CN111494375A

CN111494375A - 由产甲烷菌引起或与之相关的疾病和病状的诊断、选择和治疗方法

Info

Publication number: CN111494375A
Application number: CN202010319818.5A
Authority: CN
Inventors: M.皮门特尔; R.马瑟; C.张
Original assignee: Cedars Sinai Medical Center
Current assignee: Cedars Sinai Medical Center
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2020-08-07
Also published as: BR112015022825A2; WO2014152754A3; US20220354925A1; EP2967060A4; HK1214752A1; US10226505B2; AU2014239164B2; JP2023016863A; MX2015012444A; EP2967060A2; WO2014152754A2; US20160038562A1; CN105208861A; JP2019031501A; US20180071359A1; US20200360468A1; US10688149B2; AU2014239164A1; US9744208B2; JP2016516717A

Abstract

本文描述的发明提供了确定、选择和/或治疗受试者中由高量的产甲烷菌引起或与之相关的疾病和病状，或受试者中由低量的产甲烷菌引起或与之相关的疾病和病状的方法和系统。在各个实施方案中，为有需要的受试者选择和/或施用抑制所述产甲烷菌的生长或促进所述产甲烷菌的生长的疗法。

Description

由产甲烷菌引起或与之相关的疾病和病状的诊断、选择和治疗方法

本申请是申请号为201480027652.2、申请日为2014年3月14日、发明名称为“由产甲烷菌引起或与之相关的疾病和病状的诊断、选择和治疗方法”的发明专利申请的分案申请。

背景技术

本文的所有出版物均以引用方式并入，达到如同每个单独的出版物或专利申请明确且单独地表明以引用方式并入的相同程度。以下说明包括可用于理解本发明的信息。并非承认本文提供的任何信息为现有技术或与当前权利要求保护的发明有关，或明确地或隐含地提及的任何出版物为现有技术。

人胃肠(GI)道是大量微生物的宿主，这些微生物包括古生菌、细菌和真核细胞。迄今为止，已经鉴定出至少70个分类的细菌和13个分类的古生菌，并且认为其宏基因组(微生物组)含有比人基因组多100倍的基因(A1,A2)。虽然肠道内微生物的组成和数量取决于许多因素(A3,A4)，但是到成年时大多数人达到指定个体特有的微生物类型和数量确定的、相对稳定的平衡(A5)。认为这种微生物群落通过建立利于其共存的共生关系(A3,A6)而与宿主一起发展，例如帮助宿主分解食物以吸收和消除(A7)。虽然这些肠道微生物对人宿主的全面影响将需要多年才会显露，但是肠道微生物和人宿主之间复杂且往往相互依赖的关系在过去十年已经受到越来越多的科学关注，并且这种关注持续增长。具体而言，有充分且越来越多的证据表明肠道微生物在能量平衡、炎症和胰岛素抗性中的潜在作用(A8–A10)，并且因此，肠道微生物已被视为代谢病状和肥胖的可能病因因素，以及潜在的治疗靶标(A11–A15)。

产甲烷菌是定殖于人肠道的肠道微生物的重要组成部分。这些生物并非细菌而是古生菌并且通过利用氢和二氧化碳(来自于互养产氢细菌)生成甲烷[10]。几十年前，Miller和Wolin通过富集培养从9个成人的显示甲烷生成的粪便样本中分离出在形态和生理上与史氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)相似的产甲烷菌。通过免疫学方法检查时，这些分离株与史氏甲烷短杆菌(M.smithii)非常密切相关并且与甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)的其它成员不相关或相关性差[11]。利用相同的形态和免疫学技术，Weaver等在乙状结肠镜检查之前在其70％的受试者的自来水灌肠样本中检测到史氏甲烷短杆菌。接受呼气分析的这些患者中的一小部分需要至少2x10⁸个产甲烷菌/克干重的粪便才具有>百万分之6(ppm)的可检测呼气甲烷[12]。然而，这些研究尚未检查有IBS的患者并且尚未使用分子技术例如PCR进行重复。

这个不同的群主要在厌氧条件下生长，并且生成作为发酵副产物的甲烷(CH₄)。产甲烷菌的独特之处在于其代谢在来自于其它肠道微生物的产物的存在下增强(A16)，因为它们清除作为甲烷生成的底物的氢和氨(A17,A18)。一旦吸收到体循环中，甲烷就经由肺部清除。人肠道中发现的大多数产甲烷菌来自于甲烷短杆菌属(genusMethanobrevibacter)；主要为史氏甲烷短杆菌(A7)。在70％的人受试者中发现史氏甲烷短杆菌，并且通过乳果糖呼气试验对呼气甲烷的分析可用作对甲烷产量的间接度量(A7,A19)。大多数受试者(15％)在呼气试验早期产生大量甲烷，表明更高的甲烷潜力(A20)，并且通过定量PCR(qPCR)测定，呼气试验中甲烷产量增加与粪便中史氏甲烷短杆菌的水平增加相关(A20,A21)。

拟杆菌(Bacteroides)种(多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron))和史氏甲烷短杆菌引入无菌小鼠产生比用单独的多形拟杆菌更高的体重(A22)，并且已经证实产甲烷菌会增强多糖代谢细菌消化无菌小鼠结肠内含多聚果糖的聚糖的能力(A22)，表明产甲烷菌可在热量收获中起作用。在人中，发明人最近已发现在正常群体和肥胖受试者中，呼气试验中甲烷增多与更高的平均BMI相关。在肥胖群体中，甲烷与非甲烷对照相比和6.7kg/m2显著更高的BMI相关(P<0.05)(A23)。虽然这些数据表明了产甲烷菌在人中在热量收获和增重中的作用，但是这受迄今为止，仅证明了大肠中产甲烷菌的定殖的事实所削弱(A24-26)。

因此，如本文所述，发明人在不同饮食条件下试验并比较了增重和GI道中史氏甲烷短杆菌定殖的位置和范围。还如本文所述，发明人使用定量聚合酶链式反应(PCR)由在呼气试验中有和无可检测甲烷的IBS患者的粪便检查了史氏甲烷短杆菌在人呼气中作为甲烷产量的决定因素的重要性。

肥胖构成了显著且迅速增长的公共卫生挑战并且与冠状动脉病、高血压、中风、2型糖尿病、某些癌症和过早死亡的风险增加相关(B1,B2)。阐明促成肥胖发展的机制是确定预防方法的关键。研究已经开始确定肠道菌群和代谢之间的关系(B3–B5)。已经将拟杆菌和厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度的变化与小鼠(B6)和人(B4)中代谢的变化和增重联系起来。产甲烷古生菌，史氏甲烷短杆菌的共同定殖在无菌动物中导致比感染单独的多形拟杆菌更高的增重(B7)。

因此，需要确定产甲烷菌的存在，及其原因和/或与各种疾病和病状的关联，及为那些疾病和病状，例如肥胖、前期糖尿病、糖尿病、II型糖尿病、胰岛素抗性、葡萄糖耐受不良、高血糖症、便秘、脂肪肝、血脂异常(例如，高脂血症)、高胆固醇、克罗恩氏病(Crohn’sdisease)、溃疡性结肠炎、显微镜性结肠炎、营养不良、吸收不良和/或再喂食综合征(举几个例而言)选择和/或施用适当治疗的方法。

发明概述

连同组合物和方法一起描述和说明以下实施方案及其方方面，其意为示例性的和说明性的，而非在范围上限制。

本发明的各个实施方案提供了一种治疗患有或怀疑患有由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状的受试者的方法，其包括：基于第一疗法适于具有高于参考值的产甲烷菌量的受试者的认识，向具有或确定具有高于参考值的产甲烷菌量的所述受试者施用第一疗法，或基于第二疗法适于具有低于所述参考值的产甲烷菌量的受试者的认识，向具有或确定具有低于参考值的产甲烷菌量的所述受试者施用第二疗法。在各个实施方案中，已经确定要治疗的受试者具有高量的产甲烷菌。在各个实施方案中，已经确定要治疗的受试者具有低量的产甲烷菌。

在各个实施方案中，所述方法还可包括鉴定患有或怀疑患有由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状的受试者。

在各个实施方案中，所述受试者具有或确定具有高量的产甲烷菌互养微生物(methanogen syntrophic microorganism)。在各个实施方案中，产甲烷菌互养微生物可为产氢微生物。在各个实施方案中，所述方法还可包括选择或导向第三疗法以抑制产甲烷菌互养微生物的生长。在各个实施方案中，所述方法还可包括施用第三疗法。

在各个实施方案中，由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状可选自肥胖、便秘、脂肪肝(NASH)、前期糖尿病、糖尿病、II型糖尿病、胰岛素抗性、葡萄糖耐受不良、高血糖症及其组合。

在各个实施方案中，由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状可为高脂血症或高胆固醇。

在各个实施方案中，由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状可为克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、显微镜性结肠炎、营养不良、吸收不良或再喂食综合征。

在各个实施方案中，所述产甲烷菌可来自于甲烷短杆菌属。在各个实施方案中，所述甲烷短杆菌可选自酸性甲烷短杆菌(M.acididurans)、嗜树木甲烷短杆菌(M.arboriphilus)、弯曲甲烷短杆菌(M.curvatus)、有表皮甲烷短杆菌(M.cuticularis)、丝状甲烷短杆菌(M.filiformis)、戈特氏甲烷短杆菌(M.gottschalkii)、米勒斯科甲烷短杆菌(M.millerae)、奥蕾氏甲烷短杆菌(M.olleyae)、口腔甲烷短杆菌(M.oralis)、瘤胃甲烷短杆菌(M.ruminantium)、史氏甲烷短杆菌、陶尔甲烷短杆菌(M.thaueri)、沃斯甲烷短杆菌(M.woesei)、沃丽尼甲烷短杆菌(M.wolinii)及其组合。在各个实施方案中，所述甲烷短杆菌为史氏甲烷短杆菌(M.Smithii)。

在各个实施方案中，所述第一疗法可为一种抗生素，或者两种或更多种抗生素的组合。在各个实施方案中，所述抗生素或所述两种或更多种抗生素的组合可选自利福昔明(rifaximin)、新霉素(neomycin)、万古霉素(vancomycin)和甲硝唑(metronidazole)。在各个实施方案中，所述抗生素可为利福昔明。在某些实施方案中，所述抗生素可为新霉素。在其它实施方案中，所述抗生素可为万古霉素。还有其它实施方案中，所述抗生素可为甲硝唑。在各个实施方案中，所述两种或更多种抗生素的组合可为利福昔明和新霉素，或利福昔明和甲硝唑。

在各个实施方案中，所述第一疗法可为能够抑制产甲烷菌生长的益生素。

在各个实施方案中，所述第一疗法可为低热量饮食。

在各个实施方案中，所述第一疗法可为低脂饮食。

在各个实施方案中，所述第一疗法可为要素饮食。

在各个实施方案中，所述第一疗法可为他汀(statin)。在各个实施方案中，所述他汀选自阿托伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)及其组合。

在各个实施方案中，所述疾病或病状可为肥胖并且所述第一疗法为减肥药。在各个实施方案中，所述减肥药可为苯丁胺(phentermine)、苯丁胺/托吡酯(topiramate)、赛尼可(xenical)、氯卡色林(lorcaserin)或利莫那班(rimonabant)。

在各个实施方案中，所述疾病或病状可选自前期糖尿病、糖尿病、II型糖尿病、胰岛素抗性、葡萄糖耐受不良、高血糖症，所述第一疗法选自α-葡糖苷酶抑制剂、糊精类似物、二肽基肽酶-4抑制剂、GLP1激动剂、美格列奈(meglitinide)、磺酰脲、双胍、噻唑烷二酮(TZD)、胰岛素及其组合。

在各个实施方案中，所述α-葡糖苷酶抑制剂可选自阿卡波糖(acarbose)、米格列醇(miglitol)及其组合。

在各个实施方案中，所述糊精类似物可为普兰林肽(pramlintide)。

在各个实施方案中，所述二肽基肽酶-4抑制剂可选自沙格列汀(Saxagliptin)、西他列汀(Sitagliptin)、维格列汀(Vildagliptin)、利拉利汀(Linagliptin)、阿格列汀(Alogliptin)或其组合。

在各个实施方案中，所述GLP1激动剂可选自利拉鲁肽(liraglutide)、艾塞那肽(exenatide)、艾塞那肽缓释剂或其组合。

在各个实施方案中，所述美格列奈可选自那格列奈(nateglinide)、瑞格列奈(repaglinide)及其组合。

在各个实施方案中，所述磺酰脲可选自氯磺丙脲(chlorpropamide)、格列美脲(Glimepiride)、格列吡嗪(Glipizide)、格列本脲(Glyburide)、妥拉磺脲(Tolazamide)、甲苯磺丁脲(Tolbutamide)及其组合。

在各个实施方案中，所述双胍可选自二甲双胍(Metformin)、欧米特(Riomet)、格华止(Glucophage)、格华止缓释剂、格华止(Glumetza)及其组合。

在各个实施方案中，所述噻唑烷二酮可选自罗格列酮(Rosiglitazone)、匹格列酮(Pioglitazone)及其组合。

在各个实施方案中，所述胰岛素可选自门冬胰岛素(Aspart)、地特胰岛素(Detemir)、甘精胰岛素(Glargine)、赖谷胰岛素(Glulisine)、赖脯(Lispro)胰岛素及其组合。

在各个实施方案中，所述疾病或病状可选自前期糖尿病、糖尿病、II型糖尿病、胰岛素抗性、葡萄糖耐受不良、高血糖症，并且所述第一疗法可选自格列吡嗪/二甲双胍、格列本脲/二甲双胍、匹格列酮/格列美脲、匹格列酮/二甲双胍、瑞格列奈/二甲双胍、罗格列酮/格列美脲、罗格列酮/二甲双胍、沙格列汀/二甲双胍、西他列汀/辛伐他汀、西他列汀/二甲双胍、利拉利汀/二甲双胍、阿格列汀/二甲双胍、阿格列汀/匹格列酮、溴隐亭(bromocriptine)、考来维仑(welchol)及其组合。

在各个实施方案中，所述疾病或病状可为便秘，并且所述第一疗法可选自轻泻药、饮食、鸟苷酸环化酶C激动剂、血清素激动剂、氯通道激动剂及其组合。

在各个实施方案中，所述鸟苷酸环化酶C激动剂可为利那洛肽(linaclotide)。

在各个实施方案中，所述血清素激动剂可为普卢卡必利(prucalorpride)、替加色罗(tegaserod)或其组合。

在各个实施方案中，所述氯通道激动剂可为鲁比前列酮(lubiprostone)。

在各个实施方案中，所述疾病或病状可为脂肪肝，并且所述第一疗法为二甲双胍。

在各个实施方案中，所述疾病或病状可为克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、显微镜性结肠炎、营养不良、吸收不良或再喂食综合征并且所述第二疗法为施用产甲烷菌。

在各个实施方案中，所述产甲烷菌来自于所述甲烷短杆菌属。在各个实施方案中，所述甲烷短杆菌可选自酸性甲烷短杆菌、嗜树木甲烷短杆菌、弯曲甲烷短杆菌、有表皮甲烷短杆菌(M.cuticularis)、丝状甲烷短杆菌、戈特氏甲烷短杆菌(M.gottschalkii)、米勒斯科甲烷短杆菌(M.millerae)、奥蕾氏甲烷短杆菌(M.olleyae)、口腔甲烷短杆菌、瘤胃甲烷短杆菌、史氏甲烷短杆菌、陶尔甲烷短杆菌(M.thaueri)、沃斯甲烷短杆菌(M.woesei)、沃丽尼甲烷短杆菌(M.wolinii)及其组合。在各个实施方案中，所述甲烷短杆菌为史氏甲烷短杆菌(M.Smithii)。

本发明的各个实施方案提供了一种方法，其包括使来自于受试者的生物样本经受对产甲烷菌量的分析；将所述产甲烷菌量与参考值比较；并且如果所述产甲烷菌量高于所述参考值，基于所述第一疗法适于具有高于所述参考值的产甲烷菌量的受试者的认识，为所述受试者选择或导向第一疗法，或如果所述产甲烷菌量低于所述参考值，基于所述第二疗法适于具有低于所述参考值的产甲烷菌量的受试者的认识，为所述受试者选择或导向第二疗法，其中所述受试者患有或怀疑患有由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状。

本发明的各个实施方案提供了一种方法，其包括使来自于受试者的生物样本经受对产甲烷菌量的分析；将所述产甲烷菌量与参考值比较；并且如果所述产甲烷菌量高于所述参考值，基于所述第一疗法适于具有高于所述参考值的产甲烷菌量的受试者的认识，为所述受试者选择或导向第一疗法，或如果所述产甲烷菌量低于所述参考值，基于所述第二疗法适于具有低于所述参考值的产甲烷菌量的受试者的认识，为所述受试者选择或导向第二疗法，其中所述受试者需要测定患由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病和病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病和病状的易感性。

本发明的各个实施方案提供了一种方法，其包括使来自于受试者的呼气样本经受对甲烷量和氢量的分析；将所述甲烷量和氢量与甲烷参考值和氢参考值比较；并且如果所述甲烷量高于所述甲烷参考值并且在呼气试验90分钟时或之前所述氢量高于所述氢参考值，基于所述第一疗法适于具有高于所述甲烷参考值和所述氢参考值的甲烷量和氢量的受试者的认识，为所述受试者选择或导向第一疗法，或如果所述甲烷量和氢量低于所述甲烷参考值和所述氢参考值，基于所述第二疗法适于具有低于所述甲烷参考值和所述氢参考值的甲烷量和氢量的认识，为所述受试者选择或导向第二疗法，其中所述受试者患有或怀疑患有由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病和病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病和病状。

在各个实施方案中，所述方法还可包括提供所述生物样本。在各个实施方案中，所述方法还可包括提供所述呼气样本。在各个实施方案中，所述方法还可包括施用所选疗法。

在各个实施方案中，所述方法还可包括使所述生物样本经受对产甲烷菌互养微生物量的分析。在各个实施方案中，所述产甲烷菌互养微生物可为产氢微生物。在各个实施方案中，所述方法还可包括选择或导向第三疗法以抑制所述产甲烷菌互养微生物的生长。在各个实施方案中，所述方法还可包括施用所述第三疗法。

在所述方法的各个实施方案中，所述生物样本可选自粪便、来自于所述胃肠道内的部位的粘膜活检、来自于所述胃肠道内的部位的抽吸液或其组合。在所述方法的各个实施方案中，所述胃肠道内的所述部位可为口腔、胃、小肠、大肠、肛门或其组合。在所述方法的各个实施方案中，所述胃肠道内的所述部位可为十二指肠、空肠、回肠或其组合。在所述方法的各个实施方案中，所述胃肠道内的所述部位可为盲肠、结肠、直肠、肛门或其组合。在所述方法的各个实施方案中，所述胃肠道内的所述部位可为升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠或其组合。

