KR20120024176A - 초고압 재결정화 방법을 이용하여 약용식물로부터 활성물질을 분리, 정제하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 약용식물로부터 초고압 재결정화를 이용하여 식물 내에 존재하는 활성물질을 분리, 정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

초고압 재결정화 방법을 이용하여 약용식물로부터 활성물질을 분리, 정제하는 방법{Method for separation and purification of active material from medicinal plant by ultra high pressure recrystallization}
본 발명은 천연에 존재하는 약용식물로부터 선택적인 추출?분리 공정을 통하여 초고압 재결정화를 이용하여 식물 내에 존재하는 활성물질을 높은 수율과 높은 지표 성분함량으로 분리?정제하는 방법에 관한 것이다.
천연에 존재하는 약용식물에는 각기 다른 약리작용을 나타내는 수많은 활성물질이 내재되어 있으며, 그 종류 또한 플라보노이드, 플라보놀, 페놀, 아미노산, 리그난, 알칼로이드, 카테킨 화합물 등 다양하다. 인체 내에서 유용하게 작용하는 활성물질의 우수한 효과를 입증하기 위해서는 장기간의 연구가 필요하고, 식품, 의약품, 화장품 등의 산업에 응용하기 위해서는 많은 양의 활성성분의 분리가 요구되며, 경제적이고 생산성이 뛰어난 활성성분의 고순도 분리정제 기술 개발이 요구된다. 하지만 현재까지 천연 약용식물들에 포함되어 있는 활성물질을 지표성분수준으로 분리정제하는 기술은 실리카겔 매질 등의 다공성 극성물질을 충진한 컬럼 크로마토그래피로 분리하는 기술과 Prep-HPLC (High Perpomance Liquid Chromatography)를 이용하여 분획을 통해 분리하는 방법 등 크로마토그래피를 이용한 방법에 국한되어 있다.
대한민국 공개특허 특2002-0011553호는 헥산-에틸아세테이트를 기울기 용출용매로 이용하여 실라카겔 컬럼 크로마토그래피(Silicagel column chromatography)를 수행하여 플라보노이드 화합물을 분리 제조하는 방법을 제시하였고, 대한민국 공개특허 특2002-0090672호는 실리카겔에 메칠렌클로라이드에 녹인 활성물질을 흡착시킨 후 용매 기울기 용리법을 이용하여 일차적으로 활성물질을 분리한 후 박막 크로마토그래피를 이용하여 몇 가지 분획으로 나누어 최종적으로 HPLC를 이용하여 순수한 화합물을 정제하는 방법을 제시하였다.
상기 컬럼 크로마토그래피를 이용한 분리정제 방법들은 미량성분을 분리하는 공정에 있어 생산단가가 높아지고 수율이 낮으며, 생산시간이 오래 걸린다는 문제점이 있으며 다량의 유기용매를 사용하여 의약품, 식품 제조상 안전성의 문제를 발생시키는 문제가 있다. 이러한 유기용매로부터 인체에 대한 안정성이 보장되고 경제적이며 생산성이 높은 천연물에서의 유효성분의 분리 방법이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 컬럼 크로마토그래피를 이용한 분리 정제 공정을 개선시키려 거듭 노력한 결과, 기존의 크로마토그래피법을 이용하지 않고도 선택도(selectivity) 및 기타 요인(factor)을 이용하여 초고압 조건 아래에서 재결정화 방법을 이용하여 약용식물로부터 유용한 활성물질을 대량 분리하고 고순도로 선별적으로 정제할 수 있음을 확인하였으며 이에 본 발명을 완성하였다.
초고압 추출이란 물리적으로 100MPa(1,000atm)를 상회하는 압력을 가하여 추출하는 기술을 뜻하며, 바다 속 10,000m의 압력 하에 물질을 추출하는 것과 같은 효과를 가지는 추출방법으로, 기존의 전통적인 열수 추출, 초음파 추출, 환류 추출 등의 추출방법은 추출 수율이 낮고, 에너지 소비가 많으며, 열로 인한 유용성분의 파괴 및 단백질 변성, 성분의 손실, 열에 대한 불안정성, 색상 변화 등의 단점이 있는데 반하여, 초고압 추출은 추출 수율이 높고, 유용성분의 파괴가 적으며, 색상변화, 불쾌취가 적다는 등의 장점을 갖는 유용한 추출방법이라 할 수 있다[High pressure processing of foods, Christopher J. Doona et al., Blackwell publishing]. 이러한 초고압 추출방법은 상기와 같이 추출기술 중 유용한 방법으로 알려져 있지만, 초고압을 이용한 재결정화 방법으로 천연물로부터 활성물질을 추출하는 기술은 어떠한 연구결과나 특허에서도 찾아볼 수 없다.
