JP2012518033A - 血漿タンパクの精製手段と、それを実施する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は血漿タンパクを選択的に結合させるための親和性基質であって、固体の基質材料を含み、この固体の基質材料上で上記血漿タンパクにデオキシリボ核酸アプタマ（deoxyribonucleic adaptamer）が特異的に固定されている親和性基質に関するものである。
Description
本発明は、医薬品の活性成分として使用可能な血漿タンパク（blood plasma proteins）の精製分野に関するものである。
血漿タンパクは古くから医薬品の活性成分を構成してきた。医薬品の活性成分として使用される血漿タンパクの中では特に、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、トロンビンまたはフォンビルブラント因子を挙げることができる。
最近まで血漿タンパクはヒト血漿の精製でしか得られなかった。ここ数年間でいくつかの血漿タンパクはトランスジェニック哺乳類の体液、例えばトランスジェニック哺乳類の乳汁で産生された組換え型タンパクの形で得られるようになった。
いずれの場合でも、被精製血漿タンパクを含む出発材料は錯体構成の材料から成り、そのタンパクは極めて多数の物質（タンパク、リピド、炭水化物、アミノ酸、無機質塩、セルデブリスおよび代謝廃棄物、例えば尿素、尿酸またはビリルビンを含む）と組合されて存在している。
従って、血漿タンパクの精製方法の開発は複雑な作業であり、ヒトまたは獣医学が使用する医薬品として市場に出すためには健康面体および各種要求規制を満たす必要がある。
人間または獣医学で使用する医薬品の活性成分として使用される血漿タンパクは極めて高い純度に精製された形で存在しなければならず、生体に害を与える望ましくない物質、他の血漿タンパク、上記タンパクの分解産物を含んでいてはならない。
血漿タンパクの精製方法は公知であり、例えば、第ＶＩＩＩ因子、抗-トロンビン-ＩＩＩ、プラスミノーゲン、第ＶＩＩ因子またはフォンビルブラント因子の精製方法が知られている。
公知の全ての方法は、タンパク沈殿段階とそれに続くクロマトグラフィ基質への通過、その後の溶離段階、深層濾過段階、限外濾過段階または他に濃縮段階をベースとする一連の選択的分離段階とを有している。
血漿タンパクの精製法の開発には、新規な方法であれ、公知方法の改良（ほんのわずかの改良）であれ、一連の中間生成物の調査と確認に極めて長い時間を必要とし、最終製品が変質しない形で、高い純度で得られ、望ましくない物質を実質的に含まないことを確認する必要がある。特に、酵素活性を有する凝固タンパク、例えば、因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＸＩの場合、精製された最終タンパクが活性でないことが重要である。しかし、精製の一つの段階において例えば所定条件下、例えば使用する濾過材料またはクロマトグラフ材料の品質、塩濃度または温度でクロマトグラフィ段階に血漿タンパクが活性化され易い。
公知の方法が、クロマトグラフ基質にグラフトしたリガンドに問題の凝固タンパクを特異的に固定させ、クロマトグラフィ溶出液中に精製されたタンパクを回収するという原則に基づくアフィニティークロマトグラフィ段階を含まない理由の少なくとも一部はそのためである。
所望タンパクの精製方法にアフィニティークロマトグラフィ精製段階が含まれない他の理由は、クロマトグラフ基質にグラフトしたリガンド分子の一部が離脱し、精製されたタンパク溶出液の容積中にリガンド分子が観察されるというこの方法の欠点によって説明される。凝固不全を治療するための医薬品中にクロマトグラフィ基質の成分物質が混入するということは医学規則で禁止されている。
従来技術の血漿タンパクの精製方法は満足できるものであるが、既存の方法に比較して改善された方法、代替方式に対するニーズが依然としてある。
本発明は、血漿タンパクを選択的に結合させるための親和性基質であって、固体の基質材料を含み、この固体の基質材料上で上記血漿タンパクにデオキシリボ核酸アプタマ（deoxyribonucleic adaptamer）が特異的に固定されている親和性基質にある。
本発明の他の対象は、血漿タンパクを含むサンプルを親和性基質と接触する段階を含む基質上に血漿タンパクを固定する方法にある。
本発明はさらに、下記（a)〜（c)の工程から成る血漿タンパクの精製方法にも関するものである：
（a) 血漿タンパクを含むサンプルを上記定義の親和性基質と接触させて (i) 親和性基質に固定された核酸アプタマと(ii)上記血漿タンパクとの間に錯体を形成させ、
（b) 段階（a)で形成させた錯体からタンパクを遊離させ、
（c) 血漿タンパクを精製させた形で回収する。
本発明はさらに、下記（a)〜（c)の工程から成る血漿タンパクの精製方法にも関するものである：
（a) 血漿タンパクを含むサンプルを上記定義の親和性基質と接触させて (i) 親和性基質に固定された核酸アプタマと(ii)上記血漿タンパクとの間に錯体を形成させ、
（b) 段階（a)で形成させた錯体からタンパクを遊離させ、
（c) 血漿タンパクを精製させた形で回収する。
本発明はさらに、ヒト以外のタンパクを実質的に含まない、少なくとも99.9重量％の組換え型ヒトタンパクを含む組換え型ヒト血漿タンパクの精製された組成物に関するものでもある。
長期間の研究後に、出願人はクロマトグラフィ基質に予備固定したリガンドに対する当該タンパクの特異的に結合させ、基質に保持された当該タンパクを開放し、溶出液容積中に精製されたタンパクを回収にする、クロマトグラフィ段階を有する血液の血漿タンパクの精製方法を開発した。
より詳細には、本発明は当該タンパクに対して特異的に結合する核酸アプタマが固定された基質に当該凝固タンパクを特異的結合させる段階と、それ続く精製された当該タンパクの回収の段階とを含む血液の血漿タンパクの精製方法を提供する。
驚くことに、本発明に従って当該血漿タンパクに特異的なデオキシリボ核酸アプタマが固定されたアフィニティークロマトグラフィ基質、すなわち、デオキシリボ核酸アプタマを含む固定された化合物の形で含むアフィニティークロマトグラフィ基質が医薬品の活性成分として使用できる血漿タンパクを得る方法で使用できるということが分かった。
驚くことに、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）アプタマを使用することによって本発明で定義する親和性基質を組み立てることができるということが本発明に従って示された。従来技術ではＤＮＡ（デオキシリボ核酸）アプタマは使い易くないリガンド核酸で、標的タンパク対する特異性は対応するリボゾームリボ核酸分子の特異性より悪いと考えられていたので、このことは驚くべきことである。特に、従来技術では、リガンド・デオキシリボ核酸は対応するリボゾームリボ核酸より柔軟性が低く、従って、コンファメーション変化を受けるリガンドRNAより劣ると考えられていた。核酸アプタマが標的タンパクに結合するとコンファメーション変化が起こるということを思い出す必要がある。さらに、核酸アプタマのコンファメーション変化が早い程、標的タンパク対する核酸アプタマの親和性も高くなることも公知である。（下記文献参照）。
Mlchaud et aI., 2003, Anal Chem, vol. 76: 101 5-1 020 Brumbt et al., 2005, Anal Chem, vol. 77: 1993-1 998)
Mlchaud et aI., 2003, Anal Chem, vol. 76: 101 5-1 020 Brumbt et al., 2005, Anal Chem, vol. 77: 1993-1 998)
また、本発明の親和性基質を用いることで、錯体組成物の出発培地、例えば人間のＩＸ因子が濃縮された血漿組成物や当該凝結タンパクに特異的に結合する人間のＩＸ因子に対するトランスジェニック動物の乳汁から凝結タンパクを精製することができるということも明らかにされた。
さらに、本発明の親和性基質を用いることで、人間外のオルソロガス（orthologous）なタンパクを含む媒体、例えばヒト因子ＩＸに対してトランスジェニックな動物が産生する乳汁（この乳汁は天然に産生するＩＸ因子をさらに含むことができる）を含む出発媒体から人間の凝結タンパクを選択的に精製することができるということも明らかにされた。トランスジェニック動物が天然に産生するＩＸ因子（外来ＦＩＸ）はブタタンパクＦＩＸにすることができる。
さらに、本発明の親和性基質を用いることで、人間外のオルソロガス（orthologous）なタンパクを含む媒体、例えばヒト因子ＶＩＩに対してトランスジェニックな動物が産生する乳汁（この乳汁は天然に産生するＶＩＩ因子をさらに含むことができる）を含む出発媒体から人間の凝結タンパクを選択的に精製することができるということも明らかにされた。トランスジェニック動物が天然に産生するＦＶＩＩ因子（外来ＦＶＩＩ）はウサギタンパクＦＶＩＩにすることができる。
本発明はさらに、血液の血漿タンパクを選択的に結合するための親和性基質に関するものであり、この親和性基質には、上記デオキシリボ核酸アプタマを含む化合物の形で含む、血漿タンパクに特異的に結合するアプタマが固定されている。
当該血漿タンパクに特異的に結合するデオキシリボ核酸アプタマ分子およびこのデオキシリボ核酸アプタマを含む化合物が、固形基質材料に担持された標的タンパクを特異的にビンド（結合）するサイトを構成する。
「デオキシリボ核酸アプタマ」という用語は血液の血漿タンパクに特異的に結合する5〜120のヌクレオチド長さを有する単鎖ＤＮＡを含む。「デオキシリボ核酸アプタマを含む化合物」という用語は上記定義のＤＮＡをその構造中に含む化合物を含む。従って、人間または哺乳類の血漿タンパクに特異的に結合するＤＮＡを含む化合物はビオチン分子を含む、上記ＤＮＡをその構造中に含む化合物を含む。
本発明の上記定義の親和性基質は当該血漿タンパク（以下「標的タンパク」ともいう）を効率的に固定することができる。
上記定義の親和性基質は標的タンパクの吸着能が高い。すなわち、固体の基質を被精製血漿タンパクを含む溶液と接触させることで、固体の基質に担持された標的サイトの少なくとも50パーセントを飽和させることができる。
本発明では、核酸アプタマ分子に特異的に結合された血漿タンパク分子を少なくとも75パーセントの優れた収率で親和性基質から溶出させることができる。
さらに、本発明の親和性基質は当該血漿タンパクに対して高い特異性を有する。すなわち、溶出液中に含まれるタンパクの全重量に対し99.95重量パーセントに達する純度で血漿タンパクが得られる。
実施例に示すように、本発明の親和性基質では、高純度の標的血漿タンパクを含む組成物、例えば出発材料中に含まれるタンパクの全重量に対して98重量％を超える出発材料を使用することで、当該血漿タンパクの純度を２桁のオーダーで増加させることができる。特に、出発材料中に存在する不純物が被精製標的血漿タンパクの構造および物理化学特性に近い場合に、この純度の増加が得られ、有利である。
さらに重要なことには、本発明親和性基質の高い生体吸収能、高い収率、そして高い特異性の特徴が、錯体組成物の出発媒体、例えば血漿または血漿タンパクにトランスジェニックである哺乳類の体液からの当該血漿タンパクの精製のために得られることである。
また、固体基質材料上への核酸アプタマの固定は不可逆で、長期間安定することが分かっている。すなわち、基質から外れた核酸アプタマは溶出溶液中にその存在が検出されない。
特に、本発明の親和性基質は、溶出後に、基質に結合して残ったタンパクを除去することで、何度でも(i)標的凝固タンパクの吸収能、(ii) 標的タンパクに対する特異性、 (iii) 固体基質材料に固定したデオキシリボ核酸アプタマを遊離させないで「再生」できるということが分かっている。本発明の親和性基質の再生は公知の方法および公知の再生剤（例えば尿素）で実行できる。
当該凝固タンパクのリガンドとして使用される上記ＤＮＡは多くの利点を有している。上記アプタマがそのオリゴヌクレオチドの種類によって弱い免疫原性とストリンジェントな物理化学的条件（尿素、ＤＭＳＯの存在、強い酸性または塩基性ｐＨ、有機溶媒の使用、高温）に対して高い耐性を有し、それによって、アフィニティーリガンドとして使用する際の安全性、特にウィルスまたは非通常病原に対して種々の健康安全上の制御戦略を変えることができる。それに加えて、選択的が極めて高い。最後に、既に述べたように、デオキシリボ核酸アプタマの生産コストが相対的に安い。
すなわち、本発明の親和性基質の上記特徴から血漿タンパクの精製手段として使用される親和性基質の能力が得られる。すなわち、
（１）本発明の親和性基質を用いることで非常に高い純度を有する血漿タンパクの精製方法を実行できる。
（２）本発明の親和性基質は望ましくない物質、特にデオキシリボ核酸アプタマ分子を精製された血漿タンパクを含む溶出溶液中に放出しない。
（３）核酸アプタマ分子の離脱はヒトの健康に対する欠点にならない。
（４）親和性基質での当該血漿タンパクの固定とその後の溶出によって、酵素活性を有する血漿タンパクの場合、血漿タンパクの活性形を検出可能な量形成することはない。
（５）親和性基質は比較的安価に製造できる、特に、核酸アプタマの生産コストが安い。
（６）血漿タンパクの精製に親和性基質を使用すること自体が相対的に安価である。すなわち、基質を何度でも再生でき、長期間使用できる。
（１）本発明の親和性基質を用いることで非常に高い純度を有する血漿タンパクの精製方法を実行できる。
（２）本発明の親和性基質は望ましくない物質、特にデオキシリボ核酸アプタマ分子を精製された血漿タンパクを含む溶出溶液中に放出しない。
（３）核酸アプタマ分子の離脱はヒトの健康に対する欠点にならない。
（４）親和性基質での当該血漿タンパクの固定とその後の溶出によって、酵素活性を有する血漿タンパクの場合、血漿タンパクの活性形を検出可能な量形成することはない。
（５）親和性基質は比較的安価に製造できる、特に、核酸アプタマの生産コストが安い。
（６）血漿タンパクの精製に親和性基質を使用すること自体が相対的に安価である。すなわち、基質を何度でも再生でき、長期間使用できる。
それに加えて、既に述べたように、本発明の親和性基質は標的血漿タンパクを可逆的な方法で、選択的、高収率、高特異性で、工業用スケールで従来から使用されている媒体、例えば当該タンパクを含むヒト血漿または培養媒体または体液から、錯体構成媒体の精製方法を用いて結合させることができる。
さらに、後で詳細に説明するように、本発明の親和性基質は当該血漿タンパクを含む溶液を大容積で処理するのに適している。すなわち、本発明の親和性基質は工業的スケールで使用するのに適した血漿タンパクの精製ツールを構成する。
