis de MetHb mais baixos do gue esperado, encontrados.

No tratamento com NO3+SO4, o consumo de oxigênio era somente mais baixo diretamente após alimentação (9h da manhã) e recuperado até o mesmo nivel como o tratamento de controle após esse ponto de tempo. A adição de SO4 aparentemente alivia a diminuição em consumo de oxigênio invocada pela alimentação de nitrato. Possivelmente, SO4 foi reduzido para H2S no periodo diretamente após alimentação e desempenhou um papel na aceleração de redução de nitrito como foi proposto. Uma aceleração clara dependente de dose de redução de nitrito foi encontrada anteriormente quando sulfeto foi adicionado a fluido de rúmen in vitro (Takahashi e outros, 1989) . A aceleração em redução de nitrito foi bem menos quando SO4 foi adicionado ao meio e portanto parece plausível que era H2S, que ativamente recuperou o consumo de oxigênio no experimento dos requerentes.

Os resultados do experimento são também representados no gráfico da figura 2, mostrando o consumo de oxigênio (1/kg MW/h) durante o curo de um periodo de 24 h nos grupos que recebem a dieta basal ou uma das três dietas experimentais.

Exemplo II: efeito de sulfato sobre methemoglobinemia em gado suplementado com nitrato

O efeito de ingestão de sulfato de dieta sobre a concentração de metamoglobina em sangue de vacas suplementadas com nitrato foi avaliado. Foi levantada a hipótese de que sulfato de dieta reduziria o acúmulo de nitrito no rúmen de vacas alimentadas com nitrato e consequentemente evitaria a formação de metamoglobina em sangue.

Material e métodos Projeto experimental

O experimento foi um projeto de bloco randomizado, com 4 animais por bloco e doses diferentes de sulfato como tratamentos. Os animais foram divididos em bloco por rendimento de leite e subsequentemente em um bloco aleatoriamente distribuído para um de quatro tratamentos de dieta: NO3, NO3 + SO4 baixo, NO3 + SO4 médio, NO3 + SO4 elevado.

Alimentação

A dieta basal consistiu em 45% de silagem de milho, 7,5% de alfafa seca, 4,1% de palha de cevada cortada, e 42% de uma pré-mistura concentrada em uma base DM. Os aditivos de dieta foram incluídos na pré-mistura (tabela 5) . Na alimentação, as pré-misturas foram distribuídas para as vacas como parte de uma Ração misturada total. A água estava disponivel livremente durante o experimento. Nitrato foi suplementado de uma fonte comercialmente disponivel (Calcinit, Yara AS, Noruega) e SO4 suplementar foi adicionado à dieta na forma de MgSÜ4 anidro.Tabela 5: composição das misturas contendo os aditivos experimentais (% de DM)

Durante a fase de adaptação, as vacas foram introduzidas às pré- misturas experimentais nas etapas de 25% por semana, (tabela 6).Tabela 6: composição das combinações experimentais de concentrado durante a fase de adaptação

Amostragem de sangue

O sangue foi amostrado 3h após alimentação duas vezes por semana durante todo o experimento para monitorar estreitamente a concentração de metamoglobina. O sangue foi coletado em tubos evacuados contendo heparina, mergulhados imediatamente em água gelada e armazenado em um refrigerador a 4 C. ao término de cada dia de amostragem, amostras foram despachadas para análise e foram analisadas no dia seguinte. O teor de metamoglobina do sangue foi determinado pelo método de Evelyn e Malloy (1938) . No dia 37, quando nitrato foi alimentado em sua taxa de inclusão máxima (3% de nitrato em base DM) , a amostragem de sangue foi realizada mais freqüentemente (-0,5 h, 0,5h, 1,5 h, 3 h, 5 h e 8 h após alimentação) para estabelecer a cinética de nitrato e seus vários metabolites no plasma.

