CN102497786A - 用于降低反刍动物的胃肠产甲烷作用的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及借助于在摄取的饲料的正常发酵期间竞争甲烷微生物所需的氢原子的试剂来降低反刍动物的胃肠产甲烷作用。本发明一方面在于发现硝酸盐还原途径以及硫酸盐还原途径在反刍动物胜过胃肠产甲烷作用，并且硝酸盐和硫酸盐的产甲烷作用降低效果是完全加成的。同时，据发现，联合给予硝酸盐和硫酸盐完全有效地避免或缓解通常单独使用硝酸盐所遇到的亚硝酸盐中毒的潜在问题，当需要时，所述效果通过加入亚硝酸盐还原益生微生物而进一步增强。因此，本发明提供这样的产品，其包含大量硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合，和任选地，亚硝酸盐还原益生微生物；以及利用这样的组合物来降低反刍动物的胃肠产甲烷作用的方法。

Description

用于降低反刍动物的胃肠产甲烷作用的组合物
技术领域
本发明涉及反刍动物的饲料添加剂和补充剂领域。更具体而言，本发明涉及借助于在摄入的饲料的正常发酵期间竞争甲烷微生物所需的氢原子的抑制剂来降低反刍动物的胃肠产甲烷作用。本发明提供包含所述抑制剂的饲料补充剂和饲料组合物，以及它们用于降低产甲烷作用的非治疗性用途。
背景技术
产甲烷作用是瘤胃发酵过程期间氢(H2)清除的主要途径(Beauchemin et al.，2008)。从瘤胃环境除去H2对于瘤胃发酵的有效延续很重要，但是由产甲烷作用产生的甲烷则涉及动物饲料能量的损失(Johnson and Johnson，1995)以及促使全球变暖的重要温室气体(Steinfeld et al.，2006)。这两个问题均使得全球寻求减少反刍动物的甲烷产生的饲料添加剂。
降低甲烷释放的研究选择之一是将过量的H2重新导入产生更多对反刍动物有益的产物的过程中，由此降低产甲烷作用。实例包括通过加入丙酸前体刺激产丙酸作用(propiogenesis)，以及向瘤胃中引入还原性产乙酰作用(acetogenesis)的尝试(Joblin，1999，Molano et al.，2008)。成功地将这些过程引入瘤胃会分别产生作为动物营养的丙酸或乙酸，同时降低产甲烷作用的H2的有效性。然而，引入丙酸前体(苹果酸和富马酸)对甲烷产生造成不确定的效果(Asanuma et al.，1999，Ungerfeld et al.，2007)，并且目前向瘤胃中引入还原性产乙酰作用的尝试由于与产甲烷作用相比对氢的较低亲和力而失败(Le Van et al.，1998)。
降低甲烷释放的其他选择描述于US 5,843,498，其涉及用于抑制瘤胃产甲烷作用和改善饲料效率的反刍动物饲料组合物，所述组合物包含作为有效组分的半胱氨酸和/或其盐。
少数研究组研究了硝酸盐作为甲烷降低饲料添加剂的潜力，而且添加硝酸盐看起来一致地降低产甲烷作用(Guo et al.，2009，Sar et al.，2005，Takahashi et al.，1998)。
引入硝酸盐(NO3)作为替代性氢降低剂(sink)以减少瘤胃中的产甲烷作用的可能性被极大忽略，这是由于始终发现硝酸盐在瘤胃中还原成氨期间所形成的作为中间产物的亚硝酸盐的毒性效果(Lewis，1951)。据报导反刍动物饲料中的高剂量硝酸盐导致高铁血红蛋白血症，从而降低血液将氧气运输至动物组织的能力。此外，已知瘤胃中的亚硝酸盐积累降低瘤胃中的微生物活性，这又降低动物的饲料摄入。
已经建议向高硝酸盐饲喂的反刍动物补充甲酸盐、乳酸盐或富马酸以缓解亚硝酸盐对发酵的抑制效果(Iwamoto，1999；Iwamoto，2001)。与单独的硝酸盐处理相比，同时给予硝酸盐和GOS或乳链菌肽还报导为降低瘤胃和血浆亚硝酸盐和高铁血红蛋白浓度的有效措施，同时将瘤胃产甲烷作用保持在低水平(Sar，2004)。
利用益生素加速亚硝酸盐还原已经得到广泛研究。美国专利第6,120,810号教导通过给予动物包含有效量的亚硝酸盐还原微生物产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidiproprionici)的组合物来减少反刍动物的硝酸盐中毒。欧洲专利申请第1 630 226号公开一种用于反刍动物的饲料组合物，其包含具有亚硝酸盐还原酶活性的微生物，所述微生物选自肠细菌、棒状杆菌、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、嗜甲基菌属(Methylophilus)的细菌、放线菌属(Actinomyces)的细菌、瘤胃细菌以及上述细菌的组合。还据报导(Sar，2005)大肠杆菌W3110可以用于减轻使用硝酸盐抑制反刍动物的产甲烷作用时的中毒。
已经研究了硫化合物、铜和钨对硝酸盐还原的抑制效果(Takahashi，1989)。其作者报道，在来自硝酸盐适应的阉羊(0.55g NaNO3/kg体重，每天两次)的瘤胃液中，亚硝酸盐形成不受用硫酸盐-S孵育，也不受用亚硫酸盐-S孵育的影响。在含S氨基酸中，据证实甲硫氨酸在抑制硝酸盐的微生物还原中是无效的，而半胱氨酸则显著地减少亚硝酸盐形成。这篇文章没有涉及或提出任何产甲烷作用降低效果。半胱氨酸在防止亚硝酸盐积累中的效率则在后续研究中得到证实(Takahashi，1991；Takahashi 1998)。
本发明的主要目的是提供用于降低反刍动物的产甲烷作用，同时避免或克服与亚硝酸盐积累有关的具体问题的处理方法及其中所用的组合物。
发明概述
在一方面，如下文的实验部分所详述，本发明在于发现，硝酸盐还原途径以及硫酸盐还原途径在反刍动物中胜过胃肠产甲烷作用，并且硝酸盐和硫酸盐单独使用时所获得的产甲烷作用降低效果是完全加成的。硝酸盐和硫酸盐的单独效果看起来是独立的。
同时，如下文的实验部分所详述，据发现，联合给予硝酸盐和硫酸盐完全有效地避免或缓解通常单独使用硝酸盐所遇到的亚硝酸盐中毒的潜在问题。
令人惊讶的是，尽管据发现给予硝酸盐降低肠甲烷微生物数目，但是给予硫酸盐或联合给予硝酸盐和硫酸盐却不这样。然而，联合给予硝酸盐和硫酸盐明显地降低总细菌中甲烷微生物的比例。
尽管本发明的范围不受任何此类潜在理论或假设的限制或缩减，但是认为通过硝酸盐降低产甲烷作用(方程式1)是由硝酸盐还原成氨中替代使用H2而导致的。据认为，瘤胃中硝酸盐还原采用方程式2所述的还原途径。这表明，8摩尔的H重定向至硝酸盐还原，由此理论上对于饲喂的每摩尔硝酸盐，减少1摩尔的甲烷产生。以这种方式，饲喂的每100g的NO3会减少25.8g的CH4。
CO2+4H2→CH4+2H2O(方程式1)
NO3 -+4H2+2H+→NH4 ++3H2O(方程式2)
硝酸盐还原成氨比CO2还原成CH4产生更多的能量，因此如果瘤胃中有足够的硝酸盐，则预期其可以是H2清除的主要途径。NO3完全还原成NH3消耗8个电子，因此每摩尔还原的硝酸盐降低1摩尔甲烷排放。反应的终产物氨可以视为对低蛋白饲料饲喂的反刍动物有价值的营养。
如上文所述，本发明人发现硫酸盐自身还是通过与硝酸盐还原无关的机制有效降低甲烷排放的强还原剂。硫酸盐还原成H2S(方程式3)也消耗8个电子，因此提供与每摩尔硝酸盐降低甲烷排放相同的潜力。
SO4 2-+4H2+2H+→H2S+4H2O(方程式3)
硫酸盐也有效地降低产甲烷作用这一发现可以由热力学角度的事实来解释，硫酸盐还原比产甲烷作用可能更容易发生。从化学计量比而言，100g硫酸盐完全还原成硫化氢会减少16.7g CH4产生。
硫化氢(H2S)看起来在NO2还原成NH4 +中充当电子供体，因此向饲料补充硫酸盐可以额外地缓解瘤胃中的亚硝酸盐积累。
