KR20120082141A - 바이오 에탄올 생산 향상용 피루브산 탈카르복실산 효소와 알코올 탈수소화 효소를 코딩하는 유전자가 도입된 형질전환체 및 그 균주를 이용한 에탄올 생성방법 - Google Patents
바이오 에탄올 생산 향상용 피루브산 탈카르복실산 효소와 알코올 탈수소화 효소를 코딩하는 유전자가 도입된 형질전환체 및 그 균주를 이용한 에탄올 생성방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 글리세롤을 발효원으로 이용하도록 조작되어진 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 글리세롤 생산 유전자의 결손을 통하여 부산물인 글리세롤 생산을 저해시킨 균주에의 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)와 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)을 과발현 시킴으로써 바이오 에탄올 생산능이 향상된 형질전환체 및 그 형질전환체를 이용한 에탄올 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 생산하는 글리세롤의 합성 경로인 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 2(glycerol dehydrogenase)와 효모 글리세롤 채널 Fps1p 를 인코딩하는 FPS1의 유전자를 결손 시켜 글리세롤의 생산량이 줄어들며 상대적으로 에탄올 생산능이 향상되어진 효모 형질 전환체에 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(pdc) 및 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adh)가 도입된 재조합체를 제작하며 이를 이용한 에탄올 생산 증대 방법에 대한 것이다.
Description
본 발명은 글리세롤을 발효원으로 이용하도록 조작되어진 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 글리세롤 생산 유전자의 결손을 통하여 글리세롤 생산을 저해시킴으써 바이오 에탄올 생산능이 향상된 형질전환체에 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)와 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)를 과발현할 수 있는 재조합 균주 및 이 균주를 이용하여 에탄올을 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 글리세롤을 발효원으로 이용하도록 제작되어진 형질전환체에서의 에탄올 생산능 증대를 위하여 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)에서 10% 정도의 부산물로 생산이 되어지는 글리세롤의 합성 경로인 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 2(glycerol dehydrogenase)와 효모 글리세롤 채널 Fps1p를 인코딩하는 FPS1의 유전자를 결손 시켜 글리세롤의 생산량을 줄이며 상대적으로 에탄올 생산능이 향상되어진 형질전환체에 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(이하, 'pdc'라 함) 및 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(이하, 'adh'라 함)가 도입된 재조합체를 제작하며 이를 이용한 에탄올 생산 증대 방법에 대한 것이다.
에탄올은 현재 산업 용매로써 거대한 시장을 형성하고 있으며, 앞으로 자동차 등의 수송연료로 사용 가능성이 현실화되고 있어 계속적인 수요 증가가 예상되고 있다.
글리세롤은 C3H8O3로 C6H12O6인 글루코오스 (glucose)에 비하여 1단계 환원된 물질로서 미생물의 대사 과정에서 보다 향상된 환원력을 제공할 수 있다. 발효를 통하여 생산되는 많은 물질이 그 대사과정에서 환원력을 요구하는 경우가 많기 때문에 글리세롤을 기질로 효과적으로 이용할 수 있다면, 원하는 발효산물의 수율 및 생산성의 향상을 가져 올 수 있다. 현재 바이오 디젤의 생산량이 늘어남에 따라 글리세롤의 생산량 늘어났기 때문에 가격이 급격히 하락하고 있는 실정이다. 상기한 바와 같이 바이오디젤의 생산량이 급증함에 따라, 부산물인 글리세롤의 생산도 늘어나 글리세롤을 포함하고 있는 부산물을 효과적으로 처리하는 문제가 발생할 것이다. 따라서 글리세롤을 이용하여 효과적으로 발효에 의해 유용한 발효산물을 생산할 수 있다면 많은 부속 효과를 가져 올 수 있다.
에탄올 발효를 위한 저비용의 효소적 방법을 개발하는 것은 기질 이용의 효율 및 발효 공정의 경제성을 향상시키는데 있어 매우 큰 잠재력을 갖는다. 따라서, 효소를 개발하는 것, 그리고 유리하게는 복합 당의 효율적인 해중합 (depolymerization)에 사용될 수 있고 이후에 상기 당을 알콜로 신속하게 발효시킬 수 있는 그러한 효소를 생산하는 생물촉매를 개발하는 것은 매우 유익할 것이다.
그람-음성 및 그람-양성 박테리아와 같은 특정 미생물은, 예를 들어 셀룰로스 및 헤미셀룰로스의 해중합을 통한 발효가능한 당의 생산, 당의 피루베이트로의 전환, 기질 피루베이트의 아세트알데히드로의 전환, 및 최후로는 기질 아세트알데히드의 에탄올로의 전환을 촉매할 수 있는 다수의 발효 효소를 생산한다. 그러나, 그러한 생물체가 필수적인 모든 효소를 가장 바람직한 양으로 생산하는 경우는 거의 없다.
따라서, 본 발명은 형질전환체에서 높은 수준으로 발현될 수 있는 피루베이트 데카르복실라제를 코딩하는 유전자 및 알코올 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자를 제공하고 그에 따라, 에탄올 발효에 필요한 나머지 핵심 효소들을 생산하는 생물체와 함께 배양할 때, 우수한 양의 에탄올 생산을 달성할 수 있다. 피루베이트 데카르복실라제 (PDC) 효소는 단일적으로 또는 알코올 탈수소화(ADH) 효소와 함께 원하는 활성의 혼합물을 지닌 조 추출물로서 사용될 수도, 또는 정제된 조성물로서 사용될 수도 있다. 본 발명은, 적어도 부분적으로는 박테리아에서 에탄올 발효의 핵심 효소-코딩 유전자를 발견한 것에 기초한다. 알코올 탈수소화(ADH) 효소는 많은 유기체에서 생체내 일차 알코올의 대사에 중요한 효소이다. 이 효소는 가역적으로 알코올을 알데히드 (aldehyde)로 산화시키는 반응을 촉매한다(Jeffery et al., 1981; Neale et al., 1986).이 ADH는 조효소로 NAD + (H) 또는 NADP(H)를 이용하며, 박테리아 (Reid amp; Fewson, 1994), 효모 (Shain etal., 1992), 식물 (Gaut amp; Clegg, 1991; Schwartz amp; Endo, 1966; Sun amp; Plapp, 1992; van der Straeten et al., 1991; Bicsak, T. A. et al., 1982), 곤충 (Danielesson et al., 1994), 척추동물 (Bonnichesen amp; Wassen,1948; Sun amp; Plapp, 1992), 그리고 사람 (Satre et al., 1994; von Wartburg et al., 1964; Yasunami et al., 1991)에 이르기까지 거의 모든 생물종에 분포되어 있다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 글리세롤을 발효원으로 이용시 바이오 에탄올 제조에 있어서 생산균주인 효모에서 바이오에탄올 생산량이 증대될 수 있도록 개량되어진 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용한 에탄올 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 포함하는 에탄올 생성용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사카로마이시스 세레비지애 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)를 코딩하는 유전자와 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 함유하는 발현벡터 pGcyaDakAdhPdc를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 피루브산 탈카르복실산 효소 (pyruvate decarboxylase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 서열번호 1에 기재된 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등의 돌연변이가 유발된 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 가진 돌연변이체도 본 발명의 피루브산 탈카르복실산 효소에 포함된다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 피루브산 탈카르복실산 효소 (pyruvate decarboxylase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 2에 기재된 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제너러시를 고려하여 상기 서열번호 2에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 피루브산 탈카르복실산 효소 유전자에 포함된다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서, 상기 알코올 탈수소화(alcohol dehydrogenase) 효소를 인코딩하는 유전자는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 서열번호 3에 기재된 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등의 돌연변이가 유발된 알코올 탈수소화 활성을 가진 돌연변이체도 본 발명의 효소에 포함된다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서, 상기 알코올 탈수소화(alcohol dehydrogenase) 효소를 인코딩하는 서열번호 4에 기재된 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제너러시를 고려하여 상기 서열번호 4에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 알코올 탈수소화(alcohol dehydrogenase) 효소를 인코딩하는 유전자에 포함된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 발현벡터는 도 4a에 기재된 개열지도를 가지는 발현벡터pGcyaDakAdhPdc인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 본 발명의 형질전환체는 효모, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 속 미생물 유래인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 발현벡터를 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)와 효모 글리세롤 채널 FPS1을 인코딩하는 FPS1 (glycerol facilitator channel) 유전자가 결손된 형질전환체에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)는 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 서열번호 5에 기재된 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등의 돌연변이가 유발된 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 가진 돌연변이체도 본 발명의 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제에 포함된다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 유전자는 서열번호 6에 기재된 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제너러시를 고려하여 상기 서열번호 6에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 유전자에 포함된다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서, 상기 효모 글리세롤 채널 Fps1을 인코딩하는 FPS1은 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 서열번호 7에 기재된 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등의 돌연변이가 유발된 글리세롤 파실리테이터 채널 활성을 가진 돌연변이체도 본 발명의 효모 글리세롤 채널에 포함된다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서, 상기 효모 글리세롤 채널 Fps1을 인코딩하는 FPS1유전자는 서열번호 8에 기재된 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제너러시를 고려하여 상기 서열번호 8에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 효모 글리세롤 채널 유전자에 포함된다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 형질전환체에 글리세롤 디히드로게나제, 디히드록시아세톤 키나아제, 및 글리세롤 업테이크 프로테인 유전자를 추가로 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase)는 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 서열번호 9에 기재된 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등의 돌연변이가 유발된 글리세롤 디히드로게나제 활성을 가진 돌연변이체도 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase) 유전자는 서열번호 10에 기재된 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제너러시를 고려하여 상기 서열번호 10에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서, 상기 디히드록시아세톤 키나아제(dihydroxyacetone kinase)는 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 서열번호 11에 기재된 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등의 돌연변이가 유발된 디히드록시아세톤 키나아제 활성을 가진 돌연변이체도 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서, 상기 디히드록시아세톤 카나아제 유전자는 서열번호 12에 기재된 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제너러시를 고려하여 상기 서열번호 12에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서, 상기 글리세롤 업테이크 프로테인은 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 서열번호 13에 기재된 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등의 돌연변이가 유발된 디히드록시아세톤 키나아제 활성을 가진 돌연변이체도 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서, 상기 글리세롤 업테이크 프로테인 유전자는 서열번호 14에 기재된 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제너러시를 고려하여 상기 서열번호 14에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 글리세롤을 기질로 하여 상기 본 발명의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 글리세롤을 이용한 에탄올 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 형질전환체를 포함하는 에탄올 생성용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명의 상기 본 발명의 형질전환체의 제조방법에 의해 형성된 형질전환체에 추가적으로 재조합된 벡터 pGcyaDakAdhPdc 및 pGupCas를 형질전환시키는 단계를 포함하는 글리세롤을 이용한 에탄올 생산용 형질전환체의 제조방법을 제공한다.