本発明の親和性基質の上記以外の利点は、特定実施例の親和性基質に関する説明またはその親和性基質を使用した凝固タンパクの精製方法に関する説明から明らかに成るであろう。
出願人が知る限り、工業的スケールで使用可能な条件下で血液の血漿タンパクを精製するために、固定されたデオキシリボ核酸アプタマを含む親和性基質を記載した文献は本発明が最初のものである。第ＶＩＩ因子および第ＩＸ因子に対するトロンビンに特異的な核酸アプタマは従来技術（特許文献１、国際特許第WO02 26932号公報参照）で種々公知である。
「選択的な結合(binding)」とは本明細書では親和性基質の固定核酸成分に当該血漿タンパクを特異的に非共役結合することを意味し、核酸と当該タンパクとの間に非共役結合錯体が形成されている上記親和性基質を適切な組成物の溶液（溶出溶液でもよい）と接触させた時に可逆的なものを意味する。
「血漿タンパク（plasma protein）」という用語は本明細書では任意のタンパク、特に血漿に含まれる工業的または治療上重要な任意のタンパクを意味する。血液の血漿タンパクにはアルブミン、α／マクログロブリン、抗キモトリプシン、抗トロンビン、抗トリプシン、アポＡ、アポＢ、アポＣ、アポＤ、アポＥ、アポＦ、アポＧ、βＸＩＩａ、Ｃ１−抑制物質、Ｃ−反応性タンパク、Ｃ７、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ４ｂＰ、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ１ｑ、Ｃ８、Ｃ９、カルボキシペプチダーゼＮ、セルロプラスミン、因子Ｂ、因子Ｄ、因子Ｈ、フィブリノゲン、因子ＩＸ、プロアクセレリン、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩａ、因子ＶＩＩＩ、因子Ｘ、因子Ｘｌ、因子ＸＩＩ、因子ＸＩＩＩ、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ヘパリン補因子ＩＩ、ヒスチジンが豊富なＧＰ、免疫グロブリンＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩＴＩ、ＩｇＭ、キニナーゼＩＩ、キニノーゲンＨＰＭ、リソチーム、ＰＡＩ２、ＰＡＩ１、ＰＣＩ、プラスミン、プラスミンインヒビター、プラスミノーゲン、プレアルブミン、プロカリクレイン、プロパージン、プロテアーゼネキシンＩＮＨ、プロテインＣ、タンパクＳ、タンパクＺ、プロトロンビン、ＴＦＰＩ、チオール−プロテイナーゼ、トロンボモジュリン、組織因子（ＴＦ）、ＴＰＡ、トランスコアルブミン（transcolabamin）ＩＩ、トランスコルチン、トランスフェリン、ビトロネクチンおよびフォンビルブラント因子が含まれる。
特に、血漿タンパクにはには凝固タンパク、すなわち血塊を形成させる結果となるカスケード反応連鎖に関係する血漿タンパクが含まれる。この凝固タンパクには第Ｉ因子(フィブリノゲン)、第ＩＩ因子（プロトロンビン）、第Ｖ因子（プロアクセレリン）、第ＶＩＩ因子（プロコンバーチン）、第ＶＩＩＩ因子（抗血友病Ａ因子）、第ＩＸ因子（抗血友病因子Ｂ）、第Ｘ因子（スチュワート因子）、第ＸＩ因子（ローゼンソール因子またはＰＴＡ）、第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）、第ＸＩＩＩ因子（フィブリン安定化因子またはＦＳＦ）、ＰＫ（カリクレイン前駆体）、ＨＭＷＫ（高分子キニノーゲン）、組織トロンボプラスチン、ヘパリン補因子ＩＩ（ＨＣｌＩ）、プロテインＣ（ＰＣ）、トロンボモジュリン（ＴＭ）、タンパクＳ（ＰＳ）、フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）および組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）およびその他の組織因子が含まれる。
本発明の一実施例では、血タンパクは酵素活性を有する凝固タンパクから成る。
酵素活性を有する凝固タンパクには第ＩＩ因子（プロトロンビン）、第ＶＩＩ因子（プロコンバーチン）、第ＩＸ因子（抗血友病因子Ｂ）、第Ｘ因子（スチュワート因子）、第ＸＩ因子（ローゼンソール因子またはＰＴＡ）、第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）、第ＸＩＩＩ因子（フィブリン安定化因子またはＦＳＦ）およびＰＫ（カリクレイン前駆体）が含まれる。
本発明の好ましい実施例では、血漿タンパクは天然または組換え型ヒト血漿タンパクから成る。
本発明の好ましい実施例では、血漿タンパクは天然型または組換え型ヒト因子ＶＩＩである。
一般に、本発明のアプタマが固定される固体基質には、構造および組成が濾過材、メンブレン等で一般的な任意タイプの基質が含まれる。この固体基質には特に樹脂、アフィニティークロマトグラフィカラム樹脂、ポリマビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、濾過メンブレンの基質材料、その他が含まれる。固体基質にはさらに、ガラスまたは金属をベースにした材料、例えば鋼、金、銀、アルミニウム、銅、珪素、ガラスまたはセラミックをベースにした材料が含まれる。固体の基質にはさらにポリマー材料、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリ弗化ビニリデンおよびこれらの組合せも含まれる。
本発明の実施例では、固体の基質はアプタマとの付着、結合、複合体形成、固定化または相互作用を容易にする材料またはアプタマを含む化合物で被覆することができる。
本発明の実施例では、固体基質は表面を金の層、カルボキシメチル化処理した層、デキストラン、ストレプトアビジン、コラーゲン、アビジン、その他の層で被覆されたガラススライドにすることができる。
本発明のアプタマまたは本発明のアプタマを含む化合物は付着コーテング、例えば上記の共有結合の生成または非共有結合（例えば水素結合、静電気力、ファンデルワールス力、その他）による会合反応によって固体基質上に固定できる。
デオキシリボ核酸アプタが固定された本発明の親和性基質の例には、その構造中に固体の基質材料へ非共有結合で結合される化合物が含まれる。
実施例には表面にストレプトアビジン分子がグラフトされた固体基質材料から成る親和性基質が記載されており、核酸アプタマは末端の1つでビオチン分子に結合したアプタマを含む化合物を構造中に含み、アプタマは、基質材料のストレプトアビジン分子と核酸アプタマを含む化合物のビオチン分子との間の非共役結合による固定化によって、固体基質材料に固定されている。
実施例には表面にストレプトアビジン分子がグラフトされた固体基質材料から成る親和性基質が記載されており、デオキシリボ核酸アプタマは末端の1つでビオチン分子に結合したアプタマを含む化合物を構造中に含み、デオキシリボ核酸アプタマは、基質材料のストレプトアビジン分子とデオキシリボ核酸アプタマを含む化合物のビオチン分子との間の非共役結合による固定化によって、固体基質材料に固定されている。
実施例ではストレプトアビジン分子がグラフトされた基質材料から成る親和性基質の実施例が記載されている。この種の固体基質材料は市場で容易に入手できる。
「血漿タンパクに特異的に結合する核酸」または「アプタマ」または「核酸アプタマ」という表現は、当該血漿タンパクに結合する能力が他の任意のタンパクに結合する能力よりも大きいデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を意味する。
本発明の実施例では、本発明の親和性基質の組成の核酸アプタマは、他のどのヒトタンパクにも結合する能力より大きい所与のヒト血漿タンパクに結合する能力を有する。
本発明の実施例では、本発明核酸アプタマは所定のヒト血漿タンパクに結合する能力を有しており、その能力はヒト以外の哺乳類のゲノムによってコードされる他の任意のホモローグの血漿タンパクに結合する能力より大きい。例えば、ヒト因子ＶＩＩに対して特異的な核酸アプタマのヒト因子ＶＩＩに結合する能力は、ウサギ第ＶＩＩ因子を含むヒト以外の哺乳類由来の第ＶＩＩ因子に結合する能力より大きい。
本発明では、第1のデオキシリボ核酸アプタマのヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合する能力は当量質量の第２のデオキシリボ核酸アプタマのそれより大きく、第1のデオキシリボ核酸アプタマの場合の共振信号値は、得られる共振測定単位とは無関係に、第２のデオキシリボ核酸アプタマの場合に得られる共振信号値より統計学的に高い。例えば、結合を検出する技術としてBiacore（登録商標）法を使用した場合、第1のデオキシリボ核酸アプタマのヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合する能力は当量質量の第２のデオキシリボ核酸アプタマのそれより大きく、第1のデオキシリボ核酸アプタマの場合の共振信号値は、得られる共振測定単位とは無関係に、第２のデオキシリボ核酸アプタマの場合に得られる共振信号値より統計学的に高い。「統計学的に」個別の２つの測定値には、使用した結合検出技術の測定誤差より大きい差が２つの値の間にあることを含む。
本発明の親和性基質のデオキシリボ核酸アプタは標的凝固タンパクに対する親和性が大きいのが好ましい。デオキシリボ核酸アプタは標的血漿タンパクに対して５００ｎＭ以下のＫｄ値を有するのが好ましい。このＫｄ値はBiacore（登録商標）法に従って測定できる。
例えば、配列SEQ ID番号86の核酸を含むアプタマの場合、そのヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合する能力はヒト以外の哺乳類由来の他の因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合する能力より大きいことが示された。特に、配列SEQ ID番号86の核酸を含むアプタマは天然因子ＶＩＩ／ＶＩＩａまたは組換え型因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含む任意種類のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合する能力が強いが、ウサギ因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含むヒト以外の哺乳類のゲノムによってコードされる因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合する能力は弱く、ゼロに近い。
特に、配列SEQ ID番号86の核酸を含むアプタマの場合、Biacore（登録商標）法によって、解離定数Ｋｄで表されるヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合する能力値は約１００ｎＭであることが決定された。さらに、核酸アプタマはヒト・血漿因子ＶＩＩ／ＶＩＩａおよび例えばトランスジェニック・ウサギが生産する組換え型ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに対して同じ結合能を有する。
さらに、配列SEQ ID番号86の核酸を含むアプタマとヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの間の錯体は化学量論であることも示された。すなわち、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの分子数に対する配列SEQ ID番号86の核酸の分子数の比はほぼ１：１、特に１：１であることが示された。
既に述べたように、本発明の親和性基質はヒト以外のトランスジェニック哺乳類が産生した組換え型ヒト血漿タンパクの精製段階で使用できる。血漿タンパクの精製方法の実施例では、複雑な出発媒体はトランスジェニック哺乳類によって天然に産生される多くのタンパクの混合物としての組換え型ヒトタンパクから成り、組換え型ヒトタンパクのホモローグな血漿固タンパクを含むこともできる。この例では本発明の親和性基質の核酸アプタマ成分に当該ヒトタンパクが選択的に結合し、同じ操作条件下で、ヒト以外の哺乳類が天然に産出したホモローグなタンパクは結合しないのが有利である。
本発明の親和性基質の構成要件の核酸アプタマの特定実施例では、当該ヒト血漿タンパクに「特異的に」結合するアプタマの能力はヒトタンパクとヒト以外の哺乳動物の相同タンパクの解離定数Ｋｄの比としても現れる。
本発明の親和性基質の構成要件の核酸アプタマの他の特徴としては、ヒト血漿タンパクに特異的に結合する核酸アプタマの能力は下記の条件(A)で表される：
ヒトＫｄ／非ヒトＫｄ＜０．０１ （Ａ）
（ここで、
「ヒトＫｄ」はヒトタンパクに対する核酸アプタマの解離定数（モル単位表示）であり、
「非ヒトＫｄ」はヒト以外の相同タンパクに対する核酸アプタマの解離定数で、同じモル単位で表示される。
ヒトＫｄ／非ヒトＫｄ＜０．０１ （Ａ）
（ここで、
「ヒトＫｄ」はヒトタンパクに対する核酸アプタマの解離定数（モル単位表示）であり、
「非ヒトＫｄ」はヒト以外の相同タンパクに対する核酸アプタマの解離定数で、同じモル単位で表示される。
組換え型ヒト血漿タンパクの精製方法で使用するのに適した本発明の親和性基質は、組換え型ヒトタンパクに特異的に結合する上記核酸アプタマはヒトＫｄ／非ヒトＫｄの比が０．００５以下であることで定義できる。
本発明の親和性基質の構成要件の核酸アプタマはＳＥＬＥＸとよばれる方法に従って調製できる。「アプタマ」という用語はタンパクに特異的に結合できる単一鎖の核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡの分子を含む意味で使用される。アプタマは一般に５〜120のヌクレオチドから成り、ＳＥＬＥＸ(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)法として公知の方法に従ってインビトロで選択でき、これは最初に下記特許文献に記載された。
国際特許第WO 1991/019813号公報
アプタマを選択するＳＥＬＥＸ法ではタンパクを核酸、ＤＮＡの組換えライブラリ（一般に1015の分子）と接触させる。標的に結合しない核酸は除去され、標的に結合するＤＮＡを分離し、増幅させる。当該タンパクに対する親和性が良いＤＮＡが十分に濃縮された溶液が得られるまでこの方法を繰り返す（下記文献参照）。
Tuerk and Gold, "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase" (1990) Science, 249(4968）、505-10 Ellington and Szostak, "In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands", (1990) Nature Aug 30;346(6287):818-22)
