KR20120067189A - Ａｈｎａｋ 단백질을 포함하는 지방세포 분화 유도용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Ahnak 단백질을 포함하는 줄기세포에서 지방세포로의 분화 유도용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 (a) 줄기세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계의 줄기세포에 상기 조성물을 첨가하는 단계를 포함하는 줄기세포에서 지방세포로 분화 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 Ahnak을 통해 지방세포의 분화를 효과적으로 유도시킬 수 있으며, 이러한 조성물을 이용한 지방세포로의 분화 유도방법을 통해 지방세포를 대량으로 생산할 수 있다. 이러한 지방세포는 희귀난치병 및 지방세포 이식 관련 질환의 치료를 위한 세포치료제 등의 신약개발에 이용될 수 있다.

Description

Ａｈｎａｋ 단백질을 포함하는 지방세포 분화 유도용 조성물{A composition comprising Ahnak protein for differentiation of adipocyte}

본 발명은 Ahnak 단백질을 포함하는 줄기세포에서 지방세포로의 분화 유도용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 (a) 줄기세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계의 줄기세포에 상기 조성물을 첨가하는 단계를 포함하는 줄기세포에서 지방세포로 분화 유도하는 방법에 관한 것이다.

인체 지방조직은 백색 및 갈색지방조직으로 나눌 수 있으며 포도당대사와 에너지균형에 중요한 역할을 한다. 백색지방조직은 영양물질의 공급이 원활할 때는 트리글리세라이드(triglyceride)형태로 에너지를 저장하고 음식물공급이 부족할때는 유리지방산을 유리시킨다. 갈색지방조직은 체온조절에 관여한다. 이 조직은 백색지방조직처럼 인슐린(insulin)에 민감하고 다양한 내분비 기능을 가진다. 지방조직의 양은 에너지섭취량과 소비량사이의 균형에 의해 결정된다. 이 균형의 장애는 과도한 체중증가와 비만으로 기인되며 고혈압과 제2형 당뇨병같은 심혈관 질환과 관련된 대사질환과 연관될 수 있다. 따라서, 지방조직세포의 분화조절에 대한 이해는 지방조직의 재생을 이용한 지방이식, 비만과 관련된 질병의 치료에 응용될 수 있다.

인간 중간엽줄기세포(human mesenchymal stem cell)는 성체줄기세포로, 배아줄기세포에 일반적으로 문제가 되는 암 (cancer)화나 윤리적인 문제에서 자유로울뿐 아니라 지방세포, 골아세포, 연골세포, 심장세포, 근육세포 및 신경세포 등 다양한 세포로의 분화가 가능하다고 보고되고 있다. 뿐만 아니라 중간엽줄기세포는 이식시에도 면역반응을 유발시키지 않기 때문에 세포치료의 효과적인 수단으로써 각광받고 있는 줄기세포이다. 하지만, 중간엽줄기세포는 특정 세포로의 효율적인 대량 분화 기술이 아직 확립되어 있지 않아 실제 임상, 산업적 이용에 큰 제약이 있다. 따라서 특정단계로의 분화를 대량으로 및 효율적으로 유도 시키는 기술의 확립이 절실하며, 이를 위해서는 특정 단계로의 분화 유도 신호전달 기작을 밝히는 것이 급선무이다.

한편, Ahnak (Ahnak nucleoprotein)은 700kDa의 크기를 가진 핵단백질로서, 중심부에 있는 반복 단위 (central repeated unit, CRU)가 PLC-γ1 및 PKC (protein kinase C)에 결합하여 이를 활성화하여 종양의 증식에 영향이 있다는 결과나 (JBC 279:26645-53, 2004; JBC 283:6312-20, 2008; Tuberculosis and Respiratory Disease, 47(3) 1999), 면역과 관련된 T 세포 활성화에 관련된 칼슘 신호전달에 역할을 한다는 (Immunity 28; 64, 2008) 것에 대해서 알려져 있을 뿐 지방세포로의 분화를 유도할 수 있다는 기작에 대해서는 전혀 개시된 바가 없다.

