KR20110117689A - 염증성, 자가면역 및 심장혈관 질환의 에오탁신-2(ｃｃｌ24) 억제제 - Google Patents

염증성, 자가면역 및 심장혈관 질환의 에오탁신-2(ｃｃｌ24) 억제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 염증성 질환, 예를 들어 류머티즈 관절염, 실험적 자가 면역성 뇌척수염(EAE), 대장염, 당뇨 및 아테롬성 동맥경화증의 동물 모델에서 현저한 예방효과를 갖는다는 발견에 기초하고 있다. 따라서 본 발명은 염증성, 자가면역 또는 심장혈관 질환의 치료에서 다른 치료제와 결합되게 또는 단독으로 사용되는 특이적 안티-에오탁신 2 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 특이적 안티-에오탁신-2 모노클로날 항체, 및 본 발명의 항체를 이용하는 치료방법을 제공한다.

Description

염증성, 자가면역 및 심장혈관 질환의 에오탁신-2(ＣＣＬ24) 억제제{Eotaxin-2 (CCL24) inhibitors in inflammatory, autoimmune, and cardiovascular disorders}
본 발명은 염증성, 자가면역 및 심장혈관 질환의 치료에서 에오탁신-2(CCL24) 억제제, 특히 안티 에오탁신-2 폴리클로날 또는 모노클로날 항체의 용도에 관한 것이다.
케모카인(chemokine)은 염증 부위에 대해 특이적 세포집단을 구성함은 물론 이들 세포의 항상성 수송(homestatic trafficking)을 조정하면서, 백혈구에 대한 화학유인물질로서 작용하는 작은 사이토카인이다. 케모카인 조절이상은 염증 및 자가면역을 비롯한 면역 시스템을 포함하는 광범위한 인간 질환에 역할을 하는 것으로 여겨진다(1).
인간 에오탁신 패미리는 CC 케모카인 패미리에 속하는 3개의 공지된 사이토카인을 포함한다:
에오탁신 1 (호산구 화학주성 단백질 1, 이는 에오탁신 또는 케모카인 (C-C모티프) 리간드 11 (CCL11)으로 또한 명명됨)은 이들의 화학주성(chemotaxis)을 유도하여 호산구(eosinophils)을 선택적으로 구성하며, 따라서 알러지 반응에 관여하는 것으로 알려져 있다.
에오탁신 2 (호산구 화학주성 단백질 2, 이는 케모카인 (C-C모티프) 리간드 24 (CCL24), 골수성 전구세포 억제인자 2 (MPIF-2)로 또한 명명됨)은 호산구(2-4), 호염기구(4), Th2-타입 림프구(5) 및 중성구를 포함하는 염증성 세포에 대한 강력한 화학유인물질이다. 에오탁신-2는 다양한 유형의 내피세포(5-9)로 발현되며 또한 내피세포(10) 및 평활근 세포(11)에서 혈관형성 및 이동 반응을 유도한다.
에오탁신 3 (호산구 화학주성 단백질 3, 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 26 (CCL26), 대식세포 염증성 단백질 4-알파(MIP-4-알파), 흉선 간질 케모카인-1 (TSC-1), 및 IMAC)은 호산구 및 호염기구에 대한 화학주성이다.
에오탁신-2는 에오탁신과 단지 39% 상동성이 있으며 또한 두 개의 폴리펩티드는 NH2-말단 영역에서 거의 완전히 다르다(12). 에오탁신-2는 염색체 7q11.23에 위치하며 또한 에오탁신은 염색체-17q21.1에 위치한다. 에오탁신-3 유전자는 염색체 7상의 에오탁신-2 유전자에 매우 가까이에 있지만 그것과 단지 33% 상동성을 갖는다. 이들 케모카인은 CCR3 수용체에 특이적으로 결합한다. CCR3 즉 에오탁신 수용체는 7-막관통 G 단백질-결합 수용체이며, 이는 호산구로 발현됨은 물론 대식세포 및 내피세포을 포함하는 광범위한 배열의 세포 유형으로 발현된다(13).
국제출원공개 WO 97/00960호는 인간 에오탁신 (CCL11)은 물론 단리 또는 재조합 인간 에오탁신 단백질을 암호화하는 핵산을 기술하고 있다. 국제출원공개 WO 97/00960호는 또한 특별한 부위에 대한 호산구의 구성에서 또는 알러지 증상의 치료에서 에오탁신 단백질의 사용방법을 기술하고 있다.
CCR3 발현은 천식 및 알러지의 발병에서 최초로 연구되었으며, 이는 치료 표적으로서 계속 작용한다(14). 그러나 더욱 최근에, 이러한 경로에 대한 역할은 염증성 장질환(15), 다발성 경화증(16) 및 류머티즈 관절염(RA)을 포함하는 추가적인 염증성 및 자가면역 질환의 연구에서 나타났다.
류머티즈 관절염(RA)는 광범위한 염증성 세포(17)에 의한 활막조직의 강한 파괴적 침입에 의해 나타나는 통상의 만성 염증성 질환이다. 대식세포 및 섬유아세포로부터 유래하는 복수의 사이토카인은 (RA)에서 사이토카인 및 케모타인의 분비를 담당한다(18). 관절 극에서 백혈구의 축적은 사이토카인 및 매트릭스 분해 효소를 포함하는 조직 분해 인자의 분비를 유도한다.
케모카인 억제는 아주반트 유도 관절염(adjuvants induced arthritis), 흔히 사용되는 RA 동물모델에서 치료 옵션으로 이전에 시험 되었다(19). 동일한 모델을 사용하면, CCR3은 활막조직에 백혈구를 구성하는데 역할을 하는 것으로 나타났다(20). 많은 케모카인 및 케모카인 수용체의 발현차이는 또한 RA 단백질의 혈청 및 활막조직에서 입증되었다(21).
사이토카인 및 케모카인과 관련하는 염증은 불안정하게 한 다음 파괴하는 아테롬성 동맥경화 플라크(atherosclerotic plaque) 성장 및 성향을 촉진하는데 중심 역할을 하는 것으로 생각된다(22, 23). 에오탁신/CCL24 수용체(CCR3)는 플라크 대식세포에서 발현된다(24). 임상 연구는 건강한 남자의 집단에서 에오탁신 유전자의 비보존적 다형성이 심근경색증에 증가된 위험과 연관되어 있음을 입증하였다(25). 후속 연구에서는, 증가된 순환 에오탁신 수준은 관상 아테롬성 동맥경화증 및 허혈의 존재와 연관되어 있는 것으로 발견되었다 (26, 27).
아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis)은 지방분해가 내공(lumen)을 점진적으로 좁히게 하는 동맥벽에서 진행하는 과정이다. 성숙 플라크(mature plaque)는 두 개의 기본 구조 즉 지질 코어 및 섬유상 캡(fibrous cap)으로 이루어진다. 지질 코어가 더 작고 섬유상 캡이 더 두꺼우면, 플라크는 더 안정하다. 이것은 파괴하는 성향 및 심근경색 또는 불안정한 협심증 원인이 감소 된다는 것을 의미한다. 급성 관상동맥 증후군 (예, 심근 경색 및 불안정한 협심증)의 원인이 되는 대부분의 플라크는 ＜70% 협착증을 갖는 것으로 혈관 조영적으로 나타났다(28, 29에서 검토됨). 이들 병변의 대략 60%는 (주로 대식세포, T세포, 오래된 출혈, 혈관신생 및 칼슘을 포함하는) 지질 및 괴사성 부스러기의 큰 혈관형성 코어를 갖는 플라크의 파열에 의해 원인이 된다. 파열 캡(ruptured cap)은 추측하건대 얇은데, 그 이유는 대식세포가 플라크에 걸쳐 이동함에 따라 소화하는 금속 프로테이나제를 분비하기 때문이며 또한 평활근 세포 (플라크의 지지부재)가 염증성 사이토카인 등의 여러 가지 인자들에 의해 원인이 된 노화 또는 세포사멸에 의하여 고갈되기 때문이다.
국제출원공개 WO 06/93932호는 개개의 혈청에서 에오탁신의 수준을 측정함으로써 아테롬성 동맥경화증의 검출 또는 진단 방법을 기술하고 있다. 이 출원은 혈청에서 상승된 에오탁신 수준의 검출이 증후군의 발병 전에 아테롬성 동맥경화증을 진단하는 수단을 제공할 수 있다는 것을 추가로 제안하고 있다.
상기 간행물들의 어느 것도 염증성, 자가면역 또는 심장혈관 증상을 치료하는 치료 개입을 위한 표적으로서 에오탁신-2을 교시 또는 제안하고 있지 않다.
본 발명은 염증성 질환, 예를 들어 류머티즈 관절염, 실험적 자가 면역성 뇌척수염(EAE), 대장염, 당뇨 및 아테롬성 동맥경화증의 동물 모델에서 현저한 예방 효과를 갖는다는 발견에 기초하고 있다. 이론에 의해 제한하고 싶지는 않지만, 상기 예방효과는 활성 염증성 세포 (림프구 및 단핵 세포)의 부착 및 이동 특성을 약화시킴으로써 적어도 부분적으로 개입할 수 있다. 따라서 본 발명은 염증성 및/또는 자가면역 질환을 치료하기 위하여 치료제를 개발하는 신규 표적으로서 에오탁신-2를 도입하고 있다. 본 발명은 또한 이러한 질환들의 치료에서 다른 치료제와 결합하여 또는 단독으로 사용되는 특이적 안티-에오탁신 2 항체를 제공한다.
염증성 및/또는 자가면역 질환은 예를 들면 건선, 염증성 장질환(IBD) (괴양성 대장염 및 크론병을 포함함), 류머티즈 관절염, 당뇨, 다발성 경화증, 전신홍반 루푸스(SLE), 피부 경화증 및 천포창(pemphigus)을 포함한다.
따라서 발명 양상의 첫 번째에 따르면, 본 발명은 하나 이상의 에오탁신-2 길항제 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 염증성, 자가면역 또는 심장혈관 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 상기 에오탁신-2 길항제는 안티-에오탁신-2 항체 또는 상기 항체의 결합 활성을 유지하는 그의 단편일 수 있다.
안티-에오탁신-2 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 특정의 실시양태에서 안티-에오탁신-2 항체는 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체이다.
특정한 구체 실시양태에서, 상기 안티-에오탁신-2 항체는 하이브리도마 D8 (ECACC 수탁번호: D809081702), 하이브리도마 G7, 또는 하이브리도마 G8 (ECACC 수탁번호: G80908170), 또는 상기 항체의 결합활성을 유지하는 그의 단편이다.
특정한 구체 실시양태에서, 상기 안티-에오탁신-2 항체는 다음 a) 내지 e)로 이루어진 그룹에서 선택된 모노클로날 항체이다:
a) 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 중쇄 및 서열번호 2와 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;
b) 서열번호 3과 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 중쇄 및 서열번호 4와 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;
c) 서열번호 5와 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 중쇄 및 서열번호 6과 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;
d) 하이브리도마 D8 (ECACC 수탁번호: D809081702), 하이브리도마 G7, 또는 하이브리도마 G8 (ECACC 수탁번호: G80908170)에 의해 분비된 모노클로날 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산과 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 중쇄, 및 하이브리도마 D8 (ECACC 수탁번호: D809081702), 하이브리도마 G7, 또는 하이브리도마 G8 (ECACC 수탁번호: G80908170)에 의해 분비된 모노클로날 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산과 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체; 및
e) 상기 항체의 결합활성을 유지하는 상기 a) 내지 d)의 항체의 특정한 단편.
또 하나의 실시양태에서, 에오탁신-2 길항제는 안티센스 분자 또는 에오탁신-2 mRNA에 대한 siRNA분자이다.
또 하나의 실시양태에서, 상기 에오탁신-2 길항제는 소분자 화학물질이다.
특정의 실시양태에서, 상기 염증성, 자가면역 또는 심장혈관질환은 아테롬성 동맥 경화증, 류머티즈 관절염, 염증성 장 질환, 다발성 경화증 및 당뇨로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 하나의 실시양태에서, 본 발명은 치료학적 유효 투여량의 에오탁신-2 길항제 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 염증성 또는 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 특정한 실시양태에 따르면, 상기 자가면역 질환은 류머티즈 관절염, 염증성 장질환 (예, 대장염), 다발성 경화증 및 당뇨로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서 본 발명은 치료학적 유효 투여량의 에오탁신-2 길항제 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 아테롬성 동맥 경화 플라크를 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 치료학적 유효 투여량의 에오탁신-2 길항제 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 아테롬성 동맥 경화 플라크를 안정화하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 치료학적 유효 투여량의 에오탁신-2 길항제 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 급성 관상동맥 증후군을 가진 환자의 주요 심혈관 사고를 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 또한 상기 에오탁신-2 길항제 또는 상기 약제학적 조성물을 하나 이상의 추가적인 치료제와 함께 투여함을 포함한다.