상기 본 발명의 형질전환체 제조방법의 일 구체예에 있어서, 상기 재조합된 벡터 pGcyaDakAdhPdc, 및 pGupCas는 도 4a 및 4b에 기재된 개열지도를 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 글리세롤을 기질로 하여 본 발명의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 에탄올 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에 있어서, 상기 글리세롤은 바이오디젤의 부산물로 생성된 글리세롤인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 본 발명의 형질전환체를 포함하는 에탄올 생산용 조성물을 제공한다.본 발명의 에탄올 생성물 조성물은 예를 들어 상기 형질전환체를 배양하여 글리세롤을 기질로 하여 에탄올을 생성하는데 적합한 폴리펩타이드, 브로쓰, 세포 용해물, 정제 또는 정제되지 않은 효소 추출물 또는 폴리펩타이드 등을 포함한다.
본 발명에서 효모를 숙주로서 사용하는 경우는, 발현벡터로서, 예를 들면 YEp13, YCp50, pRS계, pYEX계 벡터 등이 이용가능하다. 프로모터로서는, 예를 들면 GAL프로모터, AOD프로모터 등을 사용할 수 있다. 효모에의 재조합체 DNA의 도입방법으로서는, 예를 들면 일렉트로포레이션법(Method Enzymol., 194, 182-187(1990)), 스페로플라스트법(Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 84, 1929-1933(1978)), 아세트산리튬법(J. Bacteriol., 153, 163-168(1983)) 등이 이용가능하다.
또, 재조합벡터에는, 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 또는, 균체밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 또 가진 것도 가능하다.
본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.
또 배양방법은, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다.대장균 등의 세균을 숙주로 해서 얻게 된 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB배지,NB배지 등을 들 수 있다. 또, 배양온도는 상기 언급한 적온의 범위에서 배양함으로써 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase), 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase), 글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase)와 디히드록시아세톤 키나아제 (dihydroxyacetone kinase) 또는 글리세롤 업테이크 프로테인 (glycerol uptake protein)을 균체 내에 축적시키고, 회수한다.
탄소원은 미생물의 증식에 필요하고, 예를 들면 글루코스, 프럭토스, 슈크로스, 말토스, 갈락토스, 전분 등의 당류; 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급알콜류; 글리세롤 등의 다가알콜류; 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산 등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 이용할 수 있다.
질소원으로서는, 예를 들면 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄등의 암모늄염 외에, 펩톤, 고기즙, 효모엑기스,맥아엑기스, 카제인분해물, 옥수수 침지액 등의 천연물유래의 것을 들 수 있다. 또, 무기물로서는, 예를 들면 인산제 1칼륨,인산제 2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다. 배양액에, 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가해도 된다.
또, 프로모터가 유도성의 발현벡터를 사용해서 형질전환한 미생물을 배양하는 경우는, 프로모터의 종류에 적합한 유도물질을 배지에 첨가하면 된다. 예를 들면, 이소프로필--D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 테트라사이클린, 인돌아크릴산(IAA) 등을 유도물질로서 들 수 있다.
피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase), 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase), 글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase)와 디히드록시아세톤 키나아제 (dihydroxyacetone kinase) 또는 글리세롤 업테이크 프로테인 (glycerol uptake protein)의 취득은, 얻게 되는 배양물 중으로부터, 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 추출, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피, 겔여과 등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행할 수 있다.
얻게 된 정제물질이 목적의 효소인 것의 확인은, 통상의 방법, 예를 들면 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 웨스턴블로팅등에 의해 행할 수 있다.
이하, 본 발명을 설명한다.
본 발명은 글리세롤을 발효원으로 이용하도록 조작되어진 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 글리세롤 생산 유전자의 결손을 통하여 부산물인 글리세롤 생산을 저해시킴으써 주산물인 바이오 에탄올 생산능이 향상된 형질전환체에의 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)와 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)의 과발현 형질전환체를 이용한 에탄올 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 생산하는 글리세롤의 합성 경로인 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 2(glycerol dehydrogenase)와 효모 글리세롤 채널 Fps1p 를 인코딩하는 FPS1의 유전자를 결손 시켜 글리세롤의 생산량이 줄어들며 상대적으로 에탄올 생산능이 향상되어진 효모 형질 전환체에 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(pdc) 및 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adh)가 도입된 재조합체를 제작하며 이를 이용한 에탄올 생산 증대 방법에 대한 것이다.
본 발명의 사카로마이세스 세레비지애 속 미생물로부터 유래한 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 2(glycerol dehydrogenase)와 효모 글리세롤 채널 Fps1p 를 인코딩하는 FPS1의 유전자의 결손을 통한 글리세롤 생산능을 저해함으로써 에탄올 생산능이 증가된 이 균주에 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(pdc), 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)와 글리세롤을 이용하도록 제작되어진 유전자를 형질 전환시켜 기존의 형질전환체와 비교시 에탄올 생산능이 증가됨을 확인하였다. 또한, 본 발명에 따라 글리세롤을 탄소원으로 이용하도록 제작되어진 사카로마이세스 세레비지애 속 미생물로부터 생산되어지는 글리세롤의 생산을 저해한 효모 형질 전환체는 공정에 유용하게 사용될 수 있다. 글리세롤을 기질로 한 발효결과 상기 유전자가 결손 되어진 효모 형질 전환체에 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)와 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)를 과발현시 기존의 유전자 결손만을 시킨 효모균주보다 많은 양의 에탄올을 생성하였다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
사카로마이세스 세레비제에서의 글리세롤 생산 경로에 관여하는 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase, gpd)와 글리세롤 외분비 통로인 Fps1의 유전자를 결손 시킴으로 에탄올 생산 증대된 균주에서 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)와 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)의 과발현을 통하여 보다 더 증대된 에탄올 생산량이 증대되었다.
본 발명의 실시예에서는 사카로마이세스 세레비지에를 주형으로 한 PCR반응을 통하여 PDC1와 ADH1 각각 1.6kb, 1.0kb의 PCR product를 얻었고, 얻어진 PCR product를 pGcyaDak 유전자에 클로닝하여 효모에 형질전환 함으로써 글리세롤 생산경로를 차단한 균주에의 삽입을 통하여 보다 에탄올 생산능이 증대된 균주를 제작하였으며 이후, Gup1의 유전자 삽입을 위하여 효모-유전자 삽입벡터( yeast-integration vector)에 구축하였으며 이를 사카로마이세스 세레비지애에 유전자 삽입하였다. 상기 유전자로부터 발현되는 단백질의 글리세롤을 이용한 에탄올 생산을 조사하였다.
이로써, 본 발명에 따라 재조합되고 형질 전환된 사카로마이시스 세레비지애 YPH499fps1 △ gpd2 △ (pGcyaDak, pGupCas)에 의하여 에탄올 생산이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
따라서 대표적인 에탄올 생산균주인 효모 사카로마이시스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에서의 글리세롤을 이용한 에탄올 생산량의 증대를 위하여 본 발명자는 사카로마이시스 세레비지애로부터 유래한 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)와 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)를 과발현하였고, 글리세롤 생산 경로가 차단되어진 균주에의 형질전환을 통하여 효모 형질 전환체를 개발하여 이를 대한민국 서울시 서대문구 홍제1동 유림빌딩 소재 한국미생물보존센터(KCCM)에 2010년 12월 17일 사카로마이시스 세레비지애 YPH499fps1 △g p d2△ (pGcyaDakAdhPdc,pGupCas) 기탁번호 KCCM11152P로 기탁하였다.뿐만 아니라 상기 효모 형질 전환체가 탄소원으로 글리세롤을 효율적으로 이용하여 에탄올 생산이 효율적으로 증가한다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서는 사카로마이세스 세레비지애에서의 글리세롤을 탄소원으로 이용하도록 제작되어진 형질전환체에서의 에탄올 생산 증대를 위하여 글리세롤 생산 유전자, 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 와 효모 글리세롤 채널 Fps1을 결손시킨 형질전환체에서의 보다 높은 에탄올 생산능을 위하여 피루브산 탈카르복실산 효소와 알코올 탈수소화 효소 코딩하는 유전자를 도입한 형질전환체를 이용하였으며 에탄올 생산량 증대를 이루었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 속 미생물 유래의 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)와 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)를 과발현을 통하여 에탄올 생산능이 증대되었으며 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase, gpd2)와 글리세롤 외분비 통로인 효모 글리세롤 채널 Fps1의 유전자 결손을 통하여 글리세롤 생산을 억제하였으며 또한 글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase)와 디히드록시아세톤 키나아제 (dihydroxyacetone kinase) 유전자가 도입된 형질전환체에 글리세롤 업테이크 프로테인 (glycerol uptake protein)을 유전자 삽입한 재조합 벡터를 효모 균주에 도입하였다. 이후, 상기 효모균주에 비하여 에탄올 생산수율이 높아진 것을 확인하였다. 본 발명에 따라 글리세롤을 탄소원으로 이용하도록 조작되어진 균주에의 글리세롤 생산 유전자를 차단하고 이에 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)와 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)를 과발현함으로써 제작되어진 효모 형질 전환체는 바이오디젤의 부산물로 생성이 되는 글리세롤을 이용하여 많은 양의 에탄올을 생산할 수 있어 매우 유용한 발명인 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에서 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)와 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)를 인코딩하는 유전자를 확인한 그림이고, Lane 1, 1kb DNA 마커; Lane 2, PDC1, Lane 3, ADH1 유전자를 확인한 그림을 나타낸다.
도 2은 본 발명에서 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)와 FPS1의 유전자 결손을 위한 homology arm의 확인을 위한 PCR 산물을 확인한 그림이고, Lane 1, 1kb DNA 마커; Lane 2, Fps1의 유전자 결손을 위하여 Zeocin 내성 유전자의 5'와 3'에 Fps1 homology arm이 형성된 것 이며, Lane 3, Gpd2의 유전자 결손을 위하여 Kanamycin 내성 유전자의 5'와 3'에 Gpd2 homology arm이 형성된 것 을 확인한 그림을 나타낸다.
