KR20110113785A - Ｐ-카드헤린 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 P-카드헤린에 결합하고 P-카드헤린을 억제하는 작용을 하는 인간 항체를 포함한 항체 및 그의 항원-결합 부분에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 P-카드헤린 항체로부터 유도된 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 및 상기 면역글로불린을 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 P-카드헤린 항체의 제조 방법, 이들 항체를 포함하는 조성물, 및 상기 항체 및 조성물의 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 유전자이식 동물 또는 식물에 관한 것이다.

Description

Ｐ-카드헤린 항체{P-CADHERIN ANTIBODIES}

본 발명은 P-카드헤린에 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 부분에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 항체 및 항원-결합 부분을 암호화하는 핵산 분자, P-카드헤린 항체 및 항원-결합 부분의 제조 방법, 상기 항체 및 항원-결합 부분을 포함하는 조성물, 및 상기 항체, 항원-결합 부분 및 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.

본 출원은 본원에 그대로 참고로 인용된, 2005년 4월 26일자 미국 가출원 제 60/675,311 호에 대해 우선권을 주장한다.

카드헤린은 발생시 세포-세포 유착 및 조직 항상성을 조절하는 막투과 당단백질의 상과이다[Gumbiner, J. Cell . Biol., 148:399-404, 2000; Yagi, et al., Genes Dev., 14:1169-1180, 2000]. 카드헤린의 세포내 영역은, 액틴 세포골격에 대한 카드헤린 부착의 기저부를 형성하는 카테닌 및 p120과 같은 세포질 단백질과 상호작용한다. 카드헤린은 5개의 세포외 Ca^{2 +} 결합 영역, 및 전통적 카드헤린중에서 고도로 보존되는 소 세포질 영역을 갖는다. 전통적인 카드헤린 부류의 구성원으로는 P-카드헤린, E-카드헤린 및 N-카드헤린이 포함된다. 카드헤린과 같은 세포 부착 분자는 암 및 전이 세포의 세포 결합에서 중요한 역할을 하는 것으로 고려된다[Furukawa et al., Microscopy Res . Technique, 38(4):343-352, 1997]. 정상 성인 조직에서의 P-카드헤린 발현율은 낮으며, 주로 근상피세포 및 중층 상피의 기저층으로 제한된다[Shimoyama, et al., Cancer Res., 49:2128-2133, 1989]. P-카드헤린은 크론씨병 및 대장염과 같은 염증성 장 질환에서 상향조절된다[Hardy, et al., Gut, 50:513-519, 2002]. 많은 증거들이 현재 이상 P-카드헤린 발현이 세포 증식 및 결장, 유방, 폐, 갑상선 및 자궁경부 종양과 관련됨을 또한 나타내고 있다[Gamallo, Modern Pathology, 14:650-654, 2001; and Stefansson et al., J. Clin. Oncol., 22(7):1242-1252, 2004]. 인간 P-카드헤린은 외음부 유표피암에 대해 상승된 NCC-CAD-299 단클론성 항체에 의해 인지되는 항원인 것으로 보고되었다[Shimoyama, et al., Cancer Res., 49:2128-2133, 1989]. P-카드헤린 매개된 부착 및 세포내 신호전달의 조절은 생체내에서 종양 세포의 감소된 증식 및 생존을 야기할 것으로 기대된다.

따라서, P-카드헤린이 세포 증식 및 고형 종양 진행에 있어 갖는 것으로 생각되는 중요한 역할의 견지에서, 다양한 암을 갖는 환자에게 치료적 유익을 제공할 수 있는 P-카드헤린에 대한 항체를 생성하는 것이 바람직하다.

발명의 요약

한 태양에서, 본 발명은 하기 A) 내지 K)에 기술된 바와 같은 여러 기능적 특성중 하나 이상을 갖는 P-카드헤린 항체 또는 그의 항원-결합 부분이다.

A) 예를 들면, 한 태양에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 E-카드헤린에 대한 결합 친화도(K_D(E))보다 P-카드헤린에 대해 더 큰 결합 친화도(K_D(P))를 갖는다. 한 태양에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 1.5 이상의 K_D(E)/K_D(P)를 갖는다. 또 다른 태양에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분은 2 이상, 3 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 50 이상, 100 이상, 200 이상, 500 이상, 또는 1000 이상의 K_D(E)/K_D(P)를 갖는다. 전형적으로, K_D(E) 값은 0과 같이 매우 작을 수 있기 때문에 K_D(E)/K_D(P)의 값에는 상한치가 없다. 그러나, 실제로는, K_D(E)/K_D(P)의 상한치는 1 x 10⁶일 수 있다. P-카드헤린 및 E-카드헤린 둘 다에 대한 상기 K_D 값은 당해 분야의 기술을 가진 자에게 공지된 임의의 기술에 의해, 예를 들면, ELISA, RIA, 유세포측정법, 또는 표면 플라즈몬 공명, 예를 들어, 비아코어(BIACORE, 등록상표)에 의해 측정할 수 있다.

B) 또 다른 태양에서, 상기 항체 또는 그의 부분은 표면 플라즈몬 공명으로 측정할 때 1000 nM 이하의 K_D 하에 P-카드헤린에 결합한다. 또 다른 태양에서, 항체 또는 부분은 표면 플라즈몬 공명으로 측정할 때 500 nM 미만, 100 nM 미만, 50 nM 미만, 20 nM 미만, 10 nM 미만, 1 nM 미만, 500 pM 미만 또는 100 pM 미만의 K_D 하에 P-카드헤린에 결합한다. 전형적으로, K_D 값에 하한치는 없다. 그러나, 실제로는 하한치는 약 1 pM인 것으로 추정할 수 있다.

C) 또 다른 태양에서, 상기 항체 또는 그의 부분은 표면 플라즈몬 공명으로 측정할 때 0.01^s-1 이하의 P-카드헤린에 대한 오프 속도(off rate, k_off)를 갖는다. 예를 들면, 특정 태양에서, 항체 또는 부분은 0.005^s-1 미만, 0.004^s-1 미만, 0.003^s-1 미만, 0.002^s-1 미만 또는 0.001^s-1 미만의 P-카드헤린에 대한 k_off를 갖는다. 전형적으로 k_off 값에 대한 하한치는 없다. 그러나, 실제로는, 하한치는 약 1 x 10^{-7 s-1}인 것으로 추정할 수 있다.

D) 또 다른 태양에서, P-카드헤린 항체 또는 그의 부분은 P-카드헤린 의존성 세포 부착 분석법으로 측정할 때 100 nM 이하의 IC₅₀을 갖는다. 또 다른 태양에서, 상기 IC₅₀은 P-카드헤린 의존성 세포 부착 분석법으로 측정할 때 50 nM 미만, 40 nM 미만, 20 nM 미만, 10 nM 미만, 1 nM 미만, 500 pM 미만, 200 pM 미만, 100 pM 미만 또는 10 pM 미만이다. 전형적으로 P-카드헤린 의존성 세포 부착 분석법으로 측정할 때 IC₅₀의 값에 대한 하한치는 없다. 그러나, 실제로는, 하한치는 약 1 pM인 것으로 추정할 수 있다.

E) 또 다른 태양에서, P-카드헤린 또는 그의 부분은 P-카드헤린 의존성 세포 응집 분석법으로 측정할 때 100 nM 이하의 IC₅₀을 갖는다. 또 다른 태양에서, 상기 IC₅₀은 P-카드헤린 의존성 세포 응집 분석법으로 측정할 때 50 nM 미만, 40 nM 미만, 20 nM 미만, 10 nM 미만, 1 nM 미만, 500 pM 미만, 200 pM 미만, 100 pM 미만 또는 1 pM 미만이다. 전형적으로 P-카드헤린 의존성 세포 응집 분석법으로 측정할 때 IC₅₀의 값에 대한 하한치는 없다. 그러나, 실제로는, 하한치는 약 1 pM인 것으로 추정할 수 있다.

F) 또 다른 태양에서, P-카드헤린 항체 또는 그의 부분은 IgG가 존재하지 않는 대조용 샘플에 비해 P-카드헤린-의존성 타원체 붕괴 분석에서 2배 이상 타원체 붕괴를 증가시킨다. 또 다른 태양에서, P-카드헤린 항체 또는 그의 부분은 P-카드헤린-의존성 타원체 붕괴 분석에서 IgG가 존재하지 않는 대조용 샘플에 비해 3배 이상, 4배 이상, 6배 이상, 10배 이상 또는 15배 이상 타원체 붕괴를 증가시킨다.

G) 또 다른 태양에서, P-카드헤린 항체 또는 그의 부분은 P-카드헤린에 대한 결합에 대해 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; 및 g-129-1c4로 이루어진 군에서 선택된 항체와 경쟁한다.

H) 또 다른 태양에서, P-카드헤린 항체 또는 그의 부분은 P-카드헤린에 대한 결합에 대해 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; 및 g-129-1c4로 이루어진 군에서 선택된 항체와 교차-경쟁한다.

I) 또 다른 태양에서, P-카드헤린 항체 또는 그의 부분은 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; 및 g-129-1c4로 이루어진 군에서 선택된 항체와 동일한 P-카드헤린의 에피토프에 결합한다.

J) 또 다른 태양에서, P-카드헤린 항체 또는 그의 부분은 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; 및 g-129-1c4로 이루어진 군에서 선택된 항체와 실질적으로 동일한 K_D하에 P-카드헤린에 결합한다.

K) 또 다른 태양에서, P-카드헤린 항체 또는 그의 부분은 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; 및 g-129-1c4로 이루어진 군에서 선택된 항체와 실질적으로 동일한 k_off하에 P-카드헤린에 결합한다.

본 발명의 또 다른 태양은 서열번호: 1 내지 13 및 320 내지 325중 어느 하나와 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 V_H 영역을 포함하는, A) 내지 K)에서 전술한 기능적 특성 중 하나 이상을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 부분이다. 한 태양에서, 상기 V_H 영역은 서열번호: 1 내지 12 및 320 내지 325 중 어느 하나와 아미노산 서열이 91% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일하다.

또 다른 태양에서, 항체 또는 그의 부분은 서열번호: 1 내지 13 및 320 내지 325중 어느 하나이거나 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 가짐으로써 서열번호: 1 내지 13 및 320 내지 325 중 어느 하나와 상이한 V_H 영역을 포함하는, A) 내지 K)에서 전술한 기능적 특성 중 하나 이상을 갖는다. 예를 들면, V_H 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호: 1 내지 13 및 320 내지 325 중 어느 하나와 상이할 수 있다. 또 다른 태양에서, 임의의 상기 보존적 아미노산 치환은 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역에서 일어날 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양은 서열번호: 14 내지 23 및 326 내지 331중 어느 하나와 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 V_L 영역을 포함하는, A) 내지 K)에서 전술한 기능적 특성 중 하나 이상을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 부분이다. 한 태양에서, 상기 V_L 영역은 서열번호: 14 내지 23 및 326 내지 331 중 어느 하나와 아미노산 서열이 91% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일하다.

또 다른 태양에서, 항체 또는 그의 부분은 A) 내지 K)에서 전술한 기능적 특성 중 하나 이상을 가지며, 서열번호: 14 내지 23 및 326 내지 331중 어느 하나이거나 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 가짐으로써 서열번호: 14 내지 23 및 326 내지 331 중 어느 하나와 상이한 V_L 영역을 포함한다. 예를 들면, V_L 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호: 14 내지 23 및 326 내지 331 중 어느 하나와 상이할 수 있다. 또 다른 태양에서, 임의의 상기 보존적 아미노산 치환은 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역에서 일어날 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양은, V_L 및 V_H 영역이 각각 항체 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; 및 g-129-1c4 중 어느 하나의 V_L 및 V_H 영역 각각과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한, A) 내지 K)에서 전술한 기능적 특성 중 하나 이상을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 부분이다. 예를 들면, V_L 및 V_H 영역은 각각 항체 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; 및 g-129-1c4 중 어느 하나의 V_L 및 V_H 영역 각각과 아미노산 서열이 91%, 93%, 95%, 97%, 99% 이상 또는 100% 동일하다.

본 발명의 또 다른 태양은 하기 a) 내지 u)로 이루어진 군에서 선택된 항체 또는 그의 항원-결합 부분이다: a) 서열번호: 1에 나타낸 바와 같은 V_H 영역, 및 서열번호: 14에 나타낸 바와 같은 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 그의 부분; b) 서열번호: 2에 나타낸 바와 같은 V_H 영역, 및 서열번호: 14에 나타낸 바와 같은 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 그의 부분; c) 서열번호: 2에 나타낸 바와 같은 V_H 영역, 및 서열번호: 15에 나타낸 바와 같은 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 그의 부분; d) 서열번호: 3에 나타낸 바와 같은 V_H 영역, 및 서열번호: 16에 나타낸 바와 같은 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 그의 부분; e) 서열번호: 4에 나타낸 바와 같은 V_H 영역, 및 서열번호: 17에 나타낸 바와 같은 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 그의 부분; f) 서열번호: 4에 나타낸 바와 같은 V_H 영역, 및 서열번호: 23에 나타낸 바와 같은 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 그의 부분; g) 서열번호: 5에 나타낸 바와 같은 V_H 영역, 및 서열번호: 18에 나타낸 바와 같은 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 그의 부분; h) 서열번호: 6에 나타낸 바와 같은 V_H 영역, 및 서열번호: 23에 나타낸 바와 같은 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 그의 부분; i) 서열번호: 7에 나타낸 바와 같은 V_H 영역, 및 서열번호: 23에 나타낸 바와 같은 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 그의 부분; j) 서열번호: 8에 나타낸 바와 같은 V_H 영역, 및 서열번호: 23에 나타낸 바와 같은 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 그의 부분; k) 서열번호: 9에 나타낸 바와 같은 V_H 영역, 및 서열번호: 23에 나타낸 바와 같은 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 그의 부분; l) 서열번호: 10에 나타낸 바와 같은 V_H 영역, 및 서열번호: 19에 나타낸 바와 같은 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 그의 부분; m) 서열번호: 11에 나타낸 바와 같은 V_H 영역, 및 서열번호: 20에 나타낸 바와 같은 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 그의 부분; n) 서열번호: 12에 나타낸 바와 같은 V_H 영역, 및 서열번호: 21에 나타낸 바와 같은 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 그의 부분; o) 서열번호: 13에 나타낸 바와 같은 V_H 영역, 및 서열번호: 22에 나타낸 바와 같은 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 그의 부분; p) 서열번호: 320에 나타낸 바와 같은 V_H 영역, 및 서열번호: 326에 나타낸 바와 같은 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 그의 부분; q) 서열번호: 321에 나타낸 바와 같은 V_H 영역, 및 서열번호: 327에 나타낸 바와 같은 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 그의 부분; r) 서열번호: 322에 나타낸 바와 같은 V_H 영역, 및 서열번호: 328에 나타낸 바와 같은 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 그의 부분; s) 서열번호: 323에 나타낸 바와 같은 V_H 영역, 및 서열번호: 329에 나타낸 바와 같은 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 그의 부분; t) 서열번호: 324에 나타낸 바와 같은 V_H 영역, 및 서열번호: 330에 나타낸 바와 같은 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 그의 부분; 및 u) 서열번호: 325에 나타낸 바와 같은 V_H 영역, 및 서열번호: 331에 나타낸 바와 같은 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 그의 부분.

또 다른 태양에서, a) 내지 u) 군에서 전술한 바와 같은 임의의 항체 또는 그의 부분에 있어, V_H 및/또는 V_L 영역은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 상기 인용된 특정 서열번호와 상이할 수 있다. 예를 들면, V_H 및/또는 V_L 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 아미노산 치환에 의해 인용된 서열번호와 상이할 수 있다. 또 다른 태양에서, 임의의 상기 보존적 아미노산 치환은 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역에서 일어날 수 있다.

또 다른 태양에서, 본 발명은, 서열번호: 1 내지 13 및 320 내지 325 중 어느 하나로부터 독립적으로 선택된 V_H 영역, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호: 1 내지 13 및 320 내지 325 중 어느 하나와 상이한 서열을 포함하고, 또한 서열번호: 14 내지 23 및 326 내지 331 중 어느 하나로부터 독립적으로 선택된 V_L 영역, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호: 14 내지 23 및 326 내지 331 중 어느 하나와 상이한 서열을 포함하는, A) 내지 K)에서 전술한 기능적 특성중 하나 이상을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다. 예를 들면, V_H 및 V_L 영역은 각각 독립적으로 서열번호: 1 내지 13, 320 내지 325, 14 내지 23 및 326 내지 331 중 어느 하나와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 아미노산 치환에 의해 상이할 수 있다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 서열번호: 26 내지 37 및 91 내지 256 중 어느 하나로부터 선택된 V_H CDR3, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호: 26 내지 37 및 91 내지 256 중 어느 하나와 상이한 서열을 포함하는, A) 내지 K)에서 전술한 기능적 특성중 하나 이상을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다. 예를 들면, V_H CDR3는 서열번호: 26 내지 37 및 91 내지 256 중 어느 하나와 1, 2, 3 또는 4개의 보존적 아미노산 치환에 의해 상이할 수 있다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 서열번호: 40 내지 47 및 257 내지 319 중 어느 하나로부터 선택된 V_L CDR3, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호: 40 내지 47 및 257 내지 319 중 어느 하나와 상이한 서열을 포함하는, A) 내지 K)에서 전술한 기능적 특성중 하나 이상을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다. 예를 들면, V_L CDR3는 서열번호: 40 내지 47 및 257 내지 319 중 어느 하나와 1, 2, 3, 4 또는 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 상이할 수 있다.

또 다른 태양에서, 본 발명은, 서열번호: 24에 나타낸 바와 같은 V_H CDR1, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호: 24와 상이한 서열; 서열번호: 25에 나타낸 바와 같은 V_H CDR2, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호: 25와 상이한 서열; 및 서열번호: 26 내지 37 및 91 내지 256 중 어느 하나로부터 독립적으로 선택된 V_H CDR3, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호: 26 내지 37 및 91 내지 256 중 어느 하나와 상이한 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다. 예를 들면, 상기 언급한 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 각각의 인용된 서열번호와 상이하다.

또 다른 태양에서, 본 발명은, 서열번호: 38에 나타낸 바와 같은 V_L CDR1, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호: 38과 상이한 서열; 서열번호: 39에 나타낸 바와 같은 V_L CDR2, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호: 39와 상이한 서열; 및 서열번호: 40 내지 47 및 257 내지 319 중 어느 하나로부터 독립적으로 선택된 V_L CDR3, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호: 40 내지 47 및 257 내지 319 중 어느 하나와 상이한 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다. 예를 들면, 상기 언급한 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 각각의 인용된 서열번호와 상이하다.

본 발명은 또한, 서열번호: 24에 나타낸 바와 같은 V_H CDR1; 서열번호: 25에 나타낸 바와 같은 V_H CDR2; 서열번호: 26 내지 37 및 91 내지 256 중 어느 하나로부터 독립적으로 선택된 V_H CDR3; 서열번호: 38에 나타낸 바와 같은 V_L CDR1; 서열번호: 39에 나타낸 바와 같은 V_L CDR2; 및 서열번호: 40 내지 47 및 257 내지 319 중 어느 하나로부터 독립적으로 선택된 V_L CDR3을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다. 또 다른 태양에서, 언급한 V_H 및 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 또한 각각 독립적으로 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 상기 인용한 특정 서열번호와 상이할 수 있다. 예를 들면, CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 각각의 인용된 서열번호와 상이하다.

본 발명은 또한 임의의 항체 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; 및 g-129-1c4에서 발견되는 바와 같은 V_H 및 V_L CDR1, V_H 및 V_L CDR2, 및 V_H 및 V_L CDR3를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다.

본 발명은 또한 서열번호: 1 내지 13 및 320 내지 325 중 어느 하나로부터 선택된 V_H 영역을 포함하거나 또는 1 내지 10개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호: 1 내지 13 및 320 내지 325 중 어느 하나와 상이한 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다.

본 발명은 또한 서열번호: 14 내지 23 및 326 내지 331 중 어느 하나로부터 선택된 V_L 영역을 포함하거나 또는 1 내지 10개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호: 14 내지 23 및 326 내지 331 중 어느 하나와 상이한 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다.

본 발명은 또한 서열번호: 1 내지 13 및 320 내지 325 중 어느 하나로부터 독립적으로 선택된 V_H 영역, 또는 1 내지 10개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호: 1 내지 13 및 320 내지 325 중 어느 하나와 상이한 서열을 포함하고, 또한 서열번호: 14 내지 23 및 326 내지 331 중 어느 하나로부터 독립적으로 선택된 V_L 영역, 또는 1 내지 10개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호: 14 내지 23 및 326 내지 331 중 어느 하나와 상이한 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다.

본 발명은 또한 서열번호: 24에 나타낸 바와 같은 V_H CDR1, 또는 1 내지 4개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호: 24와 상이한 서열; 서열번호: 25에 나타낸 바와 같은 V_H CDR2, 또는 1 내지 4개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호: 25와 상이한 서열; 및 서열번호: 26 내지 37 및 91 내지 256 중 어느 하나로부터 선택된 V_H CDR3, 또는 1 내지 4개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호: 26 내지 37 및 91 내지 256 중 어느 하나와 상이한 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다.

본 발명은 또한 서열번호: 38에 나타낸 바와 같은 V_L CDR1, 또는 1 내지 4개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호: 38과 상이한 서열; 서열번호: 39에 나타낸 바와 같은 V_L CDR2, 또는 1 내지 4개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호: 39와 상이한 서열; 및 서열번호: 40 내지 47 및 257 내지 319 중 어느 하나로부터 선택된 V_L CDR3, 또는 1 내지 4개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호: 40 내지 47 및 257 내지 319 중 어느 하나와 상이한 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호: 48에 나타낸 바와 같은 V_H FR1; 서열번호: 49에 나타낸 바와 같은 V_H FR2; 서열번호: 50 내지 55중 어느 하나에서 선택된 V_H FR3; 서열번호: 56 및 57 중 어느 하나로부터 선택된 V_H FR4; 서열번호: 58 및 59 중 어느 하나로부터 선택된 V_L FR1; 서열번호: 60 내지 62 중 어느 하나로부터 선택된 V_L FR2; 서열번호: 63 내지 66 중 어느 하나로부터 선택된 V_L FR3; 서열번호: 67에 나타낸 바와 같은 V_L FR4를 포함하는, A) 내지 K)에서 전술한 기능적 특성중 하나 이상을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다. 또 다른 태양에서, 언급한 V_H 및 V_L FR1, FR2, FR3 및 FR4 서열은 또한 각각 독립적으로 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 상기 인용한 특정 서열번호와 상이할 수 있다. 예를 들면, FR1, FR2, FR3 및 FR4 서열은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 아미노산 치환에 의해 각각의 인용된 서열번호와 상이하다. 또 다른 태양에서, FR1, FR2, FR3 및 FR4 서열중 임의의 서열은 각각 독립적으로 각각의 생식세포주 골격 서열에 부합되도록 돌연변이될 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양은 IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD 분자이거나 또는 그로부터 유도된, 본원에 기술된 임의의 항체이다. 예를 들면, 항체는 IgG₁ 또는 IgG₂일 수 있다. 예를 들면, 한 태양에서, IgG는 중쇄 불변 영역이 서열번호: 344를 포함하고 경쇄 불변 영역이 서열번호: 345를 포함하나, 단, 서열번호: 344의 C-말단 라이신 잔기가 분리되거나 분리되지 않은 IgG₁이다.

또 다른 태양은 Fab 단편, F(ab')₂ 단편, F_v 단편, 단일쇄 F_v 단편, 단일쇄 V_H 단편, 단일쇄 V_L 단편, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 이중특이성(bispecific) 항체인 전술한 임의의 항체 또는 항원-결합 부분을 제공한다.

또 다른 태양은 본원에 기술된 바와 같은 임의의 항체 또는 그의 부분 및 하나 이상의 추가의 분자 물질을 포함하는 유도체화 항체 또는 항원-결합 부분이다. 예를 들면, 하나 이상의 추가의 분자 물질은 또 다른 항체(예를 들면, 이중특이 항체 또는 디아바디(diabody), 검출제, 표지, 세포독성제, 약제, 및/또는 항체, 또는 항체 부분과 또 다른 분자(예를 들면, 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 표식)와의 결합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분을 유도할 수 있는 유용한 검출제로는 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 로다민, 5-다이메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 피코에리트린, 란타나이드 인광체 등을 포함한 형광 화합물이 포함된다. 항체는 또한 검출에 유용한 효소, 예를 들면, 양고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제, 글루코스 옥시다제 등으로 표지될 수 있다. 또 다른 태양에서, 본 발명의 항체 또는 그의 부분은 또한 비오틴으로, 또는 2차 수용체(예를 들면, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 영역, 에피토프 표식)에 의해 인지된 예정된 폴리펩티드 에피토프로 표지될 수 있다. 본 발명의 또 다른 태양에서, 임의의 항체 또는 그의 부분은 또한 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 메틸 또는 에틸기 또는 탄수화물기와 같은 화학기로 유도체화될 수 있다.

일부 태양에서, 본원에 개시된 P-카드헤린 항체 또는 항원 결합 부분은 고체 지지체에 부착된다.