而且还发现，通过额外给予有效量的亚硝酸盐还原益生微生物甚至可以进一步增强这种结果。如下文的实验部分所详述，在亚硝酸盐还原开始的时候观察到硫酸盐引起的初始延滞，这可以通过饲料摄入后立即可得的H2S的延滞来解释。这又导致饲料摄入的减少，因此本发明的另一目标是避免这种情况。如下文的实验部分所详述，本发明人发现这可以通过共给予某些亚硝酸盐还原益生微生物来实现。
附图说明
图1示出接受基础饲料或三种实验饲料之一的雄性Texel杂交羔羊中随24h(小时)时间段的甲烷产生(l/hr)，所述实验饲料补充了硝酸盐化合物、硫酸盐化合物或者硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合。
图2示出接受基础饲料或三种实验饲料之一的雄性Texel杂交羔羊中随24h时间段的氧气消耗(l/kg MW/hr)，所述实验饲料补充了硝酸盐化合物、硫酸盐化合物或者硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合。
图3示出接受4种实验饲料之一的奶牛(cow)血液中的高铁血红蛋白的浓度，所述实验饲料补充了硝酸盐或者硝酸盐和量渐增的硫酸盐的三种组合之一。
图4示出用各种测试产品模拟的瘤胃中的气体产生。图A-C示出所示时间点的累积气体产生。误差棒表示重复模拟容器之间的SE，星号表示包含Ca(NO3)2+MgSO4的对照(表示为“无”)与t检验的统计学差异。
图5表示用各种测试产品模拟的瘤胃中的甲烷产生。图A表示12小时模拟后的累积甲烷产生，图B表示所有产生的气体中的甲烷比例。误差棒表示重复模拟容器之间的SE，星号表示包含Ca(NO3)2+MgSO4的对照(表示为“无”)与t检验的统计学差异。
图6表示用各种测试产品模拟的瘤胃中硝酸盐的残留浓度。图A-C分别表示2、4和12小时发酵后的硝酸盐的残留浓度。误差棒表示重复模拟容器之间的SE，星号表示包含Ca(NO3)2+MgSO4的对照(表示为“无”)与t检验的统计学差异。
图7表示用各种测试产品模拟的瘤胃中亚硝酸盐的残留浓度。图A-C分别表示2、4和12小时发酵后的亚硝酸盐的残留浓度。误差棒表示重复模拟容器之间的SE，星号表示包含Ca(NO3)2+MgSO4的对照(表示为“无”)与t检验的统计学差异。
图8表示用各种测试产品模拟的瘤胃中铵的残留浓度。图A-C分别表示2、4和12小时发酵后的铵的残留浓度。误差棒表示重复模拟容器之间的SE，星号表示包含Ca(NO3)2+MgSO4的对照(表示为“无”)与t检验的统计学差异。
发明详述
本发明的第一方面涉及一种动物饲料补充剂，其包含10-100％的硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合。
在本文及其权利要求书中，动词“包含”及其变形以非限制性的含义使用，表示包括该词语之后的物品，但是不排除未特别指出的物品。此外，不定冠词“一个(a)”或“一个(an)”所指的元素不排除存在多于一个所述元素的可能性，除非上下文明确要求有且仅有一个所述元素。不定冠词“一个(a)”或“一个(an)”因此通常表示“至少一个”。
本文所用的术语“动物饲料补充剂”表示包含活性成分的浓缩的添加剂预混合物(premix)，所述预混合物或补充剂可以加入动物饲料或口粮中以形成本发明的补充饲料。术语“动物饲料预混合物”、“动物饲料补充剂”和“动物饲料添加剂”通常视为具有类似或相同的含义，并且通常视为可以互换。通常，本发明的动物饲料补充剂为粉末或者压缩或颗粒固体的形式。实际上，家畜通常可以通过将动物饲料补充剂直接加入口粮来进行饲养，如所谓的施肥(top-dress)；或者所述动物饲料补充剂可以用于制备或制造诸如复合动物饲料或舔块(lick block)的产品，这在下文会有更详细的描述。本发明并不特别地局限于此。本发明的补充剂通常以16-2500g/动物/天的量饲喂动物。
本发明的动物饲料补充剂包含硝酸盐化合物，通常是生理可接受或耐受的硝酸盐化合物。根据本发明，硝酸盐-N需要对于通过瘤胃或肠微生物还原是容易可得的，并且所述硝酸盐化合物在水中应当具有足够的溶解度。因此，根据本发明，所述硝酸盐化合物优选为离子硝酸盐化合物，最优选无机硝酸盐，例如硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、硝酸铵，这些盐在标准温度和压力下全部都易溶于水。此外，从健康和安全的角度出发，通常优选使用复合无机硝酸盐，例如式5.Ca(NO3)2·NH4NO3·10H2O所表示的化合物，其可商购自Yara，商品名为“Calcinit”。
本发明的动物饲料补充剂还包含硫酸盐化合物，通常是生理可接受或耐受的硫酸盐化合物。根据本发明，所述硫酸盐化合物优选为离子硫酸盐化合物，最优选选自无机硫酸盐，其中除了硫酸钙以外，许多是高度溶于水的。特别优选地，本发明的硫酸盐化合物选自可溶性无机硫酸盐，包括硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫酸锌、硫酸锰、硫酸铜和硫酸亚铁。
在本发明的优选实施方案中，所述补充剂包含硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合，其基于干重的量为10-100wt％，优选地，所述量大于10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、97或99wt％。
由于本发明部分地基于这样的发现，对于降低反刍动物中的胃肠产甲烷作用的目的，硝酸盐和硫酸盐是部分地可交换的，所述补充剂中硝酸盐和硫酸盐的摩尔比通常为100∶1-1∶50，更优选50∶1-1∶10、25∶1-1∶5或10∶1-1∶2.5，最优选5∶1-1∶1。
本发明的硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合通常提供的硝酸盐和硫酸盐的总量基于干重大于50g/kg。在优选的实施方案中，所述硝酸盐和硫酸盐的总量大于75g/kg，更优选大于90g/kg，最优选大于100g/kg。实际上，所述量通常小于750g/kg。在另一优选实施方案中，所述饲料补充剂中硫酸盐的量基于干重大于25g/kg，更优选大于40g/kg，最优选大于50g/kg。通常，所述量不大于250g/kg，优选不大于200g/kg，最优选不大于165g/kg。在另一优选实施方案中，所述饲料补充剂中的硝酸盐的量基于干重大于20g/kg，更优选大于30g/kg，最优选大于40g/kg。通常，所述量基于干重小于600g/kg，更优选小于550g/kg。
本领域技术人员应当理解，除非另外指明，本文所用的“硝酸盐”和/或“硫酸盐”的所有量和/或剂量指硝酸盐和/或硫酸盐化合物所包含或提供的相对于组合物总干重的硝酸盐和/或硫酸盐的重量。确定所述补充剂所包含的组分的确切的理想量以及用于制备口粮或复合动物饲料等的补充剂的量，属于训练的专业人员的技能，例如考虑动物的具体类型及其所保持的环境。每种组分的优选剂量如下文所示。
本发明的动物饲料补充剂可以包含任何其他成分而不偏离本发明的范围。其通常可以包含制备期望的产品形式所需的已知赋形剂，并且其可以包含旨在改善饲料的质量和/或改善消耗补充剂的动物的性能的其他添加剂。这样的赋形剂的合适实例包括载体或填充剂，例如乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、碳酸氢钠、氯化钠等；以及粘合剂，例如阿拉伯树胶、黄蓍胶、藻酸钠、淀粉、PVP和纤维素衍生物等。本领域技术人员已知的饲料添加剂的实例包括维生素、氨基酸和微量元素、消化增强剂以及肠道菌群稳定剂等。
