KR20110138527A

KR20110138527A - 다공성 폴리머 비드와 나노 에멀젼에 의해 안정화된 레티놀을 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20110138527A
Application number: KR1020100058459A
Authority: KR
Inventors: 정상호; 손지현; 장수진; 김윤정; 천종우
Original assignee: (주)에이씨티
Priority date: 2010-06-21
Filing date: 2010-06-21
Publication date: 2011-12-28
Also published as: KR101192161B1

Abstract

본 발명은 불안정한 지용성 물질인 레티놀을 안정화하여 화장료에 이용하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따르면 레티놀(Vitamin A)이 다공성 고분자 입자에 포집되어 형성된 레티놀 나노 고분자캡슐을 녹두 MCT(medium chain triglyceride)추출물과 레시틴으로 나노 에멀젼화 하는 것에 의하여 안정화된 레티놀을 함유하는 항염 및 피부주름개선용 화장료조성물이 제공된다.

Description

다공성 폴리머 비드와 나노 에멀젼에 의해 안정화된 레티놀을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing stabilized retinol in the mesoporous polymer bead and the nano emulsion}

본 발명은 불안정한 지용성 물질인 레티놀을 안정화하여 화장료에 이용하는 기술에 관한 것으로서, 구체적으로는 생리활성성분 레티놀(Vitamin A)을 메조다공성(mesoporous) 고분자 입자 내에 흡착시켜 1차로 안정화시킨 후, 이를 다시 특정 지용성 천연추출물과 레시틴을 이용하여 나노 에멀젼화함으로써 2차로 안정화시켜 저자극성 주름개선용 화장료에 이용하는 기술에 관한 것이다.

기능성화장품(cosmeceutical)이란 화장품(cosmetics)과 의약품(pharmaceutical)의 개념이 합성된 것으로서, 최근 기능성화장품의 개발에 관심이 집중되고 있다. 기능성을 갖는 활성성분의 연구, 효능성분의 경피흡수촉진과 관련된 제형의 연구 및 피부생리에 대한 기초 연구 등이 활발하게 이루어지고 있다. 이에 따라 피부노화방지, 자외선이나 유해물질 등의 외부 환경으로부터의 피부보호, 및 새로운 피부세포생성 촉진 등에 관련된 기능성 성분의 개발과 이들의 효능과 피부안전성의 측정 방법연구 등이 주된 관심분야가 되고 있다. 화장품 원료로 집중적으로 연구되고 있는 유효성분으로는 비타민 A, C, E 등의 비타민, 세라마이드(ceramide), 알파하이드록시액시드(α-hydroxy acid) 또는 베타하이드록시액시드(β-hydroxy acid), 글루칸(glucan), 효소(enzyme), 조절인자(modulator), 각종 식물추출물 등을 들 수 있다.

비타민은 과거부터 피부 주름 개선용으로 많이 사용되어 왔으며, 비타민이 피부에 미치는 영향에 관한 기초 연구가 활발히 진행되고 있으나, 낮은 안정성으로 인하여 다양한 적용에는 제한을 받고 있는 실정이다. 따라서 비타민 자체의 안정성을 향상시키고자 하는 연구가 병행되어 왔다. 특히 비타민 A인 레티놀에 대한 연구가 최근 10년 동안 활발히 진행되고 있다. 레티놀은 피부의 콜라겐 합성을 증대시키고, 각질층의 턴오버를 촉진시켜 세포의 생성을 촉진 시키는 효과를 지니고 있는 것으로 보고되고 있다. 그러나 레티놀을 과량으로 피부에 적용 하면 강한 피부자극을 유발하고 레티놀 자체가 매우 불안정하다는 단점을 지니고 있다. 그러므로 레티놀의 안정성을 향상시키며, 적은 양의 사용으로도 충분한 활성을 나타낼 수 있도록, 경피흡수를 촉진하고 지속적으로 균일한 양을 피부에 제공할 수 있는 제형화 기술이 요구되어 왔다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 현재 캡슐화, 무수 베이스, 특별용기의 개발 등에 관한 연구가 진행 중이며, 특히 고분자를 이용한 레티놀 캡슐화에 대한 연구는 국내외에서 다양하게 진행되고 있다.

그 일 예로서 대한민국 특허등록 제0463167호에는 수 내지 수백 나노미터 크기의 고분자 입자 내에 생리활성 유효성분으로서의 레티놀을 포집하고, 상기 고분자입자를 피부의 내부로 확산, 침투시켜, 상기 생리활성 유효성분을 포집한 고분자 입자가 피부구조의 중간층에 머물게 하여, 상기 고분자 입자내의 유효성분이 피부내부로 서서히 전달되도록 하는 경피흡수제가 개시되어 있다.

