KR20120028098A

KR20120028098A - 신규 애주름버섯 균주 및 이를 이용한 천마종자의 기내발아방법

Info

Publication number: KR20120028098A
Application number: KR1020100090104A
Authority: KR
Inventors: 박응준; 이위영; 안진권; 가강현; 김승택
Original assignee: 대한민국(관리부서 : 산림청 국립산림과학원장)
Priority date: 2010-09-14
Filing date: 2010-09-14
Publication date: 2012-03-22
Also published as: KR101200399B1

Abstract

본 발명은 신규 애주름버섯(Mycena sp. KFRI 1212) 균주 및 이를 이용한 천마종자의 기내발아방법에 관한 것으로서, 지금까지 천마종자는 중국에서 연구된 바 있는 흰애주름버섯균주만이 발아시킬 수 있는 것으로 알려져 왔지만, 본 발명을 통해 기존 흰애주름버섯균주와는 다른 애주름버섯균주를 이용한 천마종자의 발아가 가능하게 되었다.
따라서 본 발명은 기존 무성번식재배방법에 의한 천마퇴화현상의 극복, 무분별한 야생천마 수집에 의한 국내 천마 유전자원의 감소를 극복할 수 있는 방법의 제공과 더불어 종자를 이용한 천마의 번식 및 재배방법이 상용화될 경우 발생할 수 있는 중국산 흰애주름버섯균주에 대한 로얄티 지불 문제 등을 해결할 수 있다는 장점이 있다.

Description

신규 애주름버섯 균주 및 이를 이용한 천마종자의 기내발아방법{KFRI 1212 and in vitro germination method of Gastrodia elata seeds using the KFRI 1212}

본 발명은 천마종자의 발아에 관한 기술이다. 보다 상세하게는 본 발명은 신규한 애주름버섯(Mycena sp. KFRI 1212) 균주 및 이를 이용한 천마종자의 기내발아방법에 관한 것이다.

현재까지 천마종자는 중국에서 연구된 바 있는 흰애주름버섯균주만이 발아시킬 수 있는 것으로 알려져 왔지만, 본 발명을 통해 기존 흰애주름버섯균주와는 다른 애주름버섯균주를 이용한 천마종자의 발아가 가능하게 되었다.

천마는 난과(Orchidaceae)에 속하는 다년생 고등식물이지만 광합성 능력이 퇴화된 식물이다. 한국, 중국, 일본 등의 고산지대에 자생하는 것으로 알려진 천마는 예부터 귀중한 상등품 약재로 이용되어 왔으며, 덩이줄기(塊莖)는 중풍, 고혈압, 현기증, 신경성 질환 등에 효능이 좋아 두부질환의 예방과 치료제로 이용되어 왔다. 1911년 천마는 독립적 생육이 불가능하고, 뽕나무 버섯(Armillaria mellea)과 공생을 통해 공생한다는 것이 최초로 밝혀졌다.

이 후 우리나라에서는 1995년 뽕나무 버섯균주인 천마균1호가 개발 보급되면서 대량재배가 가능하게 되었으나, 자마(子麻)에 의한 계속된 무성번식으로 품질과 수량이 저하되는 천마퇴화현상, 천마균주의 오용과 배양기술의 부족, 연작피해, 건조 등 환경 스트레스에 대한 천마자체의 생리적 취약성 등으로 인해 급격한 생산성 변동 및 재배농가의 경제적 손실로 이어지고 있다.

연속적인 무성번식으로 인한 천마의 퇴화현상을 막을 수 있는 가장 효과적인 방법으로 대두되고 있는 것이 천마종자를 이용한 유성번식방법이다. 천마의 유성번식방법에 대한 연구는 지금까지 중국을 중심으로 진행되어 왔으며, 지금까지 천마종자를 발아시킬 수 있는 것으로 알려진 유일한 발아균주는 흰애주름버섯(Mycena osmundicola)뿐이었다. 주름버섯은 담자균류 주름버섯목 주름버섯과의 버섯으로, 분포지역은 한국(변산반도국립공원, 가야산, 발왕산), 일본, 중국, 시베리아, 유럽, 북아메리카, 호주, 아프리카이다. 주름버섯은 여름부터 가을까지 풀밭이나 밭에 무리를 지어 자라며 가끔 균륜(菌輪)을 만든다.