일부 태양에서, 본 발명의 임의의 P-카드헤린 항체의 중쇄의 C-말단 라이신은 분리된다. 본 발명의 다양한 태양에서, P-카드헤린 항체의 중쇄 및 경쇄는 N-말단 신호 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 예를 들면, 중쇄 신호 서열은 서열번호: 346일 수 있고, 경쇄 신호 서열은 서열번호: 347일 수 있다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 인간 기원을 갖는, 본원에 기술된 바와 같은 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 부분에 관한 것이다.

본 발명은 또한 전술한 바와 같은 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 부분 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 전술한 바와 같은 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 한 특정 태양은 서열번호: 68 내지 90 및 332 내지 343 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자이다. 본 발명은 또한 핵산 분자에 작용가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하거나 포함하지 않는, 본원에 기술된 임의의 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

또 다른 태양은 본원에 기술된 벡터중 어느 하나를 포함하거나 또는 본원에 기술된 핵산 분자중 어느 하나를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 임의의 항체 또는 항원-결합 부분을 생성하거나, 또는 임의의 상기 항체 또는 상기 항원-결합 부분의 중쇄 또는 경쇄를 생성하는 분리된 세포주를 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 숙주 세포 또는 세포주를 적당한 조건하에서 배양하고 상기 항체 또는 항원-결합 부분을 회수하는 것을 포함하는, P-카드헤린 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 생성하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본원에 기술된 임의의 핵산을 발현시키는, 상기 임의의 핵산을 포함하는 비-인간 유전자이식 동물 또는 유전자이식 식물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 비-인간 유전자이식 동물 또는 유전자이식 식물로부터 항체를 분리하는 단계를 포함하는, P-카드헤린에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 부분 또는 임의의 약학 조성물을 이상 세포 성장의 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물에서 이상 세포 성장을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 핵산 분자를 발현시키는 적당한 조건하에서 본원에 기술된 임의의 핵산 분자 효과량을 이상 세포 성장의 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물에서 이상 세포 성장을 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 태양에서, 이상 세포 성장을 치료하는 방법은 또한, 항-종양제, 항-신생혈관생성제, 신호 전환 억제제 및 항-증식제로부터 선택된 하나 이상의 물질을 함께 이상 세포 성장을 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함한다. 특정 태양에서, 상기 이상 세포 성장은 암성이다.

본 발명은 또한 세포를 본원에 기술된 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 부분 또는 본원에 기술된 임의의 약학 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, P-카드헤린-의존성 세포 응집을 감소시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 태양은 인간 V_H-3 부류 유전자를 이용하는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분이다. 한 태양에서, 예를 들면, 인간 V_H-3 부류 유전자는 V_H-3-23이다.

본 발명의 또 다른 태양은 인간 항체인, 본원에 기술된 바와 같은 임의의 항체 또는 항원-결합 부분을 제공한다. 다른 태양에서, 상기 항체 또는 항원-결합부분은 인간 재조합 항체이다.

본 발명은 또한 파아지상에 인간 항체의 라이브러리를 합성하고, 상기 라이브러리를 P-카드헤린 또는 그의 항원 부분으로 선별하고, P-카드헤린에 결합하는 파아지를 분리하고, 파아지로부터 항체를 수득하는 단계를 포함하는, P-카드헤린 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 생성하는 방법을 제공한다.

정의 및 일반적 기술

본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 기술 용어들은 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자들에 의해 보편적으로 이해되는 의미를 갖는다. 또한, 문맥에 달리 필요하지 않는 한, 단수형 용어는 복수를 포함하고 복수형 용어는 단수를 포함한다. 일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화와 관하여 사용된 명명법 및 이들의 기술은 공지된 것들이며 당해 분야에서 통상적으로 사용된다.

본 발명의 방법 및 기술은 일반적으로 당해 분야에 공지된 방법에 따라서 및 달리 언급하지 않는 한 본 명세서 전체에 인용되고 논의되어 있는 다양한 일반적이고 보다 특정한 참조문헌에 기술된 바와 같이 수행된다. 예를 들면, 본원에 참고로 인용된 문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000; Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc., 2002; Harlow and Lane, Using Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998; and Coligan, et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc., 2003]을 참조하시오. 효소 반응 및 정제 기술은 제조자의 설명서에 따라서, 당해 분야에서 통상적으로 이루어지듯이 또는 본원에 기술된 바와 같이 수행한다. 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 약제 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 이들의 실험 절차 및 기술은 공지되어 있고 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 것들이다. 표준 기술을 화학 합성, 화학 분석, 약학 제제, 제형, 전달 및 환자의 치료에 사용한다.

기본 항체 구조 단위는 사량체를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각각의 사량체는 각각 하나의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50 내지 70 kDa)를 갖는 쌍인 2개의 동일한 폴리펩티드쇄의 쌍으로 이루어진다. 각 쇄의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 120개 이상의 아미노산으로 된 가변 영역을 포함한다. 각 쇄의 카복시-말단 부분은 주로 작동인자 기능을 담당하는 불변 영역을 한정한다. 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 분류되며, 항체의 아이소타입(isotype)을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의한다. 경쇄 및 중쇄내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산으로된 "J" 영역에 의해 연결되며, 중쇄는 또한 약 3개 이상의 아미노산으로 된 "D" 영역을 포함한다(일반적으로, 본원에 그대로 참고로 인용된 문헌 [Fundamental Immunology, Ch. 7, Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989] 참조). 각 중쇄/경쇄 쌍의 가변 영역(V_H 및 V_L)은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 비손상 IgG 항체는, 예를 들면, 2개의 결합 부위를 갖는다. 이작용성 또는 이중특이성 항체를 제외하고, 2개의 결합 부위는 동일하다.

중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 상보성 결정 영역 또는 CDR로도 또한 지칭되는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, 동일한 일반 구조의 비교적 보존된 골격 영역(FR)을 나타낸다. 용어 "가변성"은 가변 영역의 특정 부분이 항체들간의 서열에서 광범위하게 상이하고 그 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용되는 점을 말한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 영역 전체에 고르게 분포되지 않지만, 보다 고도로 보존된 FR에 의해 분리되는 CDR에 집중된다. 각 쌍의 두 쇄로부터의 CDR은 FR에 의해 정렬되어 특정 에피토프에 대한 결합을 가능케한다. N-말단으로부터 C-말단까지 경쇄 및 중쇄는 모두 영역 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 영역에 대한 아미노산의 지정은 본원에 참고로 인용된 문헌 [Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991; or Chothia & Lesk, J. Mol . Biol., 196:901-917, 1987; Chothia, et al., Nature, 342:878-883, 1989]에 따른다.

하기의 용어들은 달리 언급하지 않는 한 하기의 의미를 갖는 것으로 이해된다.

달리 명확히 언급하지 않는 한, 용어 "P-카드헤린"은 내재성 막 단백질이며 세포-세포 유착을 조절하는 막투과 당단백질의 전통적 카드헤린 부류의 구성원인 인간 P-카드헤린을 말한다. 인간 P-카드헤린의 클로닝 및 서열은, 예를 들면, 본원에 참고로 인용된 문헌 [Shimoyama, et al., J. Cell Biol., 109(4 pt 1), 1787-1794, 1989]에 보고되었다. 용어 P-카드헤린은 재조합 인간 P-카드헤린 및 재조합 키메라 형태의 P-카드헤린을 포함하며, 이들은 표준 재조합 발현 방법에 의해 제조할 수 있거나 상업적으로 구입할 수 있다(알 앤 디 시스템즈(R&D Systems) 861-PC-100).

달리 명확히 언급하지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "E-카드헤린"은 내재성 막 단백질이며 세포-세포 유착을 조절하는 막투과 당단백질의 전통적 카드헤린 부류의 구성원인 인간 E-카드헤린을 말한다. E-카드헤린은, 예를 들면, 본원에 참고로 인용된 문헌 [Takeichi, Science, 251:1451-1455, 1991]에 기술되어 있다. 용어 E-카드헤린은 재조합 인간 E-카드헤린 및 재조합 키메라 형태의 E-카드헤린을 포함하며, 이들은 표준 재조합 발현 방법에 의해 제조할 수 있거나 상업적으로 구입할 수 있다(알 앤 디 시스템즈 648-EC-100).

용어 "폴리펩티드"는 천연 또는 인공 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩티드 유사체를 포함한다. 폴리펩티드는 단량체성 또는 다량체성일 수 있다.

용어 "분리된 단백질", "분리된 폴리펩티드" 또는 "분리된 항체"는, 그의 유도 기원 또는 근원으로 인해, (1) 그의 천연 상태에서 그와 수반되는 천연 결합 성분들과 결합하지 않거나, (2) 동일한 종으로부터의 다른 단백질을 함유하지 않거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 천연에서 발생하지 않는 단백질, 폴리펩티드 또는 항체이다. 따라서, 화학적으로 합성되거나, 또는 천연에서 유래된 세포와 상이한 세포 시스템에서 합성되는 폴리펩티드는 그의 천연 결합 성분들로부터 "분리"될 것이다. 단백질은 또한 당해 분야에 공지된 단백질 정제 기술을 이용하여 분리에 의해 천연 결합 성분들을 실질적으로 함유하지 않게 될 수 있다.

분리된 항체의 예로는 P-카드헤린을 이용하여 친화도 정제된 P-카드헤린 항체, 및 시험관내에서 세포주에 의해 합성된 P-카드헤린 항체가 포함된다.

단백질 또는 폴리펩티드는 약 60 내지 75% 이상의 샘플이 단일 종의 폴리펩티드를 나타내는 경우 "실질적으로 순수"하거나, "실질적으로 동종"이거나 "실질적으로 정제"된 것이다. 폴리펩티드 또는 단백질은 단량체성 또는 다량체성일 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 단백질은 전형적으로 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%(w/w)의 단백질 샘플, 보다 통상적으로는 약 95%의 단백질 샘플을 구성할 수 있으며, 바람직하게는 99% 이상 순수할 수 있다. 단백질 순도 또는 동종성은 단백질 샘플의 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동과 같은 당해 분야에 공지된 많은 방법에 의해 나타낼 수 있으며, 이어서 당해 분야에 공지된 색소로 겔을 염색하여 단일 폴리펩티드 띠를 가시화시킬 수 있다. 특정한 목적으로, HPLC 또는 정제에 대해 당해분야에 공지된 다른 방법을 이용함으로써 보다 고도의 분해를 제공할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드 단편"은 아미노-말단 및/또는 카복시-말단 결실을 갖지만 남은 아미노산 서열은 천연 서열의 상응하는 위치와 동일한 폴리펩티드를 말한다. 일부 태양에서, 단편은 5, 6, 8 또는 10개 이상의 아미노산의 길이이다. 다른 태양에서, 단편은 14개 이상, 20개 이상, 50개 이상, 또는 70, 80, 90, 100, 150 또는 200개 이상의 아미노산의 길이이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유사체" 또는 "폴리펩티드 유사체"는 일부 기준 아미노산 서열과 실질적인 동일성을 갖는 단편을 포함하고 기준 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 기능 또는 활성을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 전형적으로, 폴리펩티드 유사체는 기준 서열에 대해 보존적 아미노산 치환(또는 삽입 또는 결실)을 포함한다. 유사체는 20개 또는 25개 이상의 아미노산 길이를 가질 수 있거나, 또는 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 또는 200개 이상의 아미노산 길이 이상일 수 있으며, 흔히 전장(full-length) 폴리펩티드만큼 길 수 있다. 본 발명의 일부 태양은 생식세포주 아미노산 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개 치환을 갖는 폴리펩티드 단편 또는 폴리펩티드 유사체 항체를 포함한다. 항체 또는 면역글로불린 분자의 단편 또는 유사체는 본 명세서의 교지내용에 따라 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에 의해 용이하게 제조할 수 있다.

특정 태양에서, P-카드헤린 항체 또는 그의 항원-결합 부분에 대한 아미노산 치환은 (1) 단백질분해에 대한 민감성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 민감성을 감소시키고, (3) 단백질 착체를 형성하기 위한 결합 친화도를 변화시키고, (4) 상기 유사체의 다른 물리화학 또는 기능적 특성을 제공하거나 변형시키지만, P-카드헤린에 대한 특이적 결합은 유지시키는 것이다. 유사체는 천연 펩티드 서열에 대한 다양한 치환을 포함할 수 있다. 예를 들면, 단일 또는 다중 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환은 정상적으로-발생하는 서열에서, 예를 들면, 분자내 접촉을 형성하는 영역(들) 밖의 폴리펩티드 부분에서 이루어질 수 있다. 아미노산 치환은 폴리펩티드의 활성을 개선할 수 있는 분자내 접촉을 형성하는 영역(들)에서 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 실질적으로 모 서열의 구조적 특성을 변화시키지 않아야 한다; 예를 들면, 치환체 아미노산은 모 서열에서 일어나는 면역글로불린 결합 영역을 구성하는 역평행(anti-parallel) β-시트를 변형시키거나 또는 모 서열을 규정하는 다른 유형의 2차 구조를 파괴하지 않아야 한다. 일반적으로, 글라이신 및 프롤린은 역평행 β-시트에 사용하지 않는다. 당해 분야에 인지된 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 본원에 참고로 인용된 문헌 [Proteins, Structures and Molecular Principles, Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York, 1984; Introduction to Pretein Structure, C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y., 1991; and Thornton, et al., Nature, 354:105, 1991]에 기술되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 면역글로불린과 같은 뜻이며 당해 분야에 통상적으로 알려진 바와 같이 이해된다. 특히, 용어 항체는 임의의 특정한 항체 제조 방법에 의해 제한되지 않는다. 예를 들면, 용어 항체는 제한하지 않고 재조합 항체, 단클론성 항체 및 다클론성 항체를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 항체의 "항원-결합 부분"(또는 간단히 "항체 부분")은 항원(예를 들면, P-카드헤린)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 말한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 항체의 "항원-결합 부분"이란 용어내에 포함되는 결합 단편들의 예로는 (i) V_L, V_H, C_L 및 C_H1 영역으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지(hinge) 영역에서 다이설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')₂ 단편; (iii) V_H 및 C_H1 영역으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔(arm)의 V_L 및 V_H 영역으로 이루어진 Fv 단편; (v) V_H 영역으로 이루어진 dAb 단편[Ward, et al., Nature, 341:544-546, 1989]; 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)이 포함된다. 또한, Fv 단편의 두 영역, V_L 및 V_H는 별도의 유전자들에 의해 암호화되지만, 이들은, V_L 및 V_H 영역들이 쌍을 이뤄 1가 분자(단일쇄 Fv(scFv)로 알려짐)를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 구성될 수 있게 하는 합성 링커에 의해, 재조합 방법을 이용하여, 결합될 수 있다(예를 들면, 문헌 [Bird, et al., Science, 242:423-426, 1988; and Huston, et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 85:5879-5883, 1988] 참조). 상기 단일쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포함된다. 디아바디(diabody)와 같은 다른 형태의 단일쇄 항체도 또한 포함된다. 디아바디는, V_H 및 V_L 영역이 단일 폴리펩티드 쇄 상에서, 그러나 동일쇄상의 두 영역 사이에 쌍을 이루기에는 너무 짧은 링커를 사용하여 발현됨으로써 그 영역들을 강제적으로 또 다른 쇄의 상보성 영역들과 쌍을 이루게 하고 2개의 항원 결합 부위를 생성하는 2가의 이중특이성 항체이다(예를 들면, 문헌 [Holliger, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:6444-6448, 1993; Poljak, et al., Structure, 2:1121-1123, 1994] 참조).

또한, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 항체 또는 항체 부분과 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 결합에 의해 생성된 보다 거대한 면역유착(immunoadhesion) 분자의 일부일 수 있다. 상기 면역유착 분자의 예로는 사량체 scFv 분자를 제조하기 위한 스트렙타비딘 코어 영역의 사용[Kipriuanov, et al., Human Antibodies and Hybridomas, 6:93-101, 1995] 및 2가 및 비오티닐화 scFv 분자를 제조하기 위한 시스테인 잔기, 표지 펩티드 및 C-말단 폴리히스티딘 표식의 사용[Kipriyanov, et al., Mol . Immunol., 31:1047-1058, 1994]이 포함된다. 다른 예로는 항체로부터 하나 이상의 CDR이 공유적으로 또는 비공유적으로 분자내에 혼입되어 P-카드헤린과 같은 문제의 항원에 특이적으로 결합하는 면역유착으로 만드는 경우가 포함된다. 상기 태양에서, CDR(들)은 보다 거대한 폴리펩티드 쇄의 일부로서 혼입될 수 있거나, 또 다른 폴리펩티드 쇄에 공유적으로 연결될 수 있거나, 또는 비공유적으로 혼입될 수 있다. Fab 및 F(ab')₂ 단편과 같은 항체 부분들은 통상적인 기술, 예를 들면, 각각 전체 항체의 파파인 또는 펩신 절단을 이용하여 전체 항체로부터 제조할 수 있다. 또한, 항체, 항체 부분 및 면역유착 분자는 본원에 기술된 바와 같은 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 수득할 수 있다.

본 발명과 관련하여 본원에서 "항체"가 언급된 경우, 그의 항원-결합 부분도 또한 사용될 수 있음을 주지해야 한다. 항원-결합 부분은 특이 결합에 대해 비손상 항체와 경쟁한다(일반적으로, 본원에 그대로 참고로 인용된 문헌 [Fundamental Immunology, Ch. 7(Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989] 참조). 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 비손상 항체의 효소적 또는 화학적 분리에 의해 생성될 수 있다. 일부 태양에서, 항원-결합 부분은 Fab, Fab', F(ab')₂, Fd, Fv, dAb, 및 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일쇄 항체(scFv), 키메라 항체, 디아바디, 및 폴리펩티드에 결합하는 특이 항원을 제공하기에 충분한 항체의 적어도 일부분을 함유하는 폴리펩티드를 포함한다. 하나 이상의 결합 부위를 갖는 태양에서, 결합 부위는 서로 동일할 수 있거나 다를 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 가변 및 불변 영역 서열이 인간 서열인 임의의 항체를 의미한다. 상기 용어는 인간 유전자로부터 유도되었지만, 예를 들면, 가능한 면역원성을 감소시키고, 친화도를 증가시키고, 바람직하지 않은 접힘을 야기할 수 있는 시스테인을 배제시키는 등을 위해 변화된 서열을 갖는 항체를 포함한다. 상기 용어는 또한 인간 세포에 전형적이지 않은 글라이코실화를 제공할 수 있는 비-인간 세포에서 재조합적으로 생성된 상기 항체를 포함한다. 이들 항체는 하기에 기술하는 바와 같이 다양한 방법으로 제조할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 항체"는 상이한 종으로부터의 항체를 포함하는 둘 이상의 상이한 항체로부터의 영역을 포함하는 항체를 의미한다. 예를 들면, 키메라 항체의 하나 이상의 CDR은 인간 P-카드헤린 항체로부터 유도될 수 있다. 한 예로, 인간 항체로부터의 CDR은 마우스 또는 래트와 같은 비-인간 항체로부터의 CDR과 조합될 수 있다. 또 다른 예에서, 모든 CDR이 인간 P-카드헤린 항체로부터 유도될 수 있다. 또 다른 예에서, 하나 이상의 인간 P-카드헤린 항체로부터의 CDR이 키메라 항체에서 조합될 수 있다. 예를 들면, 키메라 항체는 제 1 인간 p-카드헤린 항체의 경쇄로부터의 CDR1, 제 2 인간 P-카드헤린 항체의 경쇄로부터의 CDR2 및 제 3 인간 P-카드헤린 항체의 경쇄로부터의 CDR3를 포함할 수 있으며, 중쇄로부터의 CDR은 하나 이상의 다른 P-카드헤린 항체로부터 유도될 수 있다. 또한, 하나 이상의 CDR이 취해진 P-카드헤린 항체 중 하나로부터 또는 하나 이상의 상이한 인간 항체로부터 유도될 수 있다. 또한, 용어 "키메라 항체"는 인간 및 비-인간 항체를 포함한 상기 언급한 조합들 중 임의의 조합을 포함하는 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간화 항체"는 비-인간 종의 항체 서열의 특징인 아미노산 잔기가 인간 항체의 상응하는 위치에서 발견된 잔기로 치환된, 비-인간 기원의 항체를 말한다. 상기 "인간화" 공정은 생성된 항체의 인간에서의 면역원성을 감소시키는 것으로 생각된다. 비-인간 기원의 항체는 당해 분야에 공지된 기술을 이용하여 인간화될 수 있음을 인지할 것이다(예를 들면, 문헌 [Winter, et al., Immunol . Today, 14:43-46, 1993] 참조). 문제의 항체는 CH1, CH2, CH3, 힌지 영역, 및/또는 골격 영역을 상응하는 인간 서열로 치환하도록 재조합 DNA 기술에 의해 처리될 수 있다(예를 들면, WO 92/02190 호, 및 미국 특허 제 5,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,792, 5,714,350 및 5,777,085 호 참조). 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간화 항체"는 그 의미내에 키메라 인간 항체 및 CDR-그라프트 항체를 포함한다. 본 발명의 키메라 인간 항체는 비-인간 종의 V_H 및 V_L 및 인간 항체의 C_H 및 C_L 영역을 포함한다. 본 발명의 CDR-이식 항체는 인간 항체의 V_H 및 V_L의 CDR을 각각 인간 이외의 다른 동물 항체의 V_H 및 V_L로 치환시켜 생성된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "ELISA"는 효소-결합 면역흡착 분석을 말한다. 상기 분석법은 당해 분야의 기술자에게 공지되어 있다. 상기 분석의 예는 문헌 [Vaughan, T.J., et al., Nat . Biotech., 14:309-314, 1996] 및 본 출원의 실시예 7에서 찾을 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표면 플라즈몬 공명"은, 예를 들면, 비아코어(BIACORE, 등록상표) 시스템(파마시아 바이오센서(Pharmacia Biosensor) AB, 스웨덴 업살라, 및 뉴저지주 피츠카타웨이)을 사용하여, 생체감지 매트릭스내에 단백질 농도 변화 탐지에 의해 실시간 생체특이성 상호작용의 분석을 가능케한다. 추가의 설명에 대해서는, 문헌 [Jonsson et al., Ann . Biol . Clin., 51:19-26, 1993; Jonsson, et al., Biotechnique , 11:620-627, 1991; Jonsson, et al., J. Mol. Recognit., 8:125-131, 1995; and Jonsson, et al., Anal . Biochem., 198:268-277, 1991]을 참조하시오.

용어 "K_D"는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 친화도 평형 상수를 말한다. 항체는 K_D가 1 mM 이하, 바람직하게는 100 nM 이하, 가장 바람직하게는 10 nM 이하인 경우 항원에 특이적으로 결합한다고 한다. K_D 결합 친화도 상수는 표면 플라즈몬 공명에 의해, 예를 들면, 실시예 6에 논의된 바와 같이 비아코어(등록상표) 시스템을 사용하여 측정할 수 있다.

용어 "k_off"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리율 상수를 말한다. k_off 해리율 상수는 표면 플라즈몬 공명에 의해, 예를 들면, 실시예 6에 논의된 바와 같이 비아코어(등록상표) 시스템을 이용하여 측정할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "P-카드헤린 의존성 세포 부착 분석"은 고체 지지체상에 고정화된 수용체 P-카드헤린에 대한 세포의 부착을 차단하는 P-카드헤린 항체의 능력을 측정하기 위해 이용되는 분석을 말한다. 상기 유형의 분석은, 예를 들면, P-카드헤린을 플라스틱과 같은 고체 지지체상에 고정화시킴으로써 수행될 수 있다. 이어서, P-카드헤린을 과발현하는 세포를 P-카드헤린-P-카드헤린 상호작용에 의해 고체 지지체에 부착시킨다. 그 다음, 부착 수준을 P-카드헤린 항체의 존재 및 부재하에 정량화할 수 있다. 이어서, 항체 농도의 함수로서 부착성을 IC₅₀ 값을 측정하는데 이용할 수 있다. 실시예 3은 P-카드헤린 항체에 대한 IC₅₀ 값을 측정하기 위해 사용된 P-카드헤린-의존성 세포 부착 분석에 대한 추가의 설명을 제공한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "P-카드헤린 의존성 세포 응집 분석"은 그 표면상에 P-카드헤린을 발현하는 세포의 응집을 차단하는 P-카드헤린 항체의 능력을 측정하기 위한 분석을 말한다. 예를 들면, 상기 유형의 분석은 P-카드헤린을 과발현하는 세포주를 사용할 수 있는데, 이때 상기 세포는 현탁액으로 제공되어 P-카드헤린-의존성 응집체를 형성하게 된다. 이어서, 응집 분석을 이용하여 항체의 존재 및 부재하에 야기된 세포 응집체의 크기를 측정함으로써 상기 응집을 방지하는 P-카드헤린 항체의 능력을 정량화한다. 이어서, P-카드헤린 항체 농도의 함수로서 세포 응집체 크기를 IC₅₀ 값을 측정하는데 이용할 수 있다. 실시예 4는 여러 P-카드헤린 항체에 대한 IC₅₀ 값을 측정하기 위해 사용된 P-카드헤린-의존성 응집 분석에 대한 추가의 설명을 제공한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "P-카드헤린-의존성 타원체 붕괴 분석"은 미리-형성된 P-카드헤린-의존성 세포 응집을 파괴하는 P-카드헤린 항체의 능력을 측정하기 위한 분석을 말한다. 항체 농도의 함수로서 응집체의 크기 감소를 측정하여 IC₅₀ 값을 측정할 수 있다. 실시예 5는 P-카드헤린 항체에 대한 IC₅₀ 값을 측정하기 위해 사용된 P-카드헤린-의존성 타원체 붕괴 분석에 대한 추가의 설명을 제공한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "분자 선택성"은 관련 항원에 대한 친화도보다 큰 특정 항원에 대한 항체의 결합 친화도를 말한다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 E-카드헤린에 비해 P-카드헤린에 선택성일 수 있다, 즉, P-카드헤린에 대한 항체의 결합 친화도가 E-카드헤린에 대한 것보다 2배 이상, 예를 들면, 4배 또는 10배 또는 50배 또는 100배 이상일 수 있다는 의미이다. 상기 결합 친화도는 당해 분야에 기술을 가진 자에게 공지된 표준 기술을 사용하여 측정할 수 있다.