在所述方法的各个实施方案中，对产甲烷菌量的分析可通过使用定量聚合酶链式反应(qPCR)进行。

在所述方法的各个实施方案中，由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的所述疾病或病状可选自肥胖、便秘、脂肪肝(NASH)、前期糖尿病、糖尿病、II型糖尿病、胰岛素抗性、葡萄糖耐受不良、高血糖症、高脂血症、高胆固醇及其组合。

在所述方法的各个实施方案中，由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的所述疾病或病状可为克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、显微镜性结肠炎、营养不良、吸收不良或再喂食综合征。

在所述方法的各个实施方案中，所述产甲烷菌可来自于所述甲烷短杆菌属。在各个实施方案中，所述甲烷短杆菌可选自酸性甲烷短杆菌、嗜树木甲烷短杆菌、弯曲甲烷短杆菌、有表皮甲烷短杆菌(M.cuticularis)、丝状甲烷短杆菌、戈特氏甲烷短杆菌(M.gottschalkii)、米勒斯科甲烷短杆菌(M.millerae)、奥蕾氏甲烷短杆菌(M.olleyae)、口腔甲烷短杆菌、瘤胃甲烷短杆菌、史氏甲烷短杆菌、陶尔甲烷短杆菌(M.thaueri)、沃斯甲烷短杆菌(M.woesei)、沃丽尼甲烷短杆菌(M.wolinii)及其组合。在各个实施方案中，所述甲烷短杆菌可为史氏甲烷短杆菌(M.Smithii)。

在所述方法的各个实施方案中，所述参考值可为约1,000个/ml生物样本。在其中取呼气样本的某些实施方案中，所述甲烷参考值为约3ppm，并且所述氢参考值为约20ppm。

在所述方法的各个实施方案中，所述第一疗法可为一种抗生素或两种或更多种抗生素的组合。在各个实施方案中，所述抗生素或所述两种或更多种抗生素的组合可选自利福昔明、新霉素、万古霉素和甲硝唑。在各个实施方案中，所述抗生素可为利福昔明。在各个实施方案中，所述抗生素可为新霉素。在各个实施方案中，所述抗生素可为万古霉素。在各个实施方案中，所述抗生素可为甲硝唑。在各个实施方案中，所述两种或更多种抗生素的组合可为利福昔明和新霉素，或利福昔明和甲硝唑。

在所述方法的各个实施方案中，所述第一疗法可为能够抑制所述产甲烷菌生长的益生素。

在所述方法的各个实施方案中，所述第一疗法可为低热量饮食。

在所述方法的各个实施方案中，所述第一疗法可为低脂饮食。

在所述方法的各个实施方案中，所述第一疗法可为要素饮食。

在所述方法的各个实施方案中，所述第一疗法可为他汀。在各个实施方案中，所述他汀可选自阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀及其组合。

在所述方法的各个实施方案中，所述疾病或病状为肥胖并且所述第一疗法可为减肥药。在各个实施方案中，所述减肥药可为苯丁胺、苯丁胺/托吡酯、赛尼可、氯卡色林或利莫那班。

在所述方法的各个实施方案中，所述疾病或病状可选自前期糖尿病、糖尿病、II型糖尿病、胰岛素抗性、葡萄糖耐受不良、高血糖症、高脂血症和高胆固醇，并且所述第一疗法可选自α-葡糖苷酶抑制剂、糊精类似物、二肽基肽酶-4抑制剂、GLP1激动剂、美格列奈、磺酰脲、双胍、噻唑烷二酮(TZD)、胰岛素及其组合。在各个实施方案中，所述α-葡糖苷酶抑制剂可选自阿卡波糖、米格列醇及其组合。在各个实施方案中，所述糊精类似物可为普兰林肽。在各个实施方案中，所述二肽基肽酶-4抑制剂选自沙格列汀、西他列汀、维格列汀、利拉利汀、阿格列汀或其组合。在各个实施方案中，所述GLP1激动剂可选自利拉鲁肽、艾塞那肽、艾塞那肽缓释剂或其组合。在各个实施方案中，所述美格列奈可选自那格列奈、瑞格列奈及其组合。在各个实施方案中，所述磺酰脲可选自氯磺丙脲、格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、妥拉磺脲、甲苯磺丁脲及其组合。在各个实施方案中，所述双胍可选自二甲双胍、欧米特(Riomet)、格华止(Glucophage)、格华止缓释剂、格华止(Glumetza)及其组合。在各个实施方案中，所述噻唑烷二酮可选自罗格列酮、匹格列酮及其组合。在各个实施方案中，所述胰岛素可选自门冬胰岛素、地特胰岛素、甘精胰岛素、赖谷胰岛素、赖脯胰岛素及其组合。

在所述方法的各个实施方案中，所述疾病或病状可选自前期糖尿病、糖尿病、II型糖尿病、胰岛素抗性、葡萄糖耐受不良、高血糖症、高脂血症和高胆固醇，并且所述第一疗法可选自格列吡嗪/二甲双胍、格列本脲/二甲双胍、匹格列酮/格列美脲、匹格列酮/二甲双胍、瑞格列奈/二甲双胍、罗格列酮/格列美脲、罗格列酮/二甲双胍、沙格列汀/二甲双胍、西他列汀/辛伐他汀、西他列汀/二甲双胍、利拉利汀/二甲双胍、阿格列汀/二甲双胍、阿格列汀/匹格列酮、溴隐亭、考来维仑及其组合。

在所述方法的各个实施方案中，所述疾病或病状可为便秘，并且所述第一疗法可选自轻泻药、饮食、鸟苷酸环化酶C激动剂、血清素激动剂、氯通道激动剂及其组合。在各个实施方案中，所述鸟苷酸环化酶C激动剂可为利那洛肽。在各个实施方案中，所述血清素激动剂可为普卢卡必利、替加色罗或其组合。在各个实施方案中，所述氯通道激动剂可为鲁比前列酮。

在所述方法的各个实施方案中，所述疾病或病状可为脂肪肝，并且所述第一疗法可为二甲双胍。

在所述方法的各个实施方案中，所述疾病或病状可为克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、显微镜性结肠炎、营养不良、吸收不良或再喂食综合征并且所述第二疗法可为施用产甲烷菌。

在各个实施方案中，所述产甲烷菌可来自于所述甲烷短杆菌属。在各个实施方案中，所述甲烷短杆菌可选自酸性甲烷短杆菌、嗜树木甲烷短杆菌、弯曲甲烷短杆菌、有表皮甲烷短杆菌(M.cuticularis)、丝状甲烷短杆菌、戈特氏甲烷短杆菌(M.gottschalkii)、米勒斯科甲烷短杆菌(M.millerae)、奥蕾氏甲烷短杆菌(M.olleyae)、口腔甲烷短杆菌、瘤胃甲烷短杆菌、史氏甲烷短杆菌、陶尔甲烷短杆菌(M.thaueri)、沃斯甲烷短杆菌(M.woesei)、沃丽尼甲烷短杆菌(M.wolinii)及其组合。

在各个实施方案中，所述甲烷短杆菌可为史氏甲烷短杆菌(M.Smithii)。

本发明的其它特征和优点将从以下详述，连同附图中显而易见，附图仅以举例的方式说明了本发明实施方案的特征。

附图简述

在参考附图中说明了示例性实施方案。本文所公开的实施方案和附图旨在被视为示例性而非限制性。

图1根据本发明的各个实施方案描绘了粪便中甲烷和非甲烷生产者中的史氏甲烷短杆菌计数。

图2根据本发明的各个实施方案描绘了作为检测呼气时甲烷的决定因素的相对于原核细菌的史氏甲烷短杆菌百分比。

图3根据本发明的各个实施方案描绘了史氏甲烷短杆菌和呼气甲烷AUC之间的相关性。

图4根据本发明的各个实施方案描绘了史氏甲烷短杆菌与总原核生物的百分比和呼气甲烷AUC之间的相关性。

图5根据本发明的各个实施方案描绘了呼气AUC中氢和甲烷之间的相关性。

图6根据本发明的各个实施方案描绘了史氏甲烷短杆菌水平和便秘与腹泻相关程度之间的相关性。C-D为便秘与腹泻相关程度的确证度量。数量越大便秘与腹泻越相关。

图7根据本发明的各个实施方案描绘了粪便中史氏甲烷短杆菌与总细菌的百分比和便秘相对程度的比较。C-D为便秘与腹泻相关程度的确证度量。数量越大便秘与腹泻越相关。史氏甲烷短杆菌％通过史氏甲烷短杆菌相对于总原核细菌的量测定。

图8根据本发明的各个实施方案描绘了粪便中总原核细菌计数和腹痛评分之间的相关性。

图9描绘了随时间推移(在饮食调控之前)史氏甲烷短杆菌强饲对该物种的粪便量的影响。根据本发明的各个实施方案*P<0.01。

图10a-10b根据本发明的各个实施方案描绘了饮食脂肪含量对大鼠重量和粪便史氏甲烷短杆菌水平的影响。(a)从成年重量平稳期开始随时间推移的大鼠重量。1周高脂饮食后重量的变化*P<0.00001。恢复高脂饮食后重量的变化

(b)随时间推移的史氏甲烷短杆菌水平。对于开始高脂食物后粪便史氏甲烷短杆菌的增量*P<0.01。对于恢复正常食物后粪便史氏甲烷短杆菌的减少◇P<0.001。对于恢复高脂食物后粪便史氏甲烷短杆菌的增量

图11a-11c根据本发明的各个实施方案描绘了高脂饮食对粪便史氏甲烷短杆菌水平的影响。(a)在高脂饮食之前、1周后和5周后的史氏甲烷短杆菌水平。(b)粪便史氏甲烷短杆菌水平和增重程度。比较从第98天到第154天的增重。(c)恢复高脂食物对粪便史氏甲烷短杆菌水平的影响。

图12a-12b根据本发明的各个实施方案描绘了在肠段附近的史氏甲烷短杆菌和总细菌水平。(a)死后肠段附近的史氏甲烷短杆菌。回肠和盲肠与左结肠之间P<0.001；比较回肠与空肠P＝0.03并且比较回肠与十二指肠P＝0.07。(b)死后肠段附近的细菌总量。

图13a-13b根据本发明的各个实施方案描绘了饮食脂肪含量对肠内史氏甲烷短杆菌和总细菌水平的影响。(a)饮食后整个肠内的史氏甲烷短杆菌。◆P<0.05。(b)饮食后整个肠内的细菌总量。无比较显著。

图14根据本发明的各个实施方案描绘了无史氏甲烷短杆菌定殖的段数和重量。趋势在统计上不显著。

图15A-15B描绘了呼气试验中甲烷和氢的身体组成和产量。(A)按组的BMI。示出了甲烷和氢组与其它各组之间P<.02的显著性水平。误差线表示SEM。(B)按组的体脂百分比。示出了甲烷和氢组与其它各组之间P≤.001的显著性水平。

图16A-16B显示甲烷生产者具有比非甲烷生产者明显更高的180分钟血清葡萄糖AUC。(A)根据本发明的各个实施方案，比较了甲烷生产者和非甲烷生产者的葡萄糖曲线下面积图。葡萄糖负荷后180分钟期间，甲烷生产者与非甲烷受试者(585.5±128.3mg/dL)相比具有更高的血清葡萄糖AUC(774.2±140.3mg/dL)(P＝0.03)。

图17示出了在抗生素之前和之后的胆固醇。P＝0.082

图18示出了在抗生素之前和之后葡萄糖耐量试验的葡萄糖AUC。P＝0.11

图19示出了在抗生素之前和之后的胰岛素AUC。P＝0.048

图20示出了在抗生素之前和之后的Matsuda评分。P＝0.062

图21A-21B显示在不产甲烷和产甲烷的人受试者之间在OGTT后的180分钟胰岛素AUC上无显著差异。

图22示出了在OGTT后的葡萄糖与胰岛素比例。

图23描绘了本发明的示例性装置/系统。

发明描述

本文引用的所有参考文献整体以引用方式并入，如同完整阐述一样。除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton等人，微生物与分子生物学词典第3版，修订版，约翰.威利出版社(纽约,NY2006)(Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3^rded.,Revised,J.Wiley&Sons(New York,NY 2006))；March，高级有机化学反应、机制和结构第7版，约翰威利出版社(纽约,NY 2013)(March,Advanced Organic ChemistryReactions,Mechanisms and Structure 7^th ed.,J.Wiley&Sons(New York,NY 2013))；及Sambrook和Russel，分子克隆:实验室手册第4版，冷泉港实验室出版社冷泉港,纽约2012)(Sambrook and Russel，Molecular Cloning:A Laboratory Manual 4^th ed.,Cold SpringHarbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,NY 2012))为本领域的技术人员提供了用于本申请中的许多术语的一般性指导。

本领域的技术人员将认识到可用于本发明实践的与本文所述的那些方法和材料相似或等效的许多方法和材料。实际上，本发明决不限于所述的方法和材料。为了本发明的目的，下文定义了以下术语。

“有益结果”可包括但决不限于减轻或缓和所述疾病或病状的严重程度，预防或抑制所述疾病状况恶化，治愈所述疾病状况和延长患者的寿命或预期寿命。

如本文所用的“哺乳动物”是指哺乳纲的任何成员，包括但不限于人和非人灵长类，诸如黑猩猩和其它猿和猴物种；农场动物，诸如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，诸如狗和猫；实验室动物，包括啮齿类，诸如小鼠、大鼠和豚鼠，等等。该术语不指定特定的年龄或性别。因此，成年和新生受试者以及胎儿无论是雄性还是雌性都旨在包括在该术语的范围内。

如本文所用的“治疗有效量”是指能够在具有高量的产甲烷菌的患者中或在具有低量或不存在产甲烷菌的患者中实现有益结果的量。治疗有效量可在个体基础上测定并且将至少部分基于对哺乳动物生理特征、递送系统的类型或所用治疗技术及相对于所述疾病或病状进展的施用时间的考虑。

如本文所用的“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指治疗性治疗和防治或预防性措施，其中即使治疗最终不成功，但目的是预防、减缓和/或减轻所述疾病。

如本文所用的“选择一种疗法”是指，例如，为受试者挑选、选择或规定一种疗法。

如本文所述，发明人证明史氏甲烷短杆菌很可能是在有IBS的患者中产生呼气甲烷的重要产甲烷菌。此外，粪便中史氏甲烷短杆菌水平和相对比例与甲烷生成的程度相关，表明这可能是在呼气试验期间在人中产生甲烷的主要产甲烷菌。最后，这是在LBT中通过qPCR证明史氏甲烷短杆菌在有甲烷的C-IBS受试者中很重要的首次研究。

近期文献表明了产甲烷胃肠道微生物群在功能性胃肠病诸如IBS的病理生理学中的作用。具体地，LBT中的甲烷气体与便秘表现型相关[5,6,7]。发明人小组已经证实甲烷并非如先前所认为的那样为惰性气体；而是减缓肠道通过率[14]。在对5只狗的体内研究中，通过中部小肠瘘灌注甲烷使近端小肠运动性降低平均59％[14]。在人研究中还已将呼气甲烷的存在与肠道通过率的明显减缓相关联[8,15,16]。在有IBS的患者中，在众多出版物中已经证实在乳果糖呼气试验中甲烷几乎与便秘为主型疾病普遍相关[5,6,7,8]。然而，在此类患者中为了确定甲烷来源对粪便的评价尚未在IBS中尝试。

如本文所述，发明人确定史氏甲烷短杆菌普遍存在于IBS患者的粪便中。然而，甲烷呼气试验为阳性的患者与甲烷阴性患者相比携带有显著更高量的史氏甲烷短杆菌。这些患者在其粪便中相对于其它细菌还具有更高比例的史氏甲烷短杆菌。粪便中史氏甲烷短杆菌的计数或相对比例越高，呼气甲烷的程度越高。这暗示粪便定量PCR是比呼气分析灵敏得多的检测肠道产甲烷菌的工具。

有趣的是，单独的产甲烷菌可能不会有问题。在这项研究中，大多数受试者在其粪便中具有可检测的史氏甲烷短杆菌。然而，史氏甲烷短杆菌的水平可能是问题。基于这项研究，当史氏甲烷短杆菌的水平超过4.2x 10⁵个拷贝/克湿粪便或1.2％的粪便细菌总量时，呼气时的甲烷似乎可检测。这很重要，因为在对呼气和便秘IBS时甲烷的原始描述中，并非所有便秘显著IBS受试者都具有甲烷。然而，几乎所有甲烷受试者都便秘。总的来说，这些发现表明通过qPCR验粪可鉴定引起呼气试验不够灵敏而不能检测的便秘的阈值。

还如本文所述，在呼气分析中产生可检测甲烷的史氏甲烷短杆菌的阈值比Weaver等人早期报道的阈值小得多[12]。这个差异很可能是由于使用了不同的技术。在Weaver等人的研究中，由粪便样本培养产甲烷菌并且基于形态和免疫学方法鉴定为史氏甲烷短杆菌。因为生物为厌氧的，所以粪便的处理和针对产甲烷菌培养可能很困难。将粪便样本暴露于空气可伤害限制其生长的生物。在q-PCR的情况下，因为PCR将检测活性和非活性生物，所以处理不成问题。

因为用不可吸收的抗生素消除产甲烷菌可显著改善肠道症状，所以这些数据可具有治疗和临床意义[17,18]。在有便秘为主型IBS的甲烷生产者中，新霉素与在后续呼气试验中与甲烷的消除良好相关的安慰剂相比，引起便秘的改善44.0±12.3％与5.0±5.1％[19]。在回顾性研究中，10天利福昔明和新霉素的组合与单独的新霉素(分别为33％和63％)或利福昔明(分别为28％和56％)相比引起甲烷(87％)和便秘症状(85％)明显减少更多[20]。

发明人观察到了史氏甲烷短杆菌和便秘之间相关的正向趋势。发明人的结果表明史氏甲烷短杆菌是C-IBS患者肠道内在呼气试验中产生甲烷的主要产甲烷古生菌。这受粪便中史氏甲烷短杆菌水平和呼气试验中甲烷AUC之间的相关性支持。

如本文进一步描述，发明人首次证明大鼠肠道产甲烷菌史氏甲烷短杆菌的定殖不限于大肠，而是延伸到小肠，包括回肠、空肠和十二指肠。事实上，发明人发现史氏甲烷短杆菌的水平在小肠中比在大肠中高，在回肠中看到水平升高最多。而且，发明人发现使大鼠转换为高脂饮食导致粪便中史氏甲烷短杆菌的水平增高，并且试验的所有肠段中史氏甲烷短杆菌的水平增高。最显著地，发明人发现增重更多的大鼠具有比增重较少的大鼠更高的粪便史氏甲烷短杆菌水平，并且不论饮食如何，肠的史氏甲烷短杆菌定殖范围也与这些大鼠中的增重相对应。总的来说，这些发现支持肠道史氏甲烷短杆菌定殖的水平和范围预示这种动物模型中增重的程度。