이러한 배경하에 본 발명자들은 Ahnak 단백질이 지방세포의 분화와 관련한 신호전달에 관여하는 단백질을 활성화시키고, 핵내 지방세포 분화와 관련된 유전자의 전사효율을 증가시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 Ahnak 단백질을 포함하는 줄기세포에서 지방세포로의 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 (a) 줄기세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계의 줄기세포에 상기 조성물을 첨가하는 단계를 포함하는 줄기세포에서 지방세포로 분화 유도하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 Ahnak 단백질을 포함하는 줄기세포에서 지방세포로의 분화 유도용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "Ahank 유전자"(NCBI Gene ID: 79026)는 700 kDa의 핵단백질을 코딩하는 유전자이다. 상기 단백질은 신경 조직의 Tau 처럼 신경조직에서 AA(arachidonic acid)의 존재하에 PLCγ를 활성화시키는 단백질이다. PLCγ-1(phospholipase C)의 활성인자로 PKC(protein kinase C)에 의해 인산화된 Ahnak은 인산화되지 않은 Ahnak 보다 PLC-γ의 활성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 폐 조직에서 정제한 Ahnak 단백질은 70 kDa에서 130 kDa까지 크기의 차이가 매우 심한 것으로 보이는데 이것은 Ahnak 단백질의 특성상 단백질 분해효소에 매우 불안정하기 때문이다. 일반적으로 128개의 아미노산이 하나의 단위(unit)로 30회 정도 반복되는데 이중 1 단위(unit)만 존재하여도 PLCγ를 활성화시킬 수 있으며, 최대 4 단위(unit)의 Ahnak 단백질이 존재할 수 있다. Ahnak의 기능에 대해서는 현재까지도 많은 연구가 되고 있는 분야로 PLC-γ1 및 PKC (protein kinase C)에 결합하여 이를 활성화하여 종양의 증식에 영향이 있다는 결과나, 면역과 관련된 T 세포 활성화에 관련된 칼슘 신호전달에 역할을 한다는 개시가 있으나, 상기 유전자와 지방세포의 분화와의 연관성에 대해서는 현재까지 전혀 개시된 바가 없는 사실로 본 발명자들은 상기 유전자에 의해 지방세포의 분화가 유도될 수 있다는 사실을 최초로 규명하였다.

본 발명자들은 도 4에 개시된 바와 같이 BMP(bone morphogenic protein) 단백질이 지방세포의 분화와 관련한 신호전달에 관여하는 단백질을 활성화시켜 지방세포의 분화를 유도한다는 공지된 기술을 기초로 하여(Nature 454; 1000, 2008), 본 발명의 Ahnak 단백질을 포함하는 조성물이 지방세포의 분화에 관여하는 BMP 단백질의 신호전달 경로를 활성화하는데 개시자로 작용하여 지방세포의 분화를 유도할 수 있음을 확인하였다. 구체적으로 지방세포의 분화와 관련하여 BMP 단백질은 지방세포의 분화를 유도하는 신호전달 단백질인 PRDM 16 단백질 및 UCP-1 단백질을 활성화시킨다. 활성화된 PRDM 16 및 UCP-1에 의한 신호전달 경로를 통해 C/EBP γ의 발현이 증가하며, C/EBP β, C/EBP α, PPARγ 및 aP2 단백질이 활성화되어 발현이 증가한다. 상기 단백질들의 활성화 결과 Smad 단백질이 활성화되어, 핵내로 이동하게 되고, 핵내로 이동한 Smad 단백질은 핵내 지방세포분화와 관련된 DNA의 전사효율을 최대화시킨다. 이러한 신호전달 경로의 개시자인 Smad 단백질이 본 발명의 Ahnak을 포함하는 조성물에 의해 활성화될 수 있으며, Ahnak에 의해 활성화된 Smad 단백질은 상기의 신호전달 경로에 관여하는 단백질의 발현 및 활성을 최대로 유지하며 지방세포의 분화를 효과적으로 유도할 수 있는 것을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "줄기세포"는 동물의 미분화된 세포로서 모든 다세포 생물에 존재하며, 무한 증식이 가능한 자가 재생산 능력과 정상 염색체 유지 및 다양한 세포로의 분화 능력을 가지고 있는 세포를 말한다. 1960년대에 캐나다 Ontario Cancer Institute의 Ernest A. McCulloch와 James E. Till에 의해 발견된 이후, 특히 신체 210여개의 장기를 구성하는 조직의 어떠한 세포로도 분화할 수 있다는 만능(Totipotent) 잠재력으로 인해 인체의 마스터 세포(Master cell)로 알려져 있다. 이러한 줄기세포는 이에 제한은 없으나 그 예로 유래에 따라 배아줄기세포, 성체줄기세포, 제대혈 줄기세포, 중간엽 줄기세포 또는 지방세포 유래 줄기세포일 수 있다. 바람직하게는 중간엽 줄기세포, 지방세포 유래 줄기세포일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 지방세포 유래 줄기세포일 수 있다.