용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이 결합하거나 또는 분자와 상호작용할 수 있는 임의의 단백질 결정인자를 포함한다. 에피토프 결정인자는 일반적으로 분자의 화학적으로 활성인 표면 기들, 예를 들면, 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄로 이루어지며, 일반적으로 특정한 3차원 구조적 특성, 및 특정한 전하 특성을 갖는다. 에피토프는 "선형"이거나 "입체형태적"일 수 있다. 선형 에피토프에서, 단백질과 상호작용 분자(예를 들면, 항체) 사이의 모든 상호작용 지점들은 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 직선으로 존재한다. 입체형태적 에피토프에서, 상호작용 지점들은 서로 분리되어 있는 단백질상의 아미노산 잔기를 가로질러 존재한다. 일단 항원상에 목적하는 에피토프가 결정되면, 예를 들어, 본 발명에 기술된 기술을 이용하여 상기 에피토프에 대한 항체를 생성하는 것이 가능하다. 또는, 발견 과정중에, 항체의 생성 및 특성화에 의해 바람직한 에피토프에 대한 정보가 밝혀질 수 있다. 상기 정보로부터, 동일 에피토프에 대한 결합에 대해 항체를 경쟁적으로 검색하는 것이 가능하다. 이것을 달성하기 위한 접근방법은 서로와 경쟁적으로 결합하는 항체를 찾아내기 위한 교차-경쟁 연구를 수행하는 것이다, 즉 항체는 항원에 대한 결합에 대해 경쟁한다. 그의 교차-경쟁을 기초로 한 항체를 "수용(binning)"하기 위한 고효율 공정이 국제 특허 공개번호 WO 03/48731 호에 기술되어 있다.

본원에서 항체와 관련하여 사용된 바와 같이, 용어 "경쟁하다"는 제 1 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 제 2 항체 또는 그의 항원-결합 부분과의 결합에 대해 경쟁하는 것을 의미하는데, 이때 제 1 항체와 그 동족 에피토프와의 결합은 제 2 항체의 부재하에서 제 1 항체의 결합에 비해 제 2 항체의 존재하에서 검출가능하게 감소된다. 그 에피토프에 대한 제 2 항체의 결합이 또한 제 1 항체의 존재하에 검출가능하게 감소되는 대안이 있을 수 있으나 반드시 그렇지는 않다. 즉, 제 1 항체는 제 1 항체의 그 각각의 에피토프에 대한 결합을 억제하는 제 2 항체 없이 그 에피토프에 대한 제 2 항체의 결합을 억제할 수 있다. 그러나, 각각의 항체가 다른 항체와 그의 동족 에피토프 또는 리간드와의 결합을 동일하거나 더 크거나 더 적은 정도로 억제하는 경우, 항체는 그 각각의 에피토프(들)의 결합에 대해 서로 "교차-경쟁"한다고 말한다. 경쟁 및 교차-경쟁 항체는 모두 본 발명에 포함된다. 상기 경쟁 또는 교차-경쟁이 일어나는 메카니즘(예를 들면, 입체 장애, 형태 변화, 또는 공통 에피토프 또는 그의 부분에 대한 결합 등)에 무관하게, 숙련된 전문가라면 본원에 제공된 교지내용을 기초로 상기 경쟁 및/또는 교차-경쟁 항체가 포함되며 본원에 개시된 방법에 유용할 수 있음을 인지할 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 특정 유전자와 관련하여 "사용한다"는 용어는 항체내 특정 영역의 아미노산 서열이 궁극적으로 B-세포 성숙동안 상기 유전자로부터 유도되었음을 의미한다. 예를 들면, 인간 V_H-3 부류 유전자를 사용하는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열"이란 어구는 항체의 V_H 영역이 B-세포 성숙시 유전자 단편의 V_H-3 부류로부터 유도된 상황을 말한다. 인간 B-세포에는, 항체를 생성하는 30개 이상의 별개의 기능성 중쇄 가변 유전자가 존재한다. 그러므로, 특정 중쇄 가변 유전자의 사용은 항원에 결합하는 성질과 기능적 활성의 조합에 대해 항체-항원 상호작용의 바람직한 결합 모티프를 나타낸다. 인지하듯이, 유전자 활용 분석은 항체 구조에 대한 제한된 개관만을 제공한다. 인간 B-세포는 확률적으로 V-D-J 중쇄 또는 V-J 카파 경쇄 전사체를 생성하므로, 제한하지 않고, 체세포 과돌연변이, n-부가 및 CDR3 연장을 포함하여 많은 2차 과정들이 일어난다(예를 들면, 문헌 [Mendez et al., Nature Genetics, 15:146-156, 1997] 참조).

본원에서 사용된 바와 같이, 20개의 통상적인 아미노산 및 그의 약어는 통상적인 관례를 따른다(본원에 참고로 인용된 문헌 [Immunology - A Synthesis, 2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass., 1991] 참조).

본원에 언급된 바와 같이 용어 "폴리뉴클레오티드"는 길이가 10개 이상의 염기로 된 뉴클레오티드의 중합체 형태, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 어느 한 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태를 의미한다. 상기 용어는 단일 및 이중 가닥 형태를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 게놈, cDNA, 또는 합성 기원, 또는 그의 일부 조합의 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 이때 그 기원에 의해, "단리된 폴리뉴클레오티드"는 (1) "단리된 폴리뉴클레오티드"가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 일부와 결합하지 않거나, (2) 자연에서는 결합되지 않는 폴리뉴클레오티드에 작용가능하게 결합되거나, (3) 보다 거대 서열의 일부로서 자연에서는 존재하지 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "천연 뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 변형되거나 치환된 당 기를 갖는 뉴클레오티드 등을 포함한다. 본원에 언급된 용어 "올리고뉴클레오티드 결합"은 포스포로티오에이트, 포스포리다이티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로다이셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포로아닐라데이트, 프소포로아미데이트 등과 같은 올리고뉴클레오티드 결합을 포함한다. 예를 들면, 본원에 참고로 인용된 문헌 [LaPlanche, et al., Nucl . Acids Res., 14:9081, 1986; Stec, et al., J. Am . Chem . Soc., 106:6077, 1984; Stein, et al., Nucl . Acids Res., 16:3209, 1988; Zon, et al., Anti-Cancer Drug Design, 6:539, 1991; Zon, et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp.87-108, F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England, 1991]; 미국 특허 제 5,151,510 호; [Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews, 90:543, 1990]을 참조하시오. 올리고뉴클레오티드는 경우에 따라 검출용 표지를 포함할 수 있다.

"작용가능하게 연결된" 서열은 문제의 유전자와 인접한 발현 조절 서열 및 문제의 유전자를 조절하도록 트랜스로 또는 떨어져 작용하는 발현 조절 서열 둘 다를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현 조절 서열"은 이들이 접합되는 암호 서열의 발현 및 프로세싱을 수행하는데 필수적인 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 발현 조절 서열은 적절한 전사 개시, 종료, 프로모터 및 증강인자 서열; 접합 및 폴리아데닐화 신호와 같은 유효 RNA 프로세싱 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 증대시키는 서열(즉, 코작(Kozak) 공통 서열); 단백질 안정성을 증대시키는 서열, 및 바람직한 경우, 단백질 분비를 증대시키는 서열을 포함한다. 상기 조절 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 달라진다; 원핵생물에서, 상기 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종료 서열을 포함한다; 진핵생물에서는, 상기 조절 서열은 일반적으로 프로모터 및 전사 종료 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열"은 적어도, 그 존재가 발현 및 프로세싱에 필수적인 모든 성분들을 포함하는 것이며, 또한 그 존재가 유리한 추가의 성분들, 예를 들면, 리더 서열 및 융합 상대 서열을 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 그에 결합된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 일부 태양에서, 벡터는 플라스미드, 즉, 그중에 추가의 DNA 단편이 접합될 수 있는 DNA의 원형 이중 가닥 단편이다. 일부 태양에서, 벡터는 추가의 DNA 단편이 바이러스 게놈중에 접합될 수 있는 바이러스 벡터이다. 일부 태양에서, 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자동 복제될 수 있다(예를 들면, 세균 복제 기원을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 태양에서, 벡터(예를 들면, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포내에 도입시 숙주 세포의 게놈내로 통합될 수 있으며, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 이들이 작용가능하게 결합되는 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")로 언급된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입되는 세포를 의미한다. "재조합 숙주 세포" 및 "숙주 세포"는 특정 대상 세포 뿐 아니라 상기 세포의 자손을 의미하는 것임을 주지해야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 특정 변형이 일어날 수 있기 때문에, 상기 자손은 사실상 모세포에 동일할 수 있지만, 여전히 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "숙주 세포)의 범주내에 포함된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "생식세포주"는 생식 세포에 의해 모체로부터 자손까지 전달되는 바와 같은 항체 유전자 및 유전자 단편의 뉴클레오티드 서열을 말한다. 생식세포주 서열은 B 세포 성숙 과정동안 재조합 및 과돌연변이에 의해 변형된 성숙한 B 세포에서 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 구분된다.

핵산 서열과 관련하여 용어 "서열 동일성 퍼센트"는 최대 일치를 위해 정렬될 때 동일한 두 서열중의 잔기를 의미한다. 서열 동일성 비교 길이는 약 9개 이상의 뉴클레오티드, 통상적으로 약 18개 이상의 뉴클레오티드, 보다 통상적으로 약 24개 이상의 뉴클레오티드, 전형적으로 약 28개 이상의 뉴클레오티드, 보다 전형적으로 약 32개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 36개, 48개 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 범위 이상일 수 있다. 뉴클레오티드 서열 동일성을 측정하기 위해 사용될 수 있는, 당해 분야에 공지된 많은 상이한 알고리듬들이 존재한다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열은 위스콘신 패키지 버전(Wisconsin Package Version) 10.0(제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group, GCG), 위스콘신주 매디슨)의 프로그램인 파스타(FASTA), 갭(Gap) 또는 베스트핏(Bestfit)을 이용하여 비교할 수 있다. 예를 들어, 프로그램 파스타2 및 파스타3를 포함한 파스타는 조회 및 검색 서열 사이에 가장 중첩되는 영역들의 배열 및 서열 동일성 퍼센트를 제공한다(본원에 참고로 인용된 문헌 [Pearson, Methods Enzymol., 183:63-98, 1990; Pearson, Methods Mol . Biol., 132:185-219, 2000; Pearson, Methods Enzymol., 266:227-258, 1996; Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84, 1998]). 달리 명시하지 않는 한, 특정 프로그램 또는 알고리듬에 대한 기본 파라미터를 사용한다. 예를 들면, 핵산 서열사이의 서열 동일성 퍼센트는 그 기본 파라미터(6의 글자 크기 및 점수 행렬에 대한 노팜(NOPAM) 계수)를 갖는 파스타를 사용하거나, 또는 본원에 참고로 인용된 GCG 버전 6.1에 제공된 바와 같은 기본 파라미터를 갖는 갭을 사용하여 측정할 수 있다.

뉴클레오티드 서열에 대한 언급은 달리 명시하지 않는 한 그의 보체를 포함한다. 따라서, 특정 서열을 갖는 핵산에 대한 언급은 그의 상보성 서열과 함께 그의 상보성 가닥을 포함하는 것으로 이해해야 한다.

핵산 또는 그의 단편을 언급할 때, 용어 "실질적인 유사성" 또는 "실질적인 서열 유사성"은, 또 다른 핵산(또는 그의 상보성 가닥)으로 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실하에 최적으로 정렬될 때, 상기 논의한 바와 같은 파스타(FASTA), 블라스트(BLAST) 또는 갭(Gap)과 같은 임의의 공지된 서열 동일성 알고리듬으로 측정하여 뉴클레오티드 염기의 약 85% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상에 뉴클레오티드 서열 동일성이 존재함을 의미한다.

아미노산 서열과 관련하여 용어 "서열 동일성 퍼센트"는 최대 일치를 위해 정렬될 때 동일한 두 서열중의 잔기를 의미한다. 서열 동일성 비교 길이는 약 5개 이상의 아미노산, 통상적으로 약 20개 이상의 아미노산, 보다 통상적으로 약 30개 이상의 아미노산, 전형적으로 약 50개 이상의 아미노산, 보다 전형적으로 약 100개 이상의 아미노산, 보다 더 전형적으로 약 150, 200개 또는 그 이상의 아미노산의 범위 이상일 수 있다. 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위해 사용될 수 있는, 당해 분야에 공지된 많은 상이한 알고리듬들이 존재한다. 예를 들면, 아미노산 서열은 위스콘신 패키지 버전(Wisconsin Package Version) 10.0(제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group, GCG), 위스콘신주 매디슨)의 프로그램인 파스타(FASTA), 갭(Gap) 또는 베스트핏(Bestfit)을 이용하여 비교할 수 있다.

폴리펩티드에 적용될 때, 용어 "실질적인 동일성" 또는 "실질적인 유사성"은, 두 아미노산 서열이, 프로그램과 함께 공급된 바와 같은 기본 갭 중량을 이용하여 프로그램 갭 또는 베스트핏에 의해 최적으로 정렬될 때, 70%, 75% 또는 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다. 특정 태양에서, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다.

본원에서 사용된 바와 같이, "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 성질(예를 들면, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 R기를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 실질적으로 단백질의 기능적 특성을 변화시키지 않는다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우, 서열 동일성 퍼센트는 치환의 보존적 특성을 조정하기 위해 상향 조절될 수 있다. 상기 조절을 수행하는 방법은 당해 분야의 전문가에게 공지되어 있다(예를 들면, 문헌 [Pearson, Methods Mol . Biol., 243:307-331, 1994] 참조). 유사한 화학적 성질을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 군의 예로는 1) 지방족 측쇄: 글라이신, 알라닌, 발린, 류신 및 아이소류신; 2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아마이드-함유 측쇄: 아스파라진 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 라이신, 아르기닌 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파트산 및 글루탐산; 및 7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌이 포함된다. 예를 들면, 보존적 아미노산 치환 군은 발린-류신-아이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파테이트 및 아스파라긴-글루타민일 수 있다.

또는, 보존적 치환은 본원에 참고로 인용된 문헌 [Gonnet et al., Science, 256:1443-1445, 1992]에 개시된 팜(PAM)250 로그-유사 행렬에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. "중간정도로 보존적" 치환은 팜250 로그-유사 행렬에서 음이 아닌 값을 갖는 임의의 변화이다.

폴리펩티드에 대한 서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 측정한다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함하여 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 지정된 유사성의 척도를 이용하여 서열을 매치시킨다. 예를 들면, GCG는 밀접하게 관련된 폴리펩티드, 예를 들면, 상이한 유기체 종으로부터의 상동 폴리펩티드 사이, 또는 야생형 단백질과 그 유사체 사이에서 서열 상동성 또는 서열 동일성을 측정하기 위한 프로그램에 의해 지정된 바와 같은 기본 파라미터하에 사용될 수 있는 "갭" 및 "베스트핏"과 같은 프로그램을 포함한다(예를 들면, GCG 버전 6.1(위스콘신주 유니버시티 오브 위스콘신) 참조). 폴리펩티드 서열은 또한 기본 또는 권장 파라미터를 사용하여 파스타를 이용하여 비교할 수 있다(GCG 버전 6.1 참조). 파스타(예를 들면, 파스타2 및 파스타3)는 조회 검색 서열 사이에 가장 잘 중첩되는 영역의 배열 및 서열 동일성 퍼센트를 제공한다[Pearson, Methods Enzymol., 183:63-98, 1990; Pearson, Methods Mol . Biol., 132:185-219, 2000]. 본 발명의 서열을 상이한 유기체로부터 많은 서열을 포함하는 데이터베이스에 비교하는 경우 또 다른 바람직한 알고리듬은 프로그램과 함께 공급되는 기본 파라미터를 이용하는 컴퓨터 프로그램 블라스트, 특히 블라스트p 또는 t블라스트n이다(예를 들면, 문헌 [Altschul, et al., J. Mol . Biol., 215:403-410, 1990; Altschul, et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997] 참조).

상동성에 대해 비교된 폴리펩티드 서열의 길이는 일반적으로 약 16개 이상의 아미노산 잔기, 통상적으로 약 20개 이상의 잔기, 보다 통상적으로 약 24개 이상의 잔기, 전형적으로 약 28개 이상의 잔기, 바람직하게는 35개 이상의 잔기이다. 많은 상이한 유기체로부터의 서열을 포함하는 데이터베이스를 검색하는 경우, 아미노산 서열을 비교하는 것이 바람직하다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표지" 또는 "표지된"은 항체중 또 다른 분자의 혼입을 말한다. 한 태양에서, 표지는 검출가능한 마커, 예를 들면, 방사성표지된 아미노산의 혼입, 또는 표지된 아비딘(예를 들면, 광학적 또는 색측정 방법에 의해 검출될 수 있는 형광성 마커 또는 효소 활성을 함유하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 잔기의 폴리펩티드에 대한 부착이다. 또 다른 태양에서, 표지 또는 마커는 치료용, 예를 들면, 약물 결합체 또는 독소일 수 있다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지하는 다양한 방법이 당해 분야에 공지되어 있으며 이용할 수 있다. 폴리펩티드에 대한 표지의 예로는 다음이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다: 방사성동위원소 또는 방사성핵종(예를 들면, ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹ln, ¹²⁵I, ¹³¹I), 형광성 표지(예를 들면, FITC, 로다민, 란타나이드 인광체), 효소 표지(예를 들면, 양고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광체 마커, 비오티닐 군, 2차 리포터에 의해 인지되는 미리 결정된 폴리펩티드 에피토프(예를 들면, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 영역, 에피토프 표식), 자기 물질, 예를 들면, 가돌리늄 킬레이트, 독소, 예를 들면, 백일해 독소, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 다이하이드록시 안트라신 다이온, 미토잔트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀올 및 퓨로마이신, 및 그의 유사체 또는 동족체. 일부 태양에서, 표지는 가능한 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 팔에 의해 결합된다.

"치료 효과량"은 치료될 질환의 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감시킬, 투여되는 치료제의 양을 말한다. 암의 치료와 관련하여, 치료 효과량은 다음의 효과 중 하나 이상을 갖는 양을 말한다: 종양 크기 감소; 종량 전이 억제(즉, 다소 지연, 바람직하게는 중단); 종양 성장의 다소의 억제(즉, 다소 지연, 바람직하게는 중단); 및 암과 관련된 하나 이상의 증상의 다소의 완화(또는, 바람직하게는 제거).

"치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 생물학적 이상 및/또는 그의 수반 증상을 완화 또는 제거하는 방법을 말한다. 암과 관련하여, 상기 용어들은 단순히 암에 걸린 개인의 기대 수명이 증가되거나, 또는 질환의 하나 이상의 증상이 경감될 것을 의미한다.

"접촉하는"은 항체가 P-카드헤린의 생물 활성에 영향을 미칠 수 있는 방식으로 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 표적 P-카드헤린 또는 그의 에피토프와 결합시키는 것을 말한다. 상기 "접촉"은 "시험관내에서", 즉, 시험관, 페트리 접시 등에서 수행될 수 있다. 시험관에서, 접촉은 단지 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 P-카드헤린 또는 그의 에피토프만을 포함할 수 있거나 또는 전체 세포를 포함할 수 있다. 세포는 또한 세포 배양 접시에서 유지되거나 성장하고 그 환경에서 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 접촉할 수 있다. 이와 관련하여, P-카드헤린-관련 이상에 영향을 미치는 특정 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 능력, 즉, 항체의 IC₅₀은 보다 복잡한 살아있는 유기체에 생체내로 항체를 사용하는 것을 시도하기 전에 측정될 수 있다. 유기체 밖의 세포의 경우, P-카드헤린을 항체 또는 그의 항원-결합 부분과 접촉시키기 위한 다수의 방법이 존재하며 당해 분야에 전문가에게 공지되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "이상 세포 성장"은 달리 언급하지 않는 한 정상 세포의 이상 성장 및 이상 세포의 성장을 포함하여 정상적인 조절 메카니즘(예를 들면, 접촉 억제 상실)과 무관한 세포 성장을 말한다. 여기에는 다음의 이상 성장이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다: 돌연변이된 티로신 키나제를 발현시킴으로써 또는 수용체 티로신 키나제의 과발현에 의해 증식하는 종양 세포(종양들); 이상 티로신 키나제 활성화가 일어나는 다른 증식성 질환의 양성 및 악성 세포; 수용체 티로신 키나제에 의해 증식하는 임의의 종양; 이상 세린/트레오닌 키나제 활성화에 의해 증식하는 임의의 종양; 이상 세린/트레오닌 키나제 활성화가 일어나는 다른 증식성 질환의 양성 및 악성 세포; 활성화된 Ras 종양유전자를 발현하는 양성 및 악성 종양; Ras 단백질이 또 다른 유전자에서 종양발생 돌연변이의 결과로 활성화되는 양성 및 악성 종양 세포; 이상 Ras 활성화가 일어나는 다른 증식성 질환의 양성 및 악성 세포. 상기 양성 증식성 질환의 예는 건선, 양성 전립선 비대증, 인간 파필로마 바이러스(HPV) 및 레스티노시스(restinosis)이다. "이상 세포 성장"은 또한 효소 파네실 단백질 트랜스퍼라제의 활성으로부터 비롯되는 양성 및 악성 세포의 이상 성장을 말하며 이를 포함한다.

용어 "이상 세포 성장" 및 "과증식성 이상"은 본 출원에서 상호교환적으로 사용된다.

"시험관내"는 제한하지 않고 시험관 또는 배양 배지와 같은 인공적 환경에서 수행되는 절차를 말한다.

"생체내"는 제한하지 않고 마우스, 래트 및 토끼와 같은 살아있는 유기체내에서 수행되는 절차를 말한다.

인간 P- 카드헤린 항체

본 발명은 인간 P-카드헤린에 결합하는 분리된 인간 항체 또는 그의 항원-결합 부분에 관한 것이다. 바람직하게, 인간 항체는 E-카드헤린보다 P-카드헤린에 대해 더 큰 친화도를 갖는 재조합 인간 P-카드헤린 항체이다. 본 발명의 다양한 태양은 상기 항체 및 항원-결합 부분, 그의 약학 조성물, 및 상기 항체 및 항원-결합 부분을 제조하기 위한 핵산, 재조합 발현 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 시험관내 또는 생체내에서, 인간 P-카드헤린을 검출하거나 또는 인간 P-카드헤린 활성을 억제하기 위해 본 발명의 항체 및 항원-결합 부분을 사용하는 방법도 또한 본 발명에 포함된다.

인간을 포함하여 여러 종으로부터의 P-카드헤린 아미노산 및 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있다(예를 들면, 기탁번호 NM 001793.3 참조). 인간 P-카드헤린 또는 그의 항원 결합 부분은 당해 분야에 전문가에 공지된 방법에 따라 제조할 수 있거나, 또는 상업적 판매처에서 구입할 수 있다(예를 들면, R&D 시스템즈 861-PC-100).

특정 태양에서, 본 발명의 항체는 다음으로 나타내는 IgG이다: 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; 및 g-129-1c4. 실시예 1에서 더 상세히 논의하는 바와 같이, scFv 파아지 디스플레이 라이브러리의 고효율 검색을 이용하여 129-1c4 scFv를 확인하고, 이어서 이것을 IgG로 전환시켰다. 129-1c4는 초기 파아지 디스플레이 검색시 확인된 리더 항체를 나타내며, 그로부터 본 발명의 여러 다른 항체가 유도된 계통의 모 항체이다. 상기 유도된 여러 항체는 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 및 200-h06으로 표시하며; 129-1c4 모 계통내의 최적화된 항체를 나타낸다. g-129-1c4 항체는 V_H 및 V_L 영역의 골격 영역중 특정 아미노산이 생식세포주 골격 영역중 상기 아미노산에 매치되도록 돌연변이된 129-1c4 모 항체의 생식세포주 버전이다. 상기 언급한 항체 중 임의의 항체는 또한 골격 영역 서열이 g-129-1c4와 같은 생식세포주 골격 서열에 동일하도록 생식세포주형성될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 한 태양에서, 항체 g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-195-e11; g-200-h06; 및 g-194-e06은 194-b09; 194-g09; 196-g03; 196-h02; 194-e01; 195-e11; 200-h06; 및 194-e06 각각의 생식세포주 버전이다. 생식세포주 버전에 도달하도록 돌연변이된 특정 아미노산은 생식세포주 대 비-생식세포주 항체의 서열을 비교함으로써 당해 분야에 숙련가에게 명백하다. 하기에서 논의하는 바와 같이, 본 발명 항체들의 특정 아미노산 서열은 표 1 내지 3 및 도 1에 기재되어 있다.