Tuerk and Gold, "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase" (1990) Science, 249(4968）、505-10 Ellington and Szostak, "In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands", (1990) Nature Aug 30;346(6287):818-22)
ＳＥＬＥＸ法の他の例は下記文献に記載されており、本発明でデオキシリボ核酸アプタマを選択する方法を実行する時に使用できる。
欧州特許第EP 0 786 469号公報
欧州特許第EP 668 931号公報
欧州特許第EP 1 695 978号公報
欧州特許第EP 1 493 825号公報
ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを精製する手段として使用する場合、当該血タンパクに特異的に結合するＤＮＡは、スペーサ手段と固体基質上に固定化する適切な手段とをその化学構造（本明細書では「化合物」とよぶ）を有するのが好ましい。
本発明の実施例では、デオキシリボ核酸アプタマは下記の式(I)の化合物の構造を含む：
［ＦＩＸ］ｘ−［ＳＰＡＣ］ｙ−［ＡＰＴ］ （Ｉ）
（ここで、
［ＦＩＸ］は基質上に固定するための化合物を表し、
［ＳＰＡＣ］はスペーサ鎖を表し、
［ＡＰＴ］は血漿タンパクに特異的に結合するデオキシリボ核酸アプタマを表し、
ｘはOまたは1に等しい整数
ｙはOまたは1に等しい整数を表す）
［ＦＩＸ］ｘ−［ＳＰＡＣ］ｙ−［ＡＰＴ］ （Ｉ）
（ここで、
［ＦＩＸ］は基質上に固定するための化合物を表し、
［ＳＰＡＣ］はスペーサ鎖を表し、
［ＡＰＴ］は血漿タンパクに特異的に結合するデオキシリボ核酸アプタマを表し、
ｘはOまたは1に等しい整数
ｙはOまたは1に等しい整数を表す）
式(I)の化合物で［ＳＰＡＣ］で表される「スペーサ鎖」は公知の任意のタイプものにすることができる。このスペーサ鎖の機能はＤＮＡを上記化合物が固定されている固体基質の表面から物理的に離し、ＤＮＡが固定される固体基質の表面に対して相対的に動けるようすることにある。このスペーサ鎖は固体基質が式（Ｉ）のＤＮＡにあまり近付きすぎてＤＮＡとそれに接触される血漿タンパク分子との間の結合を妨げる立体障害を制限または防ぐ役目をする。
式（Ｉ）の化合物でのスペーサ鎖はＤＮＡアプタマの５'末端または３'末端に結合されるのが好ましい。
スペーサ鎖はアプタマの一端と固体基質とに結合されるのが好ましい。スペーサとのこの構造はアプタマを固体基質上に直接固定しないという利点がある。スペーサ鎖は非特異性のオリゴヌクレオチドまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるのが好ましい。スペーサ鎖が非特異性のオリゴヌクレオチドから成る場合、そのオリゴヌクレオチドは長さが少なくとも５つのヌクレオチド、好ましくは長さが５〜１５のヌクレオチドから成るのが好ましい。
スペーサ鎖がポリエチレングリコールから成る式(I)の化合物の実施例の場合、スペーサ鎖は例えばSigma Aldrich社から市販のＰＥＧ（Ｃ１８）型のポリエチレングリコールを含む。
アプタマを固体基質に直接またはスペーサ鎖に固定するために、ＤＮＡを種々の化学基、例えばＤＮＡを共有結合で固定する基、例えばチオール、アミンまたは固体基質に存在する化学基と反応可能な他の任意の基で化学的に修正することができる。
式(I)の化合物で、化合物[ＦＩＸ]は（ｉ）固体基質の表面材料と一つ以上の共有結合を形成することができる化合物および（ｉｉ）弱い非共有結合、例えば水素結合、静電気力またはファンデルワールス力によって固体基質を拘束できる化合物の中から選択される化合物から成る。
化合物［ＦＩＸ］の第１の種類は二官能性カップリング剤、例えばグルタールアルデヒド、ＳｌＡＢ、その他のＳＭＣＣを含む。
ＳｌＡＢは下記式（Ｉ）の化合物で、下記文献に記載されている：
Hermanson G.T. 1996, Bioconjugate techniques, San Diego: Academic Press, pp 239-242
ＳｌＡＢは下記式（Ｉ）の化合物で、下記文献に記載されている：
Hermanson G.T. 1996, Bioconjugate techniques, San Diego: Academic Press, pp 239-242
化合物ＳｌＡＢは酢酸沃素およびスルホ−ＮＨＳエステル基を有する２つの反応基を有し、それぞれアミノ基およびスルフヒドリル基と反応する。
化合物ＳｌＡＢは酢酸沃素およびスルホ−ＮＨＳエステル基を有する２つの反応基を有し、それぞれアミノ基およびスルフヒドリル基と反応する。
化合物ＳＭＣＣは下記文献に記載されている。
Samoszuk M.K. et al. 1989, Antibody, Immunoconjugates Radiopharm., 2(1): 37-46
化合物ＳＭＣＣは下記文献に記載されている。
Samoszuk M.K. et al. 1989, Antibody, Immunoconjugates Radiopharm., 2(1): 37-46
化合物ＳＭＣＣはそれぞれスルホ−ＮＨＳエステル基およびマレイミド基から成る２つの反応基を有し、それぞれアミノ基およびスルフヒドリル基と反応する。
化合物［ＦＩＸ］の第２の種類は固体基質に存在すアビジンまたはストレプトアビジン分子に非共有結合で結合可能なビオチンを含む。
化合物［ＦＩＸ］の第２の種類は固体基質に存在すアビジンまたはストレプトアビジン分子に非共有結合で結合可能なビオチンを含む。
血液の凝固経路に関係する各種タンパクの結合可能な核酸アプタマは従来技術で公知であり、Willebrand因子を介して結合するアプタマ（特許文献７）、アルファトロンビンを結合するアプタマ（特許文献８）またはトロンビン（非特許文献５）、第ＩＸ因子／ＩＸａを結合するアプタマ（非特許文献６〜７、特許文献９、１０）が含まれる。
ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合する核酸アプタマは下記文献に記載されている。
Rusconi et al., 2000, Thromb Haemost, Vol. 84(5):841-848; Layzer et al., 2007, Spring, Vol. 17: 1-11
Rusconi et al., 2000, Thromb Haemost, Vol. 84(5):841-848; Layzer et al., 2007, Spring, Vol. 17: 1-11
上記文献にはそれが結合する標的タンパクを精製するためにリボヌクレオチド・アプタマ（これに限定されない）成るアプタマを使用することは記載されていない点に注意されたい。
既に述べたように、デオキシリボ核酸アプタマの特別な利点は、リボゾームリボ核酸アプタマと比較して製造が容易で、その製造コストが安い点にあり、リボゾームリボ核酸アプタマの製造コストより大幅に安い。
本発明の他の対象は、適切な量の本発明定義の親和性基質を入れた容器を有する血漿タンパクを精製するためのアフィニティークロマトグラフィ装置にある。
クロマトグラフィ基質を入れる容器の各種形態は従来技術で公知であり、上記の「容器」という用語に含まれる。この容器の重要な特徴は出発材料サンプルをアフィニティークロマトグラフィ装置に入れる手段と、親和性基質と接触した後に液体を取り出す手段とが存在することである。
本発明の他の対象は、血漿タンパクを含むサンプルを上記定義の親和性基質と接触する段階を含む、持体上に血漿タンパクを固定する方法にある。
「血漿タンパクを含むサンプル」とは一般に凝固タンパクが懸濁または可溶化された任意種類の液体を意味する。この種のサンプルの例は以下に記載する精製方法に関する説明で定義される。
本発明はさらに、下記工程から成る血漿タンパクをの精製方法にも関するものである：
（a) 上記定義の親和性基質と血漿タンパクを含むサンプルとを接触させて(i)上記親和性基質上に固定したデオキシリボ核酸アプタマと(ii) 血漿タンパクとの間に錯体を形成し、
（b) 段階（a)で形成された錯体からタンパクをフリーにし、
（c) 血漿タンパクを精製された形で回収する。
（a) 上記定義の親和性基質と血漿タンパクを含むサンプルとを接触させて(i)上記親和性基質上に固定したデオキシリボ核酸アプタマと(ii) 血漿タンパクとの間に錯体を形成し、
（b) 段階（a)で形成された錯体からタンパクをフリーにし、
（c) 血漿タンパクを精製された形で回収する。
本発明の好ましい実施例では、上記サンプルはヒト血漿タンパクを含む。この実施例では、当該血漿タンパクを含むサンプルは当該タンパクを含む液体試料から成り、当該タンパクを含む液体試料を含み、ヒト以外の哺乳類の対応する血漿タンパクの分子を含むことができる。上記精製方法の実施例では、前記サンプルは生物学的溶液、例えば体液、細胞、細胞物質、組織、組織材料、器官または生物全部から成る。
上記精製方法の実施例では、前記サンプルは動物由来の生物学的溶液、例えば血液、血液誘導体、哺乳動物乳汁または哺乳類の乳汁誘導体から成る。このサンプルは血漿、血漿凍結沈殿物、精製乳汁またはその誘導体から成ることができる。
上記精製方法の特に好ましい実施例では、前記サンプルは当該ヒトタンパク用トランスジェニック動物に由来する。溶液はヒトタンパクのトランスジェニック哺乳類の乳汁または哺乳類の乳汁誘導体であるのが好まし。本発明では遺伝子導入実験動物は(i) ヒト以外の哺乳類、例えばウシ、ヤギ、ウサギ、ブタ、サル、ラットまたはハツカネズミ、(ii)鳥類、(iii)昆虫、
例えば蚊、カイコ等を含む。本発明の好ましい実施例では、当該ヒトタンパク用トランスジェニック動物はヒト以外のトランスジェニック哺乳類、特に好ましくは当該ヒトタンパク用のトランスジェニックウサギ（doe rabbit）である 。トランスジェニック哺乳類の乳汁中にトランスジェニックタンパクを発現できるようにする特定のプロモータのコントロール下にある当該タンパクをコードする核酸から成る表現カセットの遺伝子中へ挿入するために、トランスジェニック哺乳類はその乳汁中に当該組換え型ヒトタンパクを産生するのが有利である。
例えば蚊、カイコ等を含む。本発明の好ましい実施例では、当該ヒトタンパク用トランスジェニック動物はヒト以外のトランスジェニック哺乳類、特に好ましくは当該ヒトタンパク用のトランスジェニックウサギ（doe rabbit）である 。トランスジェニック哺乳類の乳汁中にトランスジェニックタンパクを発現できるようにする特定のプロモータのコントロール下にある当該タンパクをコードする核酸から成る表現カセットの遺伝子中へ挿入するために、トランスジェニック哺乳類はその乳汁中に当該組換え型ヒトタンパクを産生するのが有利である。
トランスジェニック動物の乳汁中にヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを生産する方法は下記工程から成ることができる：乳汁中に天然に分泌されるタンパクのプロモータの制御下にあるヒト因子ＶＩＩＮｌＩａをコードする遺伝子（例えばカゼイン・プロモータ、β−カゼイン・プロモータ、ラクトアルブミン・プロモータ、βラクトグロブリン・プロモータまたはＷＡＰプロモータ）を有するＤＮＡ分子をヒト以外の哺乳類の胎児に一体化し、その胎児を同じ生物種の哺乳動物の雌の下に置く。胎児から哺乳類が十分に成長すると、哺乳類から乳汁分泌が誘発され、それから乳汁を集める。この乳汁は当該組換え型ヒトタンパクを含む。
ヒト以外の哺乳動物の雌の乳汁中でタンパクを調製する方法の例は下記文献に記載されている。
欧州特許第ＥＰ０の５２７０６３号公報
ＷＡＰ（ホエー酸タンパク）プロモータを含むプラスミドはＷＡＰ遺伝子のプロモータを含む配列を導入して調整できる。このプラスミドはＷＡＰプロモータの制御下に置かれた異種遺伝子を受けることが可能な状態で調製できる。上記プロモータおよび本発明のタンパクをコードする遺伝子を含むプラスミドを用い、ウサギ胎児の雄の前核へマイクロインジェクションしてトランスジェニクウサギを得ることができる。それから胎児をホルモン調節した雌の輸卵管に移植する。トランスジェンの存在は得られた若いトランスジェニクウサギから抽出したＤＮＡを用いてサザン法によって確認される。動物の乳汁濃度は特定の放射性免疫アッセイで評価される。
ヒト以外の哺乳動物雌の乳汁中でタンパクを調製する方法は下記文献にも記載されている。例えば特許文献１２（トランスジェニクなハツカネズミ）および特許文献１３（トランスジェニク哺乳類のフォンビルブラント因子の生産）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
米国特許第ＵＳ７，０４５，６７６号明細書
欧州特許第ＥＰ１７３９１７０号公報
本発明の精製方法は、人血の血漿サンプルまたは人血の血漿画分、例えば人血の血漿の凍結沈殿物から精製された血漿タンパクを得るのにも適している。
上記精製法の実施例では、標的血漿タンパクはヒトである。
上記精製法の実施例では、サンプルは少なくとも一種のヒト以外の血漿タンパクから成る。
上記精製法の実施例では、ヒト血漿タンパクはヒト以外の血漿タンパクにホモローグである。
上記精製法の実施例では、ヒト血漿タンパクはヒト以外の血漿タンパクの相同染色体である。
上記精製法の実施例では、出発サンプルは天然材料、人血の血漿またはその画分または精製された当該タンパクを含む当該タンパクのトランスジェニックであるヒト以外の哺乳類の体液のサンプルから成ることができる。トランスジェニック非ヒト哺乳類の体液には乳汁、例えば乳汁の脱脂画分または乳汁のカゼインミセル除去画分が含まれる。
しかし、上記実施例は天然出発サンプル中に存在する多くのタンパクによって親和性基質を詰まらせる危険があるため、本発明の精製方法の好ましい実施例でない。
好ましい実施例では、出発サンプルは当該血漿タンパクを溶液中に懸濁して含む液体から成り、この液体は血漿タンパクを精製する多段階の方法で生じる中間生成物から成る。
例えば、当該タンパクに対してトランスジェニックなヒト以外の哺乳類の体液から血漿タンパクを精製する方法では、出発サンプルはヒト以外のトランスジェニック哺乳類の乳汁の濾過液を使用して実行されるイオン交換クロマトグラフィの溶出液から成る。本発明精製方法のこの特定例は実施例に示してある。
同様に、ヒト血漿から当該血漿タンパクを精製する方法の場合には、出発サンプルはヒト血漿サンプルの凍結沈殿画分で実行される深層濾過段階の濾過液から成る。
