KR100541424B1 - 항염증성 생약 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 강활, 인진 및 갈근 추출물을 유효성분으로 하는 항염증성 생약 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로 상기 생약 조성물은 항염증 작용, 소염 진통작용, 관절조직 분해효소 억제작용, 염증유발 관련 효소 억제작용, 발부종 억제 등의 치료 효능이 우수하여 관절염, 특히 골관절염 치료제 또는 소염진통제로서 유용하다.
강활, 인진, 갈근, 소염, 골관절염, 프로테오글리칸, 프로스타글란딘, 일산화질소

Description

항염증성 생약 조성물 및 이의 제조방법{Herbal Pharmaceutical Compositions Having Anti-inflammatory Activity and a Method for Preparing the Same}
도 1과 도 2는 본 발명의 생약 조성물(실시예 1) 및 강활, 인진 및 갈근의 단독 추출물의 마우스 대식세포주에서 염증반응물질인 일산화질소의 생성 억제 정도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 생약 조성물(실시예 1)의 마우스 대식세포에서 염증반응물질인 프로스타글란딘 E2의 생성 억제 정도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 생약 조성물(실시예 1)의 토끼 연골조직에서 염증반응물질 일산화질소의 생성 억제 정도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 생약 조성물(실시예 1)의 토끼 연골조직에서 염증반응물질인 프로스타글란딘 E2의 생성 억제 정도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 생약 조성물(실시예 1)의 연골조직의 구성성분인 프로테오글리칸의 분해 억제 정도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 생약 조성물(실시예 1)의 연골조직 분해효소인 메트릭스메탈로르포테아제-9 (MMP-9)의 활성억제 정도를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 생약 조성물(실시예 1)의 랫드에서 발부종 억제 정도를 나타낸 그림이다.
본 발명은 항염증성 생약 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로 항염증 작용, 소염 진통작용, 관절조직 분해효소 억제작용, 염증유발관련 효소 억제작용, 발부종 억제 등의 치료 효능이 우수한 항염증성 생약 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 인간을 비롯한 모든 호기성 생물체는 산소를 이용한 에너지 대사 과정에서 항상 발생하는 활성 산소의 상해에 대하여 자기 방어기구를 구비하고 있지만, 조직의 방어능을 초월한 활성산소의 생성은 관절염 등 여러 질환의 원인이 되고 있다.
상기 활성산소는 가장 안정한 형태의 산소인 삼중항 산소(3O2)가 산화, 환원 과정에서 환원되어 생성되는 일중항 산소인 수퍼옥사이드 음이온(Superoxide anion, 1O2 -)과 과산화수소(H2O2), 아히드록시라디칼(·OH)과 같은 자유라디칼로서, 이들은 단백질, DNA, 효소 및 T 세포와 같은 면역계통의 인자를 손상시켜 각종 질병을 유발시킨다.
이러한 이유로 항산화제의 개발연구가 활발히 진행되어 예방적 항산화제인 수퍼옥사이드 디스무테이즈(Superoxide dismutase), 카탈레이즈(Catalase), 글루타티온 페록시데이즈(Glutathioneperoxidase) 등 과 같은 항산화 효소와 천연 항산화제인 비타민 E, 비타민 C, 카로테노이드(Carotenoid), 글루타티온(Glutathione) 및 합성 항산화제인 부틸히드록시 아니졸(t-Butyl-4-hydroxyanisole; BHA) 디부틸 히드록시 톨루엔(3,5-(t-Butyl)-4-hydroxytoluene; BHT) 등 많은 항산화제가 알려져 있다. 그러나 천연 항산화 효소는 노화에 따라 활성산소에 대한 방어능력이 저하되고 합성 항산화제는 돌연변이를 유발하거나 독성 등의 문제가 있어 안전하고 효과적인 천연 항산화제의 개발이 절실히 요청되고 있다.
