JP2007538003A - 心筋梗塞、脳卒中および末梢動脈閉塞疾患に対する感受性遺伝子、治療の方法 - Google Patents

心筋梗塞、脳卒中および末梢動脈閉塞疾患に対する感受性遺伝子、治療の方法 Download PDF

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Abstract

心筋梗塞(ＭＩ)と染色体13q12の遺伝子座との関連が示されている。 特に、遺伝子学的関連性分析によって、この遺伝子座内にあるＦＬＡＰ遺伝子が、心筋梗塞および急性冠状動脈症候グループ、そして、脳卒中および末梢動脈閉塞疾患に対する感受性遺伝子であることが示されている。 具体的には、心筋梗塞、急性冠状動脈症候グループ、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の進行を招く危険要素を有する個体を特定する際の処置対象経路と診断方法が記載されている。 本発明は、ロイコトリエン合成阻害剤とスタチンを含む組成物、それに、心筋梗塞、急性冠状動脈症候グループ、脳卒中および／または末梢動脈閉塞疾患の危険要素を有するヒトでのＣ-反応性タンパク質を低減するための方法、すなわち、これら組成物の使用方法を提供する。

Description

本願は、2005年１月10日に出願された米国出願第60/642,909号の優先権を主張する。 この出願は、2003年２月21日に出願された米国仮出願第60/449,331号および2002年10月17日に出願された米国仮出願第60/419,433号の優先権を主張している2003年10月16日に出願された国際出願第PCT/US03/32556号の一部継続出願である2004年１月30日に出願された米国出願第10/769,744号の一部継続出願である2004年４月22日に出願された米国出願第10/830,477号の一部継続出願でもある。 そして、ここに本願明細書の一部を構成するものとして、これら各優先権出願に基づく既得権を侵害または放棄せずに、これら各優先権出願の全開示内容を援用する。
心筋梗塞(ＭＩ)および急性冠状動脈症候群(ＡＣＳ)、例えば、非持続性狭心症、非ＳＴ増大性心筋梗塞(ＮＳＴＥＭＩ)またはＳＴ増大性心筋梗塞(ＳＴＥＭＩ)などは、先進工業国において、入院を要するする病因として増加している。 心臓血管の疾患は、米国、欧州および日本での主要な死亡原因としての地位を長らく維持している。 罹患率および死亡率の双方、それに、健康医療制度に要する財政的負担の観点から、これら疾患に伴う損失は大きなものになっている。
一般的に、冠状動脈での血流が突然に減少し、次いで、アテローム性動脈硬化症に伴って生じた冠状動脈内の血栓閉塞によって、心筋梗塞が生じる。 大抵の場合、アテロームプラークが破裂、破壊または腫瘍化し、そして、血餅が形成しやすい条件下であれば、梗塞が形成される。 稀に、梗塞の形成は、冠状動脈栓、先天性異常、冠状動脈痙攣および種々の全身的疾患、特に、炎症性疾患に起因する冠状動脈閉塞が原因の場合がある。 心筋梗塞の医学的危険因子として、喫煙、肥満、高血圧、それに２００mg/dlを超える血清全コレステロールレベル、血清ＬＤＬコレステロールの上昇、および血清ＨＤＬコレステロールが低いこと、などがあげられる。 心臓血管に関する疾患の既往歴が無い個体での発病率は、約１％である。 心筋梗塞または急性急性冠状動脈症候群を経験した個体が、血管形成術およびステント移植を含む最高度の医学管理を行わない場合には、次の年に心筋梗塞を再発する危険度は、１０〜１４％になる。
アテローム性動脈硬化症は、多くの大動脈および中度の血管の血管床に対して影響を及ぼす。 心筋梗塞および非持続性狭心症(急性冠状動脈症候群)は、冠状動脈アテローム性動脈硬化症から始まるが、虚血性発作は、そのほとんどが頚動脈または大脳の動脈アテローム性動脈硬化症に起因している。 末梢動脈閉塞疾患(ＰＡＯＤ)を原因とする肢部の虚血は、腸骨、大腿および膝窩の動脈アテローム性動脈硬化症に起因している。 血栓症を阻害する薬物(アスピリン)の普及、または血中コレステロールレベルの上昇などの医学的危険因子の治療(スタチン）、糖尿病または高血圧のような医学的危険因子の治療法(利尿薬および抗高血圧剤)があるにもかかわらず、アテローム硬化性疾患の発生は、未だによく認められる。
アテローム硬化性疾患は、脂質、特に、低密度のリポタンパク質(ＬＤＬ)コレステロールが動脈の壁内部に蓄積に起因している。 捕捉されたＬＤＬは、マクロファージによって酸化されて取り込まれる。 これにより、コレステロールを飽食してなる、「泡沫細胞」とも称されるマクロファージが蓄積されて、アテローム硬化性病変が形成される。 疾患が進行するにつれて、平滑筋細胞が増殖し、そして、脂質に富んだ壊死した中心部を囲む細胞外マトリックスの「繊維状帽(繊維状キャップ)」が動脈壁に成長する。 繊維状アテローム硬化性プラークは、大抵の個体において、その生存期間内は、動脈壁に比較的安定に存在している。 このような繊維状の病変は、内径を減少したり、または心臓への酸素運搬に対して重篤な影響を与えずに、弾性膜を外方向に移動させて、動脈の壁を広範囲に再建する。 したがって、疾患が後期に至るまでに、患者の内管が塞らずして、大きな繊維性のアテローム硬化性病変が進行する場合がある。 しかし、冠状動脈の内管は、時間をかけて徐々に狭くなる場合があり、症例によっては、特に運動時のような流動の要求が高まる状態では、心臓への血流を鈍らせることになる。 これにより、持続性狭心症と称される、安静によって緩和される胸痛を招く可逆性の虚血を生じる場合がある。
繊維性アテローム硬化性病変が比較的に持続性であるのとは対照的に、(いずれもが急性冠状症候群に属する)心筋梗塞および非持続性狭心症に関連する病因は、薄い繊維状帽、大きな脂質核および炎症性細胞、例えば、Ｔリンパ球および単核細胞／マクロファージの浸潤によって特徴付けられる。 非侵襲性の撮像技術は、ほとんどの心筋梗塞が、軽度または中度の狭窄症を伴う部位で生じていることを示しており、このことは、冠状動脈閉塞が、そのほとんどが、病因が除去された後に形成された血栓または血餅に起因しており、狭窄症による内管閉塞だけに起因するものでないことを示している。 プラークの破壊は、マクロファージが侵入および蓄積して、局所的な炎症性プロセスによって活性化される場合には、通常、繊維状帽、病変部の周縁での腐食または不均一な薄層化に起因する場合がある。 繊維状帽の薄層化は、活性化されたマクロファージから放出されるプロテアーゼによって崩壊した細胞外マトリックスが原因の場合がある。 これらの変化がプラークを不安定化せしめ、そして、組織因子の凝血促進および血栓症の発生確率を高める他の因子の出現とも相俟って、心筋梗塞の危険度を高める場合がある。
急性冠状動脈症候群において、局所的な血栓症と同時に組織の破壊または腐食作用を示す病因は、通常、血管形成術、または内腔の開通性を維持するためのバルーン拡張、およびステントの配置によって除去される。 急性冠状動脈症候群を経験した患者は、冠状動脈疾患の多血管性に起因して、二次的な冠状動脈疾患を招く確率が高く、最初の疾患から１２ヶ月以内の再発率は、１０〜１４％に達する。
心筋梗塞の再発とは、既存の慢性アテローム硬化性病変部位の動脈血管壁での炎症性疾患の発症であり、時として病因を除去する場合もあるが、局所的な血栓症とそれに続いて心筋梗塞を招く。 プラーク不安定性を招く動脈壁炎症を発症する持続的プロセスは知られてはいないが、循環系への腫瘍壊死因子αやインターロイキン-６の放出が始まる。 損傷した血管壁から放出された、前述したサイトカインまたは生物学的媒介物、それにその他のサイトカインまたは生物学的媒介物は、肝臓での炎症性応答を刺激し、Ｃ反応性タンパク質を含むいくつかの非特異的遺伝子炎症性マーカーを増加させる。 アテローム性動脈硬化症に対して特異的ではないけれども、Ｃ反応性タンパク質(ＣＲＰ)および血清アミロイドＡの増加は、おそらくは血管壁の炎症というよりは、心筋梗塞の危険度を予測するものと考えられる。
喫煙、高脂質血症、高血圧および糖尿病のような古典的な危険因子は、冠状動脈心臓疾患(ＣＨＤ)や心筋梗塞などの多くの症例に関連しているが、多くの患者は、これら危険因子との関連性を有していない。 実際に、これら危険因子の一つ以上を保有する多くの患者では、心筋梗塞が進行していない。 家族歴は、主要な危険因子の一つとして長年認識されてきた。 心筋梗塞のいくつかの家族集団では、その他の従来の危険因子に対する遺伝的関与が認められてはいるが、数多くの研究は、これらの危険因子以外にも、重大な遺伝的感受性因子があることを示している（Friedlander Y. et al., Br. Heart J. 1985;53:382-7, Shea S. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 1984;4:793-801、および Hopkins P.N. et al., Am. J. Cardiol. 1988;62:703-7）。 主要な遺伝的感受性因子は、家族性の高コレステロール過剰血症などの、稀な高脂質血症のメンデル形態についてのみ同定されている。
遺伝的な危険度は、集団内の個体間相互における遺伝子上のわずかな差異によって比較されている。 個体間の遺伝子の差異は、そのほとんどが、高頻度で発生する単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に起因するものであるが、その他の変化もまた重要である。 単一ヌクレオチド多型は、ヒトゲノムでは、平均で1,000塩基対ごとに配置される。 それ故に、250,000塩基対を含む典型的なヒト遺伝子では、２５０の異なる単一ヌクレオチド多型性を含有していることになる。 ごく少数の単一ヌクレオチド多型性が、エキソン内に配置されて、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変更する。 ほとんどの単一ヌクレオチド多型性は、遺伝子機能に何らの影響も与えないが、その他のものは、転写、スプライシング、翻訳、あるいは遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの安定性を変更する場合がある。 ヒトゲノムでのさらなる遺伝的多型性は、長鎖または短鎖のＤＮＡでの挿入、欠失、転座または逆位に起因する。 それ故に、疾患の危険度に関与する遺伝的多型性は、タンパク質のアミノ酸配列を直接的に変更するか、遺伝子から産生されるタンパク質の量を増加させるか、または遺伝子によって産生されるタンパク質の量を減少させる。
疾患の危険度に関与する遺伝的多型性は完全には解明されていないため、このような危険因子についての遺伝子試験は、臨床用医薬のために重要となる。 例えば、痴呆患者でのapoE4多型性の遺伝子キャリアを同定して、アルツハイマー病を判別診断するためのアポリタンパク質Ｅ試験、そして、深部の静脈性血栓症の疾病素質を突き止めるためのFactor Ｖ Leiden試験がある。 重要なことに、癌の治療にあっては、個々の癌患者について最も適切な治療法を選択するために、腫瘍細胞での遺伝子変異体の診断が行われている。
乳癌では、抗-エストロゲン性薬剤(タモキシフェン)または抗-Her２抗体(ハーセプチン)を治療計画に組み込む場合、エストロゲン受容体またはヘレグリン２型(Her２)受容体チロシンキナーゼ発現での遺伝子変形を決定する。 BcrおよびAbl受容体チロシンキナーゼをコードする遺伝子を融合するフィラデルフィア染色体遺伝子転座を利用する慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)診断は、Bcr-Ablキナーゼの特異的な阻害剤であるGleevec(STI571)が、癌の治療のために用いられるべきである。 このような遺伝子改変を有する慢性骨髄性白血病患者は、Bcr-Ablキナーゼを阻害することにより、腫瘍細胞が迅速に消失して、白血病を緩解せしめる。
多くの一般的な炎症性マーカーは、冠状心臓疾患の危険性を予測するが、これらのマーカーは、アテローム性動脈硬化症には特異的ではない。 例えば、Stein（Stein, S., Am J Cardiol, 87(suppl):21A-26A（2001))は、Ｃ反応性タンパク質(ＣＲＰ)、血清アミロイドＡ、フィブリノーゲン、インターロイキン-６、組織壊死因子-α、可溶性脈管細胞接着性分子(ｓＶＣＡＭ)、可溶性脈管間接着性分子(ｓＩＣＡＭ)、Ｅ-セレクチン、１型マトリックスメタロプロテアーゼ、２型マトリックスメタロプロテアーゼ、３型マトリックスメタロプロテアーゼ、および９型マトリックスメタロプロテアーゼなどの冠状心臓疾患の危険性を予測するための代替手段として、以下の血清炎症性マーカー内の任意の一つを使用することを開示している。 これらの血清炎症性マーカー内の一つ以上のマーカー値の上昇は、冠状心臓疾患に特異的でないのみならず、加齢と共に、また、脳血管疾患、末梢血管疾患、非インスリン依存性糖尿病、変形性関節症、細菌性感染および敗血症にも関連して認められる。
血清Ｃ反応性タンパク質(ＣＲＰ)は、全身性炎症に対する簡便な感受性マーカーであると考えられている。 一般的に、ＣＲＰは、市販の酵素に結合した免疫吸着剤アッセイ(ＥＩＡ)を用いて、血清試料に関して測定される。 これまでに報告された複数の研究において一致していることは、冠状動脈疾患の危険度の増大と、血清ＣＲＰの増加との間で相関が見出されていることである。 例えば、Women's Health Studyによれば、27,939人の健康な米国人女性でＣＲＰが測定されている。 女性の血清ＣＲＰにおける五分位点でのカットオフ値は、１リットルあたりのＣＲＰが、0.49mg以下、0.49mgを超えて1.08mgまで、1.08mgを超えて2.09mgまで、2.09mgを超えて4.19mgまで、および4.19mgを超える範囲となっている。 Ridker, P. M. et al., New England. J Med., 347:1557-1565(2001)を参照されたい。 最も低い五分位点において、年齢調整を加えた場合でさえ、１リットルあたり0.49mgを超えるすべての五分位点が、冠状心臓疾患の危険度の増加と関連しており、また、これらの女性での(１リットルあたりＣＲＰが4.19mgを越える)血清ＣＲＰに関する最も高い五分位点において、最高値の4.5の相対的危険度が認められた。 女性における血清ＣＲＰの増加と冠状心臓疾患との間に同様の相関が報告されている(Ridker, P. M. et al., New Engld. J. Med., 342:836-843(2000)およびBermudez, E. A. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 22: 1668-1673(2002))。 また、男性では、血清炎症性マーカー(例えば、ＣＲ)の増加と、冠状心臓疾患の危険度の増加との間での相関が報告されている(Doggen, C. J. M. et al., J. Internal Med, 248:406-414(2000)およびRidker, P.M. et al., New England. J. Med., 336:973-979(1997))。 血清ＣＲＰについての五分位点は、Doggen et alによって報告されているように、１リットルあたり、ＣＲＰが、0.65mg未満、0.65mgを超えて1.18mgまで、1.18mgを超えて2.07mgまで、2.07mgを超えて4.23mgまで、4.23mgを超える範囲となっている。 女性の場合とは異なり、血清ＣＲＰの増加は、ＣＲＰでの４番目および５番目の五分位点においてのみ、冠状心臓疾患にとの間で、相対危険度の増加と相関関係にあった（各々の相対危険度は、１.７倍および１.９倍であった）。
また、女性での血清ＣＲＰは、脂質マーカー、例えば、血清低密度リポタンパク質-コレステロール(ＬＤＬ-Ｃ)のレベルと組み合わせて測定された。 Ridker, P. M. et al.,(2002)による研究によると、血清ＣＲＰとＬＤＬ-Ｃとの間での相関は最小限のものであるが、両血清マーカーについてのスクリーニングは、一方だけを用いた場合よりも良好な徴候を示した。 したがって、中央値を越える(１リットルあたりのＣＲＰが1.52mgを超える)血清ＣＲＰ、そして、中央値を超える(１リットルあたりＬＤＬ-Ｃが123.7mgを超える)血清ＬＤＬ-Ｃを保有する女性は、冠状心臓疾患に関して最も高い危険度を有していた。
さらに、ＣＲＰ値または他の血清炎症性マーカー値が高いことは、心筋梗塞の既往歴を有する患者において、二次的な心筋梗塞の危険度が高いことを示すものである（Retterstol, L. et al., Atheroscler., 160:433-440 (2002))。
ＣＲＰが肝臓で産生されるため、ＣＲＰおよび他の血清炎症性マーカーの増加が冠状動脈疾患の徴候である理由を解明する具体的な根拠は、未だ経験的にも存在していない。 Doggen, C. J. M. et al.,によって議論されるように、以下の因子の一つ以上が、観察された相関の機序を解明するものと推測されている：(１)動脈性病変内の内因性炎症および組織損傷、(２)ヘリコバクターピロリまたはクラミジア肺炎菌による前炎症、(３)インターロイキン-６を含むペプチドサイトカインの放出、または(４)相補系の活性化。
ロイコトリエン経路の最終産物は、アラキドン酸から誘導される強力な炎症性脂質媒介物である。 これらは、脂質酸化および／または前炎症性効果を介して、アテローム性動脈硬化症の進行およびアテローム硬化性プラークの不安定化に密接に関与することができる。 ＬＴＣ４、ＬＴＤ４およびＬＴＥ４は、血管狭窄を誘発することが知られている。
Allen et al., Circulation, 97:2406-2413(1998)は、ＬＴＣ４およびＬＴＤ４に応答して、アテローム性動脈硬化症が、ヒト心外膜冠状動脈の過剰活性を誘発できるロイコトリエン受容体の出現と関連する、という新たな機構を紹介している。 一方で、ＬＴＢ４は、強力な前炎症性薬剤である。 それ故に、ロイコトリエン経路でのこれら最終生成物の産生の増大は、心筋梗塞およびアテローム性動脈硬化症の危険因子とされ、一方で、炎症および炎症および血管狭窄／血管痙攣の双方は、心筋梗塞およびアテローム性動脈硬化症の病原論において、すでに周知の役割を果たす。 ノックアウトマウスにおける５-ＬＯ酵素のヘテロ接合での欠陥は、ＬＤＬＲ-/-マウスでのアテローム硬化性病変の大きさを、約９５％にまで減少させることが報告されている(Mehrabian et al., Circulation Research. 91:120(2002))。 しかしながら、ヒトの心筋梗塞またはアテローム性動脈硬化症におけるロイコトリエンの関与に関しては、このような遺伝学的証拠は、未だ報告されていない。 Mehrabian et al.,は、正常な個体での５-ＬＯプロモーター多型性と頚動脈内膜の肥厚との間の相関を突き止めるために行った非常に小規模の遺伝子相関試験を報告している。 しかし、そこで示されたデータは、小さなロイコトリエン産生量が、頚動脈アテローム性動脈硬化症と相関する、という矛盾した結果を示すに止まっている。
本願明細書に記載の染色体13q12-13での遺伝子は、心筋梗塞(ＭＩ)において主要な役割を果たすものとして同定されている。 本願明細書で、以下にＭＩ遺伝子と称する、この遺伝子は、本願明細書で、以下にＦＬＡＰと称する、タンパク質(ＡＬＯＸ５ＡＰまたはＦＬＡＰ)を活性化する５-リポオキシゲナーゼをコードする核酸を含む。 この遺伝子が、脳卒中および末梢動脈閉塞疾患においても役割を果たすことが示されている。
本願発明は、ＦＬＡＰまたはロイコトリエン経路の他の構成要素(例えば、ＦＬＡＰ、アラキドネート４-リポオキシゲナーゼ(５-ＬＯ)、ロイコトリエンＣ４シンセターゼ(ＬＴＣ４Ｓ)、ロイコトリエンＡ４ヒドロラーゼ(ＬＴＡ４Ｈ)、ロイコトリエンＢ４ １２-ヒドロキシデヒドロゲナーゼ(ＬＴＢ４ＤＨ)などの生合成酵素；受容体および／または酵素の結合剤；およびロイコトリエンＢ４受容体１(ＢＬＴ１)、ロイコトリエンＢ４受容体２(ＢＬＴ２)、システイニルロイコトリエン受容体１(ＣｙｓＬＴＲ１)、システイニルロイコトリエン受容体２(ＣｙｓＬＴＲ２)を含む、ロイコトリエンＬＴＡ４、ＬＴＢ４、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、ＬＴＥ４、ＣｙｓＬＴＲ１、ＣｙｓＬＴＲ２のための受容体)が関連する特定の疾患および状態(例えば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、末梢動脈閉塞疾患)のための治療(予防および／または治療)の方法に関する。 この方法は、次の方法、すなわち、心筋梗塞または心筋梗塞に対する感受性のための治療方法、心筋梗塞の予防的治療法、一過性脳虚血発作、一過性単眼視覚消失症または脳卒中、または脳卒中に対する感受性のための治療方法、跛行、末梢動脈閉塞疾患または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性のための治療方法、急性冠状動脈症候群(例えば、非持続性狭心症、非ＳＴ増大性心筋梗塞(ＮＳＴＥＭＩ)またはＳＴ増大性心筋梗塞(ＳＴＥＭＩ))のための治療方法、０.９未満の足関節上腕血圧比の患者での心筋梗塞、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の発症危険度を減少させるための治療方法、二次心筋梗塞または脳卒中の発症危険度を減少させるための治療方法、動脈(例えば、冠状動脈、頸動脈、および／または大腿動脈)の血流を再生させるためのアテローム性動脈硬化症のための治療(例えば、血管形成術、ステント、冠状動脈バイパス移植)を必要とする患者のための治療方法、０.９未満の足関節上腕血圧比の患者の治療方法、および／またはロイコトリエン合成を抑制するための(例えば、心筋梗塞を治療するための)治療方法を含む。
本願発明は、心筋梗塞(ＭＩ)のための予防的治療方法を提供する。 これら方法は、心筋梗塞に罹病しやすいヒトを選択し、in vivoでのロイコトリエン合成を阻害する治療上有効量の心筋梗塞治療剤、すなわち、５-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質(ＦＬＡＰ)および５-リポキシゲナーゼ(５-ＬＯ)から選択された少なくとも一つのタンパク質の活性を阻害することでロイコトリエン合成を阻害する心筋梗塞治療剤を含む組成物をヒトに投与する工程を含む。 これら方法は、予防的処置を行う以前および最中の動物、すなわち、ミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)レベルを効果的に低下させる量の心筋梗塞治療剤が投与された動物でのＭＰＯレベルをモニターする工程も含む。 これら方法は、予防的処置を行う以前および最中のヒト、すなわち、Ｃ-反応性タンパク質などの少なくとも一つの他の炎症マーカーモニターする工程をさらに含む。
本願発明の方法では、ロイコトリエン合成阻害剤は、その治療有効量で個体に投与される。 ロイコトリエン合成阻害剤として、ロイコトリエン合成経路の構成要素(例えば、ＦＬＡＰ、５-ＬＯ、ＬＴＣ４Ｓ、ＬＴＡ４ＨおよびＬＴＢ４ＤＨ)を、阻害または拮抗する薬剤が使用できる。 例えば、ロイコトリエン合成阻害剤として、本明細書に記載したように、ＦＬＡＰポリペプチド活性を阻害または拮抗する薬剤(例えば、ＦＬＡＰ阻害剤)および／またはＦＬＡＰ核酸発現を阻害または拮抗する薬剤(例えば、ＦＬＡＰ核酸アンタゴニスト)とすることができる。 その他の実施態様によれば、ロイコトリエン合成阻害剤として、ロイコトリエン生合成経路の他の構成要素(例えば、ＬＴＣ４Ｓ、ＬＴＡ４Ｈ、ＬＴＢ４ＤＨ)のポリペプチド活性および／または核酸発現を阻害または拮抗する薬剤とすることができる。 好ましい実施態様によれば、これら薬剤は、ＦＬＡＰまたは５-ＬＯの活性および／または核酸発現を改変する。 好ましい薬剤として、本明細書の薬剤一覧表Ｉに挙げたものがある。 その他の実施態様によれば、好ましい薬剤として、ＭＫ-０５９１とも称される１-((４-クロロフェニル)メチル)-３-((1,1-ジメチルエチル)チオ)-α、α-ジメチル-５-(２-キノリニルメトキシ)-１Ｈ-インドール-２-プロパン酸、ＢＡＹ-ｘ-１００５とも称される(Ｒ)-(＋)-α-シクロペンチル-４-(２-キノリニルメトキシ)-ベンゼン酢酸、Ａ-８１８３４とも称される３-(３-(１、１-ジメチルエチルチオ-５-(キノリン-２-イルメトキシ)-１-(４-クロロメチルフェニル)インドール-２-イル)-２、２-ジメチルプロピオンアルデヒドオキシム-０-２-酢酸、光学的に純粋な鏡像異性体、塩類、化学的誘導体および類似体；または、ジロイトン、アトレロイトン、ＺＤ-２１３８とも称される６-((３-フルオロ-５-(テトラヒドロ-４-メトキシ-２Ｈ-ピラン-４イル)フェノキシ)メチル)-１-メチル-２(１Ｈ)-キノリノン、ＭＫ-８８６とも称される１-((４-クロロフェニル)メチル)-３-((１、１ジメチルエチル)チオ)-α、α-ジメチル-５-(２-キノリニルメトキシ)-１Ｈ-インドール-２-プロピオン酸、ＣＪ-１３６１０とも称される４-(３-(４-(２-メチル-イミダゾール-１-イル)-フェニルスルファニル)-フェニル)-テトラヒドロ-ピラン-４-カルボン酸アミド、これらの光学的に純粋な鏡像異性体、塩類、化学的誘導体および類似体などがある。 その他の実施態様によれば、このような薬剤として、ロイコトリエン(例えば、ＬＴＡ４、ＬＴＢ４、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、ＬＴＥ４、ＣｙｓＬＴＲ１、ＣｙｓＬＴＲ２)の代謝または活性を改変し、例えば、ロイコトリエンアンタゴニストまたはロイコトリエンに対する抗体、およびロイコトリエン受容体(例えば、ＢＬＴ１、ＢＬＴ２、ＣｙｓＬＴＲ１およびＣｙｓＬＴＲ２)の活性を改変する薬剤がある。
実施例10で示した結果は、危険要素ＦＬＡＰおよびＬＴＡ4ハプロタイプを保有する患者の細胞、全血および尿での代謝レベルにおいて、ＦＬＡＰ阻害剤(ＤＧ-０３１、Bay-Ｘ-１００５とも呼ばれている)が、活性好中球によるロイコトリエンＢ４生産の２６％の減少、全血でのミエロペルオキシダーゼの１３％の減少、そして、尿ロイコトリエンＥ４の２７％の増加など、用量依存的な顕著な効果を奏することを実証している。 さらに、ＦＬＡＰ阻害剤の効果が途切れてもなお、感受性に富んだＣ-反応性タンパク質や血清アミロイドＡに関して効果が残存する証拠も示されている。 被験者の８５％が摂取していたスタチンが奏する効果に加えて、ＣＲＰおよび血清アミロイドＡの減少という有効性も認められた。
本願発明は、ロイコトリエン合成阻害剤とスタチンを含む組成物を提供する。 また、本願発明は、ヒトでのＣＲＰレベルを低減する薬剤を製造するためのロイコトリエン合成阻害剤とスタチンの使用も実現する。 これら組成物は、ヒトへの投与も意図しており、好ましくは、薬学的に許容可能な希釈剤、補助剤、賦形剤または担体（の少なくとも一つ）をさらに含む。 製剤化および共製剤化のための材料と方法は周知であり、その多くが、本願明細書で詳述されている。 ある実施態様によれば、本願組成物の製剤化によって、具体的には、持続型徐放性製剤を含めた経口投与用の丸剤またはカプセル剤のような、所望の単位用量製剤にすることも意図している。 他の実施態様によれば、経皮的な共投与、例えば、皮膚貼付剤の使用も意図している。 さらに他の実施態様によれば、具体的には、薬剤溶出ステントによって一方または双方の薬剤を投与することも意図している。
特に、これら組成物は、ロイコトリエン合成経路の構成要素、例えば、５-リポキシゲナーゼ、５-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質(ＦＬＡＰ)、ロイトクライエンＣ４シンターゼ、ロイクライエンＡ４ヒドラーゼ、アラキドン酸４-リポキシゲナーゼ、ロイコトリエンＢ４ 12-ヒドロキシデヒドロゲナーゼ、ロイコトリエンＡ４受容体、ロイコトリエンＢ４受容体、ロイコトリエンＣ４受容体、ロイコトリエンＤ４受容体、ロイコトリエンＥ４受容体、ロイコトリエンＢ４受容体１、ロイコトリエンＢ４受容体２、システイニルロイコトリエン受容体１、およびシステイニルロイコトリエン受容体２などが奏する活性を阻害するロイコトリエン合成阻害剤を含むことができる。 ＬＴ阻害剤であれば、いずれのものでも本願発明において利用可能であり、その内の幾つかのＬＴ阻害剤を本願明細書に記載している。 副作用を最小化ならしめる上で、ＬＴ合成経路の構成要素に特異的なＬＴ阻害剤が好ましい。 阻害剤の例として、タンパク質に作用する小分子の生物学的阻害剤（例えば、抗体物質、ペプチド）および核酸レベルで機能する生物学的阻害剤（例えば、アンチセンス核酸および干渉ＲＮＡ核酸および亜鉛フィンガータンパク質）の双方がある。
ロイコトリエン経路の構成要素の活性を阻害する好適な薬剤を、本願明細書の薬剤表Ｉに記載しており、そこには、１-((４-クロロフェニル)メチル)-３-((１,１-ジメチルエチル)チオ)-α,α-ジメチル-５-(２-キノリニルメトキシ)-１Ｈ-インドール-２-プロピオン酸、(Ｒ)-(＋)-α-シクロペンチル-４-(２-キノリニルメトキシ)-ベンゼン酢酸、３-(３-(１,１-ジメチルエチルチオ-５-(キノリン-２-イルメトキシ)-１-(４-クロロメチルフェニル)インドール-２-イル)-２,２-ジメチルプロピオンアルデヒド オキシム-０-２-酢酸、ジロートン、アトレロイトン、６-((３-フルオロ-５-(テロラヒドロ-４-メトキシ-２Ｈ-ピラン-４ イル)フェノキシ)メチル)-１-メチル-２(１Ｈ)-キンロリノン、１-((４-クロロフェニル)メチル)-３-((１,１ジメチルエチル)チオ)-α,α-ジメチル-５-(２-キノリニルメトキシ)-１Ｈ-インドール-２-プロピオン酸、および、４-(３-(４-(２-メチル-イミダゾール-１-イル)-フェニルスルファニル)-フェニル)-テロラヒドロ-ピラン-４-カルボン酸アミドが記載されている。 ある実施態様によれば、ＦＬＡＰの阻害剤を、ＬＴ阻害剤としている。 好ましい化合物のグループとして、本願明細書に記載のBAY X1005（DG-031とも呼ばれている）と、それに、本明細書の一部を構成するものとしてその全開示を援用するMohrs et alの米国特許第4,970,215号に記載の関連化合物がある。 他の態様によれば、ＬＴＡ４Ｈの阻害剤を、ＬＴ阻害剤としている。 その他の好ましい薬剤として、薬剤表IIに記載した薬剤や、本願明細書に記載のＬＴＡ４Ｈ剤がある。 それ以外に好ましい薬剤として、Penning et al., Med Chem. 2002 45 (16): 3482-90、Penning, Curr Pharm Des. 2001, 7 (3): 163-79、および、Penning et al., JMed Chem. 2000 43 (4): 721-35に記載の薬剤がある。
Figure 2007538003
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 上掲の薬剤の他に、以下のＬＴＡ4H阻害剤が、本明細書の一部を構成するものとしてその全開示を援用する米国公開特許公報第2003/0004101号に開示されている。
その他のＬＴＡ４Ｈ剤の一覧
１. １-[２-[４-(フェニルメチル)フェノキシ]エチル]-２-メチル-４-テトラゾリルピペリジン
２. １-[２-[４-(４-オキサゾリル)フェノキシ)フェノキシ]エチル]ピロリジン
３. ３-[メチル[３-[４-(２-チエニルメチル)フェノキシ]プロピル]アミノ]プロピオン酸
４. メチル３-[メチル[３-[４-(２-チエニルメチル)フェノキシ]プロピル]アミノ]プロピオン酸塩
５. ３-[メチル[３-[４-(３-チエニルメチル)フェノキシ]プロピル]アミノ]プロピオン酸
６. メチル-３-[メチル[３-４(３-チエニルメチル)フェノキシ]プロピル]アミノ]プロピオン酸塩
７. ３-[メチル[３-[４-(４-フルオロフェノキシ)フェノキシ]プロピル]アミノ)プロピオン酸
８. ３-[メチル[３-[４-(４-ビフェニルオキシ)フェノキシ]プロピル]アミノ]プロピオン酸
９. Ｎ-[３-[[３-[４-(フェニルメチル)フェノキシ]プロピル]メチルアミノ]プロピオニル]ベンゼンスルホンアミド
10. １-[２-[４-(フェニルメチル)フェノキシ]エチル]-２-メチル-４-(１Ｈ-テトラゾール-５-イル)ピペリジン
11. １-[２-[４-(フェニルメチル)フェノキシ]エチル]-４-(１Ｈ-テトラゾール-５-イル)ピペリジン
ある実施態様によれば、本願発明の組成物はスタチンを含み、そして、本願発明の方法はスタチンの投与を含む。 これに関連して、「スタチン」の用語は、３-ヒドロキシ-３-メチルグルタル補酵素Ａ(HMG-CoA)を、コレステロール前駆体のメバロン酸に変換する酵素であるHMG-CoA還元酵素の阻害剤に属する物質を指すものと理解すべきである。 この酵素に対する特異性に優れた無数の化合物が開発されており、また、ヒトの治療目的で認可されている。 本願発明の組成物は、薬剤表IIIに列挙したようなスタチン、例えば、ロブバスタチン(ビサスタチンとも呼ばれている)、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロバスタチン(メボリンとも呼ばれている)、シンバスタチン、プラバスタチン、ピタバスタチン、メバスタチン、クレバスタチン、ML-236A、ML-236B、MBV-530AおよびMB-530Bなどを含むことができる。
薬剤に関する言及に際しては、薬学的に許容可能な塩類、酸、塩基、エステル、プロドラッグ、代謝産物、および、これら薬剤に関するその他の一般的な製剤をも含まれているものと理解されたい。
新たに得られた知見から、血清ＣＲＰが、心臓血管病の罹患率／死亡率のマーカーとして同定されており、また、血清ＣＲＰの減少と良好な臨床状態とが相関していることが明らかにされている。 （例えば、Ridker et al., N. Engl. J. Med. 352(１): 20-28 (2005); Nissen et al., N. Engl. J. Med. 352(１): 29-38 (2005);および、Pearson et al., Circulation 107: 499-511 (2003)を参照されたい。) 血清ＣＲＰが、3.0mg/Lを超えると危険度が高く、1.0〜3.0であれば平均的であり、そして、１mg/Lにも満たない場合には危険度が低いものと考えられている。（Pearson et al.） 本願発明の組成物と方法は、血清ＣＲＰを抑制するための手段を提供する。 ＣＲＰの減少は、濃度基準で測定することが可能であり、その場合、ＣＲＰが3.0mg/L未満とする組成物や方法が好ましく、さらに好ましくは、目標濃度を、2.75mg/L、2.5mg/L、2.25mg/L、2.0mg/L、1.75mg/L、1.5mg/L、1.25mg/L、1.0mg/L、0.75mg/Lおよび0.5mg/Lに設定する。 ＣＲＰの減少は、百分率基準で測定することも可能であり、その場合、無薬療法や単一薬物療法との比較を経て、患者でのＣＲＰ減少率として臨床的有効性を評価する。 本願発明の組成物および方法は、当初のＣＲＰ測定値に応じて、10％〜90％またはそれ以上、例えば、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、または、これら数値間に設定された目標値で示されるＣＲＰ減少率を意図している。
本願発明は、ＭＰＯを抑制する方法およびＭＰＯレベルをモニターする方法も意図している。 ＭＰＯの減少は、濃度基準で測定することが可能であり、その場合、正常な集団でのＭＰＯの四分位点分布に基づいてＭＰＯレベルを抑制する（すなわち、第四分位点から第三分位点または第三分位点から第二分位点へ移行せしめる）組成物および方法が好ましい。 ＭＰＯの減少は、百分率基準で測定することも可能であり、その場合、無薬療法や単一薬物療法との比較を経て、患者でのＭＰＯ減少率として臨床的有効性を評価する。
本願発明の組成物および方法は、当初のＭＰＯ測定値に応じて、10％〜90％またはそれ以上、例えば、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、または、これら数値間に設定された目標値で示されるＭＰＯ減少率を意図している。
本願発明のある実施態様によれば、本願発明の組成物は、ヒトでの血清Ｃ反応性タンパク質(ＣＲＰ)を抑制する上で有効量のロイコトリエン合成阻害剤を含んでいる。 ある実施態様によれば、本願発明の組成物は、ヒトでの低密度血清リポタンパク質コレステロール(ＬＤＬ)および血清ＣＲＰを抑制する上で有効量のスタチンを含んでいる。 本願明細書に記載した少なくとも一つの予備的かつ短期間の研究によれば、スタチン療法によってすでにＣＲＰの抑制が認められたヒトに対して、ＬＴ阻害剤であるBAY-X1005を投与したところ、ＣＲＰのさらなる減少が確認されている。 長期にわたる組み合わせ療法を行ったところ、短期間の研究で認められた20％〜30％のＣＲＰの抑制効果を超える効果がさらに得られるであろう。
本願発明のある実施態様によれば、本願発明の組成物は、ヒトでの血清ＣＲＰを抑制する上で有効量のロイコトリエン合成阻害剤とスタチンを含んでいる。 本願発明の他の実施態様によれば、本願発明の組成物は、ヒトでの血清ＬＤＬ-Ｃを抑制する上で有効量のスタチンとロイコトリエン合成阻害剤とを含んでいる。 本願発明は、ヒトでのＣＲＰを相乗的に抑制する上で有効量のロイコトリエン合成阻害剤とスタチンとを含む組成物をも包含している。
ある実施態様によれば、ヒトでの血清Ｃ-反応性タンパク質を相乗的に抑制する上で有効量のロイコトリエン阻害剤とスタチンが、本願発明の組成物に取り込まれている。
BAY-X1005を用いて本願発明を実施するに際して、成人患者に対しては、１日に50〜750mgの用量を意図している。 １日に１回〜５回の頻度で、100〜500mgの用量を意図している。 １日に１回〜３回の頻度で、250〜375mgの用量が好ましい。
臨床的に認可されているスタチンの用量についても研究がされており、製造業者によって発表もされている。 好ましい実施態様によれば、スタチンは、ＬＴ阻害剤と共に丸剤やカプセル剤の形態で製剤化されて、１日に１回〜４回の頻度で投与される。
本願発明は、このような組成物を用いて、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患などの心臓血管疾患に関する危険要素を排除するための方法を提供する。 ある方法によれば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に関する一つ以上の危険要素が認められるヒトに対して、ロイコトリエン合成阻害剤とスタチンを含む組成物は、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に関する一つ以上の危険要素を抑制する上で有効な量で投与される。 好ましくは、その危険要素とは、血清ＬＤＬ-Ｃの増大であったり、あるいは、ＣＲＰまたは血清アミロイドＡなどの炎症マーカーの増大として出現する。 さらに好ましい実施態様によれば、ＬＤＬ-ＣとＣＲＰの双方の量が臨床的にも顕著に抑制されることとなり、この場合の臨床的に顕著な量とは、例えば、臨床研究における集団を分析した際に認められる好ましくない心臓血管状態に関する危険度についての統計学的に定量可能な顕著な抑制と相関する量のことを指す。
本願発明は、これら化合物を用いて、ヒトのＣＲＰを抑制するための方法も提供する。
ある実施態様によれば、本願発明は、Ｃ反応性タンパク質(ＣＲＰ)を抑制する処置を必要とするヒトに対して、ヒトの血清Ｃ反応性タンパク質を抑制する上で有効量の組成物、すなわち、前述したＬＴ阻害剤とスタチンを含む本願発明の組成物を投与することを含む、ヒトのＣＲＰを抑制する方法に関する。 ＣＲＰを抑制する処置を必要とするヒトは、遺伝的要素、ＣＲＰ分析、その他の炎症マーカーの分析、および、心筋梗塞の危険度に関する非遺伝的マーカーおよび非炎症マーカーの分析など、本願明細書に記載の様々な要素に基づいて同定することができる。 ある実施態様によれば、本願発明の方法は、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患からなるグループから選択される疾患や状態の危険要素を保有するヒト、すなわち、投与工程に移されるヒトを選択する工程を含む。 従って、本願発明は、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の危険要素を保有するヒトを選択し、そして、ヒトでの血清ＣＲＰを抑制する上で有効量の組成物、すなわち、ロイコトリエン合成阻害剤とスタチンとを含む組成物をヒトに投与する、工程を含む方法を提供する。 この方法は、組成物による治療効果をモニターするために、ヒトでの血清ＣＲＰを分析する工程をさらに含むことができ、組成物を投与した後の血清ＣＲＰの減少によって治療効果が指示される。
さらに他の実施態様によれば、用量または調薬量を調整するために、危険要素および／または毒性のモニターリングが利用される。 例えば、血清ＣＲＰおよび／またはＬＤＬおよび／または血清または尿ロイコトリエンの分析値が、目標レベル、すなわち、集団での残余の50パーセンテイル、40パーセンテイル、30パーセンテイル、20パーセンテイル、10パーセンテイル、１パーセンテイルと等価のレベル、または、これら数値間に設定された目標値にまで低減しない場合には、スタチンまたはロイコトリエン合成阻害剤の用量または調薬量は増大される。 上述したように、血清ＣＲＰを目標レベルにまで誘導したり、あるいは、特定のヒトでのＣＲＰを目標値(％)にまで減少させる目的で調薬量を調整するために、モニターリングを利用することもできる。
このモニターリングは、ＣＲＰの他にも、幾つかのパラメーターとも関連している。 多数のヒトにおいて認められるスタチンの効能は、血清ＬＤＬの抑制であって、また、本願発明の方法は、ヒトでの血清ＬＤＬおよび血清ロイコトリエンを抑制する上で有効量の本願発明を投与することを含む。 この実施態様では、血清ＬＤＬがモニターリングされる。 本願明細書に記載のその他のマーカー、例えば、血清アミロイドＡおよびミエロペルオキシダーゼもモニターリングされる。
本願発明のある実施態様によれば、処置を行うために選択された個体またはヒトとは、少なくとも一つの危険要素、すなわち、心筋梗塞、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に関する危険要素ハプロタイプ、FLAP核酸の多形性、５-ＬＯ遺伝子プロモーターの危険要素多形性などを保有する個体である。 本願発明は、ヒトのFLAP遺伝子型またはハプロタイプを決定し、および、心筋梗塞の危険性の大きさに相関するFLAP遺伝子型またはハプロタイプを保有するヒト、すなわち、処置を必要とするヒトを選択する工程を含む、心筋梗塞に対して感受性を有するヒトを選択する方法を提供する。 本願発明の方法は、FLAP遺伝子内部またはFLAP遺伝子近傍の少なくとも一つの危険要素ハプロタイプ、すなわち、表14に記載のハプロタイプ、表15に記載のハプロタイプ、表19に記載のハプロタイプ、ハプロタイプＢ４、ハプロタイプＢ５、ハプロタイプＢ６、ハプロタイプＡ４、ハプロタイプＡ５、ハプロタイプHapＢ、ハプロタイプHapＣ１、ハプロタイプHapＣ２、ハプロタイプHapＣ３、ハプロタイプHapＣ４-ＡおよびハプロタイプHapＣ４-Ｂの存在に基づいて、ヒトを選択する工程を含む。
本願発明の方法は、処置に供するヒトを選択する工程も含んでおり、前記個体でのマーカーSG13S106 (SNP DGOOAAHII)(配列番号：１、第176579位)、対立遺伝子Ｇを含むハプロタイプの存在は、心筋梗塞に対する感受性を有する個体を同定し；マーカーSG13S99 (DGOOAAFIU)、対立遺伝子Ｔ(配列番号：１、第138551位); SG13S377 (DGOOAAJFF)(配列番号：１、第169965位)、対立遺伝子Ｇ; SG13S106 [SNP DGOOAAHII](配列番号：１、第176579位)、対立遺伝子Ｇ; SG13S32 (配列番号：１、第198547位)、対立遺伝子Ａ; および、SG13S35 (配列番号：１、第206117位)、対立遺伝子Ｇを含むハプロタイプの存在は、心筋梗塞に対する感受性を有する個体を同定し；前記個体でのマーカーSG13S375 (配列番号：１、第164874位)、対立遺伝子Ｔ; SG13S25 (配列番号：１、第165553位)、対立遺伝子Ｇ; SG13S32 (配列番号：１、第176579位)、対立遺伝子Ａ;および、SG13S106 (配列番号：１、第198547位)、対立遺伝子ＧまたはＡを含むハプロタイプの存在は、心筋梗塞に対する感受性を有する個体を同定し；前記個体でのマーカーSG13S375 (SNP DGOOAAJFC)(配列番号：１、第164874位)、対立遺伝子Ｔ;および、SG13S25 (配列番号：１、第165553位)、対立遺伝子Ｇを含むハプロタイプの存在は、心筋梗塞に対する感受性を有する個体を同定し；前記個体でのマーカーSG13S375 (SNP DGOOAAJFC)(配列番号：１、第164874位)、対立遺伝子Ｔ;および、SG13S25 (配列番号：１、第165553位)、対立遺伝子Ｇ、およびSG13S32 (配列番号：１、第198547位)を含むハプロタイプの存在は、心筋梗塞に対する感受性を有する個体を同定し；前記個体でのマーカーSG13S106 (SNP DGOOAAHII)(配列番号：１、第176579位)、対立遺伝子Ｇ、SG13S30 (配列番号：１、第193840位)、対立遺伝子Ｇ;および、SG13S42 (配列番号：１、第203877位)、対立遺伝子Ａを含むハプロタイプの存在は、心筋梗塞に対する感受性を有する個体を同定し；前記個体でのマーカーSG13S377 (配列番号：１、第169965位)、対立遺伝子Ａ; SG13S114 (配列番号：１、第178096位)、対立遺伝子Ａ; SG13S41 (配列番号：１、第202045位)、対立遺伝子Ａ; および、SG13S35 (配列番号：１、第206117位)、対立遺伝子Ｇを含むハプロタイプの存在は、心筋梗塞に対する感受性を有する個体を同定する。
他の実施態様によれば、本願発明は、心筋梗塞に対する感受性と相関する少なくとも一つのFLAP多形性の有無に関してヒトの核酸を解析することを含む、心筋梗塞に対する感受性を保有するヒトを選択する方法を提供する。 心筋梗塞に対する感受性と相関するFLAP多形性として、SG13S377 (配列番号：１、第169965位)、対立遺伝子Ａ; SG13S114 (配列番号：１、第178096位)、対立遺伝子Ａ; SG13S41 (配列番号：１、第202045位)、対立遺伝子Ａ;および、SG13S35 (配列番号：１、第206117位)、対立遺伝子Ｇがある。 心筋梗塞に対する感受性と相関するその他のFLAP多形性として、SG13S375 (配列番号：１、第164874位)、対立遺伝子Ｔ、SG13S25 (配列番号：１、第165553位)、対立遺伝子Ｇ; SG13S32 (配列番号：１、第176579位)、対立遺伝子Ａ; および、SG13S106 (配列番号：１、第198547位)、対立遺伝子ＧまたはＡがある。 本願発明の方法は、少なくとも一つのFLAP多形性の有無、および増大したＣＲＰまたはＭＰＯの有無に基づいた個体の選択を行うことをさらに含めることができる。
その他の実施態様によれば、本願発明は、ヒトの核酸でのＦＬＡＰハプロタイプ、すなわち、SG13S377(配列番号：１、第169965位)、対立遺伝子Ａ; SG13S114 (配列番号：１、第178096位)、対立遺伝子Ａ; SG13S41 (配列番号：１、第202045位)、対立遺伝子Ａ、および、SG13S35 (配列番号：１、第206117位)、対立遺伝子Ｇのマーカーからなるハプロタイプの有無を分析し、および、処置に供するヒト、すなわち、ＦＬＡＰハプロタイプを具備した核酸を保有するヒトを選択する、工程を含む心筋梗塞(ＭＩ)の予防的治療方法を提供する。 この方法は、in vivoにてロイコトリエン合成を阻害する治療上有効量の心筋梗塞治療剤、すなわち、５-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質(ＦＬＡＰ)および５-リポキシゲナーゼ(５-ＬＯ)から選択される少なくとも一つのタンパク質の活性を阻害することによってロイコトリエン合成を阻害する心筋梗塞治療剤を含む組成物を、患者に投与することをさらに含む。
ある実施態様によれば、本願発明は、少なくとも一つの心筋梗塞の素因を有する患者での二次的心筋梗塞の危険度を抑制する方法、すなわち、５-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質(ＦＬＡＰ)および５-リポキシゲナーゼ(５-ＬＯ)から選択される少なくとも一つのタンパク質の活性を阻害することによってロイコトリエン合成を阻害する治療上有効量の心筋梗塞治療剤を患者に投与し、および、患者のロイコトリエンレベルを抑制する上で有効量のそれら治療剤の投与前および投与中の患者のミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)をモニターリングする、工程を含む方法を提供する。
その他の実施態様によれば、本願発明は、心筋梗塞に対して感受性を示すヒトをスクリーニングする方法、すなわち、ヒトの核酸でのＦＬＡＰハプロタイプ、すなわち、SG13S377(配列番号：１、第169965位)、対立遺伝子Ａ; SG13S114(配列番号：１、第178096位)、対立遺伝子Ａ; SG13S41(配列番号 ：１、第202045位)、対立遺伝子Ａ;および、SG13S35(配列番号：１、第206117位)、対立遺伝子ＧのマーカーからなるＦＬＡＰハプロタイプの有無を分析し、および、ＦＬＡＰハプロタイプの存在と増大した心筋梗塞の危険度との相関に基づいて、心筋梗塞に対して感受性を示す患者を同定する、工程を含む方法を提供する。
処置に供される患者またはヒトは、糖尿病、高血圧、高コレステロール血症、トリグリセリドの増大、lp(a)の増大、肥満、０.９未満の足関節上腕血圧比、喫煙歴または喫煙者、一過性脳虚血発作、一過性単眼視覚消失症、頸動脈内膜切除歴、無症候性頸動脈狭窄症、跛行、壊疽や潰瘍の形成または切断手術の必要性が認められる虚血肢、脈管性または末梢の動脈血管再生移植、血清ＬＤＬコレステロールの増大および／または血清ＨＤＬコレステロールの減少、200mg/dlを超える全血清コレステロール値、ロイコトリエン合成の増大などの少なくとも一つの家族系または既往系の危険要素を有しており、および／または、前出の心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、持続性狭心症、前出の一過性脳虚血発作、一過性単眼視覚消失症または脳卒中、無症候性頸動脈狭窄症まやは頸動脈内膜切除、アテローム性動脈硬化の少なくとも一つは、冠動脈の血流を回復させるための処置(例えば、血管形成術、ステント、血管再生術)を必要としている。
加えて、治療対象として選択された個体またはヒトは、例えば、Ｃ反応性タンパク質(ＣＲＰ)、血清アミロイドＡ、フィブリノーゲン、ロイコトリエン、ロイコトリエン代謝産物、インターロイキン-６、組織壊死因子-α、可溶性脈管細胞接着性分子(ｓＶＣＡＭ)、可溶性脈管間接着性分子(ｓＩＣＡＭ)、Ｅ-セレクチン、１型マトリックスメタロプロテアーゼ、２型マトリックスメタロプロテアーゼ、３型マトリックスメタロプロテアーゼ、および９型マトリックスメタロプロテアーゼ、ミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)、およびＮ-チロシンなどの炎症マーカー値の上昇が認められる。 本願発明は、少なくとも一つの増大した炎症マーカー値に関係して増大した血清レベルを低減するために、有効量の心筋梗塞治療剤を投与することを含む心筋梗塞の予防的治療法を提供する。
ある特定の実施態様によれば、本願発明は、in vivoにてロイコトリエン合成を阻害する治療上有効量の心筋梗塞治療剤を含む組成物を、心筋梗塞の予防が必要な患者に投与し、および、予防的処置を行う以前および最中のヒト、すなわち、ミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)レベルを効果的に低下させる量の心筋梗塞治療剤が投与されたヒトでのＭＰＯレベルをモニターリングする工程を含む、心筋梗塞(ＭＩ)の予防法を提供する。
また、本願発明は、ヒトから採取した血液試料とカルシウムイオン透過担体とを接触させて、ロイコトリエンの生成を刺激し、および、接触工程を終えた後に、対照と比較して認められたロイコトリエン生成の増大と心筋梗塞(ＭＩ)が進行する危険度の増大とが相関する条件下で、当該血液試料でのロイコトリエンの生成を分析する、工程を含む心筋梗塞が進行する危険度についてヒトをスクリーニングする方法も提供する。 これら方法で用いる対照は、処置するために選抜された被験者と同じ性別のヒト、あるいは、処置するために選抜された被験者と同じ年齢のヒトである。
ＬＴアンタゴニストを利用する治療法によった場合、スタチンですでに処置されたヒトは、本願発明の恩恵を享受することができる。 よって、さらに別の本願発明の実施態様とは、血清ＬＤＬを抑制するためのスタチン治療、すなわち、ヒトでの血清Ｃ反応性タンパク質(血清ＣＲＰ)を任意に抑制するスタチン治療を施したヒトを選択し、および、ヒトでのＣＲＰをさらに抑制する上で有効量のロイコトリエン合成アンタゴニストをヒトに投与する工程を含む、ヒトでのＣＲＰを抑制する方法である。
さらに別の本願発明の実施態様とは、血清Ｃ反応性タンパク質(血清ＣＲＰ)を抑制する処置が必要なヒトを同定し、スタチンを含む組成物をヒトに投与し、および、ロイコトリエン合成阻害剤を含む組成物をヒトに投与する工程を含み、そして、スタチンとロイコトリエン合成阻害剤が、ヒトでの血清ＣＲＰを抑制する上で有効量で投与される、ヒトでのＣＲＰを抑制する方法である。 前述したように、スタチンとＬＴ阻害剤は、単一の組成物として同時に投与することができ、また、別個の組成物として同時に投与することができ、あるいは、連続して投与することもできる。 日々の投与形態を、投与計画に応じて、例えば、ある薬剤を、毎日２回投与する一方で、他の薬剤を、毎日３回投与するなど、ある時は同時投与とし、また、ある時は個別投与とすることもできる。