본 발명은 상기한 바와 같은 약용식물에서 활성물질을 분리, 정제하는 종래 방법의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명자들은 압력 변화를 이용하여 순수한 활성물질을 대량 재결정화함으로써 분리 정제하는 방법을 제공하려는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 약용식물로부터 활성성분을 추출, 농축한 후 초고압 처리하여 압력의 변화에 의해 평형상수가 변하고 용해도가 작아진 상태에서 재결정화시켜 활성성분이 석출되도록 하는 것을 특징으로 하는 약용식물로부터 초고압 재결정화를 이용하여 활성성분을 고순도로 분리정제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 활성물질을 포함하는 약용식물에 초고압을 가하여 활성물질을 석출시킴으로써 재결정화하여 활성물질을 분리, 정제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 분리, 정제 방법이
(a) 건조, 세절된 약용식물에 용매를 가하여 활성성분을 추출하는 공정;
(b) 활성성분이 용출된 용액으로부터 파우더를 수득하는 공정;
(c) 수득된 파우더에 2종 이상의 용매를 가하여 분획을 실시하는 공정; 및
(d) 활성성분이 포함된 분획에 50~1,000MPa의 초고압을 가하여 활성성분을 재결정화하는 공정;을 포함하는 것을 특징으로 한다. 압력이 50MPa 미만이면 활성성분이 재결정화되기 어려우며, 1,000MPa를 초과하면 압력을 높이는데 많은 에너지가 소요되므로 비경제적이다. 상기 파우더 수득 공정은 감압 농축 등 본 발명이 속하는 기술분야에서 보통의 지식을 가진 자에게 알려진 다양한 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 (c) 공정 이후 (d) 공정 이전에 활성성분이 포함된 분획에 용매를 가하고 분산시키는 공정;이 추가됨을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 (d) 공정 이후 재결정화된 활성성분을 추가 정제, 분리하는 방법을 추가하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 방법을 이용하여 녹차로부터 활성물질 테아닌(Theanine)을 분리, 정제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법을 이용하여 레몬버베나로부터 활성물질 액티오사이드 및 아이소액티오사이드 중 1종 이상을 분리, 정제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법을 이용하여 지황으로부터 활성물질 액티오사이드를 분리, 정제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법을 이용하여 소나무 뿌리로부터 활성물질 택시폴린-3-글루코사이드를 분리, 정제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법을 이용하여 호장근으로부터 활성물질 레스베라톨을 분리, 정제하는 방법을 제공한다.
상기 방법에서 용매는 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸 에테르, 클로로포름, 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 용매 사용한다.
본 발명은 약용식물 유래 활성물질을 초고압 조건 하에 재결정화시킴으로써 추출에 소요되는 비용, 시간 등을 절감하면서도 종래 재결정화 방법에 비하여 현저히 높은 수율로 활성물질을 얻을 수 있다.
도 1은 L-테아닌 표준물질과 본 발명 실시예에 따라 녹차로부터 분리한 테아닌의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 2는 L-테아닌 표준물질과 본 발명 실시예에 따라 녹차로부터 분리한 테아닌의 UV-스펙트럼을 나타낸다.
도 3은 액티오사이드 표준물질과 본 발명 실시예에 따라 레몬버베나 잎으로부터 분리한 액티오사이드의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 4는 액티오사이드 표준물질과 본 발명 실시예에 따라 레몬버베나 잎으로부터 분리한 액티오사이드의 UV-스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 액티오사이드 표준물질과 본 발명 실시예에 따라 지황으로부터 분리한 액티오사이드의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 6은 액티오사이드 표준물질과 본 발명 실시예에 따라 지황으로부터 분리한 액티오사이드의 UV-스펙트럼을 나타낸다.
도 7은 택시폴린-3-글루코사이드 표준물질과 본 발명 실시예에 따라 소나무 뿌리로부터 분리한 택시폴린-3-글루코사이드의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 8은 택시폴린-3-글루코사이드 표준물질과 본 발명 실시예에 따라 소나무 뿌리로부터 분리한 택시폴린-3-글루코사이드의 UV-스펙트럼을 나타낸다.
도 9는 레스베라톨 표준물질과 본 발명 실시예에 따라 호장근으로부터 분리한 레스베라톨의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 10은 레스베라톨 표준물질과 본 발명 실시예에 따라 호장근으로부터 분리한 레스베라톨의 UV-스펙트럼을 나타낸다.
이하에서 본 발명의 이해를 돕기 위해 실시예, 비교예, 시험예 등의 구체적인 예를 들어 본 발명의 구성을 자세히 설명한다. 그러나 본 발명이 하기의 실시예기재 범위로 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하며, 본 발명의 범위 내에서 당업자의 통상적인 변화가 가능하다.
<녹차로부터 테아닌의 분리정제>
[ 실시예 1] 열수 추출 후 폐기 녹차잎 추출물 제조
건조된 녹차잎 10g에 정제수를 90g 첨가한 후 수조(HB-205WP, Hanbaek, Korea)를 이용하여 60℃ 조건으로 1시간 동안 열수 처리하였다. 그 후 80메시 필터와 1.2um 필터를 이용, 여과하여 열수 추출 후 폐기되는 녹차잎을 얻었다. 수득된 폐기 녹차잎에 95% 에탄올을 90g 투입하고, 상온에서 4시간 동안 침지 추출하여 1.2um 필터를 통과시킨 후 추출여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 65℃, 20hPa, 1시간 동안 농축을 실시하여 농축물을 얻었다. 이 농축물에 10g의 정제수를 첨가하여 조 용해 후 99% 에탄올을 500g 투입하였고, 초고압장치(TFS-2L, TOYO KOATSU CO., LTD., Japan)를 이용하여 50~100MPa, 5~25℃ 하에 1시간 동안 초고압을 가한 결과 용액 내에 결정이 석출되었다. 결정이 포함된 용액을 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000rpm, 15℃ 조건으로 15분간 원심분리하고, 1.2um 필터로 여과를 수행하여 펠렛을 수득하였다. 이를 하기 시험예에서 시료로 사용하였다.