在一优选实施方案中，所述动物饲料补充剂还包含亚硝酸盐还原益生微生物。如上文所解释的，本文所用的术语“亚硝酸盐还原益生微生物”指这样的活微生物，当以合适的量给予时其通过将在瘤胃和/或肠中积累的亚硝酸盐还原成铵来赋予宿主健康益处。这样的亚硝酸盐还原微生物的许多实例为本领域技术人员已知。亚硝酸盐还原益生微生物的优选实例包括具有亚硝酸盐还原酶活性的瘤胃细菌和肠细菌、产丙酸丙酸杆菌、棒状杆菌、枯草芽胞杆菌、嗜甲基菌属的细菌、放线菌属的细菌和大肠杆菌(Escherichia coli)W3110。根据本发明，最优选地，亚硝酸盐还原益生微生物选自埃氏巨球形菌(Megasphaeraelsdenii)，特别是其瘤胃菌株；以及产丙酸丙酸杆菌(Propionibacteriumacidipropionici)，特别是产丙酸丙酸杆菌菌株P5，其在美国典型培养物保藏中心(ATCC)的微生物保藏登录号为55467，并且可以以
Figure BPA00001519801400081
concentrate”商购自Agtech Products Inc。
在一优选实施方案中，本发明提供了上文所定义的动物饲料补充剂，其还包含所述亚硝酸盐还原益生微生物，其量基于干重为1.0*108-1.0*1014cfu/kg，更优选1.0*109-1.0*1013cfu/kg，最优选1.0*1010-1.0*1012cfu/kg，例如1.0*1011cfu/kg。本领域技术人员已知，集落形成单位(CFU)是活细菌或真菌数的量度。与计数所有死和活细胞的直接显微镜计数不同，CFU测量活细胞，并且例如通过将(稀释的)样品在琼脂或胰胨豆胨琼脂平板在扩充并计数由此获得的菌落而测定。
而且，本发明人发现当给予乳酸或乳酸盐化合物时获得良好的结果。在不期望被任何具体理论束缚的情况下，认为补充乳酸或乳酸盐可以增强益生微生物的效率。因此，在一优选实施方案中，本发明提供上文所定义的复合动物饲料，其还包含有效量的乳酸盐或乳酸，优选地，所述复合动物饲料所包含的乳酸或乳酸盐的量基于干重大于20g/kg，更优选大于30g/kg，最优选大于40g/kg。
本发明的另一方面涉及诸如复合动物饲料和舔块的产品，其包含上文所定义的补充剂。
因此，在一方面，本发明提供了一种复合动物饲料组合物，其包含硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合，所述组合提供的硝酸盐和硫酸盐的总量基于干重大于10g/kg。
本文所用的术语“复合动物饲料组合物”表示这样的组合物，其适合用作动物饲料，并且从各种天然或非天然基质或原料和/或添加剂混合而成。因此，特别地，本文使用术语“复合”来区分本发明的动物饲料与任何天然存在的原料。这些混合物或复合饲料根据靶动物的具体需求而进行配制。商业制备的复合饲料所用的主要成分通常包括小麦麸；稻麸；玉米粉；谷粒，如大麦、小麦、黑麦和燕麦；大豆粉；苜蓿粉；小麦粉等。商业复合饲料通常包含不低于15％的粗蛋白和不低于70％的可消化的总营养，尽管本发明并不特别地局限于此。液体、固体以及半固体复合动物饲料组合包括于本发明的范围内，固体和半固体形式是特别优选的。这些组合物通常制备为粉末形式、颗粒或碎屑。实际上，通常饲喂家畜复合饲料的组合例如本发明的复合饲料和青贮饲料或干草等的组合。通常，复合动物饲料以0.3-10kg/动物/天的量进行饲喂。确定所述复合动物饲料所包含的这些组分合适量属于训练的专业人员的技能，例如考虑动物的类型及其所保持的环境。
本发明的复合动物饲料中硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合通常提供的硝酸盐和硫酸盐的总量基于干重大于10g/kg。在一优选实施方案中，所述硝酸盐和硫酸盐的总量大于15g/kg，更优选大于17.5g/kg，最优选大于20g/kg。实际上，所述量通常小于750g/kg，优选小于500g/kg，更优选小于250g/kg。在另一优选实施方案中，所述复合动物饲料中硫酸盐的量基于干重大于5g/kg，更优选大于7.5g/kg、10g/kg或12g/kg。通常，所述量不大于200g/kg，优选不大于175g/kg，最优选不大于150g/kg。在另一优选实施方案中，所述复合动物饲料中硝酸盐的量基于干重大于5g/kg，更优选大于7.5g/kg，最优选大于10g/kg。通常，所述量基于干重小于600g/kg，更优选小于500g/kg，最优选小于250g/kg。而且，在一优选实施方案中，本发明提供了上文所定义的复合动物饲料，其还包含亚硝酸盐还原益生微生物，其量为1.0*108-1.0*1014cfu/kg，更优选1.0*109-1.0*1013cfu/kg，最优选1.0*1010-1.0*1012cfu/kg。而且，在一优选实施方案中，本发明提供了上文所定义的复合动物饲料，其还包含有效量的乳酸盐或乳酸，其量优选大于5g/kg，更优选大于7.5g/kg，最优选大于10g/kg。
本发明的复合动物饲料组合物可以包含本领域常用的任何其他饲料添加剂。本领域技术人员已知，该语境中的术语“饲料添加剂”指动物营养中所用的产品，其用于改善饲料的质量和动物来源的食物的质量，或者改善动物的性能，例如提供饲料材料增强的可消化性。非限制性实例包括工艺添加剂，如防腐剂、抗氧化剂、乳化剂、稳定剂、酸性调节剂和青贮饲料添加剂；感官添加剂，特别是调味剂和着色剂；(其他)营养添加剂，如维生素、氨基酸和微量元素；以及(其他)畜牧学添加剂，如消化增强剂和肠道菌群稳定剂
本领域技术人员应当清楚，本发明的复合动物饲料组合物可以包含任何其他成分或添加剂，而不偏离本发明的范围。
在另一方面，本发明提供了包含本发明的补充剂的舔石(lick stone)或舔块。本领域技术人员已知，这样的舔石或舔块特别方便用于向在天然或耕作牧场或者天然和耕作牧场放牧的反刍动物饲喂无机补充剂(以及蛋白质和碳水化合物)。除了本发明的硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合和任选的亚硝酸盐还原益生微生物以外，本发明的这样的舔石或舔块通常包含各种类型的粘合剂，例如水泥、石膏、石灰、磷酸钙、碳酸盐和/或明胶；以及任选地包含其他添加剂，例如维生素、微量元素、无机盐、感官添加剂等。
本发明的舔块中的硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合通常提供的硝酸盐和硫酸盐的总量基于干重大于15g/kg。在一优选实施方案中，所述硝酸盐和硫酸盐的总量大于25g/kg，更优选大于30g/kg。实际上，所述量通常小于450g/kg，优选小于400g/kg。在另一优选实施方案中，所述舔块中硫酸盐的量基于干重大于3g/kg，更优选大于5g/kg，最优选大于6g/kg。通常，所述量不大于150g/kg，优选不大于100g/kg，最优选不大于75g/kg。在另一优选实施方案中，所述舔块中硝酸盐的量基于干重大于10g/kg，更优选大于20g/kg，最优选大于25g/kg。通常，所述量基于干重小于400g/kg，更优选小于300g/kg。在一优选实施方案中，本发明提供了上文所定义的舔块，其还包含亚硝酸盐还原益生微生物，其量为1.0*108-1.0*1014cfu/kg，更优选1.0*109-1.0*1013cfu/kg，最优选1.0*1010-1.0*1012cfu/kg
本发明的另一方面涉及一种降低反刍动物的胃肠甲烷产生的方法，所述方法包括向所述反刍动物给予有效量的硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合，其中所述方法是非治疗性的。
