KR20110139199A - 혈장 단백질을 정제하는 수단 및 그의 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 혈장단백질을 선택적으로 결합하기 위한(묶기 위한) 친화성 기질에 관한 것으로, 이 친화성 기질은, 상기 혈장 단백질과 특이적으로 결합하는 리보 핵산 압타머가 고정화되는 고형 기질물질로 이루어진다.
본 발명의 청구대상은 또한 기질상에 혈장 단백질을 고정화하기 위한 방법이며, 이 방법은 이 혈장 단백질을 함유하는 샘플이 친화성 기질과 접촉하게 되는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 하기의 단계들로 이루어진 혈장 단백질을 정제하기 위한 방법에 관한 것이다:
a) (i) 상기 친화성 기질위에 고정된 데옥시리보핵산 압타머핵산 압타머 상기 혈장 단백질 사이에 복합체를 형성하기 위하여, 혈장 단백질을 함유한 샘플을 위에서 정의한 친화성 기질과 접촉하도록 하는 단계; 및
b) 단계 a)에서 형성된 복합체로부터 상기 단백질을 방출하는 단계; 및
c) 정제된 형태로 상기 혈장 단백질을 회수하는 단계.
본 발명은 또한 99 중량%의 재조합 인간 혈장 단백질을 포함하며 실질적으로 비인간 단백질이 없는 재조합 인간 혈장 단백질의 정제된 조성물에 관한 것이다.

Description

혈장 단백질을 정제하는 수단 및 그의 방법 {MEANS FOR PURIFYING A PROTEIN OF BLOOD PLASMA AND METHODS FOR IMPLEMENTING SAME}
본 발명은 약제의 유효 성분으로서 이용될 수 있는 혈장 단백질의 정제 분야에 관련된 것이다.
혈장 단백질은 오랜기간 약제를 위한 유효 성분을 구성해왔다. 약제의 유효 성분으로서 이용되는 혈장 단백질 중에, 특히 인자 VII, 인자 VIII, 트롬빈 또는 폰빌레브란트인자(von willebrand factor)가 언급될 수 있다.
최근까지, 혈장 단백질은 오로지 인간 혈장의 정제에 의해서만 얻어졌었다. 과거 몇 년 동안에 걸쳐서, 소량의 혈장 단백질은, 예를 들면 유전자 이식 포유 동물의 우유같은, 유전자 이식 포유 동물의 체액에서 생산된 재조합 단백질의 형태로 얻어져왔다.
모든 경우에서, 정제될 혈장 단백질을 함유하는 출발 물질은 복합체 구성물(complex constitution)의 물질로 구성되며, 여기서 관심의 단백질(the protein of interest)은, 단백질, 지질, 탄수화물, 아미노산, 무기 염류, 세포 잔해물 및 요소(urea), 요산(uric acid) 또는 빌리루빈(bilirubin)과 같은 대사 폐기물을 포함하여 매우 다수의 물질과 결합하여 존재하고 있다.
그러므로, 혈장 단백질을 정제하기 위한 방법의 개발은, 인간에게 쓰이기 위한 약제의 판매에 요구되는 위생과 규정의 지표가 정해져 있으므로, 복잡한 작업이다.
인간이나 가축에게 쓰이기 위한 약제에서, 유효 성분으로서 이용되는 혈장 단백질은 고순도의 형태로 존재하여야하고, 다른 혈장 단백질 또는 위에서 언급한 단백질의 분해 산물들(degradation products)을 포함하여 유기체에 해로울 수 있는 바람직하지 않은 물질들과 연관되어서는 안된다고 여겨지고 있다.
다양한 혈장 단백질을 정제하는 방법이, 인자 VIII, 안티트롬빈-III, 플라스미노겐, 인자 VII 또는 폰빌레브란트인자를 정제하는 방법을 포함하여, 알려져 있다.
모든 공지된 방법들은, 순차적인 용리 단계들, 심층 여과 단계들, 초미세 여과 단계들 또는 농축(concentration) 단계들에 이어서 크로마토그래피 기질들(substrates)을 통과하는, 단백질 침전의 단계들을 기반으로 하는 선택적 분리 단계들의 연속으로 구성한다.
응고 단백질을 정제하는 방법의 개발은, 공지된 방법들에 대해 이러한 방법들이 전적으로 신규이던, 또는 이러한 방법이 활용(adaptations)이던, 심지어 최소한의 활용이던, 균이 없고 비발열성이며, 바람직하지 않은 물질이 거의 없고, 변형되지 않은 형태로 순도가 높은 최종 생성물이 확실히 획득될 수 있도록 하기 위해, 오랜 연구와 연속적인 중간 생성물에 적합한 수많은 제어를 필요로 한다는 것이 명시되어 있다. 특히, 효소 활성을 가지고 있는 혈장 단백질을 위해, 예를들어 인자 VII, VIII 및 XI에서, 정제된 최종 단백질이 활성화 되지 않는 것은 필수적이다. 그러나, 응고 단백질의 활성화는, 예를 들면, 사용된 필터들 또는 크로마토그래피 기질들의 품질 또는 염분 농도 또는 온도 같은 미리 계획해 놓은 조건들이 일정하게 유지되지 않는다면, 크로마토그래피 단계를 포함하여, 정화 단계들 중 어떤 하나의 단계를 거치는 중에 유발되기 쉽다.
상기 설명들은, 공지된 방법들이 크로마토그래피의 기질에 접합된 리간드에의 관심의 혈장 단백질의 특정한 고정화의 원리를 기반으로 하는, 친화 크로마토그래피 단계와, 그 후의 크로마토그래피 용출액에서의 정제된 단백질의 회수를 포함하지 않는 이유를 적어도 부분적으로 설명한다.
치료적 관심의 단백질의 정제를 위한 방법에서 친화 크로마토그래피 정제 단계의 부재는, 친화 기질에 접합된 리간드 분자들 일부의 분리가 관찰되는 이 기술의 결함으로 또한 설명될 수 있고, 상기 발견되고 있는 리간드 분자는 용출액 내의 정제된 치료적 단백질과 결합된다. 정제된 혈장 단백질을 포함하는 약제에서, 어쩌면 유기체에 해로운 크로마토그래피 기질을 구성하는 물질들은 환자의 건강을 위태롭게 할 수 있어, 의료 규정에 의해 금지된다는 것은 이해된다.
혈장 단백질들을 정제하는 공지된 방법들이 만족스러움에도 불구하고, 이전 기술에서의 대안적인 방법들 또는 존재하는 방법들과 비교해 개선된 방법들이 필요하다.
오랜 기간 연구한 결과, 출원인은 관심있는 단백질과 크로마토그래피 기질에 미리 고정된 리간드가 특이적으로 결합한 후, 상기 기질에 잔류된 관심의 단백질을 방출하고 용출액에서 정제된 단백질을 회수하는 크로마토그래피 단계를 포함하는 혈장 단백질을 정제하는 방법을 개발했다.
보다 상세하게는, 본 발명에 의하면, 혈장 단백질을 정제하는 방법이 제공되며, 이 방법은 관심의 혈장 단백질과 특이적으로 결합하는 데옥시리보핵산 압타머가 고정된 기질에 상기 관심의 혈장 단백질이 특이적으로 결합하는 단계; 및 상기 관심의 정제된 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
놀랍게도, 관심의 혈장 단백질에 특이한 고정된 데옥시리보핵산 압타머, 즉 이러한 혈장 단백질을 포함하는 고정된 화합물들의 형태를 포함하는 고정된 데옥시리보핵산 압타머가 고정되는 친화성 크로마토그래피 기질들이 약제의 유효성분으로 사용될 수 있는 혈장 단백질을 얻는 방법들에 성공적으로 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다.
도 1은 토끼 우유에서 생성된 재조합 인간 인자 VII을 항-인간 FVII 핵산 압타머가 고정된 친화성 기질을 이용하여 정제하는 방법을 실시하는 동안에 얻어진 크로마토그래피 프로파일을 예시한다.
여기서 X 축은 시간, Y축은 254 나노미터에서의 흡광도 지수(OD)를 나타낸다.
도 2는 시간의 함수로서 280 nm에서의 흡광도의 측정지수들의 곡선을 나타낸다.
도 3은 밴드들의 비교 정량을 가능케 하는 쿠마씨 블루 염색된 SDS PAGE 전기영동 겔의 이미지이다. 도 3에서 겔의 왼쪽에서 오른쪽으로, 레인은 하기 출발 물질이 도의 왼쪽에서 오른쪽으로 이동하였다는 결과를 나타낸다.:
- 레인 "2" 또는“MD”: 출발 조성물 Betafact®,
- 레인 "3" 또는“NR”: 도2의 크로마토그래피 프로파일의 피이크 No. 1에 해당하는 비잔류 분획(nonretained fraction).
- 레인 "4" 또는“E1”: 도2의 크로마토그래피 프로파일의 피이크 No. 2에 해당하는 용리 분획(elution fraction).
도 4는 시간의 함수로서 280 nm에서의 흡광도의 측정값들의 곡선을 나타낸다.
도 5는 SDS PAGE 전기영동 겔의 이미지이다. 여기서 도5의 좌측으로부터 우측으로 가면서 레인들은 하기의 출발 물질들의 결과들을 나타낸다:
- 레인 “E5”: MEP HyperCel 크로마토그래피 단계에 의해 정제된 유전자이식 인간 인자 IX를 함유하는 유전자 이식 암퇘지의 우유의 출발 조성물.
- 레인 “E6”: 도4의 크로마토그래피 프로파일의 피이크 No. 1에 해당하는 비잔류 분획.
- 레인 “E7”: 도4의 크로마토그래피 프로파일의 피이크 No. 2에 해당하는 용리 분획.
- 레인 “E8”: 도4의 크로마토그래피 프로파일의 피이크 No. 3에 해당하는 재생 분획.
- 레인 “T FIX”: 정제된 인간 플라즈마 인자 IX 대조군.
도 6은 시간의 함수로서 280 nm에서의 흡광도의 측정값들의 곡선을 나타낸다. 도6에서 피이크 No. 1은 칼럼상에 잔류되지 않았던 출발 물질의 분획에 해당되고 피이크 No. 2는 용리 분획에 해당한다.
도 7은 불순물들의 방출을 시각화하기 위하여 질산은으로 SDS PAGE에 의해 분석된, 출발 물질 및 용리된 산물의 겔의 이미지을 나타낸다: 레인 No. 1은 출발 산물 분획에 해당하고 레인 No. 2는 용리 분획에 해당한다. 출발 산물의 상당한 순도에도 불구하고, 용리된 분획은 더 이상 어떠한 오염물 또는 퇴화된 형상물을 함유하지 않는다는 것이 주목된다.
도 8은 유전자 이식 토끼의 우유에서 생성된 재조합 인간 인자 VII에 압타머가 고정된 Mapt2의 결합 곡선을 나타낸다. 화살표는 다양한 주입 시간에 해당한다. 도 8의 왼쪽에서 오른쪽으로, 각각: 1: 재조합 인자 VII의 주입; 2: 1M　NaCl을 포함하는 버퍼의 주입; 3: 2M NaCl을 포함하는 버퍼의 주입; 4: 3M NaCl을 포함하는 버퍼의 주입; 5: 10　mM EDTA를 포함하는 50　mM 트리스 버퍼(Tris buffer)의 주입. x-축: 초로 표현되는 시간; y-축: 상대적인 빛의 세기(arbitrary units, RU)로 표현되는 반응 시그널의 지수.
도 9은 유전자 이식 토끼의 우유에서 생성된 재조합 인간 인자 VII에 압타머가 고정된 Mapt2의 결합 곡선을 나타낸다. 화살표들은 도9상에서 왼쪽에서 오른쪽으로 가면서 각각 다양한 주입의 시간에 해당한다: 1: 50% 프로필렌 글리콜; 2: 10 mM의 EDTA
놀랍게도, 본 발명의 상세한 설명에서 정의한 친화성 기질을 데옥시리보핵산(DNA) 압타머를 사용하여 제조할 수 있다는 것이 본 발명에 의해 보여지며, 여기서 이 DNA 압타머는 그러함에도 불구하고 공지기술에서 사용하기 쉽지 않은 리간드 핵산으로 간주되었고 이 DNA 압타머의 표적단백질에 대한 특이성이 해당하는 서열의 RNA 분자의 특이성보다 적다. 특히, 리간드 DNAs는 해당하는 RNA보다 더 적은 유연성을 가지며, 또한 결과적으로 리간드RNAs보다 배좌 변화를 덜 겪을 수 있다는 것이 공지기술에서 인정된다. 핵산 압타머가 표적 단백질과 결합할 때, 배좌 변화가 일어난다는 것을 상기할 수 있다. 핵산 압타머의 배좌 변화가 빠르면 빠를수록, 상기 핵산 압타머의 표적 단백질에 대한 친화성이 더 높다는 것이 역시 기재되어 있다.(Michaud et al., 2003, Anal Chem, vol. 76: 1015-1020; Brumbt et al., 2005, Anal Chem, vol. 77: 1993-1998).
본 발명의 친화성 기질은, 상기 관심있는 응고성 단백질과 큰 특이성을 가지고 결합하여, 인간 인자 Ⅸ가 풍부한 혈장 조성물 및 인간 인자 Ⅸ가 유전자 이식된 동물의 우유와 같은 복합체 조성물의 출발 배지로부터, 응고성 단백질을 정제할 수 있음을 또한 보여주고 있다.
본 발명의 친화성 기질은 인간 응고성 단백질을 비인간 오르토로고스 단백질(nonhuman orthologous protein)을 포함하는 출발 배지, 예를 들어 유전자 이식 동물에서 자연적으로 생성된 인자 IX를 포함하고, 상기 유전자 이식 동물(또는 내인성 FIX)에서 자연적으로 생성된 상기 인자 IX는 예를 들어 돼지 FIX가 될 수 있는, 인간 인자 IX를 생산하기 위해 유전자 이식된 동물의 우유로부터 선택적으로 정제할 수 있음을 또한 보여주고 있다.