도 3(A)는 본 발명에서 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 글리세롤 디히드로게나제 유전자의 PCR 산물을 확인한 그림이고, Lane 1, 1kb DNA 마커; Lane 2, Gcy PCR 산물이며,
도 3(B)는 본 발명에서 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 디히드록시아세톤 키나아제 유전자의 PCR 산물을 확인한 그림이고, Lane 1, 1kb DNA 마커; Lane 2, Dak PCR 산물이며,
도 3(C)는 본 발명에서 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 글리세롤 업테이크 프로테인 유전자의 PCR 산물을 확인한 그림이고, Lane 1, 1kb DNA 마커; Lane 2, Gup PCR 산물을 나타낸다.
도 4a는 본 발명에서 제시된 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)와 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)를 글리세롤 디히드로게나제 유전자와 디히드록시아세톤 키나아제 유전자가 양방향으로 삽입된 재조합 벡터 pGcyaDak에 유전자 삽입하는 재조합 과정을 나타낸 모식도이고,
도 4b는 본 발명에서 제시된 글리세롤 업테이크 프로테인의 유전자 삽입을 위하여 구축한 재조합 벡터 pGup의 재조합 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 본 발명에서 제시된 유전자 결손된 균주에 재조합 벡터 pGcyaDakAdhPdc, pGup를 형질전환하여 glycerol을 기질로 하여 에탄올 생산량이 증대됨을 생산함을 확인한 그래프이다. 도 5에서 심벌은 검은색 ▲, YPH499 (pESC-TRP);푸른색 ◆,사카로마이시스 세레비지애 YPH499fps1 △ gpd2 △ (pGcyaDak, pGupCas);붉은색 ■,사카로마이시스 세레비지애 YPH499fps1 △ gpd2 △ (pGcyaDakAdhPdc,pGupCas)을 나타낸다.
도 2은 본 발명에서 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)와 FPS1의 유전자 결손을 위한 homology arm의 확인을 위한 PCR 산물을 확인한 그림이고, Lane 1, 1kb DNA 마커; Lane 2, Fps1의 유전자 결손을 위하여 Zeocin 내성 유전자의 5'와 3'에 Fps1 homology arm이 형성된 것 이며, Lane 3, Gpd2의 유전자 결손을 위하여 Kanamycin 내성 유전자의 5'와 3'에 Gpd2 homology arm이 형성된 것 을 확인한 그림을 나타낸다.
도 3(A)는 본 발명에서 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 글리세롤 디히드로게나제 유전자의 PCR 산물을 확인한 그림이고, Lane 1, 1kb DNA 마커; Lane 2, Gcy PCR 산물이며,
도 3(B)는 본 발명에서 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 디히드록시아세톤 키나아제 유전자의 PCR 산물을 확인한 그림이고, Lane 1, 1kb DNA 마커; Lane 2, Dak PCR 산물이며,
도 3(C)는 본 발명에서 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 글리세롤 업테이크 프로테인 유전자의 PCR 산물을 확인한 그림이고, Lane 1, 1kb DNA 마커; Lane 2, Gup PCR 산물을 나타낸다.
도 4a는 본 발명에서 제시된 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)와 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)를 글리세롤 디히드로게나제 유전자와 디히드록시아세톤 키나아제 유전자가 양방향으로 삽입된 재조합 벡터 pGcyaDak에 유전자 삽입하는 재조합 과정을 나타낸 모식도이고,
도 4b는 본 발명에서 제시된 글리세롤 업테이크 프로테인의 유전자 삽입을 위하여 구축한 재조합 벡터 pGup의 재조합 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 본 발명에서 제시된 유전자 결손된 균주에 재조합 벡터 pGcyaDakAdhPdc, pGup를 형질전환하여 glycerol을 기질로 하여 에탄올 생산량이 증대됨을 생산함을 확인한 그래프이다. 도 5에서 심벌은 검은색 ▲, YPH499 (pESC-TRP);푸른색 ◆,사카로마이시스 세레비지애 YPH499fps1 △ gpd2 △ (pGcyaDak, pGupCas);붉은색 ■,사카로마이시스 세레비지애 YPH499fps1 △ gpd2 △ (pGcyaDakAdhPdc,pGupCas)을 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 효모의 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)와 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자의 형질전환
<실시예 1-1> 효모의 PDC1과 ADH1의 유전자의 증폭
피루브산에서 에탄올로의 전환을 위하여 작용하는 두가지 핵심 효소인 PDC1과 ADH1의 과발현을 통한 에탄올 생산의 증대를 위하여 유전자를 클로닝하기 위하여 사카로마이시스 세레비지애의 지노믹디엔에이 (BY4741) 로부터 펩타이드 부분의 염기서열을 참고로 하여 PDC의 클로닝을 위하여 Pst(5-ctgcagatga gttatactgt cggtacctat-3;서열번호 15), Sph( 5-ttcggacaat tgttcgagga gatccgtacg-3;서열번호 16), ADH는 Xba (5-tctagaatgg cttcttcaac tttttatatt-3;서열번호 17), Sal(5-cttgagaagg actcgcgaaa gattcagctg-3;서열번호 18) 으로 각각의 인식서열이 삽입되도록 프라이머를 디자인하여 합성하였다. 이후 상기 합성된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과 각각 1.6kb, 1.0kb의 PCR 밴드를 확인할 수 있었고 도면 1에 각각 도시하였다.
<실시예 1-2> 효모의 PDC1과 ADH1의 유전자의 클로닝
상기 실시예 1에서 얻은 증폭산물을 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하였고 아가로스 겔 상의 DNA 절편은 Biospin gel extraction kit (Bioflux)를 사용하여 회수하였다.
그 후, PDC1은 Pst,Sph ADH1는 Xba, Sal로 절단한 후 각각의 제한효소로 절단한 후 글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase)와 디히드록시아세톤 키나아제 (dihydroxyacetone kinase)의 유전자가 양방향 삽입되어진 pGcyaDak에 라이게이션(ligation) 시켜 대장균(E. coli) DH5a(인비트로겐(Invitrogen)에 형질전환을 하였다. 이어 형질 전환체로부터 라이게이션 (ligation) 된 재조합 플라스미드 DNA를 분리하였다. 상기 재조합 벡터를 각각pGupCaspGcyaDakAdhPdc이라 명명하였으며 이를 4a에 도식화 하였다.
재조합된 벡터 pGcyaDakAdhPdc, pGupCas를 글리세롤 생산경로가 차단되어진 돌연변이체 균주(YPH499fps1gpd2)에 클론테크 (clontech)사의 이스트메이커 이스트 트랜스포메이션 키트 (YEASTMAKER yeast transformation kit2) 에서 제공하는 실험방법에 따라 효모 숙주세포를 형질 전환시켰다. 이후, 트립토판 결핍 SD배지 (0.67% yeast nitrogen base, 2% glucose, 0.067% yeast nigrogen base w/o trp, 2% agar)을 이용하여 형질 전환체를 선별하였으며, 이를 사카로마이시스 세레비지애 YPH499fps1 △ gpd2 △ (pGcyaDakAdhPdc, pGupCas)라 명명하였다.
<실시예 2> 효모의 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase, gpd2),효모 글리세롤 채널 Fps1 유전자의 결손
글리세롤의 생산 경로의 차단을 위하여 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase, gpd2),효모 글리세롤 채널 Fps1 유전자의 결손을 위하여 forward (5-atgagtaatcctcaaaaagctctaaacgactgagccatattcaacgg
gaaacgtcttgctcagtttcatttgatgctcgatgagtttttccattatggtaatgctaagaaggtaacatga-3;서열번호 19)에 Fps1의 start codon에서부터 40mer까지의 유전자를 포함시켰으며 reverse(5'-gtcaaagtaaactacgagctactcaaaaaggtaataccattactattcttccattgtacttcatgttaccttcttatcattaccataatggaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactg-3';서열번호 20)에 Fps1의 stop codon이 포함시켰으며 pPICZ 벡터 (Invitrogen, USA) 디엔에이를 주형으로 한 PCR반응을 통하여 1.5kb의 양 옆에 각각 Fps1 유전자의 start codon과 stop codon이 포함되어졌으며 Zeocin 내성을 가지는 PCR product를 얻었고, 또한 같은 방법으로 Gpd2의 유전자 결손을 위하여 forward (5-atgcttgctgtcagaagattaacaagatacacattccttagtgttgacaa
ttaatcatcggcatagtatagggadgctcgaaggctttaatttgcaagct-3;서열번호 21),reverse (5'-attgaagagctagacatcgatgacgaatagcccctgcgagcttccgaaattaaacgttcgataacttctcgatctgtagctactgcttattattcgtcatcgatgtctagctcttcaatagcttgcaaattaaagccttcgagcgtcccc;서열번호 22) 프라이머를 이용하여 pET28a 벡터(Invitrogen, USA) 디엔에이를 주형으로 한 PCR반응을 통하여 1.5kb PCR product를 얻었고, 얻어진 Kanamycin내성을 가지도록 하는 유전자와 5'와 3'에 Gpd2에 유사성을 가지는 부위를 첨가함으로써 각각의 PCR product를 효모 YPH499 (MATa ura3-52lys2-801_amberade2-101_
ochretrp1-63his3-200leu2-1) (Clontech Laboratories, Inc.) homologous recombination 함으로써 Fps1, Gpd2 유전자 결손 균주를 제작하였다. 이후, Zeocin, Kanamycin이 포함된 YPD배지 (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, and 2% glucose, 2% agar)를 이용하여 유전자 결손된 균주를 선별하였으며 유전자 결손을 위한 PCR 밴드는 도면 2에 도시하였다. 이를 사카로마이시스 세레비지애 YPH499fps1△ gpd2 △라 명명하였다.
<실시예 3> 글리세롤 디히드로게나제, 디히드록시아세톤 키나아제, 글리세롤 업테이크 프로테인 유전자의 형질전환
<실시예 3-1> 효모의 글리세롤 디히드로게나제, 디히드록시아세톤 키나아제, 글리세롤 업테이크 프로테인 유전자의 증폭
글리세롤을 해당과정의 중간물질인 DHAP로 효율적으로 전환하기 위하여 글리세롤 디히드로게나제, 디히드록시아세톤 키나아제 유전자를 클로닝하기 위하여 사카로마이시스 세레비지애의 지노믹디엔에이 (BY4741) 로부터 펩타이드 부분의 염기서열을 참고로 하여 Gcy의 클로닝을 위하여 BamH (5-ggatccatgcctgctactttacatga
ttct-3;서열번호 23), Sal( 5-gtcgacatacttgaatacttcgaaaggag-3;서열번호 24), Dak는 Spe (5-actagtatgtccgctaaatcgtttgaagtc-3;서열번호 25), Cla(5-atcgatatacaaggcgctttgaaccccctt-3;서열번호 26) 그리고 Gup1에는 EcoR(5-gaattcatgtcgctgatcagcatcctg-3;서열번호 27), Spe(5-actagtccagca
ttttaggtaaattccgtg-3;서열번호 28)으로 각각의 인식서열이 삽입되도록 프라이머를 디자인하여 합성하였다. 이후 상기 합성된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과 각각 936bp, 1755bp 그리고 1683bp의 PCR 밴드를 확인할 수 있었고 도면 3에 각각 도시하였다.
