CN107779483A - 一种基于响应面法紫花地丁芹菜素的酶提方法及其含量测定 - Google Patents

一种基于响应面法紫花地丁芹菜素的酶提方法及其含量测定 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于响应面法紫花地丁芹菜素的酶提方法及其含量测定，属于中药技术领域。该发明纤维素酶酶法提取紫花地丁中芹菜素，对纤维素酶酶提法提取过程中的酶解温度、酶解时间、酶解pH值和纤维素酶用量采用响应面分析法筛选得到了最佳工艺参数，采用该工艺参数提取的紫花地丁芹菜素的产率达到38.50μg/g以上；该工艺生态环保、稳定、可行，有效避免了使用有机溶剂提取时的溶剂残留和溶剂污染，在能高效提取紫花地丁芹菜素的同时更加安全环保。

Description

一种基于响应面法紫花地丁芹菜素的酶提方法及其含量测定
技术领域
本发明涉及紫花地丁芹菜素提取技术领域，尤其是一种基于响应面法紫花地丁芹菜素的酶提方法。
背景技术
紫花地丁(Viola philippicassp munda W.Becker)为堇菜科堇菜植物，多年生草本，春、夏、秋季均可，采收,有清热解毒、清热利湿的功效,为民间中草药,分布广泛。芹菜素是其黄酮的主要组分，黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、防止心血管疾病、消炎、抗过敏、镇痛、抗菌、抗病毒等作用。
现有技术中，中国专利CN200910170069.8公开了一种从紫花地丁提取芹菜素的方法，采用甲醇超声处理，离心、浓缩、萃取、大孔吸附树脂LSA-10与层析柱硅胶吸附层析，连续分离，浓缩，丙酮结晶，得到芹菜素纯品。但存在对提取设备有特殊要求，同时采用有毒有机溶剂提取，对环境污染大等缺点。
另有报道(张玲,李继昌,许薇,李丽,刘桂丽.采用响应曲面优化紫花地丁总黄酮提取工艺研究[J].东北农业大学学报,2013,44(6):150～155.)，采用响应曲面优化紫花地丁总黄酮提取工艺研究,该研究以总黄酮为检测指标，采用超声提取法提取紫花地丁中黄酮化合物，考察乙醇体积分数、超声功率、提取温度和提取时间四种因素对提取工艺影响，并对提取工艺进行优选。响应回归模型达到极显著水平,响应值98.13％来源于所选变量，回归方程拟合程度良好，可以用该模型代替真实试验点对试验结果进行分析和预测。
响应面分析法(Response surface methodology,RSM)是一种优化工艺条件有效方法，是利用中心组合试验拟合出一个完整二次多项式模型，通过偏导数求得最佳参数，使得试验设计与结果表达方面更加优良，具有试验次数少、周期短、精度高等特点。目前，紫花地丁提取工艺采用是正交设计法，传统的单变量优化试验存在不考虑各个因素之间交互作用的不足。与响应面法比较，正交设计法无法做到用较少试验数据在给定范围内找到因素与响应值间明确函数表达式，得出最佳因素组合和响应值最优值，因此在药学中提取药物活性成分领域得到广泛的应用。
酶法提取是一项生物工程技术，其根据药材特点选用恰当的生物酶，可以在温和的条件下将植物细胞壁降解，促进有效成分的释放，从而达到高效提取中药有效成分或部位的目的。酶法提取，具有提取条件温和、能耗小，对设备无特殊要求等优点，使得酶法提取天然植物中黄酮类成分得到了大量的研究，但是尚未见该技术在提取紫花地丁芹菜素提取中的应用研究。
基于此，为了能够实现酶解法提取紫花地丁芹菜素，使得芹菜素得率得到大幅度的提高，降低提取成本，本研究者结合响应面法和酶法应用于紫花地丁中芹菜素成分进行探索，为紫花地丁芹菜素提供一种新思路。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明基于响应面分析法对纤维素酶法提取紫花地丁中芹菜素的工艺参数进行界定，得到的最佳酶法提取的紫花地丁芹菜素得率高，工艺可控、稳定、可行。