특정한 실시양태에 따르면, 상기 하나 이상의 추가적인 치료제는 화학요법제, 케모카인, 펩티드, 항체 및 항생제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
류머티즈 관절염의 치료에 있어서, 상기 추가적인 치료제는, 제한적이지 않지만, 메토트렉세이트(methotrexate), 스테로이드, 안티-TNFα항체, 안티 TNF 수용체 항체, 안티-IL6 수용체 항체, 또는 안티-CD20 항체를 포함한다.
IBD(염증성 장 질환)의 치료에 있어서, 상기 추가적인 치료제는, 제한적이지 않지만, 사이클로스포린, NSAIDS (비-스테로이드 항 염증약), 스테로이드, 또는 안티 TNF-항체 (예, Infliximab)를 포함한다.
다발성 경화증의 치료에 있어서, 상기 추가적인 치료제는, 제한적이지 않지만, 코파손(copaxone), 인터페론-베타, 정맥내 면역 글로불린(IVIG), 또는 VLA-4(예, Tysabri)에 대한 모노클로날 항체를 포함한다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 하나 이상의 추가적인 치료제는 상기 에오탁신-2 길항제 또는 상기 약제학적 조성물과 동시에 투여된다.
본 발명의 또 하나의 실시양태에 따르면, 상기 하나 이상의 추가적인 치료제 및 상기 에오탁신-2 길항제 또는 상기 약제학적 조성물은 연속적으로 투여된다.
또 하나의 양상에서, 본 발명은 안티-에오탁신 2 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주를 제공하며, 여기서 상기 하이브리도마는 D8 (ECACC 수탁번호: D809081702), G7 또는 G8 (ECACC 수탁번호: D809081701)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 에오탁신-2에 대한 모노클로날 항체, 또는 에오탁신 2에 대한 결합력을 유지하는 그의 특정한 단편을 제공하며, 여기서 상기 모노클로날 항체는 하이브리도마 D8 (ECACC 수탁번호: D809081702), G7, 또는 G8 (ECACC 수탁번호: D80908101)로부터 선택된다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 에오탁신-2에 대한 모노클로날 항체를 제공하며, 여기서 상기 항체는 다음 a) 내지 e)로 이루어진 그룹에서 선택된 모노클로날 항체이다:
a) 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 중쇄, 및 서열번호 2와 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;
b) 서열번호 3과 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 중쇄, 및 서열번호 4와 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;
c) 서열번호 5와 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 중쇄, 및 서열번호 6과 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;
d) 하이브리도마 D8 (ECACC 수탁번호: D809081702), G7, 또는 G8 (ECACC 수탁번호: D809081701)로부터 분비된 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산과 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 중쇄, 및 하이브리도마 D8 (ECACC 수탁번호: D809081702), G7, 또는 G8 (ECACC 수탁번호: D809081701)로부터 분비된 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산과 90% 이상의 상동성을 갖는 경괘를 포함하는 모노클로날 항체; 및
e) 상기 항체의 결합활성을 유지하는 상기 a) 내지 d)의 항체의 특정한 단편.
본 발명은 추가로 본 발명의 모노클로날 항체를 암호화하는 분리된 핵산 분자, 또는 그의 항원-결합 부분은 물론, 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
특정한 실시양태에서, 상기 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포주에서 복제할 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 또한 염증성 및 자가면역 질환의 치료에서 에오탁신-2 길항제의 용도를 포함한다. 하나의 실시양태에서 상기 에오탁신-2 길항제는 항체이다.
본 발명은 또한 염증성 및 자가면역 질환의 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조에서 에오탁신-2 길항제의 용도를 포함한다. 하나의 실시양태에서 상기 에오탁신-2 길항제는 항체이다.
본 발명은 에오탁신 2 (CCL24)에 특이적으로 결합하며 또한 그의 기능을 억제하는 항체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물 및 염증성, 자가면역 또는 심장혈관 질환을 치료하기 위한 그의 용도에 관한 것이다.
본 발명을 더욱 용이하게 이해하도록 하기 위해, 다양한 정의가 상세한 설명 전반을 통하여 기술된다.
하나의 양상에 따르면, 본 발명의 치료방법은 에오탁신 2의 활성 및/또는 발현을 감소시킬 수 있는 치료학적 유효량의 에오탁신-2 길항제를 이를 필요로 하는 환자에게 공급함으로써 수행하며, 이렇게 하여 환자의 염증성, 자가면역 또는 아테롬성 동맥경화 질환을 감소시킬 수 있다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "환자"는 본 발명으로부터 유용할 수 있는 대상 예를 들어 포유동물 (예, 개, 고양이, 양, 돼지, 말, 소 또는 인간)을 언급한다. 하나의 구체적 실시양태에서 상기 환자는 인간이다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "치료"는 에오탁신 2에 의해 매개되는 질환 또는 증상의 유해한 효과를 감소, 예방, 치유, 역전, 약화, 경감, 최소화, 억제 또는 정지하는 것을 언급한다.
용어 "에오탁신 2" (호산구 화학주성 단백질 2), "CCL24" (케모카인 (C-C모티프) 리간드 24) 또는 "MPIE-2" (골수계 전구세포 억제 인자 2)는 상호 교환적으로 사용되며 또한 인간 염색체 7에 위치한 인간 CCL24 유전자에 의해 암호화되며 또한 당해 분야에 공지된 CC 케모카인 패미리에 속하는 시토카인을 언급한다.
CCL24는 케모카인 수용체 CCR3과 상호작용한다. CCL24 활성은 호산구, 호염기구, T 림프구 및 호중구에서 화학주성의 유도는 물론, 내피 및 평활근 세포에서 혈관형성 및 이동 반응의 유도를 언급한다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "염증"은 병원체, 손상된 세포 (예를 들어 화상, 외상, 신생물 종양에 의해 원인이 됨) 등의 해로운 자극, 또는 화학물질, 가열 또는 냉각 등의 자극제에 대한 면역 시스템의 복합 생물학적 반응을 언급한다. 용어 "염증성 질환"은 제한되지 않지만 아테롬성 동맥경화증 및 다양한 자가면역 질환을 포함하는 염증과 관련된 질환을 언급한다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "아테롬성 동맥경화증" (또한 동맥경화성 혈관질환 또는 ASVD로도 알려져 있음)은 동맥벽이 콜레스테롤 등의 지방 물질의 축적으로 인해 두꺼워지는 병리학적 증상이다. 이 과정은 동맥의 벽에서 만성 염증성 반응의 결과이며, 이는 대부분 대식세포의 축적에 기인하며 또한 작용성 고밀도 지질 단백질(HDL)에 의해 대식세포로부터 지방 및 콜레스테롤의 적절한 제거 없이 저밀도 지질 단백질에 의해 촉진된다. 동맥의 이러한 경화 또는 퍼링(furring)은 동맥 내에 복수 개의 플라크의 형성에 의해 원인이 된다.
아테롬성 동맥경화 플라크 또는 죽종(arethoma)은 세포 (주로 대식세포)로 이루어진 동맥 벽, 또는 지질(콜레스테롤 및 지방산), 칼슘 및 다양한 량의 섬유상 결합조직을 함유하는 세포 파편의 축적 및 팽창이다. 동맥벽에서 죽종 및 변화는 통상 내강 직경의 변화없이 여분의 벽 두께를 보충하는데 충분히 긴 작은 동맥류 (확장)에 의해 생긴다. 성숙한 플라크는 두 개의 기본 구조 즉 지질 코어 및 섬유상 캡으로 이루어져 있다. 지질 코어가 더 작고 섬유상 캡이 더 두꺼우면 플라크는 더 안정하다. 이것은 그의 파열 성향 및 심근경색증 또는 불안정한 협심증 원인이 감소된다는 것을 의미한다. 급성 관상동맥 증후군 (예, 심근경색 및 불안정 협심증)의 원인이 되는 대부분의 플라크가 ＜70% 협착을 갖는 것으로 혈관 조영적으로 나타난다는 것은 명백하다(28, 29에서 검토됨). 이들 병변의 대략 60%는 지질 및 괴사 파편(주로 대식세포, T세포, 오래된 출혈, 혈관형성, 및 칼슘을 포함함)의 큰 혈전형성 코어를 가진 플라크의 파열에 의해 원인이 된다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "심장혈관질환"(CVD)은 심(심장) 및/또는 혈관(vascular)의 신체 시스템에 영향을 미칠 수 있는 질환을 언급한다. 대부분의 심장혈관 질환은 만성 증상 즉 장기간에 걸쳐 발전 또는 지속하는 증상을 반영한다. 그러나 심장혈관 질환의 결과의 일부는 심장 또는 뇌에 피를 공급하는 관이 차단될 때 갑자기 일어나는 심장 발작 또는 뇌졸중 등의 급성 사고일 수 있다. CVD는 또한 아테롬성 동맥 경화증, 관상 심질환(CHD) 및 관상동맥 질환(CAD) 즉 협심증 (불안정한 협심증 및 신규 발병 협심증을 포함함) - 격렬한 흉통 또는 심지어 심장발작 - 심근 경색, 및 ST- 또는 NON-ST 상승을 유도할 수 있는 심장에 공급하는 혈관의 질환을 포함한다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "자가면역 질환"(Autoimmune disease)은 체내에 정상적으로 존재하는 물질 및 조직에 대한 신체의 과잉 면역 반응으로부터 생기는 병리학적 증상을 기술한다. 면역 시스템은 병원체로서 신체의 일부에 오류가 생겨그것을 공격한다. 이것은 특정한 조직으로 제한될 수 있거나 또는 폐 및 신장에서 기저막에 영향을 미칠 수 있는 상이한 부위에서 특정한 조직을 포함할 수 있다. 자가면역 질환의 예는 적어도 모든 예시된 질환들 예를 들어 류머티즈 관절염, 다발성 경화증 및 대장염을 포함하며, 또한 두드러진 예는 다른 것들 중에서 복강질환, 당뇨병 타입I (IDDM), 전신홍반 루프스(SLE), 세그렌 증후군(Sjorgen's syndrome), 샤그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss Syndrome), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroditis), 그레브스병(Graves' disease), 건선, 염증성 장 질환 (궤양성 대장염 및 크론병), 피부경화증 및 천포창(pemphigus)을 포함한다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "에오탁신 2 길항제"(eotaxin-2 antagonist)는 에오탁신 2/CCL24와 상호작용하며 또한 사이토카인의 정상 활성 또는 발현을 차단 또는 억제하는 분자를 언급한다. 다수의 약제가 본 발명의 이러한 양상에 따라 사용할 수 있다. 따라서 예를 들면 상기 길항제는 에오탁신 2, 소분자 화학물질, siRNA, DNAzye, 리보자임, 또는 안티센스 폴리뉴클레오타이드의 활성을 억제하는 항체일 수 있다.
본 발명의 문맥에서 용어 "안티 에오탁신-2 항체"는 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 포함한다. 또한 상기 항체는 예를 들면 생쥐 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체 및 인간 항체일 수 있다. 상기 용어는 에오탁식 2, 예를 들어 단일 사슬 (SC) 항체, Fab, F(ab')2 또는 Fv 항체 단편은 물론 그의 임의 결합물에 결합할 수 있는 전체 항체분자는 물론 그의 작용성 단편을 언급한다.
