KR20090089206A

KR20090089206A - 배아줄기세포를 혈관모세포로 분화 유도하는 방법

Info

Publication number: KR20090089206A
Application number: KR1020080014625A
Authority: KR
Inventors: 한용만; 박상욱; 이은영
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2008-02-18
Filing date: 2008-02-18
Publication date: 2009-08-21
Also published as: KR100948170B1

Abstract

본 발명은 MEK/ERK(mitogen-activated protein kinase kinase/extracellular regulated kinase) 신호전달 억제제 및 BMP(bone morphogenetic protein)를 포함하는 배아줄기세포 분화 유도용 조성물 및 상기 조성물을 이용하여 배아줄기세포로부터 중간엽 세포(mesoderm cell)로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다. 또한, 상기 방법으로 얻어진 중간엽 세포는 다양한 중간엽성 조직 세포로 분화할 수 있으며, 구체적인 예시로서 본 발명은 상기 방법으로 얻어진 중간엽 세포를 VEGF(vascular endothelial cell growth factor) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)의 존재 하에 배양하여 혈관모세포(hemangioblast)로 분화 유도하는 방법에 관한 것이다. 상기와 같이 분화된 혈관모세포는 이후 다양한 배양 조건 하에서 혈관내피세포, 혈관평활근세포 및 조혈줄기세포로 효과적으로 분화 유도될 수 있다.

배아줄기세포, 중간엽 세포, 혈관모세포, MEK/ERK 신호전달 억제제, BMP

Description

배아줄기세포를 혈관모세포로 분화 유도하는 방법 {Method for inducing the defferentiation of embryonic stem cells into hemangioblast}

본 발명은 MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP를 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물 및 상기 조성물을 이용하여 배아줄기세포로부터 중간엽 세포(mesoderm cell)로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다. 또한, 상기 방법으로 얻어진 중간엽 세포는 다양한 중간엽성 조직 세포로 분화할 수 있으며, 구체적인 예시로서 본 발명은 상기 방법으로 얻어진 중간엽 세포를 VEGF(vascular endothelial cell growth factor) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)의 존재 하에 배양하여 혈관모세포(hemangioblast)로 분화 유도하는 방법에 관한 것이다. 상기와 같이 분화된 혈관모세포는 이후 다양한 배양 조건 하에서 혈관내피세포, 혈관평활근세포 및 조혈줄기세포로 효과적으로 분화 유도될 수 있다.

인간 배아줄기세포(human embryonic stem cells: hESCs)는 인간 배반포(blastocyst)의 내세포괴 (inner cell mass)에서 유래한 세포로서(J. A. Thomson et al, Science 282, 1145-1147, 1998), 자가증식(self-renewal) 할 수 있는 능력과, 인체 내의 다양한 세포 타입으로 분화할 수 있는 분화전능성(pluripotency)을 가지고 있다(K. S. O'Shea et al, Anat Rec 257, 32-41, 1999; A. M. Wobus et al, Preface, Cells Tissues Organs 165, 129-130, 1999). 이러한 인간 배아줄기세포의 특성으로 인해, 인간 배아줄기세포는 당뇨병, 파키슨씨 질환과 같이 세포자체의 기능이 저하되거나 사멸됨으로 인해 발생하는 질환의 치료에 이용될 수 있다고 알려져 있다(J. H. Kim et al. Nature 418, 50-56, 2002; S. Gerecht-Nir et al, Transpl Immunol 12, 203-209, 2004; Y. Hori et al, Proc Natl Acad Sci USA 99, 16105-16110, 2002). 현재까지 여러 연구 그룹에서 인간 배아줄기세포를 이용하여 다양한 세포 타입으로 분화 유도하고 있다. 인간 배아줄기세포의 분화방법은 크게 3가지 방법으로 나눌 수 있다. 첫 번째로, 인간 배아줄기세포로부터 배아체(embryoid body)를 형성하는 방법이다(Itskovitz-Eldor J et al. Mol Med 6:88-95, 2000). 두 번째로, 단일층(monolayer)으로 자라고 있는 인간 배아줄기세포에 FBS 또는 FCS 등의 동물 유래 혈청(serum)을 첨가하여 자연분화시키는 방법이다(Wang et al. Nature biotech 25, 317-318, 2007). 마지막으로, 인간 배아줄기세포를 분화된 다른 세포와 함께 공배양(co-culture)하는 방법이다(Vodyanik, M. A. et al. Blood 105, 617-626, 2005). 이러한 3가지 분화방식은 인간 배아줄기세포가 자연적으로 분화할 수 있는 환경을 조성하여 다양한 세포 타입의 생성을 유도하고, 분화된 세포들 중 실험자가 원하는 세포 타입을 분리하여 획득하는 방법을 취하고 있다. 따라서 특정 세포 타입으로의 분화효율이 낮고, 특히 동물유래인자나 혈청이 함유된 경우에는 혈청 속의 다양한 인자들 때문에 인간 배아줄기세포를 통한 초기 인간의 발생기작을 연구하는데에 큰 어려움이 있다.

한편, 배아줄기세포는 외배엽, 중배엽 및 내배엽성 줄기세포로 분화할 수 있는데, 이 중 중배엽성 기원(mesodermal origin)의 다능성 줄기 세포는 발단 단계에서 뼈, 연골 조직, 힘줄, 근육, 지방 및 혈관 내피 등으로 분화한다 (Minguell et al., Esp. Biol. Med. 226, 507-520, 2001). 이러한 중배엽성 줄기세포에서 유래한 대표적인 세포군은 소위 혈관모세포(Hemangioblast)를 들 수 있다. 중배엽성 기원의 다능성 줄기세포는 자가 증식성을 가지며, 다양한 동물 모델 시스템에 이들 세포를 이식하면 국소 부위에서 이들 세포가 분화하여 혈관 및 다양한 혈액세포로 분화하여 조직이 재생되므로 세포 치료에 유용하다. 이러한 중배엽성 기원의 줄기세포를 세포 치료 등에 이용할 수 있을 만큼 충분한 양을 얻기 위해서는 배아줄기세포로부터 중배엽성 기원의 줄기세포로 분화 유도하는 기술이 필요하다. 그러나, 배아줄기세포를 중배엽성 기원의 줄기세포로 효과적으로 분화 유도하는 방법은 현재까지 국내외적으로 거의 알려진 바가 없다.