本文所用的术语“降低胃肠产甲烷作用”指降低胃肠道中的甲烷气体产生。如上文所解释的，反刍动物的瘤胃和肠中的发酵通过所谓的甲烷微生物产生甲烷气体。本发明意图降低这一过程，从而降低胃肠道的直接甲烷排放。评价动物的甲烷排放在本领域技术人员的知识和技术范围内。如上文所解释的，瘤胃和肠中的甲烷产生是通常发生在健康动物中的过程，并且降低产甲烷作用并不增强或削弱反刍动物的整体健康状态或生活质量(well-being)。然而，利用硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合降低甲烷形成可以增加动物营养利用的效率，从而本发明的方法可以增强动物生长和/或产率。
本领域技术人员应当容易地理解，本发明的处理方法在治疗称为“膨胀病”的疾病状况中是无效的。膨胀病是通常描述为由于瘤胃中的气体积累而产生的瘤胃异常膨胀。气体(二氧化碳、甲烷和其他气体)通常在瘤胃发酵过程中产生，并且通常通过食道排出，从而防止气体积累。在膨胀病发病期间，食道被一层泡沫堵塞。如果感觉到液体(或泡沫)，则食道的开口包含阻塞食道的受体。膨胀病期间形成的泡沫源自小饲料颗粒的快速发酵。膨胀病的原因是泡沫的形成，并非是瘤胃气体的产生，瘤胃气体的产生是反刍动物中天然存在的过程。因此，甲烷产生不能视为膨胀病的原因，并且降低甲烷不能视为治疗膨胀病。针对膨胀病的治疗性处理旨在防止瘤胃中泡沫层的形成或除去泡沫层，而不是防止瘤胃气体的产生。而且，二氧化碳是瘤胃发酵期间产生的主要气体。因此，本发明的方法既不意图也不适合于治疗膨胀病或缓解其症状。
因此，本发明的处理方法是处理的非治疗性方法，即所述方法不改善患有特定疾病状况的动物的健康，即与不接受本发明的处理方法的反刍动物相比，其不预防特定的疾病或疾病状况，也不在任何程度上影响反刍动物的健康情况。如上文所述，本发明的方法的优势限于环境和/或经济方面。
从分类学上而言，反刍动物是偶蹄目的哺乳动物，其通过以下过程消化基于植物的食物：首先将其在动物称为瘤胃的第一胃中软化，然后将现在称为食团的半消化的食物回流并再次咀嚼。再咀嚼食团以进一步破碎植物物质并刺激消化的过程称为“反刍”。反刍哺乳动物包括牛(cattle)、山羊、绵羊、长颈鹿、野牛、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、角马、羚羊、叉角羚和蓝牛羚。本发明主要涉及处理驯养的反刍动物的方法，特别是用于商业家畜饲养的反刍动物。因此，在本发明的一优选实施方案中，所述反刍动物选自牛、山羊、绵羊和水牛。
本发明的一优选实施方案提供了上文所定义的方法，其中向反刍动物给予硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合，其量提供大于每天0.05g/kg体重的硝酸盐和硫酸盐的总剂量。在一优选实施方案中，本发明方法的所述硝酸盐和硫酸盐的总剂量为每天0.05-10g/kg体重，更优选每天0.1-5g/kg体重，最优选每天0.2-2.5g/kg体重。
在另一优选实施方案中，本发明提供了上文所定义的方法，其中硫酸盐的剂量为每天0.025-1.8g/kg体重，更优选每天0.05-0.9g/kg体重，最优选每天0.1-0.45g/kg体重。
在另一优选实施方案中，本发明提供了上文所定义的方法，其中硝酸盐的剂量为每天0.025-8g/kg体重，更优选0.05-4g/kg体重，最优选每天0.1-2g/kg体重。
本文所定义的每天每kg体重的量，指给定处理时间段期间各种化合物的平均量，例如在一周或一个月的处理期间。因此，可以每天、每隔一天、每隔两天等给予所述化合物，而不偏离本发明的范围。尽管优选地，所述方法包括每天给予指定剂量的硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合。甚至更优选地，在每次饲喂动物的饲喂期间给予所述组合物，以获得上述每日剂量的量进行给予。
如上文所解释的，瘤胃微生物菌落将之前未适应它们饲料中的硝酸盐的动物的硝酸盐还原成亚硝酸盐的能力，超过它们将亚硝酸盐还原成氨的能力。这可能导致瘤胃中亚硝酸盐的净积累，其容易通过瘤胃壁吸收并将血液血红蛋白从亚铁形式转化为三价铁形式即高铁血红蛋白，使得血红蛋白分子不能将氧气运送至组织。所导致的疾病状况即高铁血红蛋白血症是一般缺氧的状态，在轻度情况下，可以抑制动物的性能，但是在严重情况下，可能导致动物死亡。本发明人确立，在本发明的方法中，在绵羊饲料中小心、逐步地引入硝酸盐允许瘤胃微生物菌落适应并提高它们还原硝酸盐和亚硝酸盐的能力。据证实，缓慢适应高硝酸盐饲料的绵羊不经历高铁血红蛋白血症的临床指征。因此，在本发明的一优选实施方案中，所述方法包括硝酸盐适应的第一阶段和继续处理的第二阶段：所述第一阶段包括至少3天、优选至少4天、最优选至少5天的两个或更多个、优选三个或更多个连续时间段，其中每个时间段内的硝酸盐的平均每日剂量小于100％的在所述第二阶段给予的平均每日剂量，并且其中每个时间段内的平均每日剂量高于该时间段之前的时间段内的平均每日剂量。在一优选实施方案中，一个时间段至下一个时间段的硝酸盐评价每日剂量的增加小于每天1g/kg体重，优选小于每天0.5g/kg体重，更优选小于每天0.25g/kg体重，最优选小于每天0.1g/kg体重。优选地，所述第二阶段包括大于5、10、25、50、100、250或350天的给予硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合的时间段，其平均每日剂量为0.15-3g/kg体重。
在一优选实施方案中，具有或不具有初始适应阶段的上述方法还包括向反刍动物给予上文所定义的亚硝酸盐还原益生微生物。特别优选的是，给予的所述益生微生物的量为每天1.0*105-1.0*1014cfu/kg体重，更优选每天1.0*107-1.0*1013cfu/kg体重，最优选每天1.0*109-1.0*1012cfu/kg体重。在一优选实施方案中，所述方法包括给予益生微生物和给予乳酸或乳酸盐。特别优选的是，给予的乳酸或乳酸盐的量为每天至少0.025g/kg体重，更优选每天0.05-5g/kg体重，最优选每天0.1-2.5g/kg体重。
本发明的方法可以包括根据上文所述的剂量方案给予硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合，以及任选地给予亚硝酸盐还原益生微生物，达至少5、10、25、50、100、250或350天。如上文所述，本发明令人感兴趣的方面在于这样的事实，即本发明的方法提供了非常持续的降低肠产甲烷作用的效率，即该效果不随处理的延长时间段而降低，如由于瘤胃或肠微生物渐增的抗性，由此使得反刍动物的长期处理特别可行。
从上文明显可知，本发明的方法包括口服给予硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合，以及任选地给予亚硝酸盐还原益生微生物。优选地，所述处理包括口服给予上文所定义的复合动物饲料组合物和/或动物饲料补充剂产品，本领域技术人员应当理解，即使可以使用其他液体、固体或半固体口服可吸收的组合物也不偏离本发明的范围。