그러나 상기와 같이 레티놀을 고분자 입자 내에 포집시켜 직접 피부의 내부로 확산, 침투시키는 경우에 피부자극의 우려가 있으며, 제형 내에서의 충분한 안정성을 확보하지 못하는 문제점이 있었다. 본 발명자들은 레티놀을 1차적으로 다공성 고분자 비드(mesoporous polymer bead)에 흡착 시킨 후, 2차적으로 나노 에멀젼을 형성하는 안정화기술을 이용하여 레티놀 캡슐을 제조하고 이를 화장료에 이용함으로써 레티놀의 안정성이 크게 향상될 뿐 아니라, 경피흡수가 촉진되며 레티놀의 제일 큰 문제점인 피부자극이 감소되며 피부주름개선효과가 우수한 화장료를 제조할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 이중 안정화방법에 의하여 안정화된 레티놀을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 레티놀을 효과적으로 안정화시키는 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 레티놀이 메조다공성 폴리머 비드(mesoporous polymer bead)에 흡착되어 형성된 레티놀 나노 고분자캡슐을 지용성 천연추출물인 녹두 MCT(medium chain triglyceride)추출물과 레시틴을 이용하여 나노 에멀젼화하는 것에 의하여 안정화된 레티놀을 함유하는 피부주름개선용 화장료조성물이 제공된다.

상기 메조다공성 고분자 비드는 생체적합성이 우수한 메조다공성 고분자 비드(mesoporous polymer bead)이며, 바람직하게는 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트(ethylene glycol dimethacrylate)로 가교 결합된 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate)로 이루어진다. 활성성분인 레티놀은 상기 레티놀 나노 고분자캡슐의 0.5~10 중량%로 함유된다.

상기 레시틴은 하이드로제네이티드 레시틴, 하이드로제네이티드 포스파티딜콜린, 포스포리피드, 하이드로제네이티드 라이소포스파티딜콜린, 하이드로제네이티드 라이소레시틴, 하이드로옥실레이티드 레시틴 및 불포화레시틴으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 레시틴이며, 바람직하게는 하이드로제네이티드 라이소레시틴이다. 상기 나노에멀젼은 50 ~ 200nm의 크기를 가지며, 바람직하게는 70 ~ 100nm의 크기를 가진다.

상기 안정화된 레티놀은 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.0001 중량％ 내지 50 중량％ 함유된다. 상기 화장료조성물은 그 제형이 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤, 피부 점착타입의 화장료, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 샴푸, 린스, 바디크렌저, 비누, 치약, 구강청정제, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제로 적용될 수 있다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면,

(A)(a1)에탄올에 50nm 내지 500nm의 메조다공성 고분자 비드(mesoporus polymer bead)를 첨가하여 교반 후, 항산화제인 부틸히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene)을 혼합하여 용해하는 단계; (a2)레티놀(Vitamin A)을 첨가하여 완전히 용해시킨 다음 증류수를 혼합하여 교반하는 단계; (a3)감압여과 후 건조하여 레티놀이 흡착된 나노 고분자 캡슐을 제조하는 단계;

(B)(b1)글리세린(glycerin)을 가온한 후, 토코페릴아세테이트(tocopheryl acetate)와 뷰틸하이드록시아니솔(butylated hydroxy anisole), 녹두 MCT추출물을 혼합하면서 용해시키는 단계;

(b2)콜레스테롤(cholesterol)을 첨가하여 용해시킨 후, 상기 레티놀이 흡착된 나노 고분자 캡슐을 첨가하는 단계;

(b3)하이드로제네이티드라이소 레시틴(hydrogenated lysolecithin)을 혼합하여 용해시키고, 정제수를 넣어 교반하여 나노 에멀젼 조성물을 제조하는 단계; 및

(C)고압 호모게나이저(Microfluidizer)를 사용하여 50 ~ 200nm 크기의 나노 에멀젼을 형성하여 안정화하는 단계를 포함하는 레티놀의 안정화 방법이 제공된다.

상기 제조방법에 있어서 상기 나노 에멀젼 조성물은 글리세린 1 ~ 60중량%, 토코페릴아세테이트 0.5 ~ 1중량%, 뷰틸하이드록시아니솔 0.03~0.05중량%, 녹두 MCT(medium chain triglyceride)추출물 1 ~ 12중량%, 콜레스테롤 1 ~ 2중량%, 레티놀 나노 고분자캡슐 1 ~ 10중량%, 하이드로제네이티드라이소 레시틴 1 ~ 3중량% 및 정제수를 포함하여 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 안정화된 레티놀을 함유하는 화장료 조성물은 이중으로 안정화된 레티놀을 사용하여 그 안정성이 높고, 경피흡수율이 우수하며, 레티놀을 특정의 크기로 형성되는 나노 고분자캡슐에 포집하여 피부내로 침투시키므로 서방성이 우수하여 활성성분을 피부에 지속적으로 공급함으로써 피부주름을 개선한다.

도 1a 및 도 1b는 본 발명의 안정화된 레티놀의 역가 유지능을 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 안정화 레티놀의 사이토카인 발현 억제능을 나타내는 그래프이다.
도 3a 및 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 안정화 레티놀의 콜라겐생성 촉진효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 안정화 레티놀 함유 제형의 안정성을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 안정화 레티놀 함유 화장료의 안정성시험결과를 나타내는 사진도이다.