혈청 면역 글로불린 ("폴리클로날 항체") 또는 그의 반응성 부분의 정제 방법은 황산 암모늄 또는 황산 나트륨에 의한 침전 이후에 투석, 이온 교환 크로마토그래피, 어피너티 크로마토그래피(affinity chromatography), 및 겔 여과를 포함하여 당해 분야에 잘 알려져 있다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"(또한 mAb 또는 moAb로도 명명됨)은 세포의 단일 클론에 의해 생산되는 동일한, 단일 특이적 항체를 언급한다. 모노클로날 항체를 생산 및 분리하는 방법은 예를 들어 이후의 실시예 부분에서 나타낸 바와 같이 당해 분야에 잘 알려져 있다. 본 발명은 또한 키메릭 또는 인간화 항체를 포함한다. 본 출원에서 사용되는 용어 "인간화 항체"(humanized antibody)는 인간 척추를 가지며 또한 비-인간-유도 상호보완 결정 영역들(CDRs)을 가지는 항체 또는 그의 단편을 언급한다. 비-인간 CDRs는 예를 들면 원하는 특이성, 친화성 및/또는 용량을 갖는 생쥐, 쥐, 토끼 또는 염소 항체로부터 얻을 수 있다. 특정한 실시양태에서, 추가적인 아미노산은 항체의 결합 특성을 개선하기 위하여 이들의 비-인간 대응물(non-human counterpart)로 인간 항체 골격에서 대체된다. 본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "키메릭 항체"(chimeric antibody)는 상이한 종으로부터 유래하는 폴리펩타이드를 함유하는 항체 또는 그의 단편이며, 예를 들면 항체의 마우스 Fc 영역을 인간의 것으로 대체하여 얻어진 마우스-인간 항체 키메라이다.
인간화 항체를 제조하는 방법은 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 인간화 항체는 적절한 CDR 코딩 세그먼트(원하는 결합 특성을 담당함)를 인간 항체 "골격" 내로 삽입함으로써 제조할 수 있다. 이것은 숙주 세포 (예, 포유동물 세포)에서 적절한 벡터 및 발현을 사용하는 재조합 DNA 방법을 통하여 달성된다. 즉, 원하는 특성을 갖는 모노클로날 항체가 마우스 (또는 다른 비-인간 동물)에서 발전된 후, 상기 항체를 코딩하는 DNA가 분리되어 벡터로 클론화 한 다음 배열된다. 이어서 항체 CDRs에 상응하는 DNA서열을 결정할 수 있다. 원하는 CDRs의 정확한 서열이 알려지면, 인간 항체 변이체용 DNA를 함유하는 구조물 내로 이들 서열을 적절하게 삽입하기 위한 전략을 고안할 수 있다.
본 발명은 추가로 에오탁신 2에 결합 활성을 유지하는 안티 에오탁신 2 항체의 단편을 포함한다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "Fab"는 항체 분자의 단일, 일가 항원-결합 단편을 함유하는 단편을 언급한다. Fab는 하나의 순수한 경쇄 및 일부의 중쇄를 포함하며 또한 파파인에 의한 전체 항체의 소화에 의해 생산할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "(Fab)2"는 전체 항체의 펩신 소화에 의해 얻어진 항체 단편을 언급한다. 펩신 소화는 Fc 부분에서 항체의 절단을 생기게 하며, 이것은 두 개의 Fab 단편 및 상기 Fab 단편의 작은 부분을 함유하며 또한 S-S결합에 의해 결합되는 2가 단편을 생기게 한다. "Fab"는 S-S결합의 절단(opening)을 생기게 하는 (Fab)2의 환원에 의해 얻어진다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "Fv"는 경쇄의 가변성 영역 및 중쇄의 가변성 영역을 함유하는 유전학적으로 고안된 단편을 언급한다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "단일 사슬 항체"는 적절한 링커 (예, 폴리펩티드)에 의해 결합된, 경쇄의 가변성 영역 및 중쇄의 가변성 영역을 함유하는 유전학적으로 고안된 분자를 언급한다. 단일 사슬 항체는 전형적으로 경쇄 및 중쇄 가변성 영역 및 링커를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 단일 폴리뉴클레오타이드를 발현함으로써 제조된다. 단일 사슬 항체를 제조하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면 미국특허 제4,946,778호 참조.
본 발명에 따른 항체 단편은 적절한 단백질 분해효소 예를 들어 파파인 또는 펩신을 사용하여 항체의 단백질 분해성 가수분해에 의하여, 또는 박테리아 (예, 이. 콜라이) 또는 포유동물 세포 (예, 중국 햄스터 오바리 (CHO) 세포) 등의 숙주 세포에서 항체 단편을 암호화하는 핵산의 재조합 발현에 의하여 제조할 수 있다.
본 발명의 항체는 발현 벡터를 사용하여 적절한 숙주 세포에서 항체를 암호화하는 핵산을 발현시켜 재조합으로 제조할 수 있다. 여기서 사용되는 바와 같은 용어 "발현 벡터"는 안티 에오탁신 2 항체 사슬을 암호화하는 유전자 정보를 세포에 전달할 수 있는 핵산 구조물을 언급한다. 삽입(insert)은 표적 세포에서 발현되며, 항체가 생산되고 또한 세포의 매체에 분비되거나 또는 세포로부터 직접 추출된다. 벡터는 다양한 기원, 예를 들면, 제한되지 않지만, 플라스미드, 박테리오파지 및 다른 바이러스, 코스미드(cosmids), 및 인공염색체일 수 있다. 전형적으로, 고안된 벡터는 복제의 기원, 클로닝 부위, 선택적 마커 및 본 발명의 항체를 암호화하는 이종 핵산을 포함한다. 바이러스성 벡터는 일반적으로 감염되지 않은 변형된 바이러스성 DNA 또는 RNA를 갖는 유전적으로 고안된 바이러스이지만, 바이러스성 프로모터 및 이종 핵산을 포함하며, 따라서 바이러스성 프로모터를 사용하여 이종 핵산의 번역을 가능하게 한다. 바이러스성 벡터의 비제한적인 예는 재조합 레트로바이러스 (렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노-연합된 바이러스, SV40, 헤르페스 심플렉스(Herpes Simplex) 및 백시니아 바이러스이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 또한 본 발명의 항체를 포함하는 면역 결합체 및 이중 특이성 분자를 포함한다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "안티센스 치료법"(antisense therapy)은 특정한 질환에 영향을 미치는 것으로 알려진 유전자의 발현의 억제를 포함하는 치료 형태를 언급한다. 본 발명의 문맥에서, 안티센스 치료법은 에오탁신 2 mRNA의 발현의 억제를 목적으로 한다. 따라서 안티센스 치료법은 에오탁신 2 mRNA의 서열에 상보적인 핵산의 가닥 (DNA, RNA 또는 화학적 유사물), 또는 그의 단편(안티센스올리고뉴클레오타이드)의 합성을 수반하며, 이는 유전자에 의해 생산된 메신저 RNA (mRNA)에 결합하고, 유전자를 비활성화하고, 유전자를 "off"로 효과적으로 변할 것이다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "siRNA"(Small interfering RNA) (또한 짧은 간섭 RNA 또는 사일런싱 RNA로도 알려져 있음)은 생물학에서 다양한 역할을 하는 이중 가닥 RNA 분자의 부류, 전형적으로 길이 20-25 뉴클레오타이드이다. 가장 두드러지게는, siRNA는 특이적 유전자의 발현을 간섭하는 RNA 간섭 (RNAi) 경로에 관여한다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "소분자 화합물질"(small molecular chemical)은 유기 화합물을 언급한다. 소분자에 대한 분자량 상한은 대략 800 달톤이다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "메토트렉세이트"(methotrexate)는 암 및 자가면역 질환의 치료에 사용되는 항대사물질 및 엽산길항제(antifolate drug)를 언급한다.
본 발명의 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 경구투여, 즉 피하, 근육내 및 정맥내 투여에 유용하다. 경구 투여용 조성물은 흔히 허용 가능한 담체 또는 부형제, 바람직하게는 수성 담체에 용해된 항체를 포함한다. 다양한 수성 담체, 예를 들면 물, 완충수, 염수, PBS(인산 완충염류 용액) 등을 사용할 수 있다. 이들 용액은 멸균성이며 또한 일반적으로 특별한 물질을 함유하지 않는다. 본 조성물은 pH 조절 및 완충제, 독성 조절제 등, 예를 들면 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소듐 락테이트, 히스티딘 및 아르기닌 등의 적절한 생리학적 조건에 필요한 약제학적으로 허용되는 보조물질을 함유할 수 있다.
경구투여용 조성물의 제조방법은 당해 분야의 기술자들에게 공지 또는 자명하며 또한 예를 들면 Remington's Pharmaceutical Science (15th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa, 1980)에 더욱 자세하게 기술되어 있다.
본 발명의 항체는 저장을 위해 냉동 또는 동결건조하여 사용 전에 적절한 담체에 재구성할 수 있다. 이 기술은 통상적인 면역 글로불린 및 공지된 동결건조에 효과적인 것으로 나타났으며 또한 재구성 기술이 사용될 수 있다.
치료 목적을 위하여, 조성물은 증상 및 그의 합병증을 치료하거나 적어도 부분적으로 경감하는데 충분한 량으로 투여한다. 이것을 수행하기 위하여 적합한 량은 "치료학적으로 유효 투여량"으로 정의된다. 이러한 용도로 유효한 량은 증상의 중증도 및 환자 자신의 면역 시스템의 일반적 상태에 따라 달라지지만, 일반적으로 투여량 당 항체 약 0.01 내지 약 150mg 범위이다. 일일, 주마다 또는 월마다 계획에 대한 단일 또는 복수 투여는 치료하는 의사에 의해 선택되는 투여량 수준 및 양상으로 수행할 수 있다.
본 발명에 따르면, 염증성, 자가면역 및 심장혈관 질환의 치료에 유용한 에오탁신-2(CCL24) 억제제, 특히 에오탁신-2 폴리클로날 또는 모노클로날 항체가 제공된다.
본 발명을 이해하고 또한 실제로 실시하는 방법을 알기 위하여,이하에 첨부한 도면을 참조하여 비-제한적인 실시예에 의거하여 실시양태들을 설명할 것이다.
도 1은 에오탁신-2 대 에오탁신에 안티 에오탁신-2mAb(D8)의 결합을 나타내는 그래프이다. 그 결과는 405nm에서 광학밀도(OD) 해독 값으로 나타낸다. 다양한 항체 농도 (5μ/㎖ 내지 50μ/㎖ 사이)가 측정되었다.
도 2A는 D8-처리 세포의 파이브로넥틴에 결합 정도를 나타내는 그래프이다. 그 결과는 마우스 IgG로 처리한 대조 세포에 비하여 부착 백분율(percentage adhesion)로 나타낸다. 3가지 유형의 세포, 즉 마우스 비세포, 래트 비세포 및 인간 PBMC를 시험하였다.
도 2B는 D8-처리 세포의 VEGF에 대한 이동성을 나타내는 그래프이다. 그 결과는 마우스 IgG(50㎍)로 처리한 대조 세포에 비하여 백분율 이동성(percentage migration)으로 나타낸다. 그래프는 다양한 D8 량(12.5, 25 및 50㎍)을 사용하여 래트 비세포 및 인간 PBMC로 얻어진 결과를 입증한다.
도 3A는 질병의 발병으로부터 시간 함수로서 래트의 관절염 스코어 (AS) (±표준오차)에 대한 안티-에오탁신-2 모노클로날 항체 (G7, G8, D8), IgG 및 PBS로 처리한 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3B는 래트의 이동성 스코어(±표준오차)에 대한 안티-에오탁신-2 모노클로날 항체 (G7, G8, D8), IgG 및 PBS로 처리한 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3C는 발목 직경(mm)(±표준오차)에 대한 안티-에오탁신-2 모노클로날 항체 (G7, G8, D8), IgG 및 PBS로 처리한 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4A는 PBS, IgG, D8, G7 및 G8 항체로 처리한 래트로부터 관절의 조직학적 스코어를 나타내는 그래프이다.
도 4B 및 4C는 D8 (도 4B) 또는 PBS (도 4C)로 처리한 래트로부터 관절의 대표적 외관을 나타내는 사진이다 (헤마토실린 에오신 (H&E) 염색).
도 5는 시간(일)의 함수로서 아주반트 유도 관절염 (±표준오차)을 갖는 래트의 중량(그램)에 대한 안티-에오탁신-2 모노클로날 항체 (G7, G8, D8), IgG 및 PBS로 처리한 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6A는 시간(일)의 함수로서 아주반트 유도 관절염 (±표준오차. 백분율)에서의 관절염 스코어 (AS; Y 축)에 대한 3개의 투여량(20㎍, 100㎍ 및 1000㎍)에서 예방 모드에서 안티-에오탁신-2 D8 항체의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6B는 시간(일)의 함수로서 아주반트 유도 관절염 (±표준오차)에서의 관절염 스코어 (AS; Y 축)에 대한 3개의 투여량(20㎍, 100㎍ 및 1000㎍)으로 치료 모드에서의 안티-에오탁신-2 D8 항체의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 시간(일)의 함수로서 예방 모드(±표준오차)에서 아주반트 유도 관절염에서의 관절염 스코어에 대하여, PBS-처리 대조군과 비교하여, D8 (100㎍), 메토트렉세이트(0.25mg/kg) 및 D8 100㎍과 결합된 메토트렉세이트의 예방효과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 PBS (도 8A) 및 D8 (도 8B)로 처리된 래트로부터 관절의 사후 x-선 분석 사진이다. 강한 관절 주위 연부조직 부기는 PBS 처리 래트(별표)에서 명백할 뿐만 아니라 발목관절(화살표 머리)에서 탈석회화 및 조기 골침식에서 명백하다(대표 도면).