본 발명의 친화성 기질은 인간 응고성 단백질을 비인간 오르토로고스 단백질(nonhuman orthologous protein)을 포함하는 출발 배지, 예를 들어 유전자 이식 동물에서 자연적으로 생성된 인자 VII을 포함하고, 상기 유전자 이식 동물(또는 내인성 FVII)에서 자연적으로 생성된 상기 인자 VII는 예를 들어 토끼 FVII가 될 수 있는, 인간 인자 VII을 생산하기 위해 유전자 이식된 동물의 우유로부터 선택적으로 정제할 수 있음을 또한 보여주고 있다.
본 발명은 혈장 단백질을 선택적으로 결합시키기 위한 친화성 기질에 관한 것으로, 이 친화성 기질은 상기 혈장 단백질과 특이적으로 결합하는 데옥시리보핵산 압타머, 이러한 데옥시리보핵산 압타머를 포함하는 화합물들의 형태로 포함하는 데옥시리보핵산 압타머가 고정되는 고형 기질물질을 포함한다.
관심의 혈장 단백질과 특이적으로 결합하는 데옥시리보핵산 압타머의 분자들 및 이러한 데옥시리보핵산 압타머를 포함하는 화합물들은 상기 고형 기질 물질에 의해 운반되는 상기 표적 단백질의 특이성 결합을 위한 자리들(sites)을 만들어낸다.
용어“데옥시리보핵산 압타머”는 5 내지 120 뉴클레오티드의 길이를 가지며 혈장 단백질과 특이적으로 결합하는 단일 가닥의 데옥시리보핵산을 포함한다. 표현“데옥시리보핵산 압타머를 포함하는 화합물들”은 또한 화합물들의 구조에서 위에서 정의한 상기 데옥시리보핵산들을 포함하는 화합물들을 포함한다. 그래서, 인간 또는 포유류 혈장 단백질과 특이적으로 결합하는 데옥시리보핵산을 포함하는 화합물들은 비오틴 분자를 포함하는 데옥시리보핵산이 구조에 포함된 화합물들을 포함한다.
본 발명에 의하면, 위에서 정의한 친화성 기질은 관심의 혈장 단백질의 효율적인 고정을 가능케 한다는 것을 보여주며, 관심의 혈장 단백질은 또한 본 명세서에서 “표적 단백질(target protein)”이라고 일컬어질 것이다.
위에서 정의한 친화성 기질은 표적 단백질의 높은 흡착성능을 가진다. 그 이유는 고상 기질을, 정제할 혈장 단백질을 함유하는 액상 용액(liquid solution)과 접촉하게 함으로써, 고상 기질에 의해 운반된 표적 자리들의 적어도 50 퍼센트를 포화시킬 수 있기 때문이다.
데옥시리보핵산 압타머에 특이적으로 결합된 혈장 단백질 분자들은 차후에 적어도 75 퍼센트의 우수한 수율로 친화성 기질로부터 용리될 수 있다는 것을 본 발명은 또한 보여주고 있다.
또한, 관심의 혈장 단백질이 용리액에 함유된 단백질의 총 중량에 대하여 최대 99.95 중량%의 순도로 발견될 수 있기 때문에, 본 발명의 친화성 기질은 상기 관심의 혈장 단백질에 대한 높은 특이성을 갖는다는 것을 보여준다.
실시예들에서 예시된 바와 같이, 관심의 응고 단백질의 순도의 크기의 2 차수(two orders)의 증가는, 예를 들면 상기 출발 산물에 함유된 단백질의 총 중량에 대하여 98 중량%이상의 표적 응고 단백질을 포함하는 조성물을 사용하여, 본 발명에 따라 출발 물질을 사용한 친화성 기질로부터 또한 얻어질 수 있다. 출발 산물에 존재하는 정재하는 것이 바람직한 불순물들이 표적 응고 단백질의 구조적 또는 물리화학적 특성에 매우 가까운 구조적 또는 물리화학적 특성을 가질 때를 포함하여 이러한 순도의 증가가 달성될 수 있다는 것을 기술하고 있다.
중요하게도, 본 발명의 친화성 기질의 높은 흡착 성능, 우수한 수율 및 높은 특이성의 상기 특성들은 특히, 혈장 아니면 관심의 혈장 단백질로 유전자 이식된 표유류의 생물체 유체 등의, 복합체 조성물의 출발 배지로부터의 상기 관심 혈장 단백질의 정제를 위해 얻어진다는 것을 보여준다.
핵산 압타머의 고상 기질 물질상의 고정화는 비가역적이고 오래 지속되며, 그 이유는 기질로부터 분리된 데옥시리보핵산 압타머가 용리 용액 에서 검출될 수 없다기 때문이라는 것을 또한 보여주었다.
특히, 본 발명의 친화성 기질은 용리 후에 기질에 결합된 상태로 잔류하고 있던 단백질을 제거하여 (ⅰ) 표적 혈장 단백질의 흡착 성능, (ⅱ) 상기 표적 단백질에 대한 특이성, 아니면 (ⅲ) 상기 고상 기질물질상에 고정된 데옥시리보핵산 압타머의 방출의 부재의 심각한 손상이 없이 아주 여러 번 “재생될(regenerated)” 수 있다는 것을 보여주고 있다. 게다가, 본 발명의 친화성 기질은 공지 기법들 및 요소 등의 공지 재생제들(regenerating agents)을 가지고 재생될 수 있다.
관심의 혈장 단백질의 리간드로서 사용된 데옥시리보핵산들은 많은 이점을 갖는다. 핵산의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 성질 덕분에, 압타머는 약한 면역원성을 가지며 건강 안정성, 특히 친화성 리간드로서의 사용의 관점에서 바이러스 또는 비관습적 병원체에 대한 안정성을 제어하기 위한 다양한 전략들을 가능케 하는 엄격한 물리화학적 조건들 (요소의, DMSO의, 강 산성 또는 강 염기성 pH의 존재, 유기 용매의, 높은 온도의 사용)에 대한 높은 저항성을 갖는다. 또한, 압타머는 아주 선택성이 있다. 마지막으로, 이미 언급한 바와 같이, 데옥시리보핵산 압타머의 생산은 아주 제한된 비용을 수반한다.
그래서, 본 발명의 친화성 기질의 상기 특성들을 결합함으로써, 혈장 단백질을 정제하기 위한 수단으로 사용될 상기 친화성 기질의 능력을 발휘하게 되며, 그 이유는 다음과 같다:
- 상기 친화성 기질은 매우 높은 순도의 혈장 단백질을 정제하는 방법을 수행할 수 있게 만들며,
- 상기 친화성 기질은 원하지 않는 물질들, 특히 데옥시리보핵산 압타머 분자들을 정제된 혈장 단백질을 함유하는 용리용액(the solution of eluate)안으로 검출될 정도로 방출하지 않으며,
- 데옥시리보핵산 압타머 분자들의 있을 수 있는 분리는 인간 건강에 단점을 초래하지 않으며,
- 관심의 혈장 단백질의 친화성 기질상에의 결합 및 그 후의 상기 혈장 단백질의 용리 는, 그것이 효소활성을 갖는 혈장 단백질일 때, 검출할 수 있는 정도의 양의 활성형태의 상기 혈장 단백질의 형성을 초래하지 않으며,
- 상기 친화성 기질은 특히 데옥시리보핵산 압타머의 낮은 제조비로 인해 상당히 염가이며, 또한
- 혈장 단백질을 정제하기 위한 친화성 기질의 사용은 상기 기질의 오래 지속됨으로 인해, 특히 상기 기질을 여러 번 장기간에 걸쳐서 재생할 수 있다.
또한, 이미 언급한 바와 같이, 본 발명의 친화성 기질은 양호한 수율로 양호한 특이성을 가지고 선택적으로 가역적으로, 복합체 구성의 배지로부터의, 특히, 인간 혈장 또는 배양액 또는 관심의 단백질을 함유하는 생체액 등의 산업규모로 전통적으로 사용된 배지로부터의 정제의 방법들에서, 표적 혈장 단백질과 결합할 수 있다.
게다가, 본 명세서에서 나중에 상세하게 설명되는 바와 같이, 본 발명의 친화성 기질은 관심의 혈장 단백질을 함유하는 용액을 다량 처리하는 데 적합하다. 그래서, 본 발명의 친화성 기질은 산업규모로 사용하는데 특히 적합한 혈장 단백질을 정제하기 위한 툴을 구성한다.
본 발명의 친화성 기질의 다른 장점들은 차후에, 친화성 기질 자체의 설명과 관련하여, 또는 상기 친화성 기질이 사용될 수 있는 혈장 단백질을 정제하는 방법과 관련하여 본 명세서에서 상세하게 기술될 것이다.
출원인이 알기로는, 본 발명은 산업규모로 사용하기 위한 조건들하에서 혈장 단백질을 정제하기 위한, 고정된 데옥시리보핵산 압타머를 포함하는 친화성 기질을 처음으로 기술한다. 게다가 트롬빈, 인자 Ⅶ 및 인자 Ⅸ에 대한 특이성이 있는 다양한 핵산 압타머가 공지기술에서 알려져 있다(PCT 출원 No.　WO　02/26932 참고). 그러나, 출원인이 알기로는, 혈장 단백질을 정제하기 위한 공정들에서 산업규모로 사용될 수 있는 친화성 기질의 제조를 위한 데옥시리보핵산 압타머의 사용에 대하여 공지기술에서는 기술될 적이 없었다.
용어 선택적 결합(selective binding)은 본 명세서에서는 관심의 혈장 단백질의 친화성 기질의 고정된 구성성분 데옥시리보핵산과의 특이성 비공유결합을 의미하며, 이것은 상기 데옥시리보핵산과 상기 관심 단백질사이의 비공유 복합체(noncovalent complexes)이 형성되는 친화성 기질을, 적절한 조성의 용액과 접촉되게 함으로써 가역적이다. 여기서 절적한 조성의 용액은 용리 용액으로 또한 일컬어진다.
본 발명에 따른 용어 혈장 단백질은 혈장에 함유된 임의 단백질, 특히 산업상 또는 치료상의 관심의 임의 단백질을 의미할 것이다. 혈장 단백질은 알부민, 알파/마크로글로불린, 안티쵸모트립신(antichyomotrypsin), 안티트롬빈, 안티트립신(antitrypsin), 아포 A(Apo A), 아포 B, 아포 C, 아포 D, 아포 E, 아포 F, 아포 G, 베타 XIIa, C1-저해제, C-반응성 단백질, C7, C1r, C1s, C2, C3, C4, C4bP, C5, C6, C1q, C8, C9, 카르복시펩티다아제N, 세룰로플라스민, 인자 B, 인자 D, 인자r H, 인자 I, 인자 IX, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 피브리노겐, 피브로넥틴, 합토글로빈, 헤모펙신 헤파린 보조인자 II, 히스티딘-농후 GP, IgA, IgD, IgE, IgG, ITl, IgM, 키닌아제 II, 키니노겐 HPM, 라이소자임, PAI 2, PAI 1, PCI, 플라스민, 플라스민 저해제, 플라스미노겐, 프리알부민, 프로칼리크레인, 프로퍼어딘, 프로테아제 넥신 INH, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 프로트롬빈, TFPI, 티올-프로테이나아제, 트롬보모듈린, 조직인자(TF), TPA, 트랜스콜라바민II, 트랜스코르틴, 트랜스페린, 비트로넥틴 및 폰 빌레브란트 인자를 포함한다.
특히, 상기 혈장 단백질은 응고 단백질을 포함하며, 다시 말하면 혈전의 형성을 초래하는 단계적 연쇄반응들(cascade reactions)의 체인에 관련된 혈장 단백질을 포함한다. 상기 응고 단백질은 인자 I (피브리노겐), 인자 II (프로트롬빈), 인자 V (프로악셀레린), 인자 VII (프로콘버틴), 인자 VIII (항혈우병 인자A), 인자 IX (항혈우병 인자B), 인자 X (슈트와트 인자), 인자 XI (로젠탈 인자[Rosenthal factor] 또는 PTA), 인자 XII (하게만 인자), 인자 XIII (피브린-안정화 인자 or FSF), PK (프리칼리크레인), HMWK (고 분자량 키니노겐), 조직 트롬보프라스틴, 헤파린 보조인자 II (HCII), 단백질 C (PC), 트롬보모듈린 (TM), 단백질 S (PS), 폰 빌레브란트factor (vWF) 및 외인계 응고억제제 (TFPI), 또는 아니면 조직 인자들을 포함한다.
일부 실시예들에서는, 혈장 단백질은 효소활성을 갖는 응고 단백질로 이루어진다.
효소 활성을 갖는 응고 단백질은 인자 II (프로트롬빈), 인자 VII (프로콘버틴), 인자 IX (항혈우병 인자B), 인자 X (슈트와트 인자), 인자 XI (로젠탈 인자 또는 PTA), 인자 XII (하게만 인자), 인자 XIII (피브린-안정화 인자 또는 FSF) 및 PK (프리칼리크레인)을 포함한다.
일부 바람직한 실시예들에서, 혈장 단백질은 천연 또는 재조합 인간 혈장 단백질로 이루어진다..
일반적으로, 본 발명의 압타머가 고정되는 고상 기질은 필터 기질, 막(membranes) 등에서 일반적으로 발견되는 구조(structure) 및 조성을 갖는 임의 형태의 기질을 포함한다. 고상(solid) 기질들은 특히 수지, 친화성 크로마토그래피 칼럼 수지, 폴리머 비드(polymer beads), 자성 비드(magnetic beads), 상자성 비드(paramagnetic beads), 필터막의 기질 물질 등을 포함한다. 고상 기질은 또한 특히 강, 금, 은, 알루미늄, 구리, 실리콘, 유리 또는 세라믹 등의 유리 또는 금속을 기본으로 하는 물질을 포함한다. 고상 기질은 또한 특히 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드, 폴리비닐리덴 플루라이드, 및 그것들의 조합체 등의 폴리머 물질을 포함한다.
