ES2700225T3 - Medios para la purificación de una proteína del plasma sanguíneo, y procedimientos para su realización - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la purificación de una proteína plasmática humana recombinante a partir de un medio de partida que es una solución biológica que proviene de un animal no humano transgénico para dicha proteína plasmática humana, que comprende las etapas siguientes: a) poner en contacto una muestra que contiene la proteína plasmática humana con un soporte de afinidad que comprende un soporte sólido en el que se inmovilizan unos aptámeros desoxirribonucleicos que se unen específicamente a dicha proteína plasmática humana, a fin de formar unos complejos entre (i) los aptámeros nucleicos inmovilizados sobre dicho soporte de afinidad y (ii) dicha proteína plasmática humana, y b) liberar la proteína a partir de los complejos formados en la etapa a), y c) recuperar dicha proteína plasmática humana en una forma purificada.

Description

DESCRIPCIÓN

Medios para la purificación de una proteína del plasma sanguíneo, y procedimientos para su realización Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la purificación de las proteínas del plasma sanguíneo, utilizables como principios activos de medicamentos.

Técnica anterior

Las proteínas del plasma sanguíneo constituyen desde hace mucho tiempo unos principios activos de medicamentos. Entre las proteínas del plasma sanguíneo utilizadas como principios activos de medicamento, se puede citar, en particular, el factor VII, el factor VIII, la trombina o también el factor de Willebrand.

Hasta hace poco, las proteínas del plasma se obtenían exclusivamente por purificación a partir del plasma sanguíneo humano. Desde hace algunos años, algunas proteínas del plasma se obtienen en forma de proteínas recombinantes producidas en fluidos corporales de mamíferos transgénicos, por ejemplo en la leche de mamíferos transgénicos.

En todos los casos, el material de base que contiene la proteína plasmática a purificar consiste en un material de constitución compleja, en el que la proteína de interés está presente en combinación con sustancias muy numerosas, incluyendo proteínas, lípidos, glúcidos, aminoácidos, sales minerales, restos celulares y desechos metabólicos como la urea, el ácido úrico o la bilirrubina.

La elaboración de un procedimiento de purificación de una proteína plasmática es, por lo tanto, un trabajo complejo, teniendo en cuenta las características sanitarias y reglamentaciones exigidas para la comercialización de un medicamento para uso humano.

Se comprende que, en un medicamento para uso humano o veterinario, la proteína plasmática utilizada como principio activo debe estar presente en una forma altamente purificada y no asociarse a sustancias indeseables susceptibles de ser perjudiciales para el organismo, incluyendo otras proteínas plasmáticas, o también unos productos de degradación de las proteínas antes citadas.

Se conocen unos procedimientos de purificación de proteínas plasmáticas variadas, incluyendo unos procedimientos de purificación del factor VIII, de la anti-trombina-III, del plasminógeno, del factor VII o también del factor de Willebrand.

El conjunto de los procedimientos conocidos comprende una sucesión de etapas de separación selectiva basadas en etapas de precipitación de las proteínas, de paso sobre soportes de cromatografía seguido de etapas de elución secuencial, de etapas de filtración en profundidad, de ultrafiltración o también de etapas de concentración.

Se precisa que la elaboración de procedimientos de purificación de las proteínas de la coagulación, ya sean estos procedimientos totalmente nuevos, o bien que estos procedimientos sean unas adaptaciones, incluso mínimas, de procedimientos conocidos, necesita largas investigaciones y numerosos controles de conformidad de los productos intermedios sucesivos, a fin de asegurarse de que el producto final se obtendrá con una gran pureza, en una forma no alterada, sustancialmente libre de sustancias indeseables y al mismo tiempo estéril y sin pirógenos. En particular, para las proteínas plasmáticas de la coagulación que tienen una actividad enzimática, como por ejemplo los factores VII, VII y XI, es esencial que la proteína final purificada no esté activada. Ahora bien, la activación de una proteína de la coagulación es susceptible de ser inducida durante una cualquiera de las etapas de purificación, incluso durante las etapas de cromatografía, si no se respetan las condiciones de consigna predeterminadas, por ejemplo calidad de los filtros o del soporte cromatográfico utilizados, concentración salina o también temperatura.

Lo anterior explica, al menos en parte, porqué los procedimientos conocidos no comprenden etapa de cromatografía de afinidad, basada en el principio de inmovilización específica de la proteína plasmática de interés sobre un ligando injertado sobre el soporte cromatográfico, y después recuperación de la proteína purificada en el eluato de cromatografía.

La ausencia de etapa de purificación por cromatografía de afinidad en los procedimientos de purificación de proteínas de interés terapéutico se explica también por las desventajas de esta técnica, en la que se observa el desprendimiento de una parte de las moléculas de ligando injertadas sobre el soporte de afinidad, que se encuentran asociadas a la proteína terapéutica purificada en el volumen del eluato. Se comprende que la presencia, en un medicamento que comprende una proteína plasmática purificada, de sustancias constitutivas de un soporte de cromatografía, que son eventualmente perjudiciales para el organismo, puede poner en juego la salud del paciente y están prohibidas por la reglamentación médica.

Romig et al. (J. Chromatogr. 1999, 731, 275-284) describe la purificación de una proteína recombinante de fusión L-selectina-lg a partir del sobrenadante clarificado de un medio de cultivo de CHO por cromatografía sobre un soporte de afinidad que comprende unos aptámeros.

Liu et al. (Journal of molecular récognition, 2003; 16 :23-27) describe unos aptámeros de ARN específicos de la trombina bovina destinados a aplicaciones clínicas.

Zhao et al. (Anal. Chem, 2008, 80, 3915-3920) describe un procedimiento de detección del citocromo C y de la trombina por cromatografía capilar sobre un soporte de afinidad de aptámeros.

A pesar de que los procedimientos conocidos de purificación de las proteínas plasmáticas sean satisfactorios, existe una necesidad en el estado de la técnica de procedimientos alternativos o mejorados, con respecto a los procedimientos existentes.

Resumen de la invención

La invención se refiere a un procedimiento tal como se define en las reivindicaciones, en particular un procedimiento para la purificación de una proteína plasmática humana recombinante a partir de un medio de partida que es una solución biológica que proviene de un animal no humano transgénico para dicha proteína plasmática humana, que comprende las etapas siguientes:

a) poner en contacto una muestra que contiene la proteína plasmática humana con un soporte de afinidad que comprende un soporte sólido en el que se inmovilizan aptámeros desoxirribonucleicos que se unen específicamente a dicha proteína plasmática humana, a fin de formar unos complejos entre (i) los aptámeros desoxirribonucleicos inmovilizados sobre dicho soporte de afinidad y (ii) dicha proteína plasmática humana,

b) liberar la proteína a partir de los complejos formados en la etapa a), y

c) recuperar dicha proteína plasmática humana en una forma purificada.

Descripción de las figuras

La figura 1 ilustra un perfil de cromatografía obtenido durante la realización del procedimiento de purificación de un factor VII humano recombinante producido en la leche de coneja con el soporte de afinidad en el que se inmovilizan aptámeros nucleicos anti-FVII humano. En las abscisas: el tiempo; en las ordenadas: el valor de absorbancia (D.O.) a 254 nanómetros.

La figura 2 representa la curva de los valores de medición de la absorbancia a 280 nm en función del tiempo.

La figura 3 es una fotografía de un gel de electroforesis SDS PAGE con una coloración con azul de coomasie que permite una cuantificación relativa de las bandas. De la izquierda a la derecha del gel en la figura 3, las pistas representan los resultados de migración de los productos de partida siguientes:

- pista “MD”: la composición de partida Betafact®,

- pista “NR”: la fracción no retenida que corresponde al pico n° 1 del perfil cromatográfico de la figura 2,

- pista “E1 ”: la fracción de elución que corresponde al pico n° 2 del perfil cromatográfico de la figura 2,

La figura 4 representa la curva de los valores de medición de la absorbancia a 280 nm en función del tiempo.

La figura 5 es un cliché de un gel de electroforesis SDS PAGE. De la izquierda hacia la derecha del gel en la figura 5, las pistas representan los resultados de migración de los productos de partida siguientes:

- pista “E5”: composición de partida de leche de cerda transgénica que contiene el factor IX humano transgénico pre­ purificado por una etapa cromatográfica MEP HyperCel,

- pista “E6”: fracción no retenida que corresponde al pico n° 1 del perfil cromatográfico de la figura 4,

- pista “E7”: fracción de elución que corresponde al pico n° 2 del perfil cromatográfico de la figura 4,

- pista “E8”: fracción de regeneración que corresponde al pico n° 3 del perfil cromatográfico de la figura 4,

- pista “T FIX”: control de factor IX humano plasmático purificado.

La figura 6 representa la curva de los valores de medición de la absorbancia a 280 nm en función del tiempo. En la figura 6, el pico n° 1 corresponde a la fracción del producto de partida que no se ha retenido sobre la columna. El pico n° 2 corresponde a la fracción de elución.

La figura 7 representa un cliché de un gel del producto de partida así como el producto eluido que se ha analizado en SDS PAGE con coloración con nitrato de plata a fin de visualizar la eliminación de las impurezas: la pista n° 1 corresponde a la fracción del producto de partida y la pista n° 2 a la fracción de elución. A pesar de la pureza importante del producto de partida, se constata que la fracción eluida ya no contiene contaminantes o formas degradadas.

La figura 8 representa las curvas de unión del aptámero inmovilizado Mapt2 al factor VII humano recombinante producido en la leche de una coneja transgénica. Las flechas corresponden al tiempo de las diferentes inyecciones, respectivamente de la izquierda a la derecha en la figura 8: 1: inyección del factor VII recombinante; 2: inyección de un tampón a 1M NaCl; 3: inyección de un tampón a 2M NaCl, 4: inyección de un tampón a 3M NaCl; 5: inyección de un tampón Tris 50 mM, EDTA 10 mM. En las abscisas: tiempo expresado en segundos; en las ordenadas: valor de la señal de respuesta, expresado en unidades (RU) arbitrarias.

La figura 9 representa las curvas de unión del aptámero inmovilizado Mapt2 al factor VII humano recombinante producido en la leche de una coneja transgénica. Las flechas corresponden al tiempo de las diferentes inyecciones, respectivamente de izquierda a derecha en la figura 9: 1: propilenglicol al 50%; 2: EDTA a 10 mM.

Descripción detallada de la invención

Después de largas búsquedas, el solicitante ha elaborado un procedimiento de purificación de las proteínas del plasma sanguíneo, que comprende una etapa de cromatografía durante la cual tiene lugar una unión específica de la proteína de interés en un ligando previamente inmovilizado sobre el soporte de cromatografía, después de liberación de la proteína de interés retenida sobre dicho soporte y recuperación de la proteína purificada en el volumen del eluato.

Más precisamente, se proporciona, según la invención, un procedimiento para la purificación de las proteínas del plasma sanguíneo que comprende una etapa de unión específica de la proteína plasmática de interés sobre un soporte sobre el cual se inmovilizan unos aptámeros desoxirribonucleicos que se unen específicamente a dicha proteína de interés, seguida de una etapa de recuperación de dicha proteína de interés purificada.

De manera sorprendente, se ha mostrado que unos soportes de cromatografía de afinidad sobre los cuales se inmovilizan unos aptámeros desoxirribonucleicos específicos de la proteína plasmática de interés, es decir incluso en forma de compuestos inmovilizados que comprende tales aptámeros desoxirribonucleicos, pueden utilizarse con éxito en procedimientos de obtención de proteínas plasmáticas, utilizables como principios activos de un medicamento.

De manera sorprendente, se ha mostrado que se puede fabricar un soporte de afinidad tal como se define en la presente descripción utilizando unos aptámeros de ácido desoxirribonucleico (ADN), sin embargo considerados en el estado de la técnica como ácidos nucleicos ligandos cuya utilización es difícil, y cuya especificidad para la proteína diana es menor que la especificidad de la molécula de ARN de secuencia correspondiente. En particular, se admite, en el estado de la técnica, que los ADN ligandos tienen una flexibilidad menor que el ARN correspondiente y que por lo tanto son menos aptos que los ARN ligandos para sufrir cambios de conformación. Se recuerda que cuando un aptámero nucleico se une a la proteína diana, se produce un cambio de conformación. Se ha descrito también que cuanto más rápido es el cambio de conformación del aptámero nucleico, más elevada es la afinidad de dicho aptámero para la proteína diana (Michaud et al., 2003, Anal Chem, Vol. 76: 1015-1020; Brumbt et al., 2005, Anal Chem, Vol. 77: 1993-1998).

Se ha mostrado también que el soporte de afinidad permite purificar unas proteínas de la coagulación de secuencia primaria muy distintas, tales como el factor VII y el factor IX humanos.