[ 실시예 2] 녹차잎 추출물 제조
건조된 녹차잎 10g에 99 % 에탄올을 90g 첨가 후 상온에서 2시간 동안 침지 추출하였다. 그 후 80메시 필터와 1.2um 필터로 여과하여 남은 박을 얻은 후 남은 박에 다시 99% 에탄올 90g을 첨가하여 2시간 동안 침지 추출하고 남은 박을 얻었다. 이렇게 하여 최대한 카테킨 및 카페인 성분들을 제거한 후 남은 박을 이용하여 정제수 50g을 투여하여 균질교반기(homodisper)를 이용하여 2000rpm, 20℃ 조건으로 30분간 교반하여 에탄올로 인해 응고된 표면을 완화시킨 후 70% 에탄올을 50g 투여하여 균질교반기를 이용하여 2000rpm, 20℃ 조건으로 30분간 교반한 후 1.2um 필터로 통과시켜 추출여액을 얻었다. 이를 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)로 65℃, 20hPa 조건에서 1시간 동안 농축하여 농축물을 얻었다. 이 농축물에 10g의 정제수를 첨가하여 조 용해 후 99% 에탄올 500g을 투입하여 초고압장치(TFS-2L, TOYO KOATSU CO., LTD., Japan)를 이용하여 50~100MPa, 5~25℃ 조건으로 1시간 동안 초고압을 가한 결과 용액 내에 결정이 석출되었다. 결정이 포함된 용액을 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000rpm, 15℃ 조건으로 15분간 원심분리하고, 1.2um 필터로 여과를 수행하여 펠렛을 수득하였다. 이를 하기 시험예에서 시료로 사용하였다.
[ 비교예 1] 열수 추출 후 폐기 녹차잎 추출물 제조
건조된 녹차잎 10g에 정제수를 90g 첨가한 후 수조(HB-205WP, Hanbaek, Korea)를 이용하여 60℃ 조건으로 1시간 동안 열수 처리하였다. 그 후 80메시 필터와 1.2um 필터를 이용, 여과하여 열수 추출 후 폐기되는 녹차잎을 얻었다. 수득된 폐기 녹차잎에 95% 에탄올을 90g 투입, 상온에서 4시간 동안 침지 추출하여 1.2um 필터를 통과시킨 후 추출여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)로 65℃, 20hPa 조건으로 1시간 동안 농축하여 농축물을 얻었다. 이 농축물에 10g의 정제수를 첨가하여 조 용해 후 99% 에탄올을 500g 투입하였고, 5~25℃에서 1시간 방치하여 재결정화하였다. 이를 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)로 8,000rpm, 15℃ 조건으로 15분간 원심분리하고, 1.2um 필터로 여과를 수행하여 ㅍ펠렛을 수득하였다. 이를 하기 시험예에서 사용하였다.
[ 비교예 2] 녹차잎 추출물 제조
건조된 녹차잎 10g에 99% 에탄올을 90g 첨가 후 상온에서 2시간 동안 침지 추출하였다. 그 후 80메시 필터와 1.2um 필터를 이용하여, 여과하고 남은 박을 얻은 후 남은 박에 다시 99% 에탄올 90g을 첨가하여 2시간 동안 침지 추출하고 남은 박을 얻었다. 이렇게 하여 최대한 카테킨 및 카페인 성분들을 제거한 후 남은 박에 정제수 50g을 투여하여 균질교반기(homodisper)를 이용하여 2000rpm, 20℃ 조건으로 30분간 교반하여 에탄올로 인해 응고된 표면을 완화시킨 후 70% 에탄올을 50g 투여하여 균질교반기로 2000rpm, 20℃ 조건으로 30분간 교반한 후 1.2um 필터를 통과시켜 추출여액을 얻었다. 65℃, 20hPa 조건에서 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 1시간 동안 농축을 실시하여, 농축물을 얻었다. 이 농축물에 10g의 정제수를 가하여 조 용해 후 99% 에탄올을 500g 투입, 5~25℃에서 1시간 방치하여 재결정화하였다. 이를 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)로 8,000rpm, 15℃ 조건 하에 15분간 원심분리하고, 1.2um 필터로 여과를 수행하여 펠렛을 수득하였다. 이를 하기 시험예에서 시료로 사용하였다.
[ 시험예 1] 펠렛 수득율 산출
상기와 같이 얻어진 각 시료를 이용하여 수득율을 산출하였다. 녹차잎에서의 테아닌(theanine) 함량(1%) 대비 재결정화되는 테아닌 함유 펠렛의 수득량을 산출하여 수득율(%)을 나타내었다. 상기 각 실시예 및 비교예는 압력과 온도를 여러 가지로 변형시킨 조건에서 수행하였다.
조건 수득율
(%)
비교예 1
(열수 추출 후 폐기 녹차잎)		 1atm(25℃, 1h) 1.2
1atm(5℃, 1h) 2.7
비교예 2
(일반 녹차잎)		 1atm(25℃, 1h) 1.4
1atm(5℃, 1h) 3.1
실시예 1
(열수 추출 후 폐기 녹차잎)		 50MPa(25℃, 1h) 12.6
50MPa(5℃, 1h) 14.7
100MPa(25℃, 1h) 21.8
100MPa(5℃, 1h) 26.4
실시예 2
(일반 녹차잎)		 50MPa(25℃, 1h) 25.4
50MPa(5℃, 1h) 30.2
100MPa(25℃, 1h) 41.5
100MPa(5℃, 1h) 45.2
상기 표1의 결과와 같이, 비교예에서 상온, 저온 침지로 제조한 재결정화 시료의 경우 수득율이 적었고, 실시예의 초고압을 이용한 재결정화 시료의 경우 같은 시간 대비 수득율이 증가하였다. 또한 열수 추출 후 폐기되는 녹차잎을 이용하여 초고압 재결정화로 제조한 시료는 일반 녹차잎으로 초고압 재결정화한 시료보다는 적지만, 일반 상온, 저온 침지방법으로 제조한 어떤 시료보다 비약적으로 수득율이 상승함을 알 수 있었다.
