KR20120040026A

KR20120040026A - 단삼을 포함하는 신부전 예방 및 치료용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR20120040026A
Application number: KR1020100101526A
Authority: KR
Inventors: 용 기 박
Original assignee: 동국대학교 경주캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2010-10-18
Filing date: 2010-10-18
Publication date: 2012-04-26
Also published as: KR101271054B1

Abstract

본 발명은 단삼을 포함하는 신부전 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 단삼, 백출, 저령, 백복령, 반하, 황련 및 대황으로 이루어지는 7가지의 혼합 한약재의 추출물로부터 신장 질환에 대한 항염증 및 신장 조직의 섬유화 억제 효과가 우수한 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 신장세포에 섬유화가 일어나고 주변 대식세포의 염증반응으로 병이 심화되는 신부전 환자에 있어서, 항산화 작용을 통해 세포손상을 방지하고, 항염증 효과 및 항섬유화 작용이 있어 만성 신부전증과 급성 신부전증의 병증을 예방하거나 치료할 수 있으며, 항염증 효과로 인하여 신우신염, 방광염, 대장염, 위염, 퇴행성뇌질환 및 관절염 등을 치료하거나 완화시킬 수 있고, 항산화효과로 인하여 신부전증 뿐만 아니라 노화방지, 항암, 뇌혈관질환, 심혈관질환, 고혈압, 당뇨병, 비만 등을 예방하거나 치료할 수 있다.

Description

단삼을 포함하는 신부전 예방 및 치료용 약제학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing and treatmenting containing of Salvia miltiorrhiza from disease related to renal failure}

본 발명은 단삼을 포함하여 이루어지는 한약재 추출물을 포함하는 신부전 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 단삼 추출물 또는 단삼, 백출, 저령, 백복령, 반하, 황련 및 대황으로 이루어지는 7가지의 혼합 한약재 추출물을 포함하는 신장 질환에 대한 항염증 및 신장 조직의 섬유화 억제 효과가 우수한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 신장의 주된 기능은 노폐물을 걸러 소변을 만들면서 몸의 수분과 전해질, 산과 염기의 균형을 조절하여 몸의 체액상태를 항상 적절하게 유지하며, 칼슘과 인을 조절하여 뼈를 튼튼한 상태로 유지하고, 조혈호르몬을 만들어 빈혈을 방지하면서 혈압을 조절하는 호르몬을 분비하여 혈압이 정상으로 유지하도록 한다.

그러나 신부전은 여러 원인에 의해 신장 기능이 점진적으로 회복 불능의 상태로 저하되는 질환으로 초기 증상이 요독증의 초기에 나타나는 메스꺼움, 식욕부진, 야뇨증, 수면장애, 피로, 소화불량 등과 같이 지나치기 쉬운 것이 대부분이어서 예방하거나 초기에 진단하기가 어렵고, 신부전이 심해지면 숨을 쉴 때 소변 냄새가 나고, 부기 가려움증, 기억력 감퇴 등을 보이다가 심하면 호흡곤란, 경련, 혼수 등의 증상이 발생된다.

신부전은 신장세포의 섬유화와 염증세포의 활성화로 인한 염증반응이 주로 나타나기 때문에, 신장세포의 섬유화를 줄이고 염증반응을 억제함으로써 계속해서 신장세포가 파괴되어 만성신부전으로 진행되는 것을 막아줄 수 있다.

이에, 신부전 치료의 목표는 신장의 기능이 마지막 단계(정상 신장 기능의 10 ~ 15%)로 진행되는 것을 멈추거나 늦추는 것으로, 신장의 기능이 나빠지게 한 주요 원인인 고혈압과 당뇨병을 치료하는 것이 필수적이며, 이를 위해 안지오텐신 전환효소 억제제나 안지오텐신 2 수용체길항제가 사용되고 있다. 그러나 신장 기능의 상실은 멈출 수 없으며 결국에는 혈액투석이나 복막투석, 신장이식 등 신대체요법을 사용하게 된다.

따라서 신부전은 아직 특이한 치료제가 없는 실정이며 더욱이 신부전의 핵심 병리기전인 신장섬유화를 억제하는 약물은 개발된 적이 없다.

그러나 신부전의 경우 약물을 지속적으로 복용해야 하고, 이에 대한 부작용으로 인하여 최근에는 염증반응을 억제하고 신장 섬유화를 조절하는 한약재와 같은 천연약물을 연구하여 만성 신부전을 치료하고자 하는 시도가 활발히 진행되고 있다.