本发明的目的之一是提供一种基于响应面法紫花地丁芹菜素的酶提方法，具体是通过以下技术方案得以实现的：
(1)将紫花地丁干燥、粉碎，得到紫花地丁70～90目粉末；
(2)称取紫花地丁粉末，加入缓冲溶液，调节pH值、纤维素酶用量加入量、酶解温度、酶解时间，进行酶解；
(3)将步骤(2)经过酶法提取的物料进行过滤，得到粗提液；
(4)采用旋转蒸发仪将粗提液浓缩至稠膏，并采用真空干燥箱烘干，即可。
优选地，步骤(2)所述的pH值为3.5～5.5。
优选地，步骤(2)所述的纤维素酶加入量为药材质量的1.2％～2.4％。
优选地，步骤(2)所述的温度控制在40～60℃。
优选地，步骤(2)所述的酶解时间为90～210min。
优选地，步骤(4)所述的真空干燥，烘干时间为12～30h。
进一步地，所述步骤(2)中纤维素酶用量、酶解温度、pH值及酶解时间的参数应满足如下关系式：
Y＝-369.71208+7.43483A+0.43450B+43.76733C+105.75722D+0.00183AB+0.07700AC-0.43833AD-0.02183BC-0.00972BD-3.95000CD-0.07308A2-0.00132B2-4.07267C2-18.25741D2；其中，A表示酶解温度，B表示酶解时间，C表示pH值，D表示纤维素酶用量，Y为芹菜素得率。
本发明的第二个目的是提供一种基于响应面法紫花地丁芹菜素的含量测定方法。
采用高效液相色谱法定量分析芹菜素的含量，在高效液相色谱法测定过程中，流动相采用甲醇:0.2％磷酸溶液＝52:48的体积比混合溶液，流速为1mL/min，并在波长为350nm下绘制紫花地丁中芹菜素的标准曲线，具体的回归方程如下：
Y芹菜素＝3917.22X+91.80(R2＝0.9993)，其中Y芹菜素为芹菜素含量，X为芹菜素的峰面积。
紫花地丁芹菜素得率Y＝[(芹菜素含量×提取物重量)/紫花地丁原药材重量]×100％
进一步地，所述的磷酸溶液为磷酸-磷酸二氢盐溶液或磷酸-磷酸氢盐溶液。
所述的磷酸二氢盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠中的一种；所述的磷酸氢盐为磷酸氢钾、磷酸氢钠中的一种。
优选地，一种基于响应面法紫花地丁芹菜素的酶提方法，包括以下步骤：
(1)将紫花地丁烘干、粉碎，得紫花地丁80目的粉末；
(2)称取紫花地丁粉末，加入缓冲溶液，调整pH值为4.6，加入药材质量1.8％的纤维素酶，控制温度为50℃，酶解时间155min；
(3)将步骤(2)酶解后的物料进行过滤，得到粗提液；
(4)采用旋转蒸发仪将粗提液浓缩至稠膏，并采用真空干燥箱烘干24h，即可。
为了更好的方便本技术领域人员对所选参数的理解，本发明结合试验例进行分 析，结合响应曲面分析法筛选紫花地丁中芹菜素酶提参数的具体步骤如下：
1.单因素试验考察
1.1酶解温度试验
以酶解时间150min，酶解pH值4.5，纤维素酶用量1.8％，酶解温度40℃、45℃、50℃、55℃、60℃条件进行酶法提取，并测定计算出紫花地丁芹菜素得率，得出酶解温度最优值，其测定结果如图1所示。
从图1可知，在酶解时间、酶解pH值、酶用量相同的条件下，当酶解温度为50℃时，芹菜素得率最高。因此，酶解温度以50℃为宜。
1.2酶解时间试验