一般に、本発明の精製方法を実行する際の親和性基質の使用条件は従来のクロマトグラフィ基質を使用するための一般的な条件、例えばリガンド抗体が固定された免疫親和性基質のタイプとほぼ同じである。当業者は例えば下記文献を参照することができる。
Ballon et al. (Pascal Bailon, George K. Ehrlich, Wen-Jian Fung and Wolfgang Berthold, An Overview of Affinity Chromatography, Humana Press, 2000
Ballon et al. (Pascal Bailon, George K. Ehrlich, Wen-Jian Fung and Wolfgang Berthold, An Overview of Affinity Chromatography, Humana Press, 2000
しかし、以下で詳細に説明するように、本発明方法の溶出段階（c)の条件は血漿タンパクを精製するめに非常に有利である。
段階（a)では適当な容積の精製されるサンプルを親和性基質と接触させる。(i) 親和性基質に固定された核酸アプタマと(ii) 精製されるサンプル中に含まれた当該血漿タンパクとの間に錯体が形成される。
実施例に示すように段階（a)でMgCl2が低濃度の緩衝液またはMgCl2を含まない緩衝液を使用することで、因子VIIを捕らえる条件が改善される。
「MgCl2が低濃度の緩衝液」という表現は本発明では最終MgCl2濃度が１mM以下である緩衝液を意味する。
MgCl2濃度が１mM以下である緩衝液はMgCl2濃度が0.5mM、0.1mM、0.05mMおよび0.01mM以下である緩衝液を含み、有利には0mMに等しい。
本発明の1つの特定実施例では親和性基質を洗浄緩衝液で洗浄する段階（ａ'）を含む。本発明方法は親和性基質を洗浄してイオン強度を増やす段階（ａ'）、すなわち段階（a)のイオン強度と比較してイオン強度が増加する緩衝液で洗浄する段階を含むのが好ましい。段階（ａ'）で使用する洗浄緩衝液のイオン強度は段階（ａ）で使用するイオン強度より2〜500倍大きいのが好ましい。好ましくは、段階（ａ'）で使用する洗浄緩衝液のイオン強度を段階（ａ）で使用するイオン強度より100〜500倍、好ましくは200〜500倍大きくする。
本発明実施例では、段階（ａ'）の洗浄で高いイオン強度を有する洗浄緩衝液、特に、高いＮａＣｌ濃度を有する緩衝液を使用することで、検出可能な方法で親和性基質に対する第ＶＩＩ因子の結合性に影響を及ぼさずに、非特異的に親和性基質に結合している物質を効果的に除去することができることが示されている。
最終ＮａＣｌ濃度が少なくとも１Ｍである洗浄緩衝液を段階（ａ'）で使用するのが好ましい。
本発明では最終ＮａＣｌ濃度が少なくとも１Ｍである洗浄緩衝液は最終ＮａＣｌ濃度が少なくとも１．５Ｍ、２Ｍ、２．５Ｍまたは少なくとも３Ｍ１Ｍである洗浄緩衝液を含む。
本発明方法の段階（ａ'）で使用する洗浄緩衝液の最終ＮａＣｌ濃度は最大で３．５Ｍであるのが好ましい。本発明方法の段階（ａ'）で使用する洗浄緩衝液の最終ＮａＣｌ濃度は１．５〜３．５の間、好ましくは２〜３．５間、好ましくは２．５〜３．５の間、例えば３〜３．５の間にするのが有利である。
本発明実施例ではさらに、段階（ａ'）で高い疎水性の洗浄緩衝液、特に高濃度のプロピレングリコールを使用することで、検出可能な方法で親和性基質に対する第ＶＩＩ因子の結合性に影響を及ぼさずに、親和性基質に非特異的に結合した物質を効果的に除去することができるたとが示された。
従って、段階（ａ'）では少なくとも２０％（ｖ／ｖ）の最終プロピレングリコール含量を有する洗浄緩衝液を使用するのが好ましい。
本発明では、少なくとも２０％の最終プロピレングリコール含量を有する洗浄緩衝液は、（洗浄緩衝液の全容積に対する）容積で少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％または少なくとも６０％の最終プロピレングリコール含量を有する洗浄緩衝液を含む。
段階（ａ’）で使用する洗浄緩衝液は最大で５０％の最終プロピレングリコール含量を有するのが好ましい。段階（ａ’）で使用する洗浄緩衝液は２０％〜５０％の間、好ましくは３０％〜５０％の間の最終プロピレングリコール含量を有するのが好ましい。
本発明の特定実施例では、段階（ａ’）で使用する洗浄緩衝液はＮａＣｌとプロピレングリコールとを含む。
精製法の実施例では、段階（ｂ）は段階（a)で核酸アプタマと錯体を形成した当該血漿タンパク分子を溶出する段階から成る。
実施例に示すように、上記精製方法の一つの点は(i) 親和性基質に固定された核酸アプタマと(ii) 血漿タンパクとの間に形成された錯体を二価−イオン−キレート剤、例えばＥＤＴＡと接触させて溶出段階を実行できる点にある。
本発明の親和性基質の特徴によって可能になる上記方法の利点は、当該血漿タンパクの特性を少なくとも部分的に失わせるような厳しい溶出条件を使用せずに、血漿タンパクを溶出できる点にある。厳しい溶出条件を避けるということは、公知の親和性基質上、特に固定された抗体から成親和性基質でタンパクを精製する方法で一般に実行されている酸性pHを溶出段階を使用することを含む。
本発明の精製方法の実施例では、段階（b)は親和性基質を二価-イオンキレート剤、好ましくはＥＤＴＡを含む溶出緩衝液と接触させて実行される。例えば、溶出緩衝液はＥＤＴＡを最終濃度で少なくとも１ｍＭ、最大で３０ｍＭ含むことができる。「少なくとも１ｍＭ」とは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｍＭを含む。「最大で３０ｍＭ」は２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４，１３、１２またはｌｌｍＭを含む。
段階（c)では段階（b)の終わりに得られる溶出液液体を集めて精製された当該血漿タンパクを回収する。この段階（c)の終わりに当該血漿タンパクの精製された液体組成物が得られる。この精製された液体組成物は公知の適当なタンパクのコンディショニングおよび保存方法に従って処理でき、例えばビンに直接詰めたり、適切な溶液で希釈してビンに詰めたり、好ましくは殺菌および非発熱性条件下で凍結乾燥した後、貯蔵条件に応じて外界温度、-4℃またはより低温で貯蔵する。
すでに述べたように、本発明の親和性基質は、当該血漿タンパクを精製するために連続したサイクルで使用することができ、例えば溶出段階（c)で凝固タンパク分子の全てをシステマチックに解放にしないのでその吸収能が減少し、次の精製サイクルでのフリーなアプタマサイト数が減る。
全ての公知のクロマトグラフィ基質では適当な時間に基質から血漿タンパク分子の全てと、親和性基質の固体成分に一般に非特異的に結合した全ての物質を除去するために、親和性基質の再生段階を実行する必要がある。
従って、本発明の実施例では、本発明の精製方法は前記親和性基質を再生溶液と接触させて親和性基質を再生させる追加の段階（d)を含む。
クロマトグラフィ基質を再生させるための各種緩衝液、特にアフィニティークロマトグラフィ基質は当業者に周知で、本発明方法の段階（d)で使用できる。当業者は例えば下記文献を参照できる。
Mohr et al. (Affinity Chromatography: Practical and Theoretical Aspects, Peter Mohr, Klaus Pommerening, Edition: illustrated, CRC Press, 1985
Mohr et al. (Affinity Chromatography: Practical and Theoretical Aspects, Peter Mohr, Klaus Pommerening, Edition: illustrated, CRC Press, 1985
例えば、親和性基質を再生させる段階（d)は実施例に示すように基質を50mMトリスおよび50％エチレングリコール緩衝液と接触させて実行できる。
実施例に示すように、本発明の精製方法では純度が非常に高い血漿タンパクを得ることができ、精製された最終製品に含まれるタンパクの全重量で99.95％を超える純度にすることができる。
出発サンプルがヒト以外のトランスジェニック哺乳類が天然に産生するタンパクを含む混合物の実施例での本発明精製方法の他の利点は、最終組成物がトランスジェニック哺乳類由来のタンパクを実質的に含まない、特に組換え型ヒトタンパクの相同体である哺乳類のタンパクを実質的に含まない高純度の組換え型当該ヒトタンパクからなることにある。
例えば、組換え型ヒト因子VIIをトランスジェニック・ウサギの乳汁中に生産させ、それを本発明の精製方法で精製した場合、最初の出発サンプル中に含まれるタンパクの重量に対してトランスジェニック哺乳類のタンパクの1.5重量％以下しか含まない。出発サンプル中に組換え型ヒト因子ＶＩＩが85重量％存在する場合、同じ本発明の精製方法を実行して最終産物中に存在するタンパクの99.95重量％を超える高純度の組換え型ヒト因子ＶＩＩが含まれるということが示された。
本発明の他の対象は、実質的にヒト以外のタンパクを含まない組換え型ヒトタンパクの少なくとも99.9重量％を含む組換え型ヒト血漿タンパクの精製組成物にある。
本発明はさらに、精製された組成物のタンパクの全重量に対するヒト以外のタンパクの重量百分率が0.1重量％以下で、組換え型ヒトタンパクの重量百分率が少なくとも99.9重量％である組換え型ヒト血漿タンパクの精製された組成物にも関するものである。
精製された組成物で「少なくとも99.9重量％」とは重量で少なくとも99.91％、99.92％、99.93％、99.94％、99.95％、99.96％、99.97％、99.98％および99.99％を含む。精製された組成物で「0.1重量％以下」とは重量で多くとも0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％および0.01％を含む。
本発明はさらに、医薬品として使用可能な上記定義の精製された組成物にも関するものである。
本発明はさらに、薬学的に許容される一種以上の賦形剤を含む上記定義の組換え型ヒト血漿タンパクの精製された組成物を含む医薬組成物にも関するものである。
本発明はさらに、凝固不全を治療するための上記定義の精製された組成物にも関するものである。
本発明はさらに、凝固不全を治療するための医薬品の製造での本発明定義の精製された組成物の使用にも関するものである。
以下、本発明に従って有利に使用できる、凝固タンパクに特異的に結合するアプタマの特定実施例を説明する。
本発明で使用可能なアプタマの特定実施例
本発明者は血液の血漿タンパクに、特にヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸アプタマのファミリーを製造して、(i) 普通の構造上の特徴と（ii）普通の機能上の特徴との間の関係の存在を示すことを示した。
本発明者は血液の血漿タンパクに、特にヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸アプタマのファミリーを製造して、(i) 普通の構造上の特徴と（ii）普通の機能上の特徴との間の関係の存在を示すことを示した。
構造上の観点から、本発明で使用可能なヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸または核酸アプタマのファミリーは、下記式（Ｉ）の核酸と少なくとも40％のヌクレオチド一致性を有するポリヌクレオチドの少なくとも15の連続したヌクレオチドを含む：
５'−［ＳＥＱＩＤ番号１］ｘ−［ＳＥＱＩＤ番号Ｘ］−［ＳＥＱＩＤ番号２］ｙ−３' （Ｉ）
（ここで、
「ＳＥＱＩＤ番号Ｘ」はＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００から成る群の中から選択される核酸から成り、
「ｘ」は０または１の整数であり、
「ｙ」は０または１の整数である）
５'−［ＳＥＱＩＤ番号１］ｘ−［ＳＥＱＩＤ番号Ｘ］−［ＳＥＱＩＤ番号２］ｙ−３' （Ｉ）
（ここで、
「ＳＥＱＩＤ番号Ｘ」はＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００から成る群の中から選択される核酸から成り、
「ｘ」は０または１の整数であり、
「ｙ」は０または１の整数である）
本発明の実施例では、配列SEQ ID番号Ｘの酸は、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、 41、 42、43、44、45、46、47、48、49または50ヌクレオチドの長さを有する。
本発明の他の実施例では、配列SEQ ID番号Ｘの核酸は43、44、45、46、47、48または49ヌクレオチドの長さを有する。
本発明の他の好ましい実施例では、配列SEQ ID番号Ｘの核酸は43、44または45ヌクレオチドの長さを有する。
本発明の他の実施例では、配列SEQ ID番号Ｘの核酸は43、44、45、46、47、48または49ヌクレオチドの長さを有する。
本発明の他の好ましい実施例では、配列SEQ ID番号Ｘの核酸は43、44または45ヌクレオチドの長さを有する。
既に述べたように、式（Ｉ）の核酸は長さがの少なくとも15ヌクレオチドである。
本発明の実施例では、式（Ｉ）の核酸は少なくとも15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、 62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80または81ヌクレオチドの長さであり、これは上記長さを有する核酸を含む。
式（Ｉ）のアプタマを得る方法の実施例では、一連の選抜サイクルを実行して血漿タンパク特異的に結合する当該核酸のファミリーを構築し、一連の各選抜段階で５'末端および３'末端にそれぞれ配列SEQ ID番号１とSEQ ID番号２を有し、構造的に変化する配列SEQ ID番号Ｘを有する核酸アプタマのセットおよびサブセットを単離し、特徴付ける。本発明の核酸アプタマの主たるファミリーはこれらの間に少なくとも40％のヌクレオチド配列一致性を有する全てが可変な配列SEQ ID番号Ｘを有する。このことは配列SEQ ID番号Ｘに対して、凝固タンパクに結合する性質を保持するために、構造上の制約が核酸アプタマのこれら５'末端および３'末端に位置する配列に対する構造上の制約より少ないことを意味する。
「x」が０で、「y」が１に等しい整数の場合、本発明の核酸アプタマは、下記の式（Ｉ−１）の核酸と少なくとも40％ヌクレオチド一致性を有するポリヌクレオチドの少なくとも15の連続したヌクレオチドから成る核酸を含む：
５'−［ＳＥＱＩＤ番号Ｘ］−［ＳＥＱＩＤ番号２］−３' （Ｉ−１）
５'−［ＳＥＱＩＤ番号Ｘ］−［ＳＥＱＩＤ番号２］−３' （Ｉ−１）