Se ha mostrado también que el soporte de afinidad permite purificar unas proteínas de la coagulación a partir de medios de partida de composición compleja, como una composición plasmática enriquecida en factor IX humano y una leche de animal transgénico para el factor IX humano, con una gran especificidad de unión a dicha proteína de la coagulación de interés.

Se ha mostrado también que el soporte de afinidad permite purificar selectivamente una proteína de la coagulación humana a partir de un medio de partida que comprende también una proteína ortóloga no humana, por ejemplo, a partir de una leche de animal transgénico para el factor IX humano, comprendiendo dicha lecha también el factor IX producido naturalmente por dicho animal transgénico, pudiendo ser dicho factor IX producido naturalmente por dicho animal transgénico (o FIX endógeno), por ejemplo, un FIX porcino.

Se ha mostrado también que el soporte de afinidad permite purificar selectivamente una proteína de la coagulación humana a partir de un medio de partida que comprende también una proteína ortóloga no humana, por ejemplo a partir de una leche de animal transgénico para el factor VII humano, comprendiendo dicha leche también el factor VII producido naturalmente por dicho animal transgénico, pudiendo ser dicho factor VII producido naturalmente por dicho animal transgénico (o FVII endógeno), por ejemplo, un FVII de conejo.

Se describe un soporte de afinidad para la unión selectiva de una proteína del plasma sanguíneo, que comprende un material de soporte sólido sobre el cual se inmovilizan unos aptámeros desoxirribonucleicos que se unen específicamente a dicha proteína plasmática, incluso en forma de compuestos que comprenden tales aptámeros desoxirribonucleotídicos.

Las moléculas de aptámero desoxirribonucleico que se unen específicamente a la proteína plasmática de interés, así como los compuestos que comprenden tales aptámeros desoxirribonucleicos, constituyen unos sitios de unión específica de dicha proteína diana llevados por dicho material de soporte sólido.

Por “aptámeros desoxirribonucleicos” se abarcan unos ácidos desoxirribonucleicos monocatenarios que tienen una longitud de 5 a 120 nucleótidos de longitud y que se unen específicamente a una proteína del plasma sanguíneo. Por “compuestos” que comprenden un aptámero desoxirribonucleico, se abarcan también unos compuestos que comprenden, en su estructura, dichos ácidos desoxirribonucleicos definidos anteriormente. Así, los compuestos que comprenden un ácido desoxirribonucleico que se unen específicamente a una proteína plasmática, humana o de mamífero, abarcan los compuestos en los que dicho ácido desoxirribonucleico se incluye en una estructura que comprende una molécula de biotina.

Se ha mostrado que un soporte de afinidad tal como se ha definido anteriormente permitía una inmovilización eficaz de la proteína plasmática de interés, que puede también denominarse “proteína diana” en la presente descripción. Un soporte de afinidad tal como se ha definido anteriormente posee una alta capacidad de adsorción de la proteína diana, ya que poner en contacto el soporte sólido con una solución líquida que contiene la proteína plasmática a purificar permite saturar al menos el 50 por ciento de los sitios diana portados por el soporte sólido.

Se ha mostrado también que las moléculas de la proteína plasmática que se unen específicamente a las moléculas de aptámeros desoxirribonucleicos, pueden después eluirse del soporte de afinidad con un buen rendimiento, de al menos el 75 por ciento.

Además, se ha mostrado que el soporte de afinidad posee una gran especificidad para la proteína plasmática de interés, ya que dicha proteína plasmática puede encontrarse con un grado de pureza que va hasta el 99,95 por ciento en peso, con respecto al peso total de las proteínas contenidas en el eluato.

Como se ilustra en los ejemplos, un incremento de dos órdenes de magnitud de la pureza de la proteína de la coagulación de interés puede también se puede obtener con un soporte de afinidad tal como se describe aquí, utilizando como producto de partida una composición que comprende la proteína diana de la coagulación a un alto grado de pureza, por ejemplo a más del 98% en peso, con respecto al peso total de las proteínas contenidas en dicho producto de partida. Se precisa que tal incremento de pureza se obtiene incluso cuando las impurezas presentes en el producto de partida poseen unas características estructurales o fisicoquímicas muy similares a las de la proteína diana de la coagulación que se quiere purificar.

De manera importante, se ha mostrado que las características anteriores de alta capacidad de absorción, de buen rendimiento y de alta especificidad del soporte de afinidad se obtenían en particular para la purificación de la proteína plasmática de interés a partir de un medio de partida de composición compleja, tal como un plasma sanguíneo o también un fluido biológico de un mamífero transgénico para dicha proteína plasmática de interés. Se ha mostrado también que la inmovilización de los aptámeros nucleicos sobre el material de soporte sólido era irreversible y duradera, ya que la presencia de aptámeros desoxirribonucleicos desprendidos del soporte no es detectable en la solución de eluato.

En particular, se ha mostrado que el soporte de afinidad puede ser “regenerado” por eliminación de las proteínas que permanecen unidas sobre el soporte después de la elución, muchas veces sin alteración significativa de (i) su capacidad de absorción de la proteína plasmática diana, (ii) su especificidad frente a dicha proteína diana, o también (iii) su ausencia de liberación de los aptámeros desoxirribonucleicos inmovilizados sobre el material de soporte sólido. Además, la regeneración del soporte de afinidad puede realizarse según técnicas conocidas y con agentes de regeneración conocidos, tal como la urea.

Los ácidos desoxirribonucleicos utilizados como ligandos de la proteína plasmática de interés presentan numerosas ventajas. Debido a su naturaleza oligonucleotídica, los aptámeros poseen una baja inmunogenicidad y una resistencia importante a condiciones fisicoquímicas rigurosas (presencia de urea, de DMSO, de un pH muy ácido o muy básico, utilización de disolventes orgánicos o de temperatura elevada) que permiten estrategias variadas de control de la seguridad sanitaria, en particular de la seguridad frente a virus o agentes patógenos no convencionales, en el ámbito de un uso como ligando de afinidad. Además, su selectividad es importante. Finalmente, como ya se ha mencionado, la producción de aptámeros desoxirribonucleicos implica costes relativamente limitados.

Así, la combinación de características anteriores del soporte de afinidad materializan la aptitud de dicho soporte de afinidad para utilizarse como medio para la purificación de una proteína del plasma sanguíneo, por que

- dicho soporte de afinidad permite la utilización de procedimientos de purificación de una proteína plasmática que tiene un muy alto grado de pureza,

- dicho soporte de afinidad no libera de manera detectable sustancias indeseables, en particular moléculas de aptámeros desoxirribonucleicos, en la solución de eluato que contiene la proteína plasmática purificada,

- el eventual desprendimiento de moléculas de aptámeros desoxirribonucleicos no conlleva inconvenientes para la salud humana,

- la unión, y después la elución de la proteína plasmática de interés sobre el soporte de afinidad, cuando se trata de una proteína plasmática con actividad enzimática, no conlleva la formación de cantidades detectables de la forma activada de dicha proteína plasmática,

- dicho soporte de afinidad es poco costoso de fabricar, en particular debido a costes reducidos de la producción de los aptámeros desoxirribonucleicos, y

- la realización de dicho soporte de afinidad para la purificación de una proteína plasmática es, por su parte, poco costosa debido a la longevidad de dicho soporte, debido en particular a la posibilidad de la regenerar numerosas veces, y durante un largo periodo de tiempo.

Además, como ya se ha mencionado, el soporte de afinidad es apto para fijar selectivamente, de manera reversible, la proteína plasmática diana, con un buen rendimiento y una buena especificidad, en procedimientos de purificación a partir de medios de constitución compleja, en particular a partir de medios clásicamente utilizados a escala industrial, tales como el plasma humano o medios de cultivo o fluidos biológicos que contienen dicha proteína de interés.

Además, como se detallará más adelante en la presente descripción, el soporte de afinidad es apto para el tratamiento de grandes volúmenes de solución que contiene la proteína plasmática de interés. El soporte de afinidad constituye, por lo tanto, una herramienta de purificación de una proteína del plasma sanguíneo que es perfectamente adecuado para una utilización a escala industrial.

Otras ventajas del soporte de afinidad se especificarán posteriormente en la presente descripción, o bien en relación con la descripción del soporte de afinidad en sí, o bien en relación con los procedimientos de purificación de una proteína plasmática en los que puede utilizarse dicho soporte de afinidad.

Según el conocimiento del solicitante, se describe aquí por primera vez un soporte de afinidad que comprende aptámeros desoxirribonucleicos inmovilizados para la purificación de una proteína del plasma sanguíneo en condiciones de utilización a escala industrial. Se conoce por otro lado, en el estado de la técnica, una variedad de aptámeros nucleicos específicos de la trombina, del factor VII y del factor IX (véase la solicitud PCT n° WO 02/26932). Sin embargo, según el conocimiento del solicitante, la utilización de aptámeros desoxirribonucleicos para la fabricación de soportes de afinidad utilizables a escala industrial en procedimientos de purificación de proteínas plasmáticas no se ha descrito jamás en el estado de la técnica.

Por “unión selectiva” se entiende, para los fines de la presente descripción, la unión específica de manera no covalente de la proteína plasmática de interés con los ácidos desoxirribonucleicos inmovilizados constitutivos del soporte de afinidad, y que es reversible poniendo en contacto el soporte de afinidad sobre el cual se han formado los complejos no covalentes entre dichos ácidos desoxirribonucleicos y dicha proteína de interés con una solución de constitución adecuada, que puede denominarse también solución de elución.

Por “proteína plasmática” se entiende cualquier proteína, especialmente cualquier proteína de interés industrial o terapéutico, contenida en el plasma sanguíneo. Las proteínas del plasma sanguíneo abarcan la albúmina, alfa/macroglobulina, antiquimotripsina, antitrombina, antitripsina, Apo A, Apo B, Apo C, Apo D, Apo E, Apo F, Apo G, beta XlIa, C 1 -inhibidor, proteína C-reactiva, C7, C1r, C1s, C2 C3, C4, C4bP, C5, C6, C1q, C8, C9, carboxipeptidasa N, ceruloplasmina, Factor B, Factor D, Factor H, Factor I, Factor IX, Factor V, Factor VII, Factor VIIa, Factor VIII, Factor X, Factor XI, Factor XII, Factor XIII, Fibrinógeno, Fibronectina, Haptoglobina, Hemopexina, Heparina cofactor II, Histidina rich GP, IgA, IgD, IgE, IgG, ITI, IgM, Kininasa II, Kininógeno HPM, Lisoziyma, PAI 2, PAI I, PCI, Plasmina, inhibidor de la plasmina, Plasminógeno, Prealbúmina, Prokalicreina, Properdina, Proteasa Nexina INH, proteína C, proteína S, proteína Z, Protrombina, TFPI, Tiol-proteinasa, Trombomodulina, Factor tisular (TF), TPA, Transcolabamina II, Transcortina, Transferrina, Vitronectina, y el Factor de Willebrand.

En particular, las proteínas plasmáticas abarcan las proteínas de coagulación, es decir las proteínas plasmáticas implicadas en la cadena de reacciones en cascada que lleva a la formación de un coágulo sanguíneo. Las proteínas de coagulación abarcan el Factor I (fibrinógeno), el Factor II (protrombina), el Factor V (proaccelerina), el Factor VII (proconvertina), el Factor VIII (factor anti-hemofílico A), el Factor IX (factor anti-hemofílico B), el Factor X (Factor Stuart), el Factor XI (Factor Rosenthal o PTA), el Factor XII (Factor Hageman), el Factor XIII (Factor que estabiliza la fibrina o FSF), la PK (Prekalicrina) el KHPM (kininógeno de alto peso molecular), la tromboplastina tisular, el cofactor II de la heparina (HCII), la proteína C (PC), la trombomodulina ^{( T m ) ,} la proteína S (PS), el factor de Willebrand (Wf) y el inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI), o también los factores tisulares.

En algunos modos de realización, la proteína plasmática consiste en una proteína de la coagulación de actividad enzimática.

Las proteínas de la coagulación con actividad enzimática abarcan el Factor II (protrombina), el Factor VII (proconvertina), el Factor IX (factor anti-hemofílico B), el Factor X (Factor Stuart), el Factor XI (Factor Rosenthal o PTA), el Factor XII (Factor Hageman), el Factor XIII (Factor que estabiliza la fibrina o FSF) y la PK (Prekalicrina). Según la invención, la proteína plasmática consiste en una proteína plasmática humana, recombinante.

En unos modos de realización preferidos, la proteína plasmática es el factor VII humano recombinante.