根据上文，本发明的又一方面涉及包含硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合的组合物在非治疗性降低反刍动物的胃肠甲烷产生中的用途。优选地，所述用途包括向所述反刍动物给予硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合，其量提供的硝酸盐和硫酸盐的总剂量大于每天0.05g/kg体重。优选地，硝酸盐化合物和硫酸盐化合物所用的剂量如上文所述。在另一优选实施方案中，所述用途还包括向所述反刍动物给予亚硝酸盐还原益生微生物，其剂量如上文所述。仍然更优选地，本发明提供了上文所定义的组合物中的任一种在非治疗性降低反刍动物的胃肠甲烷产生中的用途。
本发明的另一方面涉及补充硝酸盐的反刍动物的治疗性处理。如上文所解释的，已知反刍动物的补充硝酸盐有助于降低胃肠产甲烷作用，但是也增加亚硝酸盐积累即所谓的“硝酸盐毒性综合征”和/或高铁血红蛋白血症的风险或发作，从而降低血液将氧气运送至动物组织的能力。此外，瘤胃中亚硝酸盐积累已知降低瘤胃中的微生物活性，这又可能降低动物的食物吸收。如上文所解释的，本发明人确立，向这样的补充硝酸盐的反刍动物给予硫酸盐化合物，优选地与亚硝酸盐还原益生微生物组合，大大降低或者甚至防止这些副作用。
因此，本发明的一方面涉及治疗或预防补充硝酸盐的反刍动物的亚硝酸盐积累、“硝酸盐毒性综合征”和/或高铁血红蛋白血症的方法，所述方法包括向所述反刍动物给予有效量的硫酸盐化合物，任选地与有效量的亚硝酸盐还原益生微生物组合。
本发明的另一方面涉及包含硫酸盐化合物，任选地与亚硝酸盐还原益生微生物组合的制剂，其用于治疗或预防补充硝酸盐的反刍动物的亚硝酸盐积累、“硝酸盐毒性综合征”和/或高铁血红蛋白血症的方法。
本发明的又一方面涉及硫酸盐化合物，任选地与亚硝酸盐还原益生微生物组合，在制备用于治疗或预防补充硝酸盐的反刍动物的亚硝酸盐积累、“硝酸盐毒性综合征”和/或高铁血红蛋白血症的方法的制剂中的用途。
根据上文的描述，治疗和/或预防亚硝酸盐积累、“硝酸盐毒性综合征”和/或高铁血红蛋白血症的方法通常包括给予所述组合物，其量足以提供的硫酸盐的总剂量为每天0.025-1.8g/kg体重，更优选每天0.05-0.9g/kg体重，最优选每天0.1-0.45g/kg体重；以及任选的所述益生微生物，其总剂量为每天1.0*105-1.0*1014cfu/kg体重，更优选每天1.0*107-1.0*1013cfu/kg体重；最优选每天1.0*109-1.0*1012cfu/kg体重。在一优选实施方案中，所述方法包括给予益生微生物和给予乳酸或乳酸盐。特别优选的是，给予乳酸或乳酸盐的量为每天至少0.025g/kg体重，更优选每天0.05-5g/kg体重，最优选每天0.1-2.5g/kg体重。
本文所用的术语“补充硝酸盐的反刍动物”指通常通过饲喂接受大量硝酸盐的反刍动物。优选地，所述反刍动物补充的硝酸盐的量足以降低胃肠产甲烷作用，更优选的量大于每天0.025g/kg体重，最优选为每天0.05-8g/kg体重。本领域技术人员应当理解，所述方法可以等同地适合于治疗或预防反刍动物的亚硝酸盐积累、“硝酸盐毒性综合征”和/或高铁血红蛋白血症，所述反刍动物接受大量的硝酸盐用于其他目的或者甚至无意地接受，例如由于环境条件。
上文所限定的发明在下文的实验部分会更详细地示例和解释，这并非意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例1甲烷减少中的硝酸盐和硫酸盐
材料与方法
动物和豢养(housing)
在本实验中，评价了饲料硝酸盐和硫酸盐的甲烷降低性质。在4周的适应时间段内，向饲料缓慢引入硝酸盐和硫酸盐。在实验期间监测饲料摄入和生长。假设饲料硝酸盐和硫酸盐会降低肠发酵的甲烷排放。
Animal Care and Use Committee of the Animal Sciences Group，WUR，Lelystad批准本实验的实验方案。实验用20头雄性Texel杂交羔羊进行，其重量在实验开始时为42.9±4.3kg(平均值±标准偏差)。在对饲料添加剂的4周适应阶段中，将动物豢养于单独的牛棚中以允许单独饲喂。每周将绵羊称重以在整个实验期间监测生长。
适应时间段后，将4只动物(一组)豢养于间接呼吸量热室中一周来测定气体交换。在接下来的周中，每周将新的一组绵羊引入该室中。每个呼吸室容纳一只绵羊。所用的呼吸量热室详细描述于Verstegen etal.(1987)。将温度保持于15℃，相对湿度设定为70％。一种类型的室的通气速率为70l/min，其他类型的为90l/min。
以9-min的间隔分析进出室的空气的CO2、O2和CH4。通过进出空气之间的浓度差乘以气流来计算这些气体的净产生和消耗，随后再计算为标准环境(0℃，101kPa，无水蒸气)。
实验设计
实验设计为2x2阶乘设计，以硝酸盐和硫酸盐为因数。动物通过重量分组，随后在组内随机分配为四种饲料处理之一：CON、NO3、SO4或NO3+SO4。
饲喂
基础饲料由基于DM的74％玉米青贮饲料、16％铡碎的大麦秸秆、9％甲醛处理的大豆粉以及1％矿物预混合物组成。饲料添加剂包含于混合物中(表1)，其以10％的饲料DM加入基础饲料。在饲喂时，将预混合物手工混合成饲料。在实验期间自由取水。从可商购的来源(Calcinit，Yara)补充硝酸盐，并且以无水MgSO4的形式向饲料中加入补充的SO4。
在适应阶段内，以每周25％的步骤将绵羊引入实验预混合物。每天8:30饲喂羔羊。早晨饲喂之前，从饲料筐除去残屑，并称重以确定主动饲料摄入。在呼吸室的一周内，将饲料有效性限制为在豢养于呼吸室之前的一周中在组内消耗最少饲料的动物所消耗的饲料的95％。进行饲料限制以避免添加剂对DMI的效果与对甲烷产生的效果之间的相互作用。
将实验饲料中的硝酸盐换为对照饲料的尿素以保持等氮(isonitrogenous)饲料。向对照饲料中加入石灰石以保证处理之间相等的Ca摄入。向饲料中加入MgO以获得饲料之间相似的Mg水平。对于每个处理而言，向饲料的不同添加体积不同，并用木纤维素进行平衡。
表1：包含实验添加剂的混合物的组成(DM的％)
Figure BPA00001519801400171
2化学式5Ca(NO3)2·NH4NO3·10H2O
血液、瘤胃和肝取样
在饲喂后1、3和5h在d2(第2天)、d8(第8天)、d15(第15天)、d22(第22天)和d28(第28天)对血液取样。第2、8、15和22天均为饲料中实验预混合物的25％渐增步骤后的1天。在第28天，羔羊已经进行100％饲料处理达一周。在包含肝素的收集管(Vacutainer)中取血样，并在取样后直接保存于冰箱中。在取样天结束时，分配样品用于分析，并在第二天进行分析。通过Evelyn and Malloy(1938)所述的方法测定血液的高铁血红蛋白含量。
完成呼吸室中的时间段后，将绵羊处死，并在处死后尽快从瘤胃取瘤胃流体样品(200ml)。将样品在取样后直接浸入冰水以停止微生物发酵，并且在取得所有样品后冷冻。在处死时，取肝的重复样品，冷藏并冷冻以用于随后的维生素A状态评价。
结果和讨论
适应时间段血液的高铁血红蛋白含量
在饲料补充25％或50％的最终预混合物包含率期间，绵羊均不具有阳性血液MetHb-含量(＜2％的Hb)。当饲料中包含75％的包含率时，一只绵羊在饲喂3h后表现出测试的NO3-饲料阳性，但是值仅为3％的Hb。当绵羊在100％包含率达1周时(d28)，两只绵羊在饲喂后3h测试的NO3-处理为阳性，并且MetHb-值分别为7％的Hb和3％的Hb。对照饲料和两种含硫酸盐的饲料的绵羊未具有高于2％的Hb的MetHb水平(检测限制)，这可能表明S在降低瘤胃中的亚硝酸盐中发挥作用。
4wk(周)的适应时间段足以防止与亚硝酸盐毒性和高铁血红蛋白血症有关的任何显著问题。Alaboudi and Jones(1985)报道了类似的发现。DM为2.9％的硝酸盐水平视为对未适应的反刍动物是致死的，但是适应显然使得瘤胃细菌能增加它们的亚硝酸盐还原能力。