도 9A는 시간(일)의 함수로서 DSS-유도 대장염을 가진 마우스의 % 중량손실/증가를 입증하는 그래프이다. 마우스는 5㎕ 또는 25㎕의 안티-에오탁신-2 항체 D8로 처리하였다. 대조 동물은 PBS 또는 IgG로 처리하였다.
도 9B는 DSS-유도 대장염을 가진 마우스의 % MPO 활성을 입증하는 그래프이다. 마우스는 5㎕, 25㎕, 100㎕ 또는 200㎕의 안티-에오탁신-2 항체 D8로 처리하였다. 대조 동물은 PBS 또는 IgG로 처리하였다.
도 9C는 안티-에오탁신-2 항체 D8(5㎍) 또는 대조군(PBS)로 처리된 DSS-유도 대장염을 가진 마우스의 혈청에서 다양한 사이토카인 (IL-10, IL-12p70, IL-6, MCP-1(단핵세포 화학유인성 단백질-1) 및 TNF)의 수준을 입증하는 그래프이다.
도 9D는 5㎕, 25㎕, 100㎕ 또는 200㎕의 안티-에오탁신-2 항체 D8로 처리된 DSS-유도 대장균을 가진 마우스의 대장의 조직학적 분석을 나타내는 그래프이다. 대조동물은 PBS 또는 IgG로 처리하였다. [I]는 병변의 정도(크기)를 나타내며; [II]는 염증(염증성 세포 침윤)을 나타내며; 또한 [III]은 손상(조직 파괴)를 나타낸다.
도 10은 PBS, IgG, 안티-에오탁신-2 항체 D8 (25㎍) 또는 안티-에오탁신-2 항체 D8 (100㎍)로 처리된, 유도 EAE를 가진 마우스에서 시간의 함수로서 질병 중증도의 평균을 나타내는 그래프이다.
도 11A는 PBS, 또는 안티-에오탁신-2 항체 (D8)로 처리된, NOD 마우스에서 시간의 함수로서 질병 빈도(당뇨 마우스의 백분율)을 나타내는 그래프이다.
도 11B는 PBS, 또는 안티-에오탁신-2 항체 (D8)로 처리된, NOD 마우스의 혈청에서 에오탁신-2 수준(pg/ml)을 나타내는 그래프이다.
도 12A는 안정 대 불안정 플라크에서 염증성 인자의 발현의 정량적 분석을 나타내는 그래프이다. 4개의 플라크는 각각의 그룹에서 분석하였다.
도 12B는 대표적인 예를 제공하는 영상이다.
도 13은 생쥐 죽종에서 에오탁신-2의 면역 조직화학적 국소화를 입증하는 영상이다. 도 13A는 특징적 지방선조(AHA 클래스 I-II)를 나타내며, 도 13B는 중간 플라크(AHA 클래스 II)를 나타내며, 도 13C는 아테롬성 병변 (AHA 클래스 III-IV)를 나타내며 또한 도 13D는 관련 없는 IgG로 염색된 음성 대조군을 나타낸다. 두꺼운 화살표는 에오탁신-2에 양성인 대표적인 내피 세포를 나타내는 반면, 얇은 화살표는 플라크 대식세포 내에서 각각의 염색을 나타낸다.
도 14A는 어린 및 어른 KO ApoE 마우스의 대동맥에서 에오탁신-2 및 TGFβ mRNA 발현을 입증하는 겔의 영상이다. 도 14B는 oxLDL로 배양된 생쥐의 H5V 내피세포에서 에오탁신-2 및 TGF-베타 mRNA의 발현을 나타내는 겔의 영상이다.
도 15A는 내피 상에 단핵세포 (비세포)의 부착에 대한 에오탁신-2 차단의 효과를 나타내는 그래프이다. 도 15B는 거의 유사한 프로토콜에서 단핵구-대식세포주로 수행한 대표적인 결과를 나타낸다.*p＜0.05
도 16A은 안티 에오탁신-2 항체로 4주간 처리에 대한 반응에서 병변(플라크) 크기를 나타내는 그래프이다. 도 16B는 안티 에오탁신-2 항체로 10주간 처리에 대한 반응에서 병변 크기를 나타내는 그래프이다. 도 16C는 안티-에오탁신-2 항체로 10주간 처리에 대한 반응에서 % 섬유상 영역을 나타내는 그래프이다.*p＜0.01; **p＜0.05.
도 17은 에오탁신-2에 대한 차단 항체로 처리한 apoE 마우스로부터 대표적인 부분의 영상이다. 도 A-C는 각각 PBS, 대조 IgG, 에오탁신-2 ab 처리로부터 대표적인 오일-적색 O 염색된 지방 선상 병변을 나타낸다. 도 17D-F는 유사한 마우스 그룹으로 더 긴 처리 연구에서 더 진행된 병변의 유사한 평가를 나타낸다. 도 17 G-I 및 J-L은 각각 PBS, 대조 IgG-2 항체 처리로부터 마손 삼색형(Masson's trichrom) 및 본 기손(von Giesson) 조직화학적 (각각) 연구를 나타낸다.
실시예
모노클로날 항체의 제조
mAbs의 여러 가지 클론은 표준 프로토콜에 따라 제조된다. 요컨대, Balb/C 마우스는 20㎍의 에오탁신-2 (Peprotec, 미국)로 면역화한 다음 4개의 추가적인 부스트(boost)로 면역화한다. 혈청에서 폴리클로날 안티-에오탁신-2 Abs의 존재를 확인한 후, 마우스를 희생시키고, 세포를 이들의 비장으로부터 분리하고 또한 NS/0 골수종 라인으로 교잡시킨(hybridize) 다음, 에오탁신-2에 결합을 위해 클론 스크리닝을 한다. 이어서 하이브리도마는 혈청 불함유 배지에서 2-3주간 성장시키고, 배지를 수집하고 100 kDa 센트리콘(Biological Industries, 이스라엘)로 농축시켰다. 생쥐의 에오탁신-2로 mAbs (D8)의 하나의 교차 반응성은 ELISA로 확인하였다.
다음의 프라이머들은 모노클로날 항체 D8, G8 및G7의 핵산 서열을 측정하는데 사용하였다.
중쇄 (IgG 감마-1):
전방향(서열번호 7):
5'CGAAGAGACAGTGACCAGAGTCCCTTGGCCCCAGTAAGCAAAGCTATTAC
CGAAGGTACAGTAATACACGGCCGTGTC 3'
역방향 (서열번호 8):
5' CGGGGAAGTAGTCCTTGACCAGGC 3'
경쇄(Kappa):
전방향 (서열번호 9):
(변성) 5' RR HRYY BWDMTVACHARWC 3'
또는 (서열번호 10):
5' GATGTCTTGTGAGTGGCCTCAC 3'
역방향 (서열번호 11):
5' TGGGATAGAAGTTATTCAGCAGGC 3'
결합 분석( binding assay )
플레이트는 4℃에서 하룻밤 1μ/㎖의 에오탁신 또는 에오탁신-2 (버퍼 카보네이트 중)로 코팅하였다. 플레이트는 PBS로 3회 세척하고 37℃에서 45분간 2%BSA로 차단시켰다. 안티 에오탁신-2 항체 (D8 클론)은 37℃에서 1.5시간 PBS 중에 단계 희석을 하였다. 세척은 상기 지시한 바와 같이 반복하였으며 또한 플레이트는 염소 안티-마우스 퍼옥시다제 결합 항체로 37℃에서 1시간 배양하였다. 세척은 상기와 같이 반복하고 결합은 비색분석 기질을 사용하여 검출하였다.
비세포 부착분석
부착분석(adhesion assay)에서, C57B1 마우스 및 루이스 래트 비세포는 피콜 그라디언트(ficoll gradient)상에 분리하고 하룻밤 배양 중에 10cm 접시에 플레이트 하였다. 다음날 세포들을 수확하고 D8 또는 총 마우스 IgG (5-50ug/ml)의 증가하는 농도로 2시간 동안 회전시키면서 예비 가열하였다. 이어서 세포들은 원심분리하고 피브로넥틴으로 예비 피복된 96-웰 플레이트 상에 플레이트 하였다. 1시간 배양 후, 비부착 세포는 세척하여 제거하고 부착세포의 양은 XTT 키트 (Biological Industries, 이스라엘)을 사용하여 분석하였다. 유사한 부착 분석은 건강한 기부자로부터 수집된 말초혈액 단핵 세포 (PBMCs)를 사용하여 수행하였다.
이동성 분석
C57B/6J-유도 비세포는 물론, 래트 비세포 및 D8(30ug/ml)로 예비 가열된 인간 PBMCs를 트랜스-웰 시스템의 상부 챔버 상에 플레이트 하였다. 하부 챔버는 VEGF (혈관 내피 성장인자) (20ng/ml)로 보충된 혈청 불-함유 배지를 함유하였다. 4시간 후 하부 챔버 중의 배지를 수집하고 유동세포분석법(분마다 수집된 세포의 수)을 사용하여 세포들 계산하였다.
플라크 및 심혈관 in vitro 연구
I. 인간 카로티드 플라크 제조 및 단백질 어레이
인간 아테롬성 동맥경화 플라크는 두 개 그룹의 환자들로부터 회수하였다. 안정한 플라크(n-4)는 무증상 심한 카로티드 아테롬성 동맥경화증을 가진 환자의 동맥내막 절제 시료로부터 입수하였다. 대표적인 불안정 플라크는 급성 심근경색증(n=4)을 가진 환자들로부터 책임 혈관(culprit vessel)의 경피 혈관 형성시 얻어진 시료이었다. 혈전제거(thrombectomies)는 전용 흡인장치에 의해 수행하였다. 얻어진 물질은 책임 동맥으로부터 불안정 플라크의 적색 혈전, 백색 혈전 및 단편으로 구성되어 있다. 세척 및 용균(lysis) 후, 나머지 조직은 주로 아테롬성 경화 파열 플라크의 단편들을 포함한다.
RayBio™ 인간 염증성 항체 어레이 3.1 (Ray Biotech, 미국)은 안정 및 불안정 인간 플라크에서 40개 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자들의 검출에 사용하였다. 요컨대, 플라크는 펠렛 유봉(pellet pestle)을 사용하여 키트 내에 제공된 용균 버퍼 내에서 균질화 하였다. 어레이(array)는 각각의 샘플 단백질 500mg으로 배양하고, 제조업자의 지침에 따라 진행하였다. 결과들은 TINA 2.0 프로그램을 사용하여 분석하였다.
II . 모세관 세포
생쥐 모세관 세포(H5V)는 10% 소태아 혈청(FCS) (Invitrogen) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 설페이트 (Biological Industries, 이스라엘)로 보충된 DMEM F- 12 (Biological Industries, 이스라엘)중에 배양하였다. 세포들은 8% CO2를 가진 습윤 배양기에서 37℃로 유지시켰다. 모노사이토이드 U937 세포는 106 cells/ml의 농도로 10% FCS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 설페이트를 함유하는 완전 배지 RPMI 1640에서 배양하였다. 세포들은 5% CO2 습윤 배양기에서 37℃에서 유지시켰다.
III . 내피세포에 의한 부착 분석
부착 분석에서, H5V 마우스 내피세포는 oxLDL, lμg/ml (전술한 바와 같이 제조, 33)의 존재하에 72시간 동안 배양하였다. 이어서 세포를 oxLDL, lμg/ml의 존재하에 농도 4 x 103 세포/웰에서 96웰 플레이트 중에 하룻밤 플레이트 하였다. 다음날, ApoE 마우스로부터 U937 세포 또는 비장 유도 림프구를 8 x 104/웰의 농도로 첨가하기 전에 1시간 동안 중성화 염소 안티 마우스 에오탁신-2 항체 (Cytolab, 미국) 또는 염소 IgG로 세포들을 예비 가열하였다. 1시간 배양 후에, 비-부착세포들은 세척하여 제거하고 부착 세포의 량은 XTT 키트(Biological Industries, 이스라엘)을 사용하여 분석하였다.