본 발명의 항체는 중쇄 가변 영역의 V_H3 유전자 부류의 사용에 매우 치우쳐 생성되었다. 특히, 129-1c4 모 항체는 V_H3-23 가변 유전자 단편으로부터 유도되었다. 인간 B-세포에는, 항체를 생성하기 위한 30개 이상의 뚜렷한 기능성 중쇄 가변 유전자들이 존재한다. 그러므로, 치우침(bias)은 항원에 대한 결합 및 기능적 활성의 조합 특성들에 대해 항체-항원 상호작용의 바람직한 결합 모티프이다.

인지하듯이, 유전자 활용 분석은 항체 구조에 대한 제한된 개관만을 제공한다. 인간 B-세포는 통계학적으로 V-D-J 중쇄 또는 V-J 카파 경쇄 전사체를 생성하지만, 제한하지 않고 체세포 과돌연변이, n-부가 및 CDR3 연장을 포함하여 일어나는 많은 2차 공정이 존재한다(예를 들면, 문헌 [Mendez et al., Nature Genetics, 15:141-156, 1997] 및 2002년 2월 19일자 미국 공개 특허출원 제 2003-0070185 호 참조). 따라서, 본 발명의 항체 구조를 더 조사하기 위해, 항체의 예상된 아미노산 서열을 클론으로부터 수득된 cDNA로부터 생성하였다. 또한, N-말단 아미노산 서열은 단백질 서열분석을 통해 수득되었다. 도 1은 본 발명의 여러 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 제공한다.

상기 언급한 각각의 특정 항체는 표 1 및 2에 나타낸 바와 같이, 중쇄(V_H) 및 경쇄(V_L)의 가변 영역 서열에 의해 설명된다. 상기 서열번호들에 대해 언급되는 특정 서열을 도 1에 나타내었다. 표 1 및 2에서 보이듯이, 상기 언급한 항체의 상응하는 V_H 및 V_L 아미노산 및 DNA 서열을 서열번호: 1-23, 68-90 및 320-343으로 기술된다.

본 발명의 추가의 항체 및 항원-결합 부분은 또한 표 1 및 2에 나타낸 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 구성하는 다양한 CDR 및 FR 서열을 포함하는 것으로 설명될 수 있다. 따라서, 본 발명 항체의 다양한 CDR 및 FR 서열에 상응하는 서열번호를 표 3에 나타낸다. 또한, 129-1c4 모 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역에서 많은 무작위 돌연변이도 또한 수행하여, 에피토프 경쟁 분석(실시예 8 참조)으로 측정할 때 10배 내지 417배 범위의 개선된 P-카드헤린 친화도를 얻었다. 상기 돌연변이 V_H 및 V_L CDR3 서열의 서열번호(서열번호: 91 내지 256 및 257 내지 319)도 또한 하기 표 3에 포함되어 있다.

항체 생성 방법

파아지 디스플레이 라이브러리

본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분은 당해 분야에 공지된 여러 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 파아지 디스플레이 기술을 이용하여 P-카드헤린에 대해 다양한 친화도를 갖는 항체 레퍼토리를 포함하는 라이브러리를 제공할 수 있다. 이어서, 이들 라이브러리를 검색하여 P-카드헤린에 대해 목적하는 친화도를 갖는 항체를 확인하고 분리할 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 재조합 인간 P-카드헤린 항체는 재조합 조합 항체 라이브러리를 검색하여 분리할 수 있다. 바람직하게, 라이브러리는 인간 B 세포로부터 분리된 mRNA로부터 제조된 인간 V_L 및 V_H cDNA를 사용하여 생성된 scFv 파아지 디스플레이 라이브러리이다. 상기 라이브러리를 제조하고 검색하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 파아지 디스플레이 라이브러리를 구축하기 위한 키트는 상업적으로 시판한다(예를 들면, 파마시아 재조합 파아지 항체 시스템(the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System), 카탈로그 번호 27-9400-01; 및 스트레이트진 서프잽(Strategene SurfZAP, 등록상표) 파아지 디스플레이 키트, 카탈로그 번호 240612). 항체 디스플레이 라이브러리를 구축하고 검색하는데 사용될 수 있는 다른 방법 및 시약도 또한 존재한다(예를 들면, 본원에 참고로 인용된, 미국 특허 제 5,223,409 호; PCT 공개 번호 WO 92/18619 호, WO 91/17271 호, WO 92/20791 호, WO 92/15679 호, WO 93/01288 호, WO 92/01047 호 및 WO 92/09690 호; 문헌 [Fuchs et al., Bio / Technology, 9:1370-1372, 1991; Hay, et al., Hum . Antibod . Hybridomas, 3:81-85, 1992; Huse, et al., Science, 246:1275-1281, 1989; McCafferty et al., Nature, 348:553-554, 1990; Griffiths, et al., EMBO J., 12:725-734, 1993; Hawkins, et al., J. Mol . Biol., 226:889-896, 1991; Clackson, et al., Nature, 352:624-628, 1991; Gram, et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 89:3576-3580, 1992; Garrad, et al., Bio / Technology, 9:1373-1377, 1991; Hoogenboom, et al., Nuc . Acid Res., 19:4133-4137, 1991; Barbas, et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 88:7978-7982, 1991; and Griffiths, et al., EMBO J., 13:3245-3260, 1994] 참조).

파아지 디스플레이 기술에 사용하기 위한 항체의 라이브러리를 제조하기 위한 또 다른 방법은, 인간 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물을 P-카드헤린 또는 그의 항원 부분으로 면역화시키고, 면역화된 동물로부터 항체-생성 세포를 추출하고; RNA 암호화 중쇄 및 경쇄의 본 발명의 항체를 분리하고, RNA를 역전사시켜 cDNA를 생성한 다음 cDNA를 프라이머를 사용하여 증폭하고, 항체 파아지상에서 발현하도록 cDNA를 파아지 디스플레이 벡터내에 삽입시키는 단계를 포함한다. 상기 레퍼토리를 작성하기 위해, 면역화된 동물로부터 B 세포를 불멸화시키는 것을 불필요하다. 오히려, 1차 B 세포를 DNA 공급원으로 바로 사용할 수 있다. 예를 들면, 비장으로부터 유도된 B 세포로부터 수득된 cDNA 혼합물을 사용하여 발현 라이브러리, 예를 들면, 이. 콜라이에 형질감염된 파아지 디스플레이 라이브러리를 제작한다. 궁극적으로, 라이브러리로부터 항원에 대해 목적하는 수준의 결합 친화도를 제공하는 클론을 동정하고, 상기 결합을 담당하는 생성물을 암호화하는 DNA를 회수하고 표준 재조합 발현을 위해 조작한다. 미리 조작된 뉴클레오티드 서열을 사용하여 파아지 디스플레이 라이브러리도 또한 구축하고 유사한 방식으로 검색할 수 있다. 일반적으로, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA를 독립적으로 공급하거나 결합하여 파아지 라이브러리의 제작을 위한 Fv 유사체를 생성한다. 그 다음, 파아지 라이브러리를 P-카드헤린에 대해 최고의 친화도를 갖는 항체에 대해 검색하고 적절한 클론으로부터 유전자 물질을 회수한다. 추가의 검색 회수는 분리된 원래 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다.

한 태양에서, 바람직한 특성을 갖는 인간 P-카드헤린 항체를 분리하고 생성하기 위해, 본원에 기술된 바와 같은 인간 P-카드헤린 항체를 먼저, 본원에 참고로 인용된 PCT 공개번호 WO 93/06213 호에 기술된 에피토프 인식 방법을 이용하여 P-카드헤린에 대해 유사한 결합 활성을 갖는 인간 중쇄 및 경쇄 서열을 선별하는데 사용한다. 본 방법에 사용된 항체 라이브러리는 바람직하게는 본원에 참고로 인용된 PCT 공개번호 WO 92/01047 호, 문헌 [McCafferty, et al., Nature, 348:552-554, 1990; and Griffiths, et al., EMBO J., 12:725-734, 1993]에 기술된 바와 같이 제조되고 검색된 scFv 라이브러리이다. scFv 항체 라이브러리는 항원으로 인간 P-카드헤린을 사용하여 검색할 수 있다. 파아지 라이브러리를 P-카드헤린에 대해 최고의 친화도를 갖는 항체에 대해 검색하고 적절한 클론으로부터 유전자 물질을 회수한다. 추가의 검색 회수는 분리된 원래 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다.

일단 초기 인간 V_L 및 V_H 영역이 선택되면, 초기에 선택된 V_L 및 V_H 단편의 상이한 쌍을 P-카드헤린 결합에 대해 검색하여 바람직한 V_L/V_H 쌍 조합을 선별하는 "맥스 앤 매치(mix and match)" 실험을 수행한다. 상기 믹스 앤 매치 실험은 또한 V_H 및 V_L 단편이 하기에 기술하는 바와 같이 최적화된 결합을 위해 무작위로 돌연변이된 후에 수행할 수 있다. 또한, 항체의 질을 더 개선하기 위해, 천연 면역 반응시에 항체의 친화도 성숙을 담당하는 생체내 체세포 돌연변이 과정과 유사한 과정에서, 바람직하게는 V_H 및/또는 V_L의 CDR3 영역내에서, 바람직한 V_L/V_H 쌍(들)의 V_L 및 V_H 단편을 무작위로 돌연변이시킬 수 있다. 상기 시험관내 친화도 성숙은, 예를 들면, V_H CDR3 또는 V_L CDR3에 상보성인 PCR 프라이머를 각각 이용하여 V_H 및 V_L 영역을 증폭시킴으로써 수행할 수 있는데, 상기 프라이머는 생성된 PCR 산물이 무작위 돌연변이가 V_H 및/또는 V_L CDR3 영역내로 도입된 V_H 및 V_L 단편을 암호화하도록 특정 위치에서 4개의 뉴클레오티드 염기의 무작위 혼합물이 "혼입"된 것이다. 상기 무작위 돌연변이된 V_H 및 V_L 단편은 P-카드헤린에 대한 결합에 대해 재검색될 수 있으며, P-카드헤린에 대해 높은 친화도 및 낮은 오프 속도를 나타내는 서열을 선택할 수 있다. 앞에서 논의한 바와 같이, 무작위 돌연변이되고 개선된 친화도를 나타내는 본 발명의 여러 V_H 및 V_L CDR3 서열은 서열번호: 91 내지 256 및 257 내지 319로 나타낸다.

재조합 면역글로불린 디스플레이 라이브러리로부터 본 발명의 P-카드헤린 항체의 검색 및 분리 후에, 선택된 항체를 암호화하는 핵산을 디스플레이 패키지로부터(예를 들면, 파아지 게놈으로부터) 회수하고 표준 재조합 DNA 기술에 의해 다른 발현 벡터에 서브클로닝할 수 있다. 경우에 따라, 하기에 기술하는 바와 같이 본 발명의 다른 항체 형태를 생성하기 위해 핵산을 더 조작할 수 있다. 조합 라이브러리의 검색에 의해 분리된 재조합 인간 항체를 발현하기 위해, 항체를 암호화하는 DNA를 하기에 기술하는 바와 같이 재조합 발현 벡터내에 클로닝하고 숙주 세포에 도입힌다.

면역화

또 다른 태양에서, 인간 P-카드헤린 항체는 그 게놈내에 P-카드헤린 항원과의 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌 일부 또는 전부를 포함하는 비-인간 유전자이식 동물을 면역화시킴으로써 생성될 수 있다. 예를 들면, 비-인간 동물은 제노마우스(XENOMOUSE, 등록상표) 동물(압제닉스, 인코포레이티드(Abgenix, Inc.), 캘리포니아주 프레몬트)일 수 있다.

제노마우스(등록상표) 마우스는 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 거대 단편을 포함하고 마우스 항체 생성에 결함이 있는 공학처리된 마우스 균주이다(예를 들면, 문헌 [Green, et al., Nature Genetics, 7:13-21, 1994] 및 미국 특허 제 5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598, 6,130,364, 6,162,963 및 6,150,584 호, 및 또한 WO 91/10741 호, WO 94/02602 호, WO 96/34096 호, WO 96/33735 호, WO 98/16654, WO 98/24893 호, WO 98/50433 호, WO 99/45031 호, WO 99/53049 호, WO 00/09560 호, 및 WO 00/037504 호 참조).

상기 문헌들에 개시된 방법은 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 5,994,619 호에 기술된 바와 같이 변형될 수 있다. 미국 특허 제 5,994,619 호는 돼지와 소로부터 유도된 새로 배양된 내부 세포괴(cultured inner cell mass, CICM) 세포 및 세포주, 및 그중에 이종 DNA가 삽입된 유전자이식 CICM 세포를 생성하는 방법을 기술하고 있다. CICM 유전자이식 세포를 사용하여 클로닝된 유전자이식 배, 태아 및 자손을 생성할 수 있다. 상기 제 5,994,619 호 특허는 또한 이종 DNA를 그의 자손에게 전달할 수 있는 유전자이식 동물을 생성하는 방법을 기술하고 있다. 상기 방법에 사용할 수 있는 비-인간 동물의 예로는 래트, 양, 돼지, 염소, 소, 닭 및 말이 포함된다.

제노마우스(등록상표) 마우스는 완전히 인간 항체의 성인-유사 인간 레퍼토리를 생성하며 항원-특이적 인간 항체를 생성한다. 일부 태양에서, 제노마우스(등록상표) 마우스는 효모 인공 염색체(YAC) 중 인간 중쇄 유전자좌 및 카파 경쇄 유전자좌의 메가염기쌍 크기의 생식세포주 구성 단편의 도입을 통해 인간 항체 V 유전자 레퍼토리의 약 80%를 함유한다. 다른 태양에서, 제노마우스(등록상표) 마우스는 인간 람다 경쇄 유전자좌의 거의 전부를 함유한다(본원에 참고로 인용된 문헌 [Mendez, et al., Nature Genetics, 15:146-156, 1997; Green and Jakobovits, J. Exp. Med., 188:483-495, 1998], 및 WO 98/24893 호 참조).

일부 태양에서, 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 비-인간 동물은 인간 면역글로불린 "미니유전자좌(minilocus)"를 갖는 동물이다. 미니유전자좌 접근방법에서, 외인성 Ig 유전자좌는 Ig 유전자좌로부터 개개의 유전자의 혼입을 통해 모방된다. 따라서, 하나 이상의 V_H 유전자, 하나 이상의 D_H 유전자, 뮤 불변 영역 및 제 2 불변 영역(바람직하게는 감마 불변 영역)이 동물내 삽입을 위한 구조물 중에 형성된다. 상기 접근방법은 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 5,545,807, 5,545,806, 5,569,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,591,669, 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215 및 5,643,763 호에 기술되어 있다.

이어서, 전술한 바와 같은 비-인간 동물을 항체 생성을 허용하는 조건하에서 하기에 기술하는 바와 같은 P-카드헤린 항원으로 면역화시킬 수 있다. 항체-생성 세포를 동물로부터 분리하고, 문제의 P-카드헤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산을 분리된 항체-생성 세포로부터 또는 상기 세포로부터 생성된 불멸화 세포주로부터 분리한다. 이들 핵산은 이어서 당해 분야의 전문가에게 공지되고 하기에 기술하는 바와 같은 기술을 이용하여 비-인간 서열의 양을 감소시키도록, 즉, 항체를 인간화시켜 인간에서의 면역 반응을 감소시키도록 처리한다.

일부 태양에서, P-카드헤린 항원은 분리되고/되거나 정제된 P-카드헤린일 수 있다. 일부 태양에서, P-카드헤린 항원은 인간 P-카드헤린이다. 다른 태양에서, P-카드헤린 항원은 P-카드헤린을 발현 또는 과-발현하는 세포일 수 있다. 다른 태양에서, P-카드헤린 항원은 효모, 곤충 세포, 이. 콜라이와 같은 세균, 또는 다른 공급원으로부터 재조합 기술에 의해 발현된 재조합 단백질이다. 동물의 면역화는 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 따를 수 있다(예를 들면, 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies : A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990] 참조). 마우스, 래트, 양, 염소, 돼지, 소 및 말과 같은 비-인간 동물을 면역화하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies : A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990] 및 미국 특허 제 5,994,619 호 참조). 예를 들면, P-카드헤린 항원은 면역 반응을 자극하기 위해 보조제와 함께 투여될 수 있다. 대표적인 보조제로는 완전 또는 불완전 프로인트(Freund) 보조제, RIBI(뮤라밀(muramyl) 다이펩티드) 또는 ISCOM(면역자극 복합체)가 포함된다. 상기 보조제는 폴리펩티드가 국소 침착물중에 그것을 봉쇄시킴으로써 신속히 분산되는 것을 보호하거나, 이들 보조제는 숙주가 대식세포 및 면역 시스템의 다른 성분들에 대해 화학주성인 인자를 분비하도록 자극하는 물질을 함유할 수 있다. 바람직하게, 폴리펩티드가 투여되는 경우에는, 면역화 일정은 여러주에 걸쳐 2번 이상의 폴리펩티드 투여를 포함할 것이다.

예를 들면, 전술한 바와 같은 유전자이식 동물을 P-카드헤린으로 면역화한 후에, 1차 세포(예를 들면, 비장 또는 말초혈 B 세포)를 면역화된 유전자이식 동물로부터 분리하고, 목적하는 항원에 특이적인 항체를 생성하는 개개 세포를 동정할 수 있다. 이어서, 각각의 개별적 세포로부터 폴리아데닐화 mRNA를 분리하고, 가변 영역 서열을 어닐링시키는 센스 프라이머(예를 들면, 인간 중쇄 및 경쇄 영역 유전자의 FR1 영역의 대부분 또는 전체를 인지하는 변성 프라이머 및 불변 영역 서열을 어닐링시키거나 연결시키는 안티-센스 프라이머)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 수행한다. 이어서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 cDNA를 클로닝하고 임의의 적절한 숙주 세포, 예를 들면, 골수종 세포에서, 각각의 면역글로불린 불변 영역, 예를 들면, 중쇄 및 κ 또는 λ 불변 영역과의 키메라 항체로서 발현시킨다(본원에 참고로 인용된 문헌 [Babcook, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 93:7843-7848, 1996] 참조). 이어서, P-카드헤린 항체를 본원에 기술한 바와 같이 동정하고 분리할 수 있다.

항체를 생성하는 재조합 방법

본 발명의 항체 또는 항체 부분은 숙주 세포에서 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자의 재조합 발현에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, 항체를 재조합적으로 발현시키기 위해, 항체의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA 단편을 갖는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시켜 경쇄 및 중쇄를 숙주 세포에서 발현시키고, 바람직하게는 숙주 세포가 배양되는 배지내로 분비시키고, 상기 배지로부터 항체를 회수할 수 있다. 표준 재조합 DNA 방법을 이용하여 항체 중쇄 및 경쇄 유전자를 수득하고, 이들 유전자를 재조합 발현 벡터에 혼입시키고, 본원에 참고로 인용된 문헌 [Sambrook, Fritsch and Maniatis(eds), Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Ausubel, F.M. et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1989] 및 미국 특허 제 4,816,397 호에 개시된 바와 같은 숙주 세포내에 벡터를 도입한다.

돌연변이 및 변형

본 발명의 P-카드헤린 항체를 발현시키기 위해, V_H 및 V_L 영역을 암호화하는 DNA 단편을 전술한 임의의 방법을 이용하여 먼저 수득할 수 있다. 다양한 돌연변이, 결실 및/또는 부가도 또한 당해 분야에 전문가에게 공지된 표준 방법을 이용하여 DNA 서열내로 도입할 수 있다. 예를 들면, PCR 생성물이 목적하는 돌연변이를 함유하도록 돌연변이된 뉴클레오티드를 PCR 프라이머에 혼입하는 PCR-매개 돌연변이유발, 또는 부위-지향 돌연변이유발과 같은 표준 방법을 이용하여 돌연변이유발을 수행할 수 있다. 예를 들어, 수행될 수 있는 치환의 한 유형은 항체중 하나 이상의 시스테인을 변화시키는 것으로, 이것은 또 다른 잔기, 예를 들면, 제한하지 않고 알라닌 또는 세린에 대해 화학적으로 반응성일 수 있다. 예를 들면, 비-정규 시스테인의 치환이 존재할 수 있다. 치환은 가변 영역의 CDR 또는 골격 영역에서 또는 항체의 불변 영역에서 이루어질 수 있다. 일부 태양에서, 시스테인은 정규 시스테인이다.

항체는 또한, 예를 들면, 항체의 결합성을 변화시키기 위해 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역에서 돌연변이될 수 있다. 예를 들면, P-카드헤린에 대한 항체의 K_D를 증가 또는 감소시키거나, k_off를 증가 또는 감소시키거나, 또는 항체의 결합 특이성을 변화시키기 위해 하나 이상의 CDR 영역에서 돌연변이를 행할 수 있다. 부위-지향 돌연변이유발 기술은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 본원에 참고로 인용된 문헌 [Sambrook, Fritsch and Maniatis(eds), Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989] 참조). 예를 들면, 실시예 8에서 더 상세히 논의하는 바와 같이, 129-1c4 모항체의 많은 변이 V_H 및 V_L CDR3 서열을 상기에서 논의한 절차에 따라 제조할 수 있으며, 상기 서열들은 도 1에서 서열번호: 91 내지 256(V_H CDR3 변이체) 및 서열번호: 257 내지 319(V_L CDR3 변이체)로 나타내었다.

돌연변이는 또한 P-카드헤린 항체의 반감기를 증가시키기 위해 골격 영역 또는 불변 영역에서 수행될 수 있다(예를 들면, 본원에 참고로 인용된 PCR 공개 번호 WO 00/09560 호 참조). 골격 영역 또는 불변 영역에서의 돌연변이는 또한 항체의 면역원성을 변화시키거나, 또 다른 분자에 대한 공유 또는 비-공유 결합을 위한 부위를 제공하거나, 또는 보체 결합, FcR 결합 및 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)과 같은 성질을 변화시키기 위해 수행될 수 있다. 본 발명에 따라, 단일 항체는 가변 영역의 하나 이상의 CDR 또는 골격 영역에서 또는 불변 영역에서 돌연변이를 가질 수 있다.

"생식세포주형성(germlining)"으로 알려진 공정에서, V_H 및 V_L 서열에서 특정 아미노산은 생식세포주 V_H 및 V_L 서열에서 천연으로 발견되는 아미노산과 매치하도록 돌연변이될 수 있다. 특히, V_H 및 V_L 서열에서 골격 영역의 아미노산 서열은 항체가 투여될 때 면역원성의 위험을 감소시키기 위해 생식세포주 서열에 매치되도록 돌연변이될 수 있다. 인간 V_H 및 V_L 유전자에 대한 생식세포주 DNA 서열은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, "브이베이스(Vbase)" 인간 생식세포주 서열 데이터베이스 참조; 또한 본원에 참고로 인용된 문헌 [Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. department of Health and Human Services, NIH Publicaion No. 91-3242, 1991; Tomlinson, et al., J. Mol . Biol., 227:776-798, 1992; and Cox, et al., Eur . J. Immunol., 24:827-836, 1994] 참조).

수행될 수 있는 아미노산 치환의 또 다른 유형은 항체에서 가능한 단백질분해 부위를 제거하는 것이다. 상기 부위는 가변 영역의 CDR 또는 골격 영역에 또는 항체의 불변 영역에 존재할 수 있다. 시스테인 잔기의 치환 및 단백질분해 부위의 제거는 항체 생성물에서 이종성의 위험을 감소시키므로 그의 상동성을 증가시킬 수 있다. 아미노산 치환의 또 다른 유형은 가능한 탈아마이드화 부위를 형성하는 아스파라진-글라이신 쌍을 잔기의 하나 또는 둘 다를 변형시켜 제거하는 것이다. 또 다른 예로, 본 발명의 P-카드헤린 항체의 중쇄의 C-말단 라이신을 분리할 수 있다. 본 발명의 다양한 태양에서, P-카드헤린 항체의 중쇄 및 경쇄는 선택적으로 N-말단 신호 서열, 예를 들면, 서열번호: 346 및 347로 나타낸 서열을 포함한다.

일단 본 발명의 V_H 및 V_L 단편을 암호화하는 DNA 단편이 수득되면, 이들 DNA 단편을, 예를 들면, 가변 영역 유전자를 전장 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자, 또는 scFv 유전자로 전환시키기 위해 표준 재조합 DNA 기술에 의해 더 조작할 수 있다. 상기 조작에서, V_L- 또는 V_H-암호화 DNA 단편은 또 다른 단백질을 암호화하는 DNA 단편, 예를 들면, 항체 불변 영역 또는 유연성 링커에 작용가능하게 연결된다. 이와 관련하여 사용된 바와 같이, 용어 "작용가능하게 연결된"은 2개의 DNA 단편에 의해 암호화된 아미노산 서열이 프레임내(in-frame) 유지되도록 2개의 DNA 단편이 연결된 것을 의미하는 것이다.