越来越理解肠道微生物在宿主代谢和能量平衡中起作用并且影响宿主代谢和能量平衡，并且发明人认为其促成代谢病症和肥胖的发展。通过酶的生成，肠道微生物在以下方面帮助宿主：利用不易消化的碳水化合物和宿主源糖缀合物，导致短链脂肪酸(SCFA)产量增加；使胆汁酸去缀合和脱羟基，这样改变了饮食脂质的溶解和吸收；及降胆固醇和生物合成来自于K和B族的维生素、类异戊二烯和氨基酸诸如赖氨酸和苏氨酸(A1,A11,A28,A29)。还已表明肠道微生物影响肠道通过时间，并且经由对内毒素toll-样受体4轴和肠道屏障功能的影响促成与肥胖相关的慢性低度炎症和胰岛素抗性(A14,A30)。这些数据支持肠道微生物在促成宿主增重中的作用，这验证了在发明人的动物模型中增重比饮食脂肪含量更多取决于肠道的史氏甲烷短杆菌定殖程度和范围的发明人发现。

多条证据支持产甲烷菌可在宿主代谢和能量平衡中起特定作用。产甲烷菌诸如在人肠道中最常见的史氏甲烷短杆菌，通过厌氧发酵生成甲烷(A17,A18)，并且去除氢原子和加速多糖和碳水化合物的发酵(A22)。这增加了SCFA的产量，随后SCFA在肠道中被吸收并用作宿主的附加能量源(A11)。这种更有效的能量提取可导致增重并且最终促成肥胖(A32)。这样的一种潜在机制是通过SCFA对其用作配体的G蛋白偶联受体的影响。G蛋白偶联受体Gpr41在肠道、结肠和脂细胞内表达，并刺激二者均影响能量代谢并且还影响食欲水平/饱腹感的脂肪素瘦素和肽酪氨酸-酪氨酸(肽-YY)的表达。另外，已经将血浆SCFA的调节与抗胰岛素人受试者中炎症标志的减少联系起来(A33,A34)，表明对与肥胖相关的慢性低度炎症的潜在影响。有趣的是，在人研究中发明人发现在75g口服葡萄糖耐量试验期间，尽管具有同等的BMI和基线胰岛素抗性(稳态模型评估-胰岛素抗性)，但产甲烷受试者(即，在呼气试验中甲烷增加的那些受试者)具有比非甲烷受试者更大的血清葡萄糖曲线下面积，表明肠道产甲烷受试者在用高碳水化合物负荷激发时葡萄糖耐受性可受损，并且因此具有比非甲烷受试者更高的高血糖症易感性(参见本文实施例5)。产甲烷菌可借此影响宿主的能量提取的最终潜在机制是通过减缓肠道运动性。在人肠易激综合征患者中，发明人发现在呼气试验中有甲烷的患者更可能患有作为主要症状亚型的便秘(A19,A35)，并且生成的甲烷的量与便秘程度有关，如通过布里斯托粪便评分(Bristol Stool Score)和排便频率所测量(A35)。甲烷也与其它便秘病症相关(A36,A37)。在动物体内研究中，发明人小组证明向小肠灌注甲烷导致小肠通过减缓59％(A38)。由胃轻瘫社团通过显示具有极慢运动性(胃轻瘫)的受试者具有更高的BMI(A39)的研究，和通过超短肠患者的研究证明小肠通过的减缓可能与更高的BMI相关，其中发明人小组发现用艾塞那肽减缓肠道导致腹泻、营养缺乏和对慢性肠胃外营养素的需要的消退，并且伴有增重(A40)。总的来说，这些表示更多的史氏甲烷短杆菌定殖可促成发明人在这些大鼠中观察到的伴随性增重的几种潜在机制。

迄今为止，主要已在左结肠中鉴定出产甲烷菌(A24–A26)，并且已经论证得出对已知不会在大肠外部出现的肠道微生物群的改变不大可能是增重的显著直接原因。发明人的结果首次证明在大鼠中，不仅是在小肠内出现史氏甲烷短杆菌的定殖，而且在十二指肠、空肠和回肠中的史氏甲烷短杆菌水平事实上比在盲肠或左结肠中高，在回肠中的水平最高。而且，这些动物中增重的程度与定殖的肠段数量相对应，并且发明人认为肠道史氏甲烷短杆菌定殖的范围预示并且促成增重。

总之，发明人的结果首次证明产甲烷菌史氏甲烷短杆菌定殖不限于大肠，而是也出现在小肠中。而且，在这种大鼠模型中，发明人发现不管饮食脂肪含量如何，小肠史氏甲烷短杆菌定殖的水平和范围与增重程度相关并且预示增重程度。

还如本文所述，发明人在近800名受试者的分析中证明了呼气试验中甲烷和氢的存在与BMI增加以及体脂百分比增加之间的明确关联。这项研究是其同类中的首例鉴定甲烷和氢的生成作为人受试者中较高BMI和脂肪含量的指标。

肥胖是公共健康问题并且无疑有多因素。在能量摄入、消耗和储存的多个领域中看到调节异常。对肠道菌群在肥胖的发病机理中的潜在作用越来越感兴趣。Gordon、Backhed等的研究(B3–B7)已经证实了在小鼠模型中微生物菌群和增重之间有趣的关系，包括肠道中厚壁菌门与拟杆菌门相对丰度的改变与潜在增强的营养收获之间的关联(B3)。肠道菌群已经牵连于可促成增重的许多机制中，包括导致胰岛素抗性的脂多糖生成增加(B5)，禁食诱导脂肪因子的抑制(B14)，肝脏中AMP活化蛋白激酶驱动的脂肪酸氧化的抑制(B15)，肠促胰岛素调节(B16)，及SCFA生成和吸收增加，从而为宿主提供了增加的生脂肪底物(B17)。在Ob/Ob小鼠的盲肠菌群中也已经观察到增加的产甲烷菌(B3)。发明人认为本文描述的这种大规模人研究显示了产甲烷菌，并且特别是史氏甲烷短杆菌在人肥胖中的作用。

人GI道由多达10¹²个微生物物种定殖，包括细菌和古生菌，其中史氏甲烷短杆菌是最丰富的产甲烷生物(B9)。发明人在本文中表明甲烷阳性个体在GI道中具有史氏甲烷短杆菌。发明人已表明呼气试验中甲烷增加与粪便中更高的史氏甲烷短杆菌水平相关，并且甲烷阳性肥胖受试者具有比甲烷阴性肥胖对照高的平均6.7kg/m²的BMI(B11)。虽然最初认为史氏甲烷短杆菌仅存在于大肠，弱化了其可在热量收获和增重中起重要作用的可能性，但是发明人在本文中使用大鼠模型表明史氏甲烷短杆菌定殖事实上在整个小肠中出现。重要的是，史氏甲烷短杆菌定殖的肠段数量与该大鼠模型中增重的程度直接有关并且在高脂饮食的存在下进一步增强。

发明人认为史氏甲烷短杆菌在动物增重中的作用具促进性并且涉及与其它微生物的互养关系，史氏甲烷短杆菌借此清除由互养生物生成的氢用于其需氢厌氧代谢，生成作为副产物的甲烷。这样清除氢使互养生物更有生产力，从而增加了SCFA产量和宿主的热量利用率(B8)。发明人的结果支持这一点-呼气试验中氢和甲烷的存在，而不是单独的甲烷或氢，与更高的BMI和体脂百分比相关，可能是因为这些受试者具有丰富的氢为甲烷生成供以燃料。

另外，甲烷本身(由肠道产甲烷菌生成时呈气体形式)也可促成能量收获增加。发明人先前指出了人受试者中呼气甲烷和便秘(便秘-肠易激综合征)之间的关联(B13)并且，使用动物体内模型，证明甲烷气体直接减缓在肠道内的通过率59％(B19)。发明人认为通过率的减缓可导致收获营养素和吸收热量的时间更长，表示增重的另一潜在机制。

虽然甲烷生产者的平均年龄高于对照的平均年龄，但是即使在控制作为混杂变量的年龄时，结果仍显著。此外，没有证据表明甲烷产量随年龄增加，而是在成年期稳定(B20)，使得年龄不大可能会影响研究结果。发明人在本文中表明饮食可影响动物模型中的总体肠道菌落和史氏甲烷短杆菌水平。发明人的研究未说明受试者间的饮食差异。然而，考虑到大样本尺寸，这些个体差异可在组间减轻。

总之，发明人的研究首次证明在呼气试验中具有甲烷和氢的个体具有较高的BMI和体脂百分比。发明人认为这是由于需氢产甲烷菌史氏甲烷短杆菌的过度定殖，其通过与其它微生物的互养关系增强了能量收获和向宿主生物的营养素递送。

本发明的各个实施方案至少部分基于这些发现。

本发明的各个实施方案提供了一种为患有或怀疑患有由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状的受试者选择、导向和/或施用一种疗法的方法。所述方法包括使来自于受试者的生物样本经受对产甲烷菌量的分析；将所述产甲烷菌量与参考值比较；并且如果所述产甲烷菌量高于所述参考值，基于所述第一疗法适于具有高于所述参考值的产甲烷菌量的受试者的认识，为所述受试者选择或导向第一疗法，或如果所述产甲烷菌量低于所述参考值，基于所述第二疗法适于具有低于所述参考值的产甲烷菌量的受试者的认识，为所述受试者选择或导向第二疗法，其中所述受试者患有或怀疑患有由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状。如在该上下文中使用的第一疗法和第二疗法不是指施用两种疗法，仅仅是提供两类疗法之间的区别。第一疗法是适于治疗具有高量的产甲烷菌的受试者的疗法。第二疗法是适于治疗具有低量或不可检测量的产甲烷菌的受试者的疗法。

在各个实施方案中，所述方法还包括鉴定患有或怀疑患有由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状的受试者。

在各个实施方案中，所述方法还包括获得或提供生物样本。在各个实施方案中，所述方法还包括施用所选疗法。

在各个实施方案中，所述方法还包括使所述生物样本经受对产甲烷菌互养微生物量的分析。在各个实施方案中，所述产甲烷菌互养微生物为产氢微生物。在各个实施方案中，所述方法还包括选择或导向第三疗法以抑制产甲烷菌互养微生物的生长。在各个实施方案中，所述方法还包括施用第三疗法。在各个实施方案中，第三疗法和第一疗法可为相同或相同类型的疗法。

各个实施方案提供了一种为需要测定患由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状的易感性的受试者选择或导向一种疗法的方法。所述方法包括使来自于受试者的生物样本经受对产甲烷菌量的分析；将所述产甲烷菌量与参考值比较；并且如果所述产甲烷菌量高于所述参考值，基于所述第一疗法适于具有高于所述参考值的产甲烷菌量的受试者的认识，为所述受试者选择或导向第一疗法，或如果所述产甲烷菌量低于所述参考值，基于所述第二疗法适于具有低于所述参考值的产甲烷菌量的受试者的认识，为所述受试者选择或导向第二疗法，其中所述受试者需要测定患由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状的易感性。

在各个实施方案中，所述方法还包括鉴定需要测定患由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状的易感性的受试者。

在各个实施方案中，所述方法还包括提供生物样本。

在各个实施方案中，所述方法还包括施用所选疗法。

在各个实施方案中，所述方法还包括使所述生物样本经受对产甲烷菌互养微生物量的分析。在各个实施方案中，所述产甲烷菌互养微生物为产氢微生物。在各个实施方案中，所述方法还包括选择或导向第三疗法以抑制产甲烷菌互养微生物的生长。在各个实施方案中，所述方法还包括施用第三疗法。

本发明的各个实施方案提供了一种治疗患有或怀疑患有由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状的受试者的方法。所述方法包括使来自于受试者的生物样本经受对产甲烷菌量的分析；将所述产甲烷菌量与参考值比较；并且如果所述产甲烷菌量高于所述参考值，基于所述第一疗法适于具有高于所述参考值的产甲烷菌量的受试者的认识，为所述受试者选择或导向第一疗法，或如果所述产甲烷菌量低于所述参考值，基于所述第二疗法适于具有低于所述参考值的产甲烷菌量的受试者的认识，为所述受试者选择或导向第二疗法；并且向受试者施用所选疗法以治疗所述疾病或病状，其中所述受试者患有或怀疑患有由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状。

如在该上下文中使用的第一疗法和第二疗法不是指施用两种疗法，仅仅是提供两类疗法之间的区别。第一疗法是适于治疗具有高量的产甲烷菌的受试者的疗法。第二疗法是适于治疗具有低量或不可检测量的产甲烷菌的受试者的疗法。

在各个实施方案中，所述方法还包括鉴定患有或怀疑患有由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状的受试者供治疗。

在各个实施方案中，所述方法还包括获得或提供生物样本。

本发明的各个实施方案提供了一种治疗患有或怀疑患有由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状的受试者的方法。所述方法包括基于第一疗法适于具有高于所述参考值的产甲烷菌量的受试者的认识向具有或确定具有高于参考值的产甲烷菌量的受试者施用第一疗法，或基于所述第二疗法适于具有低于所述参考值的产甲烷菌量的受试者的认识向具有或确定具有低于参考值的产甲烷菌量的受试者施用第二疗法。

在各个实施方案中，所述受试者具有或确定具有高量的产甲烷菌互养微生物。在各个实施方案中，所述产甲烷菌互养微生物为产氢微生物。在各个实施方案中，所述方法还包括选择或导向第三疗法以抑制产甲烷菌互养微生物的生长。在各个实施方案中，所述方法还包括施用第三疗法。在各个实施方案中，第三疗法和第一疗法可为相同或相同类型的疗法。

本发明的各个实施方案提供了一种诊断由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状的方法。所述方法包括使来自于受试者的生物样本经受对产甲烷菌量的分析；将所述产甲烷菌量与参考值比较；并且如果所述产甲烷菌量高于所述参考值，则确定受试者患有所述疾病或病状，或如果所述产甲烷菌量低于所述参考值，则确定受试者没有患有所述疾病或病状。

在各个实施方案中，所述方法还包括鉴定受试者以供诊断。在各个实施方案中，所述方法还包括获得或提供生物样本。

在各个实施方案中，所述方法还包括使所述生物样本经受对产甲烷菌互养微生物量的分析。在各个实施方案中，所述产甲烷菌互养微生物为产氢微生物。

本发明的各个实施方案提供了一种诊断对由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状的易感性的方法。所述方法包括使来自于受试者的生物样本经受对产甲烷菌量的分析；将所述产甲烷菌量与参考值比较；并且如果所述产甲烷菌量高于所述参考值，则确定受试者易患由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状，或如果所述产甲烷菌量低于所述参考值，则确定受试者不易患由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状。

本发明的各个实施方案提供了一种诊断对由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状的易感性的方法。所述方法包括使来自于受试者的生物样本经受对产甲烷菌量的分析；将所述产甲烷菌量与参考值比较；并且如果所述产甲烷菌量低于所述参考值，则确定受试者易患由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状，或如果所述产甲烷菌量高于所述参考值，则确定受试者不易患由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状。

本发明的各个实施方案提供了一种方法，其包括使来自于受试者的呼气样本经受对甲烷量和氢量的分析；将所述甲烷量和氢量与甲烷参考值和氢参考值比较；并且如果所述甲烷量高于所述甲烷参考值并且在呼气试验90分钟时或之前所述氢量高于所述氢参考值，基于所述第一疗法适于具有高于所述甲烷参考值和所述氢参考值的甲烷量和氢量的受试者的认识，为所述受试者选择或导向第一疗法，或如果所述甲烷量和氢量低于所述甲烷参考值和所述氢参考值，基于所述第二疗法适于具有低于所述甲烷参考值和所述氢参考值的甲烷量和氢量的受试者的认识，为所述受试者选择或导向第二疗法，其中所述受试者患有或怀疑患有由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状。

在各个实施方案中，所述方法还包括提供呼气样本。

在各个实施方案中，所述方法还包括施用所选择或导向的疗法。

在各个实施方案中，所述方法还包括选择或导向第三疗法以抑制产甲烷菌互养微生物的生长。

在各个实施方案中，所述方法还包括施用第三疗法。

在各个实施方案中，本发明提供了包括适于进行本文所述的本发明方法的组件的系统。

参考值

在各个实施方案中，参考值为约10,000个/ml生物样本。例如，在粪便样本中，参考值可为10,000个产甲烷菌/ml粪便样本。因此，高产甲烷菌量为高于10,000个/ml生物样本的量，并且低产甲烷菌量为低于10,000个/ml生物样本的量。在一些实施方案中，参考值为约1,000个/ml。因此，高产甲烷菌量为高于1,000个/ml生物样本的量，并且低产甲烷菌量为低于1,000个/ml生物样本，例如1,000个产甲烷菌/ml粪便的量。在一些实施方案中，参考值为约5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000或20,000个/ml生物样本。因此，在一些实施方案中，高产甲烷菌量为高于约5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000或20,000个/ml生物样本的量，并且低产甲烷菌量为低于约5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000或20,000个/ml生物样本的量。在一些实施方案中，这些量可为每毫克生物样本。

在各个实施方案中，参考值，特别是用于测定低产甲烷菌量时为约4,000个/ml生物样本。因此，低产甲烷菌量为低于4,000个/ml生物样本的量。在一些实施方案中，参考值为约3,000、2,000、1,000或500个/ml生物样本。因此，在一些实施方案中，低产甲烷菌量为小于3,000、2,000、1,000或500个/ml生物样本的量。在一些实施方案中，这些量可为每毫克生物样本。

参考值可取决于将确定的疾病或病状的类型。不同类型的疾病和病状可具有不同参考值。

在一些实施方案中，可由来自于健康受试者的生物样本确定参考值。

例如，如果生物样本为粪便，则可由健康受试者的粪便获得参考值。在其它实施方案中，参考值为来自于健康受试者群体的相同类型的生物样本的平均产甲烷菌计数。在其它实施方案中，参考值为来自于健康受试者群体的相同类型的生物样本的平均值加上平均产甲烷菌计数的一个或两个标准偏差。在一些实施方案中，健康受试者群体范围可从至少3个健康个体到25个健康个体，和甚至多于50个健康个体。

在其中取呼气样本的某些实施方案中，甲烷参考值为约3ppm并且氢参考值为约20ppm。

受试者

从中获得生物样本的受试者可以是患有或怀疑患有至少部分由具有高产甲烷菌量引起或与具有高产甲烷菌量相关的疾病或病状的受试者。这些受试者的实例包括但不限于是或怀疑是或患有超重、肥胖、便秘、C-IBS、IBS、前期糖尿病、糖尿病、II型糖尿病、胰岛素抗性、葡萄糖耐受不良、高血糖，或患有脂肪肝(NASH)、高脂血症或高胆固醇的那些受试者。

从中获得生物样本的受试者可以是患有或怀疑患有至少部分由具有低产甲烷菌量引起或与具有低产甲烷菌量相关的疾病或病状的受试者。这些受试者的实例包括但不限于患有或怀疑患有克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、显微镜性结肠炎、营养不良、吸收不良和/或再喂食综合征的受试者。

在某些实施方案中，从中获得生物样本的受试者可以是需要了解他或她是否易患至少部分由具有高产甲烷菌量引起或与具有高产甲烷菌量相关的疾病或病状的受试者。这些受试者的实例包括但不限于需要了解他或她是否易患超重、肥胖、便秘、前期糖尿病、糖尿病、II型糖尿病、胰岛素抗性、葡萄糖耐受不良、高血糖，或患脂肪肝(NASH)、高脂血症或高胆固醇的那些受试者。