以酶解温度50℃，酶解pH值4.5，纤维素酶用量1.8％，酶解时间90min、120min、150min、180min、210min条件进行酶法提取，并测定计算出紫花地丁芹菜素得率，得到酶解时间最优值，其结果如图2所示。
从图2可知，在酶解温度、酶解pH值、酶用量相同的条件下，当酶解时间为150min时，芹菜素得率达到最大值，随着酶解时间进一步增加，芹菜素得率无显著增加。因此，酶解时间以150min为宜。
1.3酶解pH值试验
以酶解温度50℃，酶解时间150min，纤维素酶用量1.8％，酶解pH值3.5、4.0、4.5、5.0、5.5条件进行酶法提取，并测定计算出紫花地丁芹菜素得率，得到酶解pH最优值，其结果如图3所示。
1.4酶用量试验
以酶解温度50℃，酶解时间150min，酶解pH值4.5，按照药材质量比加入酶用量分别为1.2％、1.5％、1.8％、2.1％、2.4％，并测定计算出紫花地丁芹菜素得率，得到酶用量最优值，其结果如图4所示。
从图4可知，在酶解温度、酶解时间、酶解pH值相同的条件下，当酶用量为1.8％时，芹菜素得率达到最大值。因此，酶用量以1.8％为宜。
2.响应面优化设计
2.1响应面优化设计将上述单因素试验得到的结果拟定为最优水平，并进行响应面优化设计，因素水平设置表见表1。
表1 响应面优化设计因素水平设计表
2.2试验结果利用Design-Expert软件根据Box-Benhnken设计原则进行四因素三水平实验设计，试验方案以及响应结果如表2所示：
表2 四因素三水平设计因素表及实验结果
以酶解温度A、酶解时间B、酶解pH值C、纤维素酶用量D为自变量，以紫花地丁芹菜素得率为响应值Y，建立多元二次方程，并对多元二次方程进行计算，得出紫花地丁芹菜素回归方程如下：
Y＝-369.71208+7.43483A+0.43450B+43.76733C+105.75722D+0.00183AB+0.07700AC-0.43833AD-0.02183BC-0.00972BD-3.95000CD-0.07308A2-0.00132B2-4.07267C2-18.25741D2。
对上述紫花地丁芹菜素回归方程进行方差分析，其结果如表3所示：
表3 芹菜素方差分析结果
并利用Design-Expert软件对多元二次回归方程进行响应面分析，得到回归方程各因素相互之间的响应面图，如图5～图10所示。最终得出紫花地丁芹菜素的纤维素酶提取法优化后的工艺参数为：酶解温度49.94℃、酶解时间155.08min、酶解pH值4.58、酶用量1.76％。
根据实际情况进行了工艺参数的修正，修正结果为：酶解温度50℃、酶解时间155min、酶解pH值4.6、酶用量1.8％。
2.3试验验证
采用优化修正后的试验参数(酶解温度50℃、酶解时间155min、酶解pH值4.6、酶用量1.8％)进行三次平行试验，紫花地丁芹菜素得率分别为42.62μg/g、42.40μg/g、42.52μg/g，平均值42.51μg/g。
本发明的有益效果
(1)在本发明创造中，通过响应面法对纤维素酶法提取紫花地丁中芹菜素的工艺参数进行界定，其能够充分考虑各个因素及两两因素相互作用对得到充分的弥补和完善，避免了单因素试验处理之后的正交设计调整参数存在的片面性和离散型，通过响应面法得到了最佳酶法提取紫花地丁芹菜素的工艺参数，该工艺高效、可控、稳定、可行。
(2)本发明创造通过对紫花地丁进行纤维素酶酶解法提取，并对提取过程中的酶解温度、酶解时间、酶解pH值、纤维素酶用量等工艺参数进行合理的确定和选择，使得紫花地丁芹菜素产率高达38.50μg/g以上。
(3)本发明纤维素酶酶解法提取紫花地丁中芹菜素，该方法生态环保，提取率高，有效避免了使用有机溶剂提取时的溶剂残留和溶剂污染，在能高效提取紫花地丁芹菜素的同时更加安全环保。
