KR20110132877A - 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트의 합성 방법 - Google Patents

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신선미
김예슬
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Abstract

본 발명은 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트의 신규의 2-단계 합성 방법을 제공한다. 본 방법은 i) 하기 화학식 I의 구아노신의 5'-OH를 요오드로 치환하여 하기 화학식 II의 요오드화된 구아노신을 제조하는 단계, 및 ii) 하기 화학식 II의 요오드화된 구아노신으로부터 하기 화학식 III의 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트를 제조하는 단계를 포함하며, 종래의 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트 합성 방법에 비하여 단축된 시간내에 더 높은 수율로 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트를 합성할 수 있다.

Description

5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트의 합성 방법{Method for synthesizing 5'-deoxy-5'-thioguanosine-5'-monophosphorothioate}
본 발명은 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트의 신규한 합성 방법에 관한 것이다.
현대의 생물학적 시스템이 DNA 게놈과 단백질 효소에 기반을 두고 있음에도 불구하고, RNA는 단백질 생합성의 조절, RNA 스플라이싱, 및 레트로바이러스 복제를 비롯한 많은 기본적인 세포 과정에서 중요한 역할을 하며, 유사한 화학적 특성을 공유하는 4가지의 상이한 "빌딩 블록(building blocks)"만을 함유하며, 서열 변화를 잘 용인하는 다양한 3차 구조를 형성할 수 있으며, 물에 가용성인 특징을 갖는다. 또한, 테트라하이메나(Tetrahymena)에서의 셀프-스플라이싱(self-splicing) pre-rRNA의 발견 및 리보핵산단백질 복합체 내의 RNA 성분에 의한 tRNA 전구체의 절단의 발견은 촉매 RNA, 즉 라이보자임의 존재를 입증하였다. 이러한 관점에서, RNA의 부위-특이적 치환 및 유도체화는 RNA 구조와 기능을 연구하기 위한 강력한 도구를 제공할 수 있다. 종래의 고체상 합성 방법을 이용하여 약 40 뉴클레오티드보다 짧은 올리고뉴클레오티드의 임의의 특정 위치에 작용기를 도입할 수 있지만, 더 큰 RNA 분자의 부위-특이적 변형 및 치환을 위한 방법은 제한적이다.
RNA 분자의 몇몇 5'-변형이 RNA 구조 연구, RNA-단백질 상호작용 확인, 및 촉매 RNA의 인비트로(in vitro) 선별에서 광범위한 응용을 갖는 것으로 나타났지만, 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 변형이 전사 또는 키나아제 반응에 의해 RNA의 5'-말단을 작용화시키기 위한 가장 일반적인 방법 중 하나이다. 그러나, 말단 포스포로티오에이트는, RNA 구조를 위한 가장 매력적인 프로브인 형광단(fluorophore)과의 결합 효율이 낮은 단점을 갖는다.
한편, 설프하이드릴(sulfhydryl) 기는 포스포로티오에이트의 사용에 대한 대안으로서 핵산 내로 통합시킬 수 있는 또 다른 반응성기이며, 이는 티올-반응성 작용기가 할로아세트아미드, 말레이미드, 벤질리칼리드, 및 브로모메틸케톤을 포함하며, 티올기는 티올-다이설파이드 교환 반응의 독특한 특성을 보여주기 때문이다. 유리 티올기는 카르보다이이미드 및 시스테아민을 이용하여 RNA의 5'-말단 내로 화학적으로 도입될 수 있으나, 포스포르아미데이트 결합은 안정하지 못하다.
상기와 같은 문제점을 극복하기 위하여, T7 RNA 폴리머라제에 의한 인 비트로 전사에 의해 RNA내로 통합된 후, 탈인산화에 의해 5'-말단 설프하이드릴기를 제공할 수 있는 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트가 개발되어 이용되었다. 그러나, 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트를 위한 기존의 합성 방법은 그 절차가 복잡하고 시간이 오래 걸리며 수율이 약 30% 정도로 낮은 단점이 있어 활용성이 낮다.
상기와 같은 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트의 기존의 합성 방법의 단점을 극복하기 위한 연구를 통해, 본 발명자들은 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트를 짧은 시간내에 높은 수율로 합성할 수 있는 새로운 합성 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트의 신규 합성 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트(GSMP)의 신규 합성 방법을 제공한다.
종래의 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트의 합성은 i) 50% 수성 포름산 내의 5'-데옥시-5'-요오도-2',3'-아이소프로필리덴 구아노신의 현탁액을 2.5일 동안 교반한 후 용매를 증발시켜 제거하는 단계, ii) 물 내의 5'-데옥시-5'-요오도구아노신의 현탁액에 트라이소듐 티오포스페이트를 첨가한 후 반응 혼합물을 실온에서 아르곤 대기하에서 3일 동안 교반하는 단계, iii) 여과에 의해 침전물을 제거한 후 감압하에서 용매를 증발시키는 단계, 및 iv) 물에 용해시킨 후 메탄올을 첨가하여 침전시키고, 여과에 의해 침전물을 제거한 후, 용매를 증발시키는 단계의 4 단계를 통해 이루어졌으며 전체 합성 과정에 6일 이상의 기간이 걸렸다. 또한, 그 합성 수율도 약 30% 정도로 낮았다.
반면, 본 발명의 합성 방법은 i) 하기 화학식 I의 구아노신의 5'-OH를 요오드로 치환하여 하기 화학식 II의 요오드화된 구아노신을 제조하는 단계, 및 ii) 하기 화학식 II의 요오드화된 구아노신으로부터 하기 화학식 III의 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트를 제조하는 단계의 두 단계를 통해 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트를 합성한다.
[화학식 I]
Figure pat00001
[화학식 II]
Figure pat00002
[화학식 III]
Figure pat00003