本願発明のある特定の実施態様によれば、処置に供するために選抜された動物またはヒトは、心筋梗塞、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の危険要素ハプロタイプ；ＦＬＡＰ遺伝子での危険要素ハプロタイプ；ＦＬＡＰ核酸での多形性；５-ＬＯ遺伝子プロモーターでの危険要素多形性；糖尿病、高血圧、高コレステロール血症、トリグリセリドの増大、lp(a)の増大、肥満、０.９未満の足関節上腕血圧比(ＡＢＩ)、喫煙歴または喫煙者、一過性脳虚血発作、一過性単眼視覚消失症、頸動脈内膜切除歴、無症候性頸動脈狭窄症、跛行、壊疽や潰瘍の形成または切断手術の必要性が認められる虚血肢、脈管性または末梢の動脈血管再生移植、炎症マーカー(例えば、Ｃ反応性タンパク質(ＣＲＰ)、血清アミロイドＡ、フィブリノーゲン、ロイコトリエン、ロイコトリエン代謝産物、インターロイキン-６、腫瘍壊死因子-α、可溶性脈管細胞接着性分子(ｓＶＣＡＭ)、可溶性脈管間接着性分子(ｓＩＣＡＭ)、Ｅ-セレクチン、１型マトリックスメタロプロテアーゼ、２型マトリックスメタロプロテアーゼ、３型マトリックスメタロプロテアーゼ、９型マトリックスメタロプロテアーゼ、ミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)、およびＮ-チロシンなどのマーカー)の増大；ＬＤＬコレステロールの増大および／またはＨＤＬコレステロールの減少、ロイコトリエン合成の増大などの少なくとも一つの危険要素を有しており、および／または、前出の心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、持続性狭心症、前出の一過性脳虚血発作、一過性単眼視覚消失症または脳卒中、無症候性頸動脈狭窄症まやは頸動脈動脈内膜切除、アテローム性動脈硬化の少なくとも一つは、冠動脈の血流を回復させるための処置(例えば、血管形成術、ステント、血管再生術)を必要としている。
さらに、本願発明は、動物(例えば、血液、血清、血漿または尿の試料)でのロイコトリエン代謝産物(例えば、LTE4、LTD4、LTB4)を分析またはモニターリングをすることによって、動物での心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、アテローム性動脈硬化、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の危険度を分析する方法も意図している。 処置に供するために選抜された動物またはヒトでは、ロイコトリエン、あるいは、LTC4、LTD4、LTB4およびLTE4などのロイコトリエン代謝産物の数値が高い。 ロイコトリエンおよびロイコトリエン代謝産物のレベルは、動物の血清、血漿、血液または尿で測定することができる。 ロイコトリエン代謝産物のレベルの増大は、危険度の高まりを指し示すものである。 本願発明は、患者から得た被験試料(例えば、好中球を含む試料)でのロイコトリエンまたはロイコトリエン代謝産物の産生をカルシウムイオン透過担体を用いて刺激し、および、対照のレベルとロイコトリエンまたはロイコトリエン代謝産物のレベルとを比較することによって、患者での心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、アテローム性動脈硬化、脳卒中、一過性脳虚血発作、一過性単眼視覚消失症、無症候性頸動脈狭窄症、末梢動脈閉塞疾患、跛行または虚血肢の危険度の高さを分析する方法も包含している。 対照のレベルと比較して、ロイコトリエンまたはロイコトリエン代謝産物の産生レベルが顕著に大きいことは、危険度の高まりを指示するものである。
さらに、本願発明は、処置前の動物でのロイコトリエンまたはロイコトリエン代謝産物のレベルを分析またはモニタリングし、および、その処置前のレベルと、処置中または処置後に分析したロイコトリエンまたはロイコトリエン代謝産物のレベルとを比較することによって、ロイコトリエン合成阻害剤を用いた処置への応答度を分析する方法をも意図している。 処置前と比較して、処置中または処置後のレベルが顕著に低いことは、ロイコトリエン合成阻害剤を用いた処置の効果を指示するものである。 処置前、処置中および処置後の患者から得た血清、血漿、血液または尿中のロイコトリエンのレベルをモニタリングすることができる。 さらに、本願発明は、患者から得た第一の被験試料(例えば、好中球を含む試料)でのロイコトリエンまたはロイコトリエン代謝産物の産生をカルシウムイオン透過担体を用いて刺激し、および、そのロイコトリエンまたはロイコトリエン代謝産物のレベルと、処置中または処置後の患者から得た第二の被験試料でのロイコトリエンまたはロイコトリエン代謝産物のレベルとを比較することによって、ロイコトリエン合成阻害剤を用いた処置への応答度を分析する方法をも意図している。 第二の被験試料でのロイコトリエンまたはロイコトリエン代謝産物の産生レベルが、第一の被験試料での産生レベルよりも顕著に小さいことは、処置効果を指示するものであり、例えば、処置または治療剤によって、動物のロイコトリエンレベルは、一般的なヒトの集団における平均値にまで、あるいはその平均値を下回るレベルにまで抑制される。
同様に、本願発明は、処置前、処置中または処置後の個体での炎症マーカーのレベルを分析またはモニターリングすることで、ロイコトリエン合成阻害剤を用いた処置の効果を評価する方法を含む。 処置中または処置後の炎症マーカーのレベルが、処置前の炎症マーカーのレベルよりも顕著に低ければ、処置の効果が認められたことになる。
スタチンを含む本願発明の組成物の効果を検証するために、この組成物を投与したヒトの血清での危険要素マーカーの分析に基づいて、全コレステロール、ＬＤＬ-Ｃおよび／またはトリグリセリドを定量することができる。 処置中または処置後の血清中の全コレステロール、ＬＤＬ-Ｃおよび／またはトリグリセリドのレベルが、処置前の全コレステロール、ＬＤＬ-Ｃおよび／またはトリグリセリドのそれよりも顕著に低ければ、処置の効果が認められたことになる。
本願発明は、本願明細書に記載した通り、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中、末梢動脈閉塞疾患、および／またはアテローム性動脈硬化症を治療するための医薬の製造のためのロイコトリエン合成阻害剤の使用、そして、ロイコトリエン合成を抑制させる医薬の製造のためのロイコトリエン合成阻害剤の使用に関する。
多様な系統情報を、心筋梗塞に関連する染色体13q12-13での遺伝子をマッピングする強力な遺伝子シェアリング方法に取り込んだ。 1,000マイクロサテライトマーカーのフレームワークマップを用いた心筋梗塞に関する感受性遺伝子についてのゲノム規模の調査によって、13q12-13に対する関連性が示唆される遺伝子座が明らかになった。 連鎖解析には、６度の減数分裂を経た、６０家族、１５９名の女性心筋梗塞患者が参加した。 まず、心筋梗塞の危険度に密接に関与する遺伝子因子を有する多数の患者を集めるために、女性心筋梗塞患者だけを連鎖解析の対象とした。 アイスランドの心筋梗塞患者の集団から得た試料を用いた以前の疫学的研究によれば、女性心筋梗塞患者の同胞での相対危険度は、男性発端者の同胞での相対危険度よりも顕著に高かった(1.59(CI 1.47-1.73)対1.35(CI 1.28-1.42))(未公開データ)ため、心筋梗塞についての遺伝子因子は、男性よりも女性で強いことが示された。 マーカーＤ１３Ｓ２８９が、最高のＬＯＤスコア(２.５)を示した。 家族に関するＬＯＤスコアは、候補領域に１４個のマイクロサテライトマーカーを添加した後も同じであった。 さらに他のマーカーが介在することで、最高のＬＯＤスコアを示したマーカーの近辺において、０.７〜０.８の分散度で共有可能な情報が付加された。 この連鎖解析では、心筋梗塞に寄与する遺伝子を、染色体13q12においてマッピングした。
次いで、染色体13q12-13での候補心筋梗塞遺伝子座を、マイクロサテライトマーカーを併用して最後にマッピングした。 心筋梗塞の患者および対照者は、100Kb未満のマーカー間の平均間隔を有するマイクロサテライトマーカーを用いて、まずは、１２Mbの候補領域が遺伝子決定された。 心筋梗塞候補遺伝子座での遺伝子型が決定されたすべてのマイクロサテライトマーカーを利用した最初のハプロタイプ連鎖解析は、女性心筋梗塞と顕著に関連した４つおよび５つのマイクロサテライトマーカーで構成されるいくつかの二次的なハプロタイプをもたらした（例えば、以下の表１４および表１５を参照）。 これらの二次的ハプロタイプのすべてに共通の領域は、マーカーＤＧ１３Ｓ１６６およびＤ１３Ｓ１２３８によって規定される。 この領域は、唯一の遺伝子(ＦＬＡＰ核酸配列)を含む。 マーカーＤＧ１３Ｓ１６６およびＤ１３Ｓ１２３８に対応する対立遺伝子０および-２のそれぞれに関与する二つのマーカーハプロタイプは、患者で過剰量が認められる。 これらの遺伝子についての特定の変異体が、心筋梗塞との関連の観点から検索された。
ＦＬＡＰ遺伝子でのＳＮＰについてスクリーニングを行うために、エキソンおよびイントロンの両方について、遺伝子全体を配列決定した。 最初に、遺伝子内の９つのＳＮＰを、患者および対照者において遺伝子決定した。 ＦＬＡＰ遺伝子の近傍またはＦＬＡＰ遺伝子内での他のマイクロサテライトマーカーを、すべての患者および対照者に関して、遺伝子決定した。 さらに、ＦＬＡＰ遺伝子に対して５'から200Kb以内に位置する５つの公知のＳＮＰを、患者および対照者に関して、遺伝子決定した。 これらのマーカーをも含む患者と対照者の研究におけるハプロタイプ連鎖解析は、女性の心筋梗塞に有意に関連する同じハプロタイプの異種変異体の幾つかを示した(例えば、表８を参照）。 表９は、本明細書において、女性心筋梗塞「危険要素」ハプロタイプと称する、これら女性心筋梗塞危険度ハロタイプの代表例である二つのハプロタイプを示している。 女性心筋梗塞「危険要素」ハプロタイプを保有する男性心筋梗塞患者の相対的危険度は増大しており(例えば、表９を参照)、このことは、女性心筋梗塞「危険要素」ハプロタイプが、心筋梗塞を保有する男性での危険度を高めることを示唆している。 さらに、これらの結果は、ＦＬＡＰ遺伝子が、心筋梗塞感受性遺伝子であるという仮説を支持するものである。
心筋梗塞、そして、脳卒中および末梢動脈閉塞疾患に関連するＳＮＰハプロタイプ
心筋梗塞に関連するＳＮＰマーカーだけを保有するハプロタイプを同定する過程で、ＦＬＡＰ遺伝子の配列決定および遺伝子の領域フランキングによって、その他のＳＮＰを同定した。 現時点で、１３４３名の患者および関連性の認められない６２４名の対照者において、４５個のＳＮＰをすべて遺伝子決定した。 患者で認められた相関する二つのシリーズのＳＮＰハプロタイプを入念に検討して、それらを表７に示した。 これらのハプロタイプの長さは、３３kb〜６９kbの範囲で変化し、これらのハプロタイプは、連鎖性が不平衡な１つまたは二つのブロックをカバーする。 双方のシリーズのハプロタイプ(HapＡおよびHapＢ)は、ＳＮＰ ＳＧ１３Ｓ２５の共通の対立遺伝子Ｇを含む。 北米の集団で分析で同定されたHapC2(実施例13を参照)も、ＳＮＰ ＳＧ１３Ｓ２５の対立遺伝子Ｇを含んでいる。 Ａシリーズでのすべてのハプロタイプは、ＳＮＰ ＳＧ１３Ｓ１１４を含み、一方で、Ｂシリーズでのすべてのハプロタイプは、ＳＮＰ ＳＧ１３Ｓ１０６を含む。 Ｂシリーズにおいて、ハプロタイプＢ４、Ｂ５およびＢ６は、２を超える相対危険度(ＲＲ)を有しており、10％を超える対立遺伝子頻度を有する。 Ａシリーズでのハプロタイプは、わずかに低いＲＲと、さらに低いｐ値を有しているが、高い頻度(１５〜１６％)を有している。 シリーズＢおよびＡでのハプロタイプは、非常に強く相関しており、すなわち、Ｂでのハプロタイプは、Ａでのハプロタイプのサブセットを規定する。 したがって、シリーズＢでのハプロタイプは、Ａよりもさらに特異的である。 しかし、シリーズＡでのハプロタイプは、より感受性であるので、すなわち、ＡよりもＢにおいて、集団性危険度が少ないことが認められているので、複数の変異を保有する個体を得ることになる。 さらに、これらのハプロタイプは、(５５歳以前に最初の心筋梗塞を発病したと定義される)初期に発病した患者について、両性において、類似の危険度比および対立遺伝子頻度を示す。 それに加えて、既知の危険因子、例えば、高血圧、高コレステロール、喫煙および糖尿病、を保有する種々の患者グループを分析しても、これらのハプロタイプとの有意な相関は認められず、このことは、ＦＬＡＰ遺伝子のハプロタイプが、心筋梗塞に対する固有の遺伝子感受性因子であることを示唆するものである。
北米コホート（実施例12に記載）の分析によって、表33（実施例13）において実証された心筋梗塞に関連する他のハプロタイプＣが同定された。 HapＣは、マーカーSG13S375のＴ対立遺伝子によって定義される。 SG13S375のＴ対立遺伝子の他に、SNPsを含むHapＣハプロタイプには４つの変異体が存在する。 HapＣ２は、SNPs SG13S375の対立遺伝子ＴとSNPs SG13S25の対立遺伝子Ｇによって定義される。 HapＣ３は、SNPs SG13S375の対立遺伝子Ｔ、SNP SG13S25の対立遺伝子Ｇ、およびSNP SG13S32の対立遺伝子Ａによって定義される。 HapＣ４-Ａは、SNPs SG13S375の対立遺伝子Ｔ、SNP SG13S25の対立遺伝子ＧおよびSNP SG13S32の対立遺伝子Ａに加えて、SNP SG13S106の対立遺伝子Ａによって定義される。 HapＣ４-Ｂは、SNPs SG13S375の対立遺伝子Ｔ、SNP SG13S25の対立遺伝子ＧおよびSNP SG13S32の対立遺伝子Ａに加えて、SNP SG13S106の対立遺伝子Ｇによって定義される。 HapＣ４-ＡおよびHapC４-Ｂは、HapＡおよびHapＢに相関する。
脳卒中と末梢動脈閉塞疾患は、心筋梗塞に密接に関連する（そのすべてがアテローム性動脈硬化に由来している）疾患であるので、心筋梗塞発症の危険性に関与するFLAP遺伝子内のSNPハプロタイプが、脳卒中および／または末梢動脈閉塞疾患の発症にも関与しているか否かを決定するための分析を行った。 表２０は、ハプロタイプＡ４によって、心筋梗塞の発症危険性が増大するにつれて、脳卒中の発症危険性も同程度に増大することを示している。 表３４は、スコットランドコホート（実施例14）における脳卒中の危険度が、HapＡに関連していることを実証している。 重要度はさほど大きくはないが、ハプロタイプＡ４は、末梢動脈閉塞疾患の進行にも関与する危険性が認められる。
ＦＬＡＰ核酸は、５-リポオキシゲナーゼを活性化するタンパク質をコードし、５-リポオキシゲナーゼ(５-ＬＯ)との組み合わせが、ロイコトリエン合成に必要とされている。
ＦＬＡＰは、５-ＬＯと協同して作用し、アラキドン酸からロイコトリエンを合成する最初の工程を触媒する。 ＦＬＡＰは、アラキドン酸の５(Ｓ)-ヒドロペルオキシ-６-トランス-８、11、14-シス-エイコサテトラエン酸(５-HPETE)への変換、および、アリル性エポキシド５(Ｓ)-トランス-７、９-トランス-11、14-シス-エイコサテトラエン酸（ロイコトリエンＡ４、ＬＴＡ４)への変換を触媒する。
ロイコトリエンは、単核細胞、マクロファージおよび好中球のような、白血球を誘導する骨髄によって主に産生される炎症性プロセスでの非常に強力な生物学的媒介体のファミリーに属する。 ＦＬＡＰおよび５-ＬＯの双方は、アテローム性動脈硬化症病変内に検出され(Proc Natl Acad Sci USA. 2003年２月４日; 100(3):1238-43)、血管自身がロイコトリエンの供給源にもなりうる。 心筋梗塞-危険度ＦＬＡＰハプロタイプが、高い血清ロイコトリエンレベルと関連することが、本願明細書に記載されている。 かつてアテローム性動脈硬化症病変を保有した個体でのロイコトリエン産生力の改善は、局所的に血栓を形成するプラークの不安定化または繊維状帽の脆砕性を招く場合がある。 このような現象が、冠状動脈内で発生すると、心筋梗塞または非持続性狭心症を招く。 脳血管内でこのような現象が発生すると、発作または一過性の虚血性発作を引き起こす。 体肢に通じる大動脈でこのような現象が発生すると、抹消動脈閉塞性疾患(PAOD)を有する患者において、肢部虚血を引き起こしたり、悪化させたりする。 それ故に、高いロイコトリエンレベルをもたらす遺伝子的影響素因を有する個体は、以前に経験した心筋梗塞のようなアテローム性動脈硬化症に起因する現象の発症危険度が高くなる。
ＦＬＡＰ機能の阻害剤は、細胞質から細胞膜への５-ＬＯの転座を妨げ、５-ＬＯの活性 化を阻害し、ロイコトリエン合成を減少させる。
これら発見に基づいて、ロイコトリエン阻害剤、例えば、ロイコトリエンの生合成を阻害するか、またはロイコトリエン受容体を介したシグナル伝達を拮抗する薬剤を用いて、心筋梗塞(ＭＩ)および急性冠動脈症候群(ＡＣＳ)ならびに脳卒中および末梢動脈閉塞疾患を治療する方法が利用できるようになる。 本願明細書で使用される「治療」の語は、疾患または状態に関連する症状を改善するだけでなく、疾患または状態の発症の防止または遅延；疾患または状態の二次的症状の発生の防止または遅延；および／または、疾患または状態の重篤度または頻度を減らすことを指す。 アテローム性動脈硬化症の場合には、「治療」はさらに、プラークの成長の最小化または減退を指す。 さらに、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の個体の危険度を評価するための方法も利用可能である。 好ましい実施態様によれば、治療される個体は、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に感受性である(危険度が増加している)個体であり、例えば、本願明細書に記載される代表的な標的集団の一つに属する個体である。
代表的な標的集合
本願発明の実施態様での心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の危険性を有する個体とは、本願明細書では、ＦＬＡＰにおける危険要素ハプロタイプを有する個体を指す。 ある実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連するハプロタイプは、13ql2-13遺伝子座に、マーカーSG13S99、SG13S25、SG13S377、SG13S106、SG13S32およびSG13S35を含む。 他の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連するハプロタイプは、13ql2遺伝子座に、マーカーSG13S99、SG13S25、SG13S106、SG13S30およびSG13S42を含む。 第三の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連するハプロタイプは、13ql2-13遺伝子座に、マーカーSG13S25、SG13S106、SG13S30およびSG13S42を含む。 第四の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連するハプロタイプは、13ql2-13遺伝子座に、マーカーSG13S99、SG13S25、SG13S114、SG13S89およびSG13S32を含む。 第五の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連するハプロタイプは、13ql2-13遺伝子座に、マーカーSG13S25、SG13S114、SG13S89およびSG13S32を含む。 その他の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連するハプロタイプは、13ql2-13遺伝子座に、マーカーSG13S375を含む。 その他の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連するハプロタイプは、13ql2-13遺伝子座に、マーカーSG13S25およびSG13S375を含む。 その他の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連するハプロタイプは、13ql2-13遺伝子座に、マーカーSG13S25、SG13S375およびSG13S32を含む。 さらにその他の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連するハプロタイプは、13ql2-13遺伝子座に、マーカーSG13S25、SG13S375、SG13S32およびSG13S106を含む。 心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連するその他のハプロタイプとして、表４、８、９、14、15、17および19に記載のハプロタイプの他に、表13に記載のマーカーを含むハプロタイプなどがある。
ＦＬＡＰ危険要素ハプロタイプを有する個体における心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の危険度の増加は、血液および／または動脈血管壁内での、動脈血管壁または骨髄で誘導される炎症性細胞によるロイコトリエン産生の上昇とも論理的にも符合する。 ＦＬＡＰ危険要素ハプロタイプは、高い血清ロイコトリエンＥ４レベルとも関連することが、本願明細書において示されている。 血清ロイコトリエンレベル(特に、ロイコトリエンＥ４)が、心筋梗塞の患者における血清ＣＲＰレベルと相関することも、本願明細書において示されている。 それ故に、ＦＬＡＰ遺伝子の変異は、(血管内および／または全身での)ロイコトリエンレベルの増大を招き、心筋梗塞の危険因子として示されたＣＲＰレベルも高くなる。 それ故に、ＦＬＡＰ危険要素ハプロタイプを有する個体は、高い血清Ｃ反応性タンパク質を有すると考えられる。 血清Ｃ反応性タンパク質のレベルは、危険要素ＦＬＡＰハプロタイプの存在に起因する脂質蓄積とアテローム発生によって引き起こされる動脈壁の炎症レベルとしても使用することができる。
本願発明のその他の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の危険性を有する個体とは、ＦＬＡＰ遺伝子の多型性を有する個体であって、また、本願明細書でいう多型性とは、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性の指標でもある。 本願明細書で使用する「遺伝子」の語は、ポリペプチドをコードする核酸のみならず、プロモーター領域、転写改善要素、スプライシングドナー／アクセプター部位、および他の非転写核酸要素をも指す。 代表的な多型性としては、以下の表１３に挙げたものがある。
本願発明のさらにその他の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の危険性を有する個体とは、本願明細書では、プロモーター領域内の５-ＬＯ遺伝子に危険要素多型性を有する個体のことを指す。
第四の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の危険性を有する個体とは、炎症性マーカー値が増大した個体を指す。 本願明細書で使用する「増大した炎症性マーカー値」とは、統計学的に有意な量よりも多く、対照の個体において通常認められる量よりも多いか、または、最低測定値(例えば、平均または中央値より低い値、四分位点または五分位点の最低値)に関連する集合における疾患危険度を、高測定値(例えば、平均または中央値より高い値、第２、第３または第４の四分位点；第２、第３、第４または第５の五分位点)のそれと比較して得られる炎症性マーカーの量である。 「炎症性マーカー」とは、個体での炎症の存在の指標となる分子、例えば、Ｃ反応性タンパク質(ＣＲＰ)、血清アミロイドＡ、フィブリノーゲン、ロイコトリエンレベル（例えば、ロイコトリエンＢ４、ロイコトリエンＣ４）、ロイコトリエン代謝産物(例えば、ロイコトリエンＥ４）、インターロイキン-６、組織壊死因子-α、可溶性脈管細胞接着性分子(ｓＶＣＡＭ)、可溶性脈管間接着性分子(ｓＩＣＡＭ)、Ｅ-セレクチン、１型マトリックスメタロプロテアーゼ、２型マトリックスメタロプロテアーゼ、３型マトリックスメタロプロテアーゼ、および９型マトリックスメタロプロテアーゼ、ミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)、Ｎ-チロシン、またはその他のマーカー（例えば、Doggen, C. J. M. et al., J. Internal Med., 248:406-414（2000）; Ridker, P. M. et al., New England. J. Med. 1997:336: 973-979, Rettersol, L. et al., 2002: 160:433-440; Ridker, P. M. et al., New England, J. Med., 2002: 347:1557-1565; Bermudez, E. A. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2002: 22:1668-1673）、などの分子を指す。 ある特定の実施態様によれば、このような炎症性マーカーの存在は、血清中または尿中で測定することができる。
第五の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の危険性がある個体では、ＬＤＬコレステロールが多く、および／または、ＨＤＬコレステロールレベルが低い。 例えば、米国心臓協会は、100mg/dl未満のＬＤＬコレステロールレベルが最適であり；100〜129mg/dlのレベルは最適値に近く／最適値より上であり；130〜159mg/dlがボーダーラインより上であり；160〜189mg/dlは高い値域であり；190mg/dlを超えると非常に高い、との見解を示している。 従って、ＬＤＬレベルの高さが故に心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の危険性が認められる個体は、例えば、最適値に近い／最適値より上のレベル、ボーダーラインよりも高いレベル、高いレベルまたは非常に高いレベルという表現が用いられる、100mg/dlを超えるコレステロールを有する。 同様に、米国心臓協会は、40mg/dl未満のＨＤＬコレステロールレベルは、心臓疾患の危険性が大きいことを示しており、60mg/dl以上のＨＤＬコレステロールレベルは、心臓疾患に対して予防的である、との見解を示している。 それ故に、ＨＤＬレベルが低いために心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の危険性が認められる個体とは、例えば、40mg/dl未満のＨＤＬコレステロールといった、60mg/dl未満のＨＤＬコレステロールを保有する個体である。
第六の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患についての危険性がある個体では、ロイコトリエン合成が増加している個体である。 本願明細書で用いる「ロイコトリエン合成の増加」の表現は、統計学的に有意な量よりも多く、対照の個体において通常認められるロイコトリエン産生量よりも多いか、または、最低測定値(例えば、平均または中央値より低い値、四分位点または五分位点の最低値)ににおける疾患危険度を、高測定値(例えば、平均または中央値より高い値、第２、第３または第４の四分位点；第２、第３、第４または第５の五分位点)のそれと比較して得られるロイコトリエン産生量である。 例えば、ＦＬＡＰ危険要素ハプロタイプは、高い血清ロイコトリエン合成レベルと相関する。 個体でのロイコトリエン合成の増加は、種々の方法によって評価することができる。 例えば、個体から得た試料(例えば、血清、血漿または尿)に含まれるロイコトリエン代謝物(例えば、ＬＴＥ４)を評価することで、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中、末梢動脈閉塞疾患またはアテローム性動脈硬化症の危険度の増大について評価できる。 血液、細胞または組織を含む試料を各個体から採取して、好適な分析条件下で、ex vivoで、それらをロイコトリエンまたはロイコトリエン代謝産物に関して検査するために用いることができる。 ロイコトリエン代謝物レベルの増大、および／または、ex vivoでのロイコトリエンの産生レベルの増大は、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中、末梢動脈閉塞疾患またはアテローム性動脈硬化症の危険度が増大していることを示す。
さらにその他の実施態様での心筋梗塞、急性冠動脈症候群または脳卒中についての危険性がある個体とは、心筋梗塞、急性冠動脈症候群または脳卒中のいずれかを経験しているか、または持続性狭心症を患っており、それ故に、二次的な心筋梗塞、急性冠動脈症候群または脳卒中の危険性がある個体である。 その他の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患についての危険性がある個体とは、アテローム性動脈硬化症を患った個体、または動脈血流を再生するための処置(例えば、血管形成術、ステント、冠状動脈バイパス移植)を必要とする個体である。
さらにその他の実施態様での心筋梗塞、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患についての危険性がある個体として、０.９未満の足関節上腕血圧比を有する個体、脳卒中の危険性のある個体、一度またはそれ以上の一過性脳虚血発作を経験した個体、一過性単眼視覚消失症を経験した個体、頸動脈内膜切除を経験した個体、または無症候性頸動脈狭窄症を有する個体、末梢動脈閉塞疾患に罹患する危険のある個体、壊疽や潰瘍の形成に至るか、あるいは切断手術が必要となる跛行、虚血肢を有する（または罹患経験のある）個体、または、血管再生術を受けた経験のある個体などが挙げられる。
さらにその他の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患についての危険性がある個体とは、糖尿病、高血圧、高コレステロール血症、トリグリセリドの増大（例えば、＞200mg/dl）、lp(a)増大、肥満、０.９未満の足関節上腕血圧比(ＡＢＩ)、および／または喫煙歴または喫煙者である個体である。
心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患についての危険性がある個体は、これらに典型的な標的集団の一つ以上の集団に属する場合がある。 例えば、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、一過性脳虚血発作、一過性単眼視覚消失症、または脳卒中の少なくとも一方を経験しており、かつ炎症性マーカーレベルが高い個体などである。 本願明細書で使用する「標的集団内の個体」は、前述した典型的な標的集団代表的な標的集合の一つ以上の集団に属する心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患についての危険性がある個体を指す。
危険要素ハプロタイプの評価
本願明細書で使用する「ハプロタイプ」の語は、表１３に記載したような遺伝子マーカーの組み合わせ(「対立遺伝子」)を指す。 ある実施態様によれば、ハプロタイプは、一つ以上の対立遺伝子（例えば、単一のＳＮＰを有するハプロタイプ））、二つ以上の対立遺伝子、三つ以上の対立遺伝子、四つ以上の対立遺伝子、または五つ以上の対立遺伝子を含む。 遺伝子マーカーとは、ＦＬＡＰに関連する「多型性部位」に位置する特定の「対立遺伝子」である。 集団(天然集団、または合成分子などの合成集団、例えば、合成分子のライブラリー)内での一つ以上の配列が存在可能なヌクレオチド位置を、本願明細書では、「多型性部位」と称している。 多型性部位が、単一のヌクレオチド長である場合、上記部位は、単一ヌクレオチド多型性(「ＳＮＰ」)と称する。 例えば、特定の染色体位置で、アデニンを有する集団の構成要素、それに、チミンを有する別集団の構成要素が同じ位置に存在する場合、この位置は多型性部位と言え、具体的には、この多型性部位は、ＳＮＰである。 多型性部位は、置換、挿入または欠失に基づいて配列内で変化することができる。 多型性部位での配列の変更態様を、本願明細書では、多型性部位の「対立遺伝子」と称する。 したがって、前記した例のＳＮＰでは、アデニン対立遺伝子およびチミン対立遺伝子の両方が可能となる。
通常、参照配列は、特定の配列に対して参照される。 参照配列と異なる対立遺伝子は、「変異体」対立遺伝子と称する。 例えば、参照ＦＬＡＰ配列を、本願明細書の配列番号：１に記載している。 本願明細書で使用する「変異体ＦＬＡＰ」の用語は、配列番号：１とは異なるが、その他の部分は実質的に同じである配列を指す。 本願明細書に記載のハプロタイプを生成する遺伝子マーカーは、ＦＬＡＰ変異体である。
その他の変異体として、例えば、ＦＬＡＰポリペプチドに影響を与える変化を付与するポリペプチドがある。 参照ヌクレオチド配列と比較した場合に、先述したように、これら配列での相違点として、フレームシフトを引き起こす一個または一つ以上のヌクレオチドの挿入；コードしたアミノ酸に変化を付与する少なくとも一つのヌクレオチドの変化；未成熟の停止コドンを生成する少なくとも一つのヌクレオチドの変化；ヌクレオチドによってコードされる一つ以上のアミノ酸を欠失する幾つかのヌクレオチドの欠失；読取枠のコード配列を中断する非等価の組換えまたは遺伝子変換のような一つ以上のヌクレオチドの挿入；配列のすべてまたは一部の複製；転座；またはヌクレオチド配列の転位などがある。 このような配列変化は、ＦＬＡＰ核酸によってコードされるポリペプチドを改変する。 例えば、核酸配列内の変化がフレームシフトを生じさせる場合、フレームシフトは、コードされるアミノ酸を改変したり、および／または切断されたポリペプチドを生成する未成熟の停止コドンを生成する場合がある。 あるいは、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連する多型性が、一つ以上のヌクレオチドでの同様の改変(すなわち、アミノ酸配列に変化を及ぼさない改変)である場合がある。 このような多型性は、例えば、スプライシング部位を改変し、ｍＲＮＡの安定性または移動性に影響を及ぼすか、さもなければ、ポリペプチドの転写または翻訳に影響を与える場合がある。 参照ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドは、特定の参照アミノ酸配列を有する「参照」ポリペプチドであり、また、変異体対立遺伝子によってコードされるポリペプチドは、変異体アミノ酸配列を有する「変異体」ポリペプチドと称される。
ハプロタイプとは、遺伝子マーカーの組み合わせ、例えば、多型性部位での特定の対立遺伝子の組み合わせである。 本願明細書に記載のハプロタイプ、例えば、表１３に記載のマーカーを有するハプロタイプは、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患を保有しない個体よりも、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患を保有する個体においてより頻繁に認められる。 したがって、これらのハプロタイプは、個体での心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性を検出するための予測値をもたらす。 ある事例において、本願明細書に記載のハプロタイプは、種々の遺伝子マーカーの組み合わせ、例えば、ＳＮＰおよびマイクロサテライトである。 それ故に、ハプロタイプの検出は、上記したような方法に従って、多型性部位で配列を検出するための当該技術分野で公知の方法によって実現することができる。
本願明細書に記載の特定の方法において、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患についての危険性がある個体とは、危険要素ハプロタイプが同定される個体である。 ある実施態様によれば、危険要素ハプロタイプは、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の有意な危険度を示す。 ある実施態様によれば、ハプロタイプに関連する有意性は、見込値によって測定される。 その他の実施態様によれば、有意性は百分率(％)によって測定される。 ある実施態様によれば、有意な危険度は、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８および１.９を含むが、これらに限定されず、少なくとも約１.２の見込値で測定される。 さらにその他の実施態様によれば、少なくとも１.２の見込値が有意である。 さらにその他の実施態様によれば、少なくとも約１.５の見込値が有意である。 さらにその他の実施態様によれば、危険度における有意な増加は、少なくとも約１.７で有意である。 さらにその他の実施態様によれば、危険度における有意な増加とは、約25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、および98％を含むが、これらに限定されず、少なくとも約20％である。 さらにその他の実施態様によれば、危険度における有意な増加は、少なくとも約50％である。 さらにその他の実施態様によれば、危険要素ハプロタイプのｐ値は、＜0.05である。 しかしながら、危険度が医薬的に有意であるか否かを同定することは、特定の疾患、ハプロタイプおよび環境因子を含む種々の因子に依存する場合がよくあるものと考えられる。
ＦＬＡＰ遺伝子またはＦＬＡＰ遺伝子の一部を含む危険要素ハプロタイプは、健康な個体(対照者)に存在する頻度と比較して、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に罹患した個体(患者)での危険要素においてハプロタイプがさらに頻繁に認められる場合、ハプロタイプの存在が、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患への感受性を示す。 相関関係に関する単純な試験法の例として、２×２分割表を用いたフィッシャーの正確確率検定がある。 染色体のコホートに関する２×２分割表は、双方のハプロタイプを含む集団、一方のハプロタイプのみを含む集団、そして、いずれのハプロタイプも含まない集団から構成されている。
ある特定の実施態様によれば、危険要素ハプロタイプとは、FLAP内またはFLAP近傍の危険要素ハプロタイプ、すなわち、表14に記載のハプロタイプ、表15に記載のハプロタイプ、表19に記載のハプロタイプ、ハプロタイプＢ４、ハプロタイプＢ５、ハプロタイプＢ６、ハプロタイプＡ４、ハプロタイプＡ５またはハプロタイプHapＢなどのハプロタイプに対して顕著な相関性を示すハプロタイプである。 その他の実施態様によれば、危険要素ハプロタイプは、FLAP内またはFLAP近傍の危険要素ハプロタイプ、すなわち、心筋梗塞または脳卒中への感受性に対して顕著な相関性を示すハプロタイプを含む。 ある特定の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連するハプロタイプは、13ql2-13遺伝子座のSG13S99、SG13S25、SG13S377、SG13S106、SG13S32およびSG13S35マーカーを含む。 その他の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連するハプロタイプは、13ql2-13遺伝子座のSG13S99、SG13S25、SG13S106、SG13S30およびSG13S42マーカーを含む。 第三の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連するハプロタイプは、13ql2-13遺伝子座のSG13S25、SG13S106、SG13S30およびSG13S42マーカーを含む。 第四の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連するハプロタイプは、13ql2-13遺伝子座のSG13S99、SG13S25、SG13S114、SG13S89およびSG13S32マーカーを含む。 その他の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連するハプロタイプは、13ql2-13遺伝子座のSG13S375マーカーを含む。 さらに他の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連するハプロタイプは、13ql2-13遺伝子座のSG13S25およびSG13S375マーカーを含む。 さらに他の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連するハプロタイプは、13ql2-13遺伝子座のSG13S25、SG13S375およびSG13S32マーカーを含む。 その他の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連するハプロタイプは、13ql2-13遺伝子座のSG13S25、SG13S375およびSG13S32マーカーを含む。 その他の実施態様によれば、危険要素ハプロタイプは、ハプロタイプＢ４、Ｂ５、Ｂ６、Ａ４、Ａ５、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４-ＡおよびＣ４-Ｂからなるグループから選択される。 この危険要素ハプロタイプは、ハプロタイプＢ４、Ｂ５、Ｂ６、Ａ４、Ａ５、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４-Ａおよび／またはＣ４-Ｂ内にあるマーカーの組み合わせを含むこともできる。 さらに他の実施態様によれば、危険要素ハプロタイプとして、ハプロタイプHapＢとすることができる。 他の実施態様によれば、危険要素ハプロタイプは、表13に記載の多形性を含む。
ＳＮＰおよび／またはマイクロサテライトマーカーの存在に関する遺伝子決定のための標準的な技術、例えば、蛍光を利用した技術(Chen et al., Genome Res. 9, 492（1999））、ＰＣＲ、ＬＣＲ、Nested ＰＣＲ(プライマーシフトＰＣＲ)および核酸増幅のためのその他の技術を使用することができる。 好ましい実施態様によれば、この方法は、個体でのＦＬＡＰ遺伝子またはＦＬＡＰ遺伝子の一部を含むＳＮＰおよび／またはマイクロサテライトの存在または頻度を評価する工程を含み、この工程において、健康な対照者と比較して、ＳＮＰおよび／またはマイクロサテライトが過剰または高頻度であることは、個体が心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患を有するか、またはそれらに感受性であることを示唆する。 例えば、スクリーニング手段として使用可能なハプロタイプを形成可能なＳＮＰおよびマーカーについては、表１３(後出)を参照されたい。 これらのマーカーおよびＳＮＰは、危険要素ハプロタイプにおいて同定することができる。 例えば、危険要素ハプロタイプは、マイクロサテライトマーカーおよび／またはＳＮＰ、例えば、表１３に記載のものを含むことができる。 ハプロタイプの存在によって、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性が示されるので、そのものが、本願明細書に記載の治療方法での標的集団に属する個体であることが明らかとなる。
ハプロタイプ分析は、ＬＯＤスコアによって候補と定められる感受性遺伝子座をも特定する。 次いで、特定された領域を、１００Kb未満の平均マーカー間隔を有するマイクロサテライトマーカーを用いて、超微細にマッピングする。 公的なデータベースに認められ、この領域内でもマッピングされる、すべての使用可能なマイクロサテライトマーカーを使用することができる。 加えて、ヒトゲノムのdeCODE遺伝子配列アセンブリにおいて同定されたマイクロサテライトマーカーを使用することができる。 期待値-最大化アルゴリズムを用いて、患者および対照者でのハプロタイプの頻度を、概算することが可能である(Dempster A. et al., 1977. J. R. Stat. Soc. B, 39: １-389）。 欠失した遺伝子型に対応して、段階の不確実性に対処可能な、アルゴリズムを実施することができる。
帰無仮説下で、患者および対照者が、同一の頻度を有すると想定する。 同様の方法を用いて、本願明細書に記載のマーカーを含むことができる候補危険要素ハプロタイプが、対照者よりも患者において高頻度に認められる一方で、他のハプロタイプの頻度は双方のグループで同じであるという別の仮説が試される。 両仮説の下で個別に確度が最大化され、対応する統計学的ｌ-df確度比を、統計学的な有意性を評価するために用いる。
ｌ-lodドロップでの危険要素ハプロタイプを検索するために、例えば、現実的な領域を具備したマーカースパンを実現ならしめるために、遺伝子決定されたマーカーのすべての可能な組み合わせについて関連性が試験される。 患者グループおよび対照者グループを一旦合わせて後、元来の患者グループおよび対照者グループと同じ規模の任意の二つの集団に分割することができる。 次いで、ハプロタイプ分析を繰り返して、登録された最も有意なｐ値を決定する。 このランダム化スキームを、ｐ値の経験的分布を構築するために、例えば、１００回超の回数で繰り返すことができる。 好ましい実施態様では、ｐ値が＜0.05であると、危険要素ハプロタイプであるとされる。
ハプロタイプ分析の詳細は、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する2003年10月16日に出願された国際出願第PCT/US02/32556号に記載されている。
治療の方法
本願発明は、個体、例えば、上記した標準集団内の個体での心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患を(上述したように、予防的および／または治療的に)処置する方法、ならびにＦＬＡＰまたはロイコトリエン経路の他の構成要素に関連するその他の疾患および状態(例えば、アテローム性動脈硬化症)を治療する方法を包む。 本願明細書に記載の「ロイコトリエン経路」の構成要素は、ポリペプチド(例えば、酵素、受容体)、およびロイコトリエン産生に関連する他の分子：例えば、ＦＬＡＰ、５-ＬＯ、その他のロイコトリエン生合成酵素(例えば、ロイコトリエンＣ４シンセターゼ、ロイコトリエンＡ４ヒドロラーゼ)などの酵素；受容体または酵素の結合剤；例えば、ＬＴＡ4、LTB4、LTC4、LTD4、LTE4などのロイコトリエン；および、ロイコトリエンの受容体（例えば、ロイコトリエンＢ４受容体１(BLT1)、ロイコトリエンＢ４受容体２(BLT2)、システイニルロイコトリエン受容体１(CysLTR1)、システイニルロイコトリエン受容体２(CysLTR2))を含む。
特に、本願発明は、(例えば、上述したような危険要素集団での個体に認められる)心筋梗塞または心筋梗塞感受性を治療する方法；および、急性冠症候群(例えば、非持続性狭心症、非ＳＴ増大性心筋梗塞(ＮＳＴＥ心筋梗塞)またはＳＴ増大性心筋梗塞(ＳＴＥ心筋梗塞)の治療方法；０.９未満の足関節上腕血圧比を有する患者での心筋梗塞、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の危険度を低減する方法；二次性心筋梗塞；脳卒中または脳卒中に対する感受性；一過性脳虚血発作；一過性単眼視覚消失症の危険度を低減する方法；二次性脳卒中；末梢動脈閉塞疾患または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性；０.９未満の足関節上腕血圧比；跛行または虚血肢；動脈(例えば、冠状動脈、頸動脈、および／または大腿動脈)の血流を再生させるための治療(例えば、血管形成術、ステント、冠状動脈バイパス移植)を必要とするアテローム性動脈硬化症の危険度を低減する方法；０.９未満の足関節上腕血圧比の治療；および／または、(例えば、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患を治療するために)ロイコトリエン合成を抑制する方法に関する。
さらに、本願発明は、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、末梢動脈閉塞疾患、脳卒中、および／または、アテローム性動脈硬化の（例えば、本願発明の方法を用いた）治療のための薬物の製造における、一つまたはそれ以上のロイコトリエン合成阻害剤の使用も意図している。 また、本願発明は、本願明細書に記載の方法を用いて、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、末梢動脈閉塞疾患、脳卒中、および／または、アテローム性動脈硬化症の危険度を低減する医薬の製造のための、本願明細書に記載の一つ以上のロイコトリエン合成阻害剤の使用をも実現する。 これら薬物は、ロイコトリエン合成阻害剤だけを含むものでいてもよく、あるいは、上述したスタチンと併用してもよい。
本願発明の方法では、「ロイコトリエン合成阻害剤」が使用される。 ある実施態様によれば、「ロイコトリエン合成阻害剤」として、本願明細書に記載のＦＬＡＰポリペプチド活性および／またはＦＬＡＰ核酸発現を阻害する薬剤(例えば、核酸アンタゴニスト)がある。 その他の実施態様によれば、ロイコトリエン合成阻害剤は、ロイコトリエン生合成経路の他の構成要素(例えば、５-ＬＯ；LTC4S；ＬＴＡ4H；LTB4DH)のポリペプチド活性および／または核酸発現を阻害する薬剤である。 さらにその他の実施態様によれば、ロイコトリエン合成阻害剤は、ロイコトリエンの活性または代謝を改変する薬剤(例えば、ロイコトリエンのアンタゴニスト；ロイコトリエン受容体のアンタゴニスト)である。 好ましい実施態様によれば、ロイコトリエン合成阻害剤は、ＦＬＡＰまたは５-ＬＯの活性および／または核酸発現を改変するか、または、ＦＬＡＰと５-ＬＯとの間の相互作用を改変する。
ロイコトリエン合成阻害剤は、種々の手段、例えば、触媒的分解、調節抑制、またはロイコトリエン経路の構成要素をコードする核酸の発現、転写または翻訳への干渉；ポリペプチドの後翻訳加工による改変；スプライシング変異体の転写の改変；または、ポリペプチド活性への干渉(例えば、ポリペプチドへの結合、またはロイコトリエン経路の構成要素と相互作用する他のポリペプチド(例えば、本願明細書に記載のＦＬＡＰ結合剤またはロイコトリエン経路を構成するその他の結合剤)への結合；ロイコトリエン経路の二つ以上の構成要素間での相互作用(例えば、ＦＬＡＰと５-ＬＯとの間の相互作用)の改変；または、ロイコトリエン経路の構成要素の活性への拮抗などによって、ロイコトリエンの構成要素のポリペプチド活性または核酸発現を改変することができる。
代表的なロイコトリエン合成阻害剤として、以下のものがある：
ロイコトリエン生合成経路の構成要素(例えば、ＦＬＡＰ、５-ＬＯ)の活性を阻害する、以下の薬剤一覧表に示した薬剤、LTC4S、ＬＴＡ4H；ロイコトリエン経路の構成要素の受容体(例えば、ＦＬＡＰ受容体、ＬＴＡ4受容体、LTB4受容体、LTC4受容体、LTD4受容体、TLE4受容体、CysLT1受容体、CysLT2受容体、５-ＬＯ受容体)の活性を阻害する薬剤；BLT1；BLT2；CysLTR1；CysLTR2；ロイコトリエン経路の構成要素に結合する薬剤、例えば、ＦＬＡＰ結合剤(例えば、５-ＬＯ)またはロイコトリエン経路の構成要素の受容体に結合する薬剤(例えば、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト）；ロイコトリエン(例えば、ＬＴＡ4、LTB4、LTC4、LTD4、LTE4、CysLT1、CysLT2)に結合する薬剤；ロイコトリエン(例えば、LTB4DH)の分解を促す薬剤；または、ロイコトリエンの活性に影響を与える(例えば、活性を増大または減少させる)薬剤；
ロイコトリエンに対する抗体；
二本鎖アンチセンス核酸または短い二本鎖を妨げるＲＮＡ、ＦＬＡＰ、５-ＬＯまたはロイコトリエンシンセターゼポリペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸を含む、ＦＬＡＰ、５-ＬＯ、またはロイコトリエンシンセターゼ、またはその他のロイコトリエン経路の構成要素、またはこそれらの断片または誘導体をコードする核酸に対する抗体、およびこのようなアンチセンス核酸(例えば、核酸、ｃＤＮＡ、および／またはｍＲＮＡ、二本鎖を妨げるＲＮＡ、またはそれらの活性断片または誘導体をコードする核酸、またはオリゴヌクレオチド；例えば、配列番号：１または３に記載の一つの相補体、または配列番号：２をコードする核酸に対する核酸相補体、またはそれらの断片または誘導体）を含むベクター；
疑似ペプチド；融合タンパク質またはそれらのプロドラッグ；リボザイム；その他の低分子；および
ロイコトリエン経路の構成要素(例えば、ＦＬＡＰまたは５-ＬＯ核酸またはポリペプチド活性)の発現を改変する(例えば、阻害または拮抗する)他の薬剤、またはＦＬＡＰスプライシング変異体または５-ＬＯスプライシング変異体の転写を制御する薬剤(例えば、スプライシング変異体の発現に影響を与える薬剤、または各スプライシング変異体の発現量に影響を与える薬剤）。
一個を超えるロイコトリエン合成阻害剤を、必要に応じて、併用することができる。
治療は、個体での活性を阻害または拮抗することで、ＦＬＡＰポリペプチド、５-ＬＯポリペプチド、またはロイコトリエン経路のその他の構成要素の活性を改変するように設計される。 例えば、ロイコトリエン合成阻害剤は、個体内でロイコトリエンの合成を減少させるために、またはＦＬＡＰ核酸またはＦＬＡＰ核酸の特定のスプライシング変異体の発現または利用可能性を低減または減少させるために投与することができる。 天然のＦＬＡＰ核酸または特定のスプライシング変異体の発現または活性を最小限にする発現または利用可能性の低減は、欠陥核酸または特定のスプライシング変異体の発現または活性を最小限にし、それにより、欠陥核酸または特定のスプライシング変異体の生成を最小限にする。 同様に、例えば、ロイコトリエン合成阻害剤は、５-ＬＯをコードする核酸または５-ＬＯをコードする核酸による、特定のスプライシング変異体の発現または利用可能性の低減または減少させるために投与することができる。
