KR20120083928A

KR20120083928A - 세라미드 및 콜라겐의 합성 촉진제 그리고 콜라겐의 당화 억제제

Info

Publication number: KR20120083928A
Application number: KR1020127015268A
Authority: KR
Inventors: 도모야 이치카와; 게이시로 요시다; 스스무 시무라; 유이치 오이시
Original assignee: 가부시키가이샤 롯데
Priority date: 2009-11-18
Filing date: 2010-11-17
Publication date: 2012-07-26
Also published as: JP6096964B2; JP2016155852A; JPWO2011061932A1; JP2015164954A; JP5921747B2; WO2011061932A1; CN102665701A; KR102077858B1

Abstract

피부의 세라미드의 합성을 촉진시킴으로써 피부의 수분 유지 기능 등의 배리어 기능을 높일 수 있고, 또한 피부에 함유되는 콜라겐량을 증가시켜, 콜라겐의 당화를 억제함으로써 피부의 주름이나 처짐을 방지하고, 또한 안전하게 섭취할 수 있는 경구용제를 제공한다. 본 발명은 자일리톨을 경구 섭취하는 세라미드 합성 촉진제, 콜라겐 합성 촉진제 및 콜라겐의 당화 억제제이고, 세라미드의 합성 촉진 효과, 콜라겐량의 증가 효과 및 콜라겐의 당화 억제 효과가 우수하고, 또한 안전하게 섭취할 수 있다.

Description

세라미드 및 콜라겐의 합성 촉진제 그리고 콜라겐의 당화 억제제{CERAMIDE AND COLLAGEN SYNTHESIS PROMOTER AND COLLAGEN SACCHARIFICATION INHIBITOR}

본 발명은 세라미드 및 콜라겐의 합성 촉진제 그리고 콜라겐의 당화 억제제에 관한 것이다.

종래, 피부의 노화나 피질의 악화에 수반하여, 건성 피부나, 주름?처짐 등의 문제가 발생하는 것이 알려져 있다.

피부의 수분 유지 기능이 저하되어 피부가 건조하여, 그 표면이 꺼칠꺼칠한 상태가 되는 것을 건성 피부라고 한다. 건성 피부는 외부로부터의 자극을 받기 쉬워, 거칠어짐, 염증, 발진, 습진, 튼살 등이 일어나기 쉬운 상태이기 때문에, 그 개선이 요구된다.

피부의 건조를 막아, 건성 피부를 개선하는 방법으로서, 바셀린, 미네랄 오일, 세라미드 등의 수분의 증산을 억제하는 성분을 배합한 외용제를 피부에 도포하는 방법이 실시되고 있다. 또, 피부에 주름이나 처짐이 생기는 것을 방지하는 방법으로서 콜라겐을 피부에 도포하는 방법이 실시되고 있다. 그러나, 그러한 외용제를 도포하는 것만으로 본래의 피부와 동일한 수분 유지 기능을 발휘시키는 것은 기술적으로 매우 곤란하다. 또, 그 효과는 일시적인 것으로, 지속적인 효과에 대해서는 의문을 가지고 있어, 건성 피부나 주름?처짐의 근본적인 해결이 되지 않는다는 문제점이 있다.

이러한 문제점이 없는 방법으로, 피부의 세포에 있어서 세라미드나 콜라겐의 합성을 촉진시키는 성분을 경구 섭취하는 방법이 검토되고 있다.

세라미드는 스핑고신 염기와 지방산이 산아미드 결합된 복합 지질로, 표피의 각질 세포간 지질의 주요한 성분이다. 각질 세포간 지질은 수분 투과, 화학적 자극, 물리적 자극에 대한 피부의 배리어 기능을 유지하는 데에 있어서 중요한 역할을 하고 있는데, 세라미드는 특히 수분 투과에 대한 배리어 기능에 기여하고 있다. 그 때문에, 피부에 함유되는 세라미드의 양은 피부의 수분 유지 기능을 측정하는 데에 중요한 지표가 된다. 아토피성 피부염에 보여지는 건성 피부나 노인의 건피증에서는 세라미드의 감소가 원인의 하나로 생각되고 있다 (비특허문헌 1).

세라미드의 생합성에 있어서의 율속 효소로서, 세린팔미토일트랜스페라아제 (SPT) 가 알려져 있다. SPT 는 세린과 팔미토일-CoA 로부터 3-케토디하이드로스핑고신을 합성하는 효소이고, 세라미드를 비롯한 스핑고 지질의 생합성에 있어서 최초의 반응을 촉매하는 효소이다.

한편, 세포 외 매트릭스의 하나인 콜라겐은 3 개의 폴리펩티드 사슬로 이루어지는 나선 구조를 기본적인 구성 단위로 하는 섬유상 단백질이다. 콜라겐을 구성하는 아미노산은 주로 글리신, 프롤린, 하이드록시프롤린 및 알라닌 등으로 이루어지고, 그 중에서도 하이드록시프롤린은 콜라겐에 특징적인 아미노산이기 때문에, 콜라겐량을 정량할 때의 지표로 되어 있다.