염증성 질환이란 세균의 침입에 의하여 형성되는 농양의 병리적 상태를 의미한다. 염증을 유발하는 효소인 시클로옥시게나제(COX)는 2 종류가 알려져 있다. 이중 COX-1는 염증부위뿐만 아니라 정상적인 인체 여러 장기와 조직, 즉, 위장관 또는 신장 등에서 프로스타글란딘(Prostaglandin; 이하 HG)의 물질을 생성하는 데에도 관여한다. 이에 비하여 COX-2는 염증이 있는 부위에서만 작용하는 효소로 알려져 있다. 시판되고 있는 디클로페낙(diclofenac), 아스피린(aspirin) 및 이부프로펜(ibuprofen) 등의 비스테로이드성 항염증제(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs; 이하 NSAIDs)는 COX-1과 COX-2를 동시에 억제하거나 주로 COX-1을 억제하므로 염증이 있는 조직 뿐만 아니라, 장기 복용시, 간 위장관, 또는 신장 등의 기능유지에 필수적인 HG를 동시에 억제하여 많은 부작용을 야기하는 것으로 알려져 있다(Isselbcher et al., Harrison's Principles of Internal Medicine, (13th ed)2, pp1543-1711).
염증성 질환중 대표적인 관절염은 노화에 의해 발병하는 대표적인 질환으로 국내의 경우 전체 인구의 약 20% 정도가 관절염으로 고통받고 있는 것으로 알려져 있다. 관절염의 세부 종류는 100 여 개에 이르지만, 이중 골관절염이 전체 관절염의 대부분을 차지한다.
골관절염(osteoarthritis)은 관절의 연골이 닳아 없어져 관절뼈가 맞부딪치면서 통증을 유발하기 때문에 관절 주변의 근육을 쓰지 않게 되어 힘도 점차 빠지게 되는 질환이다. 골관절염은 과거에 퇴행성 관절염(degenerative joint disease)이라고 알려진, 사람에게 흔히 발생되는 관절 질환으로서 관절의 이상 또는 손상 후에 발생하거나, 관절 손상을 받지 않고도 발생할 수 있다.
골관절염은 코르티코스테로이드(corticosteroid) 유형의 소염물질, 예를 들면, 프로스타글란딘 합성 저해 기능을 갖는 하이드로코르티존(hydrocortisone) 및 베타메타손(betamethasone) 등을 사용하여 치료되어 왔으나, 이러한 스테로이드계 호르몬의 경구투여는 일시적으로 효과가 있을 수 있지만 그 심각한 부작용 때문에 사용시 지속적인 주의 관찰과 함께 경구 투여가 아닌 관절내 주사를 원칙으로 한다.
상기 방법 외에 비스테로이드성 소염제를 복용하는 방법이 사용되고 있으나 상기 설명한 바와 같이 위장관에 부작용을 일으키는 문제점이 있다.
본 발명은 항염증 작용, 소염 진통작용, 관절조직 분해효소 억제작용, 염증유발관련 효소 억제작용, 발부종 억제 등의 치료 효능이 우수한 항염증성 생약 조 성물 및 이의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 강활, 인진 및 갈근 추출물을 유효성분으로 하는 항염증성 생약 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 강활, 인진 및 갈근의 혼합물을 물 또는 유기 용매로 추출하거나, 상기 강활, 인진 및 갈근을 각각 물 또는 유기 용매로 추출하여 추출물을 얻고; 상기 추출물을 에틸 아세테이트로 층분리하여 농축시키는 공정을 포함하는 항염증성 생약 조성물의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 항염증성 생약 조성물은 강활, 인진, 및 갈근을 유효성분으로 포함한다.
본 발명에서 유효성분으로 사용되는 강활(羌活; Angelica koreana Max.)은 리모넨(limonene), o-크레졸, 알파-피넨(alpha-pinene) 등의 정유성분과 아피제닌(apigenin), 오스테놀(osthenol), 베르갑틴(bergaptin) 등의 성분을 포함하고 있으며, 감기, 두통, 신경통 등에 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
상기 인진(茵蔯)은 국화과 쑥속에 속하는 다년생 초본형 낙엽관목으로 생당쑥, 애당쑥, 사철쑥, 더위지기(Artemisia iwayomogi), 흰산쑥(Artemisa sacrorum subsp. Kitamura), 털산쑥(Artemisa sacrorum subsp. manshuria var. vestita Kitamura) 등으로 불리워지고 있다. 특히 인진(더위지기)는 특유의 향기와 약효로 인하고 많은 관심을 가져왔으며, 민간에서 식용, 약용, 단방약으로 애용하여 왔다. 동의보감과 본초강목에서 손상된 간회복, 지방간, 간암, 간염, 황달 등의 간질환의 치료, 예방, 식욕증진, 소화불량, 담낭염, 위장병 등의 위장질환의 치료, 중풍, 혈액순환, 청혈작용 등의 순환기계 기능의 개선 및 당뇨병의 치료에 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 인진에 함유되어 있는 주성분은 배당체인 스코폴레틴(scopoletin)을 비롯한 정유성분과 아피제닌(apigenin), 쿠마린 (coumarin), 옥시카르본산(oxycarbonic acid), 사포닌(saponin), 탄닌(tannin), 시토스테린 수지(sitosterin resin) 등으로, 해독, 항균, 면역 등의 효과가 예상되며 혈청 지질의 감소효과로 고혈압, 당뇨, 비만, 뇌졸중 등의 치료와 예방에 효과가 있다.