<실시예 3-2> 글리세롤 디히드로게나제, 디히드록시아세톤 키나아제, 글리세롤 업테이크 프로테인 유전자의 클로닝
상기 실시예 1에서 얻은 증폭산물을 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하였고 아가로스 겔 상의 DNA 절편은 Biospin gel extraction kit (Bioflux)를 사용하여 회수하였다.
그 후, Gcy는 BamH, Sal, Dak는 Spe, Cla그리고 Gup1은 EcoR, Spe으로 절단한 후 효모-대장균 셔틀 벡터 (yeast-E. coli shuttle vector) 인 pESC-trp (Clontech) 에 라이게이션 (ligation) 시켜 에스세리시아 콜라이 (대장균, E. coli) DH5a에 형질 전환을 하였다. 이어 형질 전환체로부터 라이게이션 (ligation) 된 재조합 플라스미드 DNA를 분리하였다. 상기 재조합 벡터를 각각pESC-Gcy, pESC-Dak, pESC-Gup이라 명명하였다. 그 후 pESC-Gcy를 벡터로 하여 Dak를 클로닝하여 에스세리시아 콜라이 DH5a(인비트로겐(Invitrogen)에 형질 전환을 하였다. 이어 형질 전환체로부터 라이게이션 된 재조합 플라스미드 DNA를 분리하였다. 상기 재조합 벡터를 pGcyaDak이라 명명하였고 도면 4에 도시하였다. 또한 pESC-Gup1을 유전자 삽입하기 위하여 BamH1 인식서열을 포함하도록 sense primer (5-ggatccatgt cagcattttaggtaaattccgtg-3;서열번호 29) 그리고 anti-sence primer (5-ggatccataatgtcgctgatcagcatcctg tct-3;서열번호 30)를 제작하여 효모 유전자 삽입 벡터 (yeast integration vector)인 YIP-5에 클로닝하여 이를 사카로마이시스 세레비지애의 지노믹디엔에이에 유전자 삽입하였다.
<
실시예
4> 효모 형질
전환체를
이용한 바이오 에탄올의 생산
사카로마이시스 세레비지애 YPH499fps1 △ gpd2 △ (pGcyaDak, pGupCas)와 사카로마이시스 세레비지애 YPH499fps1△ gpd2 △ (pGcyaDak, pGupCas)를 갈락토오스로 발현 유도되는 SG배지에서 24시간 전배양 후 48시간 진탕 배양하여 2%의 글리세롤이 기질로 첨가된 발효배지에 600nm파장에서 흡광도를 측정했을 때 각각 1가 되도록 한다. 상기 발효배양액을 30℃, 100rpm에서 배양하며 일정한 시간별로 배양액을 채취하여 가스 크로마토그래피를 실시함으로 생산된 에탄올을 측정하였다. 상기 방법대로 실행결과 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)와 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)유전자 과발현되어진 균주 사카로마이시스 세레비지애 YPH499fps1 △ gpd2 △ YPH499fps1gpd2(pGcyaDakAdhPdc, pGupCas)에서의 에탄올 생산수율이 사카로마이시스 세레비지애 YPH499fps1△ gpd2 △ (pGcyaDak, pGupCas)보다 높게 측정이 되었다. 이 결과를 도면 5에 도시하였다.
<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION
<120> Recombinant yeast by overexpression of pyruvate decarboxylase and
alcohol dehydrogenase for improving productivity of bioethanol
and Method for producing ethanol using the same
<160> 30
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 563
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 1
Met Ser Glu Ile Thr Leu Gly Lys Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Lys Gln
1 5 10 15
Val Asn Val Asn Thr Val Phe Gly Leu Pro Gly Asp Phe Asn Leu Ser
20 25 30
Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Glu Val Glu Gly Met Arg Trp Ala Gly Asn
35 40 45
Ala Asn Glu Leu Asn Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Ile
50 55 60
Lys Gly Met Ser Cys Ile Ile Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser
65 70 75 80
Ala Leu Asn Gly Ile Ala Gly Ser Tyr Ala Glu His Val Gly Val Leu
85 90 95
His Val Val Gly Val Pro Ser Ile Ser Ala Gln Ala Lys Gln Leu Leu
100 105 110
Leu His His Thr Leu Gly Asn Gly Asp Phe Thr Val Phe His Arg Met
115 120 125
Ser Ala Asn Ile Ser Glu Thr Thr Ala Met Ile Thr Asp Ile Ala Thr
130 135 140
Ala Pro Ala Glu Ile Asp Arg Cys Ile Arg Thr Thr Tyr Val Thr Gln
145 150 155 160
Arg Pro Val Tyr Leu Gly Leu Pro Ala Asn Leu Val Asp Leu Asn Val
165 170 175
Pro Ala Lys Leu Leu Gln Thr Pro Ile Asp Met Ser Leu Lys Pro Asn
180 185 190
Asp Ala Glu Ser Glu Lys Glu Val Ile Asp Thr Ile Leu Ala Leu Val
195 200 205
Lys Asp Ala Lys Asn Pro Val Ile Leu Ala Asp Ala Cys Cys Ser Arg
210 215 220
His Asp Val Lys Ala Glu Thr Lys Lys Leu Ile Asp Leu Thr Gln Phe
225 230 235 240
Pro Ala Phe Val Thr Pro Met Gly Lys Gly Ser Ile Asp Glu Gln His
245 250 255
Pro Arg Tyr Gly Gly Val Tyr Val Gly Thr Leu Ser Lys Pro Glu Val
260 265 270
Lys Glu Ala Val Glu Ser Ala Asp Leu Ile Leu Ser Val Gly Ala Leu
275 280 285
Leu Ser Asp Phe Asn Thr Gly Ser Phe Ser Tyr Ser Tyr Lys Thr Lys
290 295 300
Asn Ile Val Glu Phe His Ser Asp His Met Lys Ile Arg Asn Ala Thr
305 310 315 320
Phe Pro Gly Val Gln Met Lys Phe Val Leu Gln Lys Leu Leu Thr Thr
325 330 335
Ile Ala Asp Ala Ala Lys Gly Tyr Lys Pro Val Ala Val Pro Ala Arg
340 345 350
Thr Pro Ala Asn Ala Ala Val Pro Ala Ser Thr Pro Leu Lys Gln Glu
355 360 365
Trp Met Trp Asn Gln Leu Gly Asn Phe Leu Gln Glu Gly Asp Val Val
370 375 380
Ile Ala Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Gly Ile Asn Gln Thr Thr Phe
385 390 395 400
Pro Asn Asn Thr Tyr Gly Ile Ser Gln Val Leu Trp Gly Ser Ile Gly
405 410 415
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Leu Gly Ala Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ile
420 425 430
Asp Pro Lys Lys Arg Val Ile Leu Phe Ile Gly Asp Gly Ser Leu Gln
435 440 445
Leu Thr Val Gln Glu Ile Ser Thr Met Ile Arg Trp Gly Leu Lys Pro
450 455 460
Tyr Leu Phe Val Leu Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Ile Glu Lys Leu Ile
465 470 475 480
His Gly Pro Lys Ala Gln Tyr Asn Glu Ile Gln Gly Trp Asp His Leu
485 490 495
Ser Leu Leu Pro Thr Phe Gly Ala Lys Asp Tyr Glu Thr His Arg Val
500 505 510
Ala Thr Thr Gly Glu Trp Asp Lys Leu Thr Gln Asp Lys Ser Phe Asn
515 520 525
Asp Asn Ser Lys Ile Arg Met Ile Glu Ile Met Leu Pro Val Phe Asp
530 535 540
Ala Pro Gln Asn Leu Val Glu Gln Ala Lys Leu Thr Ala Ala Thr Asn
545 550 555 560
Ala Lys Gln
<210> 2
<211> 1692
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 2
atgtctgaaa ttactttggg taaatatttg ttcgaaagat taaagcaagt caacgttaac 60
accgttttcg gtttgccagg tgacttcaac ttgtccttgt tggacaagat ctacgaagtt 120
gaaggtatga gatgggctgg taacgccaac gaattgaacg ctgcttacgc cgctgatggt 180
tacgctcgta tcaagggtat gtcttgtatc atcaccacct tcggtgtcgg tgaattgtct 240
gctttgaacg gtattgccgg ttcttacgct gaacacgtcg gtgttttgca cgttgttggt 300
gtcccatcca tctctgctca agctaagcaa ttgttgttgc accacacctt gggtaacggt 360
gacttcactg ttttccacag aatgtctgcc aacatttctg aaaccactgc tatgatcact 420
gacattgcta ccgccccagc tgaaattgac agatgtatca gaaccactta cgtcacccaa 480
agaccagtct acttaggttt gccagctaac ttggtcgact tgaacgtccc agctaagttg 540
ttgcaaactc caattgacat gtctttgaag ccaaacgatg ctgaatccga aaaggaagtc 600
attgacacca tcttggcttt ggtcaaggat gctaagaacc cagttatctt ggctgatgct 660
tgttgttcca gacacgacgt caaggctgaa actaagaagt tgattgactt gactcaattc 720
ccagctttcg tcaccccaat gggtaagggt tccattgacg aacaacaccc aagatacggt 780
ggtgtttacg tcggtacctt gtccaagcca gaagttaagg aagccgttga atctgctgac 840
ttgattttgt ctgtcggtgc tttgttgtct gatttcaaca ccggttcttt ctcttactct 900
tacaagacca agaacattgt cgaattccac tccgaccaca tgaagatcag aaacgccact 960
ttcccaggtg tccaaatgaa attcgttttg caaaagttgt tgaccactat tgctgacgcc 1020
gctaagggtt acaagccagt tgctgtccca gctagaactc cagctaacgc tgctgtccca 1080
gcttctaccc cattgaagca agaatggatg tggaaccaat tgggtaactt cttgcaagaa 1140
ggtgatgttg tcattgctga aaccggtacc tccgctttcg gtatcaacca aaccactttc 1200
ccaaacaaca cctacggtat ctctcaagtc ttatggggtt ccattggttt caccactggt 1260
gctaccttgg gtgctgcttt cgctgctgaa gaaattgatc caaagaagag agttatctta 1320
ttcattggtg acggttcttt gcaattgact gttcaagaaa tctccaccat gatcagatgg 1380
ggcttgaagc catacttgtt cgtcttgaac aacgatggtt acaccattga aaagttgatt 1440
cacggtccaa aggctcaata caacgaaatt caaggttggg accacctatc cttgttgcca 1500
actttcggtg ctaaggacta tgaaacccac agagtcgcta ccaccggtga atgggacaag 1560
ttgacccaag acaagtcttt caacgacaac tctaagatca gaatgattga aatcatgttg 1620
ccagtcttcg atgctccaca aaacttggtt gaacaagcta agttgactgc tgctaccaac 1680
gctaagcaat aa 1692
<210> 3
<211> 348
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 3
Met Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Ser His
1 5 10 15
Gly Lys Leu Glu Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Ala Asn
20 25 30
Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu
35 40 45