본 발명은 공기, 수분이나 열에 불안정한 활성성분인 레티놀을 효과적으로 안정화시키며, 동시에 경피흡수율을 높여 적은 양의 사용으로도 항염 및 주름개선효과를 확보하며, 활성성분의 서방성을 구현하여 피부자극을 억제하는 것을 기술적특징으로 한다.

이를 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 레티놀(Vitamin A)이 메조다공성 고분자 입자에 포집되어 형성된 레티놀 나노 고분자캡슐을 녹두 MCT(medium chain triglyceride)추출물과 레시틴으로 나노 에멀젼화하는 것에 의하여 안정화된 레티놀을 함유하는 항염 및 피부주름개선용 화장료조성물이 제공된다.

이하 레티놀의 이중 안정화방법에 관하여 상세하게 설명한다.

먼저 활성성분인 레티놀이 생체 적합성이 우수한 메조다공성 폴리머 비드(mesoporous polymer bead)에 흡착되어 1차적으로 안정화되는 레티놀 나노 고분자캡슐을 제조한다. 상기 메조다공성 폴리머 비드로는 생체 적합성이 우수한 다공성 고분자 물질이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트로 가교 결합된 폴리메틸메타크릴레이트가 사용될 수 있다.

이 경우 레티놀을 포집하는 상기 메조다공성 고분자 입자는 50nm 내지 500nm, 바람직하게는 200nm 내지 300nm, 더욱 바람직하게는 200nm의 크기를 가지는 다공성 고분자 비드를 사용할 수 있다. 레티놀을 포집한 상기 메조다공성 고분자 입자는 이후의 나노 유화과정에서 입자크기가 조정된다. 이는 레티놀의 포집단계에서 너무 작은 입자의 다공성 고분자 비드를 사용하는 경우에는 레티놀의 포집이 어렵기 때문이다. 활성성분인 레티놀은 제한적이지 않지만, 상기 레티놀 나노 고분자캡슐의 0.5~10중량%로 함유된다.

이와 같이 1차 안정화된 레티놀 나노 고분자캡슐을 글리세린, 토코페릴아세테이트, 뷰틸하이드록시아니솔, 녹두 MCT(medium chain triglyceride)추출물, 콜레스테롤, 레시틴 및 정제수를 포함하는 조성물에 첨가하여 2차 안정화를 위한 나노 에멀젼 조성물을 제조한다. 이 후 고압 호모게나이져를 이용하여 50 ~ 200nm의 크기, 바람직하게는 70 ~ 100nm의 크기를 가지는 나노 에멀젼을 형성하여 안정화된 레티놀을 제조한다.

상기 레시틴으로는 하이드로제네이티드 레시틴, 하이드로제네이티드 포스파티딜콜린, 포스포리피드, 하이드로제네이티드 라이소포스파티딜콜린, 하이드로제네이티드 라이소레시틴, 하이드로옥실레이티드 레시틴 및 불포화레시틴으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 레시틴이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 하이드로제네이티드 라이소레시틴이 사용된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 녹두 MCT추출물은 녹두를 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드(caprylic/capric triglyceride)에 혼합 후 80℃ 정도에서 3~5시간 추출하여 제조되는 것이다. 상기 녹두 추출물 자체의 항염 및 주름개선 효능은 레티놀 함유 에멀젼 내에서 그 효과의 상승이 이루어지며, 상기 녹두 MCT 추출물은 상기 나노 에멀젼의 안정화에도 기여하므로, 녹두 MCT 추출물의 첨가는 레티놀의 안정성이 향상된 항염 및 주름기능 개선용 화장료의 제조에 있어서 중요하다. 본 발명에서는 레티놀을 나노 고분자 캡슐에 흡착시켜 직접 피부에 적용하는 것이 아니라, 이를 다시 에멀젼 형성 캡슐화함으로써 피부에 적용을 하는 특징을 가진다. 이는 불안정한 활성성분인 레티놀을 더욱 안정화함으로써 오랜 기간 동안 역가가 유지되도록 할 뿐 아니라, 나노 에멀젼화 됨에 따라 피부투과율이 향상된다는 효과를 가져온다.

본 발명의 구체적인 일 구현예에 따르면 상기 레티놀이 흡착된 나노 고분자캡슐을 담지하는 에멀젼은 상기 레티놀이 담지된 나노 고분자캡슐 10 중량%를 글리세린 60 중량%, 토코페릴 1 중량%, 뷰틸하이드록시아니솔 0.05 중량 %, 녹두 MCT추출물 12 중량%, 콜레스테롤 2 중량%, 하이드로제네이티드 라이소레시틴 3중량% 및 정제수와 혼합하여 이루어지는 조성물을 통하여 제조될 수 있다.

상기 안정화된 레티놀은 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.0001 중량％ 내지 50 중량％ 함유된다. 상기 화장료조성물은 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤, 피부 점착타입의 화장료, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 샴푸, 린스, 바디크렌저, 비누, 치약, 구강청정제, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제의 제형으로 적용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 안정화된 레티놀은 하기의 방법에 의하여 제조될 수 있다.