또한, 배아줄기세포로부터 혈관모세포로 분화 유도하는 기술로는 배아줄기세포를 VEGF, bFGF, IGF(insulin-like growth factor) 및 EGF(epidermal growth factor)를 포함한 배지에서 배양하여 내피세포(endothelial cell)로 분화 유도하는 방법 (국제공개특허 WO 03/040319), 배아줄기세포를 SCF(stem cell factor), FLT-3 리간드, IL-3, IL-6 및 G-CSF(granulocyte colony stimulating factor)로부터 선택된 조혈성장인자(hematopoietic growth factor)를 포함한 환경에서 배양하여 조혈세포주(Hematopoietic lineage)를 생산하는 방법 (미국공개특허 US 2003/0153082), 인간 배아체를 인간 태반기질세포와 복합배양하여 인간 배아체를 조혈모세포로 분화 유도하는 방법(국내특허출원 제10-2006-0009934호) 및 인간 배아체를 인간 골수기질세포와 복합배양하여 인간 배아체를 조혈모세포로 분화 유도하는 방법(국내특허출원 제10-2004-0097538호) 등이 있다. 그러나, 현재까지 배아줄기세포의 신호전달체계 조절을 통하여 혈관모세포로 분화 유도하려는 시도에 관해서는 전혀 알려진 바가 없다.

이러한 배경 하에, 본 발명자는 배아줄기세포의 신호전달체계를 조절하여 보다 효율적으로 배아줄기세포를 중배엽성 줄기 세포로 분화 유도할 수 있는 방법을 찾고자 예의 노력한 결과, 배아줄기세포에 MEK/ERK신호전달억제제 및 BMP를 처리하면 높은 효율로 중배엽성 줄기세포로 분화 유도시킬 수 있음을 발견하였고, 나아가 상기 방법으로 분화된 중배엽성 줄기세포에 VEGF 및 bFGF를 처리하면 혈관모세포(hemangioblast)로 분화 유도시키는데 탁월한 효과가 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다. 이러한 분화 유도 방법은 동물 유래의 혈청의 첨가 없이도, 인간 배아줄기세포의 신호전달체계를 조절하여 효과적으로 다양한 세포를 생산할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 하나의 목적은, MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP를 포함하는 배아줄기세포 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 조성물을 이용하여 배아줄기세포로부터 중간엽 세포(mesoderm cell)로의 분화를 유도하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법으로 얻어진 중간엽 세포를 VEGF 및 bFGF의 존재 하에 배양하여 혈관모세포(hemangioblast)로 분화 유도하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법으로 얻어진 혈관모세포를 VEGF 및 bFGF의 존재 하에 배양하여 혈관내피세포(vascular endothelial cell)로 분화 유도하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법으로 얻어진 혈관모세포를 PDGF-BB의 존재 하에 배양하여 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cell)로 분화 유도하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법으로 얻어진 혈관모세포를 MethCult GF H4434 (Stem Cell Technologies사, Canada)에 배양하여 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell)로 분화 유도하는 방법을 제공하는 것이다.

따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP를 포함하는 배아줄기세포 분화 유도용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "배아줄기세포(embryonic stem cell)"는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로서, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)일 수 있는 세포를 의미하며, 넓은 의미로는 배아줄기세포로부터 유래한 배아체(embryoid bodies)도 포함한다. 배아체는 배아줄기세포의 다양한 조직 형태로의 자발적 분화 과정에서 줄기세포에 의해 형성된 중간구조이며, 배아 줄기 세포의 배양 중에 형성된 응집물(aggregate) 형태이다. 한편, 본 발명의 배아줄기세포는 인간을 포함한 포유동물로부터 유래할 수 있고, 바람직하게는 인간 배아줄기세포이다.

본 발명에서 용어,“분화(differentiation)”란 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 의미한다. 다능성 베아줄기세포는 계통이 한정된 전구세포(예컨대, 외배엽성 세포, 중배엽성 세포 또는 내배엽성 세포 등)로 분화한 후, 다른 형태의 전구세포로 더 분화될 수 있고(예컨대, 혈관모세포 등), 그 뒤 특정 조직(예컨대, 혈관 등)에서 특징적인 역할을 수행하는 말기 분화세포(예컨대, 혈관내피세포 및 혈관평활근세포 등)로 분화될 수 있다.

본 발명에서 용어, "MEK/ERK 신호전달 억제제"란 MEK/ERK(mitogen-activated protein kinase kinase/extracellular regulated kinase) 신호전달과정에 관여하는 ERK1/2 및 ERK1/2의 upstream 분자인 MEK1/2를 표적으로 하는 물질들을 의미한다.

MEK(mitogen-activated protein kinase kinase)는 세포질 내의 MAP 카이네이즈 신호전달계 말단에 작용하는 효소로서 세포 밖의 신호를 핵 내부로 전달하는 중요한 매개체 역할을 하며, 미엘린 기저 단백질(myelin basic protein)의 트레오닌(Thr) 잔기를 시험관 내에서 인산화(phosphorylation)시킨다. ERK는 고등생물에 존재하는 대표적인 MAP 카이네이즈로서 외부 신호에 의해 트레오닌(Thr)과 티로신(Tyr) 잔기를 인산화시킨다. 이와 같은 트레오닌과 티로신 잔기의 인산화는 MAP 카이네이즈 활성화에 결정적인 역할을 하므로, 이들 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환될 경우에는 효소가 활성화되지 않는다는 것이 보고되었다.

본 발명은 MEK/ERK 에 의한 신호전달 억제가 줄기세포 분화 조절에 효과적임을 처음으로 입증한 것으로서, 본 발명의 조성물에 포함되는 MEK/ERK 신호전달 억제제는 바람직하게는 PD98059 또는 U0126를 의미한다. PD98059는 2-(2-amino-3-methoxyphenyl)-4H-1-Benzopyran-4-one2-(2'-Amino-3'-methoxy)-flavone2-(2-amino-3-methoxyphenyl)-chromone 이고, U0126 은 1,4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis[2-aminophenylthio] butadiene 로 표시된다. 그러나, 상기 화합물 외에도 모든 MEK/ERK 신호전달 억제제가 본 발명의 범주에 속하게 됨은 당업자에게 있어서 자명하다. ERK1/2 는 MEK 1/2에 의해서 활성화되며 MEK 1/2 의 활성을 억제하면 ERK1/2 의 활성이 곧바로 억제되므로, MEK 1/2는 ERK1/2의 직접적인 상위 신호전달분자가 된다.