ロイコトリエン合成阻害剤は、治療的有効量(すなわち、疾患または状態に関連する症状を軽減し、疾患または状態の発症の防止または遅延によって、および／または、疾患または状態の症状の重篤度または頻度を少なくすることによって、疾患または状態を治療するのに十分な量)で投与される。 個体での特定の疾患または状態の治療における治療的有効量は、症状および疾患の重篤度に依存しており、標準的な臨床技術によって決定することができる。 加えて、最適な投薬範囲の同定を補助すべく、in vitroまたはin vivoアッセイを任意に使用することができる。 さらに、配合物に用いられる正確な投薬量は、投与経路、疾患または障害の重篤度に応じて、医師の判断および患者個々の状態に従って決定されるべきである。 効果的な投薬は、in vitro試験系または動物モデル試験系で得られる投薬-応答曲線から推定してもよい。
本願発明の好ましい実施態様によれば、ロイコトリエン合成阻害剤薬剤は、ＦＬＡＰおよび／または５-ＬＯの活性を阻害する薬剤である。 好ましい薬剤を、以下の薬剤一覧表Ｉに示した。
Figure 2007538003
Figure 2007538003
 本願発明の好ましい方法によれば、薬剤一覧表IIIに示した薬剤は、ＦＬＡＰ、またはロイコトリエン経路のその他の構成要素、またはロイコトリエン合成の増大に関連する疾患および状態を予防的および／または治療的に治療するために使用可能である。 特に、これら薬剤は、上述したような危険要素集団に属する個体での(例えば、コレステロールの増大、Ｃ反応性タンパク質の増加、および／または遺伝子型のような同定された危険因子に基づく)心筋梗塞または心筋梗塞感受性；急性冠状症候群、例えば、非持続性狭心症、非ＳＴ増大性心筋梗塞(ＮＳＴＥ心筋梗塞)またはＳＴ増大性心筋梗塞(ＳＴＥ心筋梗塞)を治療するために；０.９未満の足関節上腕血圧比を有する個体での心筋梗塞、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の危険度を低減するために；心筋梗塞を一度以上経験した個体での二次的心筋梗塞の危険度を低減するために；脳卒中または脳卒中感受性に対して；二次的脳卒中の危険度を低減するために；末梢動脈閉塞疾患または末梢動脈閉塞疾患感受性に対して；動脈(例えば、冠状動脈、頸動脈、および／または大腿動脈)の血流を再生するための処置(例えば、血管形成術、ステント、冠状動脈バイパス移植)を必要とする患者でのアテローム性動脈硬化症を治療するために；０.９未満の足関節上腕血圧比を治療するために；および／または、ロイコトリエン合成を減少させる(例えば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患を治療する)ために、使用することができる。
本願発明の好ましい実施態様によれば、ロイコトリエン合成阻害剤として、ＦＬＡＰの阻害剤、例えば、ＭＫ-０５９１とも称される１-((４-クロロフェニル)メチル)-３-((１、１-ジメチルエチル)チオ)-α、α-ジメチル-５-(２-キノリニルメトキシ)-１Ｈ-インドール-２-プロピオン酸、ＢＡＹ-ｘ-１００５とも称される(Ｒ)-(＋)-α-シクロペンチル-４-(２-キノリニルメトキシ)-ベンゼン酢酸、Ａ-８１８３４とも称される３-(３-(１、１-ジメチルエチルチオ-５-(キノリン-２-イルメトキシ)-１-(４-クロロメチルフェニル)インドール-２-イル)-２、２-ジメチルプロピオンアルデヒドオキシム-０-２-酢酸、それらの光学的に純粋な鏡像異性体、塩類、化学的誘導体、および類似体、それに、ヒトへの投与によってロイコトリエン生合成を効果的に減少せいめるＦＬＡＰを阻害するその他の化合物がある。
本願発明のその他の好ましい実施態様によれば、ロイコトリエン合成阻害剤として、５ＬＯの阻害剤、例えば、ジロイトン、アトレロイトン、ＺＤ-２１３８とも称される６-((３-フルオロ-５-(テトラヒドロ-４-メトキシ-２Ｈ-ピラン-４イル)フェノキシ)メチル)-１-メチル-２(１Ｈ)-キノリノン、ＭＫ-８８６とも称される１-((４-クロロフェニル)メチル)-３-((１、１ジメチルエチル)チオ)-α、α-ジメチル-５-(２-キノリニルメトキシ)-１Ｈ-インドール-２-プロピオン酸、ＣＪ-１３６１０とも称される４-(３-(４-(２-メチル-イミダゾール-１-イル)-フェニルスルファニル)-フェニル)-テトラヒドロ-ピラン-４-カルボン酸アミド、これらの光学的に純粋な鏡像異性体、塩類、化学的誘導体および類似体、それに、ヒトへの投与によってロイコトリエン生合成を効果的に減少せいめる５-ＬＯを阻害するその他の化合物がある。
上記化合物は、以下の式；
Figure 2007538003
 で表される化合物または薬学的に許容されるその塩類であって、式中、Ｍは、水素、薬学的に許容されるカチオン、薬学的に許容される代謝的に開裂可能な基からなるグループから選択され；Ｂは、１〜１２個の炭素原子を有する直鎖または分枝の二価アルキレンであり；Ｚは、１〜６個の炭素原子を有するアルキルまたは１〜６個の炭素原子を有するハロアルキルで任意に置換された、チアゾリルであり；Ｌは、(ａ)１〜６個の炭素原子を有するアルキレン、(ｂ)２〜６個の炭素原子を有するアルケニレン、(ｃ)２〜６個の炭素原子を有するアルキニレン、(ｄ)１〜６個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル、(ｅ)＞Ｃ＝Ｏ、(ｆ)＞Ｃ=Ｎ-ＯＲ1（Ｒ1は、水素またはＣ1〜Ｃ6アルキルである）、(ｇ)-(ＣＨＲ1)n(ＣＯ)(ＣＨＲ2)m（ｎおよびｍは、独立して、１〜６の整数から選択され、Ｒ1およびＲ2は、独立して、水素およびＣ1〜Ｃ6-アルキルから選択される)からなるグループから選択され、(ｈ)-(ＣＨＲ1)nＣ=ＮＯＲ2（Ｒ1、Ｒ2およびｎは、先に定義した通りである)；(ｉ)-(ＣＨＲ1)nＯＮ=ＣＲ2（Ｒ1、Ｒ2およびｎは、先に定義した通りである)；(ｊ)-(ＣＨＲ1)n-Ｏ-(ＣＨＲ2)m-（Ｒ1、Ｒ2、ｎおよびｍは、先に定義した通りである)、(ｋ)-(ＣＨＲ1)n-ＮＲ2(ＣＨＲ3)m-（Ｒ1、Ｒ2、ｎおよびｍは、先に定義した通りであり、Ｒ3は水素およびＣ1〜Ｃ6-アルキルから選択される）；(ｌ)-(ＣＨＲ1)n-Ｓ-ＣＨＲ2)m-（Ｒ1、Ｒ2、ｎおよびｍは、先に定義した通りである）；および(ｍ)-(ＣＨＲ1)n-(ＳＯ2)-(ＣＨＲ2)m-（Ｒ1、Ｒ2、ｎおよびｍは、先に定義した通りである）からなるグループから選択され；Ａは、１〜６個の炭素原子を有するアルキルで任意に置換された炭素環アリール、１〜６個の炭素原子を有するハロアルキル、１〜６個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル、１〜１２個の炭素原子を有するアルコキシ、２個のアルコキシ部分が、各々独立して、１〜６個の炭素原子、１〜６個の炭素原子を有するアルキルチオ、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、アミノ、１〜６個の炭素原子を有するアルキルアミノ、ジアルキルアミノを含有してもよいアルコキシアルコキシル、２個のアルキル基が独立して、１〜６個の炭素原子、２〜８個の炭素原子を有するアルカノイルアミノを含有していてもよいジアルキルアミノ、アルカノイルが２〜８個の炭素原子を有し、アルキル基が１〜６個の炭素原子を有し、アルキルアミノカルボニルが２〜８個の炭素原子を有しているＮ-アルカノイル-Ｎ-アルキルアミノ、２個のアルキル基が独立して１〜６個の炭素原子を有するカルボキシル、アルコキシカルボニルを有するか、または２〜８個の炭素原子を有し、場合により１〜６個の炭素原子、１〜６個の炭素原子を有するハロアルキル、１〜６個の炭素原子を有するアルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲン、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、１〜６個の炭素原子を有するハロアルキル、１〜６個の炭素原子を有するアルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンで任意に置換されるフェノキシで置換されるフェニル、または、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、１〜６個の炭素原子を有するハロアルキル、１〜６個の炭素原子を有するアルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンで任意に置換されるフェニルチオを有するジアルキルアミノアルボニルである。 好ましくは、この化合物は、(Ｒ)-Ｎ-[３-[-５-(４-フルオロフェニルメチル)チアゾ-２-イル]-１メチル-２-プロピニル]-Ｎ-ヒドロキシウレアと命名された化合物またはそれらの薬学的に許容される塩である。 本明細書の一部を構成するものとして援用する米国特許第4,615,596号公報を参照されたい。
上記化合物は、以下の式；
Figure 2007538003
 で表される化合物または薬学的に許容されるその塩類であって、式中、Ａは、１〜１２個の炭素原子を有する直鎖または分枝の二価アルキレン、および３〜８個の炭素原子を有する二価シクロアルキレンからなるグループから選択され；Ｒ1は、水素、１〜６個の炭素原子を有するアルキルチオ、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、１〜６個の炭素原子を有するアルコキシ、またはハロゲンによって任意に置換された１〜６個の炭素原子を有するフェニルチオ、アルキル部分が１〜６個の炭素原子を含有し、フェニル基が、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、１〜６個の炭素原子を有するアルコキシ、またはハロゲンで任意に置換されるフェニルアルキルチオからなるグループから選択され、Ｒ2は、-COOBからなるグループから選択され、ここで、Ｂは、水素、薬学的に許容されるカチオン、または代謝的に開裂可能な基、すなわち、１〜６個の炭素原子を有するアルキル部分を含む-COOアルキル、アルキル部分が、１〜６個の炭素原子を有するアルキルで任意に置換され、およびアリール部分が、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、１〜６個の炭素原子を有するアルコキシ、またはハロゲンで任意に置換される-COOアルキル炭素環式アリール、-CONR5R6の式で表され、Ｒ5は、水素、ヒドロキシル、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、および１〜６個の炭素原子を有するアルコキシから選択され、Ｒ6は、水素および１〜６個の炭素原子を有するアルキル、-COR6、および-OHからなるグループから選択され；Ｒ3は、アルキル部分が、１〜６個の炭素原子を含有し、フェニル基が、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、１〜６個の炭素原子を有するアルコキシ、またはハロゲンで任意に置換されるフェニルアルキルであり、Ｒ4は、アルキル部分が、１〜６個の炭素原子を含有し、ヘテロアリール部分が、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、１〜６個の炭素原子を有するアルコキシ、またはハロゲンで任意に置換され、チアゾリルオキシが、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、１〜６個の炭素原子を有するアルコキシまたはハロゲンで任意に置換されるチアゾリルアルキルオキシからなるグループから選択される。 本明細書の一部を構成するものとして援用する米国特許第5,288,743号公報を参照されたい。
上記化合物は、以下の式；
Figure 2007538003
 で表される化合物または薬学的に許容されるその塩類であって、式中、Ｍは、水素、薬学的に許容されるカチオンからなるグループから選択され；Ｂは、１〜１２個の炭素原子を有する直鎖または分枝の二価アルキレンであり；Ｚは、(ａ)１〜６個の炭素原子を有するアルキル、または１〜６個の炭素原子を有するハロアルキルで任意に置換されたフリル、および(ｂ)１〜６個の炭素原子を有するアルキル、または１〜６個の炭素原子を有するハロアルキルで任意に置換されたチエニルからなるグループから選択され；および、Ｌは、１〜６個の炭素原子を有するアルキレンであり；Ａは、１〜６個の炭素原子を有するアルキルで任意に置換されたフェニル、１〜６個の炭素原子を有するハロアルキル、１〜６個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル、１〜１２個の炭素原子を有するアルコキシ、２個のアルコキシ部分が各々独立して、１〜６個の炭素原子、１〜６個の炭素原子を有するアルキルチオ、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、アミノ、１〜６個の炭素原子を有するアルキルアミノを含有してもよいアルコキシアルコキシル、２個のアルキル基が独立して、１〜６個の炭素原子、２〜８個の炭素原子を有するアルカノイルアミノを含有していてもよいジアルキルアミノ、アルカノイルが２〜８個の炭素原子を有し、アルキル基が１〜６個の炭素原子を有し、アルキルアミノカルボニルが２〜８個の炭素原子を有しているＮ-アルカノイル-Ｎ-アルキルアミノ、２個のアルキル基が独立して１〜６個の炭素原子を有するカルボキシル、２〜８個の炭素原子を有するアルコキシカルボニルを有し、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、１〜６個の炭素原子を有するハロアルキル、１〜６個の炭素原子を有するアルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンで任意に置換されるフェニル、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、１〜６個の炭素原子を有するハロアルキル、１〜６個の炭素原子を有するアルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンで任意に置換されるフェノキシ、または、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、１〜６個の炭素原子を有するハロアルキル、１〜６個の炭素原子を有するアルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンで任意に置換されるフェニルチオを有するジアルキルアミノカルボニルである。 好ましくは、上記化合物は、Ｎ-[３-(５-４-フルオロフェニルメチル)フル-２-イル]-３-ブチン-２-イル]-Ｎ-ヒドロキシウレア；Ｎ-[３-(５-４-フルオロフェニルメチル)-２-チエニル)-１-メチル-２-プロピニル]-Ｎ-ヒドロキシウレア；(Ｒ)-Ｎ-[３-(５-４-フルオロフェニルメチル)-２-チエニル)-１-メチル-２-プロピニル]-Ｎ-ヒドロキシウレア；および、(Ｒ)-Ｎ-[３-(５-４-クロロフェニルメチル)-２-チエニル)-１-メチル-２-プロピニル]-Ｎ-ヒドロキシウレア；(Ｓ)-Ｎ-[３-(５-４-フルオロフェニルメチル)-２-チエニル)-１-メチル-２-プロピニル]-Ｎ-ヒドロキシウレアからなるグループから選択される化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩類である。 本明細書の一部を構成するものとして援用する米国特許第5,288,751号公報を参照されたい。
上記化合物は、以下の式；
Figure 2007538003
 で表される化合物または薬学的に許容されるその塩類であって、式中、Ａは、１〜１２個の炭素原子を有する直鎖または分枝の二価アルキレン、２〜１２個の炭素原子を有する直鎖または分枝の二価アルケニレン、および３〜８個の炭素原子を有する二価シクロアルキレンからなるグループから選択され；Ｒ1は、１〜６個の炭素原子を有するアルキルチオであり；Ｒ6は、水素および１〜６個の炭素原子を有するアルキルからなるグループから選択され；Ｒ7は、アルキル部分が１〜６個の炭素原子を有する（カルボキシル）アルキル、アルコキシカルボニル部分が２〜６個の炭素原子を有し、アルキル部分が１〜６個の炭素原子を有する（アルコキシカルボニル）アルキルを有し、アルキル部分が１〜６個の炭素原子を有する（アミノカルボニル）アルキル、アルキル部分がそれぞれ独立して、１〜６個の炭素原子を有する((アルキルアミノ)カルボニル)アルキル、アルキル部分がそれぞれ独立して、１〜６個の炭素原子を有する((ジアルキルアミノ)カルボニル)アルキルからなるグループから選択され；Ｒ3は、フェニルアルキルであり、ここで、アルキル部分は１〜６個の炭素原子を有し；Ｒ4は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、１〜６個の炭素原子を有するハロアルキル、１〜１２個の炭素原子を有するアルコキシ、ハロゲン、またはヒドロキシで任意に置換された、２-、３-または６-キノリルメトキシである。 好ましくは、上記化合物は、３-(３-１、１-ジメチルエチルチオ)-５-(キノリン-２-イルメトキシ-１-(４-クロロフェニルメチル)-インドール-２-イル)-２、２-ジメチルプロピオンアルデヒドオキシム-Ｏ-２酢酸；３-(３-１、１-ジメチルエチルチオ)-５-(キノリン-２-イルメトキシ-１-(４-クロロフェニルメチル)-インドール-２-イル)-２、２-ジメチルプロピオンアルデヒドオキシム-Ｏ-２-(３-メチル)ブチル酸；３-(３-１、１-ジメチルエチルチオ)-５-(６、７-ジクロロキノリン-２-イルメトキシ)-１-(４-クロロフェニルメチル)-インドール-２-イル)-２、２-ジメチルプロピオンアルデヒドオキシム-Ｏ-２酢酸；および３-(３-１、１-ジメチルエチルチオ)-５-(６−フルオロキノリン-２-イルメトキシ)-１-(４-クロロフェニルメチル)-インドール-２-イル)-２、２-ジメチルプロピオンアルデヒドオキシム-Ｏ-２-プロピオン酸からなるグループから選択される化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩類である。 本明細書の一部を構成するものとして援用する米国特許第5,459,150号公報を参照されたい。
上記化合物は、以下の式；
Figure 2007538003
 で表される化合物または薬学的に許容されるその塩類であって、式中、Ｑは、１個または２個の窒素ヘテロ原子を含有し、窒素、酸素および硫黄から選択されるヘテロ原子を任意に含有する、９-、10-または11-員環の二環式ヘテロ環部分であり、Ｑは、ハロゲノ、ヒドロキシ、シアノ、ホルミル、オキソ、チオキソ、(１〜４Ｃ)アルキル、(３〜４Ｃ)アルケニル、(３〜４Ｃ)アルキニル、(１〜４Ｃ)アルコキシ、フルオロ-(１〜４Ｃ)アルキル、ヒドロキシ-(１〜４Ｃ)アルキル、(２〜５Ｃ)アルカノイル、フェニル、ベンゾイルおよびベンジルから選択される４個までの置換基を任意に有してもよく、これらフェニル、ベンゾイルおよびベンジル置換基は、ハロゲノ、(１〜４Ｃ)アルキルおよび(１〜４Ｃ)アルコキシから選択される１個または２個の置換基を任意に有してもよく；Ｘは、オキシ、チオ、スルフィニルまたはスルホニルであり；Ａｒは、ハロゲノ、シアノ、トリフルオロメチル、ヒドロキシ、アミノ、(１〜４Ｃ)アルキル、(１〜４Ｃ)アルコキシ、(１〜４Ｃ)アルキルアミノおよびジ-(１〜４Ｃ)アルキルアミノから選択される１個または２個の置換基を任意に有する、フェニレン、ピリジンジイル、ピリミジンジイル、チオフェンジイル、フランジイル、チアゾールジイル、オキサゾールジイル、チアジアゾールジイルまたはオキサジアゾールジイルであり；および、Ｑは、以下の式IIおよびIIIの基：
Figure 2007538003
 から選択され、式中、Ｒは、水素、(２〜５Ｃ)アルカノイルまたはベンゾイルであり、ベンゾイル基は、ハロゲノ、(１〜４Ｃ)アルキルおよび(１〜４Ｃ)アルコキシから選択される１個または２個の置換基を有してもよく；Ｒは、(１〜４Ｃ)アルキルであり；Ｒは、水素または(１〜４Ｃ)アルキルであるか；またはＲとＲは結合して、メチレン、ビニレン、エチレンまたはトリメチレン基を形成する。 好ましくは、上記化合物は、(2S、4R)-４-[５-フルオロ-３-(１-メチル-２-オキソ-１、２、３、４-テトラヒドロキノリン-６-イルチオ)フェニル]-４-ヒドロキシ-２-エチルテトラヒドロピラン、(2S、4R)-４-[５-フルオロ-３-(１-メチル-２-オキソ-１、２、３、４-テトラヒドロキノリン-６-イルスルホニル)フェニル]-４-ヒドロキシ-２-エチルテトラヒドロピラン、（2S、4R)-４-ヒドロキシ-２-メチル-４-[２-(１-メチル-２-オキソ-１、２、３、４-テトラヒドロキノリン-６-イルチオ)チアゾール-５-イル]テトラヒドロピラン、（2S、4R)-４-ヒドロキシ-２-メチル-４-[２-(１-メチル-２-オキソ-１、２、３、４-テトラヒドロキノリン-６-イルスルホニル)チアゾール-５-イル]テトラヒドロピラン、（2S、4R)-４-[２-(７-フルオロ-１-メチル-２-オキソ-１、２、３、４-テトラヒドロキノリン-６-イルチオ)チアゾール-５-イル]-４-ヒドロキシ-２-メチルテトラヒドロピラン、（2S、4R)-４-ヒドロキシ-２-メチル-４-[２-(１-メチル-２-オキソインドリン-５-イルチオ)チアゾール-５-イル]テトラヒドロピラン、（2S、4R)-４-ヒドロキシ-２-メチル-４-[２-(１-メチル-２-オキソ-１、２、３、４-テトラヒドロキノリン-６-イルチオ)チエン-４-イル］テトラヒドロピラン、（2S、4R)-４-ヒドロキシ-２-メチル-４-[２-(１-メチル-２-オキソ-１、２、３、４-テトラヒドロキノリン-６-イルスルホニル)チエン-４-イル]テトラヒドロピラン、（2S、4R)-４-ヒドロキシ-２-メチル-４-[２-(１-メチル-２-オキソ-１、２、３、４-テトラヒドロキノリン-６-イルチオ)チエン-５-イルテトラヒドロピラン、（2S、4R)-４-ヒドロキシ-２-メチル-４-[２-(１-メチル-２-オキソ-１、２-ジヒドロキノリン-６-イルチオ)チエン-４-イル]テトラヒドロピラン、（2S、4R)-４-ヒドロキシ-２-メチル-４-[２-(１、８-ジメチル-２-オキソ-１、２、３、４-テトラヒドロキノリン-６-イルチオ)チエン-４-イル]テトラヒドロピラン、４-[２-(８-フルオロ-１-メチル-２-オキソ-１、２、３、４-テトラヒドロキノリン-６-イルチオ)チエン-４-イル]-４-ヒドロキシ-２-メチルテトラヒドロピラン、４-[２-(７-フルオロ-１-メチル-２-オキソ-１、２、３、４-テトラヒドロキノリン-６-イルチオ)チエン-４-イル]-４-ヒドロキシ-２-メチルテトラヒドロピラン、（2S、4R)-４-ヒドロキシ-２-メチル-４-[２-(１-メチル-２-オキソインドリン-５-イルチオ)チエン-４-イル]テトラヒドロピラン、（2S、4R)-４-ヒドロキシ-２-メチル-４-[３-(１-メチル-２-オキソ-１、２、３、４-テトラヒドロキノリン-６-イルチオ)フェニル]テトラヒドロピラン、（2S、4R)-４-ヒドロキシ-２-メチル-４-[３-(１-メチル-２-オキソ-１、２、３、４-テトラヒドロキノリン-６-イルスルホニル)フェニル]テトラヒドロピラン、（2S、4R)-４-(３-(１-エチル-２-オキソ-１、２、３、４-テトラヒドロキノリン-６-イルチオ)フェニル]-４-ヒドロキシ-２-メチルテトラヒドロピラン、（2S、4R)-４-[３-(７-フルオロ−１-メチル-２-オキソ-１、２、３、４-テトラヒドロキノリン-６-イルチオ)フェニル]-４-ヒドロキシ-２-メチルテトラヒドロピラン、（2S、4R)-４-ヒドロキシ-２-メチル-４-[３-(１-メチル-２-オキソ-１，２-ジヒドロキノリン-６-イルチオ)フェニル]テトラヒドロピラン、（2S、4R)-４-[３-(８-クロロ-１-メチル-２-オキソ-１、２、３、４-テトラヒドロキノリン-６-イルチオ)フェニル]-４-ヒドロキシ-２-メチルテトラヒドロピラン、および（2S、4R)-４-ヒドロキシ-２-メチル-４-[３-(１-メチル-２-オキソインドリン-５-イルチオ)フェニル］テトラヒドロピランからなるグループから選択される。 本明細書の一部を構成するものとして援用する欧州特許第623614号公報を参照されたい。
上記化合物は、以下の式；
Figure 2007538003
 で表される化合物または薬学的に許容されるその塩類であって、式中、Ｑは、１個または２個のチオキソ置換基を有し、ヘテロ環部分が、ハロゲノ、ヒドロキシ、シアノ、アミノ、(１〜４Ｃ)アルキル、(１〜４Ｃ)アルコキシ、フルオロ-(１〜４Ｃ)アルキル、(１〜４Ｃ)アルキルアミノ、ジ-[(１〜４Ｃ)アルキル]アミノ、アミノ-(１〜４Ｃ)アルキル、(１〜４Ｃ)アルキルアミノ-(１〜４Ｃ)アルキル、ジ-[１〜４Ｃ)アルキル]アミノ-(１〜４Ｃ)アルキル、フェニルおよびフェニル-(１〜４Ｃ)アルキルからなるグループから選択される１個、２個または３個の置換基を任意にさらに有してもよい、１個または２個の窒素ヘテロ原子を含有する10員環の二環式ヘテロ環部分であり、上記フェニルまたはフェニル-(１〜４Ｃ)アルキル置換基は、ハロゲノ、(１〜４Ｃ)アルキルおよび(１〜４Ｃ)アルコキシから選択される置換基を有してもよく；Ａは、Ｘに直接結合するか、または(１〜３Ｃ)アルキレンであり；Ｘは、オキシ、チオ、スルフィニル、スルホニルまたはイミノであり；Ａｒは、ハロゲノ、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、カルバモイル、ウレイド、(１〜４Ｃ)アルキル、(１〜４Ｃ)アルコキシ、(１〜４Ｃ)アルキルアミノ、ジ-[(１〜４Ｃ)アルキル]アミノ、フルオロ-(１〜４Ｃ)アルキルおよび(２〜４Ｃ)アルカノイルアミノから選択される１個または２個の置換基を任意に有してもよいフェニレンであるか；または、Ａｒは、ピリジレンであり；Ｒは、(１〜４Ｃ)アルキル、(３〜４Ｃ)アルケニルまたは(３〜４Ｃ)アルキニルであり；ＲおよびＲは共に、式-Ａ-Ｘ-Ａ-の基を形成し、ＡおよびＡが結合する炭素原子と共に、５〜７員環を有する環を規定し、また、ＡおよびＡは、同一でも相違していてもよく、それぞれが(１〜３Ｃ)アルキレンであり、Ｘは、オキシ、チオ、スルフィニルまたはスルホニルであり、環は１個、２個または３個の置換基を有してもよく、同一でも相違していてもよく、ヒドロキシ、(１〜４Ｃ)アルキルおよび(１〜４Ｃ)アルコキシから選択されるか；または、ＲおよびＲは共に、式-Ａ-Ｘ-Ａ-の基を形成し、Ａが結合する酸素原子と、Ａが結合する炭素原子と共に、５〜７環原子を有する環を形成し、また、ＡおよびＡは、同一でも相違していてもよく、それぞれが(１〜３Ｃ)アルキレンであり、Ｘは、オキシ、チオ、スルフィニルまたはスルホニルであり、環は、１個、２個または３個の(１〜４Ｃ)アルキル置換基を有してもよく、Ｒは、(１〜４Ｃ)アルキル、(２〜４Ｃ)アルケニルまたは(２〜４Ｃ)アルキニルであり；または、それらの薬学的に許容される塩である。 好ましくは、上記化合物は、４-(５-フルオロ-３-(１-メチル-２-チオキソ-１、２-ジヒドロキノリン-６-イルメトキシ)フェニル]-４-エトキシテトラヒドロピラン、および４-(５-フルオロ-３-(１-メチル-２-チオキソ-１、２、３、４-テトラヒドロキノリン-６-１メトキシ)フェニル]-４-メトキシテトラヒドロピラン、４-(５-フルオロ-３-(１-メチル-２-チオキソ-１、２、３、４-テトラヒドロキノリン-６-イルチオ)フェニル]-４-メトキシテトラヒドロピラン、およびそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選択される。 本明細書の一部を構成するものとして援用する欧州特許第466452号公報を参照されたい。
上記化合物は、以下の式；
Figure 2007538003
 で表される置換４-(キノリン-２-61-メトキシ)フェニル酢酸誘導体または薬学的に許容されるその塩類であって、式中、Ｒ1は、以下の式；
Figure 2007538003
 で表される基であって、Ｒ2およびＲ3は、同一でも相違していてもよく、水素、低級アルキル、フェニル、ベンジル、または、以下の式；
Figure 2007538003
Figure 2007538003
 で表される基であって、Ｒ4は、水素、低級アルキル、フェニルまたはベンジルであり、これらは、ヒドロキシル、カルボキシル、低級アルコキシカルボニル、低級アルキルチオ、ヘテロアリールまたはカルバモイルで任意に置換されることができ、Ｒ5は、水素、低級アルキル、フェニルまたはベンジルであり、Ｒ6は、式-ＣＯＲ5または-ＣＯ2Ｒ5の基であり、Ｒ7は、水素、低級アルキルまたはフェニルを表し、Ｙは、以下の式；
Figure 2007538003
 で表される基であって、式中、Ｒ8は、水素、低級アルキルまたはフェニルを表し、ｎは、０〜５の数を示し、Ｚは、ノルボルニルであるか、または、以下の式；
Figure 2007538003
 で表される基であって、式中、Ｒ9およびＲ10は、同一でも相違していてもよく、水素、低級アルキルまたはフェニルを示し、また、Ｒ9およびＲ10は、共に６個までの炭素原子を有する飽和炭素環式環を形成することができ、ｍは１〜６の数を示し、ＡおよびＢは、同一でも相違していてもよく、水素、低級アルキルまたはハロゲンまたはそれらの薬学的に許容される塩を示す。 好ましくは、上記化合物は、２-[４-(キノリン-２-イル-メトキシ)フェニル]-２-シクロペンチル酢酸、２-[４-(キノリン-２-イル-メトキシ)フェニル]-２-シクロヘキシル酢酸、および２-[４-(キノリン-２-イル-メトキシ)フェニル]-２-シクロヘプチル酢酸、２-[４-(キノリン-２-イル-メトキシ)フェニル]-２-シクロペンチル酢酸の(＋)-鏡像異性体、２-[４-(キノリン-２-イル-メトキシ)フェニル]-２-シクロペンチル酢酸の(−)-鏡像異性体、およびそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選択される。 本明細書の一部を構成するものとして援用する米国特許第4,970,215号公報を参照されたい。
上記化合物は、以下の式；
Figure 2007538003
 で表される化合物または薬学的に許容されるその塩類であって、式中、Ｒ、Ｒ、Ｒ、ＲおよびＲは、独立して、水素、ハロゲン、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、-ＣＦ3、-ＣＮ、-ＮＯ2、-Ｎ3、-Ｃ(ＯＨ)ＲＲ、-ＣＯ2Ｒ、-ＳＲ、-Ｓ(Ｏ)Ｒ、-Ｓ(Ｏ)2Ｒ、-Ｓ(Ｏ)2ＮＲＲ、-ＯＲ、-ＮＲＲ、-Ｃ(Ｏ)Ｒまたは-(ＣＨ2)tＲであり；Ｒは、水素、-ＣＨ3、-ＣＦ3、-Ｃ(Ｏ)Ｈ、Ｘ-ＲまたはＸ-Ｒであり；ＲおよびＲは、独立して、アルキル、-(ＣＨ2)uＰｈ(Ｒ)2または-(ＣＨ2)uＴｈ(Ｒ)2であり；Ｒは、-ＣＦ3またはＲであり；Ｒは、水素またはＸ-Ｒであり；Ｒは、それぞれ独立して、水素または低級アルキルであるか、または同じ炭素原子上の２個のＲが結合して３〜６個の炭素原子を有するシクロアルキル環を形成し；Ｒは、水素、低級アルキルまたは-ＣＨ2Ｒであり；Ｒは、低級アルキルまたは-(ＣＨ2)rＲであり；Ｒは、-ＣＦ3またはＲであり；Ｒは、水素、-Ｃ(Ｏ)Ｒ、Ｒであるか、または同じ窒素上の２個のＲが結合して、Ｏ、ＳまたはＮから選択される２個までのヘテロ原子を含有する４〜６個の原子を有する単環式ヘテロ環式環を形成し；Ｒは、水素、-ＣＦ3、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニルまたは-(ＣＨ2)rＲであり；Ｒは、-(ＣＨ2)s-Ｃ(ＲＲ)-(ＣＨ2)s-Ｒまたは-ＣＨ2Ｃ(Ｏ)ＮＲＲであり；Ｒは、水素または低級アルキルであり；Ｒは、(ａ)核となる３〜９個の炭素原子と、Ｎ、ＳまたはＯから選択される１個〜２個の核となるヘテロ原子とを含有し、ヘテロ環式基での各々の環が５個または６個の原子で形成されている単環式または二環式のヘテロ環式環、または(ｂ)Ｗ-Ｒの基であり；Ｒは、アルキルまたはＣ(Ｏ)Ｒであり；Ｒは、１個または２個のＲで置換されたフェニルであり；Ｒは、水素、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキルスルホニル、低級アルキルカルボニル、-ＣＦ3、ＣＮ、-ＮＯ2または-Ｎ3であり；Ｒは、アルキル、シクロアルキル、単環式モノヘテロ環式環であり；Ｒは、標準的なアミノ酸の残基構造であるか、または同じ窒素に結合するＲおよびＲは環化してプロリン残基を形成することができ；ｍは、０〜１であり；ｎは、０〜３であり；ｍが１の場合、ｐは１〜３であり；ｍが０の場合、ｐは０〜３であり；ｒは、０〜２であり；ｓは、０〜３であり；ｔは、０〜２であり；ｕは、０〜３であり；ｖは、０または１であり；Ｗは、Ｏ、ＳまたはＮＲであり；Ｘは、ＯまたはＮＲであり；Ｘは、Ｃ(Ｏ)、ＣＲＲ、Ｓ、Ｓ(Ｏ)またはＳ(Ｏ)2であり；Ｘは、Ｃ(Ｏ)、ＣＲＲ、Ｓ(Ｏ)2または結合であり；Ｙは、ＸまたはＸであり；Ｑは、-ＣＯ2Ｒ、-Ｃ(Ｏ)ＮＨＳ(Ｏ)2Ｒ、-ＮＨＳ(Ｏ)2Ｒ、-Ｓ(Ｏ)2ＮＨＲ-Ｃ(Ｏ)ＮＲＲ、-ＣＯ2Ｒ、-Ｃ(Ｏ)ＮＲＲ、-ＣＨ2ＯＨ、あるいは１Ｈ-または２Ｈ-テトラゾール-５-イルである化合物；および、これらの薬学的に許容される塩類である。 これら化合物の好ましい実施態様は、以下の化合物およびそれらの薬学的に許容される塩類から選択される：
３-[Ｎ-(ｐ-クロロベンジル)-３-(ｔ-ブチルチオ)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(ｐ-クロロベンジル)-３-メチル-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(ｐ-ｔ-ブチルチオベンジル)-３-(ｔ-ブチルチオ)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(ｐ-クロロベンジル)-３-(フェニルチオ)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(ｐ-クロロベンジル)-３-(フェニルスルホニル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、Ｎ-オキシド、
３-[Ｎ-(ｐ-クロロベンジル)-３-(フェニルスルホニル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(ｐ-クロロベンジル)-３-(フェニルスルフィニル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(ｐ-クロロベンジル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(ｐ-クロロベンジル)-３-ベンゾイル-５-(キノリン２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(ｐ-クロロベンジル)-３-ベンジル-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(ｐ-クロロベンジル)-３-(３、３-ジメチル-１-オキソ-１-ブチル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
２-[Ｎ-(ｐ-クロロベンジル)-３-(ｔ-ブチルチオ)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]エトキシエタン酸、
３-[Ｎ-(ｐ-クロロフェニル)-３-(３、３-ジメチル-１-ブチル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(ｐ-クロロベンジル)-３-(ｔ-ブチルチオ)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２-メチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(ｐ-クロロベンジル)-３-メチル-５-(６、７-ジクロロキノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(ｐ-クロロベンジル)-３-メチル-５-(７-クロロキノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(ｐ-ジクロロベンジル)-４-アリル-５-(キノリン-２-イルメトキシ)-３-(ｔ-ブチルチオ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(ｐ-クロロベンジル)-４-アルキル-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(ｐ-クロロベンジル)-６-(キノリン-２-イルメトキシ)-３-(ｔ-ブチルチオ)インドール-２-イル-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(ｐ-クロロベンジル)-４-(キノリン-２-イルメトキシ)-３-(ｔ-ブチルチオ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(ｐ-クロロベンジル)-７-(キノリン-２-イルメトキシ)-３-(ｔ-ブチルチオ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
２-[２-[Ｎ-(ｐ-クロロベンジル)-３-(ｔ-ブチルチオ)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]エトキシ]プロパン酸、
３-[Ｎ-(ｐ-クロロベンジル)-４-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-メチル-３-(ｐ-クロロベンゾイル)-６-(キノリン-２-イルエトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-メチル-３-(ｐ-クロロベンジル)-６-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-ｉ-プロポキシ-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-(ｔ-ブチルチオ)-５-(キノリン-２-イル-メトキシ)インドール-２-イル]-２-エチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-トリフルオロアセチル-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-(３、３-ジメチル-１-オキソ-１-ブチル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２-メチルプロパン酸、
３-[３-(３、３-ジメチル-１-オキソ-１-ブチル-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-トリフルオロメチルベンジル)-３-(３、３-ジメチル-１-オキソ-１-ブチル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-ベンジル-３-(３、３-ジメチル-１-オキソ-１-ブチル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(３-メトキシベンジル)-３-(３、３-ジメチル-１-オキソ-１-ブチル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-アリル-３-(３、３-ジメチル-１-オキソ-１-ブチル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-メトキシベンジル)-３-(３、３-ジメチル-１-オキソ-１-ブチル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-メチル-３-(３、３-ジメチル-１-オキソ-３-ブチル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[３-(４-クロロベンジル)-６-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(フェニルスルホニル)-３-(４-クロロベンジル)-６-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-ベンジル-３-(４-クロロベンジル)-６-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(フェニルスルホニル)-３-(４-クロロベンジル)-６-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-(ｔ-ブチルスルホニル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-アリル-３-(４-クロロベンジル)-６-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(ｎ-プロピル)-３-(４-クロロベンジル)-６-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-エチル-３-(４-クロロベンジル)-６-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-(ｔ-ブチルベンゾイル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-(４-クロロベンゾイル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-(1,1-ジメチルエチル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-アセチル-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-シクロプロパンカルボニル-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-(３-シクロペンチルプロパノイル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-(３-メチルブタノイル)-５-(キノリン-２-イル-メトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-プロパノイル-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-(２-メチルプロパノイル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-トリメチルアセチル-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-フェニルアセチル-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-フルオロベンジル)-３-(３、３-ジメチル-１-オキソ-１-ブチル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-ブロモベンジル)-３-(３、３-ジメチル-１-オキソ-１-ブチル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-ヨードベンジル)-３-(３、３-ジメチル-１-オキソ-１-ブチル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-(１、１-ジメチルブチル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-(１、１-ジメチルプロピル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(３-フルオロベンジル)-３-(１、１-ジメチルエチル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-(３-メチルエチル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-シクロプロピル-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-(１-メチル-１-シクロプロピル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-シクロペンチル-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-シクロヘキシル-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-(α,α-ジメチルベンジル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-(２-｛４-クロロ-α,α-ジメチルベンジル｝-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-(１-アダマンチル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-((１-アダマンチル)メチル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(１、１-ジメチルエチル)-３-(４-クロロベンジル)-６-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(１、１-ジメチルプロピル)-３-(４-クロロベンジル)-６-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-３-(３、３-ジメチル-１-オキソ-１-ブチル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパン酸、
メチル３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-3,6-ビス(アセチル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパノエート、または
メチル３-[Ｎ-(４-クロロベンジル)-3,6-ビス(シクロプロパンカルボニル)-５-(キノリン-２-イルメトキシ)インドール-２-イル]-２、２-ジメチルプロパノエート。 本明細書の一部を構成するものとして援用する欧州特許第419049号公報を参照されたい。
「アルキル」の語は、１個の水素原子を除去することで、直鎖または分枝の飽和炭化水素から誘導される一価の基を指す。 アルキル基として、メチル、エチル、ｎ-およびiso-プロピル、ｎ-、sec-、iso-およびtert-ブチルなどがある。 「ヒドロキシアルキル」の語は、先に定義したような、１個〜３個のヒドロキシル基によって置換されているが、１個より多いヒドロキシ基が、アルキル基の１個の炭素原子に結合していないアルキル基を指す。 「アルキルアミノ」の語は、構造-ＮＨＲ’(Ｒ’は、先に定義したような、アルキルである)を有する基を指し、アルキルアミノの例として、メチルアミノ、エチルアミノ、iso-プロピルアミノなどがある。 「アルキルアミノカルボニル」の語は、由来分子部分にカルボニル基を介して結合する、先に定義したような、アルキルアミノ基を指すものである。 アルキルアミノカルボニルの例として、メチルアミノカルボニル、エチルアミノカルボニル、iso-プロピルアミノカルボニルなどがある。 「アルキルチオ」の語は、由来分子部分に硫黄原子を介して結合する、先に定義したような、アルキル基を指すものであり、このような例として、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、ｎ-、sec-およびtert-ブチルチオなどがある。 「アルカノイル」の語は、由来分子部分にカルボニル基を介して結合する、先に定義したような、アルキル基を表す。 アルカノイル基としては、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブタノイルなどがある。 「アルカノイルアミノ」の語は、由来分子部分に窒素原子を介して結合する、先に定義したような、アルカノイル基を指す。 アルカノイルアミノとして、ホルムアミド、アセトアミドなどがある。 「Ｎ-アルカノイル-Ｎ-アルキルアミノ」の語は、由来分子部分にアミノアルキル基を介して結合する、先に定義したような、アルカノイル基を指す。 Ｎ-アルカノイル-Ｎ-アルキルアミノとして、Ｎ-メチルホルムアミド、Ｎ-メチル-アセトアミドなどがある。 「アルコキシ」または「アルコキシル」の語は、由来分子部分に酸素原子を介して結合する、先に定義したような、アルキル基を示す。 代表的なアルコキシ基として、メトキシル、エトキシル、プロポキシル、ブトキシルなどがある。 「アルコキシアルコキシル」の語は、先に定義したような、アルキル基に酸素を介して結合し、由来分子部分に順番に酸素を介して結合する、先に定義したような、アルキル基を指す。 アルコキシアルコキシルとして、メトキシメトキシル、メトキシエチルオキシル、エトキシエトキシルなどがある。 「アルコキシアルキル」の語は、由来分子部分にアルキレン基を介して結合する、先に定義したような、アルコキシ基を指す。 「アルコキシカルボニル」の語は、エステル基；すなわち、由来分子部分にカルボニル基を介して結合するアルコキシ基を表し、例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニルなどがある。 「アルケニル」の語は、少なくとも一つの炭素-炭素二重結合を含有する炭化水素から１個の水素原子を除去することによって誘導される一価の基を示す。 アルケニル基として、例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル、１-メチル-２-ブテン-１-イルなどがある。 「アルキレン」の語は、直鎖または分枝の飽和炭化水素から２個の水素原子を除去することによって誘導される二価の基を示し、例えば、メチレン、１、２-エチレン、１、１-エチレン、１、３-プロピレン、２、２-ジメチルプロピレンなどがある。 「アルケニレン」の語は、少なくとも一つの炭素-炭素二重結合を含有する直鎖または分枝鎖の炭化水素から誘導される二価の基を示す。 アルケニレンの例として、-CH=CH-、-CH2CH=CH-、-C(CH3)=CH-、-CH2CH=CHCH2-などがある。 「シクロアルキレン」の語は、飽和炭素環式炭化水素から２個の水素原子を除去することにより誘導される二価の基を指し、例えば、シクロペンチレン、シクロヘキシレンなどがある。 「シクロアルキル」の語は、単環式または二環式の飽和炭素環式環化合物から１個の水素原子を除去することによって誘導される一価の基を示すものである。 その例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、およびビシクロ[2.2.2]オクタニルがなどがある。 「アルキニレン」の語は、炭素-炭素三重結合を含有する直鎖または分枝鎖の非環式炭化水素基から２個の水素原子を除去することによって誘導される二価の基を指す。
アルキニレンの例として、-CH≡CH-、-CH≡CH-CH2-、-CH≡CH-CH(CH3)-などがある。 「炭素環式アリール」の語は、「４ｎ＋２ｐ電子」の語、またはHuckel芳香族ルールに従った単環式または二環式の縮合環または非縮合環から１個の水素原子を除去することによって誘導される一価の炭素環式環基を指す。 炭素環式アリール基の例として、フェニル、１-および２-ナフチル、ビフェニルイル、フルオレニルなどがある。 「(炭素環式アリール)アルキル」の語は、由来分子部分にアルキレン基を介して結合する、先に定義したような、炭素環式アリール環基を指す。 代表的な(炭素環式アリール)アルキル基としては、フェニルメチル、フェニルエチル、フェニルプロピル、１-ナフチルメチルなどがある。 「炭素環式アリールアルコキシ」の語は、由来分子部分に酸素原子を介して結合する、先に定義したような、炭素環式アリールアルキル基を指す。 「炭素環式アリールオキシアルキル」の語は、由来分子部分に酸素原子を介して結合し、アルキレン基を介して結合する、先に定義したような、炭素環式アリール基を指す。 このような基として、フェノキシメチル、１-および２-ナフチルオキシメチル、フェノキシエチルなどがある。
「(炭素環式アリール)アルコキシアルキル」の語は、由来分子部分にアルコキシアルキル基を介して結合する、先に定義したような、炭素環式アリール基を指す。 代表的な(炭素環式アリール)アルコキシアルキル基として、フェニルメトキシメチル、フェニルエトキシメチル、１-および２-ナフチルメトキシエチルなどがある。 「炭素環式アリールチオアルキル」の語は、由来分子部分に硫黄原子を介して結合し、アルキレン基を介して結合する、先に定義したような、炭素環式アリール基を指し、その典型例は、フェニルチオメチル、１-および２-ナフチルチオエチルなどがある。 「ジアルキルアミノ」の語は、構造-ＮＲ'Ｒ”を指し、Ｒ'およびＲ”は独立して、先に定義したような、アルキルから選択される構造を有する基を指す。 さらに、Ｒ'およびＲ”は、任意に、-(CH2)kk-の構造、式中、kkは２〜６の整数である構造としてもよい。 ジアルキルアミノの例として、ジメチルアミノ、ジエチルアミノカルボニル、メチルエチルアミノ、ピペリジノなどがある。 「ハロまたはハロゲン」の語は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を指す。 「ハロアルキル」の語は、それらに結合する１個、２個または３個のハロゲン原子を有する、先に定義したような、アルキル基を指し、クロロメチル、ブロモエチル、トリフルオロメチルなどの基がある。 「ヒドロキシアルキル」の語は、１個〜３個のヒドロキシル基で置換されるが、１個を越えるヒドロキシ基が、アルキル基の１個の炭素原子に結合していない、先に定義したような、アルキル基を指す。 「フェノキシ」の語は、由来分子部分に酸素原子を介して結合するフェニル基を指す。 「フェニルチオ」の語は、由来分子部分に硫黄原子を介して結合するフェニル基を指す。 「ピリジルオキシ」の語は、由来分子部分に酸素原子を介して結合するピリジル基を指す。 本願明細書に記載の「ヘテロアリール」または「ヘテロ環状アリール」の語は、１個の酸素原子、１個、２個、３個または４個の窒素原子、１個の窒素原子および１個の硫黄原子、または１個の窒素原子および１個の酸素原子を含有する、置換または未置換の５-または６-員環の芳香族基を指す。