[시험예 2] HPLC 분석을 통한 테아닌 정량분석
상기 실시예 및 비교예를 통해 분리,정제한 펠렛의 테아닌 정량분석을 위하여 HPLC(High pressure liquid chromatography)를 이용해 분석을 수행하였다. 시료는 각 용매로 적당 농도를 제조하여 0.2um 필터에 여과, 전처리 후 기기에 주입하였다. 기기는 HPLC(Agilent 1200series system, Agilent, USA)를 사용하여 UV 탐지기를 이용, 205nm 영역에서 분석하였으며, C18 컬럼(Zorbax XDB-C18 4.6 x 250mm, Agilent, USA)을 사용하여 0.1 % TFA(in DW) 용매와 메탄올 용매를 사용한 기울기 용법으로 분석하였다. 분석에 사용된 용매는 HPLC급 시약을 사용하였으며, 표준 물질로는 테아닌(L-Theanine >99.5%, Sigma, USA)을 사용하여 성분분석을 수행하였다. 분석 결과는 [표 2] 및 [도 1]과 같으며, 스펙트럼 분석 결과는 [도 2]와 같다.
조건 테아닌 수율(%) 테아닌 피크
스펙트럼 분석
(Max Abs., nm)
비교예1
(열수 추출 후 폐기 녹차잎)		 1atm (25℃, 1h) 1.9 200
1atm (2℃, 1h) 2.2 200
비교예2
(일반 녹차잎)		 1atm (25℃, 1h) 2.3 200
1atm (2℃, 1h) 2.1 200
실시예1
(열수 추출 후 폐기 녹차잎)		 50MPa (25℃, 1h) 70.1 200
50MPa (2℃, 1h) 69.4 200
100MPa (25℃, 1h) 71.5 200
100MPa (2℃, 1h) 73.4 200
실시예2
(일반 녹차잎)		 50MPa (25℃, 1h) 70.5 200
50MPa (2℃, 1h) 68.9 200
100MPa (25℃, 1h) 71.1 200
100MPa (2℃, 1h) 72.8 200
상기 표 2의 결과와 같이, 비교예로서 상온, 저온 침지로 제조한 재결정화 시료의 경우 테아닌의 함량이 적었고, 본 발명 실시예인 초고압을 이용한 재결정화 시료의 경우 테아닌의 함량이 현저히 증가하였다. 또한, 본 발명의 방법을 이용한 결과 열수 추출 후 폐기되는 녹차잎을 이용하여 초고압 재결정화한 시료도 일반 녹차잎으로 초고압 재결정화한 시료와 동일한 약 70% 정도의 높은 수율을 나타내었다.
{ 레몬버베나로부터 액티오사이드 및 아이소액티오사이드의 분리정제}
[ 실시예 3] 레몬버베나 추출물 제조
건조된 레몬버베나 잎 10g에 70% 에탄올을 90g 첨가 후 냉각 콘덴서가 달린 환류장치를 이용하여 80℃ 가온 조건으로 2시간 동안 환류 처리하였다. 그 후 80메시 필터와 1.2um 필터를 이용, 여과하여 추출 여액을 얻었다. 수득된 추출 여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)로 65℃, 20hPa 조건 하에서 1시간 동안 농축하여 농축물을 얻었다. 이 농축물에 50g의 정제수를 첨가하여 조 용해 후 n-헥산(Hexane)을 50g 투입하여 분획하였고, 분획 후 정제수 층에 EtOAc, BuOH를 차례로 분획하여 최종적으로 BuOH 층을 수득하였다. 그 후, 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 65℃, 20hPa 조건으로 1시간 동안 농축하여 농축파우더를 얻었다. 10g의 정제수를 가하고 초고압장치(TFS-2L, TOYO KOATSU CO., LTD., Japan)를 이용하여 50~100 MPa, 25℃ 조건으로 1시간 동안 초고압을 가한 결과 용액 내에 결정이 석출되었다. 결정이 포함된 용액을 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000rpm, 15℃ 조건으로 15분간 원심분리하고, 1.2um 필터로 여과를 수행하여 펠렛을 수득하였다. 이를 하기 시험예에서 시료로 사용하였다.
[ 비교예 3] 레몬버베나 추출물 제조
건조된 레몬버베나 잎 10g에 70% 에탄올을 90g 첨가 후 냉각 콘덴서가 달린 환류장치를 이용하여 80℃ 가온 조건으로 2시간 동안 환류 처리하였다. 그 후 80메시 필터와 1.2um 필터를 이용, 여과하여 추출 여액을 얻었다. 수득된 추출 여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)로 65℃, 20hPa 조건으로 1시간 동안 농축하여 농축물을 얻었다. 이 농축물에 50g의 정제수를 첨가하여 조 용해 후 n-헥산(Hexane)을 50g 투입하여 분획하였고, 분획 후 정제수 층에 EtOAc, BuOH를 차례로 분획하여 최종적으로 BuOH 층을 수득하였다. 그 후, 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)로 65℃, 20hPa 조건 하에 1시간 동안 농축을 실시하여 농축파우더를 얻었다. 10g의 정제수를 농축파우더에 가하고 25℃에서 1시간 동안 침지하여 재결정화 처리하였다. 이를 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)로 8,000rpm, 15℃ 조건으로 15분간 원심분리하고, 1.2um 필터로 여과하여 펠렛을 수득하였다. 이를 하기 시험예에서 시료로 사용하였다.