(A)(a1)에탄올에 50nm 내지 500nm의 메조다공성 고분자 비드(mesoporous polymer bead)를 첨가하여 교반 후, 부틸히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene)를 혼합 하여 용해하는 단계; (a2)레티놀(Vitamin A)을 첨가하여 완전히 용해시킨 다음 증류수를 혼합하여 교반하는 단계; (a3)감압여과 후 건조하여 레티놀이 흡착된 나노 고분자 캡슐을 제조하는 단계;

(B)(b1)글리세린(Glycerin)을 80℃ 정도로 가온한 후, 토코페릴아세테이트(tocopheryl acetate), 뷰틸하이드록시아니솔(butylated hydroxy anisole), 녹두 MCT(medium chain triglyceride)추출물을 혼합하면서 용해시키는 단계; (b2)콜레스테롤(cholesterol)을 첨가하여 용해시킨 후, 상기 레티놀이 흡착된 나노 고분자 캡슐을 첨가하는 단계; (b3)하이드로제네이티드 라이소 레시틴(hydrogenated lecithin)을 혼합하여 70℃ 정도에서 용해시키고, 정제수를 넣어 교반하여 나노 에멀젼 조성물을 제조하는 단계; 및

(C)고압 호모게나이저(Microfluidizer)를 사용하여 50 ~ 200nm의 크기를 가지는 나노 에멀젼을 형성시키는 단계를 포함하는 방법에 의하여 안정화된 레티놀을 제조한다.

상기 (A)단계에서 50nm 내지 500nm의 메조다공성 고분자 비드(mesoporous polymer bead)를 사용하여 레티놀이 흡착된 나노 고분자 캡슐을 제조하지만, 이는 상기 (C)단계의 나노 유화과정에서 입자크기가 조정될 수 있다. 이에 따라 본 발명의 일 실시예에 따르면, 나노 에멀젼 내부에 존재하는 나노 고분자 캡슐의 크기는 40~180nm로 조정될 수 있다.

상기 나노 고분자 캡슐의 입자크기가 40nm 보다 작게 되면, 지나치게 피부 깊숙하게 침투되어 외부로의 배출이 어렵다는 문제가 있으며, 입자크기가 180nm를 초과하는 경우에는 나노 에멀젼의 입자크기가 증가하므로, 경피흡수율이 저하된다는 문제가 있다. 상기 나노 고분자 캡슐은 피부 중간층에 머물면서 유효성분을 서서히 방출하며, 피부의 턴-오버주기와 함께 서서히 피부외층으로 밀려나오게 되어 피부로부터 박리되는 각질층과 함께 제거된다.

상기 제조방법에 있어서 상기 나노 에멀젼 조성물은 글리세린 1 ~ 60중량%, 토코페릴아세테이트 0.5 ~ 1중량%, 뷰틸하이드록시아니솔 0.03~0.05중량%, 녹두 MCT추출물 1 ~ 12중량%, 콜레스테롤 1 ~ 2중량%, 레티놀 나노 고분자캡슐 1 ~ 10중량%, 하이드로제네이티드 라이소레시틴 1 ~ 3중량% 및 정제수를 포함하여 이루어지는 것이 바람직하다.

HPLC를 이용하여 안정화된 레티놀에 대한 역가 유지능을 확인한 결과, 본 발명에 의해 안정화된 레티놀은 28일 동안 상온(25℃)에서 100%이상 함량을 유지하고 고온(45℃)에서도 90%이상 유지되어 안정성이 우수함을 확인할 수 있었다. 자극완화 효과를 알아보기 위해 TNF-α 및 IL-1 α 발현 억제효과를 평가한 결과 HaCaT 세포주에 본 발명에 따른 안정화된 레티놀을 처리한 경우에는 이들 사이토카인의 발현이 모두 현저하게 감소하였다. 프로콜라겐(Procollagen) mRNA 발현에 미치는 영향을 확인한 결과 본 발명에 따라 제조된 안정화된 레티놀을 처리 시 COL1A1의 발현량이 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명에 따른 안정화된 레티놀은 피부자극이 적으면서 주름개선 효과가 뛰어난 물질임을 나타내는 것이다.

[실시예]

이하 실시예 및 시험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명이 하기의 예에 의하여 제한되지는 않는다.