さらに、「ヘテロアリール」の語は、芳香族ヘテロ環式環が１個または２個のベンゼン環と縮合している、二環式または三環式基を含む。 代表的なヘテロアリール基として、ピリジル、チエニル、インドリル、ピラジニル、イソキノリル、ピローリル、ピリミジル、ベンゾチエニル、フリル、ベンゾ[ｂ]フリル、イミダゾリル、チアゾリル、カルバゾリルなどがある。 「ヘテロアリールアルキル」の語は、先に定義したような、由来分子部分にアルキレン基を介して結合するヘテロアリール基を指す。 「ヘテロアリールオキシ」の語は、先に定義したような、由来分子部分に酸素原子を介して結合するヘテロアリール基を指す。 「ヘテロアリールアルコキシ」の語は、先に定義したような、由来分子部分に酸素原子を介して結合する、ヘテロアリールアルキル基を指す。
心臓血管疾患の危険要素を除去する方法
本願発明は、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中および／または末梢動脈閉塞疾患の危険要素を除去するための組成物および方法をも包含している。 危険要素を除去する方法は、本願明細書で詳述したロイコトリエン合成阻害剤をそれ単独で、あるいはスタチンとの組み合わせで含む組成物を、これら状態のいずれかの危険性を有する個体に投与することを含む。 危険性を有する個体として、本願明細書に記載の標的集団、特に、ＣＲＰ値が増大している個体の他に、FLAPおよび／またはロイコトリエン経路の他の構成要素に関連する他の疾患および状態の危険性を有する個体がある。 特に、本願発明は、有効量のロイコトリエン阻害剤をそれ単独で、あるいはスタチンとの組み合わせて投与することを含む、血漿ＣＲＰレベルまたは血漿血清アミロイドＡレベルを低減する方法をも包含している。
スタチンとは、３-ヒドロキシ-３-メチルグルタル補酵素Ａ(ＨＭＧ-ＣｏＡ)をコレステロール前駆体であるメバロン酸に変換する酵素、すなわち、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの拮抗的阻害剤である。 ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの活性部位に結合すると、スタチンは、酵素の立体構造を改変し、これにより、機能的構造の形成が阻害されることとなる。 ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの活性部位での立体構造の変化は、スタチン製剤を、効果的かつ特異的なものにする。 ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの阻害は、肝細胞での細胞間コレステロール合成を抑制する。 細胞間コレステロールが減少すると、細胞表面にて肝臓ＬＤＬ受容体が増大し、それらは、循環性ＬＤＬとその前駆体、中密度リポタンパク質（ＩＤＬ）および超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）のレベルを交互に抑制する。 加えて、トリグリセリドが豊富なリポタンパク質の合成と分泌を抑制するアポリポタンパク質Ｂ-１００の肝合成を、スタチンは阻害する。 脂質生合成においてスタチンが奏するその他の利点として、ＬＤＬ酸化の阻害と、スカベンジャー受容体の発現阻害がある。
また、スタチンは、エステル化コレステロールのマクロファージへの蓄積を抑制し、内皮細胞の酸化窒素合成を促し、炎症プロセスを抑制し、関節形成片の安定性を高め、そして、血小板活性と凝固プロセスを回復せしめる。
その優れた有効性と特異性の高さが故に、スタチンは、先進工業国において最も普及の進んだ薬剤の一つとなっている。 本願発明の好ましい実施態様によれば、スタチンとは、以下の薬剤、すなわち、ロブバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチンまたはピタバスタチンのいずれかである。 これら薬剤の詳細を、以下のスタチン薬剤表IIIに示してある。
Figure 2007538003
Figure 2007538003
 メバスタチンとその関連化合物は、米国特許第3,983,140号に開示されている。 ロバスタチン（メビノリン）とその関連化合物は、米国特許第4,231,938号に開示されている。 メビノリン（ロバスタチン）のケト類似体は、欧州特許出願第0,142,146号(A2)に開示されており、また、キノリンおよびピリジン誘導体は、米国特許第5,506,219号および第5,691,322号に開示されている。
プラバスタチンとその関連化合物は、米国特許第4,346,227号に開示されている。 シンバスタチンとその関連化合物は、米国特許第4,448,784号および第4,450,171号に開示されている。
フルバスタチンとその関連化合物は、米国特許第5,354,772号に開示されている。 セリバスタチンとその関連化合物は、米国特許第5,006,530号および第5,177,080号に開示されている。 アトルバスタチンとその関連化合物は、米国特許第4,681,893号、第5,273,995号、第5,385,929号および第5,686,104号に開示されている。
ピタバスタチン（ニスバスタチン(NK-104)またはイタバスタチン）とその関連化合物は、米国特許第5,011,930号に開示されている。 ロスバスタチン（ビサスタチン(ZD-4522))とその関連化合物は、米国特許第5,260,440号に開示されている。
その他の利用可能なHMG CoAレダクターゼ分子は、米国特許第5,753,675号、第4,613,610号、第4,686,237号、第4,647,576号および第4,499,289号、そして、英国特許第GB 2205837号に開示されている。
スタチンまたは本願明細書に記載の薬剤に関連して引用した特許は、スタチン／薬剤、そして、その生物化学的に活性な相同体、塩類、プロドラッグ、代謝産物などの調製ならびに利用方法について記載している。 それら特許は、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する。 スタチンの用量については、特許や業界誌（例えば、本明細書の一部を構成するものとして援用する医家用便覧2004）にも記載されているし、また、それらを執筆している製造業者や医療従事者によっても明らかにされている。 特に、スタチン単独を処方する際と同様またはそれ以下の用量のスタチンを用いる組み合わせ療法を意図している。
ロイコトリエン合成阻害剤を単独で、あるいはスタチンと組み合わせて含む組成物は、ＣＲＰや血清アミロイドＡのような危険要素の除去において有効量のロイコトリエン合成阻害剤を含む。 ロイコトリエン合成阻害剤の有効日用量は、０.０１mg〜１００ｇ、好ましくは、０.１mg〜１ｇであり、とりわけ、これら範囲内の個別の用量を意図している。 毎日、１回〜４回の頻度で供される成人向の単一用量として、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、500mgおよび750mgがある。 この組成物は、全血清コレステロール、血清ＬＤＬおよび／または血清ＣＲＰを抑制する上で有効量のスタチンを含む。 有効日用量は、０.０１mg〜１００ｇ、好ましくは、０.１mg〜１ｇであり、とりわけ、これら範囲内の個別の用量を意図している。 毎日、１回〜４回の頻度で供される用量として、５mg、10mg、15mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、80mg、100mg、150mg、200mg、250mgおよび500mgがある。
新たに得られた証拠は、増大したＣＲＰが、臨床上の副作用に関する独立した危険要素であることを示唆している。 例えば、Ridker et al., N. Engl. J. Med. 352:１ (2005年１月６日)を参照されたい。 他の実施態様によれば、本願発明は、血清ＣＲＰレベルを抑制する作用を相乗的に奏する量のロイコトリエン合成阻害剤およびスタチンを含む組成物、単位用量、そして、それらを投与する方法を提供する。 相乗的有効量とは、(ａ)安全かつ有効な用量において、いずれか一方の薬剤だけを利用した平均的な患者よりも、ＣＲＰの減少率を顕著にする量、または(ｂ)副作用をほとんど示さずに、ＣＲＰの減少に至らしめる単一薬剤療法での用量と同等の用量、または、(ｃ)ＣＲＰの減少に至らしめる単一薬剤療法での用量と同等であり、かつ、単一薬剤療法よりも効果的に少なくとも一つのその他の心臓血管に関する危険要素を排除する用量である。
ある実施態様によれば、本願発明は、ロイコトリエン合成阻害剤とスタチンを含む組成物、すなわち、例えば、ある特定の用量でそれらを同時に投与するための組成物を提供する。 特に、錠剤、丸剤またはカプセル形態の組成物、例えば、持続型徐放性製剤などの組成物を意図している。 他の実施態様によれば、単一用量のロイコトリエン合成阻害剤と単一用量のスタチンを含む単位用量を含有しているものの、混合までには至っていない形態が意図されている。 他の実施態様によれば、本願発明の方法は、ロイコトリエン阻害剤を含む組成物とスタチンを含む組成物とを同時または個別に投与すること、例えば、スタチンを含む組成物の投与前または投与後にロイコトリエン合成阻害剤を投与することを含む。 とりわけ、血清ＣＲＰレベルおよび心臓血管に関するその他の危険要素レベルを管理するために、個体の危険度レベルに応じて、（例えば、貼付剤または静脈内投与で）継続的に、１日に１回〜１２回、１日に１回、２日に１回、１週間に２回、１または数週間、１または数ヶ月または１または数年にわたって毎週、毎月、あるいは患者の生涯にわたって、個体に薬剤を投与するための組成物および方法を意図している。 心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の初期予防または二次予防のための処置および生活管理プラン設計において、これら組成物を利用することも意図している。
核酸治療薬
その他の実施態様によれば、本願発明の核酸；本願発明の核酸に相補的な核酸；またはこのような核酸の一部(例えば、以下に記載したオリゴヌクレオチド)；またはロイコトリエン経路の構成要素(例えば、５-ＬＯ)をコードする核酸は、「アンチセンス」治療に使用することができ、ここで、ｍＲＮＡおよび／または核酸のゲノミックＤＮＡ核酸に特異的にハイブリダイズする核酸(例えば、オリゴヌクレオチド)は、in situで投与または産生される。 ｍＲＮＡおよび／またはＤＮＡに特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸は、例えば、翻訳および／または転写を阻害することによって、ｍＲＮＡおよび／またはＤＮＡによってコードされるポリペプチドの発現を阻害する。 アンチセンス核酸の結合は、従来の塩基対相補性、または、例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合する場合には、二重螺旋の主要な溝に対する特異的な相互作用を介して実現することができる。
アンチセンス構築物は、例えば、上述したような発現プラスミドとして、送達可能である。 プラスミドが、細胞内に転写される場合、ロイコトリエン経路の構成要素(例えば、ＦＬＡＰまたは５-ＬＯ)のためのポリペプチドをコードするｍＲＮＡおよび／またはＤＮＡの一部に相補性であるＲＮＡを産生する。 あるいは、アンチセンス構築物は、オリゴヌクレオチドプローブとすることができる。 ex vivoで産生され、細胞内に導入され；次いで、ポリペプチドのｍＲＮＡおよび／またはゲノミックＤＮＡとともにハイブリダイズすることによって発現を阻害する。 ある実施態様によれば、オリゴヌクレオチドプローブは、エンドヌクレアーゼ(例えば、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ)に耐性であり、in vivoでそれらを安定にする、修飾されたオリゴヌクレオチドである。 アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用するための核酸分子の例として、ＤＮＡのホスホルアミデート、ホスホチオエートおよびメチルホスホネート類似体がある（米国特許第5,176,996号、第5,264,564号および第5,256,775号も参照されたい）。 さらに、アンチセンス治療において有用なオリゴマーを構築する遺伝子的アプローチは、例えば、Vander Krol et al.,(Bio Techniques 6:958-976（1988))；およびStein et al., (Cancer Res. 48:2659-2668（1988))にも記載されている。 アンチセンスＤＮＡに関しては、翻訳開始部位から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
アンチセンス治療を行うために、オリゴヌクレオチド(ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡ)は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに相補的であるように設計される。 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ転写物に結合し、翻訳を防ぐ。 完全に相補的であることが好ましいが、必要ではない。 本願明細書で言及した、ＲＮＡの一部に対する配列「相補性」の語は、ＲＮＡとハイブリダイズ可能な配列が十分な相補性を有し、安定な二本鎖を形成することを指し；二本鎖のアンチセンス核酸の場合、二本鎖ＤＮＡの一本の鎖を試験してもよく、または、三本鎖形成を分析してもよい。 ハイブリダイズする能力は、上述したように、アンチセンス核酸の相補性の程度および長さに依存する。 一般的に、ハイブリダイズする核酸が長くなればなるほど、より多くの塩基が含有されることとなり、安定な二本鎖(または、場合によっては三本鎖)を形成するＲＮＡとミスマッチを起こす。 当業者は、標準的な手法によって、ミスマッチの許容度を確認することができる。
アンチセンス治療において使用されるオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはキメラ混合物または誘導体、またはそれらの改変体、一本鎖または二本鎖とすることができる。 オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改良するために、塩基部分、糖部分またはホスフェート骨格で改変可能である。 オリゴヌクレオチドは、併用する他の基、例えば、ペプチド(例えば、in vivoでの標的宿主細胞受容体)、または細胞膜を通って容易に移動する薬剤(例えば、Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556 (1989);Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652（1987);PCT国際公開番号WO88/09810を参照)または血液脳関門（例えば、PCT国際公開番号WO89/10134を参照）、またはハイブリダイゼーションの起点となる開裂薬剤(例えば、Krol et al., Bio Techniques 6:958-976（1988))または挿入剤(Zon, Pharm. Res. 5:539-549（1988))を含むことができる。 この目的を達成するために、オリゴヌクレオチドは、他の分子(例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションの起点となる架橋薬剤、移動薬剤、ハイブリダイゼーションの起点となる開裂薬剤）に接合してもよい。
アンチセンス分子は、ロイコトリエン経路の構成要素をin vivoで発現する細胞に送達される。 アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを脂肪に送達するために、多くの方法を使用することができる。 例えば、アンチセンス分子は、組織部位に直接注入されるか、または所望の細胞を標的化するように設計された、改変されたアンチセンス分子(例えば、標的細胞表面上で発現する受容体または抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に結合するアンチセンス)は、全身的に投与可能である。 あるいは、好ましい実施態様によれば、組換えＤＮＡ構築物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、強力なプロモーター（例えば、pol IIIまたはpol II)の制御下で使用される。 患者での標的細胞をトランスフェクトする目的でこれら構築物を使用すると、内因性転写物と相補的な塩基対が形成され、ｍＲＮＡの翻訳を防ぐ上で十分な量の一本鎖ＲＮＡの転写を実現する。 例えば、ベクターは、細胞によって吸収され、アンチセンスＲＮＡの転写物を導くようにin vivoで導入できる。 このようなベクターは、所望のアンチセンスＲＮＡを産生するための転写が可能である限りは、エピソームのままでもよく、または、染色体へ組み込むこともできる。 このようなベクターは、当該技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術や、上述した方法によって構築することができる。 例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣまたはウイルスベクターは、組織部位に直接導入可能な組換えＤＮＡ構築物を産生するために使用することができる。 あるいは、ウイルスベクターは、所望の組織を選択的に感染させるように使用することもでき、この場合、別の経路で（例えば、全身的）に投与されてもよい。
本願発明のその他の実施態様によれば、小さな二本鎖の干渉ＲＮＡ(ＲＮＡ干渉(ＲＮＡi))を使用することができる。 ＲＮＡｉは、転写後プロセスであり、ここに二本鎖ＲＮＡが導入されると、標的ｍＲＮＡの触媒的分解を介して、配列特異的な遺伝子のサイレンシングが生じる。 例えば、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する、Elbashir, S. M. et al., Nature 411:494-498（2001);Lee, N. S., Nature Biotech.19:500-505（2002）; Lee, S-K et al., Nature Medicine 8（7):681-686（2002）を参照されたい。 ハースループット方式で遺伝子機能を検索したり、あるいはヒトの疾患における遺伝子発現を調節するために、RNAiは日常的に利用されている(Chi et al., PIVAS, 100 (11): 6343-6346 (2003))。 長鎖の二本鎖ＲＮＡの導入が、相同的な遺伝子転写の配列特異的な攪乱を招く。 長鎖の二本鎖ＲＮＡは、21〜23個の小さなヌクレオチドからなるsiRNA(小さな干渉ＲＮＡ)に代謝される。 このsiRNAは、二機能性ヘリカーゼを有するタンパク質複合体RISC(RNA誘導型サイレンシング複合体)に結合する。 このヘリカーゼは、リボヌクレアーゼ活性を有しており、ＲＮＡをほぐすことができる。 ほどかれたsiRNAは、標的へのアンチセンス鎖の結合を許容する。 これにより、コグネイトmRNAは、配列依存的に分解される。 内因性RNAiの他に、外因性RNAi、化学合成または組換的に製造したものも使用できる。 FLAP遺伝子の非イントロン部分、例えば、配列番号：１または配列番号：３に記載の対応するmRNAなどを用いて、RNAiに関与するFLAP遺伝子の標的部分が、標的化および抑制される。 この技術を用いることで、FLAP遺伝子の核酸におけるRNAi遺伝子の移動と、タンパク質産生の阻害量の決定が可能となる。 よって、遺伝子のmRNAを直接的に標的化することで、遺伝子特異的な治療薬のデザインが可能となる。
さらに、ロイコトリエン経路(例えば、ＦＬＡＰ、５-ＬＯ)の構成要素の内因性発現は、標的化された同種組換えによって、遺伝子またはそのプロモーターを不活化または「ノックアウト」することによって減らすことができる(例えば、Smithies et al., Nature 317:230-234 (1985); Thomas & Capecchi, Cell 51:503-512 (1987); Thomson et al., Cell 5:313-321 (1989)を参照）。 例えば、選択可能なマーカーおよび／または陰性に選択可能なマーカーの存在または非存在下で、ロイコトリエン経路の構成要素(または完全に関連しないＤＮＡ配列)での改変された内因性遺伝子に対して(遺伝子のコード領域または制御領域のいずれかで)同種のＤＮＡによってフランキングされた非官能性遺伝子を使用して、遺伝子をin vivoで発現する細胞をトランスフェクトすることができる。 標的化された同種組換えを介するＤＮＡ構築物の挿入により、遺伝子の不活化が生じる。 組換えＤＮＡ構築物は、適切なベクターを用いてin vivoで必要とされる部位に直接的に投与または標的化可能である。 あるいは、未改変遺伝子の発現は、類似の方法を用いて高めることができる。 標的化された同種組換えは、上述したように、細胞中の遺伝子の代わりに、未改変の機能性遺伝子、またはそれらの相補体を含むＤＮＡ構築物を挿入するために使用することができる。 その他の実施態様によれば、標的化された同種組換えは、細胞内に存在するものとは異なるポリペプチド変異体をコードする核酸を含むＤＮＡ構築物を挿入するために使用することができる。
あるいは、ロイコトリエン経路の構成要素の内因性発現は、ロイコトリエン経路の構成要素の制御領域(すなわち、プロモーターおよび／またはエンハンサー)に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的化して身体内の標的細胞中の遺伝子の転写を防ぐ三重らせん構造を形成することによって減らすことができる。 （一般論として、Helene, C., Anticancer Drug Des., 6 (6):569-84 (1991); Helene, C. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660:27-36 (1992);および Maher, L. J., Bioassays 14 (12):807-15 (1992)を参照）。 同様に、本願明細書に記載のアンチセンス構築物は、ロイコトリエン経路の構成要素の一つの通常の生物学的活性を拮抗することによって、例えば、in vivoにおける組織の分化およびex vivoの組織培養物の双方での組織操作において使用可能である。 さらに、アンチセンス技術(例えば、アンチセンス分子のマイクロインジェクション、または転写物が核酸ＲＮＡまたは核酸配列に関してアンチセンスであるプラスミドを用いたトランスフェクション)が、疾患に関連する状態の進行における、ロイコトリエン経路の一つ以上の構成要素の役割を観察するために使用可能である。 このような技術は、細胞培養物内でも使用可能であるが、トランスジェニック動物においても使用可能である。
本願明細書に記載の治療薬剤は、上述したように、組成物として、またはそれら自身で送達可能である。 これら薬剤は、全身的に投与されるか、または特定の組織に標的化することができる。 治療薬剤は、化学合成；組換え産生；in vivo産生（例えば、トランスジェニック動物、例えば、Meade et alの米国特許第4,873,316号)を含む種々の方法によって製造可能であり、例えば、本願明細書に記載の標準的な手段を用いて単離可能である。 加えて、上述した治療方法のいずれかの組み合わせ(例えば、ロイコトリエン経路の構成要素のための改変ｍＲＮＡを標的化するアンチセンス治療を併用した未改変ポリペプチドの投与；第二のスプライシング変異体を標的化するアンチセンス治療を併用した第一のスプライシング変異体の投与)を使用することもできる。
本願発明はさらに、例えば、本願明細書に記載の方法を用いて、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患、および／またはアテローム性動脈硬化症を治療するための医薬の製造のために、このような治療薬剤を使用することにも関する。
治療のモニタリングプロセス
本願発明はさらに、例えば、ロイコトリエン合成阻害剤を用いた処置における、上述した標的集団の一つにおける個体での応答をモニタリングする方法に関する。
炎症性マーカーのレベルは、上述した標的集団での個体において上昇可能であるため、ロイコトリエン合成阻害剤を用いた治療前および治療中の個体の炎症性マーカーのレベルの評価は、治療が動脈血管壁または炎症性細胞を誘発する骨髄におけるロイコトリエンの産生の効率的な減少を示す。 例えば、本願発明の実施態様によれば、心筋梗塞またはＡＣＳの危険性を保有する個体についての標的集団に属する個体(例えば、ＦＬＡＰハプロタイプに起因する危険性を保有する個体、すなわち、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の危険性を保有する個体)は、個体のロイコトリエンレベルを試験することで、ロイコトリエン合成阻害剤を用いた治療に対する応答について評価することができる。 血液、血清、血漿または尿でのロイコトリエン(例えば、ロイコトリエンＥ４、システイニルロイコトリエン１)、またはロイコトリエンのex vivo産物(例えば、ロイコトリエンを産生するためにカルシウムイオノフォアで刺激された血液試料)は、ロイコトリエン合成阻害剤を用いた処置前、および処置中または処置後において測定することができる。 治療前のロイコトリエンレベルは、治療中または治療後のロイコトリエンレベルと比較される。 治療の効力は、ロイコトリエン産生の減少によって示される。 治療前のロイコトリエンのレベルよりも、治療中または治療後のロイコトリエンのレベルが顕著に減少することは、効果があることを示す。 治療中または治療後の低いレベルは、例えば、血清または尿でのロイコトリエンの減少、またはロイコトリエンのex vivo産生の減少と見ることができる。 本願明細書に記載の「顕著に低い」レベルとは、対照の個体において通常認められる量よりも少ないレベルであるか、またはさらに低い測定値域（例えば、平均または中央値、他の四分位点；他の五分位点)と比較される他の測定値域（例えば、平均値または中央値、最も高い四分位点または最も高い五分位点)と関連する集団における疾患危険度と比較して少ないレベルである。
例えば、本願発明のある実施態様によれば、ロイコトリエン合成阻害剤を用いた処置前の個体、そして、ロイコトリエン合成阻害剤を用いた処置の最中または処置後の個体でのロイコトリエンまたはロイコトリエン代謝産物のレベルを分析し、そして、それらレベルは比較される。 処置中または処置後の個体でのロイコトリエンまたはロイコトリエン代謝産物のレベルが、処置前の個体でのロイコトリエンまたはロイコトリエン代謝産物のレベルより顕著に低いことは、ロイコトリエン合成阻害剤による処置効果を示すものである。 他の実施態様によれば、ロイコトリエン合成阻害剤を用いた処置前に、個体から得た最初の試料に対して、カルシウムイオン透過担体を用いて、ロイコトリエンまたはロイコトリエン代謝産物の産生が刺激され、次いで、ロイコトリエン合成阻害剤を用いた処置の最中または処置後に、個体から得た第二の試料に対して、カルシウムイオン透過担体を用いて、ロイコトリエンまたはロイコトリエン代謝産物の産生が刺激され、そして、最初の被験試料での産生レベルが、第二の被験試料でのロイコトリエンまたはロイコトリエン代謝産物の産生レベルと比較される。 第二の被験試料でのロイコトリエンまたはロイコトリエン代謝産物のレベルが、最初の被験試料でのロイコトリエンまたはロイコトリエン代謝産物のレベルよりも顕著に低いことは、ロイコトリエン合成阻害剤による処置効果を示すものである。
本願発明のその他の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の危険性を保有する個体についての標的集団に属する個体(例えば、Ｃ反応性タンパク質の上昇に起因する危険性を保有する個体など、上述した標的集団に属する個体)は、個体での炎症性マーカーのレベルを試験することによって、ロイコトリエン合成阻害剤を用いた治療に対する応答について評価することができる。 例えば、適切な被験試料(例えば、血清、血漿または尿)での炎症性マーカーのレベルは、ロイコトリエン合成阻害剤を用いた治療前、および治療中または治療後に測定することができる。 治療前の炎症性マーカーのレベルは、治療中または治療後の炎症性マーカーのレベルと比較される。 治療の効果は、炎症性マーカーのレベルの減少によって示される。 すなわち、治療中または治療後の炎症性のレベルが、治療前の炎症性マーカーのレベルよりも顕著に低い(例えば、顕著に低い)ことは、効果があることを示すものである。 代表的な炎症性マーカーとして、Ｃ反応性タンパク質(ＣＲＰ)、血清アミロイドＡ、フィブリノーゲン、ロイコトリエン（例えば、LTB４、LTC４、LTD４、LTE４）、ロイコトリエン代謝産物(例えば、システイニルロイコトリエン１)、インターロイキン-６、組織壊死因子-α、可溶性脈管細胞接着性分子(ｓＶＣＡＭ)、可溶性脈管間接着性分子(ｓＩＣＡＭ)、Ｅ-セレクチン、１型マトリックスメタロプロテアーゼ、２型マトリックスメタロプロテアーゼ、３型マトリックスメタロプロテアーゼ、９型マトリックスメタロプロテアーゼ、ミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)、およびＮ-チロシンなどがある。 好ましい実施態様によれば、炎症性マーカーは、ＣＲＰまたはＭＰＯである。
ロイコトリエン合成阻害剤による治療効果は、血漿、血清または尿中の危険要素バイオマーカーを測定することによってモニターすることができる。 臨床分析に利用可能なバイオマーカーとして、ＣＲＰ、血清アミロイドＡ、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10, TNF-α、Ｅ-セレクチン、Ｐ-セレクチン、および細胞間接着分子-１、脈管細胞接着性分子-１などがある。 ＣＲＰレベルから予見できる心臓血管障害の相対的危険度は、１mg/Lに満たない場合の危険度は小さく、通常は、１.０〜３.０mg/Lであり、３.０mg/Lを超える患者での危険度はいっそう高いものとなる。 ロイコトリエン合成阻害剤単体またはスタチンとの組み合わせによって得られる至適な治療効果とは、ＣＲＰレベルを、２.０mg/Lまたはそれ以下に低減することにある。
全血清コレステロール値、血清LDLおよび／または血清トリグリセリドのレベルを測定することによって、スタチンの治療効果がモニターされる。 治療期間中または治療後の全血清コレステロール値、LDL-Ｃおよび／またはトリグリセリドのレベルが、治療開始前の全コレステロール値、LDL-Ｃおよび／またはトリグリセリドのレベルより顕著に低くなっている場合、治療効果を確認することができる。 コレステロール値の管理目的で、「高危険度の患者」は、130mg/Dlまたはそれ以上のLDLレベルを有し、好ましくは、スタチン処置によって、LDLレベルが、100mg/dlに満たないレベルにまで低減される。 「危険度が中度の患者」とは、心臓血管病に関する二つまたはそれ以上の危険要素を有し、かつ、10年以内に心臓発作を患う危険率が10〜20％である個体を指す。 好ましくは、スタチン処置によって、LDLレベルが、129mg/dlに満たないレベルで維持される。 最近になって、スタチン処置によって、血清LDL-Cが、70mg/dLに満たないレベルにまで低減した際の、罹患率と死亡率に対する新たな有効性が研究発表されている。 (Ridker et al., N. Engl. J. Med. 352 (1): 20-28, 2005; Nissen et al., N. Engl. J. Med. 352 (1): 29-38, 2005)。 つまり、スタチンが奏する好適な治療効果とは、Ridker et al., N Engl. J. Med. 352 (1): 20-28. 2005 および Nissen et al., N. Engl. J. Med. 352 (1): 29-38, 2005で記載されているように、LDL-Cレベルを70mg/dLに満たないレベルにまで低減する点にあり、スタチン処置によってＣＲＰが低減することがうかがえる。 ＣＲＰは、スタチン処置と連動してモニターすることができる新たなパラメーターである。
増大した危険度の評価
本願発明は、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、アテローム性動脈硬化、脳卒中、一過性脳虚血発作、一過性単眼視覚消失症、無症候性頸動脈狭窄症、末梢動脈閉塞疾患、跛行または虚血肢に罹患する危険度に関して個体（例えば、本願明細書に記載の標的集団、例えば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の危険性を有する個体）を評価する方法をも意図している。 これら方法は、個体でのロイコトリエン代謝産物（例えば、LTE4、LTD4、LTB4）のレベルの評価工程を含み、ロイコトリエン代謝産物のレベルの増大によって、危険度の増大が指示される。 このレベルは、好適な組織や液体試料、例えば、血液、血清、血漿または尿などに対して分析することができる。 ある特定の実施態様によれば、この試料は、好中球を含んでいる。 ロイコトリエン代謝産物のレベルは、本願明細書に記載の方法など、標準的な方法によって分析することができる。
例えば、ある実施態様によれば、個体から得た最初の被験試料に対してカルシウムイオン透過担体を用いることで、ロイコトリエン代謝産物の産生が刺激される。 産生レベルは、対照レベルと比較される。 この対照レベルとは、対照の個体、すなわち、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の危険性の無い個体において通常認められるレベルであって、あるいは、この対照レベルとは、高レベル（例えば、平均値または中央値を超えるレベル、第２、第３または第４の四分位点を超えるレベル、第２、第３、第４または第５の五分位点を超えるレベル）の個体集団と比較して低レベル（例えば、平均値または中央値に満たないレベル、最小の四分位点、最小の五分位点）の個体集団に属する集団での疾患危険度との比較によって導かれたレベルである。 対照レベルよりも大きなロイコトリエン代謝産物の産生レベルは、危険度が増大していることを指示している。 危険度が増大した個体は、本願明細書に記載の処置に適用する候補個体である。
薬学的組成物
本願発明はさらに、本願明細書に記載の薬剤、例えば、本願明細書に記載されたロイコトリエン合成阻害剤である薬剤を含む薬学的組成物に関する。 例えば、ロイコトリエン合成阻害剤は、生理学的に許容可能な担体または賦形剤と共に処方して、薬学的組成物を調製することができる。 担体および組成物は、滅菌することができる。 調製物は、投与形態に適合させるべきである。
本願発明は、薬剤表Ｉに記載のロイコトリエン合成阻害剤と薬剤表IIIに記載のスタチンとを含む組成物も提供する。 ロイコトリエン合成阻害剤とスタチンは、薬学的組成物を調製する際に用いる生理学的に許容可能な担体または賦形剤と共に製剤化することができる。 この組成物は、ロイコトリエン合成阻害剤とスタチンとを単一用量で送給するために製剤化することができる。 スタチンおよびその他のHMG-CoA還元酵素阻害剤を単離および精製するためのプロセスは、抽出、クロマトグラフィー、ラクトン化および結晶化などの方法を、多様に組み合わせて利用する。 スタチン、スタチン誘導体およびスタチン塩の製剤例は、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する、米国特許第6,316,460号、第6,589,959号、再発行第RE37,314号、第5,354,772号、第5,356,896号、第5,686,104号、第5,969,156号、第6,126,971号、第5,030,447号、第5,180,589号、第5,622,985号、第6,825,015号、第6,838,566号、第5,403,860号、第5,763,653号および第5,763,646号、国際特許公開公報第WO 86/03488号、第WO 86/07054号、フランス特許第2596393号、欧州特許出願第0221025号、英国特許第2055100A号および第2073199A号、および欧州特許第65,835号に開示されている。
好適な薬学的に許容される担体として、水、塩溶液(例えば、塩化ナトリウム)、生理食塩水、緩衝化食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物、例えば、ラクトース、アミロースまたはデンプン、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘稠性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、それに、これらの組み合わせなどがあるが、これらに限定されない。 薬学的調製物は、必要に応じて、補助剤、例えば、滑沢剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩類、緩衝剤、着色剤、香料および／または活性薬剤との間で有害な反応を起こさない芳香族基質などと混合することができる。
組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤をさらに含むことができる。 組成物は、液体溶液、懸濁物、乳濁物、錠剤、ピル、カプセル、持続性放出配合物、または粉末とすることができる。 組成物は、従来の結合剤および担体(例えば、トリグリセリド)を用いて、座剤とすることができる。 経口用製剤は、標準的な担体、例えば、薬用マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含むことができる。
これらの化合物を導入する方法として、皮内、筋肉内、腹腔内、眼球内、静脈内、皮下、局所的、経口および鼻腔内などがあるが、これらに限定されない。 また、その他の好適な導入方法として、(後述の)遺伝子治療、充電式または生分解可能な装置、粒子加速装置(「遺伝子銃」)および徐放性ポリマー製装置を用いることができる。 さらに、本願発明の薬学的組成物は、他の薬剤を併用する組み合わせ治療の一部において、投与することもできる。
この組成物は、ヒトへの投与に適した薬学的組成物として、通常の手順に従って調製することができる。 例えば、静脈内投与用組成物は、通常は、滅菌等張性の水性緩衝剤で溶解した溶液である。 必要に応じて、この組成物は、可溶化剤および注射部位での痛みを緩和するための局所麻酔剤をさらに含んでいてもよい。 一般的に、これらの成分は、その単位投薬用量を、凍結乾燥粉末または水不含濃縮物の形態で、個別または混合して、活性薬剤の量を示すアンプルや小袋のような密閉容器内に入れて提供される。 点滴で投与する場合には、組成物を、薬用滅菌水、生理食塩水またはデキストロース／水を入れた注入用瓶を用いて投与することができる。 注射で投与する場合には、注射用滅菌水または生理食塩水の入ったアンプルは、組成物成分が投与前に混合できるようにする。
局所投与に適した担体を含み、好ましくは、水よりも大きな動的粘度を有する、スプレー不可能な、粘稠性固体から半固体または固体の組成物を塗布することができる。 好適な製剤は、溶液、懸濁物、乳濁物、クリーム、軟膏、粉末、浣腸、ローション、ゾル、擦剤、軟膏剤、エアロゾルなどを含むことができ、必要に応じて、滅菌済のもの、防腐剤、滅菌剤、湿潤剤、緩衝剤または浸透圧などの補助剤に影響を与える塩類と混合したものをさらに含むことができるが、これらに限定されない。 薬剤は、化粧品調製物に取り込んでもよい。 活性成分を、固体または液体の不活性担体物質と組み合わせて、または、通常は、ガス性噴射剤、例えば、圧縮空気などの圧縮揮発物と共に絞出型容器に封入してなる、スプレー可能なエアロゾル調製物も局所投与用として好ましい。
本願明細書に記載の薬剤は、中性形態または塩形態として配合できる。
薬学的に許容される塩類としては、遊離アミノ基と、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する誘導物とから形成される塩類、および遊離カルボキシルと、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する誘導物とから形成される塩類がある。
薬剤は、治療的有効量で投与される。 特定の障害または状態の治療における治療的有効な薬剤の量は、障害または状態の性質に応じて、標準的な臨床技術によって決定することができる。 加えて、in vitroまたはin vivo分析を、最適な投薬範囲を同定する際に役立てるべく、任意に使用することができる。 また、調製物で用いる正確な投薬量は、投与経路、症状の重篤度に応じて、医師の判断および患者個々の状況に従って決定されるべきである。 効果的な用量は、in vitroモデルまたは動物モデルを用いた試験系から導かれる投薬−応答曲線から推定してもよい。
さらに、本願発明は、本願発明の薬学的組成物での一つ以上の成分で満たされた、一つ以上の容器を含む薬学的製品またはキットを提供する。 ヒトへの投与のための製造、使用または販売に関する政府認可に関する、薬学的製品または生物学的製品の製造、使用または販売についての政府当局の規制を伝える注意書を、任意に、容器に添付することができる。 これら製品またはキットに、投与、薬物投与の順序(例えば、個別、連続または並行)に関する情報などを含んだラベルを付けることができる。 さらに、これら製品またはキットは、患者に治療を促すための手段を含むことができる。 これら製品またはキットでは、組み合わせ療法での単一の単位用量でも、または、単位用量を複数回にわたって投与することもできる。 特に、薬剤は、個別に、任意の組み合わせで混合されて、単一のガラス瓶または錠剤中に存在せしめることができる。 例えば、本願発明の製品またはキットに、ロイコトリエン合成阻害剤とスタチンとの双方を同時に送給するための単一用量、あるいは、ロイコトリエン合成阻害剤を送給するための用量と、それと平行して、あるいはそれに引き続いて送給されるスタチンのための用量、すなわち、二つまたはそれ以上の用量を含ませることができる。
ブリスターパックまたはその他の分配手段にて、利用できる薬剤が好ましい。 本願発明の目的のために、単位投薬とは、各薬剤の個体での薬力学に応じて、標準的な時間で、ＦＤＡで承認された用量で、投与することを意図するものである。
本願発明の核酸
ＦＬＡＰ核酸、その一部および変異体
加えて、本願発明は、ヒトのＦＬＡＰ核酸を含む、単離された核酸分子に関する。 本願明細書で使用する「ＦＬＡＰ核酸」の語は、ＦＬＡＰポリペプチドをコードする単離された核酸分子を指す。 本願発明のＦＬＡＰ核酸分子として、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、またはＤＮＡ、例えば、ｃＤＮＡおよびゲノミックＤＮＡがある。 ＤＮＡ分子として、二本鎖または一本鎖があり、また、一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡとして、コード鎖、すなわちセンス鎖、または非コード鎖、すなわちアンチセンス鎖がある。 核酸分子は、遺伝子または核酸のコード配列のすべてまたは一部を含むことができ、他の非コード配列、例えば、イントロンおよび非コード３'および５'配列(制御配列、例えば、プロモーター、転写改善因子、スプライシングドナー／アクセプター部位を含む)をさらに含む。
例えば、ＦＬＡＰ核酸は、配列番号：１または３、またはそれらの相補体、またはＦＬＡＰポリペプチド(例えば、配列番号：２に記載したようなポリペプチド)をコードする、単離された核酸分子(例えば、ｃＤＮＡまたは核酸)の一部または断片から構成することができる。 好ましい実施態様によれば、単離された核酸分子は、配列番号：１または３、またはそれらの相補体からなるグループから選択される核酸分子を含む。
さらに、本願発明の核酸分子は、マーカー配列、例えば、ポリペプチドの単離または精製を助けるポリペプチドをコードする配列に融合することができる。 このような配列として、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)融合タンパク質をコードする配列、およびインフルエンザ由来のヘマグルチニンＡ(ＨＡ)ポリペプチドマーカーをコードする配列があるが、これらに限定されない。
本願明細書で使用する「単離された」核酸分子とは、遺伝子または核酸配列を(ゲノム配列におけるように)普通にフランキングし、および／または、その他の転写した配列から完全または部分的に精製した(例えば、ＲＮＡライブラリーにおけるように)核酸から分離されるものである。 例えば、本願発明の単離された核酸は、天然由来か、または、組換え技術によって産生される場合の培地、または化学的に合成される場合の化学前駆体またはその他の化学物質のような、複雑な細胞環境に応じて、実質的に単離されていてもよい。 ある事例によれば、単離された物質は、組成物(例えば、他の基質を含有する粗抽出物)、緩衝系または試薬混合物の一部を形成する。 他の条件下では、このような物質は、例えば、ＰＡＧＥまたはカラムクロマトグラフィー(例えば、ＨＰＬＣ)によって決定されるべく、本質的に均一になるように精製されていてもよい。 ある実施態様によれば、単離された核酸分子は、存在するすべての巨大分子種の(モル基準で)少なくとも50％、80％または90％含む。 ゲノミックＤＮＡの観点から、「単離された」の語は、ゲノミックＤＮＡが天然に付随している染色体から分離されている核酸分子を指すこともできる。
例えば、単離された核酸分子は、核酸分子が誘導される細胞のゲノミックＤＮＡにおいて、核酸分子をフランキングする４kb、３kb、２kb、１kb、０.５kbまたは０.１kbのヌクレオチドを含む、約５kb未満を含有することができるが、これらに限定されない。
核酸分子は、他のコード配列または制御配列に融合することができ、これは単離されているとみなされる。 従って、ベクター内に取り込まれる組換えＤＮＡは、本願明細書で使用する「単離された」の定義に含まれる。 さらに、単離された核酸分子は、異種宿主細胞内の組換えＤＮＡ分子を含み、また、溶液中に部分的または実質的に精製されたＤＮＡ分子を含む。 さらに、「単離された」核酸分子は、in vivoおよびin vitroでの、本願発明のＤＮＡ分子のＲＮＡ転写物を含む。 単離された核酸分子または核酸配列は、化学的または組換え手段によって合成される核酸分子または核酸配列を含む。 それ故に、ベクター内に含まれる組換えＤＮＡは、本願明細書で使用される「単離された」の定義に含まれる。 さらに、単離されたヌクレオチド配列として、異種有機体中の組換えＤＮＡ分子、および溶液中の部分的または実質的に精製されたＤＮＡ分子がある。 さらに、in vivoおよびin vitroでの、本願発明のＤＮＡ分子のＲＮＡ転写物は、「単離された」ヌクレオチド配列に含まれる。 このように単離されたヌクレオチド配列は、同種配列を単離するための(例えば、他の哺乳動物種由来の)プローブ、(例えば、染色体を用いたin situハイブリダイゼーションによって)遺伝子のマッピング、または組織(例えば、ヒト組織)内での核酸の発現をNorthernブロット分析などで検出などに利用できるので、コードされたポリペプチドの製造において有用である。
さらに、本願発明は、自然界では必ずしも見出されない、ＦＬＡＰポリペプチド(例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド)またはＦＬＡＰポリペプチドの他のスプライシング変異体またはそれらの多型性変異体をコードする核酸分子に関する。 従って、例えば、自然界の核酸配列とは異なるが、遺伝コードの縮重に起因して、本願発明のＦＬＡＰポリペプチドをコードするＤＮＡ分子も、本願発明は意図している。 さらに、本願発明は、その一部(断片)をコードするヌクレオチド配列、またはＦＬＡＰポリペプチドの類似体または誘導体のような変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も含む。 このような変異体は、例えば、対立遺伝子変異または単一ヌクレオチド多型性のように、自然発生のものであっても、または種々の突然変異原および突然変異原性プロセスによる誘発など、非自然発生のものであってもよい。 意図される変異として、付加および欠失を含む、保存性または非保存性のアミノ酸変化を生じ得る一つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、および置換があるが、これらに限定されない。 好ましくは、ヌクレオチド(および／または得られるアミノ酸)の変化は、目立たず、または保存されている。 すなわち、それら変化は、ＦＬＡＰポリペプチドの特徴または活性を変えるものではない。 ある好ましい実施態様によれば、ヌクレオチド配列は、一つ以上の多型性マイクロサテライトマーカーを含む断片である。 他の好ましい実施態様によれば、ヌクレオチド配列は、ＦＬＡＰ核酸中に一つ以上の単一ヌクレオチド多型性(例えば、以下の表１３に記載の単一ヌクレオチド多型性)を含む断片である。
本願発明の核酸分子のその他の改変として、例えば、同位体標識、メチル化、ヌクレオチド間修飾、例えば、無電荷結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート）、有電荷結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート)、未決定部分(例えば、ポリペプチド）、インターカレーター(例えば、アクリジン、ソラレン)、キレート化剤、アルキレート化剤、および修飾結合(例えば、α-アノマー性核酸)などがある。 さらに、水素結合および他の化学的相互作用を介して指定の配列に結合する能力をもつ、核酸分子を模倣する合成分子も含む。 このような分子として、分子骨格中にホスフェート結合に代わるペプチド結合代替物を有するものがある。
さらに、本願発明は、(例えば、選択的なハイブリダイゼーションのような)高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子、本願明細書に記載の核酸配列(例えば、本願明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸配列に特異的にハイブリダイズし、かつ、任意に、ポリペプチドの活性を保有する核酸分子)に関する。 ある実施態様によれば、本願発明は、(例えば、選択的なハイブリダイゼーションのような)高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１または３、またはそれらの相補体からなるグループから選択される核酸配列を含む核酸配列にハイブリダイズする、本願明細書に記載の変異体を含む。 その他の実施態様によれば、本願発明は、(例えば、選択的なハイブリダイゼーションのような)高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：２、またはそれらの多型性変異体のアミノ酸配列をコードする核酸配列にハイブリダイズする、本願明細書に記載の変異体を含む。 好ましい実施態様によれば、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする変異体は、ＦＬＡＰの活性を有する。
このような核酸分子は、特定のハイブリダイゼーション(例えば、高度にストリンジェントな条件)によって検出および／または単離することができる。 本願明細書で使用する「特定のハイブリダイゼーション」の語は、第一の核酸が、第二の核酸以外の任意の核酸にハイブリダイズしないような方法において(例えば、第一の核酸が、ハイブリダイゼーションが行われる試料での任意の他の核酸よりも、第二の核酸と高い類似性を有する場合に）、第一の核酸が第二の核酸にハイブリダイズする能力を指す。 ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェンシー条件」の語は、特定の核酸が、第二の核酸にハイブリダイゼーション可能なインキュベーションおよび洗浄条件、例えば、温度および緩衝剤濃度の条件を指す当該技術分野の用語であり；第一の核酸は、第二の核酸と完全に(すなわち１００％)相補性であってもよく、または、第一および第二の核酸は、完全よりは小さい相補性の程度を共有していてもよい(例えば、70％、75％、85％、95％）。 例えば、特定の高度にストリンジェンシーな条件は、完全に相補性の核酸を、相補性の低いものと区別するために使用することができる。 核酸ハイブリダイゼーションのための「高度にストリンジェンシーな条件」の語、「中度にストリンジェンシーな条件」の語および「低度にストリンジェンシーな条件」の語は、Current Protocols in Molecular Biology（本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する、Ausubel, F. M. et al., 「Current Protocols in Molecular Biology」, John Wiley & Sons,(1998) pp.2.10.1-2.10.16 および pp.6.3.1-6.3.6)で説明されている。 ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する際の条件は、イオン強度(例えば、０.２×ＳＳＣ、０.１×ＳＳＣ）、温度(例えば、室温、４２℃、６８℃)、および脱安定化剤(例えば、ホルムアミド)または変性剤(例えば、ＳＤＳ)の濃度のみならず、核酸配列の長さ、塩基組成、ハイブリダイゼーション配列間のミスマッチ率、および非同一の配列内での配列のサブセットの発生頻度にも依存している。 従って、等価な条件は、２個の核酸分子間の同一性または類似性の類似度を維持しながら、これらのパラメーターの一つ以上を変動させることによって決定することができる。 通常は、互いに少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％または少なくとも約95％またはそれ以上の同一性が、互いにハイブリダイズされるような条件が使用される。 ハイブリダイゼーション条件を、ハイブリダイゼーションが起こらないストリンジェンシーレベルからハイブリダイゼーションが最初に観察されるレベルまで変動させることによって、対象とした配列が、試料内で最も類似した配列と(例えば、選択的に)ハイブリダイズ可能である条件を決定することができる。