갈근(칡뿌리; Puerariae Radix)은 대한약전에 의하면 칡(Pueraria lobata Ohwi)의 주피를 제거한 뿌리로서, 민간에서는 기호식품, 음료, 건강식품으로 널리 사용되고 있다. 한방에서 갈근은 기육을 풀어주는 작용을 하므로 감기몸살이나 발진성 질환, 항강통 등에 사용되고 있다. 갈근은 아피제닌(apigenin), 이소플라보노이드(isoflavonoide), 제니스테인 (genistein) 등을 다량 함유하고 있으며, 주로 이소플라보노이드와 관련한 성분의 연구가 많이 보고 되고 있다. 갈근과 관련한 약리작용으로는 항알코올 중독(antidipsotropic) 간보호작용, 숙취억제 작용 등이 알려져 있다. 또한 갈근은 뇌혈관과 관상동맥을 확장시킬 수 있어 뇌하수체 후엽 호르몬에 의해 발생하는 급성 심근허혈을 예방할 수 있는 것으로 알려져 있다.
상기 강활은 5 내지 50 중량부, 상기 인진은 5 내지 30 중량부, 상기 갈근은 5 내지 30 중량부로 사용되는 것이 바람직하다. 상기 함량 범위에서 사용하여야 우수한 생약 조성물의 효능을 얻을 수 있다.
본 발명의 생약 조성물은 0.5 내지 5 중량%의 아피제닌(apigenin)을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 아피제닌은 강활, 인진 및 갈근에 모두 포함되어 있는 유효성분으로 상기 아피제닌이 상기 기재된 범위 내로 함유되어야 염증성 질환에 효과적이다.
상기 생약 조성물은 강활, 인진 및 갈근의 혼합물을 물 또는 유기 용매로 추출하여 추출물을 얻거나, 상기 강활, 인진 및 갈근을 각각 추출하여 추출물을 얻고, 상기 추출물을 에틸 아세테이트로 층분리하여 농축시켜 제조된다.
상기 추출물은 식물의 추출부위별 분쇄물을 증류수 또는 유기용매에 침지하고, 여과한 후 용매를 건조시켜 제조한다. 상기 유기용매로는 알코올, 헥산, 클로로포름 등이 사용될 수 있다. 상기 알코올 용매는 탄소수 1 내지 5의 알코올이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 에탄올, 메탄올, 프로판올 또는 부탄올이며, 가장 바람직하게는 에탄올과 메탄올이다. 추출부위는 식물의 꽃, 엽, 줄기, 껍질, 꽃봉오리, 뿌리, 열매, 종자 또는 식물체일 수 있으며, 바람직하기로는 강활은 뿌리이고, 인진은 잎이며, 갈근은 뿌리이다.
추출물은 식물 또는 식물의 건조물을 분쇄하고, 분쇄물에 용매를 1:1 내지 1:6 중량비로 가하여 침지한 후, 이를 여과 또는 원심분리하여 상등액을 수득하여 제조될 수 있다. 상기 침지 온도는 20 내지 60 ℃인 것이 바람직하고 24 내지 48 시간인 것이 바람직하다. 상기 상등액을 에틸아세테이트로 분액추출(층분리)하여 생약 조성물을 얻는다. 층분리는 3회 이상 실시하는 것이 바람직하다.
생약 조성물은 액상으로 사용하거나, 진공농축 또는 동결건조하여 용매가 제 거된 분말로 사용할 수도 있다.
상기 생약 조성물의 적합한 제형으로는 산제, 액제, 환제, 정제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제, 좌약제 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출물을 약제학적으로 허용되는 염을 약학적으로 불활성인 유기 또는 무기 담체를 이용하여 적합한 제형으로 제조할 수 있다. 즉 제형이 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 캡슐제인 경우 락토오스, 옥수수 전분 또는 그 유도체, 활석, 스테아린산 또는 그 염을 사용할 수 있다. 또한 제형이 연질 캡슐제의 경우에는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체의 폴리올이 사용가능하다. 용액 또는 시럽 형태의 경우에는 물, 폴리올, 글리세롤, 및 식물성 오일 등이 사용될 수 있다. 좌약용 담체로는 천연 오일 또는 경화된 오일, 왁스, 지방, 액체 폴리올 등이 사용가능하다.