整数「ｘ」が１に等しく、整数「ｙ」が０に等しい場合、本発明の核酸アプタマは下記の式（Ｉ−２）の核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続したヌクレオチドから成る核酸を含む：
５'−［ＳＥＱＩＤ番号１］−［ＳＥＱＩＤ番号Ｘ］−３' （Ｉ−２）
５'−［ＳＥＱＩＤ番号１］−［ＳＥＱＩＤ番号Ｘ］−３' （Ｉ−２）
整数「ｘ」が０で、整数「ｙ」が０に等しい場合、本発明の核酸アプタマは下記の式（Ｉ−３）の核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続したヌクレオチドから成る核酸を含む：
５'−［ＳＥＱＩＤ番号Ｘ］−３' （Ｉ−３）
５'−［ＳＥＱＩＤ番号Ｘ］−３' （Ｉ−３）
従って、上記の核酸アプタマは配列ＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５番およびＳＥＱＩＤ８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００の核酸から成る群の中から選択される核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続したヌクレオチドを有する核酸を含む。
一般に、第２のヌクレオチドまたは核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有する第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドまたは核酸と少なくとも４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％のヌクレオチド同一性を有する。
配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘを有する本発明の核酸のいくつかの実施例では、この配列ＳＥＱＩＤ番号ＸがＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００の中の少なくとも１つと少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有する配列の少なくとも１５の連続したヌクレオチドを有する核酸から成る群の中から選択される。
配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘを有する本発明の核酸のいくつかの実施例では、この配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘが、配列ＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５番およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００の少なくとも１つと少なくとも４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％，５６％，５７％，５８％，５９％，６０％，６１％，６２％，６３％，６４％，６５％，６６％，６７％，６８％，６９％，７０％，７１％，７２％，７３％，７４％，７５％，７６％，７７％，７８％，７９％，８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％のヌクレオチド同一性を有する核酸からなる群の中から選択される。
上記のことから、本発明は上記定義の式（Ｉ）のシリーズの少なくとも１５の連続したヌクレオチドを有する単一鎖の核酸のファミリーを含む。
本発明で２つの核酸間の「百分比同一性」は整列した２つの配列を比較窓を介して最適な方法で比較して決定される。
従って、比較窓中にあるヌクレオチド配列の一部は、２つの配列間で最適なアランメントが得られるように、参照配列（付加または欠失がない）と比較して付加または欠失（例えばギャップ）を有する。
「百分比同一性」の計算方法では、比較した２つの配列で全く同じ核酸塩基が得られた位置の数を求め、２つの核酸塩基間で同一性のある位置の数を比較窓中の位置の全数で割り、得られた結果に１００を掛けることで、２つの配列の百分比ヌクレオチド同一性を求める。
比較用の最適配列アランメントは公知のアルゴリズムを使用したコンピュータで実行できる。
百分比配列同一性はCLUSTAL Wソフトウェア（バージョン１．８２）を使用して決定するのが好ましい。その設定パラメータは以下の通り：
(1)CPU MODE=ClustaIW mp;
(2)ALIGNMENT=「full」;
(3)OUTPUT FORMAT=「aln w/numbers」;
(4)OUTPUT ORDER=「alignment」;
(5)COLOR ALIGNMENT=「no」;
(6)KTUP(word sizw)=「default」;
(7)WINDOW LENGTH=「default」;
(8)SCORE TYPE=「percent」;
(9)TOPDIAG=「default」;
(10)PAIRGAP=「default」;
(11)PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE=「none」;
(12)MATRIX=「default」;
(13)GAP OPEN=「default」;
(14)END GAPS=「default」;
(15)GAP EXTENSION=「default」;
(16)GAP DISTANCES=「default」;
(17)TREE TYPE=「分岐図」
(18)TREE GRAPH DISTANCES=「hide」。
以下、本発明の実施例を示す。
(1)CPU MODE=ClustaIW mp;
(2)ALIGNMENT=「full」;
(3)OUTPUT FORMAT=「aln w/numbers」;
(4)OUTPUT ORDER=「alignment」;
(5)COLOR ALIGNMENT=「no」;
(6)KTUP(word sizw)=「default」;
(7)WINDOW LENGTH=「default」;
(8)SCORE TYPE=「percent」;
(9)TOPDIAG=「default」;
(10)PAIRGAP=「default」;
(11)PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE=「none」;
(12)MATRIX=「default」;
(13)GAP OPEN=「default」;
(14)END GAPS=「default」;
(15)GAP EXTENSION=「default」;
(16)GAP DISTANCES=「default」;
(17)TREE TYPE=「分岐図」
(18)TREE GRAPH DISTANCES=「hide」。
以下、本発明の実施例を示す。
実施例１
親和性基質の製造
親和性基質はストレプトアビジン(streptavidin-agarose−Novagen、登録商標）がグラフトされたマトリックスから成る固体の基質材料から製造した。
１mlのカラムから成る容器に１ml容積（すなわち11mm）のゲルを入れた。ゲルを精製水で洗浄して貯蔵用溶剤を除去した。
ゲルの特徴は以下の通り：
（１）ビオチン吸着能：≧８５ナノモル／１ｍｌゲル
（２）機能テスト：ＡＴで３０分間のコースでビオチン標識化したトロンビンのキャプチャー＞９９％、
（３）その他のテスト：プロテアーゼ無し、エンド／エクソヌクレアーゼ無し、RNase無し
（４）防腐剤：１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５＋ＮａＮ3 0.02
親和性基質の製造
親和性基質はストレプトアビジン(streptavidin-agarose−Novagen、登録商標）がグラフトされたマトリックスから成る固体の基質材料から製造した。
１mlのカラムから成る容器に１ml容積（すなわち11mm）のゲルを入れた。ゲルを精製水で洗浄して貯蔵用溶剤を除去した。
ゲルの特徴は以下の通り：
（１）ビオチン吸着能：≧８５ナノモル／１ｍｌゲル
（２）機能テスト：ＡＴで３０分間のコースでビオチン標識化したトロンビンのキャプチャー＞９９％、
（３）その他のテスト：プロテアーゼ無し、エンド／エクソヌクレアーゼ無し、RNase無し
（４）防腐剤：１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５＋ＮａＮ3 0.02
充填カラム（ゲル・ベッド高さ＝１ｃｍ）の出口に２５４ｎｍのＵＶフィルターと記録装置とを備えた吸光度検出器を接続した。
配列ＳＥＱＩＤ番号８６のビオチン標識化した抗ヒトＦＶＩＩ核酸アプタマを精製水中に０．５ｍｇ／０．１８７ｍｌの最終濃度（すなわち最終モル濃度＝０．１ｍＭ）で可溶化した。核酸アプタマ溶液を標準サイクルに従って９５℃で活性化して固体基質材料上にアプタマを固定化した。
核酸アプタマ溶液を４．８ｍｌの精製水で、次に１．５ｍｌのＭｅ++緩衝液（５×濃縮）で予備希釈した。
吸光度検出器を１ＡＵＦＳ（吸光度単位フルスケール）に合わせ、２５４ｎｍでこの溶液のＯＤを０．５７５Ｕ254で記録した。
ビオチン標識化した核酸アプタマ溶液は予めパックしたストレプトアビジン−アダロースゲル上へ注入し、ペリスタル型ポンプで２．５ｍｌ／分の流速で再循環させた（すなわちゲル（入口／出口 Ｉ／Ｏ）上での接触時間＝２４秒）。上記条件での２５４ｎｍでのＯＤは直ちに０．０５ＡＵ254（すなわち理論的なカップリング値の９１％）に到達した。すなわち１ミリリットルのゲル当たり０．４５５ｍｇの核酸アプタマで安定する。
１０ｍＭ−ＣａＣｌ2＋４ｍＭ−ＭｇＣｌ2緩衝液で洗浄し、次いで２Ｍ−ＮａＣｌで洗浄して固体基質材料上にグラフトしたストレプトアビジン分子に特異的に結合していない核酸アプタマを除去した。
配列ＳＥＱＩＤ番号８６のビオチン標識化した抗ヒトＦＶＩＩ核酸アプタマを精製水中に０．５ｍｇ／０．１８７ｍｌの最終濃度（すなわち最終モル濃度＝０．１ｍＭ）で可溶化した。核酸アプタマ溶液を標準サイクルに従って９５℃で活性化して固体基質材料上にアプタマを固定化した。
核酸アプタマ溶液を４．８ｍｌの精製水で、次に１．５ｍｌのＭｅ++緩衝液（５×濃縮）で予備希釈した。
吸光度検出器を１ＡＵＦＳ（吸光度単位フルスケール）に合わせ、２５４ｎｍでこの溶液のＯＤを０．５７５Ｕ254で記録した。
ビオチン標識化した核酸アプタマ溶液は予めパックしたストレプトアビジン−アダロースゲル上へ注入し、ペリスタル型ポンプで２．５ｍｌ／分の流速で再循環させた（すなわちゲル（入口／出口 Ｉ／Ｏ）上での接触時間＝２４秒）。上記条件での２５４ｎｍでのＯＤは直ちに０．０５ＡＵ254（すなわち理論的なカップリング値の９１％）に到達した。すなわち１ミリリットルのゲル当たり０．４５５ｍｇの核酸アプタマで安定する。
１０ｍＭ−ＣａＣｌ2＋４ｍＭ−ＭｇＣｌ2緩衝液で洗浄し、次いで２Ｍ−ＮａＣｌで洗浄して固体基質材料上にグラフトしたストレプトアビジン分子に特異的に結合していない核酸アプタマを除去した。
実施例２
組換え型ヒト因子ＶＩＩの精製方法
上記のアプタマ親和性基質を下記文献に記載の方法で調製した精製されたＦＶｌｌ／ＦＶｌｌａを使用してテストした。
国際特許第Ｗ０２００８／０９９０７７号公報
組換え型ヒト因子ＶＩＩの精製方法
上記のアプタマ親和性基質を下記文献に記載の方法で調製した精製されたＦＶｌｌ／ＦＶｌｌａを使用してテストした。
被精製サンプルの製造
出発材料の生物物質は組換え型ヒトＦＶＩＩを含むトランスジェニクウサギ乳汁である。発現カセットはβ−カゼイン遺伝子プロモータの制御下にあるヒトＦＶＩＩトランスジーンから成る。簡単に言うと、１４０ミリリットルの乳汁を出生後の日４〜日１２の間の初乳汁分泌を２匹のウサギから集め、集めた乳汁のアミド分解（amidolytic）ＦＶＩＩ（生物学的に活性化されたＦＶＩＩ）の平均タイター値は９２８ＩＵ／ｍｌである。乳汁は−８０℃の温度で保存した。
テスト時にはウサギ乳汁を水浴中で３７℃の温度で解凍し、クエン酸ナトリウム溶液で希釈してｐＨ７．５での最終クエン酸塩濃度を６２ｇ／ｌにした。このクエン酸ナトリウム処理で燐酸カルシウム（phosphocalcic）カゼインミセルを不安定できる。乳汁のリピドリッチなタンパク溶液は一連の濾過器（それぞれ（ｉ）１５〜０．５μｍ気孔率閾値の深層濾過器と（ｉ）０．２μｍメンブランフィルタ）で精製する。
出発材料の生物物質は組換え型ヒトＦＶＩＩを含むトランスジェニクウサギ乳汁である。発現カセットはβ−カゼイン遺伝子プロモータの制御下にあるヒトＦＶＩＩトランスジーンから成る。簡単に言うと、１４０ミリリットルの乳汁を出生後の日４〜日１２の間の初乳汁分泌を２匹のウサギから集め、集めた乳汁のアミド分解（amidolytic）ＦＶＩＩ（生物学的に活性化されたＦＶＩＩ）の平均タイター値は９２８ＩＵ／ｍｌである。乳汁は−８０℃の温度で保存した。
テスト時にはウサギ乳汁を水浴中で３７℃の温度で解凍し、クエン酸ナトリウム溶液で希釈してｐＨ７．５での最終クエン酸塩濃度を６２ｇ／ｌにした。このクエン酸ナトリウム処理で燐酸カルシウム（phosphocalcic）カゼインミセルを不安定できる。乳汁のリピドリッチなタンパク溶液は一連の濾過器（それぞれ（ｉ）１５〜０．５μｍ気孔率閾値の深層濾過器と（ｉ）０．２μｍメンブランフィルタ）で精製する。
１９８ＩＵ／ｍＩのＦＶＩＩタイター（すなわち３６ｍｇのトランスジェニクＦＶＩＩ）を有する濾過後の溶液の容積３６０ｍｌを１６ｍｌ容積のMEP-HyperCelクロマトグラフィ・ゲル（Pall BioSepra）で予備精製した。この捕獲ゲルを用いることでカゼインを含む乳タンパクの９５％を除去でき、しかも、ＦＶＩＩの初期量の６０％を保持できる。
上記段階の終わりに得られた１７．５ｍｇの低純度ＦＶＩＩ（〜５％）は容積２０ｍｌのQ-sepharoseＸＬ（登録商標）（GE Healthcare）を使用したイオン交換クロマトグラフィで精製する。ヒトＦＶＩＩは、７８ｍｌ容積の５ｍＭ−塩化カルシウムを含む緩衝液で溶出する。アミド分解（amidolytic）ＦＶＩＩ濃度は３３７ＩＵ／ｍｌすなわち０．１７ｍｇのＦＶＩＩ／ｍｌで、２８０ｎｍ、ε1%＝１３でＯＤで測定した全タンパクは０．１８ｍｇ／ｍｌ、と見積もられる。従って、ＦＶＩＩ純度は９４％。
上記段階の終わりに得られた１７．５ｍｇの低純度ＦＶＩＩ（〜５％）は容積２０ｍｌのQ-sepharoseＸＬ（登録商標）（GE Healthcare）を使用したイオン交換クロマトグラフィで精製する。ヒトＦＶＩＩは、７８ｍｌ容積の５ｍＭ−塩化カルシウムを含む緩衝液で溶出する。アミド分解（amidolytic）ＦＶＩＩ濃度は３３７ＩＵ／ｍｌすなわち０．１７ｍｇのＦＶＩＩ／ｍｌで、２８０ｎｍ、ε1%＝１３でＯＤで測定した全タンパクは０．１８ｍｇ／ｍｌ、と見積もられる。従って、ＦＶＩＩ純度は９４％。