V_H 영역을 암호화하는 분리된 DNA는, V_H-암호화 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작용가능하게 연결시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당해 분야에 공지되어 있으며(예를 들면, 문헌 [Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. department of Health and Human Services, NIH Publicaion No. 91-3242, 1991), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있으나, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 불변 영역이다. IgG1 불변 영역 서열은 상이한 개체들 사이에 일어나는 것으로 알려진 임의의 다양한 대립유전자 또는 동종이형, 예를 들면, Gm(1), Gm(2), Gm(3) 및 Gm(17)일 수 있다. 이들 동종이형은 IgG1 불변 영역에서 천연 아미노산 치환을 나타낸다. 예를 들면, 중쇄 IgG1 불변 영역은 서열번호:344일 수 있다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, V_H-암호화 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작용가능하게 연결될 수 있다. CH1 중쇄 불변 영역은 임의의 중쇄 유전자로부터 유도될 수 있다.

V_L 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 V_L-암호화 DNA를 경쇄 불변 영역 C_L을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작용가능하게 연결시킴으로써 전장 경쇄 유전자( 및, Fab 경쇄 유전자)로 전환시킬 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 공지되어 있으며(예를 들면, 문헌 [Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. department of Health and Human Services, NIH Publicaion No. 91-3242, 1991), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다. 카파 불변 영역은 상이한 개체들 사이에 일어나는 것으로 알려진 임의의 다양한 대립유전자, 예를 들면, Inv(1), Inv(2) 및 Inv(3)일 수 있다. 람다 불변 영역은 3개의 람다 유전자 중 임의의 유전자로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, 경쇄 IgG1 불변 영역은 서열번호: 347일 수 있다.

scFv 유전자를 생성하기 위해, V_H 및 V_L 서열이 인접 단일쇄 단백질로서 발현되고 이때 V_L 및 V_H 영역이 유연성 링커에 의해 연결되도록, V_H- 및 V_L-암호화 DNA 단편을 유연성 링커를 암호화하는, 예를 들면, 아미노산 서열 (Gly₄-Ser)₃을 암호화하는 또 다른 단편에 작용가능하게 연결한다(예를 들면, 문헌 [Bird et al., Science, 242:423-426, 1988; Huston et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 85:5879-5883, 1988; MaCafferty et al., Nature, 348:552-554, 1990] 참조). 단일쇄 항체는, 단일 V_H 및 V_L 만을 사용하는 경우 1가일 수 있거나, 2개의 V_H 및 V_L을 사용하는 경우 2가일 수 있거나, 또는 2개보다 많은 V_H 및 V_L을 사용하는 경우 다가일 수 있다. P-카드헤린 및 또 다른 분자에 특이적으로 결합하는 이중특이성 또는 다가 항체를 생성할 수 있다.

또 다른 태양에서, 또 다른 폴리펩티드에 결합된 본 발명의 P-카드헤린 항체의 전체 또는 일부를 포함하는 융합 항체 또는 면역유착이 이루어질 수 있다. 또 다른 태양에서, P-카드헤린 항체의 가변 영역만이 폴리펩티드에 연결된다. 또 다른 태양에서는, P-카드헤린 항체의 V_H 영역이 제 1 폴리펩티드에 연결되고, P-카드헤린 항체의 V_L 영역은, V_H 및 V_L 영역이 서로와 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 방식으로 제 1 폴리펩티드와 결합하는 제 2 폴리펩티드에 연결된다. 또 다른 바람직한 태양에서, V_H 및 V_L 영역들이 서로 상호작용할 수 있도록 V_H 영역이 V_L 영역과 링커에 의해 분리되어 있다. 이어서, V_H-링커-V_L 항체를 문제의 폴리펩티드에 연결시킨다. 또한, 두 개(이상)의 단일쇄 항체가 서로 연결되는 융합 항체를 생성할 수 있다. 이것은 단일 폴리펩티드 쇄 상에 2가 또는 다가 항체를 생성하고자 하는 경우, 또는 이중특이성 항체를 생성하고자 하는 경우에 유용하다.

또 다른 태양에서, 다른 변형된 항체는 P-카드헤린 항체 암호화 핵산 분자를 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 본 명세서의 교지 내용에 따라 표준 분자 생물 기술을 이용하여 "카파 바디(Kappa body)"[Ill, et al., Protein Eng., 10:949-957, 1997], "미니바디(minibody)"[Martin, et al., EMBO J., 13:5303-5309, 1994], "디아바디(diabody)"[Holliger, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:6444-6448, 1993], 또는 "자누신(Janusin)"[Traunecker, et al., EMBO J., 10:3655-3659, 1991 and Traunecker, et al., Int . J. Cancer, (Suppl.) 7:51-52, 1992]을 제조할 수 있다.

하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하여 다양한 방법에 의해 이중특이성 항체 또는 항원-결합 단편을 생성할 수 있다(예를 들면, 문헌 [Songsivilai & Lachmann, Clin . Exp . Immunol., 79:315-321, 1990; Kostelny, et al., J. Immunol., 148:1547-1553, 1992] 참조). 또한, 이중특이성 항체는 "디아바디" 또는 "자누신"으로 형성될 수 있다. 일부 태양에서, 이중특이성 항체는 P-카드헤린의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 태양에서, 전술한 변형된 항체는 본원에 제공된 인간 P-카드헤린 항체로부터의 하나 이상의 가변 영역 또는 CDR 영역을 사용하여 제조한다.

벡터 및 숙주 세포

본 발명의 항체 및 항원-결합 부분을 발현하기 위해, 유전자들이 전사 및 번역 조절 서열에 작용가능하게 연결되도록, 전술한 바와 같이 수득된 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA를 발현 벡터내에 삽입한다. 이와 관련하여, 용어 "작용가능하게 연결된"은 벡터내의 전사 및 번역 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그의 의도한 기능을 발휘하도록 항체 유전자가 벡터내로 접합되는 것을 의미한다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 상용가능하도록 선택된다. 발현 벡터로는 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-결합 바이러스(AAV), 식물 바이러스, 예를 들면, 콜리플라워 모자이크 바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 코스미드, YAC, EBV 유도된 에피소머 등이 포함된다. 항체 유전자는, 벡터내의 전사 및 번역 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그의 의도한 기능을 발휘하도록 벡터내로 접합된다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 상용가능하도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별도의 벡터에 삽입될 수 있다. 바람직한 태양에서, 상기 두 유전자 모두 동일한 발현 벡터에 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법(예를 들면, 항체 유전자 단편상의 상보성 제한효소 부위와 벡터의 접합, 또는 제한효소 부위가 존재하지 않는 경우 평활 말단 접합)에 의해 발현 벡터에 삽입된다.

편리한 벡터는 임의의 V_H 또는 V_L 서열이 전술한 바와 같이 용이하게 삽입되고 발현될 수 있도록 처리된 적절한 제한효소 부위를 가지면서, 기능적으로 완전한 인간 C_H 또는 C_L 면역글로불린 서열을 암호화하는 벡터이다. 상기 벡터에서, 스플라이싱은 통상적으로 삽입된 J 영역내 스플라이스 공여체 부위와 인간 C 영역 이전의 스플라이스 수용체 부위 사이에 존재하며, 또한 인간 C_H 엑손내에 존재하는 스플라이스 영역에 존재한다. 폴리아데닐화 및 전사 종료는 암호화 영역 이후의 천연 염색체 부위에서 일어난다. 재조합 발현 벡터는 또한 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 촉진하는 단일 펩티드를 암호화할 수 있다. 항체 쇄 유전자는, 단일 펩티드가 면역글로불린 쇄의 아미노 말단에 프레임내로 연결되도록 벡터에 클로닝될 수 있다. 단일 펩티드는 면역글로불린 단일 펩티드 또는 이종 신호 펩티드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.

항체 쇄 유전자 이외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 쇄 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 갖는다. 당해 분야에 숙련된 자라면, 조절 서열의 선택을 포함하여 발현 벡터의 설계가 형질전환될 숙주세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 요인에 따라 달라질 수 있음을 인지할 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현에 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 유도하는 바이러스 요소, 예를 들면, 레트로바이러스 LTR, 사이토메갈로바이러스(CMV)(예를 들면, CMV 프로모터/증강인자), 시미안 바이러스 40(SV40)(예를 들면, SV40 프로모터/증강인자), 아데노바이러스(예를 들면, 아데노바이러스 주 후기(major late) 프로모터(AdMLP)), 폴리오마로부터 유도된 프로모터 및/또는 증강인자, 및 강한 포유동물 프로모터, 예를 들면, 천연 면역글로불린 및 액틴 프로모터를 포함한다. 바이러스 조절 요소 및 그의 서열에 대한 추가의 설명은, 예를 들면, 미국 특허 제 5,168,062, 4,510,245 및 4,968,615 호를 참조하시오. 프로모터 및 벡터의 설명 및 식물의 형질전환을 포함하는 식물에서 항체를 발현시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 6,517,529 호 참조). 세균 세포 또는 진균 세포, 예를 들면, 효모 세포에서 폴리펩티드를 발현시키는 방법도 또한 당해 분야에 공지되어 있다.

항체 쇄 유전자 및 조절 서열 이외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예를 들면, 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들면, 복제 기원) 및 선택성 마커 유전자를 가질 수 있다. 선택성 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 촉진한다(예를 들면, 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 호 참조). 예를 들면, 전형적으로 선택성 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 약물, 예를 들어, G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 제공한다. 바람직한 선택성 마커 유전자로는 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭에서 dhfr-숙주 세포에서 사용하기 위해), 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자(G418 선택을 위해) 및 글루타메이트 신타제 유전자가 포함된다.

P-카드헤린 항체를 암호화하는 핵산 분자 및 이들 핵산 분자를 포함하는 벡터는 적절한 포유동물, 식물, 세균 또는 효모 숙주 세포의 형질감염에 사용될 수 있다. 형질전환은 숙주 세포에 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의해 이루어질 수 있다. 포유동물 세포에 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 덱스트란-매개 형질감염, 인산 칼슘 침전, 폴리브렌-매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 리포좀내 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화, 및 핵내에 DNA의 직접적 미세주입을 포함한다. 또한, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유동물 세포내로 도입될 수 있다. 세포를 형질전환시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 및 4,959,455 호 참조). 식물 세포를 형질전환시키는 방법은, 예를 들면, 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환, 바이오리스틱(biolistic) 형질전환, 직접 주입, 전기천공 및 바이러스 형질전환을 포함하여, 당해 분야에 공지되어 있다. 세균 및 효모 세포를 형질전환시키는 방법도 또한 당해 분야에 공지되어 있다.

발현용 숙주로 유용한 포유동물 세포주는 당해 분야에 공지되어 있으며, 미국 종균협회(ATCC)로부터 이용가능한 많은 불멸화 세포주가 포함된다. 이들로는, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, NSO 세포, SP2 세포, HEK-293T 세포, NIH-3T3 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포암 세포(예를 들면, Hep G2), A549 세포, 및 많은 다른 세포주가 포함된다. 특히 바람직한 세포주는 어느 세포주가 높은 발현 수준을 갖는지를 결정하여 선택된다. 사용될 수 있는 다른 세포주는 곤충 세포주, 예를 들면, Sf9 또는 Sf21 세포이다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포에 도입하는 경우, 숙주 세포에서 항체를 발현하거나 또는 보다 바람직하게는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지내에 항체를 분지하기에 충분한 시간 기간동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체를 생성한다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다. 식물 숙주 세포로는, 예를 들면, 니코티아나(Nicotiana), 아라비돕시스(Arabidopsis), 개구리밥, 옥수수, 밀, 감자 등이 포함된다. 세균 숙주 세포로는 이. 콜라이 및 스트렙토마이세스( Streptomyces) 종이 포함된다. 효모 숙주 세포로는 쉬조사카로마이세스 폼베( Schizosaccharomyces pombe ), 사카로마이세스 세레비지에( Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)가 포함된다.

또한, 생성 세포주로부터 본 발명의 항체의 발현은 많은 공지된 기술을 이용하여 증대될 수 있다. 예를 들면, 글루타민 신세타제(GS 시스템) 및 DHFR 유전자 발현 시스템이 특정 조건하에서 발현을 증대시키기 위한 일반적인 접근방법이다. 제한 희석 클로닝 및 미세점적 기술과 같은 통상적인 기술을 이용하여 고발현 세포 클론을 동정할 수 있다. GS 시스템은 유럽 특허 제 0 216 846, 0 256 055, 0 323 997 및 0 338 841 호에 논의되어 있다.

상이한 세포주에 의해 또는 유전자이식 동물에서 발현된 항체는 서로 상이한 글라이코실화를 가질 것이다. 그러나, 본원에 제공된 핵산 분자에 의해 암호화되거나 또는 본원에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 모든 항체는 항체의 글라이코실화와 무관하게 본 발명의 일부이다.

유전자이식 동물 및 식물

본 발명의 P-카드헤린 항체는 또한 문제의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 서열에 대해 유전자이식된 동물 또는 식물의 생성 및 그로부터 회수가능한 형태의 항체 생성을 통해 유전자이식에 의해 제조될 수 있다. 포유동물에서의 유전자이식적 제조와 관련하여, P-카드헤린 항체는 염소, 소 또는 다른 포유동물의 유즙에서 생성되고 그로부터 회수될 수 있다(예를 들면, 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 및 5,741,957 호 참조). 일부 태양에서, 인간 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 비-인간 유전자이식 동물은, 전술한 바와 같이, P-카드헤린 또는 그의 면역원 부분으로 면역화시킨다. 식물에서 항체를 제조하는 방법은, 예를 들면, 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 6,046,037 및 5,959,177 호에 기술되어 있다.

일부 태양에서, 비-인간 유전자이식 동물 또는 식물은 본 발명의 P-카드헤린 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 표준 유전자이식 기술에 의해 동물 또는 식물에 도입함으로써 제조된다(문헌 [Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo : A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, 1999] 및 미국 특허 제 6,417,429 호 참조). 유전자이식 동물을 제조하기 위해 사용되는 유전자이식 세포는 배아 간세포 또는 체세포 또는 수정란일 수 있다. 유전자이식 비-인간 유기체는 키메라, 비-키메라 이형접합체 및 비-키메라 동형접합체일 수 있다(예를 들면, 본원에 참고로 인용된 문헌 [Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo : A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, 1999; Jackson, et al., Mouse Genetics and Transgenics : A Practical Approach, Oxford University Press, 2000; and Pinkert, Transgenic Animal Technology : A Laboratory Handbook, Academic Press, 1999] 참조). 일부 태양에서, 유전자이식 비-인간 동물은 문제의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 표적화 구조물에 의한 표적화된 붕괴 및 치환을 갖는다. P-카드헤린 항체는 임의의 유전자이식 동물에서 제조될 수 있다. 바람직한 태양에서, 비-인간 동물은 마우스, 래트, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말이다. 비-인간 유전자이식 동물은 상기 암호화된 폴리펩티드를 혈액, 유즙, 뇨, 타액, 눈물, 점액 및 다른 체액에서 발현시킨다.

분류군 전환( class switching )

P-카드헤린 항체의 강(예를 들면, IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD) 및 아강(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)은 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 상기 항체들은 상업적으로 시판한다. 일반적으로, 항체의 강(class) 및 아강(subclass)은 ELISA 또는 웨스턴 블롯(Western Blot) 및 다른 기술에 의해 결정될 수 있다. 또는, 강 및 아강은 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 영역 전체 또는 일부를 서열화하고, 그의 아미노산 서열을 다양한 강 및 아강의 면역글로불린의 공지된 아미노산 서열과 비교하고, 항체의 강 및 아강을 결정함으로써 결정될 수 있다. 본 발명의 P-카드헤린 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD 분자일 수 있다. 예를 들면, P-카드헤린 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아강인 IgG일 수 있다. 한 태양에서, P-카드헤린 항체는 서열번호: 344로 나타낸 중쇄 불변 영역 및 서열번호: 345로 나타낸 경쇄 불변 영역을 가질 수 있다.

본 발명의 한 태양은 P-카드헤린 항체의 강 또는 아강을 또 다른 강 또는 아강으로 전환시키는 방법을 제공한다. 일부 태양에서, C_L 또는 C_H를 암호화하는 서열을 포함하지 않는 V_L 또는 V_H를 암호화하는 핵산 분자를 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 분리한다. 이어서, 핵산 분자를 목적하는 면역글로불린 강 또는 아강으로부터의 C_L 또는 C_H를 암호화하는 핵산 서열에 작용가능하게 연결시킨다. 이것은 전술한 바와 같이 C_L 또는 C_H 쇄를 포함하는 벡터 또는 핵산 분자를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들면, 원래 IgM이었던 P-카드헤린 항체는 IgG로 분류군 전환될 수 있다. 또한, 분류군 전환을 이용하여 하나의 IgG 아강을 또 다른 아강으로, 예를 들면, IgG1으로부터 IgG2로 전환시킬 수 있다. 목적하는 아이소타입을 포함하는 본 발명의 항체를 생성하는 또 다른 방법은 P-카드헤린 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 및 P-카드헤린 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산을 분리하고, V_H 영역을 암호화하는 서열을 분리하고, V_H 서열을 목적하는 아이소타입의 중쇄 불변 영역을 암호화하는 서열에 접합시키고, 경쇄 유전자 및 중쇄 구조물을 세포에서 발현시키고, 목적하는 아이소타입을 갖는 P-카드헤린 항체를 수거하는 단계를 포함한다.

탈면역화 항체

본 발명의 또 다른 태양에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은, 예를 들면, 본원에 참고로 인용된 PCT 공개 번호 WO 98/52976 호 및 WO 00/34317 호에 기술된 기술을 이용하여 그의 면역원성을 감소시키기 위해 탈면역화될 수 있다.

유도체화 및 표지화 항체

본 발명의 P-카드헤린 항체 또는 항원-결합 부분은 또 다른 분자(예를 들면, 또 다른 펩티드 또는 단백질)로 유도체화되거나 결합될 수 있다. 일반적으로, 항체 또는 그의 부분은 P-카드헤린 결합이 유도체화 또는 표지화에 의해 불리하게 영향받지 않도록 유도체화된다. 따라서, 본 발명의 항체 및 항체 부분은 본원에 기술된 인간 P-카드헤린 항체의 비손상 형태 및 변형된 형태 둘 다를 포함하는 것이다. 예를 들면, 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 하나 이상의 다른 분자 물질, 예를 들면, 또 다른 항체(예, 이중특이성 항체 또는 디아바디), 검출제, 표지, 세포독성제, 약제, 및/또는 항체 또는 항체 부분과 또 다른 분자(예를 들면, 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 표식)와의 결합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드에 기능적으로 결합될 수 있다(화학 커플링, 유전자 융합, 비공유 결합 등에 의해).

유도체화 항체의 한 유형은 (예를 들면, 이중특이성 항체를 생성하기 위해, 동일 유형 또는 상이한 유형의) 2개 이상의 항체를 가교결합시켜 생성된다. 적당한 가교결합제로는 적절한 스페이서에 의해 분리된 2개의 별개의 반응기를 갖는 이종이작용성(heterobifunctional)(예를 들면, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스터)이거나 또는 동종이작용성(homobifunctional)(예를 들면, 다이석신이미딜 수베레이트)인 것들이 포함된다. 상기 가교결합제는 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Co., 일리노이주 록포드)에서 시판한다.

유도체화 항체의 또 다른 유형은 표지화 항체이다. 그에 의해 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분이 유도체화될 수 있는 유용한 검출제로는 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 로다민, 5-다이메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 피코에리트린, 란타나이드 인광체 등을 포함한 형광 화합물이 포함된다. 항체는 또한 검출에 유용한 효소, 예를 들면, 양고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제, 글루코스 옥시다제 등으로 표지될 수 있다. 항체를 검출가능한 효소로 표지하는 경우, 상기 항체는 식별될 수 있는 반응 생성물을 생성하기 위해 효소가 이용하는 추가의 시약을 가함으로써 검출된다. 예를 들면, 검출제 양고추냉이 퍼옥시다제가 존재하는 경우, 과산화수소 및 다이아미노벤지딘의 첨가에 의해 착색된 반응 생성물이 야기되고, 이것은 검출가능하다. 항체는 또한 비오틴으로 표지화되고 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합의 간접 측정을 통해 검출될 수 있다. 항체는 또한 2차 리포터(예를 들면, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 영역, 에피토프 표식)에 의해 인지되는 미리결정된 폴리펩티드 에피토프로 표지될 수 있다. 일부 태양에서, 표지는 가능한 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 팔에 의해 부착된다. P-카드헤린 항체는 또한 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 메틸 또는 에틸기 또는 탄수화물기와 같은 화학기로 유도체화될 수 있다. 이들 기는 항체의 생물학적 특성을 개선하는데, 예를 들면, 혈청 반감기를 증가시키는데 유용하다.

P- 카드헤린에 대한 P- 카드헤린 항체의 결합 친화도

P-카드헤린에 대한 P-카드헤린 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 결합 친화도(K_D) 및 해리율(k_off)은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 결합 친화도는 ELISA, RIA, 유세포측정법, 또는 표면 플라즈몬 공명, 예를 들면, 비아코어(BIACORE, 등록상표)에 의해 측정할 수 있다. 해리율은 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정할 수 있다. 바람직하게, 결합 친화도 및 해리율은 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정한다. 보다 바람직하게, 결합 친화도 및 해리율은 비아코어(등록상표)를 이용하여 측정한다. 항체가 P-카드헤린 항체와 실질적으로 동일한 K_K를 갖는지 여부는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 측정할 수 있다. K_D 및 k_off를 측정하는 상기 방법은 초기 검색 단계시에, 및 후속의 최적화 단계시에 사용될 수 있다.

P- 카드헤린 항체에 의해 인지되는 P- 카드헤린 에피토프의 동정

본 발명은 P-카드헤린에 결합하고 표 1 또는 2에 기술된 바와 같은 임의의 항체와 동일한 에피토프와 경쟁 또는 교차-경쟁하고/하거나 결합하는 인간 P-카드헤린 항체를 제공한다. 항체가 동일한 에피토프에 결합하는지 또는 본 발명의 P-카드헤린 항체와 결합에 대해 교차 경쟁하는지 여부를 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 한 태양에서, 본 발명의 P-카드헤린 항체를 포화 조건하에서 P-카드헤린에 결합시킨 다음 P-카드헤린에 결합하는 시험 항체의 능력을 측정한다. 시험 항체가 P-카드헤린 항체와 동시에 P-카드헤린에 결합할 수 있는 경우, 시험 항체는 P-카드헤린 항체와 상이한 에피토프에 결합한다. 그러나, 시험 항체가 동시에 P-카드헤린에 결합할 수 없는 경우, 시험 항체는 동일 에피토프, 중첩 에피토프, 또는 인간 P-카드헤린 항체에 의해 결합된 에피토프에 밀착되어 있는 에피토프에 결합한다. 이 실험은 ELISA, RIA, 비아코어(등록상표) 또는 유세포측정법을 이용하여 수행할 수 있다. 바람직한 태양에서, 실험은 ELISA를 이용하여 수행한다.

P- 카드헤린 항체에 의한 P- 카드헤린 활성의 억제

P-카드헤린 활성을 억제하는 P-카드헤린 항체는 많은 분석법을 이용하여 동정할 수 있다. 예를 들면, 세포 응집 분석은 P-카드헤린-의존성 세포 응집을 측정하는 방법을 제공한다. 상기 유형의 분석은 P-카드헤린을 과발현하는 세포주를 사용하는데, 이때 상기 세포는 현탁액으로 제공되어 P-카드헤린-의존성 응집체를 형성하게 된다. 이어서, 응집 분석을 이용하여 항체의 존재 및 부재하에 야기된 세포 응집체의 크기를 측정함으로써 상기 응집을 방지하는 P-카드헤린 항체의 능력을 정량화한다. 이어서, P-카드헤린 항체 농도의 함수로서 세포 응집체 크기를 IC₅₀ 값을 측정하는데 이용할 수 있다. 실시예 4는 여러 P-카드헤린 항체에 대한 IC₅₀ 값을 측정하기 위해 사용된 P-카드헤린-의존성 응집 분석에 대한 추가의 설명을 제공한다.

세포 부착 분석은 고체 지지체상에 고정화된 수용체 P-카드헤린에 대한 세포의 부착을 차단하는 P-카드헤린 항체의 능력을 측정하기 위해 이용될 수 있다. 상기 유형의 분석은, 예를 들면, P-카드헤린을 플라스틱과 같은 고체 지지체상에 고정화시킴으로써 수행될 수 있다. 이어서, P-카드헤린을 과발현하는 세포를 P-카드헤린-P-카드헤린 상호작용에 의해 고체 지지체에 부착시킨다. 그 다음, 부착 수준을 P-카드헤린 항체의 존재 및 부재하에 정량화할 수 있다. 이어서, 항체 농도의 함수로서 부착성을 IC₅₀ 값을 측정하는데 이용할 수 있다. 실시예 3은 P-카드헤린 항체에 대한 IC₅₀ 값을 측정하기 위해 사용된 P-카드헤린-의존성 세포 부착 분석에 대한 추가의 설명을 제공한다.

P-카드헤린 활성의 억제는 또한 P-카드헤린-의존성 타원체 붕괴 분석을 이용하여 측정할 수 있다. 상기 유형의 분석은 미리-형성된 P-카드헤린-의존성 세포 응집을 파괴하는 P-카드헤린 항체의 능력을 측정한다. 항체 농도의 함수로서 응집체의 크기 감소를 측정하여 IC₅₀ 값을 측정할 수 있다. 실시예 5는 P-카드헤린 항체에 대한 IC₅₀ 값을 측정하기 위해 사용된 P-카드헤린-의존성 타원체 붕괴 분석에 대한 추가의 설명을 제공한다. 다양한 항체 또는 그의 항원-결합 부분에 의한 P-카드헤린 활성의 억제를 측정하기 위한 전술한 방법 및 분석은 초기 검색 단계, 및 후속 최적화 단계시에 이용할 수 있다.