콜라겐은 피부의 탄력을 유지하는 데에 있어서 중요한 역할을 가지고 있고, 피부 콜라겐량의 저하나 콜라겐의 질적 변화는 나이가 들어감에 따른 자연 노화나, 자외선 등에 의한 광 노화와 상관하여, 주름이나 처짐의 원인이 되는 것이 알려져 있다. 질적 변화의 하나인 콜라겐의 당화 (糖化) 는 나이가 들어감과 함께 진행하는 현상으로, 최근에는 피부의 노화 현상의 하나로서 생각되고 있다.

세라미드 합성 촉진제로서, 니코틴산 유도체 (특허문헌 1), 식물 추출물 (특허문헌 2 ? 4), 한방 생약 (비특허문헌 2), 우유의 인지질 (비특허문헌 3), 일본 술 성분 (비특허문헌 4), 니아신아미드 (비특허문헌 5) 등이 개시되어 있다.

콜라겐 합성 촉진제로서, 자이모모나스 발효 대사액 (비특허문헌 10), 식물 추출물 (특허문헌 5 ? 9), 콜라겐 펩티드 유사의 디펩티드나 트리펩티드 (특허문헌 10 ? 11), γ-오리자놀 분해물 (특허문헌 12) 등이 개시되어 있다.

그러나, 이들 중에는 피부에 대한 자극성이 강한 것 등도 있어, 안전성의 면에서 불충분한 것이 있다. 또, 배양 세포에 유효 성분을 직접 작용시켜 효과를 평가하고 있는 것도 있는데, 인간이나 동물에서의 사용을 생각한 경우, 유효 성분이 체내에 흡수되는지, 유효 성분이 체내에서 어떠한 대사를 받아도 효과를 발휘할 수 있는지 라는 점이 불명확하여, 충분한 효과가 얻어지는지의 여부가 명확하지 않다. 요컨대, 그 효과나 안전성의 면에서 충분하다고는 하기 어렵다.

일본 특허공보 제3508042호 일본 공개특허공보 2006-111560호 일본 공개특허공보 2004-210743호 일본 공개특허공보 2002-370998호 일본 공개특허공보 2007-230917호 일본 공개특허공보 2006-273756호 일본 공개특허공보 2006-265120호 일본 공개특허공보 2005-139141호 일본 공개특허공보 2005-120108호 일본 공개특허공보 2010-024200호 일본 공개특허공보 2006-056904호 일본 공개특허공보 2005-263677호

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상기 과제에 기초하여, 본 발명은 피부의 세라미드 합성을 촉진시킴으로써 피부의 수분 유지 기능 등의 배리어 기능을 높일 수 있고, 또한 피부 콜라겐량을 증가시키고 및 콜라겐의 당화를 억제하는 것에 의해 피부의 주름이나 처짐을 방지하는, 안전하게 섭취할 수 있는 경구용제의 제공을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 과제에 대해 예의 연구한 결과, 자일리톨을 경구 섭취함으로써, 세라미드의 합성이 촉진되고, 또한 세린팔미토일트랜스페라아제의 mRNA 발현량이 높아지는 것을 알아내었다. 또, 본 발명자들은 자일리톨을 경구 섭취함으로써 피부의 콜라겐량이 증대되고, 또한 콜라겐의 당화가 억제되는 것을 알아내었다. 이들의 지견에 의해, 본 발명자들은 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 자일리톨을 유효 성분으로서 함유하는, 경구 섭취하는 세라미드 및 콜라겐의 합성 촉진제 그리고 콜라겐의 당화 억제제에 관한 것이다.

자일리톨을 경구 섭취함으로써, 세라미드 합성량 및 피부 중의 콜라겐량을 증가시키고, 또한 당화 콜라겐 레벨을 감소시킬 수 있다.

또, 자일리톨은 종래부터 과자 등의 감미료로서 사용되고 있어, 경구 섭취해도 그 안전성에 대해서는 문제없다.