De manera general, los soportes sólidos sobre los cuales se pueden inmovilizar los aptámeros abarcan cualquier tipo de soporte que tiene la estructura y la composición encontrada comúnmente para los soportes de filtro, de membranas, etc. Los soportes sólidos abarcan en particular las resinas, las resinas para columna de cromatografía de afinidad, las bolas de polímeros, las bolas magnéticas, las bolas paramagnéticas, los materiales de soportes de membrana filtrante, etc. Los soportes sólidos abarcan también en particular los materiales a base de cristal o de metal, tales como el acero, el oro, la plata, el aluminio, el cobre, el silicio, el vidrio, la cerámica. Los soportes sólidos abarcan también en particular unos materiales poliméricos, tales como un polietileno, un polipropileno, una poliamida, un fluoruro de polivinilideno, y unas combinaciones de estos.

En algunos modos de realización, el soporte sólido puede revestirse con un material que facilita el enganche, la unión, la formación de complejos, la inmovilización o la interacción con los aptámeros, o con los compuestos que comprenden dichos aptámeros.

En algunos modos de realización, el soporte sólido es una lámina de vidrio cuya superficie se reviste de una capa de oro, de una capa que ha sufrido un tratamiento por carboximetilación, de una capa de dextrano, de colágeno, de avidina, de estreptavidina, etc.

De esta manera, los aptámeros, o los compuestos que comprenden dichos aptámeros, se pueden inmovilizar sobre el soporte sólido por medio de un revestimiento de enganche, como por ejemplo el descrito anteriormente, o bien por reacción química con creación de enlaces covalentes, o bien por asociación mediante enlaces no covalentes tales como enlaces hidrógeno, fuerzas electroestáticas, fuerzas de Van der Waals, etc.

Los ejemplos describen unos modos de realización de un soporte de afinidad en los que se inmovilizan los aptámeros desoxirribonucleicos por medio de compuestos en la estructura de los cuales se incluyen, mediante enlaces no covalentes, al material de soporte sólido.

En los ejemplos, se describen en particular unos soportes de afinidad que comprenden un material de soporte sólido en la superficie del cual se injertan unas moléculas de estreptavidina, incluyéndose los aptámeros desoxirribonucleicos en la estructura de compuestos que comprenden aptámeros acoplados, en uno de sus extremos, con una molécula de biotina, e inmovilizándose dichos aptámeros sobre dicho material del soporte sólido por inmovilización no covalente entre las moléculas de estreptavidina del material de soporte y las moléculas de biotina de los compuestos que comprenden dichos aptámeros desoxirribonucleicos.

En los ejemplos, se describe un modo de realización de un soporte de afinidad que comprende un material de soporte sobre el cual se injertan las moléculas de estreptavidina. Tales materiales de soporte sólido están fácilmente disponibles en el comercio.

Por “ácidos desoxirribonucleicos que se unen específicamente a una proteína plasmática” o “aptámeros” o “aptámeros nucleicos” se entienden unas moléculas de ADN (ácido desoxirribonucleico) que poseen la capacidad de unirse a una proteína plasmática de interés dada, superior a la capacidad para unirse a cualquier otra proteína. En algunos modos de realización, los aptámeros nucleicos constitutivos del soporte de afinidad tienen la capacidad de unirse a una proteína plasmática humana dada, superior a la capacidad para unirse a cualquier otra proteína humana.

En algunos modos de realización, los aptámeros nucleicos tienen en particular la capacidad de unirse a una proteína plasmática humana dada, superior a la capacidad de unirse a cualquier otra proteína plasmática homóloga codificada por el genoma de un mamífero no humano. De manera ilustrativa, un aptámero nucleico específico del factor VII humano, utilizable en un soporte de afinidad, posee una capacidad de unirse al factor VII humano superior a la capacidad de unirse al factor VII que proviene de un mamífero no humano, incluyendo el factor VII de conejo.

En el sentido de la presente descripción, un primer aptámero desoxirribonucleico nucleico posee una capacidad de unirse al factor VII/FIIa humano, superior a la de un segundo aptámero desoxirribonucleico de masa equivalente, cuando, utilizando una cualquiera de las técnicas de detección de enlace anteriores y en las mismas condiciones de ensayo, se obtiene un valor de señal de enlace superior estadísticamente significativo con el primer aptámero desoxirribonucleico, con respecto al obtenido con los segundos aptámeros desoxirribonucleicos. De manera ilustrativa, cuando la técnica de detección de unión utilizada es la técnica Biacore®, un primer aptámero desoxirribonucleico posee una capacidad de unirse al factor VII/VIIa humano, superior a la de un segundo aptámero desoxirribonucleico de masa equivalente, cuando el valor de la señal de resonancia para el primer aptámero desoxirribonucleico, sea cual sea la unidad de medición de resonancia expresada, es estadísticamente superior al valor de señal de resonancia medida para el segundo aptámero desoxirribonucleico. Dos valores de medición “estadísticamente” distintos abarcan dos valores que tienen entre sí una diferencia superior al error de medición de la técnica de detección de enlace utilizada.

Preferiblemente, un aptámero desoxirribonucleico del soporte de afinidad posee una fuerte afinidad para la proteína plasmática diana. Preferiblemente, dicho aptámero desoxirribonucleico posee un valor de Kd, frente a dicha proteína plasmática diana, inferior a 500 nM. El valor de Kd se puede medir según la técnica Biacore®.

A título ilustrativo, se ha mostrado que el aptámero nucleico que comprende la secuencia SEQ ID n° 86 tiene una capacidad de unirse al factor VII/VIIa humano, que es significativamente superior a su capacidad de unión a cualquier factor VII/VIIa que proviene de un mamífero no humano. En particular, mientras que un aptámero que comprende el ácido nucleico de secuencia SEQ ID n° 86 posee una fuerte capacidad para unirse a cualquier tipo de factor VII/VIIa humano, incluyendo un factor VII/VIIa natural o un factor VII/VIIa recombinante, éste tiene una capacidad baja o nula para unirse a un factor VII/VIIa codificado por el genoma de un mamífero no humano, incluyendo un factor VII/VIIa de conejo.

Más precisamente, para el aptámero que comprende el ácido nucleico de secuencia SEQ ID n° 86, se ha determinado según la técnica Biacore®, que el valor de capacidad de unión al factor VII/VIIa humano, expresado como la constante de disociación Kd, es de aproximadamente 100 nM. Además, dicho aptámero nucleico posee una capacidad de unión idéntica al mismo tiempo al factor VII/VIIa humano plasmático y a un factor VII/VIIa humano recombinante, por ejemplo producido en un conejo transgénico.

Se ha mostrado también que los complejos entre un aptámero que comprende el ácido nucleico de secuencia SEQ ID n° 86 y un factor VII/VIIa humano son estequiométricos, es decir que la relación del número de moléculas de ácido nucleico de secuencia SEQ ID n° 86 con el número de moléculas de factor VII/VIIa humano complejadas es de aproximadamente 1::1, y puede ser en particular de 1 ::1.

Según la invención, como ya se ha mencionado anteriormente, el soporte de afinidad puede utilizarse en una etapa de un procedimiento de purificación de una proteína plasmática humana recombinante producida por un mamífero transgénico no humano. En tales modos de realización de un procedimiento de purificación de una proteína plasmática, el medio complejo de partida comprende la proteína recombinante humana en mezcla con numerosas proteínas producidas naturalmente por dicho mamífero transgénico, incluyendo, llegado el caso, la proteína plasmática homóloga a la proteína recombinante humana. Se comprende que, en tales modos de realización, es ventajoso que los aptámeros nucleicos constitutivos del soporte de afinidad se fijan selectivamente sobre la proteína humana de interés, y no se fija, en las mismas condiciones operativas, sobre la proteína homóloga producida naturalmente por el mamífero no humano.

Según un aspecto particular de los aptámeros nucleicos constitutivos del soporte de afinidad, la capacidad de dichos aptámeros para unirse “específicamente” a la proteína plasmática humana de interés puede también expresarse como la relación de las constantes de disociación Kd, respectivamente para la proteína humana y para la proteína homóloga de mamífero no humano.

Según otra característica de un aptámero nucleico constitutivo del soporte de afinidad, la capacidad de dicho aptámero nucleico para unirse específicamente a la proteína plasmática humana puede también expresarse mediante la condición (A) siguiente:

Kd humana / Kd no humana < 0,01 (A),

en la que:

- “Kd humana” es la constante de disociación de un aptámero nucleico denominada proteína humana, expresada en unidades molares, y

- “Kd no humana” es la constante de disociación de dicho aptámero nucleico para la proteína homologa no humana, expresada en las mismas unidades molares.

Preferiblemente, para una utilización óptima del soporte de afinidad en unos procedimientos de purificación de una proteína plasmática humana recombinante, un aptámero nucleico que se une específicamente a dicha proteína humana recombinante se puede definir también con una relación Kd humana/Kd no humana inferior a 0,005.

Los aptámeros nucleicos constitutivos del soporte de afinidad pueden prepararse según la técnica denominada SELEX. El término “aptámero” tal como se utiliza abarca una molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) monocatenaria capaz de unirse de manera específica a una proteína. Los aptámeros comprenden generalmente entre 5 y 120 nucleótidos y pueden seleccionarse in vitro según un procedimiento conocido bajo el nombre de SELEX (Systematic Evoution of Ligands by Exponential Enrichment), que se ha descrito inicialmente, en particular, en la solicitud PCT n° WO 1991/019813). El procedimiento SELEX de selección de los aptámeros consiste, en lo que se refiere a la obtención de los aptámeros ADN utilizados tales como se describen aquí, en poner en presencia una proteína con una biblioteca combinatoria de ácidos desoxirribonucleicos (en general 1015 moléculas), los ácidos desoxirribonucleicos que no se unen a la diana se eliminan, los ácidos desoxirribonucleicos que se unen a la diana se aíslan y se amplifican. El procedimiento se repite hasta que la solución esté suficientemente enriquecida con los ácidos desoxirribonucleicos que tienen una buena afinidad para la proteína de interés (Tuerk y Gold, “Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase” (1990) Science, 249(4968):505-10 y Ellington y Szostak, “In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands”, (1990) Nature 30 de agosto; 346(6287):818-22). Otros ejemplos de procedimiento SELEX se dan en los documentos EP 0786469, EP 668931, EP 1695978, EP 1493825, cuyas enseñanzas pueden ser incorporarse en la realización del procedimiento de selección de un aptámero desoxirribonucleico utilizado según el procedimiento de purificación de la invención.

Para su utilización en un medio de purificación del factor VlI/VIIa humano, un ácido desoxirribonucleico que se une específicamente a una proteína plasmática de interés se incluye preferiblemente en una estructura química, también denominada “compuesto” en la presente descripción, que comprende también un medio espaciador y, llegado el caso, un medio de inmovilización sobre un soporte sólido.

En algunos modos de realización, el aptámero desoxirribonucleico está incluido en la estructura de un compuesto de fórmula (I) siguiente:

[FIX]x-[SPAC]y-[APT] (I), en la que:

-[FIX] significa un compuesto de inmovilización sobre un soporte,

-[SPAC] significa una cadena espaciadora,

-[APT] significa un ácido desoxirribonucleico que se une específicamente a una proteína plasmática, también designado aptámero desoxirribonucleico,

- x es un número entero igual a 0 o 1, y

- y es un número entero igual a 0 o 1.

La “cadena espaciadora” designada [SPAC] en el compuesto de fórmula (I) puede ser de cualquier tipo conocido. Dicha cadena espaciadora tiene como función alejar físicamente el ácido desoxirribonucleico de la superficie del soporte sólido sobre el cual dicho compuesto puede inmovilizarse y permitir una movilidad del ácido nucleico con respecto a la superficie del soporte sólido sobre el cual puede inmovilizarse. La cadena espaciadora limita o evita que unos volúmenes estéricos, debidos a una proximidad demasiado grande del soporte y del ácido nucleico, interfieran en los eventos de unión entre dicho ácido nucleico y unas moléculas de proteína plasmáticas susceptibles de ponerse en contacto con este.

En el compuesto de fórmula (I), la cadena espaciadora está unida preferiblemente en el extremo 5’ o en el extremo 3’ del ácido desoxirribonucleico aptámero.

Ventajosamente, la cadena espaciadora está unida al mismo tiempo a un extremo del aptámero y al soporte sólido. Esta construcción con espaciador tiene como ventaja no inmovilizar directamente el aptámero sobre el soporte sólido. Preferentemente, la cadena espaciadora es un oligonucleótido no específico o un polietilenglicol (PEG). Cuando la cadena espaciadora consiste en un oligonucleótido no específico, dicho oligonucleótido comprende ventajosamente al menos 5 nucleótidos de longitud, preferiblemente entre 5 y 15 nucleótidos de longitud.

Según algunos aspectos de un compuesto de fórmula (I) en los que la cadena espaciadora consiste en un polietilenglicol, dicha cadena espaciadora abarca un polietilenglicol de tipo PEG (C18), comercializado por la compañía Sigma Aldrich.