분자 선택성

E-카드헤린과 같은 다른 카드헤린에 비해 본 발명의 P-카드헤린 항체의 선택성은 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 웨스턴 블롯, 유세포측정법, ELISA, 면역침전 또는 RIA를 이용하여 선택성을 측정할 수 있다. 실시예 7은 E-카드헤린에 비해 P-카드헤린에 대한 특정 항체의 선택성을 측정하기 위해 사용된 ELISA 분석에 대한 추가의 설명을 제공한다. 다양한 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 P-카드헤린에 대한 선택성을 측정하기 위한 전술한 방법 및 분석은 초기 검색 단계, 및 후속 최적화 단계시에 사용될 수 있다.

약학 조성물 및 투여

본 발명은 또한 이상 세포 성장을 치료하는데 효과적인 양의, 본원에 기술한 바와 같은 P-카드헤린 항체 또는 그의 항원-결합 부분 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 인간을 포함한 포유동물에서 이상 세포 성장을 치료하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 항체 및 항원-결합 부분은 대상에게 투여하기에 적합한 약학 조성물중에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 약학 조성물은 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 상용성인, 임의의 용매 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 물질 및 흡수 지연제 등을 의미한다. 약학적으로 허용되는 담체의 몇몇 예는 물, 식염수, 포스페이트 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 및 그의 혼합물이다. 많은 경우에, 등장성 물질, 예를 들면, 당, 폴리알콜, 예를 들면, 만니톨, 솔비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직하다. 약학적으로 허용되는 물질의 또 다른 예는 습윤제 또는 항체의 저장 수명 또는 효과를 증대시키는 소량의 보조 물질, 예를 들면, 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 완충제이다.

본 발명의 조성물은 다양한 형태, 예를 들면, 액체, 반고체 및 고체 투여형, 예를 들어, 액체 용액(예, 주사액 및 주입액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제, 분말, 리포좀 및 좌약의 형태일 수 있다. 바람직한 형태는 목적하는 투여 방식 및 치료 용도에 따라 달라진다. 전형적인 바람직한 조성물은 주사액 또는 주입액, 예를 들면, 인간의 수동 면역에 사용되는 바와 유사한 조성물의 형태이다. 바람직한 투여 방식은 비경구(예를 들면, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내)이다. 바람직한 태양에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여한다. 또 다른 바람직한 태양에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여한다. 주사용 제형은 단위 투여형으로, 예를 들면, 방부제를 첨가하거나 첨가하지 않고, 앰플 또는 다중-용량 용기에 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 좌약, 용액 또는 유화액과 같은 형태를 가질 수 있으며, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형 보조제를 함유할 수 있다. 또는, 활성 성분은 사용전에 적절한 비히클, 예를 들면, 멸균 발열원-비함유수로 복원되기 위한 분말 형태일 수 있다.

치료 조성물은 전형적으로 멸균되어야 하고 제조 및 저장 조건하에서 안정하여야 한다. 조성물은 용액, 미세유화액, 분산액, 리포솜, 또는 고농도 약물에 적절한 다른 정리된 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사액은 P-카드헤린 항체를 필요한 양으로 적절한 용매에 상기 열거한 하나의 성분 또는 성분 혼합물들과 함께 필요한 대로 혼입한 후 멸균 여과하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거한 것들 중 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 혼입함으로써 제조한다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분과 그의 미리 멸균-여과한 용액으로부터의 임의의 추가의 바람직한 성분들의 분말을 제공하는 진공 건조 및 냉동-건조이다. 용액의 적절한 유동성은, 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사 조성물의 지연된 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 이루어질 수 있다.

본 발명의 항체 또는 항체 부분은 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있으나, 많은 치료 용도의 경우 바람직한 투여 경로/방식은 피하, 근육내 또는 정맥내 주입이다. 숙련된 전문가에게 인지되듯이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다.

특정 태양에서, 본 발명의 항체 조성물은, 임플란트, 경피 패치 및 미세캡슐화 전달 시스템을 포함하여 방출 조절형 제형과 같이, 항체를 신속한 방출로부터 보호할 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 생분해성, 생체친화성 중합체, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글라이콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스터 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 상기 제형을 제조하기 위한 많은 방법이 일반적으로 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있다(예를 들면, 본원에 참고로 인용된 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978] 참조).

추가의 활성 화합물도 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 특정 태양에서, 본 발명의 억제 P-카드헤린 항체는 하나 이상의 치료제와 공-배합되고/되거나 공-투여된다. 이들 물질로는, 제한하지 않고, 다른 표적과 결합하는 항체, 항종양제, 항-신생혈관생성제, 신호 전환 억제제, 항증식제, 화학요법제, 또는 P-카드헤린을 억제하는 펩티드 유사체가 포함된다. 상기 복합 요법은 보다 작은 투여량의 억제 P-카드헤린 항체, 및 공-투여되는 물질을 필요로 할 수 있으므로, 다양한 단일요법과 관련된 가능한 독성 또는 복잡함을 배제할 수 있다.

본 발명의 조성물은 "치료 효과량" 또는 "예방 효과량"의 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분을 포함할 수 있다. "치료 효과량"은 필요한 투여량 및 기간동안 목적하는 치료 결과를 달성하기에 효과적인 양을 말한다. 항체 또는 항원-결합 부분의 치료 효과량은 개인의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개인에서 목적하는 반응을 이끌어내는 항체 또는 항체 부분의 능력과 같은 요인들에 따라 달라질 수 있다. 치료 효과량은 또한 항체 또는 항원-결합 부분의 임의의 독성 또는 유해 효과가 치료적으로 유리한 효과에 의해 상쇄되는 양이다. "예방 효과량"은 목적하는 필요한 투여량 및 시간 동안 예방 결과를 달성하기에 효과적인 양이다. 전형적으로, 예방 용량을 질환에 걸리기 전 또는 질환의 초기 단계에서 대상에게 사용되므로, 예방 효과량은 치료 효과량보다 적을 수 있다.

투여 요법을 조정하여 최적의 목적 반응(예를 들면, 치료 또는 예방적 반응)을 제공할 수 있다. 예를 들면, 단일 거환을 투여할 수 있거나, 여러개의 분할 용량을 시간 경과에 따라 투여할 수 있거나, 또는 치료 상황의 긴급성에 의해 보여지듯이 용량을 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수 있다. 용이한 투여 및 균일한 투여량을 위해 비경구 조성물을 단위 투여형으로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같이, 단위 투여형은 치료될 포유동물에 대한 단위 투여량으로 적당한 물리적으로 분리된 단위를 말하며; 각각의 단위는 필요한 약학적 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 제공하도록 계산된 미리결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 단위 투여형에 대한 설명은 (a) P-카드헤린 항체 또는 그의 부분의 독특한 특성 및 달성될 특정 치료 또는 예방 효과, 및 (b) 개개인에서 민감성 치료를 위해 상기 항체를 배합하는 분야에서 고유한 제한에 의해 기술되고, 이것들에 직접적으로 의존된다.

본 발명의 항체 또는 항체 부분의 치료 또는 예방 효과량에 대한 비-제한 범위는 0.025 내지 50 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 50 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 25, 0.1 내지 10 또는 0.1 내지 3 mg/kg이다. 일부 태양에서, 제형은 20 mM 시트르산 나트륨, pH 5.5, 140 mM NaCl 및 0.2 mg/ml 폴리솔베이트 80의 완충액중에 5 mg/ml의 항체를 함유한다. 투여량 값은 완화될 상태의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있음을 주지해야 한다. 또한, 임의의 특정 대상에 대해, 개인적 필요 및 조성물의 투여를 투여하고 관리하는 개인의 전문가적 판단에 따라서 시간경과에 따라 특정 투여 요법이 조정되어야 하며, 본원에 나타낸 투여량 범위는 단지 예시적인 것이며 청구된 조성물의 범위 또는 실행을 제한하는 것이 아님을 주지해야 한다.

본 발명의 또 다른 태양은 본 발명의 P-카드헤린 항체 또는 항원-결합 부분을 포함하는 키트 또는 상기 항체 또는 부분을 포함하는 조성물을 제공한다. 키트는 항체 또는 조성물 이외에 진단제 또는 치료제를 포함할 수 있다. 키트는 또한 진단 또는 치료 방법에 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 바람직한 태양에서, 키트는 항체 또는 그를 포함하는 조성물 및 하기에 기술하는 방법에서 사용할 수 있는 진단제를 포함한다. 또 다른 바람직한 태양에서, 키트는 항체 또는 그를 포함하는 조성물 및 하기에 기술하는 방법에서 사용할 수 있는 하나 이상의 치료제를 포함한다.

유용한 진단 방법

P-카드헤린 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 시험관내 또는 생체내에서 생물 샘플중 P-카드헤린을 검출하기 위한 진단 방법에 사용할 수 있다. 예를 들면, P-카드헤린 항체는, 제한하지 않고 ELISA, RIA, 유세포측정법, 조직 면역조직화학, 웨스턴 블롯 또는 면역침전을 포함한 통상적인 면역분석법에 사용될 수 있다. 본 발명의 P-카드헤린 항체는 인간으로부터의 P-카드헤린을 검출하기 위해 사용될 수 있다. P-카드헤린 항체는 또한 마우스, 래트 및 필리핀 원숭이(cynomolgus monkey)로부터의 P-카드헤린을 검출하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 생물 샘플을 본 발명의 P-카드헤린 항체와 접촉시키고 결합된 항체를 검출하는 것을 포함하는, 생물 샘플에서 P-카드헤린을 검출하는 방법을 제공한다. 한 태양에서, P-카드헤린 항체는 검출가능한 표지로 직접 표지화된다. 또 다른 태양에서, P-카드헤린 항체(제 1 항체)는 표지되지 않고, 제 2 항체 또는 P-카드헤린 항체에 결합할 수 있는 다른 분자는 표지된다. 당해 분야의 전문가에게 공지되어 있듯이, 특정 종 및 강의 제 1 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 항체를 선택한다. 예를 들면, P-카드헤린 항체가 인간 IgG인 경우, 제 2 항체는 항-인간-IgG일 수 있다. 항체에 결합할 수 있는 다른 분자로는, 제한하지 않고, 단백질 A 및 단백질 G가 포함되며, 이들은 둘 다, 예를 들면, 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Co.)에서 상업적으로 시판한다.

항체 또는 제 2 항체에 적당한 표지는 앞에서 논의하였으며, 다양한 효소, 인공 기, 형광 물질, 발광 물질 및 방사능 물질이 포함된다. 적당한 효소의 예로는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린스테라제가 포함되고; 적당한 인공 기 복합체의 예로는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 포함되고; 적당한 형광성 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 로다민, 다이클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 포함되고; 발광 물질의 예로는 루미놀이 포함되고; 적당한 방사능 물질의 예로는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S 또는 ³H가 포함된다.

다른 태양에서, P-카드헤린은 검출가능한 물질로 표지된 P-카드헤린 표준물 및 비표지 P-카드헤린 항체를 이용하는 경쟁 면역분석에 의해 생물 샘플에서 분석될 수 있다. 상기 분석에서는, 생물 샘플, 표지된 P-카드헤린 표준물 및 P-카드헤린 항체를 혼합하고 비표지 항체에 결합된 표지된 P-카드헤린 표준물의 양을 측정한다. 생물 샘플중 P-카드헤린의 양은 P-카드헤린 항체에 결합된 표지된 P-카드헤린 표준물의 양에 반비례한다.

여러 목적으로 상기 개시한 면역분석법을 이용할 수 있다. 예를 들면, P-카드헤린 항체를 이용하여 배양 세포내 P-카드헤린을 검출할 수 있다. 바람직한 태양에서, P-카드헤린 항체를 이용하여 다양한 화합물로 처리된 세포에 의해 생성된 P-카드헤린의 양을 측정한다. 상기 방법은 P-카드헤린 단백질 수준을 조절하는 화합물을 동정하는데 이용될 수 있다. 상기 방법에 따르면, 한 세포 샘플을 일정 기간동안 시험 화합물로 처리하고, 이 동안 다른 샘플은 처리하지 않고 방치한다. P-카드헤린의 총 수준이 측정되면, 세포를 용해시키고 총 P-카드헤린 수준을 전술한 면역분석법중 하나를 이용하여 측정한다. 처리된 세포 대 미처리 세포 중 P-카드헤린의 총 수준을 비교하여 시험 화합물의 효과를 측정한다.

총 P-카드헤린 수준을 측정하기에 바람직한 면역분석법은 유세포측정법 또는 면역조직화학이다. ELISA, RIA, 유세포측정법, 웨스턴 블롯, 면역조직화학, 내재성 막 단백질의 세포 표면 표지화 및 면역침전과 같은 방법들이 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 문헌 [Harlow and Lane, Using Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998] 참조). 또한, 면역분석법은 P-카드헤린 발현의 활성화 또는 억제에 대해 많은 화합물을 시험하기 위한 고효율 검색을 위해 규모를 증대시킬 수 있다.

본 발명의 P-카드헤린 항체는 또한 조직내 또는 조직으로부터 유도된 세포내 P-카드헤린의 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 태양에서, 조직은 병든 조직이다. 상기 방법의 일부 태양에서, 조직 또는 그의 생검을 환자로부터 절제한다. 그 다음, 조직 또는 생검을 면역분석에 사용하여 상기 논의한 방법에 의해, 예를 들면, 총 P-카드헤린 수준 또는 P-카드헤린의 편재화를 측정한다.

본 발명의 항체는 또한 P-카드헤린을 발현하는 조직 및 장기를 확인하기 위해 생체내로 사용될 수 있다. 본 발명의 인간 P-카드헤린 항체를 사용하는 한 가지 이점은 이들 항체가 비-인간 기원의 항체 또는 인간화 또는 키메라 항체와 달리, 투여시 항체에 대한 실질적인 면역 반응을 야기하지 않고 생체내에서 안전하게 사용될 수 있다는 것이다.

상기 방법은 검출가능하게 표지된 P-카드헤린 항체 또는 그를 포함하는 조성물을 상기 진단 시험을 필요로 하는 환자에게 투여하고, 환자를 영상 분석에 적용하여 P-카드헤린-발현 조직의 위치를 측정하는 단계를 포함한다. 영상 분석은 의료 분야에서 공지되어 있으며, 제한하지 않고, x-선 분석, 자기공명영상법(MRI) 또는 컴퓨터 단층촬영이 포함된다. 항체는 생체내 영상화에 적합한 임의의 약제, 예를 들면, x-선 분석에 사용될 수 있는 바륨과 같은 조영제, 또는 MRI 또는 CT에 사용될 수 있는 가돌리늄 킬레이트와 같은 자성 조영제로 표지될 수 있다. 다른 표지 물질로는, 제한하지 않고, 방사성동위원소, 예를 들면, ⁹⁹Tc가 포함된다. 또 다른 태양에서, P-카드헤린 항체는 표지되지 않고, 검출가능하고 P-카드헤린 항체에 결합될 수 있는 제 2 항체 또는 다른 분자를 투여함으로써 영상화될 것이다. 한 태양에서, 문제의 조직이 P-카드헤린을 발현하는지를 측정하기 위해 환자로부터 생검을 수득한다.

유용한 치료 방법

또 다른 태양에서, 본 발명은 P-카드헤린 항체를 그를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 P-카드헤린 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 본원에 기술된 임의의 항체 또는 항원-결합 부분은 치료적으로 사용될 수 있다. 바람직한 태양에서, P-카드헤린 항체는 인간, 키메라 또는 인간화 항체이다. 또 다른 바람직한 태양에서, P-카드헤린은 인간 P-카드헤린이고 환자는 인간 환자이다. 또는, 환자는 P-카드헤린 항체가 그와 교차-반응하는 P-카드헤린을 발현하는 포유동물일 수 있다. 항체는 수의용으로 또는 인간 질환의 동물 모델로서 항체가 그와 교차-반응하는 P-카드헤린을 발현하는 비-인간 포유동물(예를 들면, 래트, 마우스 또는 필리핀 원숭이)에게 투여될 수 있다. 상기 동물 모델은 본 발명 항체의 치료 효과를 평가하는데 유용할 수 있다.

또 다른 태양에서, P-카드헤린 항체 또는 그의 항체 부분은 부적절하게 높은 수준의 P-카드헤린을 발현하는 환자에게 투여될 수 있다. 항체는 1회 투여할 수 있으나, 보다 바람직하게는 수회 투여한다. 항체는 매일 3회로부터 6 개월 이상마다 1회까지 투여할 수 있다. 투여는 매일 3회, 매일 2회, 매일 1회, 2일마다 1회, 3일마다 1회, 매주 1회, 2주일마다 1회, 매월 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회 및 6개월마다 1회와 같은 스케줄로 이루어질 수 있다. 항체는 또한 소형펌프에 의해 연속적으로 투여될 수 있다. 항체는 점막, 구강, 비내, 흡입, 정맥내, 피하, 근육내, 비경구 또는 종양내 경로에 의해 투여될 수 있다. 항체는 1회, 2회 이상, 또는 질병이 치료되거나 완화되거나 치유될 때까지 일정 기간 이상동안 투여될 수 있다. 항체는 일반적으로 질병이 존재하는 한 계속 투여된다. 항체는 일반적으로 전술한 바와 같은 약학 조성물의 일부로서 투여된다. 항체 투여량은 일반적으로 0.1 내지 100 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.5 내지 50 mg/kg, 보다 바람직하게는 1 내지 20 mg/kg, 훨씬 더 바람직하게는 1 내지 10 mg/kg의 범위이다. 항체의 혈청 농도는 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 측정할 수 있다.

본 발명은 또한 이상 세포 성장을 치료하는데 효과적인 치료 효과량의, 본원에 기술된 바와 같은 P-카드헤린 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 인간을 포함한 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 이상 세포 성장을 치료하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법의 한 태양에서, 이상 세포 성장은, 중피종, 간담(간 및 담관), 원발성 또는 속발성 CNS 종양, 원발성 또는 속발성 뇌종양, 폐암(NSCLC 및 SCLC), 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 난소암, 대장암, 직장암, 항문부암, 위암, 위장(위, 결장 및 십이지장), 유방암, 자궁암, 나팔관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 외음부암, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 고환암, 만성 또는 급성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신세포암, 신우암, 중추신경계(CNS) 종양, 원발성 CNS 림프종, 비-호지킨 림프종, 척추축 종양, 뇌간부 신경교종, 뇌하수체 선종, 부신피질암, 담낭암, 다발성 골수종, 담관암, 섬유육종, 신경아세포종, 망막모세포종, 또는 상기 암들의 하나 이상의 조합이 포함하나, 이로 한정되지는 않는 암이다.

본 발명의 바람직한 태양에서, 암은 폐암(NSCLC 및 SCLC), 두경부암, 난소암, 대장암, 직장암, 항문부암, 위암, 유방암, 신장 또는 수뇨관암, 신세포암, 신우암, 중추신경계(CNS) 종양, 원발성 CNS 림프종, 비-호지킨 림프종, 척추축 종양, 또는 하나 이상의 상기 암들의 조합에서 선택된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 태양에서, 암은 폐암(NSCLC 및 SCLC), 난소암, 대장암, 직장암, 항문부암 또는 하나 이상의 상기 암들의 조합에서 선택된다.

상기 방법의 또 다른 태양에서, 상기 이상 세포 성장은 건선, 양성 전립선 비대증 또는 레스티노시스를 포함하나 이로 한정되지는 않는 양성 증식성 질환이다.

본 발명은 또한 유사분열 억제제, 알킬화제, 항-대사제, 삽입 항생물질, 성장인자 억제제, 세포 주기 억제제, 효소, 토포아이소머라제(topoisomerase) 억제제, 생물 반응 조절제, 항체, 세포독, 항-호르몬제 및 항-안드로겐으로 이루어진 군에서 선택된 항종양제와 함께, 이상 세포 성장을 치료하는데 효과적인 양의, 본원에 기술된 바와 같은 P-카드헤린 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 이상 세포 성장을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 유사분열 억제제, 알킬화제, 항-대사제, 삽입 항생물질, 성장인자 억제제, 세포 주기 억제제, 효소, 토포아이소머라제 억제제, 생물 반응 조절제, 항-호르몬제 및 항-안드로겐으로 이루어진 군에서 선택된 항종양제와 함께, 이상 세포 성장을 치료하는데 효과적인 양의, 본원에 기술된 바와 같은 P-카드헤린 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는, 인간을 포함한 포유동물에서 이상 세포 성장을 치료하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 항증식제, 키나제 억제제, 신생혈관생성 억제제, 성장인자 억제제, 콕스(cox)-I 억제제, 콕스-II 억제제, 유사분열 억제제, 알킬화제, 항-대사제, 삽입 항생물질, 성장인자 억제제, 방사선, 세포 주기 억제제, 효소, 토포아이소머라제 억제제, 생물 반응 조절제, 항체, 세포독, 항-호르몬제, 스타틴 및 항-안드로겐으로 이루어진 군에서 선택된 항종양제와 함께, 치료 효과량의, 본원에 기술된 바와 같은 P-카드헤린 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 과증식성 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 한 태양에서, P-카드헤린 항체 또는 그의 항원 결합 부분 및 본원에 기술된 약학 조성물과 함께 사용되는 항종양제는 항-신생혈관생성제, 키나제 억제제, 판 키나제 억제제 또는 성장인자 억제제이다. 바람직한 판 키나제 억제제로는 미국 특허 제 6,573,293 호(화이자 인코포레이티드, 미국 뉴욕)에 기술된 SU-11248이 포함된다.

항-신생혈관생성제로는 다음의 약제, 예를 들면, EGF 억제제, EGFR 억제제, VEGF 억제제, VEGFR 억제제, TIE2 억제제, IGF-IR 억제제, COX-II(사이클로옥시게나제 II) 억제제, MMP-2(매트릭스-메탈로프로테이나제 2) 억제제 및 MMP-9(매트릭스-메탈로프로테이나제 9) 억제제가 포함되나 이로 한정되지는 않는다. 바람직한 VEGF 억제제로는, 예를 들면, 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코의 진엔테크(Genentech)의 아바스틴(Avastin)(베바시주맙) 항-VEGF 단클론성 항체가 포함된다.

또 다른 VEGF 억제제로는 CP-547,632(화이자 인코포레이티드, 미국 뉴욕), AG13736(화이자 인코포레이티드), ZD-6474(아스트라제네카(AstraZeneca)), AEE788(노바티스(Novartis)), AZD-2171, VEGF 트랩(리제네론(Regeneron)/아벤티스(Aventis)), 바탈라닙(Vatalanib)(PTK-787, ZK-222584로도 알려짐; 노바티스 앤 쉐링(Novartis & Schering) AG), 마쿠겐(Macugen)(페갑타닙 옥타소디움, NX-1838, EYE-001, 화이자 인코포레이티드/길리드(Gilead)/아이테크(Eyetech)), IM862(시트란 인코포레이티드(Cytran Inc.), 미국 워싱턴주 커크랜드); 및 리보자임사(Ribozyme, 콜로라도주 보울더) 및 카이론(Chiron, 캘리포니아주 에머리빌)의 합성 리보자임인 안지오자임 및 그의 혼합물이 포함된다. 본 발명의 실시에 유용한 VEGF 억제제는 본원에 그대로 참고로 인용된 미국 특허 제 6,534,524 및 6,235,764 호에 개시되어 있다. 특히 바람직한 VEGF 억제제로는 CP-547,632, AG13736, 바탈라닙, 마쿠겐 및 그의 혼합물이 포함된다.

또 다른 VEGF 억제제는, 예를 들면, WO 99/24440(1999년 5월 20일자 공개), PCT 국제 출원 PCT/IB99/00797 호(1999년 5월 3일자 출원), WO 95/21613 호(1995년 8월 17일자 공개), WO 99/61422 호(1999년 12월 2일자 공개), 미국 특허 제 6,534,524 호(AG13736 개시), 미국 특허 제 5,834,504 호(1998년 11월 10일자 허여), WO 98/50356 호(1998년 11월 12일자 공개), 미국 특허 제 5,883,113 호(1999년 3월 16일자 허여), 미국 특허 제 5,886,020 호(1999년 3월 23일자 허여), 미국 특허 제 5,792,783 호(1998년 8월 11일자 허여), 미국 특허 제 6,653,308 호(2003년 11월 25일자 허여), WO 99/10349 호(1999년 3월 4일자 공개), WO 97/32856 호(1997년 9월 12일자 공개), WO 97/22596 호(1997년 6월 26일자 공개), WO 98/54093 호(1998년 12월 3일자 공개), WO 98/02438 호(1998년 1월 22일자 공개), WO 99/16755 호(1999년 4월 8일자 공개) 및 WO 98/02437 호(1998년 1월 22일자 공개)에 기술되어 있으며, 이들은 모두 그대로 본원에 참고로 인용된다.