본 발명에서 용어, "BMP(bone morphogenetic proteins)" 란 골형성 성장인자로서, 골형성을 촉진하는 물질로 알려져 있으나 본 발명에서는 배아줄기세포의 분화를 조절하는 물질로 사용된다. 본 발명의 BMP는 바람직하게는 BMP-2, BMP-4, 또는 BMP-7을 의미한다.

본 발명은 배아줄기세포를 MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP의 자극 하에 배양하는 것을 특징으로 하며, 상기 자극 방법은 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 상기 물질을 배지 중에 첨가하는 방법을 들 수 있다. 그 밖에도, 상기 물질을 배지에 첨가하는 방법과 동일한 효과를 나타내는 모든 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 줄기세포 분화 유도제로서 MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP만을 포함할 수도 있고, 또는 다른 분화 유도제를 추가적으로 포함하여 이들 분화 유도제 사이에 상승적인(synergic) 효과가 발생하도록 할 수 있다. 본 발명의 조성물에 추가적으로 사용할 수 있는 분화 유도제는 줄기세포의 분화 유도제로 알려진 어떠한 것도 가능하다. 바람직하게, 본 발명의 조성물은 MEK/ERK 신호전달 억제제의 경우 배지 조성물 내에 20μM 내지 50 μM의 농도로 포함되는 것이 바람직하고, BMP 의 경우 배지 조성물 내에 10μM 내지 20 μM의 농도로 포함되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 조성물을 배지조성물 형태로 사용하는 경우, 일반적인 기본 배지 첨가물을 포함할 수 있으며, 예를 들면 혈청, 아미노산, 항생제 및 분화조절물질이 가능하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP를 포함하는 배아줄기세포 분화 유도용 조성물은 배아줄기세포를 중간엽 세포를 포함한 중배엽 계열의 세포들로 효과적으로 분화 유도시킬 수 있다. 이러한 중배엽 계열의 세포들로는 중간엽 세포(mesoderm cell), 혈관모세포(hemangioblast), 혈관내피세포(vascular endothelial cell), 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cell) 또는 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell)가 포함된다.

본 발명에서 용어, "중간엽 세포(mesoderm cell)"란 중배엽성 기원(mesodermal origin)의 다능성 줄기 세포를 말하며, 이러한 중간엽 세포는 발달 단계에서 뼈, 연골 조직, 힘줄, 근육, 지방 및 혈관 내피 등으로 분화한다 (Minguell et al., Esp. Biol. Med. 226, 507-520, 2001). 이러한 중배엽성 줄기세포에서 유래한 대표적인 세포군은 소위 혈관모세포(Hemangioblast)를 들 수 있다. 본 발명의 중간엽 세포는 자가 증식성 및 다능성을 가진다.

배아줄기세포로부터 중간엽 세포로의 분화를 확인하기 위하여, 중간엽 세포에 특이적인 마커의 검출을 이용할 수 있다. 중간엽 세포에 특이적인 마커의 예로는 구스코이드(Goosecoid), 브라키우리(Brachyury), TBX-4, TBX-5 및 TBX-6 등을 들 수 있다. 이러한 중간엽 세포에 특이적인 각종 마커의 발현을 검출하는 방법은 특별히 한정되지 않으나, 역전사 효소 매개 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 또는 혼성화 분석으로서 임의의 마커 단백질을 코딩하는 mRNA를 증폭, 검출, 해석하기 위한 종래에 흔히 사용되는 분자생물학적 방법으로 확인할 수 있다. 중간엽 세포에 특이적인 마커 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 이미 공지되어 있어 유전자은 행(GenBank)과 같은 공공 데이터베이스로부터 이용가능하며, 프라이머 또는 프로브로 사용하기 위하여 필요한 마커 특이적 서열을 용이하게 결정할 수 있다. 보다 바람직하게는, 면역조직 화학적 염색법이나 면역 전기영동법과 같은 면역화학적 방법을 사용하여 마커의 발현을 단백질 수준에서 확인할 수 있다. 면역화학적 방법에서, 중간엽 세포에 결합하는 마커 특이적인 다클론성 항체 또는 단일 클론 항체를 사용할 수 있으며, 시판되고 있는 항체를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 VEGF 및 bFGF을 추가로 포함할 수 있으며, VEGF 및 bFGF는 중간엽 세포를 혈관모세포(hemangioblast)로 분화 유도시킬 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP를 포함하는 배아줄기세포 분화 유도용 조성물을 이용하여 배아줄기세포로부터 중간엽 세포(mesoderm cell)로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 얻어진 중간엽 세포를 VEGF 및 bFGF의 존재 하에 배양하여 혈관모세포(hemangioblast)로 분화 유도하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법으로 얻어진 혈관모세포를 VEGF 및 bFGF의 존재 하에 배양하여 혈관내피세포(vascular endothelial cell)로 분화 유도하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법으로 얻어진 혈관모세포를 PDGF-BB의 존재 하에 배양하여 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cell)로 분화 유도하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법으로 얻어진 혈관모세포를 MethCult GF H4434 배지에 배양하여 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell)로 분화 유도하는 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명의 배아줄기세포 분화 유도방법은 1) 미분화 배아줄기세포를 준비하는 단계; 2) 상기 배아줄기세포를 MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP를 포함하는 배아줄기세포 분화 유도용 조성물을 포함하는 배지에서 배양하여 중간엽 세포로 분화시키는 단계; 3) 상기 분화된 중간엽 세포를 VEGF 및 bFGF의 존재 하에 배양하여 혈관모세포(hemangioblast)로 분화시키는 단계; 및 4) 상기 분화된 혈관모세포를 혈관내피세포, 혈관평활근세포 및 조혈줄기세포로 분화시키는 단계를 순차적으로 포함할 수 있다.

먼저, 상기 단계 1)은 미분화 상태의 배아줄기세포를 준비하는 단계로서, 배아줄기세포를 영양세포와 공배양하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 세포를 증식시키기 위해서는 혈청을 사용하지만, 배아줄기세포는 혈청을 사용하여 배양하면 미분화상태를 유지시킬 수 없기 때문에 혈청 대신 영양(feeder)세포 위에 부착시켜 공배양시킬 수 있으며, 이때 영양세포로서 미토마이신 C 처리되어 증식이 정지된 생쥐 유래 섬유아세포인 MEF(mouse embryonic fibroblast, MEF) 또는 STO (ATCC, USA)를 사용할 수 있다.