이에, 본 발명자들은 부작용이 거의 없는 한약재를 이용하여 신부전을 예방 및 치료할 수 있는 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 단삼 추출물 또는 단삼, 백출, 저령, 백복령, 반하, 황련 및 대황을 특정비율로 혼합한 한약재로부터의 추출물이, 부작용이 거의 없고 신부전의 예방 및 치료에 높은 효과를 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 단삼 추출물 또는 단삼, 백출, 저령, 백복령, 반하, 황련 및 대황을 특정비율로 혼합한 한약재로부터 추출한 추출물을 포함하여 이루어지는 신부전 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 단삼 추출물로 이루어지는 신부전 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 단삼 20 ~ 26중량%, 백출 9 ~ 15중량%, 저령 9 ~ 15중량%, 백복령 9 ~ 15중량%, 반하 12 ~ 18중량%, 황련 6 ~ 12중량% 및 대황 12 ~ 18중량%의 혼합 한약재 추출물로 이루어진 신부전 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

본 발명은 단삼 추출물 또는 단삼, 백출, 저령, 백복령, 반하, 황련 및 대황으로 이루어지는 7가지의 혼합 한약재의 추출물로부터 신장 질환에 대한 항염증 및 조직의 섬유화 억제 효과가 우수한 약제학적 조성물을 개발한 것이다.

단삼(생약명:Salviae miltiorrhizae radix, 학명: Salvia miltiorrhiza BGE)은 뿌리를 건조하여 한약재로 사용하는데, 한방에서 강장약, 통경약, 진통약, 항염약, 지혈약으로 월경불순, 복통, 폐경, 산후통, 류마치스 증상에 사용하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 상기 효능 이외에 역할을 한다. 이때, 본 발명에서는 단삼을 주자(酒炙)로 법제한 것을 사용하는 것이 바람직하다.

백출(생약명:Atractylodis macrocephalae rhizome, 학명: Atractylodes macrocephala KOIDZ.)은 한방에서는 방향성 건위약으로 소화불량에 사용되거나, 몸 안에 있는 여분의 물을 몸 밖으로 배출하는 효능이 있어 소화기관이나 피하에 수분이 정체되어 있는 증상을 치료하는데 사용하는 것으로 알려져 있는데, 본 발명에서는 상기한 인진, 택사, 백봉령 및 저령과 함께 신장기능을 원활하게 하는 역할을 한다.

백복령(생약명: Poria, 학명: Poria cocos SCHW.)은 한방에서 비장이나 위장이 허약하여 잘 붓거나 소화불량 또는 배뇨 곤란의 증상 등에 사용하는 것으로 알려져 있는데, 본 발명에서는 상기한 인진, 택사, 백출 및 저령과 함께 배뇨에 상승효과를 제공하고 신장기능을 원활하게 하는 역할을 한다. 특히 백복령은 반하와 함께 거담(祛痰)의 효과를 제공한다.

저령(생약명: Polyporus, 학명:Polyporus umbellatus PERS. FRIES)은 이뇨, 항균, 항종양, 해열, 급성요도염 등의 비뇨기 계통의 소변 장애에 주로 사용하는 것으로 알려져 있는데, 본 발명에서는 이외의 한약재들과 함께 신장이 제기능을 할 수 있도록 하는 역할을 한다.

반하(생약명: Pinelliae rhizome, 학명: Pinellia ternata THUNB. BREIT.)는 구토약, 진경약 및 가래 삭히는 약으로써 위하수, 임신구토, 구토, 기침, 어지러움증, 두통, 급성위염, 인후통 증상에 사용하는 것으로 알려져 있는데, 통상적으로 독성을 제거하기 위하여 생강으로 법제한 반하를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 백복령과 함께 거담제의 역할을 한다.

황련(생약명: Coptis rhizome, 학명: Coptis chinensis FRANCH)은 소염제, 진정제로써 신경불안, 충혈 및 염증 등에 사용하는 것이 알려져 있는데, 일반적으로 술에 담궜다가 말려서 법제한 황련을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 상기 신부전 유래의 염증 발생을 억제하는 역할을 한다.

대황(생약명: Rhei radix et rhizoma, 학명:Rheum palmatum L.)은 한방에서 건위약으로 소화불량, 만성위장염, 고창, 기무력증과 설사약으로 반성변비, 습관성변비 증상에 사용되고 있는데, 본 발명에서는 상기 효능 이외에 해열제의 역할을 한다. 통상적으로는 잿불에 묻어 구워서 법제한 것을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약제학적 조성물은 천연물로부터 추출하여 장기간 복용해도 부작용이 미미하고, 염증을 유발하는 활성질소종, 염증사이토카인과 신장세포의 섬유화를 유도하는 TGF-β(tumor growth factor-β), Smad2(Sma- and Mad-related protein2) 및 α-SMA(α-smooth muscle actin)의 발현을 억제하면서 활성산소생성 효소의 활성을 억제하는 항산화 효과에 의하여 신부전증을 치료하거나 예방하게 된다.