ハイブリダイゼーション条件の例として、中度または低度にストリンジェンシーな条件のための洗浄条件に関する記載が、Krause, M. H.およびS. A. Aaronson, Methods in Enzymology 200:546-556(1991)、およびAusubel et al., 「Current Protocols in Molecular Biology」, John Wiley & Sons,(1998)に記載されている。 洗浄工程では、通常、条件がハイブリッドの相補性の最小レベルを決定するように設定されている。 一般的に、同種ハイブリダイゼーションのみが起こる最も低い温度から出発し、（ＳＳＣ濃度定数を保持しつつ）最終洗浄温度が１℃下げられるごとに、ハイブリダイズする配列間のミスマッチ度の最大が１％増加する。 一般的に、ＳＳＣの濃度が二倍になると、Ｔmが−１７℃上昇する。 これらのガイドラインを用いて、高度、中度または低度なストリンジェンシーの洗浄温度は、ミスマッチレベルに応じて、経験的に決定することができる。
例えば、低度なストリンジェンシー洗浄は、０.２×ＳＳＣ/０.１％ＳＤＳを含有する溶液中で、室温で、１０分間の洗浄を含むことができ；中度なストリンジェンシー洗浄は、あらかじめ加温した(４２℃)、０.２×ＳＳＣ/０.１％ＳＤＳを含有する溶液中で、４２℃で、１５分間の洗浄を含むことができ；および、高度なストリンジェンシー洗浄は、あらかじめ加温した(６８℃)、０.１×ＳＳＣ/０.１％ＳＤＳを含有する溶液中で、６８℃で、１５分間の洗浄を含むことができる。 さらに、洗浄は、繰り返しまたは連続的に行うことができ、当該技術分野で周知の所望の結果が得られる。 等価な条件は、標的核酸分子および使用されるプライマーまたはプローブ間の同様の同一性または類似性を維持しながら、当該技術分野で周知の、実施例に記載の変数の一つ以上を変動させることによって決定することができる。
二つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の相同率または同一性は、的確な比較を容易ならしめるために配列を整列させて対比することで(例えば、的確な比較のために、第一の配列の配列内にギャップを導入することができる)、決定することができる。 次いで、対応する位置でのヌクレオチドまたはアミノ酸を比較し、二つの配列間で一致している位置の数の関数から、一致率を求める（すなわち、一致率＝同じ位置の数／位置全体の数×１００）。 一方の配列での位置が、他方の配列での対応する位置と同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基によって占められている場合、これらの分子はその位置で相同である。
本願明細書で使用されている核酸またはアミノ酸「ホモロジー」の語は、核酸またはアミノ酸「同一性」の語と等価である。 ある実施態様によれば、比較の目的で整列される配列の長さは、参照配列の少なくとも30％、例えば、少なくとも40％、また、ある実施態様によれば、少なくとも60％、およびその他の実施態様によれば、少なくとも70％、80％、90％または95％である。 二つの配列の実際的な比較は、周知の方法で、例えば、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。 このような数学的アルゴリズムの好ましい例が、Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993) に記載されているが、これに限定されない。 このようなアルゴリズムは、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:389-3402 (1997)に記載されているような、NBLASTおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)に組み込まれる。 BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター(例えば、NBLAST)を使用することができる。 ある実施態様によれば、配列比較のためのパラメーターは、スコア=１００、ワード長=１２に設定するか、または変動させることができる（例えば、Ｗ=５またはＷ=２０）。
配列を比較するために使用される数学的アルゴリズムのその他の好ましい例として、Myers and Miller,CABIOS 4（1）:11-17 (1988)のアルゴリズムがあるが、これに限定されない。 このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージ(Accelrys、ケンブリッジ、英国)の一部である、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれる。 アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを使用する場合、PAM120残存重量表、ギャップ長ペナルティー１２、およびギャップペナルティー４を使用することができる。 配列分析のための他のアルゴリズムは、当該技術分野で周知であり、Torellis and Robotti, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5 (1994)に記載されているADVANCEやADAM；それに、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8 (1988)に記載されているFASTAがある。
その他の実施態様によれば、二つのアミノ酸配列間の一致率は、BLOSUM63マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれかを利用するＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用いて、ギャップ長12、10、８、６または４、および、長さ重量２、３または４の条件で行うことができる。 さらにその他の実施態様によれば、二つの核酸配列間の一致率は、ギャップ長50および長さ重量３の条件で、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用いて行うことができる。
さらに、本願発明は、配列番号：１または３、または配列番号：１または３の相補体を含む核酸配列に高度にストリンジェントな条件でハイブリダイズする断片またはその一部を含有する単離された核酸分子、ならびに、本願発明のアミノ酸配列またはそれらの多型性変異体をコードする核酸配列に高度にストリンジェントな条件でハイブリダイズする断片または部分を含む単離された核酸分子を提供する。 本願発明の核酸断片は、少なくとも、約15個、例えば、少なくとも約18、20、23または25個のヌクレオチドであり、また、30、40、50、100、200またはそれよりも大きな長さのヌクレオチドとすることもできる。
さらに長い断片、例えば、本願明細書に記載の抗原性ポリペプチドをコードする30個以上のヌクレオチドを含む断片は、例えば、後述する抗体を生成する上で特に有用である。
プローブおよびプライマー
関連する態様によれば、本願発明の核酸断片は、本願明細書に記載のアッセイにおいて、プローブまたはプライマーとして使用される。 「プローブ」または「プライマー」の語は、核酸分子の相補的な鎖に塩基特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指すものである。 このようなプローブおよびプライマーとして、Nielsen et al., (Science 254:1497-1500 (1991))に記載されたポリペプチド核酸がある。
プローブまたはプライマーは、少なくとも約15個、例えば、約20〜25個、ある実施態様によれば、約40、50または75個の、本願発明の連続したヌクレオチド、例えば、配列番号：１または３、または配列番号：１または３の相補体の連続核酸配列を含む核酸、または配列番号：２のアミノ酸配列またはそれらの多型性変異体をコードする核酸配列にハイブリダイズする核酸領域を含む。 好ましい実施態様によれば、プローブまたはプライマーは、１００個以下のヌクレオチド、ある実施態様によれば、６〜５０個のヌクレオチド、例えば、１２〜３０個のヌクレオチドを含む。 その他の実施態様によれば、プローブまたはプライマーは、連続核酸配列または連続ヌクレオチド配列の相補体に対して少なくとも70％同一であり、例えば、少なくとも80％同一であり、ある実施態様によれば、少なくとも90％同一であり、その他の実施態様によれば、少なくとも95％同一であるか、または隣接する核酸配列または隣接するヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズ可能でさえある。 さらに、プローブまたはプライマーは、しばしば、標識、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素共因子を含む。
本願発明において特に有用なプローブおよびプライマーとして、（例えば、ＦＬＡＰ遺伝子内の）マーカー部分にハイブリダイズするもの、そして、所望のマーカー、特に、本願発明のハプロタイプを形成するマーカーを含む小さなＤＮＡ断片の（例えば、ＰＣＲを用いた）増幅を許容するものが挙げられる。 一つまたは二つまたは三つまたはそれ以上のこれらプローブおよびプライマーを用いたキットを、本願発明の一態様として、企図している。
上述したような本願発明の核酸分子は、標準的な分子生物学的技術を用いて同定および単離することができ、配列情報は、本願明細書に記載してある。 例えば、核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応、および配列番号：１または３またはそれらの相補体の一つ以上、または本願明細書に記載の一つ以上のアミノ酸配列をコードする配列に基づくヌクレオチドに基づいて設計される合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅および単離することができる。 一般論として、PCR Technology: Principles and Applications for ＤＮＡ Amplifcation (H. A. Erlich eds., Freeman Press, NY, NY, 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds. Academic Press, San Diego, CA, 1990); Mattila et al., Nucl. Acids Res. 19: 4967 (1991); Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17 (1991); PCR (McPherson et al., eds., IRL Press,Oxford);および、米国特許第4,683,202号を参照されたい。 核酸分子は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノミックＤＮＡを鋳型として用いて増幅することができ、適切なベクター内でクローン化され、ＤＮＡ配列分析によって配列決定される。
その他の好適な増幅方法として、リガーゼ連鎖反応(ＬＣＲ)(Wu and Wallace, Genomics 4:560 (1989), Landegren et al., Science 241:1077 (1988)、転写増幅(Kwoh et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173（1989））、および自己持続性配列複製（Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87:1874 (1990))および核酸に基づく配列増幅(NASBA)がある。 後者の二つの増幅方法は、等温転写に基づく等温反応を含み、増幅産物として、一本鎖ＲＮＡ(ssＲＮＡ)および二本鎖ＤＮＡ(dsＤＮＡ)を、約30または100：１でそれぞれ含む。
増幅されたＤＮＡは(例えば、放射性同位体で)標識することができ、そして、ヒト細胞から誘導されるｃＤＮＡライブラリー、zapエクスプレス内のｍＲＮＡ、ZIPLOXまたはその他の好適なベクターをスクリーニングするためのプローブとして使用することができる。 対応するクローンを単離することができ、ＤＮＡを得た後にin vivoで切断し、クローン化した挿入物を、適切な分子量のポリペプチドをコードする正しい読取枠を同定するための当該技術分野で周知の方法によって、一方向または双方向から配列決定することができる。 例えば、本願発明の核酸分子の直接分析は、市販の周知の方法を用いて行うことができる。 例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual（第２編、CSHP, New York 1989); Zyskind et al., Recombinant ＤＮＡ Laboratory Manual, (Acad. Press, 1988))を参照されたい。 これら方法や類似の方法を用いて、ペプチドおよびポリペプチドをコードするＤＮＡを単離し、配列決定して、さらに特徴の決定をすることができる。
本願発明のアンチセンス核酸分子は、配列番号：１または３のヌクレオチド配列および／または配列番号：１または３の一つ以上の相補体および／または配列番号：１または３または配列番号：１または３の一つ以上の相補体の一つ以上の部分および／または配列番号：２のアミノ酸配列をコードする配列または配列番号：１または３またはそれらの相補体の一つ以上の部分をコードする配列を用いて設計することができる。 それらは、当該技術分野で周知の手順に従い、化学合成および酵素連結反応を用いて構築することができる。 例えば、アンチセンス核酸分子(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然のヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を改善せしめる目的で、または、アンチセンスおよびセンス核酸の間に形成される二本鎖の物理的安定性を改善せしめる目的で、種々の改変が施されたヌクレオチドを用いて化学的に合成することができる。 例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換されたヌクレオチドを使用することができる。 あるいは、アンチセンス核酸分子は、核酸分子がアンチセンス方向にサブクローン化される発現ベクターを用いて生物学的に産生することができる(すなわち、挿入された核酸分子から転写されたＲＮＡは、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
さらに、患者の内因性ＤＮＡ配列と比較してＦＬＡＰに関連する一つ以上の障害を同定するために、およびプローブとして、例えば、関連するＤＮＡ配列をハイブリダイズして開発するために、または試料から既知の配列を取り出すために、この核酸配列を使用することができる。 また、ＤＮＡ免疫技術を用いて抗ポリペプチド抗体を取得する目的で、および抗ＤＮＡ抗体の取得または免疫応答の誘発のための抗原として、遺伝子指紋のためのプライマーを取得するために、この核酸配列を使用することができる。 本願明細書で同定されるヌクレオチド配列の一部または断片(および対応する完全な遺伝子配列)は、ポリヌクレオチド試薬として多くの局面で使用することができる。 例えば、これらの配列は、(ｉ)染色体上の各遺伝子のマッピング、および遺伝子疾患に関連する遺伝子領域または核酸領域の位置決定、(ii)微小な生物学的試料からの個体を同定(組織タイピング)、および(iii)生物学的試料の法医学的同定への利用など、に用いることができる。 さらに、分析、特徴決定または治療のために使用される組換えポリペプチド、または、その対応するポリペプチドが、組織分化中または疾患状態のいずれかにおいて構成的に発現する組織用マーカーを同定および発現するために、本願発明のヌクレオチド配列を使用することができる。 さらに、核酸配列は、本願明細書に記載のスクリーニングおよび／または診断アッセイでの試薬として使用でき、本願明細書に記載のスクリーニングおよび／または診断アッセイにおいて使用するキット(例えば、試薬キット)の構成要素として使用できる。
ベクター
本願発明の他の態様は、配列番号：１または３またはそれらの相補体(またはそれらの一部)の核酸分子を含む核酸構築物に関する。 本願発明のさらに他の態様は、配列番号：２またはそれらの多型性変異体のアミノ酸をコードする核酸分子を含む核酸構築物に関する。 この構築物は、ベクター(例えば、発現ベクター)を含み、このベクター内に、本願発明の配列が、センス配向またはアンチセンス配向で挿入される。 本願明細書で使用する「ベクター」の語は、それに結合した他の核酸を移動することができる核酸分子を指す。 あるタイプのベクターは「プラスミド」とも称されており、その内部に他のＤＮＡセグメントが結合可能な環状二本鎖ＤＮＡループを指す。 他のタイプのベクターとして、ウイルスゲノムへの他のＤＮＡセグメントの結合を可能ならしめる、ウイルスベクターがある。 あるベクターは、宿主細胞内で自律複製可能であり、宿主細胞内にベクターが導入される(例えば、細菌の複製起源を有する細菌性ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。 その他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞に導入されると、宿主細胞のゲノム内に組み込まれて、宿主ゲノムに沿って複製される。
さらに、特定のベクター(例えば、発現ベクター)は、それらが結合する遺伝子または核酸の発現を導くことができる。 一般的に、組換えＤＮＡ技術におけるベクターの実用性は、プラスミドの形態でよく認められる。 しかしながら、本願発明では、このような他の形態の発現ベクター、例えば、等価機能を付与するウイルスベクター(例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス)をも意図している。
本願発明の好ましい組換え発現ベクターは、宿主細胞内で核酸分子を発現するのに好適な形態で、本願発明の核酸分子を含む。 このことは、組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択的に発現される核酸配列に作動可能に結合する一つ以上の制御配列を含むことを意味する。 組換え発現ベクター内で、「作動可能に結合する」または「作動可能的に結合する」の語は、目的の核酸配列が、核酸配列の発現を可能にする様式で(例えば、in vitro転写／翻訳系、またはベクターが宿主細胞内に導入される場合の宿主細胞において)制御配列に結合することをも意図している。 「制御配列」の語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むことを意図している。 このような制御配列は、例えば、Goeddel、"Gene Expression Technology", Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。 制御配列として、多様なタイプの宿主細胞内での核酸配列の構成的発現を導くもの、および特定の宿主細胞内でのみ核酸配列の発現を導くもの(例えば、組織特異的な制御配列)などがある。 当業者であれば、発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択および所望なポリペプチドの発現レベルなどの因子に依存することを理解するであろう。 本願発明の発現ベクターは、宿主細胞内に導入され、また、本願明細書に記載の核酸分子によってコードされる融合ポリペプチドを含む、ポリペプチドを産生することができる。
本願発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞、例えば、大腸菌、(バキュロウイルス発現ベクターを用いる)昆虫細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞のような微生物細胞内で本願発明のポリペプチドを発現するために設計することができる。 好適な宿主細胞は、前出のGoeddelの文献で詳細に議論されている。 あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリマーゼを用いて、in vitroで転写および翻訳される。
本願発明の他の態様は、本願発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本願明細書で互換的に使用することができる。 これら用語は、特定の対象細胞を指すのみならず、このような細胞の後代または潜在的後代をも指すものと理解される。 特定の改変は、突然変異または環境的影響のいずれかに起因して、連続して生成途中で発生してもよく、実際のところ、後代とは、親細胞と同一でないものまでもがが、本願明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。
宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞である。 例えば、本願発明の核酸分子は、微生物細胞(例えば、大腸菌)、昆虫細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞(例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)またはＣＯＳ細胞)内で発現可能である。 他の好適な宿主細胞は、当業者に周知のものである。
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術によって、原核細胞または真核細胞に導入可能である。 本願明細書で使用する「形質転換」および「トランスフェクション」の語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共析出、ＤＥＡＥ-デキストランで媒介されるトランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔を含む、外来核酸分子(例えば、ＤＮＡ)を宿主細胞に導入するための当該技術分野で周知の種々の技術をも意図している。 宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための好適な方法は、Sambrook et al(前出)、およびその他の実験マニュアルに記載されている。
哺乳動物細胞を安定的にトランスフェクションするために、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション技術に従って、細胞の小画分だけが、そのゲノム内に外来ＤＮＡを組み込む手法がある。 これら成分を同定および選択するために、(例えば、抗生物質に対する耐性のための)選択可能なマーカーをコードする遺伝子または核酸は、一般的に、目的の遺伝子または核酸と共に宿主細胞に導入される。 好ましい選択可能なマーカーとして、薬剤に耐性を付与するもの、例えば、Ｇ418、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートなどがある。 選択可能なマーカーをコードする核酸分子は、本願発明の核酸分子と同じベクターで宿主細胞内に導入可能であるか、または他のベクターで導入可能である。 導入された核酸分子で安定にトランスフェクトする細胞は、薬物選択によって同定することができる(例えば、選択可能なマーカー遺伝子または核酸を組み込まれた細胞は生存しているが、他の細胞は死滅する)。
本願発明の宿主細胞、例えば、培地内の原核宿主細胞または真核宿主細胞は、本願発明のポリペプチドを産生(すなわち、発現)するために使用することができる。 それ故に、本願発明はさらに、本願発明の宿主細胞を用いてポリペプチドを産生するための方法も提供する。 ある実施態様によれば、本願発明の方法は、ポリペプチドが産生されるように、本願発明の宿主細胞(ここに、本願発明のポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入される)を、好適な培地で培養する工程を含む。 その他の実施態様によれば、本願発明の方法は、培地または宿主細胞からポリペプチドを単離する工程をさらに含む。
また、本願発明の宿主細胞は、非ヒト-トランスジェニック動物を作製するために使用することができる。 例えば、ある実施態様によれば、本願発明の宿主細胞として、本願発明の核酸分子(例えば、外因性ＦＬＡＰ核酸、またはＦＬＡＰポリペプチドをコードする外因性核酸)が導入された、受精済卵母細胞または胚幹細胞がある。 次いで、このような宿主細胞は、内因性ヌクレオチド配列が改変されたゲノムまたは相同組換え動物内に外因性ヌクレオチド配列が導入された非ヒト-トランスジェニック動物を作製するために使用することができる。 このような動物は、核酸配列およびこの配列によってコードされるポリペプチドの機能および／または活性の研究、および、それら活性の修飾物質を同定および／または評価する上で有用である。 本願明細書に記載の「トランスジェニック動物」の語は、非ヒト動物、好ましくは、哺乳動物、さらに好ましくは、ラットまたはマウスのような齧歯類であり、これら動物細胞の一つ以上が、導入遺伝子を含む。 トランスジェニック動物の他の例として、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリおよび両生類がある。 導入遺伝子とは、細胞のゲノム内に組み込まれる外因性ＤＮＡであって、作製されたトランスジェニック動物の成熟体のゲノム内に保持され、かつ一つ以上のタイプの細胞またはトランスジェニック動物の組織内での遺伝子産物の発現を指示する遺伝子である。 本願明細書に記載の「相同組換え動物」の語は、非ヒト動物、好ましくは、哺乳動物、さらに好ましくは、マウスであって、その内因性遺伝子は、動物が成長する以前に、動物細胞、例えば、未成熟動物細胞内に導入される内因性遺伝子と外因性ＤＮＡ遺伝子との間の相同組換えによって改変されている。
受精卵操作および微量注射を利用してトランスジェニック動物、特に、マウスのような動物を生成するための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第4,736,866号および第4,870,009号、米国特許第4,873,191号およびHogan, Manipulatingtlze Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986) に記載されている。 相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するための方法は、Bradley, Current Opinion in BioTechniques ２: 823-829 (1991)およびＰＣＴ国際公開WO90/11354、WO91/01140、WO92/0968およびWO93/04169に記載されている。 本願明細書に記載の非ヒト-トランスジェニック動物のクローンは、Wilmut et al., Nature 385: 810-813 (1997)およびＰＣＴ国際公開WO97/07668およびWO97/07669に記載の方法に従って製造することができる。
本願発明のポリペプチド
さらに、本願発明は、ＦＬＡＰ核酸(「ＦＬＡＰポリペプチド」)によってコードされる単離されたポリペプチド、およびそれらの断片および変異体、ならびに本願明細書に記載のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド(例えば、他のスプライシング変異体)に関する。 「ポリペプチド」の語は、非特定の長さのアミノ酸のポリマー；ペプチド、オリゴペプチドを指し、タンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれる。 本願明細書では、ポリペプチドが、組換え細胞および非組換え細胞から単離されるときに細胞物質を実質的に伴わず、または、化学的合成されるときに化学前駆体または他の化学物質を実質的に伴わない場合に、「単離された」または「精製された」の語を用いている。 しかしながら、ポリペプチドは、細胞内(例えば「融合タンパク質」)では通常は関連しない他のポリペプチドと結合することができ、この場合も「単離されて」または「精製されて」の語を用いる。 本願発明のポリペプチドを製造するための方法の詳細については、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する、2003年10月16日に出願された国際出願第PCT/US03/32556号に記載されている。
本願発明の抗体
ある形態のポリペプチドまたは核酸産物に対しては特異的に結合するが、それ以外の形態のポリペプチドまたは核酸産物には特異的に結合しない、ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体(例えば、表１３に示したようなＳＮＰを有する核酸によってコードされるポリペプチド)が提供される。 さらに、本願発明の核酸(例えば、配列番号：１または配列番号：３、または配列番号：１または配列番号：３の相補体)によってコードされるポリペプチド、または多型性部位またはこの部位を含有する本願発明の核酸によってコードされるポリペプチドのいずれかの部分に結合する抗体が提供される。 さらに、本願発明は、本願発明のポリペプチドおよびポリペプチド断片、またはそれらの一部に対する抗体、または、配列番号：１または３のすべてまたは一部、またはそれらの相補体、または他の変異体またはそれらの一部を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を有する抗体を提供する。 本願発明の抗体を製造するための方法の詳細については、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する、2003年10月16日に出願された国際出願第PCT/US03/32556号に記載されている。
診断アッセイ
本願明細書に記載の核酸、プローブ、プライマー、ポリペプチドおよび抗体は、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性、またはＦＬＡＰのような心筋梗塞遺伝子に関連する疾患または状態に対する感受性の診断方法、それに、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性、またはＦＬＡＰが関与する疾患または状態に対する感受性を診断する上で有用なキットにおいて、使用することができる。 ある実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性、またはＦＬＡＰが関与する疾患または状態に対する感受性を診断する上で有用なキットは、表１３に記載のＳＮＰの一つ以上を具備した本願明細書に記載のプライマーを含む。
本願発明の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性の診断(またはＦＬＡＰに関連する疾患または状態またはこれらに対する感受性の診断)は、本願明細書に記載のＦＬＡＰ核酸での多型性を検出することによって行われる。 多型性として、単一のヌクレオチド、または一個を超えるヌクレオチドの挿入または欠失によって生じるフレームシフト改変のような、ＦＬＡＰ核酸における改変；コードされるアミノ酸における変化を生じる、少なくとも一つのヌクレオチドの変化；未成熟停止コドンを生成する、少なくとも一つのヌクレオチドの変化；ヌクレオチドによってコードされる一つ以上のアミノ酸の欠失を生じる幾つかのヌクレオチドの欠失；遺伝子または核酸のコード配列の中断を生じる、非等価の組換えまたは遺伝子変換のような、一つまたは幾つかのヌクレオチドの挿入；遺伝子または核酸のすべてまたは一部の複製；遺伝子または核酸のすべてまたは一部の移動；または、遺伝子または核酸のすべてまたは一部の再配列がある。 一個を超えるこのような改変は、一個の遺伝子または核酸において発生してもよい。 このような配列変化は、ＦＬＡＰ核酸によってコードされるポリペプチドにおいても改変を招く。 例えば、改変がフレームシフト改変である場合、フレームシフトは、コードされるアミノ酸において出現するか、および／または、切断されたポリペプチドの生成を生じる未成熟停止コドンの生成を招く。 あるいは、ＦＬＡＰ核酸に関連する疾患または状態に関与する多型性、またはＦＬＡＰ核酸に関連する疾患または状態に対する感受性に関与する多型性として、一つ以上のヌクレオチドにおける同様の改変(すなわち、ＦＬＡＰ核酸によってコードされるポリペプチドにおいて変化を招かない改変)がある。 このような多型性は、スプライシング部位を変化せしめ、ｍＲＮＡの安定性または移動性に影響を与え、または核酸の転写または翻訳に影響を与える場合がある。 上述した改変のいずれかを有するＦＬＡＰ核酸は、「改変された核酸」と称される。
心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性を診断する第一の方法において、ハイブリダイゼーション方法、例えば、サザーン分析、ノーザン分析、またはin situハイブリダイゼーションを使用することができる(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., eds.,John Wiley & Sons (1999年のすべての補遺を含む)を参照）。 例えば、ゲノミックＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡの被験体から得た生物学的試料(「試験試料」)は、ＦＬＡＰ核酸に関連する疾患または状態に対して感受性を有しており、この感受性を有する疑いがあるか、またはこの感受性についての素因を有するか、または感受性について欠陥を保有すると考えられる個体(「試験個体」)から得られる。 このような個体は、成体、子供、または胎児のいずれでもよい。 試験試料として、ゲノミックＤＮＡを含有する任意の供給源、例えば、血液試料、羊膜液試料、脳脊髄液試料、または皮膚、筋肉、頬または結膜粘液、胎盤、胃腸管またはその他の臓器由来組織試料などがある。 胎児細胞または組織由来のＤＮＡの試験試料を、適切な方法、例えば、羊水穿刺または絨毛膜柔毛サンプリングによって得ることができる。 次いで、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡ試料に関して、心筋梗塞核酸内での多型性の有無、および／または、ＦＬＡＰによってコードされるスプライシング変異体の有無を決定するために試験される。 多型性またはスプライシング変異体の存在は、ゲノミックＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡでの核酸と核酸プローブとをハイブリダイゼーションすることによって示すことができる。 本願明細書に記載の「核酸プローブ」の語は、ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブであり；核酸プローブは、ＦＬＡＰ核酸内に少なくとも一つの多型性を含有するか、またはＦＬＡＰ核酸の特定のスプライシング変異体をコードする核酸を含む。 プローブは、上述した核酸分子のいずれか(例えば、核酸、プローブまたはプライマーを含む核酸、断片、ベクターなど)とすることができる。
心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性(またはＦＬＡＰに関連する疾患または状態)を診断するために、ＦＬＡＰ核酸を含有する試験試料は、少なくとも一つの核酸プローブと接触してハイブリダイゼーション試料を形成する。 ｍＲＮＡまたはゲノミックＤＮＡを検出するための好ましいプローブは、本願明細書に記載のｍＲＮＡまたはゲノミックＤＮＡにハイブリダイズ可能な標識された核酸プローブである。 核酸プローブは、例えば、全長核酸分子またはそれらの一部、例えば、少なくとも15、30、50、100、250または500ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドとすることができ、適切なｍＲＮＡまたはゲノミックＤＮＡにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドである。 例えば、核酸プローブは、配列番号：１および３の一方のすべてまたは一部、またはそれらの相補体またはそれらの一部とすることができ；または、配列番号：２のすべてまたは一部をコードする核酸とすることができる。 本願発明の診断アッセイにおいて使用するその他の好適なプローブは、上記した通りである(例えば、「本願発明の核酸」の見出し以下に記載したプローブおよびプライマーを参照されたい)。
核酸プローブがＦＬＡＰ核酸に特異的に十分にハイブリダイゼーション可能な条件下に、ハイブリダイゼーション試料を置く。 本願明細書に記載の「特定のハイブリダイゼーション」の語は、完全なハイブリダイゼーションを示す(例えば、ミスマッチなし)。 特定のハイブリダイゼーションは、上記したような、高度にストリンジェントな条件から中度にストリンジェントな条件下で行うことができる。 特に好ましい実施態様によれば、特定のハイブリダイゼーションのためのハイブリダイゼーション条件は、高度にストリンジェントな条件である。
次いで、特定のハイブリダイゼーションは、対象物が存在する場合、標準的な方法を用いて検出される。 特定のハイブリダイゼーションが、試験試料内で核酸プローブとＦＬＡＰ核酸との間で発生する場合、ＦＬＡＰは、多型性を有するか、あるいは核酸プローブ内に存在するスプライシング変異体である。 さらに、一個を超える核酸プローブは、この方法にて、並行して使用することができる。 核酸プローブのいずれか一つを用いた特定のハイブリダイゼーションは、ＦＬＡＰ核酸における多型性、またはＦＬＡＰ核酸をコードする特定のスプライシング変異体の存在を示すので、ＦＬＡＰに関連する疾患または状態、またはＦＬＡＰに関連する疾患または状態(例えば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患)に対する感受性を診断する際の指標となる。
ノーザン分析(Current Protocols in Molecula Biology, Ausubel, F. et al., eds., John Wiley & Sons (前出)を参照）にあっては、上記したハイブリダイゼーション方法は、疾患または状態、またはＦＬＡＰに関連する疾患または状態(例えば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患)に対する感受性に関連する多型性または特定のスプライシング変異体の存在を同定するために使用される。 ノーザン分析について、ＲＮＡの試験試料は、適切な手段によって個体から得られる。 核酸プローブの個体由来のＲＮＡへの特定のハイブリダイゼーションは、上記したように、ＦＬＡＰ核酸における多型性、またはＦＬＡＰによってコードされる特定のスプライシング変異体の存在を示し、それ故に、ＦＬＡＰに関連する疾患または状態、またはＦＬＡＰに関連する疾患または状態(例えば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患)に対する感受性を診断する指標となりうる。
核酸プローブの代表的な使用例として、例えば、米国特許第5,288,611号および第4,851,330号を参照されたい。
あるいは、ペプチド核酸(ＰＮＡ)プローブは、上記したハイブリダイゼーション方法において、核酸の代わりに使用することができる。 ＰＮＡは、例えば、Ｎ-(２-アミノエチル)グリシン単位のようなペプチド様の無機骨格と、メチレンカルボニルリンカーを介してグリシン窒素に結合する有機塩基(Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵ)とを有する疑似ＤＮＡである(例えば、Nielsen, P. E. et al., Bioconjugate Chemistry 5, American Chemical Society, p.1 (1994)を参照）。 このＰＮＡプローブは、ＦＬＡＰに関連する疾患または状態、またはＦＬＡＰに関連する疾患または状態(例えば、心筋梗塞)に対する感受性に関与する多型性を有する核酸に特異的にハイブリダイズするように設計可能である。 ＰＮＡプローブのＦＬＡＰ核酸へのハイブリダイゼーションによって、本願明細書に記載したように、疾患または状態、または疾患または状態に対する感受性を診断する。
本願発明の他の方法によれば、核酸での突然変異または多型性によって制限部位の創出または削除を招く場合には、改変された核酸または多型性を含有する核酸を検出するために、制限消化による突然変異分析を用いることができる。 ゲノミックＤＮＡを含有する試験試料は、個体から得られる。 ポリマーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)は、被験個体由来のゲノミックＤＮＡの試験試料内のＦＬＡＰ核酸(および、必要に応じて、フランキング配列)を増幅するために使用することができる。 ＲＦＬＰ分析は、そこに記載の手順に従って実施される(Current Protocols in Molecular Biology, (前出)を参照)。 関連ＤＮＡ断片の消化パターンは、ＦＬＡＰ核酸内での改変または多型性の有無を示すので、ＦＬＡＰに関連する疾患または状態、またはＦＬＡＰに関連する疾患または状態(例えば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患)に対する感受性の有無が示される。
さらに、配列分析を、ＦＬＡＰ核酸内の特定の多型性を検出するために使用することができる。 ＤＮＡまたはＲＮＡの試料は、試験個体から得られる。 核酸、および／または、必要に応じて、そのフランキング配列を増幅するために、ＰＣＲまたはその他の適切な方法を使用することができる。 ＦＬＡＰ核酸、または核酸の断片、またはｃＤＮＡ、またはｃＤＮＡの断片、またはｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡの断片の配列は、標準的な方法を用いて決定される。 核酸、核酸断片、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡ断片、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ断片の配列は、核酸、ｃＤＮＡ(例えば、配列番号：１または３、および／または配列番号：１または３の相補体の一つ以上、または、適切であれば、配列番号：２をコードする核酸配列またはそれらの断片)またはｍＲＮＡの既知の核酸配列に対して比較がされる。 ＦＬＡＰでの多型性の存在は、その個体が、疾患を有するか、またはＦＬＡＰに関連する疾患(例えば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患)に対する感受性を有することを示す。
さらに、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドは、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)プローブを用いて増幅したオリゴヌクレオチドのドットブロットハイブリダイゼーションによって、ＦＬＡＰ核酸における多型性の存在を検出するために使用することができる(例えば、Saiki, R. et al., Nature 324：163-166 (1986)を参照）。 「対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド」(本願明細書において、「対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブ」とも称される)の語は、ＦＬＡＰに特異的にハイブリダイズし、ＦＬＡＰに関連する疾患または状態、またはＦＬＡＰに関連する疾患または状態(例えば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患)に対する感受性に関与する多型性を含有する、約10〜50塩基対、例えば、約15〜30塩基対のオリゴヌクレオチドである。 ＦＬＡＰ核酸での特定の多型性に特異的な対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブは、標準的な方法を用いて調製することができる(Current Protocols in Molecular Biology (前出)を参照）。 疾患、または疾患に対する感受性に関連する核酸での多型性を同定するために、試験用ＤＮＡ試料が個体から取得される。 ＰＣＲは、ＦＬＡＰ核酸のすべてまたは断片、およびそのフランキング配列を増幅するために使用することができる。 増幅されたＦＬＡＰ核酸(または核酸断片)を含有するＤＮＡは、標準的な方法を用いてドットブロットされ(Current Protocols in Molecular Biology (前出)を参照)、ブロットを、オリゴヌクレオチドプローブと接触せしめる。 次いで、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いた、個体由来のＤＮＡに対するハイブリダイゼーションは、ＦＬＡＰでの多型性を示すので、ＦＬＡＰに関連する疾患または状態、またはＦＬＡＰに関連する疾患または状態(例えば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患)に対する感受性の指標である。
対立遺伝子特異的なプライマーは、標的ＤＮＡにおいて多型性の重複が認められる部位にハイブリダイズし、そして、プライマーが完全な相補性を示す対立遺伝子形態だけを増幅する。 Gibbs, Nucleic Acid Res. 17, 2427-2448 (1989)を参照。 このプライマーは、離間した部位でハイブリダイズする第二のプライマーと組み合わせて使用される。 二個のプライマーを起点とする増幅によって、特定の対立遺伝子の存在を示唆する検出可能な産物を生じる。 通常は、第二の一対のプライマーを用いて対照試験も実施されており、その試験では、一方が、多型性部位で一個の塩基ミスマッチを示し、また、他方が、別異の部位で完全な相補性を示す。 一個の塩基ミスマッチが増幅を妨げるので、検出可能な産物は形成されない。 多型性を有する整列せしめたオリゴヌクレオチドの最も３'の位置においてミスマッチが含まれる場合、この位置がプライマーからの伸長を最も不安定化するため、この方法は、最も効果的に作用する(例えば、WO 93/22456参照)。
ロックされた核酸(ＬＮＡ)と同等の類似体を添加することで、プライマーおよびプローブの大きさを８塩基程度にまで減らすことができる。 ＬＮＡは、フラノース環の２'位および４'位が、Ｏ-メチレン(オキシ-ＬＮＡ)、Ｓ-メチレン(チオ-ＬＮＡ)、またはアミノメチレン(アミノ-ＬＮＡ)部分を介して結合する、新規な種類に属する二環式ＤＮＡ類似体である。 これらＬＮＡのすべてに認められる共通点は、ＤＮＡ類似体について最も多く報告されている相補的核酸に対する親和性である。 例えば、特定のすべてのオキシ-ＬＮＡのノナマーは、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡとそれぞれが複合体を形成した場合に、６４℃〜７４℃の融点を有することが示されている一方で、対応するＤＮＡのノナマーで形成した場合には、ＤＮＡおよびＲＮＡの双方において２８℃であった。 また、ＬＮＡモノマーが、標準的なＤＮＡまたはＲＮＡモノマーと組み合わせて使用される場合、Ｔmの実質的な増加が認められる。 プライマーおよびプローブに関して、ＬＮＡモノマーが含まれる位置(例えば、３'末端、５'末端または中間位置)によって、Ｔmは顕著に増加する。
その他の実施態様によれば、個体由来の標的核酸配列セグメントに相補的なオリゴヌクレオチドプローブの構成配列(アレイ)は、ＦＬＡＰ核酸での多型性を同定するために使用することができる。 例えば、ある実施態様によれば、オリゴヌクレオチドを使用することができる。 オリゴヌクレオチドの構成配列は、通常は、異なる既知の位置において基質の表面に結合する、複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む。 さらに、「Genechip(商標)」とも称される、これらのオリゴヌクレオチドの構成配列は、例えば、米国特許第5,143,854号およびPCT特許公開公報第WO 90/15070号および第WO 92/10092号などで記載されており、当該技術分野で周知である。 これらの構成配列は、一般的には、機械的な合成法、または、フォトリソグラフィー法および固相オリゴヌクレオチド合成法の組み合わせを利用する光を用いた合成方法によって製造することができる。 本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用するFodor et al., Science 251：767-777（1991）；Pirrung et al., 米国特許第5,143,854号；（PCT国際公開WO 90/15070も参照されたい）；Fodor et al., PCT国際公開WO 92/10092；および米国特許第5,424,186号を参照されたい。 機械的合成法を用いたこれらの構成配列を合成するための技術は、例えば、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する米国特許第5,384,261号に記載されている。 その他の実施例によれば、直鎖の構成配列を使用することができる。
オリゴヌクレオチドの構成配列が調製されると、目的の核酸は、この構成配列とハイブリダイズされ、多型性について検証される。 ハイブリダイゼーションおよび検証は、通常は、本願明細書に記載の方法、さらには、例えば、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用するPCT出願公開公報第WO 92/10092号および第WO 95/11995号、そして、米国特許第5,424,186号に記載されている方法によって行われる。 要約すると、一つ以上の既に同定された多型性マーカーを含む標的核酸配列は、周知の増幅技術(例えば、ＰＣＲ)を用いて増幅される。 この方法は、通常、多型性に始まり、上流および下流の双方での標的配列において、この二つの鎖に対して相補的なプライマー配列の使用を含む。 不斉ＰＣＲ技術を使用してもよい。 標識を組み込んだ増幅された標的は、通常は、適切な条件下で構成配列とハイブリダイズする。 ハイブリダイゼーションおよび構成配列の洗浄が終了すると、次に、標的配列がハイブリダイズする構成配列上の位置を決定するために検証される。 スキャン検証して得られるハイブリダイゼーションデータは、通常は、構成配列上の位置に関する関数から導かれた蛍光強度として表現されるる。 逆の方法によれば、多型性を有するプローブを固体表面に結合させ、次いで、ＰＣＲ複製配列を添加して、これらのプローブにハイブリダイズさせる。
単一の検出ブロックに関して記載すると、例えば、単一の多型性構成配列の検出では、複数の検出ブロック含めることができるので、複数の特定の多型性を分析することができる。 構成配列と標的とのハイブリダイゼーションが、変動する最適な条件下で実施されるためには、一般的に、検出ブロックが、一個の構成配列内または複数の別個の構成配列内に振り分けられてもよいことが理解される。 例えば、Ａ-Ｔが豊富なセグメントに属するものとは別に、Ｇ-Ｃが豊富なゲノム配列に属する多型性の検出が望ましいことがよくある。 このことは、各状況におけるハイブリダイゼーション条件を、個別に最適化できることを示している。
多型性を検出するためのオリゴヌクレオチド構成配列のその他の用途は、例えば、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する米国特許第5,858,659号および第5,837,832号に記載されている。 核酸分析のその他の方法は、本願明細書に記載の核酸における多型性、または本願明細書に記載の核酸によってコードされる変異体を検出するために使用することができる。 代表的な方法として、例えば、直接手動式配列決定(Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81：1991-1995 (1988)；Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad.Sci., USA 74：5463-5467 (1977)；Beavis et al., 米国特許第5,288,644号）；自動式蛍光配列決定；一本鎖構造多型性アッセイ(ＳＳＣＰ)；固定式変性ゲル電気泳動(ＣＤＧＥ)；変性勾配ゲル電気泳動(ＤＧＧＥ)(Sheffield, V. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：232-236（1989））、移動度シフト分析(Orita, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：2766-2770 (1989））、制限酵素分析(Flavell et al., Cell 15：25 (1978)；Geever et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78：5081（1981））；異種二本鎖分析；化学的ミスマッチ開裂(ＣＭＣ)(Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：4397-4401 (1985))；リボヌクレアーゼ(Myers, R. M. et al., Science 230：1242 (1985))；ヌクレオチドミスマッチを認識するポリペプチド(例えば、大腸菌mutＳタンパク質)の使用；対立遺伝子特異的なＰＣＲ、などがある。