또한, 배아줄기세포를 영양세포 없이 배양하는 경우(feeder-free culture) 에는 영양세포에 의한 조건배지(conditioned medium, CM)가 첨가된 마트리젤(matrigel)-코팅된 배양접시에서 배양할 수 있다. 본 발명에서 용어, "conditioned medium"은 영양세포인 MEF 또는 STO를 bFGF가 첨가된 인간 배아줄기세포 배지에서 배양하여 생성된 배양액을 의미한다. 구체적으로, 본 발명에서는 조건배지를 제조하기 위하여 영양세포로 STO(ATCC, USA)를 사용하였고, 이는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, Hyclone, USA), 0.1 mM 비필수 아미노산, 1X 페니실린/스트렙토마이신 및 0.5 mM 베타-머캡토에탄올이 첨가된 DMEM (Invitorgen, USA) 배지에서 유지 배양한 후, 10 ㎍/㎖ 마이토마이신-C(Sigma, USA)에서 2시간 30분 동안 불활성화하여 사용하였다.

단계 2)는 상기 준비된 배아줄기세포 유래 배아체에 MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP를 처리하여 중간엽 세포로 분화 유도하는 단계이다. MEK/ERK 신호전달 억제제는 MEK/ERK의 신호전달을 억제시켜 정상적인 신호전달과정을 방해하는 물질이면 특별히 한정하지 않으나, 바람직하게는 PD98059 또는 U0126을 사용할 수 있다. 이때, MEK/ERK 신호전달 억제제는 20 내지 50 μM 의 배양 배지 내 농도로 처리하는 것이 바람직하다. BMP 는 BMP-2,4 또는 7이 바람직하고 10 내지 20 μM 의 배양 배지 내 농도로 처리한다. MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP는 동시에 처리하는 것이 이들을 각각 단독으로 처리하는 것보다 바람직하다 (도 2A).

또한, 중간엽 세포로 분화 유도시, MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP 이외에도 배아줄기세포를 중간엽 세포로 분화 유도를 촉진하는 공지의 물질 및 일반적인 배지 첨가물을 추가로 포함할 수 있다. 단계 2)은 분화 세포가 형성될 수 있는 충분한 시간 동안 실시하는 것이 일반적이며, 바람직하게는 3일 내지 5일이 좋다.

단계 3)은 상기 분화된 중간엽 세포를 VEGF 및 bFGF의 존재 하에 배양하여 혈관모세포(hemangioblast)로 분화시키는 단계이다. VEGF와 bFGF는 배지 내에 50 ng/㎖ 의 농도로 포함되는 것이 바람직하고, 이 외에도 혈관모세포로 분화 유도를 촉진하는 공지의 물질 및 일반적인 배지 첨가물을 추가로 포함할 수 있다. 단계 3)은 분화 세포가 형성될 수 있는 충분한 시간 동안 실시하는 것이 일반적이며, 바람직하게는 3일 내지 5일이 좋다.

단계 4)는 상기 분화된 혈관모세포를 적절한 배양 조건 하에서 혈관내피세포, 혈관평활근세포 및 조혈줄기세포로 분화시키는 단계이다. 혈관모세포를 혈관내피세포로 분화하기 위해서는 VEGF 및 bFGF의 존재 하에 배양하는 것이 바람직하며, 이 때 VEGF와 bFGF는 배지 내 농도는 50ng/㎖ 로 하여 3일 내지 5일간 배양하는 것이 바람직하다. 또한, 혈관모세포를 혈관평활근세포로 분화하기 위해서는 PDGF-BB(Platelet-derived growth factor-BB)의 존재 하에 배양하는 것이 바람직하며, 이 때 PDGF-BB는 배지 내 농도는 50ng/㎖ 로 하여 3일 내지 5일간 배양하는 것이 바람직하다. 또한, 혈관모세포를 조혈줄기세포로 분화하기 위해서는 MethCult GF H4434 (Stem Cell Technologies사, Canada)에 배양하는 것이 바람직하며, 15일 정도 배양하는 것이 바람직하다.

본 발명의 구체적인 실시예에서도 상기 4 단계에 따라 인간 배아줄기세포를 분화 유도시켰다 (도 1). 우선 1 단계에서는, 영양세포주인 STO세포주 위에서 인간 배아줄기세포를 공배양 한 후, feeder-free 배양을 위해 10㎖ 주사기 바늘을 이용하여 하나의 콜로니를 직경 300 내지 500 ㎛로 잘라서 마트리젤(Matrigel) 위에 올 려 놓고, 4~8 ng/㎖의 bFGF가 첨가된 조건배지에서 2 일간 배양하였다. 2 단계에서는, 조건배지에서 2 일간 배양한 인간 배아줄기세포를 MEK1/2억제제인 PD98059 및 BMP-4를 각각 20~50μM 및 10~20ng/㎖의 농도로 unconditioned medium에 첨가하여, 3일간 배양하였다. 이 때, "unconditioned medium" 은 bFGF가 첨가되지 않은 배아줄기세포 배양 배지를 말한다. 3 단계에서는, unconditioned medium에 VEGF와 bFGF를 각각 50 ng/㎖의 농도로 첨가하여 3일간 배양하였다. 4 단계에서는, 혈관모세포 표시인자인 CD34 를 발현하는 세포를 CD34 마이크로비드(microbead)를 이용하여, CD34 양성세포만 분리하여 획득하였다. 획득한 CD34 양성세포는 혈관내피세포로 분화시키기 위해, EGM(Endothelial cell Growth Medium, clonetics사, USA)에 VEGF와 bFGF를 첨가하여 약 5일동안 배양하였다. 또한, CD34 양성세포를 혈관평활근세포로 분화시키기 위해, EGM(Endothelial cell Growth Medium, clonetics사, USA)에 50 ng/㎖의 PDGF-BB를 첨가하여, 약 5일동안 배양하였다. 또한, CD34 양성세포를 조혈줄기세포로 분화시키기 위해, MethCult GF H4434 (Stem Cell Technologies사, Canada)에서 약 15일동안 배양하였고, 실험방법은 제조사의 프로토콜을 따라 수행하였다.