适应饲料硝酸盐和硫酸盐期间的饲料摄入和生长
加入NO3或SO4所导致的饲料摄入并没有不同(表2)，但是趋向于比提供全剂量硝酸盐时更低。然而，当包括大于25％的最终包含率时，饲料摄入由于包含NO3而一致地降低(在超过第1周的时间段中约9％)。本研究中所用的较少数目的动物妨碍作出对饲料摄入的效果的结论，但是不应当忽视一致的较低饲料摄入。Bruning-Fann and Kaneene(1993)报导，当饲料硝酸盐水平大于3％的饲料DM时，在绵羊中观察到对饲料摄入的不利效果。如通过Marais et al.(1988)体外证实的，饲料摄入的这种减少可能与亚硝酸盐诱导的细胞壁消化的抑制有关。
饲喂NO3或SO4不影响体重增加(表3)。
表2：在对饲料添加剂的4周适应阶段内的饲料摄入(g/羔羊/天)
Figure BPA00001519801400181
Figure BPA00001519801400191
表3：在适应饲料添加剂的阶段内的体重(BW；kg/羔羊)和体重增加(BWG；kg/羔羊/周)
表4：在呼吸室中的测量周内的饲料摄入、气体交换和热产生
Figure BPA00001519801400193
Figure BPA00001519801400201
NO3和SO4对气体交换的效果
呼吸室中测定的气体流动如表4所示。
在本部分实验期间所应用的饲喂限制在处理之间导致非常类似的饲料摄入。由于向饲料加入硝酸盐来源而使得甲烷产生降低34％。
我们的实验中NO3处理的绵羊每天消耗平均24.9g NO3，这理论上降低甲烷产生6.4g。NO3处理的甲烷产生的实际减少为8.1l，这对应于5.8g CH4(CH4＝0.714g/l)。因此，甲烷产生的减少实际上有些低于化学计量所解释的，这可以通过硝酸盐不完全还原成氨或者在异化硝酸盐还原以外的其他过程中使用硝酸盐来解释。本研究中所用的硝酸盐来源是高度可溶的，因此很可能大部分硝酸盐可用于瘤胃中的还原。然而，大部分溶解的硝酸盐已经处于瘤胃的液相中，并且在被还原之前可能已经通过瘤胃。
加入硫酸盐导致每天的甲烷产生降低19％。
在我们的研究中，SO4处理的绵羊平均消耗27.0g SO4/天，这对应于甲烷降低4.5g。实际观察到的甲烷降低为4l或2.9g。SO4作为氢降低的理论能力与其所观察到的降低甲烷排放的能力的差异可以是瘤胃中MgSO4的溶解性。
在饲料中，向SO4处理的绵羊饲喂了相当量的S(加入7.4g S/kgDM)。这一水平大大高于NRC所推荐的最大值(4g/kg DM)。高于这一上限的饲喂增加脑脊髓灰质软化的风险，这是由于瘤胃顶部空间中存在的高水平H2S以及随后H2S的吸入所致。然而，这一实验的结果确实表明SO4有效地降低甲烷产生。当以推荐水平(2-4g S/kg DM)进行饲喂时，预期SO4仍然有降低甲烷产生的效果。
氧气消耗和CO2产生均由于硝酸盐处理而较低。据报导，反刍动物饲料中的高剂量硝酸盐导致高铁血红蛋白血症，从而降低血液将氧气运送到动物组织的能力。然而，在这一实验中，以规律的基础对血液取样，仅在两只绵羊中发现MetHb水平略微升高(最大水平为7％的Hb)，并且看起来不大可能解释较低的O2消耗。较低的O2消耗可能反映了饲喂硝酸盐时的不同代谢。Sar et al.(2004)在向绵羊瘤胃内剂量给药0.9g NO3/kg0.75的BW时也观察到较低的O2消耗和较低的CO2消耗。在本研究中，饲喂了相当多的硝酸盐(1.4g NO3/kg0.75的BW)，但是在我们的研究中MetHb水平明显较低(Sar et al.研究中Hb的18.4％)。这可能是由于Sar et al.(2004)的研究中缺乏适应时间段以及将硝酸盐作为溶液剂量给药至瘤胃的事实所致。在另一研究(Takahashi et al.，1998)中，将NaNO3以1.5g/kg BW0.75的速率剂量给药至绵羊的瘤胃，这非常类似于我们研究中的浓度。观察到高达30％的MetHb浓度，并且从该研究数据可以得出结论，即MetHb每增加10％，氧气消耗降低10.3％。在我们的研究中观察到氧气消耗降低6％。利用(Takahashi et al.，1998)的回归等式，这可能表示动物的MetHb水平为约5％。实际上，在两只动物中观察到类似的水平(Hb的3％和7％)。
对照处理的甲烷产生对于每天一次的极限饲喂的绵羊是典型的。在8AM饲喂动物，其后甲烷产生逐渐增加，饲喂后5-6h达到最大甲烷产生。由于动物进行极限饲喂，并且每天仅饲喂一次，所以甲烷产生在峰值之后连续降低。向口粮中加入硝酸盐引起明显不同的甲烷产生模式，饲喂之后甲烷产生率立即保持很低的水平，并且假设在该时间段内，氢被用于硝酸盐还原，由此限制产甲烷作用的H2有效性。饲喂后10小时，甲烷产生率不再与对照处理有何不同，这可能反映包含硝酸盐的饲料的缺乏，并返回作为H-降低的产甲烷作用。尽管甲烷产生在饲喂后由于饲喂的硝酸盐而明显较低，但是甲烷产生从未降至0，并且同时发生硝酸盐还原和产甲烷作用。甲烷产生的基础水平可以至少部分地通过后肠发酵的甲烷产生来解释。硝酸盐不大可能到达后肠而不被还原，因此硝酸盐饲喂可能不影响胃肠道这一部分中的甲烷产生。
SO4处理的甲烷产生率与对照处理没有任何不同，但是在整个24h时间段中明显低于对照处理。将SO4处理与NO3+SO4处理相比时观察到相同的情况。显然，NO3和SO4对甲烷产生的效果是不错的，并且SO4的效果看起来较不依赖于包含SO4的饲料的有效性。
实验的结果还示于图1中，其示出接受基础饲料或者三种实验饲料之一的组中在24h时间段中的甲烷产生(l/hr)。
24h时间段中的氧气消耗
就在8AM的饲喂后，NO3处理的氧气消耗低10-18％。处理之间氧气消耗的差异在16PM后消失。这种现象与NO3处理的饲喂后的时间段中明显降低的甲烷产生一致。假设在这个时间段中，明显的硝酸盐还原发生在瘤胃中，并且亚硝酸盐的产生是作为NO3处理的中间产物。这个时间段中亚硝酸盐的存在可能解释了NO3处理的较低的氧气消耗。尽管对于NO3处理从未观察到高于Hb的7％的MetHb水平，但是观察到氧气消耗明确的降低。样品的存储时间(取样后约24h分析样品)可能解释低于预期发现的MetHb水平。
对于NO3+SO4处理，氧气消耗仅在饲喂后立即降低(9AM)，并且在这个时间点后恢复到与对照处理相同的水平。加入SO4明显地缓解饲喂硝酸盐所引起的氧气消耗的抑制。可能如所认为的，SO4在饲喂后的时间段立即还原成H2S，并在亚硝酸盐的加速还原中发挥作用。较早前，当体外向瘤胃流体中加入硫化物时发现明显的剂量依赖性亚硝酸盐的加速还原(Takahashi et al.，1989)。当向介质中加入SO4时，亚硝酸盐的加速还原低得多，因此正是H2S在我们的实验中主动恢复氧气消耗看起来是可信的。
实验的结果还示于图2中，其示出接受基础饲料或者三种实验饲料之一的组中在24h时间段中的氧气消耗(1/kg MW/hr)。
实施例2：硫酸盐对补充硝酸盐的牛的高铁血红蛋白血症的效果
评价了饲料硫酸盐摄入对补充了硝酸盐的奶牛的血液中高铁血红蛋白浓度的效果。假定饲料硫酸盐会降低饲喂硝酸盐的奶牛的瘤胃中亚硝酸盐的积累，并因此防止血液中高铁血红蛋白的形成。
材料与方法
实验设计
实验为随机组设计，每组4只动物，并且用不同的硫酸盐剂量处理。动物通过乳产率分组，随后在组内随机分配为四种饲料处理之一：NO3、NO3+低SO4、NO3+中等SO4、NO3+高SO4。
饲喂