이때, 본 발명에서 상기 한약재로부터 추출물을 제조하기 위해 사용되는 물은 보건부 기준하여 음용 기준에 적합한 물을 말하는 것으로, 일반적으로 여과기나 정수기 등으로 여과시킨 정제수, 멸균수, 음이온수 등의 물이나 수돗물, 생수 등을 사용할 수 있다. 하지만, 본 발명에서 한약재의 유효 성분을 추출하기 위해 사용하는 용매는 물에 한정되는 것은 아니며, 인체에 해롭지 않을 정도로 제거하는 장치를 사용한다면 메탄올, 에탄올, 아세톤, 디에틸에테르 등의 유기 용매를 사용할 수 있다.

또한, 한약재 중량의 1 내지 10배, 바람직하게는 2 내지 6배의 물을 첨가하여 추출할 수 있으며, 일주일간 1 내지 10회, 바람직하게는 2 내지 5회 추출한 후 여과하고, 그 여과액을 감압 농축할 수 있다. 이때 본 발명의 추출온도는 특별히 한정되는 것은 아니나, 상온에서 이루어지는 것이 바람직하다.

하지만, 본 발명에서 사용되는 성분들은 상기 법제된 약재로만 국한되어 사용되는 것은 아니며, 본 발명의 목적에 부합되는 것이라면 부작용이 최소화시키는 선에서 다른 방법으로 법제화된 약재를 사용해도 무방하다.

그리고 본 발명의 한 양태에서 단삼 20 ~ 26중량%, 백출 9 ~ 15중량%, 저령 9 ~ 15중량%, 백복령 9 ~ 15중량%, 반하 12 ~ 18중량%, 황련 6 ~ 12중량% 및 대황 12 ~ 18중량%를 사용하는데, 이는 각 한약재당 상술한 최대 사용량을 초과하여 사용하면 다른 필요 성분을 충분하게 사용하지 못하고, 최소 사용량 미만을 사용하면 각 한약재의 유효 효과가 저감되고, 상술한 각 한약재당 사용 범위가 신부전에 대한 최대의 효과를 나타내는데 바람직하기 때문이다. 이때, 구체적으로 더 바람직하게는 단삼 150g, 백출 80g, 저령 80g, 백복령 80g, 반하 100g, 황련 60g, 대황 100g으로 이루어지는 혼합 한약재와 물을 첨가하여 열수 추출한 것을 사용한다.

하지만, 본 발명에서는 물 이외에도 신부전증을 예방 또는 치료하기 위하여 상기 한약재의 유효 성분을 충분히 추출하면서 인체에 전혀 무해하다면 유기 용매를 사용하여 추출한 다음, 유기 용매를 제거하는 공정을 거치게 할 수도 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 식품의약안정청(KFDA)의 통상적인 약제학적 제제로의 제형화 기준에 의거하여 제형화 할 수 있다.

상기 추출물은 그 자체를 사용하거나 약제학적 제제로의 제형화 기준에 허용이 가능한 부형제, 예를 들어 미결정셀룰로오즈, 콜로이드성 이산화규소, 옥수수전분 및 붕해제, 예를 들어 옥수수전분, 크로스포비돈, 전젤라틴화전분 및 활택제, 예를 들어 글리세릴베헤네이트 및 제피제, 예를 들어 오파드라이 등과 함께 제형화 할 수 있다. 그리고 본 발명의 한약재 추출물 및 제형화 된 제제는 통상적인 방법으로, 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.

상기 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 염수, 완충제, 물, 링거액 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 담체를 사용한 경구투여와 비경구투여용으로 분말, 과립, 주사액, 시럽, 용액제, 정제 등과 같은 제형으로 제조한다. 다만, 본 발명의 담체가 상기의 담체로 한정되는 것은 아니다. 이때, 비경구 투여는 경구 이외에 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강 등을 통한 유효 성분의 투여를 의미한다.

상기 제형에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함하여 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 제형화 할 수 있다. 그리고 본 발명의 투여량은 환자의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있어 한정되지 않으며 증상에 따라 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있으나, 통상적으로 본 발명에서는 실험적인 유효량으로 체중 1㎏ 당 100㎎ 내지 200mg을 하루에 연속적 또는 간헐적으로 투여가 가능할 것으로 판단된다.