본 발명의 방법에 있어서, 구아노신의 5'-OH를 요오드로 치환하는 제1 단계는 유기화학 분야에 공지된 많은 다양한 방법을 이용하여 이루어질 수 있으며, 예를 들어, 유기 용매 내의 구아노신 수화물, 트라이페닐포스핀, 및 이미다졸의 현탁액에 요오드를 첨가하여 구아노신의 5'-OH를 요오드로 치환시킨 후, 요오드화된 구아노신을 침전시킴으로써 이루어질 수 있다.
치환 반응이 유기 용매 내의 구아노신 수화물, 트라이페닐포스핀, 및 이미다졸의 현탁액에 요오드를 첨가하여 이루어질 경우, 사용되는 유기 용매는 예를 들어, N-메틸-2-피롤리디논을 이용할 수 있으나 이로 한정되지는 않으며, 치환 반응을 위한 반응 시간은 약 3 시간이 바람직하다.
요오드화된 구아노신의 침전은 유기 용매, 예를 들어, 다이클로로메탄과 물로 희석함으로써 이루어질 수 있으며, 그외에 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있다.
본 방법에 있어서, 요오드화된 구아노신으로부터 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트를 제조하는 제2 단계는 예를 들어, 요오드화된 구아노신을 티오포스페이트 함유 화합물과 반응시켜 이루어질 수 있으며, 그 외의 당업계에 공지된 방법을 이용하여 이루어질 수 있다.
티오포스페이트 함유 화합물로는 예를 들어, 트라이소듐 티오포스페이트, 트라이포타슘 티오포스페이트 등을 이용할 수 있으나, 이로 한정되지 않으며, 요오드화된 구아노신과 티오포스페이트 함유 화합물의 반응 시간은 약 3일 이상이 바람직하다.
본 발명의 합성 방법의 구체적인 한 가지 예는 하기 반응식 1과 같다.
[반응식 1]
Figure pat00004
(a: P(Ph)3, I2, 이미다졸, N-메틸-2-피롤리디논, b: 트라이소듐 티오포스페이트, 물)
상기 반응식 1의 합성 방법에서, 제1 단계는 N-메틸-2-피롤리디논 내의 구아노신 수화물(1), 트라이페닐포스핀, 및 이미다졸의 자기 교반된 현탁액에 요오드를 첨가하여 약 3 시간 동안 반응시켜 구아노신의 5'-OH를 요오드로 치환한 후, 반응 용액을 다이클로로메탄과 물로 희석하여 백색 결정성 고체인 요오드화된 구아노신(2)을 수득하는 단계이다.
제2 단계는 제1 단계에서 수득한 요오드화된 구아노신(2)을 물에서 트라이소듐 티오포스페이트와 반응시켜 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트(3)를 수득하는 단계이다. 요오드화된 구아노신과 트라이소듐 티오포스페이트의 반응 시간은 3일 이상이 바람직하다.
본 발명의 방법에 의해 합성된 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트의 수율은 약 70%에 가까우며, 3일의 짧은 기간에 합성이 이루어질 수 있어, 본 방법은 종래의 합성 방법에 비하여 단시간에 높은 수율로 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트를 제공한다.
본 발명의 방법에 의해 합성된 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트는 종래의 합성 방법에 의해 합성된 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트와 동일하게, 하기 반응식 2에서와 같은 공지의 방법에 의해, 전사를 효율적으로 시작하기 위하여 구아노신을 필요로 하는 T7 RNA 폴리머라제를 이용한 인 비트로 전사에 의해 RNA의 5'-말단 내로 성공적으로 통합된 후 알카라인 포스파타제로 처리되어 RNA의 5'-말단에 설프하이드릴기를 제공할 수 있음이 확인되었다.
[반응식 2]
Figure pat00005
(a: T7 RNA 폴리머라제, GSMP, GTP, ATP, UTP, b: 알카라인 포스파타제)
본 발명의 방법에 의해 합성된 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트를 이용하여 RNA의 5'-말단에 설프하이드릴기를 도입하는 경우, T7 RNA 폴리머라제를 이용한 인 비트로 전사를 위해 이용되는 GTP, ATP, CTP, UTP에 대한 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트의 비율이 높을수록 RNA의 5'-말단에 존재하는 설프하이드릴기의 백분율이 높아지는 것으로 확인되었다.
본 발명의 방법은 종래의 방법에 비하여 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트를 단시간에 높은 수율로 합성할 수 있도록 함으로써, RNA의 5'-말단을 변형시키기 위한 도구를 용이하게 얻을 수 있도록 하여, 형광단과 같은 리포터를 안정한 티오-결합을 통해 RNA의 5'-말단에 효율적으로 도입시킬 수 있도록 한다.
도 1a는 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트가 T7 RNA 폴리머라제에 의한 인 비트로 전사에 의해 RNA에 통합될 수 있음을 보여준다.
도 1b는 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트가 RNA에 통합된 후 알칼라인 포스파타제에 의한 탈인산화에 의해 설프하이드릴기로 전환될 수 있음을 보여준다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오직 본 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업자에게 있어서 자명하다.
하기 실시예를 위하여, 달리 표시하지 않으면, 모든 시약은 상업적 공급처로부터 입수하여 추가 정제없이 사용하였으며, 필요할 경우 Depc-처리된 탈이온수를 사용하였다. 1H NMR 스펙트럼은 브루커(Bruker) 400 MHz 분광계에서 실시하였으며 1H를 위한 내부 기준으로서 TMS를 사용하였다. 모든 실험은 두벌씩 실시하였다.
실시예 1. 5'- 데옥시 -5'- 티오구아노신 -5'- 모노포스포로티오에이트의 합성