IV . 대동맥 및 H5V 내피세포의 PCR 분석
조직시료 및 H5V 내피세포로부터 RNA는 제조업자의 프로토콜에 따라 EZ-RNA 키트(Biological Industries, 이스라엘)을 사용하여 구아니디늄 티오시아네이트 및 페놀 클로로포름 방법에 의해 분리하였다. RT-PCR은 통상적인 써모사이클러(thermocycler) 중의 AMV 리버스 트랜스크립타제(TaKaRa RNA PCR kit, Takara, 일본)을 사용하여 수행하였다. 특이적 유전자 증식은 핫 스타 TaKaRa Ex Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 수행하였다. 인트론 배열을 가교하는 특이적 프라이머는 에오탁신-2 및 TGF-베타의 마우스에 대해 고안하였다 (표 1). 다음의 PCR 조건들은 G3PDH 및 TGF-베타의 증식을 위해 사용하였다: 95℃에서 시료를 2분간 배양한 후 95℃에서 30초간, 55℃에서 45초간 및 72℃에서 1분간으로 이루어진 27 사이클(G3PDH) 또는 35 사이클(TGF 베타). 터치다운 PCR 증식 프로토콜은 에오탁신-2 mRNA 발현의 분석 즉 시작 온도 70℃ 및 60℃의 어닐링 온도에서 30 사이클 동안 증식을 위해 사용하였다. PCR 시료는 Gelstar Nucleic Acid Stain (Gambrex, 미국)으로 염색된 2% 아가로즈 겔에 대해 수행하였고, PCR 생성물은 300 nm UV 투조기(transilluminator)로 가시화하고 또한 Polaroid 카메라 시스템으로 사진을 찍었다. 분리된 RNA의 유전체 염색의 부재는 역전사(reverse transcription) 전에 정제된 RNA 시료에 대한 글리세랄데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제(G3PDH) PCR 반응을 수행하여 확인하였다. 핵산분해효소 불-함유 물의 음성 대조군은 모든 시료 수행과 함께 포함되었다. 각각의 RNA 시료는 여러 번 분석하였다.
V. 대동맥동( aortic sinus )의 면역조직화학적 분석
대동맥동의 저온조 부분(두께 5μm)은 간접적 면역 퍼옥시다제 염색을 사용하여 평가하였다. 이어서 슬라이드는 메이어 헤마토실린(Mayer's hematoxylin)으로 대비 염색하고 글리세롤(Daka)을 설치하였다. 면역 조직화학적 염색은 어피너티 정제된 염소 안티-생쥐 에오탁신-2(Cytolab, 이스라엘)을 사용하여 수행하였다.
통계적 분석
그룹들 사이의 비교는 원-웨이 아노바 시험(one-way Anova test)으로 행하였다. P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 결과는 평균 및 표준오차로 표현된다.
실시예 1: 안티 에오탁신-2 mAb(D8)의 특이성 및 항염증성 효과
안티 에오탁신-2 생쥐 모노클로날 항체(mAbs)의 여러 클론들은 상술한 바와 같이 제조하였다.
D8 항체 중쇄를 암호화하는 핵산 서열은 다음 서열번호 1로서 나타낸다. 서열번호 1:
GGGCAGCAGANCCGGGGCNGNGGATAGACAGANGGGGGNNGNCGTTTTGGCTGA
GGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTGACCCCAGTTGTCCATAGCGTAGCTACTACCGTAGGA
ATGACTTGCACAGAAATATG
TAGCCGTGTCCTCATTTCTGAGGTTGTTGATCTGCAAATAGGCAGTGCTGGCAGAGGTTTC
CAAAGAGAGGGCAAACCGT
CCCTTGAAGTCATCAGTATATGTTGGCTCTCCATTGTAGGTGTTGATCCAGCCCATCCACTT
TAAACCCTTTCCTGGAGC
CTGCTTTACCCAGTTCATTCCAGAGTTTGTGAAGGGATACCCAGAAGCCCTGCAGGAGATC
TTGACTGTGTCTCCAGGCT
TCTTCAGCTCANGTCCAGACTGCACCAACTGGATCTGGGCCATGGCCNGCTA
D8 항체 경쇄(kappa)를 암호화하는 핵산 서열은 다음 서열번호 2로 나타낸다. 서열번호 2:
GGGCCAATGGNNGAGGACGCGGATGGGGGTGTCGNNGTGC
CTTNGTCGNNNNCTNNTTGNNCANCNTCNACNNCNNNNANNNNANNGNNNNNTGNAANA
NNGATGGNNNTNNNCNACANN
NTGGNNTCCTNNNNNNNTNNNNTGNNNNNGACNNCANANACANNNNCNACNNNATGANC
NNCNNNCNNNNNTTGANNNNN
GNCNANTATGAACNANNNAANNNNNNTACCTGNNANGCCACTCACAAGACATCA
G8 항체 중쇄를 암호화하는 핵산 서열은 다음 서열번호 3으로 나타낸다. 서열번호 3:
GGGCAGCAGNTCCAGGGGCCAGNGGATAGACAGANGGGGGNGTCGTTTTGGCTG
AGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTGACCCCAGTTGTCCATAGCGTAGCTACTACCGTAGG
AATGACT
TGCACAGAAATAT
GTAGCCGTGTCCTCATTTCTGAGGTTGTTGATCTGCAAATAGGCAGTGCTGGCAGAGGTTT
CCAAAGAGAGGGCAAACCG
TCCCTTGAAGTCATCAGTATATGTTGGCTCTCCATTGTAGGTGTTGATCCAGCCCATCCACT
TTAAACCCTTTCCTGGAG
CCTGCTTTACCCAGTTCATTCCAGAGTTTGTGAAGGGATACCCAGAAGCCCTGCAGGAGAT
CTTGACTGTGTCTCCAGGC
TTCTTCAGCTCAGGTCCAGACTGCACCAACTGGATCTGGGCCATGGCCGGCTANN
G8 항체 경쇄(kappa)를 암호화하는 핵산 서열은 다음 서열번호 4로 나타낸다. 서열번호 4:
GGGCCAATGGNNGAGGACGCGGATGGGGGTGTCGNNGTGCCT
TNGTCGNGTGCTTNTTGAACAACTTCTACCCCNNANACNTNANNGTNNNNTGGAANATTG
ATGGCNGTGAACGACAAAAT
GGCGTCCTGAACANTTGGACTGATCCANGACAGCAAANACANCNCCTACAGCATGAGCAG
CACCCTCACGTTGACNNNNG
ACNANTNTGAACGACGTANNNNCNNTACCTGTNANGCCACTCACAAGACATCA
G7 항체 중쇄를 암호화하는 핵산 서열은 다음 서열번호 5로 나타낸다. 서열번호 5:
GGGCAGCAGNTCCAGGGGCCAGNNGGATAGACAGANGGGGGNGNCGTTTTGGCT
GAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTGACCCCAGTTGTCCATAGCGTAGCTACTACCGTAG
GAATGACTTGCACAGAAATA
TGTAGCCGTGTCCTCATTTCTGAGGTTGTTGATCTGCAAATAGGCAGTGCTGGCAGAGGTT
TCCAAAGAGAGGGCAAACC
GTCCCTTGAAGTCATCAGTATATGTTGGCTCTCCATTGTAGGTGTTGATCCAGCCCATCCA
CTTTAAACCCTTTCCTGGA
GCCTGCTTTACCCAGTTCATTCCAGAGTTTGTGAAGGGATACCCAGAAGCCCTGCAGGAG
ATCTTGACTGTGTCTCCAGG
CTTCTTCAGCTCAGGTCCAGACTGCACCAACTGGATCTGGGCCATGGCCGGCTANN
G7 항체 경쇄(kappa)를 암호화하는 핵산 서열은 다음 서열번호 6으로 나타낸다. 서열번호 6:
GGGCCTTTGGNNGAGGACGCGGATGGGGGTGTCCNNGTGCCT
TNGTCGNGTGCTTNTTGAACAACTTCTACCCCNNANACNTNANNGTNNNNTGGAANATTG
ATGGCNGTGAACGACAAAAT
GGCGTCCTGAACANTTGGACTGATCCANGACAGCAAATACANCNCCTACAGCATGAGCAG
CACCCTCACGTTGACNNNNG
ACNANTNTGAACGACGTANNNNCNNTACCTGTNANGCCACTCACAAGACATCA
상기 핵산 서열에서 문자 N은 뉴클레오티드 A, T, C 또는 G의 어느 것의 존재를 나타낸다.
D8 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 2009년 8월 17일 수탁번호 D809081702로 영국 윌쯔셔, 살리스버리, 유럽 세포배양 컬렉션(ECACC)에 기탁하였다.
G8 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 2009년 8월 17일 수탁번호 G809081701로 ECACC에 기탁하였다.
신규한 안티 에오탁신-2 항체(D8)의 특이성은 결합분석에서 평가하였다. 클론 D8에서 생산된 mAbs의 계열 희석액은 하룻밤 배양을 위해 에오탁신 또는 에오탁신-2로 피복된 플레이트에 첨가하였다. 세척 후에, 상기 플레이트는 염소 안티-마우스 퍼옥시다제 결합 항체로 배양하고, 다시 세척하고 열량측정 기질을 사용하여 결합을 탐지하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, 클론 D8의 mAbs는 시험 희석의 모든 범위에서 에오탁신-2에 현저한 결합을 나타내고 또한 에오탁신에 결합은 없었다.
항체는 또한 피브로넥틴에 생쥐 또는 래트 비세포의 부착을 억제할 수 있는 이들의 능력 또는 VEGF를 향한 이들의 이동을 약화할 수 있는 능력을 시험하였다. D8 (50μg)은 피브로넥틴(FN)에 생쥐 및 래트 비세포는 물론 인간 PBMCs의 부착을 35-55%까지 억제하는 것으로 나타났다 (도 2A).
VEGF를 향한 이행성은 투여량 의존 방식으로 약화하였으며 (도 2B), 이는 항체의 잠재적 항-염증성 효과를 확인하였다.
실시예 2: 클론 D8 mAb (in vivo 데이터)의 항-염증성 잠재성
A. 류머티즘 관절염 모델
아주반트 관절염(Adjuvant arthritis)은 불완전한 프레운드 아주반트(Freund's adjuvant)의 주입에 의해 루이스 래트(이스라엘, 하란으로부터 입수한 6주령 수컷 루이스 래트)에서 유도하였다. 프레운드 불완전 어주반트는 10 mg/ml에서 광물유 중에 가열-사멸된 Mycobacterium Tuberculosis (딥코, 디트로이트, MI)를 현탁시켜 제조하였다. 래트는 꼬리의 기저에서 100㎕ 아주반트로 피부내 주사하였다. 관절염을 10일 후 주사에 의해 진전되었다.
아주반트 유도 관절염에 대한, 대조군으로서 비특이적 TgG 및 PBS 와 비교하여, 안티 - 에오탁신 -2 항체의 효과의 평가:
래트 (그룹 당 8 마리)는 에오탁신-2, (G7, G8, D8)에 대한 모노클로날 항체 3 X/주로 복강내 주사(IP)로 처리하였다. 대조군은 전체 마우스 (비특이적) IgG 또는 PBS로 처리하였다. 주사는 아주반트 투여 후 3일에 개시하였으며 또한 래트가 희생될 때까지 1주일에 3번 수행하였다.
투여량 반응 실험:
제2 세트의 실험에서, D8, 즉 아주반트 유도 관절염 모델에서 가장 좋은 예방 결과를 나타내는 안티-에오탁신-2 항체는 투여량 반응 모델에서 시험하였다. 어주반트 관절염은 상술한 프로토콜에 따라 유도하였다. 동물(아암 당 6마리 래트)은 어주반트 주사 3일 후 개시하여, 일주에 3회씩 20μg, lOOμg 또는 1000μg의 투여량으로 D8로 복강내 처리하였다(D8 예방 그룹). 별도 세트의 동물(각 그룹에서 6마리)은 관절염 발병 후, 즉 관절염이 이미 명확해졌을 때 동일한 투여량으로 처리하였다(D8 처리 그룹).