ウサギ乳汁由来の残留タンパクをこの段階でＦＶＩＩから分離するのは、構造上類似性、例えばＧＬＡ−ｄｏｍａｉｎまたはＥＧＦｄｏｍａｉｎタンパクのため、あるいは物理化学的な類似性（イオン電荷および／または分子寸法が類似）のため、難しい。従来方法では直交法（ヒドロキシアパタイトゲルとサイズ排除クロマトグラフィ分離の組合せ）によって純度を９９．９５％まで改良できる。
しかし、人間で繰り返して注射する場合には、遺伝子組換えタンパクで許容される外来タンパクに対する負荷は５０ｐｐｍを超えてはならない。すなわち純度＞９９．９９５％でなければならない。この純度をアフィニティーマトリックスでの精製だけで達成できるように見える。
しかし、人間で繰り返して注射する場合には、遺伝子組換えタンパクで許容される外来タンパクに対する負荷は５０ｐｐｍを超えてはならない。すなわち純度＞９９．９９５％でなければならない。この純度をアフィニティーマトリックスでの精製だけで達成できるように見える。
本発明の親和性基質上での組換え型ヒトＦＶＩＩの精製段階
上記段階の終わりに得られた精製されたヒトＦＶＩＩ溶液の６ｍｌの容積（ＦＶＩＩの１．１ｍｇ）を用いて本発明の親和性基質で高純度の組換え型ヒトＦＶＩＩに精製する段階を行う。上記段階で得られたＦＶＩＩ溶液を４ｍＭ−ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2でｐＨ７．５に予備調節し、アプタマ−アガロースゲル（親和性基質）上にペリスタル型ポンプで０．１ｍｌ／分の流速で注入する（すなわち、親和性基質との接触時間１０分）（Ｉ／Ｏ）。
注射後、ゲルを５０ｍＭトリス＋５０ｍＭ−ＮａＣｌ＋４ｍＭＭｇＣｌ2＋１０ｍＭＣａＣｌ2、ｐＨ７．５緩衝液で洗浄する。１０ｍｌの非吸着溶液を回収する。ＦＶＩＩは５０ｍＭトリス＋１０ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５緩衝液で溶出させる。溶出ピークの収集はＯＤプロフィルに従って実行する。モル計算から親和性基質に固定された核酸アプタマの量は１７ナノモルで、これはＦＶＩＩ分子とのモル−モル相互作用で、ＦＶＩＩの０．９ｍｇの親和性基質の絶対キャパシティに対応する。
上記段階の終わりに得られた精製されたヒトＦＶＩＩ溶液の６ｍｌの容積（ＦＶＩＩの１．１ｍｇ）を用いて本発明の親和性基質で高純度の組換え型ヒトＦＶＩＩに精製する段階を行う。上記段階で得られたＦＶＩＩ溶液を４ｍＭ−ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2でｐＨ７．５に予備調節し、アプタマ−アガロースゲル（親和性基質）上にペリスタル型ポンプで０．１ｍｌ／分の流速で注入する（すなわち、親和性基質との接触時間１０分）（Ｉ／Ｏ）。
注射後、ゲルを５０ｍＭトリス＋５０ｍＭ−ＮａＣｌ＋４ｍＭＭｇＣｌ2＋１０ｍＭＣａＣｌ2、ｐＨ７．５緩衝液で洗浄する。１０ｍｌの非吸着溶液を回収する。ＦＶＩＩは５０ｍＭトリス＋１０ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５緩衝液で溶出させる。溶出ピークの収集はＯＤプロフィルに従って実行する。モル計算から親和性基質に固定された核酸アプタマの量は１７ナノモルで、これはＦＶＩＩ分子とのモル−モル相互作用で、ＦＶＩＩの０．９ｍｇの親和性基質の絶対キャパシティに対応する。
［図１］は２５４ｎｍでの吸光度値（ＯＤ）を連続モニターしたウサギ乳汁中に産生された組換え型ヒトＦＶＩＩのクロマトグラフィ・プロフィルを示す。
この［図１］で注射（１）後の吸収曲線の屈曲（２）は組換え型ヒトＦＶＩＩと親和性基質の飽和開始を示す。時間（３）で組換え型ヒトＦＶＩＩの注射を停止する。［図１］の直線状の時間のスケールを示すと、注射開始時間（１）と注射終了時間（２）との間の持続時間は１０分である。親和性基質は上記凝固タンパクで飽和し続け、（ｉ）親和性基質の抗ＦＶＩＩ核酸アプタマと（ｉｉ）被精製組成物中に最初に含まれていた組換え型ヒトＦＶＩＩ分子との間に錯体が形成される。被精製組成物をカラムに送り、カラムを緩衝液で洗浄する（洗浄段階６）。その後、時間（４）で１０ｍＭの最終ＥＤＴＡ濃度から成る緩衝液を注入して溶出段階を実行する。吸収ピークは核酸アプタマ／組換え型ＦＶＩＩ錯体から組換え型ヒトＦＶＩＩが開放されたことを示している。組換え型ヒトＦＶＩＩの分子は迅速にリリースされ、従って、少容積である点に注意されたい。従って、本発明の親和性基質によって組換え型ヒトＦＶＩＩタンパクの高濃度の溶出溶液が得られる。時間（５）で５０ｍＭトリス緩衝液を用いて親和性基質を再生させる段階を実行する。（７）で見られる吸光度ピークは再生段階で親和性基質から開放された物質に対応する。
この［図１］で注射（１）後の吸収曲線の屈曲（２）は組換え型ヒトＦＶＩＩと親和性基質の飽和開始を示す。時間（３）で組換え型ヒトＦＶＩＩの注射を停止する。［図１］の直線状の時間のスケールを示すと、注射開始時間（１）と注射終了時間（２）との間の持続時間は１０分である。親和性基質は上記凝固タンパクで飽和し続け、（ｉ）親和性基質の抗ＦＶＩＩ核酸アプタマと（ｉｉ）被精製組成物中に最初に含まれていた組換え型ヒトＦＶＩＩ分子との間に錯体が形成される。被精製組成物をカラムに送り、カラムを緩衝液で洗浄する（洗浄段階６）。その後、時間（４）で１０ｍＭの最終ＥＤＴＡ濃度から成る緩衝液を注入して溶出段階を実行する。吸収ピークは核酸アプタマ／組換え型ＦＶＩＩ錯体から組換え型ヒトＦＶＩＩが開放されたことを示している。組換え型ヒトＦＶＩＩの分子は迅速にリリースされ、従って、少容積である点に注意されたい。従って、本発明の親和性基質によって組換え型ヒトＦＶＩＩタンパクの高濃度の溶出溶液が得られる。時間（５）で５０ｍＭトリス緩衝液を用いて親和性基質を再生させる段階を実行する。（７）で見られる吸光度ピークは再生段階で親和性基質から開放された物質に対応する。
親和性基質の動的結合能
下記の［表１］に示すテスト結果は０．４５〜０．４９ｍｇ／ｍｌの親和性マトリックスすなわちバイオアベイラブル（bioavailable）なリガンドの５０〜５５％の動的結合能を示す。ＥＤＴＡで約７５％の動的溶出が計算される。
下記の［表１］に示すテスト結果は０．４５〜０．４９ｍｇ／ｍｌの親和性マトリックスすなわちバイオアベイラブル（bioavailable）なリガンドの５０〜５５％の動的結合能を示す。ＥＤＴＡで約７５％の動的溶出が計算される。
親和性基質の特異的分離能
親和性基質の特異性をウサギ乳タンパクに特異的なＥＬＩＳＡアッセイで評価した。結果は［表２］に示した。
親和性基質の特異性をウサギ乳タンパクに特異的なＥＬＩＳＡアッセイで評価した。結果は［表２］に示した。
［表２］の結果は、トランスジェニクなヒトＦＶＩＩの純度を９８．３％〜９９．９５％とすると、アプタマ−アガロースによる除去の平均値２ｌｏｇ10が得られることを示す。これはヒトＦＶＩＩに対するアプタマの特異性を示し、残留ウサギ乳タンパクとの相互作用はほとんどないことを示す。
溶出前に２Ｍ−ＮａＣｌおよび／またはプロピレングリコールまたは５０％エチレングリコール溶液で中間洗浄すると結果はより良くなる（これらの条件ではＦＶＩＩは溶出されない）。
実施例２の結果は、アプタマ−アガロースゲル（Apta-2）上での親和性基質がリガンド１ｍｇ当たり少なくとも１ｍｇのＦＶＩＩの動的結合能の優れた特徴を有することを示し、溶出収率は少なくとも７５％である。また、純度の明らかな改良（〜９９．９５％）、残留ウサギ乳タンパクＲＭＰの除去２ｌｏｇ10からも特異性は確認できる。最適化していない２つのテストで最終レベルは約５００ｐｐｍになる。
溶出前に２Ｍ−ＮａＣｌおよび／またはプロピレングリコールまたは５０％エチレングリコール溶液で中間洗浄すると結果はより良くなる（これらの条件ではＦＶＩＩは溶出されない）。
実施例２の結果は、アプタマ−アガロースゲル（Apta-2）上での親和性基質がリガンド１ｍｇ当たり少なくとも１ｍｇのＦＶＩＩの動的結合能の優れた特徴を有することを示し、溶出収率は少なくとも７５％である。また、純度の明らかな改良（〜９９．９５％）、残留ウサギ乳タンパクＲＭＰの除去２ｌｏｇ10からも特異性は確認できる。最適化していない２つのテストで最終レベルは約５００ｐｐｍになる。
実施例３
ヒト血漿ＩＸ因子の精製方法
Ａ．材料および方法
Ａ．１ アフィニティークロマトグラフィ基質
「Ｍａｐｔ−１」親和性ゲル材料、スペーサ鎖無し、理論リガンド濃度：０．４６ｍｇ／ｍｌ：容積１ｍｌ
アプタマはクロマトグラフィ基質材料に化学共役反応で直接結合した。使用したアプタマは配列SEQ ID番号101のアプタマである。
ヒト血漿ＩＸ因子の精製方法
Ａ．材料および方法
Ａ．１ アフィニティークロマトグラフィ基質
「Ｍａｐｔ−１」親和性ゲル材料、スペーサ鎖無し、理論リガンド濃度：０．４６ｍｇ／ｍｌ：容積１ｍｌ
アプタマはクロマトグラフィ基質材料に化学共役反応で直接結合した。使用したアプタマは配列SEQ ID番号101のアプタマである。
Ａ．２ 出発材料
出発材料はヒト血漿由来のＩＸ因子がリッチな組成物から成り、これはLFB社から「Betafact」の名称で市販されている。出発材料を注入した：Betafact MPVP（血漿ＦＩＸ 、60％純度）、ゲルml当たりＩＸ因子を200ＩＵ負荷（すなわち800μg）、接触時間10分。
出発材料はヒト血漿由来のＩＸ因子がリッチな組成物から成り、これはLFB社から「Betafact」の名称で市販されている。出発材料を注入した：Betafact MPVP（血漿ＦＩＸ 、60％純度）、ゲルml当たりＩＸ因子を200ＩＵ負荷（すなわち800μg）、接触時間10分。
Ａ．３ 精製プロトコル
ゲル平衡化： 0.050 M トリス-HCl、0.010のM CaCl2、pH 7.5、
溶出： 0.020 M トリス-HCl、0.010のM EDTA、pH 7.5、
再生： 0.020 M トリス-HCl、1 M NaCl、50％プロピレングリコール、pH 7.5
タンパクピークは280ｎｍの波長で吸光度値を測定して検出。
ゲル平衡化： 0.050 M トリス-HCl、0.010のM CaCl2、pH 7.5、
溶出： 0.020 M トリス-HCl、0.010のM EDTA、pH 7.5、
再生： 0.020 M トリス-HCl、1 M NaCl、50％プロピレングリコール、pH 7.5
タンパクピークは280ｎｍの波長で吸光度値を測定して検出。
Ａ．４ ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでの電気泳動のプロトコル
10-ウエルNOVEXゲル（Invitrogen）、4-12％、Bis-トリス；MESランニング緩衝液、200Vで５分間マイグレーション、CBB（G250）またはAgNO3（GEキット）で染色。
10-ウエルNOVEXゲル（Invitrogen）、4-12％、Bis-トリス；MESランニング緩衝液、200Vで５分間マイグレーション、CBB（G250）またはAgNO3（GEキット）で染色。
Ｂ． 結果
結果は［図２］および［図３]に示した。
［図２］は時間を関数とする２８０ｎｍで測定した吸光度曲線。［図３］のピーク番号１はカラムに保持されなかった出発生成物の分画に対応する。ピーク番号２は溶出分画に対応する。ピーク番号３は再生段階を実行することによって基質から脱着された画分に対応。
［図３］はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルの画像。［図３］のゲルの左から右に向かって各レーンは下記の出発材料のマイグレーション結果を表す：
レーン「MD」：「Betafact（登録商標）」出発組成物、
レーン「NR」：［図２］のクロマトグラフプロフィルのピークNo.1に対応する保持されない画分、
レーン「EI」：［図２］のクロマトグラフ・プロフィルのピークNo.2に対応する溶出分画。
結果は［図２］および［図３]に示した。
［図２］は時間を関数とする２８０ｎｍで測定した吸光度曲線。［図３］のピーク番号１はカラムに保持されなかった出発生成物の分画に対応する。ピーク番号２は溶出分画に対応する。ピーク番号３は再生段階を実行することによって基質から脱着された画分に対応。
［図３］はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルの画像。［図３］のゲルの左から右に向かって各レーンは下記の出発材料のマイグレーション結果を表す：
レーン「MD」：「Betafact（登録商標）」出発組成物、
レーン「NR」：［図２］のクロマトグラフプロフィルのピークNo.1に対応する保持されない画分、
レーン「EI」：［図２］のクロマトグラフ・プロフィルのピークNo.2に対応する溶出分画。
［表３］は各種画分の電気泳動プロフィルを積分して得たＦＩＸの純度百分比を要約したものである。この％ＦＩＸは当業者に周知の方法で計算される。すなわち、ＣＢＢで染色したゲルの電気泳動バンドの濃度を定量積分する（［図３］のデータの累積量に対応）。電気泳動バンドの濃度の定量積分は適切なスキャナでゲルをスキャンして得られる。
［図３］および［表３］に示した結果は［図２］の結果を確認している。これらの結果はアプタマが固定されているクロマトグラフィ基質はＩＸ因子がリッチな血漿画分のような錯体培地からヒト・ＩＸ因子を特異的に精製できるということを示している。
上記溶出液は優れた電気泳動純度を示し、ＦＩＸの官能が維持されることで特徴付けられると結論付けることができる。この実験はクロマトグラフ基質に直接結合した配列SEQ ID番号101のアプタマの能力を示し、従って、スペーサ無しで、血漿不純物を含む錯体培地中のＦＩＸに結合し、精製するという能力を示している。
上記溶出液は優れた電気泳動純度を示し、ＦＩＸの官能が維持されることで特徴付けられると結論付けることができる。この実験はクロマトグラフ基質に直接結合した配列SEQ ID番号101のアプタマの能力を示し、従って、スペーサ無しで、血漿不純物を含む錯体培地中のＦＩＸに結合し、精製するという能力を示している。
実施例４
トランスジェニック雌豚の乳汁抽出物に含まれる組換え型ＩＸ因子の精製法
Ａ．材料および方法
Ａ．１ アフィニティークロマトグラフィ基質
スペーサ鎖無しに、Mapt-1アプタマが直接結合で固定された親和性ゲル材料。理論的なリガンド濃度0.46mg/ml：容積１ml。
Mapt-1アプタマは化学的カップリング反応でクロマトグラフィ基質材料に直接結合される。
使用したアプタマは配列SEQ ID番号101のMapt Iアプタマである。
トランスジェニック雌豚の乳汁抽出物に含まれる組換え型ＩＸ因子の精製法
Ａ．材料および方法
Ａ．１ アフィニティークロマトグラフィ基質
スペーサ鎖無しに、Mapt-1アプタマが直接結合で固定された親和性ゲル材料。理論的なリガンド濃度0.46mg/ml：容積１ml。