버섯갓은 지름 5~10cm로 공 모양에서 빵 모양을 거쳐 편평해진다. 갓 표면은 흰색이지만 노란색 또는 붉은색을 띠고 비단실 같은 광택이 있으며 가장자리는 어릴 때 안쪽으로 감긴다. 살은 두껍고 흰색인데 흠집이 생기면 약간 붉은색을 띤다. 주름살은 끝붙은 주름살로 촘촘하며 처음에 보라색이다가 자갈색 또는 흑갈색으로 변한다. 버섯대는 크기가 5~10cm×7~20mm로 기부가 가늘다. 버섯대 표면은 흰색이며 손으로 만지면 갈색으로 변한다. 고리는 자루 상부 또는 중간에 붙어 있고 얇은 흰색 막질인데 쉽게 떨어진다. 홀씨는 6~9.5×4.5~7μm의 타원형 또는 달걀 모양이고 자갈색이고, 식용으로도 이용되고 있다.

환경제어가 가능한 기내배양방법을 이용해 천마 종자로부터 자마를 번식하는 방법에 대한 체계적인 연구는 전 세계적으로 보고된 바 없다. 따라서 유성번식방법에 의해 생산된 천마종자를 이용하여 실제 천마재배 시 종마로서 사용되는 자마를 기내배양방법을 통해 연중 대량생산할 수 있는 방법의 개발이 절실하다고 할 것이며, 본 발명은 이를 해결하고자 한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 본 발명의 기재로부터 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 천마종자를 발아시킬 수 있는 애주름버섯 균주를 국내에서 수집 및 분리하게 되었다.

그 결과 천마종자를 발아시키는 신규의 애주름버섯 균주를 발견하였으며, 지금까지 천마종자를 발아시키는 유일한 균주로서 알려진 흰애주름버섯과의 다양한 비교를 통해 기존 흰애주름버섯 균주와는 다르지만 천마종자를 발아시키는 동일한 능력을 갖는 신규 애주름버섯균주를 제공할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

보다 상세하게는 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 본 발명에서는 신규한 애주름버섯(Mycena sp.) 균주인 KFRI 1212(KACC93108P)을 제공한다.

그리고 본 발명에서는 신규한 애주름버섯(Mycena sp.) 균주인 KFRI 1212(KACC93108P)를 이용하여 기내발아된 원구경을 제공한다.

또한 본 발명에서는 신규한 애주름버섯(Mycena sp.) 균주 KFRI 1212(KACC93108P)를 이용한 천마종자의 기내발아방법을 제공한다.

바람직하게는 상기 천마종자의 기내발아방법은 (1)잔나비배지(glucose 25 g/l, yeast extract 2 g/l, glutamic acid 1g/l, thiamine 0.1 g/l, KH₂PO₄ 2 g/l, MgSO₄ 0.5 g/l, disodium dihydrate EDTA 0.2 g/l, MnSO₄ 0.1 g/l)를 이용하여 신규한 애주름버섯 균주(Mycena sp.)인 KFRI 1212(KACC93108P)를 제1차 배양하는 단계; (2)상기 제1차 배양된 균주를 낙엽미강 배지(미강:물=1:4)에 접종하여 제2차 배양하는 단계; (3)천마종자를 포함하고 있는 꼬투리를 화염소독한 후 한천배지(Agar 8 g/l)가 함유된 페트리디쉬에 종자를 살포하는 단계; (5)상기 신규한 애주름버섯 균주 KFRI 1212(KACC93108P)가 감염된 낙엽미강 배지를 2 x 2 cm로 자른 후, 천마종가가 살포된 상기 한천배지의 중앙에 올려놓는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명인 신규 애주름버섯 균주 및 이를 이용한 천마종자의 기내발아방법에는 첫째, 기존 무성번식재배방법에 의한 천마퇴화현상의 극복할 수 있다는 점, 둘째, 무분별한 야생천마 수집에 의한 국내 천마 유전자원의 감소를 극복할 수 있는 방법의 제공이 가능하다는 점, 셋째, 종자를 이용한 천마의 번식 및 재배방법이 상용화될 경우 발생할 수 있는 중국산 흰애주름버섯균주에 대한 로얄티 지불 문제를 해결할 수 있다는 점 등의 유리한 효과가 있다.