본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분과 함께 사용될 수 있는 다른 항증식제로는, 하기 미국 특허 출원: 제 09/21946 호(1998년 12월 28일자 출원); 제 09/454058 호(1999년 12월 2일자 출원); 제 09/501163 호(2000년 2월 9일자 출원); 제 09/539930 호(2000년 3월 31일자 출원); 제 09/202796 호(1997년 5월 22일자 출원); 제 09/384339 호(1999년 8월 26일자 출원); 및 제 09/383755 호(1999년 8월 26일자 출원); 하기 미국 가출원 번호 제 60/168207 호(1999년 11월 30일자 출원); 제 60/170119 호(1999년 12월 10일자); 제 60/177718 호(2000년 1월 21일자 출원); 제 60/168217 호(1999년 11월 30일자) 및 제 60/200834 호(2000년 5월 1일자 출원)에 개시되고 청구된 화합물을 포함하여, 효소 파네실 단백질 트랜스퍼라제의 억제제 및 수용체 티로신 키나제 PDGFr의 억제제가 포함된다. 상기 특허출원 및 가출원 각각은 본원에 그대로 참고로 인용된다.

PDGRr 억제제로는 본원에 그대로 참고로 인용된 2001년 7월 7일 공개된 WO 01/40217 호 및 2004년 3월 11일자로 공개된 WO 2004/020431 호에 개시된 것들이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 바람직한 PDGFr 억제제로는 화이자의 CP-673,451 및 CP-868,596 및 그의 약학적으로 허용되는 염이 포함된다.

바람직한 GARF 억제제로는 화이자의 AG-2037(펠리트렉솔 및 그의 약학적으로 허용되는 염)이 포함된다. 본 발명의 실시에 유용한 GARF 억제제는 본원에 그대로 참고로 인용된 미국 특허 제 5,608,082 호에 개시되어 있다.

본원에 기술된 바와 같은 P-카드헤린 항체 또는 그의 항원 결합 부분 및 본원에 기술된 약학 조성물과 함께 사용될 수 있는 유용한 COX-II 억제제의 예로는 셀레브렉스(CELEBREX, 등록상표)(셀레콕시브), 파레콕시브, 데라콕시브, ABT-963, MK-663(에토리콕시브), COX-189(루미라콕시브), BMS 347070, RS 57067, NS-398, 벡스트라(발데콕시브), 파라콕시브, 비옥스(Vioxx, 로페콕시브), SD-8381, 4-메틸-2-(3,4-다이메틸페닐)-1-(4-설파모일-페닐)-1H-피롤, 2-(4-에톡시페닐)-4-메틸-1-(4-설파모일페닐)-1H-피롤, T-614, JTE-522, S-2474, SVT-2016, CT-3, SC-58125 및 아르콕시아(Arcoxia)(에토리콕시브)가 포함된다. 또한, COX-II 억제제는 본원에 그대로 인용된 미국 특허출원 제 10/801,446 및 10/801,429 호에 개시되어 있다.

한 바람직한 태양에서, 항종양제는 본원에 그대로 인용된 미국 특허 제 5,466,823 호에 개시된 바와 같은 셀레콕시브이다. 셀레콕시브의 구조를 하기에 나타내었다:

한 바람직한 태양에서, 항종양제는 본원에 그대로 인용된 미국 특허 제 5,633,272 호에 개시된 바와 같은 발데콕시브이다. 발데콕시브의 구조를 하기에 나타내었다:

한 바람직한 태양에서, 항종양제는 본원에 그대로 인용된 미국 특허 제 5,932,598 호에 개시된 바와 같은 파라콕시브이다. 파라콕시브의 구조를 하기에 나타내었다:

한 바람직한 태양에서, 항종양제는 본원에 그대로 인용된 미국 특허 제 5,521,207 호에 개시된 바와 같은 데라콕시브이다. 데라콕시브의 구조를 하기에 나타내었다:

한 바람직한 태양에서, 항종양제는 본원에 그대로 인용된 미국 특허 제 6,034,256 호에 개시된 바와 같은 SD-8381이다. SD-8381의 구조를 하기에 나타내었다:

한 바람직한 태양에서, 항종양제는 본원에 그대로 인용된 WO 2002/24719 호에 개시된 바와 같은 ABT-963이다. ABT-963의 구조를 하기에 나타내었다:

한 바람직한 태양에서, 항종양제는 하기에 나타낸 바와 같은 로페콕시브이다:

한 바람직한 태양에서, 항종양제는 본원에 그대로 인용된 국제 출원번호 WO 1998/03484 호에 개시된 바와 같은 MK-663(에토리콕시브)이다. 에토리콕시브의 구조를 하기에 나타내었다:

한 바람직한 태양에서, 항종양제는 본원에 그대로 인용된 국제 출원번호 WO 1999/11605 호에 개시된 바와 같은 COX-189(루미라콕시브)이다. 루미라콕시브의 구조를 하기에 나타내었다:

한 바람직한 태양에서, 항종양제는 본원에 그대로 인용된 미국 특허 제 6,180, 651 호에 개시된 바와 같은 BMS-347070이다. BMS-347070의 구조를 하기에 나타내었다:

한 바람직한 태양에서, 항종양제는 NS-398(CAS 123653-11-2)이다. NS-398(CAS 123653-11-2)의 구조를 하기에 나타내었다:

한 바람직한 태양에서, 항종양제는 RS 57067(CAS 17932-91-3)이다. RS-57067(CAS 17932-91-3)의 구조를 하기에 나타내었다:

한 바람직한 태양에서, 항종양제는 4-메틸-2-(3,4-다이메틸페닐)-1-(4-설파모일-페닐)-1H-피롤이다. 4-메틸-2-(3,4-다이메틸페닐)-1-(4-설파모일-페닐)-1H-피롤의 구조는 하기에 나타내었다:

한 바람직한 태양에서, 항종양제는 2-(4-에톡시페닐)-4-메틸-1-(4-설파모일페닐)-1H-피롤이다. 2-(4-에톡시페닐)-4-메틸-1-(4-설파모일페닐)-1H-피롤의 구조는 하기에 나타내었다:

한 바람직한 태양에서, 항종양제는 멜록시캄이다. 멜톡시캄의 구조는 하기에 나타내었다:

본 발명의 항체 및 본원에 기술된 약학 조성물과 함께 사용되는 항종양제로 유용한 억제제로는 아스피린이 포함되고, 프로스타글란딘을 제조하는 효소(사이클로옥시게나제 I 및 II)를 억제하여 보다 낮은 수준의 프로스타글란딘을 생성하는 비-스테로이드성 항-염증 약물(NSAID)로는 살살레이트(Salsalate, 아미제식(Amigesic)), 다이플루니살(Diflunisal, 돌로비드(Dolobid)), 이부프로펜(Ibuprofen, 모트린(Motrin)), 케토프로펜(Ketoprofen, 오루디스(Orudis)), 나부메톤(Nabumetone, 렐라펜(Relafen)), 피록시캄(Piroxicam, 펠덴(Feldene)), 나프록센(Naproxen, 알레베(Aleve), 나프로신(Naprosyn)), 다이클로페낙(Diclofenac, 볼타렌(Voltaren)), 인도메타신(Indomethacin, 인도신(Indocin)), 슐린닥(Sullindac, 클리노릴(Clinoril)), 톨메틴(Tolmetin, 톨렉틴(Tolectin)), 에토돌락(Etodolac, 로딘(Lodine)), 케토롤락(Ketorolac, 토라돌(Toradol)), 옥사프로진(Oxaprozin, 데이프로(Daypro)) 및 그의 혼합물이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 바람직한 COX-I 억제제로는 이부프로펜(모트린), 뉴프린, 나프록센(알레베), 인도메타신(인도신), 나부메톤(렐라펜) 및 그의 혼합물이 포함된다.

본원에 기술된 바와 같은 P-카드헤린 항체 또는 그의 항원 결합 부분 및 본원에 기술된 바와 같은 약학 조성물과 함께 사용되는 표적화제로는 EGFr 억제제, 이레사(Iressa)(게피티니브, 아스트라제네카), 타르세바(Tarceva)(엘로티니브 또는 OSI-774, OSI 파마슈티칼스 인코포레이티드(OSI Pharmaceuticals Inc.)), 에르비툭스(Erbitux)(세툭시맙, 임클론 파마슈티칼스, 인코포레이티드(Imclone Pharmaceuticals, Inc.)), EMD-7200(메르크(Merck) AG), ABX-EGF(암젠 인코포레이티드(Amgen Inc.) 및 압제닉스 인코포레이티드(Abgenix Inc.)), HR3(쿠바 정부(Cuban Government)), IgA 항체(유니버시티 오브 에를랑겐-뉘른베르크(University of Erlangen-Nuremberg)), TP-38(IVAX), EGFR 융합 단백질, EGF-백신, 항-EGFr 면역리포솜(헤르메스 바이오사이언시즈 인코포레이티드(Hermes Biosciences Inc.)) 및 그의 혼합물이 포함된다.

바람직한 EGFr 억제제로는 이레사, 에르비툭스, 타르세바 및 그의 혼합물이 포함된다.

본 발명은 또한 다음과 같은 판 erb 수용체 억제제 또는 ErbB2 수용체 억제제로부터 선택된 항종양제에 관한 것이다: CP-724,714(화이자 인코포레이티드), CI-1033(카네트리닙, 화이자 인코포레이티드), 헤르셉틴(Herceptin)(트라스트주맙, 젠엔테크 인코포레이티드(Genentech Inc.)), 오미타그(Omitarg)(2C4, 퍼투주맙, 젠엔테크 인코포레이티드), TAK-165(타케다(Takeda)), GW-572016(로나파닙, 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)), GW-282974(글락소스미스클라인), EKB-569(웨이스(Wyeth)), PKI-166(노바티스), dHER2(HER2 백신, 코릭사(Corixa) 및 글락소스미스클라인), APC8024(HER2 백신, 덴드레온(Dendreon)), 항-HER2/neu 이중특이성 항체(데코프 암 센터(Decof Cancer Center)), B7.her2.IgG3(아젠시스(Agensys)), AS HER2(래드 생물 의학 연구 기관(Research Institute for Rad Biology & Medicine)), 삼작용성 이중특이 항체(유니버시티 오브 뮌헨(University of Munich)) 및 mAB AR-209(아로넥스 파마슈티칼스 인코포레이티드(Aronex Pharmaceuticals Inc) 및 mAB 2B-1(카이론) 및 그의 혼합물. 바람직한 erb 선택성 항종양제로는 헤르셉틴, TAK-165, CP-724,714, ABX-EGF, HER3 및 그의 혼합물이 포함된다. 바람직한 판 erbb 수용체 억제제로는 GW572016, CI-1033, EKB-569 및 오미타그 및 그의 혼합물이 포함된다.

추가의 erbB2 억제제로는 각각 본원에 그대로 참고로 인용된 WO 98/02434 호(1998년 1월 22일 공개), WO 99/35146 호(1999년 7월 15일 공개), WO 99/35132 호(1999년 7월 15일 공개), WO 98/02437 호(1998년 1월 22일 공개), WO 97/13760 호(1997년 4월 17일 공개), WO 95/19970 호(1995년 7월 27일 공개), 미국 특허 제 5,587,458 호(1996년 12월 24일 허여) 및 미국 특허 제 5,877,305 호(1999년 3월 2일 허여)에 기술된 것들이 포함된다. 본 발명에 유용한 erbB2 수용체 억제제는 또한 각각 본원에 그대로 참고로 인용된 미국 특허 제 6,465,449 및 6,284,764 호 및 국제 출원 WO 2001/98277 호에 기술되어 있다.

또한, 다른 항종양제는 다음의 약제들로부터 선택될 수 있다: BAY-43-9006(오닉스 파마슈티칼스 인코포레이티드(Onyx Pharmaceuticals Inc.)), 제나센스(Genasense)(오그메로센, 젠타(Genta)), 파니튜무맙(Panitumumab)(압제닉스/암젠), 제발린(Zevalin)(쉐링(Schering)), 벡사르(Bexxar)(코릭사/글락소스미스클라인), 아바렐릭스(Abarelix), 알림타(Alimta), EPO 906(노바티스), 디스코더몰라이드(XAA-296), ABT-510(애보트(Abbott)), 네오바스타트(Neovastat)(애터나(Aeterna)), 엔자스타우린(enzastaurin)(엘리 릴리(Eli Lilly)), 콤브레스타틴(Combrestatin) A4P(옥시젠(Oxigene)), ZD-6126(아스트라제네카), 플라보피리돌(아벤티스(Aventis)), CYC-202(사이클라셀(Cyclacel)), AVE-8062(아벤티스), DMXAA(로슈(Roche)/안티소마(Antisoma)), 티미택(Thymitaq)(엑시미아스(Eximias)), 테모다르(Temodar)(테모졸로마이드, 쉐링 플로우(Schering Plough)) 및 레빌림드(Revillimd)(셀레진(Celegene)) 및 그의 혼합물.

다른 항종양제는 다음의 약제들로부터 선택될 수 있다: CyPat(사이프로테론 아세테이트), 히스테렐린(Histerelin)(히스트렐린 아세테이트), 플레나익시스(Plenaixis)(아바렐릭스 데포트), 아트라젠탄(Atrasentan)(ABT-627), 사트라플라틴(Satraplatin)(JM-216), 탈로미드(Thalomid)(탈리도마이드), 테라토프(Theratope), 테밀리펜(Temilifene)(DPPE), ABI-007(파클리탁셀), 에비스타(Evista)(랄록시펜), 아타메스테인(Atamestane)(바이오메드(Biomed)-777), 지오탁스(Xyotax)(폴리글루타메이트 파클리탁셀), 타르게틴(Targetin)(벡사로틴) 및 그의 혼합물.

또한, 다른 항종양제는 다음의 약제로부터 선택될 수 있다: 트리자온(Trizaone)(티라파자민), 아포신(Aposyn)(엑시설린드), 네바스타트(Nevastat)(AE-941), 세플렌(Ceplene)(히스타민 다이하이드로클로라이드), 오라테신(Orathecin)(루비테칸), 바이룰리진(Virulizin), 가스트리뮨(Gastrimmune)(G17DT), DX-8951f(엑사테칸 메실레이트), 온코네이스(Onconase)(란피르네이스), BEC2(미투모압), 자이트린(Xcytrin)(모텍사핀 가돌리늄) 및 그의 혼합물.

*또 다른 항종양제는 다음 약제 세아바크(Ceavac)(CEA), 뉴트렉신(NeuTrexin)(트라이메트레세이트 글루큐로네이트) 및 그의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 추가의 항종양제는 다음 약제 오바렉스(OvaRex)(오레고보맙), 오시뎀(Osidem)(IDM-1) 및 그의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 또 다른 항종양제는 다음 약제 아드벡신(Advexin)(ING201), 티라존(Tirazone)(티라파자민) 및 그의 혼합물에서 선택될 수 있다. 또 다른 항종양제는 다음 약제 RSR13(에파프록시랄), 코타라(131I chTNT 1/b), NBI-3001(IL-4) 및 그의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 또 다른 항종양제는 다음 약제 캔박신(Canvaxin), GMK 백신, PEG 인테론 A, 탁소프렉신(Taxoprexin)(DHA/파클리탁셀) 및 그의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 다른 바람직한 항종양제로는 화이자의 MEK 1/2 억제제 PD325901, 어레이 바이오팜(Array Biopharm)의 MEK 억제제 ARRY-142886, 브리스톨 마이어스(Bristol Myers)의 CDK2 억제제 BMS-387,032, 화이자의 CDK 억제제 PD0332991 및 아스트라제네카의 AXD-5438 및 그의 혼합물이 포함된다. 또한, mTOR 억제제, 예를 들면, CCI-779(웨이스) 및 라파마이신 유도체 RAD001(노바티스) 및 AP-23573(아리아드(Ariad)), HDAC 억제제 SAHA(메르크 인코포레이티드/애톤 파마슈티칼스(Merck Inc./Aton Pharmaceuticals) 및 그의 혼합물도 사용될 수 있다. 또 다른 항종양제로는 오로라 2 억제제 VX-680(버텍스(Vertex)), Chk1/2 억제제 XL844(엑실리시스(Exilixis))가 포함된다.

다음의 세포독성제, 예를 들면, 에피루비신(엘렌스(Ellence)), 도세탁셀(탁소테어(Taxotere)), 파클리탁셀, 지네카드(Zinecard)(덱스라족산), 리툭시맙(리툭산(Rituxan), 이마티닙 메실레이트(글리벡(Gleevec)), 및 그의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 본원에 기술된 바와 같은 P-카드헤린 항체 또는 그의 항원-결합 부분 및 본원에 기술된 바와 같은 약학 조성물과 함께 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 엑세메스테인(아로마신(Aromasin), 화이자 인코포레이티드), 류프로렐린(루프론(Lupron) 또는 류플린(Leuplin), TAP/애보트/타케다), 아나스트로졸(아리미덱스(Arimidex), 아스트라제네카), 고스렐린(졸라덱스(Zoladex), 아스트라제네카), 독세르칼시페롤, 파드로졸, 포메스테인, 타목시펜 시트레이트(타목시펜, 놀바덱스(Nolvadex), 아스트라제네카), 카소덱스(Casodex)(아스트라제네카), 아바렐릭스(Abarelix)(프라에시스(Praecis)), 트렐스타(Trelstar) 및 그의 혼합물을 포함하나 이로 한정되지는 않는 호르몬 요법과 함께 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 부분을 이용하는 것도 또한 포함한다.

본 발명은 또한 풀베스트란트, 토레미펜, 랄록시펜, 라소폭시펜, 레트로졸(페마라(Femara), 노바티스), 항-안드로겐, 예를 들면, 바이칼루타미드, 플루타미드, 미페프리스톤, 닐루타미드, 카소덱스(Casodex, 등록상표)(4'-사이아노-3-(4-플루오로페닐설포닐)-2-하이드록시-2-메틸-3'-(트라이플루오로메틸) 프로피온아닐라이드, 바이칼루타미드) 및 그의 혼합물을 포함하나 이로 한정되지는 않는 항-에스트로겐과 같은 호르몬 치료제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 항체를 단독으로 또는 하나 이상의 지지 간호 제품, 예를 들면, 필그라스팀(Filgrastim)(뉴포겐(Neupogen)), 온단세트론(조프란(Zofran)), 프라그민(Fragmin), 프로크리트(Procrit), 알록시(Aloxi), 에멘드(Emend) 또는 그의 혼합물과 함께 제공한다.

특히 바람직한 세포독성제로는 캄프토사르, 에르비툭스, 이레사, 글리벡, 탁소테어 및 그의 혼합물이 포함된다.

다음 토포아이소머라제 I 억제제, 즉, 캄포토테신, 이리노테칸 HCl(캄프토사르), 에도테카린, 오라테신(슈퍼겐(Supergen)), 엑사테칸(다이치(Daiichi)), BN-80915(로슈) 및 그의 혼합물을 항종양제로 사용할 수 있다. 특히 바람직한 토포아이소머라제 II 억제제로는 에피루비신(엘렌스)가 포함된다.

본 발명의 항체는 항종양제, 알킬화제, 항대사제, 항생물질, 식물-유도 항종양제, 캄포토테신 유도체, 티로신 키나제 억제제, 다른 항체, 인터페론 및/또는 생물 반응 조절제와 함께 사용될 수 있다.

알킬화제로는 질소 머스터드 N-옥사이드, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란, 부설판, 미토브로니톨, 카보쿠온, 티오테파, 라니무스틴, 니무스틴, 테모졸로마이드, AMD-473, 알트레타민, AP-5280, 아파지쿠온, 브로스탈리신, 벤다무스틴, 카무스틴, 에스트라무스틴, 포테무스틴, 글루포스파미드, 이포스파미드, KW-2170, 마포스파미드 및 미토락톨이 포함되나, 이로 한정되지는 않으며; 백금-배위 알킬화 화합물로는 시스플라틴, 파라플라틴(카보플라틴), 엡타플라틴, 로바플라틴, 네다플라틴, 엘록사틴(옥살리프라틴, 사노피(Sanofi)) 또는 사트르플라틴 및 그의 혼합물이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 특히 바람직한 알킬화제로는 엘록사틴(옥살리플라틴)이 포함된다.

항대사제로는 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린 리보사이드, 머캅토퓨린, 5-플루오로우라실(5-FU) 단독으로 또는 류코보린, 테가퍼, UFT, 독시플루리딘, 카모퍼, 시타라빈, 시타라빈 옥포스페이트, 에노시타빈, S-1, 알림타(프리메트렉세드 이나트륨, LY231514, MTA), 겜자(Gemzar)(겜시타빈, 엘리 릴리), 플루다라빈, 5-아자시티딘, 카페시타빈, 클라드리빈, 클로파라빈, 데시타빈, 에플로르니틴, 에티닐사이티딘, 시토신 아라비노사이드, 하이드록시유레아, TS-1, 멜팔란, 넬라라빈, 놀라트렉세드, 옥포스페이트, 이나트륨 프레메트렉세드, 펜토스타틴, 펠리트렉솔, 랄티트렉세드, 트리아핀, 트리메트렉세이트, 비다라빈, 빈크리스틴, 비노렐빈과 함께; 또는 예를 들면, N-(5-[N-(3,4-다이하이드로-2-메틸-4-옥소퀴나졸린-6-일메틸)-N-메틸아미노]-2-테노일)-L-글루탐산과 같은 유럽 특허출원 제 239362 호에 개시된 바람직한 항대사제 중 하나 및 그의 혼합물이 포함되나 이로 한정되지는 않는다.

항생물질로는 아클라루비신, 액티노마이신 D, 암루비신, 아나마이신, 아드리아마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 엘사미트루신, 에피루비신, 갈라루비신, 이다루비신, 미토마이신 C, 네모루비신, 네오카르지노스타틴, 페플로마이신, 피라루비신, 레베카마이신, 스티말라머, 스트렙토조신, 발루비신, 지노스타틴 및 그의 혼합물과 같은 삽입 항생물질이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.

식물 유도 항종양 물질로는, 예를 들면, 유사분열 억제제, 예를 들어, 빈블라스틴, 도세탁셀(탁소테어), 파클리탁셀 및 그의 혼합물로부터 선택된 것들이 포함된다.

세포독성 토포아이소머라제 억제제로는 아클라루비신, 아모나파이드, 벨로테칸, 캄프토테신, 10-하이드록시캄프토테신, 9-아미노캄프토테신, 다이플로모테칸, 이리노테칸 HCl(캄프토사르), 에도테카린, 에피루비신(엘렌스), 에토포시드, 엑사테칸, 기마테칸, 루토테칸, 미톡산트론, 피라루비신, 픽산트론, 루비테칸, 소부족산, SN-38, 타플루포시드, 토포테칸 및 그의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 약제가 포함된다.

바람직한 세포독성 토포아이소머라제 억제제로는 캄프토테신, 10-하이드록시캄프토테신, 9-아미노캄프토테신, 이리노테칸 HCl(캄프토사르), 에도테카린, 에피루비신(엘렌스), 에토포시드, SN-38, 토포테칸 및 그의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 약제가 포함된다.

면역제로는 인터페론 및 많은 다른 면역증진제가 포함된다. 인터페론으로는 인터페론 알파, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 인터페론 베타, 인터페론 감마-1a, 인터페론 감마-1b(액티뮨(Actimmune)) 또는 인터페론 감마-n1 및 r의 혼합물이 포함된다. 다른 약제로는 필그라스팀, 렌티난, 시조필란, 테라시스, 유베니멕스, WF-10, 알데스류킨, 알렘투주맙, BAM-002, 다카바진, 다클리주맙, 데니류킨, 겜투주맙, 오조가미신, 이브리투모맙, 이미퀴모드, 레노그라스팀, 렌티난, 멜라노마 백신(코릭사(Corixa)), 몰그라모스팀, 온코VAX-CL, 사그라모스팀, 타소네민, 테크류킨, 티말라신, 토시투모맙, 비룰리진, Z-100, 에프라투주맙, 마투모맙, 오레고보맙, 펩투모맙(Y-muHMFG1), 프로벤지(Provenge)(덴드레온) 및 그의 혼합물이 포함된다.

생물 반응 조절제는 살아있는 유기체의 방어 메카니즘 또는 생물 반응, 예를 들면, 생존, 성장, 또는 항종양 활성을 갖도록 유도하는 조직 세포의 분화를 조절하는 약제이다. 상기 약제로는 크레스틴, 렌티난, 시조피란, 피티바닐, 유베니멕스 및 그의 혼합물이 포함된다.

다른 항암제로는 알리트레티노인, 암플리겐, 아트라센탄 벡사로텐, 보르테조밉, 보센탄, 칼시트리올, 엑시슐린드, 피나스테리드, 포테무스틴, 이반드론산, 밀테포신, 미톡산트론, l-아스파라지나제, 프로카바진, 데카바진, 하이드록시카바미드, 페가스파가제, 펜토스타틴, 타자로틴, 텔시타(TLK-286, 텔릭 인코포레이티드(Telik Inc.)), 벨케이드(Velcade)(보테마집, 밀레니움(Millenium)), 트레티노인 및 그의 혼합물이 포함된다.

다른 항-신생혈관생성 화합물로는 아시트레틴, 펜레티나이드, 탈리도마이드, 졸레드론산, 안지오스타틴, 아플리딘, 실렝타이드, 콤브레타스타틴 A-4, 엔도스타틴, 할로푸지논, 레비마스타트, 레모밥, 레블리미드, 스투알라민, 유크레인, 비탁신 및 그의 혼합물이 포함된다.