본 발명의 치료용 약제는 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등을 더 포함할 수 있다.
투여 방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 병증의 정도, 성별, 연령에 따라 다를 수 있으나 통상 건강한 성인 남성의 경우 1일 2 mg 내지 10 mg/kg의 양으로 투여되는 것이 바람직하다. 투여회수 또한 환자의 체중, 병증의 정도, 성별, 연령에 따라 용이하게 조절될 수 있다.
또한 각종 식품에 첨가되어 염증성 질환을 예방, 치료하기 위한 기능성 식품에도 사용될 수 있다. 첨가될 식품은 시중에서 유통되고 있는 모든 식품이 될 수 있으며 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 생약 조성물은 항염증 작용, 항염증 작용, 소염 진통작용, 관절조직 분해효소 억제작용, 염증유발관련 효소 억제작용, 발부종 억제 효능이 우수하여 염증성 질환의 치료 및 예방에 유용하게 사용될 수 있다. 상기 염증성 질환의 예로는 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염 등이 있다. 상기 관절염중 골관절염 치료에 우수한 효능을 가진다.
골관절염을 유발하는 연골 파손 과정에서, 일부 염증이 유발될 수 있으며, 이로써 염증 관련 효소의 방출을 야기하여 연골 손상을 가속시킨다. 골관절염이 진행되면, 염증 반응과 함께 활액량이 늘어나는 것을 확인할 수 있는데 이는 연골이 파괴되어 활액내로 프로테오글리칸(proteoglycan)이 방출되기 때문이며, 따라서 활액내의 프로테오글리칸 농도를 감소시키는 것 또한 골관절염의 개선에 중요한 마커가 된다.
또한, 골관절염이 유도되면, 관절내 염증 반응과 함께 통증이 증가하게 되는데 이러한 통증은 활액내에서 이와 관련된 중요한 인자인 프로스타글란딘E2의 농도가 증가하기 때문이며, 따라서 활액내의 프로스타글란딘E2의 농도를 감소시키는 것이 또한 골관절염의 개선에 중요하다.
일반적으로 염증 부위에서는 과다한 양의 NO가 발생하여 세포 조직의 괴사를 촉진시킨다고 알려져 있다 [Moncada, S et al., Pharmacol. Rev. 43: 109-142 (1991)]. 이러한 NO를 발생시키는 iNOS(inducible nitric oxide synthetase)의 활 성을 억제하거나 단백질 발현을 억제하는 것은 많은 염증성 질병에서 치료의 중요한 관건이 되고 있다. iNOS는 외부자극에 반응하여 생체를 방어하려는 목적으로 단시간에 과량의 NO를 생성하지만, 관절염과 같은 질환에서는 과잉 분비된 NO가 괴사, 통증 등의 2차적인 부작용을 일으키게 된다. 따라서, iNOS의 과잉발현 억제는 골관절염 치료에 중요한 것으로 알려져 있다.
사이클로옥시게나제 2(cyclooxygenase 2; COX-2)는 통증 유발 물질인 프로스타글란딘을 합성하는 효소이며, 이는 NO를 비롯한 기타 자극에 의해 합성이 촉진되기 때문에 COX-2의 발현을 억제하거나 활성을 억제하는 것은 또한 골관절염 치료에 중요한 마커가 된다.
본 발명의 생약 조성물은 프로테오글리칸과 프로스타글란딘E2의 생성을 억제하고 일산화질소의 생성을 억제하고, 관절조직 분해효소인 매트리스 메탈로프로테나제의 활성을 억제하는 것으로 나타났다.
실시예
실시예 1: 생약 조성물의 제조
수돗물로 잘 세척하여 불순물을 제거하고 하루동안 건조시킨 강활 50 중량부, 인진 30 중량부 및 갈근 20 중량부를 고루 섞은 후 70% 에탄올로 추출한 후 동량의 에틸 아세테이트를 가하여 3회 층분리한 후 에틸 아세테이트 층만 모아 50 내지 60 ℃로 생약 추출물을 감압 농축하였다. 추출물의 지표물질은 아피제닌(apigenin)으로 추출물에 포함된 아피제닌의 함량은 HPLC로 분석한 결과 2.06 중량 %였다.