일부 실시예에서는, 고상 기질은 부착, 결합, 복합체 형성, 고정 또는 그 압타머와의 상호작용 또는 상기 압타머를 이루는 화합물들과의 상호작용을 용이하게 하는 물질로 피복될 수 있다.
일부 실시예들에서는, 그 고상 기질은 표면이 금의 층, 카르복시메틸레이션에 의해 처리되어진 층, 덱스트란, 콜라겐, 아비딘, 스트렙타아비딘의 층 등으로 피복된 유리 슬라이드(glass slide)이다.
이러한 방식으로, 본 발명에 의한 압타머들, 또는 본 발명에 의한 압타머들을 포함하는 화합물들은 예를 들면 위에 기재된 바와 같이, 공유결합의 생성의 화학반응에 의해, 또는 수소결합, 정전기력, 반데르발스 힘 등의 비공유결합을 통한 제휴(association)에 의해 부착코팅(attachment coating)을 통해 고상 기질 위에 고정될 수 있다
실시예들은 데옥시리보핵산 압타머가, 화합물(압타머는 화합물의 구조에 포함됨)에 의해, 고상 기질물질에의 비공유 결합으로, 고정되는 본 발명의 친화성 기질의 예들을 기재하고 있다.
실시예들에서, 표면에서 스트렙타아비딘 분자들이 접목되는(grafted) 고상 기질 물질을 포함하는 친화성 기질들이 특히 기재되어 있으며, 데옥시리보핵산 압타머들은, 단들(ends)중의 하나에 비오틴 분자와 결합된 압타머들을 포함하는 화합물들의 구조에 포함되어 있으며 또한 상기 압타머들은 상기 고상 기질 물질 위에, 기질 물질의 스트렙타아비딘 분자들과 상기 데옥시리보핵산 압타머들을 포함하는 화합물들의 비오틴 분자들 사이의 비공유 고정(noncovalent immobilization)에 의해, 고정되어 있다.
실시예들에서, 스트렙타아비딘 분자들이 접목되어 있는(grafted) 기질 물질을 포함하는 친화성 기질의 예가 기재되어 있다. 이러한 고상 기질 물질들은 쉽게 상업적으로 입수할 수 있다.
표현 "혈장 단백질과 특이적으로(specifically) 결합하는 데옥시리보핵산들", 또는 "압타머들" 또는 "핵산 압타머들"은 소정의 혈장 단백질과 결합할 능력을 어떤 다른 단백질과 결합할 능력보다 크게 가지는 DNA (데옥시리보핵산) 분자들을 의미할 것이다.
일부 예들에서, 본 발명에 따른 친화성 기질의 구성 핵산 압타머들은 소정의 인간 혈장 단백질과 결합할 능력이 어떤 다른 인간 단백질과 결합할 능력보다 크다.
일부 예에서는, 본 발명에 따른 핵산 압타머들은 특히 소정의 인간 혈장 단백질과 결합할 능력을 가지며, 이 능력은 비인간 포유류의 게놈으로 부호화된 어떤 다른 상동 혈장 단백질과 결합할 능력보다 더 크다. 예시를 통해, 본 발명의 친화성 기질에 사용될 수 있는 인간 인자 VII에 대한 특이성이 있는 핵산 압타머는 토끼 인자 VII을 포함하여, 비인간 포유류에서 기원한 인자 VII과 결합할 능력보다 큰 인간 인자 VII과 결합할 능력을 가진다.
본 설명을 위하여, 제 1 데옥시리보핵산 압타머는 인간 인자 VII/VIIa과 결합하는 능력이, 상기 결합 검출 기법들 중 어느 하나를 동일한 시험 조건들 하에서 사용함으로써, 제 1 데옥시리보핵산 압타머에서 얻은 결합 신호값이 제 2 데옥시리보핵산 압타머에서 얻은 결합신호값에 비하여 통계적으로 현저하게 더 높은 결합신호값일 때, 등가 질량의 제 2 데옥시리보핵산 압타머의 능력보다 더 크다. 예시를 통하여, 사용된 결합 검출 기법이 Biacore®기법일 때, 제 1 데옥시리보핵산 압타머는 인간 인자 VII/VIIa과 결합하는 능력이, 표시된 공명 측정단위와 관계없이, 제 1 데옥시리보핵산 압타머에 대한 공명 신호 값이 제 2 데옥시리보핵산 압타머에 대한 측정된 공명 신호값보다 통계적으로 더 높을 때, 등가 질량의 제 2 데옥시리보핵산 압타머의 능력보다 더 크다. 두개의 "통계적으로" 뚜렷이 다른 측정값은 그것들 사이에, 사용된 결합 검출 기법의 측정 오류보다 더 큰 차이를 가지는 두개의 값을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 친화성 기질의 데옥시리보핵산 압타머는 표적 혈장 단백질에 대한 강한 친화성을 가진다. 바람직하게는, 상기 데옥시리보핵산 압타머는 상기 표적 혈장 단백질에 대하여, 500 nM 보다 적은 Kd 값을 가진다. Kd 값은Biacore®기법에 따라 측정될 수 있다.
예시를 통해, 서열 SEQ ID No 86을 포함하는 핵산 압타머는 비인간 포유류에서 나온 임의의 인자 VII/VIIa과의 결합능력보다 현저하게 더 큰 인간 인자 VII/VIIa과의 결합능력을 가진다는 것이 밝혀졌다. 특히, 서열 SEQ ID No 86의 핵산을 포함하는 압타머는 천연 인자 VII/VIIa 또는 재조합 인자 VII/VIIa을 포함하여, 임의 형태의 인간 인자 VII/VIIa과 결합할 강한 능력을 가지고 있지만, 그것은 토끼 인자 VII/VIIa 을 포함하여, 비인간 포유류의 게놈에 의해 부호화된 인자 VII/VIIa 과 약한 또는 제로의 결합력을 갖는다.
보다 구체적으로는, 서열 SEQ ID No　86의 핵산을 포함하는 압타머에 대하여, 해리 상수 Kd로 표시된, 인간 인자 VII/VIIa과 결합하는 능력에 대한 값은 대략적으로 100　nM 이라는 것이 Biacore®기법에 의해 결정되었다. 게다가, 상기 핵산 압타머는 인간 혈장 인자 VII/VIIa에 대하여 그리고 예를 들면 유전자 이식 토끼에서 생성된 재조합 인간 인자 VII/VIIa에 대하여 동일한 결합 능력을 가진다.
또한, 서열 SEQ ID No 86의 핵산을 포함하는 압타머와 인간 인자 VII/VIIa 사이의 복합체들은 화학양론적(stoichiometric)이며, 즉 복합체화된 서열 SEQ ID No 86의 핵산의 분자들의 수의 인간 인자 VII/VIIa의 분자들의 수의 비는 약 1:1이고, 특히 1:1일 수 있다는 것을 보여 주였다.
위에서 이미 언급된 바와 같이, 본 발명의 친화성 기질은 비인간의 유전자이식 포유류에 의해 생성된 재조합 인간 혈장 단백질을 정제하기 위한 방법의 단계(a step)에 사용될 수 있다. 혈장 단백질을 정제하는 방법의 이러한 예들에서, 복합체 출발 배지는, 타당한 것으로서 재조합 인간 단백질에 상동인 혈장 단백질을 포함하여, 상기 유전자 이식 포유류에 의해 천연적으로 생성된 다수의 단백질들을 갖는 혼합물로서의 재조합 인간 단백질을 포함한다. 이러한 예들에서, 본 발명의 친화성 기질의 구성 핵산 압타머는 관심의 인간 단백질에 선택적으로 결합하고, 동일한 작동 조건들 하에서 비인간 포유류에 의해 천연적으로 생성된 상동 단백질에 결합하지 않는 것이 유리하다는 것을 이해하게 된다.
본 발명의 친화성 기질의 구성 핵산 압타머의 이들 특별한 예들에서, 상기 압타머가 관심의 인간 혈장 단백질에 "특이적으로(specifically)"결합하는 능력은 또한 인간 단백질과 비인간 포유류 상동 단백질 각각에 대한 해리 상수의 비로서 표시될 수 있다.
본 발명에 따른 친화성 기질의 구성 핵산 압타머의 또 하나의 특징에 의하면, 상기 핵산 압타머의 인간 혈장 단백질과 특이적으로 결합하는 능력은 하기의 조건(A)로 또한 표시될 수 있다:
인간 Kd/비 인간 Kd < 0.01 (A),
여기서:
- "인간 Kd" 는 몰 단위(molar units)로 표시된, 상기 인간 단백질에 대한 핵산 압타머의 해리 상수이고,
- "비 인간 Kd" 동일한 단위로 표시된, 비 인간 상동 단백질에 대한 상기 핵산 압타머의 해리 상수이다.
바람직하게는, 본 발명의 친화성 기질을 재조합 인간 혈장 단백질을 정제하는 방법들에 최적으로 사용하기 위하여는, 상기 재조합 인간 단백질과 특이적으로 결합하는 핵산 압타머는 또한 0.005 보다 적은 인간 Kd/비 인간 Kd ratio로서 정의될 수 있다.
본 발명의 친화성 기질의 구성 핵산 압타머는 SELEX라 불리는 기법에 의해 제조될 수 있다. 사용된 용어 "압타머"는 하나의 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 단일 가닥의(single-stranded) 데옥시리보핵산(DNA)의 하나의 분자를 포함한다. 압타머들은 일반적으로 5 내지 120 뉴클레오티드들을 포함하며 SELEX로 알려진 방법에 의해 시험관(in vitro)에서 선택될 수 있다. (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment), 이것은 처음으로 특히 PCT 출원 No.　WO　1991/019813에 기재되었다. 압타머들을 선택하는 SELEX 방법은, 본 발명에 따라 사용된 DNA 압타머들을 수득하는 것과 관련하여, 단백질을 데옥시리보핵산들의 조합 라이브러리(combination library)(대개 1015 분자들)와 접촉하게 하는 데 있다; 그 표적에 결합하지 않는 데옥시리보핵산들은 없어지게 되며, 그 표적에 결합하는 데옥시리보핵산들은 분리되고 확장된다. 그 방법은 용액(the solution)이 관심의 단백질에 대한 우수한 친화성을 갖는 데옥시리보핵산들로 충분하게 풍부하게 될 때까지 반복된다. (Tuerk and Gold, "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase (1990) Science, 249(4968): 505-10 and Ellington and Szostak, "In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands", (1990) Nature Aug 30;346(6287):818-22). SELEX 방법의 다른 예들은 자료들 EP　0　786　469, EP 668 931, EP 1　695　978 and EP 1　493 825에 제시되어 있으며, 그것의 교시들은 본 발명에 따라 사용된 데옥시리보핵산 압타머를 선택하는 방법의 실시에서 재현될 수 있다.
인간 인자 VII/VIIa를 정제하기 위한 수단에 SELEX 방법을 사용하기 위하여, 관심의 혈장 단백질과 특이적으로 결합하는 데옥시리보핵산은, 본 명세서에서 "화합물(compound)"이라고도 불리는 화학구조(a chemical structure)에 바람직하게는 포함되며, 또한 스페이서 수단(a spacer means) 및 적절한 곳에 고상 기질위의 고정 수단(a means of immobilization)을 구성한다.
일부의 예들에서, 데옥시리보핵산 압타머는 하기 식(I)의 화합물의 구조에 포함된다:
[FIX] x -[SPAC] y - [APT] (I), 여기서:
- [FIX] 는 기질위에 있는 고정용 화합물(a compound of immobilization)을 나타내며,
- [SPAC] 는 스페이서 체인(a spacer chain)을 나타내며,
- [APT]는 혈장 단백질과 특이적으로 결합하는 데옥시리보핵산을 나타내며, 또한 데옥시리보핵산 압타머로 표시되고,
- x 는 0 또는 1의 정수이고, 또한
- y 는 0 또는 1의 정수이다.
식(I)의 화합물에서 [SPAC]로 표시된 "스페이서 체인"은 임의의 공지의 형태일 수 있다. 상기 스페이스 체인은 상기 화합물이 고정될 수 있는 고상 기질의 표면으로부터 데옥시리보핵산을 물리적으로 거리를 두게 하고, 또한 상기 화합물이 고정될 수 있는 고상 기질의 표면에 대한 핵산의 상대적인 이동성을 가지게 하는 기능을 가진다. 스페이서 체인은 고상 기질과 핵산이 서로 너무 가까워서, 상기 핵산과, 상기 핵산과 접촉하게 될 수 있는 혈장 단백질의 분자들 사이의 결합 이벤트들을 방해하기 때문에 생기는 입체장애(steric hindrance)를 제한하거나 또는 방지한다.
식 (I)의 화합물에서 스페이서 체인은 압타머 디옥시리보핵산의 5' 단( 5' end) 또는 3'단( 3' end)에 결합되는 것이 바람직하다.
유리하게는, 스페이서 체인은 압타머의 한 단(one end)과 고상 기질에 결합된다. 스페이서를 갖는 이 구조는 압타머를 고상 기질위에 바로 고정하지 않는 잇점을 갖는다. 바람직하게는, 스페이서 체인은 비특이성의(nonspecific) 올리고뉴클레오티드 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 스페이서 체인이 비특이성 올리고뉴클레오티드로 이루어질 때, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 길이에 있어서(in length) 적어도 5 뉴클레오티드들로, 바람직하게는 길이에 있어서 5 내지 15 뉴클레오티드들로 이루어진다.
스페이서 체인이 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 식 (I)의 화합물의 예들에서, 상기 스페이서 체인은 예를 들면 회사 Sigma Aldrich에 의해 판매되는 PEG(C18) 형의 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
스페이서 체인상에 압타머를 고정시키기 위하여, 데옥시리보핵산은 상기 핵산을 공유결합에 의해 고정시키는 것을 가능케 만드는 기능기들, 예를 들면 티올들(thiols), 아민들(amines) 또는 고상 기질위에 존재하는 화학 기능기들과 반응할 수 있는 임의의 다른 기능기 등의 다양한 화학 기능기들로 화학적으로 개질될 수 있다.