본 발명의 분화 유도방법을 통해 배아줄기세포로부터 분화 유도된 세포는 형태학적, 생리학적 또는 면역학적 특징을 가지는데, 바람직하게는 분화 유도된 세포 특이적인 표지 인자들의 유전자 발현 정도가 증가될 수 있다. 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 중간엽 세포의 경우, 중간엽 세포 특이적인 표지 인자, 예를 들면 구스코이드(Goosecoid), 브라키우리(Brachyury), TBX-4, TBX-5 및 TBX-6 중 하나 이상의 유전자 발현 정도가 증가되는 특징을 가질 수 있다. 또한, 중간엽 세포로부터 분화 유도된 혈관모세포의 경우 CD34 양성의 특징을 가진다. 또한, 혈관모세포로부터 분화 유도된 혈관내피세포의 경우, 혈관내피세포 특이적 마커 유전자인 vWF(von Willerbrand factor), EphB4(Ephrin receptor B4), VE-cadherin(Vascular Endothelial-cadherin), CD105(endoglin) 및 CD31(PECAM-1) 중 하나 이상의 유전자 발현 정도가 증가되는 특징을 가질 수 있다. 또한, 혈관모세포로부터 분화 유도된 혈관평활근세포의 경우, 혈관평활근세포 특이적 마커 유전자인 SM22α, SM-MHC(smooth muscle-myosin heavy chain), PDGF-B 수용체, α-SMA(α-smooth muscle actin) 및 칼포닌(calponin) 중 하나 이상의 유전자 발현 정도가 증가되는 특징을 가질 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 조성물 및 이를 이용한 분화 유도 방법의 분화 유도 효과를 확인하기 위하여, 본 발명의 MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP를 인간 배아줄기세포에 처리하여 중간엽 세포 특이적인 마커 유전자인 구스코이드(Goosecoid), 브라키우리(Brachyury), TBX-4, TBX-5 및 TBX-6의 발현을 RT-PCR 및 면역형광염색에 의해 확인하였고(도 2), 상기 분화된 중간엽 세포에 VEGF 및 bFGF를 처리하여 혈관모세포 특이적인 마커인 CD34 의 발현을 RT-PCR로 확인하였다(도 3). 또한, 상기 분화된 혈관모세포로부터 혈관내피세포(도 4), 혈관평활근세포(도 5) 및 조혈줄기세포(도 6)로의 분화 여부를 확인하기 위하여 각 세포 에 특이적인 마커의 발현을 RT-PCR 로 확인한 결과, 본 발명의 조성물이 탁월한 분화 유도 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

상기에서 기술한 바와 같이, 인간 배아줄기세포의 신호전달체계를 조절하여 중간엽 세포로 분화 유도하기 위해 MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP 를 사용할 수 있으며, 이렇게 분화 유도된 중간엽 세포에 VEGF 및 bFGF를 처리하여 동물 유래의 혈청(serum) 없이도 배아줄기세포를 혈관내피세포, 혈관평활근세포, 조혈줄기세포로 분화할 수 있는 혈관모세포를 효과적으로 유도할 수 있다. 이와 같은 분화방법을 통하여 배아줄기세포를 효과적으로 원하는 세포로 분화 유도할 수 있으며, 초기 인간 발생을 연구하는 중요한 기작을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명이 이에 의해 한정되지 않는다.

실시예 1. 인간 배아줄기세포의 배양

본 발명에서, 인간 배아줄기세포 배양 배지는 20% 넉아웃 시럼 리플레이스먼트(knockout serum replacement, Invitrogen, USA), 0.1 mM 비필수 아미노산(Non-essential amino acid, NEAA; Invitrogen, USA), 0.1 mM 베타-머캡토에탄올, 4 ng/ ㎖ 인간 재조합 염기성 FGF(recombinant human basic FGF, Invitrogen, USA) 및 1X 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin; Invitrogen, USA)이 포함된 DMEM/F12 (Invitrogen, USA) 배지를 사용하고, 0.22 mm filter로 여과(filtration) 하여 사용하였다.

영양세포주인 STO 세포주 위에서 인간 배아줄기세포를 공배양한 후, feeder-free 배양을 위해 10㎖ 주사기 바늘을 이용하여 하나의 콜로니를 직경 300 내지 500 ㎛로 잘라서 마트리젤(Matrigel) 위에 올려 놓고, 4~8 ng/㎖의 bFGF가 첨가된 조건배지에서 2 일간 배양하였다.

실시예 2. 인간 배아줄기세포의 중간엽 세포로의 분화 유도

2-1. RT - PCR 에 의한 확인

실시예 1에서 배양한 인간 배아줄기세포를 MEK1/2억제제인 PD98059 및 BMP-4를 각각 20~50μM 및 10~20ng/㎖의 농도로 조건배지에 첨가하여 3일간 배양한 후, 인간 배아줄기세포가 중간엽 세포로 분화되었는지 확인하기 위하여 중간엽세포 특이적인 마커 유전자(marker genes)들의 발현을 RT-PCR을 통해 알아보았다. 유전자발현 분석은 총 RNA를 세포에서 분리한 후, 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하여 각각의 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR (polymerase-chain reaction)법으로 분석하였다.

대조군으로 조건배지에서만 5일간 처리한 표본을 사용했고, 실험군으로는 PD98059 및 BMP-4를 단독으로 각각 20~50μM 및 10~20ng/㎖의 농도로 unconditioned medium에 추가하여 세포배양액으로 넣어준 후, 3일과 5일 동안 그 경과를 관찰하였다. 또한, PD98059 및 BMP-4을 동시에 처리한 표본 역시 3일과 5일 동안 그 경과를 관찰하였다.

그 결과, 도 2(A)에 나타난 바와 같이, PD98059 및 BMP-4를 동시에 처리한 표본에서만 중간엽세포 특이적 마커인 BRACHYURY, GOOSECOID, TBX-4,TBX-5, 및 TBX-6 이 발현되었고, PD98059 또는 BMP-4 만 단독으로 처리한 표본에서는 중간엽세포 특이적 마커의 발현이 일어나지 않았다.