Para inmovilizar el aptámero sobre la cadena espadadora, el ácido desoxirribonucleico puede modificarse químicamente con diferentes grupos químicos tales como unos grupos que permiten inmovilizar dicho ácido nucleico de manera covalente, tales como tioles, aminas o cualquier otro grupo capaz de reaccionar con unos grupos químicos presentes sobre el soporte sólido.

En el compuesto de fórmula (I), el compuesto [FIX] consiste en un compuesto seleccionado entre (i) un compuesto capaz de formar uno o varios enlaces covalentes con el material de soporte sólido y (ii) un compuesto capaz de unirse específicamente sobre el soporte sólido por medio de enlaces débiles no covalentes, incluyendo enlaces hidrógeno, fuerzas electrostáticas o fuerzas de Van der Waals.

El primer tipo de compuesto [FIX] abarca los agentes de acoplamiento bifuncionales, como el glutaraldehído, el SIAB o también el SMCC.

El compuesto SIAB, descrito por Hermanson G.T. (1996, Bioconjugate techniques, San Diego: Academic Press, p 239-242), es el compuesto de fórmula (I) siguiente:

El compuesto SIAB comprende dos grupos reactivos, respectivamente un grupo yodoacetato y un grupo éster Sulfo-NHS, reaccionando estos grupos respectivamente sobre unos grupos amino y sulfhidrilo.

El compuesto SMCC, que está descrito por Samoszuk M.K. et al. (1989, Antibody, Immunoconjugates Radiopharm., 2(1): 37-46), es el compuesto de fórmula (II) siguiente:

El compuesto SMCC comprende dos grupos reactivos, respectivamente un grupo éster Sulfo-NHS y un grupo maleimido, que reaccionan respectivamente con un grupo amino y un grupo sulfhidrilo.

El segundo tipo de compuesto [FIX] abarca la biotina, que es capaz de unirse de manera específica no covalente a unas moléculas de avidina o de estreptavidina presentes en el soporte móvil.

Se conocen ya en el estado de la técnica unos aptámeros nucleicos capaces de unirse a diversas proteínas implicadas en la vía de la coagulación sanguínea, incluyendo unos aptámeros de unión al factor de Willebrand (solicitud PCT n° WO 2008/150495), unos aptámeros de aunión a la alfa-trombina (solicitud de patente europea n° EP 1972693) o la trombina (Zhao et al., 2008, Anal Chem, Vol. 80(19): 7586-7593), unos aptámeros de unión al Factor IX/IXa (Subash et al., 2006, Tromb Haemost, Vol. 95: 767-771; Howard et al., 2007, Atherioscl Tromb Vasc Biol, Vol. 27: 722-727; Solicitud PCT n° WO 2002/096926; Patente en los Estados Unidos n° US 7,312,325), unos aptámeros de unión al Factor X/Xa (Solicitud PCT n° WO 2002/096926; Patente en los Estados Unidos n° US 7,312,325).

Aptámeros nucleicos que se unen al factor VII/VIIa humano se han descrito también en el estado de la técnica (Rusconi et al., 2000, Tromb Haemost, Vol. 84(5): 841-848; Layzer et al., 2007, Spring, Vol. 17: 1-11).

Se precisa que ninguno de los aptámeros anteriores, que consisten principalmente, si no exclusivamente, en aptámeros ribonucleotídicos, se describe para su utilización para purificar la proteína diana sobre la cual se unen. Como ya se ha mencionado, una ventaja específica de los aptámeros desoxirribonucleicos se refiere a su facilidad de fabricación, comparada con las dificultades de síntesis de los aptámeros ARN, así como su precio de fabricación que es significativamente más reducido que el precio de fabricación de un aptámero ARN.

La presente descripción describe también un dispositivo de cromatografía de afinidad para la purificación de una proteína plasmática, que comprende un contenedor en el que está dispuesto una cantidad adaptada de un soporte de afinidad tal como se define en la presente descripción.

Se conocen en el estado de la técnica formas variadas de contenedores para soportes de cromatografía y son engloban por el significado del término “contenedor” anterior. Las características importantes de tal contenedor incluyen la presencia de un medio de alimentación del dispositivo de cromatografía de afinidad de una muestra inicial y de un medio de salida del líquido después de ponerse en contacto con el soporte de afinidad.

Se describe también un procedimiento para inmovilizar una proteína plasmática sobre un soporte, que comprende una etapa durante la cual se pone en contacto una muestra que contiene dicha proteína plasmática de interés con un soporte de afinidad tal como se ha definido anteriormente.

Por “muestra que contiene una proteína plasmática” se entiende en general cualquier tipo de solución líquida en la que dicha proteína plasmática está en suspensión o está solubilizada. Unos modos de realización específicos de tal muestra, en particular en relación con el procedimiento de purificación descrito a continuación, se definirán ulteriormente en la presente descripción.

La presente invención tiene por objeto un procedimiento para la purificación de una proteína plasmática que comprende las etapas siguientes:

a) poner en contacto una muestra que contiene una proteína plasmática con un soporte de afinidad tal como se define en la presente descripción, a fin de formar unos complejos entre (i) los aptámeros desoxirribonucleicos inmovilizados sobre dicho soporte de afinidad y (ii) dicha proteína plasmática, y

b) liberar la proteína a partir de los complejos formados en la etapa a), y

c) recuperar dicha proteína plasmática en una forma purificada.

Según la invención, la proteína plasmática es una proteína plasmática humana recombinante. La muestra que contiene la proteína plasmática de interés consiste en una muestra líquida que contiene dicha proteína de interés, incluyendo una muestra líquida que comprende dicha proteína de interés y que es susceptible de contener también unas moléculas de la proteína plasmática homóloga de un mamífero no humano. Según la invención, dicha muestra consiste en una solución biológica, tales como un fluido corporal, una célula, un triturado celular, un tejido, un triturado tisular, un órgano o un organismo entero.

En algunos modos de realización del procedimiento de purificación anterior, dicha muestra consiste en una solución biológica líquida que proviene de un animal tal como sangre, un derivado de sangre (derivado sanguíneo), leche de mamífero o un derivado de leche de mamífero. Dicha muestra puede consistir en plasma, crioprecipitado de plasma, leche aclarada o sus derivados.

Según la invención, dicha muestra proviene de un animal transgénico para la proteína de interés humano. Ventajosamente, la solución es leche de mamífero o un derivado de leche de mamífero transgénico para dicha proteína de interés humano. En el sentido de la invención, los animales transgénicos abarcan (i) los mamíferos no humanos tales como las vacas, las cabras, los conejos, los cerdos, los simios, las ratas y los ratones, (ii) los pájaros o también (iii) los insectos tales como los mosquitos, las moscas o los gusanos de seda. En algunos modos de realización preferidos, el animal transgénico para la proteína de interés humano es un mamífero transgénico no humano, de manera muy preferida una coneja transgénica para dicha proteína de interés humano. Ventajosamente, el mamífero transgénico produce dicha proteína de interés humano recombinante en sus glándulas mamarias, debido a la inserción en su genoma de un casete de expresión que comprende el ácido nucleico que codifica dicha proteína de interés que está dispuesto bajo el control de un promotor específico que permite la expresión de la proteína transgénica en la leche de dicho mamífero transgénico.

Un método de producción de dicha proteína plasmática humana en la leche de un animal transgénico puede comprender las etapas siguientes: una molécula de ADN que comprende un gen que codifica la proteína de interés, estando dicho gen bajo el control de un promotor de una proteína segregada naturalmente en la leche (tales como el promotor de la caseína, de la beta-caseína, de la lactalbúmina, de la beta-lactoglobulina o el promotor WAP) se integra en un embrión de un mamífero no humano. El embrión se coloca después en una hembra de mamífero de la misma especie. Una vez que el mamífero procedente del embrión se haya desarrollado suficientemente, se induce la lactación del mamífero, después se recoge la leche. La leche contiene entonces la proteína humana recombinante de interés.

Un ejemplo de procedimiento de preparación de proteína en la leche de una hembra de mamífero diferente del ser humano se da en el documento EP 0527063, cuya enseñanza puede tomarse para la producción de la proteína de interés según la invención. Un plásmido que contiene el promotor WAP (Whey Acidic Protein) se fabrica por introducción de una secuencia que comprende el promotor del gen WAP, realizándose este plásmido con el fin de poder recibir un gen extraño colocado bajo la dependencia del promotor WAP. El plásmido que contiene el promotor y el gen que codifica la proteína de la invención se utilizan para obtener conejas transgénicas, por microinyección en el pronúcleo macho de embriones de conejas. Los embriones se transfieren después en el oviducto de hembras hormonalmente preparadas. La presencia de los transgenes se revela mediante la técnica de Southern a partir del ADN extraído de los gazapos transgénicos obtenidos. Las concentraciones en la leche de los animales se evalúan con la ayuda de ensayos radio-inmunológicos específicos.

Otros documentos describen unos procedimientos de preparación de proteínas en la leche de una hembra de mamífero diferente del hombre. Se puede citar, sin limitarse a ellos los documentos US 7,045,676 (ratón transgénico) y EP 1739170 (producción de factor von Willebrand en un mamífero transgénico).

Se describe también que el procedimiento de purificación es también perfectamente adecuado para la obtención de una proteína plasmática purificada a partir de una muestra de plasma sanguíneo humano, o de una fracción de plasma sanguínea humana, por ejemplo la fracción crioprecipitada de plasma sanguíneo humano.

Según la invención, la proteína del plasma sanguíneo diana es humana.

En algunos modos de realización del procedimiento de purificación según la invención, la muestra comprende al menos una proteína del plasma sanguíneo no humano.

En algunos modos de realización del procedimiento de purificación según la invención, dicha proteína del plasma sanguíneo humano es homóloga a dicha proteína del plasma no humano.

En algunos modos de realización del procedimiento de purificación según la invención, dicha proteína del plasma sanguíneo humano es la homóloga a dicha proteína del plasma no humano.

Se describe que la muestra de partida puede consistir en el material bruto, es decir la muestra de plasma sanguíneo humano, o una fracción de este. En algunos modos de realización del procedimiento de purificación según la invención, la muestra de partida puede consistir en un fluido corporal de un mamífero no humano transgénico para la proteína de interés, y que contiene dicha proteína de interés a purificar. Los fluidos corporales de un mamífero no humano transgénico abarcan la leche o una fracción de la leche, por ejemplo una fracción deslipidada de leche o también una fracción empobrecida en micelas de caseína.

Sin embargo, el modo de realización anterior no es el modo de realización privilegiado del procedimiento de purificación de la invención, en particular debido al riesgo de obstruccion del soporte de afinidad por las numerosas proteínas presentes en la muestra bruta de partida.

En unos modos de realización preferidos, dicha muestra de partida consiste en una solución líquida que contiene la proteína plasmática de interés en suspensión en dicha solución, consistiendo dicha solución en un producto intermedio generado durante un procedimiento de purificación multi-etapas de una proteína plasmática.

A título ilustrativo, para un procedimiento de purificación de una proteína plasmática según la invención a partir de un fluido corporal de un mamífero no humano transgénico para dicha proteína, la muestra de partida puede consistir en un eluato de una cromatografía de intercambio de iones realizado a partir de un filtrado de leche de dicho mamífero transgénico no humano. Este modo particular de realización de un procedimiento de purificación según la invención se ilustra en los ejemplos.

Se describe que para un procedimiento de purificación de una proteína plasmática de interés a partir del plasma humano, la muestra de partida puede consistir en un filtrado de una etapa de filtración en profundidad realizada sobre la fracción crioprecipitada de una muestra de plasma humano.

De manera general, las condiciones de utilización del soporte de afinidad para realizar el procedimiento de purificación de la invención son muy similares a las condiciones de utilización convencionales de un soporte de cromatografía clásica, por ejemplo del tipo soporte de inmunoafinidad sobre el cual se inmovilizan unos anticuerpos ligandos. El experto en la materia puede referirse, por ejemplo, al trabajo de Bailon et al. (Pascal Bailon, George K. Ehrlich, Wen-Jian Fung y Wolfgang Berthold, An Overview of Affinity Chromatography, Humana Press, 2000).

Sin embargo, como se detallará a continuación en la descripción, las condiciones de la etapa c) de elución del procedimiento de la invención son muy ventajosas para la purificación de una proteína plasmática.

En la etapa a), un volumen apropiado de la muestra a purificar se pone en contacto con el soporte de afinidad. Unos complejos se forman entre (i) los aptámeros nucleicos inmovilizados sobre dicho soporte de afinidad y (ii) la proteína plasmática de interés contenida en la muestra a purificar.

Se ha mostrado en los ejemplos que las condiciones de captura del factor VII se mejoran cuando se utiliza en la etapa a) un tampón a concentración reducida en MgCl2 o incluso un tampón sin MgCl2.