식(I)의 화합물에서, 화합물[FIX]은 (i) 고상 기질 물질과 하나 또는 그 이상의 공유 결합(들)을 형성할 수 있는 화합물 및 (ii) 수소결합들, 정전기력들 또는 반데르발스 력들을 포함하여, 약한 비공유 결합들에 의해 고상 기질에 특이적으로 결합할 수 있는 화합물로부터 선택된 화합물로 이루어진다.
화합물 [FIX]의 제 1 형은 글루타르알데히드, SIAB 또는 SMCC 등의 두 기능을 가진 커플링제들을 포함한다.
Hermanson G.T. 에 의해 기재된 화합물 SIAB (1996, Bioconjugate techniques, San Diego: Academic Press, pp 239-242)은 다음의 화학식(I)의 화합물이다:
Figure pct00001
화합물 SIAB는 2개의 반응기, 각각 요오드아세테이트기 및 설포-NHS 에스테르기를 포함하며, 이들 기들은 각각 아미노 및 설프히드릴 기들과 반응한다. Samoszuk M.K. et al. (1989, Antibody, Immunoconjugates Radiopharm., 2(1): 37-46)에 의해 기재된 화합물 SMCC는 하기의 화학식 (II)의 화합물이다:
Figure pct00002
화합물 SMCC 은 2개의 반응기, 각각 설포-NHS-에스테르기 및 말레이미드기를 포함하며, 이들 기들은 각각 아미노 및 설프히드릴 기들과 반응한다.
화합물 [FIX]의 제 2 형은 비오틴을 포함하며, 이것은 움직이는 기질 위에 존재하는 아비딘 또는 스트렙타아비딘 분자들에 비 공유 방식으로 결합할 수 있다
폰 빌레브란트 인자와 결합하는 압타머들(PCT application No.　WO 2008/150495), 알파-트롬빈 (European patent application No.　EP 1 972 693) 또는 트롬빈 (Zhao et al., 2008, Anal Chem, Vol. 80(19): 7586-7593)과 결합하는 압타머들, 인자 IX/IXa와 결합하는 압타머들 (Subash et al., 2006, Thromb Haemost, vol. 95: 767-771; Howard et al., 2007, Atherioscl Thromb Vasc Biol, vol. 27: 722-727; PCT application No.　WO 2002/096926; United States patent No.　US 7,312,325), 및 인자 X/Xa와 결합하는 압타머들 (PCT application No.　WO 2002/096926; United States patent No.　US 7,312,325)을 포함하여, 혈액응고경로에 연루된 다양한 핵산 압타머들은 공지기술에서 이미 알려져 있다.
인간 인자VII/VIIa에 결합되는 핵산 압타머는 공지기술에 또한 기재되어 있다(Rusconi et al., 2000, Thromb Haemost, vol. 84(5): 841-848; Layzer et al., 2007, Spring, vol. 17: 1-11).
리보뉴클레오티드 압타머들로 주로 구성되고 이 압타머들로만 독점적으로 구성되는 않은 위의 압타머들중 어느것도 그것들이 결합되는 표적 단백질을 정제하기 위한 그것들의 용도로 기재되지 않았다고 상세히 열거되어 있다.
이미 언급된 바와 같이, 데옥시리보핵산 압타머들의 구체적인 잇점은, RNA 압타머들을 합성하는 데에 있어서의 어려움들에 비하여, 그것을 쉽게 제조할 수 있다는 점이다. 또한 데옥시리보핵산 압타머들의 비용(cost price)은 RNA 압타머의 비용보다 현저히 낮다.
본발명의 청구대상(subject)은 또한, 본 명세서에서 정의된 적당량의 친화성 기질이 저장된 용기를 포함하는 혈장 단백질을 정제하는 친화성 크로마토그래피 장치이다.
크로마토그래피 기질들용 변형된 형태의 용기들이 공지기술에 공지되어 있으며 위의 "용기"의 의미에 의해 포함되어진다. 이러한 용기의 중요한 특징들은 출발 샘플을 친화성 크로마토그래피 장치에 공급하기 위한 수단의 존재 및 출발 샘플이 친화성 기질과 접촉되어지고 난 후에 그 액체의 방출물을 위한 수단의 존재를 포함한다.
본 발명의 청구대상은 또한 관심의 혈장 단백질을 함유하는 샘플이 위에 정의된 친화성 기질과 접촉되어지는 단계를 포함하는, 혈장 단백질을 지지체위에 고정시키기 위한 방법이다.
표현 "혈장 단백질을 함유하는 샘플"은 일반적으로 상기 혈장 단백질이 현탁액상태에 있거나 또는 가용성으로 만들어진(solubilized) 임의 형태의 액상 용액을 의미할 것이다. 특히 차후에 기술될 정제 방법과 관련하여, 이러한 샘플의 구체적인 예들은 차후에 본 명세서에서 정의되어질 것이다.
본 발명은 또한 하기의 단계들을 포함하는, 혈장 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다:
a) (i) 본 명세서에서 정의된 친화성 기질위에 고정된 데옥시리보핵산 압타머들과 (ii) 혈장 단백질사이에 복합체들(complexes)을 형성하기 위하여, 상기 혈장 단백질을 함유하는 샘플을 상기 친화성 기질과 접촉하게 하는 단계, 및
b) 단계 a)에서 형성된 복합체들로부터 그 단백질을 방출하는 단계; 및
c) 상기 혈장 단백질을 정제된 형태로 회수하는 단계.
일부 바람직한 실시예들에서, 상기 샘플은 인간 혈장 단백질을 함유한다. 바람직하게는, 이들 실시예들에서, 관심의 혈장 단백질을 함유하는 샘플은, 상기 관심의 단백질을 포함하며 비 인간 포유류의 상동 혈장 단백질의 분자들을 또한 포함할 수 있는 액상 샘플로 구성된다. 위의 정제 방법의 일부 실시예에서, 상기 샘플은 체액, 세포, 분쇄된 세포 물질(ground cell material), 조직, 분쇄된 조직 물질, 기관 또는 전체 유기체(a whole organism) 등의 생체 용액(a biological solution)으로 이루어진다.
위의 정제 방법의 일부 실시예에서는 상기 샘플은 혈액, 혈액유도체(a blood derivative), 포유류 우유 또는 포유류 우유 유도체(a mammalian milk derivative) 등의 동물로부터 유래한 액상 생체 용액으로 이루어진다. 상기 샘플은 혈장, 혈장 냉침전물(plasma cryoprecipitate), 정제(clarified) 우유, 또는 그것들의 유도체(derivatives thereof)로 이루어진다.
위의 정제방법의 특히 바람직한 실시예들에서는, 상기 샘플은 관심의 인간 단백질로 유전자 이식한 동물에서 생긴다. 바람직하게는, 그 용액은 포유류로부터의 우유 또는 관심의 상기 인간 단백질로 유전자 이식한 포유류로부터의 우유의 유도체(derivative)이다. 본 발명의 목적을 위하여, 유전자 이식 동물들은 (i) 젖소, 염소, 토끼, 돼지, 원숭이, 쥐, 생쥐 등의 비 인간 포유류들, (ii) 새들 또는 (iii) 모기, 파리 또는 누에 등의 곤충들을 포함한다. 일부 바람직한 실시예들에서, 관심의 인간 단백질로 유전자 이식한 동물은 비 인간 유전자 이식 포유류, 바람직하게는 관심의 상기 인간 단백질로 유전자 이식한 전부 암컷 토끼이다. 바람직하게는, 유전자 이식 포유류는, 상기 관심의 단백질을 부호화하는 핵산을 포함하는 발현 카셋(an expression cassette)을 그의 게놈안으로 삽입하였기 때문에, 그의 젖샘들에서 상기 관심의 재조합 인간 단백질을 생성하며, 상기 관심의 단백질은 상기 유전자 이식 포유류의 우유에서 유전자 이식 단백질의 발현을 허용하는 특정 프로모터의 통제하에 있다.
유전자 이식 동물의 우유에서 상기 인간 혈장 단백질을 생성하는 방법은 다음의 단계들로 이루어질 수 있다: 관심의 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 분자는 비인간 포유류의 배아에 통합되어 있으며, 상기 유전자는 우유에서 자연적으로 분비되는 프로모터(예를 들어, 카제인 프로모터, 베타-카제인 프로모터, 락트알부민 프로모터, 베타-락토글로불린 프로모터 또는 WAP 프로모터)의 통제하에 있다. 그 후에 그 배아는 동일 종(the same species)의 포유류 암컷에 놓여진다. 그 배아로부터 생긴 포유류가 충분하게 발육되면, 그 포유류에 의한 젖분비가 유도되고, 이어서 우유가 수집된다. 그리고 나서, 우유는 관심의 재조합 인간 단백질을 함유한다.
인간이외에 포유류 암컷의 우유에서 단백질을 제조하는 방법의 예는 문헌 EP 0 527 063에 제공되어 있으며, 그것의 교시는 본 발명의 단백질을 제조하는데 재현될 수 있다.
WAP (Whey Acidic Protein) 프로모터를 함유하는 프라스미드는 WAP 유전자의 프로모터를 포함하는 서열을 도입함으로써 생성되며, 이 프로스미드는 WAP 프로모터의 제어하에서 놓여진 외부 유전자(foreign gene)를 받을 수 있는 방식으로 준비되어 있다. 프로모터와 본 발명의 단백질을 부호화하는 유전자를 함유하는 프라스미드는 암토끼의 배아들의 수컷 전핵안으로의 미량주사에 의해 유전자 이식 암 토끼를 얻는데 사용된다. 그리고 나서, 배아들은 호르몬에 의해 제조된 암컷들의 수란관안으로 놓여진다. 전이유전자들의 존재는 얻어진 젊은 유전자 이식 토끼들로부터 추출된 DNA를 사용하는 Southern 기법에 의해 밝혀진다. 동물들의 우유에서의 농도들은 특정 방사선 면역 분석(radioimmunological assays)에 의해 측정된다.
다른 문헌들은 인간이 아닌 포유류 암컷의 우유에서 단백질을 제조하는 방법을 공개하였다. 문헌 US 7,045,676 (유전자 이식 생쥐) 및 EP 1 739 170 (유전자 이식 포유류에서의 폰 빌리 브란트 인자의 생산)을 참조할 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 정제방법은 또한 인간 혈장 시료, 또는 인간 혈장의 동결침전된 분획과 같은 인간 혈장의 분획으로부터 정제된 혈장 단백질을 얻는데 매우 적합하다.
상기 언급된 정제의 일부 실시예에서, 표적 혈장 단백질은 인간이다.
상기 정제 방법의 일부 실시예에서, 시료는 하나 이상의 비인간 혈장 단백질을 포함한다.
상기 정제 방법의 일부 실시예에서, 상기 인간 혈장 단백질은 상기 비인간 응고성 단백질에 상동성이다.
상기 정제 방법의 일부 실시예에서, 상기 인간 응고성 단백질은 상기 비인간 응고성 단백질의 동족체이다.
상기 정제 방법의 일부 실시예에서, 출발 시료는 인간 혈장 시료, 또는 그의 분획, 또는 관심의 단백질로 유전자 이식한 비인간 포유류의 체액이며, 정제될 상기 관심의 단백질을 포함하는 원재료(crude material)로 구성될 수 있다. 유전자 이식한 비인간 포유류의 체액은 우유 또는 우유의 탈지 분획 또는 카제인-미셀-결여 분획(casein-micelle-depleted fraction)과 같은 우유의 분획을 포함한다.
그러나, 상기 실시예는 출발 원재료 시료(crude starting sample)에서 수많은 단백질이 존재함으로써 특히 친화성 기질이 뭉칠 위험이 있기 때문에 본 발명 정제방법의 바람직한 실시예가 아니다.
바람직한 실시예에서, 상기 출발 시료는 용액 중 부유된 상태로 관심의 혈장 단백질을 포함하는 액체 용액으로 구성되고, 상기 액체 용액은 혈장 단백질을 정제하는 다단계 방법동안 생성된 중간 생성물로 구성된다.
실 예로서, 상기 단백질로 유전자 이식한 비인간 포유류의 체액으로부터 혈장 단백질을 정제하는 방법을 위하여, 출발 시료는 상기 비인간 유전자 이식 포유류의 우유를 여과하는 데 사용된 이온 교환 크로마토그래피의 용출액으로 구성될 수 있다. 본 발명에 따른 정제 방법의 특정 실시예는 실시예에 설명된다.
같은 방법으로, 인간 혈장으로부터 관심의 혈장 단백질을 정제하는 방법을 위하여, 출발 시료는 인간 혈장 시료의 동결침전된 분획을 사용한 심층 여과(deep filtration) 단계에서의 여액으로 구성될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 정제 방법을 수행하기 위한 친화성 기질의 사용 조건은 예를 들어 리간드 항체가 고정화된 면역친화성 기질 타입(immunoaffinity substrate type)와 같은, 종래의 크로마토그래피 기질을 사용하는 종래의 조건과 매우 유사하다. 당업계의 기술은, 예를 들어, Bailon et al.의 책에서 참조할 수 있다 (Pascal Bailon, George K. Ehrlich, Wen-Jian Fung and Wolfgang Berthold, An Overview of Affinity Chromatography, Humana Press, 2000).
그러나, 앞으로 명세서에 기재될 바와 같이, 본 발명 방법의 용리 단계 c)의 조건은 혈장 단백질을 정제하는 데 매우 이롭다.
단계 a)에서, 정제될 시료의 적절한 양이 친화성 기질과 접촉한다.
(i) 상기 친화성 기질에 고정된 핵산 압타머 와 (ii) 정제될 시료에 포함된 관심의 혈장 단백질의 복합체가 형성된다.
인자 VII을 포획하는 조건은 MgCl2를 저농도로 포함하거나 전혀 포함하지 않은 버퍼가 단계 a)에서 사용될 때 개선된다는 것이 실시예에서 밝혀졌다.
"MgCl2를 저농도로 포함하는 버퍼"라는 표현은 최종 MgCl2 농도가 1　mM미만인 버퍼를 의미하도록 의도된 것이다.