本願発明のある実施態様によれば、ＦＬＡＰに関連する疾患または状態(例えば、心筋梗塞)またはＦＬＡＰに関連する疾患または状態(例えば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患)に対する感受性の診断は、定量ＰＣＲ(動力学的熱サイクル)による、発現分析によっても行うことができる。 TaqMan(登録商標)を用いるこの技術は、患者が同種または異種であるかにかかわらず、多型性を同定するために使用することができる。 この技術は、ＦＬＡＰ核酸によってコードされるポリペプチドまたはＦＬＡＰ核酸によってコードされるスプライシング変異体の発現、または組成物での改変の存在を評価することができる。 さらに、変異体の発現は、物理的または機能的差異として定量化することができる。
本願発明のその他の実施態様によれば、心筋梗塞、、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性の(または他のＦＬＡＰに関連する疾患または状態に対する)診断は、酵素免疫吸着測定法(ELISA)、ウェスターンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を含む種々の方法によっても、ＦＬＡＰポリペプチドの発現および／または組成物を試験することができる。 個体由来の試験試料は、発現時の改変および／またはＦＬＡＰ核酸によってコードされるポリペプチドの組成物での改変の存在、またはＦＬＡＰ核酸によってコードされる特定の変異体の存在について評価される。 ＦＬＡＰ核酸によってコードされるポリペプチドの発現時の改変は、例えば、定量的ポリペプチド発現(すなわち、産生するポリペプチドの量)での改変であり、ＦＬＡＰ核酸によってコードされるポリペプチドの組成物での改変は、定量的ポリペプチド発現での改変(例えば、改変されたＦＬＡＰポリペプチドまたは異なるスプライシング変異体の発現)である。 好ましい実施態様によれば、ＦＬＡＰに関連する疾患または状態またはＦＬＡＰに関連する疾患または状態に対する感受性の診断は、ＦＬＡＰ変異体によってコードされる特定のスプライシング変異体、またはスプライシング変異体の特定のパターンを検出することによってなされる。
このような(定量的および定性的)改変の双方が可能である。 ポリペプチド発現または組成物に関する「改変」の語は、対照試料でのＦＬＡＰ核酸によるポリペプチドの発現または組成物と比較して、試験試料での発現または組成物における改変を指す。 対照試料は、試験試料に対応する試料(例えば、同じ種類の細胞由来)であり、疾患、またはＦＬＡＰ核酸に関連する疾患または状態に対する感受性によって影響を受けていない個体に由来する試料である。 対照試料と比較した場合の、試験試料でのポリペプチドの発現または組成物での改変は、ＦＬＡＰに関連する疾患または状態またはＦＬＡＰに関連する疾患または状態(例えば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患)に対する感受性の指標ともなる。 同様に、対照試料と比較した場合に、試験試料での一つ以上の異なるスプライシング変異体の存在、または試験試料での異なるスプライシング変異体の有意に異なる量の存在は、ＦＬＡＰ核酸に関連する疾患または状態に対する感受性の指標ともなる。 ＦＬＡＰ核酸によってコードされるポリペプチドの発現または組成物を試験する種々の手段として、分光学、比色法、電気泳動、等電点電気泳動および免疫アッセイなどがあり(例えば、David et al., 米国特許第4,376,110)、例えば、免疫ブロッティング(Current Protocols in Molecular Biology、特に第10章、をも参照されたい)。 例えば、ある実施態様によれば、ポリペプチドに結合可能な抗体(例えば、上述したような抗体)、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体を使用することができる。 抗体は、ポリクローナル、または、さらに好ましくは、モノクローナルとすることができる。 無傷な抗体、またはそれらの断片(例えば、FabまたはF(ab')2)を使用することができる。
「標識された」の語は、プローブまたは抗体に関しては、検出可能な基質をプローブまたは抗体に結合(すなわち、物理的に結合)したり、および、直接標識化される他の試薬で再活性化してプローブまたは抗体を間接的に標識化することで、プローブまたは抗体を直接に標識することも意図される。 間接的な標識の例として、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出、および、蛍光標識されたストレプトアビジンで検出できる、ビオチンを用いたＤＮＡプローブの末端標識がある。
ウェスターンブロッティング分析は、改変されたＦＬＡＰ(例えば、表１３に記載のＳＮＰを有するＦＬＡＰ)によってコードされるポリペプチドに特異的に結合する上述した抗体を使用すれば、未改変核酸によってコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体、または核酸によってコードされる特定のスプライシング変異体に特異的に結合される抗体は、特定のスプライシング変異体、または多型性または改変されたＦＬＡＰによってコードされるポリペプチドの試験試料での存在、または非多型性または未改変核酸によってコードされる特定のスプライシング変異体またはポリペプチドの試験試料での非存在を検証するために用いることができる。 多型性または改変された核酸によってコードされるポリペプチドの存在、または非多型性または未改変核酸によってコードされるポリペプチドの非存在に基づいて、ＦＬＡＰ核酸によってコードされる特定のスプライシング変異体の存在(または非存在)に関して、ＦＬＡＰに関連する疾患または状態、またはそれらに関連する疾患または状態に対する感受性についての診断がされる。
この方法のある実施態様によれば、試験試料でのＦＬＡＰ核酸によってコードされるポリペプチドのレベルまたは量は、対照試料でのＦＬＡＰによってコードされるポリペプチドのレベルまたは量と比較される。 対照試料でのポリペプチドのレベルまたは量よりも高いまたは低い試験試料でのポリペプチドのレベルまたは量は、その相違が統計学的に有意であれば、ＦＬＡＰによってコードされるポリペプチドの発現における改変の指標となり、また、疾患または状態、またはＦＬＡＰに関連する疾患または状態に対する感受性を診断する指標ともなる。 あるいは、試験試料でのＦＬＡＰ核酸によってコードされるポリペプチドの組成物は、対照試料でのＦＬＡＰによってコードされるポリペプチドの組成物と(例えば、異なるスプライシング変異体の存在について)比較される。 試験試料でのポリペプチドの組成における相違に基づいて、対照試料でのポリペプチドの組成と比較して、疾患または状態、またはＦＬＡＰに関連する疾患または状態に対する感受性についての診断がされる。 その他の実施態様によれば、ポリペプチドのレベルまたは量および組成の双方は、試験試料および対照試料において評価することができる。 対照試料と比較される試験試料でのポリペプチドの量またはレベルにおける相違；対照試料と比較される試験試料での組成における相違；または、量またはレベルにおける相違、それに、組成における相違の双方は、疾患または状態、またはＦＬＡＰに関連する疾患または状態(例えば、心筋梗塞)に対する感受性の指標である。
さらに、本願発明は、ＦＬＡＰでの危険要素ハプロタイプを同定することで、個体での心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性を診断および同定する方法に関する。 ある実施態様によれば、危険要素ハプロタイプは、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の有意な危険度を付与する。 ある実施態様によれば、ハプロタイプと関連する有意性は見込値によって測定される。 さらにその他の実施態様によれば、有意性は百分率によって測定される。 ある実施態様によれば、有意な危険度は、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８および１.９を含む、少なくとも約１.２の見込値で測定されるが、これらに限定されない。 さらにその他の実施態様によれば、少なくとも１.２の見込値が有意である。 さらにその他の実施態様によれば、少なくとも約１.５の見込値が有意である。 さらにその他の実施態様によれば、危険度における有意な増加が、少なくとも約１.７である場合に有意といえる。 さらにその他の実施態様によれば、危険度における有意な増加として、約25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％および98％などがあるが、これらに限定されず、少なくとも約20％である。 さらにその他の実施態様によれば、危険度における有意な増加は、少なくとも約50％である。 さらにその他の実施態様によれば、危険要素ハプロタイプのｐ値は、＜０.０５である。
しかし、危険度が医学的に有意であるか否かを同定することは、特定の疾患、ハプロタイプ、およびしばしば環境因子を含む、種々の因子によって変化することも理解される。
さらに、本願発明は、心筋梗塞の(罹患した)疑いがある個体で頻繁に認められるＦＬＡＰ核酸での危険要素ハプロタイプについて、健康な個体(対照者)でのその頻度と比較して、スクリーニングする工程を含む、個体における心筋梗塞、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性を診断する方法に関し、そこでのハプロタイプの存在は、心筋梗塞に対する感受性を示す。 心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に関連するＳＮＰおよび／またはマイクロサテライトマーカーの存在について遺伝子決定するための標準的な技術、例えば、蛍光に基づく技術(Chen et al., Geraofyae Res. 9, 492 (1999)、ＰＣＲ、ＬＣＲ、Nested ＰＣＲおよび核酸増幅のためのその他の技術を使用することができる。 好ましい実施態様によれば、上記した方法は、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に関連するＦＬＡＰ核酸でのＳＮＰおよび／またはマイクロサテライトの個体での存在または頻度を評価する工程を含む。 ここで、健康な対照者と比較して、ＳＮＰおよび／またはマイクロサテライトが過剰であるかまたは頻度が高いことは、その個体が心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の疑いがあることを示す。 スクリーニング用ツールとして使用可能なハプロタイプを含むＳＮＰについては、表７を参照されたい。 さらに、スクリーニング用ツールとして使用するためのＳＮＰおよびマーカーを記載した表１３も参照されたい。
ある実施態様によれば、危険要素ハプロタイプは、表１３で表示した多型性の存在によって特徴付けられる。 例えば、ＳＮＰとして「Ｃ」または「Ｔ」が可能であるSG13S99；ＳＮＰとして「Ｇ」または「Ａ」が可能であるSG13S25；ＳＮＰとして「Ｇ」または「Ａ」が可能であるSG13S377；ＳＮＰとして「Ｇ」または「Ａ」が可能であるSG13S106；ＳＮＰとして「Ｔ」または「Ａ」が可能であるSG13S114；ＳＮＰとして「Ｇ」または「Ａ」が可能であるSG13S89；ＳＮＰとして「Ｇ」または「Ｔ」が可能であるSG13S30；ＳＮＰとして「Ｃ」または「Ａ」が可能であるSG13S32；ＳＮＰとして「Ｇ」または「Ａ」が可能であるSG13S42；および、ＳＮＰとして「Ｇ」または「Ａ」が可能であるSG13S35などがある。 これに加えて、ＳＮＰとして「Ｔ」が可能であるSG13A375；ＳＮＰとして「Ａ」が可能であるSG13S32；および、ＳＮＰとして「Ｇ」または「Ａ」が可能であるSG13S106などもある。
診断方法において有用なキット(例えば、試薬キット)は、例えば、本願明細書に記載のハイブリダイゼーションプローブまたはプライマー(例えば、標識されたプローブまたはプライマー)、標識された分子を検出するための試薬、制限酵素(例えば、ＲＦＬＰ分析用の制限酵素）、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド、改変または未改変(天然の)ＦＬＡＰポリペプチドに結合する抗体、ＦＬＡＰを含む核酸を増幅させるための手段、または本願明細書に記載の核酸の核酸配列を分析するための手段、または本願明細書に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を分析するための手段を含めた、本願明細書に記載の方法のいずれかにおいて有用な手段を含む。 ある実施態様によれば、心筋梗塞、、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性を診断するためのキットは、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患を有するかまたは心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患が疑われる個体に頻繁に存在するＦＬＡＰ核酸内の領域の核酸増幅のためのプライマーを含むことができる。 プライマーは、心筋梗塞の指標である核酸をフランキングするＳＮＰ部分を用いて設計することができる。 特に好ましい実施態様によれば、プライマーは、表７に示したような、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患についての危険要素ハプロタイプ、または、より具体的には、以下に示したＳＮＰマーカーによって設計されるハプロタイプに関連するＦＬＡＰ核酸内の領域を増幅するために設計される。 ある実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連するハプロタイプは、13q12-13遺伝子座で、マーカーSG13S99、SG13S25、SG13S377、SG13S106、SG13S32およびSG13S35を含む。 ある特定の実施態様によれば、SG13S99、SG13S25、SG13S377、SG13S106、SG13S32およびSG13S35の各々(Ｂ６ハプロタイプ)での、対立遺伝子Ｔ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＡおよびＧの存在によって、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性が診断される。 その他の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性と関連するハプロタイプは、13q12-13遺伝子座に、マーカーSG13S99、SG13S25、SG13S106、SG13S30およびSG13S42を含む。 ある特定の実施態様によれば、SG13S99、SG13S25、SG13S106、SG13S30およびSG13S42の各々(Ｂ５ハプロタイプ)での、対立遺伝子Ｔ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡの存在によって、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性が診断される。 第三の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性と関連するハプロタイプは、13q12-13遺伝子座で、マーカーSG13S25、SG13S106、SG13S30およびSG13S42を含む。 ある特定の実施態様によれば、SG13S25、SG13S106、SG13S30およびSG13S42の各々(Ｂ４ハプロタイプ)での、対立遺伝子Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡの存在によって、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性が診断される。 第四の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性と関連するハプロタイプは、13q12-13遺伝子座で、マーカーSG13S99、SG13S25、SG13S114、SG13S89およびSG13S32を含む。 ある特定の実施態様によれば、SG13S99、SG13S25、SG13S114、SG13S89およびSG13S32の各々(Ａ５ハプロタイプ)での、対立遺伝子Ｔ、Ｇ、Ｔ、ＧおよびＡの存在によって、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性が診断される。 第五の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性と関連するハプロタイプは、13q12-12遺伝子座で、マーカーSG13S25、SG13S114、SG13S89およびSG13S32を含む。 ある特定の実施態様によれば、SG13S25、SG13S114、SG13S89およびSG13S32の各々(Ａ４ハプロタイプ)での、対立遺伝子Ｇ、Ｔ、ＧおよびＡの存在によって、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性が診断される。 ある実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連するハプロタイプは、13q12-13遺伝子座で、マーカーSG13S375を含む。 ある特定の実施態様によれば、SG13S375(HapC1ハプロタイプ)での、Ｔの存在によって、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性が診断される。 その他の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性と関連するハプロタイプは、13q12-13遺伝子座に、マーカーSG13S25およびSG13S375を含む。 ある特定の実施態様によれば、SG13S375およびSG13S25の各々(HapC2ハプロタイプ)での、ＴおよびＧの存在によって、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性が診断される。 その他の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性と関連するハプロタイプは、13q12-13遺伝子座に、マーカーSG13S25, SG13S375およびSG13S32を含む。 ある特定の実施態様によれば、SG13S375、SG13S25およびSG13S32の各々(HapC3ハプロタイプ)での、Ｔ、ＧおよびＡの存在によって、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性が診断される。 さらにその他の実施態様によれば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性と関連するハプロタイプは、13q12-13遺伝子座に、マーカーSG13S25、SG13S375、SG13S32およびSG13S106を含む。 ある特定の実施態様によれば、SG13S375、SG13S25、SG13S32およびSG13S106の各々(HapC4-A)ハプロタイプ)での、Ｔ、Ｇ、ＡおよびＧの存在によって、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性が診断される。 ある特定の実施態様によれば、SG13S375、SG13S25、SG13S32およびSG13S106の各々(HapC4-B)ハプロタイプ)での、Ｔ、Ｇ、ＡおよびＡの存在によって、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患に対する感受性が診断される。
スクリーニングアッセイおよびそれによって同定される薬剤
本願発明は、本願発明の核酸をハイブリダイズするヌクレオチドの存在を同定するための方法(本願明細書では、「スクリーニングアッセイ」とも称する)、および本願発明の核酸によってコードされるポリペプチドの存在を同定するための方法を提供する。 ある実施態様によれば、試料内の目的の核酸分子(例えば、本願発明の核酸に対して有意な相同性を示す核酸)の存在(または、非存在)は、本願発明の核酸を含む核酸(例えば、配列番号：１または３またはそれらの相補体、または配列番号：２の配列を有するアミノ酸をコードする核酸、またはこのような核酸の断片または変異体の一つの配列を有する核酸)と試料とを、上記したストリンジェントな条件下で接触させ、次いで、ハイブリダイゼーションの存在(または、非存在)を評価することによって検証することができる。 好ましい実施態様によれば、高度にストリンジェンシーな条件は、選択的なハイブリダイゼーションに適切な条件である。 その他の実施態様によれば、目的の核酸分子を含有する試料が、目的の核酸分子(例えば、ＦＬＡＰ核酸)の一部と少なくとも部分的に相補的な連続する核酸配列を含有する核酸(例えば、上述したプライマーまたはプローブ)と接触され、接触された試料は、ハイブリダイゼーションの存在または非存在について評価される。 好ましい実施態様によれば、連続核酸配列を含有する核酸は、目的の核酸分子の一部に対して完全に相補的である。
これらの実施態様のいずれにおいても、目的の核酸のすべてまたは一部を、ハイブリダイゼーションを行う前に増幅することができる。
その他の実施態様によれば、試料内の目的のポリペプチド(例えば、本願発明のポリペプチドまたはそれらの断片または変異体)の存在(または、非存在)は、目的のポリペプチドに特異的にハイブリダイズする抗体(例えば、上述した抗体)と試料とを接触させ、目的のポリペプチドに対する抗体の結合の存在(または、非存在)について試料を評価することで、評価を行うことができる。
その他の実施態様によれば、本願発明は、薬剤(例えば、融合タンパク質、ポリペプチド、疑似ペプチド、プロドラッグ、受容体、結合剤、抗体、低分子または他の薬剤、または本願明細書に記載のポリペプチドの活性を変える(例えば、増加または減少させる)リボザイム、または本願明細書に記載のポリペプチドと相互作用する)ものを同定するための方法を提供する。 例えば、このような薬剤として、本願明細書に記載のポリペプチドに結合する薬剤(例えば、ロイコトリエン経路の構成要素のための結合剤、例えば、ＦＬＡＰ結合剤)；例えば、本願発明のポリペプチドの活性を刺激または阻害する薬剤；または本願発明のポリペプチドがロイコトリエン経路結合剤の構成要素と相互作用する能力を改変する(例えば、改善または阻害する)薬剤(例えば、受容体または他の結合剤)；または、ロイコトリエン経路の構成要素ポリペプチドの翻訳後プロセスを改変する薬剤、例えば、ＦＬＡＰポリペプチド(例えば、細胞表面のような細胞内の他の位置で通常は合成されるポリペプチドに関するタンパク分解性プロセスを改変する薬剤；細胞からの多量のポリペプチドの放出を促すためにタンパク分解性プロセスを改変する薬剤など)などがある。
ある実施態様によれば、本願発明は、本願明細書に記載のポリペプチドに結合し、このポリペプチド(または、それらの生物学的に活性な部分)の活性を調整する候補薬剤または試験薬剤をスクリーニングするためのアッセイ、およびこのアッセイによって同定可能な薬剤を提供する。 試験薬剤は、生物学的ライブラリー；個別に対処可能な並行固相または溶液相ライブラリー；デコンヴォルーションを必要とする合成ライブラリー法；「一ビーズ一化合物」ライブラリー法；および、アフィニティークロマトグラフィー選別を用いる合成ライブラリー法を含む当該技術分野で周知の組み合わせライブラリー法などの多様な方法のいずれかを用いて取得することができる。 生物学的ライブラリーによった場合では、ポリペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つの方法では、ポリペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリーが利用可能である(Lam, K.S., Anticancer Drug Des. 12:145 (1997））。
ある実施態様によれば、ＦＬＡＰポリペプチドの活性を改変する薬剤を同定するために、細胞、細胞溶解物、またはＦＬＡＰポリペプチド(例えば、配列番号：２またはＦＬＡＰ核酸によってコードされる他のスプライシング変異体、例えば、表１３に記載のＳＮＰを含む核酸)を含有または発現する溶液、またはそれらの断片または誘導体(上記したような)が、試験される薬剤と接触可能であり、あるいは、ポリペプチドは、試験される薬剤と直接的に接触可能である。 ＦＬＡＰ活性のレベル(量)が評価され(例えば、ＦＬＡＰ活性のレベル(量)が直接または間接的に測定され)て、対照での活性レベル(すなわち、試験される薬剤が存在しない状態でのＦＬＡＰポリペプチドまたはそれらの活性断片または誘導体の活性のレベル)と比較される。 薬剤の存在下での活性のレベルが、薬剤の非存在下での活性のレベルとは統計学的に有意な量で異なる場合、この薬剤は、ＦＬＡＰポリペプチドの活性を改変する薬剤であるといえる。 薬剤の非存在下での活性と比較して、薬剤の存在下でのＦＬＡＰ活性のレベルの増加は、この薬剤がＦＬＡＰ活性を高める薬剤であることを示している。 同様に、薬剤の非存在下での活性と比較して、薬剤の存在下でのＦＬＡＰ活性のレベルの減少は、この薬剤がＦＬＡＰ活性を阻害する薬剤であることを示している。 その他の実施態様によれば、試験される薬剤の存在下での、ＦＬＡＰポリペプチドまたはそれらの誘導体もしくは断片の活性のレベルは、すでに確立された対照のレベルと比較される。 薬剤の存在下での活性レベルと対照レベルとの統計学的に有意な差異は、この薬剤がＦＬＡＰ活性を改変することを示している。
さらに、本願発明は、ＦＬＡＰ核酸(例えば、アンチセンス核酸、融合タンパク質、ポリペプチド、疑似ペプチド、プロドラッグ、受容体、結合剤、抗体、低分子または他の薬剤、またはリボザイム)の発現を改変する薬剤、それに、その核酸の発現(例えば、転写または翻訳)を改変する(例えば、増加または減少せしめる)薬剤、または、本願明細書に記載の核酸と相互作用する薬剤を同定するためのアッセイ、ならびにこれらアッセイによって同定可能な薬剤に関する。 例えば、ＦＬＡＰポリペプチドをコードする核酸(例えば、ＦＬＡＰ核酸)を含有する溶液は、試験される薬剤と接触可能である。 この溶液は、例えば、核酸を含有する細胞または核酸を含有する細胞溶解物を含むことができ、あるいは、この溶液は、核酸の転写／翻訳に必要な要素を含む他の溶液とすることができる。 必要に応じて、溶液に懸濁していない細胞を使用することができる。 ＦＬＡＰ発現のレベルおよび／またはパターン(例えば、ｍＲＮＡまたは発現タンパク質のレベルおよび／またはパターン、例えば、異なるスプライシング変異体のレベルおよび／またはパターン)が評価され、対照での発現レベルおよび／またはパターン(すなわち、試験される薬剤の非存在下でのＦＬＡＰ発現のレベルおよび／またはパターン)と比較される。 薬剤の存在下でのレベルおよび／またはパターンが、薬剤の非存在下でのレベルおよび／またはパターンと統計学的に有意に異なる場合、この薬剤は、ＦＬＡＰ核酸の発現を改変する薬剤といえる。 ＦＬＡＰ発現の改善は、この薬剤が、ＦＬＡＰ活性の活性化因子であることを示す。 同様に、ＦＬＡＰ発現の阻害は、この薬剤が、ＦＬＡＰ活性の抑制因子であることを示す。
その他の実施態様によれば、試験される薬剤の存在下でのＦＬＡＰポリペプチド(例えば、異なるスプライシング変異体)のレベルおよび／またはパターンは、すでに確立された対照でのレベルおよび／またはパターンと比較される。 薬剤の存在下での量および作用形態のレベルおよび／またはパターンが、対照のレベルおよび／またはパターンと比較して、統計学的に有意に異なる場合、この薬剤が、ＦＬＡＰ発現を改変することを示す。
本願発明のその他の実施態様によれば、細胞、細胞溶解物、またはリポーター遺伝子に作動可能に結合するＦＬＡＰ核酸のプロモーター領域をコードする核酸を含有する溶液を用いて、ＦＬＡＰ核酸の発現を改変する薬剤、または本願明細書に記載の核酸と相互作用する薬剤を同定することができる。 試験される薬剤と接触した後、リポーター遺伝子の発現のレベル(例えば、ｍＲＮＡまたは発現タンパク質のレベル)が評価され、対照での発現レベル(すなわち、試験される薬剤の非存在下でのリポーター遺伝子の発現レベル)と比較される。 薬剤存在下でのレベルが、量および作用形態において、薬剤非存在下でのレベルとは統計学的に有意に異なる場合、ＦＬＡＰ核酸プロモーターに作動可能に結合する核酸の発現を改変する能力に基づいて、この薬剤は、ＦＬＡＰ核酸の発現を改変する薬剤といえる。
リポーターの発現の改善は、この薬剤が、ＦＬＡＰ活性の活性化因子であることを示している。 同様に、リポーターの発現の阻害は、この薬剤が、ＦＬＡＰ活性の抑制因子であることを示している。 その他の実施態様によれば、試験薬剤の存在下でのリポーターの発現レベルは、すでに決定された対照のレベルと比較される。 薬剤の存在下でのレベルが、量または作用形態において、対照のレベルとは統計学的に有意に異なる場合、この薬剤は、発現を改変する薬剤といえる。
ＦＬＡＰ核酸によってコードされる異なるスプライシング変異体の量を改変する薬剤(例えば、第一のスプライシング変異体の活性を改善し、第二のスプライシング変異体の活性を阻害する薬剤）、および第一のスプライシング変異体の活性を刺激し、そして、第二のスプライシング変異体の活性を阻害する薬剤が、上述した方法を用いて容易に同定できる。
本願発明のその他の実施態様によれば、このアッセイは、ポリペプチドの活性への試験薬剤による影響を、ＦＬＡＰ結合剤との比較において、評価するために使用することができる。 例えば、ＦＬＡＰ核酸と相互作用する化合物(本願明細書にて「ＦＬＡＰ結合剤」と称され、ＦＬＡＰ核酸と相互作用するポリペプチドまたは受容体などの他の分子、または５-ＬＯなどの他の分子)を発現する細胞は、試験薬剤の存在下でＦＬＡＰと接触され、試験薬剤がＦＬＡＰとＦＬＡＰ結合剤との相互作用を改変する能力が決定される。 あるいは、ＦＬＡＰ結合剤を含有する細胞溶解物または溶液を使用することができる。 ＦＬＡＰまたはＦＬＡＰ結合剤に結合する薬剤は、ＦＬＡＰが、ＦＬＡＰ結合剤に結合する能力、ＦＬＡＰ結合剤に関連する能力、またはＦＬＡＰ結合剤と相互作用する能力を阻害または改善させることで、相互作用性を改変することができる。 試験薬剤が、ＦＬＡＰ核酸またはＦＬＡＰ核酸結合剤に結合する能力の決定は、例えば、試験薬剤と放射性同位体または酵素標識とを結合することによって実現可能である。 ポリペプチドに対する試験薬剤の結合が、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃまたは3Ｈで標識された試料の直接的または間接的検出、放射能発光の直接検出による放射能同位体の検出、または、シンチレーション計測によって、決定することができる。 あるいは、試験薬剤は、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼを用いて酵素的に標識することができ、適切な基質から産物への変換を決定することによって、この酵素標識は検出される。 任意の反応体を標識化せずに、試験薬剤が、ポリペプチドと相互作用する能力を決定することも、本願発明の意図するところである。 例えば、試験薬剤、ＦＬＡＰまたはＦＬＡＰ結合剤のいずれをも標識化しなくとも、ミクロフィジオメーターは、試験薬剤とＦＬＡＰまたはＦＬＡＰ結合剤との相互作用を検出するために使用することができる。 McConnell, H. M. et al., Science 257：1906-1912 (1992)。 本願明細書で使用される「ミクロフィジオメーター」(例えば、Cytosensor(商標))の語は、光対処可能なポテンシオメトリックセンサー(ＬＡＰＳ)を用いて、セルが、その環境を酸性化する速度を測定する分析装置である。 この酸性化速度の変化は、リガンドとポリペプチドとの間の相互作用の指標として使用可能である。
よって、これらレセプターは、ＦＬＡＰに関連する疾患または状態、またはＦＬＡＰに関連する疾患または状態に対する感受性を治療するために使用されるアゴニスト、またはＦＬＡＰに関連する疾患または状態(例えば、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患)に対する感受性を研究するためのアンタゴニストである化合物をスクリーニングするために使用することができる。 薬剤は、ＦＬＡＰ活性化を制御するために設計することができ、ＦＬＡＰと相互作用するタンパク質(例えば、５-ＬＯ)の下流の遺伝子またはポリペプチドを、シグナル経路および転写作用を制御するために使用することができる。
本願発明のその他の実施態様によれば、このアッセイは、本願明細書に記載したような、一つ以上のＦＬＡＰポリペプチドと相互作用するポリペプチドを同定するために使用することができる。 例えば、酵母２-ハイブリッド系、例えば、Fields and Song (Fields, S. and Song, O., Nature 340：245-246 (1989))に記載の系は、一つ以上のＦＬＡＰポリペプチドと相互作用するポリペプチドを同定するために使用することができる。 酵母２-ハイブリッドシステムでは、ベクターは、二つの機能的ドメイン(ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性ドメイン)を有する転写因子の順応性に基づいて構築される。 二つのドメインが分割されているが、互いに相互作用する二つの異なるタンパク質に融合される場合、転写活性は取得可能であり、特定のマーカー(例えば、HisおよびAdeのような栄養マーカー、またはlacZのようなカラーマーカー)の転写は、相互作用および転写活性の存在を同定するために使用することができる。 例えば、本願発明の方法では、第一のベクターとして、ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸、およびＦＬＡＰポリペプチド、スプライシング変異体、またはそれらの断片または誘導体を含んだものが使用され、第二ベクターとして、転写活性ドメイン、ＦＬＡＰポリペプチド、スプライシング変異体、またはそれらの断片または誘導体と潜在的に相互作用しえるポリペプチドをコードする核酸(例えば、ＦＬＡＰポリペプチド結合剤またはレセプター)を含んだものが使用される。 適切な条件下で行う第一のベクターおよび第二のベクターを含む酵母のインキュベーション（例えば、Clontech社（パロ アルト、カリフォルニア州、米国）のMatchmaker(商標)システムが利用しているような交配条件)は、目的のマーカーを発現するコロニーの同定を可能にする。 これらのコロニーは、ＦＬＡＰポリペプチドまたはそれらの断片または誘導体と相互作用するポリペプチドを同定するために試験することができる。 このようなポリペプチドは、上記したように、ＦＬＡＰポリペプチドの発現の活性を改変する薬剤として有用な場合がある。
上記した本願発明のアッセイ方法での一つ以上の実施態様によれば、ポリペプチドの一方または双方の非複合体からの複合体の分離を容易ならしめ、そして、アッセイの自動化を促すために、ＦＬＡＰ、ＦＬＡＰ結合剤、またはアッセイの他の要素のいずれかを、固体支持体上に固定することが望ましい場合がある。 ポリペプチドへの試験薬剤の結合、または、試験薬剤の存在下または非存在下でのポリペプチドと結合剤との相互作用は、反応体を保存するのに好適な容器内で実現可能である。 このような容器の例として、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心管などがある。 ある実施態様によれば、融合タンパク質(例えば、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ融合タンパク質)は、マトリックスまたは他の固体支持体へのＦＬＡＰ核酸またはＦＬＡＰ結合剤の結合を可能ならしめるドメインと共に提供することができる。
その他の実施態様によれば、本願発明の核酸分子の発現のモジュレーターは、細胞、細胞溶解物、またはＦＬＡＰ核酸をコードする核酸を含有する溶液を、試験薬剤と接触せしめて、細胞、細胞溶解物、または溶液中の適切なｍＲＮＡまたはポリペプチド(例えば、スプライシング変異体)の発現を決定する方法によって同定される。 試験薬剤の存在下での適切なｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルは、試験薬剤の非存在下でのｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルと比較される。 そして、この試験薬剤は、この比較に基づいて、発現のモジュレーターとして同定することができる。 例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、試験薬剤の非存在下よりも存在下で(統計学的に有意に)大きい場合、この試験薬剤は、ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現の刺激物質またはエンハンサーとして同定される。 あるいは、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、試験薬剤の非存在下よりも存在下で(統計学的に有意に)小さい場合、この試験薬剤は、ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現の阻害剤として同定される。 細胞内でのｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のレベルは、本願明細書に記載したｍＲＮＡまたはポリペプチドの検出方法によって決定することができる。
その他の実施態様によれば、本願発明は、本願明細書に記載のＦＬＡＰ結合剤(例えば５-ＬＯ)などのロイコトリエン経路結合剤の構成要素の活性を変える(例えば、減少または増加させる)薬剤(例えば、融合タンパク質、ポリペプチド、疑似ペプチド、プロドラッグ、受容体、結合剤、抗体、低分子または他の薬物、またはリボザイム)を同定するための方法を提供する。 例えば、このような薬剤として、例えば、ロイコトリエン経路結合剤(例えば、ＦＬＡＰ結合剤)の構成要素の活性を刺激または阻害する薬剤；ロイコトリエン経路結合剤の構成要素(例えば、受容体または他の結合剤)が本願発明のポリペプチドと相互作用する能力を改変する(例えば、改善または阻害する)薬剤；または、ロイコトリエン経路結合剤の構成要素の翻訳後プロセスを改変する薬剤(例えば、細胞表面のような細胞内の他の位置で通常は合成されるロイコトリエン経路の構成要素結合剤に関するタンパク分解プロセスを改変する薬剤、それに、細胞から活性結合剤を放出するタンパク分解プロセスを改変する薬剤など)などがある。
例えば、本願発明は、ロイコトリエン経路の構成要素(または、それらの酵素的に活性な要素)へ結合したり、あるいは、これらの活性を調整する候補薬剤または試験薬剤をスクリーニングするためのアッセイ、および、このアッセイによって同定可能な薬剤を提供する。 上記したように、この試験薬剤は、生物学的ライブラリー；個別に対処可能な並行固相または溶液相ライブラリー；デコンヴォルーションを必要とする合成ライブラリー法；「一ビーズ一化合物」ライブラリー法；および、アフィニティークロマトグラフィー選別を用いる合成ライブラリー法を含む当該技術分野で周知の組み合わせライブラリー法での多様な方法のいずれかを用いて取得することができる。 生物学的ライブラリーによった場合、ポリペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つの方法では、ポリペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリーが利用可能である(Lam, K.S., Anticancer Drug Des. 12:145 (1997））。
ある実施態様によれば、ロイコトリエン経路の構成要素(例えば、ＦＬＡＰ結合剤、またはロイコトリエン経路の構成要素に結合する薬剤(「結合剤」)の活性を改変する薬剤を同定するために、細胞、細胞溶解物、または結合剤(例えば、５-ＬＯ、またはロイコトリエン経路構成要素受容体、または他の結合剤)を含有または発現する溶液、または断片(例えば、酵素的に活性な断片)またはそれらの誘導体は、試験される薬剤と接触することができ、あるいは、結合剤(またはそれらの断片または誘導体)は、試験される薬剤と直接に接触させることができる。 結合剤の活性レベル(量)が(直接的または間接的に)評価されて、対照での活性レベル(すなわち、試験される薬剤の非存在下での活性レベル)と比較される。 薬剤存在下での活性レベルが、薬剤非存在下での活性レベルと統計学的に有意に異なる場合、この薬剤は、ロイコトリエン経路の構成要素の活性を改変する薬剤であるといえる。 対照と比較した活性レベルの増加は、この薬剤が、活性を高める薬剤(アゴニスト)であることを示す。 同様に、対照と比較した活性レベルの減少は、この薬剤が、活性を阻害する薬剤(アンタゴニスト)であることを示す。 その他の実施態様によれば、試験される薬剤の存在下での活性レベルは、すでに決定された対照でのレベルと比較される。 対照でのレベルおよび量と比較して、薬剤の存在下での活性レベルが、統計学的に有意に異なる場合、この薬剤は、活性を改変する薬剤であるといえる。
さらに、本願発明は、上記したスクリーニングアッセイによって同定される新規な薬剤に関する。 それ故に、本願明細書に記載の薬剤を適切な動物モデルにおいて使用することも、本願発明では意図している。 例えば、本願明細書に記載の薬剤(例えば、調整薬剤、アンチセンス核酸分子、特異的な抗体、またはポリペプチド結合剤である試験薬剤)は、このような薬剤を用いた治療の効力、毒性または副作用を決定するために、動物モデルに対して使用することができる。 あるいは、本願明細書に記載の同定された薬剤は、このような薬剤の作用機構を決定するために、動物モデルに対して使用することができる。
さらに、本願発明は、本願明細書に記載の処置のために用いる、上記スクリーニングアッセイで同定された新規な薬剤の使用にも関する。 加えて、本願明細書に記載の同定された薬剤は、ポリペプチドまたは核酸(または、ポリペプチドまたは核酸を含む細胞)と本願明細書に記載の薬剤とを接触させることによって、ＦＬＡＰ核酸によってコードされるポリペプチドの活性を改変するために、または、ＦＬＡＰ核酸の発現を改変するために使用することができる。
本願発明を、実施例に沿って説明するが、以下の実施例に基づいて本願発明は限定的に解釈されるべきではない。 ここに本明細書の一部を構成するものとして、本明細書で引用した全文献での教示内容を援用する。
実施例１：心筋梗塞に関連する遺伝子およびハプロタイプの同定
７１３名の心筋梗塞患者に関連する２９６複数アイスランド家族の全ゲノムスキャンを行った。 女性心筋梗塞患者および初期開始心筋梗塞患者についての染色体13q12-13上の遺伝子座への示唆的連鎖、およびハプロタイプ関連分析を通じて、５-リポキシゲナーゼ活性化蛋白質(ＦＬＡＰ)をコードする遺伝子を同定し、該遺伝子内の４-ＳＮＰハプロタイプは、心筋梗塞の２倍近い危険性を与えると判断された。 男性患者は、危険なハプロタイプへの最も強い関連を示した。 心筋梗塞へのＦＬＡＰ関連の独立した確認が、散在性心筋梗塞を持つ患者の英国コホートで得られた。 これらの知見は、心筋梗塞の複雑な性質の実質的危険性を付与する単離された最初の特異的遺伝子としてのＦＬＡＰを支持する。
方 法
実験集団
実験に参加する患者は、1981年から2000年にアイスランドにおいて75歳以前に発症したた全心筋梗塞を含む登録者から募った(8000名を超える患者）。 この登録は、世界保健機構MONICAプロジェクトの一部である(世界保健機構MONICAプロジェクト、WHO MONICAプロジェクト主要調査者、J Clin Epidemiol 41, 105-14（1988））。 登録されている全患者の診断は、症状、兆候、心電図、心臓酵素、および壊死の剖検知見に基づいた厳格な診断規則に従った。
７１３名の心筋梗塞患者および１７４１名の彼らの一親等親族からの遺伝子型が、連鎖分析で用いられた。 心筋梗塞遺伝子座のマイクロサテライト関連研究では、８０２名の無関係な心筋梗塞患者(ｎ=233の女性、ｎ=624の男性およびｎ=300の初期開始）および８３７名の集団を基本とする対象を用いた。 ＦＬＡＰ遺伝子における、およびその関連するＳＮＰ関連研究では、７７９名の無関係な心筋梗塞患者を遺伝子型の分類を行った（ｎ=293の女性、ｎ=486の男性およびｎ=385の初期開始）。 ＳＮＰ関連研究に関する対照グループは、集団を基本にし、その医学的履歴が知られていない30〜85歳の年齢範囲にある６２８名の無関係な男性および女性から構成された。
研究は、アイスランドのデータ保護委員会およびアイスランドの国内生物倫理委員会によって承認された。 通知による同意を、すべての実験参加者から得た。 医学的情報および血液試料に関連する個人的識別情報は、文献に開示された手順に従って、第三者による暗号書き直しシステムによって暗号化した(Gulcher, J.R., Kristjamsson,K., Gudbjartsson,H. & Stefansson,OK., Eur J Hum Genet 8, 739-42（2000））。
統計学的解析
約1000のマイクロサテライトマーカーセットを用いて、全ゲノムスキャンを、文献に開示された手順に従って行った（Gretarsdottir, S. et al., Am J Hum Genet 70, 593-603(2002））。 多点罹患-唯一対立遺伝子-共有方法（Kong,A. & Cox,N.J., Am J Hum Genet 61, 1179-88（1997))を用いて、連鎖についての証拠を評価した。 すべての結果は、プログラム アレグロ（Gudbjartsson,D.F., Jonasson,K., Frigge,M.L. & Kong,A.Allegro, Nat Genet 25,12-3（2000))およびデコード遺伝子マップ(Kong,A. et al., Nat Genet 31,241-7（2002))を用いて得た。 関連１-df(自由度)統計学を活用する指数関数的対立遺伝子-共有モデル(Kong,A. & Cox,N.J. Am J Hum Genet 61, 1179-88（1997))のような、Spairsスコアリング関数（Whittemore,A.S. & Halpern,J., Biometrics 50, 118-27（1994）;Kruglyak,L., Daly,M.J., Reeve-Daly,M.P. & Lander,E.S., Am J Hum Genet 58, 1347-63（1996))を用いた。 全スコアを得るために、家族スコアを組み合わせる場合、各罹患対を等しく重み付けすること、および各家族を等しく重み付けするなど、対数スケールの中間的なものである重み付けスキームを用いた。 解析で罹患していないすべての遺伝子型に分類された個体は、「未知」として処理される。 小さな試料の挙動に関する関心が故に、対応するＰ値は、通常、比較のために２つの異なる方法で計算し、より有意でないものを報告した。 最初のＰ値は、大試料理論：Ｚlr＝√(２loge(10)LOD)に基づいて計算し、連鎖なしの帰無仮説下で、ほぼ標準正規分布として分布する(Kong,A. & Cox,N.J. Am Hum Genet 61, 1179-88（1997））。 第二のＰ値は、帰無仮説下で、観察されたLODスコアを、その完全なデータサンプリング分布に対して比較することによって計算する（Gudbjartsson, D.F.,Jonasson, K.,Frigge, M.L. & Kong, A.Allegro, Nat Genet 25, 12-3（2000））。 データのセットが、少数の域を超える家族よりなる場合、これらの２つのＰ値は非常に近似する傾向がある。 用いた情報尺度(Nicolae,D. University of Cicago（1999))は、アレグロで実施する情報尺度が情報の古典的尺度に密接に関連し（Dempster,A.,Laird,NM,Rudin,DB.,J R Stat Soc B 39,1-38（1977））、また、マーカー遺伝子型が完全に非情報的である場合の０、および遺伝子型が罹患親族内の家系による対立遺伝子共有の正確な量を決定する場合の１の間の特性を有する。
単一-マーカー関連実験では、フィッシャーの正確検定を用いて各対立遺伝子についての両側Ｐ値を計算して得たすべてのＰ値は、特に断りの無い限りは、複数比較で調整しなかった。 保有頻度よりはむしろ、対立遺伝子が、マイクロサテライト、ＳＮＰおよびハプロタイプで提示された。 連鎖解析のための家族として募った患者の関連性に起因する偏りを最小化するために、一親等および二親等の親族は、患者リストから排除した。 ハプロタイプ研究では、プログラムNEMO（Gretarsdottir,S. et al., Nat Genet 35, 131-8（2003））、すなわち、ハプロタイプ頻度を見積もるための計算手段として予測-最大化アルゴリズムを用い、尤度手法を利用して不足する遺伝子型および相に伴う不確実性を扱うプログラムを用いた。 帰無仮説下では、罹患した個体および健常者は、同一のハプロタイプ頻度を有すると仮定する。 代替仮説下では、ハプロタイプで危険性を有する候補者が、健常者よりも罹患した個体においてより高い頻度を有することができるが、すべての他のハプロタイプの頻度の比率は、双方のグループにおいて同一であると仮定する。 尤度は双方の仮説、および統計学的有意性を評価するために用いる対応する１-df尤度比率統計学の下で別々に最大化される(id）。 危険を増大させるハプロタイプについてのみ調査を行ったにもかかわらず、すべての報告されたＰ値は、特に断りのない限りは両側である。 複数検定について修正したハプロタイプ関連の有意性を評価するために、無作為化検定を同一遺伝子型データを用いて行った。 罹患した個体および健常者のコホートを、無作為化し、解析を繰り返した。 この手法を1000回まで繰り返し、得られたＰ値は、元患者および健常者コホートを用いて観察されたＰ値よりも小さいか、またはそれと同等と判断されたハプロタイプについてのＰ値を示す反復の分立である。
単一-マーカーおよびハプロタイプ分析双方について、相対的危険性(ＲＲ)および集団に帰される危険性は、ハプロタイプの二つの対立遺伝子の危険性を個人が多重に担う多重モデルを仮定して計算された(Terwilliger, J.D. & Ott, J.A., Hum Hered 42, 337-46 (1992）；Falk, C.P. & Rubinstein,P., Ann Hum Genet 51（Pt3), 227-33（1987））。 LDはD' (Lewontin, R. C., Genetics 50,757-82（1964）)およびＲ２(Hill, W. G. & Robertson, A., Genetics 60, 615-28（1968))の標準定量を用いて、ＳＮＰの対の間で計算した。 NEMOを用いて、二つのマーカー対立遺伝子組合せの頻度は、最大尤度によって見積もられ、連鎖平衡からの偏差は、尤度比率検定によって見積もられる。 特定の領域におけるＬＤ構造を解明するために、すべてのＳＮＰ組合せをプロットした場合、Ｄ'は左上角にプロットされ、Ｐ値は右上角にプロットされた。 得られたＬＤプロットにおいて、マーカーは、それらの物理的位置よりは、むしろ等距離にプロットされる。
ＤＮＡ多型の同定
新しい多型反復(例えば、ジヌクレオチドまたはトリヌクレオチド反復)は、Sputnikプログラムで同定された。 マイクロサテライト対立遺伝子では:CEPH試料1347-02（Centre d' Etudes du Polymorphisme Humain, genomics repository)を参照として用いる。 この試料における各ミクロサテライトの下方対立遺伝子は０に設定され、その他の試料中のすべての他の対立遺伝子は、この参照に対する関係に従って番号付けされる。 従って、対立遺伝子は、CEPH試料中の下方対立遺伝子よりも１bpだけ長く、対立遺伝子２は、CEPH試料中の下方対立遺伝子よりも２bpだけ長く、対立遺伝子３は、CEPH試料中の下方対立遺伝子よりも３bpだけ長く、対立遺伝子４は、CEPH試料中の下方対立遺伝子よりも４bpだけ長く、対立遺伝子-１は、CEPH試料中の下方対立遺伝子よりも１bpだけ短く、対立遺伝子-２は、CEPH試料中の下方対立遺伝子よりも２bpだけ短く、等々である。 遺伝子中の単一ヌクレオチド多型は、患者および健常者から得たPCR配列決定エクソンおよびイントロン領域によって検出された。 公的な単一ヌクレオチド多型は、NCBI ＳＮＰデータベースから得られた。 ＳＮＰは、蛍光偏光鋳型を標的としたダイターミネーター取り込みでＳＮＰを検出する方法(ＳＮＰ-FP-TDIアッセイ)(Chen, X., Zehnbauer, B., Gnirke, A. & Kwok, P.Y., Proc Natl Acad Sci USA 94, 1075-61. (1997）)およびTaqManアッセイ(Applied Biosystems)を用いて遺伝子型の分類を行った。
結 果
連鎖分析