도 1 은 실시예에 있어서의 시험 스케줄의 개략.
도 2 는 시험예 1 에 있어서, 3 개월 시험 그룹에 있어서의 세린팔미토일트랜스페라아제 유전자 (Spt) 의 발현 레벨을 나타내는 그래프.
도 3 은 시험예 1 에 있어서, 6 개월 시험 그룹에 있어서의 세린팔미토일트랜스페라아제 유전자 (Spt) 의 발현 레벨을 나타내는 그래프.
도 4 는 시험예 2 에 있어서, 3 개월 시험 그룹에 있어서의 세라미드 레벨의 측정 결과를 나타내는 그래프.
도 5 는 시험예 2 에 있어서, 6 개월 시험 그룹에 있어서의 세라미드 레벨의 측정 결과를 나타내는 그래프.
도 6 은 시험예 3 에 있어서의 추출?분획의 공정도.
도 7 은 시험예 3 에 있어서, 3 개월 시험 그룹에 있어서의 하이드록시프롤린 양을 나타내는 그래프.
도 8 은 시험예 3 에 있어서, 6 개월 시험 그룹에 있어서의 하이드록시프롤린 양을 나타내는 그래프.
도 9 는 시험예 3 에 있어서, 3 개월 시험 그룹에 있어서의 콜라겐량당의 형광 강도를 나타내는 그래프.
도 10 은 시험예 3 에 있어서, 6 개월 시험 그룹에 있어서의 콜라겐량당의 형광 강도를 나타내는 그래프.

자일리톨은 탄소수 5 개의 당 알코올이며, 자일리트라고도 불린다. 자일로오스에 대한 수소 첨가에 의해 생성되고, 우식원성이 없는 감미료로서 추잉껌이나 캔디 등의 과자에 널리 이용되고 있다.

자일리톨은 글리세린, 프로필렌글리콜 등의 폴리올류의 하나이며, 보수력이 높아 피부에 도포함으로써 그 수분 유지 기능을 높이는 효과를 기대할 수 있는 점에서, 외용제의 보습 성분으로서 배합되는 경우가 있다. 그러나, 이와 같은 효과는 외용했을 경우에 기대할 수 있는 효과로, 자일리톨을 경구 섭취해도, 그대로 피부까지 도달하여 이와 같은 효과를 발휘할 수 있는 것은 아니다.

자일리톨을 경구 섭취한 경우의 피부에 대한 효과에 대해서는, 자일리톨을 5.0 중량％ 및 10.0 중량％ 라는 비교적 고용량으로 함유하는 자일리톨 혼이를 준 래트에 의한 실험에 있어서, 피부의 콜라겐량이 증가하고, 또한 콜라겐의 당화를 억제하는 작용이 보고되어 있다 (비특허문헌 6, 비특허문헌 7). 그러나, 피부의 세라미드 합성에 대한 효과에 대해서는 지견이 없었다. 또, 콜라겐에 대한 효과에 대해서도, 자일리톨을 비롯한 한 당 알코올을 인간이 한 번에 다량으로 섭취했을 경우, 설사 등의 부작용이 우려되기 때문에, 보다 적은 자일리톨 함량으로 동일한 효과를 기대할 수 있을지에 대한 평가가 요망되어 있다.

이에 대해, 본 발명자들은, 자일리톨을 경구로 섭취함으로써, 피부의 세라미드의 합성이 촉진되는 것, 또한 세라미드 생합성에 있어서의 율속 효소인 세린팔미토일트랜스페라아제 (SPT) 의 mRNA 발현량이 높아지는 것을 알아내었다. 또, 본 발명자들은 종래부터 소량의 자일리톨을 경구 섭취함으로써 피부의 콜라겐량이 증대되고, 또한 콜라겐의 당화가 억제되는 것을 알아내었다. 새롭게 얻어진 이들의 지견에 의해, 본 발명자들은 본 발명에 관련된 세라미드 합성 촉진제, 콜라겐 합성 촉진제 및 콜라겐의 당화 억제제를 완성시켰다.

본 발명의 세라미드 합성 촉진제, 콜라겐 합성 촉진제 및 콜라겐의 당화 억제제는, 바람직하게는, 1 일당 투여량이 피투여자의 1 일 식사로 섭취하는 칼로리 100 kcal 당 0.4 g ? 1.35 g 이 되는 양의 자일리톨을 유효 성분으로서 함유한다. 더욱 바람직하게는, 1 일당 투여량이 피투여자의 1 일 식사로 섭취하는 칼로리 100 kcal 당 0.4 g ? 0.67 g 이 되는 양의 자일리톨을 유효 성분으로서 함유한다. 또, 본 발명의 세라미드 합성 촉진제, 콜라겐 합성 촉진제 및 콜라겐의 당화 억제제는, 바람직하게는, 유효 성분으로서 자일리톨을 0.1 중량％ ? 99 중량％ 의 비율로 함유하고, 더욱 바람직하게는, 1 중량％ ? 90 중량％ 의 비율로 함유한다.

또, 본 발명의 세라미드 합성 촉진제, 콜라겐 합성 촉진제 및 콜라겐의 당화 억제제는 경구에 의해 섭취되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 세라미드 합성 촉진제, 콜라겐 합성 촉진제 및 콜라겐의 당화 억제제는, 예를 들어, 의약품, 의약부외품 또는 음식품 등으로서 이용할 수 있다.