본 발명에서 용어, "동물"은 인간 및 영장류들뿐만 아니라 소, 돼지, 양, 말, 개, 쥐, 래트 또는 고양이 등의 가축을 포함하며, 바람직하게는 인간이다.

본 발명에서 용어, "배아줄기세포(Embryonic Stem Cell, ESC)"는 배아의 초기 발생 단계 중 하나인 배반포(blastocyst) 단계의 내부세포괴(inner cell mass, ICM)에서 유래하는 줄기세포로, 수정된 후 4~5일 정도 된 상태로, 50~150 여개의 세포들을 가지고 있으며, 이 세포들은 더 많은 줄기세포로 분열하거나 삼배엽 세포로 분화할 수 있는 만능성(pluripotent) 분화 능력을 가진 줄기세포들이다.

본 발명에서 용어, "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)"는 근육, 뼈, 지방 등의 중간엽 조직으로 분화되는 중간엽 줄기세포로 골수에 존재하며 신경, 피부와 같은 세포로 분화될 수 있는 능력을 가진 성체 줄기세포(Adult stem cell, AS) 중 하나를 말한다. 이러한 성체 줄기세포는 지속적인 세포 교체를 반복하는 기관에서 발견되며, 이러한 기관들에는 피부의 표피층, 소장의 내막, 골수, 뇌, 힘줄 등이 있다.

본 발명에서 용어, "제대혈 줄기세포"는 태반과 태아의 제대로부터 나온 혈액에 존재하는 줄기세포를 말하며, 골수 유래 줄기세포에 비해 증식이 더 강한 특성이 있다.

본 발명에서 용어, "지방세포 유래 줄기세포(adipose derived stem cell)"는 지방조직에 분포하는 다분화성을 지닌 세포를 말한다. 이들은 골수 중간엽 줄기세포와 동등한 수준의 분화 잠재력을 가지고 있으며, 콜로니 형성능과 세포 배양에서의 증식능 유지에 골수 중간엽 줄기세포 보다 우수한 것으로 보고되어 있다. 지방세포 유래 줄기세포는 N-acetyl-L-cystein, ascorbic acid-2-phosphate와 같은 항산화제가 첨가되고, 칼슘 농도가 낮을 때 성장률과 세포주기가 증가된다. 또한 지방세포 유래 줄기세포의 증식은 FGF-2(fibroblast growth factor)에 의해 자극받을 수 있고, 지방세포 유래 줄기세포가 혈관 내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 인슐린 유사 성장 인자(insulin like growth factor, IGF)와 같은 잠재적 성장 인자들을 분비하는 것으로 알려져 있다. 지방세포 유래 줄기세포는 골수나 제대혈에서 분리한 줄기세포와는 다르게 여러번 반복해서 채취가 가능하며 골수처럼 채취할 때 환자에게 고통을 주지도 않는 장점이 있고, 대부분 자가 유래(autologous)이기 때문에 면역학적 거부반응이 없다는 장점을 가진다. 또한, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 배양이 용이하며, 골수에 비해 분리되는 중간엽 줄기세포의 양이 100~1000 배나 더 많고, 자가 재생(self-renewal) 능력 및 다분화성(multipotent) 능력도 뛰어난 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 용어, "분화 유도용 조성물"은 초기 단계의 세포가 각 조직으로서의 특성을 갖게 되는 과정을 유도할 수 있는 조성물을 의미하며, 본 발명의 목적상 상기 줄기세포를 지방세포로 분화 유도할 수 있는 조성물을 의미한다. 바람직하게 상기 분화유도용 조성물은 Smad3의 인산화를 증가시키거나, Smad1의 인산화를 증가시켜서 지방세포의 분화를 유도할 수 있다. 상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에서는 Ahnak이 넉아웃된 마우스는 TGFβ에 의해 Smad3가 인산화가 적게 되는 것을 확인하였으며(도 5), Smad3가 핵내로 적게 이동하는 것을 확인하였으며(도 6), BMP2에 의한 Smad1의 인산화도 적게 일어나는 것을 확인하였다(도 8). 이는 Ahnak이 없으면 Smad1/3가 결합하여 지방세포 분화와 관련된 유전자의 전사를 촉진하게 핵내로 이동할 수 없음을 입증하는 것이다.