이와 같이, 본 발명에 따른 한약재의 추출물은 상술한 바와 같이 상호 효능 간의 적절한 조화로 인하여 신부전증과 관련한 전반적인 병증에 대하여 부작용은 최소화하면서 예방 또는 치료의 시너지 효과를 제공할 수 있게 된 것이다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 신장세포에 섬유화가 일어나고 주변 대식세포의 염증반응으로 병이 심화되는 신부전 환자에 있어서, 항산화 작용을 통해 세포손상을 방지하고, 항염증 효과 및 항섬유화 작용이 있어 만성 신부전증과 급성 신부전증의 병증을 예방하거나 치료할 수 있으며, 항염증 효과로 인하여 신우신염, 방광염, 대장염, 위염, 퇴행성뇌질환 및 관절염 등을 치료하거나 완화시킬 수 있고, 항산화효과로 인하여 신부전증 뿐만 아니라 노화방지, 항암, 뇌혈관질환, 심혈관질환, 고혈압, 당뇨병, 비만 등을 예방하거나 치료할 수 있다.

도 1은 본 발명의 조성물(실시예 1 및 2)을 대식세포에 처리한 다음 염증물질인 활성질소종(nitric oxide, NO) 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 조성물(실시예 2)을 농도별로 대식세포에 처리한 다음 염증물질인 활성질소종(nitric oxide, NO) 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 조성물(실시예 1 및 2) 처리 후, 대식세포로부터 염증사이토카인인 TNF-α의 분비 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 조성물(실시예 2)을 농도별로 처리한 후, 대식세포로부터 염증사이토카인인 TNF-α의 분비 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 조성물(실시예 1 및 2) 처리 후, 대식세포로부터 염증사이토카인인 IL-1β의 분비 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 조성물(실시예 2)을 농도별로 처리한 후, 대식세포로부터 염증사이토카인인 IL-1β의 분비 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 TGF-β로 자극한 MDCK 신장세포에서 본 발명의 조성물(실시예 1 및 2) 처리에 대한 섬유화(fibrosis) 억제 효과를 나타낸 도면이다.
도 8은 TGF-β로 자극한 MDCK 신장세포에 본 발명의 조성물(실시예 1 및 2)을 처리한 후, 신장 섬유화의 핵심 인자인 α-SMA의 발현 억제 효과를 나타낸 도면이다. 여기서, C는 정상세포, T는 TGF-β 유도 섬유화 세포를 나타낸다.
도 9는 TGF-β로 자극한 MDCK 신장세포에 본 발명의 조성물(실시예 1 및 2)을 처리한 후, 신장 섬유화의 핵심 인자인 Smad2/3의 발현 억제 효과를 나타낸 도면이다. 여기서, C는 정상세포, T는 TGF-β 유도 섬유화 세포를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 조성물(실시예 2)에 대한 독성 활성산소반응기들의 소거 효과를 나타낸 도면이다. 여기서, 각 수치는 3회 측정한 값의 평균±표준편차이며, TEAC는 총항산화능(trolox equivalent antioxidant capacity), ORAC는 반응성산소기 제거능(oxygen radical absorbance capacity), DPPH는 1,1-디페닐-2-피크릴-히드라질(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)을 나타낸다.
도 11은 신부전이 유발된 쥐(mouse)에 본 발병의 조성물(실시예 2)을 처리한 후 혈액으로부터 분리한 혈장 내 크레아티닌 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 조성물(실시예 2)이 신부전 쥐의 신장조직에서 항산화효소들의 활성 증가 효과 및 지질과산화와 단백질산화 억제 효과를 나타낸 도면이다. 여기서, 각 수치는 6회 측정한 값의 평균±표준편차이다. 또한, a는 정상과의 통계적 의의, b는 대조군과의 통계적 의의를 나타내며(* P < 0.05, * P < 0.01, * P < 0.001), TBARS(thiobarbituric acid-reactive substances)는 지질 과산화 정도, PCO는 단백질 산화 정도, SOD는 SOD(superoxide dismutase)의 활성 정도, CAT는 카탈라아제(catalase)의 활성 정도, GPx는 GPx(glutathion peroxidase)의 활성 정도를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 제조

본 실시예에서 사용한 약재는 (주)광명당제약(울산, 한국)으로부터 구입하여 동국대학교 한의과대학 본초학교실에서 검정하고 정선한 것을 사용하였다.

건조된 단삼 1㎏을 세말하고 물(4ℓ)을 가하여 상온에서 24시간 추출한 후 2겹 거어즈와 와트만 여과지(Whatman No. 3)로 여과하여 완전히 용해되지 않은 고형물들을 분리한 다음 감압 농축을 통해 수분을 제거하여 분말 형태로 제조하였다. 상기의 추출과정을 3회 반복 실시하였고, 이때 얻은 추출물의 수율은 36.9%였다.

상기 조성물은 4℃에 보관하면서 효과 검증을 위한 약제로 사용하였다.