[ 시험예 3] 펠렛 수득율 산출
상기와 같이 얻어진 실시예 3 및 비교예 3의 시료를 이용하여 수득율을 산출하였다. 투입된 레몬버베나 잎의 중량 대비 재결정화되는 펠렛의 수득량을 산출하여 수득율(%)을 나타내었으며, 상기 실시예 3은 압력조건을 달리하여 실시하였다.
조건 수득율
(%)
비교예 3
(레몬버베나 잎)		 1atm(25℃, 1h) 0.3
실시예 3
(레몬버베나 잎)		 50MPa(25℃, 1h) 7.2
100MPa(25℃, 1h) 6.4
상기 표 3의 결과와 같이, 비교예에서 일반 침지로 제조한 재결정화 시료의 경우 수득율이 매우 낮았고, 본 발명 실시예에서 초고압을 이용한 재결정화 시료의 경우 같은 시간 대비 수득율이 비약적으로 증가하였다.
[시험예 4] HPLC 분석을 통한 액티오사이드 및 아이소액티오사이드의 정량분석
상기 실시예 3을 통해 분리 정제한 펠렛의 액티오사이드(acteoside) 및 아이소액티오사이드(Isoacteoside)의 정량분석을 위하여 HPLC를 이용하였다. 시료는 각 용매로 적당 농도를 제조 하여 0.2um 필터에 여과, 전처리 후 기기에 주입하였다. 기기는 HPLC(Agilent 1200series system, Agilent, USA)와 UV 탐지기(detector)를 이용, UV 전영역에서 분석하였으며, C18 컬럼(Zorbax XDB-C18 4.6 x 250mm, Agilent, USA)을 사용하여 2% 아세트산(in DW) 용매와 아세토나이트릴(Acetonitrille) 용매를 사용한 기울기 용법으로 분석하였다. 분석에 사용된 용매는 HPLC급 시약을 사용하였으며, 표준 물질로는 액티오사이드(Acteoside, >99%, Chromadex, USA)와 아이소액티오사이드(Isoacteoside, >98%, Chromadex, USA)를 사용하였다. 분석 결과는 [표 4], [도 3]과 같으며, 스펙트럼 분석 결과는 [도 4]와 같다.
조건 액티오사이드
(w/w%)		 아이소액티오사이드
(w/w%)
비교예 3
(레몬버베나 잎)		 1 atm (25℃, 1h) 12.2 1.3
실시예 3
(레몬버베나 잎)		 50MPa (25℃, 1h) 76.4 5.4
100MPa (25℃, 1h) 76.2 6.3
상기 표 4와 같이, 비교예로서 침지하여 제조한 재결정화 시료의 경우 액티오사이드 및 아이소액티오사이드의 함량이 적었고, 본 발명의 실시예로서 초고압을 이용한 재결정화 시료의 경우 액티오사이드 및 아이소액티오사이드의 함량이 현저히 증가하였다.
{지황으로부터 액티오사이드의 분리 정제}
[ 실시예 4] 지황 추출물 제조
건조된 지황 10g에 70% 에탄올을 90g 첨가 후 냉각 콘덴서가 달린 환류장치를 이용하여 80℃ 가온조건으로 2시간 동안 환류 처리하였다. 그 후 80메시 필터와 1.2um 필터를 이용, 여과하여 추출 여액을 얻었다. 수득된 추출 여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)로 65℃, 20 hPa 조건에서 1시간 동안 농축하여 농축물을 얻었다. 이 농축물에 50g의 정제수를 첨가하여 조 용해 후 n-헥산(Hexane)을 50g 투입하여 분획하였고, 분획 후 정제수 층에 EtOAc, BuOH를 차례로 분획하여 최종적으로 BuOH 층을 수득하였다. 그 후, 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)로 65℃, 20hPa 조건에서 1시간 동안 농축하여 농축파우더를 얻었다. 10g의 정제수를 농축파우더에 가하고 25℃에서 1시간 동안 초고압장치(TFS-2L, TOYO KOATSU CO., LTD., Japan)로 50~100MPa의 초고압을 가한 결과 용액 내에 결정이 석출되었다. 결정이 포함된 용액을 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)로 8,000rpm, 15℃ 조건 하에 15분간 원심분리하고, 1.2um 필터로 여과를 수행하여 펠렛을 수득하였다. 이를 하기 시험예에서 시료로 사용하였다.