본 발명에서 용어, "Smad" 단백질은 여러 생물종에서 잘 보존되어 있는 단백질의 하나로, 전사 활성의 매개자이자, 액티빈, 인히빈, 및 BMP(bone morphogenetic protein)와 같은 TGF-β와 관련된 단백질의 세포 표면 수용체를 통해 매개되는 신호전달 과정을 매개한다. 수용체에 의해 조절되는 Smad 단백질을 R-Smad (Receptor regulated Smad)라고 하며, Smad-1, 2, 3, 5 및 8 들이 R-Smad에 속한다. 이들은 세포 내의 파트너인 Co-Smad (Common partner Smad)인 Smad-4와 결합하여 세포핵 내로 이동하여 전사인자와 결합하여 목표 유전자들의 전사를 조절한다. 즉, Smad 단백질이 활성화되면 핵내로 이동하여 핵내 유전자의 전사를 활성화시킨다. 본 발명에서는 Ahnak 단백질에 의해 Smad 단백질이 인산화되어 활성화되면, 인산화된 Smad 단백질에 의해 핵내 지방세포 분화와 관련된 유전자들의 전사를 활성화시켜 지방세포의 분화를 유도하는 매개체로서의 역할을 한다.

본 발명에서 용어, "BMP(bone morphogenetic protein)"는 TGF-β(transforming growth factor-β) 슈퍼 패밀리에 속하는 신호전달계 단백질로서 초기 태생기 분화, 태생기 조직형성 및 성인 조직의 항상성 유지 등을 조절한다. 특히, 초기 태생기시 BMP의 농도차이는 배아의 등배형성 시 축 형성에 결정적 작용을 한다. 세포밖으로 분비된 BMP들은 세포막의 Type I과 Type II 세린/쓰레오닌 카이네즈 (serine/threonine kinase) 수용체들에 결합하여 BMP 신호전달을 시작하게 된다. Type II 수용체는 type I 수용체를 인산화시키고, 인산화된 Type I 수용체는 세포내의 기질인 Smad 단백질을 인산화시켜 세포 내의 신호전달이 이루어진다. BMP 단백질은 일반적으로 뼈 및 연골의 성장 및 재생에 필수적인 사이토카인으로 알려져 있는 골형성 촉진 단백질이지만 지방세포 분화도 촉진할 수 있다. 세포내에서 BMP 단백질은 골아세포에서 형성되며 세포외 기질로 방출되어 자신과 주변의 세포를 자극하여 뼈 형성을 촉진시킨다. 세포내에서 BMP 단백질이 수용체와 결합하면 세포질에 있는 신호단백질인 Smad 단백질 군이 인산화되어 BMP 단백질과 복합체를 이루게 되고, 이들 복합체는 핵내로 이동하여 전사조절인자와 결합한다. 이렇게 활성화된 전사조절인자는 골형성 및 지방세포분화유도 등의 전사를 시작한다. 본 발명의 일 실시예에서는 BMP 단백질이 활성화되어 지방세포의 분화와 관련된 유전자들의 전사를 활성화시키고, 지방세포의 분화를 유도할 수 있음을 확인하였다.