1000程度のマイクロサテライトマーカーのフレームワークセットを用いた全ゲノムスキャンによって、心筋梗塞罹患性の遺伝子を調査した。 初期の連鎖分析は、WHO MONICA研究基準(世界保健機構MONICAプロジェクト、WHO MONICAプロジェクト主要研究調査者、J Clin Epodemiol 41, 105-14 (1988))を満足する７１３名の心筋梗塞患者を含み、２９６にも及ぶ家族のグループを構成していた。 また、連鎖分析は、初期開始、男性および女性患者に関し、別々に繰り返して実施した。 各分析における患者および家族の数の記載を、表１に挙げる。
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 これらの分析のいずれも、ゲノム-幅有意性の遺伝子座を生じなかった。 しかしながら、最も有望なLODスコア(LOD=2.86)が、ピークマーカーD13S289における女性心筋梗塞患者についての染色体13q12-13において観察された(データは示さず）。 この遺伝子座もまた、初期開始心筋梗塞を有する患者において、最も有望なLODスコア(LOD=2.03)を示した。 D13S289の周囲の30センチモルガン(cM)領域での、さらに別の14個のマイクロサテライトマーカーをタイプ分けすることによって、同一性と家系共有についての情報を、90％を超えるまでに増やした後、女性分析からのLODスコアは、2.48(Ｐ値=0.00036)まで下降し、その一方で、最大LODスコアは、D13S289に残った(図６.１）。
マイクロサテライト関連研究
女性心筋梗塞連鎖分析におけるLODスコアでの１の降下に対応する7.6Mb領域は、40の既知の遺伝子を含有する(表２）。
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 この領域におけるいずれの遺伝子が心筋梗塞に最も寄与するようであるかを判断するために、この領域内に位置する120のマイクロサテライトマーカーをタイプ分けし、８０２名の無関係心筋梗塞患者および８７３名の集団-ベースの健常者を用いて、関連症例の調査を行った。 また、連鎖研究で用いた三つの表現型、すなわち、初期開始、男性および女性心筋梗塞患者の各々についての関連研究も繰り返した。
初期関連研究は、マイクロサテライトマーカー間の平均距離が約100kbである場合に行った。 この分析は、有意に女性心筋梗塞に関連した４および５のマイクロサテライトマーカーよりなる幾つかの拡大されたハプロタイプを明らかにした(図１および図２、および表13および表14を参照）。 これらのすべての拡大されたハプロタイプに共通する領域は、マーカーDG13S166およびD13S1238によって規定される。 この領域は、唯一の遺伝子、ＦＬＡＰ核酸配列を含んでいた。 マーカーDG13S166およびD13S1238の各々に関する対立遺伝子０および-２に関連する二つのマーカーハプロタイプが、患者において過剰に認められた。
これは、ＦＬＡＰ遺伝子が心筋梗塞の病因に関連することを示唆する最初の証拠であった。
今や、60kb当たり一つのマイクロサテライトマーカーのマーカー密度でもって、染色体13q12-13上の候補範囲に関して、より多くのマイクロサテライトマーカー(ｎ=120)を用いて引き続いて行ったハプロタイプ分析は、元のハプロタイプ関連に対して、減少した有意性を示した。 しかしながら、マーカーの増大した密度を用いるハプロタイプ関連分析を、再度、ＦＬＡＰ遺伝子について行った。 この分析は、300kb領域が心筋梗塞の罹患性に関連することを強く示唆した。 図５.２に示すように、最低Ｐ値(0.00009)にてすべての心筋梗塞に対する関連を示したハプロタイプは、アラキドン酸５-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質(ＦＬＡＰ)をコードする遺伝子、および高度に荷電したタンパク質と呼ばれる未知の機能を持つ遺伝子を含めた二つの既知の遺伝子を含有する領域をカバーする。
しかしながら、この領域における女性心筋梗塞に対するハプロタイプ関連は、すべての心筋梗塞患者についてよりも低い有意性(Ｐ値=0.005)であり、最も有意なハプロタイプ関連が、男性心筋梗塞患者で観察された(Ｐ=0.000002）。 この男性心筋梗塞ハプロタイプは、試験したすべてのハプロタイプを調製した後もなお有意であった唯一のハプロタイプであった。
前記した関連結果を考慮すると、ＦＬＡＰは魅力的な候補であり、従って、この遺伝子に対して注意を向けた。
ＦＬＡＰおよび連鎖脱平衡マッピングにおける多型についてのスクリーニング
ＦＬＡＰ遺伝子内の変異が、心筋梗塞に有意に関連するか否かを決定し、原因変種について調査するために、ＦＬＡＰ遺伝子を９３名の患者および９３名の健常者において配列決定を行った。 配列決定された領域は、５つの既知のエクソンおよびイントロン、および最初のエクソンに対して26kb領域５’、および５番目のエクソンに対して７kb領域３'を含めた、ＦＬＡＰ遺伝子を含む60kbを対象とする。 すべてにおいて、１４４個のＳＮＰが同定され、そのうち、９６個が低い従たる対立遺伝子頻度が理由でその後の分析から排除し、あるいはそれらは他のＳＮＰに完全に相関し、従って、冗長であった。 図６は、エクソン、イントロン、およびＦＬＡＰ遺伝子の５'および３'隣接領域に対する、遺伝子型の分類のために用いた48のＳＮＰの分布を示す。 一つだけのＳＮＰが、コーディング配列(エクソン２)内で同定された。 このＳＮＰは、アミノ酸置換に導かなかった。 NCBIヒトゲノムアセンブリー、形成34におけるこれらのＳＮＰの位置を表３に記載する。
Figure 2007538003
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 ＳＮＰに加えて、ＦＬＡＰプロモーター領域についても、文献に開示されているモノポリマーＡリピートよりなる多型のタイプ分類を行った(Koshino, T. et al., Mol Cell Biol Res Commun 2,32-5 (1999））。
さらなる遺伝子型の分類に関して選択される48個のＳＮＰによって規定される連鎖非平衡(ＬＤ)ブロック構造を、図８に示す。 強いＬＤが、ＦＬＡＰ領域を横切って検出されたが、少なくとも一つの組換えが起こり、その領域に強く関連する二つのＬＤブロックに分割された模様である。
心筋梗塞に対するハプロタイプの関連性
対照関連症例調査を行うために、48の選択されたＳＮＰおよびモノポリマーＡリピートマーカーを、779名の無関係心筋梗塞患者および628名の集団-ベースの健常者の組において遺伝子型の分類を行った。 49のマーカーの各々をそれら疾患に対する関連性について個々に試験を行った。 ３つのＳＮＰ、その内の一つは第一のエクソンから３kb上流に位置し、その他の二つ、つまり、第一のエクソンから１kbおよび３kb下流のものは、心筋梗塞に対する名目上有意な関連を示した(表４）。
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 しかしながら、試験を行ったマーカーの数について調整を行ったところ、これらの結果は有意ではなかった。 次いで、同一コホートを用いてそれら疾患に対して関連性を示すハプロタイプについて調査を行った。 計算上の理由で、調査は、二つ、三つまたは四つのＳＮＰから構成されるハプロタイプ組合せに制限され、そして、患者において過剰な唯一のハプロタイプのみを試験した。 得られたＰ値は、患者および健常者を無作為化して試験されたすべてのハプロタイプについて調整を行った(前出の方法を参照)。
0.05未満の調整されたＰ値にて疾患との有意な関連性が認められた幾つかのハプロタイプが見出された(表５）。
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 最も有意な関連性が、名目のＰ値0.0000023および調整されたＰ値0.005において、遺伝子の最初の四つのエクソンを含めた33kbにわたる四つのＳＮＰハプロタイプで観察された(図６.３）。 Ａ４として表示したこのハプロタイプは、患者において１５.８％のハプロタイプ頻度(保有頻度30.3％)を有しているのに対して、健常者では９.５％(保有頻度17.9％)を有していた(表６）。
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 同一のＳＮＰから構成される他のハプロタイプと比較したＡ４ハプロタイプによって付与される相対的危険性は、増殖性モデルを仮定した場合に１.８であり、対応する集団の寄与危険性(PAR)は13.5％であった。 表６に示したように、Ａ４ハプロタイプは、女性患者(保有頻度25.7％)よりも、男性患者(保有頻度30.9％)においてより高頻度で観察された。 0.05未満に調整されたＰ値に有意に関連するすべての他のハプロタイプは、Ａ４ハプロタイプに高度に相関し、そのハプロタイプの変異体と考えるべきである(表５）。 表６は、779名の心筋梗塞患者、702名の脳卒中患者、577名の末梢動脈閉塞疾患患者および628名の健常者を用いるハプロタイプＡ４関連研究の結果を示す。 一親等および二親等の親族は、患者コホートから排除した。 すべて既知の心筋梗塞の症例を、関連する試験前に脳卒中および末梢動脈閉塞疾患患者コホートから除外した。 脳卒中に対するＡ４ハプロタイプの有意な関連性が、1.67の相対的危険性(Ｐ値=0.000095)において観察された。 加えて、Ａ４ハプロタイプが、脳卒中の特定のサブ-表現型に第一に関連しているか否かが決定され、虚血性発作および出血性発作の双方が、Ａ４ハプロタイプに有意に関連していることが見出された(以下の表２２）。
ハプロタイプＡ４に関する多数の変異体
ＳＮＰハプロタイプの二つの相関するシリーズが、表７でＡおよびＢとして示した患者で過剰に観察された。 ハプロタイプの長さは、33Kbおよび69Kbの間で変化し、ハプロタイプは連鎖非平衡の一つまたは二つのブロックをカバーする。 ハプロタイプの双方のシリーズは、ＳＮＰ SG13S25共通対立遺伝子のＧを含む。 Ａシリーズにおけるすべてのハプロタイプは、ＳＮＰ SG13S114を含有するが、一方で、Ｂシリーズにおけるすべてのハプロタイプは、ＳＮＰ SG13S106を含む。 Ｂシリーズでは、ハプロタイプB4、B5およびB6は、２を超える相対的危険性(ＲＲ)を有し、10％を超える対立遺伝子頻度であった。 Ａシリーズにおけるハプロタイプは、僅かに低いＲＲおよびより低いＰ値を有するが、より高頻度(15〜16％)で認められる。 シリーズＢおよびＡにおけるハプロタイプは強く相関し、すなわち、Ｂにおけるハプロタイプは、Ａにおけるハプロタイプのサブセットを規定する。 よって、ハプロタイプＢは、Ａよりも特異的である。 しかしながら、ハプロタイプＡは、感受性が高く、すなわち、ＡよりもＢでの集団寄与危険性が低いことから明らかなように、それらは推定突然変異を有する多くの個体を捉える。 さらに、これらのハプロタイプは、初期-開始患者(55歳前の第一の心筋梗塞の開始として規定）、および両性に関する同様な危険性比率および対立遺伝子頻度を示す。 加えて、高血圧、高コレステロール、および喫煙歴および糖尿病のような既知の危険因子を有する種々の患者グループの分析でも、これらのハプロタイプのいずれに対しても有意な相関性は明らかにされず、ＦＬＡＰ遺伝子におけるハプロタイプが、心筋梗塞について独立した遺伝子的罹患性因子を表すことを示している。
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 女性心筋梗塞に対するハプロタイプの関連付け
最終的に我々がＡ４ハプロタイプの同定に至るすべてのＳＮＰをタイプ分けをする前に、我々は、いくつかのＳＮＰおよび三つのマイクロサテライトマーカーで遺伝子型の分類がされた４３７名の女性心筋梗塞患者、１０４９名の男性心筋梗塞患者、および８１１名の健常者を含むハプロタイプ関連分析を行った。 これらのマーカーは、ＦＬＡＰ遺伝子を含む300kb領域内にすべて位置していた。 これらのデータを用いる心筋梗塞患者の対照症例研究において、健常者と比較して女性心筋梗塞患者において有意に過剰表現されるいくつかのハプロタイプが見出された(表８参照)。 すべてのこれらのハプロタイプは、相互に密接にに相関していた。
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 表９は、これら女性の心筋梗塞危険性ハプロタイプの代表例である二つのハプロタイプを示す。 これらのハプロタイプの相対的危険性は2.4および４であり、それらは、各々、女性心筋梗塞患者の23％および13％に認められた。
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 表10は、これらの同一ハプロタイプも、健常者と比較して男性心筋梗塞患者において過剰に表現はされているが、相対的危険性は低度であったことを示す。 タイプ分けおよびＦＬＡＰ領域における多数のＳＮＰを分析した後、これらの女性心筋梗塞「危険性」ハプロタイプは、幾つかの試験のために調整した後には、もはや有意とは考えられないことに注意すべきである。
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 表13は、本願明細書に記載の方法に従ってゲノム配列内で同定したＦＬＡＰタンパク質、マーカー、多型およびＳＮＰをコードする位置と共にエクソンを示す。
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 Length=Mbで表したハプロタイプの長さ。 P-val=p値。 RR=相対的危険性。 Naf=患者の数。 P al=ハプロタイプの対立遺伝子頻度。 Pca=ハプロタイプの保有頻度。 N ct=健常者の数。 対立遺伝子=ハプロタイプにおける対立遺伝子。 マーカー=ハプロタイプにおけるマーカー。
実施例２：５-リポキシゲナーゼプロモーターにおける多型および心筋梗塞の間の関係
５-リポキシゲナーゼ遺伝子のG-Cが豊富な転写因子結合領域における突然変異のファミリーが、これまでに同定されている。 これらの突然変異は、一つの欠失、二つの欠失、または通常はタンデムに五つのSp１結合モチーフを含むATG翻訳開始部位から176bp〜147bp上流の領域における一つのジンクフィンガー(Sp1/Egr-１)結合部位の付加よりなる。 ヒト５-リポキシゲナーゼ遺伝子プロモーターでのこれら天然突然変異は、転写因子結合およびレポーター遺伝子転写を修飾することが示されている。 CATレポーター構築体の転写を促進するDNAの突然変異体形態の能力は、野生型DNAのそれよりも有意に低いことが示されている（J. Clin. Invest. Volume 99, Number 5, March 1997, 1130-1137）。
５-リポキシゲナーゼがヒト集団においてアテローム性動脈硬化症の病気、特に心筋梗塞(ＭＩ)と関連するか否かを試験するために、可変数のタンデムSp1/Egr-１結合部位よりなるこのプロモーター多型に関して、１１１２名の心筋梗塞患者、７４８名の末梢動脈閉塞疾患患者、および５４１名の脳卒中患者において遺伝子型の分類を行った。
表１６に示す結果は、(最も活性なプロモーターを有し、そして、５-LO mRNAの最も高い発現を示す対立遺伝子を表す；J. Clin. Invest. Volume 99, Number 5, March 1997, 1130-1137)野生型対立遺伝子が、心筋梗塞と有意に関連することを示す（RR=1.2、ｐ<0.05）。 結果は、増大した５-リポキシゲナーゼの発現が、心筋梗塞の病因においてある役割を演じるという病気の仮説に合致する。
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 実施例３：ＦＬＡＰ 心筋梗塞危険性ハプロタイプを有する個体でのＬＴＥ４生合成の増加
ロイコトリエン経路の最終生成物の既知の機能および５-ＬＯ関連性データに基づいて、ＦＬＡＰ遺伝子の発現の増加および／または機能の改善によって、ＦＬＡＰハプロタイプと心筋梗塞との関連性を、さらに詳細に説明する。 換言すると、「危険要素」ＦＬＡＰハプロタイプを保有する個体は、ＦＬＡＰの増量、またはさらに活性なＦＬＡＰのいずれか、または双方を有している。 これにより、これらの個体でのロイコトリエンの産生が増大する。
この理論を実証するために、患者の血清試料での下流ロイコトリエン代謝産物であるＬＴＥ４を測定した。 ヒト血清でのＬＴＥ４の定量は、タンデム質量分光測定法と組み合わせた液体クロマトグラフィーによって行った。 以下のプロトコルに従って実施した。
分析方法
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 装置および条件
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 他の装置
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 材 料
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 ストック溶液
メタノールで100μg/mlの濃度に調整されたＬＴＥ4のストック溶液を、供給業者に調製してもらった。 このストック溶液を、20μg/mlになるまでメタノールで希釈し、得られた溶液(ＷＳ-１)を、２〜８℃の温度で冷蔵保存した。
49.5ｇ/mlの濃度の内部標準ストック溶液(ＬＴＥ4-ｄ3)を、供給業者に調製してもらった。 このストック溶液を、１g/mlの濃度になるまでメタノールで希釈し、得られた溶液を、２〜８℃の温度で冷蔵保存した。
補充溶液、較正用標準および定性用対照試料の調製
これまでに得られた溶液を希釈して、１ng/ml〜10,000ng/mlの濃度の補充溶液(ＳＳ)を調製した。
以下の補充溶液が、調製された。
Figure 2007538003
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 調製後、較正用標準および定性用対照のための補充溶液を、２〜８℃の温度で冷蔵保存した。
較正用標準試料および定性用対照試料の調製
新鮮な較正用標準試料および定性用対照試料(ＱＣ)は、表Ｐ８および表Ｐ９のそれぞれに記載のブランク血漿を加えることによって、各使用時に調製した。
Figure 2007538003
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 試料調製
各研究試料400μlの部分標本、較正用標準試料、ＱＣ試料および対照ブランクを、エッペンドルフバイアルに、ピペットで分取する。 ブランク以外のすべての試料に、20μlの内部標準用溶液を添加し、数秒間、試料を遠心分離して混合する。 10％酢酸の60μlを用いて血漿試料のpHをpH4.5に調整し、抽出前に、手早く、4100rpmで、10分間遠心分離する。 固体相を抽出し、96-ウェルプレートに、メタノール１mlおよび水１mlを加えて養生する。 次いで、血漿試料の400μlをプレートに置く。 減圧した後、ディスクを１分間乾燥させる。 水２mlおよび２％酢酸に溶解した30％メタノール１mlで洗浄する。 その後、プレートに、メタノール0.6mlを加えて溶出させる。 次いで、数分間、プレートを乾燥させる。 メタノール溶出物を、窒素気流下、45℃で、ほぼ乾燥するまで蒸発させる。 残渣を30μlの移動相に移して、数分間、遠心分離して混合する。 次いで、この溶液を、10,000rpmで、10分間、遠心分離し、そして、その10μlを、自動サンプラーで、定量のためにLC-MS/MSシステムに注入する。
測定の実施
試料はバッチ内で調製され、そこで測定に供されるが、一般的なバッチは、以下の構成からなる。
較正用標準試料１セット、予備用の最低度の較正用標準試料が一つ、そして、ブランク試料が一つである。
１６名から採取した試料および対照用試料１セット（ＣL、ＣM、ＣH）。
１７名から採取した試料および対照用試料１セット（ＣL、ＣM、ＣH）。
血漿試料での定量分析
較正標準のピークエリア比 ANALYTE/INTERNAL STANDARD およびそれらの基準 ANALYTE 濃度から、標準曲線を計算する。 秤量曲線１/Ｘ2を使用する場合、二次回帰式からＬＴＥ4に関する既知の試料を計算した。 試料の測定ピークエリアを、標準曲線について用いた計算式に従って、ANALYTEのピコグラム／血漿ミリリットル(pg/ml)に変換した。
標準曲線の回帰計算および未知の試料と対照試料とでの濃度の計算は、MassLynx Softwareを用いて行った。
判定基準
較正標準
較正曲線に関する決定(Ｒ2)係数は、0.98を超えなければならない。
較正曲線は、50pg/ml〜1500pg/mlの濃度範囲を対象としていた。
較正曲線の濃度は、回帰式から再計算される場合、基準値の25％以内でなければならない。 これらの基準を外れた較正標準(各操作にて、多くて三つ)を除外して、残りの標準を用いて改めて較正を行った。 標準曲線が合格しない場合、試料を再分析しなければならない。
対照試料
分析された定性用参照試料の少なくとも２/３が、回帰式から計算される場合、それらの基準値の25％以内でなければならない。 参照試料の２/３を超えるデータが外れてしまう場合には、試料を再分析しなければならない。
結 果
表１７(下記)は、女性の心筋梗塞「危険要素」ハプロタイプに関して、低いＬＴＥ４レベルを保有する女性心筋梗塞患者(最低レベルに属する５０名)よりも、高いＬＴＥ４レベルを保有する女性心筋梗塞患者(最高レベルに属する５０名)に対して、さらに有意に関連することを示している。 加えて、高レベルのＬＴＥ４を保有する女性心筋梗塞患者と、低レベルのＬＴＥ４を保有する女性心筋梗塞患者とを比較するハプロタイプ分析によれば、高レベルにおいて、１.６倍もの「危険要素」ハプロタイプをを有することが示された(表１８を参照されたい)。 この結果は、高レベルのＬＴＥ４を保有する心筋梗塞患者のグループにおいて、「危険要素」ハプロタイプが豊富であることを明確に示すものである。 「危険要素」ハプロタイプの保有頻度は、女性心筋梗塞グループ全体では、それぞれ１２％および２０％であるが、高レベルのＬＴＥ４を保有する女性心筋梗塞グループでは、それぞれ１５％および２４％にまで上昇した。 これに対応して、「危険要素」ハプロタイプの保有頻度は、低レベルのＬＴＥ４を有する女性心筋梗塞のグループにおいて、それぞれ８％および１８％にまで減少する(注記：保有頻度は、２×疾患対立遺伝子頻度×(１−疾患対立遺伝子頻度)＋(疾患対立遺伝子頻度)2として表される。）。
ＬＴＥ４は、心筋梗塞危険度に関与する主要なロイコトリエン代謝産物のロイコトリエン合成経路の上流でのロイコトリエン合成速度を簡明に指し示す場合があることに注意されたい。 例えば、ロイコトリエンＢ４は、心筋梗塞血小板の炎症性状態に関与するロイコトリエンＥ４よりも有望ではあると考えられるが、Ｂ４の半減期が短いので、血清試料内で確実に測定することは困難である。
Figure 2007538003
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 実施例４：Ｃ反応性タンパク質(ＣＲＰ)と相関するＬＴＥ４の増加
ロイコトリエンの産生増加と、心筋梗塞の危険因子であると認識されている炎症性マーカーＣＲＰの増加との関連を調査した。 図４に示してあるように、血清ＬＴＥ４レベルと血清ＣＲＰレベルとの間に、有意な陽性の相関が認められた。
実施例５：危険要素ハプロタイプを保有する患者でのＣＲＰレベルの評価
女性心筋梗塞の危険要素ハプロタイプの存在下での、炎症性マーカーのレベルの増加を確認するために、危険要素ハプロタイプを保有する女性心筋梗塞患者のＣＲＰレベルを評価した。
その結果を、表１９に示す。 危険要素ハプロタイプを保有していない患者と比較して、危険要素ハプロタイプを保有する患者での平均ＣＲＰは大きかった。
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 実施例６：心筋梗塞患者と健常者での血清ＬＴＥ４レベルの増加
ロイコトリエン経路の最終産物は、アテローム性動脈硬化症の進行および脂質酸化および／または炎症性効果を介してアテローム硬化性血小板の不安定化に強力に関与する、強力な炎症性脂質媒介物である。 その例として、(１) 心筋梗塞は、ＦＬＡＰでの遺伝変異体と相関する、(２) 心筋梗塞は、５-ＬＯでの高発現プロモーター多型性と相関する、(３) Ｃ-反応性タンパク質レベルは、血清ロイコトリエンＥ４と相関する、そして、(４)心筋梗塞危険度ＦＬＡＰハプロタイプを保有する患者は、血清ロイコトリエンＥ４およびＣＲＰ値が高い、ことが挙げられる。 これらのデータに基づいて、血清ロイコトリエンＥ４レベルは、心筋梗塞危険度と相関するという仮説を立てた。
この仮説を検証するために、ＬＴＥ４(下流ロイコトリエン代謝産物)を、４８８名の女性心筋梗塞患者および１６４名の健常者の血清試料に関して測定した。 ウィルコクソン順位-合計片側検定法を用いて得られた患者に関するＬＴＥ４レベルは、健常者のレベルより高かった。 較差のｐ値は、０.００９２であったので、我々の仮説は立証された。 したがって、増加したロイコトリエンＥ４は、心筋梗塞に対する危険因子であるといえる。 血清または血漿でのＬＴＥ４レベルは、一次的または二次的心筋梗塞を防ぐための最良の処置および生活様式管理計画を決定する際に、個体の心筋梗塞危険度の概略を把握するために用いてもよい。 その他のロイコトリエン代謝物を、同様にして、心筋梗塞危険度プロフィールとして使用することもできる。
実施例７：心筋梗塞患者の活性化好中球における増大したＬＴＢ４の生産
５-リポキシゲナーゼ経路の二つの分岐の内の一つの主な生物活性産物は、ＬＴＢ4である。 過去に心筋梗塞の履歴を持つ患者が、健常者と比較して５-LO経路の増大した活性を有するか否かを判断するために、単離された血中好中球におけるＬＴＢ4生産を、カルシウムイオン透過担体、イオノマイシンでのin vitro刺激の前後に測定した。 心筋梗塞患者または健常者からの休止好中球におけるＬＴＢ4生産の間で、有意差は検出されなかった(結果は示さず）。 対照的に、イオン透過担体で刺激された心筋梗塞患者からの好中球によるＬＴＢ4生産は、各々、15分および30分では、健常者の好中球による生産性よりも有意に大きかった（図５.１）。 さらに、図５.２に示されたように、観察されたＬＴＢ4放出の増加は、その細胞が健常者からの細胞よりもＬＴＢ4を有意により多く生産した、ハプロタイプＡ４の男性キャリアの事例を十分説明できるものであった(Ｐ値=0.0042)(表20）。 表20に示すように、ボーダーラインでの有意性に関して、HapAを保有していない男性において強調されたＬＴＢ4応答も認められた。 これは、回収されなかったＦＬＡＰ遺伝子、または、幾人かのＦＬＡＰ危険性ハプロタイプを持たない患者におけるＬＴＢ4応答での上方制御を説明可能な５-LO経路に属するその他の遺伝子に由来する変異体として説明することができる。 表20に示すように、ＬＴＢ4応答の差異は、女性では検出されなかった。 しかしながら、試料サイズが小さいため、これは決定的なものと考えることができない。 これらを考慮すると、危険なハプロタイプの男性保有者に由来する刺激された好中球のＬＴＢ4生産の上昇したレベルは、ＦＬＡＰ遺伝子における病気関連変異体が、炎症性細胞を刺激する因子に対するＦＬＡＰ応答を増加させ、その結果、ロイコトリエンの生産および心筋梗塞に対する危険性の増大をもたらすことを示唆する。
方 法
抹消血液好中球の単離および活性化
43名の心筋梗塞患者および35歳の性別が合致した健常者から、EDTAが入ったバキュテイナーに、50mlの血液を採血した。 すべての血液は絶食から12時間後の早朝の同一時刻に採血した。 Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences)を用いて好中球を単離した。
簡単に述べれば、Ficollグラジエントからの赤血球ペレットを回収し、赤血球細胞を、引き続いて、氷上で、0.165M NH4CLで10分間溶解させた。 PBSで洗浄後、好中球を計数し、15％胎児ウシ血清(FCS)(GIBCO BRL)を含むRPMI-1640(GIBO BRL)での４ml培養にて、２×106細胞/mlで平板培養した。 次いで、最大有効濃度のイオノマイシン(１μM)で細胞を刺激した。 イオノマイシン付加から０、15、30、60分後に、600μlの培地を吸引し、後述するように、ＬＴＢ４放出の測定のために、−80℃で貯蔵した。 細胞を、５％CO2/95％空気の湿潤化雰囲気下で、37℃で維持した。 すべての試料をインドメタシン(１μM)で処理して、シクロオキシゲナーゼ酵素をブロックした。
好中球におけるＬＴＢ4のイオノマイシン−誘導放出
ＬＴＢ４イムノアッセイ(Ｒ＆Ｄシステムズ)を用いて、培養されたイオノマイシン刺激好中球からの上清中のＬＴＢ4濃度を定量した。 用いたアッセイは、試験試料(200□l)内に存在するＬＴＢ-４が、ウサギポリクローナル抗体上の部位について、固定した量のアルカリ性ホスファターゼ-標識ＬＴＢ４と競合する競合結合技術に基づいている。 インキュベーションの間に、ポリクローナル抗体は、マイクロプレート上に被覆されたヤギ抗-ウサギ抗体に結合するようになる。 過剰の複合体および未結合試料を除去するために洗浄し、基質溶液をウェルに加えて、結合した酵素活性を測定する。 発色を停止させ、405nmで吸光度を計測する。 イオノ強度は、試料中のＬＴＢ４の濃度に逆比例する。
ＬＴＢ４イムノアッセイを用いる各ＬＴＢ４測定を二連で行った。
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 実施例８：心筋梗塞に関連するハプロタイプは脳卒中および末梢動脈閉塞疾患の危険性も付与する。
脳卒中および末梢動脈閉塞疾患は、心筋梗塞に密接に関連するので(すべてはアテローム硬化症に基づいて起こる）、心筋梗塞に対する危険性を付与するＦＬＡＰ遺伝子におけるＳＮＰハプロタイプもまた、脳卒中および／または末梢動脈閉塞疾患の危険性を付与すると報告されている。 「危険な」ハプロタイプ(Ａ４ハプロタイプ)は、以下の四つのＳＮＰによって規定することができる。 対立遺伝子Ｇを有するSG13S25、対立遺伝子Ｔを有するSG13S114、対立遺伝子Ｇを有するSG13S89、および対立遺伝子Ａを有するSG13S32。
表２１は、ハプロタイプＡ４が心筋梗塞を有する危険性を増大させるにつれ、ハプロタイプＡ４は、同程度の脳卒中を有する危険性を増加させることを示す。 「危険な」ハプロタイプは、脳卒中患者の28％および健常者の17％が保有しており、このハプロタイプが関連する脳卒中を有する相対的危険性が１.７であることを意味する(ｐ値=5.8 10-06)。
有意ではないが、「危険な」ハプロタイプは、末梢動脈閉塞疾患を有する危険性も付与する。
Figure 2007538003
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 表２１に示した関連分析で用いた患者コホートは、一親等および二親等の親族を含んでもよい。
前記議論の表２１は、779名の心筋梗塞患者、702名の脳卒中患者、577名の末梢動脈閉塞疾患患者および628名の健常者を用いるハプロタイプＡ４関連研究の結果を示す。 一親等および二親等の親族は、患者コホートから排除した。 心筋梗塞のすべての既知の症例は、関連性に関する試験の前に、脳卒中および末梢動脈閉塞疾患コホートから除去した。 脳卒中に対するＡ４ハプロタイプの有意な関連性が、1.67の相対的危険性でもって観察された(Ｐ値=0.000095）。 加えて、Ａ４ハプロタイプが、脳卒中の特定のサブ-表現型に主として関連するか否かが判断され、虚血性および出血性双方の発作が、Ａ４ハプロタイプに有意に関連することが見出された(表２２）。
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 最後に、Ａ４ハプロタイプは、末梢動脈閉塞疾患には、あまり有意には関連していなかった(表２１）。 女性心筋梗塞と比較して、男性心筋梗塞に対するＡ４ハプロタイプのより強い関連性と同様、それは、男性の脳卒中および末梢動脈閉塞疾患に対するより強い関連性をやはり示すことに注意すべきである。
研究対象
本研究で用いた脳卒中および末梢動脈閉塞疾患コホートは、文献に開示されたものである(Gretarsdottir, S. et al. Nat Genet 35, 131-8 (2003)；Gretarsdottir, S. et al., Am J Hum Genet 70, 593-603 (2002）;Gudmundsson, G. et al., Am J Hum Genet 70,586-92（2002））。 脳卒中連鎖分析では、164名の家族内の、かつ164の家族における六つの減数分裂を含めた、少なくとも１名のその他の男性患者に関連した虚血性発作またはＴＩＡを有する342名の男性患者からの遺伝子型を用いた。 関連研究では、すべての形態の脳卒中を有する702名の患者(ｎ=329の女性およびｎ=373の男性)および577名の末梢動脈閉塞疾患患者(ｎ=221の女性およびｎ=356の男性)を解析した。 ＭＤも併発した脳卒中または末梢動脈閉塞疾患を有する患者は排除した。 脳卒中および末梢動脈閉塞疾患関連研究で用いた健常者は、心筋梗塞ＳＮＰ関連研究(ｎ=628)で用いたのと同一であった。
研究は、アイスランドのデータ保護協会およびアイスランドの国内生物倫理委員会によって承認された。 通知した同意が、すべての研究参加者から得られた。 医学的情報および血液試料に関連する個人的な識別子は、文献に開示された手順に記載されたようにして、第三者から提供された暗号化システムで暗号化した(Gulcher, J.R., Kristjansson, K., Gudbjartsson,H. & Stefansson, K., Eur J Hum Genet 8, 739-42（2000））。 加えて、虚血性発作または一過性虚血性発作を有する男性患者の独立した連鎖研究において、同一遺伝子座への連鎖が同一ピークマーカーにおいて1.51のLODスコアで観察され（図７）、さらに、真菌罹患性因子がこの遺伝子座に存在するであろうことを示唆した。
実施例９：英国コホートにおけるＦＬＡＰに対するハプロタイプ関連
その他の研究では、ＦＬＡＰ遺伝子における変異体もまたアイスランド国外の集団における心筋梗塞の危険性に対する印象を残すと判断された。 Ａ４ハプロタイプを規定する四つのＳＮＰを、散在性心筋梗塞を有する英国の750名の患者のコホート、および728名の英国の健常者集団においてタイプ分けを行った。 患者および健常者は、レイチェスターおよびシェフィールドで募った三つの別々の研究コホートに由来する。 患者および健常者の間で、ハプロタイプの頻度に有意な差異は見出されなかった(各々、16.9％対15.3％）。 しかしながら、ＦＬＡＰ遺伝子を横断して分布する別の九つのＳＮＰを、英国コホートにおいてタイプ分けし、心筋梗塞と関連付けられるであろうその他のハプロタイプについて調査を行い、二つのＳＮＰが名目上有意なＰ値で、心筋梗塞に対する関連を示した(データは示さず）。 さらに、三つおよび四つのＳＮＰハプロタイプ組合せは、英国コホートにおいて心筋梗塞の危険性を増加させ、さらに、最も有意な関連が名目のＰ値＝0.00037を有する四つのＳＮＰハプロタイプで観察された(表２３)。
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 このものは、ハプロタイプHapＢと呼ばれていた。 HapＢのハプロタイプ頻度は、健常者での4.0％(保有頻度7.8％)と比較して、1.95の相対的危険性を与える心筋梗塞患者コホートにおいて7.5％である(保有頻度14.4％）。 このハプロタイプは、調整されたＰ値＝0.046を有する、1000の無作為化工程を用いて試験されたすべてのハプロタイプについて、調整を終えた後に依然として有意であった。 他のＳＮＰハプロタイプでは、0.05未満の調整されたＰ値を有するものはなかった。 二つの危険なハプロタイプＡ４およびHapＢは、相互に排除するように見え、同一染色体が双方のハプロタイプを運ぶ例もない。
英国の研究集団
英国での三つの別々のコホートの募集の方法は、文献にすでに記載されている（Steeds,R., Adams,M., Smith,P., Channer,K. & Samani,N.J., Thromb Haemost 79, 980-4 (1998); Brouilette,S., Singh,R.K., Thompson,J.R., Goodall, A.H. & Samani,N.J., Arterioscler Thromb Vasc Biol 23,842-6 (2003））。 簡単に述べれば、最初の二つのコホートにおいて、合計547名の患者には、ライセスターに所在の王立ライセスター診療所(1993年７月〜1994年４月)およびシェフィールドに所在の王立ハラムシャイア病院(1995年11月〜1997年３月)での冠動脈集中治療室(CCU)で治療を受け、かつ、兆候、心臓酵素の上昇、または心電図の変化の点で急性心筋梗塞に関する世界保健機構の基準（虚血性心臓病の診断についての命名法および基準。 国際心臓学会と世界保健機構の共同報告は、臨床的命名の標準化に影響を与える。 Circulation 59,607-9（1979))を満足した者を含む。 合計で530名の規制対象が、各病院、すなわち、成人の外来患者、そして、一般医療、外科、整形外科および産科病棟に入院している非-心血管病の患者から募られ、由来する集団の代表であると考えられる患者を研究に供した。 冠動脈心臓病の履歴を報告した対象は、除外した。
第三のコホートにおいて、203名が、ライセスターでの三つの冠動脈集中治療室の登録患者から遡及的に募った。 全員が50歳前で、世界保健機構基準に従って心筋梗塞に罹っていた。 参加の時点において、患者は、急性症状から少なくとも三ヶ月が経過していた。 健常者のコホートは、症例が、未成熟冠動脈心臓病の個人的または家族的な履歴がなく、年齢、性別、および現在の血縁状態が合致した180名より構成されていた。 規制対象は、同一地域内に所在する三つの主要なケアプラクティスから募った。 すべてのコホートでの対象は、北ヨーロッパ起源の白人であった。
考 察
これらの結果は、ＦＬＡＰをコードする遺伝子の変異体が、心筋梗塞および脳卒中の増大した危険性に関連することを示す。 アイスランドコホートにおいて、ＦＬＡＰ遺伝子に横たわるハプロタイプは、すべての心筋梗塞患者の30％が保有しており、心筋梗塞の２倍近い危険性である。 これらの知見は、引き続いて、脳卒中患者の独立したコホートにおいて再現された。 加えて、ＦＬＡＰ遺伝子に横たわるもう一つのハプロタイプは、英国コホートにおいて心筋梗塞と関連付けられる。 染色体13q12-13に対する示唆的連鎖が幾つかの異なる表現型で観察され、女性心筋梗塞、両性の初期開始心筋梗塞、および男性における虚血性発作またはＴＩＡを含めたいくつかの異なる表現型で観察された。 しかしながら、驚くべきことには、最も強いハプロタイプ関連は、心筋梗塞または脳卒中を有する男性において観察された。 従って、ＦＬＡＰ遺伝子内で、または連鎖領域内の他の遺伝子において、これらの心血管表現型に対してやはり危険性を付与し得るその他の変異体またはハプロタイプが存在し得る。
これらのデータは、ＦＬＡＰ遺伝子の危険なハプロタイプが、虚血性、ＴＩＡおよび出血性発作を含めた発作のすべての亜集団において増大した頻度を有することも示す。 興味を引く点として、Ａ４ハプロタイプが、末梢動脈閉塞疾患よりも、心筋梗塞および脳卒中に対して有意に高い危険性を付与することである。 これは、これらの疾患の病因の差異によって説明できよう。 脚足への血液の流れを徐々に減少させる原因であるアテローム性動脈硬化症病巣がために、虚血性脚を有する末梢動脈閉塞疾患患者とは異なり、心筋梗塞および脳卒中患者は、急性症状を罹っており、心臓および脳の領域への血液の流れを突然減少させる血管の破壊が伴う。
英国コホートにおいて、Ａ４ハプロタイプおよび心筋梗塞の間に関連性は見出されなかった。 しかしながら、心筋梗塞に対する有意な関連性は、ＦＬＡＰ遺伝子に認められる異なる変異体で見出された。 遺伝子の異なるハプロタイプは、第二集団での心筋梗塞に対して危険性を付与することが見出されるという事実は、驚くべきことではない。 心筋梗塞のような通常の病気は、多くの異なる突然変異または配列変動に関連し、変異体に関連するこれらの疾患の頻度は集団の間で異なり得る。 さらに、同一の突然変異が、ハプロタイプの由来に応じて異なることもある。
以上のことから、心筋梗塞が、ＦＬＡＰにおける遺伝的変動に相関し、また、心筋梗塞が、５-LOにおける高発現プロモーター多形に相関し、女性心筋梗塞危険性ＦＬＡＰハプロタイプを有する患者よりも高レベルの血清LTE4を有し、そして、LTE4のレベルが、血清中のCRPレベルと相関し、また、心筋梗塞危険性ＦＬＡＰハプロタイプを有する患者が、増大したCRPを有することが明らかとなった。 これらを考え合わせると、以上の結果は、増大したロイコトリエン合成が、心筋梗塞に対する危険因子であり、この危険性は、ＦＬＡＰおよび５-LO遺伝子における変異体によって部分的に駆動され、血清LTE4およびCRPのレベルの測定によって部分的に捉えられることを示す。 さらに、心筋梗塞に対する危険性を付与するＦＬＡＰ遺伝子でのＳＮＰハプロタイプは、脳卒中および／または末梢動脈閉塞疾患の危険性も付与する。
本願発明で利用されるマーカー
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 本明細書で引用した全文献の内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
好適な実施形態を参照しながら本願発明を説明してきたが、当業者であれば、特許請求の範囲の欄に示した本願発明の趣旨を逸脱せずに、その形態および詳細を多様に変更できることは容易に理解できるであろう。
実施例１０：無作為化されたプラセボ-制御交差臨床試験は、ＦＬＡＰの阻害によって、心筋梗塞の危険性のバイオマーカーを低下させたことを示す。
ＦＬＡＰを介する５-リポキシゲナーゼ経路は、動脈炎症の最も優れたケモカインメディエーターの一つであるロイコトリエンＢ４の生産に導く。 実施例７に記載の実験は、心筋梗塞患者が、健常者よりも多くのＬＴＢ4を生産することを示した。 よって、危険な変異体は、ロイコトリエン経路を上方制御するものと考えられる。 臨床試験を行うことで、心筋梗塞の素因であるＦＬＡＰにおいて遺伝的変化を有する患者は、ＦＬＡＰ阻害剤DG-031によって、ＦＬＡＰの阻害による恩恵を受けるであろうことが示された。 短期間の研究において、心筋梗塞の危険性に関連するバイオマーカーのレベルの変化は、心筋梗塞の危険性の変化の証拠として考えられる。
患者の集団
研究に参加したすべての患者は、心筋梗塞の履歴を有し、ＦＬＡＰおよび／またはＬＴＡ4ヒドロラーゼ遺伝子の特異的心筋梗塞-関連ハプロタイプの保有者であった（本願明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する米国特許出願第10/944,272号およびＰＣＴ出願第PCT/2004/030582号を参照されたい）。 募集プロセスは、心筋梗塞の遺伝学的研究にかねてから参加していた個体を含む（Helgadottir et al., Nat. Genet. 2004；36(3)：233-9, 2004）。 ＦＬＡＰとは別に、ＬＴＡ4ヒドロラーゼ遺伝子もまた、アイスランドにおいて心筋梗塞に対する有意な関連を示し、ＬＴＡ4ヒドロラーゼ遺伝子のベースラインmRNA発現は、健常者よりも心筋梗塞患者においてよく認められ、すなわち、ＦＬＡＰまたは、ＬＴＡ4ヒドロラーゼ遺伝子のいずれかの危険変異体を有する患者は、心筋梗塞を保持する危険性が大きい。 従って、ＦＬＡＰまたはＬＴＡ4ヒドロラーゼ危険性ハプロタイプのいずれかの保有者を募り、彼らのハプロタイプは、研究のために収集した血液試料に由来するDNAの分析によって確認した。
九つの単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)マーカーについて、遺伝子型の分類を行い、危険性ハプロタイプを規定した。 これらのSPマーカーを、以下の表２５に記載し、また、実施例１に詳述している。 ＦＬＡＰおよびＬＴＡ4ヒドロラーゼ遺伝子でのＳＮＰ遺伝子型の分類は、Helgadottir et al., 2004 March；36（3）：233-9に記載されたＳＮＰ-ベースのTaqmanプラットフォーム(ＡＢＩ)を用いて行った。 各個体が保有するハプロタイプは、Gretarsdottir et al., Nat Genet 35：131-8, 2003の記載に従って、プログラムNEMO(バージョン1.01)および902イン-ハウス集団対照を用いて見積もった。
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 応募者に対して、臨床試験のために、デコード ジェネティクス社（アイスランド国、レイキャビク)で既に収集された彼らの医学的および遺伝子的情報の使用を許可するよう求めた。 臨床的および遺伝子型的基準によって適格性があると同定された900名を超える患者の内、640名は、彼らの遺伝子的および医学的データの使用を許可する、彼らの署名が入った同意書を返送してきた。 ＦＬＡＰおよびＬＴＡ4ヒドロラーゼ遺伝子に関する遺伝子型を引き続いて再度確認し、ＦＬＡＰおよび／またはＬＴＡ4ヒドロラーゼ遺伝子に関する変異体を保有する者は、もし彼らが表２４に記載されたその他の包含基準をも満たし、排除基準のいずれも満たさないならば、研究に適格性であると判断した。 研究に参加する患者のベースラインの特徴を、表２７に記載する。 提出された同意書およびプロトコルを与えて参加したすべての患者は、アイスランドの国内生物倫理委員会によって承認された。
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 研究の実行
すべての研究参加者は、レイキャビクのメトロポリタン市街地またはその近郊に居住していた。 すべての研究参加者は、アイスランドの大学病院の外来患者として、あるいはプライベートクリニックにおいて指名された心臓学者によって追跡され、すべての患者は、心筋梗塞の遺伝学に関する研究に参加した。 患者たちが同意書を提出して後、現在の状態を含めた患者の心血管履歴についての共-罹患率、同時投薬および特別な所見を含めた、医学的および投薬履歴を明らかにした。 すべての研究参加者は、研究訪問(通院)に先立って、絶食させ、その投薬を受けさせなかった。 心臓学者は、全８回の通院時において患者を診察し、症例報告書をまとめた。 全員に対して採血を行い、その後に直ちに処理を施した。 バイオマーカー研究で用いたすべての血液検体は、採血から２時間以内に処理を施した。
研究薬物
研究適格性基準に適合した患者(191名の対象者)を登録し、三つの異なる用量-レベルグループに無作為に分割した。 (１) DG-031（250mg×１回/日）、対プラセボでの250mg/日の療法を実施する64名の患者、(２) DG-031（250mg×２回/日）対プラセボでの500mg/日の療法を実施する64名の患者、および(３) DG-031（250mg×３回/日）対プラセボでの750mg/日の療法を実施する63名の患者。 750mg/日の用量は、Bayer x 1005（現在のDG-031）に関する薬物開発プログラムの一部として、健康なボランティアおよび喘息患者について行った、以前の第１相〜第３相のヒト研究において許容されていた（Dahlen et al., Thorax 1997；52：342-7）。 すべての患者に、１日当たり３錠の錠剤を与えた。 ４週間にわたる各処置期間内に、２週間の洗浄期間を導入した。 プラセボ錠剤は、それらが活性な薬物成分を含有しない以外は、活性な錠剤と、形状、色彩、形態および味質が同一であった。 対象者に対して標準的なケアを行う以外に、対象者には、心臓学者によって処方されたすべての投薬および処置計画に沿って、登録に先駆けて、DG-031またはプラセボを投与した。 交差研究計画を、図９にまとめてある。 19名の初期段階での中止(主に旅行を理由とする不参加)のため、11名の人員を登録締切前に交代させた。 従って、合計で191名の対象者を登録し、172名は全８回の通院を終え、８名の患者は通院目標に達しなかった(4.4％)。 ３名の対象者は、初期段階で通院してこなかった。
データ解析、無作為化および統計学的検討
すべてのデータは、予め確立された解析計画に従って、かつ意図的処置によって解析した。 仮説を、0.05の両側名目有意性レベルにて検定した。 各研究アーム、ならびに(用量レベルが組み合わせられる)プールされたセットについて、一次分析に関して検討した。 これら各セットは、標準ＡＢ/ＢＡクロスオーバーデザインで表現され、効率性の一次分析において、治療期間の最後(４回目および７回目の通院)に、心筋梗塞危険性のバイオマーカーのレベルを一次応答変数として用いた。 DG-031およびプラセボ処置の間での差異は、バイオマーカーの各々に関して、別々に評価された一次結果であった。 処置効果は、変換されたデータが正常であるとの仮定の下で、適当に変換された応答変数に関する期間差に基づいて、２-サンプルｔ-検定を用いて検定した。 我々は、処置効果を、95％ＣＩでもってして、２-サンプルｔ-検定で認められた平均差の１/２として報告する。 繰越効果に関するプレ検定は、一次分析の一部として行わなかった。 繰越に関する検定を行い、一次分析の結果とは別に報告する。 一次分析において予備的に特定したように、プールされた二つの最高用量のセットに関する一次目的に対する10個のバイオマーカーに基づく単純なボンフェロニ調整を用いて、一次目的の結果を報告した。 報告された全ｐ値は、名目値である。
潜在的な季節要因を排除するために、ＢＡ(プラセボ/薬物)グループの測定と共にＡＢ(薬物/プラセボ）グループの測定を比較する２-サンプルｔ-検定で、繰越効果も検討した。 ＡＢグループでの三度目の通院時の薬物効果を見積もるために、ｖ３およびｖ２が、各々、三度目および二度目の通院時の測定値を表す(ｖ３-ｖ２)を用いた。 同様に、(ｖ４-ｖ２)および(ｖ５-ｖ２)を用いて、四度目および五度目の通院時における効果を見積もった。 六度目の通院時における効果を見積もるために、［(ｖ６-ｖ２)＋(ｖ３-ｖ２)］を用いた。 ＢＡグループでのｖ６は、ＡＢグループから三度目の通院時における薬物効果を控除した２週間後の薬物効果を含むことに注意されたい。 同様に、［(ｖ７-ｖ２)＋(ｖ４-ｖ２)］を用いて、七度目の通院時における効果を見積もった。 二つの高用量のＡＢグループを、すべての通院時に用いた。 三つのＢＡグループのすべてを、三度目、四度目および五度目の通院時に用いる。 これはすなわち、五度目の通院時までは、すべてが同一の処置を受けたことによるものであるが、二つの高用量のＢＡグループのみを、六度目および七度目の通院時に用いる。
この研究での試料の大きさは、その変数に関して、アッセイは２０％の変動係数を有し、また、変動の個人内係数は２５％と高いものと仮定して、三つのアームの各々が、５％に落ちるまでの後に、少なくとも８０％の検出力（α=0.05にて、両側）で、log-正常応答変数に関して１５％の相対的降下を検出するように選択した。 これらの仮定に基づいて、募集標的は、前述したような三つの異なる用量-レベルのグループへ無作為化した180名の対象者を含んでいた。
登録訪問では、薬物の内容を知らされていない個別の研究職看護師が、コンピューターで無作為化して作成したリストに従って投薬キットを分配した。 研究患者の無作為化は、性別に従って層別化した。 双方の層に関して、並び替えを行ったブロックサイズ１２のブロックデザインを用いて、患者を六つの研究班の各々に割り当てた。 すべてのバイオマーカーは、シフトされたlog変換を用いて変換した(変換された値は、各アッセイに関する当初の値＋シフト定数の自然対数である）。 足りないデータは、単純な最後の観察キャリドフォワード(LOCF)スキームを用いて充足して、従前に測定を行っていない場合には、次の観察データを繰り戻しした。 データセットについての統計学的異常値は、中央値からのＩＲＱ距離に基づいて得た。
バイオマーカーの測定
ELISAおよび質量分析アッセイを用いて、心筋梗塞危険バイオマーカーのレベルを測定し、その測定結果を、表２８にまとめてある。 血漿の測定とは別に、ELISAおよび質量分析法を用いて、白血球のイオノマイシン-活性化に続いて、ex vivoにて全血調製物で、ＬＴＢ4およびミエロペルオキシダーゼも測定した。 用量-依存性刺激および時間-依存性刺激の双方を行って、細胞の最大ＬＴＢ4およびミエロペルオキシダーゼ検出力を測定した。 これらメディエーターの生成量は、固定した用量における細胞の数に関連するので、白血球細胞計測数に関して修正を行った。 対数スケールでの調整は、ブラインドレビューの時点で経験的に決定された係数を用いて、直線モデルに基づくものであった。 IL-６、IL-12p40、TNFα、MMP-９、sICAM、sVCAM、Ｐ-セレクチン、Ｅ-セレクチン、MCP-１および酸化されたLDLを含めた幾つかの三次マーカーについても測定を行った。
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 臨床結果
処置前のバイオマーカー変数に関するベースライン値を、表２９に示す。 一次効率終点に関して、統計学的分析計画に記載したように、10の変数を、500mgおよび750mgアームに関して対象となるプールされたセットにおいて検討し、そのデータを、表３０に示す。
研究の一次効率終点は、DG-031が、500mgおよび750mgアーム(名目のｐ=0.0042)でのプールされたセットでのin vivoでのイオノマイシン-活性化好中球に起因するＬＴＢ4レベルの低下によって確認し、このレベル低下は、多重検定で修正した後において統計学的に有意である。 表３０に示すように、ＬＴＢ4およびミエロペルオキシダーゼ生産の最大低下は、750mg/日の用量のDG-031において、ＬＴＢ4では26％(名目のｐ=0.0026)、そして、ミエロペルオキシダーゼでは13％(名目のｐ=0.023)に達した。 また、DG-031は、血清sICAM-１を有意に低下させた(名目のｐ=0.02)が、その他の三次マーカーでは、効果は観察されなかった。 Lp-PLA2は、最高用量のDG-031に応答して９％だけ増加し(名目のｐ=0.0056）、Lp-PLA2に相関したLDLコレステロール(８％)で観察されたのと匹敵する増大が認められた。 対照的に、Lp-PLA2に対する二つの低用量(250mg/日および500mg/日)の効果は、有意ではなかった。 LTE4の尿中レベルは、最大用量のDG-031に応答して27％だけ増加した(名目のｐ=0.00002）。 DG-031に応答したＬＴＢ4およびミエロペルオキシダーゼ生産の阻害の間で、有意な相関が観察された(ｒ＝0.65、ｐ＜0.00001）。