Por tampón de concentración reducida en MgCl2, se entiende según la invención un tampón cuya concentración final en MgCl2 es inferior a 1 mM.

Un tampón cuya concentración en MgCl2 es inferior a 1 mM abarca los tampones cuya concentración en MgCl2 es inferior a 0,5 mM, 0,1 mM, 0,05 mM y 0,01 mM, ventajosamente igual a 0 mM.

En un modo de realización particular, el procedimiento comprende una etapa a’) que lava el soporte de afinidad con un tampón de lavado. Ventajosamente, el procedimiento comprende una etapa a’) que lava el soporte de afinidad aumentando la fuerza iónica, es decir con un tampón de lavado cuya fuerza iónica se aumenta con respecto a la fuerza iónica de la etapa a). Ventajosamente, la fuerza iónica del tampón de lavado se aumenta de 2 a 500 veces con respecto a la fuerza iónica de la etapa a). Ventajosamente, la fuerza iónica del tampón de lavado se aumenta de 100 a 500 veces, preferentemente de 200 a 500 veces, con respecto a la fuerza iónica de la etapa a).

Se ha mostrado en los ejemplos que la utilización en la etapa a’) de un tampón de lavado que tiene una fuerza iónica elevada, en particular una concentración elevada en NaCl, permite eliminar eficazmente las sustancias unidas de manera no específica al soporte de afinidad sin afectar simultáneamente de manera detectable a la unión del factor VII al soporte de afinidad.

En la etapa a’), se utiliza así preferiblemente un tampón de lavado que tiene una concentración final en NaCl de al menos 1 M.

Según la invención, un tampón de lavado que tiene una concentración final en NaCl de al menos 1 M abarca los tampones de lavado que tienen una concentración final en NaCl de al menos 1,5 M, 2 M, 2,5 M o al menos 3 M. Preferentemente, un tampón de lavado utilizado en la etapa a’) del procedimiento tiene una concentración final en NaCl de cómo máximo 3,5 M. Ventajosamente, un tampón de lavado utilizado en la etapa a’) del procedimiento tiene una concentración final en NaCl comprendida entre 1,5 y 3,5, preferentemente entre 2 y 3,5, preferentemente entre 2,5 y 3,5, preferentemente entre 3 y 3,5.

Se ha mostrado también en los ejemplos que la utilización en la etapa a’) de un tampón de lavado que tiene una hidrofobicidad elevada, en particular una concentración elevada en propilenglicol, permite eliminar eficazmente las sustancias relacionadas de manera no específica al soporte de afinidad sin afectar simultáneamente de manera detectable la unión del factor VII con el soporte de afinidad.

En la etapa a’), se utiliza preferentemnte un tampón de lavado que tiene un contenido final en propilenglicol de al menos un 20%.

Según la invención, un tampón de lavado que tiene un contenido final en propilenlicol de al menos un 20% abarca los tampones de lavado que tienen un contenido final en propilenglicol de al menos un 25% M, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, o al menos un 60% en volumen, con respecto al volumen total del tampón de lavado.

Preferentemente, un tampón de lavado utilizado en la etapa a’) del procedimiento tiene un contenido final en propilenglicol de cómo máximo un 50%. Ventajosamente, un tampón de lavado utilizado en la etapa a’) del procedimiento tiene un contenido final en propilenglicol comprendido entre el 20% y el 50%, preferentemente entre el 30% y el 50%.

Según un modo de realización particular, el tampón de lavado utilizado en la etapa a’) contiene al mismo tiempo NaCl y propilenglicol como se ha descrito anteriormente.

La etapa b) consiste en una etapa de elución de las moléculas de la proteína plasmática de interés que ha formado unos complejos con los aptámeros nucleicos durante la etapa a).

Como se ilustra en los ejemplos, una ventaja específica del procedimiento de purificación anterior es la posibilidad de realizar la etapa de elución poniendo en contacto los complejos formados entre (i) los aptámeros nucleicos inmovilizados sobre dicho soporte de afinidad y (ii) dicha proteína plasmática con un agente quelante de iones divalentes, como EDTA.

Esta ventaja técnica, que se hace posible gracias a las características del soporte de afinidad de la invención, permite la elución de la proteína plasmática sin necesitar recurrir a la utilización de condiciones drásticas de elución, susceptibles de desnaturalizar, al menos parcialmente, la proteína plasmática de interés. Dichas condiciones drásticas que se evitan abarcan el uso de un pH ácido para la etapa de elución, que se practica correctamente por los procedimientos de purificación de proteínas sobre los soportes de afinidad conocidos, y muy particularmente sobre los soportes de afinidad que comprenden unos anticuerpos inmovilizados.

Así, en algunos modos de realización del procedimiento de purificación anterior, la etapa b) se realiza poniendo en contacto el soporte de afinidad con un tampón de elución que contiene un agente quelante de los iones divalentes, preferentemente EDTA.

A título ilustrativo, el tampón de elución puede contener una concentración final de EDTA de al menos 1 mM y de cómo máximo 30 mM.

La expresión “al menos 1 mM” abarca al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mM.

La expresión “como máximo 30 mM” abarca como máximo 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 o 11 mM.

En la etapa c), se recupera la proteína plasmática de interés y se purifica recogiendo el líquido de eluato obtenido al final de la etapa b).

Al final de la etapa c), se obtiene una composición líquida purificada de la proteína plasmática de interés. Dicha composición líquida purificada puede tratarse después de manera apropiada, según cualquier técnica conocida de envasado y de conservación de las proteínas, incluyendo por fabricación de frasco directa o después de la dilución con una solución adaptada, o también por liofilización, preferiblemente en condiciones estériles y no pirógenas, y después conservación en condiciones apropiadas, a temperatura ambiente, a -42C o bien a baja temperatura, según el tipo de envasado elegido.

Como ya se ha mencionado anteriormente en la presente descripción, el soporte de afinidad de la invención puede, con los ciclos sucesivos de utilización para la purificación de una proteína plasmática de interés, sufrir una reducción de su capacidad de absorción, por ejemplo debido a que la etapa c) de elución no permite sistemáticamente liberar la totalidad de las moléculas de proteína plasmática, lo que reducir el número de sitios aptámeros libres para los ciclos ulteriores de purificación.

Como para la totalidad de los soportes de cromatografía conocidos, es por lo tanto necesario, en momentos apropiados, realizar una etapa de regeneración del soporte de afinidad, a fin de liberar la totalidad de las moléculas de proteína plasmática de dicho soporte, y eliminar cualquier sustancia que pueden unirse al material sólido del soporte de afinidad, en general por unión no específica.

Así, en algunos modos de realización, el procedimiento de purificación de la invención comprende una etapa adicional d) de regeneración del soporte de afinidad, poniendo en contacto dicho soporte de afinidad con una solución de regeneración.

Unos tampones variados para la regeneración de soporte de cromatografía, en particular de soportes de cromatografía de afinidad son bien conocidos por el experto en la materia, que pueden utilizarse en la etapa d) del procedimiento. El experto en la materia puede referirse por ejemplo al trabajo de Mohr et al. (Affinity Chromatography: Practical and Theoretical Aspects, Peter Mohr, Klaus Pommerening, Edición: illustrated, CRC Press, 1985).

A título ilustrativo, la etapa d) de regeneración del soporte de afinidad se puede realizar poniendo en contacto dicho soporte con una solución tampón de Tris 50 mM, etilenglicol 50% como se ilustra en los ejemplos.

Como se ilustra en los ejemplos, el procedimiento de purificación anterior permite obtener una proteína plasmática de un grado de pureza muy alto, eventualmente de un grado de pureza superior al 99,95% en peso, con respecto al peso total de las proteínas contenidas en el producto final purificado.

Otra ventaja del procedimiento de purificación anterior, en particular en los modos de realización en los que la muestra de partida consiste en una muestra que comprende la proteína plasmática humana de interés en forma recombinante en mezcla con unas proteínas producidas naturalmente por el mamífero transgénico no humano, es que la composición final que comprende la proteína humana recombinante de interés de alto grado de pureza está sustancialmente libre de proteínas que provienen de dicho mamífero transgénico, y en particular sustancialmente libre de proteínas de dicho mamífero, homólogas de dicha proteína humana recombinante.

A título ilustrativo, se ha mostrado en los ejemplos que el factor VII humano recombinante producido en la leche de una coneja transgénica, y después purificado con el procedimiento de purificación definido en la presente descripción, comprende menos del 1,5% en peso de las proteínas de dicho mamífero transgénico, con respecto al peso de dichas proteínas contenidas inicialmente en la muestra de partida. En la misma ejecución del procedimiento de purificación según la invención, un 85% en peso del factor VII humano recombinante presente en la muestra de partida estaba contenido en el producto final de alto grado de pureza en factor VII humano recombinante, superior al 99,95% del peso de las proteínas presentes.

Se describe una composición purificada de una proteína plasmática humana recombinante que comprende al menos el 99,9% en peso de dicha proteína humana recombinante y que está sustancialmente libre de proteínas no humanas.

Se describe también una composición purificada de una proteína plasmática humana recombinante que comprende al menos el 99,9% en peso de dicha proteína humana recombinante y como máximo el 0,01% en peso de proteínas no humanas, expresándose los porcentajes en peso con respecto al peso total en proteínas de dicha composición purificada.

En la composición purificada anterior, “al menos el 99,9%" abarca al menos el 99,91%, el 99,92%, el 99,93%, el 99,94%, el 99,95%, el 99,96%, el 99,97%, el 99,98% y el 99,99%

En la composición purificada anterior, “como máximo el 0,01%" abarca como máximo el 0,09%, el 0,08%, el 0,07%, el 0,06%, el 0,05%, el 0,04%, el 0,03%, el 0,02% y el 0,01%.

Se describe también una composición purificada tal como se ha definido anteriormente, utilizable como medicamento.

Se describe también una composición farmacéutica que comprende una composición purificada de una proteína plasmática humana recombinante tal como se ha definido anteriormente, en combinación con uno o varios excipientes farmacéuticamente aceptables.

La presente descripción describe también una composición purificada tal como se ha definido anteriormente para el tratamiento de los trastornos de la coagulación.

Se describe también la utilización de una composición purificada tal como se ha definido anteriormente para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de los trastornos de la coagulación.

Se describen a continuación unos modos de realización específicos de aptámeros que se unen específicamente a una proteína de la coagulación, que pueden utilizarse ventajosamente en el procedimiento de purificación según la invención.

Modos de realización específicos de aptámeros utilizables en el procedimiento de purificación según la invención. La solicitante ha construido una familia de aptámeros nucleicos que se unen específicamente a las proteínas del plasma sanguíneo y en particular al factor VlI/VIIa humano del cual ha podido mostrar la existencia de relaciones entre (i) las características estructurales comunes y (ii) la o las características funcionales comunes.

Desde un punto de vista estructural, la familia de ácidos nucleicos, o aptámeros nucleicos, se une específicamente al factor VlI/VIIa humano y utilizables según la invención comprende al menos 15 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido que tiene al menos un 40% de identidad en nucleótidos con el ácido nucleico de fórmula (I) siguiente:

5'-[SEQ ID N°1]x-[SEQ ID N° X]-[SEQ ID N°2]y-3' (I),

en la que:

- “SEQ ID n° X" consiste en un ácido nucleico seleccionado del grupo constituido de los ácidos nucleicos de secuencias SEQ ID n° 3 a SEQ ID n° 85 y SEQ ID n° 87 a SEQ ID n° 100,

- “x" es un número entero igual a 0 o 1, y

- “y" es un número entero igual a 0 o 1.

Según algunos aspectos, el ácido de secuencia SEQ ID n° X tiene una longitud de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 nucleótidos. Según otros aspectos, el ácido nucleico de secuencia SEQ ID n° X tiene una longitud de 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49 nucleótidos de longitud.

Según algunos otros aspectos preferidos, el ácido nucleico de secuencia SEQ ID n° X tiene una longitud de 43, 44 o 45 nucleótidos de longitud.

Como ya se ha mencionado anteriormente, el ácido nucleico de fórmula (I) tiene al menos 15 nucleótidos de longitud.

En algunos aspectos, el ácido nucleico de fórmula (I) tiene al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 o 81 nucleótidos de longitud, lo que abarcan los ácidos nucleicos que poseen exactamente cada uno unas longitudes especificadas.

En algunos aspectos del procedimiento de obtención de los aptámeros de fórmula (I), los ciclos sucesivos de selección realizados para construir la familia de ácidos nucleicos de interés que se unen específicamente a las proteínas del plasma sanguíneo han llevado a aislar y caracterizar, en cada etapa sucesiva de selección, unos conjuntos y sub-conjuntos de aptámeros nucleicos que comprenden, en sus extremos 5’ y 3’, respectivamente las secuencias SEQ ID n° 1 y SEQ ID n° 2, enmarcando estructuralmente una secuencia variable SEQ ID n° X. En la familia principal de aptámeros nucleicos de la invención, el conjunto de las secuencias variables SEQ ID n° X tienen, en sí, una identidad de secuencia en nucleótidos de al menos un 40%. Esto significa que, para la secuencia SEQ ID n° X, las obligaciones de estructura, para conservar la propiedad de unión a las proteínas del plasma sanguíneo son mucho menores que las obligaciones de estructura para las secuencias localizadas respectivamente en los extremos 5’ y 3’ de estos aptámeros nucleicos.