基础饲料由基于DM的45％玉米青贮饲料、7.5％干苜蓿、4.1％铡碎的大麦秸秆以及42％浓预混合物组成。饲料添加剂包含于混合物中(表5)。在饲喂时，将预混合物作为总混合口粮的一部分递送至奶牛。在实验期间自由取水。从可商购的来源(Calcinit，Yara AS，Norway)补充硝酸盐，并且以无水MgSO4的形式向饲料中加入补充的SO4。
表5：包含实验添加剂的混合物的组成(DM的％)
Figure BPA00001519801400231
Figure BPA00001519801400241
在适应阶段内，以每周25％的步骤向奶牛引入实验预混合物(表6)。
表6：适应阶段内实验浓缩物组合的组成
Figure BPA00001519801400242
血液取样
在整个实验期间，每周两次在饲喂后3h对血液取样以密切监测高铁血红蛋白的浓度。将血液收集入包含肝素的排空管，立即放入冰冷的水中，并存储于4℃冰箱中。在每个取样天结束时，将样品分配用于分析，并在第二天进行分析。通过Evelyn and Malloy(1938)的方法测定血液的高铁血红蛋白含量。在第37天，当硝酸盐以其最大包含率(基于DM的3％硝酸盐)饲喂时，更频繁地进行血液取样(-0.5h、饲喂后0.5h、1.5h、3h、5h和8h)以建立血浆中硝酸盐及其各种代谢物的动力学。
结果和讨论
适应时间段内的血液高铁血红蛋白含量
在饲料补充25％或50％的最终硝酸盐包含率内，没有奶牛具有可检测的血液高铁血红蛋白。当以75％的最终包含率将硝酸盐加入饲料中时，未补充硫酸盐的奶牛在饲喂后3h表现出升高的血液血红蛋白。相比之下，在饲料中给予硫酸盐的奶牛对高铁血红蛋白测试为阴性，而不管提供的S的量的如何。在100％的硝酸盐包含率时，所有的处理都表现出血液高铁血红蛋白升高，尽管与给予硝酸盐和硫酸盐的奶牛相比，对于单独给予硝酸盐的奶牛这种升高更明显。在补充硫酸盐的奶牛中，不可能区分硫酸盐剂量的效果(见表7)。结论是，硫酸盐能够抵消瘤胃中亚硝酸盐的积累，因而防止(中等硝酸盐添加)或降低(高硝酸盐添加)血液中高铁血红蛋白的形成。
表7：血液高铁血红蛋白(血红蛋白的％)
Figure BPA00001519801400251
不同上标的平均值为差异显著的(P＜0.1)
实验的结果还示于图3中，其示出接受4中实验饲料任一种的奶牛的血液中高铁血红蛋白的浓度。
实施例3：埃氏巨球形菌和反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)对瘤胃模型中的硝酸盐和亚硝酸盐还原率的效果
在本实验中，研究了体外瘤胃发酵系统中硝酸盐还原的动力学以及埃氏巨球形菌(M.elsdenii)和反刍月形单胞菌(S.ruminantium)对其的效果。
材料与方法
瘤胃模拟中所用的饲料为1克干物质，并且由草青贮饲料(0.5g干物质)和商业复合饲料(0.5g干物质)组成。处理如下表所示：
  处理   改变
  无改变
  57mg的Calcinit/40ml*)
  57mg的Calcinit+10μl埃氏巨球形菌/40ml*)
  57mg的Calcinit+100μl埃氏巨球形菌/40ml*)
  57mg的Calcinit+1000μl埃氏巨球形菌/40ml*)
  57mg的Calcinit+10μl埃氏巨球形菌+100mg乳酸钠/40ml*)
  57mg的Calcinit+100μl埃氏巨球形菌+100mg乳酸钠/40ml*)
  57mg的Calcinit+1000μl埃氏巨球形菌+100mg乳酸钠/40ml*)
  57mg的Calcinit+10μl埃氏巨球形菌+200mg乳酸钠/40ml*)
  57mg的Calcinit+100μl埃氏巨球形菌+200mg乳酸钠/40ml*)
  57mg的Calcinit+1000μl埃氏巨球形菌+200mg乳酸钠/40ml*)
  57mg的Calcinit+100mg乳酸钠/40ml*)
57mg的Calcinit+200mg乳酸钠/40ml*)
  57mg的Calcinit+10μl反刍月形单胞菌/40ml*)
  57mg的Calcinit+100μl反刍月形单胞菌/40ml*)
  57mg的Calcinit+1000μl反刍月形单胞菌/40ml*)
  57mg的Calcinit/40ml*)
  无改变
*)处理2-17包含7.52mg MgSO4/40ml。
所有处理一式四份进行，模拟容器的总数为72。
在血清瓶中对干饲料组分和Calcinit称重，将瓶用通过用于O2清除的热铜催化剂的CO2冲洗，并用厚丁基橡胶塞密封。在无氧气的CO2气流下，将36.5ml厌氧、还原、温度调整(+37℃)的缓冲溶液引入每个模拟容器。加入过夜生长的细菌培养物、MgSO4溶液、乳酸盐溶液以及使总液体体积等于1.5ml/容器的缓冲溶液。最后，在血清瓶中加入2ml新鲜、过滤的瘤胃流体，终体积为40ml。这种接种开始实际的瘤胃模拟。记录每个容器的接种时间，并在取样和停止发酵时考虑。
瘤胃发酵在37℃下继续12小时。在发酵期间，在模拟2、4、6、9和12小时后，测量气体产生以了解瘤胃微生物的总体代谢活性。
将在12小时内、在每一模拟容器中所产生的所有气体，从72个容器中的每一容器单独收集到排空的2升输液瓶中，所述输液瓶预引入了乙烷作为内标。分析这些样品的甲烷以观察处理对12小时中瘤胃细菌所产生的总甲烷的效果。利用火焰电离检测器以及纯甲烷和乙烷作为标准品，通过气相色谱来进行分析。
在4和12小时，分析所有模拟容器的挥发性脂肪酸(VFA)和乳酸(总称为SCFA)。利用填充柱，通过气相色谱分析酸的游离酸。SCFA定量为乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、2-甲基丁酸、戊酸、异戊酸和乳酸。
在0、2、4和12小时分析所有模拟容器的NO3和NO2。所述方法为分光光度法、基于用钒(III)还原硝酸盐，并且联合通过酸性Griess反应的检测。
在0、2、4和12小时分析所有模拟容器的NH4。所述方法为比色法，并基于酚-次氯酸盐反应。
对于所有测量参数，统计学分析由双尾t检验组成。所述检验针对具有Calcinit和MgSO4改变的处理(处理2和17)进行。选择t检验以使得单独的处理独立于同时测试的其他处理。结果标示于图中，其中0.01≤p-值＜0.05表示为：*；0.001≤p-值＜0.01表示为：**；0.0001≤p-值＜0.001表示为：***；以及p-值＜0.0001表示为：****。
结果
处理对总气体产生的效果
在该研究工作中，我们用5％瘤胃流体将所有容器接种，但是，另外，一些容器接受一定剂量的反刍月形单胞菌或埃氏巨球形菌。这些细菌是瘤胃中主要的乳酸盐利用者，而且认为它们具有还原硝酸盐和/或亚硝酸盐的能力。还联合乳酸测试了埃氏巨球形菌，基本原理是乳酸为所述细菌的底物，并且对其在瘤胃微环境的竞争力有积极效果。如图4所示，加入NO3和MgSO4导致气体产生的明显抑制。随时间推移这种效果更显著，在12h时间点时，测量到几乎抑制了25％的累积气体产生。
与硝酸盐富集的处理相比，反刍月形单胞菌接种物在开始的4小时内对气体产生有积极效果。这种效果在100和1000μl/40ml的剂量时在统计上是显著的。埃氏巨球形菌(M.esdenii)也刺激初始气体产生，但是仅在最高1000μl剂量下如此。提供乳酸时抑制气体产生，这可能是由于其对瘤胃微生物代谢的直接抑制效果。在较后的时间点未检测到反刍月形单胞菌的刺激效果。然而，最高剂量的埃氏巨球形菌继续增加累积气体产生，在较后的时间点相对积极效果甚至更显著。乳酸添加继续抑制气体产生，其剂量依赖于孵育的总持续时间。然而，联合乳酸盐，高剂量的埃氏巨球形菌使代谢抑制无效，而且实际上变为刺激气体产生。尽管埃氏巨球形菌以高剂量刺激总体气体产生，但其并未完全克服硝酸盐的不利效果。