His Ala Trp His Gly Asp Trp Pro Leu Pro Val Lys Leu Pro Leu Val
50 55 60
Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Gly Met Gly Glu Asn Val
65 70 75 80
Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Ser Cys Met Ala Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Gly Asn Glu Ser Asn Cys
100 105 110
Pro His Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln
115 120 125
Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala His Ile Pro Gln Gly Thr
130 135 140
Asp Leu Ala Gln Val Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr
145 150 155 160
Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Met Ala Gly His Trp Val Ala Ile
165 170 175
Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys
180 185 190
Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Gly Gly Glu Gly Lys Glu
195 200 205
Glu Leu Phe Arg Ser Ile Gly Gly Glu Val Phe Ile Asp Phe Thr Lys
210 215 220
Glu Lys Asp Ile Val Gly Ala Val Leu Lys Ala Thr Asp Gly Gly Ala
225 230 235 240
His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile Glu Ala Ser
245 250 255
Thr Arg Tyr Val Arg Ala Asn Gly Thr Thr Val Leu Val Gly Met Pro
260 265 270
Ala Gly Ala Lys Cys Cys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val Lys Ser
275 280 285
Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu
290 295 300
Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Leu Val Lys Ser Pro Ile Lys Val
305 310 315 320
Val Gly Leu Ser Thr Leu Pro Glu Ile Tyr Glu Lys Met Glu Lys Gly
325 330 335
Gln Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
340 345
<210> 4
<211> 1047
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 4
atgtctatcc cagaaactca aaaaggtgtt atcttctacg aatcccacgg taagttggaa 60
tacaaagata ttccagttcc aaagccaaag gccaacgaat tgttgatcaa cgttaaatac 120
tctggtgtct gtcacactga cttgcacgct tggcacggtg actggccatt gccagttaag 180
ctaccattag tcggtggtca cgaaggtgcc ggtgtcgttg tcggcatggg tgaaaacgtt 240
aagggctgga agatcggtga ctacgccggt atcaaatggt tgaacggttc ttgtatggcc 300
tgtgaatact gtgaattggg taacgaatcc aactgtcctc acgctgactt gtctggttac 360
acccacgacg gttctttcca acaatacgct accgctgacg ctgttcaagc cgctcacatt 420
cctcaaggta ccgacttggc ccaagtcgcc cccatcttgt gtgctggtat caccgtctac 480
aaggctttga agtctgctaa cttgatggcc ggtcactggg ttgctatctc cggtgctgct 540
ggtggtctag gttctttggc tgttcaatac gccaaggcta tgggttacag agtcttgggt 600
attgacggtg gtgaaggtaa ggaagaatta ttcagatcca tcggtggtga agtcttcatt 660
gacttcacta aggaaaagga cattgtcggt gctgttctaa aggccactga cggtggtgct 720
cacggtgtca tcaacgtttc cgtttccgaa gccgctattg aagcttctac cagatacgtt 780
agagctaacg gtaccaccgt tttggtcggt atgccagctg gtgccaagtg ttgttctgat 840
gtcttcaacc aagtcgtcaa gtccatctct attgttggtt cttacgtcgg taacagagct 900
gacaccagag aagctttgga cttcttcgcc agaggtttgg tcaagtctcc aatcaaggtt 960
gtcggcttgt ctaccttgcc agaaatttac gaaaagatgg aaaagggtca aatcgttggt 1020
agatacgttg ttgacacttc taaataa 1047
<210> 5
<211> 440
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 5
Met Leu Ala Val Arg Arg Leu Thr Arg Tyr Thr Phe Leu Lys Arg Thr
1 5 10 15
His Pro Val Leu Tyr Thr Arg Arg Ala Tyr Lys Ile Leu Pro Ser Arg
20 25 30
Ser Thr Phe Leu Arg Arg Ser Leu Leu Gln Thr Gln Leu His Ser Lys
35 40 45
Met Thr Ala His Thr Asn Ile Lys Gln His Lys His Cys His Glu Asp
50 55 60
His Pro Ile Arg Arg Ser Asp Ser Ala Val Ser Ile Val His Leu Lys
65 70 75 80
Arg Ala Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr
85 90 95
Thr Ile Ala Lys Val Ile Ala Glu Asn Thr Glu Leu His Ser His Ile
100 105 110
Phe Glu Pro Glu Val Arg Met Trp Val Phe Asp Glu Lys Ile Gly Asp
115 120 125
Glu Asn Leu Thr Asp Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr
130 135 140
Leu Pro Asn Ile Asp Leu Pro His Asn Leu Val Ala Asp Pro Asp Leu
145 150 155 160
Leu His Ser Ile Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Phe Asn Ile Pro His
165 170 175
Gln Phe Leu Pro Asn Ile Val Lys Gln Leu Gln Gly His Val Ala Pro
180 185 190
His Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Leu Gly Ser Lys
195 200 205
Gly Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Val Thr Asp Glu Leu Gly Ile Gln
210 215 220
Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala Lys Glu
225 230 235 240
His Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr Gln Leu Pro Lys Asp Tyr Gln
245 250 255
Gly Asp Gly Lys Asp Val Asp His Lys Ile Leu Lys Leu Leu Phe His
260 265 270
Arg Pro Tyr Phe His Val Asn Val Ile Asp Asp Val Ala Gly Ile Ser
275 280 285
Ile Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Ala Cys Gly Phe Val
290 295 300
Glu Gly Met Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Leu
305 310 315 320
Gly Leu Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Arg Met Phe Phe Pro Glu Ser
325 330 335
Lys Val Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile
340 345 350
Thr Thr Cys Ser Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Thr Tyr Met Ala
355 360 365
Lys Thr Gly Lys Ser Ala Leu Glu Ala Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly
370 375 380
Gln Ser Ala Gln Gly Ile Ile Thr Cys Arg Glu Val His Glu Trp Leu
385 390 395 400
Gln Thr Cys Glu Leu Thr Gln Glu Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr
405 410 415
Gln Ile Val Tyr Asn Asn Val Arg Met Glu Asp Leu Pro Glu Met Ile
420 425 430
Glu Glu Leu Asp Ile Asp Asp Glu
435 440
<210> 6
<211> 1323
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 6
atgcttgctg tcagaagatt aacaagatac acattcctta agcgaacgca tccggtgtta 60
tatactcgtc gtgcatataa aattttgcct tcaagatcta ctttcctaag aagatcatta 120
ttacaaacac aactgcactc aaagatgact gctcatacta atatcaaaca gcacaaacac 180
tgtcatgagg accatcctat cagaagatcg gactctgccg tgtcaattgt acatttgaaa 240
cgtgcgccct tcaaggttac agtgattggt tctggtaact gggggaccac catcgccaaa 300
gtcattgcgg aaaacacaga attgcattcc catatcttcg agccagaggt gagaatgtgg 360
gtttttgatg aaaagatcgg cgacgaaaat ctgacggata tcataaatac aagacaccag 420
aacgttaaat atctacccaa tattgacctg ccccataatc tagtggccga tcctgatctt 480
ttacactcca tcaagggtgc tgacatcctt gttttcaaca tccctcatca atttttacca 540
aacatagtca aacaattgca aggccacgtg gcccctcatg taagggccat ctcgtgtcta 600
aaagggttcg agttgggctc caagggtgtg caattgctat cctcctatgt tactgatgag 660
ttaggaatcc aatgtggcgc actatctggt gcaaacttgg caccggaagt ggccaaggag 720
cattggtccg aaaccaccgt ggcttaccaa ctaccaaagg attatcaagg tgatggcaag 780
gatgtagatc ataagatttt gaaattgctg ttccacagac cttacttcca cgtcaatgtc 840
atcgatgatg ttgctggtat atccattgcc ggtgccttga agaacgtcgt ggcacttgca 900
tgtggtttcg tagaaggtat gggatggggt aacaatgcct ccgcagccat tcaaaggctg 960
ggtttaggtg aaattatcaa gttcggtaga atgtttttcc cagaatccaa agtcgagacc 1020
tactatcaag aatccgctgg tgttgcagat ctgatcacca cctgctcagg cggtagaaac 1080
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ttgcttaacg gtcaatccgc ccaagggata atcacatgca gagaagttca cgagtggcta 1200
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tag 1323
<210> 7
<211> 669
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 7
Met Ser Asn Pro Gln Lys Ala Leu Asn Asp Phe Leu Ser Ser Glu Ser
1 5 10 15
Val His Thr His Asp Ser Ser Arg Lys Gln Ser Asn Lys Gln Ser Ser
20 25 30
Asp Glu Gly Arg Ser Ser Ser Gln Pro Ser His His His Ser Gly Gly
35 40 45
Thr Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ser Asn Asn
50 55 60