실시예 2. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 제조

(1) 재료

단삼(Salviae miltiorrhizae radix): 150g

백출(Atractylodis macrocephalae rhizome): 80g

저령(Polyporus): 80g

백복령(Poria): 80g

반하(Pinelliae rhizome): 100g

황련(Coptis rhizome): 60g

대황(Rhei radix et rhizoma): 100g

(2) 본 발명의 추출물 제조

상기 준비된 혼합 한약재 650g에 물을 한약재 부피의 두 배 정도로 넣고, 5시간동안 가열하여 열수 추출한 다음, 추출물을 거어즈로 여과하고 수득한 추출액을 동결 건조하여 본 발명의 만성 신부전 치료용 약제학적 조성물을 제조하였다. 이때, 수율은 30.1%였다.

실험예 1. 세포 및 동물 실험을 통한 효과

(1) 항염증 효과

가. 활성질소종 억제 효과

활성질소종(nitric oxide; NO)은 병원균 감염 후 활성화되는 대식세포로부터 생성되는 자유 라디칼로서 적정양의 활성질소종의 생성은 혈관 내 항상성을 유지시키고 항암효과를 나타내지만, 과도한 양의 활성질소종의 생성은 오히려 세포와 조직에 강력한 독성을 나타내어 염증반응을 매개함으로써 급성 및 만성 염증성질환의 병 발달을 가속화시키는 것으로 알려져 있다.

이에, 본 실험예에서는 쥐의 대식세포주인 RAW264.7 세포를 대상으로 상기 실시예 1 및 2의 추출물을 처리한 후 대식세포들로부터 분비되는 활성질소종의 양이 감소되는 지의 여부를 확인하고자 하였다.

먼저, RAW264.7 세포를 24시간 배양한 다음 상기 각 추출물을 여러 농도로 처리하여 30분간 배양하였다. 여기에 lipopolysaccharide(LPS)를 처리하여 세포를 활성화시킴으로써 활성질소종 분비를 유도하였다. 다시 이를 24시간 동안 배양한 후 배양액을 수거하여 세포로부터 분비된 활성질소종의 농도를 그리스(Griess) 반응법으로 측정하였다. 이를 통해 처리한 약물이 대식세포로부터 분비되는 염증을 유발물질인 활성질소종의 생산을 얼마나 억제시킬 수 있는지 조사하였다.

이의 결과, 도 1 및 2에서 도시한 바와 같이, 본 발명의 약제학적 조성물은 활성화된 대식세포로부터 과도하게 분비되는 활성질소종의 생산을 효과적으로 감소시킨 것으로 나타났다.

나. 염증사이토카인 분비의 억제효과

일반적으로 외부 병원균에 노출되면 대식세포로부터 TNF-α나 IL-1β와 같은 염증반응을 매개하는 사이토카인이 다량 분비되어 염증반응이 가속화되기 때문에, 사이토카인의 다량 분비는 신장염, 대장염, 폐혈증, 류마티스 관절염 및 퇴행성뇌질환과 같은 다양한 염증질환의 발병과 밀접하게 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, TNF-α와 같은 염증사이토카인의 증가는 암을 발생시킬 뿐 아니라 악액질, 당뇨, 비만 등의 대사성 질환에서 인슐린에 대한 저항성을 유도함으로써 병 발달에 기여하는 것으로 보고되고 있다.

이에, 본 실험예에서는 쥐의 대식세포주인 RAW264.7 세포를 대상으로 상기 실시예 1 및 2의 추출물을 처리한 후, 외부자극에 의해 활성화된 대식세포로부터 과도하게 분비되는 TNF-α를 효과적으로 억제시키는 지와 대식세포들로부터 분비되는 TNF-α와 IL-1β의 양이 감소되는 지의 여부를 확인하고자 하였다.

먼저, RAW264.7 세포를 24시간 배양한 다음 본 발명의 추출물을 여러 농도로 처리하여 30분간 배양한 후 LPS를 처리하여 세포를 24시간 동안 활성화시켰다. 그리고, 세포 배양액을 수거하여 세포로부터 분비된 사이토카인의 농도를 효소결합반응법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)으로 측정하였다. 이때, 측정은 각 사이토카인을 검출할 수 있는 ELISA 키트(kit)를 이바이오사이언스(eBioscience)사로부터 구입하여 사용하였으며, 배양액 내 사이토카인 농도(pg/㎖)는 각 사이토카인의 재조합 단백질(recombinant protein)을 이용하여 표준정량곡선(standard curve)을 제작한 후 이를 기준으로 환산하였다.

이의 결과, 도 3 내지 6에 도시한 바와 같이 본 발명의 추출물은 투여량과 비례하여 활성화된 대식세포로부터 과도하게 분비되는 염증사이토카인의 생산을 강력하게 감소시키는 것으로 나타났다.