从中获得生物样本的受试者可以是需要了解他或她是否易患至少部分由具有低产甲烷菌量引起或与具有低产甲烷菌量相关的疾病或病状的受试者。这些受试者的实例包括但不限于需要了解他或她是否易患克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、显微镜性结肠炎、营养不良、吸收不良和/或再喂食综合征的受试者。

高脂血症可为家族性(也称为原发性)，由特定遗传异常引起，或当由导致血浆脂质和脂蛋白代谢改变的另一种潜在病症引起时为获得性(也称为继发性)。同样，高脂血症可为特发性，即原因未知。

高脂血症也根据升高的脂质类型分类，即高胆固醇血症、高甘油三酯血症或呈混合型高脂血症。脂蛋白(a)的升高水平也可分类为高脂血症的形式。

家族性高脂血症可为I型(a、b或c)、II型(a或b)、III型、IV型或V型。

生物样本

通过本发明的方法分析的生物样本可为粪便、来自于所述胃肠道内的部位的粘膜活检或来自于所述胃肠道内的部位的抽吸液。在各个实施方案中，所述胃肠道内的部位为口腔、胃部、小肠、大肠或肛门。在各个实施方案中，所述胃肠道内的部位为十二指肠、空肠或回肠。在各个实施方案中，所述胃肠道内的部位为盲肠、结肠、直肠或肛门。在各个实施方案中，所述胃肠道内的部位为升结肠、横结肠、降结肠或乙状结肠。

在某些实施方案中，生物样本可为受试者的呼气。

疾病或病状

在各个实施方案中，至少部分由具有高产甲烷菌量引起或与具有高产甲烷菌量相关的疾病或病状包括但不限于肥胖、便秘、便秘为主型肠易激综合征(C-IBS)、IBS、脂肪肝(NASH)、前期糖尿病、糖尿病、II型糖尿病、高脂血症、高胆固醇、胰岛素抗性、葡萄糖耐受不良和高血糖症。

在各个实施方案中，至少部分由具有低产甲烷菌量引起或与具有低产甲烷菌量相关的疾病或病状包括但不限于克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、显微镜性结肠炎、营养不良、吸收不良和/或再喂食综合征。

产甲烷菌量高时用于疾病或病状的选择、导向(例如，导向疗法)或治疗的疗法

直接抑制产甲烷菌的生长并从而治疗由高产甲烷菌量引起或与之有关的疾病或病状，或降低患有由高产甲烷菌量引起或与之有关的疾病或病状的可能性的疗法。

在各个实施方案中，一旦检测到高产甲烷菌量，就单独地或与治疗本文所述疾病或病状的已知疗法一起同时施用这些疗法。

在各个实施方案中，可为具有高于参考值的产甲烷菌量的受试者选择和/或施用一种抗生素或两种或更多种抗生素的组合。抗生素的实例包括但不限于氨基糖苷类(例如，阿米卡星(amikacin)、庆大霉素(gentamicin)、卡那霉素(kanamycin)、新霉素、奈替米星(netilmicin)、链霉素(streptomycin)、妥布霉素(tobramycin)、巴龙霉素(paromomycin))、安莎霉素类(ansamycins)(例如，格尔德霉素(geldanamycin)、除莠霉素(herbimycin))、碳头孢烯类(carbacephems)(例如，氯碳头孢(loracarbef))、碳青酶烯类(carbapenems)(例如，厄他培南(ertapenem)、多尼培南(doripenem)、亚胺培南(imipenem)、西司他丁(cilastatin)、美罗培南(meropenem))、头孢菌素类(cephalosporins)(例如，第一代：头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢唑啉(cefazolin)、头孢菌素(cefalotin)或头孢噻吩(cefalothin)、头孢氨苄(cefalexin)；第二代：头孢克洛(cefaclor)、头孢孟多(cefamandole)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢丙烯(cefprozil)、头孢呋辛(cefuroxime)；第三代：头孢克肟(cefixime)、头孢地尼(cefdinir)、头孢妥仑(cefditoren)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢泊肟(cefpodoxime)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢布烯(ceftibuten)、头孢唑肟(ceftizoxime)、头孢曲松(ceftriaxone)；第四代：头孢吡肟(cefepime)；第五代：头孢托罗(ceftobiprole))、糖肽类(例如，替考拉宁(teicoplanin)、万古霉素)、大环内酯类(macrolides)(例如，阿奇霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin)、地红霉素(dirithromycin)、红霉素(erythromycin)、罗红霉素(roxithromycin)、醋竹桃霉素(troleandomycin)、泰利霉素(telithromycin)、壮观霉素(spectinomycin))、单环内酰胺类(monobactams)(例如，氨曲南(aztreonam))、青霉素类(penicillins)(例如，阿莫西林(amoxicillin)、氨苄青霉素(ampicillin)、阿洛西林(azlocillin)、羧苄青霉素(carbenicillin)、氯唑西林(cloxacillin)、双氯青霉素(dicloxacillin)、氟氯西林(flucloxacillin)、美洛西林(mezlocillin)、甲氧西林(meticillin)、萘夫西林(nafcillin)、苯唑西林(oxacillin)、青霉素(penicillin)、哌拉西林(piperacillin)、替卡西林(ticarcillin))、抗生多肽类(例如，杆菌肽(bacitracin)、粘菌素(colistin)、多粘菌素b(polymyxin b))、喹诺酮类(quinolones)(例如，环丙沙星(ciprofloxacin)、依诺沙星(enoxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、曲伐沙星(trovafloxacin))、利福霉素类(rifamycins)(例如，利福平(rifampicin)或甲哌力复霉素(rifampin)、利福布汀(rifabutin)、利福喷丁(rifapentine)、利福昔明)、磺胺类(例如，甲磺灭脓(mafenide)、百浪多息(prontosil)、磺胺醋酰(sulfacetamide)、磺胺甲二唑(sulfamethizole)、氨苯磺胺(sulfanilamide)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、磺胺异噁唑(sulfisoxazole)、三甲氧苄二氨嘧啶(trimethoprim)、三甲氧苄二氨嘧啶-磺胺甲噁唑(复方新诺明(co-trimoxazole)，增效磺胺甲基异唑类(“tmp-smx”))和四环素类(tetracyclines)(例如，地美环素(demeclocycline)、强力霉素(doxycycline)、米诺环素(minocycline)、土霉素(oxytetracycline)、四环素)以及胂凡纳明(arsphenamine)、氯霉素(chloramphenicol)、氯洁霉素(clindamycin)、林可霉素(lincomycin)、乙胺丁醇、磷霉素(fosfomycin)、梭链孢酸(fusidic acid)、呋喃唑酮(furazolidone)、异烟肼(isoniazid)、利奈唑胺(linezolid)、甲硝唑、莫匹罗星(mupirocin)、硝基呋喃妥因(nitrofurantoin)、平板霉素(platensimycin)、吡嗪酰胺(pyrazinamide)、喹努普丁(quinupristin)/达福普汀(dalfopristin)组合和替硝唑(tinidazole)。

在各个实施方案中，选择或导向和/或施用的抗生素为利福昔明。选择、导向和/或施用的利福昔明疗法可为200-2400mg/剂，每天施用两次或三次。在各个实施方案中所述剂量可为约50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650或700mg/剂。在各个实施方案中，利福昔明疗法可每天施用1、2、3、4或5次。在各个实施方案中，所述疗法可施用5、7、10、14、15、20、21或28天。在各个实施方案中，所述疗法可在无治疗期后再次施用。

在各个实施方案中，选择和/或施用的抗生素为新霉素。选择、导向和/或施用的新霉素疗法可为500-1000mg/剂，每天施用两次。在各个实施方案中所述剂量可为约100、200、300、400、500、600、700、750、1000、1100、1200、1300、1400或1500mg/剂。在各个实施方案中，新霉素疗法可每天施用1、2、3、4或5次。在各个实施方案中，所述疗法可施用5、7、10、14、15、20、21或28天。在各个实施方案中，所述疗法可在无治疗期后再次施用。

在各个实施方案中，选择和/或施用的抗生素为万古霉素。选择、导向和/或施用的万古霉素疗法可为约125mg/剂，每天施用四次。在各个实施方案中所述剂量可为约50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450或500mg/剂。在各个实施方案中，万古霉素疗法可每天施用1、2、3、4或5次。在各个实施方案中，所述疗法可施用5、7、10、14、15、20、21或28天。在各个实施方案中，所述疗法可在无治疗期后再次施用。

在各个实施方案中，选择和/或施用的抗生素为甲硝唑。选择、导向和/或施用的甲硝唑疗法可为250-500mg/剂，每天施用三次。在各个实施方案中所述剂量可为约50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900或1000mg/剂。在各个实施方案中，甲硝唑疗法可每天施用1、2、3、4或5次。在各个实施方案中，所述疗法可施用5、7、10、14、15、20、21或28天。在各个实施方案中，所述疗法可在无治疗期后再次施用。

在各个实施方案中，选择、导向和/或施用的两种或更多种抗生素为利福昔明和新霉素。在各个实施方案中，选择、导向和/或施用的两种或更多种抗生素为利福昔明和甲硝唑。

特别有效的抗生素可为不可吸收的抗生素。不可吸收的抗生素的实例包括但不限于利福昔明、新霉素、杆菌肽、万古霉素、替考拉宁、雷莫拉宁(ramoplanin)和巴龙霉素(paramomycin)。

在一些实施方案中，选择和/或施用抑制产甲烷菌生长的益生菌剂，例如双岐杆菌(Bifidobacterium)或乳酸杆菌(Lactobacillus)种或菌株，例如嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、植物乳杆菌(L.plantarum)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、副干酷乳杆菌副干酷亚种(L.paracasei subsp.paracasei)或干酪乳杆菌代田株(L.casei Shirota)。抑制产甲烷菌生长的益生菌剂通常呈药学上可接受的可摄取制剂，例如呈胶囊施用，或对于一些受试者而言，消耗补充了接种物的食物是有效的，例如牛奶、酸奶、乳酪、肉或其它可发酵食物制剂。这些益生菌剂可抑制产甲烷菌的生长，例如通过与产甲烷菌竞争生长并因此减少或抑制产甲烷菌的生长。

在各个实施方案中，选择、导向和/或施用的疗法可为低热量饮食。这对患有或易患肥胖、超重的受试者或患有或易患前期糖尿病、糖尿病、II型糖尿病、胰岛素抗性、葡萄糖耐受不良、高血糖，或患高脂血症或高胆固醇的受试者可特别有益。

在各个实施方案中，选择、导向和/或施用的疗法可为低脂饮食。发明人的研究表明产甲烷菌生长在脂肪的存在下增加。因此，低脂饮食可抑制产甲烷菌的生长并治疗由高产甲烷菌水平引起或与之有关的疾病或病状，或降低患这些疾病或病状的可能性。

在各个实施方案中，选择、导向和/或施用的疗法可为要素饮食。也称为“要素饮食”的可食性全肠内营养(TEN)制剂可商购获得，例如商品名为

T.E.N.(山德士公司，明尼阿波利斯市，明尼苏达州(Sandoz Nutrition,Minneapolis,MN))及其变体等。有用的全肠内营养制剂满足受试者的所有营养需要，含有游离氨基酸、碳水化合物、脂质和所有必需维生素和矿物质，但是呈易于在上胃肠道吸收的形式，从而剥夺产甲烷菌先前用于增殖的至少一些营养物的营养素或使产甲烷菌对先前用于增殖的至少一些营养物的营养素“饥饿”。从而，抑制产甲烷菌生长。

在各个实施方案中，选择、导向和/或施用的疗法可为甲烷生成的选择性抑制剂，例如莫能菌素(monensin)或他汀(HMG-CoA还原酶抑制剂)。他汀可选择性抑制产甲烷菌的生长，不会明显抑制非产甲烷菌的生长。他汀的实例包括但不限于阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。他汀可商购获得，诸如洛伐他汀(MEVACOR)、洛伐他汀缓释剂(ALTOPREV)、普伐他汀(PRAVACHOL)、辛伐他汀(ZOCOR)、氟伐他汀(LESCOL)、氟伐他汀24-小时(LESCOL XL)、阿托伐他汀(LIPITOR)、瑞舒伐他汀(CRESTOR)、匹伐他汀(LIVALO))。

可选择和/或施用治疗由高产甲烷菌水平引起或与之有关的疾病或病状的疗法

在各个实施方案中，一旦检测到高产甲烷菌量，治疗所述疾病或病状的这些疗法就可单独地或连同如本文所述直接抑制产甲烷菌的生长的疗法一起施用。

剂量和治疗方案可如生产商为指定疾病或病状所指定那样。

在各个实施方案中，选择、导向和/或施用的疗法可为减肥药。减肥药的实例包括但不限于苯丁胺、苯丁胺/托吡酯、赛尼可、氯卡色林和利莫那班。

在各个实施方案中，选择、导向和/或施用的疗法可为治疗前期糖尿病、糖尿病、II型糖尿病、胰岛素抗性、葡萄糖耐受不良或高血糖症的药物或组合药物。药物的实例包括但不限于α-葡糖苷酶抑制剂、糊精类似物、二肽基肽酶-4抑制剂、GLP1激动剂、美格列奈、磺酰脲、双胍、噻唑烷二酮(TZD)和胰岛素。药物另外的实例包括溴隐亭和考来维仑。α-葡糖苷酶抑制剂的实例包括但不限于阿卡波糖和米格列醇。糊精类似物的实例为普兰林肽。二肽基肽酶-4抑制剂的实例包括但不限于沙格列汀、西他列汀、维格列汀、利拉利汀和阿格列汀。GLP1激动剂的实例包括但不限于利拉鲁肽、艾塞那肽、艾塞那肽缓释剂。美格列奈的实例包括但不限于那格列奈和瑞格列奈。磺酰脲的实例包括但不限于氯磺丙脲、格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、妥拉磺脲和甲苯磺丁脲。双胍的实例包括但不限于二甲双胍、欧米特(Riomet)、格华止(Glucophage)、格华止XR、格华止(Glumetza)。噻唑烷二酮的实例包括但不限于罗格列酮和匹格列酮。胰岛素的实例包括但不限于门冬胰岛素、地特胰岛素、甘精胰岛素、赖谷胰岛素和赖脯胰岛素。组合药物的实例包括但不限于格列吡嗪/二甲双胍、格列本脲/二甲双胍、匹格列酮/格列美脲、匹格列酮/二甲双胍、瑞格列奈/二甲双胍、罗格列酮/格列美脲、罗格列酮/二甲双胍、沙格列汀/二甲双胍、西他列汀/辛伐他汀、西他列汀/二甲双胍、利拉利汀/二甲双胍、阿格列汀/二甲双胍和阿格列汀/匹格列酮。

在各个实施方案中，选择、导向和/或施用的疗法是治疗高脂血症。此类疗法的实例包括但不限于他汀(例如，洛伐他汀(MEVACOR)、洛伐他汀缓释剂(ALTOPREV)、普伐他汀(PRAVACHOL)、辛伐他汀(ZOCOR)、氟伐他汀(LESCOL)、氟伐他汀24-小时(LESCOL XL)、阿托伐他汀(LIPITOR)、瑞舒伐他汀(CRESTOR)、匹伐他汀(LIVALO))、他汀组合产品(例如，洛伐他汀/烟酸(niacin)缓释剂(ADVICOR)、辛伐他汀/烟酸缓释剂(SIMCOR)、辛伐他汀/依替米贝(ezetimibe)(VYTORIN)、阿托伐他汀/氨氯地平(amlodipine)(CADUET)、辛伐他汀/西他列汀(JUVISYNC))、胆汁酸螯合剂(例如，考来替泊(colestipol)(COLESTID)、消胆胺树脂(例如，PREVALITE、QUESTRAN)、考来维仑(colesevelam)(WELCHOL))、2-氮杂环丁酮(吸收抑制剂)(例如，依替米贝(ZETIA))、贝特类(fibrates)(例如，非诺贝特(fenofibrate)(TRICOR、TRIGLIDE、FENOGLIDE、LIPOFEN、ANTARA、LOFIBRA)、吉非贝齐(gemfibrozil)(LOPID)、非诺贝特酸(fenofibric acid)(FIBRICOR、TRILIPIX))、烟酸(例如，烟酸(NIASPAN、SLO-NIACIN、烟酸ER))、ω3-脂肪酸类(例如，ω3-脂肪酸(LOVAZA)、二十碳五烯酸乙酯E-EPA(VASCEPA)和洛美他派(lomitapide)(JUXTAPID)。

在各个实施方案中，选择、导向和/或施用的疗法是治疗便秘。此类疗法的实例包括但不限于轻泻药、饮食、鸟苷酸环化酶C激动剂、血清素激动剂和氯通道激动剂。鸟苷酸环化酶C激动剂的实例为利那洛肽。血清素激动剂的实例包括普卢卡必利和替加色罗。氯通道激动剂的实例包括鲁比前列酮。

在各个实施方案中，选择、导向和/或施用的疗法是治疗脂肪肝。此类疗法的实例为二甲双胍。

可选择和/或施用以直接或间接治疗由低产甲烷菌量或无可检测的产甲烷菌引起或与之有关的疾病或病状的疗法

在各个实施方案中，一旦检测到低产甲烷菌量或未测定到可检测的产甲烷菌，直接促进产甲烷菌生长或直接提供产甲烷菌定殖的这些疗法就可单独地或与治疗这些疾病或病状的已知疗法一起同时施用。

在各个实施方案中，选择、导向和/或施用的疗法是治疗克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、显微镜性结肠炎、营养不良、吸收不良和/或再喂食综合征。此类疗法的实例为施用产甲烷菌。在各个实施方案中，产甲烷菌来自于甲烷短杆菌属。在甲烷短杆菌的实例中包括但不限于酸性甲烷短杆菌、嗜树木甲烷短杆菌、弯曲甲烷短杆菌、有表皮甲烷短杆菌(M.cuticularis)、丝状甲烷短杆菌、戈特氏甲烷短杆菌(M.gottschalkii)、米勒斯科甲烷短杆菌(M.millerae)、奥蕾氏甲烷短杆菌(M.olleyae)、口腔甲烷短杆菌、瘤胃甲烷短杆菌、史氏甲烷短杆菌、陶尔甲烷短杆菌(M.thaueri)、沃斯甲烷短杆菌(M.woesei)和沃丽尼甲烷短杆菌(M.wolinii)。在某些实施方案中，所述甲烷短杆菌为史氏甲烷短杆菌(M.Smithii)。

药物组合物和施用途径

在各个实施方案中，本发明提供了包含药学上可接受的赋形剂连同治疗有效量的本文所述的治疗剂的药物组合物。

“药学上可接受的赋形剂”意指用于制备通常安全、无毒且合乎需要的药物组合物的赋形剂，并且包括可接受供兽医使用以及人制药用途的赋形剂。此类赋形剂可为固体、液体、半固体，或在气溶胶组合物的情况下，为气态。