[ 비교예 4] 지황 추출물 제조
건조된 지황 10g에 70% 에탄올을 90g 첨가 후 냉각 콘덴서가 달린 환류장치를 이용하여 80℃ 가온 조건으로 2시간 동안 환류 처리하였다. 그 후 80메시 필터와 1.2um 필터를 이용, 여과하여 추출 여액을 얻었다. 수득된 추출 여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)로 65℃, 20hPa 조건 하에서 1시간 동안 농축하여 농축물을 얻었다. 이 농축물에 50g의 정제수를 첨가하여 조 용해 후 n-헥산을 50g 투입하여 분획하였고, 분획 후 정제수 층에 EtOAc, BuOH를 차례로 분획하여 최종적으로 BuOH 층을 수득하였다. 그 후, 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 65℃, 20hPa 조건으로 1시간 동안 농축하여 농축파우더를 얻었다. 농축파우더에 10g의 정제수를 첨가하여 25℃에서 1시간 침지하여 재결정화 처리하였다. 이를 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000rpm, 15℃ 조건으로 15분간 원심분리하고, 1.2um 필터로 여과하여 펠렛을 얻었다. 이를 하기 시험예에서 시료로 사용하였다.
[ 시험예 5] 펠렛 수득율 산출
상기와 같이 얻어진 실시예 4와 비교예 4의 시료에 대하여 수득율을 산출하였다. 투입된 지황의 중량 대비 재결정화되는 펠렛의 수득량을 산출하여 수득율 (%)을 나타내었으며, 실시예 4는 압력 조건을 달리 하여 실시하였다.
조건 수득율
(%)
비교예 4
(지황)		 1 atm (25℃, 1h) 0.1
실시예 4
(지황)		 50MPa (25℃, 1h) 2.3
100MPa (25℃, 1h) 2.7
상기 표 5의 결과와 같이, 비교예로 침지하여 제조한 재결정화 시료의 경우 수득율이 낮았고, 실시예 4와 같이 초고압을 이용한 재결정화 시료의 경우 같은 시간 대비 수득율이 비약적으로 증가하였다.
[시험예 6] HPLC 분석을 통한 액티오사이드의 정량분석
상기 실시예 4와 같이 분리 정제한 펠렛의 액티오사이드 정량분석을 위하여 HPLC를 이용하였다. 시료는 각 용매로 적당 농도를 제조하여 0.2um 필터로 여과, 전처리 후 기기에 주입하였다. 기기는 HPLC(Agilent 1200series system, Agilent, USA)와 UV 탐지기를 이용, UV 전영역에서 분석하였으며, C18 컬럼(Zorbax XDB-C18 4.6 x 250mm, Agilent, USA)을 사용하여 2% 아세트산(in DW) 용매와 아세토나이트릴(Acetonitrille) 용매를 사용한 기울기 용법으로 분석하였다. 분석에 사용된 용매는 HPLC급 시약을 사용하였으며, 표준물질로는 액티오사이드(>99%, Chromadex, USA)를 사용하였다. 분석결과는 [표 6], [도 5]와 같으며, 스펙트럼 분석 결과는 [도 6]과 같다.
조건 액티오사이드
(%)		 액티오사이드 피크 스펙트럼 분석
(Max Abs., nm)
비교예 4
(지황)		 1 atm (25℃, 1h) 7.4 330
실시예 4
(지황)		 50MPa (25℃, 1h) 65.3 330
100MPa (25℃, 1h) 66.7 330
상기 표 6과 같이, 비교예로 침지 제조한 재결정화 시료의 경우 액티오사이드의 함량이 적었고, 실시예 4와 같이 초고압을 이용한 재결정화 시료의 경우 액티오사이드 함량이 현저히 증가하였다.
{소나무 뿌리로부터 탁시폴린 -3- 글루코사이드 분리정제}
[ 실시예 5] 소나무 뿌리 추출물 제조
건조된 소나무 뿌리 10g에 70% 에탄올을 90g 첨가 후 냉각 콘덴서가 달린 환류장치를 이용하여 80℃ 가온 조건으로 2시간 동안 환류 처리하였다. 그 후 80메시필터와 1.2um 필터를 이용, 여과하여 추출 여액을 얻었다. 수득된 추출 여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)로 65℃, 20hPa 조건으로 1시간 동안 농축을 실시하여 농축물을 얻었다. 이 농축물에 50g의 정제수를 첨가하여 조 용해 후 n-헥산을 50g 투입하여 분획하였고, 분획 후 정제수 층에 EtOAc, BuOH를 차례로 분획하여 최종적으로 EtOAc 층을 수득하였다. 그 후, 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)로 65℃, 20hPa 조건으로 1시간 동안 농축하여 농축파우더를 얻었다. 농축파우더에 10g의 정제수를 첨가하고, 25℃에서 1시간 동안 초고압장치(TFS-2L, TOYO KOATSU CO., LTD., Japan)로 50~100MPa의 초고압을 가한 결과 용액 내에 결정이 석출되었다. 결정이 포함된 용액을 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000rpm, 15℃ 조건으로 15분간 원심분리하고, 1.2um 필터로 여과를 수행하여 펠렛을 수득하였다. 이를 하기 시험예에서 시료로 사용하였다.
[ 비교예 5] 소나무 뿌리 추출물 제조
건조된 소나무 뿌리 10g에 70% 에탄올을 90g 첨가한 다음 냉각 콘덴서가 달린 환류장치를 이용하여 80℃ 가온 조건으로 2시간 동안 환류 처리하였다. 그 후 80메시 필터와 1.2um 필터를 이용, 여과하여 추출 여액을 얻었다. 수득된 추출 여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)로 65℃, 20hPa 조건에서 1시간 동안 농축하여 농축물을 얻었다. 이 농축물에 50g의 정제수를 첨가하여 조 용해 후 n-헥산을 50g 투입하여 분획하였고, 분획 후 정제수 층에 EtOAc, BuOH를 차례로 분획하여 최종적으로 EtOAc 층을 수득하였다. 그 후, 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)로 65℃, 20hPa 조건에서 1시간 동안 농축하여 농축파우더를 얻었다. 농축파우더에 10g의 정제수를 첨가하고, 25℃에서 1시간 침지하여 재결정화 처리하였다. 이를 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)로 8,000rpm, 15℃ 조건으로 15분간 원심분리하고, 1.2um 필터로 여과하여 펠렛을 얻었다. 이를 하기 시험예에서 시료로 사용하였다.