D8의 항-염증성 효능을 종래의 항-염증성 약제의 공지된 효능과 비교하기 위하여, 하나의 그룹은 아주반트 주사 후 3일에 시작하여 일주에 한 번씩 메토트렉세이트 (ip) 0.25mg/kg으로 처리하였다 (메토트렉세이트 예방 그룹). 추가적인 그룹은 3일에 시작하여, 일주에 3회씩 D8 100㎍ (ip 주사)와 결합되게, 일주에 한 번씩 메토트렉세이트 0.25 mg/kg으로 처리하였다 (결합 D8-메토트렉세이트 예방그룹). 대조 그룹은 실험 전반을 통하여 PBS로 처리하였다.
관절염 중증도의 평가:
관절염 중증도는 체중, 다리 부기(Paw swelling), 관절염 스코어 및 전체 동물 이동성을 측정하여 평가하였다. 시료 관절은 병리학적 평가를 위해 얻었으며 또한 발목 관절의 사후검사 X-선은 침식(erosion)을 문서화하여 수행하였다.
체중 (그램)은 전신 염증의 지표로서 모든 다른 날에 측정하였다.
다리 부기의 평가: 발목 및 팔목 직경 (mm)(소수점 이후 한 자리까지)는 지름자(caliper)를 사용하여 일주에 3회 기록하였다.
관절염 스코어 측정: 각각의 다리는 부기, 홍반 및 변형의 정도에 대해 0-4의 규모로 다음과 같이 점수화하였다 (동물당 최대 스코어 16은 모두 4개 다리를 나타냄). 0 = 정상, 1 = 약간 홍반 및/또는 발목 또는 손목의 부기, 2 = 적당한 홍반 및/또는 발목 또는 팔목의 부기, 3 = 심한 홍반 및/또는 발목 또는 손목의 부기, 4 = 완전 홍반 및 발끝 및 발목 또는 손가락의 부기, 및 발목 또는 손목을 굽히지 못함.
손가락 및 발끝 부기는 이들의 부분적 기여에 따라 기록하였다: 발목(돌기): 각각의 발끝 점수 0.2; 손목; 각각의 손가락 점수 0.25. 모든 관절의 합을 계산하였다.
이동성 스코어
전체 동물 이동성은 다음의 정의에 따라 0-4로 점수화하였다.
0 = 정상, 1 = 약간 손상, 2 = 대부분 손상, 3 = 다리를 해치지 않음, 4 = 이동 없음
통계적 분석:
QuickCalcs 소프트웨어 (Graph-Pad Software, 산디에고, 캘리포니아)는 통계적 분석을 위해 사용하였다. 학생 t-시험(Student's t-test)은 실험 그룹들 사이의 현저한 차이를 확인하기 위하여 수행하였다.
결과:
A. 관절염 모델
관절염의 현저한 억제는, 면역 글로불린(IgG) 또는 PBS로 처리된 래트에 비하여, 안티-에오탁신-2 항체로 처리된 래트에서 관찰하였다. 도 3A-3C에서 입증된 바와 같이, 항체에 의한 억제는 모든 시험 인자 (관절염 스코어, 이동성 스코어 및 발목 직경)에서 명확해졌다. D8로 표시된 항체는 가장 현저한 효과를 나타냈다. 관절염 스코어 시험(도 3A)에서, 통계적으로 현저한 차이(P < 0.05)는 D8로 처리한 래트를 PBS로 처리한 래트 또는 IgG로 처리한 래트와 비교할 때 13일 내지 21일 매 측정에서 얻어졌다. 예방 효과는 유도 후 17일에 관절염의 출현 즉시 명확하게 되었다. 21일에 실험의 종료시까지 크기 증가를 계속하였다.
이동성 스코어 시험에서 통계적으로 현저한 차이(P < 0.05)는 D8로 처리한 래트를 PBS로 처리한 래트와 비교할 때 17일부터, 또한 D8로 처리한 래트를 PBS로 처리한 래트 또는 IgG로 처리한 래트와 비교할 때 18일부터, 매 측정에서 얻어졌다. 따라서 D8로 처리한 동물의 평균 이동성 스코어는 PBS로 처리한 동물 2.43에 비하여 21일에 1.37이었다 (p=0.05).
발목 직경 시험에서 통계적으로 유의한 차이(p<0.05)는 19일에 D8과 PBS 사이에서 얻어졌다. D8과 IgG 사이의 차이는 통계적 유의에 도달하지 않았다.
상기 지적한 바와 같이, D8 처리 래트는 PBS로 처리한 래트보다 2.6 내지 3.0 범위의 더 낮은 관절염 스코어를 가졌다 (도 4A). 조직학적 스코어링의 경우, 각각의 다리는 파괴의 정도에 대해 0-4의 크기로 점수화한다: 0= 정상; 1= 염증성 침윤 및 활막 과형성; 2= 파너스 형성(pannus formation) 및 연골 침식; 3= 중요한 연골 침식 및 골 파괴; 4= 관절 정합성의 상실. 관절염 래트의 관절의 조직학적 분석은 D8 처리 래트의 관절이 활막 과형성 및 분산된 염증성 침윤을 가진 반면(도 4B), PBS로 처리된 래트(대조군)의 대부분은 파너스 형성 및 강한 염증성 침윤을 가진 심한 활막염을 가진 것으로 나타났다 (도 4C).
전신 염증성 반응에 대한 안티-에오탁신-2 항체로 처리의 효과를 평가하기 위하여, 동물의 평균 체중을 문서화하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 안티-에오탁신-2 처리는 어주반트 관절염에 의해 유도된 전신 염증성 반응에 의해 원인이 된 체중 손실을 현저하게 개선하였다. 다시, 최대 예방 효과는 실험 전반을 통하여 계속 체중 증가한 D8 항체로 처리된 동물에서 관찰되었다. D8과 PBS 사이의 현저한 중량차이(p<0.05)가 17일에 관찰되었다.
투여량 반응 실험:
관절염의 D8 예방:
일련의 투여량 반응 실험에서, 100μg의 투여량에서 D8은 낮은 투여량 그룹(20μg) 및 높은 투여량 그룹(lOOOμg)에 비하여, 현저하게 우수한 예방효과를 가졌다(도 6A). 유사한 결과는 이동성 스코어, 발목 직경 및 동물 체중 (데이터 도시되지 않음)에 대해서 얻어졌다. 통계적으로 우수한 차이(P < 0.05)는 D8 lOOμ로 처리한 래트를 PBS로 처리한 래트와 비교할 때 17일 내지 24일의 매 측정에서 얻어졌다.
관절염의 D8 처리:
또한 관절염의 출현 시에 시작하여 D8 항체에 의한 복강내 처리는 PBS 처리된 동물에 비하여 관절염 스코어 중증도 (도 6B)의 현저한 감소를 초래하였다. 유사한 결과는 이동성, 체중 및 발목 직경에 대하여 얻어졌다. 도 6B에서 입증되는 바와 같이, 이 실험 셋 업에서 유사한 결과가 100μg 및 1000μg 투여량 그룹에서 얻어졌다.
조합 D8 - 메토트렉세이트 ( MTX ) 관절염 예방:
메토트렉세이트 및 D8 100μg은 둘 다 관절염 스코어에 의한 측정시 (PBS 처리 대조군에 비하여), 관절염의 발전에 대하여 현저하고 비교할 만한 예방을 제공하였지만, 메토트렉세이트과 D8의 조합은 도 7에서 입증되는 바와 같이 개선된 (상승적) 예방효과를 제공하였다.
D8 100㎍ 및 MTX 처리는 13일에 PBS에 비하여, 통계적으로 현저한 효과(p<0.05)를 나타냈다. 24일 실험 종료시에, 관절염 스코어에서 통계적으로 현저한 차이는 MTX 단독 및 MTX + D8 100㎍로 처리된 래트 사이에서 관찰되었다. 현저한 차이는 또한 이들 그룹 사이에 평균 발목 폭에서 24일에 관찰되었다 (도시되지 않음).
X-선 결과:
사후의 X-선은 D8로 처리된 래트에서 최소의 부기에 비하여 PBS 처리 래트에서 강한 정도의 관절주위 연조직 부기를 입증하였다 (도 8). 그 외에, 대조용 래트는 탈석회 작용 및 조기 침식의 징후를 나타냈으며, 이는 D8 처리 동물에서 명확하지 않았다. 이것은 D8 처리 동물에서 염증의 상당한 감소를 나타낸다.
유사한 결과는 앞발의 X-선에서 나타났다 (도시되지 않음).
B. 대장염 모델
만성 대장염을 유도하기 위하여, 10주 된 C57BL 마우스를 이들의 음료수 중에 덱스트란 설페이트(DSS)에 5일간 3회 사이클의 노출 이후에 정상적인 수돗물로 10일 간격으로 노출을 행하였다. 첫 번째 사이클 종료시에, 마우스는 6개의 처리 아암(arms)으로 무작위화 하였다: 매체 대조군 (PBS), 5μM, 25μM, lOOμM 및 200μM의 증가하는 농도로 주어진 전체 마우스 IgG 및 D8. 처리는 3X/주 치료에서 복강내(ip) 주사로 행하였다. 체중은 일주에 두 번 문서화 하였다. 마지막 사이클의 종료 시에, 마우스는 희생시켰다. 콜론의 가까운 부분은 면역 조직학적 분석을 위해 취하였고 또한 말단 부분은 유발된 염증의 정도를 분석하기 위하여 (표준 프로토콜에 따라) 미에노퍼옥시다제(myeloperoxidase, MPO) 활성 분석을 위해 취하였다. 동물의 혈청에서 염증성 사이토카인의 수준은 흐름 세포측정(flow cytometry)에 의해 탐지하였다.
IgG 또는 D8에 의한 처리는 매체 처리 동물에 비하여 체중 손실을 현저하게 약화하였다. 본 연구를 통하여, 가장 높은 체중 손실은 5㎍ D8 처리 아암에서 관찰되었다 (도 9A). 34일에 MPO 활성은 mIgG를 포함하는 모든 다른 처리 아암에 비하여 5㎍ D8 처리군에서 현저하게 감소하였다 (도 9B). 그 외에, D8-처리 동물에서 염증성 사이토카인의 수준은 대조 동물에서 탐지된 것보다 더 낮았다 (도 9C). 가까운 콜론의 면역 조직학적 분석은 콜론 조직의 손상 정도의 감소는 물론 염증의 량 및 정도의 감소를 확인하였다 (도 9D). 염증성 침윤의 정도는 병리 전문의에 의해 평가하였다.
C. EAE
EAE는 인간 질환 다발성 경화증에 대한 잠재적 치료제를 연구하기 위한 대표적인 동물모델로서 작용한다(30).
10주령 C57BL 마우스는 완전 프레운드 어주반트 중에 현탁된 200μg MOG (미엘린 올리고덴드로사이트 글리코 단백질) 펩타이드로 피하주사(sc)한 다음 1주일 후에 두 번째 주사하였다. 매체 대조군(PBS)로 질환 치료를 유도한 후 1일 (즉 두 번째 주사 후 1일)에, 전체 마우스 IgG, 25㎍ D8 및 lOO㎍ D8 (3X/주, 복강내 주사)를 시작하였다. 질환의 중증도 및 진전은 표준 EAE 스코어링 시스템에 따라 3X/주 문서화하였다(31).
D8 25μg 및 더욱 중요하게는 100μg로 처리하면 실험의 전체 과정 중에 EAE 신호의 진전을 약화시켰다. 더욱이, 더 높은 투여량 (100μg)에서 D8은 투여량의 빈도를 (모든 다른 처리 군에서) 약 90%에서 단지 55%로 감소시켰다 (도 10). 따라서 EAE의 치료에서 D8의 잠재적 치료 이점을 보여준다.
D. 당뇨
비비만 당뇨병(NOD) 마우스는 자가면역 당뇨병의 동물모델로서 작용한다 (32).
6주령 NOD 마우스는 D8 또는 매체 대조군 (PBS)로 3X/주 처리하였다. 49일 내지 112일 사이에, 질환 빈도는 상업적 뇨 시험을 사용하여 시험하였으며 또한 112일에 이들의 혈청에서 에오탁신-2 수준은 ELISA (마우스 CCL24/에오탁신-2/MPIF-2 DuoSet; R&D)를 사용하여 측정하였다.
당뇨병 빈도는 미처리 대조군에 비하여 D8-처리 군에서 현저하게 감소하였다(도 11A). 임상적 개선에 따라서, 에오탁신-2의 수준은 대조군에 비하여 안티-에오탁신-2 처리 동물에서 크게 감소하였다 (도 11B).