在某些实施方案中，本发明的治疗剂可含有一个或多个酸性官能团并且，因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。如本文所用的术语“药学上可接受的盐、酯、酰胺和前药”是指那些在合理医疗判断的范围内，适合接触患者组织使用，无异常毒性、刺激、变态反应等，与合理的效益/风险比相称，并且对本发明化合物的预期用途有效的本发明化合物的羧酸盐、氨基酸加成盐、酯、酰胺和前药。术语“盐”是指本发明化合物相对无毒的无机和有机酸加成盐。这些盐可在化合物最终分离和纯化期间原位制备或通过单独地使呈其游离碱形式的纯化化合物与适合的有机或无机酸反应并且分离这样形成的盐制备。这些可包括基于碱金属和碱土金属例如钠、锂、钾、钙、镁等的阳离子，以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等(参见，例如，Berge S.M.等人(1977)药学科学杂志(J.Pharm.Sci.)66,1，其以引用方式并入本文)。

术语“药学上可接受的酯”是指本发明化合物相对无毒的酯化产物。这些酯可在化合物最终分离和纯化期间原位制备，或通过单独地使呈其游离酸形式的纯化化合物或羟基与适合的酯化剂反应制备。可在催化剂的存在下经由用醇的处理将羧酸转化为酯。术语进一步旨在包括能够在生理条件下溶剂化的低级烃基，例如烷基酯、甲酯、乙酯和丙酯。

如本文中所用，“药学上可接受的盐或前药”是在合理医疗判断的范围内，适合接触受试者组织使用，无异常毒性、刺激、变态反应等，与合理的效益/风险比相称，并且对其预期用途有效的盐或前药。

术语“前药”是指在体内迅速转化以产生如本文公开的一种或多种功能活性化合物或其突变体、变体、类似物或衍生物的化合物。下述文献提供了全面讨论：T.Higachi和V.Stella，“作为新型递送系统的前体药物”，A.C.S.研讨会文集第14卷(T.Higachi andV.Stella,“Pro-drugs as Novel Delivery System”,Vol.14of the A.C.S.SymposiumSeries)，和在生物可逆性载体:药物设计，Edward B.Roche编，美国医药协会和帕加马出版社,1987(Bioreversible Carriers:Drug Design,ed.Edward B.Roche,AmericanPharmaceutical Association and Pergamon Press,1987)，二者特此以引用的方式并入。如本文中所用，前药是在体内施用后，代谢或以另外的方式转化为化合物的生物、药学或治疗活性形式的化合物。如本文公开的一种或多种化合物或其突变体、变体、类似物或衍生物的前药可设计为改变如本文公开的一种或多种化合物或其突变体、变体、类似物或衍生物的代谢稳定性或转运特征，以掩盖副作用或毒性，改善化合物的味道或改变化合物的其它特征或性质。凭借对药效学过程和体内药物代谢的了解，一旦有如本文公开的一种或多种化合物或其突变体、变体、类似物或衍生物的药物活性形式，制药领域的技术人员通常就可设计所述化合物的前药(参见，例如，Nogrady(1985)药物化学：一种生物化学方法，牛津大学出版社，纽约，第388-392页(Nogrady(1985)Medicinal Chemistry ABiochemicalApproach，Oxford University Press,N.Y.pages388-392))。例如，在“前体药物设计”，H.Bundgaard编，Elsevier出版公司,1985(“Design of Prodrugs,”ed.H.Bundgaard,Elsevier,1985)中描述了选择和制备适合前药的常规程序。前药的适合实例包括相应酸的甲酯、乙酯和甘油酯。

在各个实施方案中，根据本发明所述的药物组合物可配制成经由任何施用途径递送。“施用途径”可指本领域已知的任何施用途径，包括但不限于气溶胶、鼻腔、口腔、经粘膜、透皮或肠胃外。

“透皮”施用可使用局部用乳霜或软膏或通过透皮贴片的方式实现。

“肠胃外”是指通常与注射相关的施用途径，包括眶内、输注、动脉内、囊内、心内、真皮内、肌内、腹膜内、肺内、脊柱内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、经粘膜或经气管。经由肠胃外途径，所述组合物可呈用于输注或注射的溶液或混悬液，或呈冻干粉。供肠胃外使用的组合物可呈单位剂型(例如，呈单剂量安瓿)，或在容纳几个剂量的小瓶中提供并且其中可添加适合的防腐剂(参见下文)。

所述组合物可呈溶液、混悬液、乳液的形式，在输注装置或供植入的递送装置中，或可作为干粉呈现以在使用之前用水或另一种适合媒介物复水。除活性剂外，所述组合物可包含适合的肠胃外可接受的载体和/或赋形剂。活性剂可并入供控释的微球、微胶囊、纳米颗粒、脂质体等中。此外，所述组合物可包含悬浮剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂、张力调节剂和/或分散剂。

如上所指出，根据本发明所述的药物组合物可呈适于无菌注射的形式。为制备此类组合物，将适合活性剂溶于或悬浮于肠胃外可接受的液体媒介物中。可采用的可接受媒介物和溶剂为水，通过添加适量盐酸、氢氧化钠或适合缓冲液、1,3-丁二醇、林格氏液(Ringer’s solution)、右旋糖溶液和等渗氯化钠溶液将水调节至适合pH。水性制剂也可含有一种或多种防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)。在其中一种化合物仅少量或微溶于水的情况下，可添加溶解增强剂或增溶剂，或所述溶剂可包括10-60％w/w的丙二醇等。

在所述组合物中也可存在润湿剂、乳化剂和润滑剂，诸如硫酸月桂酯钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。

药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

经由肠内途径，药物组合物可呈片剂、凝胶胶囊、糖衣片剂、糖浆剂、混悬剂、溶液、粉剂、粒剂、乳液、允许控释的微球或纳米球或脂质囊泡或聚合物囊泡的形式。经由肠胃外途径，组合物可呈输注或注射用溶液或混悬剂的形式。

经由局部途径，基于根据本发明化合物的药物组合物可配制成永远治疗皮肤和粘膜，并且呈软膏、乳霜、乳剂、油膏剂、粉剂、浸渍垫、溶液、凝胶剂、喷雾剂、洗剂或混悬剂的形式。它们也可以呈允许控释的微球或纳米球或脂质囊泡或聚合物囊泡或聚合物贴片和水凝胶的形式。这些局部途径组合物可根据临床适应征呈无水形式或呈水性形式。

经由眼部途径，它们可以呈滴眼液的形式。

根据本发明所述的药物组合物也可含有任何药学上可接受的载体。如本文所用的“药学上可接受的载体”是指在所关注的化合物从身体的一钟组织、器官或部分携带或转运到身体的另一组织、器官或部分时涉及到的药学上可接受的材料、组合物或媒介物。例如，载体可以是液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料或其组合。载体的每种组分必须是“药学上可接受的”，因为它必须与制剂的其它成分相容。它还必须适合与其可接触的任何组织或器官接触使用，也就是说，它不得带有毒性、刺激、变态反应、免疫原性或过分超出其治疗益处的任何其它并发症的风险。

根据本发明所述的药物组合物也可经封装、压片或制备成乳液或糖浆剂以供口服施用。可添加药学上可接受的固体或液体载体以增强或稳定组合物，或有利于组合物的制备。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、甘油、盐水、醇和水。固体载体包括淀粉、乳糖、硫酸钙、二水合物、石膏粉、硬脂酸镁或硬脂酸、滑石、果胶、阿拉伯树胶、琼脂或明胶。载体还可包括缓释材料，诸如单独的或与蜡一起的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

药物制剂按照药剂学常规技术制备，涉及对于片剂而言必要时的碾磨、混合、造粒和压片；或对于硬明胶胶囊形式而言的碾磨、混合和填充。当使用液体载体时，制剂将呈糖浆、酏剂、乳剂或水性或非水性混悬剂的形式。此类液体制剂可直接口服或填充到软明胶胶囊中。

根据本发明所述的药物组合物可按治疗有效量递送。精确的治疗有效量是将在给定受试者中就治疗功效而言产生最有效结果的组合物的量。该量将根据各种因素而变化，包括但不限于治疗性化合物的特征(包括活性、药代动力学、药效学和生物利用率)、受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、总体身体状况、对给定剂量的反应和药剂类型)、制剂中药学上可接受的一种或多种载体的性质以及施用途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验确定治疗有效量，例如通过监测受试者对化合物施用的反应并相应地调整剂量。对于另外的指导，参见雷明顿:药学科学与实践(Gennaro编，第20版，Williams&Wilkins PA出版社,USA)(2000)(Remington:The Science and Practice ofPharmacy(Gennaro ed.，20th edition，Williams&Wilkins PA,USA)(2000))。

在使用已知的治疗性化合物时治疗剂的治疗有效量的典型剂量可在生产商推荐的范围内，并且也如通过体外反应或在动物模型中的反应对技术人员所示。此类剂量在浓度或量上通常可降低最多约一个数量级而不丧失相关生物活性。因此，实际剂量可取决于医师的判断、患者的状况和基于的治疗方法的有效性。

测量产甲烷菌或产甲烷菌互养微生物

在各个实施方案中，基于扩增的测定可用于测量产甲烷菌量或产甲烷菌互养微生物的量。在此类基于扩增的测定中，核酸序列在扩增反应(例如，聚合酶链式反应(PCR))中起模板的作用。在定量扩增中，扩增产物的量将与原始样本中模板的量成比例。与适当对照，例如健康样本的比较，提供了对产甲烷菌量的度量。

“定量”扩增的方法为本领域的技术人员公知。例如，定量PCR涉及使用相同引物同时共同扩增已知量的对照序列。这样提供了可用于校准PCR反应的内标。在Innis等(1990)PCR方法,方法指导与应用,学术出版社，纽约(Innis，et al(1990)PCR Protocols,A Guideto Methods and Applications,Academic Press,Inc.N.Y.)中提供了定量PCR的详细方法。在Ginzonger等(2000)癌症研究60:5405-5409(Ginzonger,et al.(2000)CancerResearch 60:5405-5409)中描述了使用定量PCR分析测量微卫星基因座处的DNA拷贝数。基因的已知核酸序列足以使得本领域中的技术人员能够常规地选择引物以扩增基因的任何部分。荧光定量PCR也可用于本发明的方法中。在荧光定量PCR中，定量是基于荧光信号，例如TaqMan和sybr green的量。

其它适合的扩增方法包括但不限于连接酶链式反应(LCR)(参见Wu和Wallace(1989)基因组学4:560(Wu and Wallace(1989)Genomics 4:560)，Landegren等(1988)科学241:1077(Landegren et al(1988)Science 241:1077)，和Barringer等(1990)基因89:117(Barringer et al.(1990)Gene 89:117))、转录扩增(Kwoh等(1989)美国科学院院刊86:1173(Kwoh et al(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173))、自我持续序列复制(Guatelli等(1990)美国科学院院刊87:1874(Guatelli et al.(1990)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 87:1874))、斑点PCR和接头适配子PCR等。

在本文提供的方法的还有其它实施方案中，进行单独核酸分子(或其扩增产物)的测序。在一个实施方案中，可使用在测序之前分离核酸分子群体中单个的核酸分子的高通量平行测序技术。此类策略可使用所称的“下一代测序系统”，包括但不限于本领域公知的测序仪和/或策略，诸如由Illumina/Solexa(基因组分析仪；Bennett等(2005)药物基因组学,6:373-20 382(Bennett et al.(2005)Pharmacogenomics,6:373-20 382))、AppliedBiosystems公司(SOLiD测序仪；网址为solid.appliedbiosystems.com)、Roche公司(例如，454GS FLX测序仪；Margulies等(2005)自然,437:376-380(Margulies et al(2005)Nature,437:376-380)；美国专利第6,274,320、6,258,568、6,210,891号)、来自于HelicosBiosciences公司的Heliscope^TM系统(参见，例如美国专利申请公布第2007/0070349号)等开发的测序仪和/或策略。也可使用其它测序策略诸如随机测序(例如，由Oxford Nanopore公司开发)，例如国际申请第PCT/GB2009/001690号(公开号WO/2010/004273)所述。

在本文提供的方法的还有其它实施方案中，可使用深度测序鉴定和量化产甲烷菌或产甲烷菌互养微生物。这些技术在本领域中已知。

核酸样本制备

A.核酸分离

源自来自于受试者的生物样本的可用于本发明方法中以测定产甲烷菌量的核酸样本可通过本领域中公知的方式制备。例如，外科手术或针刺活检抽吸可用于来自于受试者的生物样本。

在一个实施方案中，用于计算参考值的核酸样本取自该物种的至少1、2、5、10、20、30、40、50、100或200个不同生物。根据本发明的某些方面，如本发明方法中所用，“源自”基因组DNA的核酸可以是通过限制性酶消化和/或与其它核酸连接生成的基因组核酸的片段，和/或基因组核酸的扩增产物，或前信使RNA(前体mRNA)、前体mRNA的扩增产物，或在例如通过“鸟枪”克隆法生成的克隆载体中生成的基因组DNA片段。在某些实施方案中，基因组核酸样本经限制酶消化。

B.核酸的扩增

虽然核酸样本不需要包含扩增核酸，但是在一些实施方案中，可以需要和/或利用扩增的方式加工分离的核酸。来自于受试者的生物样本的基因组DNA样本任选地可使用限制性内切核酸酶片段化和/或在测定分析之前扩增。在一个实施方案中，使用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段。实践PCR的方法为本领域的技术人员公知。PCR的一个优点在于可使用少量DNA。例如，来自于受试者的生物样本的基因组DNA可为约150ng、175ng、200ng、225ng、250ng、275ng或300ng的DNA。

在本发明方法的某些实施方案中，使用单个引物对扩增来自于受试者的生物样本的核酸。例如，可用限制性内切核酸酶消化基因组DNA样本以生成基因组DNA的片段，然后将所述片段连接到引物对识别的适配子DNA序列上。在本发明方法的其它实施方案中，使用对产甲烷菌有特异性的成套引物对扩增来自于受试者的生物样本的核酸。此类成套引物对各自识别在基因侧面的基因组DNA序列，其中还要评估产甲烷菌检测或定量。适于杂交的DNA样本，例如可通过基因组DNA、基因组DNA片段、与适配子序列或克隆序列连接的基因组DNA片段的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得。本领域公知的计算机程序可用于具有所需特异性和最佳扩增性质的引物的设计，例如Oligo 5.0版(National Biosciences公司)。PCR方法在本领域中公知，并且例如在Innis等编，1990,PCR方法,方法指导与应用,学术出版社,圣地亚哥,加利福尼亚(Inniset al.,eds.，1990,PCR Protocols:AGuide to Methods AndApplications,Academic Press Inc.,San Diego,Calif)中有描述。对于本领域的技术人员显而易见的是受控机器人系统对分离和扩增核酸有用并且可以使用。

在其它实施方案中，其中使用限制性内切核酸酶片段化来自于受试者的生物样本的基因组DNA并且在分析之前扩增，所述扩增可包括克隆来自于受试者的生物样本的基因组DNA的区域。在此类方法中，DNA区域的扩增通过克隆方法实现。例如，表达载体可经工程化以表达大量的来自于受试者的生物样本的基因组DNA的特定片段(Sambrook和Russel，分子克隆:实验室手册第4版，冷泉港实验室出版社(冷泉港,纽约2012)(SambrookandRussel，Molecular Cloning:A Laboratory Manual 4^th ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press(Cold Spring Harbor,NY 2012)))。

还有其它实施方案中，其中使用限制性内切核酸酶片段化来自于受试者的生物样本的DNA并且在分析之前扩增，所述扩增包括表达来自于受试者的生物样本的编码基因的核酸，或基因和核酸的基因组侧翼区。然后分离包含包括内含子在内的整个转录产物的RNA(前信使RNA)并用于本发明方法中以分析和提供产甲烷菌量。在某些实施方案中，无需扩增。在此类实施方案中，可使用限制性内切核酸酶或其它方法片段化来自于受试者的生物样本的基因组DNA或前RNA。所得片段可与SNP探针杂交。通常，与扩增片段时所需DNA或前mRNA的量相比，需要分离更大量的DNA。例如，未扩增来自于受试者的生物样本的核酸时，用于杂交的来自于受试者的生物样本的DNA样本可为约400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng或1000ng DNA或更高。可选地，在其它实施方案中，使用需要极少量核酸进行分析的方法，例如少于400ng、300ng、200ng、100ng、90ng、85ng、80ng、75ng、70ng、65ng、60ng、55ng、50ng或更少，用于分子倒置探针(MIP)测定也如此。这些技术对分析临床样本，诸如石蜡包埋的福尔马林固定材料或小芯针刺活检特别有用，被表征为现成的，但是通常具有更少的DNA量(例如，小、片段化DNA)和/或不提供大量的核酸。

C.杂交

用于本发明方法中的源自来自于受试者的生物样本的核酸样本可与包含探针(例如，寡核苷酸探针)的阵列杂交以鉴定和/或量化产甲烷菌。在某些实施方案中，用于本发明方法中的探针包括可平铺在DNA芯片上的探针阵列(例如，SNP寡核苷酸探针)。在一些实施方案中，通过不包括检测经限制酶消化的核酸片段的尺寸变化的方法测定产甲烷菌。在其它实施方案中，分析SNP以鉴定或量化产甲烷菌。选择用于本发明方法中的杂交和洗涤条件，以致要通过本发明分析的核酸样本与阵列的互补寡核苷酸序列，优选与其互补DNA定位的特定阵列位点特异性结合或特异性杂交。在一些实施方案中，如例如在Affymetrix(昂飞)寡核苷酸阵列诸如在MIP测定中用于分析SNP的寡核苷酸阵列中所用，互补DNA可完全匹配或在一定程度上错配。阵列的单链合成寡脱氧核糖核酸DNA探针在与来自于受试者的生物样本的核酸样本接触之前可能需要变性，例如以去除由于自我互补序列形成的发夹或二聚体。

最佳杂交条件将取决于探针的长度和来自于受试者的生物样本的核酸样本的类型。在Sambrook和Russel，分子克隆:实验室手册第4版，冷泉港实验室出版社(冷泉港,纽约2012)(Sambrook and Russel，Molecular Cloning:A Laboratory Manual 4^th ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,NY 2012))；Ausubel等编，1989,分子生物学实验室指南，第1卷，格林出版联合公司,约翰威利出版社,纽约，第2.10.1-2.10.16页(Ausubel et al.，1989,Current Protocols in Molecules Biology，Vol.1，Green Publishing Associates,Inc.,John Wiley&Sons,Inc.,New York，at pp.2.10.1-2.10.16)中描述了对于核酸得特异性(即，严格)杂交条件的通用参数。在例如，Tijessen,1993,核酸探针杂交,爱思唯尔科学出版商(Tijessen,1993,Hybridization with NucleicAcid Probes,Elsevier Science Publishers B.V.)和Kricka,1992,非同位素DNA探针技术,学术出版社,圣地亚哥,加利福尼亚(Kricka,1992,Nonisotopic DNA ProbeTechniques,Academic Press,San Diego,Calif)中提供了示例性的有用杂交条件。