실온에서 N-메틸-2-피롤리디논 (20 ml) 내의 구아노신 수화물 (1.5 g, 5 mmol), 트라이페닐포스핀 (4.32 g, 16.5 mmol), 및 이미다졸 (2.25 g, 33.1 mmol)의 자기 교반 현탁액에 요오드 (4.02 g, 15.8 mmol)를 5분에 걸쳐 첨가하였다. 첨가동안 완전한 용해가 일어났으며 용액은 60 ℃로 가온되었다. 용액을 다시 실온으로 냉각하고 3시간 후 다이클로로메탄 (200 ml) 및 물 (60 ml)로 희석하였다. 용액으로부터 백색 결정성 고체가 분리되었으며 여과에 의해 수집하여 요오드화된 구아노신 1.4 g (71.2%)을 수득하였다.
1.4 ml의 물 내의 요오드화된 구아노신 (0.283 g, 0.72 mmol)의 현탁액에 트라이소듐 티오포스페이트 (0.48 g, 2.6 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 아르곤 대기하에서 실온에서 3일 동안 교반하였다. 침전물을 제거하기 위한 여과 후, 여과액을 감압하에서 증발시켰다. 잔사를 10 ml의 물에 용해시키고 20 ml의 메탄올을 첨가하여 침전시켰다. 여과에 의해 침전물을 제거한 후, 여과액을 증발시키고 소량의 물에 용해시킨 후 역상 크로마토그래피를 진행하였다. 원하는 생성물을 수집하여 동결건조기에 의해 건조시키고 양성자 NMR에 의해 특성화하였다. 수율 : 요오드화된 구아노신으로부터 68%. Rf = 0.36 (i-PrOH:NH3:H2O = 6:3;1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6+D2O): d7.82 (s, 1H), 5.63 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 4.28 (dd, J = 3.9 Hz, 1H), 4.08 (ddd, 2H), 2.83 (m, 2H).
실시예 2. 5'- 데옥시 -5'- 티오구아노신 -5'- 모노포스포로티오에이트를 이용한 인비트로 전사 및 티올 정량화
하기 염기 서열을 가진, 5'-말단에 T7 프로모터를 함유한 100-mer 단일쇄 DNA를 인비트로 전사를 위한 주형으로 이용하였다.
5'-CAG GAC TGC TCT CAC TCT CAC GCA CCA AGA AGC TGC CAT TGA TCC CGC TGC TCA GCA GAT ACT CAG CGG CCC CCC CTA TAG TGA TGA GTC GTA TTA GTC C-3'(서열 번호 1)
전사 반응은 37 ℃에서 0.2 mL의 전체 용액에서 GTP, ATP, CTP, 및 UTP 각각 0.2 mM, 12 mg의 DNA 주형, 2 mM 스펄미딘, 10 mM 다이티오트레이톨, 6 mM MgCl2, 및 40 mM Tris 버퍼(pH 7.9)의 존재하에서 50 유닛의 T7 RNA 폴리머라제로 실시하였다. GSMP:GTP:ATP:CTP:UTP = 0:1:1:1:1, 4:1:1:1:1, 8:1:1:1:1, 10:1:1:1:1, 20:1:1:1:1, 및 50:1:1:1:1 mM의 비율로 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트(GSMP)의 존재하에서 런오프(runoff) 전사에 의해 71 뉴클레오티드의 5'-GSMP-RNA를 합성하였다. GSMP-라벨된 RNA의 각각을 변성 7.5 M 우레아/8% 폴리아크릴아미드 젤 전기영동한 후 EtBr 염색한 결과가 도 1a에 나타난다. 도 1a의 레인 1은 ssDNA 래더이며, 레인 2는 GSMP없는 5'-GTP-RNA이며, 레인 3-7은 각각 4. 8. 10, 20 및 50 당량의 GSMP로부터 합성된 5'-GTP-RNA와 5'-GSMP-RNA의 혼합물이다. 도 1a는 본 발명의 방법에 의해 합성된 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트가 인비트로 전사를 통해 성공적으로 RNA에 통합될 수 있음을 보여준다.
변성 7.5 M 우레아/8% 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 의해 정제한 5'-GSMP-RNA는 버퍼 3 내의 10 유닛의 알카라인 포스파타제(New England Biolab, MA)와 2시간 동안 37 ℃에서 항온처리하여 탈인산화시킨 후 10 ml의 200 mM EGTA와 10분 동안 65 ℃에서 항온처리하여 반응을 중단시켰다. 에탄올 침전에 의해 RNA를 회수하여, 티올 및 설파이드 정량화 키트(Molecular Probes, OR)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 티올기의 양을 시험하였다. 그 결과, 하기 표 1 및 도 1b에 나타난 바처럼, GSMP:GTP의 비율이 약 4:1일 때, 약 39%의 전사물이 GSMP로 시작되었으며, GSMP로 시작된 전사물의 퍼센트는 GSMP:GTP의 비율이 8:1, 10:1, 20:1, 및 50:1로 변함에 따라 66%, 81%, 95%, 및 100%로 증가하였으며, 50배가 넘는 GSMP는 T7 RNA 폴리머라제에 의한 전사를 약간 억제하는 것으로 보였다.
GSMP:GTP:ATP:CTP:UTP 5'-말단에서 티올의 백분율 양
4:1:1:1:1 38.9
8:1:1:1:1 66.0
10:1:1:1:1 81.5
20:1:1:1:1 94.6
50:1:1:1:1 100
상기 결과는 본 발명의 방법에 의해 합성된 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트가 RNA에 통합된 후 탈인산화에 의해 5'-티올기를 제공할 수 있음을 보여준다.
<110> UNIVERSITY-INDUSTRY COOPERATION GROUP OF KYUNG HEE UNIVERSITY <120> Method for synthesizing 5'-deoxy-5'-thioguanosine-5'-monophosphorothioate <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template <400> 1 caggactgct ctcactctca cgcaccaaga agctgccatt gatcccgctg ctcagcagat 60 actcagcggc cccccctata gtgatgagtc gtattagtcc 100