E. 아테롬성 동맥 경화 플라크 형성의 억제
염증성 사이토카인 및 케모카인의 어레이의 발현수준은 아테롬성 동맥 경화 병변(플라크)에서 측정하였다. 급성 심근 경색을 가진 환자의 책임 관상 동맥으로부터 회수된 취약 플라크는 혈관 내막절제 시료로부터 회수된 안정한 플라크와 비교하였다. 단백질 어레이(protein array)에 의한 플라크의 분석은 도 12에 나타낸다. 프로세싱은 물질 및 방법 부분에서 기술된 바와 같이 행하였다.
상이하게 발현된 단백질 중에서, 현저한 변화는 다음의 단백질들 즉 VCAM-I, 에오탁신-2, IL-10, MCP-1 및 TIMP-2에서 발견되었으며, 이들 모두는 취약 대 안정한 플라크들에서 두 배 이상의 발현 감소를 나타냈다(도 12A).
아테롬성 동맥경화성 마우스(apoE KO 마우스)의 면역 조직화학 연구에서, 어린 마우스 및 어른 마우스로부터 지방선조 및 개선된 병변은 물질 및 방법에서 기술된 바와 같이 안티-에오탁신-2 abs로 염색하였다. 에오탁신-2는 내피 세포 내에 및 플라크 대식세포 내에 존재하는 것으로 나타났다 (도 13).
mRNA 발현은 어린(6 주령) 및 아테롬성 동맥경화 apoE KO 마우스에서 측정하였다. 대동맥은 마우스로부터 입수하였으며 또한 물질 및 방법에서 기술된 바와 같이 RT-PCR에 처리하였다. 에오탁신-2 및 TGF-베타의 mRNA 수준은 비교를 통해 분석하였다. 에오탁신-2 mRNA 수준은 어린 대 어른 마우스에서 현저하게 더 높은 것으로 나타났으며 또한 이 발현 패턴은 항-아테롬성 동맥경화제 TGF-베타에 대하여 관찰한 것과 평행하였다. 도 14A는 각각의 그룹으로부터 대표적인 예들을 나타낸다.
산화 LDL은 아테롬성 경화발생을 촉진하는데 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 마우스 H5V 내피세포는 산화 LDL (oxLDL) (l㎍/ml)로 배양하였다. oxLDL은 생쥐의 내피 세포에서 에오탁신-2 mRNA수준을 현저하게 발현 증가시켰다 (도 14B).
에오탁신-2가 플라크 염증의 세포상 성분들의 부착에 역할을 하는지를 측정하기 위하여, 부착 분석(adhesion assay)은 배양된 내피 세포 상에서 수행하였다. 어린 또는 어른 아테롬성 동맥경화성 apoE KO 마우스로부터 비세포는 비장으로부터 분리하였다. 생쥐의 내피세포는 oxLDL (lμg/ml)로 배양하였으며 또한 내피 세포 상의 비세포의 부착은 에오탁신-2 또는 대조 IgG 항체의 존재하에 조사하였다 (도 15A). 에오탁신-2에 대한 차단 항체와 내피세포의 예비 배양은 이들 세포의 비세포의 부착을 약화하는 것으로 나타났다 (도 15A). 이러한 효과는 어린 비-아테롬 동맥경화성 마우스(6 주령)으로부터 얻어진 것들에 비하여 아테롬 동맥경화성 (6 주령) apoE KO 마우스로부터 림프구에서 더욱 강하였다. 이들 발견은 또한 단핵 대식세포주(U937)가 배양된 내피세포(H5V 생쥐 내피 세포주)에 부착되었을 때 명확하였다 (도 15B).
초기 및 진전된 아테롬성 동맥경화 플라크에 대한 에오탁틴-2 차단의 효과는 상업적으로 입수 가능한 안티 에오탁신-2 항체는 물론 본 발명의 모노클로날 항체를 사용하여 측정하였다. 예비 연구에서, 차단 안티-에오탁신-2 항체(Peprotech)를 일주에 2회 용량 5㎍으로 투여하면 마우스의 대동맥에서 에오탁신-2 mRNA 수준을 현저하게 감소시키는데 충분하였다. 다음에, 안티-에오탁신-2 abs의 단기 투여의 효과를 조사하였다. 어린 apoE KO 마우스는 에오탁신-2 항체로 일주에 2회 (5㎍의 복강내 주사) 또는 대조 IgG 또는 PBS로 4주간 처리하였고, 지방선조에 대한 효과를 측정하였다. 마우스는 오일-레드 O 염색 후에 플라크 크기를 분석하기 위해 희생시켰다. 안티-에오탁신-2는 마우스 IgG에 비하여 지방선조반 형성을 대략 72%까지 급격하게 감소하였다 (도 16A). 이러한 효과는 총 콜레스테롤 내의 변화와 관련이 없었으며 또한 트리글리세라이드는 두 개의 그룹에서 유사하였다(데이터 도시되지 않음). 더욱이, 대조용 생쥐 IgG로의 처리는 PBS 주사와 비교하여 플라크 진행에 영향을 미치지 않았다.
다음에, 에오탁신-2 차단의 효과는 플라크 건축이 더욱 복잡한 장기 모델에서 시험하였다. 여기에서, 에오탁신-2 항체 (5μg/투여량)의 2주마다 주사 10주 후에, 어른 apoE KO 마우스의 심장에서 측정시 플라크 크기에 대하여 명확하지 않았다 (도 16B). 그러나, 섬유상 영역으로 측정된 플라크 안정성을 분석한 경우, 에오탁신-2에 대한 항체는 더 작은 지질 코어를 훼손시키면서 더 큰 섬유상 영역에 의해 명백해진 현저하게 더 안정한 플라크 표현형을 유도하였다 (도 16C). 다시, 이들 발견은 지질 수준과 상관없었으며 이는 그룹 사이에 차이가 없었다. 대표적인 오일-레드 O 및 매손 삼색 염색 부분은 도 17에 제공되어 있다.
아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis)은 지방분해가 내공을 점진적으로 좁히게 하는 동맥벽에서 진행하는 과정이다. 성숙 플라크(mature plaque)는 두 개의 기본 구조 즉 지질 코어 및 섬유상 캡으로 이루어진다. 지질 코어가 더 작고 섬유상 캡이 더 두꺼우면, 플라크는 더 안정하다. 이것은 파괴하는 성향 및 심근경색 또는 불안정한 협심증 원인이 감소 된다는 것을 의미한다. 급성 관상동맥 증후군 (예, 심근 경색 및 불안정한 협심증)의 원인이 되는 대부분의 플라크는 ＜70% 협착증을 갖는 것으로 혈관 조영적으로 나타난다는 것이 명확하다(28, 29에서 검토됨). 이들 병변의 대략 60%는 (주로 대식세포, T세포, 오래된 출혈, 혈관신생 및 칼슘을 포함하는) 지질 및 괴사성 부스러기의 큰 혈관형성 코어를 갖는 플라크의 파열에 의해 원인이 된다. 파열 캡은 얇은데, 그 이유는 대식세포가 플라크에 걸쳐 이동함에 따라 소화하는 금속 프로테이나제를 분비하기 때문이고 또한 평활근 세포 (플라크의 지지부재)가 염증성 사이토카인 등의 여러 가지 인자들에 의해 원인이 된 노화 또는 세포사멸에 의하여 고갈되기 때문이다.
하나의 양상에서, 본 발명은 에오탁신-2가 안전한 대 불안정한 인간 아테롬성 동맥경화 플라크에서 상이하게 발현된다는 발견에 기초하고 있다. apoE 녹아웃(KO) [20] 마우스 모델에서 에오탁신-2 경로를 차단함으로써, 본 발명자들은 지방선조 형성의 억제 (초기 아테롬성 동맥경화 병변을 나타냄) 및 플라크 안정화의 연장을 입증할 수 있었다.
본 발명의 발명자들은 에오탁신-2가 아테롬성 동맥경화성 및 비-아테롬성 동맥경화성 생쥐 동맥의 내피에서 발현된다는 것을 밝혀냈으며, 이것은 당해 분야의 종래의 보고들을 뒷받침하고 있다. 그러나, 본 발명자들은 또한 에오탁신-2가 플라크 대식세포에서 발현된다는 것을 밝혀냈다. 에오탁신-2는 아테롬성 동맥경화성 apoE KO 마우스에 비하여 어린 apoE KO 마우스의 대동맥에서 더욱 풍부하게 발현되었다. 이것은 에오탁신-2가 내피에 단핵세포/대식세포의 세포 대 세포 부착을 포함하는 아테롬성 동맥경화증의 초기단계에서 연관되어 있다는 것을 제안한다. 당연히, 후술되는 in - vitro 연구들은 에오탁신-2를 차단하면 내피세포에 림프구의 oxLDL 유도 부착을 감소시켜 in vivo 플라크 형성에서 에오탁신-2의 역할을 뒷받침하고 있음을 보여준다.
집중적인 연구에도 불구하고, 안정한 내지 불안정한 플라크의 전이를 담당하는 인자들은 달성하기 힘들게 남아 있다. 안정한 대 불안정한 인간 플라크의 염증성 단백질 어레이에 기초하여, 본 발명은 안정한 표현형과 불안정한 표현형 사이에 플라크의 전이에 연관되어 있는 잠재성 표적 단백질 에오탁신-2를 제공한다. 진한 데이터는 VCAM-1, IL-1O 및 MCP-1과 아테롬성 동맥경화증의 연합에 관하여 존재하며, 이들은 또한 안정한 대 불안정한 플라크에서 상이하게 발현되는 것으로 본 발명자들에 의해 발견되었지만, 에오탁신-1에 이러한 데이터는 존재하지 않는다.
그 외에, 에오탁신-2는 아테롬성 동맥경화성 및 비-아테롬성 동맥경화성 생쥐 동맥의 내피에서 발현되며, 따라서 종래의 보고들에 의해 뒷받침되는 것으로 본 발명자들에 의해 발견되었다. 그러나, 플라크 대식세포에서 발현되는 것으로 본 발명자들에 의해 또한 발견되었다. 흥미롭게도, 에오탁신-2는 내피에 단핵세포/대식세포의 세포 대 세포 부착을 포함하는 아테롬성 동맥경화증의 초기 단계에 상응하는 어린 대 아테롬성 동맥경화성 apoE KO 마우스의 대동맥에서 더욱 풍성하게 발현되었다. 당연히, in - vitro 연구는 in - vitro에서 잘 일어날 수 있는 바와 같이 oxLDL 매개 부착에서 에오탁신-2 차단을 위한 역할을 뒷받침하고 있다. 생쥐 아테롬성 동맥경화증의 초기단계에서 더욱 강한 발현은 또한 단기 지방선조 모델에서 이러한 경로를 차단하는 인상적인 효과를 설명한다. 이론으로 제한받고 싶지는 않지만, 내피에 염증성 세포 부착을 차단하면 원칙적으로 이러한 효과를 담당할 수 있다.
섬유상 영역에 의해 명확한 바와 같이 플라크 안정성에 대한 에오탁신-2 차단의 효과에 관하여, 염증성 세포 구성이 에오탁신-2 차단으로 인하여 약화되는 경우에는, 안정한 표현형에 대하여 더욱 유익할 것이다. 이들 발견은 플라크 축적이 에오탁신-2 차단으로 인하여 변하지 않는 지질 프로파일에 의해 더욱 영향을 받을 가능성이 있기 때문에 감소된 정도의 아테롬성 동맥경화증에 필수적으로 영향을 미치지 않을 수 있다.