2-2. 면역형광염색법에 의한 확인

중간엽 세포로의 분화 여부를 단백질 수준에서 확인하기 위하여, 조건배지에서 5일간 처리한 표본과 PD98059, BMP-4를 함께 처리한 표본에서의 배아줄기세포 특이적 마커와 중간엽 세포 특이적 마커의 발현 여부를 면역형광염색으로 알아보았다. 중간엽세포로 분화된 인간배아줄기세포를 중간엽세포 특이적 마커인 BRACHYURY, GATA-2를 염색하기 위해, 먼저, PD98059와 BMP-4를 3일간 처리한 표본을 4% paraformaldehyde로 20분간 실온에서 고정시킨 후, PBST용액(PBS에 0.1% Tween-20 첨가)으로 5분간 3번 세척한다. 그리고, 항체가 핵까지 세포를 투과(permeabilization)될 수 있게 하기 위해서 투과용액(PBS에 0.1% Triton X-100첨가)을 배양접시에 넣고, 15분간 실온에서 두었다. 15분 후, 투과용액을 제거하고, 4% FBS(Fetal Bovine Serum)를 넣어 주어, 1시간 동안 실온에서 블록킹(blocking)을 실시하였다. 그리고 나서, 블록킹용액에 Goat anti-human OCT4, Mouse anti- human SSEA-4항체를 1:300으로 희석하고, Goat anti-human BRACHYURY, Goat anti-human GATA-2 항체를 1:100으로 희석하여 배양접시에 넣어준 후, 4℃에서 하루동안 넣어두었다. 다음날, 위의 표시인자들(OCT4, SSEA-4, BRACHYURY, GATA-2)의 발현여부를 형광현미경을 이용하여, 육안으로 확인하기 위해, 이들 표시인자들의 항체에 대한 2차항체들(Alexa 488와 Alexa 594가 결합된 Donkey anti-goat IgG , Alexa 488이 결합된Goat anti-mouse IgG)를 붙인 후, 1시간동안 실온에 방치한다. 1시간 후, PBST용액으로 10분간 5번 세척한 후, 형광현미경을 통해 표시인자들의 발현 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 2(B)에 나타난 바와 같이, 배아줄기세포 특이적 마커인 OCT3/4 및 SSEA-4의 발현은 PD98059 및 BMP-4를 처리함에 따라 감소하였고, 중간엽 세포 특이적 마커인 BRACHYURY 및 GATA-2의 발현을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 중간엽 세포의 혈관모세포로의 분화 유도

실시예 2에서 얻은 중간엽 세포를 unconditioned medium에 VEGF 및 bFGF를 각각 50 ng/㎖의 농도로 첨가하여 3일간 배양한 후, 내피세포 특이적 마커(Tie-2, CD31, CD105 및 KDR)와 배아줄기세포 특이적 마커(NANOG 및 OCT4), 그리고 혈관모세포특이적 마커(CD34)의 발현 여부를 RT-PCR을 통해 확인하였다. 유전자발현 분석은 총 RNA를 세포에서 분리한 후, 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하여 각각의 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR (polymerase-chain reaction)법으로 분석하였다.

VEGF 및 bFGF를 동시에 3일과 5일동안 처리한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 배아줄기세포 특이적 마커인 OCT4 및 NANOG의 발현은 사라졌으며, 내피세포특이적 마커(Tie-2, CD31, CD105 및 KDR)와 혈관모세포 특이적 마커는 증가하였다. 이 실험에서 사용한 HUVEC은 양성대조군으로써, VEGF와 bFGF를 처리한 표본에서 내피세포 특이적 마커와 혈관모세포 특이적 마커의 발현정도를 나타낸다.

실시예 4. 인간 배아줄기세포 유래의 혈관모세포의 분리 및 혈관 내피세포로의 분화 확인

4-1. RT - PCR 에 의한 확인

혈관모세포 표시 인자인 CD34 를 발현하는 세포를 CD34 마이크로비드(microbead)를 이용하여 CD34 양성세포만 분리하여 획득하였다. 획득한 CD34 양성세포는 혈관내피세포로 분화시키기 위해 EGM(Endothelial cell Growth Medium, clonetics사, USA)에 VEGF 및 bFGF를 각각 50ng/㎖의 농도로 처리하여 약 5일동안 배양한 후, 혈관내피세포 특이적 마커의 발현 여부를 RT-PCR을 통해 알아보았다. 유전자발현 분석은 총 RNA를 세포에서 분리한 후, 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하여 각각의 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR (polymerase-chain reaction)법으로 분석하였다.

그 결과, 도 4(a)에 나타난 바와 같이, CD34 양성세포를 VEGF 및 bFGF가 첨가된 EGM에서 배양하였을 때 혈관내피세포 특이적 마커인 vWF(von Willerbrand factor), EphB4(Ephrin receptor B4), VE-cadherin(Vascular Endothelial-cadherin), CD105(endoglin) 및 CD31(PECAM-1)의 발현이 양성대조군인 HUVEC 과 유사한 수준에서 발현되었다.

4-2. 면역형광염색법에 의한 확인

혈관내피세포로의 분화 여부를 단백질 수준에서 확인하기 위하여, 혈관내피세포 특이적 마커의 발현 여부를 면역형광염색으로 알아보았다. 혈관내피세포로 분화된 인간배아줄기세포를 혈관내피세포 특이적 마커인 PECAM-1, vWF, VE-cadherin을 염색하기 위해, 먼저, 표본을 4% paraformaldehyde로 20분간 실온에서 고정시킨 후, PBST용액(PBS에 0.1% Tween-20 첨가)으로 5분간 3번 세척하였다. 그리고, 항체가 핵까지 세포를 투과(permeabilization)될 수 있게 하기위해서 투과용액 (PBS에 0.1% Triton X-100첨가)을 배양접시에 넣고, 15분간 실온에서 두었다. 15분후, 투과용액을 제거하고, 4% NGS(Normal Goat Serum)을 넣어 주어, 1시간동안 실온에서 블록킹(blocking)을 실시하였다. 그리고 나서, 블록킹용액에 mouse anti-human PECAM-1, Rabbit anti-human vWF, mouse anti-human VE-cadherin 항체를 1:100으로 희석하여 배양접시에 넣어준 후, 4℃에서 하루 동안 넣어두었다. 다음날, 위의 표시인자들(PECAM-1, vWF, VE-cadherin)의 발현여부를 형광현미경을 이용하여, 육안으로 확인하기 위해, 이들 표시인자들의 항체에 대한 2차 항체들(Alexa 488와 Alexa 594가 결합된 Goat anti-mouse IgG , Alexa 488이 결합된 Goat anti-Rabbit poly)를 붙인 후, 1시간동안 실온에 방치한다. 1시간 후, PBST용액으로 10 분간 5번 세척한 후, 형광현미경을 통해 표시인자들의 발현여부를 확인하였다.

그 결과, 도 4(b)-(d)에 나타난 바와 같이, 혈관내피세포 특이적 마커인 vWF, VE-cadherin 및 CD31(PECAM-1)의 발현을 확인할 수 있었다.