의약품의 경우, 경구제로서 투여된다. 경구제의 제형으로는, 정제, 캡슐제, 산제, 시럽제, 드링크제 등을 들 수 있다. 의약부외품의 경우, 정제, 캡슐제, 드링크제 등의 제형으로 이용된다. 음식품의 경우, 드링크 등의 음료품, 캔디, 센베이, 쿠키 등의 식품 외, 담배나 추잉껌 등의 기호품, 사료나 사료류, 또는 가글약, 치약 등의 화장품류 등을 들 수 있다. 또한, 이들은 어디까지나 예시에 지나지 않고, 자일리톨을 경구로 섭취할 수 있는 한, 본 발명은 어떠한 물품에도 사용할 수 있다.

의약품이나 의약부외품의 경우, 약리학적으로 허용되는 1 종 또는 2 종 이상의 담체, 또한 필요에 따라 다른 치료를 위한 유효 성분을 함유하고 있어도 된다. 그 외, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 분산제, 계면활성제, 가소제, 현탁제, 유화제, 희석제, 완충제, 항산화제, 세균 억제제 등을 함유하고 있어도 된다.

또, 음식품에는, 식품 제조상 허용되는 기재, 담체, 부형제, 첨가제, 증량제, 착색제, 향료 등을 함유하고 있어도 된다.

또한, 자일리톨 이외의 성분에 관해서도, 상기에 한정되는 경우는 없고, 본 발명은 공지된 어떠한 성분도 임의로 함유하고 있어도 된다.

본 발명의 자일리톨을 함유하는 세라미드 합성 촉진제, 콜라겐 합성 촉진제 및 콜라겐의 당화 억제제는 각각의 기술 분야에 있어서 공지된 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다. 그 제조 과정에 있어서, 자일리톨을 공지된 어떠한 방법으로 첨가해도 된다.

또한, 본 발명의 자일리톨을 함유하는 세라미드 합성 촉진제, 콜라겐 합성 촉진제 및 콜라겐의 당화 억제제는 인간뿐만 아니라, 인간 이외의 동물 (이하, 비인간 동물로 약기) 에 대해서도 사용할 수 있다. 비인간 동물로는, 포유류, 파충류, 양서류, 어류 등, 인간 이외의 동물을 들 수 있다.

이상의 구성에 의해, 본 발명에 있어서는, 종래의 경구에 의해 섭취하는 세라미드 합성 촉진제와 동일한 정도의 세라미드의 합성 촉진 효과를 기대할 수 있다. 그 때문에, 피부의 수분 유지 기능을 높이는 용도나, 건성 피부의 개선 등에 사용할 수 있다. 또, 본 발명에 있어서는, 콜라겐의 합성을 촉진하는 효과제 및 콜라겐의 당화를 억제하는 효과도 기대할 수 있다. 그 때문에, 피부의 주름이나 처짐을 방지하는 용도에 사용할 수 있다.

실시예

이하에, 실시예를 이용하여 본 발명에 대해 설명하는데, 이들 실시예는 전혀 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

공시 동물, 동물의 사육

SD 계 래트 (웅성, 11 주령, 생육장 출하시 체중：350 ? 400 g) 40 마리를 일본 쿠레아로부터 구입하여 실험에 사용하였다. 동물은 컨벤셔널 동물 사육실에서 실온 23±1 ℃, 습도 50±10 ％, 명암 사이클 12 시간 (명기 (明期) 8:00 ? 20:00) 이라는 환경 하에서 사육하였다. 2 주간의 순화 사육 후에 체중 측정을 실시하여, 각 군의 평균 체중이 균등해지도록 표 1 에 나타내는 4 개의 시험군으로 래트를 나누고, 그 후, 시험 사료 투여 기간으로서 11 주간 사육을 실시하였다. 11 주간 경과시의 체중에 기초하여, 각 시험군 내의 평균 체중이 균등해지도록 3 마리와 7 마리로 그룹을 나누었다. 3 마리로 나눈 그룹은 다시 1 주간만 사육하여 해부하였다 (합계 12 주간, 3 개월 시험 그룹). 7 마리로 나눈 그룹은 다시 13 주간 사육하여 해부를 실시하였다 (합계 24 주간, 6 개월 시험 그룹). 도 1 에 시험 스케줄의 개략을 나타낸다.

사료는 AIN-93G 표준 정제 사료를 기본 조성으로 하였다. 수크로오스를 자일리톨로 치환한 조성의 사료 (표 2 참조) 를 조제하여, 시험에 사용하였다. 또한, 순화 사육 중에는 대조군과 동일한 사료를 주었다. 또한, 자일리톨의 칼로리에 대해서는 2.40 kcal/g 와 3.00 kcal/g 의 어느 값도 일반적으로 받아들여지고 있기 때문에, 표 2 에는 양방의 값을 기초로 계산한 결과를 나타낸다.