Cuando el número entero “x” es igual a 0 y el número entero “y” es igual a 1, los aptámeros nucleicos de fórmula (I) abarcan los ácidos nucleicos que comprenden al menos 15 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido que tiene al menos un 40% de identidad en nucleótidos con el ácido nucleico de fórmula (I-1) siguiente

5' -[SEQ ID n2 X]-[SEQ ID n22] -3' (I-1),

Cuando el número entero “x” es igual a 1 y el número entero “y” es igual a 0, los aptámeros nucleicos de fórmula (I), abarcan los ácidos nucleicos que comprenden al menos 15 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido que tiene al menos un 40% de identidad en nucleótidos con el ácido nucleico de fórmula (I-2) siguiente

5'-[SEQ ID n21] -[SEQ ID n2 X]-3' (I-2)

Cuando el número entero “x” es igual a 0 y el número entero “y” es igual a 0, los aptámeros nucleicos de fórmula (I), abarcan los ácidos nucleicos que comprenden al menos 15 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido que tiene al menos un 40% de identidad en nucleótidos con el ácido nucleico de fórmula (I-3) siguiente:

5'-[SEQ ID n2 X]-3' (I-3)

Los aptámeros nucleicos anteriores abarcan por lo tanto los ácidos nucleicos que comprenden al menos 15 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido que tiene al menos un 40% de identidad en nucleótidos con un ácido nucleico seleccionado del grupo constituido de los ácidos nucleicos de secuencias SEQ ID n° 3 a SEQ ID n° 85 y SEQ ID n287 a SEQ ID n2100.

De manera general, un premier polinucleótido que tiene al menos un 40% de identidad en nucleótidos con un segundo polinucleótido o ácido nucleico posee al menos el 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 100% de identidad en nucleótidos con dicho segundo polinucleótido o ácido nucleico.

Según algunos aspectos de un ácido nucleico que comprende la secuencia SEQ ID n° X, dicha secuencia SEQ ID n° X se selecciona del grupo constituido de los ácidos nucleicos que tiene al menos 15 nucleótidos consecutivos de una secuencia que posee al menos el 40% de identidad en nucleótidos con al menos una de las secuencias SEQ ID n° 3 a SEQ ID n285 y SEQ ID n287 a SEQ ID n2100.

Según algunos aspectos de un ácido nucleico que comprende la secuencia SEQ ID n° X, dicha secuencia SEQ ID n° X se selecciona del grupo constituido de los ácidos nucleicos que poseen al menos el 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 100% de identidad en nucleótidos con al menos una de las secuencias SEQ ID n° 3 a SEQ ID n° 85 y SEQ ID n° 87 a SEQ ID n° 100.

Resulta de lo anterior que la presente descripción describe una familia de ácidos nucleicos monocatenarios que tienen al menos 15 nucleótidos consecutivos de la cadena de fórmula (I) definida anteriormente.

El “porcentaje de identidad” entre dos secuencias de ácidos nucleicos, en el sentido de la presente invención, se determina comparando las dos secuencias alineadas de manera óptima, a través de una ventana de comparación. La parte de la secuencia nucleotídica en la ventana de comparación puede así comprender unas adiciones o unas deleciones (por ejemplo “gaps”) con respecto a la secuencia de referencia (que no comprende estas adiciones o estas deleciones) a fin de obtener una alineación óptima entre las dos secuencias.

El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones a las que se observa una base nucleica idéntica para las dos secuencias comparadas, y después dividiendo el número de posiciones a las que se ha identificado entre las dos bases nucleicas por el número total de posiciones en la ventana de comparación, después multiplicando el resultado por cien a fin de obtener el porcentaje de identidad en nucleótidos de las dos secuencias entre sí.

La alineación óptima de las secuencias para la comparación se puede realizar de manera informática con la ayuda de algoritmos conocidos.

De manera muy preferida, el porcentaje de identidad de secuencia se determina con la ayuda del programa CLUSTAL W (versión 1.82) siendo los parámetros fijados de la siguiente manera: (1) CPU MODE = ClustaIW mp; (2) ALIGNMENT = “full”; (3) OUTPUT FORMAT = “aln w/numbers”; (4) OUTPUT ORDER = “aligned”; (5) COLOR ALIGNMENT = “no”; (6) KTUP (word size) = “default”; (7) WINDOW LENGTH = “default” ; (8) SCORE TYPE = “percent”; (9) TOPDIAG = “default”; (10) PAIRGAP = “default”; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = “none”; (12) MATRIX = “default”; (13) GAP OPEN = “default”; (14) END GAPS = “default”; (15) GAP EXTENSION = “default”; (16) GAP DISTANCES = “default”; (17) TREE TYPE = “cladogram” y (18) TREE GRAP DISTANCES = “hide”.

La presente invención se ilustra además mediante los ejemplos siguientes.

Ejemplos

Ejemplo 1: preparación de un soporte de afinidad

El soporte de afinidad se ha realizado a partir de un material de soporte sólido que consiste en una matriz sobre la cual se ha injertado estreptavidina (estreptavidina-agarosa - Novagen®).

Se ha introducido un volumen de 1 ml de gel en un contenedor que consiste en una columna (11 mm). Se ha lavado el gel con agua purificada, para eliminar el disolvente de almacenamiento.

Las características del gel son:

- capacidad de adsorción de biotina: > 85 nanomoles / ml de gel

- Ensayo funcional: Captura > 99% de trombina biotinilada e 30 minutos a TA

- Otros ensayos: Protease-free, endo/exonucleasa-free, RNasa-free.

- Conservante: 100 mM de fosfato sódico pH 7,5 NaN30,02

La salida de la columna envasada (“packée”) (altura de lecho de gel = 1 cm) se conecta a un detector de absorbancia equipado de un filtro UV a 254 nm y de una grabadora.

Los aptámeros nucleicos anti-FVII humano biotinilados de secuencia SEQ ID n° 86 se solubilizan en agua purificada a la concentración final de 0,5 mg/0,187 ml, es decir una concentración molar final de 0,1 mM. La solución de aptámeros nucleicos se ha activado a 95°C según el ciclo estándar, para la inmovilización de los aptámeros sobre el material de soporte sólido.

La solución de aptámeros nucleicos se ha diluido previamente mediante 4,8 ml de agua purificada, y después 1,5 ml de tampón Me++ (5 x concentrado).

El detector de absorbancia se ajusta a 1 AUFS (Absorbance Unit Full Scale) y se registra la DO a 254 nm de esta solución a 0,575 UA254.

La solución de aptámeros nucleicos biotinilados se inyecta sobre el gel estreptavidina-agarosa pre-envasada (“prepackée”) y se pone en recirculación con una bomba peristáltica a un caudal de 2,5 ml/minuto, es decir un tiempo de contacto sobre el gel de 24 segundos (entrada/salida E/S). En estas condiciones, la DO a 254 nm se estabiliza rápidamente a 0,05 UA254, es decir un valor del 91% de acoplamiento teórico, es decir 0,455 mg de aptámeros nucleicos por milímetro de gel.

Se realiza un lavado con un tampón 10 mM CaCl2 4 mM MgCl2 y después en NaCl 2M, a fin de eliminar los aptámeros nucleicos que no están fijados específicamente a las moléculas de estreptavidina injertadas sobre el material del soporte sólido.

Ejemplo 2: Procedimiento de purificación del factor VII recombinante humano

Los soportes de afinidad aptámeros se ensayaron a partir de una preparación purificada en FVII/FVIIa preparada según la técnica descrita en la solicitud PCT n° WO2008/099077.

Preparación de la muestra a purificar

La materia biológica de partida es la leche de coneja transgénica que contiene GVII humano recombinante. El casete de expresión comprende el transgeno FVII humano colcoado bajo el control del promotor del gen de pcaseína.

Brevemente, se han recogido 140 mililitros de leche sobre 2 conejas en primera lactación entre el día 4 y el día 12 después del parto.

El título medio en FVII amidolítico (FVII biológicamente activable) en la leche recogida es de 928 Ul/ml. Las leches se conservan a una temperatura de -80°C.

Para el ensayo, las leches de coneja se descongelan al baño maría a temperatura de 37°C, y después se diluyen por una solución de citrato de sodio para una concentración final en proteínas de 62 g/l a un pH de 7,5.

El tratamiento por el citrato de sodio permite la desestabilización de las micelas fosfocálcicas de caseínas.

La solución proteica rica en lípidos de leche se clarifica después en una secuencia de filtros, respectivamente (i) filtro profundo de 15 a 0,5 pm de umbral de porosidad, después (i) filtro membrana a 0,2 pm.

Un volumen de 360 ml de solución filtrada que tiene un título en FVII de 198 Ul/ml, es decir 36 mg de FVII transgénico, se prepurifica sobre un gel de cromatografía MEP-HyperCel® (Pall BioSepra) de un volumen de 16 ml. Este gel de captura permite eliminar el 95% de las proteínas de la leche, incluyendo la mayor parte de las caseínas, conservando al mismo tiempo el 60% de la cantidad de FVII inicial.

Una cantidad de 17,5 mg de FV de baja pureza (~5%) obtenido al final de la etapa siguiente se purifica por cromatografía de intercambios de iones, utilizando un gel de Q-sepharose® XL (GE Healthcare) de un volumen de 20 ml. El FVII humano se eluye con un volumen de 78 ml de tampón que comprende 5 mM de cloruro de calcio. La concentración en FVII amidolítica es de 337 Ul/ml, es decir 0,17 mg de FVII/ml y la concentración en proteínas totales se estima a 0,18 mg/ml por medición de DO a 280 nm y £1% = 13, es decir una pureza en FVII del 94%. Las proteínas residuales que provienen de la coneja son difícilmente separables de FVII en esta etapa, o bien por que existen homologías de estructuras tales como proteínas de GLA-dominios o de dominio EGF, o bien unas homologías fisicoquímicas (carga iónica y/o tamaño molecular próximo). Las técnicas clásicas permiten una mejora de la pureza hasta un 99,95% mediante técnicas ortogonales (combinación de separación sobre gel de hidroxiapatita y por cromatografía de exclusión de tamaño). Sin embargo, para la inyección repetida al hombre, la carga en proteínas exógenas admitidas para las proteínas de recombinación genética no debe superar 50 ppm, es decir una pureza > 99,995%. Tal pureza parece alcanzable solamente después de una purificación sobre matriz de afinidad. Etapa de purificación de FVII recombinante humano sobre el soporte de afinidad de la invención

Un volumen de 6 ml de la solución de FVII humano purificado (1,1 mg de FVII) obtenida al final de la etapa anterior se utiliza para la etapa de purificación a alto nivel de pureza del FVII humano recombinante con el soporte de afinidad de la invención.

La solución de FVII obtenida en la etapa anterior, previamente ajustada a 4 mM MgCl2 y 10 mM CaCl2 y pH 7,5, se inyecta sobre el gel aptámero-agarosa (soporte de afinidad) con una bomba peristáltica a un caudal de 0,1 ml/minuto, es decir un tiempo de contacto con el soporte de afinidad de 10 minutos (E/S).

Después de la inyección, el gel se lava en tampón tris 50 mM NaCl 50mM 4 mM MgCl2 10 mM CaCl2 a pH 7,5. Se recoge un volumen de 10 ml de solución no adsorbida.

El FVII se eluye mediante un tampón tris 50 mM EDTA 10 mM a pH 7,5. La recogida del pico de elución se realiza según el perfil de DO.

Según los cálculos molares, la cantidad de aptámeros nucleicos inmovilizados en el soporte de afinidad es de 17 nanomoles, lo que corresponde, para una interacción mol a mol con las moléculas de FVII, a una capacidad absoluta del soporte de afinidad de 0,9 mg de FVII.

La figura 1 ilustra un perfil de cromatografía de FVII humano recombinante producido en la leche de coneja, con un seguimiento en continuo de los valores de absorbancia (D.O.) a 254 nanómetros.