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 繰越効果についての検定
プラセボ相に対する処理相からの繰越効果についての検定は、薬物およびプラセボの各々についての患者の二度目の通院時と五度目通院時との間の差異に関する２-サンプルｔ-検定として行った。 薬物を摂取するコホートは、500mg/日および750mg/日の処理を行う患者から構成されており、プラセボコホートは、三つのすべてのトラックをプラセボ処理した患者を含む。 効果に対して得られたｐ-値および信頼区間を、表３１に記載している(Lp-PLA2およびＡ-チロシンでは、データは入手できなかった）。 繰越効果は、ＬＴＢ4およびミエロペルオキシダーゼでは観察されなかった。 対照的に、顕著な繰越効果が、５％レベルで有意であった(ｐ=0.017)ＣＲＰの低下を伴い、ＣＲＰおよびＳＡＡで観察された。 ＳＡＡは、この有意なレベルよりわずかに低い同様な繰越効果を示した(ｐ=0.051）。
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 図10は、第一の期間にて、高用量の二つの薬物を投与される動物でのＣＲＰおよびＳＡＡに対して見積もった平均効果を示すものである。 まず、プラセボを投与される動物での測定値は、これら見積もりに関与して、潜在的季節効果を控除してしまうことに注意されたい。 三度目の通院時(治療を開始して２週間後)および四度目の通院時(治療を開始して４週間後)にあっては、治療効果が反映されており、他方で、繰越効果が、五度目の通院時〜七度目の通院時に出現する。
ＣＲＰのレベルは、三度目および四度目の通院時において低下したが、有意ではなかった。 この低下は、五度目の通院時において約25％と顕著になり、かつ有意な数値になり(ｐ=0.017)、患者がプラセボを投与されている間は、七度目の通院時まで効果が継続すると思われる。 この延長効果は、この作用機序を考慮しなかった一次分析において、その薬物効果が検出されなかった理由の一つでもある。 この試験の設計は、特に、六度目および七度目の通院時において、見積もりでの大きな標準誤差を反映するそれら効果を突き止めるための最大検出力も備えていない。 三度目および六度目の通院時での測定は、ＳＳＡでは利用できないにもかかわらず、二度目および五度目の通院時の間でのＳＲＰおよびアミロイドＡに関して認められた変化とは密接に相関している(ｒ＝0.68、ｐ＜0.00001）。 よって、これら薬物は、双方のバイオマーカーに対して同様な効果を有するものと思料される。
データを別々に分析した場合、ＦＬＡＰまたはＬＴＡ4ヒドロラーゼハプロタイプを保有する患者の間での心筋梗塞危険性のバイオマーカーに対するDG-031の効果において、差異は検出されなかった。
研究コホートにおける処理グループまたは用量アームの間に、顕著な有害事象の差異は認められなかった。 特に、活性薬物またはプラセボに関するグループ間では、肝臓トランスアミナーゼにおける差異は検出されなかった。 活性薬物について、有意でかつ頻繁に報告された唯一の兆候は眩暈であり、活性薬物(いずれの用量も)に対して６名の患者が経験し、プラセボでは誰も経験しなかった(ｐ=0.032）。 この現象は、患者の毎日の活動には影響を与えなかった。
以上を勘案すると、心筋梗塞遺伝子-単離(実施例１)を通じて得られたデータ、および本明細書で報告した臨床試験は、DG031が、少なくとも部分的には、LDLコレステロールの最初の１/５によって付与される危険性と同様、またはそれよりも大きな急性心血管障害の相対的危険性を与える生化学的欠陥を修正可能な、安全かつ許容可能な薬物であることを示す。 実際のところ、これらデータは、DG-031が、ほぼ25％だけＣＲＰおよびＳＡＡの血清レベルを低下させることを示唆し、このことが、急性心筋事象の危険性の低下を引き起こすことを示唆する。
実施例１１：心筋梗塞の危険性に関するバイオマーカーに対するロイコトリエン合成阻害剤およびスタチンを含む組成物の効果を調べる臨床試験
実施例10に記載したような無作為化したプラセボ-制御交差性臨床試験を行って、心筋梗塞の危険性に関するバイオマーカーのレベルに対するロイコトリエン合成阻害剤およびスタチンを含む組成物の効果を調べる。 研究参加者は、所望により、表２５に記載されたＦＬＡＰおよび／またはＬＴＡ4ヒドロラーゼ遺伝子の変異体の保有者とする。 ある参加者のグループは、DG031のようなロイコトリエン合成阻害剤だけの投与を受ける。 さらに他の参加者のグループは、スタチンだけの投与を受ける。 第三の参加者のグループは、ロイコトリエン合成阻害剤およびスタチンを共に含む組成物の投与を受ける。 第四の参加者のグループは、プラセボの投与を受ける。
各参加者は、少なくとも２ヶ月間にわたって処置を受け、表２８に記載のバイオマーカーのレベルを、少なくとも３ヶ月間にわたって各参加者でモニターする。 ロイコトリエン合成阻害剤だけの投与を受けるグループでは、ＣＲＰレベルが25％減少し、また、スタチンだけを投与されるグループでも、ＣＲＰレベルが25％減少すると予測される。 組合せ療法によるＣＲＰの実質的減少は、組合せ療法が有益である証拠である。 参加者のほとんどすべて(約85％)がスタチン療法を受けていた実施例10に記載の臨床試験でのデータを考慮すると、組合せ療法を受けるグループは、ＣＲＰレベルが50％減少すると予測される。
実施例１２：北アメリカ集団における心筋梗塞に対するALOX5AP/ＦＬＡＰをコードする遺伝子における変異体の関連性
実施例１に記載したように、５-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質(ALOX5AP/ＦＬＡＰ)をコードする遺伝子の変異体は、アイスランドでの心筋梗塞および脳卒中の双方に対して危険性を与える。 ALOX5AP内のもう一つのＳＮＰ-ベースのハプロタイプは、実施例９に記載した英国コホートにおける心筋梗塞に対して有意な関連性を示した。 同様な技術を用いて、北アメリカ(「クリーブランド」)コホートにおけるHapAおよびHapＢと心筋梗塞との間の関連性を分析した。
ALOX5APハプロタイプHapAもまた、北アメリカ集団において心筋梗塞に関連した。 HapＡ(SG13S25、SG13S114、SG13S89およびSG13S32)およびHapＢ(SG13S377、SG13S114、SG13S41およびSG13S35)を規定するＳＮＰを、６９６名の心筋梗塞患者(553名の男性および143名の女性)および698名の健常者(314名の男性および384名の女性)において、遺伝子型の分類を行った。 研究対象の大部分は白人であり、ほぼ10％がアフリカ系アメリカ人であった。 個々のレベルにおける民族性についての情報は、入手できなかった。
プログラムNEMOを用いて、ＳＮＰハプロタイプ分析を行った（Gretarsdottir et al., Nat Genet 35：131-8, 2003）。 NEMOは、ハプロタイプ頻度を見積もるための計算手段として予測-最大化アルゴリズムを利用して、尤度手法を介して、欠落している遺伝子型および相での不確実性を処理する。 危険性ハプロタイプについて、我々は、ハプロタイプの二つの対立遺伝子の危険性を、個人が多重に運ぶ乗法的モデルを仮定して相対的危険性(RR)を計算した(Falk & Rubinstein P Ann Hum Genet 51 (Pt ３)：227-33, 1987：Terwilliger & Ott Hum Hered. 42：337-46, 1992）。
HapＡおよびHapＢに関するハプロタイプ関連分析の結果を、表32に示す。 アイスランド集団において示されたように(実施例１参照）、HapＡで見積もられた頻度は、対照グループでの患者集団において有意に大きかった。 全コホートでは、HapＡの対立遺伝子/ハプロタイプ頻度は、患者および健常者において、それぞれ16.9％および13.6％であり(ｐ=0.014）、これは、保有しているHapＡの各コピーに関する心筋梗塞の危険性の29％増大分に対応する。 全グループでの心筋梗塞の相対的危険性は、1.29であり、また、関連性に対するＰ-値は0.014であった。 加えて、HapＡは、人生の比較的初期(55歳前の男性、65歳前の女性)において心筋梗塞を経験した患者で過剰表現された。 表３２に示すように、初期開始心筋梗塞(55歳前の男性および65歳前の女性)の相対的危険性は、1.61でり、関連に対性するＰ-値は0.0034であった。
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 研究に用いたコホートでの心筋梗塞に対するHapＢの関連も調べた。 HapＢは、イングランドコホートにおいて、心筋梗塞の危険性を与えることがすでに判明している（実施例９参照）。 すべての健常者(７.４％)と比較して、わずかに過剰なHapＢが、全患者グループ(８.１％)で観察されたが、有意ではなかった(表３２）。
この分析は、アイスランドコホートにおいて心筋梗塞および脳卒中の危険性を与えることがすでに報告されており(実施例１)、また、(以下の実施例14に記載する)スコットランドコホートにおいて脳卒中の危険性も指摘されているALOX5APハプロタイプ、HapＡが、北アメリカ集団において心筋梗塞に関連することを実証している。 英国コホートにおいて心筋梗塞の危険性を与えるHapＢ（実施例９）は、この北アメリカコホートにおいて心筋梗塞とは関連していなかった。
実施例１３：北アメリカ集団で心筋梗塞と関連したその他のALOX5AP/ＦＬＡＰハプロタイプ
実施例１２に記載のクリーブランドコホートを分析することで、心筋梗塞に有意に関連したもう一つのハプロタイプが同定された。 このハプロタイプは、HapＣと表現され、このハプロタイプの五つの変異体が同定された(HapＣ１、HapＣ２、HapＣ３、HapＣ４-Ａ、HapＣ４-Ｂ）。 これらのハプロタイプは、クリーブランドコホートにおいて、心筋梗塞に対して最も有意な関連性を示す。
これらのハプロタイプを、表33に示す。 HapＣ１は、マーカーSG13S375のＴ対立遺伝子である。 HapＣ２は、マーカーSG13S375のＴ対立遺伝子およびSG13S25のＧ対立遺伝子を有する。 HapＣ３は、SG13S32の対立遺伝子Ａ＋マーカーSG13S375のＴ対立遺伝子、およびSG13S25のＧ対立遺伝子を加える。 四番目のＳＮＰまたはSG13S106の付加は、HapＣ３を二つの部分、またはHapＣ４-ＡおよびHapＣ４-Ｂに分ける。 HapＣ2、HapＣ3、HapＣ4-AおよびHapＣ4-BでのＳＮＰ SG13S25の対立遺伝子Ｇもまた、HapＡの特徴である。
異なる集団でのHapＣ1、HapＣ2、HapＣ3およびHapＣ4-Aおよび4-Bの頻度を、表３３に示す。 HapＣ1、HapＣ2およびHapＣ3は、試験したすべての集団において、患者グループで過剰に表現される。 試験したアイスランドおよび英国コホートにおいて、HapＣ3のHapＣ4-A部分は、HapＣ3によって付与された危険性のすべてを捉えるものと考えられる。
HapＣ4-Bを除いたすべてのHapＣ変異体は、HapＡに相関し、このことは、HapＣを保有する染色体もまた、HapＡを保有する傾向があることを示す。 HapＣ4-AおよびHapＡの間の相関は、0.52の相関係数(Ｒ２)によって規定され、0.77の連鎖非平衡(Ｄ')および6.4×10-312のＰ-値(有意性の尺度)であった。 HapＡおよびHapＢは、負に相関するが、HapＣもまたHapＢに相関する。 HapＣ4-AおよびHapＢハプロタイプの間の相関は、0.08の相関係数(Ｒ２)によって規定され、0.05の連鎖非平衡(Ｄ')および2.2×10-39のＰ-値であった。
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 実施例１４：スコットランド集団における脳卒中に対するALOX5AP/ＦＬＡＰをコードする遺伝子の変異体との関連性
HapＡおよびHapＢハプロタイプの分析を、実施例１および９に記載した手順のようにして、スコットランドコホートにおいて行った。 HapＡ(SG13S25、SG13S114、SG13S89およびSG13S32)およびHapＢ(SG13S377、SG13S114、SG13S41およびSG13S35)を規定するＳＮＰを用いて、450名のスコットランド脳卒中患者および710名の健常者で遺伝子型の分類を行った。 患者および健常者コホートについては、すでに文献で開示されている（MacLeod et al., Neurology 53：418-20, 1999；Meiklejohn et al., Stroke 32：57-62, 2001；Duthie et al., Am J Clin.Nutr.75：908-13, 2002；Whalley et al., Am J Clin.Nutr., 2004）。 簡単に述べれば、（26名の一過性虚血性発作(TIA)の患者を含めた)虚血性発作のCT確認がされた北東スコットランド由来の450名の患者を、1997年および1999年の間に、王立アバジーン診療所の急性脳卒中処置室の許可の下で一週間以内に募った。 患者は、TOAST研究基準に従って、さらに小さく分類した(Adams et al., Stroke 24：5-41, 1993）。 155名の患者(34％)は、大血管脳卒中を患っており、96名(21.3％)は心臓性脳卒中を患っており、また、109名(24.2％)は小血管脳卒中を患っていた。 五つの症例(1.1％)において、他で決定された病因を持つ脳卒中が診断され、７名（1.5％）は一つを超える病因を有し、また、78名(17.3％)は、広範に評価を行ったにもかかわらず脳卒中の未知の原因を有していた。 脳卒中またはTIAの履歴を有していない710名の健常者を、1921年(ｎ=227)および1936年(ｎ=371)のアバジーン出生コホート研究の一部として（Duthie et al., Am.J.Clin.Nutr.75：908-13, 2002；Whalley et al., Am J Clin.Nutr., 2004）、また、一次ケア(ｎ=112)(Meiklejohn et al., Stroke 32：57-62, 2001)から募集した。
プログラムNEMOを用いて、ＳＮＰハプロタイプ分析を行った（Gretarsdottir et al., Nat Genet 35：131-8（2003）。 NEMOは、ハプロタイプ頻度を見積もるための計算手段として予測-最大化アルゴリズムを利用して、尤度手法を介して、欠落している遺伝子型および相での不確実性を処理する。 試験した二つのハプロタイプは、アイスランドコホートにおいて心筋梗塞、およびイングランドコホートにおいて心筋梗塞の危険性を与えることがすでに知られているので、報告されたＰ-値は片側である。 危険性ハプロタイプでは、我々は、ハプロタイプの二つの対立遺伝子の危険性を個人が多重に運ぶ乗法モデル(Falk & Rubinstein P Ann Hum Genet 51 (Pt 3)：227-33, 1987：Terwilliger & Ott Hum Hered：42：337-46, 1992)を仮定して、相対的危険性(ＲＲ)を計算した。
HapＡおよびHapＢに関するハプロタイプ関連分析の結果を、表３４に示す。 スコットランド脳卒中および健常者集団におけるHapＡのハプロタイプ頻度は、対応するアイスランド集団にでの頻度よりも高かった。 アイスランド集団において実証されたように、見積もられたHapＡの頻度は、スコットランド健常者における頻度よりも、スコットランド脳卒中患者での頻度の方が有意に高かった。 スコットランド患者および健常者におけるHapＡの保有頻度は、各々、33.4％および26.4％であり、つまり、1.36の相対的危険性(Ｐ=0.007)と対応するPAR9.6％が得られた。 アイスランド集団では、脳卒中または心筋梗塞のいずれかを患った女性患者と比較した場合に、男性患者で、HapＡが高頻度で観察された。 性別に基づくHapＡの頻度差は、スコットランド集団では観察されなかった。
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 スコットランドコホートでの脳卒中に対するHapＢの関連も調べた。 HapＢは、イングランドコホートにおいて心筋梗塞の危険性を付与することがすでに知られている(実施例９）。 健常者(５.８％)と比較して、わずかに過剰のHapＢが患者グループ(６.８％)で観察されたが、それは有意ではなかった(表３４）。 しかしながら、性別特異的分析は、HapＢの頻度が、健常者での頻度よりも、虚血性発作を有する男性(９.２％)において高いことを示し、ＲＲは、1.65であった(Ｐ=0.016)。 虚血性発作を有する女性でのHapＢの頻度は、3.5％であり、この数値自体は小さかったが、健常者と有意に異なるものではなかった。 虚血性発作を有する男性および女性でのHapＢの頻度は、有意に異なっていた(Ｐ=0.0021）。 表３４に示したように、同様な傾向が、我々のアイスランドコホートで観察されており、HapＢの頻度は、虚血性発作を有する女性(５.８％)よりも、虚血性発作を有する男性(８.６％)において大きかったが、この差異は有意ではなかった(Ｐ=0.055)。
従って、HapＡ、ALOX5APの危険性ハプロタイプは、スコットランドコホートでの虚血性発作に関連する。 HapＢは、スコットランドコホートでの虚血性発作に関連していなかった。 しかしながら、HapＢが、男性患者において認められる比率は大きかった。
437名の女性心筋梗塞患者と721名の健常者に関して、被験ハプロタイプを検証するために、四つまたは５つのマイクロサテライトマーカーを組み合わせて用いて、ハプロタイプ関連症例と健常者との間で行った分析結果を示している。 関連性のｐ値をＹ軸に、また、マーカーの位置をＸ軸にプロットした。 ｐ値＜10-5の関連性を示したハプロタイプのみを、図中に記載した。 マーカーDG13S1103、DG13S166、DG13S1287、DG13S1061およびDG13S301と、４、０、２、14および３の各対立遺伝子との組み合わせにおいて（ｐ値＝１.０２×10-7）、マイクロサテライトマーカーに対して最も顕著なハプロタイプ関連性が認められた。 女性心筋梗塞患者でのハプロタイプの保有率が７.３％であるのに対して、健常者では０.３％に過ぎない。 この図で示したすべてのハプロタイプに共通しているセグメントは、ＦＬＡＰ遺伝子のみである。 最も顕著なマイクロサテライトマーカーハプロタイプを示すマーカーの対立遺伝子を示す。 黒四角で示したセグメントは、最も顕著に関連するハプロタイプのすべてに共通している。 ＦＬＡＰ核酸は、マーカーＤＧ１３Ｓ１６６とＤ１３Ｓ１２３８との間に位置する。 マーカーＤＧ１３Ｓ１６６およびＤ１３Ｓ１２３８のそれぞれに対応する対立遺伝子０および-２を含む二つのマーカーハプロタイプは、患者において過剰量で認められる。 このハプロタイプの保有頻度は、患者において２７％であり、健常者において１５.４％である(ｐ値 １×10-3)。 それ故に、関連性分析は、出現ピーク内で最も強く心筋梗塞と関連する遺伝子が、ＦＬＡＰであることを証明している。 主要なＳＮＰおよびＡＬＯＸ５ＡＰ/ＦＬＡＰ遺伝子での(縦型長方形で示した)エキソンの相対的位置を示す図である。 ハプロタイプの長さは、３３〜６８ｋｂの間で変動する。 血清ＬＴＥ４レベルと血清ＣＲＰレベルとの間の顕著な正の相関を示すグラフである。 心筋梗塞患者(41名)と健常者(35名)から得た好中球をイオノマイシンで刺激して出現したＬＴＢ4生産を示している。 刺激した細胞に関して、15分および30分の時点で測定した対数変換値(平均値＋標準偏差)を示している。 (7.1) 心筋梗塞患者と健常者でのＬＴＢ4生産。 患者と健常者との間での平均値の差異が、対数変換値の二標本ｔ検定を用いて検定されている。 (7.2) ハプロタイプＡ４の男性心筋梗塞患者と健常者でのＬＴＢ4生産。 健常者での平均値を、比較のために用いる。 ハプロタイプＡ４の男性患者が、最高量のＬＴＢ4を生産していることに注目されたい（健常者との比較で、ｐ値＜０.００５）。 (7.3) ロイコトリエン生物学的活性産物をもたらす５-リポキシゲナーゼ経路の概略図。 ＦＬＡＰ遺伝子を示す第13染色体連鎖領域の概略図である。 (9.1) 女性心筋梗塞患者とＦＬＡＰ遺伝子を含んだある一つのＬＯＤドロップ領域の連鎖性の調査。 (9.2) すべての心筋梗塞患者に関するマイクロサテライト関連性、単一のマーカー関連性および二つ、三つ、四つおよび五つのマーカーハプロタイプ関連性。 矢印は、男性および女性において、ＦＬＡＰ遺伝子の中でも最も顕著なハプロタイプ関連度が認められる位置である。 (9.3)ＦＬＡＰ遺伝子の構造であって、エクソンをシリンダーとして表現しており、そして、その領域で分類したすべてのＳＮＰの位置を示している（垂直線）。 この垂直線は、分析に用いた(9.2に記載の)マイクロサテライトと(9.3に記載の)ＳＮＰの位置を示している。 虚血性脳卒中または一過性脳虚血発作（６度の減数分裂を経た１６４家族の３４２名）に罹患した男性患者の第13染色体に関する、フレームワークマイクロサテライトマーカーを用いた連鎖性の調査。 ＬＯＤスコアをＹ軸に記し、また、コサンビのpterからの距離(cM)をＸ軸に記している。 ＦＬＡＰを含む60kb領域でのＳＮＰ相互間の一対連鎖不平衡(ＬＤ)である。 これらマーカーは、等距離的に記録した。 二つのＬＤ値、すなわち、左上半分の三角部にＤ'値を、また、右下半分の三角部にＰ値を記録した。 引出太線は、ＦＬＡＰ内のエクソンの位置を、また、星印は、危険要素ハプロタイプＡ４のマーカーの位置を示している。 それぞれのＬＤ強度の尺度は、図中の右側に設けてある。 臨床試験スケジュールの概略を示している。 この図は、患者が２度目の通院に訪れた時（試験の１日目）に、三つの集団のいずれかに無作為に振り分けて、そして、偽薬または薬剤を各自の腕に投与する。 ２週間の養生期間の前後に、４週間の処置期間が設けられている。 ６週間目に、集団の振り分けを改めて行った。 Ｃ反応性タンパク質および血清アミロイドＡに関する繰越効果を分析した結果（対数目盛）を示している。

Claims (84)

  1. 心筋梗塞(ＭＩ)の予防的治療法であって、以下の工程、すなわち；
    心筋梗塞に罹病しやすいヒトを選択し、
    in vivoでのロイコトリエン合成を阻害する治療上有効量の心筋梗塞治療剤、すなわち、５-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質(ＦＬＡＰ)および５-リポキシゲナーゼ(５-ＬＯ)から選択された少なくとも一つのタンパク質の活性を阻害することでロイコトリエン合成を阻害する心筋梗塞治療剤を含む組成物をヒトに投与し、および
    予防的処置を行う以前および最中のヒト、すなわち、ミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)レベルを効果的に低下させる量の心筋梗塞治療剤が投与されたヒトでのＭＰＯレベルをモニターする、
    工程を含む心筋梗塞の予防的治療法。
  2. 予防的治療を行う以前および最中のヒトでの少なくとも一つのその他の炎症マーカーをモニターする工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
  3. 前記炎症マーカーが、Ｃ-反応性タンパク質である請求項２に記載の方法。
  4. 予防的処置を行う以前および最中のヒト、すなわち、ロイコトリエンレベルを効果的に低下させる量の心筋梗塞治療剤が投与されたヒトでの血清、血漿または尿に含まれるロイコトリエンのレベルをモニターする工程をさらに含む請求項１、２または３に記載の方法。
  5. 前記モニター工程が、ヒトから採取した血液試料でのロイコトリエン生成をex vivoで分析する請求項１、２または３に記載の方法。
  6. ロイコトリエン生成の分析に先駆けて、血液試料をカルシウムイオン透過担体で刺激する請求項５に記載の方法。
  7. 前記心筋梗塞治療剤が、ＦＬＡＰ活性を阻害し、かつ、ＦＬＡＰポリペプチド活性を効果的に阻害させる量の前記組成物が、ヒトに投与される請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記組成物が、生理学的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含む請求項７に記載の方法。
  9. 前記心筋梗塞治療剤が、以下の式、すなわち；
    Figure 2007538003
     で表される化合物であり、式中、Ｒ1が、以下の式、すなわち；
    Figure 2007538003
     で表される基であり、Ｒ2およびＲ3が、互いに同一または相違しており、かつ、水素、低級アルキル基、フェニル基、ベンジル基または以下の式、すなわち；
    Figure 2007538003
    Figure 2007538003
     で表される基であり、Ｒ4が、ヒドロキシル基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルキルチオ基、ヘテロアリール基またはカルバモイル基で任意に置換することができる、水素、低級アルキル基、フェニル基またはベンジル基であり、Ｒ5が、水素、低級アルキル基、フェニル基またはベンジル基であり、Ｒ6が、-ＣＯＲ5または-ＣＯ2Ｒ5の式で表される基であり、Ｒ7が、水素、低級アルキル基またはフェニル基であり、Ｙが、以下の式、すなわち；
    Figure 2007538003
     で表される基であり、式中、Ｒ8が、水素、低級アルキル基またはフェニル基であり、ｎが、０〜５の数字であり、Ｚが、ノルボルニル基または以下の式、すなわち；
    Figure 2007538003
     で表される基であり、式中、Ｒ9およびＲ10が、互いに同一または相違しており、かつ、水素、低級アルキル基またはフェニル基であり、あるいは、Ｒ9およびＲ10が合同して、６個までの炭素原子を有する飽和した炭素環式構造を形成し、ｍが、１〜６の数字であり、そして、ＡおよびＢが、互いに同一または相違しており、かつ、水素、低級アルキル基またはハロゲン、あるいは薬学的に許容可能なそれらの塩である、式で表される化合物または薬学的に許容可能なその塩を含む請求項７または８に記載の方法。
  10. 前記心筋梗塞治療剤が、２-[４-(キノリン-２-イル-メトキシ)フェニル]-２-シクロペンチル酢酸、２-[４-(キノリン-２-イル-メトキシ)フェニル]-２-シクロヘキシル酢酸、および２-[４-(キノリン-２-イル-メトキシ)フェニル]-２-シクロヘプチル酢酸、２-[４-(キノリン-２-イル-メトキシ)フェニル]-２-シクロペンチル酢酸の(＋)-鏡像異性体、(キノリン-２-イル-メトキシ)フェニル]-２-シクロペンチル酢酸の(−)-鏡像異性体、および薬学的に許容可能なそれらの塩類からなるグループから選択される化合物を含む請求項７または８に記載の方法。
  11. 前記心筋梗塞治療剤が、ＢＡＹ-Ｘ-１００５または生理学的に許容可能なその塩、製剤またはプロドラッグを含む請求項７または８に記載の組成物。
  12. 前記心筋梗塞治療剤が、動物のロイコトリエンレベルを、ヒトでのロイコトリエンレベルの平均値に満たないレベルにまで効果的に低下させる量で投与される請求項１乃至１１のいずれかに記載の方法。
  13. 前記選択工程が、Ｃ-反応性タンパク質(ＣＲＰ)、血清アミロイドＡ、フィブリノーゲン、インターロイキン-６、腫瘍壊死因子-α(ＴＮＦ-α)、可溶性脈管細胞接着性分子(ｓＶＣＡＭ)、可溶性脈管間接着性分子(ｓＩＣＡＭ)、Ｅ-セレクチン、１型マトリックスメタロプロテアーゼ、２型マトリックスメタロプロテアーゼ、３型マトリックスメタロプロテアーゼ、９型マトリックスメタロプロテアーゼ、ミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)、およびＮ-チロシンからなるグループから選択された少なくとも一つの炎症マーカーの分析値の増大に基づいて罹患しやすいヒトを選択する工程を含む請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法。
  14. 前記心筋梗塞治療剤が、少なくとも一つの炎症マーカーに関する増大した血清レベルを低下させる量で投与される請求項１３または１４に記載の方法。
  15. ヒトから採取した血清を分析する請求項１３に記載の方法。
  16. ミエロペルオキシダーゼを分析する請求項１３乃至１５のいずれかに記載の方法。
  17. 前記選択工程が、喫煙歴または喫煙者、糖尿病、高血圧、200mg/dlを超える全血清コレステロール値、血清ＬＤＬコレステロールの増大、血清ＨＤＬコレステロールの減少、Ｃ-反応性タンパク質(ＣＲＰ)の増大、血清アミロイドＡの増大、高コレステロール血症、トリグリセリドの増大、lp(a)の増大、肥満、急性冠状動脈症候群(ＡＣＳ)、狭心症、アテローム性動脈硬化、０.９未満の足関節上腕血圧比、一過性脳虚血発作、一過性単眼視覚消失症、無症候性頸動脈狭窄症、跛行、壊疽や潰瘍の形成または切断手術の必要性が認められる虚血肢、冠動脈血流を手術やステントおよび血管形成術からなるグループから選択される少なくとも一つの家族系または既往系の危険要素を有するヒトの選択を含む請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法。
  18. 前記選択工程が、ロイコトリエンまたはロイコトリエン代謝産物に関する分析値が増大しているヒトの選択を含む請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法。
  19. 前記選択工程が、ヒトから採取した生物学的試料に含まれるロイコトリエン、すなわち、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、ＬＴＢ４およびＬＴＥ４からなるグループから選択されるロイコトリエンまたはロイコトリエン代謝産物に関する分析値が増大しているヒトの選択を含む請求項１８に記載の方法。
  20. 前記選択工程が、ヒトから採取した血清、血漿または尿に含まれるロイコトリエンＥ４(ＬＴＥ４)に関する分析値が増大しているヒトの選択を含む請求項１８または１９に記載の方法。
  21. 前記選択工程が、ヒトから採取した血液に含まれるロイコトリエンに関する分析値が増大しているヒトの選択を含む請求項１８または１９に記載の方法。
  22. ロイコトリエンの分析に先駆けて、血中でのロイコトリエン生成をカルシウムイオン透過担体で刺激する請求項２１に記載の方法。
  23. 前記選択工程が、ヒトでのＦＬＡＰの遺伝子型またはハプロタイプを決定し、および、心筋梗塞の重大な危険度とも相関するＦＬＡＰの遺伝子型またはハプロタイプを用いて、処置するヒトを選択する工程を含む請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法。
  24. 前記選択工程が、心筋梗塞の罹病性とも相関する少なくとも一つの５-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質(ＦＬＡＰ)多形性の有無に関して、ヒトの核酸を分析する工程を含む請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法。
  25. 前記選択工程が、血清ＣＲＰまたはＭＰＯを分析し、および、少なくとも一つのＦＬＡＰ遺伝子型、ハプロタイプまたは多形性の有無、そして、血清ＣＲＰまたはＭＰＯの増大の有無に基づいてヒトを選択する工程をさらに含む請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 前記選択工程が、
    SG13S377(配列番号：１、第169965位)、対立遺伝子Ａ；
    SG13S114(配列番号：１、第178096位)、対立遺伝子Ａ；
    SG13S41 (配列番号：１、第202045位)、対立遺伝子Ａ；および
    SG13S35 (配列番号：１、第206117位)、対立遺伝子Ｇ、
    を含むＦＬＡＰ(配列番号：１)ハプロタイプを有するヒトを選択する工程を含む請求項２３のいずれかに記載の方法。
  27. 前記ＦＬＡＰ(配列番号：１)多形性が、SG13S375(配列番号：１、第164874位)、対立遺伝子Ｔをさらに含む請求項２６に記載の方法。
  28. マーカーSG13S106(SNP DGOOAAHII)(配列番号：１、第176579位)、対立遺伝子Ｇをさらに含んだハプロタイプの存在が、心筋梗塞の罹病性を有するヒトを同定する請求項２６または２７に記載の方法。
  29. SG13S106(SNP DGOOAAHII)(配列番号：１、第176579位)、対立遺伝子Ｇ、SG13S30(配列番号：１、第193840位)、対立遺伝子Ｇ、およびSG13S42(配列番号：１、第203877位)、対立遺伝子Ａのマーカーをさらに含んだハプロタイプの存在が、心筋梗塞の罹病性を有するヒトを同定する請求項２６または２７に記載の方法。
  30. 心筋梗塞(ＭＩ)の予防的治療法であって、以下の工程、すなわち；
    SG13S375(配列番号：１、第164874位)、対立遺伝子Ｔを含むＦＬＡＰ(配列番号：１)ハプロタイプを有するヒトを選択し、
    in vivoでのロイコトリエン合成を阻害する治療上有効量の心筋梗塞治療剤、すなわち、ロイコトリエン合成を阻害する心筋梗塞治療剤を含む組成物をヒトに投与し、および
    予防的処置を行う以前および最中のヒト、すなわち、ミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)レベルを効果的に低下させる量の心筋梗塞治療剤が投与されたヒトでのＭＰＯレベルをモニターする、
    工程を含む心筋梗塞の予防的治療法。
  31. 前記選択工程が、
    SG13S25 (配列番号：１、第165553位)、対立遺伝子Ｇ；
    SG13S32 (配列番号：１、第176579位)、対立遺伝子Ａ；および
    SG13S106(配列番号：１、第198547位)、対立遺伝子ＧまたはＡ
    をさらに含むＦＬＡＰ(配列番号：１)ハプロタイプを有するヒトを選択する工程を含む請求項３０に記載の方法。
  32. SG13S25(配列番号：１、第165553位)、対立遺伝子Ｇ;
    SG13S99(DGOOAAFIU)、対立遺伝子Ｔ(配列番号：１、第138551位)；
    SG13S377(DGOOAAJFF)(配列番号：１、第169965位)、対立遺伝子Ｇ；
    SG13S106 [SNP DGOOAAHII](配列番号：１、第176579位)、対立遺伝子Ｇ；
    SG13S32(配列番号：１、第198547位)、対立遺伝子Ａ；および、
    SG13S35(配列番号：１、第206117位)、対立遺伝子Ｇ
    のマーカーをさらに含んだハプロタイプの存在が、心筋梗塞の罹病性を有するヒトを同定する請求項３０または３１のいずれかに記載の方法。
  33. SG13S377(配列番号：１、第169965位)、対立遺伝子Ａ；
    SG13S114(配列番号：１、第178096位)、対立遺伝子Ａ；
    SG13S41 (配列番号：１、第202045位)、対立遺伝子Ａ；および、
    SG13S35 (配列番号：１、第206117位)、対立遺伝子Ｇ
    のマーカーを含んだハプロタイプの存在が、心筋梗塞の罹病性を有するヒトを同定する請求項２３に記載の方法。
  34. SG13S375(配列番号：１、第164874位)、対立遺伝子Ｔ；
    SG13S25 (配列番号：１、第165553位)、対立遺伝子Ｇ；
    SG13S32 (配列番号：１、第176579位)、対立遺伝子Ａ；および、
    SG13S106(配列番号：１、第198547位)、対立遺伝子ＧまたはＡ
    のマーカーを含んだハプロタイプの存在が、心筋梗塞の罹病性を有するヒトを同定する請求項２３に記載の方法。
  35. SG13S375 (SNP DGOOAAJFC)(配列番号：１、第164874位)、対立遺伝子Ｔ；および、SG13S25 (配列番号：１、第165553位)、対立遺伝子Ｇのマーカーをさらに含んだハプロタイプの存在が、心筋梗塞の罹病性を有するヒトを同定する請求項３１乃至３４のいずれかに記載の方法。
  36. SG13S375 (SNP DGOOAAJFC)(配列番号：１、第164874位)、対立遺伝子Ｔ；および、SG13S25 (配列番号：１、第165553位)、対立遺伝子Ｇ、およびSG13S32 (配列番号：１、第198547位)のマーカーをさらに含んだハプロタイプの存在が、心筋梗塞の罹病性を有するヒトを同定する請求項３１乃至３４のいずれかに記載の方法。
  37. 心筋梗塞(ＭＩ)の予防的治療法であって、以下の工程、すなわち；
    SG13S37 (配列番号：１、第164874位)、対立遺伝子Ｔ；
    SG13S25 (配列番号：１、第165553位)、対立遺伝子Ｇ；
    SG13S32 (配列番号：１、第176579位)、対立遺伝子Ａ；および、
    SG13S106(配列番号：１、第198547206117位)、対立遺伝子ＧまたはＡ
    のマーカーを含んだＦＬＡＰハプロタイプの有無についてヒトの核酸を分析し、
    ＦＬＡＰハプロタイプが存在する核酸を有して、処置を要するヒトを選択し、
    in vivoでのロイコトリエン合成を阻害する治療上有効量の心筋梗塞治療剤、すなわち、ロイコトリエン合成を阻害する心筋梗塞治療剤を含む組成物をヒトに投与する、
    工程を含む心筋梗塞の予防的治療法。
  38. 予防的治療法を行う以前および最中のヒトでの少なくとも一つの炎症マーカーをモニターする工程を含む請求項３７に記載の方法。
  39. 前記炎症マーカーが、Ｃ-反応性タンパク質またはミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)である請求項３８に記載の方法。
  40. 予防的処置を行う以前および最中のヒト、すなわち、ロイコトリエンレベルを効果的に低下させる量の心筋梗塞治療剤が投与されたヒトでの血清、血漿または尿に含まれるロイコトリエンのレベルをモニターする工程をさらに含む請求項３８または３９に記載の方法。
  41. 前記モニター工程が、ヒトから採取した血液試料でのロイコトリエン生成をex vivoで分析する請求項４０に記載の方法。
  42. ロイコトリエン生成の分析に先駆けて、血液試料をカルシウムイオン透過担体で刺激する請求項４１に記載の方法。
  43. 前記心筋梗塞治療剤が、ＦＬＡＰ活性または５-リポキシゲナーゼ活性を阻害する請求項３７乃至４２のいずれかに記載の方法。
  44. 前記心筋梗塞治療剤が、以下の式、すなわち；
    Figure 2007538003
     で表される化合物であり、式中、Ｒ1が、以下の式、すなわち；
    Figure 2007538003
     で表される基であり、Ｒ2およびＲ3が、互いに同一または相違しており、かつ、水素、低級アルキル基、フェニル基、ベンジル基または以下の式、すなわち；
    Figure 2007538003
    Figure 2007538003
     で表される基であり、Ｒ4が、ヒドロキシル基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルキルチオ基、ヘテロアリール基またはカルバモイル基で任意に置換することができる、水素、低級アルキル基、フェニル基またはベンジル基であり、Ｒ5が、水素、低級アルキル基、フェニル基またはベンジル基であり、Ｒ6が、-ＣＯＲ5または-ＣＯ2Ｒ5の式で表される基であり、Ｒ7が、水素、低級アルキル基またはフェニル基であり、Ｙが、以下の式、すなわち；
    Figure 2007538003
     で表される基であり、式中、Ｒ8が、水素、低級アルキル基またはフェニル基であり、ｎが、０〜５の数字であり、Ｚが、ノルボルニル基または以下の式、すなわち；
    Figure 2007538003
     で表される基であり、式中、Ｒ9およびＲ10が、互いに同一または相違しており、かつ、水素、低級アルキル基またはフェニル基であり、あるいは、Ｒ9およびＲ10が合同して、６個までの炭素原子を有する飽和した炭素環式構造を形成し、ｍが、１〜６の数字であり、そして、ＡおよびＢが、互いに同一または相違しており、かつ、水素、低級アルキル基またはハロゲン、あるいは薬学的に許容可能なそれらの塩である、式で表される化合物または薬学的に許容可能なその塩を含む請求項４３に記載の方法。
  45. 前記心筋梗塞治療剤が、動物のロイコトリエンレベルを、ヒトでのロイコトリエンレベルの平均値に満たないレベルにまで効果的に低下させる量で投与される請求項３７乃至４４のいずれかに記載の方法。
  46. 心筋梗塞(ＭＩ)の予防法であって、以下の工程、すなわち；
    in vivoでのロイコトリエン合成を阻害する治療上有効量の心筋梗塞治療剤を含む組成物を予防を必要とする動物に投与し、および
    予防的処置を行う以前および最中のヒト、すなわち、ミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)レベルを効果的に低下させる量の心筋梗塞治療剤が投与されたヒトでのＭＰＯレベルをモニターする、
    工程を含む心筋梗塞の予防法。
  47. 心筋梗塞が進行する危険度についてヒトをスクリーニングする方法であって、以下の工程、すなわち；
    ヒトから採取した血液試料とカルシウムイオン透過担体とを接触させて、ロイコトリエンの生成を刺激し、および
    接触工程を終えた後に、対照と比較して認められたロイコトリエン生成の増大と心筋梗塞(ＭＩ)が進行する危険度の増大とが相関する条件下で、当該血液試料でのロイコトリエンの生成を分析する、
    工程を含む心筋梗塞が進行する危険度についてヒトをスクリーニングする方法。
  48. 前記対照が、被験者と同じ性別のヒトから採取された血液、すなわち、カルシウムイオン透過担体で処理した血液でのロイコトリエンを分析する請求項４７に記載の方法。
  49. 前記対照が、被験者と同じ年齢のヒトから採取された血液、すなわち、カルシウムイオン透過担体で処理した血液でのロイコトリエンを分析する請求項４７に記載の方法。
  50. 前記血液試料が、単離された血液好中球を含む請求項４８または４９に記載の方法。
  51. 前記ロイコトリエンが、ＬＴＥ４，ＬＴＤ４およびＬＴＢ４から選択された少なくとも一つである請求項４７乃至５０のいずれかに記載の方法。
  52. 心筋梗塞が進行する危険度が高いと判断されたヒトに対して心筋梗塞治療剤、すなわち、５-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質(ＦＬＡＰ)および５-リポキシゲナーゼ(５-ＬＯ)から選択される少なくとも一つのタンパク質の活性を阻害することで、ロイコトリエン合成を阻害する心筋梗塞治療剤を予防的に投与する工程をさらに含む請求項４７乃至５１のいずれかに記載の方法。
  53. 少なくとも一つの心筋梗塞因子を有する個体において心筋梗塞が発症する危険度を低減させる方法であって、以下の工程、すなわち；
    治療上有効量の心筋梗塞治療剤、すなわち、５-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質(ＦＬＡＰ)および５-リポキシゲナーゼ(５-ＬＯ)から選択される少なくとも一つのタンパク質の活性を阻害することで、ロイコトリエン合成を阻害する心筋梗塞治療剤を個体に投与し、および、
    治療剤を投与する以前および最中の個体、すなわち、ミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)レベルを効果的に低下させる量の心筋梗塞治療剤が投与された個体でのＭＰＯレベルをモニターする、
    工程を含む心筋梗塞が発症する危険度を低減させる方法。
  54. 心筋梗塞に罹病しやすいヒトをスクリーニングする方法であって、以下の工程、すなわち；
    SG13S377 (配列番号：１、第169965位)、対立遺伝子Ａ；
    SG13S114 (配列番号：１、第178096位)、対立遺伝子Ａ；
    SG13S41 (配列番号：１、第202045位)、対立遺伝子Ａ；および、
    SG13S35 (配列番号：１、第206117位)、対立遺伝子Ｇ
    のマーカーを含んだＦＬＡＰハプロタイプの有無についてヒトの核酸を分析し、
    ＦＬＡＰハプロタイプの存在と心筋梗塞が発症する危険度の高さとの相関に基づいて、心筋梗塞に罹病しやすいヒトを同定する、
    工程を含む心筋梗塞に罹病しやすいヒトをスクリーニングする方法。
  55. ロイコトリエン合成阻害剤およびスタチンを含む組成物。
  56. 薬学的に許容可能な担体をさらに含む請求項５５に記載の組成物。
  57. 前記ロイコトリエン合成阻害剤が、５-リポキシゲナーゼ、５-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質(ＦＬＡＰ)、ロイトクライエンＣ４シンターゼ、ロイクライエンＡ４ヒドラーゼ、アラキドン酸４-リポキシゲナーゼ、ロイコトリエンＢ４ 12-ヒドロキシデヒドロゲナーゼ、ロイコトリエンＡ４受容体、ロイコトリエンＢ４受容体、ロイコトリエンＣ４受容体、ロイコトリエンＤ４受容体、ロイコトリエンＥ４受容体、ロイコトリエンＢ４受容体１、ロイコトリエンＢ４受容体２、システイニルロイコトリエン受容体１、およびシステイニルロイコトリエン受容体２からなるグループから選択されるロイコトリエン合成経路タンパク質の活性を阻害する阻害剤である請求項５５または５６に記載の組成物。
  58. 前記ロイコトリエン合成阻害剤が、１-((４-クロロフェニル)メチル)-３-((１,１-ジメチルエチル)チオ)-α,α-ジメチル-５-(２-キノリニルメトキシ)-１Ｈ-インドール-２-プロピオン酸、(Ｒ)-(＋)-α-シクロペンチル-４-(２-キノリニルメトキシ)-ベンゼン酢酸、３-(３-(１,１-ジメチルエチルチオ-５-(キノリン-２-イルメトキシ)-１-(４-クロロメチルフェニル)インドール-２-イル)-２,２-ジメチルプロピオンアルデヒドオキシム-０-２-酢酸、ジロートン、アトレロイトン、６-((３-フルオロ-５-(テロラヒドロ-４-メトキシ-２Ｈ-ピラン-４イル)フェノキシ)メチル)-１-メチル-２(１Ｈ)-キンロリノン、１-((４-クロロフェニル)メチル)-３-((１,１ジメチルエチル)チオ)-α,α-ジメチル-５-(２-キノリニルメトキシ)-１Ｈ-インドール-２-プロピオン酸、および４-(３-(４-(２-メチル-イミダゾール-１-イル)-フェニルスルファニル)-フェニル)-テロラヒドロ-ピラン-４-カルボン酸アミドからなるグループから選択される請求項５５乃至５７のいずれかに記載の組成物。
  59. 前記ロイコトリエン合成阻害剤が、ＦＬＡＰ阻害剤である請求項５５乃至５７のいずれかに記載の組成物。
  60. 前記ＦＬＡＰ阻害剤が、
    以下の式、すなわち；
    Figure 2007538003
     で表される化合物であり、式中、Ｒ1が、以下の式、すなわち；
    Figure 2007538003
     で表される基であり、Ｒ2およびＲ3が、互いに同一または相違しており、かつ、水素、低級アルキル基、フェニル基、ベンジル基または以下の式、すなわち；
    Figure 2007538003
    Figure 2007538003
     で表される基であり、Ｒ4が、ヒドロキシル基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルキルチオ基、ヘテロアリール基またはカルバモイル基で任意に置換することができる、水素、低級アルキル基、フェニル基またはベンジル基であり、Ｒ5が、水素、低級アルキル基、フェニル基またはベンジル基であり、Ｒ6が、-ＣＯＲ5または-ＣＯ2Ｒ5の式で表される基であり、Ｒ7が、水素、低級アルキル基またはフェニル基であり、Ｙが、以下の式、すなわち；
    Figure 2007538003
     で表される基であり、式中、Ｒ8が、水素、低級アルキル基またはフェニル基であり、ｎが、０〜５の数字であり、Ｚが、ノルボルニル基または以下の式、すなわち；
    Figure 2007538003
     で表される基であり、式中、Ｒ9およびＲ10が、互いに同一または相違しており、かつ、水素、低級アルキル基またはフェニル基であり、あるいは、Ｒ9およびＲ10が合同して、６個までの炭素原子を有する飽和した炭素環式構造を形成し、ｍが、１〜６の数字であり、そして、ＡおよびＢが、互いに同一または相違しており、かつ、水素、低級アルキル基またはハロゲン、あるいは薬学的に許容可能なそれらの塩である、式で表される化合物または薬学的に許容可能なその塩を含む請求項５９に記載の組成物。
  61. 前記ＦＬＡＰ阻害剤が、２-[４-(キノリン-２-イル-メトキシ)フェニル]-２-シクロペンチル酢酸、２-[４-(キノリン-２-イル-メトキシ)フェニル]-２-シクロヘキシル酢酸、および２-[４-(キノリン-２-イル-メトキシ)フェニル]-２-シクロヘプチル酢酸、２-[４-(キノリン-２-イル-メトキシ)フェニル]-２-シクロペンチル酢酸の(＋)-鏡像異性体、(キノリン-２-イル-メトキシ)フェニル]-２-シクロペンチル酢酸の(−)-鏡像異性体、および薬学的に許容可能なそれらの塩類からなるグループから選択される化合物を含む請求項５９に記載の組成物。
  62. 前記ＦＬＡＰ阻害剤が、ＢＡＹ-Ｘ-１００５または生理学的に許容可能なその塩、製剤またはプロドラッグを含む請求項５９に記載の組成物。
  63. 前記ロイコトリエン合成阻害剤が、(Ｒ)-(＋)-α-シクロペンチル-４-(２-キノリニルメトキシ)-ベンゼン酢酸である請求項５９に記載の組成物。
  64. 前記スタチンが、ロブバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチンまたはピタバスタチンからなるグループから選択される請求項５５乃至６３のいずれかに記載の組成物。
  65. ヒトの血清Ｃ-反応性タンパク質(ＣＲＰ)を効果的に低減する量の前記ロイコトリエン合成阻害剤が含まれている請求項５５乃至６４のいずれかに記載の組成物。
  66. ヒトの低密度リポタンパク質コレステロール(ＬＤＬ)および血清ＣＲＰを効果的に低減する量の前記スタチンが含まれている請求項５５乃至６５のいずれかに記載の組成物。
  67. ヒトの血清Ｃ-反応性タンパク質を効果的かつ相乗的に低減する量の前記ロイコトリエン合成阻害剤と前記スタチンとが含まれている請求項５５乃至６５のいずれかに記載の組成物。
  68. ヒトへの投与のための単位用量を含む請求項５５乃至６７のいずれかに記載の組成物。
  69. 丸剤またはカプセルである請求項５５乃至６８のいずれかに記載の組成物。
  70. 単位用量内に５０〜７５０mgのＦＬＡＰ阻害剤が存在する請求項６８または６９に記載の組成物。
  71. 単位用量内に２５０〜３７５mgのＦＬＡＰ阻害剤が存在する請求項６８または６９に記載の組成物。
  72. 単位用量内に１〜２００mgのスタチンが存在する請求項６８または６９に記載の組成物。
  73. 単位用量内に５〜８０mgのＦＬＡＰ阻害剤が存在する請求項６８または６９に記載の組成物。
  74. ヒトの血清Ｃ-反応性タンパク質(ＣＲＰ)を効果的に低減する量の請求項５５乃至７３のいずれかに記載の組成物を、ＣＲＰを低減するための処置を必要とするヒトに投与する工程を含む、ヒトのＣ-反応性タンパク質を低減する方法。
  75. 投与工程に移されるヒト、すなわち、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患からなるグループから選択される疾患または状態に罹病する危険性のあるヒトを選択する工程を含む請求項７４に記載の方法。
  76. 前記組成物が、ヒトの血清ＬＤＬおよび血清ロイコトリエンを効果的に低減する量で投与される請求項７４または７５に記載の方法。
  77. ヒトの血清Ｃ-反応性タンパク質(ＣＲＰ)を低減する方法であって、以下の工程、すなわち；
    血清ＬＤＬを低減するためのスタチン療法、すなわち、ヒトの血清ＣＲＰを任意に低減するスタチン療法を受けるヒトを選択し、および
    ヒトのＣＲＰをさらに効果的に低減する量のロイコトリエン合成アンタゴニストをヒトに投与する、
    工程を含むヒトの血清Ｃ-反応性タンパク質を低減する方法。
  78. ヒトの血清Ｃ-反応性タンパク質(ＣＲＰ)を低減する方法であって、以下の工程、すなわち；
    血清ＣＲＰを低減するための処置を必要とするヒトを特定し、
    スタチンを含む組成物を当該ヒトに投与し、
    ロイコトリエン合成阻害剤を含む組成物を当該ヒトに投与する工程を含み、
    当該スタチンと当該ロイコトリエン合成阻害剤が、ヒトの血清ＣＲＰを効果的に低減する量で投与される、ヒトの血清Ｃ-反応性タンパク質を低減する方法。
  79. 前記特定工程が、心筋梗塞、急性冠状動脈症候群、脳卒中または末梢動脈閉塞疾患の一つまたはそれ以上の危険要素が認められるヒトの特定を含む請求項７８に記載の方法。
  80. 前記特定工程が、ヒトのＣＲＰの分析を含む請求項７８に記載の方法。
  81. 前記スタチンおよび前記ロイコトリエン合成阻害剤が、同時に投与される請求項７８乃至８０のいずれかに記載の方法。
  82. 投与後の治療効果をモニターするために、ヒトの血清Ｃ-反応性タンパク質を分析する工程をさらに含む請求項７８乃至８１のいずれかに記載の方法。
  83. 投与量と投与頻度を変更し、次いで、ヒトのＣＲＰを目標値に導くために分析する工程をさらに含む請求項７８乃至８２のいずれかに記載の方法。
  84. ヒトのＣＲＰレベルを低下せしめる薬剤を製造するためのロイコトリエン合成阻害剤とスタチンの使用。
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