사료 및 물은 자유 섭취로 하고, 해부의 1 주간 전부터는 16:30 ? 다음날 10:30 의 18 시간을 섭식 시간으로 하고, 10:30 ? 16:30 사이는 절식시켰다. 체중 측정 및 급이량과 잔이량의 측정은 2 일에 1 번 실시하여, 양자의 차를 섭식량으로 하였다. 또, 대변 상태, 설사 등의 이상의 유무에 대해서도 관찰?기록하였다.

시험 사육 2 ? 3 주 후에 자일리톨 5 ％ 혼이군의 1 마리에서 등부의 할큄 행동에 의한 외상이 확인되고, 그 후 치유되었지만 피부의 해석에 대한 영향이 고려되므로, 이 동물은 해석 대상으로부터 제외하였다. 또, 시험 사육 10 주째에 있어서, 자일리톨 1.5 ％ 혼이군의 1 마리에게 혈뇨가 확인되어, 그 후의 체중이 안정되지 않았기 때문에, 이 동물은 해석 대상으로부터 제외하였다.

사육에 관한 결과

시험 사료 투여 개시부터 1 ? 2 일간, 자일리톨 5.0 ％ 혼이군의 래트 10 마리 중 1 마리에게 연변 (수분량이 많은 유형의 변) 을 확인했지만, 일시적인 증상으로, 그 후에는 회복되었다. 또, 3 개월 사육 기간 중의 각 군에 있어서의 래트 평균 체중의 추이, 1 주간 합계 평균 섭식량의 추이, 및 3 개월간의 누계 섭식량에도, 사육 기간을 통해 각 군 사이에서 섭식량에 통계학적인 차는 보이지 않았다.

해부, 각 샘플의 채취

해부는 마취약 소무노펜틸 (쿄리츠 제약) 을 체중 100 g 당 0.1 ㎖ 복강 내에 투여하여 실시하였다. 마취 후, 래트 등부의 털을 바리캉으로 깎고, 그 후, 순간 접착제 (아론알파) 를 도포한 슬라이드 글라스를 등부 표면에 1 분간 첩부하여, 피부 표면의 피지를 채취하였다. 그 후, 등부 피부 (피부의 일부를 φ = 1.8 ㎝ 의 펀치로, 원형으로 컷하였다), 혈장 (심장 채혈), 간장, 부고환 지방을 채취하였다.

[시험예 1] 세라미드 합성 효소의 발현 레벨의 측정

피부로부터의 total RNA 추출과 cDNA 제조

채취한 피부 조직을 동결시킨 상태에서 파쇄하고, 파쇄된 피부편 약 350 ㎎ 을 샘플로서 제공하였다. 피부 조직으로부터의 total RNA 의 추출은 SV Total RNA Isolation System (Promega) 을 이용하여 실시하였다. total RNA 2 ㎍ 으로부터 역전사 반응 (High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, ABI) 으로 cDNA 를 제조하였다. 제조한 cDNA 는 리얼타임 PCR 에서의 해석에 사용하기 위해서, 멸균수로 5 배로 희석시켰다.

리얼타임 PCR 에 의한 각종 유전자 발현 해석

96 웰 튜브 (ABI) 에, 세린팔미토일트랜스페라아제 (Spt) 의 프라이머 및 프로브와, TaqMan (등록 상표) Universal Master Mix II (ABI) 를 혼합한 리얼타임 PCR 반응액 24 ㎕ 와, 전 항에서 제조한 cDNA 5 배 희석 샘플을 1 ㎕ 첨가하고, 리얼타임 PCR (7300 형, ABI) 에 의해, 유전자 발현 해석을 실시하였다. 프라이머 및 프로브는 하기에 나타낸 배열을 사용하였다. 또한, 프로브에 사용한 올리고 DNA 의 5＇말단에는 FAM 을, 3＇말단에는 TAMRA 를 결합하였다. mRNA 량은, 하우스키핑 유전자인 β-액틴 (Beta-actin) 의 발현량으로 보정한 후, 대조군에 대한 상대값으로서 구하였다.

Forward primer：5＇-CAG TGC AGC CTG CTT TGC TA-3＇(배열 번호 1)

Reverse primer 5＇-GCC TTT CGA GGA TTC TTT TGA TC-3＇(배열 번호 2)

Probe (rat SPT)：5＇-CCA GAA AGG ACT ACA GGC ATC ACG CAG-3＇(배열 번호 3)

세린팔미토일트랜스페라아제 유전자 (Spt) 의 발현 레벨의 측정 결과

3 개월 시험 그룹에 있어서의 세린팔미토일트랜스페라아제 유전자 (Spt) 의 발현 레벨을 도 2 에, 6 개월 시험 그룹에 있어서의 세린팔미토일트랜스페라아제 유전자 (Spt) 의 발현 레벨을 도 3 에, 각각 나타낸다.

각 군 사이에서 통계학적인 유의차 및 유의 경향은 확인되지 않았지만, 모두 자일리톨 투여군에 있어서 대조군보다 발현 레벨이 상승되어 있었다.