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수탁번호 생성물 크기 프라이머 mRNA 표적
AF281075 379bp CTGTGCCTGACCTCCAGAAC (서열번호 12)
CTAAACCTCGGTGCTATTGC (서열번호 13)		 에오탁신-2
NM-011577 492bp CTTGGGCTTGCGACCCACGTAGTA (서열번호 14)
AGACGGAATACAGGGCTTTCGATTCA (서열번호 15)		 TGF베타
NM-199472 585bp AGCCCATCACCATCTTCCAG (서열번호 16)
CCTGCTTCACCACCTTCTTG (서열번호 17)		 G3PDH
European Collection of Cell Cultures ECACCD809081702 20090817 European Collection of Cell Cultures ECACCG809081701 20090817
<110> The Medical Research, Infrastructure, and Health Services Fund of the Tel Aviv Medical Center <120> Eotaxin-2 (CCL24) inhibitors in inflammatory, autoimmune, and cardiovascular disorders <130> 1979913 <150> US 61/202,089 <151> 2009-01-28 <150> US 61/244,530 <151> 2009-09-22 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 452 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(26) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (65)..(66) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (412)..(412) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (448)..(448) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnngggc agcaganccg gggcngngga tagacagang 60 ggggnngncg ttttggctga ggagacggtg actgaggttc cttgacccca gttgtccata 120 gcgtagctac taccgtagga atgacttgca cagaaatatg tagccgtgtc ctcatttctg 180 aggttgttga tctgcaaata ggcagtgctg gcagaggttt ccaaagagag ggcaaaccgt 240 cccttgaagt catcagtata tgttggctct ccattgtagg tgttgatcca gcccatccac 300 tttaaaccct ttcctggagc ctgctttacc cagttcattc cagagtttgt gaagggatac 360 ccagaagccc tgcaggagat cttgactgtg tctccaggct tcttcagctc angtccagac 420 tgcaccaact ggatctgggc catggccngc ta 452 <210> 2 <211> 294 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (28)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (51)..(52) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (75)..(76) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (84)..(84) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (89)..(92) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (95)..(96) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (100)..(101) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (104)..(104) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (106)..(106) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (109)..(109) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (112)..(113) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (115)..(118) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (120)..(123) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (125)..(126) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (128)..(132) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (135)..(135) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (138)..(138) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (140)..(141) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (147)..(149) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (151)..(153) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (155)..(155) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (159)..(161) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (165)..(166) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (171)..(177) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (179)..(182) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (185)..(189) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (193)..(194) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (197)..(197) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (199)..(199) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (203)..(206) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (208)..(208) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (211)..(213) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (218)..(218) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (220)..(221) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (223)..(225) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (227)..(231) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (236)..(240) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (242)..(242) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (244)..(244) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (246)..(246) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (254)..(254) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (256)..(258) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (261)..(266) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (273)..(274) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (276)..(276) <223> n is a, c, g, or t <400> 2 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ntnntngnnn nnnnnnnnnn gggccaatgg nngaggacgc 60 ggatgggggt gtcgnngtgc cttngtcgnn nnctnnttgn ncancntcna cnncnnnnan 120 nnnanngnnn nntgnaanan ngatggnnnt nnncnacann ntggnntcct nnnnnnntnn 180 nntgnnnnng acnncanana cannnncnac nnnatgancn ncnnncnnnn nttgannnnn 240 gncnantatg aacnannnaa nnnnnntacc tgnnangcca ctcacaagac atca 294 <210> 3 <211> 455 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (17)..(26) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (67)..(67) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (454)..(455) <223> n is a, c, g, or t <400> 3 nnnnnnnnnn nnnnggnnnn nnnnnngggc agcagntcca ggggccagng gatagacaga 60 ngggggngtc gttttggctg aggagacggt gactgaggtt ccttgacccc agttgtccat 120 agcgtagcta ctaccgtagg aatgacttgc acagaaatat gtagccgtgt cctcatttct 180 gaggttgttg atctgcaaat aggcagtgct ggcagaggtt tccaaagaga gggcaaaccg 240 tcccttgaag tcatcagtat atgttggctc tccattgtag gtgttgatcc agcccatcca 300 ctttaaaccc tttcctggag cctgctttac ccagttcatt ccagagtttg tgaagggata 360 cccagaagcc ctgcaggaga tcttgactgt gtctccaggc ttcttcagct caggtccaga 420 ctgcaccaac tggatctggg ccatggccgg ctann 455 <210> 4 <211> 293 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (27)..(38) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (73)..(74) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (82)..(82) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (87)..(87) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (94)..(94) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (113)..(114) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (116)..(116) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (119)..(119) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (121)..(121) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (123)..(124) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (127)..(130) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (136)..(136) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (146)..(146) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (174)..(174) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (188)..(188) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (198)..(198) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (202)..(202) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (204)..(204) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (236)..(239) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (243)..(243) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (245)..(245) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (247)..(247) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (259)..(262) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (264)..(265) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (273)..(273) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (275)..(275) <223> n is a, c, g, or t <400> 4 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnngnnnn nnnnnnnngg gccaatggnn gaggacgcgg 60 atgggggtgt cgnngtgcct tngtcgngtg cttnttgaac aacttctacc ccnnanacnt 120 nanngtnnnn tggaanattg atggcngtga acgacaaaat ggcgtcctga acanttggac 180 tgatccanga cagcaaanac ancncctaca gcatgagcag caccctcacg ttgacnnnng 240 acnantntga acgacgtann nncnntacct gtnangccac tcacaagaca tca 293 <210> 5 <211> 456 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (17)..(26) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (62)..(62) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (70)..(70) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (455)..(456) <223> n is a, c, g, or t <400> 5 nnnnnnnnnn nnnnggnnnn nnnnnngggc agcagntcca ggggccagnn ggatagacag 60 angggggngn cgttttggct gaggagacgg tgactgaggt tccttgaccc cagttgtcca 120 tagcgtagct actaccgtag gaatgacttg cacagaaata tgtagccgtg tcctcatttc 180 tgaggttgtt gatctgcaaa taggcagtgc tggcagaggt ttccaaagag agggcaaacc 240 gtcccttgaa gtcatcagta tatgttggct ctccattgta ggtgttgatc cagcccatcc 300 actttaaacc ctttcctgga gcctgcttta cccagttcat tccagagttt gtgaagggat 360 acccagaagc cctgcaggag atcttgactg tgtctccagg cttcttcagc tcaggtccag 420 actgcaccaa ctggatctgg gccatggccg gctann 456 <210> 6 <211> 293 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (27)..(38) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (73)..(74) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (82)..(82) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (87)..(87) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (94)..(94) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (113)..(114) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (116)..(116) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (119)..(119) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (121)..(121) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (123)..(124) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (127)..(130) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (136)..(136) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (146)..(146) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (174)..(174) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (188)..(188) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (202)..(202) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (204)..(204) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (236)..(239) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (243)..(243) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (245)..(245) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (247)..(247) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (259)..(262) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (264)..(265) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (273)..(273) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (275)..(275) <223> n is a, c, g, or t <400> 6 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnngnnnn nnnnnnnngg gcctttggnn gaggacgcgg 60 atgggggtgt ccnngtgcct tngtcgngtg cttnttgaac aacttctacc ccnnanacnt 120 nanngtnnnn tggaanattg atggcngtga acgacaaaat ggcgtcctga acanttggac 180 tgatccanga cagcaaatac ancncctaca gcatgagcag caccctcacg ttgacnnnng 240 acnantntga acgacgtann nncnntacct gtnangccac tcacaagaca tca 293 <210> 7 <211> 78 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 cgaagagaca gtgaccagag tcccttggcc ccagtaagca aagctattac cgaaggtaca 60 gtaatacacg gccgtgtc 78 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 cggggaagta gtccttgacc aggc 24 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 9 rrhryybwdm tvacharwc 19 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 gatgtcttgt gagtggcctc ac 22 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 11 tgggatagaa gttattcagc aggc 24 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 12 ctgtgcctga cctccagaac 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 13 ctaaacctcg gtgctattgc 20 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 14 cttgggcttg cgacccacgt agta 24 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 15 agacggaata cagggctttc gattca 26 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 16 agcccatcac catcttccag 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 17 cctgcttcac caccttcttg 20

Claims (24)

  1. 하나 이상의 에오탁신-2 길항제 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 염증성, 자가면역 또는 심장혈관 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 하나 이상의 안티-에오탁신-2 길항제가 안티 에오탁신-2 항체 또는 상기 항체의 결합활성을 유지하는 그의 단편인 약제학적 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 항체가 하이브리도마 D8 (ECACC 수탁번호: D809081702), 하이브리도마 G8 (ECACC 수탁번호: G80908170)에 의해 분비된 모노클로날 항체 또는 상기 항체의 결합활성을 유지하는 그의 단편인 약제학적 조성물.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 안티-에오탁신-2 항체가 다음 a) 내지 e)로 이루어진 그룹에서 선택된 모노클로날 항체인 약제학적 조성물:
    a) 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 중쇄 및 서열번호 2와 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;
    b) 서열번호 3과 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 중쇄 및 서열번호 4와 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;
    c) 서열번호 5와 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 중쇄 및 서열번호 6과 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;
    d) 하이브리도마 D8 (ECACC 수탁번호: D809081702), 하이브리도마 G7, 또는 하이브리도마 G8 (ECACC 수탁번호: G80908170)에 의해 분비된 모노클로날 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산과 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 중쇄, 및 하이브리도마 D8 (ECACC 수탁번호: D809081702), 하이브리도마 G7, 또는 하이브리도마 G8 (ECACC 수탁번호: G80908170)에 의해 분비된 모노클로날 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산과 90% 이상의 상동성을 갖는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체; 및
    e) 상기 항체의 결합활성을 유지하는 상기 a) 내지 d)의 항체의 특정한 단편.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 에오탁신-2 길항체는 안티센스 분자 또는 에오탁신-2 mRNA에 대한 siRNA분자인 약제학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성, 자가면역 또는 심장혈관 질환이 아테롬성 동맥경화증, 류머티즈 관절염, 염증성 장 질환, 다발성 경화증 및 당뇨로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  7. 치료학적 유효 투여량의 에오탁신-2 길항제 또는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물을 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 염증성 또는 자가면역 질환을 치료하는 방법.
  8. 치료학적 유효 투여량의 에오탁신-2 길항제 또는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물을 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하여, 아테로성 동맥경화 플라크 형성을 억제하거나 또는 아테롬성 동맥경화 플라크를 안정화하는 방법.
  9. 치료학적 유효 투여량의 에오탁신-2 길항제 또는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물을 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하여, 급성 관상동맥 증후군을 가진 환자의 주요 심혈관 사고를 예방하는 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에오탁신-2 길항제 또는 상기 약제학적 조성물이 하나 이상의 추가적인 치료제와 함께 투여하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 하나 이상의 추가적인 치료제가 화학요법제, 사이토카인, 펩티드, 항체 및 항생제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 치료제가 사이클로스포린, 스테로이드, NSAIDS (비-스테로이드 항 염증약), 안티-TNFα항체, 안티-TNF 수용체 항체, 안티-IL6 수용체 항체, 안티-CD20 항체, 안티-VLA-4 항체, 정맥내 면역 글로불린(IVIG), 코파손, 및 인터페론-β로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 치료제가 메토트렉세이트인 법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 치료제 및 상기 에오탁신-2 길항제 또는 상기 약제학적 조성물이 연속적으로 또는 동시에 투여되는 방법.
  15. 안티-에오탁신 2 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마이며, 상기 하이브리도마가 D8 (ECACC 수탁번호: D809081702), G7, 또는 G8 (ECACC 수탁번호: G809081701)인 하이브리도마.
  16. 에오탁신 2에 대한 모노클로날 항체 또는 에오탁신 2에 결합할 수 있는 그의 특정한 단편이며, 상기 모노클로날 항체가 하이브리도마 D8 (ECACC 수탁번호: D809081702), G7, 또는 G8 (ECACC 수탁번호: G809081701)로부터 선택되는 항체.
  17. 에오탁신-2에 대한 모노클로날 항체이며, 상기 항체가 다음 a) 내지 e)로 이루어진 그룹에서 선택되는 모노클로날 항체:
    a) 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 중쇄 및 서열번호 2와 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;
    b) 서열번호 3과 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 중쇄 및 서열번호 4와 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;
    c) 서열번호 5와 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 중쇄 및 서열번호 6과 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;
    d) 제16항의 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산과 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산으로 암호화된 중쇄 및 제16항의 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산과 90% 이상의 상동성을 갖는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체; 및
    e) 상기 항체의 결합활성을 유지하는 상기 a) 내지 d)의 항체의 특정한 단편.
  18. 제16항 또는 제17항의 어느 한 항에 따른, 모노클로날 항체를 암호화하는 분리된 핵산 분자, 또는 그의 항원-결합 단백질.
  19. 제18항의 핵산 분자를 포함하는 발현벡터.
  20. 제19항의 발현 벡터를 포함하는 숙주세포.
  21. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    염증성, 자가면역 또는 심장혈관 질환의 치료에 사용하기 위한 모노클로날 항체.
  22. 염증성, 자가면역 또는 심장혈관 질환의 치료에서 에오탁신-2 길항제의 용도.
  23. 염증성, 자가면역 또는 심장혈관 질환의 치료를 위한 약학적 조성물의 제조에서 에오탁신-2 길항제의 용도.
  24. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 에오탁신-2 길항제가 항체인 용도.



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