(2) 신장의 섬유화 억제효과

일반적으로 신장의 섬유화(progressive interstitial fibrosis)는 세뇨관과 모세관의 파괴를 유발하여 불안정성 당뇨병(diabetes mellitus)이나 신장비대(hypertension), 신장동맥협착(renal artery stenosis), 신장기형(abnormalities) 및 요관폐쇄(ureteral obstruction) 등을 유발시키는데, 특히 혈관의 생장과 분화를 촉진하는 성장인자인 TGF(tumor growth factor)-β이 다량 분비되면 조직의 섬유화(renal fibrotic events)를 가속화시키는 것으로 알려져 있다.

그리고 만성신부전의 경우, 신장세포의 파괴와 섬유화가 동반되며 발생하고, 결국에는 신장실질(腎臟實質)에 비가역성 변화를 초래하여 미오피브로블라스트와 같은 형태(myofibroblast-like phenotype)로 세포가 변해가면서 TGF-β1 mRNA의 발현 및 α-SMA 발현이 평행하게 증가하게 되는데, 이때 상기 TGF-β1 mRNA의 발현 및 α-SMA의 발현을 유도하는 신호전달자(signal transducer)로 Smad2 (Sma- and Mad-related protein 2)가 공지되어 있다.

가. 신장세포의 섬유화 형태 변화

이에, 본 실험예에서는 마우스의 신장섬유세포인 MDCK 세포(근위세뇨관세포 기원)에 TGF-β를 처리하여 섬유화를 유도하고, 여기에 본 발명의 추출물을 처리하여 추출물이 신장세포의 섬유화를 억제시킬 수 있는지 여부를 확인하고자 다음과 같은 실험을 수행하였다.

먼저, MDCK 세포에 TGF-β(2.5ng/ml)을 처리하여 신장세포의 섬유화를 유도하였으며, 여기에 상기 실시예 1 및 2의 추출물을 여러 농도로 처리하여 72시간 배양한 후 현미경으로 신장섬유화 정도를 관찰함으로써 추출물에 의한 섬유화 억제정도를 조사하였다.

이의 결과, 도 7에 도시된 바와 같이, MDCK 신장세포에 본 발병의 추출물 1㎎/㎖을 처리하였을 때, TGF-β 처리에 의해 유발되는 신장세포의 섬유화를 억제함으로써 신장섬유화를 막아줄 수 있는 것으로 나타났다.

나. α-SMA(Alpha-Smooth muscle actin) 및 Smad2(Sma- and Mad-related protein 2) 발현 억제

또한, 본 실험예에서는 본 발명의 추출물 처리에 의해 α-SMA와 TGF-β의 신호전달자인 Smad2/3의 세포내 발현을 억제할 수 있는지의 여부를 알아보고자 다음과 같은 실험을 수행하였다.

먼저, MDCK 세포에 TGF-β(2.5 ng/㎖)와 상기 실시예 1 및 2의 추출물을 처리하여 24시간 배양한 후 배양액을 제거하고 세포만 수거하였다. 그리고 수거된 세포에 1mM PMSF 및 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail)이 첨가된 RIPA 완충용액(50mM Tris-HCl, pH7.5, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% deoxycholic acid, 0.1% SDS)을 넣어 세포로부터 단백질을 용출시켰다. 추출된 단백질 30㎍을 SDS-PAGE로 분리한 후 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)에 전이(transfer)하였다. 여기에 Smad2/3 항체(anti-Smad-2 monoclonal antibody; mAb) 및 mAb가 결합된 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase-conjugated mAb)를 반응시킨 후 화학발광(Chemiluminescence) 방법을 이용하여 Smad2/3의 발현정도를 측정하였다.

이의 결과, 도 8 및 9에 도시된 바와 같이, TGF-β로 세포를 자극하면 MDCK 세포에서 α-SMA와 Smad의 단백질 발현이 증가하는데 여기에 본 발명의 추출물을 처리하면 이들의 발현이 효과적으로 감소됨으로써 신장세포의 섬유화를 막을 수 있는 것으로 나타났다.

상술한 결과로 보아, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 TGF-β에 의해 유발되는 세포독성 및 섬유화를 억제함으로써 신장세포를 보호할 수 있으며, 섬유화를 가속화시키는 인자인 α-SMA와 Smad2/3의 유전자 발현을 강력하게 억제할 수 있는 것으로 나타났다.

또한, 본 발명의 추출물은 만성신부전증 환자의 신장세포 섬유화를 막음으로써 신장염을 치료할 수 있음을 입증할 수 있었다.

(3) 독성자유기 소거 효과

일반적으로 반응성산소기들(유해산소; reactive oxygen species; ROS)은 신장에서 허혈성 급성신부전, 항생제나 독성물질에 의해 유발되는 급성신부전 및 사구체신염 등과 같은 여러 급성 및 만성 신장질환을 일으키는 원인으로 알려져 있다.