[시험예 2] 피부 세라미드량의 측정

피부 세라미드의 추출

해부시에 등부 피부 표면으로부터 슬라이드 글라스에 채취한 피지 샘플을 헥산：에탄올을 95:5 로 혼합한 용매에 담궈, 초음파 처리에 의해, 지질 성분을 추출하였다. 추출된 지질 성분은, 소수성 필터 (Millex (등록 상표)-FH, φ = 0.45 ㎛, 미리포아) 로 여과 후, 시험관으로 옮겨, 질소 가스로 농축?건고시켰다. 건고된 지질 성분은 클로로포름으로 다시 용해시키고, 다갈색의 마이크로 튜브로 옮겨, 질소 가스로 다시 농축?건고시켰다. 이 때, 마이크로 튜브의 중량을 미리 측정해 두고, 질소 가스로의 농축?건고 후의 중량과의 차를 총 지질량으로 하였다.

얻어진 총 지질 1 ㎎ 당, 클로로포름을 10 ㎕ 첨가하고, 지질 성분을 용해시켜, 이것을 TLC 법에 제공하는 총 지질 샘플로 하였다.

TLC 법에 의한 피부 세라미드량의 수치화

실리카겔 플레이트 (HPTLC, 머크) 에 총 지질 샘플을 5 ㎕ (총 지질 0.5 ㎎ 상당량) 스폿하고, 전개 용매 (클로로포름：메탄올：아세트산 = 192:7:1) 로 전개시켰다. 전개 종료 후, 실리카겔 플레이트를 충분히 건조시키고 나서 표 3 에 나타내는 처방에 의해 조제한 황산구리 (II)-인산 용액 (발색 시약) 을 분무하여, 150 ℃ 에서 10 분 정도 가열하였다. 표본으로는 소 뇌 유래 세라미드 (Ceramide, Natural Mixture, 후나코시) 를 사용하였다. 실리카겔 플레이트에 나타난 스폿은 이미지 애널라이저 (LAS-3000, 후지 필름) 로 수치화를 실시하였다.

피부 세라미드 레벨의 측정 결과

3 개월 시험 그룹에 있어서의 세라미드 레벨의 측정 결과를 도 4 에 나타낸다. 각 군 사이에서 통계학적인 유의차 및 유의 경향은 확인되지 않았지만, 자일리톨 투여군에서는 전체적으로 대조군보다도 높은 값을 나타내고, 특히 자일리톨 2.5％ 혼이군이 대조군에 비해 높은 값이었다.

6 개월 시험 그룹에 있어서의 세라미드 레벨의 측정 결과를 도 5 에 나타낸다. 자일리톨 1.5 ％ 혼이군과 5.0 ％ 혼이군이 대조군과 비교하여, 1.4 ? 1.5 배로 통계학적으로 유의하게 증가하고 있었다. 자일리톨 2.5 ％ 혼이군도 통계학적인 유의차 및 유의 경향은 확인되지 않았지만, 대조군보다 높은 값이었다.

[시험예 3] 피부 콜라겐량의 평가, 콜라겐 중의 당화 콜라겐량의 측정

토탈 콜라겐의 추출, 분획

비특허문헌 8 에 준하여 추출?분획을 실시하였다 (도 6 참조).

채취한 피부를 동결 파쇄하고, 아세톤으로 탈지?탈수 처리를 실시하여, 해부 가위로 재단하였다. 그 후, 볼 밀 (Retsch) 로 동결 분쇄하고, 동결 건조를 거쳐, 피부 분말 샘플을 얻었다. 피부 분말 샘플 30 ㎎ 에 9 ㎖ 의 0.5 M 아세트산을 첨가하고, 4 ℃ 에서 16 시간 진탕 추출 후, 30,000 G, 4 ℃ 에서 30 분 원심 분리하여, 상청과 침전으로 나누었다.

상청에는, 최종 농도가 100 ㎎/㎖ 가 되도록 펩신 1：10,000 (생화학용, 와코우 순약) 을 첨가하고, 22 ℃ 에서 16 시간 반응시켜, 비콜라겐성의 단백을 분해하였다. 그 후, 최종 몰 농도가 1.8 M 이 되도록 염화나트륨을 첨가하고, 다시 30,000 G, 10 분, 4 ℃ 에서 원심을 실시하여, 얻어진 침전물을 0.1 M 아세트산으로 용해시킨 것을 산가용성 획분으로 하였다.

한편, 0.5 M 아세트산 추출 후의 침전물에 대해서는, 표 4 의 조성으로 조제한 콜라게나아제 버퍼로 한 번 침전을 씻은 후, 표 5 의 조성으로 200 unit/㎖ 의 농도로 조제한 콜라게나아제 효소액을 3 ㎖ 첨가하고, 37 ℃ 에서 22 시간 반응시켰다. 그 후, 30,000 G, 30 분, 4 ℃ 에서 원심을 실시하여, 상청을 콜라게나아제 가용성 획분으로 하였다.