4-3. AcLDL 흡수, 형태 및 코드구조형성 여부 확인

또한, 성숙한 내피세포는 LDL(Low Density Lipoprotein)을 흡수하는 성질을 가지고 있는데, 이러한 특성이 인간 배아줄기세포로부터 분화된 혈관내피세포에서도 있는지에 대해 확인하기 위해, AcLDL(acetylated LDL)을 약 4시간 가량 배양액에 넣어준 후, 형광현미경을 통해 AcLDL이 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 혈관내피세포에 흡수됨을 확인하였다(도 4(e)).

또한, 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 혈관내피세포의 형태는 성숙한 혈관내피세포의 조약돌모양 형태와 유사함을 위상차 현미경을 통해 확인하였다(도 4(f)).

마지막으로, 혈관내피세포는 마트리젤(Matrigel)이라고 하는 물질 위에 올려놓았을 때, 전선(코드)과 같은 구조를 형성하는 특성이 있다. 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 혈관내피세포에서도 같은 특성을 유지하고 있는지 확인하기 위하여 마트리젤(Matrigel) 위에 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 혈관내피세포를 올려놓고 24 시간 동안 배양한 결과, 코드모양의 구조물을 형성하는 것을 확인하였다(도 4(g)) .

실시예 5. 인간 배아줄기세포 유래의 혈관모세포의 혈관평활근세포로의 분화확인

5-1. RT - PCR 에 의한 확인

CD34 양성세포를 혈관평활근세포로 분화시키기 위해, EGM(Endothelial cell Growth Medium, clonetics사, USA)에 50 ng/㎖의 PDGF-BB를 첨가하여 5 일동안 배양한 후, 혈관평활근세포 마커의 발현을 RT-PCR을 통해 알아보았다. 유전자발현 분석은 총 RNA를 세포에서 분리한 후, 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하여 각각의 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR (polymerase-chain reaction)법으로 분석하였다.

그 결과, 도 5(a)에 나타난 바와 같이, CD34 양성세포는 PDGF-BB가 첨가된 EGM-2배양액에서 혈관평활근세포 특이적인 마커 유전자인 SM22α, SM-MHC(smooth muscle-myosin heavy chain), PDGF-B 수용체, α-SMA(α-smooth muscle actin) 및 칼포닌(calponin)을 발현하였다.

5-2. 면역형광염색법에 의한 확인

혈관평활근세포로의 분화 여부를 단백질 수준에서 확인하기 위하여, 혈관평활근세포 특이적 마커의 발현 여부를 면역형광염색으로 알아보았다. 혈관평활근세포로 분화된 인간배아줄기세포를 혈관평활근세포 특이적 마커인 α-smooth muscle actin(α-SMA)와 칼포닌(calponin)을 염색하기 위해, 먼저, 표본을 4% paraformaldehyde로 20분간 실온에서 고정시킨 후, PBST용액(PBS에 0.1% Tween-20 첨가)으로 5분간 3번 세척하였다. 그리고, 항체가 핵까지 세포를 투 과(permeabilization)될 수 있게 하기 위해서 투과용액 (PBS에 0.1% Triton X-100첨가)을 배양접시에 넣고, 15분간 실온에서 두었다. 15분 후, 투과용액을 제거하고, 4% NGS(Normal Goat Serum)을 넣어주어, 1시간 동안 실온에서 블록킹(blocking)을 실시하였다. 그리고 나서, 블록킹용액에 mouse anti-human α-SMA, Rabbit anti-human calponin 항체를 1:100으로 희석하여 배양접시에 넣어준 후, 4℃에서 하루 동안 넣어두었다. 다음날, 위의 표시인자들(α-SMA, 칼포닌)의 발현여부를 형광현미경을 이용하여, 육안으로 확인하기 위해, 이들 표시인자들의 항체에 대한 2차항체들(Alexa 488이 결합된 Goat anti-mouse IgG 와 Alexa 594이 결합된 Goat anti-Rabbit poly)를 붙인 후, 1시간동안 실온에 방치하였다. 1시간 후, PBST용액으로 10분간 5번 세척한 후, 형광현미경을 통해 표시인자들의 발현여부를 확인하였다.

그 결과, 도 5(b)에 나타난 바와 같이, 혈관평활근세포 특이적 마커인 α-SMA 및 칼포닌(calponin)이 단백질 수준에서도 발현되고 있음을 알 수 있다.

실시예 6. 인간 배아줄기세포 유래의 혈관모세포의 조혈줄기세포로의 분화확인

CD34 양성세포를 조혈줄기세포로 분화시키기 위해, MethCult GF H4434 (Stem Cell Technologies사, Canada)에서 약 15일 동안 배양하였고, 실험방법은 제조사의 프로토콜을 따라 수행하였다. CD34 양성세포가 조혈줄기세포로 분화하는지에 대해 확인하고자 CFU (colony forming unit) assay를 수행하였다. CFU assay를 수행하기 위해, 먼저 CD34 양성세포를 IMDM(Iscove's MDM)배지를 통해 세척한 후, 세포를 연 차적으로 희석하여 (500개, 1000개, 5000개, 5x10⁴개, 1x10⁵개 등) StemCell Technology 에서 자체 제작한 반-고체 메틸셀룰로우즈 폴리머(semi-solid methylcellulose polymer) 로 합성된 특수한 배지에 첨가하였다. 배지 내에 첨가된 성분들은 다음과 같다.

~ Iscove's MDM

~1% Methylcellulose

~30% Fetal Bovine serum

~ 1% Bovine Serum Albumin

~ 10^-4M 2-Merchaptoethanol

~ 2mM L-glutamine

~ 50ng/㎖ Stem Cell Factor

~ 10ng/㎖ GM-CSF

~ 10ng/㎖ IL-3

~ 3U/㎖ Erythropoietin

CD34 양성 세포를 위의 배지에 첨가한 후, 14일에서 20 여일 동안 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양하면서, 배양접시 내의 세포의 모양과 콜로니(colony)의 개체수를 확인하여 각 콜로니 별로 특성을 구분 지었다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, CD34 양성세포로부터 대식세포(macrophage), 적혈구(erythroid) 및 과립구(granulocyte)등의 혈액세포가 생성 됨을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명자가 유도한 CD34 양성세포가 조혈줄기세포로 분화됨을 알 수 있었다.