도 1은 전남 해남 다산초당 주변에서 채취한 신규 애주름버섯의 형태이다.
도 2는 본 발명의 신규 애주름버섯균주(Mycena sp. KFRI 1212)및 흰애주름버섯균주 (Mycena osmundicola)를 각 각 천마종자와 7주간의 공조배양한 후 발아되는 양상에 관련된 사진이다.
도3는 본 발명의 신규 애주름버섯 균주 (Mycena sp. KFRI 1212)및 흰애주름버섯 균주(Mycena osmundicola)를 각 각 천마종자와 6주간의 공조배양한 후 발아 발달 단계별로 종자수를 나타낸 그림이다. 상기 단계는 제1단계인 발아 후 구형의 원구경 형성 단계, 제2단계인 원구경의 길이신장 단계, 제3단계인 원구경의 측지형성 단계로 구성된다.
도 4는 3주간 PDA배지에서 신규 애주름버섯 균주 (Mycena sp. KFRI 1212)를 21 ℃, 24 ℃ 및 27 ℃에 배양하면서 균사생장을 관찰한 결과이다.
도 5는 3주간 PDA배지에서 배양된 신규 애주름버섯 균주 (Mycena sp. KFRI 1212)와 흰애주름버섯 균주(Mycena osmundicola)의 균총모양을 비교한 사진이다(온도조건 : 27 ℃).
도 6는 배양시간별 PDA배지에서 신규 애주름버섯 균주 (Mycena sp. KFRI 1212)와 흰애주름버섯 균주(Mycena osmundicola)의 균사생장을 비교한 그림이다(온도조건 : 27 ℃).
도 7는 PDA배지에서 대치배양에 의한 대선형성(버섯품종구분의 일반적 기준)에 대한 사진이다.
도 8은 신규 애주름버섯 균주 (Mycena sp. KFRI 1212)와 흰애주름버섯 균주(Mycena osmundicola) ITS 영역의 PCR 증폭산물을 제한효소(Hinf I)로 절단한 사진이다.
도 9는 신규 애주름버섯 균주 (Mycena sp. KFRI 1212)와 흰애주름버섯 균주(Mycena osmundicola) ITS 영역의 DNA 염기서열간의 상동성을 비교한 그림이다.

본 발명은 신규 애주름버섯 균주 및 이를 이용한 천마종자의 기내발아방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는 본 발명은 신규한 애주름버섯(Mycena sp.) 균주인 KFRI 1212(KACC93108P)에 관한 것이다.

그리고 본 발명은 신규한 애주름버섯(Mycena sp.) 균주인 KFRI 1212(KACC93108P)를 이용하여 기내발아된 천마 원구경에 관한 것이다.

또한 본 발명은 신규한 애주름버섯(Mycena sp.) 균주 KFRI 1212(KACC93108P)를 이용한 천마종자의 기내발아방법에 관한 것이다.

이하에서 첨부된 도면을 참조한 실시예에 의거하여 구체적으로 설명한다.

[실시예 1] 신규 애주름버섯균의 분리

전남 해남 다산초당 주변에서 채취(도 1 참조)된 신규 애주름버섯의 갓을 페트리 디쉬의 윗 뚜껑 내면에 라놀린(Lanolin, Sigma)으로 붙여 포자를 배지면 위에 직접 낙하시킨다. 부착하는 갓은 버섯의 대가 절개된 상태로 빠르게 건조되기 때문에 단시간 내에 부착하는 것이 바람직하다.

희뿌연 포자문(spore print)을 형성할 때까지(8-10시간) 담자포자를 낙하시킨다. 담자포자를 낙하 시킬 때 배지는 일반적으로 감자한천배지(PDA: Potato Dextros Agar, Difco)를 이용한다.

포자가 낙하한 부위의 배지를 외과용 메스로 약 0.5 x 0.5 cm 크기로 절개하여 새로운 감자한천배지위에 이식시킨다. 분리된 균주는 페트리 디쉬에서 4-5주 동안 생장시킨 후, 균사체의 선단(先端) 부위의 일부를 취해 새로운 배지에 이식하여 계대(繼代) 배양하며 균주를 보존한다.

[실시예 2] 신규 애주름버섯 균주를 이용한 천마종자의 발아

액체 배양용 재료로 사용하기 위해 Potato Dextrose Agar(PDA, Difco; 39 g/l) 배지에 배양중인 흰애주름버섯과 신규 애주름버섯 균사체를 무균적으로 잘게 짤라 250ml의 삼각플라스크에 넣고, 잔나비배지(glucose 25 g/l, yeast extract 2 g/l, glutamic acid 1g/l, thiamine 0.1 g/l, KH₂PO₄ 2 g/l, MgSO₄ 0.5 g/l, disodium dihydrate EDTA 0.2 g/l, MnSO₄ 0.1 g/l) 100ml을 첨가하여, 100rpm으로 27±1 ℃에서 약 3주간 진탕배양 하였다. 배양된 균사체를 호모게나이져로 갈아 낙엽미강 배지(미강:물=1:4)에 접종하여 배양하였다.