处理对甲烷产生的效果
除了总气体产生以外，我们还定量了所产生的CH4。在这个发酵研究中，所产生的总气体的甲烷比例相对较低，明显低于10％(图5B)。甲烷产生的水平依赖于用作瘤胃流体供体的奶牛的饲料和生理状态。在这种情况下，动物为基于高能饲料的产奶奶牛。饲料中的硝酸盐基质绝对甲烷产生几乎80％(图5A)。
处理对硝酸盐还原的效果
除了标记为“无改变”的之外，向所有的刺激容器以产品“Calcinit”的形式加入固定量的硝酸盐(至终浓度为14mM硝酸盐)。在这个发酵研究中，没有硝酸盐的情况下，总共产生的甲烷为7-8ml，而提供硝酸盐时则降低至1.5ml。
从接种的2、4和12小时后，分析硝酸盐及其还原产物亚硝酸盐和铵的浓度。尽管在0小时提供14mM硝酸盐，在2小时于所有容器中的滤液中仅发现约10mM浓度的硝酸盐。而且，溶液中测量的硝酸盐与2小时后相同或略高。这表明硝酸盐被固体基质快速吸附或被微生物群吸收。这种分配平衡会保持至细菌消耗硝酸盐进入良好的速度时。在本研究中，最终取样表明4-12小时之间的硝酸盐水平的急剧下降(图6)。高剂量埃氏巨球形菌改变的效果表明，高剂量的这种细菌显著降低硝酸盐还原的速度。
2和4小时时间点的亚硝酸盐分析与硝酸盐数据一致。在2小时时，亚硝酸盐的浓度低于0.05mM，并且所有的处理表明硝酸盐的还原率不高(图7A)。在4小时时，亚硝酸盐水平开始升高，但仍然低于0.2mM。值得注意，尽管反刍月形单胞菌看起来剂量依赖性地增加亚硝酸盐，但是埃氏巨球形菌剂量依赖性地降低亚硝酸盐(图7B)。12小时后，埃氏巨球形菌的效果更明显，因为在不存在该细菌的情况下，亚硝酸盐的浓度升高至8mM，并且在添加该细菌的情况下，剂量依赖性地降低其浓度。对于纯埃氏巨球形菌改变，需要1000μl的剂量来完全除去亚硝酸盐。然而，当与乳酸盐组合时，100μl的剂量就将亚硝酸盐浓度降低至检测限制(图7C)。在12小时时，不再检测到反刍月形单胞菌的亚硝酸盐增加效果，这表明其在瘤胃模型的微环境中的代谢作用是可以忽略的。
铵是硝酸盐/亚硝酸盐的最终还原产物。然而，这并非期望在微生物系统中积累的产物，因为其是在优选的有机氮源不可得的情况下，容易被微生物同化的氮形式。铵的瞬时作用使得不可能进行精确的化学计量平衡计算。仍然明显的是，当向发酵系统中加入14mM硝酸盐时，12小时后的铵残留浓度从10mM升高至18mM。当还向发酵介质中加入埃氏巨球形菌时，取决于所提供的额外乳酸盐底物的剂量，铵的水平达到23-31mM(图8C)。这些数据无可置辩地表明，硝酸盐改变导致铵产生或积累的升高。所述数据还强烈揭示，埃氏巨球形菌进一步强化这种代谢过程。在100μl的埃氏巨球形菌剂量时，铵的残留浓度达到峰值，并且在1000μl的剂量时表现出明显的下降。
结论
本文提供的数据再次证实，饲料中的硝酸盐降低甲烷产生。其还表明，硝酸盐被还原成亚硝酸盐，并进一步还原成铵。这一过程看起来与甲烷产生直接相关，因为防止硝酸盐定量还原的条件也降低产甲烷作用抑制的程度。
埃氏巨球形菌改变不加速硝酸盐还原，而是实际上看起来抑制硝酸盐还原。相比之下，所述细菌剂量依赖性地降低亚硝酸盐的残留浓度，并且相伴地升高其还原产物铵的浓度。这些数据表明，这种菌株并不表达功能性硝酸盐还原酶，但是当一些其他细菌将硝酸盐催化还原成亚硝酸盐时，埃氏巨球形菌菌株就容易地将亚硝酸盐进一步还原成铵。这一特征使得埃氏巨球形菌成为亚硝酸盐中毒的理想预防剂，所述亚硝酸盐中毒源自通过硝酸盐还原细菌的亚硝酸盐的快速产生和积累。
根据我们以前的知识，埃氏巨球形菌并不是奶牛中主要的乳酸盐利用者。在饲喂高谷物饲料的肉牛中，埃氏巨球形菌的条件是有利的。原因在于，仅当瘤胃中的乳酸水平很高时，这种特殊的乳酸盐利用者是高度竞争性的。所述细菌的这一特征是我们还测试乳酸和埃氏巨球形菌-乳酸组合的原因。无论包含或不包含乳酸，埃氏巨球形菌对各种参数的效果方向相同，但是当提供乳酸时，效果更强。这表明乳酸盐改进了埃氏巨球形菌的竞争性。
为何高剂量的埃氏巨球形菌抑制硝酸盐还原？这在本文中仅可以进行推测，并且最终答案仅可以得自特别设计的研究。一种可能的解释是，埃氏巨球形菌与主要的硝酸盐还原细菌竞争一些重要的营养物或辅因子。由于埃氏巨球形菌的生长不依赖于亚硝酸盐还原，并且胜过硝酸盐还原者。另一种可能的解释是终产物抑制。高剂量的埃氏巨球形菌导致铵浓度升高，这可以充当硝酸盐还原的反馈抑制剂。
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Claims (12)

1.降低反刍动物的胃肠甲烷产生的非治疗性方法，所述方法包括向所述反刍动物给予有效量的硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合。
2.如权利要求1所述的降低反刍动物的胃肠甲烷产生的非治疗性方法，其中向所述反刍动物给予的所述硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合的量提供的硝酸盐和硫酸盐的总剂量大于每天0.05g/kg体重。
3.如权利要求2所述的降低反刍动物的胃肠甲烷产生的非治疗性方法，其中向所述反刍动物给予的所述硝酸盐化合物的量提供的硝酸盐的剂量为每天0.025-8g/kg体重，并且其中向所述反刍动物给予的所述硫酸盐化合物的量提供的硫酸盐的剂量为每天0.025-1.8g/kg体重。
4.如权利要求1-3中任一项所述的降低反刍动物的胃肠甲烷产生的非治疗性方法，其还包括向所述反刍动物给予亚硝酸盐还原益生微生物，其量为1*105-1*1014cfu/kg/天。
5.如权利要求4所述的降低反刍动物的胃肠甲烷产生的非治疗性方法，其还包括向所述反刍动物给予有效量的乳酸盐化合物。
6.包含硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合的组合物用于非治疗性降低反刍动物的胃肠甲烷产生的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其中所述用途包括向所述反刍动物给予硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合，其量提供的硝酸盐和硫酸盐的总剂量大于每天0.05g/kg体重。
8.如权利要求5和6中任一项所述的用途，其中所述用途还包括向所述反刍动物给予亚硝酸盐还原益生微生物，其量为1*105-1*1014cfu/kg/大。
9.复合动物饲料，其包含硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合，所述组合提供的硝酸盐和硫酸盐的总量基于干重大于10g/kg，并且所述硫酸盐的量基于干重大于7.5g/kg。
10.如权利要求9所述的复合动物饲料，其中所述硝酸盐的量基于干重大于7.5g/kg。
11.如权利要求9或10所述的复合动物饲料，其还包含亚硝酸盐还原益生微生物，其优选地选自埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)和产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)。
12.动物饲料补充剂，其包含10-100％的硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合，其中所述动物饲料补充剂中的硫酸盐的量基于干重大于25g/kg。
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