En la figura 1, la inflexión (2) de la curva de absorción, después del momento de la inyección (1) ilustra el principio de la saturación del soporte de afinidad con FVII humano recombinante. En el tiempo (3) la inyección de FVII humano recombinante se detiene. Para ilustrar la escala lineal de los tiempos en la figura 1, se indica que la duración entre el tiempo de principio de inyección (1) y el tiempo de final de inyección (2) es de 10 minutos. El soporte de afinidad sigue saturándose con la proteína de la coagulación de interés: se han formado unos complejos entre (i) los aptámeros nucleicos anti-FVII del soporte de afinidad y (ii) las moléculas de FVII humano recombinante inicialmente contenidas en la composición a purificar. Después del paso de la composición a purificar, se procede a una etapa de lavado (6) de la columna con el tampón de lavado especificado anteriormente. Después se realiza la etapa de elución, por inyección en el tiempo (4) de la solución tampón que comprende una concentración final de 10 mM en EDTA. El pico de absorción ilustra la liberación del FVII humano recombinante a partir de los complejos aptámeros nucleicos/FVII recombinante. Cabe señalar que las moléculas de FVII humano recombinante se liberan rápidamente y por lo tanto en un volumen bajo. En consecuencia, gracias al soporte de afinidad, se obtiene una solución de elución de fuerte concentración en proteína FVII humana recombinante. En el tiempo (5), se ha realizado una etapa de regeneración del soporte de afinidad, con un tampón Tris a 50 mM. El pico de absorbancia visible en (7) corresponde a las sustancias liberadas del soporte de afinidad debido a la etapa de regeneración.

Capacidad dinámica de absorción del soporte de afinidad

La tabla 1 siguiente presenta los resultados del ensayo, que muestran una capacidad dinámica de adsorción de 0,45 a 0,49 mg/ml de las matrices de afinidad, es decir del 50 al 55% de ligandos biodisponibles.

En EDTA, se calcula un rendimiento dinámico de elución de aproximadamente el 75%.

Tabla 1: ensayo FVII recombinante humano y proteínas totales de los ensayos de matrices aptámeros-agarosa:

Principio: muestra de principio

Final: composición de las fracciones

BDC: capacidad dinámida de absorción (por “Dynamic Binding Capacity”)

DE: Rendimiento dinámico de elución (por “Dynamic Elution”); que presenta la relación entre el FVII recombinante eluido y el FVII recombinante adsorbido, expresado en porcentaje.

Capacidad de separación específica del soporte de afinidad

Los soportes de afinidad se evaluaron en especificidad por un análisis ELISA específico de las proteínas de leche de conejas.

Los resultados se representan en la tabla 2 siguiente.

Tabla : ensayo de la especificidad de los soportes de afinidad

Los resultados de la tabla 2 anterior muestran que se obtiene una media de 2 log10 de eliminación de los aptámerosagarosa llevando la pureza de FVII humano transgénico del 98,3% al 99,95%. Esto muestra una buena especificidad de los aptámeros frente a FVII humano y muy pocas interacciones con las proteínas residuales de leche de conejas.

Una mejora es posible mediante lavados intermedios antes de la elución por unas soluciones tales como NaCI 2M y/o propilenglicol o etilenglicol al 50% si en estas condiciones el FVII no se eluye.

Los resultados del ejemplo 2 ilustran las excelentes características de los soportes de afinidad sobre gel aptámeroagarosa (Apta-2) con una capacidad dinámica de adsorción de al menos 1 mg de FVII por mg de ligando con un rendimiento de elución de al menos un 75%. La especificidad está también bien establecida con una clara mejora de la pureza (~99,95%), una eliminación de 2 log10 de RMP “rabbit milk proteins” residuales. El porcentaje final se establece a aproximadamente 500 ppm sobre estos 2 ensayos no optimizados.

Ejemplo 3: procedimiento de purificación del factor IX humano plasmático

A. Material y métodos

A.1. Soporte de cromatografía de afinidad

Material Gel de afinidad Mapt-1, sin espaciador, densidad de ligando teórica 0,46 mg/ml: volumen 1 ml,

Se fija directamente el aptámero sobre el material de soporte de cromatografía, mediante una reacción de acoplamiento químico.

El aptámero utilizado es el aptámero de secuencia SEQ ID n° 101.

A.2. Producto de partida

El producto de partida consiste en una composición enriquecida en factor IX procedente de plasma humano, que está comercializada por LFB bajo la denominación Betafact®.

Materia prima inyectada: Betafact MPVP (FIX plasmático al 60% de pureza), Carga de 200 UI (es decir 800 mg) de factor IX por ml de gel, tiempo de contacto 10 minutos.

A.3. Protocolo de purificación

Equilibración gel Tris-HCl 0,050 M, CaCl20,010 M, pH 7,5,

Elución Tris-HCl 0,020 M, EDTA 0,010 M, pH 7,5,

Regeneración Tris-HCl 0,020 M, NaCl 1 M, propilenglicol 50%, pH 7,5

Se detectan los picos de proteínas por medición del valor de absorbancia a la longitud de onda de 280 nanómetros. A. 4. Protocolo de análisis por electroforesis sobre gel SDS PAGE

Gel NOVEX (Invitrogen) 10 pocillos, 4-12%, Bis-Tris; tampón de migración MES, migración a 200V durante 50 min. Coloración CBB (G250) o AgNO3 (kit GE).

B. Resultados

Los resultados se ilustran en las figuras 2 y 3.

La figura 2 representa la curva de los valores de la absorbancia a 280 nm en función del tiempo. En la figura 2, el pico n° 1 corresponde a la fracción del producto de partida que no se ha retenido en la columna. El pico n° 2 corresponde a la fracción de elución. El pico n° 3 corresponde a la fracción desorbida del soporte por la realización de la etapa de regeneración.

La figura 3 es una fotografía de un gel de electroforesis SDS PAGE. De la izquierda hacia la derecha del gel de la figura 3 las pistas representan los resultados de migración de los productos de partida siguientes:

- pista “MD”: la composición de partida Betafact®,

- pista “NR”: la fracción no retenida que corresponde al pico n° 1 del perfil cromatográfico de la figura 2

- pista “E1 ”: la fracción de elución que corresponde al pico n° 2 del perfil cromatográfico de la figura 2

Tabla 3

La tabla 3 recapitula los porcentajes de pureza de FIX obtenido por integración del perfil electroforético en las diferentes fracciones. El % de FIX se calcula según un modo de realización bien conocido por el experto en la materia, por integración cuantitativas de las densidades de las bandas electroforéticas del gel coloreado con CBB (datos numerados que corresponden a la figura 3). LA integración cuantitativa de las densidades de las bandas electroforéticas se puede obtener escaneando el gel con un escáner adaptado.

Los resultados representados en la figura 3 y en la tabla 3 confirman los de la figura 2. Estos resultados ilustran que el soporte de cromatografía sobre el cual se inmoviliza el aptámero permite la purificación específica del factor IX humano a partir de un medio complejo como una fracción plasmática enriquecida en factor IX.

Se puede concluir que el eluato presenta una buena pureza electroforética y está caracterizado por un mantenimiento de la funcionalidad del FIX. Este experimento muestra la capacidad del aptámero de secuencia SEQ ID n° 101 directamente acoplado al soporte cromatográfico, por lo tanto en ausencia de cadena espaciadora, a unir y purificar el FIX en un medio complejo que contiene unas impurezas plasmáticas.

Ejemplo 4: procedimiento de purificación del factor IX recombinante contenido en un extracto de leche de cerda transgénica

A. Material y métodos

A.1. Soporte de cromatografía de afinidad

Materia gel de afinidad en el que se inmoviliza el aptámero Mapt-1, por acoplamiento directo sin cadena espaciadora. Densidad de ligando teórica 0,46 mg/ml: volumen 1 ml,

Se fija directamente el aptámero sobre el material de soporte de cromatografía, mediante una reacción de acoplamiento químico.

El aptámero utilizado es el aptámero Mapt 1 de secuencia SEQ ID n° 101

A.2. Producto de partida

El producto de partida consiste en leche de cerda transgénica clarificada y prepurificada sobre MEP HyperCel: 1,8% de pureza muestra dializada contra el tampón de adsorción / equilibración de la resina a fin de eliminar el citrato de sodio. Carga de 302 UI (es decir 1200 gg) de factor IX por ml.

A.3. Protocolo de purificación

La muestra se inyecta con un caudal de 0,1ml/min durante 10min, se lava después el gel durante 5 min a 0,5 ml/min. La elución y la regeneración se realizan por inyección de 2 ml de cada uno de los tampones con un caudal de 0,5ml/min.

Se detectan los picos de proteínas por medición del valor de absorbancia a la longitud de onda de 280 nanómetros. A.4. Protocolo de análisis por electroforesis sobre gel SAS PAGE

A.5. Protocolo de medición de la actividad específica en factor IX

La medición de la cantidad de FIX (medición antigénica) se ha realizado con el kit FIX Ag Serachrom 0943 (Stago) según las recomendaciones del proveedor.

La medición de la actividad enzimática de FIX se ha realizado mediante un ensayo cromogénico con el kit Biophen FIX ref. 221802 (Hyphen BioMed) según las recomendaciones del proveedor.

La actividad específica se calcula mediante la relación siguiente:

Actividad enzimática del FIX/cantidad de FIX

B. Resultados

Los resultados se ilustran en las figuras 4 y 6.

La figura 4 representa la curva de los valores de medición de la absorbancia a 280 nm en función del tiempo. En la figura 4, el pico n° 1 corresponde a la fracción del producto de partida que no se ha retenido en la columna. El pico n° 2 corresponde a la fracción de elución. El pico n° 3 corresponde a la fracción desorbida del soporte mediante la realización de la etapa de regeneración.

Los resultados de la figura 4 muestran que el pico de elución es muy estrecho, lo que ilustra la muy alta especificidad para el factor IX humano del soporte de cromatografía sobre el cual se inmoviliza el aptámero.

La figura 5 es una fotografía de un gel de electroforesis SDS PAGE. De la izquierda hacia la derecha del gel de la figura 5 las pistas representan los resultados de migración de los productos de partida siguientes:

- pista “E5”: la composición de partida de leche de cerda transgénica que contiene el factor IX humano transgénico pre-purificado por una etapa cromatográfica MEP Hypercel,

- pista “E6”: la fracción no retenida que corresponde al pico n° 1 del perfil cromatográfico de la figura 4

- pista “E7”: la fracción de elución que corresponde al pico n° 2 del perfil cromatográfico de la figura 4

- pista “E8”: la fracción de elución recogida aguas abajo del n° 2 y aguas arriba del pico n° 3 del perfil cromatográfico de la figura 4

- pista “T FIX”: control de factor IX purificado.

Los resultados representados en la figura 5 confirman los de la figura 4. Estos resultados ilustran que el soporte de cromatografía sobre el cual se inmoviliza el aptámero permite la purificación específica del factor IX humano a partir de un medio complejo como una fracción plasmática enriquecida en factor IX.

Además, los resultados del ejemplo ilustran el grado importante de enriquecimiento en factor IX humano que se obtiene después del paso del producto de partida de composición compleja sobre el soporte de cromatografía de afinidad sobre el cual se inmoviliza el aptámero Mapt 2 de secuencia SEQ ID n° 86.

Se puede concluir que el eluato presenta una buena pureza electroforética con una ganancia de pureza importante con respecto al producto de partida (> 26 veces). La segunda banda identificada en el eluato corresponde seguramente a otra forma de FIX.

Ejemplo 5: Procedimiento de purificación del factor VII plasmático humano

A. Material y métodos

A.1. El soporte de cromatografía de afinidad

Material Gel de afinidad sobre el cual se ha inmovilizado el aptámero “Mapt-2 core” acoplado directamente a la biotina, sin cadena espaciadora entre el aptámero y la biotina. El aptámero se inmoviliza sobre un gel estreptavidina (proveedor Novagen) gracias a una biotina en 5’ terminal con una densidad de ligando teórico 0,4 mg/ml: volumen 1 ml,

El aptámer utilizado es el aptámero Mapt-2 Core de secuencia SEQ ID n° 20

A.2. El producto de partida

El producto de partida consiste en una composición de factor VII plasmático humano purificado al 98%.

A.3. El protocolo de purificación

Equilibración gel: Tris-HCl 0,050 M, CaCl20,010 M, MgCl20,05mM pH 7,5,

Elución: Tris-HCl 0,020 M, EDTA 0,010 M, pH 7,5,

Se inyectan 240 mg de factor VII plasmático humano purificado al 98% con un caudal de 0,5 ml/min en tampón de equilibrado

Después de la detección del pico de no retenido, se inyectan 2 volúmenes de columna de tampón de elución.

Se detectan los picos de proteínas por medición del valor de absorbancia a la longitud de onda de 280 nanómetros. B. Resultados

Los resultados se ilustran en las figuras 6 y 7

La figura 6 representa la curva de los valores de medición de la absorbancia a 280 nm en función del tiempo. En la figura 6, el pico n° 1 corresponde a la fracción del producto de partida que no se ha retenido sobre la columna. El pico n° 2 corresponde a la fracción de elución.