도 1은 인간 배아줄기세포를 조혈줄기세포, 혈관내피세포, 혈관평활근세포로 분화할 수 있는 혈관모세포로 분화 유도하는 방법을 도식화한 그림이다.

도 2는 인간 배아줄기세포가 중간엽 세포로 분화되었는지 확인하기 위하여 중간엽세포 특이적인 마커 유전자(marker genes)들의 발현을 RT-PCR (a) 및 면역형광염색법 (b) 으로 확인한 결과이다.

도 3은 인간 배아줄기세포로부터 분화된 중간엽 세포가 혈관모세포로 분화 유도되었는지 확인하기 위하여 내피세포 특이적 마커(Tie-2, CD31, CD105 및 KDR)와 배아줄기세포 특이적 마커(NANOG 및 OCT4), 그리고 혈관모세포특이적 마커(CD34)의 발현 여부를 RT-PCR을 통해 확인한 결과이다.

도 4는 인간 배아줄기세포 유래의 혈관모세포가 혈관 내피세포로 분화 유도되었는지 확인하기 위하여 혈관내피세포 특이적 마커인 vWF, EphB4, VE-cadherin, CD105 및 CD31의 발현 여부를 RT-PCR (a) 및 면역형광염색 (b-d)으로 확인한 결과이다. 또한, AcLDL이 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 혈관내피세포에 흡수됨을 형광현미경을 통해 확인하였고(e), 분화 유도된 혈관내피세포의 형태가 성숙한 혈관내피세포의 조약돌모양 형태와 유사함을 위상차 현미경을 통해 확인하였으며(f), 마트리젤(Matrigel) 위에 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 혈관내피세포를 올려놓고 24 시간 동안 배양한 결과, 코드모양의 구조물을 형성하는 것을 확인한(g) 결과를 나타낸다.

도 5는 인간 배아줄기세포 유래의 혈관모세포가 혈관평활근세포로 분화 유도 되었는지 확인하기 위하여 혈관평활근세포 마커의 발현을 RT-PCR (a) 및 면역형광염색법 (b)으로 확인한 결과이다.

도 6은 인간 배아줄기세포 유래의 혈관모세포가 조혈줄기세포로 분화 유도되었는지 확인하기 위하여 CFU (colony forming unit) assay를 수행한 결과, 대식세포(macrophage), 적혈구(erythroid) 및 과립구(granulocyte)등의 혈액세포가 생성됨을 확인한 결과이다.

Claims

MEK/ERK(mitogen-activated protein kinase kinase/extracellular regulated kinase) 신호전달 억제제 및 BMP(bone morphogenetic protein)를 포함하는 배아줄기세포 분화 유도용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 배아줄기세포는 인간 배아줄기세포인 조성물.
제 1항에 있어서, BMP는 BMP2, BMP4 또는 BMP7 인 조성물.
제 1항에 있어서, MEK/ERK 신호전달 억제제는 PD98059 또는 U0126인 조성물.
제 1항에 있어서, MEK/ERK 신호전달 억제제의 농도가 20 내지 50 μM인 조성물.
제 1항에 있어서, BMP의 농도가 10 내지 20μM인 조성물.
제 1항에 있어서, VEGF(vascular endothelial cell growth factor) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 추가로 포함하는 조성물.
MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP의 존재 하에 배아줄기세포를 배양하는 것을 포함하는, 배아줄기세포를 중배엽 계열의 세포로 분화 유도하는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 중배엽 계열의 세포는 중간엽 세포(mesoderm cell), 혈관모세포(hemangioblast), 혈관내피세포(vascular endothelial cell), 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cell) 또는 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell)인 방법.
제 8항에 있어서, BMP는 BMP2, BMP4 또는 BMP7 인 방법.
제 8항에 있어서, MEK/ERK 신호전달 억제제는 PD98059 또는 U0126인 방법.
제 8항에 있어서, MEK/ERK 신호전달 억제제의 농도가 20 내지 50 μM인 방법.
제 8항에 있어서, BMP의 농도가 10 내지 20μM인 방법.
제 8항에 있어서, 상기 배양액에서 3일 내지 5일간 배양하는 방법.
ⅰ) 배아줄기세포를 MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP의 존재 하에 배양하여 중간엽 세포로 분화를 유도하는 단계; 및 ⅱ) 상기 중간엽 세포를 VEGF 및 bFGF의 존재 하에 배양하여 혈관모세포로 분화 유도하는 단계를 포함하는, 배아줄기세포를 혈관모세포(hemangioblast)로 분화 유도하는 방법.
제15항에 있어서, VEGF 및 bFGF의 농도가 각각 50 ng/㎖인 방법.
제15항에 있어서, ⅱ) 단계의 배양액에서 3일 내지 5일간 배양하는 방법.
ⅰ) 배아줄기세포를 MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP의 존재 하에 배양하여 중간엽 세포로 분화 유도하는 단계; ⅱ) 상기 중간엽 세포를 VEGF 및 bFGF의 존재 하에 배양하여 혈관모세포로 분화 유도하는 단계; 및 ⅲ) 상기 혈관모세포를 VEGF 및 bFGF의 존재 하에 배양하여 혈관내피세포로 분화 유도하는 단계를 포함하는, 배아줄기세포를 혈관내피세포(vascular endothelial cell)로 분화 유도하는 방법.
ⅰ) 배아줄기세포를 MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP의 존재 하에 배양하여 중간엽 세포로 분화 유도하는 단계; ⅱ) 상기 중간엽 세포를 VEGF 및 bFGF의 존재 하에 배양하여 혈관모세포로 분화 유도하는 단계; 및 ⅲ) 상기 혈관모세포를 PDGF-BB(Platelet-derived growth factor-BB)의 존재 하에 배양하여 혈관평활근세포로 분화 유도하는 단계를 포함하는, 배아줄기세포를 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cell)로 분화 유도하는 방법.
ⅰ) 배아줄기세포를 MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP의 존재 하에 배양하여 중간엽 세포로 분화를 유도하는 단계; ⅱ) 상기 중간엽 세포를 VEGF 및 bFGF의 존재 하에 배양하여 혈관모세포로 분화 유도하는 단계; 및 ⅲ) 상기 혈관모세포를 MethCult GF H4434 (Stem Cell Technologies사, Canada)에 배양하여 조혈줄기세포로 분화 유도하는 단계를 포함하는, 배아줄기세포를 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell)로 분화 유도하는 방법.