제조예 1:레티놀 나노 고분자캡슐의 제조

에탄올에 100nm크기의 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트(ethylene glycol dimethacrylate)로 가교 결합된 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate) 메조다공성 고분자 비드 50g을 5L 비이커에 첨가하여 아지믹서로 40분 이상 교반 시킨 후, 부틸히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene) 2g을 혼합하여 용해시켰다. 레티놀(Vitamin A) 40g을 넣어 주고 완전하게 용해시킨 다음 정제수를 혼합하여 5분 이상 교반하였다. 감압여과 한 다음 레티놀이 흡착된 다공성 폴리머 비드를 45℃에서 진공건조 하였다.(수득률: 96.78%)

실시예 1:레티놀 나노 고분자캡슐 담지 나노 에멀젼 제조

글리세린 600g을 2L 비이커에 넣은 후 70℃로 가온 한 다음 토코페릴아세테이트 10g, 뷰틸하이드록시아니솔 0.05g, 녹두 MCT(caprylic/capric triglyceride)추출물 150g을 혼합 후 온도를 유지하면서 용해하였다. 콜레스테롤(cholesterol, Solvay Germany) 20g을 첨가하여 용해 한 다음, 상기 제조예 1에서 제조된 레티놀이 흡착된 나노 고분자캡슐 80g과 하이드로제네이티드 라이소레시친(Hydrogenated lysolecithin, PC70%) 30g을 혼합하여 65℃에서 완전하게 용해시켰다. 정제수 200g을 넣어주고 50분 교반 한 다음, 고압 호모게나이저(Microfluidizer M-110F, Microfluidizer, Germany)를 이용하여 1,500bar에서 2회 통과시켜 75nm크기의 레티놀 나노 고분자캡슐 담지 나노 에멀젼을 제조하였다.

제조예 2:레티놀 담지 나노 에멀젼의 제조

상기 실시예 1에서 상기 제조예 1의 레티놀 나노 고분자캡슐을 첨가하는 대신에 레티놀(98% 용액) 30g을 첨가하는 것 이외에는, 상기 실시예 1과 동일하게 하여 레티놀 담지 나노에멀젼을 제조하였다.

제조예 3:레티놀 담지 에멀젼의 제조

상기 실시예 1에서 녹두 MCT추출물을 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일하게 하여 레티놀 담지 나노 에멀젼을 제조하였다.

시험예 1: 레티놀에 대한 역가 유지능 확인

상기 실시예 1에 의하여 안정화된 레티놀의 역가를 상온(25℃), 고온(45℃)에서 확인하였다. 또한 상기 제조예 1, 3에서 제조된 안정화된 레티놀을 비교예 1, 2로 하여 제조 직후의 레티놀 역가와 45℃에 5주간 방치시킨 후의 레티놀역가를 HPLC(325nm에서)로 흡광도를 측정하여 확인하였다.

1) 검액제조

레티놀 2500IU에 메탄올 100mL를 취하여 메탄올에 용해하여 100mL로 한 액 10mL를 정확하게 취하여 10배 희석하고 필요하면 여과하여 검액으로 사용한다.

2) 표준액제조

레티놀 100mL로 한 액 10mL를 정확하게 취하여 메탄올을 넣어 100mL로 한 액을 표준액으로 한다.

3) 분석방법

컬럼은 C18로 충진된 것을 사용하고 검출기는 325nm 파장의 자외부흡광광도계를 사용하였다. 이동상은 90% 에탄올을 사용하였고 유량조건은 1.0mL/min이다.

그 결과를 도 1a 및 도 1b에 나타내었다.

도 1a에서 확인되는 바와 같이 35일 동안 상온(25℃) 및 고온(45℃)에서 레티놀 함량을 측정한 결과 상기 실시예 1에 의해 안정화된 레티놀은 저온에서 100%이상 함량을 유지하는 것을 확인 할 수 있으며, 고온에서도 90% 이상의 함량을 유지하여 함량 변화가 없을 정도로 안정성이 우수함을 확인할 수 있었다. 도 1b에서 확인되는 바와 같이 2차 에멀젼화하지 않은 비교예 1과, 녹두 MCT 추출물을 첨가하지 않은 비교예 2의 경우에는 실시예 1에 비하여 레티놀 역가유지능이 떨어지는 것을 알 수 있다. 이는 2차 에멀젼화를 통한 이중 안정화 및 녹두 MCT추출물 첨가에 의하여 레시틴의 역가 유지능이 크게 향상됨을 나타내는 것이다.

안정화된 레티놀의 생리활성을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법으로 효능시험을 하였다.

세포배양

실험에 사용된 세포는 HaCaT(Human Keratinocytes cell line)이며 37℃, 5%의 CO_2,10%의 소 태아혈청(FBS, Lonza), 50μg/mL의 스트렙토마이신(Sigma)을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Invitrogen)배지에서 배양하였다.

사이토카인(Cytokine)의 발현 측정

RNA 분리

RNA 분석을 위해 세포 내의 total RNA를 세포 배양으로부터 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen, USA)를 사용하여 추출하였다. RNA의 순도와 무결성은 A₂₆₀nm/A₂₈₀nm비율 측정을 통해 확인하였고, RNA 수율은 260nm에서 흡광도로 측정하였다.