Resultados e discussão Teores de metemoglobina de sangue durante periodo de adaptação

Nenhuma das vacas teve metamoglobina de sangue detectada durante a suplementação da dieta com 25% ou 50% da taxa de inclusão de nitrato final. Quando nitrato foi adicionado à dieta a 75% da taxa de inclusão final, as vacas que não foram suplementadas com sulfato apresentaram hemoglobina elevada no sangue em 3 h após alimentação. Ao contrário, as vacas que receberam sulfato em sua dieta testaram negativas para metamoglobina, independente da quantidade de S fornecida. Na taxa de inclusão de 100% de nitrato, todos os tratamentos apresentaram uma elevação em metamoglobina no sangue embora a elevação fosse mais acentuada para vacas em nitrato sozinho, em comparação com aquelas que receberam nitrato e sulfato. Entre as vacas suplementadas com sulfato, não foi possivel distinguir ume feito da dose de sulfato (vide a tabela 7) . Foi concluído que sulfato foi capaz de neutralizar o acúmulo de nitrito no rúmen, consequentemente evitando (em adição moderada de nitrato) ou reduzindo (em adição elevada de nitrato) a formação de metamoglobina no sangue.Tabela 7: metamoglobina no sangue (% de hemoglobina)

Meios com sobrescritos diferentes sãosignificativamente diferentes (P<0,l). Os resultados do experimento são tambémrepresentados no gráfico da figura 3, mostrando a concentração de metamoglobina no sangue recebem uma das quatro dietas experimentais. de vacasque

Exemplo III: efeito de Megasphaera elsdenii e Selenomonas ruminantium sobre a taxa de redução de nitrito e nitrato no modelo de fermentação de rúmen

No presente experimento a cinética de redução de nitrato em um sistema de fermentação de rúmen in vitro foi estudada e os efeitos sobre o mesmo por M. elsdenii e S. ruminantium.

Materiais e métodos

A ração utilizada em simulação de rúmen era 1 5 grama de matéria seca e composta de silagem de grama (0,5 g de matéria seca) e a ração de composto comercial, 0,5 g de matéria seca. Os tratamentos foram como indicados na seguinte tabela:

*) tratamentos 2 a 17 contêm 7,52 mg MgSO4/40 ml. Todos os tratamentos foram feitos em quádruplos,o número total de recipientes de simulação sendo 72. Os componentes de ração seca e Calcinit foram pesados em garrafas de soro, as garrafas lavadas com CO2 passados através de um catalisador de cobre quente para expurgar O2, e vedadas com tampos de borracha de butila espessas, 36,5 ml de solução de tampão ajusta em temperatura (+37°C), reduzida, anaeróbica foram introduzidos em cada recipiente de simulação sob o fluxo de CO2 livre de oxigênio. Culturas bacterianas crescidas durante a noite, a solução de MgSOé, solução de lactato e a solução de tampão para igualar o volume de liquido total a 1,5 ml/de recipiente foram adicionadas. Finalmente, 2 ml de fluido de rúmen peneirado, fresco foi adicionado nas garrafas de soro, o volume final sendo 40 ml. Essa inoculação iniciou a simulação de rúmen efetiva. O tempo de inoculação para cada recipiente foi registrado e levado em consideração ao amostrar e parar a fermentação.

A simulação de fermentação de rúmen continuou por 12 horas a 37°C. Durante a fermentação a produção total de gás foi medida após 2, 4, 6, 9 e 12 horas de simulação para ter uma idéia sobre a atividade metabólica geral dos micróbios de rúmen.

Todo gás produzido durante as 12 horas em cada recipiente de simulação foi individualmente coletado de cada dos 72 recipientes em uma garrafa de infusão de 2 litros evacuado que tinha etano pré-introduzido como um padrão interno. Essas amostras foram analisadas para metano para ver o efeito de tratamentos no metano total produzido por bactérias de rúmen durante as 12 horas. A análise foi realizada por cromatografia de gás utilizando detector de ionização de chama e metano e etano puro como padrões.

Em 4 e 12 horas todos os recipientes de simulação foram analisados em relação a ácidos graxos voláteis (VFAs) e ácido láctico (coletivamente mencionado como SCFAs). Os ácidos foram analisados por cromatografia de gás utilizando uma coluna acondicionada para a análise de ácidos livres. Os SCFAs quantificados foram ácidos acético, propiônico, butirico, iso-butirico, 2-metil-butirico, valérico, iso- valérico e láctico. NO3 e NO2 foram analisados de todos os recipientes de simulação em 0, 2, 4 e 12 horas. O método foi espectrofotométrico e baseado em redução de nitrato com vanádio (III) combinado com detecção por reação Griess ácida. NH4 foi analisado a partir de todos os recipientes de simulação em 0, 2, 4 e 12 horas. O método foi colorimétrico e baseado em reação de fenol-hipoclorito.