[ 시험예 7] 펠렛 수득율 산출
상기와 같이 얻어진 각 시료를 이용하여 수득율을 산출하였다. 투입된 소나무 뿌리 중량 대비 재결정화되는 펠렛의 수득량을 산출하여 수득율(%)을 나타내었으며, 실시예 5는 압력을 달리 하여 수행하였다.
조건 수득율
(%)
비교예 5
(소나무 뿌리)		 1 atm (25℃, 1h) 0.01
실시예 5
(소나무 뿌리)		 50MPa (25℃, 1h) 1.5
100MPa (25℃, 1h) 2.2
상기 표 7과 같이, 비교예로 침지로 제조한 재결정화 시료의 경우 수득율이 낮았고, 실시예 5와 같이 초고압을 이용한 재결정화 시료의 경우 같은 시간 대비 수득율이 비약적으로 증가하였다.
[시험예 8] HPLC 분석을 통한 택시폴린-3-글루코사이드의 정량분석
상기 실시예 5를 통해 분리 정제한 펠렛의 택시폴린-3-글루코사이드(taxifolin-3-glucoside)의 정량분석을 위하여 HPLC를 수행하였다. 시료는 각 용매로 적당 농도로 제조하여 0.2um 필터에 여과, 전처리 후 기기에 주입하였다. 기기는 HPLC(Agilent 1200series system, Agilent, USA)를 사용하여 UV 탐지기를 이용, UV 전영역에서 분석하였으며, C18 컬럼(Zorbax XDB-C18 4.6 x 250mm, Agilent, USA)을 사용하여 2% 아세트산(in DW) 용매와 아세토나이트릴 용매를 사용한 기울기 용법으로 분석하였다. 분석에 사용된 용매는 HPLC급 시약을 사용하였으며, 표준 물질로는 택시폴린-3-글루코사이드(>99%, Huisong, China)를 사용하여 성분 분석을 수행하였다. 분석 결과는 [표 8], [도 7]과 같으며, 스펙트럼 분석 결과는 [도 8]과 같다.
조건 택시폴린-3-글루코사이드(%) 택시폴린-3-글루코사이드
피크 스펙트럼 분석
(Max Abs., nm)
비교예 5
(소나무 뿌리)		 1 atm (25℃, 1h) 2.4 289
실시예 5
(소나무 뿌리)		 50MPa (25℃, 1h) 76.8 289
100MPa (25℃, 1h) 78.1 289
상기 표 8과 같이, 비교예로 침지하여 제조한 재결정화 시료의 경우 택시폴린-3-글루코사이드의 함량이 적었고, 실시예 5와 같이 초고압을 이용한 재결정화 시료의 경우 택시폴린-3-글루코사이드의 함량이 현저히 증가하였다.
{ 호장근으로부터 레스베라톨의 분리, 정제}
[ 실시예 6] 호장근 추출물 제조
건조된 호장근 10g에 70% 에탄올을 90g 첨가 후 냉각 콘덴서가 달린 환류장치를 이용하여 80℃ 가온 조건으로 2시간 동안 환류 처리하였다. 그 후 80메시 필터와 1.2um 필터로 여과하여 추출 여액을 얻었다. 수득된 추출 여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)로 65℃, 20hPa 조건에서 1시간 동안 농축하여 농축물을 얻었다. 이 농축물에 50g의 정제수를 첨가하여 조 용해 후 n-헥산을 50g 투입하여 분획하였고, 분획 후 정제수층에 EtOAc, BuOH를 차례로 분획하여 최종적으로 EtOAc 층을 수득하였다. 그 후, 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)로 65℃, 20hPa 조건에서 1시간 동안 농축하여 농축파우더를 얻었다. 농축파우더에 20g의 20% 에탄올을 가하고, 25℃에서 1시간 동안 초고압장치(TFS-2L, TOYO KOATSU CO., LTD., Japan)로 50~100MPa의 초고압을 가한 결과 결정이 석출되었다. 결정을 포함하는 용액을 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)로 8,000rpm, 15℃ 조건으로 15분간 원심분리하고, 1.2um 필터로 여과하여 펠렛을 얻었다. 이를 하기 시험예에서 시료로 사용하였다.
[ 비교예 6] 호장근 추출물 제조
건조된 호장근 10g에 70% 에탄올을 90g 첨가 후 냉각 콘덴서가 달린 환류장치를 이용하여 80℃ 가온 조건으로 2시간 동안 환류 처리하였다. 그 후 80메시 필터와 1.2um 필터로 여과하여 추출 여액을 얻었다. 수득된 추출 여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)로 65℃, 20hPa 조건에서 1시간 동안 농축하여 농축물을 얻었다. 이 농축물에 50g의 정제수를 첨가하여 조 용해 후 n-헥산을 50g 투입하여 분획하였고, 분획 후 정제수 층에 EtOAc, BuOH를 차례로 분획하여 최종적으로 EtOAc 층을 수득하였다. 그 후, 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)로 65℃, 20hPa 조건에서 1시간 동안 농축하여 농축파우더를 얻었다. 농축파우더에 20g의 20% 에탄올을 가하고, 25℃에서 1시간 침지하여 재결정화하였다. 이를 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)로 8,000rpm, 15℃ 조건 하에 15분간 원심분리하고, 1.2um 필터로 여과하여 펠렛을 수득하였다. 이를 하기 시험예에서 시료로 사용하였다.