D.寡核苷酸核酸阵列

在本发明方法的一些实施方案中，包含互补序列的DNA阵列可用于评估产甲烷菌量。杂交可用于测定产甲烷菌的存在和/或量。采用寡核苷酸“探针”(即，具有确定序列的核酸分子)的各种形式的DNA阵列为本领域中技术人员公知。通常，将各自具有确定序列的一组核酸探针以使得每个不同探针固定到预定区域的方式固定在固体支撑物上。在某些实施方案中，该组探针在支撑物上形成定位可寻址的结合(例如，杂交)位点阵列。此类结合位点中的每一个包含与支撑物上预定区域结合的探针的多个寡核苷酸分子。更具体地，所述阵列的每个探针优选位于固体支撑物上的已知、预定位置，以致每个探针的身份(即，序列)可由其在阵列上(即，在支撑物或表面上)的位置测定。微阵列可按许多方式制成，本文描述了其中几种。然而生成的微阵列共有某些共性，其可再生，允许生成给定阵列的多个拷贝并且易于相互比较。

在某些实施方案中，微阵列由在结合(例如，核酸杂交)条件下稳定的材料制成。微阵列优选较小，例如介于约1cm²和25cm²之间，优选约1至3cm²。然而，也考虑到了较大和较小的阵列并且可优选用于，例如同时评价极大量的不同探针。可在支撑物上直接合成寡核苷酸探针以形成阵列。探针可附着于例如可由玻璃、塑料(例如，聚丙烯、尼龙(nylon))、聚丙烯酰胺、硝化纤维素、凝胶或其它多孔或无孔材料制成的固体支撑物或表面。该组固定探针或固定探针阵列与含有标记的核酸物种的样本接触，以便具有与固定探针互补的序列的核酸与探针杂交或结合。例如通过洗掉任何未结合的材料而分离之后，检测并测量结合的标记序列。测量通常经计算机辅助进行。使用DNA阵列测定，可分析标记核酸，例如源自基因组DNA的限制消化的核酸片段的复杂混合物。

在某些实施方案中，在本发明方法中使用高密度寡核苷酸阵列。这些含有成千上万个与表面上确定位置的确定序列互补的寡核苷酸的阵列可通过，例如光刻技术在表面上原位合成(参见，例如，Fodor等，1991,科学251:767-773；Pease等，1994,美国科学院院刊91:5022-5026；Lockhart等，1996,自然生物技术(Nature Biotechnology)14:1675；美国专利第5,578,832、5,556,752、5,510,270、5,445,934、5,744,305和6,040,138号)。使用用于原位寡核苷酸合成的喷墨技术生成阵列的方法在本领域中也已知(参见，例如，Blanchard，国际专利公布WO98/41531，1998年9月24日公开；Blanchard等，1996,生物传感器与生物电子学11:687-690(Blanchard et al.，1996,Biosensors And Bioelectronics 11:687-690)；Blanchard,1998，基因工程中合成DNA序列，第20卷，J.K.Setlow编,普莱纽姆出版社,纽约，第111-123页(Blanchard,1998，in Synthetic DNA Arrays in GeneticEngineering，Vol.20，J.K.Setlow,Ed.,Plenum Press,New York at pages111-123))。使核酸附着于表面的另一种方法是通过在玻璃板上印刷，总体上如Schena等所述(1995,科学270:467-470)。也可使用其它制备微阵列的方法，例如通过掩蔽(Maskos和Southern，1992,核酸研究20:1679-1684)。当使用这些方法时，直接在表面例如衍生化载玻片上合成已知序列的寡核苷酸(例如，15至60-mer)。生成的阵列有几个寡核苷酸分子冗余。

生成DNA阵列的寡核苷酸探针的一种示例性方法是通过例如使用N-膦酸酯或亚磷酰胺化学法合成合成性多核苷酸或寡核苷酸(Froehler等，1986,核酸研究14:5399-5407(Froehler et al.，1986,Nucleic Acid Res.14:5399-5407)；McBride等，1983,四面体快报24:246-248(McBride et al.，1983,Tetrahedron Lett.24:246-248))。合成序列长度通常介于约15和约600个碱基之间，更通常介于约20和约100个碱基之间，最优选长度介于约40和约70个碱基之间。在一些实施方案中，合成核酸包括非天然碱基，例如但决不限于肌苷。如上所述，核酸类似物可用作杂交的结合位点。适合的核酸类似物的实例为肽核酸(参见，例如，Egholm等，1993,自然363:566-568；美国专利第5,539,083号)。在替代实施方案中，杂交位点(即，探针)由与SNP或其补体相对应的基因组DNA区域的质粒或噬菌体克隆制成。本发明方法中使用的寡核苷酸探针的尺寸在长度上可为至少10、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。在本领域中公知虽然杂交对于互补序列有选择性，但是不完全互补的其它序列也可在一定水平上与给定探针杂交。因此，可使用具有略微变化的多个寡核苷酸探针优化样本的杂交。为进一步优化杂交，可通过本领域中公知的方法改变杂交严格条件，例如杂交温度和盐浓度。

在某些实施方案中，在本发明方法中使用包含与产甲烷菌相对应的寡核苷酸的高密度寡核苷酸阵列。

E.标记

在一些实施方案中，核酸样本、其片段或其用于本发明方法中的片段经可检测标记。例如，可检测标记可为荧光标记，例如通过并入核苷酸类似物。适合用于本发明的其它标记包括但不限于生物素、亚氨基生物素、抗原、辅因子、二硝基酚、硫辛酸、烯烃化合物、可检测多肽、富电子分子、能够通过作用于底物生成可检测信号的酶和放射性同位素。

放射性同位素包括可连同本发明方法使用的放射性同位素，但不限于³²P和¹⁴C。适合本发明的荧光分子包括但不限于荧光素及其衍生物、若丹明(rhodamine)及其衍生物、德克萨斯红(texas red)、5’羧基-荧光素(“FAM”)、2’,7’-二甲氧基-4’,5’-二氯-6-羧基-荧光素(“JOE”)、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基-若丹明(“TAMRA”)、6-羧基-X-若丹明(“ROX”)、HEX、TET、IRD40和IRD41。

适于根据本发明使用的荧光分子还包括：花青染料，包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3.5、CY5、Cy5.5、Cy7和FLUORX；BODIPY染料，包括但不限于BODIPY-FL、BODIPY-TR、BODIPY-TMR、BODIPY-630/650和BODIPY-650/670；及ALEXA染料，包括但不限于ALEXA-488、ALEXA-532、ALEXA-546、ALEXA-568和ALEXA-594；以及将为本领域的技术人员所已知的其它荧光染料。适于本发明的富电子指示剂分子包括但不限于铁蛋白、血蓝蛋白和胶体金。

也可使用双色荧光标记和检测方案(Shena等，1995，科学270:467-470)。两种或更多种标记的使用可用于检测归因于实验条件(例如，杂交条件)上的微小差异的变化。在本发明的一些实施方案中，可使用至少5、10、20或100种不同颜色的染料进行标记。这样标记也将允许发明所涵盖的同时分析本多种样本。

可用于本发明方法中的经标记核酸样本、其片段或其连接到适配子区域的片段在允许具有与探针互补的序列的样本核酸与之杂交的条件下与多个寡核苷酸探针接触。根据所用标记的类型，可使用本领域中技术人员公知的方法，包括但不限于X-射线胶片、磷光成像仪或CCD相机检测杂交信号。当使用荧光标记的探针时，优选可通过扫描共聚焦激光显微镜术检测在转录物阵列的每个位点的荧光发射。在一个实施方案中，对所用两个荧光团的每一个进行使用适当激发线的单独扫描。可选地，可使用允许在对两个荧光团特定的波长下同时照射样本的激光并且可同时分析来自于两个荧光团的发射(参见Shalon等(1996)基因组研究6,639-645(Shalon et al.(1996)Genome Res.6,639-645))。在一个优选实施方案中，用带有计算机控制X-Y工作台和显微镜物镜的激光荧光扫描仪扫描所述阵列。用多行、混合气体激光器实现两个荧光团的连续激发，并且按波长分离发射光并且用两根光电倍增管检测。例如在Schena等(1996)基因组研究6,639-645中描述了此类荧光激光扫描装置。可选地，可使用光纤束，例如Ferguson等(1996)自然生物技术14,1681-1684(Fergusonet al(1996)Nat.Biotech.14,1681-1684)所述的光纤束。然后可使用计算机软件分析所产生的信号以测定产甲烷菌量。

F.用于分析产甲烷菌量的算法

一旦检测到杂交信号，就可使用算法分析所得数据。在某些实施方案中，用于量化产甲烷菌的算法基于公知方法。

G.计算机执行系统和方法

在某些实施方案中，本发明的方法执行计算机程序以计算产甲烷菌量。例如，可使用计算机程序进行本文所述的算法。计算机系统也可存储并操作通过本发明方法生成的数据，所述数据包含在不同杂交测量中接近平衡期间的多个杂交信号变化/分布曲线并且可由计算机系统使用来执行本发明的方法。在某些实施方案中，计算机系统接收探针杂交数据；(ii)存储探针杂交数据；并且(iii)比较探针杂交数据以测定产甲烷菌的量。计算所述量是高于还是低于参考值。在一些实施方案中，计算机系统(i)将产甲烷菌量与阈值或参考值比较；并且(ii)输出所述产甲烷菌量是高于还是低于阈值或参考值的指示，或基于所述指示的疾病或病状的存在。在某些实施方案中，此类计算机系统也被视为本发明的一部分。

许多类型的计算机系统可用于根据生物信息学和/或计算机领域中技术人员具有的知识执行本发明的分析方法。例如，计算机程序能够用于执行本文描述的算法。计算机系统也能够储存和处理本发明的方法所产生的数据，所述数据包括接近不同杂交测量平衡过程中的多元化的信号改变/曲线，并且所述数据能够在执行本发明方法时被计算机系统使用。在某些实施方案中，计算机系统接收探针杂交数据；(ii)存储探针杂交数据；和(iii)比较探针杂交数据以确定产甲烷菌的量。计算产甲烷菌的量比参考值高还是低。在一些实施方案中，计算机系统(i)将产甲烷菌的量与阈值或参考值比较；和(ii)输出表征所述产甲烷菌的量是在阈值或参考值以上或以下的指示，或者输出基于所述指示的疾病或病况的存在。

根据生物信息学和/或计算机领域普通技术人员的知识，可以使用许多类型的计算机系统来执行本发明的分析方法。

在此类计算机系统的操作期间可将几个软件组件加载到存储器中。软件组件可包括本领域中标准的软件组件和本发明专用的组件(例如，在Lin等(2004)生物信息学(Bioinformatics)20,1233-1240中描述的dCHIP软件；在Silver等(2007)细胞128,991-1002中描述的CRLMM软件；在Richardson等(2006)癌细胞9,121-132中描述的AromaAffymetrix软件。也可在允许方程式符号条目和高级处理规范，包括要使用的特定算法的数学软件包中为本发明的方法编程或建模，从而使需要的用户自由地在程序上为单独的方程式和算法编程。此类包包括，例如来自于Mathworks公司的Matlab软件(纳蒂克,马萨诸塞州(Natick,Mass.))、来自于Wolfram Research公司的Mathematica软件(香槟区,伊利诺州(Champaign,Ill.))或来自于MathSoft公司的S-Plus软件(西雅图,华盛顿州(Seattle,Wash.))。在某些实施方案中，计算机包括永远存储杂交信号分布曲线的数据库。此类存储分布曲线可访问并用于计算产甲烷菌量。

在非限制性实例中，图23描绘了一种装置或一种计算机系统1000，其包括一个或多个处理器1300和存储用于通过所述一个或多个处理器1300执行的一个或多个程序1600的存储器1500。

在一些实施方案中，所述装置或计算机系统1000还可包括存储用于通过所述装置或计算机系统1000的所述一个或多个处理器1300执行的所述一个或多个程序1600的非暂时性计算机可读存储介质1700。

在一些实施方案中，所述装置或计算机系统1000还可包括一个或多个输入装置1100，其可配置为发送信息到来自以下组成的组的任一个或从中接收信息：外部装置(未示出)、所述一个或多个处理器1300、存储器1500、非暂时性计算机可读存储介质1700和一个或多个输出装置1900。

在一些实施方案中，所述装置或计算机系统1000还可包括一个或多个输出装置1900，其可配置为发送信息到来自以下组成的组的任一个或从中接收信息：外部装置(未示出)、所述一个或多个处理器1300、存储器1500和非暂时性计算机可读存储介质1700。

上述经识别模块或程序中的每一个与进行如本发明描述的功能的一组指令相对应。这些模块和程序(即，指令组)不需要作为单独的软件程序、工序或模块执行，并且因此在各个实施方案中这些模块的不同子集可合并或以其它方式重排。在一些实施方案中，存储器可存储上述识别的模块和数据结构的子集。此外，存储器可存储以上未描述的附加模块和数据结构。

说明的本公开的方面也可在分布计算环境中实践，其中某些任务由通过通信网络连接的远程处理装置进行。在分布计算环境中，程序模块可位于本地和远程存储装置中。

而且，应了解本文所述的各个组件可包括电路，其可包括具有为了执行本发明的实施方案的适合值的组件和元件。此外，应了解许多不同组件可在一个或多个集成电路(IC)芯片上实现。例如，在一个实施方案中，一组组件可在单个IC芯片上实现。在其它实施方案中，在单独IC芯片上制造或实现一个或多个各自的组件。

上面已经描述的包括本发明实施方案的实例。当然，不可能为了描述要求保护的主题的目的而描述组件或方法的每个可想到的组合，但是应了解本发明的许多其它组合和排列是可能的。因此，要求保护的主题旨在涵盖落入所附权利要求的精神和范围之内的所有此类改变、修改和变型。而且，以上对说明的本公开实施方案的描述，包括摘要中描述的内容，并非旨在详尽无遗或将公开的实施方案限于公开的精确形式。虽然为了说明的目的在本文中描述了具体实施方案和实例，但是正如相关领域中技术人员可认识到那样，被视为在此类实施方案和实例的范围内的各种修改是可能的。

具体而言并且关于通过上述组件、装置、电路、系统等进行的各种功能，除非另有说明，用于描述此类组件的术语旨在与进行所述组件(例如，功能等效件)的指定功能的任何组件相对应，即使在结构上与进行本文说明的要求保护的主题的示例性方面的功能的公开结构不等效。在这点上，还应认识到本发明包括一种系统以及具有进行要求保护的主题的各种方法的动作和/或事件的计算机可执行指令的计算机可读存储介质。

已经就几个组件/区块之间的相互作用描述了前述系统/电路/模块。应了解此类系统/电路和组件/区块可包括那些组件或指定子组件、一些指定组件或子组件和/或附加组件，并且依照前述的各种排列和组合。子组件也可作为与其它组件通信耦合的组件实现，而不是包括在父组件内(分级)。另外，应注意到一个或多个组件可组合成提供总体功能性的单个组件或分成几个单独的子组件，并且可提供任何一个或多个中间层，例如管理层，以与此类子组件通信耦合以便提供集成功能性。本文所述的任何组件也可与本文未具体描述但是本领域中技术人员已知的一个或多个其它组件相互作用。

另外，虽然仅关于几种实现方式之一公开了本发明的特定特征，但是此类特征可如对于任何给定或特定应用所期望和有利的那样，与其它实施方式的一种或多种其它特征结合。此外，就发明详述和权利要求中使用术语“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有”、“含有”、其变型和其它类似词语而言，这些术语旨在以与术语“包含”类似的方式为包容性，作为开放性承接词，不排除任何附加或其它要素。

如本申请中所用，术语“组件(component)”、“模块(module)”、“系统”等通常旨在指计算机有关实体，硬件(例如，电路)、硬件和软件的组合、软件，或与具有一种或多种特定功能性的作业机器有关的实体。例如，组件可以是但不限于在处理器(例如，数字信号处理器)上运行的进程、处理器、对象、可执行文件、执行线程、程序和/或计算机。举例而言，在控制器上运行的应用程序和控制器均为组件。一个或多个组件可留在进程和/或执行线程中并且组件可位于计算机上和/或分布于两个或更多个计算机之间。进一步地，“装置”可呈以下形式呈现：专门设计的硬件；通过在其上执行使得硬件能够进行特定功能的软件使其专用化的通用硬件；存储在计算机可读介质上的软件；或其组合。

而且，词“实例”或“示例性”在本文中用于指用作实例、例子或举例说明。本文描述为“示例性”的任何方面或设计不一定被解释为优先或优于其它方面或设计。相反，使用词“实例”或“示例性”旨在以具体方式提出概念。如本申请中所用，术语“或”旨在意为包容性“或”而非排他性“或”。即，除非另有说明或从上下文明确，“X采用A或B”旨在意指任何自然包容性排列。即，如果X采用A；X采用B；或X采用A和B，则在前述任何情况下均满足“X采用A或B”。另外，如本申请及所附权利要求中所用的冠词“一种”和“一个”除非另有说明或从上下文明确为针对单数形式，则通常应解释为意指“一个或多个”。

计算装置通常包括多种介质，其可包括计算机可读存储介质和/或通信介质，其中如下这两个术语在本文中相互不同地使用。计算机可读存储介质可以是计算机可访问的任何可用存储介质，通常具有非暂时性，并且可包括易失性和非易失性介质、可移动和不可移动介质。举例而言，而非限制，计算机可读存储介质可连同存储信息例如计算机可读指令、程序模块、结构化数据或非结构化数据的任何方法或技术一起实现。计算机可读存储介质可包括但不限于RAM、ROM、EEPROM、闪存或其它存储技术、CD-ROM、数字通用光盘(DVD)或其它光盘存储器、磁带盒、磁带、磁盘存储器或其它磁存储装置或可用于存储所需信息的其它有形和/或非暂时性介质。计算机可读存储介质可由一个或多个本地或远程计算装置，例如经由访问请求、查询或其它数据检索方法访问，以进行关于所述介质所存储的信息的多种操作。

另一方面，通信介质通常体现计算机可读指令、数据结构、程序模块或数据信号中的其它结构化或非结构化数据，数据信号可为暂时性诸如调制数据信号，例如载波或其它传送机制，并且通信介质包括任何信息传输或传送介质。术语“调制数据信号”或信号是指具有其特征集中的一种或多种或以编码一个或多个信号中的信息的方式变化的信号。举例而言，而非限制，通信介质包括有线介质，诸如有线网络或有线直接连接，和无线介质诸如声学、RF、红外和其它无线介质。

为了解释简单起见，将所述方法作为一系列动作进行描绘和描述。然而根据本公开的动作可按不同顺序和/或与本文未提出和描述的其它动作一起同时发生。此外，根据公开的主题执行所述方法并非可能需要说明的所有动作。另外，本领域中的技术人员将理解并且认识到所述方法可经由状态图或事件替代性地表示为一系列相互关联的状态。另外，应了解本说明书中公开的方法能够存储在制品上以利于将此类方法传送并转移到计算装置。术语制品，如本文中所用，旨在涵盖可从任何计算机可读装置或存储介质访问的计算机程序。