천마종자를 포함하고 있는 꼬투리를 화염소독한 후 한천배지(Agar 8 g/l)가 함유된 페트리디쉬(지름 9cm)에 종자를 골고루 털었다. 이때 한 꼬투리당 약 10개의 페트리디쉬에 종자를 살포하고, 흰애주름버섯과 신규 애주름버섯 균주들이 감염된 낙엽미강 배지를 2 x 2 cm로 자른 후 종자가 살포되어 있는 한천배지 중앙에 올려놓았다. 천마종자는 이후 24±1 ℃에서 7주간 암실에서 두 가지 균주들과 공조배양하면서 발아된 천마종자(=원구경)의 수를 비교 확인하였다(도 2 및 도 3 참조).

[실시예 3] 신규 애주름버섯 균주와 흰애주름버섯 균주와의 생장특성 비교

PDA배지에 배양중인 신규 애주름버섯 균사체를 0.8 cm의 크기로 잘라내어 새로운 PDA배지의 중앙에 올려놓은 후 21 ℃, 24 ℃ 및 27 ℃에 배양하여 균사생장을 관찰하였으며, 최적생장온도는 27 ℃인 것으로 나타났다(도 4 참조).

두 균주의 균사체를 0.8 cm의 크기로 잘라내어 새로운 PDA배지의 중앙에 올려놓은 후 3주 동안 두 균주의 생장최적온도인 27 ℃에서 배양하여 균총형성을 관찰하였으며, 흰애주름버섯균의 균총밀도가 훨씬 높고 균총의 색은 흰색이었는데 반해 신균 애주름버섯균주는 균총밀도가 상대적으로 낮고 균총의 색은 약간 회갈색인 것으로 나타났다(도 5 참조).

또한 균사생장속도는 초기(배양 10일 이전)에는 흰애주름버섯이 빨랐지만 후기(배양 10일 이후)에는 신규 애주름버섯균이 빨랐고, 3주간의 배양에 따른 총 생장량은 비슷한 것으로 나타났다(도 6참조).

균주간 품종차이를 구분하는 방법의 일원으로 PDA배지에 배양중인 흰애주름버섯과 신규 애주름버섯 균사체를 0.8 cm의 크기로 잘라내어 새로운 PDA배지에 대칭하게 올려놓은 후 27 ℃ ℃ 대선형성 유무를 관찰하였다(도 7 참조).

[실시예 4] 신규 애주름버섯 균주의 분자유전학적 동정 및 흰애주름버섯균과의 비교

리보좀(ribosome) RNA를 코딩하는 유전자(rRNA)의 일부분인 Internal Transcribed Spacer 영역을 포함하는 DNA 염기서열을 분석하였다. 이 영역은 전 생물에 공통적으로 존재하며, 진화적으로 유사한 미생물의 상관관계 확인 및 동정을 위해 아주 중요한 요인으로 작용하고 있기 때문에, 본 발명의 신규 애주름버섯 균주와 흰애주름버섯 균주에 대한 상기 유전자 영역의 염기서열을 분석하였다.

즉, PDA배지에서 배양한 균사를 원심 분리하여 회수한 후 동결 건조하였다. 여기에 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)를 이용하여 DNA를 추출한 후, PCR을 이용하여 목적하는 유전자영역을 증폭하였다. 증폭된 PCR산물은 제한효소(Hinf I)를 이용하여 절단한 후 밴드의 패턴을 관찰하였다(도 8 참조).

PCR증폭산물들은 TA cloning vector(Real Biotech. Corp.)에 클로닝하고 염기서열을 결정한 후 신규 애주름버섯 균주와 흰애주름버섯균주 ITS 영역의 DNA 염기서열간 상동성을 비교하였다(도 9 참조).

동정된 신규 애주름버섯균주를 Mycena sp. KFRI 1212로 명명하고 2010년 8월 12일 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 수탁보존번호 KACC93108P로 기탁하였다.