A análise estatística consistiu em testes t de duas caudas para todos os parâmetros medidos. Os testes foram realizados contra o tratamento com Calcinit e emenda de MgSO4 (tratamentos 2 e 17). O teste-t foi escolhido para deixar os tratamento individuais serem independentes dos outros tratamentos testados simultaneamente. Os resultados são marcados nas figuras, em que 0,01 < valor-p < 0,05 é indicado como *; 0,001 < valor-p <0,01 é indicado como: **; 0,0001 < valor p < 0,001 é indicado como ***; e valor p < 0,0001 é indicado como ****.

Resultados Efeito de tratamentos sobre a produção total de gás

Nesse trabalho os requerentes inocularam todos os recipientes com 5% de fluido de rúmen, porém, além disso, alguns recipientes receberam uma dose de Selenomonas ruminantium ou Megasphaera elsdenii. Essas bactérias são os principais meios de utilização de lactato no rúmen e, além disso, acredita-se que capacidade de reduzir nitrato e/ou nitrito. M. elsdenii foi testado também em combinação com ácido láctico, o raciocínio sendo que ácido láctico é um substrato para a bactéria e poderia ter um efeito positivo em sua competitividade no microcosmo de rúmen. Como mostrado na figura 4 a adição de NO3 e MgSCU causou supressão significativa de produção de gás. Esse efeito foi mais acentuado quando o tempo passou; quase 25% de supressão de produção cumulativa de gás foi medido em ponto de tempo de 12 h. Quando comparado com o tratamento enriquecido com nitrato, inoculo de S. ruminantium teve um efeito positivo sobre a produção de gás durante as 4 primeiras horas. Esse feito foi estatisticamente significativo em doses 100 e 1000 μl/40 ml. A produção inicial de gás foi também estimulada por M. esdenii, porém somente na dose mais elevada de 1000 μl. quando ácido láctico foi fornecido a produção de gás foi suprimida, que pode ser devido a seu efeito inibidor direto sobre o metabolismo de microbióticos de rúmen. O efeito estimulador de S. ruminantium não foi detectado nos pontos de tempo posteriormente. Entretanto, a dose mais elevada de M. esldenii continuou a aumentar produção cumulativa de gás, o efeito positivo relativo sendo ainda mais significativo nos pontos de tempo posteriormente. A adição de ácido láctico continuou a suprimir a dose de produção de gás dependentemente por toda a duração da incubação. Entretanto, em combinação com lactato a dose elevada de M. elsdenii cancelou a supressão metabólica e na realidade, transformou a mesma em estimulação de produção de gás. Apesar do fato de que M. elsdenii estimulou a produção de gás geral em dose elevada, não poderia superar totalmente o efeito negativo de nitrato.

Efeito de tratamentos sobre a produção de metano Os requerentes quantificaram o CH4 produzido além da produção total de gás. Nesse estudo de fermentação a proporção de metano do total produzido foi relativamente baixa, permanecendo claramente abaixo de 10% (figura 5B). o nivel de produção de metano depende da dieta e estado fisiológico da vaca utilizada como um doador de fluido de rúmen. Nesse caso o animal era uma vaca leiteira em uma dieta de energia elevada. Nitrato na dieta suprimiu produção absoluta de metano em quase 80% (figura 5A).

Efeito de tratamentos sobre a redução de nitrato A quantidade fixa de nitrato foi adicionada em todos os recipientes de simulação, exceto por aqueles rotulados "sem alterações", na forma do produto "Calcinit" (a uma concentração final de 14 mM de nitrato) . Nesse estudo de fermentação o metano produzido total foi 7 a 8 ml na ausência de nitrato e foi reduzido para 1,5 ml quando nitrato foi fornecido.