El producto de partida así como el producto eluido se ha analizado en SDS PAGE con coloración con nitrato de plata a fin de visualizar la eliminación de las impurezas. La figura 7 representa este gel: la pista n° 1 corresponde a la fracción del producto de partida y la pista n° 2 a la fracción de elución. A pesar de la pureza importante del producto de partida, se constata que la fracción eluida no contiene ya contaminantes o formas degradadas.

Los resultados de las figuras 6 y 7 muestran que el aptámero de secuencia SEQ ID n° 20 es capaz de unir el FVII humano y eluir específicamente en presencia de EDTA.

Ejemplo 6: Ausencia de unión del aptámero con FVII de conejo

A. Material y métodos

A.1. Soporte de cromatografía de afinidad

Gel de afinidad acoplado con estreptavidina sobre el cual se ha inmovilizado el aptámero de secuencia SEQ ID n° 101 por medio de una cadena espaciadora (Proveedor Novagen) por medio de una bitoina en 5’ terminal con una densidad de ligando teórico de 0,35 mg/ml: vlumen 1 ml,

El aptámero utilizado es el aptámero de secuencia SEQ ID n° 86

A.2. Producto de partida

Eluato de hidroxiapatita enriquecido en FVII de conejo obtenido por purificación a partir de plasma de conejo, tiempo de contacto de 10 minutos, caudal de 0,5 ml/min.

A.3.3 Protocolo de purificación

Equilibrado gel Tris-HCl 0,050 M, CaCl20,010 M, MgSO30,05mM pH 7,5,

Elución Tris-HCl 0,050 M, EDTA 0,010 M, pH 7,5,

Se inyectan 36 mg en el gel con tiempo de contacto de 10 minutos, la elución se realiza por inyección de 2 ml de tampón de elución

Se detectan los picos de proteínas por medición del valor de absorbancia a la longitud de onda de 280 nanómetros. A. 4. Protocolos de análisis de las fracciones en proteínas y en factor VII

Las fracciones se analizan para su actividad amidolítica en un ensayo cromogénico gracias a un kit Stago según las recomendaciones del proveedor (Kit Facteur VIIa StatClot). La actividad amidolítica se convierte después en mg de FVII contenido en dicha fracción.

B. Resultados

Los resultados se ilustran en la tabla 4 siguiente.

Tabla 4

Los resultados de la tabla 4 muestran que el factor VII de conejo no se retiene sobre el gel de afinidad sobre el cual se inmoviliza el aptámero Mapt-2.

Ejemplo 7: Modos de realización específicos de un protocolo de interacción del factor VII humano con un aptámero sobre Biacore (resistencia a NaCl)

A. Material y métodos

Se ha fabricado un soporte sólido sobre el cual se han inmovilizado unas moléculas del aptámero nucleico de secuencia SEQ ID n° 86, también designado aquí “Mapt2”. Previamente a su unión sobre el soporte sólido, el extremo 5’ del aptámero Mapt2 se ha acoplado químicamente con una cadena espaciadora constituida de 4 moléculas de PEG(C18). Después, el extremo libre de la cadena espaciadora, opuesta al extremo acoplado con el aptámero, se ha acoplado con una molécula de biotina.

Se dispone de un soporte sólido que contiene unas moléculas de estreptavidina inmovilizadas (Serie S sensor Chip SA, GE)

Después, se ha puesto en contacto el soporte sólido anterior con los compuestos aptámeros anteriores a fin de inmovilizar los ácidos nucleicos de secuencia SEQ ID n° 86, por asociación no covalente entre las moléculas de estreptavidina del soporte y las moléculas de biotina de los compuestos aptámeros.

El aptámero Mapt2 se inmoviliza así con un porcentaje de inmovilización de 3772 RU (1 RU corresponde aproximadamente a 1 pg de producto inmovilizado por mm2).

Se ha diluido el FVII humano transgénico purificado a partir de leche de coneja transgénica (FVI1HPTG, pureza: 98%) en un tampón de desarrollo (Tris 50 mM, NaCl 50 mM, CaCl210 mM, MgCl24 mM, pH 7,4) a fin de obtener una muestra de concentración 200 mM en FVII.

La muestra se ha inyectado en el chip (soporte sólido) que contiene el aptámero Mapt2 inmovilizado por una interacción bitoina-estreptavidina. Después, se han inyectado unos tampones de concentración creciente en NaCl sobre el soporte sólido (3 series de inyecciones que van de 1 M de NaCl a 3 M de NaCl). Todas las inyecciones se realizaron con un caudal de 30 ml/min durante 60 s después de la inyección. Después de las 3 series de inyecciones con los 3 tampones que contienen NaCl, se ha inyectado después un tampón de elución (EDTA, 10 mM) durante 75 s con un caudal de 30 ml/min para desenganchar el FVII HPTG del aptámero.

Estos análisis se efectúan con el aparato de RPS Biacore T100 (GE). La modelización de las interacciones registradas se efectúa con la ayuda del programa Biaevaluation (GE).

Las curvas de unión del aptámero inmovilizado Mapt2 con FVII humano transgénico se calcularon con el módulo dedicado del programa Biacore® control Software, versión 1.2.

Los resultados de unión del aptámero Mapt2 con FVII humano han permitido determinar que la unión del aptámero Mapt2 al FVII humano no se altera por la inyección de tampones que contienen NaCl.

B. Resultados

Los resultados se ilustran en la figura 8

Ejemplo 8: Modos de realización específicos de un protocolo de interacción del factor VII humano con un aptámero sobre Biacore (resistencia al propilenglicol)

A. Material y métodos

Se ha fabricado un soporte sólido sobre el cual se ha inmovilizado unas moléculas del aptámero nucleico de secuencia SEQ ID n° 86, también designado aquí “Mapt2” Previamente a su unión sobre el soporte sólido, el extremo 5’ del aptámero Mapt2 se ha acoplado químicamente con una cadena espaciadora constituida de 4 moléculas de PEG(C18). Después, el extremo libre de la cadena espaciadora, opuesta al extremo acoplado con el

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1 . P r o c e d i m i e n t o p a r a l a p u r i f i c a c i ó n d e u n a p r o t e í n a p l a s m á t i c a h u m a n a r e c o m b i n a n t e a p a r t i r d e u n m e d i o d e p a r t i d a q u e e s u n a s o l u c i ó n b i o l ó g i c a q u e p r o v i e n e d e u n a n i m a l n o h u m a n o t r a n s g é n i c o p a r a d i c h a p r o t e í n a p l a s m á t i c a h u m a n a , q u e c o m p r e n d e l a s e t a p a s s i g u i e n t e s :

a ) p o n e r e n c o n t a c t o u n a m u e s t r a q u e c o n t i e n e l a p r o t e í n a p l a s m á t i c a h u m a n a c o n u n s o p o r t e d e a f i n i d a d q u e c o m p r e n d e u n s o p o r t e s ó l i d o e n e l q u e s e i n m o v i l i z a n u n o s a p t á m e r o s d e s o x i r r i b o n u c l e i c o s q u e s e u n e n e s p e c í f i c a m e n t e a d i c h a p r o t e í n a p l a s m á t i c a h u m a n a , a f i n d e f o r m a r u n o s c o m p l e j o s e n t r e ( i ) l o s a p t á m e r o s n u c l e i c o s i n m o v i l i z a d o s s o b r e d i c h o s o p o r t e d e a f i n i d a d y ( i i ) d i c h a p r o t e í n a p l a s m á t i c a h u m a n a , y

b ) l i b e r a r l a p r o t e í n a a p a r t i r d e l o s c o m p l e j o s f o r m a d o s e n l a e t a p a a ) , y

c ) r e c u p e r a r d i c h a p r o t e í n a p l a s m á t i c a h u m a n a e n u n a f o r m a p u r i f i c a d a .

2 . P r o c e d i m i e n t o s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 1 , c a r a c t e r i z a d o p o r q u e c o m p r e n d e u n a e t a p a a ' ) e n l a q u e d i c h o s o p o r t e d e a f i n i d a d s e l a v a c o n u n t a m p ó n d e l a v a d o .

3 . P r o c e d i m i e n t o s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 2 , e n e l q u e e l t a m p ó n d e l a v a d o s e s e l e c c i o n a e n t r e :

- u n a s o l u c i ó n t a m p ó n q u e c o m p r e n d e u n a c o n c e n t r a c i ó n f i n a l e n N a C l d e a l m e n o s 1 M , y

- u n a s o l u c i ó n t a m p ó n q u e t i e n e u n c o n t e n i d o f i n a l e n p r o p i l e n o d e a l m e n o s u n 2 0 % ( v / v ) .

4 . P r o c e d i m i e n t o s e g ú n u n a c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 a 3 , c a r a c t e r i z a d o p o r q u e l a s o l u c i ó n b i o l ó g i c a c o m p r e n d e u n a p r o t e í n a d e l p l a s m a s a n g u í n e o n o h u m a n o q u e e s h o m ó l o g a a d i c h a p r o t e í n a d e l p l a s m a s a n g u í n e o h u m a n o .

5 . P r o c e d i m i e n t o s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 4 , c a r a c t e r i z a d o p o r q u e d i c h a p r o t e í n a d e l p l a s m a s a n g u í n e o h u m a n o e s l a h o m ó l o g a d e d i c h a p r o t e í n a d e l p l a s m a n o h u m a n o .

6^{. P r o c e d i m i e n t o s e g ú n u n a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 a 5 , c a r a c t e r i z a d o p o r q u e l a e t a p a b ) s e r e a l i z a p o n i e n d o e n} c o n t a c t o e l s o p o r t e d e a f i n i d a d c o n u n t a m p ó n d e e l u c i ó n q u e c o n t i e n e u n a g e n t e q u e l a n t e d e l o s i o n e s d i v a l e n t e s .

7 . P r o c e d i m i e n t o s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 6 , c a r a c t e r i z a d o p o r q u e e l a g e n t e q u e l a n t e d e l o s i o n e s d i v a l e n t e s e s e l E D T A .

8^{. P r o c e d i m i e n t o s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 7 , e n e l q u e e l t a m p ó n d e e l u c i ó n t i e n e u n a c o n c e n t r a c i ó n d e a l m e n o s 1} m M y d e c ó m o m á x i m o 3 0 m M e n E D T A .

9 . P r o c e d i m i e n t o s e g ú n u n a c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 - 8 , e n e l q u e e l m e d i o d e p a r t i d a e s u n f l u i d o c o r p o r a l d e u n m a m í f e r o n o h u m a n o t r a n s g é n i c o p a r a d i c h a p r o t e í n a d e l p l a s m a h u m a n o .

1 0 . P r o c e d i m i e n t o s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 9 , e n e l q u e d i c h o f l u i d o c o r p o r a l e s u n a l e c h e o u n a f r a c c i ó n d e l e c h e d e d i c h o m a m í f e r o n o h u m a n o t r a n s g é n i c o .

1 2 . P r o c e d i m i e n t o s e g ú n u n a c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 a 1 1 , e n e l q u e l a p r o t e í n a p l a s m á t i c a h u m a n a e s u n a p r o t e í n a d e l a c o a g u l a c i ó n c o n a c t i v i d a d e n z i m á t i c a .

1 3 . P r o c e d i m i e n t o s e g ú n u n a c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 a 1 2 , e n e l q u e e l s o p o r t e s ó l i d o d e l s o p o r t e d e a f i n i d a d e s u n a r e s i n a p a r a c o l u m n a d e c r o m a t o g r a f í a d e a f i n i d a d .

1 4 . P r o c e d i m i e n t o s e g ú n u n a c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 a 1 3 , e n e l q u e d i c h o s a p t á m e r o s d e s o x i r r i b o n u c l e i c o s s e i n c l u y e n e n l a e s t r u c t u r a d e u n c o m p u e s t o d e f ó r m u l a ( I ) s i g u i e n t e

[FIX]x-[SPAC]y-[APT] (I),

en la que:

-[FIX] significa un compuesto de inmovilización sobre un soporte,

-[SPAC] significa una cadena espadadora,

-[APT] significa un ácido desoxirribonucleico que se une específicamente a una proteína plasmática, también designado aptámero desoxirribonucleico,

- x es un número entero igual a 0 o 1, y

- y es un número entero igual a 0 o 1.

15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4-14, en el que el aptámero desoxirribonucleico se caracteriza por que:

Kd humano/Kd no-humano < 0,01 en la que

- “Kd humano” es la constante de disociación de dicho aptámero para dicha proteína plasmática humana, expresada en unidades molares, y

- “Kd no-humano” es la constante de disociación de dicho aptámero para la proteína homóloga no humana, expresada en las mismas unidades molares.

16. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la proteína plasmática humana en una forma purificada obtenida en la etapa c) se pone en formación de frasco directo, eventualmente después de la dilución con una solución adaptada o liofilización.