Asn Asn Asn Gly Asn Asp Gly Gly Asn Asp Asp Asp Tyr Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Met Gln Asp Tyr Arg Pro Ser Pro Gln Ser Ala Arg Pro Thr Pro Thr
85 90 95
Tyr Val Pro Gln Tyr Ser Val Glu Ser Gly Thr Ala Phe Pro Ile Gln
100 105 110
Glu Val Ile Pro Ser Ala Tyr Ile Asn Thr Gln Asp Ile Asn His Lys
115 120 125
Asp Asn Gly Pro Pro Ser Ala Ser Ser Asn Arg Ala Phe Arg Pro Arg
130 135 140
Gly Gln Thr Thr Val Ser Ala Asn Val Leu Asn Ile Glu Asp Phe Tyr
145 150 155 160
Lys Asn Ala Asp Asp Ala His Thr Ile Pro Glu Ser His Leu Ser Arg
165 170 175
Arg Arg Ser Arg Ser Arg Ala Thr Ser Asn Ala Gly His Ser Ala Asn
180 185 190
Thr Gly Ala Thr Asn Gly Arg Thr Thr Gly Ala Gln Thr Asn Met Glu
195 200 205
Ser Asn Glu Ser Pro Arg Asn Val Pro Ile Met Val Lys Pro Lys Thr
210 215 220
Leu Tyr Gln Asn Pro Gln Thr Pro Thr Val Leu Pro Ser Thr Tyr His
225 230 235 240
Pro Ile Asn Lys Trp Ser Ser Val Lys Asn Thr Tyr Leu Lys Glu Phe
245 250 255
Leu Ala Glu Phe Met Gly Thr Met Val Met Ile Ile Phe Gly Ser Ala
260 265 270
Val Val Cys Gln Val Asn Val Ala Gly Lys Ile Gln Gln Asp Asn Phe
275 280 285
Asn Val Ala Leu Asp Asn Leu Asn Val Thr Gly Ser Ser Ala Glu Thr
290 295 300
Ile Asp Ala Met Lys Ser Leu Thr Ser Leu Val Ser Ser Val Ala Gly
305 310 315 320
Gly Thr Phe Asp Asp Val Ala Leu Gly Trp Ala Ala Ala Val Val Met
325 330 335
Gly Tyr Phe Cys Ala Gly Gly Ser Ala Ile Ser Gly Ala His Leu Asn
340 345 350
Pro Ser Ile Thr Leu Ala Asn Leu Val Tyr Arg Gly Phe Pro Leu Lys
355 360 365
Lys Val Pro Tyr Tyr Phe Ala Gly Gln Leu Ile Gly Ala Phe Thr Gly
370 375 380
Ala Leu Ile Leu Phe Ile Trp Tyr Lys Arg Val Leu Gln Glu Ala Tyr
385 390 395 400
Ser Asp Trp Trp Met Asn Glu Ser Val Ala Gly Met Phe Cys Val Phe
405 410 415
Pro Lys Pro Tyr Leu Ser Ser Gly Arg Gln Phe Phe Ser Glu Phe Leu
420 425 430
Cys Gly Ala Met Leu Gln Ala Gly Thr Phe Ala Leu Thr Asp Pro Tyr
435 440 445
Thr Cys Leu Ser Ser Asp Val Phe Pro Leu Met Met Phe Ile Leu Ile
450 455 460
Phe Ile Ile Asn Ala Ser Met Ala Tyr Gln Thr Gly Thr Ala Met Asn
465 470 475 480
Leu Ala Arg Asp Leu Gly Pro Arg Leu Ala Leu Tyr Ala Val Gly Phe
485 490 495
Asp His Lys Met Leu Trp Val His His His His Phe Phe Trp Val Pro
500 505 510
Met Val Gly Pro Phe Ile Gly Ala Leu Met Gly Gly Leu Val Tyr Asp
515 520 525
Val Cys Ile Tyr Gln Gly His Glu Ser Pro Val Asn Trp Ser Leu Pro
530 535 540
Val Tyr Lys Glu Met Ile Met Arg Ala Trp Phe Arg Arg Pro Gly Trp
545 550 555 560
Lys Lys Arg Asn Arg Ala Arg Arg Thr Ser Asp Leu Ser Asp Phe Ser
565 570 575
Tyr Asn Asn Asp Asp Asp Glu Glu Phe Gly Glu Arg Met Ala Leu Gln
580 585 590
Lys Thr Lys Thr Lys Ser Ser Ile Ser Asp Asn Glu Asn Glu Ala Gly
595 600 605
Glu Lys Lys Val Gln Phe Lys Ser Val Gln Arg Gly Lys Arg Thr Phe
610 615 620
Gly Gly Ile Pro Thr Ile Leu Glu Glu Glu Asp Ser Ile Glu Thr Ala
625 630 635 640
Ser Leu Gly Ala Thr Thr Thr Asp Ser Ile Gly Leu Ser Asp Thr Ser
645 650 655
Ser Glu Asp Ser His Tyr Gly Asn Ala Lys Lys Val Thr
660 665
<210> 8
<211> 2010
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 8
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gatagttcta ggaaacaatc taataagcag tcatccgacg aaggacgctc ttcatcacaa 120
ccttcacatc atcactctgg tggtactaac aacaataata acaataataa taataataat 180
aacagtaaca acaacaacaa cggcaacgat gggggaaatg atgacgacta tgattatgaa 240
atgcaagatt atagaccttc tccgcaaagt gcgcggccta ctcccacgta tgttccacaa 300
tattctgtag aaagtgggac tgctttcccg attcaagagg ttattcctag cgcatacatt 360
aacacacaag atataaacca taaagataac ggtccgccga gtgcaagcag taatagagca 420
ttcaggccta gagggcagac cacagtgtcg gccaacgtgc ttaacattga agatttttac 480
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tcgagggcta cgagtaatgc tgggcacagt gccaatacag gcgccacgaa tggcaggact 600
actggtgccc aaactaatat ggaaagcaat gaatcaccac gtaacgtccc cattatggtg 660
aagccaaaga cattatacca gaaccctcaa acacctacag tcttgccctc cacataccat 720
ccaattaata aatggtcttc cgtcaaaaac acttatttga aggaattttt agccgagttt 780
atgggaacaa tggttatgat tattttcggt agtgctgttg tttgtcaggt caatgttgct 840
gggaaaatac agcaggacaa tttcaacgtg gctttggata accttaacgt taccgggtct 900
tctgcagaaa cgatagacgc tatgaagagt ttaacatcct tggtttcatc cgttgcgggc 960
ggtacctttg atgatgtggc attgggctgg gctgctgccg tggtgatggg ctatttctgc 1020
gctggtggta gtgccatctc aggtgctcat ttgaatccgt ctattacatt agccaatttg 1080
gtgtatagag gttttcccct gaagaaagtt ccttattact ttgctggaca attgatcggt 1140
gccttcacag gcgctttgat cttgtttatt tggtacaaaa gggtgttaca agaggcatat 1200
agcgattggt ggatgaatga aagtgttgcg ggaatgtttt gcgtttttcc aaagccttat 1260
ctaagttcag gacggcaatt tttttccgaa tttttatgtg gagctatgtt acaagcagga 1320
acatttgcgc tgaccgatcc ttatacgtgt ttgtcctctg atgttttccc attgatgatg 1380
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ttaatggggg ggttggttta cgatgtctgt atttatcagg gtcatgaatc tccagtcaac 1620
tggtctttac cagtttataa ggaaatgatt atgagagcct ggtttagaag gcctggttgg 1680
aagaagagaa atagagcaag aagaacatcg gacctgagtg acttctcata caataacgat 1740
gatgatgagg aatttggaga aagaatggct cttcaaaaga caaagaccaa gtcatctatt 1800
tcagacaacg aaaatgaagc aggagaaaag aaagtgcaat ttaaatctgt tcagcgcggc 1860
aaaagaacgt ttggtggtat accaacaatt cttgaagaag aagattccat tgaaactgct 1920
tcgctaggtg cgacgacgac tgattctatt gggttatccg acacatcatc agaagattcg 1980
cattatggta atgctaagaa ggtaacatga 2010
<210> 9
<211> 312
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 9
Met Pro Ala Thr Leu His Asp Ser Thr Lys Ile Leu Ser Leu Asn Thr
1 5 10 15
Gly Ala Gln Ile Pro Gln Ile Gly Leu Gly Thr Trp Gln Ser Lys Glu
20 25 30
Asn Asp Ala Tyr Lys Ala Val Leu Thr Ala Leu Lys Asp Gly Tyr Arg
35 40 45
His Ile Asp Thr Ala Ala Ile Tyr Arg Asn Glu Asp Gln Val Gly Gln
50 55 60
Ala Ile Lys Asp Ser Gly Val Pro Arg Glu Glu Ile Phe Val Thr Thr
65 70 75 80
Lys Leu Trp Cys Thr Gln His His Glu Pro Glu Val Ala Leu Asp Gln
85 90 95
Ser Leu Lys Arg Leu Gly Leu Asp Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Met His
100 105 110
Trp Pro Ala Arg Leu Asp Pro Ala Tyr Ile Lys Asn Glu Asp Ile Leu
115 120 125
Ser Val Pro Thr Lys Lys Asp Gly Ser Arg Ala Val Asp Ile Thr Asn
130 135 140
Trp Asn Phe Ile Lys Thr Trp Glu Leu Met Gln Glu Leu Pro Lys Thr
145 150 155 160
Gly Lys Thr Lys Ala Val Gly Val Ser Asn Phe Ser Ile Asn Asn Leu
165 170 175
Lys Asp Leu Leu Ala Ser Gln Gly Asn Lys Leu Thr Pro Ala Ala Asn
180 185 190
Gln Val Glu Ile His Pro Leu Leu Pro Gln Asp Glu Leu Ile Asn Phe
195 200 205
Cys Lys Ser Lys Gly Ile Val Val Glu Ala Tyr Ser Pro Leu Gly Ser
210 215 220
Thr Asp Ala Pro Leu Leu Lys Glu Pro Val Ile Leu Glu Ile Ala Lys
225 230 235 240
Lys Asn Asn Val Gln Pro Gly His Val Val Ile Ser Trp His Val Gln
245 250 255
Arg Gly Tyr Val Val Leu Pro Lys Ser Val Asn Pro Asp Arg Ile Lys
260 265 270
Thr Asn Arg Lys Ile Phe Thr Leu Ser Thr Glu Asp Phe Glu Ala Ile
275 280 285
Asn Asn Ile Ser Lys Glu Lys Gly Glu Lys Arg Val Val His Pro Asn
290 295 300
Trp Ser Pro Phe Glu Val Phe Lys
305 310
<210> 10
<211> 939
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 10
atgcctgcta ctttacatga ttctacgaaa atcctttctc taaatactgg agcccaaatc 60
cctcaaatag gtttaggtac gtggcagtcg aaagagaacg atgcttataa ggctgtttta 120
accgctttga aagatggcta ccgacacatt gatactgctg ctatttaccg taatgaagac 180
caagtcggtc aagccatcaa ggattcaggt gttcctcggg aagaaatctt tgttactaca 240
aagttatggt gtacacaaca ccacgaacct gaagtagcgc tggatcaatc actaaagagg 300
ttaggattgg actacgtaga cttatatttg atgcattggc ctgccagatt agatccagcc 360