MgCl2 농도가 1　mM미만인 버퍼는 MgCl2 농도가 0.5　mM, 0.1　mM, 0.05　mM 및 0.01　mM미만, 바람직하게는 0 mM인 버퍼를 포함한다.
일 특정 실시예에서, 방법은 a')친화성 기질을 세척 버퍼로 세척하는 단계를 포함한다. 바람직하게는 방법은 a')이온 강도를 증가하는 동안 친화성 기질을 세척하는 단계, 예를 들어 단계 a)의 이온 강도와 비교하여 이온 강도가 증가된 세척 버퍼로 세척하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 세척 버퍼의 이온 강도는 단계 a)의 이온 강도와 비교하여 2 내지 500배 증가된다. 바람직하게는, 세척 버퍼의 이온 강도는 단계 a) 이온 강도와 비교하여, 100 내지 500배, 더 바람직하게는 200 내지 500배 증가된다.
단계 a')에서, 높은 이온 강도, 특히 높은 NaCl농도를 갖는 세척 버퍼를 사용하면 인자 VII이 친화성 기질에 결합하는 데 영향을 주지 않으면서 친화성 기질에 비특이적으로 결합된 물질을 효과적으로 제거할 수 있음이 실시예에서 밝혀졌다.
그러므로, 단계 a')에서, 최종 NaCl 농도가 적어도 1　M인 세척 버퍼가 바람직하게 사용되었다.
본 발명에 따르면, 최종 NaCl 농도가 적어도 1　M인 세척 버퍼는 최종 NaCl 농도가 적어도 1.5　M, 2　M, 2.5　M 또는 적어도 3　M인 세척 버퍼를 포함한다.
바람직하게는, 방법의 단계 a')에서 사용된 세척 버퍼는 최종 NaCl 농도가 3.5　M 이하이다. 바람직하게는, 방법의 단계 a')에서 사용된 세척 버퍼는 최종 NaCl 농도가 1.5 내지 3.5, 바람직하게는 2 내지 3.5, 바람직하게는 2.5 내지 3.5, 바람직하게는 3 내지 3.5이다.
단계 a')에서, 높은 소수성, 특히 높은 프로필렌 글리콜 농도를 갖는 세척 버퍼를 사용하면 인자 VII이 친화성 기질에 결합하는 데 영향을 주지 않으면서 친화성 기질에 비특이적으로 결합된 물질을 효과적으로 제거할 수 있음이 실시예에서 밝혀졌다.
그러므로, 단계 a')에서, 20% (v/v) 이상의 최종 프로필렌 글리콜 함량을 가지는 세척 버퍼가 바람직하게 사용되었다.
본 발명에 따르면, 20% (v/v) 이상의 최종 프로필렌 글리콜 함량을 가지는 세척 버퍼는, 세척 버퍼의 총 부피에 대하여, 최종 프로필렌 글리콜 함량이 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 또는 적어도 60%(v/v)인 세척 버퍼를 포함한다.
바람직하게는, 방법의 단계 a')에서 사용된 세척 버퍼는 최종 프로필렌 글리콜 함량이 50% 이하이다. 바람직하게는, 방법의 단계 a')에서 사용된 세척 버퍼는 최종 프로필렌 글리콜 함량이 20% 내지 50%, 바람직하게는 30% 내지 50%이다.
일 특정 실시예에 따르면, 단계 a')에서 사용된 세척 버퍼 상기 언급된 NaCl 및 프로필렌 글리콜 모두를 포함한다.
단계 b)는 단계 a)동안 핵산 압타머와 복합체로 형성된 관심의 혈장 단백질 분자들을 용리하는 단계로 구성된다.
실시예에 예시되는 바와 같이, 상기 정제 방법의 구체적 이점은 (i) 상기 친화성 기질에 고정된 핵산 압타머 와 (ii) 상기 혈장 단백질로 형성된 복합체를 EDTA와 같은 2가-이온-킬레이트화제와 접촉시킴으로써, 용리 단계를 수행할 수 있다는 것이다.
본 발명 친화성 기질의 속성때문에 가능한 이 기술의 이점은 적어도 부분적으로 관심의 혈장 단백질을 저하시킬 수 있는, 극단적인 용리 조건들을 필요로 하지 않으면서 혈장 단백질을 용리하게 한다는 것이다. 피해야 되는 상기 극단적인 조건들은 친화성 기질, 특히 고정된 항체를 포함하는 친화성 기질에서 단백질을 정제하는 공지의 방법에서 흔히 실행되는 용리 단계에서의 산성 pH의 사용을 포함한다.
그러므로, 상기 정제 방법의 일부 실시예에서, 단계 b)는 친화성 기질을 2가-이온-킬레이트화제, 바람직하게는 EDTA를 포함하는 용리 버퍼와 접촉시킴으로서 수행된다.
실 예로써, 용리 버퍼는 최종 EDTA 농도가 1　mM 이상 30　mM 이하일 수 있다.
"1　mM 이상"이라는 표현은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mM 이상을 포함한다.
"30　mM 이하"라는 표현은 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 또는 11 mM 이하를 포함한다.
단계 c)에서, 정제된 관심의 혈장 단백질은 단계 b) 후반에서 획득된 용리 액체를 수집함으로써 회수된다.
단계 c) 후반에서, 관심의 혈장 단백질의 정제된 액체 조성물이 획득된다.
상기 정제된 액체 조성물은 직접 병에 담기(direct bottling) 또는 적합한 용액에 희석한 후 병에 담기, 또는 바람직하게는 멸균 및 비발열성(apyrogenic) 조건에서, 동결-건조한 후, 주위 온도가 -4℃ 또는 선택된 조건에 따라 낮은 온도인, 적절한 조건 하에서 저장하는 것을 포함하는, 단백질을 가공하고 저장하는 어느 공지 기술에 따라, 그 후 적절하게 처리될 수 있다.
본 명세서에 이미 언급된 바와 같이, 본 발명의 친화성 기질은 용리 단계 c)에서 혈장 단백질의 모든 분자들이 순서대로 방출될 수 없고, 그 결과 이후 정제 싸이클에서 자유 압타머 부위의 수가 감소되기 때문에, 관심의 혈장 단백질을 정제하는 데 사용하는 연속 싸이클에서, 그의 흡수 용량이 감소될 수 있다.
그러므로, 모든 공지된 크로마토그래피 기질에서와 같이, 상기 기질로부터 혈장 단백질의 모든 분자들을 방출하고, 친화성 기질의 고체 물질에 일반적으로 비특이적 결합에 의해 결합될 수 있는 물질을 제거하기 위하여, 적절한 시기에, 친화성 기질을 재생하는 단계를 수행하는 것이 필요하다.
따라서, 일부 실시예에서, 본 발명의 정제 방법은 d) 친화성 기질을 재생 용액과 접촉함으로써 친화성 기질을 재생하는 부가적 단계를 포함한다.
크로마토그래피 기질, 특히 친화성 크로마토그래피 기질을 재생하기 위한 다양한 버퍼는 당업계에 잘 알려져 있고, 방법의 d)단계에서 사용될 수 있다. 이 당업계에 알려진 기술은 예를 들어, Mohr et al.의 책(Affinity Chromatography: Practical and Theoretical Aspects, Peter Mohr, Klaus Pommerening, Edition: illustrated, CRC Press, 1985)을 참조할 수 있다.
실 예로써, d)친화성 기질을 재생하는 단계는 상기 기질을 실시예에서 예시되는 바와 같이 50　mM 트리스(Tris), 50% 에틸렌 글리콜 버퍼 용액과 접촉시킴으로써 수행될 수 있다.
실시예에서 예시되는 바와 같이, 상기 정제 방법은 정제된 최종 생성물에 포함된 단백질 총 중량에 대해서 매우 높은 순도, 바람직하게는 99.95% 보다 높은 순도의 혈장 단백질을 얻는 것을 가능하게 한다.
특히 출발 시료가 비인간 유전자 이식 포유류에서 자연적으로 생성된 단백질과의 혼합물로서 재조합 형태인, 관심의 인간 혈장 단백질을 포함하는 시료로 구성된 실시예에서, 상기 정제 방법의 다른 이점은 관심의 재조합 인간 단백질을 고 순도로 포함하는 최종 조성물이 상기 유전자 이식 포유류로부터 발생한 단백질,특히 상기 재조합 인간 단백질의 동족체인 상기 포유류의 단백질을 실질적으로 포함하지 않는다는 것이다.
실 예로써, 유전자 이식 토끼의 우유에서 생성된 후, 본 명세서에 정의된 정제 방법으로 정제된 재조합 인간 인자 VII이 출발 시료에 최초로 포함된 상기 단백질의 중량에 대하여, 상기 유전자 이식 포유류 단백질 중량의 1.5% 미만을 포함한다는 것이 실시예에서 밝혀졌다. 본 발명에 따른 정제 방법과 동일한 시행에서, 출발 시료에 존재하는 재조합 인간 인자 VII의 85 중량%는 재조합 인간 인자 VII에 대하여, 본 단백질 중량의 99.95%보다 높은, 고순도로 최종 생성물에 포함되어 있다.
본 발명의 목적은 또한 상기 재조합 인간 단백질을 적어도 99.9 중량% 포함하고 비인간 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 재조합 인간 혈장 단백질의 정제된 조성물이다.
본 발명은 또한 정제된 조성물 단백질의 총 중량에 대하여, 상기 재조합 인간 단백질을 99.9 중량% 이상, 비인간 단백질을 0.1% 미만을 포함하는 재조합 인간 혈장 단백질의 정제된 조성물에 관한 것이다.
상기 정제된 조성물에서, "99.9% 이상"은 99.91%, 99.92%, 99.93%, 99.94%, 99.95%, 99.96%, 99.97%, 99.98% 및 99.99% 이상을 포함한다.
상기 정제된 조성물에서, "0.1% 미만"은 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02% 및 0.01% 미만을 포함한다.
본 발명은 또한 약물로서 이용될 수 있는, 상기 정의된 정제된 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제와 결합하는, 상기 정의된 재조합 인간 혈장 단백질의 정제된 조성물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 응고성 질환을 치료하기 위한, 상기 정의된 정제된 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 응고성 질환을 치료하기 위한 약물을 제조하는, 상기 정의된 정제된 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따라 유리하게 사용될 수 있는, 응고성 단백질과 특이적으로 결합하는 압타머의 구체적인 실시예는 하기에 기술되었다.
본 발명에 따라 사용되기 위한 압타머들의 구체적인 실시예
출원인은 (i)공통적인 구조적 특성과 (ii)공통적인 기능적 특성 사이에 관련이 있음을 보여주기 위하여, 혈장 단백질에, 특히 인간 인자 VII/VIIa에 특정하게 결합한 핵의 압타머 군을 구성했다.
구조적 관점에서, 핵산의 군 또는 인간 인자 VII/VIIa에 특정하게 결합하고 본 발명에 따라 사용될 수 있는 핵의 압타머는, 아래 식(Ⅰ)의 핵산과 적어도 40%의 뉴클레오티드 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드의 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드들를 포함한다.
5'-[SEQ ID No.1]x-[SEQ ID No. X]-[SEQ ID No.2]y-3' (Ⅰ),
여기서,
- "SEQ ID No. X"는, SEQ ID No. 3 내지 SEQ ID No. 85 및 SEQ ID No. 87 내지 SEQ ID No. 100 계열의 핵산으로 구성된 군으로 부터 선택된 핵산으로 구성하고,
- "x"는 0 또는 1의 정수이고, 그리고
- "y"도 0 또는 1의 정수이다.
일부의 실시예들에서, SEQ ID No. X 계열의 핵산은, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 뉴클레오티드들의 길이를 가진다.
다른 실시예들에서, SEQ ID No. X 계열의 핵산은, 43, 44, 45, 46, 47, 48 또는 49 뉴클레오티드들의 길이를 가진다.
일부의 다른 바람직한 실시예들에서, SEQ ID No. X 계열의 핵산은, 43, 44 또는 45 뉴클레오티드들의 길이를 가진다.
전에 언급한 바와 같이, 식 (Ⅰ)의 핵산은, 적어도 15개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다.
일부의 실시예들에서, 식(Ⅰ)의 핵산은, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 또는 81개의 결합하는 뉴클레오티드 길이를 갖고, 명시된 길이 각각을 정확하게 갖는다.
식(Ⅰ)의 압타머를 얻는 방법의 일부 실시예들에서, 혈장 단백질에 특정하게 결합한 관심의 핵산의 군을 구성하기 위해 수행되는 연속적인 선택 사이클은, 각 연속적인 선택 단계에서, 그들의 5'와 3' 말단 각각에, 다양한 서열 SEQ ID No. X을 구조적으로 형성하는, 서열 SEQ ID No. 1과 SEQ ID No. 2를 포함하는, 핵산 압타머의 셋(set) 또는 서브셋(subset)을 동정 및 특성 분석했다. 본 발명의 핵산 압타머의 주요 군에서, 모든 다양한 서열 SEQ ID No. X는, 그들 사이에 적어도 40%의 뉴클레오티드 순서 동일성을 갖는다. 이것은 서열 SEQ ID No. X에서, 구조 장애(structural constraint)는, 혈장 단백질에 대한 결합 속성을 유지하기 위하여, 각각 이들 핵산 압타머의 5' 및 3'말단에 위치된 서열에 대한 구조 장애보다 작다는 것을 의미한다.
정수 "x"는 0이고 정수 "y"는 1일 때, 본 발명의 핵산 압타머는 아래식 (I-1)의 핵산과 적어도 40%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함한다:
5' -[SEQ ID No. X]-[SEQ ID No. 2] -3' (I-1).
정수 "x"는 1이고 정수 "y"는 0일 때, 본 발명의 핵산 압타머는 아래식 (I-2)의 핵산과 적어도 40%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함한다:
5'-[SEQ ID No. 1] -[SEQ ID No. X]-3'(I-2).
정수 "x"는 0이고 정수 "y"는 0일 때, 본 발명의 핵산 압타머는 아래식 (I-3)의 핵산과 적어도 40%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함한다:
5'-[SEQ ID No. X]-3' (I-3).