Mapt-1アプタマは化学的カップリング反応でクロマトグラフィ基質材料に直接結合される。
使用したアプタマは配列SEQ ID番号101のMapt Iアプタマである。
Ａ．２ 出発材料
出発材料は清澄し、MEP HyperCel：1.8％純度で精製したトランスジェニック雌豚の乳汁から成る。クエン酸ナトリウムを除去するためにこのサンプルを樹脂の吸着／平衡用緩衝液に対して透析した。１ml当たり302ＩU（すなわち1200μg）のＩＸ因子を負荷。
出発材料は清澄し、MEP HyperCel：1.8％純度で精製したトランスジェニック雌豚の乳汁から成る。クエン酸ナトリウムを除去するためにこのサンプルを樹脂の吸着／平衡用緩衝液に対して透析した。１ml当たり302ＩU（すなわち1200μg）のＩＸ因子を負荷。
Ａ．３ 精製プロトコル
ゲル平衡化： 0.050 M トリス-HCl、0.010のM CaCl2、pH 7.5、
溶出： 0.020 M トリス-HCl、0.010のM EDTA、pH 7.5、
再生： 0.020 M トリス-HCl、1M NaCl、50％プロピレングリコール、pH 7.5。
サンプルを0.1ml/mmの流速で10分間注入し、それからゲルを5分間、0.5ml/mmで洗浄する。溶出および再生は2mlの緩衝液を0.5ml/mmの流速で注入して実行する。タンパクピークは280ｎｍの波長での吸光度値を測定して検出する。
ゲル平衡化： 0.050 M トリス-HCl、0.010のM CaCl2、pH 7.5、
溶出： 0.020 M トリス-HCl、0.010のM EDTA、pH 7.5、
再生： 0.020 M トリス-HCl、1M NaCl、50％プロピレングリコール、pH 7.5。
サンプルを0.1ml/mmの流速で10分間注入し、それからゲルを5分間、0.5ml/mmで洗浄する。溶出および再生は2mlの緩衝液を0.5ml/mmの流速で注入して実行する。タンパクピークは280ｎｍの波長での吸光度値を測定して検出する。
Ａ．４ SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析ロトコル
10-ウエルNOVEXゲル（Invitrogen）、4〜12％、Bis-トリス；MESランニング緩衝液、200Vで50分間移行。CBB（G250）またはAgNO3（GEキット）で染色。
10-ウエルNOVEXゲル（Invitrogen）、4〜12％、Bis-トリス；MESランニング緩衝液、200Vで50分間移行。CBB（G250）またはAgNO3（GEキット）で染色。
Ａ．５ ＩＸ因子に対する比活性の測定プロトコル
ＦＩＸの量（抗原量）の測定はるSerachrom 0943 ＦＩＸ Agキット（Stago）を用い、供給者の推薦条件に従って実行した。ＦＩＸの酵素活性の測定はBiophen ＦＩＸキット 参照番号221802（ハイフンBioMed）で供給元の推薦に従って比色テストで実行した。比活性は下記の比に従って計算される：ＦＩＸの酵素活性／ＦＩＸの量。
ＦＩＸの量（抗原量）の測定はるSerachrom 0943 ＦＩＸ Agキット（Stago）を用い、供給者の推薦条件に従って実行した。ＦＩＸの酵素活性の測定はBiophen ＦＩＸキット 参照番号221802（ハイフンBioMed）で供給元の推薦に従って比色テストで実行した。比活性は下記の比に従って計算される：ＦＩＸの酵素活性／ＦＩＸの量。
Ａ．５ ＩＸ因子に対する比活性の測定プロトコル
ＦＩＸの量（抗原量）の測定はるSerachrom 0943 ＦＩＸ Agキット（Stago）を用い、供給者の推薦条件に従って実行した。ＦＩＸの酵素活性の測定はBiophen ＦＩＸキット 参照番号221802（ハイフンBioMed）で供給元の推薦に従って比色テストで実行した。比活性は下記の比に従って計算される：ＦＩＸの酵素活性／ＦＩＸの量。
ＦＩＸの量（抗原量）の測定はるSerachrom 0943 ＦＩＸ Agキット（Stago）を用い、供給者の推薦条件に従って実行した。ＦＩＸの酵素活性の測定はBiophen ＦＩＸキット 参照番号221802（ハイフンBioMed）で供給元の推薦に従って比色テストで実行した。比活性は下記の比に従って計算される：ＦＩＸの酵素活性／ＦＩＸの量。
Ｂ． 結果
結果は［図４］および［図５］に示す。
［図４］は時間を関数とした280ｎｍでの吸光度の測定値の曲線を表す。［図４］でピークNo.１はカラムに保持されなかった出発材料の画分に対応し、ピークNo.2は溶出画分に対応し、ピークNo.3は再生段階を実行時に基質から脱着した画分に対応する。［図４］の結果は溶出ピークが非常に幅が狭いことを示し、それはアプタマが固定されたクロマトグラフィ基質がヒト・ＩＸ因子に対して非常に高い特異性を有することを示す。
［図５］はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルの像である。［図5］のゲルの左から右に向かって各レーンは下記の出発材料の移行結果を表す：
結果は［図４］および［図５］に示す。
［図４］は時間を関数とした280ｎｍでの吸光度の測定値の曲線を表す。［図４］でピークNo.１はカラムに保持されなかった出発材料の画分に対応し、ピークNo.2は溶出画分に対応し、ピークNo.3は再生段階を実行時に基質から脱着した画分に対応する。［図４］の結果は溶出ピークが非常に幅が狭いことを示し、それはアプタマが固定されたクロマトグラフィ基質がヒト・ＩＸ因子に対して非常に高い特異性を有することを示す。
［図５］はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルの像である。［図5］のゲルの左から右に向かって各レーンは下記の出発材料の移行結果を表す：
レーン「E5」：MEP HyperCelクロマトグラフ段階で予め精製したトランスジェニック・ヒト因子ＩＸを含むトランスジェニック雌豚の乳汁の出発組成物。
レーン「E6」：［図４］のクロマトグラフプロフィルのピークNo.1に対応する保持されない画分
レーン「E7」：［図４］のクロマトグラフプロフィルのピークNo.2に対応する溶出画分
レーン「E8」：ピークNo.2の顆粒で、［図４］のクロマトグラフプロフィルのピークNo. 3の上流が集められた溶出画分。
レーン「T ＦＩＸ」：精製されたＩＸ因子対照（コントロール）。
レーン「E6」：［図４］のクロマトグラフプロフィルのピークNo.1に対応する保持されない画分
レーン「E7」：［図４］のクロマトグラフプロフィルのピークNo.2に対応する溶出画分
レーン「E8」：ピークNo.2の顆粒で、［図４］のクロマトグラフプロフィルのピークNo. 3の上流が集められた溶出画分。
レーン「T ＦＩＸ」：精製されたＩＸ因子対照（コントロール）。
［図5］の結果は、［図4］の結果を確認している。これらの結果はアプタマが固定されたクロマトグラフィ基質は因子ＩＸがリッチな血漿画分のような錯体培地からヒト因子ＩＸを特異的に精製できることを示している。さらに、この実施例の結果は、配列SEQ ID番号.86のMapt 2つのアプタマが固定されているアフィニティークロマトグラフィ基質上に錯体組成物の出発材料を通した後に得られるヒト・ＩＸ因子の濃縮度が高いということを示している。
この溶出液は出発材料と比較して電気泳動純度を大幅な純度ゲイン（＞26倍）で示すと結論できる。溶出液中で同定された第２バンドはＦＩＸの他の形に対応する。
この溶出液は出発材料と比較して電気泳動純度を大幅な純度ゲイン（＞26倍）で示すと結論できる。溶出液中で同定された第２バンドはＦＩＸの他の形に対応する。
実施例５
ヒト血漿第ＶＩＩ因子の精製方法
Ａ．材料および方法
Ａ．１ 親和性クロマトグラフ基質
ビオチンとアプタマとの間にスペーサ鎖なしでビオチンに直接結合した「Mapt-2コア」アプタマを固定した親和性ゲル材料。アプタマは5'−末端ビオチンによってストレプトアビジン・ゲル（供給元Novagen）に固定されている。0.4mg/mlの理論的リガンド濃度：容積１ml。
使用したアプタマは配列SEQ ID番号20のMapt-2コア・アプタマである。
ヒト血漿第ＶＩＩ因子の精製方法
Ａ．材料および方法
Ａ．１ 親和性クロマトグラフ基質
ビオチンとアプタマとの間にスペーサ鎖なしでビオチンに直接結合した「Mapt-2コア」アプタマを固定した親和性ゲル材料。アプタマは5'−末端ビオチンによってストレプトアビジン・ゲル（供給元Novagen）に固定されている。0.4mg/mlの理論的リガンド濃度：容積１ml。
使用したアプタマは配列SEQ ID番号20のMapt-2コア・アプタマである。
Ａ．２ 出発材料
出発材料は98％まで精製したヒト血漿第ＶＩＩ因子組成物から成る。
出発材料は98％まで精製したヒト血漿第ＶＩＩ因子組成物から成る。
Ａ．３ 精製プロトコル
ゲル平衡化：0.050 M トリス-HCl、0.010M CaCl2、0.05mM MgCl2、pH 7.5、
溶出：0.020 Mトリス-HCl、0.010M EDTA、pH 7.5。
平衡緩衝液中の98％まで精製したヒト血漿第ＶＩＩ因子の240μgを0.5ml/mmの流速で注入。保持されない材料のピークを検出後、溶出緩衝液の2カラム容積を注入。タンパクのピークは280ｎｍの波長での吸光度値を測定して検出。
ゲル平衡化：0.050 M トリス-HCl、0.010M CaCl2、0.05mM MgCl2、pH 7.5、
溶出：0.020 Mトリス-HCl、0.010M EDTA、pH 7.5。
平衡緩衝液中の98％まで精製したヒト血漿第ＶＩＩ因子の240μgを0.5ml/mmの流速で注入。保持されない材料のピークを検出後、溶出緩衝液の2カラム容積を注入。タンパクのピークは280ｎｍの波長での吸光度値を測定して検出。
Ｂ． 結果
結果は［図６］および［図7］に示す。［図6］は時間を関数とする280ｎｍでの吸光度の測定値の曲線を表す。［図6］のピークNo.１はカラムに保持されなかった出発材料の画分に対応し、ピークNo.2は溶出分画に対応する。
不純物の除去適度を視覚化するために出発材料および溶出物を硝酸銀染色してSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。［図7］はこのゲルを表し、レーンNo.１は出発材料の画分、レーンNo.2は溶出画分に対応する。
出発材料はかなり純度が高いのにかかわらず、溶出画分は不純物を含まず、劣化もない点に注意。
［図6］および［図7］の結果は配列SEQ ID番号20のアプタマはヒトＦＶＩＩに結合でき、ＥＤＴＡの存在下で特異的に溶出できることを示す。
結果は［図６］および［図7］に示す。［図6］は時間を関数とする280ｎｍでの吸光度の測定値の曲線を表す。［図6］のピークNo.１はカラムに保持されなかった出発材料の画分に対応し、ピークNo.2は溶出分画に対応する。
不純物の除去適度を視覚化するために出発材料および溶出物を硝酸銀染色してSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。［図7］はこのゲルを表し、レーンNo.１は出発材料の画分、レーンNo.2は溶出画分に対応する。
出発材料はかなり純度が高いのにかかわらず、溶出画分は不純物を含まず、劣化もない点に注意。
［図6］および［図7］の結果は配列SEQ ID番号20のアプタマはヒトＦＶＩＩに結合でき、ＥＤＴＡの存在下で特異的に溶出できることを示す。
実施例６
ウサギＦＶＩＩへのアプタマの結合非存在
Ａ． 材料および方法
Ａ．１ アフィニティークロマトグラフィ基質
配列SEQ ID番号86のアプタマが5'−末端ビオチンを介してスペーサ鎖（供給元Novagen）により固定された、ストレプトアビジンに結合された親和性ゲル。0.35mg/mlの理論的リガンド濃度：容積１ml。
使用したアプタマは配列SEQ ID番号86のアプタマである
ウサギＦＶＩＩへのアプタマの結合非存在
Ａ． 材料および方法
Ａ．１ アフィニティークロマトグラフィ基質
配列SEQ ID番号86のアプタマが5'−末端ビオチンを介してスペーサ鎖（供給元Novagen）により固定された、ストレプトアビジンに結合された親和性ゲル。0.35mg/mlの理論的リガンド濃度：容積１ml。
使用したアプタマは配列SEQ ID番号86のアプタマである
Ａ．２ 出発材料
ウサギ血漿から精製して得たウサギＦＶＩＩリッチな濃縮ヒドロキシアパタイトの溶出液、接触時間10分、流速0.5ml/mm。
ウサギ血漿から精製して得たウサギＦＶＩＩリッチな濃縮ヒドロキシアパタイトの溶出液、接触時間10分、流速0.5ml/mm。
Ａ．３ 精製プロトコル
ゲル平衡化：0.050 Mトリス-HCl、0.010M CaCl2、0.05mM MgSO3、pH 7.5、
溶出：0.050 Mトリス-HCl、0.010M EDTA、pH 7.5、
36μgを10分の接触時間でゲルに注入する。溶出は2mlの溶出緩衝液を注入して実行。タンパクのピークは280ｎｍの波長での吸光度値を測定して検出。
ゲル平衡化：0.050 Mトリス-HCl、0.010M CaCl2、0.05mM MgSO3、pH 7.5、
溶出：0.050 Mトリス-HCl、0.010M EDTA、pH 7.5、
36μgを10分の接触時間でゲルに注入する。溶出は2mlの溶出緩衝液を注入して実行。タンパクのピークは280ｎｍの波長での吸光度値を測定して検出。
Ａ．４ タンパクおよび第ＶＩＩ因子に関する画分の分析プロトコル
アミド分解（amldolytic）活性のために各画分をStagoキットを使用してクロマトアッセイによって分析。供給元の推薦条件に従う（因子Vlla StatClotキット）。アミド分解活性を各画分に含まれるＦＶＩＩのμgに変換。
アミド分解（amldolytic）活性のために各画分をStagoキットを使用してクロマトアッセイによって分析。供給元の推薦条件に従う（因子Vlla StatClotキット）。アミド分解活性を各画分に含まれるＦＶＩＩのμgに変換。
Ｂ． 結果
結果は［表４］に示した。
結果は［表４］に示した。
［表４］の結果はMapt-2アプタマが固定された親和性ゲルにはウサギ第ＶＩＩ因子は保持されないことを示す。
実施例７
Biacoreでのアプタマとヒト因子VIIとの相互作用のための特定プロトコルの実施例（NaCl耐性）
Ａ． 材料および方法
本発明の配列SEQ ID番号86の核酸アプタマ分子（「Mapt2」という）が固定された固体の基質を製造した。
固体基質に結合する前にＭａｐｔ２アプタマの５’末端を化学的に変成してＰＥＧ（Ｃ１８）の４つの分子から成るスペーサ鎖に連結した。それから、アプタマに連結した末端とは反対側のスペーサ鎖の遊離末端にビオチン分子を連結した。
固定したストレプトアビジン分子を含む固体基質は提供された（Series Ｓ sensor ChipSA.ＧＥ）。