tacatcaaaa atgaagacat cttgagtgtg ccaacaaaga aggatggttc tcgtgcagtg 420
gatatcacca attggaattt catcaaaacc tgggaattaa tgcaggaact accaaagact 480
ggtaaaacta aggccgttgg agtctccaac ttttctataa ataacctgaa agatctatta 540
gcatctcaag gtaataagct tacgccagct gctaaccaag tcgaaataca tccattacta 600
cctcaagacg aattgattaa tttttgtaaa agtaaaggca ttgtggttga agcttattct 660
ccgttaggta gtaccgatgc tccactattg aaggaaccgg ttatccttga aattgcgaag 720
aaaaataacg ttcaacccgg acacgttgtt attagctggc acgtccaaag aggttatgtt 780
gtcttgccaa aatctgtgaa tcccgatcga atcaaaacga acaggaaaat atttactttg 840
tctactgagg actttgaagc tatcaataac atatcgaagg aaaagggcga aaaaagggtt 900
gtacatccaa attggtctcc tttcgaagta ttcaagtaa 939
<210> 11
<211> 584
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 11
Met Ser Ala Lys Ser Phe Glu Val Thr Asp Pro Val Asn Ser Ser Leu
1 5 10 15
Lys Gly Phe Ala Leu Ala Asn Pro Ser Ile Thr Leu Val Pro Glu Glu
20 25 30
Lys Ile Leu Phe Arg Lys Thr Asp Ser Asp Lys Ile Ala Leu Ile Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Ser Gly His Glu Pro Thr His Ala Gly Phe Ile Gly Lys
50 55 60
Gly Met Leu Ser Gly Ala Val Val Gly Glu Ile Phe Ala Ser Pro Ser
65 70 75 80
Thr Lys Gln Ile Leu Asn Ala Ile Arg Leu Val Asn Glu Asn Ala Ser
85 90 95
Gly Val Leu Leu Ile Val Lys Asn Tyr Thr Gly Asp Val Leu His Phe
100 105 110
Gly Leu Ser Ala Glu Arg Ala Arg Ala Leu Gly Ile Asn Cys Arg Val
115 120 125
Ala Val Ile Gly Asp Asp Val Ala Val Gly Arg Glu Lys Gly Gly Met
130 135 140
Val Gly Arg Arg Ala Leu Ala Gly Thr Val Leu Val His Lys Ile Val
145 150 155 160
Gly Ala Phe Ala Glu Glu Tyr Ser Ser Lys Tyr Gly Leu Asp Gly Thr
165 170 175
Ala Lys Val Ala Lys Ile Ile Asn Asp Asn Leu Val Thr Ile Gly Ser
180 185 190
Ser Leu Asp His Cys Lys Val Pro Gly Arg Lys Phe Glu Ser Glu Leu
195 200 205
Asn Glu Lys Gln Met Glu Leu Gly Met Gly Ile His Asn Glu Pro Gly
210 215 220
Val Lys Val Leu Asp Pro Ile Pro Ser Thr Glu Asp Leu Ile Ser Lys
225 230 235 240
Tyr Met Leu Pro Lys Leu Leu Asp Pro Asn Asp Lys Asp Arg Ala Phe
245 250 255
Val Lys Phe Asp Glu Asp Asp Glu Val Val Leu Leu Val Asn Asn Leu
260 265 270
Gly Gly Val Ser Asn Phe Val Ile Ser Ser Ile Thr Ser Lys Thr Thr
275 280 285
Asp Phe Leu Lys Glu Asn Tyr Asn Ile Thr Pro Val Gln Thr Ile Ala
290 295 300
Gly Thr Leu Met Thr Ser Phe Asn Gly Asn Gly Phe Ser Ile Thr Leu
305 310 315 320
Leu Asn Ala Thr Lys Ala Thr Lys Ala Leu Gln Ser Asp Phe Glu Glu
325 330 335
Ile Lys Ser Val Leu Asp Leu Leu Asn Ala Phe Thr Asn Ala Pro Gly
340 345 350
Trp Pro Ile Ala Asp Phe Glu Lys Thr Ser Ala Pro Ser Val Asn Asp
355 360 365
Asp Leu Leu His Asn Glu Val Thr Ala Lys Ala Val Gly Thr Tyr Asp
370 375 380
Phe Asp Lys Phe Ala Glu Trp Met Lys Ser Gly Ala Glu Gln Val Ile
385 390 395 400
Lys Ser Glu Pro His Ile Thr Glu Leu Asp Asn Gln Val Gly Asp Gly
405 410 415
Asp Cys Gly Tyr Thr Leu Val Ala Gly Val Lys Gly Ile Thr Glu Asn
420 425 430
Leu Asp Lys Leu Ser Lys Asp Ser Leu Ser Gln Ala Val Ala Gln Ile
435 440 445
Ser Asp Phe Ile Glu Gly Ser Met Gly Gly Thr Ser Gly Gly Leu Tyr
450 455 460
Ser Ile Leu Leu Ser Gly Phe Ser His Gly Leu Ile Gln Val Cys Lys
465 470 475 480
Ser Lys Asp Glu Pro Val Thr Lys Glu Ile Val Ala Lys Ser Leu Gly
485 490 495
Ile Ala Leu Asp Thr Leu Tyr Lys Tyr Thr Lys Ala Arg Lys Gly Ser
500 505 510
Ser Thr Met Ile Asp Ala Leu Glu Pro Phe Val Lys Glu Phe Thr Ala
515 520 525
Ser Lys Asp Phe Asn Lys Ala Val Lys Ala Ala Glu Glu Gly Ala Lys
530 535 540
Ser Thr Ala Thr Phe Glu Ala Lys Phe Gly Arg Ala Ser Tyr Val Gly
545 550 555 560
Asp Ser Ser Gln Val Glu Asp Pro Gly Ala Val Gly Leu Cys Glu Phe
565 570 575
Leu Lys Gly Val Gln Ser Ala Leu
580
<210> 12
<211> 1755
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 12
atgtccgcta aatcgtttga agtcacagat ccagtcaatt caagtctcaa agggtttgcc 60
cttgctaacc cctccattac gctggtccct gaagaaaaaa ttctcttcag aaagaccgat 120
tccgacaaga tcgcattaat ttctggtggt ggtagtggac atgaacctac acacgccggt 180
ttcattggta agggtatgtt gagtggcgcc gtggttggcg aaatttttgc atccccttca 240
acaaaacaga ttttaaatgc aatccgttta gtcaatgaaa atgcgtctgg cgttttattg 300
attgtgaaga actacacagg tgatgttttg cattttggtc tgtccgctga gagagcaaga 360
gccttgggta ttaactgccg cgttgctgtc ataggtgatg atgttgcagt tggcagagaa 420
aagggtggta tggttggtag aagagcattg gcaggtaccg ttttggttca taagattgta 480
ggtgccttcg cagaagaata ttctagtaag tatggcttag acggtacagc taaagtggct 540
aaaattatca acgacaattt ggtgaccatt ggatcttctt tagaccattg taaagttcct 600
ggcaggaaat tcgaaagtga attaaacgaa aaacaaatgg aattgggtat gggtattcat 660
aacgaacctg gtgtgaaagt tttagaccct attccttcta ccgaagactt gatctccaag 720
tatatgctac caaaactatt ggatccaaac gataaggata gagcttttgt aaagtttgat 780
gaagatgatg aagttgtctt gttagttaac aatctcggcg gtgtttctaa ttttgttatt 840
agttctatca cttccaaaac tacggatttc ttaaaggaaa attacaacat aaccccggtt 900
caaacaattg ctggcacatt gatgacctcc ttcaatggta atgggttcag tatcacatta 960
ctaaacgcca ctaaggctac aaaggctttg caatctgatt ttgaggagat caaatcagta 1020
ctagacttgt tgaacgcatt tacgaacgca ccgggctggc caattgcaga ttttgaaaag 1080
acttctgccc catctgttaa cgatgacttg ttacataatg aagtaacagc aaaggccgtc 1140
ggtacctatg actttgacaa gtttgctgag tggatgaaga gtggtgctga acaagttatc 1200
aagagcgaac cgcacattac ggaactagac aatcaagttg gtgatggtga ttgtggttac 1260
actttagtgg caggagttaa aggcatcacc gaaaaccttg acaagctgtc gaaggactca 1320
ttatctcagg cggttgccca aatttcagat ttcattgaag gctcaatggg aggtacttct 1380
ggtggtttat attctattct tttgtcgggt ttttcacacg gattaattca ggtttgtaaa 1440
tcaaaggatg aacccgtcac taaggaaatt gtggctaagt cactcggaat tgcattggat 1500
actttataca aatatacaaa ggcaaggaag ggatcatcca ccatgattga tgctttagaa 1560
ccattcgtta aagaatttac tgcatctaag gatttcaata aggcggtaaa agctgcagag 1620
gaaggtgcta aatccactgc tacattcgag gccaaatttg gcagagcttc gtatgtcggc 1680
gattcatctc aagtagaaga tcctggtgca gtaggcctat gtgagttttt gaagggggtt 1740
caaagcgcct tgtaa 1755
<210> 13
<211> 560
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 13
Met Ser Leu Ile Ser Ile Leu Ser Pro Leu Ile Thr Ser Glu Gly Leu
1 5 10 15
Asp Ser Arg Ile Lys Pro Ser Pro Lys Lys Asp Ala Ser Thr Thr Thr
20 25 30
Lys Pro Ser Leu Trp Lys Thr Thr Glu Phe Lys Phe Tyr Tyr Ile Ala
35 40 45
Phe Leu Val Val Val Pro Leu Met Phe Tyr Ala Gly Leu Gln Ala Ser
50 55 60
Ser Pro Glu Asn Pro Asn Tyr Ala Arg Tyr Glu Arg Leu Leu Ser Gln
65 70 75 80
Gly Trp Leu Phe Gly Arg Lys Val Asp Asn Ser Asp Ser Gln Tyr Arg
85 90 95
Phe Phe Arg Asp Asn Phe Ala Leu Leu Ser Val Leu Met Leu Val His
100 105 110
Thr Ser Ile Lys Arg Ile Val Leu Tyr Ser Thr Asn Ile Thr Lys Leu
115 120 125
Arg Phe Asp Leu Ile Phe Gly Leu Ile Phe Leu Val Ala Ala His Gly
130 135 140
Val Asn Ser Ile Arg Ile Leu Ala His Met Leu Ile Leu Tyr Ala Ile
145 150 155 160
Ala His Val Leu Lys Asn Phe Arg Arg Ile Ala Thr Ile Ser Ile Trp
165 170 175
Ile Tyr Gly Ile Ser Thr Leu Phe Ile Asn Asp Asn Phe Arg Ala Tyr
180 185 190
Pro Phe Gly Asn Ile Cys Ser Phe Leu Ser Pro Leu Asp His Trp Tyr
195 200 205
Arg Gly Ile Ile Pro Arg Trp Asp Val Phe Phe Asn Phe Thr Leu Leu
210 215 220
Arg Val Leu Ser Tyr Asn Leu Asp Phe Leu Glu Arg Trp Glu Asn Leu
225 230 235 240
Gln Lys Lys Lys Ser Pro Ser Tyr Glu Ser Lys Glu Ala Lys Ser Ala
245 250 255
Ile Leu Leu Asn Glu Arg Ala Arg Leu Thr Ala Ala His Pro Ile Gln
260 265 270
Asp Tyr Ser Leu Met Asn Tyr Ile Ala Tyr Val Thr Tyr Thr Pro Leu
275 280 285
Phe Ile Ala Gly Pro Ile Ile Thr Phe Asn Asp Tyr Val Tyr Gln Ser