본 발명자들은 BMP 단백질이 배아줄기세포에서 지방세포로 분화되는 과정에서 영향을 준다는 것(도 4)을 기초로 Ahnak을 억제하면 BMP에 의한 Smad의 활성화가 억제된다는 것을 확인하였으며, 이를 바탕으로 Ahnak이 지방세포 분화를 유도할 수 있음을 유추하였다. 구체적으로, Ahnak 유전자의 발현이 지방세포의 분화를 유도하는데 신호전달 분자로 사용되는 Smad3 단백질을 활성화시키며(도 5), 활성화된 Smad3 단백질은 핵내로 이동하여 핵내 지방세포 분화를 유도하는 단백질의 전사활성을 유도할 수 있음을 확인하였다(도 6). 세포내에서 Ahnak이 정상적으로 발현되는 경우, BMP 단백질의 활성이 증가하고, 활성화된 BMP 단백질이 뼈의 형성과 관련된 Smad1 단백질의 인산화를 증가시켜 뼈형성을 촉진할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 7). 또한, Ahnak 단백질이 정상적으로 발현되는 경우, 지방세포의 크기도 증가하는 것을 확인하였다(도 8). 이러한 결과는 본 발명의 Ahnak 단백질을 포함하는 조성물이 미분화 세포인 중간엽줄기세포 또는 지방세포 유래 줄기세포에서 지방세포로의 분화를 유도할 수 있음을 나타내는 결과이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 줄기세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계의 줄기세포에 상기 조성물을 첨가하는 단계를 포함하는 줄기세포에서 지방세포로 분화 유도하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "줄기세포" 및 "분화유도"는 상기에서 설명한 바와 같다.

상기 단계 (a)는 미분화세포인 줄기세포를 배양하는 단계로 당업계에 알려진 통상적인 배양방법에 따라 전분화능을 가진 미분화세포인 줄기세포를 배양할 수 있으며, 본 발명에서는 중간엽줄기세포 또는 지방세포 유래 줄기세포일 수 있다.

상기 단계 (b)는 상기 단계 (a)에서 배양된 줄기세포에 본 발명의 Ahnak 단백질을 포함하는 조성물을 처리하여 지방세포로의 분화를 유도하는 단계이다. 분화를 유도하기 위해 배양 배지에 첨가되는 사이토카인은 당업계에 알려진 지방세포 분화용 사이토카인을 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있으며, 분화를 유도하기 위한 유효농도를 배지에 첨가하여 사용가능하며, 이에 제한되지 않는다.

바람직하게 본 발명의 지방세포 분화 유도 방법은 상기에서 설명한 바와 같이 Smad3의 인산화를 증가시켜 수행되거나, Smad1의 인산화를 증가시켜 수행할 수 있다. 이는 활성화된 Smad1 및 Smad3이 핵내로 이동하여 핵내 지방세포 분화를 위한 유전자의 전사를 증대시켜서 이루어질 수 있다.