因此，本发明的一些实施方案提供了用于(1)诊断由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状，(2)诊断对由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状的易感性，和/或(3)为患有或怀疑患有由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状的受试者选择、导向一种疗法的计算机实现的方法，其包括：在具有一个或多个处理器和存储用于通过所述一个或多个处理器执行的一个或多个程序的存储器的装置上，所述一个或多个程序包括实施本文所述方法的指令。

本发明的一些实施方案提供了用于(1)诊断由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状，(2)诊断对由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状的易感性，和/或(3)为患有或怀疑患有由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状的受试者选择、导向一种疗法的计算机系统，其包括：一个或多个处理器；和存储一个或多个程序的存储器，所述一个或多个程序包括进行本文所述方法的指令。

本发明的一些实施方案提供了存储用于(1)诊断由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状，(2)诊断对由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状的易感性，和/或(3)为患有或怀疑患有由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状的受试者选择、导向一种疗法的一个或多个程序的非暂时性计算机可读存储介质，所述一个或多个程序用于通过计算机系统(诸如上述计算机系统)的一个或多个处理器执行，所述一个或多个程序包含进行本文所述方法的指令。

检测氢量和甲烷量

在各个实施方案中，可经由呼气试验检测和分析氢量和甲烷量(例如，P.Kerlin和L.Wong,检测小肠细菌过度生长的呼氢实验,胃肠病学杂志95(4):982-88[1988](P.Kerlinand L.Wong,Breath hydrogen testing in bacterial overgrowth of the smallintestine,Gastroenterol.95(4):982-88[1988])；A.Strocchi等，对低剂量碳水化合物吸收障碍的检测:各种H₂标准的准确性,胃肠病学杂志105(5):1404-1410[1993](A.Strocchiet al.，Detection of malabsorption of low doses of carbohydrate:accuracy ofvarious breath H₂ criteria,Gastroenterol.105(5):1404-1410[1993])；D.deBoissieu等，[1996]；P.J.Lewindon等，囊胞性纤维症中的肠功能障碍:呼吸试验的重要性,儿科与儿童健康杂志34(1):79-82[1998](D.de Boissieu et al.，[1996]；P.J.Lewindonet al.，Bowel dysfunction in cystic fibrosis:importance of breath testing,J.Paedatr.Child Health 34(1):79-82[1998]))。呼气氢或呼气甲烷试验基于在胃肠道内发现的许多专性或兼性发酵细菌在某些情况下生成可检测量的作为来自于宿主所消耗底物的发酵产物的氢或甲烷的事实。底物包括糖类诸如乳果糖、木糖、乳糖或葡萄糖。然后在小肠内生成的氢或甲烷进入宿主的血流并且被逐渐呼出。

通常，在整夜禁食后，患者吞服控制量的糖，诸如乳果糖、木糖、乳糖或葡萄糖，并且以频繁的时间间隔，通常每10至15分钟取呼气样本持续2至4小时的时期。通过气相色谱法或通过其它适合技术，单独地或组合分析样本。

检测氢量和甲烷量的另一种方法是通过气相色谱法与质谱法和/或放射检测以测量在施用经胃肠道细菌代谢，但是人宿主不易消化的同位素标记底物，诸如乳果糖、木糖、甘露糖醇或脲后同位素标记的二氧化碳、甲烷或氢的呼气排放量(例如，G.R.Swart和J.W.van den Berg，肠胃病治疗中¹³C呼吸试验，美国肠胃病学杂志[增刊]225:13-18[1998](G.R.Swart and J.W.van den Berg，¹³C breath test in gastrointestinal practice，Scand.J.Gastroenterol.[Suppl.]225:13-18[1998])；S.F.Dellert等，诊断儿童小肠细菌过度生长的¹³C-木糖呼吸试验，肠胃营养与儿科学杂志.25(2):153-58[1997](S.F.Dellertet al.，The ¹³C-xylose breath test for the diagnosis of small bowel bacterialovergrowth in children，J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.25(2):153-58[1997])；C.E.King和P.P.Toskes，诊断小肠细菌过度生长的呼吸试验，实验室科学评论21(3):269-81[1984](C.E.King and P.P.Toskes，Breath tests in the diagnosis of smallintestinal bacterial overgrowth，Crit.Rev.Lab.Sci.21(3):269-81[1984]))。不易消化的底物是在人中对其吸收或对其酶降解或分解代谢而言，能力相对或绝对缺乏的底物。

适合的同位素标记包括¹³C或¹⁴C。为了测量甲烷，适合的同位素标记也可包括²H和³H或¹⁷O和¹⁸O，只要底物用同位素标记合成，同位素标记置于底物结构中代谢适合的位置，即肠道微生物群落的酶促生物降解导致同位素标记被隔绝在气态产物中的位置。如果所选同位素标记为放射性同位素，诸如¹⁴C、³H或¹⁵O，则呼气样本可通过气相色谱法与适合的放射检测方式分析(例如，C.S.Chang等，采用肠排空率进行校正后检测小肠细菌过度生长的碳-14D-木糖呼吸试验的准确性得到提高，欧洲核医学杂志22(10):1118-22[1995](Increasedaccuracy of the carbon-14D-xylose breath test in detecting small-intestinalbacterial overgrowth by correction with the gastric emptying rate，Eur.J.Nucl.Med.22(10):1118-22[1995])；C.E.King和P.P.Toskes，对小肠细菌过度生长的患者进行的1-克[补充14C]木糖,10-克乳果糖-H₂,和80-克葡萄糖-H₂的比较，胃肠病学杂志91(6):1447-51[1986](C.E.King and P.P.Toskes，Comparison of the 1-gram[.sup.14C]xylose,10-gram lactulose-H₂,and 80-gram glucose-H₂ breath tests inpatients with small intestine bacterial overgrowth，Gastroenterol.91(6):1447-51[1986])；A.Schneider等人，对小肠细菌过度生长的患者进行的补充14C-D-木糖呼吸试验的值，消化32(2):86-91[1985](A.Schneider et al.，Value of the.sup.14C-D-xylosebreath test in patients with intestinal bacterial overgrowth，Digestion 32(2):86-91[1985]))。

试剂盒

本发明还涉及用于确定、选择和/或治疗本文所述疾病或病状的试剂盒。所述试剂盒是包括至少一种发明组合物在内的材料或组分的集合。因此，在一些实施方案中试剂盒装有如上所述，包括治疗剂的组合物。在其它实施方案中，试剂盒装有用于量化产甲烷菌或产甲烷菌互养微生物的引物。

在本发明试剂盒中配置的组分的确切性质取决于其预期目的。在一个实施方案中，试剂盒特别配置成用于治疗哺乳动物受试者的目的。在另一个实施方案中，试剂盒特别配置成用于治疗人受试者的目的。在另外的实施方案中，试剂盒配置成用于兽医应用，治疗诸如但不限于农场动物、家养动物和实验室动物的受试者。

试剂盒内可包括使用说明书。“使用说明书”通常包括描述用于使用试剂盒的组分实现所需结果，诸如量化产甲烷菌或产甲烷菌互养微生物，或抑制产甲烷菌或产甲烷菌互养微生物的生长，或治疗由产甲烷菌或产甲烷菌互养微生物引起或与之相关的疾病或病状的技术的有形表达。任选地，试剂盒还装有其它有用组分，诸如稀释剂、缓冲液、药学上可接受的载体、注射器、导管、涂药器、移液或测量工具、绷带材料或如易于为本领域中技术人员认识到的其它有用附件。

以保持其可操作性和实用性的任何便利和适合方式储存的在试剂盒中组装的材料或组分可提供给从业者。例如组分可以呈溶解、再水合或冻干形式；它们可在室温、冷藏或冷冻温度下提供。组分通常装在合适的包装材料中。如本文所用，短语“包装材料”是指用于容纳试剂盒内容物，诸如本发明组合物等的一种或多种物理结构。包装材料通过公知的方法构造，优选地提供无菌、无污染的环境。如本文所用，术语“包装”是指能够容纳各个试剂盒组分的适合的固体基质或材料，诸如玻璃、塑料、纸张、箔等。包装材料通常具有外部标签，其指明试剂盒的内容物和/或目的和/或其组分。

实施例

提供以下实施例是为了更好地说明要求保护的发明而不得解释为限制本发明的范围。就提到的特定材料来说，仅仅是为了说明的目的而非旨在限制本发明。本领域的技术人员可开发等效方法或反应物，无需实践发明能力和背离本发明的范围。

实施例1

患者纳入和排除标准

研究经发明人的伦理审查委员会批准，并且从所有参与者获得知情同意。引见进行乳果糖呼气试验的18-65岁的连续Rome II阳性IBS受试者符合研究条件。如果患者具有以下任一种，则将其排除：腹部手术史诸如肠切除(除胆囊切除术或阑尾切除术外)、已知肠道病症诸如炎症性肠病、腹腔粘连、直肠周或肠瘘、不稳定性甲状腺疾病、糖尿病、癌症、HIV、妊娠、使用已知会影响肠运动性的药剂诸如麻醉剂、易蒙停(imodium)和替加色罗，或在过去1个月内使用抗生素。

呼气和粪便样本的收集

首先让所有患者完成肠症状调查表以便基于如先前所确认的C-D VAS评分确定便秘至腹泻的相对程度[13]。然后受试者接受乳果糖呼气试验(LBT)。作为LBT的一部分，在基线呼气样本后让受试者摄取10g于溶液中的口服乳果糖(Pharmaceutical Associates,Inc.,Greenville,SC)。乳果糖是不被人消化，但是可被肠道菌群利用的多糖。然后在乳果糖摄取之后每15分钟获得重复呼气样本，直至180分钟，并且使用气相色谱法(Quintroninstrument company,Milwaukee,WI)分析甲烷和氢的水平。如先前所公开[5,13]，将阳性甲烷呼气试验定义为呼气甲烷水平≥3ppm。使用问卷和呼气试验结果，选择在呼气分析中具有甲烷和便秘为主型IBS的受试者。对照组包括具有任何形式的IBS，呼气试验中对甲烷的试验不呈阳性的受试者。呼气试验完成后，为所有受试者提供粪便容器和关于如何收集粪便样本的说明书。患者返回粪便样本，将粪便在收集24小时内新鲜冷冻。

粪便PCR试验

从每份粪便样本，使用QIAamp PCR试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)提取细菌DNA。用先前公开的通用16S rDNA引物的PCR(Eppendorf mastercycler gradient)用于检测粪便中总细菌的存在。使用仅对史氏甲烷短杆菌有特异性的rpoB基因引物对相同粪便样本进行定量PCR(表1)。另外，还使用通用引物进行定量PCR以测定总细菌计数(表1)。

表1：用于检测粪便中的细菌DNA的各种PCR引物

生物	靶标	引物(5’-3’)	扩增子大小	SEQ ID NO
					通用	16S rDNA	TCCTACGGGAGGCAGCAGT	466bp	1
		GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT		2
					史氏甲烷短杆菌	rpoB	AAGGGATTTGCACCCAACAC	70bp	3
		GACCACAGTTAGGACCCTCTGG		4

用CFX96^TM实时PCR检测系统(Bio-Rad Laboratoies,Hercules,CA)，使用光学级96孔板进行定量PCR。复样常规性地用于通过实时PCR测定DNA。PCR反应以20μl总体积使用含有各300nM的通用正向和反向引物的iQ^TM SYBR GREEN Supermix(伯乐生命医学产品有限公司(Bio-Rad laboratories))进行。反应条件设为95℃(3分钟)，接着是在95℃(10秒)、55℃(10秒)和72℃(30秒)，然后是95℃(10秒)下40次循环。数据分析利用Bio-Rad提供的CFX管理软件。为生成细菌总量的标准曲线，相对于提取自大肠杆菌(Escherichia coli)菌株ATCC25922培养物的相应连续10倍稀释液的模板DNA绘制Ct值。大肠杆菌菌株ATCC 25922先前在TB生长培养基(MO BIO Laboratories公司，卡尔斯巴德,加利福尼亚(MO BIOLaboratories,Inc.Carlsbad,CA))中生长至10⁸CFU的浓度，然后接种在LB(ISCBioExpress公司,凯斯维尔,犹他州(ISC BioExpress,Kaysville,UT))琼脂板上以检验菌落计数。通过使用

DNA Mini试剂盒(Qiagen)使10⁸CFU大肠杆菌溶液进行DNA提取。提取的DNA用于产生10倍稀释液并且建立标准曲线。类似地，通过等分10⁸CFU史氏甲烷短杆菌液体培养物的10倍稀释液获得史氏甲烷短杆菌的校准曲线。通过在600nm下测量光学密度测定浓度。

统计分析

对非参数数据利用曼-惠特尼U检验(Mann Whitney U test)并且对正态分布数据使用学生t检验(student’s t-test)。使用斯皮尔曼秩相关(Spearman rank correlation)将史氏甲烷短杆菌的量与呼气试验中甲烷的量做比较。比较氢和甲烷之间的呼气试验百万分数利用皮尔森回归分析(Pearson regression analysis)。另外，将史氏甲烷短杆菌表示为占合并总细菌和史氏甲烷短杆菌计数的百分比例并且也将这个百分比与呼气试验状态、甲烷水平和便秘程度做比较。所有试验均为双尾并且将统计显著性定义为P<0.05。

基线特征

总计9名患者(C-IBS与阳性甲烷呼气分析)和10名对照(IBS，无呼气甲烷)满足纳入标准。每个组内大多数的受试者为女性(甲烷组9名中的8名和非甲烷组10名中的8名)。平均年龄在两组之间没有差异(甲烷阳性受试者43.8±8.7岁与甲烷阴性受试者41.9±9.9岁)。确认症状C-D评分(分数范围从-100到+100)在有甲烷的C-IBS组中为51.1±37.8mm，高于非甲烷受试者的-1.0±35.1mm(P<0.01)，表明在甲烷阳性受试者中相对于腹泻，便秘明显。在胃气胀或腹痛严重程度上组间无差异。

来自于粪便的PCR结果

关于q-PCR，在2名产甲烷和1名产氢受试者中由于样本差不可判断史氏甲烷短杆菌样本，剩下7名产甲烷和9名不产甲烷的受试者符合分析条件。在对总细菌计数进行q-PCR的情况下，6个样本不可判断，剩下13名(6名呼气甲烷阳性和7名呼气甲烷阴性)进行分析。在测定史氏甲烷短杆菌百分比时，有12份测量了史氏甲烷短杆菌和细菌水平的样本。

首先检查史氏甲烷短杆菌，在甲烷生产者以及非甲烷受试者中检测史氏甲烷短杆菌。然而，史氏甲烷短杆菌的存在在呼气甲烷阳性受试者(1.8x10⁷±3.0x10⁷个拷贝/克湿粪)中与具有阴性呼气甲烷的受试者(3.2x10⁵±7.6x10⁵个拷贝/克湿粪)相比明显更高(p<0.001)。基于这些发现，对于甲烷而言为了产生阳性乳果糖呼气试验的史氏甲烷短杆菌的最低阈值视为4.2x10⁵个拷贝/克湿粪(图1)。

为进一步评价这种关系，将史氏甲烷短杆菌与合并总细菌和史氏甲烷短杆菌的比例表示为百分比。在非甲烷生产者中，史氏甲烷短杆菌百分比为0.24±0.47％并且在产甲烷受试者中为7.1±6.3％(P＝0.02)(图2)。基于百分比计数，高于1.2％的史氏甲烷短杆菌总是指示阳性呼气甲烷。

比较呼气试验中的史氏甲烷短杆菌及呼气甲烷和氢水平

通过180分钟AUC测定的生成的呼气甲烷的量与粪便中史氏甲烷短杆菌的量显著相关(R＝0.76，P<0.001)(图3)。虽然总细菌计数与呼气试验中的甲烷不相关，但是史氏甲烷短杆菌百分比与呼气试验中甲烷的水平高度相关(R＝0.77，P＝0.001)(图4)。

与甲烷相反，将呼气氢与史氏甲烷短杆菌的量、原核细菌总量和史氏甲烷短杆菌的百分比比较时，未见趋势。然而，如呼气甲烷AUC和氢AUC之间的负相关所表明，存在预期氢利用(R＝-0.61，P＝0.005)(图5)。

便秘症状、史氏甲烷短杆菌和总细菌计数

使用先前确认的检查便秘的评分作为与腹泻的相对值(C-D)，发明人检查了史氏甲烷短杆菌和总细菌水平是否预示便秘严重程度。绝对史氏甲烷短杆菌(图6)(R＝0.43，P＝0.1)和史氏甲烷短杆菌百分比(图7)(R＝0.47，P＝0.12)与根据C-D的便秘严重程度相比不十分满足显著性。同样在史氏甲烷短杆菌和史氏甲烷短杆菌百分比的情况下，在水平与腹痛或胃气胀的严重程度之间未见相关性。

在总细菌计数的情况下，与C-D评分无关并且与胃气胀无关。虽然在细菌水平和腹痛VAS评分之间存在负相关(R＝-0.51)，但是未达到统计显著性(P＝0.07)(图8)。

实施例2

大鼠的史氏甲烷短杆菌超定殖

获得20只为21日龄离乳动物的成年Sprague-Dawley大鼠(Harlan Labs,Indianapolis,IN)。隔离3天后，为所有大鼠称重，然后使用球形尖端接种针通过经口强饲接受1ml的5％碳酸氢钠等分试样，以便中和胃酸。约20分钟后，一组大鼠(n＝10)接受0.5ml于液体生长培养基中的史氏甲烷短杆菌强饲。第二组大鼠(n＝10)接受0.5ml液体生长培养基强饲。再20分钟后，在干燥罐中在异氟烷麻醉后给予强饲史氏甲烷短杆菌的大鼠0.2ml相同接种物灌肠。进行强饲和灌肠是为了确定肠道中史氏甲烷短杆菌水平是否可通过超定殖增加。

跟踪史氏甲烷短杆菌的定殖

接种后，根据动物园标准程序安置所有大鼠，每个微隔离器笼两只并且维持正常啮齿动物食物(5.7％脂肪)(Lab Rodent Diet 5001；Newco Distributors,RanchoCucamonga,CA)。第一周每天收集新鲜粪便样本，之后约每2周收集一次。

如先前所述通过进行qPCR试验特定周数的粪便样本的史氏甲烷短杆菌水平和总细菌水平(27)。使用RpoB基因的引物(5′-AAGGGATTTGCACCCAACAC-3′(正向)(SEQ ID NO:3)和5′-GACCACAGTTAGGACCCTCTGG-3′(反向)(SEQ ID NO:4))量化史氏甲烷短杆菌水平并且使用16S重组DNA(5′-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′(正向)(SEQ ID NO:1)和5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3′(反向)(SEQ ID NO:2))量化细菌总量。每周获得一次动物重量。