Reverse Transcriptase - polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

cDNA합성은 3 ㎍의 total RNA를 Oligo dT 15(500ng/㎕l) primer, dNTP (10mM), RTase inhibitor(40 U/㎕), Powerscript Ⅱ RTase(Clontech, USA) 를 첨가하여 25℃에서 10분간 프라이머 어닐링(primer annealing), 42℃에서 60분간 cDNA를 합성하고 95℃에서 5분간 RTase 변성(denaturation) 시켰다. PCR은 cDNA로부터 TNF-α, IL-1α, COL1A1과 GAPDH를 증폭하기 위하여 cDNA 3 ㎕, 10X taq polymerase 5 ㎕, 2.5mM dNTP 2 ㎕, 10pmol primer 각각 2 ㎕, taq polymerase 0.5 ㎕를 혼합하고 증류수를 더하여 50 ㎕로 조정한 후 증폭시켰다. 프라이머 서열은 하기의 표 1에 나타내었다. PCR에 의하여 생성된 산물은 1% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동하여 이미지 분석기(UGEN, U: Genius)로 확인하였으며 각 밴드의 덴시티(density)는 덴시토메트릭 프로그램(Densitometric program, Gene Tools from Syngene)을 이용하여 측정하였다. 상기 제조예 2의 안정화 레티놀(0.2%)을 비교예로 하였다.

Gene	Primer
GAPDH	Forward 5'- AAC GAA TTT GGT CGA ACA GC-3'
GAPDH	Reverse 5'- TGA GGA GGG ATT CAG TG-3'
TNF-α	Forward 5'- CAG AGG GAA GAG TTC CCC AG-3'
TNF-α	Reverse 5'- CCT TGG TCT GGT AGG AGA CG-3'
IL-1α	Forward 5'- GTC TCT GAA TCA GAA ATC CTT CTA TC-3'
IL-1α	Reverse 5'- CAT GTC AAA TTT CAC TGC TTC ATC C-3'
COL1A1	Forward 5'- AGC CAG CAG ATC GAG AAC AT-3'
COL1A1	Reverse 5'- TCT TGT CCT TGG GGT TCT TG-3'

자이모그래피(Zymography)

단백질은 cell lysis buffer[50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF]로 분리한 후 브래드포드 분석(Bradford assay)을 실시하여 단백질 양을 확인한 후 사용하였다. 2% Gelatin (Fluka)이 포함된 SDS ??PAGE GEL을 준비한다. 단백질을 Tris-Glycine SDS 버퍼와 섞고 상온에서 10분간 반응시킨다. 이때 가열은 하지 않는다. 단백질을 1X Tris ??Glycine SDS Running 버퍼와 함께 겔에 로딩(loading) 한다. Running 후 1X Zymogram Renaturing buffer에 겔을 담근 후 30동안 상온에서 온화하게 교반(gently shaking)한다. 그 후 1X Zymogram Developing buffer에 넣어서 상온에서 30분 동안 반응시키고 깨끗한 1X Zymogram Developing buffer로 교환해준 뒤 37℃에서 overnight한다. 다음날 Coomassie blue R-250(BIO-RAD)으로 30분간 염색(staining)해준 뒤 탈색(destaining)한다.

시험예 2:사이토카인 발현 억제 시험

상기 실시예 1의 안정화된 레티놀의 항염효과를 평가하기 위하여 상기 시험방법에 의하여 사이토카인 발현 억제능을 평가하였다. 사이토카인의 발현을 증가시키는 자외선을 각질형성세포에 조사한 후, 상기 제조예 2의 안정화 레티놀(0.2%)을 비교예 3으로 하여 사이토카인 발현 억제 효과를 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 확인되는 바와 같이, 사이토카인의 발현을 증가시키는 자외선을 각질형성세포에 조사한 후, 비교예 3과 실시예 1의 사이토카인 발현 억제 효과를 확인한 결과 비교예 3의 경우에는 TNF-α 및 IL-1 α의 모발현이 증가하였으나, 실시예 1의 안정화 레티놀을 처리한 경우에는 이들 사이토카인의 발현이 모두 현저하게 감소하였다.

시험예 3:콜라겐 생합성 촉진 시험

본 발명의 안정화 레티놀이 COL1A1(Type 1 procollagen)의 발현에 영향을 미치는지 확인하고자 RT-PCR을 시행하여 COL1A1의 발현량을 확인하였다. 그 결과는 도 3a 에 나타내었다. 실시예 1의 안정화 레티놀 처리 시 COL1A1의 발현량이 비교예 3에 비해 증가하는 것을 확인하였다.

Procollagen 단백질의 발현에 미치는 영향

본 발명 안정화 레티놀의 프로콜라겐(procollagen) mRNA 발현 증가효과를 확인하여 젤라틴분해 단백질 발현에도 관여하는지 확인하고자 자이모그패피(zymography)를 시행하였다. 그 결과는 도 3b에 나타내었다. 젤라틴을 분해하는 MMP-2의 단백질 발현 수준이 비교예에 비해 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 시험예 들에서 확인되는 바와 같이, 본 발명에 따른 안정화된 레티놀은 역가유지능이 우수하며 항염 및 주름개선효과가 우수함을 알 수 있었다.