그러므로, 상기 핵산 압타머는, 서열 SEQ ID No. 3 내지 서열 SEQ ID No. 85 및 서열 SEQ ID No. 87 내지 서열 SEQ ID No. 100의 염기서열을 갖는 핵산으로 구성된 군으로 부터 선택된 핵산과, 적어도 40%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 15개 이상 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함한다.
일반적으로, 이차 폴리뉴클레오티드 또는 핵산과 적어도 40%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 일차 폴리뉴클레오티드는 상기 이차 폴리뉴클레오티드 또는 핵산과 적어도 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 100%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는다.
서열 SEQ ID No. X을 포함하는 본 발명 핵산의 일부 실시예에서, 상기 서열 SEQ ID No. X은 서열 SEQ ID No. 3 내지 서열 SEQ ID No. 85 및 서열 SEQ ID No. 87 내지 SEQ ID No. 100 중에서 하나 이상은 적어도 40%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 서열의 15개 이상 연속된 뉴클레오티드를 갖는 핵산으로 구성된 군에서 선택된다.
서열 SEQ ID No. X을 포함하는 본 발명 핵산의 일부 실시예에서, 상기 서열 SEQ ID No. X는 서열 SEQ ID No. 3 내지 서열 SEQ ID No. 85 및 서열 SEQ ID No. 87 내지 서열 SEQ ID No. 100 중에서 하나 이상은, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 100%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산으로 구성된 군에서 선택된다.
이것은 앞서 언급한 본 발명은 상기 정의된 식 (I) 시리즈의 적어도 15개의 연속된 뉴클레오티드를 갖는 단일-가닥 핵산의 군을 포함한다는 결론을 이끌어 낸다.
본 발명의 목적을 위해서, 두 개의 핵산 염기서열 사이의 "동일성 분율(percentage identity)"은 비교 창(window of comparison)을 통해서, 최적으로 배열된 두 염기서열을 비교함으로써 결정된다.
그러므로, 비교 창에서 뉴클레오티드 서열의 일부는 두 염기서열 사이의 최적 배열을 획득하기 위한 방법으로 참조 서열(이들 부가 또는 삭제를 포함하지 않는다)에 비해 부가 또는 삭제(예를 들어 "갭")을 포함할 수 있다.
동일성 분율은 두 비교되는 염기서열의 동일한 핵염기(nucleic base)가 관찰되는 위치의 수를 결정하고, 두 핵염기 사이에 동일성이 있는 위치의 수를 비교 창에서의 총 위치의 수로 나누고, 서로에 대한 두 염기서열의 뉴클레오티드 동일성 분율을 얻기 위해 결과물을 100으로 증가시킴으로써 계산된다.
비교를 위한 염기서열의 최적 배열은 공지의 알고리즘을 사용한 컴퓨터에 의해 수행될 수 있다.
전적으로 바람직하게는, 염기서열 동일성 분율은 파라미터들이 하기로 고정된, 클러스탈 W 소프트웨어(버전 1.82)에 의해 결정된다: (1) CPU MODE = ClustalW mp; (2) ALIGNMENT = "full"; (3) OUTPUT FORMAT = "aln w/numbers"; (4) OUTPUT ORDER = "aligned"; (5) COLOR ALIGNMENT = "no"; (6) KTUP (word size) = "default"; (7) WINDOW LENGTH = "default"; (8) SCORE TYPE = "percent"; (9) TOPDIAG = "default"; (10) PAIRGAP = "default"; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = "none"; (12) MATRIX = "default"; (13) GAP OPEN = "default"; (14) END GAPS = "default"; (15) GAP EXTENSION = "default"; (16) GAP DISTANCES = "default"; (17) TREE TYPE = "cladogram" 및 (18) TREE GRAP DISTANCES = "hide".
본 발명은 또한 하기 실시예들에 의해 예시된다.
실시예 1: 친화성 기질의 제조
친화성 기질은 스트렙타아비딘 (스트렙타아비딘-아가로스-노바겐®)이 그래프트된 매트릭스로 구성된 고체 기질 물질로부터 제조되었다.
1 ml의 겔이 컬럼 (i.d. 11　mm)으로 구성된 컨테이너에 넣어졌다. 겔은, 저장 용제를 제거하기 위하여, 정제수로 세척되었다.
겔의 속성들:
- 비오틴 흡수 용적: ≥85 나노몰/겔의ml
- 기능 테스트: 포획 > AT에서 30분동안 비오틴 부착된 트롬빈(biotinylated thrombin)의　99%
- 기타 테스트: 프로테아제-프리, 엔도/엑소뉴클레아제-프리, RNase-프리
- 방부제: 100　mM 인산 나트륨 pH　7.5 + NaN3 0.02
포장된 컬럼(packed column; 베드 높이　=　1　cm)의 유출구는 254　nm에서의 UV 필터가 장착된 흡광 탐지기 및 기록 장치와 연결되어 있다.
비오틴 부착된 서열 SEQ ID No. 86의 항-인간 FVII 핵산 압타머는 0.5　mg/0.187　ml의 최종 농도, 예를 들어 0.1　mM의 최종 몰 농도로 정제수에 용해되어 있다. 핵산 압타머 용액은, 고체 기질 물질에 압타머를 고정하기 위하여, 표준 싸이클에 의해서 95℃에서 활성화되었다.
핵산 압타머 용액은 4.8　ml의 정제수로 미리 희석된 후 1.5　ml의 Me++ 버퍼 (5배 농축)로 희석되었다.
흡광 탐지기는 1　AUFS (풀 스케일 흡광 단위)로 조정되었고 이 용액의 254　nm에서의 OD는 0.575 AU254에서 기록되었다.
비오틴 부착된 핵산 압타머 용액은 미리 포장된(prepacked) 스트렙타아비딘-아가로스 겔로 주입되고 연동 펌프에 의해 2.5　ml/분의 유속, 예를 들어 겔의 접촉 시간이 24초(유입/유출 I/O)인 유속으로 재순환되었다. 이 조건들 하에서, 254　nm에서의 OD는 0.05　AU254, 예를 들어 91%의 이론적 결합 지수,예를 들어 겔 미리리터당 0.455　mg의 핵산 압타머에서 급격히 안정화된다.
고체 기질 물질에 그래프트된 스트렙타아비딘과 특이적으로 결합하지 않은 핵산 압타머를 제거하기 위하여 10　mM CaCl2 + 4 mM MgCl2 버퍼로 세척한 후 2　M NaCl로 세척하였다.
실시예 2: 재조합 인간 인자 VII을 정제하는 방법
압타머 친화성 기질은 PCT 출원 번호　WO2008/099077에 기재된 기술에 의해 제조된 FVII/FVIIa의 정제된 조제물을 사용하여 테스트되었다.
정제될 시료의 제조
출발 생리적 물질은 재조합 인간 FVII를 포함하는 유전자 이식 토끼 우유이다. 발현 카셋은 b-카제인 유전자 프로모터의 조절하에 있는 인간 FVII 전이유전자를 포함한다.
간단히, 140 미리리터의 우유는 태어난지 4일 내지 12일 된 첫 수유기가 된 두마리의 토끼로부터 수집되었다. 수집된 우유에서 아미돌리틱(amidolytic) FVII의 평균 역가는 928　IU/ml이다.
테스트를 위해서, 토끼 우유는 37℃의 수조에서 해빙된 후, 7.5의 pH에서 최종 구연산염 농도가 62　g/l가 되게 하기 위하여 구연산 나트륨으로 희석되었다.
구연산 나트륨의 처리는 포스포칼식 카제인 미셀(phosphocalcic casein micelle)을 불안정하게 할 수 있다.
우유의 지질이 풍부한 단백질 용액은 (i) 15 내지 0.5 ㎛의 다공성 역치를 갖는 심층 여과 및 (ii) 0.2 ㎛의 막 여과의 여과 순서에 의해 정화된다.
198　IU/ml 역가의 FVII, 예를 들어 유전자 이식 FVII 36　mg을 갖는 여과된 용액 360　ml는 16　ml의 용적을 갖는 MEP-HyperCel® 크로마토그래피 겔 (Pall BioSepra)로 미리 정제되었다. 이 포획 겔은 동시에 FVII 최초 용량의 60%를 보유하면서, 다수의 카제인을 포함하여, 95%의 우유 단백질을 제거하는 것을 가능하게 한다.
상기 단계의 후반에서 획득된 17.5 mg의 저-순도 FVII (~　5%)은 5　mM의 염화 칼슘을 포함하는 78　ml의 버퍼에 의해 용출된 20　ml의 인간 FVII를 갖는, Q-세파로스® XL 겔 (GE 헬스케어)을 사용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 아미돌리틱 FVII의 농도는 337 IU/ml, 예를 들어 1 ml에 0.17　mg의 FVII이고, 총 단백질의 농도는 280　nm에서 OD의 측정에 의해 0.18　mg/ml로 계산되고 e1%= 13, 예를 들어 94%의 FVII 순도이다.
토끼 우유로부터 유래한 잔여 단백질은, GLA-도메인 또는 EGF-도메인 단백질과 같은 구조적 상동성이 있거나 물리화학적 상동성 (이온 전하 및/또는 분자 크기)이 있기 때문에, 이 단계에서 FVII로부터 분리하기 어렵다. 공지 기술들은 직교 기술 (수산화인회석 겔로 분리 및 사이즈 배제 크로마토그래피의 결합)에 의해 순도를 99.95%까지 개선시킬 수 있다. 그러나, 인간에게 반복적으로 주입하기 위하여, 유전자 재조합 단백질에 허용된 외인성 단백질에 대한 로드는 50　ppm을 초과하여서는 안되며, 예를 들어 순도 > 99.995%를 이다. 이러한 순도는 오직 친화성 기질에서 정제한 후에 달성되는 것으로 보인다.
본 발명의 친화성 기질에서 재조합 인간 FVII 를 정제하는 단계
선행 단계의 후반에서 획득된 6　ml의 정제된 인간 FVII (1.1　mg의 FVII) 용액은 본 발명의 친화성 기질의 고 순도에서 재조합 인간 FVII를 정제하는 단계에서 사용된다.
4 mM MgCl2 및 10　mM CaCl2 및 pH 7.5로 미리 조정된, 선행 단계에서 획득된 FVII 용액은 0.1　ml/minute의 유속, 예를 들어 친화성 기질에 10분간 접촉하는 시간(I/O)에서 연동펌프에 의해 압타머-아가로스 겔(친화성 기질)로 주입된다.
주입 후에, 겔은 pH 7.5에서 50　mM 트리스 + NaCl 50mM + 4 mM MgCl2 + 10 mM CaCl2 버퍼로 세척된다.
용액의 비흡착된 10　ml 용적이 수집되었다.
FVII는 pH 7.5에서 50　mM 트리스 + EDTA 10　mM 버퍼로 용리되었다. 용리 피크의 수집은 OD 프로파일에 따라 실행되었다.
몰 계산에 따라, 친화성 기질에 고정된 핵산 압타머의 양은 FVII 분자들과의 몰-대-몰 작용에서, FVII 0.9　mg의 친화성 기질의 절대용량에 해당하는, 17 나노몰이었다.
도 1은 254 나노미터에서 흡광도 (OD) 지수를 연속적으로 모니터링한, 토끼 우유에서 생성된 재조합 인간 FVII의 크로마토그래피 프로파일을 도시하였다.
도 1에서, 주입 (1)후에, 흡착 곡선의 굴곡 (2)은 친화성 기질이 재조합 인간 FVII와 포화되기 시작함을 나타낸다. 시간 (3)에서, 재조합 인간 FVII의 주입은 멈추었다. 도 1에서 시간의 선형 눈금을 나타내기 위하여, 주입 시작 시간 (1)과 주입 종료 시간 (3) 사이의 간격은 10분으로 표시되었다. 친화성 기질은 계속해서 관심의 응고성 단백질로 포화된다: (i) 친화성 기질의 항-FVII 핵산 압타머 와 (ii) 정제될 조성물에 처음부터 포함된 재조합 인간 FVII 분자들의 복합체가 형성된다. 정제될 조성물이 컬럼에 옮겨진 후에, 상기 명시된 세척 버퍼로 컬럼을 세척하는 단계 (6)가 실행되었다. 그 후 용리 단계는 시간 (4)에서, 10　mM의 최종 EDTA 농도를 포함하는 버퍼 용액을 주입함으로써 실행되었다. 흡착 피크는 핵산 압타머/재조합 FVII 복합체로부터 재조합 인간 FVII의 방출을 나타낸다. 재조합 인간 FVII 분자들이 급속히 방출된 후 적은 용량이 된다는 것을 주목해야 한다. 계속해서, 본 발명의 친화성 기질에 의해서, 고농도의 재조합 인간 FVII 단백질의 용리 용액이 획득된다. 시간 (5)에서, 친화성 기질을 재생하는 단계가 50　mM 트리스 버퍼를 가지고 실행된다. (7)에서 볼 수 있는 흡광 피크는 재생 단계에 의해 친화성 기질로부터 방출된 물질에 해당한다.
친화성 기질의 역학적 결합 능력(Dynamic binding capacity)
하기의 표 1은 0.45 내지 0.49　mg/ml의 친화성 매트릭스, 예를 들어 50 내지 55%의 생물학적 이용가능성이 있는 리간드의 역학적 결합 능력을 보여주는, 테스트 결과를 나타낸다.
EDTA에서는, 약 75%의 역학 용리가 산출되었다.
압타머-아가로스 매트릭스 테스트의 재조합 인간 FVII 및 총 단백질 결과:
재조합 FVII 단백질 (총 mg) DBC (mg/ml) DE(%)
출발 2228 100% 1.42 100%
최종
비흡수된 924 41% 0.57 40%
용출액 971 44% 0.61 43% 0.49 74%
중량에 대한 결과 85% 83%
출발: 출발 시료
최종: 분획 조성물
DBC: 역학적 결합 능력(Dynamic binding capacity)
DE: 역학 용리(dynamic elution); 퍼센트로 표현된, 용리된 재조합 FVII와 흡착된 재조합 FVII의 비를 나타낸다
친화성 기질의 특정 분리 능력 (Specific separation capacity)
친화성 기질은 토끼 우유 단백질에 특이한 ELISA 진단법에 의해 특이성에 대하여 평가되었다.