A concentração de nitrato e os produtos de sua redução, nitrito e amónio, foram analisados após 2, 4 e 12 horas a partir da inoculação. Embora 14 mM de nitrato fosse fornecido em 0 hora, somente aproximadamente 10 mM de concentração de nitrato foram encontrados no filtrados em todos os recipientes em 2 horas. Além disso, o nitrato medido em solução foi igual ou marginalmente mais elevado 2 horas após. Isso sugere que nitrato é rapidamente absorvido pela matriz sólida ou absorvido pelo microbiota. Esse equilíbrio em divisão permaneceria até o consumo de nitrato por bactérias ficar em boa velocidade. No presente estudo a amostragem final indicou um colapso em nivel de nitrato entre 4 e 12 horas (figura 6) . O efeito da dose elevada de alteração de M. elsdenii sugeriu que a redução de nitrato foi significativamente desacelerada pela dose elevada dessabactéria.

A análise de nitrito em 2 e 4 horas de pontos de tempo foi compatível com os dados de nitrato. Em 2 horas a concentração de nitrito estava abaixo de 0,05 mM com todos os tratamentos sugerindo que a taxa de redução de nitrato estava baixa (figura 7A) . em 4 horas o nivel de nitrito tinha começado a elevar porém estava ainda abaixo de 0.2 mM. Vale a pena observar que embora S.ruminantium pareceu aumentar dependentemente de dose de nitrito, a dose de M. elsdenii reduziu dependentemente do mesmo (figura 7B). após 12 horas o efeito de M. elsdenii era mais claro uma vez que em sua ausência a concentração de nitrito tinha aumentado para 8 mM e reduzido a dose dependentemente quando a bactéria foi adicionada. Com a alteração de M. elsdenii puro a dose de 1000 ul foi necessária para remover totalmente nitrito. Entretanto, quando combinado com lactato, já a dose de 100 ul abaixou a concentração de nitrito para o limite de detecção (figura 7C). o efeito de aumentar nitrito de S. ruminantium não mais foi detectado em 12 horas sugerindo que seu papel metabólico no microcosmo do modelo de rúmen era desprezível.

Amónio é o produto de redução final de nitrato /nitrito. Entretanto, não é um produto que poderia ser esperado acumular quantitativamente no sistema microbiano porque é uma forma de nitrogênio que é prontamente assimilada por micróbios quando nenhuma fonte de nitrogênio orgânica, preferida está disponivel. Esse papel transiente de amónio torna impossível fazer cálculos precisos de equilíbrio estequiométrico. Ainda, era óbvio que quando 14 mM de nitrato foi adicionado nos sistema de fermentação a concentração residual de amónio 12 horas após aumentou de 10 para 18 mM. Quando também M. elsdenii foi adicionado no meio de fermentação o nivel de amónio atingiu 23 a 31 mM de concentração dependendo da dose de substrato adicional de lactato fornecido (figura 8C). Esses dados mostram de forma indisputável que a alteração de nitrato leva a produção ou acúmulo elevado de amónio. os dados também sugerem fortemente que M. elsdenii reforça adicionalmente esse processo metabólico. A concentração residual de amónio teve pico em dose de 100 ul de M. elsdenii, e em dose de 1000 ul mostrou um declinio claro.

Conclusões

Os dados apresentados aqui confirmaram novamente que nitrato na dieta reduz a produção de metano. Também mostraram que nitrato se torna reduzido em nitrito e adicionalmente em amónio. Esse processo pareceu ser diretamente ligado à produção de metano uma vez que as condições que evitaram redução quantitativa de nitrato também reduziram o grau de inibição de metanogênese.

A alteração de M. elsdenii não acelerou a redução de nitrato porém, na realidade, pareceu inibir a mesma. Ao contrário, a dose de bactéria reduziu de forma dependente a concentração residual de nitrito e, concomitantemente, aumentou a concentração de seu produto de redução, amónio. Esses dados sugerem que essa cepa não expressa reductase funcional de nitrato, porém sempre que alguma outra bactéria catalisa a redução de nitrato em nitrito, a cepa de M. elsdenii reduz prontamente adicionalmente em amónio. Essa característica torna M. elsdenii um meio de prevenção ideal de envenenamento por nitrito resultando de produção rápida e acúmulo de nitrito por bactérias que reduzem nitrato.