附图说明
图1为酶解温度对紫花地丁芹菜素得率的影响图；
图2为酶解时间对紫花地丁芹菜素得率的影响图；
图3为酶解pH值对紫花地丁芹菜素得率的影响图；
图4为酶用量对紫花地丁芹菜素得率的影响图；
图5为酶解温度和酶解时间对紫花地丁芹菜素得率影响的响应面三维图；
图6为酶解温度和酶解pH值对紫花地丁芹菜素得率影响的响应面三维图；
图7为酶解温度和酶用量对紫花地丁芹菜素得率影响的响应面三维图；
图8为酶解时间和酶解pH值对紫花地丁芹菜素得率影响的响应面三维图；
图9为酶解时间和酶用量对紫花地丁芹菜素得率影响的响应面三维图；
图10为酶解pH值和酶用量对紫花地丁芹菜素得率影响的响应面三维图。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例1
(1)将紫花地丁干燥、粉碎成80目，得到紫花地丁粉末；
称取紫花地丁粉末10.00g，加入醋酸-醋酸钠缓冲液，调整pH为4.6，按照药材质量比加入1.8％纤维素酶，在50℃下酶解155min；
采用旋转蒸发仪将粗提液浓缩至稠膏，并采用真空干燥箱烘干24h，即可得到粗提物。
称取上述粗取物，采用无水甲醇溶解，稀释后，采用高效液相色谱法测定紫花地丁芹菜素，并根据芹菜素得率Y＝[(芹菜素含量×提取物重量)/紫花地丁药材重量]×100％。计算出芹菜素得率为41.26μg/g。
实施例2
将紫花地丁干燥、粉碎成90目，得到紫花地丁粉末；
称取紫花地丁粉末10.00g，加入醋酸-醋酸钠缓冲液，调整pH为5.5，按照药材质量比加入2.4％纤维素酶，在60℃下酶解210min；
采用旋转蒸发仪将粗提液浓缩至稠膏，并采用真空干燥箱烘干30h，即可得到粗提物。
称取上述粗取物，采用无水甲醇溶解，稀释后，采用高效液相色谱法测定紫花地丁芹菜素，并根据芹菜素得率Y＝[(芹菜素含量×提取物重量)/紫花地丁药材重量]×100％。计算出芹菜素得率为41.05μg/g。
实施例3
将紫花地丁干燥、粉碎成70目，得到紫花地丁粉末；
称取紫花地丁粉末10.00g，加入醋酸-醋酸钠缓冲液，调整pH为3.5，按照药材质量比加入1.2％纤维素酶，在40℃下酶解90min；
采用旋转蒸发仪将粗提液浓缩至稠膏，并采用真空干燥箱烘干12h，即可得到粗提物。
称取上述粗取物，采用无水甲醇溶解，稀释后，采用高效液相色谱法测定紫花地丁芹菜素，并根据芹菜素得率Y＝[(芹菜素含量×提取物重量)/紫花地丁药材重量]×100％。计算出芹菜素得率为40.24μg/g。
实施例4
将紫花地丁干燥、粉碎成70目，得到紫花地丁粉末；
称取紫花地丁粉末10.00g，加入醋酸-醋酸钠缓冲液，调整pH为5.5，按照药材质量比加入1.2％纤维素酶，在60℃下酶解90min；
采用旋转蒸发仪将粗提液浓缩至稠膏，并采用真空干燥箱烘干30h，即可得到粗提物。
称取上述粗取物，采用无水甲醇溶解，稀释后，采用高效液相色谱法测定紫花地丁芹菜素，并根据芹菜素得率Y＝[(芹菜素含量×提取物重量)/紫花地丁药材重量]×100％。计算出芹菜素得率为40.28μg/g。
实施例5
(1)将紫花地丁干燥、粉碎成90目，得到紫花地丁粉末；
(2)称取紫花地丁粉末10.00g，加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液，调整pH值为3.5，按照药材质量比加入2.4％纤维素酶，在40℃下酶解210min；
将酶解后的物料进行过滤，得到粗提液；
采用旋转蒸发仪将粗提液浓缩至稠膏，并采用真空干燥箱烘干12h，即可得到粗提物。