결과는 하기 표 2에 나타내었다.
친화성 기질 특이성 결과:
재조합 FVII
(총 mg) 		토끼 우유 단백질 (RMP) RMP
(ppm) 		% FVII 순도
출발 1.11 100% 16992 100% 16782 98.32%
최종
비흡수된 0.46 41% 14590 40% 34738 96.53%
용출액 0.49 44% 217 43% 492 99.95%
중량에 대한 결과 85% 83%
상기 표 2의 결과는 압타머-아가로스에 의해 유전자 이식 인간 FVII의 순도를 98.3% 내지 99.95%로 하는, 평균 2　log10의 제거가 얻어짐을 보여준다. 이것은 인간 FVII에 대하여 압타머의 우수한 특이성 및 잔여 토끼 우유 단백질에 대한 약한 상호작용을 보여준다.
이들 조건하에서는, FVII가 용리되지 않는다면, 용리 전에, 2M NaCl 및/또는 50%에서 프로필렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜과 같은 용액을 사용하여 중간 세척함으로써, 개선될 가능성이 있다.
실시예 2의 결과는 적어도 75%의 용리 수율을 갖는 리간드의 mg당 적어도 1　mg의 FVII의 역학적 결합 능력을 갖는 압타머-아가로스 겔 (Apta-2)에서의 친화성 기질의 우수한 속성들을 나타낸다. 잔여 토끼 우유 단백질 RMP의 2　log10의 제거에 의해, 특이성은 또한 (~　99.95%) 순도에서 분명한 개선을 보였다. 이들 2개의 최적화되지 않은 테스트에서 최종 수치는 약 500　ppm이다.
실시예 3: 인간 혈장 인자 IX를 정제하는 방법
A. 재료 및 방법
A.1. 친화성 크로마토그래피 기질
스페이서가 없는, Mapt-1 친화성 겔 물질, 이론적 리간드 밀도 0.46 mg/ml: 용적 1 ml.
압타머는 화학 커플링 반응에 의해 크로마토그래피 기질 물질과 직접 결합한다.
사용된 압타머는 서열 SEQ ID No. 101의 압타머이다.
A.2. 출발 생성물
출발 생성물은 베타펙트®라는 이름으로 LFB에 의해 판매된, 인간 혈장으로부터 유래된 인자 IX가 풍부한 조성물로 구성된다.
주입된 출발 물질: 베타펙트 MPVP (60% 순도의 혈장 FIX), 겔 ml당 인자 IX의 200 IU (예를 들어 800㎍) 적재, 접촉 시간 10분.
A.3. 정제 프로토콜
겔 평형: 0.050 M 트리스-HCl, 0.010 M CaCl2, pH 7.5,
용리: 0.020 M 트리스-HCl, 0.010 M EDTA, pH 7.5,
재생: 0.020 M 트리스-HCl, 1 M NaCl, 50% 프로필렌 글리콜, pH 7.5.
단백질 피크는 280 나노미터의 파장에서 흡광도 지수를 측정함으로써 감지되었다.
A.4. SDS PAGE 겔 에서의 전기영동에 의한 분석 프로토콜
10-웰 NOVEX 겔 (인비트로젠), 4-12%, 비스-트리스; MES 러닝 버퍼, 50분동안 200 V에서 이동. CBB (G250) 또는 AgNO3 (GE 키트) 염색.
B. 결과
결과는 도 2 및 3에 도시되었다.
도 2는 시간 함수로서 280 nm에서의 흡광도의 측정 지수에 대한 곡선을 나타낸다. 도 2에서, 1번 피크는 컬럼에 저류되지 않은 출발 생성물의 분획에 해당한다. 2번 피크는 용리 분획에 해당한다. 3번 피크는 재생 단계를 실행함으로써 기질로부터 제거된 분획에 해당한다.
도 3은 SDS PAGE 전기영동 겔의 이미지이다. 도 3에서 겔의 왼쪽부터 오른쪽으로, 레인은 하기 출발 생성물의 이동 결과를 나타낸다:
- 레인 "MD" : 베타펙트® 출발 조성물,
- 레인 "NR" : 도 2의 크로마토그래피 프로파일의 1번 피크에 해당하는 비저류 분획,
- 레인 "E1" : 도 2의 크로마토그래피 프로파일의 2번 피크에 해당하는 용리 분획.
단계 % FIX
출발 생성물 51%
비저류 44%
용리 100%
표 3은 다양한 분획에서 전기영동 프로파일을 통합함으로써 획득된 FIX의 순도 퍼센트를 나타낸다. FIX %는 CBB에 의해 염색된 겔의 전기영동 밴드의 밀도를 통합 정량 (quantitative integration)함으로써 (도 3에 해당하는 수치 데이타), 당업계에 널리 공지된 절차에 의해 계산되었다. 전기영동 밴드의 밀도를 통합정량하는 것은 적절한 스캐너로 겔을 스캐닝함으로서 얻을 수 있다.
도 3 및 표 3에 나타낸 결과는 도 2의 결과를 확인하다. 이 결과는 압타머가 고정된 크로마토그래피 기질은 인자 IX가 풍부한 혈장 분획과 같은 복합체 배지로부터 인간 인자 IX의 특이적 정제를 가능하게 한다는 것을 나타낸다.
용리액은 우수한 전기영동 순도를 나타내고 FIX의 기능성이 유지된다는 사실에 의해 특징지워진다고 결론지을 수 있다. 이 실험은 서열번호 101의 염기서열을 갖는 압타머의 크로마토그래피 기질에 직접 결합되고, 그 결과 스페이서 사슬이 없을 때에, 혈장 불순물을 포함하는 복합체 배지에서 FIX와 결합하고 FIX를 정제하는 능력을 보여준다.
실시예 4: 유전자 이식 암퇘지 우유의 추출물에 포함된 재조합 인자 IX를 정제하는 방법
A. 재료 및 방법
A.1. 친화성 크로마토그래피 기질
Mapt-1 압타머가 스페이서 사슬 없이 직접 결합되어 고정된 친화성 겔 물질. 이론적 리간드 밀도 0.46　mg/ml: 용량 1　ml.
압타머는 화학 커플링 반응에 의해 크로마토그래피 기질 물질에 직접 결합된다.
사용된 압타머는 서열 SEQ ID No. 101의 Mapt 1 압타머이다.
A.2. 출발 생성물
출발 생성물은 MEP 하이퍼셀로 정화되고 미리 정제된 유전자 이식 암퇘지 우유로 구성된다: 1.8% 순도. 시료는 구연산 나트륨을 제거하기 위하여 수지의 흡수/평형용 버퍼로 투석되었다. ml 당 인자 IX의 302 IU (예를 들어 1200㎍)의 로드.
A.3. 정제 프로토콜
겔 평형: 0.050 M 트리스-HCl, 0.010 M CaCl2, pH 7.5,
용리: 0.020 M 트리스-HCl, 0.010 M EDTA, pH 7.5,
재생: 0.020 M 트리스-HCl, 1 M NaCl, 50% 프로필렌 글리콜, pH 7.5.
시료는 10분동안 0.1　ml/min의 유속으로 주입된 후, 겔은 0.5　ml/min에서 5분동안 세척되었다. 용리 및 재생은 각 각0.5　ml/min의 유속으로 버퍼를 주입함으로써 실행되었다.
단백질 피크는 280 나노미터의 파장에서 흡광도 지수를 측정함으로써 감지되었다.
A.4. SDS PAGE 겔 전기영동에 의한 분석 프로토콜
10-웰 NOVEX 겔 (인비트로젠), 4-12%, 비스-트리스; MES 러닝 버퍼, 50분동안 200 V에서 이동. CBB (G250) 또는 AgNO3 (GE 키트) 염색.
A.5. 인자 IX에 대한 특정 활성의 측정 프로토콜
FIX 양의 측정 (항원 측정)은 공급사의 추천에 따라 세라크롬 0943 FIX Ag 키트 (Stago)로 수행되었다.
FIX의 효소 활성 측정은 공급사의 추천에 따라 비오펜 FIX 키트, 참조. 221802 (하이펜 바이오메드)를 사용하여 발색 테스트(chromogenic test)에 의해 수행되었다.
특정 활성은 하기 비율에 따라 계산되었다:
FIX의 효소 활성/FIX의 양.
B. 결과
결과는 도 4 및 5에 도시되었다.
도 4는 시간 함수로서 280 nm에서의 흡광도의 측정 지수에 대한 곡선을 나타낸다. 도 4에서, 1번 피크는 컬럼에 저류되지 않은 출발 생성물의 분획에 해당한다. 2번 피크는 용리 분획에 해당한다. 3번 피크는 재생 단계를 실행함으로써 기질로부터 제거된 분획에 해당한다.
도 4의 결과는 용리 피크가 매우 좁다는 것을 보여주고, 이것은 압타머가 고정된 크로마토그래피 기질의 인간 인자 IX에 대한 고 특이성을 나타낸다.
도 5는 SDS PAGE 전기영동 겔의 이미지이다. 도 5에서 겔의 왼쪽부터 오른쪽으로, 레인은 하기 출발 생성물의 이동 결과를 나타낸다:
-　레인 "E5": MEP 하이퍼셀 크로마토그래피 단계에 의해 미리 정제된 유전자 이식 인간 인자 IX를 포함하는 유전자 이식 암퇘지 우유의 출발 조성물,
-　레인 "E6": 도 4의 크로마토그래피 프로파일의 1번 피크에 해당하는 비저류 분획,
-　레인 "E7": 도 4의 크로마토그래피 프로파일의 2번 피크에 해당하는 용리 분획,
-　레인 "E8": 도 4의 크로마토그래피 프로파일의 2번 피크의 하류 및 3번 피크의 상류에서 수집된 용리 분획,
-　레인 "T FIX": 정제된 인자 IX 대조군.
도 5에 나타낸 결과는 도 4의 결과를 확인하다. 이 결과는 압타머가 고정된 크로마토그래피 기질은 인자 IX가 풍부한 혈장 분획과 같은 복합체 배지로부터 인간 인자 IX의 특이적 정제를 가능하게 한다는 것을 나타낸다.
또한, 실시예의 결과는 서열 SEQ ID No. 86의 Mapt 2 압타머가 고정된 친화성 크로마토그래피 기질위에 복합체 조성물의 출발 생성물을 통과시키면 고농도의 인간 인자 IX가 얻어질 수 있다는 것을 나타낸다.
용리액은 출발 생성물과 비교하여 상당한 순도(>　26-배)를 갖는 우수한 전기영동 순도를 나타낸다고 결론지을 수 있다. 용리액에서 확인된 두번째 밴드는 분명히 FIX의 다른 형태에 해당한다.
실시예 5: 인간 혈장 인자 VII을 정제하는 방법
A. 재료 및 방법
A.1. 친화성 크로마토그래피 기질
압타머 및 비오틴 사이에 스페이서 사슬 없이, 비오틴에 직접 결합된 "Mapt-2 코어" 압타머가 고정된 친화성 겔 물질. 압타머는 0.4　mg/ml의 이론적 리간드 밀도: 용량 1　ml로, 5'-말단 비오틴에 의해 스트렙타아비딘 겔(공급사 노바겐)에 고정되었다.
사용된 압타머는 서열번호 20의 염기서열을 갖는 Mapt-2 코어 압타머이다.
A.2. 출발 생성물
출발 생성물은 98%로 정제된 인간 혈장 인자 VII의 조성물로 구성된다.
A.3. 정제 프로토콜
겔 평형: 0.050 M 트리스-HCl, 0.010 M CaCl2, 0.05　mM MgCl2, pH 7.5,
용리: 0.020 M 트리스-HCl, 0.010 M EDTA, pH 7.5.
98%로 정제된 240㎍의 인간 혈장 인자 VII은 유속 0.5　ml/min로 평형 버퍼(equilibration buffer)속으로 주입되었다.
비저류성 물질의 피크를 감지한 후에, 용리 버퍼의 두개의 컬럼 용적이 주입되었다.
단백질 피크는 280 나노미터의 파장에서 흡광도 지수를 측정함으로서 감지되었다.
B. 결과
결과는 도 6 및 7에 도시되었다.
도 6은 시간함수로서 280　nm에서의 흡광도 측정 지수 곡선을 나타낸다. 도 6에서, 1번 피크는 컬럼에 저류되지 않은 출발 생성물의 분획에 해당한다. 2번 피크는 용리 분획에 해당한다.
출발 생성물 및 용리된 생성물은 분술물의 제거를 시각화하기 위하여 질산은 염색을 하여 SDS PAGE로 분석되었다. 도 7은 이 겔을 나타낸다: 1번 레인은 출발 생성물의 분획에 해당하고 2번 레인은 용리 분획에 해당한다. 출발 생성물의 높은 순도에 불구하고, 용리된 분획에 더 이상 어떤 오염 물질들 또는 저급한 형태들을 포함하지 않는다는 것은 주목할 만하다.
도 6 및 7의 결과는 서열번호 20의 염기서열을 갖는 압타머가 인간 FVII에 결합하고 EDTA의 존재하에서 그것을 특이적으로 용리할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 6: 토끼 FVII과 압타머의 결합 결여
A. 재료 및 방법
A.1. 친화성 크로마토그래피 기질
서열번호 86의 염기서열을 갖는 압타머가 0.35　mg/ml의 이론적 리간드 밀도: 용량 1　ml로, 5'-말단 비오틴을 통해 스페이서 사슬 (공급사 노바겐)에 의해 고정된, 스트렙타아비딘에 결합된 친화성 겔.
사용된 압타머는 서열번호 86의 염기서열을 갖는 압타머이다.
A.2. 출발 생성물
접촉 시간 10분, 유속 0.5　ml/min로, 토끼 혈장을 정제함으로써 얻어진 토끼 FVII가 풍부한 수산화인회석의 용출액.