이상에서 첨부된 도면을 참조한 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하였다. 그러나 이는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위를 이에 한정하고자 하는 것은 아니고, 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물이 존재한다. 또한 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되고, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

본 발명은 신규 애주름버섯(Mycena sp. KFRI 1212) 균주 및 이를 이용한 천마종자의 기내발아방법에 관한 것으로서, 지금까지 천마종자는 중국에서 연구된 바 있는 흰애주름버섯균주만이 발아시킬 수 있는 것으로 알려져 왔지만 본 발명을 통해 기존 흰애주름버섯균주와는 다른 신규 애주름버섯균주를 이용한 천마종자의 발아가 가능하게 되었다.

따라서 본 발명은 기존 무성번식재배방법에 의한 천마퇴화현상의 극복, 무분별한 야생천마 수집에 의한 국내 천마 유전자원의 감소를 극복할 수 있는 방법의 제공과 더불어 종자를 이용한 천마의 번식 및 재배방법이 상용화될 경우 발생할 수 있는 중국산 흰애주름버섯균주에 대한 로얄티 지불 문제 등을 해결할 수 있다는 장점이 있다. 또한 환경제어가 가능한 기내배양법을 이용함으로써 1년에 한번정도 가능했던 자마수확을 연중생산이 가능하게 만듦으로써, 궁극적으로는 천마생산성의 향상과 재배농가의 소득증대에 기여할 수 있을 것으로 기대되므로 산업상이용가능성이 매우 우수하다고 할 것이다.

농업생명공학연구원

KACC93108

20100812

<110> Korea Forest Research Institute <120> KFRI1212 and in vitro germination method of Gastrodia elata seeds using the KFRI1212 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 839 <212> DNA <213> Mycena sp. (KFRI1212) <400> 1 cttggtcatt tagaggaagt aaaagtcgta acaaggtttc cgtaggtgaa cctgcggaag 60 gatcattgtt gaatagttcg tggtgctgtg ctggcctttc ggggcatgtg cacgcattgc 120 aattatttca ttatcttttt gtgaaccagt gtaggcttgg ttggatctag ttgtgcttcg 180 gcgcatttgg tgaagcccaa gtctatgatt tctataaacc tttgaatgtc tttgaatgtc 240 ttctttattg gccgcaaggc tagtaaaaac tatacaactt tcagcaacgg atctcttggc 300 tctcccatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc agaattcagt 360 gaatcatcga atctttgaac gcaccttgcg ccctttggta ttccgaaggg catgcttgtt 420 tgagtgtcat taaattctca aaacctttgg atttgttttc aaaggcttct ggatgtgagg 480 gtttgctggc ttcctttagt ggcggtctgc tccctttaaa tgcattagtg gattcctttg 540 tggacgagtc acttggtgtg ataatctatc tacgccttat ctctctgaag caaaacctat 600 gggagcccgc tcataaccgt cttgtaacga gacaactttt gaccatttga cctcaaatca 660 agtaggacta cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg aggaaaagaa actaacaagg 720 attcccctag taactgcgag tgaagcggga aaagctcaaa tttaaaatct ggcggtttca 780 ccgtccgagt tgtaatttag agaagtgtta cccgtgctgg accgtgtaca agtctcctg 839

Claims

신규한 애주름버섯(Mycena sp.) 균주인 KFRI 1212(KACC93108P).
신규한 애주름버섯(Mycena sp.) 균주인 KFRI 1212(KACC93108P)를 이용하여 기내발아된 원구경.
신규한 애주름버섯(Mycena sp.) 균주 KFRI 1212(KACC93108P)를 이용한 천마종자의 기내발아방법.
제3항에 있어서, 상기 천마종자의 기내발아방법은 (1)잔나비배지(glucose 25 g/l, yeast extract 2 g/l, glutamic acid 1g/l, thiamine 0.1 g/l, KH₂PO₄ 2 g/l, MgSO₄ 0.5 g/l, disodium dihydrate EDTA 0.2 g/l, MnSO₄ 0.1 g/l)를 이용하여 신규한 애주름버섯 균주(Mycena sp.)인 KFRI 1212(KACC93108P)를 제1차 배양하는 단계; (2)상기 제1차 배양된 균주를 낙엽미강 배지(미강:물=1:4)에 접종하여 제2차 배양하는 단계; (3)천마종자를 포함하고 있는 꼬투리를 화염소독한 후 한천배지(Agar 8 g/l)가 함유된 페트리디쉬에 종자를 살포하는 단계; (5)상기 신규한 애주름버섯 균주 KFRI 1212(KACC93108P)가 감염된 낙엽미강 배지를 2 x 2 cm로 자른 후, 천마종가가 살포된 상기 한천배지의 중앙에 올려놓는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 천마종자의 기내발아방법.