본 실험예에서는 본 발명의 추출물이 반응성산소기들을 효과적으로 소거할 수 있는지 여부를 알아보고자 총항산화능(trolox equivalent antioxidant capacity; TEAC), 반응성산소기 제거능(oxygen radical absorbance capacity, ORAC) 및 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) 분석(assay)을 실시하였다.

먼저, DPPH 소거효과를 측정하기 위해, 일정 농도로 희석한 시료 2㎖에, 순수에탄올(absolute ethanol)에 0.2mM 농도로 희석한 DPPH 용액 1㎖를 가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이 반응액을 517nm에서 흡광도를 측정하였으며 시료 첨가 전과 후의 흡광도 차이를 %로 나타내었다.

또한, 본 발명의 추출물에 의한 총항산화능은 TEAC 방법을 이용하여 측정하였다. 즉, 산성 pH에서 무색의 환원형 ABTS(2, 2'-azinobis(3-ethylbenzothiazo-thiazoline-6-sulfonate))는 H₂O₂에 의해 청록색의 ABTS+로 산화되게 되므로 시료 내에 항산화물질이 존재하게 되면, 이들 농도에 비례하여 ABTS+는 탈색되게 된다. TEAC 반응을 위해 먼저 2.45mM K2S2O8이 포함된 7mM ABTS 용액을 제조하고 암반응 조건에서 12 ~ 48 시간 동안 안정화하였다. 대조액으로써 아스코르브산(ascorbic acid)을 사용하였으며, 트롤록스(Trolox)를 표준액으로 사용하였다. 시료, 대조액 및 표준액에 1980㎕의 ABTS^?+ 용액을 넣은 후 실온에서 6분 동안 반응시켰으며 734nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 TAC 활성은 nmol 트롤록스 당량(Trolox equivalent)으로 표기하였다.

ORAC 분석(assay)을 위해 형광물질로 플루오레세인(fluorescein)을 사용하였으며, 퍼록실 라디칼(peroxyl radical)을 생성하는 AAPH(2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride)를 사용하였다. 먼저 시료 20㎕에 16.7nM 베타-피코에리트린(β-phycoerythrin) 용액 120㎕를 넣은 후 실온에서 15분간 반응시키고 다시 32mM AAPH 용액 60㎕를 넣고 여기(excitation) 파장 485nm와 발광(emission) 파장 530nm에서 2분 간격으로 60분 동안 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로 0, 0.02, 0.2, 1.0 및 2.0nmol의 트롤록스를 사용하였으며, 표준시약과 시료의 AUC(area under the curve)를 측정하였다. ORAC는 표준시약 농도와 AUC 간의 회귀곡선을 이용하여 nmol 농도로 표기하였다(AUCnet= AUCsample/standard_AUCblank).

이의 결과, 도 10에 도시된 바와 같이, 본 발명의 추출물은 항산화제인 아스코르브산과 유사하게 총항산화능(TEAC)과 반응성산소기 제거능을 나타내었으며, 독성자유기인 DPPH를 소거할 수 있는 것으로 나타났다.

상술한 결과를 보아, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 항산화효과를 통해 신장조직을 보호할 수 있는 것으로 나타났다.

(4) 신부전 쥐에서의 치료 효과

그리고 정상적인 조건에서 산소를 소모하는 모든 세포의 미토콘드리아에서 대사과정 중에 대사되는 산소의 2 ~ 5%가 슈퍼옥사이드(superoxide)나 과산화수소(H₂O₂) 같은 반응성산소기들로 전환되는데, 세포들은 이들을 분해하는 효소나 물질들을 가지고 있어서 그 독성으로부터 세포를 보호하는 기작을 가지고 있다.

하지만, 세포가 정상적인 보호 기작을 수행하지 못하면, 세포에 남은 반응성산소기들은 지질, 단백질, DNA 등 세포의 여러 구성성분을 공격하게 되는데, 특히 세포의 생체막의 경우에는 불포화지방산이 많아 반응성산소기들의 공격을 쉽게 받아서 지질의 과산화(lipid peroxidation)가 발생되면서 세포막의 투과성이 증가되어 세포 기능 저해로 인하여 결국 세포는 사멸하게 된다.

또한, 반응성산소기들은 세포 내 다량의 염증사이토카인 및 섬유세포 생장인자들을 분비하도록 자극하여 세포섬유화를 통해 신장염을 더욱 악화시키게 된다.

이에, 본 실험예에서는 허혈성 급성신부전을 유발한 쥐(renal ischemia/ reperfusion mouse model)에 본 발명의 추출물을 먹인 후, 반응성산소기들의 활성억제 정도 및 신부전 치료효과를 검증하였다.

가. 크레아티닌 생성 억제효과

먼저, 허혈/재관류(ischemia/reperfusion)에 의해 신부전이 유발된 쥐(Balb/c male mice, 8 week old)에 상기 실시예 2의 추출물 10, 50, 100㎎/kg을 수술 후 30분 및 1일 간격으로 14일간 경구투여 하였다.