A.3. 정제 프로토콜
겔 평형: 0.050 M 트리스-HCl, 0.010 M CaCl2, 0.05　mM MgSO3, pH 7.5,
용리: 0.050 M 트리스-HCl, 0.010 M EDTA, pH 7.5,
36 ㎍이 10분의 접촉 시간을 가지고 겔 속으로 주입되었다. 용리는 2　ml의 용리 버퍼를 주입함으로써 실행되었다.
단백질 피크는 280 나노미터의 파장에서 흡광도 지수를 측정함으로서 감지되었다.
A.4. 단백질 및 인자 VII에 대한 분획의 분석 프로토 콜
분획은 공급사의 추천 (인자 VIIa 스탯클랏 키트)에 따라 스타고 키트를 사용하여 발색법에 의해 아미돌리틱 활성을 분석하였다. 아미돌리틱 활성은 그 후 상기 분획을 포함하는 FVII의 ㎍으로 전환되었다.
B. 결과
결과는 하기 표 4에 기재되었다.
단계 단백질 (mg/ml) FVIIam (IU/ml) 용량
(ml) 		FVII 양
(㎍) 		순도 (%) 단계
수율(%)
출발 물질 1.38 57 2.5 71 2% 100%
투석된 용출액 0.97 21.8 3.4 36.7 1% 52%
Mapt-2 용출액 NA 0.04 4.0 0.08 NA 0.2%
표 4에서 결과는 토끼 인자 VII이 Mapt-2 압타머가 고정된 친화성 겔에 저류되지 않았음을 보여준다.
실시예 7: 인간 인자 VII과 비아코르 (NaCl에 저항)의 압타머와의 상호작용 프로토콜의 구체적 구현예
A. 재료 및 방법
여기서는 "Mapt2"라고 정의된, 서열 SEQ ID No. 86의 본 발명의 핵산 압타머 분자가 고정된 고체 기질이 제작되었다. 고체 기질에 결합하기 전에, Mapt2 압타머의 5'말단은 PEG(C18)의 4 분자들로 구성된 스페이서 사슬에 화학적으로 결합되었다. 그 후, 압타머에 결합된 말단의 반대쪽에 위치한, 스페이서 사슬의 자유 말단은 비오틴 분자에 결합되었다.
고정된 스트렙타아비딘 분자를 포함하는 고체 기질이 제작되었다 (시리즈 S 센서 칩 SA, GE).
상기 고체 기질은 그 후 기질의 스트렙타아비딘 분자와 압타머 화합물의 비오틴 분자사이의 비공유 결합에 의해, 서열 SEQ ID No. 86의 핵산을 고정하기 위하여 상기 압타머 화합물과 접촉되었다.
따라서 Mapt2 압타머는 3772 RU의 고정도로 고정되었다 (1 RU는 mm2당 고정된 생성물 약 1　pg에 해당한다).
유전자 이식 토끼 우유로부터 획득한 정제된 유전자 이식 인간 FVII (FVII HPTG, 순도: 98%)는 200　mM의 FVII 농도를 갖는 시료를 얻기 위하여 러닝 버퍼 (50 mM 트리스, 50 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, pH 7.4)에 용해되었다.
시료는 비오틴-스트렙타아비딘 상호작용에 의해 고정된 Mapt2 압타머가 포함된 칩 (고체 기질)으로 주입되었다. 다음으로, NaCl의 증가된 농도를 포함하는 버퍼가 고체 기질에 주입되었다 (1 M NaCl 내지 3 M NaCl의 범위의 3번 주입). 모든 주입은 60초 동안 30㎍/min 의 유속으로 실행되었다. NaCl을 포함하는 3개의 버퍼에 3번의 주입이 이루어진 후에, 용리 버퍼 (10mM EDTA)는 그 후 압타머로부터 FVII HPTG를 분리하기 위하여 75초동안 30㎍/min 의 유속으로 주입되었다.
이들 분석은 RPS 비아코르 T100 장치 (GE)에 의해 실행되었다. 기록된 상호작용의 모델링은 Biaevaluation 소프트웨어 (GE)에 의해 수행되었다.
Mapt2가 고정된 압타머와 유전자 이식 인간 FVII와의 결합 곡선은 버전 1.2의 비아코르® 제어 소프트웨어의 전용 모듈에 의해 계산되었다.
Mapt2 압타머와 인간 FVII의 결합 결과는 Mapt2 압타머와 인간 FVII의 결합은 NaCl을 포함하는 버퍼의 주입에 의해 해롭게 변경되지 않는다는 것을 알 수 있게 해준다.
B. 결과
결과는 도 8에 도시되었다.
실시예 8: 인간 인자 VII과 비아코르 (프로필렌 글리콜에 저항)의 압타머와의 상호작용 프로토콜의 구체적 구현예
A. 재료 및 방법
여기서는 "Mapt2"라고 정의된, 서열 SEQ ID No. 86의 본 발명의 핵산 압타머 분자가 고정된 고체 기질이 제작되었다. 고체 기질에 결합하기 전에, Mapt2 압타머의 5'말단은 PEG(C18)의 4 분자들로 구성된 스페이서 사슬에 화학적으로 결합되었다. 그 후, 압타머에 결합된 말단의 반대쪽에 위치한, 스페이서 사슬의 자유 말단은 비오틴 분자에 결합되었다.
고정된 스트렙타아비딘 분자를 포함하는 고체 기질이 제작되었다 (시리즈 S 센서 칩 SA, GE).
상기 고체 기질은 그 후 기질의 스트렙타아비딘 분자와 압타머 화합물의 비오틴 분자사이의 비공유 결합에 의해, 서열 SEQ ID No. 86의 핵산을 고정하기 위하여 상기 압타머 화합물과 접촉되었다.
따라서 Mapt2 압타머는 5319 RU의 고정도로 고정되었다 (1 RU는 mm2당 고정된 생성물 약 1　pg에 해당한다).
유전자 이식 토끼 우유로부터 획득한 정제된 유전자 이식 인간 FVII (FVII HPTG, 순도: 98%)는 200　mM의 FVII 농도를 갖는 시료를 얻기 위하여 러닝 버퍼 (50 mM 트리스, 10 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, pH 7.4)에 용해되었다.
시료는 비오틴-스트렙타아비딘 상호작용에 의해 고정된 Mapt2 압타머가 포함된 칩 (고체 기질)으로 주입되었다. 다음으로, 50% 프로필렌 글리콜을 포함하는 버퍼가 고체 기질에 주입되었다. 모든 주입은 60초 동안 30㎍/min 의 유속으로 실행되었다. 50% 프로필렌 글리콜을 포함하는 버퍼에 주입이 이루어진 후에, 용리 버퍼 (10mM EDTA)는 그 후 압타머로부터 FVII HPTG를 분리하기 위하여 75초동안 30㎍/min 의 유속으로 주입되었다.
이들 분석은 RPS 비아코르 T100 장치 (GE)에 의해 실행되었다. 기록된 상호작용의 모델링은 Biaevaluation 소프트웨어 (GE)에 의해 수행되었다.
Mapt2가 고정된 압타머와 유전자 이식 인간 FVII와의 결합 곡선은 버전 1.2의 비아코르® 제어 소프트웨어의 전용 모듈에 의해 계산되었다.
Mapt2 압타머와 인간 FVII의 결합 결과는 Mapt2 압타머와 인간 FVII의 결합은 프로필렌 글리콜을 포함하는 버퍼의 주입에 의해 해롭게 변경되지 않는다는 것을 알 수 있게 해준다.
B. 결과
결과는 도 9에 도시되었다.
SEQUENCE LISTING <110> LFB BIOTECHNOLOGIES <120> MEANS FOR PURIFYING A PROTEIN OF BLOOD PLASMA AND METHODS FOR IMPLEMENTING SAME <130> IP-2011-0089 <150> FR 2009051083 <151> 2009-02-19 <160> 101 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 1 gggagatagc cacgacct 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 2 tccaggctgt gcgaaagc 18 <210> 3 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 3 ccgcacacca cgcgcattag cccgcgcaca cgacttgaag tagc 44 <210> 4 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 4 ccgcacacca cgcgcattag cccgcgcaca cgacttgaag tagc 44 <210> 5 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 5 cgcacaccac gcgcattagc ccgcgcacac gacttgaagt agc 43 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 6 ccgcacacca cgcgcatgaa cccgcgcaca cgacttgaag tagc 44 <210> 7 <211> 44 <212> DNA <213> 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Claims (16)

  1. 혈장 단백질을 선택적으로 고정하기 위한 친화성 기질로서, 상기 혈장 단백질과 특이적으로 결합하는 데옥시리보핵산 압타머들이 고정된 고상 기질 물질을 포함하는 친화성 기질.
  2. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 데옥시리보핵산 압타머들은 하기의 식(I)의 화합물의 구조에 포함되는 것을 특징으로 하는 친화성 기질:
    [FIX]x-[SPAC]y- [APT] (I), 여기서:
    - [FIX]: 기질상의 고정용 화합물,
    - [SPAC]: 스페이서 체인,
    - [APT]: 혈장 단백질과 특이적으로 결합하는 데옥시리보핵산 압타머
    - x: 정수 0 또는 1, 및
    - y: 정수 0 또는 1.
  3. 제 2 항에 있어서, 식(I)의 화합물에서, [APT]는 서열 ID No. 1의 데옥시리보핵산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 친화성기질.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈장 단백질은, 알부민, 알파/마크로글로불린, 안티쵸모트립신(antichyomotrypsin), 안티트롬빈, 안티트립신(antitrypsin), 아포 A(Apo A), 아포 B, 아포 C, 아포 D, 아포 E, 아포 F, 아포 G, 베타 XIIa, C1-저해제, C-반응성 단백질, C7, C1r, C1s, C2, C3, C4, C4bP, C5, C6, C1q, C8, C9, 카르복시펩티다아제N, 세룰로플라스민, 인자 B, 인자 D, 인자 H, 인자 I, 인자 IX, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 피브리노겐, 피브로넥틴, 합토글로빈, 헤모펙신, 헤파린 보조인자 II, 히스티딘-농후 GP, IgA, IgD, IgE, IgG, ITl, IgM, 키닌아제 II, 키니노겐 HPM, 라이소자임, PAI 2, PAI 1, PCI, 플라스민, 플라스민 저해제, 플라스미노겐, 프리알부민, 프로칼리크레인, 프로퍼어딘, 프로테아제 넥신 INH, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 프로트롬빈, TFPI, 티올-프로테이나아제, 트롬보모듈린, 조직인자(TF), TPA, 트랜스콜라바민 II, 트랜스코르틴, 트랜스페린, 비트로넥틴 및 폰 빌레브란트 인자로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 친화성 기질.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈장 단백질은 인자 I (피브리노겐), 인자 II (프로트롬빈), 인자 V (프로악셀레린), 인자 VII (프로콘버틴), 인자 VIII (항혈우병 인자A), 인자 IX (항혈우병 인자B), 인자 X (슈트와트 인자), 인자 XI (로젠탈 인자[Rosenthal factor] 또는 PTA), 인자 XII (하게만 인자), 인자 XIII (피브린-안정화 인자 or FSF), PK (프리칼리크레인), HMWK (고 분자량 키니노겐), 조직 트롬보프라스틴, 헤파린 보조인자 II (HCII), 단백질 C (PC), 트롬보모듈린 (TM), 단백질 S (PS), 폰 빌레브란트factor (vWF) 및 외인계 응고억제제 (TFPI), 및 조직 인자로부터 선택된 응고 단백질로 이루어지는 것을 특징으로 하는 친화성 기질.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고상 기질 물질은 수지, 폴리머 비드(polymer beads), 자성 비드(magnetic beads), 상자성 비드(paramagnetic beads), 필터막의 기질 물질 및 폴리머 물질로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 친화성 기질.
  7. 기질상에 혈장 단백질을 고정하는 방법으로서, 상기 혈장 단백질을 함유하는 샘플이 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에서 청구된 친화성 기질과 접촉되어지도록 하는 단계를 포함하는 혈장 단백질의 고정방법.
  8. 하기의 단계들로 이루어진 혈장 단백질을 정제하는 방법:
    a) (i) 상기 친화성 기질에 고정된 데옥시리보핵산 압타머들과 (ii) 상기 혈장 단백질 사이에 복합체를 형성하기 위하여, 혈장 단백질을 함유한 샘플을 위에서 정의한 친화성 기질과 접촉하도록 하는 단계; 및
    b) 단계 a)에서 형성된 복합체로부터 단백질을 방출(releasing)하는 단계; 및
    c) 정제된 형태로 상기 혈장 단백질을 회수하는 단계.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 샘플은 인간 혈장, 또는 인간 혈장의 분획(a fraction), 상기 혈장 단백질로 유전자 이식한 포유류의 우유, 또는 이 우유의 분획로부터 선택된 것을 특징으로 하는 혈장 단백질의 정제방법.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 혈장 단백질은 인간인 것을 특징으로 하는 혈장 단백질의 정제방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 샘플은 적어도 하나의 비 인간 혈장 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈장 단백질의 정제방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 인간 혈장 단백질은 상기 비 인간 혈장 단백질에 상동성인(homologous) 것을 특징으로 하는 혈장 단백질의 정제방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 인간 혈장 단백질은 상기 비 인간 혈장 단백질의 동족체(homolog)인 것을 특징으로 하는 혈장 단백질의 정제방법.
  14. 제 8항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)는 친화성 기질을 2가-이온-킬레이트제, 바람직하게는 EDTA을 함유한 용리 버퍼와 접촉하게 함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 혈장 단백질의 정제방법.
  15. 재조합 인간 혈장 단백질의 정제된 조성물로서, 적어도 99.9 중량%의 상기 재조합 인간 단백질을 포함하며 실질적으로 비인간 단백질은 없는 재조합 인간 혈장 단백질의 정제된 조성물.
  16. 제 15 항에 따른 재조합 인간 혈장 단백질의 정제된 조성물을 포함하는 의약 조성물.



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