饮食调控

观察大鼠直至获得在10g以内的三个连续重量以表明生长曲线结束并且达到成年重量(对应于第112天)。在第112天，所有大鼠再转为高脂饮食(34.3％脂肪)(Teklad高脂饮食TD.06414；Harlan Laboratories,Madison,WI)并且维持这种饮食10周直至第182天。每周从所有动物中收集新鲜粪便样本和动物重量。在第182天，所有大鼠恢复为正常食物。最后，在第253天，来自每个组的5只大鼠再次饲喂高脂食物。大鼠维持其各自的饮食，同时继续获得粪便样本和每周重量持续5周直至第287天安乐死。最后这一阶段是保证在安乐死之前的一段时间10只大鼠饲喂高脂肪而10只饲喂正常食物。

安乐死和肠取样

在接种后第287天，所有大鼠通过CO₂窒息和气胸安乐死。进行剖腹术并且如先前所述从每只大鼠切取左结肠、盲肠、回肠、空肠和十二指肠的切片(A27)。如先前所述从每一段的腔体内容物提取DNA(A27)，并且用史氏甲烷短杆菌特异性和通用细菌引物进行qPCR以分别测定每一段中史氏甲烷短杆菌和总细菌的水平。研究方案经西达-赛奈实验动物照护及使用委员会(Cedars-Sinai Institutional Animal Care Utilization Committee,IACUC)批准。

统计分析

通过曼-惠特尼U检验比较接种和未接种大鼠之间通过qPCR测定的粪便中的史氏甲烷短杆菌水平。通过配对t检验比较饮食变化之前和之后体重的比较。再通过曼-惠特尼U检验比较组间肠段或粪便内的史氏甲烷短杆菌水平。为了比较干预之前和之后的史氏甲烷短杆菌水平，使用威尔克森符号秩检验(Wilcoxon signed-rank test)。对于重量而言，数据表示为平均值±标准偏差并且对于史氏甲烷短杆菌水平而言数据表示为平均值±标准误差。按P<0.05确定统计显著性。

大鼠受史氏甲烷短杆菌的定殖

在基线时，所有大鼠展示出粪便中史氏甲烷短杆菌的存在，组间无差异(图9)。

接种史氏甲烷短杆菌之后，大鼠比对照动物展示出粪便史氏甲烷短杆菌的检测量增加。然而，这到第9天水平恢复到对照水平时不持续(图9)。因为未发生超定殖，所以在剩余实验中将所有大鼠作为单个组检查。

初期转变为高脂饮食后的史氏甲烷短杆菌水平和重量

最初所有大鼠饲喂正常大鼠食物，直至获得在10g稳定水平以内的三个连续重量以表明大鼠已经达到成年重量。这个稳定水平在第112天之前的2周内出现(图10a)。在第98和112天之间获得的三次连续测量期间，在重量上的平均变化仅为5.5±5.8g。在第112天转为高脂食物之后，观察到大鼠重量突增(图10a)。平均重量从第112天的268±13g增加到第119天的292±16g(P<0.00001)。这导致与前一周内的5.1±5.4g相比，从第112到119天重量1周增加23.2±9.5g(P<0.00001)。尽管继续喂这种高脂饮食，但到第182天大鼠重296±22g，与开始喂高脂食物后1周的重量在统计上无差异(P＝0.39)。

除在转为高脂食物后所见的重量变化外，在执行高脂饮食后粪便史氏甲烷短杆菌水平也突然增加(图10b)。史氏甲烷短杆菌水平为5.6×10⁴±2.8×10³cfu/ml，在1周高脂饮食后增加近1log达3.0×10⁵±7.0×10³cfu/ml(P<0.01)(图11a)。与体重的变化一样，史氏甲烷短杆菌的变化在1周内发生并且再经几周的高脂食物并不进一步增加(图11a)。

在另一项分析中，根据经高脂肪增加更多或更少重量的大鼠，将大鼠分组。在另一项分析中，根据经高脂肪增加更多或更少重量的大鼠，将大鼠分组。在这项分析中，经高脂肪具有>10％增重的大鼠具有比增加更少重量(<10％增重)的大鼠更高的粪便史氏甲烷短杆菌水平(P＝0.08，图11b)。

恢复正常饮食时的史氏甲烷短杆菌和体重

在10周高脂饮食后在第182天恢复正常食物时，大鼠未经历体重减轻(图10a)。如本图所示，大鼠重量保持在稳定水平。然而，恢复正常食物导致随时间推移粪便史氏甲烷短杆菌水平逐渐降低(图10b)。在第189天，在停止脂肪并且重新开始正常食物1周后，史氏甲烷短杆菌水平为3.4×10³±8.1×10²cfu/ml，从第154天显著降低(P<0.001)(图10b)。在继续正常食物的大鼠中粪便史氏甲烷短杆菌水平继续下降至研究结束(2.0×10²±2.0×10²cfu/ml)(P<0.05)(图10b)。

再次随机恢复高脂饮食

在研究的最后阶段，大鼠随机分为两组(10只大鼠恢复高脂食物而另10只继续喂正常食物)。虽然图10a表明恢复高脂食物与继续喂正常食物相比不会进一步增加体重，但是两组间(高脂与正常食物)的重量差异对于任何时间点而言均未达到统计显著性。然而，恢复高脂食物的10只大鼠在平均重量上表现出从292±16g增加到319±26g，这是显著的(P<0.001，图10a)。恢复高脂食物也导致在这些动物中史氏甲烷短杆菌水平增加(P＝0.039，图11c)。

死后按肠段的细菌和史氏甲烷短杆菌水平

在接种后第287天安乐死后，从每只大鼠切取左结肠、盲肠、回肠、空肠和十二指肠的切片，并且从每一段的腔体内容物提取DNA。用史氏甲烷短杆菌特异性和通用细菌引物进行qPCR以分别测定史氏甲烷短杆菌和总细菌的水平。令人惊讶的是，在小肠内发现高水平的史氏甲烷短杆菌，并且在回肠中升高最多(图12a)。相反，总细菌水平在小肠内最低，而在盲肠和左结肠内最高(图12b)。在研究的最后阶段转为高脂饮食的大鼠与维持正常食物的大鼠比较每个肠段内的史氏甲烷短杆菌水平时，在转为高脂饮食的大鼠的所有肠段内鉴定出较高的史氏甲烷短杆菌水平(图13a)。然而，仅十二指肠、回肠和盲肠达到统计显著性。相反，在转为高脂饮食的大鼠间与维持正常食物的大鼠相比在任何肠段内未鉴定出总细菌水平的显著差异(图13b)。

史氏甲烷短杆菌肠定殖范围与大鼠重量之间的相关性

最后的比较是为了检查GI道内作为体重的决定因素的史氏甲烷短杆菌的分布。虽然在统计上不显著，但是史氏甲烷短杆菌定殖范围最大的大鼠(即，没有未定殖肠段的大鼠)的重量高于史氏甲烷短杆菌定殖不大普遍的大鼠(即，具有一个或多个未定殖肠段的大鼠)，不管其是否在研究的最后阶段饲喂高脂食物(图14)。为饲喂高脂食物，5个肠段中有3个没有史氏甲烷短杆菌定殖的大鼠记录所有大鼠的最低体重。

实施例3

研究群体

引见一个接一个的进行乳果糖呼气试验的受试者满足参与条件。排除标准是基于安全地进行生物阻抗人体测量的能力，并且排除孕妇和带有心脏起搏/去颤装置的受试者。所有受试者在参与研究之前提供知情同意。研究经西达-赛奈医疗中心伦理审查委员会批准(洛杉矶,加利福尼亚)。

调查表

受试者完成人口统计和医疗调查表及肠症状调查表(B12)，按从0到100mm的视觉模拟量表为其持续7天的肠道疾患(胃气胀、腹泻、便秘和腹痛)评级，100为最严重。

乳果糖呼气试验

受试者出现在医疗中心，如先前所述已经禁食12小时(B13)。将呼气样本收集在双袋系统中(Quintron Instrument Co,Milwaukee,Wisconsin)。初始呼气收集后，受试者摄取10g乳果糖糖浆，然后摄取250mL水。每15分钟收集呼气样本2小时并使用呼吸跟踪器-气相色谱仪(Quintron Instrument Co)分析。排出物包括氢、甲烷和二氧化碳。将氢和甲烷对于二氧化碳校正以标准化为肺泡气体水平并按百万分数(ppm)记录。如先前所述，将具有3ppm或更多甲烷的受试者视为甲烷阳性(B13)。将在试验90分钟或之前具有高于20ppm的氢的受试者视为氢阳性。

人体测量学

使用已经在其它研究中验证的身体量表(Biospace Co,Ltd,Seoul,Korea)进行生物阻抗试验(B12)。基于身高(经由测距仪测量)和导电率测定BMI和体脂百分比。

结果度量

受试者分为4组：正常(N)(90分钟时或之前甲烷<3ppm且氢<20ppm)；仅氢阳性(H+)(90分钟时或之前甲烷<3ppm且氢<20ppm)；仅甲烷阳性(M+)(90分钟时或之前甲烷≥3ppm且氢<20ppm)；及甲烷和氢阳性(M+/H+)(90分钟时或之前甲烷≥3ppm且氢≥20ppm)。主要结果度量为BMI和体脂百分比，并且主要分析比较了4个组间的这些度量。

数据和统计分析

通过ANOVA，然后通过Dunnett事后检验并通过费歇尔精确检验(Fisher exacttest)按性别比较组间的年龄。由于非正态性通过Kruskal-Wallis检验比较组间的视觉模拟量表评分。通过分析协方差(ANCOVA)模型分析BMI和体脂百分比。初始ANCOVA模型是以年龄作为协变量的双向因子模型(2个水平的性别和4个水平的分组)。因为性别与组相互作用不显著(对于BMI而言P＝.28并且对于体脂百分比而言P＝.37)，所以对于每种结果而言相互作用项在ANCOVA模型中下降。年龄显著并且在每种模型中保持。使用最小二乘方(经调整)平均值比较H+/M+组与其它3组中的每一组。自始至终使用P＝.05的双侧显著水平。SAS9.2版(SAS Institute,Cary,North Carolina)用于统计计算。

人口统计状况

总计792名受试者参与研究。记录受试者人口统计状况并且组间稍有不同(表2)。仅甲烷阳性(M+)与甲烷和氢阳性(H+/M+)组中的受试者比正常组(N)和仅氢阳性(H+)组的受试者年长。在H+和M+组内女性的百分比较低。虽然M+受试者往往具有比其它组更高程度的便秘，但是基线GI疾患在组间无差异(表2)。

表2.研究群组的人口统计比较

数据表示为平均值±SD；^aP值是为了比较4个组间的差异。

身体组成

H+/M+受试者具有比其它3组中任一组更高的BMI(图15A)。类似地，在H+/M+组中体脂百分比最高(图15B)。性别在组间无显著差异。ANOVA表明年龄在组间不同。邓尼特(Dunnett)事后检验表明M+组是对于年龄而言与N组明显不同的唯一一组。对年龄调整，在H+/M+组中BMI仍显著高于其它3组(N：24.1±5.2kg/m²；H+：24.2±4.5kg/m²；M+：24.0±3.75kg/m²；H+/M+：26.5±7.1kg/m2，对于每种比较而言P<.02)。使用类似分析，H+/M+组具有比其它组更高的体脂百分比(N：28.3±10.0％；H+：27.5±9.0％；M+：28.0±8.9％；H+/M+：34.1±10.9％)(对于每种比较而言P<.001)。

实施例4A

患者1在抗生素之前在葡萄糖耐量试验中具有260的葡萄糖峰值。每天三次施用550mg的利福昔明后，葡萄糖峰值为161mg/dL。相同患者的胆固醇为200，然后在治疗后为171。

患者2在抗生素之前在葡萄糖耐量试验中具有154的葡萄糖峰值。每天两次施用500mg的新霉素后，葡萄糖峰值为121。胆固醇在治疗之前为202并且在治疗后降至178。

实施例4B

抗生素疗法对甲烷阳性、前期糖尿病、肥胖受试者的试验。

进行针对甲烷阳性、前期糖尿病、肥胖受试者的试验的抗生素疗法并且继续进行。所述试验是开放标记前瞻性试验，其中招募甲烷阳性(呼气甲烷>3ppm)前期糖尿病、肥胖(BMI>30)患者。在这项研究中，受试者在进入后有血脂检测和葡萄糖耐量试验(胰岛素水平)。还储存血液用于肠降血糖素分析并且还储存粪便用于微生物分析。在进入后，然后用不能吸收的抗生素，利福昔明(550mg口服每日三次)和新霉素(500mg每日两次)治疗。抗生素完成后，受试者重复血脂检测和葡萄糖耐量试验。

图17-20为抗生素之前和之后通过配对t检验的前7名受试者的脂质和血糖谱。

基于测量胰岛素抗性的Matsuda评分系统，评分越低表明胰岛素抗性越高并且同样地以上结果表明提高了胰岛素敏感性。

作为迄今为止在抗生素治疗甲烷阳性、前期糖尿病、肥胖受试者的这项实验的前7名受试者中获得的结果，其中测得的全部4个代谢参数显示仅7名受试者经抗生素治疗仅14天后，在统计上显著或接近统计显著性的平均提高。总胆固醇提高(P＝0.082)。口服葡萄糖激发试验后葡萄糖曲线下面积提高(P＝0.11)。胰岛素曲线下面积提高(P＝0.048)。胰岛素抗性提高(P＝0.062)。7名受试者中，5名达到0的呼气甲烷水平，而另2名受试者的呼气甲烷水平从未降到3ppm以下。有趣的是，几乎所有有利的统计结果主要由甲烷水平降至0的5名受试者推动。

实施例5-产甲烷菌和肥胖

患者和方法

招募一个接一个的接受乳果糖呼气试验的成年受试者。20名受试者在基线呼气样本后施用10克口服乳果糖。在乳果糖摄取后3小时每15分钟重复呼气取样，以使用Quintron气相色谱仪分析甲烷和氢。将阳性甲烷呼气试验定义为呼气甲烷水平≥3ppm

方法

15名非甲烷和5名甲烷阳性受试者接受75g标准口服葡萄糖耐量试验，BMI并非是招募的标准。在禁食时和在葡萄糖摄取后3小时每30分钟获得用于分析葡萄糖和胰岛素水平的静脉取样。使用胰岛素抗性稳态模型评估法(HOMA-IR)根据公式量化胰岛素抗性：葡萄糖(mg/dL)x胰岛素(μU/mL)/405

表3.甲烷生产者与非甲烷生产者的基线特征

P<0.05视为统计显著

BMI：体重指数

HOMA-IR：胰岛素抗性稳态模型

AUC：曲线下面积

OGTT：75gm口服葡萄糖耐量试验

葡萄糖负荷后180分钟期间，甲烷生产者与非甲烷受试者(585.5±128.3mg/dL)相比具有更大的血清葡萄糖AUC(774.2±140.3mg/dL)(P＝0.03)。(参见图16)。相反，在180分钟胰岛素AUC上在甲烷生产者(217.76±122.08μU/mL)和非甲烷生产者(215.37±75.02μU/mL)之间无显著差异(图21A、B)。这样在OGTT后的葡萄糖:胰岛素比例上在甲烷生产者和非甲烷生产者之间产生差异(图22)。

我们发现产甲烷受试者在接受口服葡萄糖激发时在绝对葡萄糖水平上具有比其不产甲烷的对等人员明显更高的增量。这个发现和BMI无关。进一步地，在产甲烷受试者的胰岛素抗性上(通过HOMA-IR测量)与非甲烷生产者相比无显著差异。这表明有肠道甲烷生成的受试者在受高碳水化合物负荷激发时可能已经损害了葡萄糖耐受性，并且可能对发展高血糖症具有更高的倾向，这似乎与基础胰岛素抗性和BMI无关。

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以上在发明详述中描述了本发明的各个实施方案。虽然这些描述直接描述以上实施方案，但是应理解本领域的技术人员可构思对本文示出和描述的具体实施方案的修改和/或变化。落入该描述范围内的任何此类修改或变化旨在也包括在其中。除非特别注明，则发明人的意图是给予说明书和权利要求中词语和短语以对于适用领域中普通技术人员普通和习惯的含义。

在此次提交申请时申请人已知的本发明各个实施方案的先前描述已经提供并且旨在为了说明和描述的目的。当前描述并非旨在详尽无遗或将本发明限于公开的精确形式并且根据以上教导许多修改和变化是可能的。描述的实施方案用于解释本发明的原理及其实践应用并且使得本领域的其它技术人员能够在各个实施方案中利用本发明并做适于预期特定用途的各种修改。因此，其意图是本发明不限于公开的用于实施本发明的特定实施方案。

虽然已经显示和描述了本发明的特定实施方案，但是对于本领域的技术人员明显的是，基于本文的教导，可以进行改变和修改而不背离本发明及其较广泛的方面，因此，所附权利要求在其范围内涵盖了如本发明的真正精神和范围之内的所有此类改变和修改。本领域的技术人员将理解的是，一般而言，本文所用的术语通常旨在为“开放式”术语(例如，术语“包括(including)”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包括(includes)”应解释为“包括但不限于”，等等)。

序列表

<110> 雪松-西奈医学中心

<120> 由产甲烷菌引起或与之相关的疾病和病状的诊断、选择和治疗方法

<130> 065472-000416WO00

<150> 61/792,687

<151> 2013-03-15

<150> 61/831,498

<151> 2013-06-05

<150> 61/912,297

<151> 2013-12-05

<150> 61/931,498

<151> 2014-01-24

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 1

tcctacggga ggcagcagt 19

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 2

ggactaccag ggtatctaat cctgtt 26

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 史氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)

<400> 3

aagggatttg cacccaacac 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 史氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)

<400> 4

gaccacagtt aggaccctct gg 22

Claims

1.一种治疗患有或怀疑患有由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或者由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状的受试者的方法，其包括：

基于第一疗法适于具有高于参考值的产甲烷菌量的受试者的认识，向具有或确定具有高于参考值的产甲烷菌量的所述受试者施用第一疗法，或

基于第二疗法适于具有低于所述参考值的产甲烷菌量的受试者的认识，向具有或确定具有低于参考值的产甲烷菌量的所述受试者施用第二疗法。

2.根据权利要求1所述的方法，其还包括鉴定患有或怀疑患有由具有高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状或者由具有低产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状的所述受试者。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者已经确定具有高量的产甲烷菌。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者已经确定具有低量的产甲烷菌。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者具有或确定具有高量的产甲烷菌互养微生物。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述产甲烷菌互养微生物为产氢微生物。

7.根据权利要求5所述的方法，其还包括选择或导向第三疗法以抑制所述产甲烷菌互养微生物的生长。

8.根据权利要求7所述的方法，其还包括施用所述第三疗法。

9.根据权利要求1所述的方法，其中由具有所述高产甲烷菌量引起或与之相关的所述疾病或病状选自肥胖、便秘、脂肪肝(NASH)、前期糖尿病、糖尿病、II型糖尿病、胰岛素抗性、葡萄糖耐受不良、高血糖症及其组合。

10.根据权利要求1所述的方法，其中由具有所述高产甲烷菌量引起或与之相关的疾病或病状为高脂血症或高胆固醇。