하이드록시프롤린 (Hyp) 의 정량

비특허문헌 8 및 비특허문헌 9 에 준하여 하이드록시프롤린의 정량을 실시하였다.

산가용성 획분 혹은 콜라게나아제 가용성 획분 20 ㎕ 에, 6 N 염산을 500 ㎕ 첨가하여 혼합 후, 130 ℃ 에서 3 시간, 산 가수분해를 실시하였다. 냉각 후, pH 지시약으로서, 0.04 ％ 메틸레드 용액을 2 ㎕ 첨가하고, 2.5 N 수산화나트륨을 1150 ㎕ 첨가하였다. 용액의 색이 핑크와 옅은 황색의 중간색의 색이 되도록, 염산 및 수산화나트륨의 희석 수용액을 적절히 첨가하여 pH = 6 ? 7 로 조정하였다.

그 후, 표 6, 표 7 에 기재된 조성으로 조제한 50 mM 클로라민 T 용액을 1 ㎖ 혼합하고, 상온에서 20 분 반응 후, 18.9 ％ 과염소산 수용액을 1 ㎖ 혼합하여, 상온에서 5 분 반응시켰다. 그 후, 표 8 에 기재된 조성으로 조제한 20 ％ p-디메틸아미노벤즈알데히드 용액을 1 ㎖ 혼합하고, 60 ℃ 의 탕욕 중에서 20 분 반응시켰다. 그 후, 흐르는 물로 5 분 냉각시켜, 상온에서 1 시간 이상 가만히 정지시킨 후, 분광 광도계 (U-3900H, 히타치) 에 의해 557 ㎚ 의 흡광도를 측정하여, 검량선으로부터 하이드록시프롤린 양을 구하였다. 이렇게 해서 얻어진 하이드록시프롤린 양에 환산 계수 7.25 를 곱한 값을 콜라겐 환산값으로 하였다.

형광 강도의 측정 및 당화 콜라겐량의 평가

비특허문헌 6 에 준하여 형광 강도 측정을 실시하였다. 산가용성 획분 및 콜라게나아제 가용성 획분에 대해, 적절히 희석시켜, 형광 분광 광도계 (RF-5000, 시마즈 제작소) 에 의해 여기 파장 Ex：370 ㎚, 측정 파장 Em：440 ㎚ 로 형광 강도를 측정하였다. 각 획분의 하이드록시프롤린 양으로부터 산출한 콜라겐량당의 형광 강도를 산출하여, 당화 콜라겐량의 지표로 하였다.

하이드록시프롤린 양의 측정 결과

3 개월 시험 그룹에 있어서의 하이드록시프롤린 양을 도 7 에, 6 개월 시험 그룹에 있어서의 하이드록시프롤린 양을 도 8 에 각각 나타낸다.

3 개월 시험 그룹에 대해서는, 산가용성 획분, 콜라게나아제 가용성 획분 모두 각 군 사이에서 통계학적인 유의차 및 유의 경향이 확인되지 않았지만, 6 개월 시험 그룹에 대해서는, 어느 획분에 있어서도 하이드록시프롤린 양이 증가하고 있고, 특히 콜라게나아제 가용성 획분에 있어서는, 자일리톨 혼이군 모두가 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의하게 상승하고 있었다. 콜라겐에 특징적인 아미노산인 하이드록시프롤린의 양이 증가하고 있는 점에서, 자일리톨 혼이군에서는 콜라겐의 합성량이 증가한 것으로 생각된다.

당화 콜라겐 레벨의 측정 결과

3 개월 시험 그룹에 있어서의 하이드록시프롤린 양으로부터 산출한 콜라겐량 당의 형광 강도 (당화 콜라겐 레벨) 를 도 9 에, 6 개월 시험 그룹에 있어서의 하이드록시프롤린 양으로부터 산출한 콜라겐량 당의 형광 강도 (당화 콜라겐 레벨) 를 도 10 에 각각 나타낸다.

어느 획분에 있어서도 당화 콜라겐 레벨 감소가 보이고, 특히 3 개월 시험 그룹에 대해서는, 콜라게나아제 가용성 획분에 있어서 자일리톨 2.5 ％ 혼이군이 대조군과 비교하여 유의하게 낮은 값이었다. 또, 6 개월 시험 그룹에 대해서는, 산가용성 및 콜라게나아제 가용성의 양 획분에서, 모든 자일리톨 혼이군 (1.5 ％, 2.5 ％, 5.0 ％) 의 값이 대조군과 비교하여 유의하게 낮은 값이었다.