290 295 300
Lys His Thr Leu Pro Ser Ile Asn Phe Lys Phe Ile Phe Tyr Tyr Ala
305 310 315 320
Val Arg Phe Val Ile Ala Leu Leu Ser Met Glu Phe Ile Leu His Phe
325 330 335
Leu His Val Val Ala Ile Ser Lys Thr Lys Ala Trp Glu Asn Asp Thr
340 345 350
Pro Phe Gln Ile Ser Met Ile Gly Leu Phe Asn Leu Asn Ile Ile Trp
355 360 365
Leu Lys Leu Leu Ile Pro Trp Arg Leu Phe Arg Leu Trp Ala Leu Leu
370 375 380
Asp Gly Ile Asp Thr Pro Glu Asn Met Ile Arg Cys Val Asp Asn Asn
385 390 395 400
Tyr Ser Ser Leu Ala Phe Trp Arg Ala Trp His Arg Ser Tyr Asn Lys
405 410 415
Trp Val Val Arg Tyr Ile Tyr Ile Pro Leu Gly Gly Ser Lys Asn Arg
420 425 430
Val Leu Thr Ser Leu Ala Val Phe Ser Phe Val Ala Ile Trp His Asp
435 440 445
Ile Glu Leu Lys Leu Leu Leu Trp Gly Trp Leu Ile Val Leu Phe Leu
450 455 460
Leu Pro Glu Ile Phe Ala Thr Gln Ile Phe Ser His Tyr Thr Asp Ala
465 470 475 480
Val Trp Tyr Arg His Val Cys Ala Val Gly Ala Val Phe Asn Ile Trp
485 490 495
Val Met Met Ile Ala Asn Leu Phe Gly Phe Cys Leu Gly Ser Asp Gly
500 505 510
Thr Lys Lys Leu Leu Ser Asp Met Phe Cys Thr Val Ser Gly Phe Lys
515 520 525
Phe Val Ile Leu Ala Ser Val Ser Leu Phe Ile Ala Val Gln Ile Met
530 535 540
Phe Glu Ile Arg Glu Glu Glu Lys Arg His Gly Ile Tyr Leu Lys Cys
545 550 555 560
<210> 14
<211> 1683
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 14
atgtcgctga tcagcatcct gtctccccta attacttccg agggcttaga ttcaagaatc 60
aaaccttcac caaaaaagga tgcctctact accactaagc catcactatg gaaaactact 120
gagttcaaat tctactacat tgcatttctg gtcgtggttc ccttgatgtt ctatgctggg 180
ttacaagcta gttcgcccga aaatccaaac tatgcaagat acgaacgtct cctatctcaa 240
ggttggttat ttggcagaaa agtagacaat agtgattctc aatataggtt tttcagggac 300
aattttgcgc tattgtcagt tttaatgcta gtccacactt ctataaaacg cattgtactt 360
tattcaacaa atatcactaa attgaggttt gatctgatat ttggtttgat ctttttagtg 420
gccgctcatg gtgtcaattc gataagaatt ttagcccata tgctaatttt atatgccatc 480
gcccatgtac taaagaactt tagaagaata gccaccatca gcatttggat ttatggtatt 540
tctacgcttt ttattaacga caacttcaga gcatatccat ttggtaatat ttgctctttt 600
ttaagcccat tggaccattg gtatagaggt atcattccaa gatgggatgt ctttttcaat 660
tttactcttt tgagagtctt aagttacaac ttggacttct tagagaggtg ggagaattta 720
caaaagaaga aaagtccatc ctatgaatca aaagaagcta aatcagccat tttgctcaat 780
gaacgtgcta gattaactgc tgcacacccc atacaggact acagcttaat gaattatatt 840
gcatatgtta cttacacgcc acttttcatt gccggcccca ttataacatt caatgattat 900
gtttaccaat cgaaacatac cttgccatca ataaatttca aattcatttt ttactatgcg 960
gtgagattcg ttattgctct cttatctatg gagttcattt tacactttct ccacgttgtg 1020
gcaatctcaa aaaccaaagc gtgggaaaat gacacacctt tccagatttc catgattggc 1080
ttatttaatt tgaatattat ttggctaaaa ctactgattc cgtggaggct gtttaggctg 1140
tgggctttgc tagacggaat cgatacacct gaaaatatga tcaggtgtgt tgataacaat 1200
tacagttcac tagcattctg gagagcttgg catagaagct acaataagtg ggttgtccgt 1260
tacatatata ttcctctagg tggttcaaaa aatagagttt tgacatcact agcagtcttt 1320
tccttcgtag ctatatggca tgacatcgaa ctaaagttat tattatgggg ttggctaata 1380
gttttgttcc tcttaccaga aatttttgct acccaaattt tctctcatta taccgacgca 1440
gtctggtaca gacacgtttg cgctgtcggt gctgttttca acatatgggt tatgatgatc 1500
gctaatcttt ttggattctg cttgggctct gacggtacta aaaaattact aagcgatatg 1560
ttctgtaccg tatctggttt caaatttgta attttggcaa gcgttagttt attcatcgca 1620
gtacaaataa tgtttgaaat cagagaagaa gaaaagaggc acggaattta cctaaaatgc 1680
tga 1683
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 15
ctgcagatga gttatactgt cggtacctat 30
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 16
ttcggacaat tgttcgagga gatccgtac 29
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 17
tctagaatgg cttcttcaac tttttatatt 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 18
cttgagaagg actcgcgaaa gattcagctg 30
<210> 19
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 19
atgagtaatc ctcaaaaagc tctaaacgac tgagccatat tcaacgggaa acgtcttgct 60
cagtttcatt tgatgctcga tgagtttttc cattatggta atgctaagaa ggtaacatga 120
120
<210> 20
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 20
gtcaaagtaa actacgagct actcaaaaag gtaataccat tactattctt ccattgtact 60
tcatgttacc ttcttatcat taccataatg gaaaaactca tcgagcatca aatgaaactg 120
120
<210> 21
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 21
atgcttgctg tcagaagatt aacaagatac acattcctta gtgttgacaa ttaatcatcg 60
gcatagtata gggadgctcg aaggctttaa tttgcaagc 99
<210> 22
<211> 150
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 22
attgaagagc tagacatcga tgacgaatag cccctgcgag cttccgaaat taaacgttcg 60
ataacttctc gatctgtagc tactgcttat tattcgtcat cgatgtctag ctcttcaata 120
gcttgcaaat taaagccttc gagcgtcccc 150
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 23
ggatccatgc ctgctacttt acatgattct 30
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 24
gtcgacatac ttgaatactt cgaaaggag 29
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 25
actagtatgt ccgctaaatc gtttgaagtc 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 26
atcgatatac aaggcgcttt gaaccccctt 30
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 27
gaattcatgt cgctgatcag catcctg 27
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 28
actagtccag cattttaggt aaattccgtg 30
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 29
ggatccatgt cagcatttta ggtaaattcc gtg 33
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 30
ggatccataa tgtcgctgat cagcatcctg tct 33
Claims (16)
- 사카로마이시스 세레비지애 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)를 코딩하는 유전자와 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 함유하는 발현벡터 pGcyaDakAdhPdc.
- 제 1항에 있어서, 상기 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 발현벡터 pGcyaDakAdhPdc.
- 제 1항에 있어서, 상기 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)는 서열번호 2에 기재된 염기 서열을 가지는 발현벡터 pGcyaDakAdhPdc.
- 제 1항에 있어서, 상기 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 발현벡터 pGcyaDakAdhPdc.
- 제 1항에 있어서, 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)는 서열번호 4에 기재된 염기서열을 가지는 발현벡터 pGcyaDakAdhPdc.
- 제 1항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 4a에 기재된 개열지도를 가지는 발현벡터 pGcyaDakAdhPdc.
- 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체.
- 제 7항에 있어서, 상기 형질전환체는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인 형질전환체.
- 제 1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 발현벡터를 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)와 효모 글리세롤 채널 FPS1을 인코딩하는 FPS1 (glycerol facilitator channel) 유전자가 결손된 형질전환체에 도입하여 제조된 형질전환체.
- 제 9항에 있어서, 상기 형질전환체는 글리세롤 디히드로게나제, 디히드록시아세톤 키나아제, 및 글리세롤 업테이크 프로테인 유전자를 추가로 포함하는 형질전환체.
- 제 9항 또는 제10항에 있어서, 상기 형질전환체는 균주 기탁번호가 KCCM 11152P인 형질 전환체 효모 사카로마이시스 세레비지애 YPH499fps1 △ gpd2 △ (pGcyaDakAdhPdc,pGupCas)인 형질전환체.
- 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)와 효모 글리세롤 채널 FPS1을 인코딩하는 FPS1 (glycerol facilitator channel) 유전자가 결손된 형질전환체에 제 1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 발현벡터를 도입하는 단계를 포함하는 에탄올 생성용 형질전환체 제조방법.
- 제 12항에 있어서, 상기 형질전환체는 글리세롤 디히드로게나제, 디히드록시아세톤 키나아제, 및 글리세롤 업테이크 프로테인 유전자를 추가로 포함하는 에탄올 생성용 형질전환체 제조방법.
- 제 12항 또는 제13항에 있어서, 상기 형질전환체는 균주 기탁번호가 KCCM 11152P인 형질 전환체 효모 사카로마이시스 세레비지애 YPH499fps1 △ gpd2 △ (pGcyaDakAdhPdc,pGupCas)인 에탄올 생성용 형질전환체 제조방법.
- 글리세롤을 기질로 하여 제9항 또는 제10항의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 글리세롤을 이용한 에탄올 생산 방법.
- 제 9항 또는 제10항의 형질전환체를 포함하는 에탄올 생성용 조성물.
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