Claims (7)

  1. i) 하기 화학식 I의 구아노신의 5'-OH를 요오드로 치환하여 하기 화학식 II의 요오드화된 구아노신을 제조하는 단계, 및
    ii) 하기 화학식 II의 요오드화된 구아노신으로부터 하기 화학식 III의 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트를 제조하는 단계를 포함하는, 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트의 합성 방법.
    [화학식 I]
    Figure pat00006

    [화학식 II]
    Figure pat00007

    [화학식 III]
    Figure pat00008
  2. 제1항에 있어서, 제1 단계는 유기 용매 내의 구아노신 수화물, 트라이페닐포스핀, 및 이미다졸의 현탁액에 요오드를 첨가하여 구아노신의 5'-OH를 요오드로 치환시킨 후, 요오드화된 구아노신을 침전시킴으로써 이루어지는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 구아노신의 5'-OH의 치환 반응을 위한 유기 용매는 N-메틸-2-피롤리디논이며, 치환 반응 시간은 약 3시간인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 구아노신의 침전은 다이클로로메탄과 물을 이용한 희석에 의해 이루어지는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 단계는 요오드화된 구아노신을 티오포스페이트 함유 화합물과 3일 이상 반응시켜 이루어지는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 티오포스페이트 함유 화합물은 트라이소듐 티오포스페이트 또는 트라이포타슘 티오포스페이트인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 티오포스페이트 함유 화합물은 트라이소듐 티오포스페이트인 방법.
KR1020100052460A 2010-06-03 2010-06-03 5'-데옥시-5'-티오구아노신-5'-모노포스포로티오에이트의 합성 방법 KR20110132877A (ko)

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