그리고 상기 신부전 쥐로부터 혈액을 채취한 다음, 이 혈액으로부터 혈장을 분리한 후 크레아티닌(creatinine) 수치를 측정하였다.

이의 결과, 신부전이 유발되면 혈장 내 크레아티닌의 수치가 올라가게 되는데, 도 11에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 투여한 쥐의 경우 혈장 내 크레아티닌 수치가 떨어지는 것을 알 수 있었다.

나. 신부전 쥐의 신장에서의 항산화효소들의 활성 증가 효과

일반적으로, 반응성산소기들의 생성은 세포에 산화적 스트레스를 유발하여 신장의 섬유화를 촉진시킴으로써 신장을 파괴하는 것으로 알려져 있다.

이에, 본 실험예에서는 본 발명의 추출물이 신부전 쥐의 신장에서 반응성산소기들로부터 신장을 보호할 수 있는지 확인하기 위해, 신장조직 내 활성산소종 제거에 중요한 항산화효소들인 SOD(superoxide dismutase), 카탈라아제(catalase), GPx(glutathion peroxidase)의 활성 정도를 측정하였다.

이를 위해 쥐로부터 적출된 신장을 수크로오스 완충용액(sucrose buffer)(0.32M sucrose, 10mM Tris-HCl, pH7.4)에 넣어 균질기(homogenizer)로 마쇄한 후 1,000g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 상층액을 다시 15,000g에서 30분간 원심분리하여 세포질 분획(cytosolic fraction)을 수집한 후 SOD, 카탈라아제 및 GPx의 활성을 측정키트(kit)를 이용하여 측정하였다.

이의 결과, 도 12에서 보는 바와 같이, 신부전 쥐에 본 발명의 추출물을 먹인 경우, 본 발명의 추출물에 의해 SOD, 카탈라아제 및 GPx의 활성이 모두 용량에 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. 즉, 본 발명의 추출물은 활성산소생성 억제에 관여하는 항산화효소의 활성을 증가시켜 결과적으로 활성산소종의 생성을 억제함으로써 신장의 섬유화로부터 신장을 보호하는 것을 알 수 있었다.

라. 과산화(hydrogen peroxide) 및 지방산화(lipid peroxidation)에 대한 억제효과

상술한 바와 같이, 세포 내 반응성산소기들의 생성이 증가하면 과산화작용이나 지질산화작용에 의한 세포막 구조의 파괴, 수산기(OH-)에 의한 DNA 손상 및 DNA 이중결합구조나 SH를 포함하는 산화반응에 의한 단백질의 변성 등을 통해 신장세포 고사(apoptosis)의 원인이 되고 있다.

이에, 본 실험예에서는 신부전 쥐에 본 발명의 추출물을 투여한 후, 활성산소 생성으로 인한 지질과산화작용(lipid peroxidation)이나 단백질산화작용(protein oxidation)에 어떤 영향을 주는지를 확인하였다.

먼저, 신장에서의 지질 과산화 정도는 TBARS(thiobarbituric acid-reactive substances)를 이용하여 MDA(malodialdehyde)의 생성량을 분광광도 분석(spectrophotometric assay)을 이용하여 측정하였다.

또한 신장에서의 단백질 산화 정도는 단백질 카보닐(protein carbonyl)의 양을 단백질 카보닐 ELISA 키트(Protein Carbonyl ELISA Kit)를 이용하여 측정하였다.

이의 결과, 도 12에서 보는 바와 같이, 정상 쥐의 경우 본 발명 조성물의 투여 여부에 상관없이 신장조직에서의 과산화작용 및 지질 산화작용 정도에 변화가 없었지만, 신부전 쥐의 경우 지방산화와 과산화작용이 증가하였고 이는 본 발명의 추출물에 의해 용량에 의존적으로 억제되는 것을 나타낸다.

Claims

단삼 추출물로 이루어지는 신부전 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
단삼 20 ~ 26중량%, 백출 9 ~ 15중량%, 저령 9 ~ 15중량%, 백복령 9 ~ 15중량%, 반하 12 ~ 18중량%, 황련 6 ~ 12중량% 및 대황 12 ~ 18중량%의 혼합 한약재 추출물로 이루어지는 신부전 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 추출물은 단삼 150g, 백출 80g, 저령 80g, 백복령 80g, 반하 100g, 황련 60g 및 대황 100g으로 이루어지는 혼합 한약재로부터 추출된 것임을 특징으로 하는 신부전 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 추출물은 한약재의 열수 추출액을 동결건조한 것임을 특징으로 하는 신부전 예방 및 치료용 약제학적 조성물.