称取上述粗取物，采用无水甲醇溶解，稀释后，采用高效液相色谱法测定紫花地丁芹菜素，并根据芹菜素得率Y＝[(芹菜素含量×提取物重量)/紫花地丁药材重量]×100％。计算出芹菜素得率为40.44μg/g。
最后应说明的是：以上例举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能够从本发明公开的内容直接导出或者联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于响应面法紫花地丁芹菜素的酶提方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将紫花地丁干燥、粉碎，得到紫花地丁70～90目粉末；
(2)称取紫花地丁粉末，加入缓冲溶液，调节pH值、纤维素酶用量加入量、酶解温度、酶解时间，进行酶解；
(3)将步骤(2)经过酶法提取的物料进行过滤，得到粗提液；
(4)采用旋转蒸发仪将粗提液浓缩至稠膏，并采用真空干燥箱烘干，即可。
2.如权利要求1所述的酶提方法，其特征在于，所述步骤(4)的真空干燥，烘干时间为12-30h。
3.如权利要求1所述的酶提方法，其特征在于，所述步骤(2)中纤维素酶用量、酶解温度、pH值及酶解时间应满足如下关系式：
Y＝-369.71208+7.43483A+0.43450B+43.76733C+105.75722D+0.00183
AB+0.07700AC-0.43833AD-0.02183BC-0.00972BD-3.95000CD-0.07308A2-0.00132B2-4.07267C2-18.25741D2；其中，A表示酶解温度，B表示酶解时间，C表示pH值，D表示纤维素酶用量，Y为芹菜素得率。
4.如权利要求3所述的酶提方法，其特征在于，所述步骤(2)中的pH值为3.5～5.5。
5.如权利要求3所述的酶提方法，其特征在于，所述步骤(2)中的纤维素酶加入量为药材质量的1.2％～2.4％。
6.如权利要求3所述的酶提方法，其特征在于，所述步骤(2)中的酶解温度为40～60℃。
7.如权利要求3所述的酶提方法，其特征在于，所述步骤(2)中的酶解时间为90～210min。
8.如权利要求1～7任一项所述的酶提方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)将紫花地丁烘干、粉碎，得紫花地丁80目的粉末；
(2)称取紫花地丁粉末，加入缓冲溶液，调整pH值为4.6，加入药材质量1.8％的纤维素酶，控制温度为50℃，酶解时间155min；
(3)将步骤(2)酶解后的物料进行过滤，得到粗提液；
(4)采用旋转蒸发仪将粗提液浓缩至稠膏，并采用真空干燥箱烘干24h，即可。
9.一种采用权利要求1～8任一项所述的酶提方法提取的紫花地丁芹菜素的含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用高效液相色谱法定量分析芹菜素的含量，流动相采用甲醇:0.2％磷酸溶液＝52:48的体积比混合溶液，流速为1mL/min，波长为350nm，绘制紫花地丁中芹菜素的标准曲线，具体的回归方程如下：
Y芹菜素＝3917.22X+91.80(R2＝0.9993)，其中Y芹菜素为芹菜素含量，X为芹菜素的峰面积。
10.如权利要求9所述的含量测定方法，其特征在于，所述的磷酸溶液为磷酸-磷酸二氢盐溶液或磷酸-磷酸氢盐溶液；所述的磷酸二氢盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠中的一种；所述的磷酸氢盐为磷酸氢钾、磷酸氢钠中的一种。
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