이상과 같이, 자일리톨 투여군에서는, 자일리톨을 투여하지 않았던 대조군과 비교하여, 세라미드의 합성 촉진 효과가 보였다. 또, 자일리톨 이외의 성분을 경구 섭취한 결과를 개시하는 선행 문헌인 특허문헌 1 ? 4, 비특허문헌 2 ? 5 와 비교해도, 동일한 정도의 합성 효과를 갖는 것이 확인되었다.

또, 자일리톨 투여군에서는, 대조군과 비교하여, 콜라겐의 합성 촉진 효과 및 콜라겐의 당화를 억제하는 효과가 보였다.

[실시예 4]

이하의 처방에 따라 정제를 조제하였다.

자일리톨 40 ％

결정 셀룰로오스 25 ％

유당 25 ％

옥수수 전분 8 ％

스테아르산마그네슘 2 ％

상기 성분을 균일하게 혼합하고, 그 혼합 분말을 타정에 의해 정제로 하였다.

[실시예 5]

이하의 처방에 따라 정제를 조제하였다.

자일리톨 80 ％

유당 8 ％

하이드록시프로필셀룰로오스 10 ％

스테아르산마그네슘 2 ％

[실시예 6]

이하의 처방에 따라 시럽제를 조제하였다.

단시럽 30 ％

자일리톨 20 ％

정제수 50 ％

[실시예 7]

이하의 처방에 따라 캡슐제를 조제하였다.

자일리톨 99 ％

스테아르산마그네슘 1 ％

상기 성분을 균일하게 혼합하고, 그 혼합 분말을 하드 캡슐에 충전하였다.

[실시예 8]

이하의 처방에 따라 캡슐제를 조제하였다.

자일리톨 90 ％

유당 8 ％

스테아르산마그네슘 2 ％

[실시예 9]

이하의 처방에 따라 산제를 조제하였다.

자일리톨 65 ％

옥수수 전분 9.9 ％

하이드록시프로필셀룰로오스 25 ％

l-멘톨 0.1 ％

[실시예 10]

이하의 처방에 따라 드링크제를 조제하였다.

자일리톨 5 ％

산미료 1.2 ％

과당 포도당 액당 6 ％

향료 0.1 ％

정제수 87.7 ％

[실시예 11]

이하의 처방에 따라 드링크제를 조제하였다.

자일리톨 1 ％

산미료 1.4 ％

과당 포도당 액당 8 ％

향료 0.1 ％

정제수 89.5 ％

[실시예 12]

이하의 처방에 따라 드링크제를 조제하였다.

자일리톨 0.1 ％

산미료 1.2 ％

설탕 2 ％

과당 포도당 액당 8 ％

향료 0.2 ％

정제수 88.5 ％

이 출원은 2009년 11월 18일에 출원된 일본 특허 출원 제2009-262951호로부터의 우선권을 주장하는 것으로, 그 내용을 인용하여 이 출원의 일부로 하는 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> LOTTE CO., LTD. et al. <120> Synthesis Promoter of Ceramide and Collagen, and Glycosylation Inhibitor of Collagen <130> LOTTE-128WO <150> JP 2009-262951 <151> 2009-11-18 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 1 cagtgcagcc tgctttgcta 20 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 2 gcctttcgag gattcttttg atc 23 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 3 ccagaaagga ctacaggcat cacgcag 27

Claims

자일리톨을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 경구 섭취용의 세라미드 합성 촉진제.
제 1 항에 있어서,
자일리톨을 0.1 중량％ ? 99 중량％ 함유하는 것을 특징으로 하는 경구 섭취용의 세라미드 합성 촉진제.
제 1 항에 있어서,
1 일당 투여량이 피투여자의 1 일 식사로 섭취하는 칼로리 100 kcal 당 0.4 g ? 1.35 g 이 되는 양의 자일리톨을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 경구 섭취용의 세라미드 합성 촉진제.
자일리톨을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 경구 섭취용의 콜라겐 합성 촉진제.
제 4 항에 있어서,
자일리톨을 0.1 중량％ ? 99 중량％ 함유하는 것을 특징으로 하는 경구 섭취용의 콜라겐 합성 촉진제.
제 4 항에 있어서,
1 일당 투여량이 피투여자의 1 일 식사로 섭취하는 칼로리 100 kcal 당 0.4 g ? 1.35 g 이 되는 양의 자일리톨을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 경구 섭취용의 콜라겐 합성 촉진제.
자일리톨을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 경구 섭취용의 콜라겐 당화 (糖化) 억제제.
제 7 항에 있어서,
자일리톨을 0.1 중량％ ? 99 중량％ 함유하는 것을 특징으로 하는 경구 섭취용의 콜라겐 당화 억제제.
제 7 항에 있어서,
1 일당 투여량이 피투여자의 1 일 식사로 섭취하는 칼로리 100 kcal 당 0.4 g ? 1.35 g 이 되는 양의 자일리톨을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 경구 섭취용의 콜라겐 당화 억제제.