De acordo com o conhecimento prévio dos requerentes M. elsdenii não é um meio de utilização de lactato principal em vacas leiteiras. Entretanto, em gado de corte que está sendo alimentado com dietas com teor elevado de grãos as condições para M. elsdenii são favoráveis. O motivo é que esse meio de utilização de lactato é altamente competitivo somente quando o nivel de ácido láctico no rúmen é elevado. Essa característica da bactéria é o motivo pelo qual os requerentes testaram aqui também o efeito de ácido láctico e a combinação de M. elsdenii - ácido láctico. Os efeitos de M. elsdenii sobre vários parâmetros foram para a mesma direção quer o ácido láctico fosse incluído ou não, porém quando ácido láctico foi fornecido os efeitos eram mais fortes. Isso sugere que a competitividade de M. elsdenii foi aperfeiçoada por lactato. Por que a dose elevada de M. elsdenii inibe a redução de nitrato? Isso pode ser somente especulado aqui e a resposta final poderia somente vir de um estudo especificamente projetado. Uma explicação possivel é que M. elsdenii concorre para alguns nutrientes vitais ou co- fatores com uma bactéria que reduz nitrato principal. Uma vez que o crescimento de M. elsdenii não depende de redução de nitrito e supera o redutor de nitrato. Outra explicação possivel é uma inibição de produto final. A dose elevada de M. elsdenii leva ao aumento em concentração de amónio, que pode servir como um inibidor de realimentação para redução de nitrato.

Referências

Alaboudi, A. R. e G. A. Jones. 1985. Effect of Acclimation to High Nitrato Intakes on Some Rumen Fermentation Parameters in Sheep. Canadian Journal of Animal Science 65:841-849.

Asanuma, N., M. Iwamoto, e T. Hino. 1999. Effect of the Addition of Fumarate on Methane Production by Ruminal Microorganisms In Vitro. J. Dairy Sci. 82(4) :780- 787 .

Beauchemin, K. A., M. Kreuzer, F. O’Mara, e T. A. McAllister. 2008. Nutritional management for enteric methane abatement: a review. Australian Journal of Experimental Agriculture 48(2):21-27.

Bruning-Fann, C. S. e J. B. Kaneene. 1993. The effects of nitrato, nitrito, and N-nitroso compounds on animal health. Vet Hum Toxicol 35(3):237-253.

Evelyn, K. A. e H. T. Malloy. 1938. MICRO-DETERMINATION OF OXYHEMOGLOBIN, METHEMOGLOBIN, AND SULFHEMOGLOBIN IN A SINGLE SAMPLE OF BLOOD journal of biological chemistry 126:655663. Guo, W. S., D. M. Schafer, X. X. Guo, L. P. Ren, e Q. X. Meng. 2009. Use of nitrato-nitrogen as a sole de dieta nitrogen source to inhibit ruminal methanogenesis and to improve microbial nitrogen synthesis in vitro. Asian- Australian Journal of Animal Science 22 (4) :542-549. Iwamoto, M., Asanuma N., e Hino, T. 1999 Effects of nitrato combined with fumarate on methanogenesis, fermentation, and cellulose digestion by mixed ruminal microbes in vitro. Animal Science Journal 70 (6) :471-478.

Iwamoto, M., Asanuma N., e Hino, T. 2001. Effects of pH and electron donors on nitrato and nitrito reduction in ruminal microbiotica. Animal Science Journal 72(2): 117125.

Joblin, K. N. 1999. Ruminal acetogens and their potential to lower ruminant methane emissions. Australian Journal of Agricultural Research 50(8): 1307-1314.

Johnson, K. A. e D. E. Johnson. 1995. Methane emissions from cattle. J Anim Sci 73(8):2483-2492.

Le Van, T. D., J. A. Robinson, J. Ralph, R. C. Greening, W. J. Smolensk!, J. A. Z. Leedle, e D. M. Schaefer. 1998. Assessment of Reductive Acetogenesis with

Indigenous Ruminal Bacterium Populations and Acetitomaculum ruminis. Appl. Environ. Microbiol. 64 (9) :3429-3436.

Lewis, D. 1951. The metabolism of nitrato and nitrito in the sheep; the reduction of nitrato in the rumen of the sheep. Biochem. J. 48(2): 175-170.

Marais, J. P., J. J. Therion, R. I. Mackie, A. Kistner, e C. Dennison. 1988. Effect of nitrato and its reduction products on the growth and activity of the rumen microbial population. British Journal of Nutrition 59(02):301-313.