실시예 2: 크림의 제조

상기 실시예에서 제조된 안정화 레티놀을 첨가하여 하기 표 2의 조성으로 화장료 조성물을 제조하였다.

조성물 (중량%)	실시예 2	비교예 4	비교예 5
레티놀에멀젼(실시예 1)	3.00	-	-
Retinol crystal	-	0.04	0.03
글리세린	1.00	1.00	1.00
부틸렌글라이콜	2.00	2.00	2.00
아라키딜알코올/베헤닐알코올/아라키딜글루코사이드	2.50	2.50	2.50
글리세릴스테아레이트	0.50	0.50	0.50
피이지-4올리베이트	0.50	0.50	0.50
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.00	4.00	5.00
콜레스테릴/베헤닐/옥틸도데실라우로일글루타메이트	1.00	1.00	1.00
마카다미아씨오일	1.00	1.00	1.00
디메치콘	0.50	0.50	0.50
사이클로펜타실록산/사이클로헥사실록산	2.00	2.00	2.00
세테아릴알코올	1.00	1.00	1.00
미네랄오일	2.50	2.50	2.50
디소듐이디티에이	0.03	0.03	0.03
비에이치티	0.05	0.05	0.05
토코페릴아세테이트	0.30	0.30	0.30
판테놀	0.20	0.20	0.20
에칠헥실메톡시신나메이트	0.20	0.20	0.20
프로필파라벤	0.10	0.10	0.10
메칠파라벤	0.20	0.20	0.20
향	0.01	0.01	0.01
정제수	76.41	80.37	79.38

시험예 4: 제형 안정성 시험

상기 실시예 2 및 비교예 4, 5에 대하여 상기 시험예 1에서와 같은 방법으로 제형안정성을 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 확인되는 바와 같이, 상기 안정화된 레티놀을 함유하는 상기 실시예 3의 경우 우수한 안정성을 나타내었다.

시험예 5: 변색 실험

상기 실시예 2 및 비교예 4, 비교예 5에 따라 제조된 화장료 조성물에 대한 제형 변색 실험을 다음과 같이 시행하였다.

실시예 2 및 비교예 4, 비교예 5를 4℃, 25℃, 45℃, 50℃, 일광에서 5주간 안정성 테스트를 진행하였으며, 그 결과를 도 5 및 하기의 표 3에 나타내었다.

	조건	초기	1주	2주	3주	4주	5주
실시예 2	4℃	-	-	-	-	-	-
	25℃	-	-	-	-	-	-
	45℃	-	-	-	-	-	-
	50℃	-	-	-	-	+	+
	일광	-	-	-	-	-	-
비교예 4	4℃	-	-	-	-	-	-
	25℃	-	-	-	-	-	-
	45℃	-	-	-	++	++	++
	50℃	-	-	++	++	++	+++
	일광	-	-	-	-	-	-
비교예 5	4℃	-	-	-	-	-	-
	25℃	-	-	-	-	-	-
	45℃	+	+	++	++	+++	+++
	50℃	+	++	++	+++	+++	+++
	일광	-	-	-	-	-	-

( - 변색없음, ± < + 변색정도)

상기 표 3 및 도 5에서 확인되는 바와 같이, 본 발명 안정화된 레티놀을 함유하는 실시예 2가 비교예 4 및 비교예 5 보다 안정성이 더 우수함을 확인할 수 있다.

시험예 6: 피부자극성평가

실시예 2 및 비교예 4, 비교예 5에 따라 제조된 화장료 조성물에 대한 피부 주름 개선 효과를 다음과 같이 측정하였다.

30대의 여성 40명을 세 그룹(실험구, 대조구1, 대조구2)으로 나누어 실험구에는 실시예 2의 화장료 조성물을, 대조구 1, 2에는 비교예 4 및 5의 화장료 조성물을 눈가에 매일 밤 1회 0.2 g의 양으로 12주간 도포한 후 눈가의 주름 부위를 ARAMO TS(아람 휴비스, 대한민국)를 사용하여 측정하여 주름 개선 효과를 평가하였다. 결과는 아래 표 4 및 표 5와 같다.

	주름 측정 수치
	실시예 2			비교예 4			비교예 5
	T0	T12	차이	T0	T12	차이	T0	T12	차이
피검자1	33	28	5	36	35	1	33	30	3
피검자2	36	26	10	37	37	0	36	29	7
피검자3	37	29	8	32	31	1	37	36	1
피검자4	35	30	5	33	35	-2	35	32	3
피검자5	33	31	2	38	33	5	33	31	2
피검자6	35	30	5	35	35	0	35	28	7
피검자7	37	34	3	33	37	-4	37	35	2
피검자8	36	32	4	34	34	0	36	35	1
피검자9	33	28	5	36	35	1	33	30	3
피검자10	37	33	4	37	37	0	37	34	3
평 균	35.2	30.1	5.1	35.1	34.9	0.2	35.2	32.0	3.2

	자극 정도
	실시예 2	비교예 5
피검자1	0	3
피검자2	0	4
피검자3	0	3
피검자4	1	2
피검자5	0	3
피검자6	1	3
피검자7	0	2
피검자8	0	2
피검자9	0	3
피검자10	0	1
평 균	0.2	2.6

(자극 정도 0:자극 없음 5:자극이 심하여 사용 중단)

실험 결과, 실시예 2의 경우 12주 사용 후 피부 주름의 수치가 5.1 감소하였으며(14.49%), 비교예 4의 0.24감소(0.57%) 보다 약 25.4배 이상 주름이 더 개선되었다. 또한 비교예 5의 3.2감소보다(9.09%) 약 1.6배의 주름개선 효과를 얻었다.