次いで、上記アプタマ化合物と接触させて、基質のストレプトアビジン分子とアプタマ化合物のビオチン分子との間の非共役会合によって上記固体基質を配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸を固定する。
Ｍａｐｔ２アプタマは３７７２ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり固定した生成物が約１ｐｇに対応）の固定化度で固定された。
Biacoreでのアプタマとヒト因子VIIとの相互作用のための特定プロトコルの実施例（NaCl耐性）
Ａ． 材料および方法
本発明の配列SEQ ID番号86の核酸アプタマ分子（「Mapt2」という）が固定された固体の基質を製造した。
固体基質に結合する前にＭａｐｔ２アプタマの５’末端を化学的に変成してＰＥＧ（Ｃ１８）の４つの分子から成るスペーサ鎖に連結した。それから、アプタマに連結した末端とは反対側のスペーサ鎖の遊離末端にビオチン分子を連結した。
固定したストレプトアビジン分子を含む固体基質は提供された（Series Ｓ sensor ChipSA.ＧＥ）。
次いで、上記アプタマ化合物と接触させて、基質のストレプトアビジン分子とアプタマ化合物のビオチン分子との間の非共役会合によって上記固体基質を配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸を固定する。
Ｍａｐｔ２アプタマは３７７２ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり固定した生成物が約１ｐｇに対応）の固定化度で固定された。
トランスジェニック・ウサギの乳汁から得られる精製したトランスジェニック・ヒトＦＶＩＩ（ＦＶＩＩ ＨＰＴＧ（純度）：98％) をランニング緩衝液（50mMトリス、50mM NaCl、10mM CaCl2、4mM MgCl2、pH 7.4)で希釈してＦＶＩＩ濃度が２００ｍＭのサンプルを得る。
サンプルはビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって固定されたＭａｐｔ２アプタマを含むチップ（固体基質）上に順次注入した。次に、NaClの濃度を上げた緩衝液を固体基質上へ注入された。（1M NaClから3M NaClまでの３シリーロを注入）。全ての注入は３０μｌ／分の流速で６０秒かけて注入した。NaClを含む上記の３シリーズの緩衝液の注入後、溶出緩衝液（10mM EDTA）を３０μｌ／分の流速で７５秒間かけて注入してアプタマからＦＶＩＩ ＨＰＴＧを分離した。
解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。トランスジェニック・ヒトＦＶＩＩに対するMapt2固定アプタマの結合曲線はBiacore（登録商標）制御ソフトウェア（バージョン1.2）の専用モジュールで計算した。
このヒトＦＶＩＩに対するMapt2アプタマの結合結果から、ヒトＦＶＩＩへのMapt2アプタマの結合はNaClを含む緩衝液の注入によって有害な状態で変化しないことということが確認できる。
サンプルはビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって固定されたＭａｐｔ２アプタマを含むチップ（固体基質）上に順次注入した。次に、NaClの濃度を上げた緩衝液を固体基質上へ注入された。（1M NaClから3M NaClまでの３シリーロを注入）。全ての注入は３０μｌ／分の流速で６０秒かけて注入した。NaClを含む上記の３シリーズの緩衝液の注入後、溶出緩衝液（10mM EDTA）を３０μｌ／分の流速で７５秒間かけて注入してアプタマからＦＶＩＩ ＨＰＴＧを分離した。
解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。トランスジェニック・ヒトＦＶＩＩに対するMapt2固定アプタマの結合曲線はBiacore（登録商標）制御ソフトウェア（バージョン1.2）の専用モジュールで計算した。
このヒトＦＶＩＩに対するMapt2アプタマの結合結果から、ヒトＦＶＩＩへのMapt2アプタマの結合はNaClを含む緩衝液の注入によって有害な状態で変化しないことということが確認できる。
Ｂ． 結果
結果は［図８］に示した。
結果は［図８］に示した。
実施例８
Biacore上のアプタマとヒト因子ＶＩＩとの相互作用のためのプロトコルの特定実施例（プロピレングリコール耐性）
Ａ．材料および方法
本発明の配列SEQ ID番号86の核酸アプタマ分子（「Mapt2」という）が固定された固体の基質を製造した。
固体基質に結合する前にＭａｐｔ２アプタマの５’末端を化学的に変成してＰＥＧ（Ｃ１８）の４つの分子から成るスペーサ鎖に連結した。それから、アプタマに連結した末端とは反対側のスペーサ鎖の遊離末端にビオチン分子を連結した。
固定したストレプトアビジン分子を含む固体基質は提供された（Series Ｓ sensor ChipSA.ＧＥ）。
次いで、上記アプタマ化合物と接触させて、基質のストレプトアビジン分子とアプタマ化合物のビオチン分子との間の非共役会合によって上記固体基質を配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸を固定する。
Ｍａｐｔ２アプタマは５３１９ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり固定した生成物が約１ｐｇに対応）の固定化度で固定された。
Biacore上のアプタマとヒト因子ＶＩＩとの相互作用のためのプロトコルの特定実施例（プロピレングリコール耐性）
Ａ．材料および方法
本発明の配列SEQ ID番号86の核酸アプタマ分子（「Mapt2」という）が固定された固体の基質を製造した。
固体基質に結合する前にＭａｐｔ２アプタマの５’末端を化学的に変成してＰＥＧ（Ｃ１８）の４つの分子から成るスペーサ鎖に連結した。それから、アプタマに連結した末端とは反対側のスペーサ鎖の遊離末端にビオチン分子を連結した。
固定したストレプトアビジン分子を含む固体基質は提供された（Series Ｓ sensor ChipSA.ＧＥ）。
次いで、上記アプタマ化合物と接触させて、基質のストレプトアビジン分子とアプタマ化合物のビオチン分子との間の非共役会合によって上記固体基質を配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸を固定する。
Ｍａｐｔ２アプタマは５３１９ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり固定した生成物が約１ｐｇに対応）の固定化度で固定された。
トランスジェニック・ウサギの乳汁から得られる精製したトランスジェニック・ヒトＦＶＩＩ（ＦＶＩＩ ＨＰＴＧ（純度）：98％) をランニング緩衝液（50mMトリス、50mM NaCl、10mM CaCl2、4mM MgCl2、pH 7.4)で希釈してＦＶＩＩ濃度が２００ｍＭのサンプルを得る。
サンプルはビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって固定されたＭａｐｔ２アプタマを含むチップ（固体基質）上に順次注入した。次に、50％プロピレングリコールを含む緩衝液を固体基質上へ注入した。全ての注入は３０μｌ／分の流速で６０秒かけて注入した。50％プロピレングリコールを含む緩衝液を注入後、溶出緩衝液（10mM EDTA）を３０μｌ／分の流速で７５秒間かけて注入してアプタマからＦＶＩＩ ＨＰＴＧを分離した。
解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。トランスジェニック・ヒトＦＶＩＩに対するMapt2固定アプタマの結合曲線はBiacore（登録商標）制御ソフトウェア（バージョン1.2）の専用モジュールで計算した。
このヒトＦＶＩＩに対するMapt2アプタマの結合結果から、ヒトＦＶＩＩへのMapt2アプタマの結合はプロピレングリコールを含む緩衝液の注入によって有害な状態で変化しないことということが確認できる。
サンプルはビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって固定されたＭａｐｔ２アプタマを含むチップ（固体基質）上に順次注入した。次に、50％プロピレングリコールを含む緩衝液を固体基質上へ注入した。全ての注入は３０μｌ／分の流速で６０秒かけて注入した。50％プロピレングリコールを含む緩衝液を注入後、溶出緩衝液（10mM EDTA）を３０μｌ／分の流速で７５秒間かけて注入してアプタマからＦＶＩＩ ＨＰＴＧを分離した。
解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。トランスジェニック・ヒトＦＶＩＩに対するMapt2固定アプタマの結合曲線はBiacore（登録商標）制御ソフトウェア（バージョン1.2）の専用モジュールで計算した。
このヒトＦＶＩＩに対するMapt2アプタマの結合結果から、ヒトＦＶＩＩへのMapt2アプタマの結合はプロピレングリコールを含む緩衝液の注入によって有害な状態で変化しないことということが確認できる。
Ｂ． 結果
結果は［図９］に示した。
結果は［図９］に示した。
Claims (16)
- 血漿タンパクを選択的に結合させるための親和性基質であって、固体の基質材料を含み、この固体の基質材料上で上記血漿タンパクにデオキシリボ核酸アプタマ（deoxyribonucleic adaptamer）が特異的に固定されている親和性基質。
- 上記デオキシリボ核酸アプタマが式（Ｉ）の化合物の構造中に含まれる請求項１または２に記載の親和性基質：
［ＦＩＸ］ｘ−［ＳＰＡＣ］ｙ−［ＡＰＴ］ （Ｉ）
（ここで、
［ＦＩＸ］は基質上に固定するための化合物を表し、
［ＳＰＡＣ］はスペーサ鎖を表し、
［ＡＰＴ］は凝固タンパクに特異的に結合するデオキシリボ核酸を表し、
ｘは０または１に等しい整数であり、
ｙは０または１に等しい整数である） - 式（Ｉ）の化合物の［ＡＰＴ］が配列ＳＥＱＩＤ番号１のデオキシリボ核酸から成る請求項２に記載の親和性基質。
- 血漿タンパクがアルブミン、α/マクログロブリン、抗キモトリプシン、抗トロンビン、抗トリプシン、アポＡ、アポＢ、アポＣ、アポＤ、アポＥ、アポＦ、アポＧ、βＸＩＩａ、Ｃ１−抑制物質、Ｃ−反応性タンパク、Ｃ７、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ４ｂＰ、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ１ｑ、Ｃ８、Ｃ９、カルボキシペプチダーゼＮ、セルロプラスミン、因子Ｂ、因子Ｄ、因子Ｈ、フィブリノゲン、因子ＩＸ、プロアクセレリン、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩａ、因子ＶＩＩＩ、因子Ｘ、因子Ｘｌ、因子ＸＩＩ、因子ＸＩＩＩ、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ヘパリン補因子ＩＩ、ヒスチジンが豊富なＧＰ、免疫グロブリンＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩＴＩ、ＩｇＭ、キニナーゼＩＩ、キニノーゲンＨＰＭ、リソチーム、ＰＡＩ２、ＰＡＩ１、ＰＣＩ、プラスミン、プラスミンインヒビター、プラスミノーゲン、プレアルブミン、プロカリクレイン、プロパージン、プロテアーゼネキシンＩＮＨ、プロテインＣ、タンパクＳ、タンパクＺ、プロトロンビン、ＴＦＰＩ、チオール−プロテイナーゼ、トロンボモジュリン、組織因子（ＴＦ）、ＴＰＡ、トランスコアルブミン（transcolabamin）ＩＩ、トランスコルチン、トランスフェリン、ビトロネクチンおよびフォンビルブラント因子の中かち選択される請求項１〜３のいずれか一項に記載の親和性基質。
- 血漿タンパクが因子Ｉ（フィブリノゲン）、因子ＩＩ（プロトロンビン）、因子Ｖ（プロアクセレリン）、因子ＶＩＩ（プロコンベルチン）、因子ＶＩＩＩ（抗血友病Ａ因子）、ＩＸ因子（抗血友病因子Ｂ）、因子Ｘ（スチュワート因子）、Ｘｌ因子（ローゼンソール因子またはＰＴＡ）、因子ＸＩＩ（ハーゲマン因子）、因子ＸＩＩＩ（フィブリン安定化因子またはＦＳＦ）、ＰＫ（プレカリクレイン）、ＨＭＷＫ（高分子キニノーゲン）、組織トロンボプラスチン、ヘパリン補因子ＩＩ（HClＩ）、プロテインＣ（ＰＣ）、トロンボモジュリン（ＴＭ）、タンパクＳ（ＰＳ）、フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）および組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）または組織因子から選択される請求項１〜４のいずれか一項に記載の親和性基質。
- 固体の基質材料が樹脂、ポリマビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、濾過メンブレンの基質材料およびポリマー材料から選択される請求項1〜5のいずれか一項に記載の親和性基質。
- 請求項１〜６のいずれか一項に記載の親和性基質と血漿タンパクを含むサンプルとを接触させる段階を含む、基質上に血漿タンパクを固定する方法。
- 下記の（a)〜（c)の工程を有する血漿タンパクの精製方法：
（a) 請求項１〜６のいずれか一項に記載の親和性基質と血漿タンパクを含むサンプルとを接触させて、(i) 上記親和性基質上に固定された核酸アプタと(ii) 血漿タンパクマとの間に錯体を形成し、
（b) 段階（a)で形成された錯体からタンパクをフリーにし、
（c) 血漿タンパクを精製された形で回収する。 - 前記サンプルが人血の血漿またはその画分、上記血漿タンパクに対してトランスジェニックな哺乳類の乳汁またはその画分の中から選択される請求項８に記載の方法。
- 上記血漿タンパクがヒトの血液である請求項８または９に記載の方法。
- サンプルが少なくとも一種のヒト以外の血液の血漿タンパクを含む請求項10に記載の方法。
- 人の血液の血漿タンパクがヒト以外の血漿タンパクと相同関係にある請求項11に記載の方法。
- 人の血液の血漿タンパクがヒト以外の血漿タンパクのホモローグ（相同物）である請求項12に記載の方法。
- 親和性基質を二価-イオンキレート剤、好ましくはＥＤＴＡを含む溶出緩衝液と接触させて段階（b)を実行する請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも99.9重量％がヒト以外のタンパクを実質的に含まない組換え型ヒトタンパクから成る組換え型ヒト血漿タンパクの精製された組成物。
- 請求項15に記載の組換え型ヒト血漿タンパクの精製された組成物を含む医薬組成物。
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