실시예 2: 마우스 대식세포주에서 일산화질소 생성 억제 효과
실시예 1의 생약 추출물의 소염작용을 확인하기 위해 마우스의 대식세포주에서 염증반응물질 일산화질소의 생성 억제 활성실험을 실시하였다. 마우스 유래의 대식세포주인 RAW 264.7을 한국세포주 은행에서 구입하여 사용하였으며, 10%의 우태아혈청(fetal bovine serum, 26140-079. 제조원: Gibco), 100U/ml 페니실린, 및 100ug/ml 스트렙토마이신을 포함한 DMEM 배지를 포함한 24 well plate에 2 x 106 개의 세포를 접종하고 24 시간 동안 37 ℃, 5% CO2, 습윤조건하에서 배양하였다.
RAW 264.7 세포에서 산화질소를 유도하기 위하여 대장균의 세포벽 구성성분인 리포폴리사카라이드(LPS, Lipopolysaccharide)를 1 ug/ml의 농도로 투여하고 대조군에는 용매인 DMSO만을 처리하고 실험군에는 실시예 1의 조성물을 0.8ug/ml, 4ug/ml, 20ug/ml의 농도가 되도록 투여한 후, 16시간 동안 배양하였다. 그 다음 배지와 그리스 시약을 1:1의 비율로 혼합하고 상온에서 10분간 방치 후 흡광도 측정기로 파장 540nm에서 흡광도를 측정하였으며 대조군을 100%로 보았을 때 나타나는 상대적인 결과는 다음 도 1과 도 2에 나타내었다. 비교를 위하여 강활, 인진, 갈근의 단독 추출물의 NO 생성 억제 효과를 측정하여 도 1에 함께 도시하였다.
도 1에서 보는 바와 같이 실시예 1의 생약 추출물은 강활, 인진. 갈근 각각의 에탄올 추출물에 비해 일산화질소 생성억제 효과가 우수하였다. 또한 도 2에서 보는 바와 같이 실시예 1의 생약 추출물은 마우스 대식세포에서 농도의존적으로 일 산화질소 생성을 억제하였다.
실시예 3: 대식세포에서 프로스타글란딘 E2 (prostaglandin E2, PGE2) 생성 억제 효과
실시예 1의 생약 추출물의 소염작용을 확인하기 위해 대식세포에서 염증반응물질 프로스타글란딘 E2의 생성 억제 활성실험을 실시하였다.
실시예 2와 같은 방법으로 마우스 대식세포를 배양하였다. PGE2 측정을 위하여 Cayman사의 PGE2 면역분석키트(NO.514010)를 사용하였다. 반응이 끝난 후. 배지 50ul, Tracer 50ul, Antibody 50ul를 키트에 넣고 밤새 4℃에서 배양 후, 발색시약인 Ellman's reagent를 넣고 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 흡광도 측정기를 이용하여 파장 405nm에서 흡광도를 측정하였으며 그 결과는 다음 도 3에 나타내었다.
도 3에서 보는 바와 같이 실시예 1의 생약 추출물은 마우스 대식세포에서 농도의존적으로 PGE2 생성을 억제하였다.
실시예 4: 토끼 연골조직에서 일산화질소 생성 억제 효과
실시예 1의 생약 추출물의 소염작용을 확인하기 위해 연골조직에서 염증반응물질 일산화질소의 생성 억제 활성실험을 실시하였다.
관절세포는 4주령의 토끼 관절로부터 연골조직을 분리하여 primary culture하여 사용하였으며, 10 %의 우태아혈청 (fetal bovine serum, 26140-079. 제조원: Gibco), 100 U/ml 페니실린, 및 100ug/ml 스트렙토마이신을 포함한 DMEM 배지를 포 함한 24 well plate에 1 x 106 개의 세포를 접종하고 5-6일 동안 37 ℃, 5% CO2, 습윤조건하에서 배양하였다. 관절세포가 80%정도 자랐을 때, 배지는 serum free DMEM으로 바꾸고, 대조군을 제외한 모든 well에 IL-1 1 ng/ml, TNF-α 10 ng/ml, IFN-α 1 ng/ml, LPS 1 ug/ml을 투여한 후 20분 인큐베이션하였다. 대조군, 음성(Negative) 대조군에는 용매인 DMSO만 처리하고 실험군에는 아피제닌은 5, 10, 20uM, 실시예 1의 생약추출물은 0.8ug/ml, 4ug/ml, 20ug/ml의 농도가 되도록 투여한 후, 16 시간동안 배양하였다. 그 다음 배지와 그리스 시약을 1:1의 비율로 혼합하고 상온에서 10분간 방치 후 흡광도 측정기로 파장 540nm에서 흡광도를 측정하였으며 그 결과는 다음 도 4에 나타낸 바와 같다.