본 발명에서 생산되는 줄기세포로부터 분화된 지방세포를 희귀난치병 및 지방세포 이식 관련 질환의 치료를 위한 세포 치료제 등의 세포 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 Ahnak 단백질의 발현 유도를 통해 지방세포의 분화를 효과적으로 유도시킬 수 있으며, 이러한 조성물을 이용한 지방세포로의 분화 유도방법을 통해 지방세포를 대량으로 생산할 수 있다. 이러한 지방세포는 희귀난치병 및 지방세포 이식 관련 질환의 치료를 위한 세포치료제 등의 신약개발에 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 사용된 Ahnak 유전자의 단백질을 모식화한 것이다.
도 2는 Ahnak 넉아웃 마우스의 제작 및 체중을 나타낸 것이다. A는 Ahnak 넉아웃 마우스 제작용 벡터를 나타낸 것이다. B는 야생형 및 넉아웃 마우스의 Ahank 유전자에 대한 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다. C는 야생형 및 넉아웃 마우스의 Ahank 유전자에 대한 웨스턴 블롯팅 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 Ahnak 단백질을 포함하는 조성물이 지방세포의 분화를 유도하는 신호전달 단백질인 Smad 단백질을 활성화시킬 수 있음을 나타내는 모식도이다.
도 4는 본 발명의 Ahnak 단백질을 포함하는 조성물이 지방세포의 분화를 유도하는 신호전달 단백질인 BMP 단백질을 활성화시켜 지방세포의 분화를 유도할 수 있음을 나타내는 모식도이다.
도 5는 Ahnak 단백질의 발현은 지방세포로의 분화를 유도하는 단계에서 발현되는 Smad3 단백질을 인산화시켜 활성화할 수 있음을 나타내는 도이다.
도 6은 Ahnak 단백질과 Smad3 단백질이 활성화되며 핵내로 이동하는 것을 Ahnak 과발현 세포주(a) 및 Ahnak 야생형, 넉아웃 세포주(b)에서 나타내는 도이다.
도 7은 Ahnak 단백질에 의해 활성화된 BMP2에 의해 Smad1 단백질이 인산화될 수 있음을 나타내는 도이다.
도 8은 Ahnak 단백질이 정상적으로 발현되는 경우, 지방세포의 분화가 활발하며, 지방세포의 크기도 큰 것을 나타내는 도이다.

이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: Ahnak 넉아웃 마우스 제조

Ahnak의 N-말단 영역에 해당하는 502bp 게놈 단편을 pPNT 벡터에 클로닝하고, 이 타겟팅 벡터 (targeting vector)를 129/SvJ 마우스 배아줄기세포 (embryoinc stem cell, ES)에 찔러 넣어서 상동 재조합 (homologous recombinant)를 통한 유전자 결손을 유도하고 이들 양성 클론을 서던 블롯팅으로 확인하였다. 252개 클론 중 8개의 양성 ES 클론을 C57BL/6 배반포 (blastocyst)에 찔러 넣어서 키메라 마우스 (chimeric mice)를 얻고 수컷 키메라 마우스와 C57BL/6의 교배로 이형접합체 (heterozygote) 마우스를 얻었다. 돌연변이 대립유전자 (allele)의 생식선 전이 (germ line transmission)를 F1 자손의 게놈 DNA의 서던 블롯팅을 통하여 확인하였다. 그 후 이형접합체의 상호교배를 통하여 동형접합체 (homozygote)를 얻으며 이 동형접합체의 혈액에서 유전자형 검사 (genotyping)와 웨스턴 블롯팅을 통하여 Ahnak 단백질의 결손을 확인하였다 (도 2B 및 2C).

도 2A에 Ahnak 넉아웃 마우스 제작용 벡터 및 이를 통한 표적화된 대립유전자를 나타낸다.

실시예 2: 실험 동물의 준비 및 저지방 식이 (Low Fat Diet, LFD) 및 고지방 식이 (High Fat Diet, HFD)

각 실험 동물들을 실내 온도 24℃±2℃와 12시간의 빛-어둠 주기의 환경에서 pelleted standard chow diet (Lab Diets, IN, USA)를 수돗물과 함께 임의로 제공하며 유지하였다. 마우스가 6주령에 이르렀을 때에 수컷 Ahnak-/- 과 야생형 마우스는 각각 weight-matched group을 형성하게 되고 이때부터 12주간 실험동물들에게 각각 LFD (low fat diet) (70% 탄수화물, 10% 지방, 20% 단백질 :D12450B : Research Diets)를 제공하거나 HFD (high fat diet)(20% 탄수화물, 60% 지방, 20% 단백질 : D12492: Research Diets Inc., New Brunswick, NJ)를 제공하였다.

실시예 3: Ahnak 단백질에 의한 Smad의 활성화 분석

어떤 단백질이 Ahnak 관련 지방세포 분화와 관련되어 있는지 알아보기 위하여 하기 실험을 수행하였다.