또한 실시예 2 및 비교예 5를 사용한 피검자들의 설문 조사 결과, 비교예 5를 사용하였을 경우 자극을 호소하는 경우가 많은 반면, 실시예 2를 사용하였을 경우 경미한 자극을 나타내는 경우가 2건 이었으며, 나머지의 피검자에서는 자극을 확인 할 수 없었다. 따라서 위의 결과로부터 본 발명 안정화된 레티놀은 주름 개선 효과 및 자극 완화 효과가 우수함을 알 수 있다.

Claims

레티놀이 메조다공성 폴리머 비드(mesoporus polymer bead)에 흡착되어 형성된 레티놀 나노 고분자캡슐을 녹두 MCT(medium chain triglyceride)추출물과 레시틴을 이용하여 50 ~ 200nm의 크기로 나노 에멀젼화하는 것에 의하여 안정화된 레티놀을 함유하는 항염 및 피부주름개선용 화장료조성물.
제 1항에 있어서, 상기 메조다공성 고분자 비드는 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트(ethylene glycol dimethacrylate)로 가교 결합된 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate)로 이루어지는 것임을 특징으로 하는 항염 및 피부주름개선용 화장료조성물.
제1항에 있어서, 활성성분인 레티놀은 상기 레티놀 나노 고분자캡슐의 0.5~10중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 항염 및 피부주름개선용 화장료조성물.
제1항에 있어서, 상기 레시틴은 하이드로제네이티드 레시틴, 하이드로제네이티드 포스파티딜콜린, 포스포리피드, 하이드로제네이티드 라이소포스파티딜콜린, 하이드로제네이티드 라이소레시틴, 하이드로옥실레이티드 레시틴 및 불포화레시틴으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 것임을 특징으로 하는 항염 및 피부주름개선용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 안정화된 레티놀은 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.0001 중량％ 내지 50 중량％ 함유되는 것을 특징으로 하는 항염 및 피부주름개선용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 화장료조성물은 그 제형이 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤, 피부 점착타입의 화장료, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 샴푸, 린스, 바디크렌저, 비누, 치약, 구강청정제, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제인 것임을 특징으로 하는 항염 및 피부주름개선용 화장료 조성물.
(A)(a1)에탄올에 50nm 내지 500nm의 메조다공성 고분자 비드(mesoporus polymer bead)를 첨가하여 교반 후, 항산화제인 부틸히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene)을 혼합하여 용해하는 단계; (a2)레티놀(Vitamin A)을 첨가하여 완전히 용해시킨 다음 증류수를 혼합하여 교반하는 단계; (a3)감압여과 후 건조하여 레티놀이 흡착된 나노 고분자 캡슐을 제조하는 단계;
(B)(b1)글리세린(glycerin)을 가온한 후, 토코페릴아세테이트(tocopheryl acetate)와 뷰틸하이드록시아니솔(butylated hydroxy anisole), 녹두 MCT추출물을 혼합하면서 용해시키는 단계;
(b2)콜레스테롤(cholesterol)을 첨가하여 용해시킨 후, 상기 레티놀이 흡착된 나노 고분자 캡슐을 첨가하는 단계;
(b3)하이드로제네이티드라이소 레시틴(hydrogenated lysolecithin)을 혼합하여 용해시키고, 정제수를 넣어 교반하여 나노 에멀젼 조성물을 제조하는 단계; 및
(C)고압 호모게나이저(Microfluidizer)를 사용하여 50 ~ 200nm 크기의 나노 에멀젼을 형성하여 안정화하는 단계를 포함하는 레티놀의 안정화 방법.
제7항에 있어서 상기 나노 에멀션 조성물은 글리세린 1 ~ 60중량%, 토코페릴아세테이트 0.5 ~ 1중량%, 뷰틸하이드록시아니솔 0.03~0.05중량%, 녹두 MCT(medium chain triglyceride)추출물 1 ~ 12중량%, 콜레스테롤 1 ~ 2중량%, 레티놀 나노 고분자캡슐 1 ~ 10중량%, 하이드로제네이티드라이소 레시틴 1 ~ 3중량% 및 정제수를 포함하여 이루어지는 것임을 특징으로 하는 레티놀의 안정화 방법.
제8항에 있어서, 상기 녹두 MCT 추출물은 녹두의 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드(caprylic/capric triglyceride) 추출물인 것임을 특징으로 하는 레티놀의 안정화 방법.