도 4에서 보는 바와 같이 실시예 1의 생약 추출물은 토끼 연골조직에서 농도의존적으로 일산화질소 생성을 억제하였다.
실시예 5: 연골조직에서 프로스타글란딘 E 2 (prostaglandin E 2 , PGE 2 ) 생성 억제 효과
실시예 1의 생약 추출물의 소염작용을 확인하기 위해 토끼연골조직에서 염증반응물질 프로스타글란딘 E2의 생성 억제 활성실험을 실시하였다. 토끼 연골조직의 배양은 실시예 4와 같은 방법을 사용하였고, PGE2 측정을 위하여 Cayman사의 PGE2 면역분석키트(NO.514010)를 사용하였다. 반응이 끝난 후. 배지 50ul, Tracer 50ul, Antibody 50 ul를 키트에 넣고 밤새 4 ℃에서 배양 후, 발색시약인 Ellman's reagent를 넣고 1 시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 흡광도 측정기를 이용하여 파장 405 nm에서 흡광도를 측정하였으며 그 결과는 다음 도 5에 나타내었다.
도 5에서 보는 바와 같이 실시예 1의 생약 추출물은 마우스 대식세포에서 농도의존적으로 PGE2 생성을 억제하였다.
실시예 6: 프로테오글리칸 분해 억제효과
실시예 1의 생약 추출물의 관절조직 보호효과를 실험하기 위하여, 프로테오글리칸 분해 억제 활성실험을 실시하였다. 토끼 연골세포의 배양은 실시예 4와 같은 방법을 사용하였고, 10 %의 우태아혈청(fetal bovine serum, 26140-079, 제조원: Gibco), 100 U/ml 페니실린, 및 100ug/ml 스트렙토마이신을 포함한 DMEM배지를 포함한 24 웰 플레이트(well plate)에 1*106 개의 세포를 접종하고 5-6 일 동안 37 ℃, 5% CO2, 습윤조건하에서 배양하였다. 관절세포가 80 % 정도 자랐을 때, 배지는 serum free DMEM으로 바꾸고, 대조군을 제외한 모든 well에 IL-1 100 ng/ml를 처리한 후 20분 인큐베이션하였다. 생약추출물을 0.8 ug/ml, 4 ug/ml, 20 ug/ml의 농도가 되도록 투여한 후, 16 시간 동안 배양하였다.
위의 실험방법을 통하여 연골조직의 구성성분 중 프로테오글리칸의 분해를 유발시켜 배양액 내의 프로테오글리칸 분해 산물인 글루코스아미노글리칸 (Glucosaminoglycan, GAG)을 1-9,-디메틸메틸블루발색제 (1-9,-Dimethylmetylene blue dye)에 발색된 정도를 525 nm에서의 흡광도로 정량하였다. Chondroitin sulfate로 표준 정량화 하였다. 그 결과는 다음 도 6에 나타내었다.
도 6에서 보는 바와 같이 실시예 1의 생약 추출물은 프로테오글리칸 생성을 농도의존적으로 억제하였다.
실시예 7: 관절조직 분해효소 매트리스 메탈로프로테나제-9 (MMP-9)의 활성억제 효과
실시예 1의 생약 추출물의 관절조직 분해효소 활성 억제효과를 확인하기 위하여 MMP-9의 활성실험을 하였다. 상등액을 원심분리(centrifuge)하여 세포 파편(cell debris)을 제거하였다. 샘플과 염료(dye)를 섞은 후, 37 ℃ 에서 한 시간 동안 인큐베이션하였다. 10% Zymogram gel (Novex EC61752)을 이용하여 100 V, 3 시간 동안 SDS-PAGE를 실시하였다. Gel Renaturing 과정을 실온에서 흔들어 주며 30분씩 3회 실시 후, Gel developing 과정을 흔들어 주며 실온에서 30분간 시행하였다. 그 후 gel을 Developing buffer에 담근 후, 48 시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 전개(developing)시켰다. 염색(Staining), 탈염색(destaining) 과정을 거쳐 92 kDda의 MMP-9 밴드를 확인한다. 대조군으로 골관절에 효과가 있다고 알려진 아피제닌을 이용하였다. 그 결과는 다음 도 7에 나타낸 바와 같다.