[ 시험예 9] 펠렛 수득율 산출
상기와 같이 얻어진 각 시료를 이용하여 수득율을 산출하였다. 투입된 호장근 중량 대비 재결정화되는 펠렛의 중량을 산출하여 수득율(%)을 나타내었으며, 실시예 6은 압력을 달리하여 실시하였다.
조건 수득율
(%)
비교예 6
(호장근)		 1 atm (25℃, 1h) 2.8
실시예 6
(호장근)		 50MPa (25℃, 1h) 12.5
100MPa (25℃, 1h) 16.4
상기 표 9와 같이, 비교예로 침지 제조한 재결정화 시료의 경우 수득율이 낮았고, 실시예 6과 같이 초고압을 이용한 재결정화 시료의 경우 같은 시간 대비 수득율이 현저히 증가하였다.
[시험예 10] HPLC 분석을 통한 레스베라톨 정량분석
상기 실시예를 통해 분리, 정제한 펠렛의 레스베라톨(Resveratol) 정량분석을 위하여 HPLC를 수행하였다. 시료는 각 용매로 적당 농도로 제조하여 0.2um ㅍ피필터로 여과, 전처리 후 기기에 주입하였다. 기기는 HPLC(Agilent 1200series system, Agilent, USA)와 UV 탐지기를 이용하여, UV 전영역에서 분석하였으며, C18 컬럼(Zorbax XDB-C18 4.6 x 250mm, Agilent, USA)으로 2% 아세트산(in DW) 용매와 ㅇ아세토나이트릴 용매를 사용한 기울기 용법으로 분석하였다. 분석에 사용된 용매는 HPLC급 시약을 사용하였으며, 표준물질로는 레스베라톨(>98%, Pteropure, USA)을 사용하였다. 분석 결과는 [표 10], [도 9]와 같으며, 스펙트럼 분석 결과는 [도 10]과 같다.
조건 레스베라톨
(%)		 레스베라톨
피크 스펙트럼 분석
(Max Abs., nm)
비교예 6
(호장근)		 1 atm (25℃, 1h) 1.4 306
실시예 6
(호장근)		 50MPa (25℃, 1h) 59.7 306
100MPa (25℃, 1h) 64.6 306
상기 표 10과 같이, 비교예로 침지하여 제조한 재결정화 시료의 경우 레스베라톨 함량이 적었고, 초고압을 이용한 재결정화 시료의 경우 레스베라톨 함량이 현저히 증가하였다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 여러 가지 약용식물로부터 활성물질을 고순도로 분리 정제하는 방법으로서, 이 제조방법으로 얻은 활성물질은 화장품, 식품, 의약품 소재로서 경쟁력이 있을 것으로 기대된다.

Claims (9)

  1. 활성물질을 포함하는 약용식물에 초고압을 가하여 활성물질을 석출시킴으로써 재결정화하여 활성물질을 분리, 정제하는 방법
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 분리, 정제 방법은
    (a) 건조, 세절된 약용식물에 용매를 가하여 활성성분을 추출하는 공정;
    (b) 활성성분이 용출된 용액으로부터 파우더를 수득하는 공정;
    (c) 수득된 파우더에 2종 이상의 용매를 가하여 분획을 실시하는 공정; 및
    (d) 활성성분이 포함된 분획에 50~1,000MPa의 초고압을 가하여 활성성분을 재결정화하는 공정;을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 (c) 공정 이후 (d) 공정 이전에 활성성분이 포함된 분획에 용매를 가하고 분산시키는 공정;이 추가됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구항 2에 있어서,
    상기 (d) 공정 이후 재결정화된 활성성분을 추가 정제, 분리하는 방법을 추가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 선택된 어느 한 항의 방법을 이용하여 녹차로부터 활성물질 테아닌(Theanine)을 분리, 정제하는 방법
  6. 청구항 1 내지 청구항 4 중 선택된 어느 한 항의 방법을 이용하여 레몬버베나로부터 활성물질 액티오사이드 및 아이소액티오사이드 중 1종 이상을 분리, 정제하는 방법
  7. 청구항 1 내지 청구항 4 중 선택된 어느 한 항의 방법을 이용하여 지황으로부터 활성물질 액티오사이드를 분리, 정제하는 방법
  8. 청구항 1 내지 청구항 4 중 선택된 어느 한 항의 방법을 이용하여 소나무 뿌리로부터 활성물질 택시폴린-3-글루코사이드를 분리, 정제하는 방법
  9. 청구항 1 내지 청구항 4 중 선택된 어느 한 항의 방법을 이용하여 호장근으로부터 활성물질 레스베라톨을 분리, 정제하는 방법
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20210114152A (ko) * 2020-03-10 2021-09-23 주식회사 토아스 항산화 활성을 갖는 왁스애플 추출물을 함유하는 다중 소포성 리포좀 제조방법

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KR20210114152A (ko) * 2020-03-10 2021-09-23 주식회사 토아스 항산화 활성을 갖는 왁스애플 추출물을 함유하는 다중 소포성 리포좀 제조방법

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