Molano, G., T. W. Knight, e H. Clark. 2008. Fumaric acid supplements have no effect on methane emissions per unit of ingestão de alimento in wether lambs. Australian Journal of Experimental Agriculture 48(2): 165168.

Sar, C, B. Mwenya, B. Santoso, K. Takaura, R. Morikawa, N. Isogai, Y. Asakura, Y. Toride, e J. Takahashi. 2005. Effect of Escherichia coli wild type or its derivative with high nitrito reductase activity on in vitro ruminal methanogenesis and nitrato/nitrito reduction. J. Anim Sci. 83 (3) :644-652.

Sar, C, B. Santoso, B. Mwenya, Y. Gamo, T. Kobayashi, R. Morikawa, K. Kimura, H. Mizukoshi, e J. Takahashi. 2004. Manipulation of rumen methanogenesis by the combination of nitrato with [beta] 1-4 galactooligosaccharides or nisin in sheep. Animal Feed Science and Technology 115(1-2): 129-142.

Steinfeld, H., P. Gerber, T. Wassenaar, V. Castel, M. Rosales, and C. De Haan. 2006. Livestock's Long Shadow. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Takahashi, J., M. Ikeda, S. Matsuoka, and H. Fujita. 1998. Prophylactic effect of L-cysteine to acute and subclinical nitrato toxicity in sheep. Animal Feed Science and Technology 74 (3) :273-280.

Takahashi, J., e Young, B.A. 1991. Prophylactic effect of L-cysteine on nitrato-induced alterations in respiratory exchange and metabolic rate in sheep. Animal Feed Science and Technology 35:105-113.

Takahashi, J., N. Johchi, e H. Fujita. 1989. Inhibitory effects of sulphur compounds, copper and tungsten on nitrato reduction by mixed rumen microorganisms. British Journal of Nutrition 61 (03) :741-748.

Ungerfeld, E. M., R. A. Kohn, R. J. Wallace, e C. J. Newbold. 2007. A meta-analysis of fumarate effects on methane production in ruminal batch cultures. J. Anim Sci. 85(10):2556-2563.

Verstegen, M. W. A., W. Van der Hel, H. A. Brandsma, A. M. Henken, e A. M. Bransen. 1987. The Wageningen respiration unit for animal production research: A description of the equipment and its possibilities. Energy Metabolism in Farm Animals:

Effects of Housing, Stress and Disease. Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, The Netherlands.

Claims (5)

1. Uso de uma combinação de um composto de nitrato e um composto de sulfato caracterizado por ser na fabricação de um produto para a redução não terapêutica da produção gastrointestinal de metano em um ruminante, em que a quantidade total da combinação de nitrato e sulfato é superior a 10 g/kg e inferior a 750 g/kg, em que a quantidade de microorganismo probiótico redutor de nitrito é de 1 X 108 a 1 X 1014 cfu/kg/dia, preferencialmente de 1 X 109 a 1 X 1013 cfu/kg/dia e mais preferencialmente de 1 X 1010 a 1 X 1012 cfu/kg/dia.

2. Ração composta caracterizada por compreender uma combinação de um composto de nitrato e um composto de sulfato, a dita combinação fornecendo uma quantidade total de nitrato e sulfato superior a 10 g/kg e inferior a 750 g/kg, em que a quantidade de sulfato excede 7,5 g/kg em uma base de peso seco, em que a ração composta reduz a produção gastrointestinal de metano em um ruminante.

3. Ração composta, de acordo com a reivindicação 2, caracteri zada pelo fato de que a quantidade de nitrato excede 7,5 g/kg em uma base de peso seco.

4. Ração composta, de acordo a reivindicação 2, caracterizada por compreender adicionalmente um microorganismo probiótico redutor de nitrito selecionado a partir de Megasphaera elsdenii e Propionibacterium acidipropionici.

5. Suplemento de ração caracteri zado por compreender 10 a 100% de uma combinação de um composto de nitrato e um composto de sulfato, em que a quantidade de sulfato no suplemento de ração, em uma base de peso seco, excede 25 g/kg e não excede 250 g/kg; em que a quantidade total de nitrato e sulfato combinados é inferior a 250 g/kg; e em que o suplemento é na forma selecionada dentre um pó, um sólido compactado e um sólido granulado.

Images