상기 실시예 1의 마우스 중 유전자형이 헤테로인 암컷과 수컷을 교배시켜서 착상된 지 13.5일 된 태아를 분리한 후 머리, 팔, 다리와 장기들을 제거하고 MEFs(mouse embryonic fibroblasts)를 얻었다. MEF세포는 마우스 배아 결합조직형성세포를 뜻한다. Ahnak의 유전자형 분석을 통하여 Ahnak 야생형 또는 넉아웃 MEF세포임을 확인한 후 두 유전자형의 MEF세포에서 동시에 10ng/mL TGF-β 자극을 통해 Smad3인산화를 유도하였다. 자극 시간을 5분부터 60분까지 다양하게 준 뒤 전체 Smad3와 인산화된 Smad3를 인지하는 항체를 각각 이용하여 웨스턴 블럿으로 분석하였다.

그 결과, TGF-β 자극 시간이 점점 길어짐에 따라 전체 Smad3와 항존유전자(house keeping gene)인 β-actin 단백질 양은 변하지 않으나 인산화된 Smad3의 양만 점차 증가하는 것을 볼 수 있었다(도 5). 즉, TGF-β가 Ahnak과 R-Smad의 상호작용을 촉진하는 것을 확인하였다. 또한, Ahank 단백질이 정상적으로 발현되고 있는 경우, 지방세포 분화를 유도하는 신호전달과정에 활성화되는 단백질인 Smad3이 TGF-β에 반응하여 인산화되어 활성화되는 것을 확인하였다(도 5).

또한 Ahnak의 야생형과 넉아웃 POB(PreOstoblast)를 생후 24~72시간 이내의 마우스의 두개골에서 분리해 내어 BMP2자극을 5ng/ml의 농도로 주어 Smad1의 인산화를 유도하였다. 자극 시간을 10분에서 120분까지 다양하게 준 뒤에 전체 Smad1과 인산화된 Smad1을 인지하는 항체를 통해 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다.

그 결과, Smad1의 인산화는 BMP2의 자극 시간이 길어짐에 따라 증가하는 것을 볼 수 있다(도 7). 즉, Ahnak 단백질은 BMP2에 반응한 Smad1의 인산화를 촉진하여 핵내 지방세포 분화 유도와 관련한 캐스케이드 발현 단계에서 반응을 촉진하는 역할을 하는 것을 확인하였다(도 7). 이러한 결과는 Ahnak 단백질이 지방세포의 분화와 관련된 단계에서 발현되는 단백질을 활성화시켜 지방세포의 분화 및 성장을 유도하는데 효과가 있음을 나타내는 결과이다.

이와 같은 발현 단계 유도는 도 3의 Step Ⅰ 및 Step Ⅱ에 간략히 나타냈다.

실시예 4: Smad 에 의한 핵내 지방세포 분화 단백질들의 활성화 분석

면역형광염색법을 이용하여 단백질의 세포 내 위치를 추적, 분석하였다.

NIH3T3 세포주에 녹색형광단백질(green fluorescence protein, GFP)이 표지된 Ahnak(GFP-Ahnak)유전자를 과발현 시킨 후 10ng/mL의 TGF-β자극을 주거나 TGF-β가 포함된 혈청(serum)자극을 1시간 주었다. 자극 후 세포를 3.5% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정시키고 0.5% 트리톤 엑스 100(Triton X-100)으로 세포에 투과성을 만들어 주었다. 그 뒤 0.5% 소혈청알부민(bovine serum albumine)으로 세포 내 비 특이적 부분에 항체가 붙지 않도록 막아주고(blocking) Smad2와 3를 함께 인지하는 항체를 일차로 붙여준 후 적색형광염료인 로다민(rhodamine)이 붙어있는 이차 항체를 반응시켜주어 Smad2/3가 있는 부분에서만 적색 형광이 발광하도록 하였다. 마지막으로 핵의 위치를 표시하기 위하여 DNA에만 염색되는 청색의 형광 염료인 다피(DAPI) 염색을 실시하였다. 그리하여 녹색형광의 Ahnak 단백질, 적색형광의 Smad2/3 단백질이 TGF-β 자극 시에 청색형광을 띄는 핵 안으로 이동하는지 콘포칼 현미경(confocal microscope)으로 관찰하였다(도 6a).