도 7에서 보는 바와 같이 실시예 1의 생약 추출물은 관절조직 분해효소 MMP-9의 활성을 농도의존적으로 억제하였다.
실시예 8: 초산유발 마우스 롸이딩 신드롬 억제효과
실시예 1의 생약 추출물의 진통작용에 대한 활성을 확인하기 위해 마우스에서 롸이딩(writhing) 억제효과 실험을 실시하였다. ICR 마우스 체중을 측정하고 kg 당 200mg, 400mg씩 경구투여하고 1시간 후 0.7 % 초산을 마우스 체중g 당 0.01ml 복강주사 한다, 주사후 5 분 후부터 10 분간 마우스가 나타내는 통증 반응인 롸이딩을 보이는 회수를 관찰하였다. 결과는 표 1에 나타낸 바와 같다
표 1
비고 실시예 1의 생약 추출물 투여량 롸이딩 회수 (평균) 억제율 (%)
대조군 - 42 ± 4.2 0
실험군 A 200 mg/kg 28 ± 3.5 33
실험군 B 400 mg/kg 24 ± 3.3 43
상기 표 1의 결과와 같이 실시예 1의 생약 추출물은 롸이딩 횟수가 33 % ~ 43 %감소한 것으로 보아 진통작용이 우수함을 알 수 있다.
실시예 9: 랫드 발 부종 억제효과
실시예 1의 생약 추출물의 급성 염증에 대한 억제 활성을 확인하기 위해 랫드에서 발 부종 억제효과 실험을 실시하였다. SD 랫드에 생약 추출물을 경구투여하고 1 시간 후 1% 카라기난(carrageenan) 0.1 ml를 왼쪽 뒷 발바닥에 피하 주사 후 일정시간 간격으로 뒷발의 용적을 플레시스모미터(plethysmometer)로 측정하였다. 그 결과는 다음 도 8에 나타내었다.
도 8에서 보는 바와 같이 실시예 1의 생약 추출물은 카라기난 유도 염증에 대한 억제효과가 우수하였다.
본 발명의 강활, 인진 및 갈근의 추출물을 유효성분을 함유하는 생약 조성물은 항염증 작용, 소염 진통작용, 관절조직 분해효소 억제작용, 염증유발관련 효소 억제작용, 발부종 억제 등의 치료작용을 가지고 있어 소염진통제, 골관절염 치료제 등 염증성 질환의 치료제로서 유용하다.

Claims (9)

  1. 강활, 인진 및 갈근 추출물을 유효성분으로 하는 항염증성 생약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 강활은 5 내지 50 중량부로 함유되고, 상기 인진은 5 내지 30 중량부로 함유되고, 상기 갈근은 5 내지 30 중량부로 혼합된 것인 항염증성 생약 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생약 조성물은 물, 탄소수 1 내지 5의 알콜, 또는 이들의 혼합물로 추출한 후, 에틸 아세테이트로 분액추출된 것인 항염증성 생약 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 생약 조성물은 0.5 내지 5 중량%의 아피제닌을 포함하는 것인 항염증성 생약 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항염증성 생약 조성물은 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 및 근육염으로 이루어진 군에서 선택되는 염증성 질환의 치료 및 예방에 효과적인 항염증성 생약 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생약 조성물은 70% 에탄올로 추출한 후 에틸아세테이트로 분액추출된 것인 항염증성 생약 조성물.
  7. 강활, 인진 및 갈근 추출물을 유효성분으로 하는 소염 진통제.
  8. 강활, 인진 및 갈근 추출물을 유효성분으로 하는 골관절염 치료제.
  9. 강활, 인진 및 갈근의 혼합물을 물, 탄소수 1 내지 5의 알콜, 또는 이들의 혼합물로 추출하거나, 상기 강활, 인진 및 갈근을 각각 물, 탄소수 1 내지 5의 알콜, 또는 이들의 혼합물로 추출하여 추출물을 얻고;
    상기 추출물을 에틸 아세테이트로 층분리하여 농축시키는 공정을 포함하는 항염증성 생약 조성물의 제조방법.
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