아울러 상기 실시예 1과 3을 통하여 얻은 Ahnak 야생형과 넉아웃 MEF세포에 5, 10ng/mL의 TGF-β자극을 처리한 후 세포를 3.5% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정시키고 0.5% 트리톤 엑스 100(Triton X-100)으로 세포에 투과성을 만들어 주었다. 그 뒤 0.5% 소혈청알부민(bovine serum albumine)으로 세포 내 비 특이적 부분에 항체가 붙지 않도록 막아주고(blocking), Smad3만 인지하는 일차 항체를 붙여주었다. 또한 적색형광염료인 로다민(rhodamine)이 붙어있는 이차 항체를 반응시켜주어 Smad3가 있는 곳에서만 적색형광이 발광하도록 하였다. 마지막으로 핵의 위치를 정확히 보기 위하여 청색 형광의 다피 염료로 염색한 후 콘포칼 현미경(confocal microscope)으로 관찰하였다(도 6b).

그 결과, Ahnak 단백질이 정상적으로 발현되는 경우, TGF-β에 반응하여 Ahnak단백질과 Smad3 단백질이 활성화되며 동시에 핵내로 이동하는 것을 Ahnak 과발현 세포주(도 6a)와 Ahnak 야생형, 넉아웃 세포(도 6b)에서 모두 확인하였다. 이러한 결과는 Smad3 단백질이 핵내 지방세포 분화를 유도하는 단백질의 전사 활성을 증가시켜 지방세포의 분화를 효과적으로 촉진할 수 있음을 나타내는 결과이다.

실시예 5: 지방조직의 조직학 분석

상기 실시예 2의 실험동물에서 얻은 부고환 지방 조직 (Epididymal adipose tissue)을 10% 중성 완충 포르말린 (neutral buffered formalin)에 고정시켰다. 연속적인 알콜 농도 구배(Graded alcohol series)와 세척을 통한 탈수화 (dehydration)를 수회 진행한 후에 조직을 파라핀에 포매시켰다. 조직 절편을 두께 4㎛로 잘랐고, 헤마톡실린 (haematoxylin)과 에오신 (eosin)으로 염색을 진행하였다. 백색 지방세포 (White adipocyte)의 크기를 확인하기 위해 각 지방세포의 영역을 Opti Pro software(Olympus Co., USA) 로 각 절편을 측정하였다.

그 결과를 도 8에 나타냈다. 도 8에서 보는 바와 같이, Ahnak이 정상적으로 발현되는 경우, 지방세포의 분화 및 성장이 효과적임을 확인할 수 있었으며, 이는 고지방식이 마우스에서 더욱 그 효과가 크게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

이러한 결과는, Ahnak 단백질이 마우스의 지방세포 분화 및 성장을 조절하는데 중요한 인자로 작용하는 것을 나타낸다.

Claims (9)

1. Ahnak 단백질을 포함하는 줄기세포에서 지방세포로의 분화 유도용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)인 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 지방세포 유래 줄기세포(adipose derived stem cell)인 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 Smad3의 인산화를 증가시키는 것을 특징으로 하는 것인 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 Smad1의 인산화를 증가시키는 것을 특징으로 하는 것인 조성물.
   
6. (a) 줄기세포를 배양하는 단계; 및
   (b) 상기 (a)단계의 줄기세포에 제1항의 조성물을 첨가하는 단계를 포함하는 줄기세포에서 지방세포로 분화 유도하는 방법.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC) 또는 지방세포 유래 줄기세포(adipose derived stem cell)인 방법.
   
8. 제6항에 있어서, 상기 방법은 Smad3의 인산화를 증가시켜 수행되는 것인 방법.
   
9. 제6항에 있어서, 상기 방법은 Smad1의 인산화를 증가시켜 수행되는 것인 방법.

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