백금-배위 화합물로는 시스플라틴, 카보플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴 및 그의 혼합물이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.

캄프토테신 유도체로는 캄크포테신, 10-하이드록시캄프토테신, 9-아미노캄프토테신, 이리노테칸, SN-38, 에도테카린, 토포테칸 및 그의 혼합물이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.

다른 항종양제로는 미톡산트론, l-아스파라지나제, 프로카바진, 다카바진, 하이드록시카바미드, 펜토스타틴, 트레티노인 및 그의 혼합물이 포함된다.

CTLA4(세포독성 림프구 항원 4) 항체와 같은 항종양 면역 반응을 증대시킬 수 있는 항종양제, 및 CTLA4를 차단할 수 있는 다른 약제, 예를 들면, MDX-010(메다렉스) 및 미국 특허 제 6,682,736 호에 개시된 CTLA4 화합물; 및 다른 파네실 단백질 트랜스퍼라제 억제제, 예를 들면, 파네실 단백질 트랜스퍼라제 억제제와 같은 항증식제도 사용할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 또 다른 특정 CTLA4 항체로는 본원에 그대로 참고로 인용된 미국 가출원 제 60/113,647 호(1998년 12월 23일자 출원), 미국 특허 제 6,682,736 호에 기술된 것들이 포함된다.

본 발명에 사용될 수 있는 특정 IGF 1R 항체로는 본원에 그대로 참고로 인용된 국제 특허출원 WO 2002/053596 호에 기술된 것들이 포함된다.

본 발명에 사용될 수 있는 특정 CD40 항체로는 본원에 그대로 참고로 인용된 국제 특허출원 WO 2003/040170 호에 기술된 것들이 포함된다.

방사선요법에 반응하여 TNF알파를 발현하는 TNFerade(진벡크(Genevec))와 같은 유전자 치료제도 또한 항종양제로 사용될 수 있다.

본 발명의 한 태양에서, 스타틴을 본원에 기술된 바와 같은 P-카드헤린 항체 또는 그의 항원 결합 부분 및 그의 약학 조성물과 함께 사용할 수 있다. 스타틴(HMG-CoA 리덕타제 억제제)은 아토르바스타틴(Atorvastatin)(리피토(Lipitor), 화이자 인코포레이티드), 프로바스타틴(Provastatin)(프라바콜(Pravachol), 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb)), 로바스타틴(Lovastatin)(메바코(Mevacor), 메르크 인코포레이티드), 심바스타틴(Simvastatin)(조코(Zocor), 메르크 인코포레이티드), 플루바스타틴(Fluvastatin)(레스콜(Lescol), 노바티스), 세리바스타틴(Cerivastatin)(베이콜(Baycol), 베이어), 로수바스타틴(Rosuvastatin)(크레스토(Crestor), 아스트라제네카), 로보스타틴(Lovostatin) 및 니아신(Niacin)(아드비코(Advicor), 코스 파마슈티칼스(Kos Pharmaceuticals)), 그의 유도체 및 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

바람직한 태양에서, 스타틴은 아토보르스타틴 및 로바스타틴, 그의 유도체 및 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다.

항종양제로 유용한 다른 약제로는 카듀엣(Caduet)이 포함된다.

P-카드헤린 항체 또는 항원 결합 부분과 하나 이상의 추가의 치료제의 혼합물을 사용하여 본원에 기술된 바와 같이 과증식성 장애 또는 이상 세포 성장을 치료하는 임의의 방법에 있어, P-카드헤린 항체는 추가의 치료제와 혼합되거나 유도체화될 수 있다. 하나 이상의 추가의 치료제는 또한 별도로 투여되거나 또는 비-유도체화 또는 비-혼합 방식으로 투여될 수 있다. 하나 이상의 추가의 치료제가 항체에 유도체화되거나 혼합되지 않는 경우, 상기 치료제는 항체와 동일한 약학 제형내에 투여될 수 있거나 또는 별도의 제형으로 투여될 수 있다.

유전자 치료

본 발명의 항체 및 항체 부분을 암호화하는 핵산 분자는 유전자 치료에 의해 그를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 상기 치료법은 생체내 또는 생체외로 이루어질 수 있다. 바람직한 태양에서, 중쇄 및 경쇄 둘 다를 암호화하는 핵산 분자를 환자에게 투여한다. 보다 바람직한 태양에서는, B 세포가 항체를 생성하도록 분화되기 때문에 핵산 분자가 B 세포의 염색체내에 안정하게 통합되도록 핵산 분자를 투여한다. 바람직한 태양에서, 전구체 B 세포는 생체외로 형질감염 또는 감염시키고 그를 필요로 하는 환자에게 재-이식된다. 또 다른 태양으로, 전구체 B 세포 및 기타 세포는 문제의 세포 유형을 감염시키는 것으로 알려진 바이러스를 사용하여 생체내로 감염시킨다. 유전자 치료에 사용되는 전형적인 벡터로는 리포솜, 플라스미드 및 바이러스 벡터가 포함된다. 대표적인 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스이다. 생체내 또는 생체외로 감염후에, 치료된 환자로부터 샘플을 취하고 당해분야에 공지되어 있거나 본원에서 논의된 임의의 면역분석법을 이용하여 항체 발현 수준을 모니터할 수 있다.

바람직한 태양에서, 유전자 치료 방법은 P-카드헤린 항체의 중쇄 또는 그의 항원-결합 부분을 암호화하는 분리된 핵산 분자를 투여하고 상기 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함한다. 또 다른 태양에서, 유전자 치료 방법은 P-카드헤린 항체의 경쇄 또는 그의 항원-결합 부분을 암호화하는 분리된 핵산 분자를 투여하고 상기 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함한다. 보다 바람직한 방법에서, 유전자 치료 방법은 중쇄 또는 그의 항원-결합 부분을 암호화하는 분리된 핵산 분자, 및 본 발명의 P-카드헤린 항체의 경쇄 또는 그의 항원-결합 부분을 암호화하는 분리된 핵산 분자를 투여하고 상기 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함한다. 유전자 치료 방법은 또한 복합 요법과 관련하에 앞에서 논의한 임의의 약제와 같은 또 다른 치료제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명은 P-카드헤린에 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 부분, 상기 항체 및 항원-결합 부분을 암호화하는 핵산 분자, P-카드헤린 항체 및 항원-결합 부분의 제조 방법, 상기 항체 및 항원-결합 부분을 포함하는 조성물, 및 상기 항체, 항원-결합 부분 및 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.

도 1은 서열번호: 1 내지 347의 아미노산 및 핵산 서열을 나타낸 것이다.

본 발명을 더 잘 이해하기 위해, 하기 실시예를 나타낸다. 이들 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 어떻게든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되서는 안된다.

하기 실시예 및 제조예에서, "BSA"는 소 혈청 알부민을 의미하고; "EDTA"는 에틸렌다이아민테트라아세트산을 의미하고; "DMSO"는 다이메틸 설폭사이드를 의미하고; "MOPS"는 3-(N-모폴리노) 프로페인설폰산을 의미하고; "MES"는 2-(N-모폴리노)에테인설폰산을 의미하고; "PBS"는 포스페이트 완충 식염수를 의미하고; "dPBS"는 둘베코(Dulbecco) 포스페이트 완충 식염수를 의미하고; "HEMA"는 2-하이드록시-에틸 메타크릴레이트를 의미하고; "DMEM"은 둘베코 변형 이글 배지를 의미하고; "FBS"는 소 태아 혈청을 의미하고; "NEAA"는 비필수 아미노산을 의미하고; "HEPES"는 N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에테인설폰산을 의미하고; "DMF"는 다이메틸 폼아마이드를 의미한다.

실시예 1: scFv 파아지 디스플레이 라이브러리

scFv 파아지 디스플레이 라이브러리를 검색하기 위해 항원으로 재조합 인간 P-카드헤린(R&D 시스템즈 861-PC-100)을 사용하였다. 파아지미드 벡터에 클로닝된 거대 scFv 인간 항체 라이브러리를 선별에 사용하였다[Vaughan, T.J. et al., Nat . Biotech., 14:309-314, 1996]. 재조합 인간 P-카드헤린 및 P-카드헤린을 발현하는 HCT116 세포의 포화 단층(confluent monolayer) 상에서 일련의 반복 선별 사이클에서 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 P-카드헤린을 인지하는 scFv를 분리하였다. 간략하게, 라이브러리와 함께 배양후에, 결합된 파아지를 P-카드헤린으로부터 회수하고 미결합 파아지는 세척하였다. 이어서, 결합된 파아지를 문헌 [Vaughan, T.J. et al., Nat . Biotech., 14:309-314, 1996]에 기술된 바와 같이 보호하고, 선별 과정을 반복하였다. 필수적으로 문헌 [Vaughan, T.J. et al., Nat . Biotech., 14:309-314, 1996]에 기술된 바와 같이, 선별 사이클의 결과물로부터 대표적인 비율의 클론을 파아지 효소-결합 면역흡수 분석법(ELISA)에 적용하여 P-카드헤린에 대한 결합을 검사하였다. 다음의 두 개의 상이한 항원을 ELISA에 사용하였다: 재조합 인간 P-카드헤린(R&D 시스템즈) 및 P-카드헤린을 발현하는 A431 세포의 포화 단층. ELISA-양성 클론을 문헌 [Vaughan, T.J. et al., Nat . Biotech., 14:309-314, 1996; and Osbourn, J.K., et al., Immunotechnology, 3:293-302, 1998]에 기술된 바와 같이 DNA 서열화에 적용하였다. 유일한 ELISA-양성 클론을 전체 IgG 분자로 전환시키고, 실시예 4에 기술된 P-카드헤린 의존성 부착 분석에서 P-카드헤린을 중화시키는 그의 능력에 대해 시험하였다. 상기 검색 결과를 기초로, 항체 129-1c4(A431 부착 분석에서 1 내지 3 μM의 IC50)를 추가의 최적화를 위한 선두(lead) 모 계통으로 선택하였다.

실시예 2: 선두 최적화

129-1c4로부터 유도된 파아지 디스플레이 라이브러리를 항체 가변 중쇄(V_H) 및 가변 경쇄(V_L) CDR3 영역의 올리고뉴클레오티드-지향 돌연변이유발에 의해 제작하였다. 상기 라이브러리는 문헌 [Clackson and Lowman, Phage Display - A Practical Approach, Oxford University Press 2004]에 기술된 바와 같은 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 구축하였다. 친화도-기준 선별을 수행하였다: 라이브러리와 함께 배양후, 재조합 인간 P-카드헤린(R&D 시스템즈)을 단백질 G-코팅된 상자성 비드(다이날(Dynal) 100.03)에 의해 포획하고, 미결합 복합체는 세척해내면서 결합된 파아지를 자기 분리에 의해 회수하였다. 선별 과정동안 존재하는 재조합 인간 P-카드헤린의 농도를 감소시키면서(4 사이클동안 25 nM에서 10 pM으로) 선별 과정을 반복하였다. 또한, V_H CDR3 및 V_L CDR3 라이브러리로부터 선별 결과물을 또 다른 파아지 디스플레이 라이브러리에 재도입하고 2회 이상의 친화도-기준 선별을 거쳐 선별하였다. 선별 사이클의 결과물로부터 전형적 비율의 클론을 실시예 8에 기술된 바와 같이 129-1c4 에피토프중 scFv로서의 검색에 적용하였다.

실시예 3: P- 카드헤린 의존성 부착 분석

하기의 프로토콜을 이용하여, 실시예 2에서 전술한 바와 같은 항체 동정의 최적화 단계시에 IgG로 전환시킨 여러 최적화 scFv를 사용하여 P-카드헤린 의존성 부착 분석에서 IC₅₀ 값을 측정하였다. 이들 항체에 대해 측정된 평균 IC₅₀ 값을 하기 표 4에 나타내었다.

재조합 인간 P-카드헤린 Fc(R&D Cat. 861-PC)를 사용하기 24 시간전에 밀리큐(MilliQ) 물 중의 2 mM CaCl₂로 1 mg/ml의 농도로 희석시키고 4 ℃에서 저장하였다. A431 세포를 다음과 같이 배양하고 준비하였다. A431 세포(ECACC No. 85090402)를 눈크(Nunc) 삼중 플라스크(3 x 175 cm² 면적)에서 10% 소 태아 혈청(인비트로겐(Invitrogen) Cat. 10100-147) 및 1% 비필수 아미노산(인비트로겐 Cat. 11140-035)을 함유하는 최소 필수 배지(MEM)(인비트로겐 Cat. 31095)에서 통상적으로 배양하였다. 배양된 세포는 분석에 사용하기 위해 수거할 때 약 80% 포화되었다. 가능한 계대배양 관련 영향으로부터 보호하기 위해, 세포를 통상적으로 4 내지 8회 계대배양에 사용하고 48 또는 72 시간 배양후 수확하였다. A431 세포를 세포가 해리되기에 충분한 시간만큼만(7 내지 10 분) 0.25% 트립신/1 mM EDTA(깁코(Gibco) Cat. 25200-056)로 수확한 다음, 즉시 조직 배양 배지로 약 2 x 10⁶ 세포/ml의 밀도로 희석하였다. 이어서, A431 세포를 원심분리(1200 rpm)하고, 분석 완충액[1 mM의 최종 CaCl₂ 농도로 보충된 행크(Hank) 균형 염 용액(Mg^{2 +} 및 Ca^{2 +} 비함유, 페놀 레드 비함유)(인비트로겐 Cat. 14175-053)]에 재현탁하고, 재원심분리하고, 분석 완충액에 다시 2 x 10⁶ 세포/ml의 최종 밀도로 재현탁하였다.

다음과 같이 IgG 연속 희석물을 제조하고 A431 세포와 함께 예비-배양하였다. 180 μl의 각 시험 IgG 또는 그의 부분을 10% BSA(시그마 Cat. A-9576)를 함유하는 20 μl의 분석 완충액으로 보충하여 BSA 농도를 1%로 표준화시켰다. 항-뮤린/인간 P-카드헤린 기준 다클론성 항체(R&D Cat. AF-761)를 초기에 밀리큐 물에 재현탁하여 1 mg/ml 접종액을 수득하였다. 그 다음, 40 μl의 상기 접종액을 140 μl의 분석 완충액으로 더 희석하였다. 이어서, 10% BSA를 함유하는 20 μl의 분석 완충액을 가하여 0.2 mg/ml 항체 및 0.1% BSA에서 200 μl를 수득하였다. 2 x 90 μl의 AF-761 다클론성 항체 또는 시험 IgG를 그레이너(Greiner) 96 웰 폴리프로필렌 희석 플레이트(그레이너 Cat. 780271)의 컬럼 1에 가하여 이중 연속 희석물을 제조하였다. 이어서, 60 μl의 분석 완충액을 컬럼 2 내지 11에 가하였다. 그 다음, 컬럼 1 내지 11로부터 플레이트를 좌에서 우로 가로질러 30 μl에서 60 μl(1:3) 희석물을 제조하였다. 이어서, 60 μl의 분석 완충액을 단독으로 12 A 내지 D 웰에 가하여 최대 부착을 결정하였다. 최소 부착은 12 E 내지 H 웰에 60 μl의 25 mM EDTA(분석 완충액중)를 첨가하여 결정하였다. 그 다음, 60 μl의 A431 세포 현탁액(2 x 10⁶ 세포/ml, 상기 개략한 바와 같이 제조된 분석 완충액중)을 웰에 가하고, 진탕시킨 후 플레이트를 37 ℃에서 1 시간동안 예비-배양하였다.

시험 IgG 연속 희석물의 제조 및 A431 세포와 함께 예비-배양함과 동시에, P-카드헤린 코팅된 분석 플레이트를 다음과 같이 제조하였다. 재조합 인간 P-카드헤린 Fc를 코팅 완충액(Mg^{2 +} 및 Ca^{2 +} 비함유 PBS, 인비트로겐 Cat. 14190-094) 중에 10 μg/ml의 농도로 희석하고 플루오로눈크(Fluoronunc) 96(눈크 Cat. 437958) 웰 분석 플레이트 상에 분배하였다(100 μl/웰). 이어서, 플레이트를 실온에서 1 시간 30 분동안 배양하였다. 그 다음, 플레이트를 테칸(Tecan) 96 플레이트 세척기를 사용하여 PBS로 3회 세척하였다. 이어서, 200 μl/웰의 분석 완충액을 차단용으로 가하고 플레이트를 실온에서 1 시간동안 더 배양하였다. 이어서, 플레이트를 전술한 바와 같이 PBS로 3회 세척하였다.

그 다음, 100 μl/웰의 예비배양한 IgG/A431 물질을 그레이너 96 웰 희석 플레이트로부터 P-카드헤린 코팅된 분석 플레이트로 옮겼다. 옮길 때, 세포가 확실히 균질하도록 IgG/A431 물질을 피펫팅으로 혼합하였다. 그 다음, 분석 플레이트를 37 ℃에서 30 내지 45 분간 배양하여 부착 과정을 진행시켰다. 배양 종료시, 플레이트로부터 배지를 약하게 흡인하고 웰을 세포 세척 완충액[1 mM CaCl₂ 최종 농도로 보충된 행크의 균형 염 용액(Mg^{2 +} 및 Ca^{2 +} 비함유 및 페놀 레드 비함유, 인비트로겐 Cat. 14175-053)]으로 재충전하여 비-부착 세포를 제거하였다. 이어서, 플레이트를 15 분간 세포 세척 완충액 욕조상에서 뒤집어 잔류하는 비-부착 세포를 제거하였다. 상기 배양 종료시, 웰의 내용물을 약하게 흡인하였다.

부착 세포의 정량화는 다음과 같이 수행하였다. 100 μl/웰의 혼합 용해/알칼리 포스파타제 검출 시약[물로 1:5로 희석한 다이에탄올아민 기질 완충액 5배 농축액(피어스 Cat. 34064), 그후 25 ml의 1X 용액당 하나의 15 mg의 PNPP 정제(시그마 Cat. N-2640)를 용해시켰다]을 첨가한 후 37 ℃에서 30 내지 60 분간 배양하여 부착 세포를 검출하였다. 그 다음, 억제하지 않은 상태에서 약 0.8의 최대 OD 값을 수득하기 위해, 1 M NaOH(50 μl/웰)를 가하여 반응을 중단시켰다. 이어서, 405 nm에서 흡광도를 표준 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다.

이어서, 결과를 다음과 같이 분석하였다. 100% 부착율로 컬럼 12, 웰 A 내지 D 및 0% 부착율로 컬럼 12, 웰 E 내지 H를 취하여, 원래의 데이터를 먼저 다음과 같이 % 부착율 값으로 전환시켰다:

% 부착율 = [(값 - 최소 부착율)/(최대 - 최소 부착율)] x 100

그 다음, % 부착율 대 IgG 억제제 농도를 플롯팅하고, 프리즘 소프트웨어를 이용하여 IC₅₀ 값을 측정하였다. 부분 억제가 관찰되는 경우, IC₅₀은 곡선 중심점에 대향될 때 실제 50% 억제율을 제공하는 IgG의 농도로 나타낸다. IC₅₀ 값은 하기 표 4에 나타내었다.

2개의 별도의 A431 부착 분석을 수행하여 그의 비-생식세포주형성 등가물과 비교하여 129-1c4 계통으로부터 여러 생식세포주형성된 최적화 IgG를 조사하였다. 상기 실험에서, P-카드헤린(CFR-134041)의 새로운 배치로 변화시키는 것이 필수적이었으며, 이것은 다른 데이터와 비교하여 약간 증가된 IC₅₀ 값과 관련되는 것으로 보인다. 두 실험으로부터 여러 생식세포주 생성 IgG에 대한 평균 데이터를 표 5에 나타내었다. 앞에서 언급했듯이, g194-b09는 194-b09의 생식세포주형성된 버전 등을 말한다.

실시예 4: P- 카드헤린 -의존성 세포 응집 분석

하기의 프로토콜을 이용하여, 실시예 2에서 전술한 바와 같이 항체 동정의 최적화 단계시 IgG로 전환된 여러 최적화 scFv를 사용하는 P-카드헤린-의존성 응집 분석에서 IC₅₀ 값을 측정하였다. P-카드헤린 과발현 세포주는 현탁액 중에서 성장할 때 치밀한 다세포 응집체를 형성하기 때문에, 세포 응집은 세포 응집에 간섭하는 P-카드헤린 항체의 존재하에 측정할 수 있다. 여러 항체에 대해 측정된 평균 IC₅₀ 값을 하기 표 6에 나타내었다.

플레이트는 다음과 같이 준비하였다. 각각의 96 웰 분석 플레이트를 50 μl 폴리HEMA(90% 에탄올, 10% 메탄올 중 12 mg/ml)로 코팅한 다음 6 시간동안 밤새 증발시킨 후, 사용전에 3 x 100 μl의 멸균 H₂O로 세척하였다. 그 다음, 세포를 다음과 같이 배양하였다. 인간 세포주 SW480(P-카드헤린 G418을 안정하게 발현하는)을 완전 성장 배지[충분한 DMEM(인비트로겐 11995-065), 10% FBS(오메가 사이언티픽(Omega Scientific) FB-02), 1:100 NEAA(인비트로겐 11140-050), 1:100 나트륨 피루베이트(인비트로겐 11360-070), 1:100 글루타민(인비트로겐 25030-051), 1:100 페니실린/스트렙토라이신(인비트로겐 15070-063), 1:100 제네티신 50 mg/ml(인비트로겐 10131-035)] + G418(500 μg/ml)에서 계대배양한 후 일주일에 2회 1:3 내지 4로 분리하였다. 그 다음, 배양물을 성장 배지 + 10% DMSO 중에 냉동시켰다.

제 1 일에, SW480:pCAD 세포 및 대조군 SW480:pCLNX(안정한 대조군 벡터)를 1:3 정도의 희석율에서 5 x 10⁶ 세포/100 mm 접시로 접종하였다. 이어서, 세포를 48 시간동안 배양하여 성장시켰다. 각각의 100 mm 접시는 약 10 x 10 ⁶ 세포, 또는 2 x 96 웰에 충분한 세포를 제공하였다.

제 3 일에, 배지를 제거한 후 dPBS(둘베코 PBS, 인비트로겐 14040-133)로 세척한 다음, 세포를 3 ml/100 mm 접시로 트립신화하였다. 이어서, 2 부피(6 ml)의 완전 성장 배지로 배출한 후 중화를 수행하였다. 그 다음, 플레이트를 피펫을 이용하여 10 ml로 3회 세척하여 덩어리를 파쇄하였다. 이어서, 세포를 계수하고, 1000 rpm에서 5 분간 벡크만(Beckman) 원심분리를 이용하여 펠릿을 수득하였다. 이어서, 배지를 흡출시키고, 펠릿을 먼저 1 ml 미만의 완전 성장 배지에 손가락으로 휘저은 다음 p1000 피펫을 사용하여 재현탁한 다음, 세포 농도를 1.3 M/ml로 표준화하였다. 단일 세포 분산액을 현미경으로 확인하였다.

이어서, dPBS 및 5% FBS로 96-웰 플레이트를 30 분간 차단하여 시약 플레이트를 준비하였다. 이어서, 플레이트를 1 x 100 μl dPBS를 사용하여 세척한 후 흡출하고 털어내어 건조시켰다. 시험 IgG의 연속 희석물을 96 웰 중 하나의 웰에서 처리 플레이트의 3 웰에 충분한 4 x [IgG] 농도를 이용하여 dPBS로 제조하였다. 30 μl/웰 중 40,000 세포를 96 웰, 세척된 폴리-HEMA 코팅된 코스타(Costar)3590 비-조직 배양 플레이트(코닝(Corning) 3590)에 분취하였다. 이어서, 10 μl의 시약을 96 웰 플레이트의 각 웰로 옮겼다. 처리 당 3벌의 샘플을 8 채널 피펫을 이용하여 준비하였다. 이어서, 250 rpm에서 배양하고 37 ℃, 5% CO₂의 가습 배양기에서 밤새(16 내지 18 시간동안) 진탕시켰다.

제 4 일에, 40 μl의 진탕시킨 세포를 폴리-라이신-코팅된 96 웰 플레이트(바이오코트(BioCoat) 폴리-라이신-코팅된 96 웰 플레이트: BD 356516)로 옮겼다. 이어서, 웰을 60 μl의 완전 성장 배지로 헹구고, 플레이트를 두드려 진탕시키고, 폴리-라이신 코팅된 플레이트로 옮겼다. 필요한 경우, 50 μl의 세척을 추가로 수행하였다. 이어서, 37 ℃, 5% CO₂ 가습 배양기에서 60 분간 배양하였다. 이 단계에서 세포 전부를 정량적으로 옮기도록 가능한 한 약하게 과도한 피페팅없이 조심해야 한다. 그 다음, 배기장치에서 100 μl의 고정액(7.4% 폼알데하이드(37% w/v, 시그마 F15587))을 첨가하여 세포를 고정시킨 후 실온에서 30 분 이상 배양하였다.

세포를 세척하기 위해, 수거 비이커 또는 트레이 내에 액체를 경사분리하고 털어내어 남은 액체를 제거하고 종이 타올로 약하게 두드린다. 이어서, 웰 당 100 μl의 dPBS를 적용하여 세척한 후 15 분간 배양하였다. 이어서, 상기와 같이 경사분리하고 100 μl의 훽스트(Hoescht)(dPBS중 1 μg/ml 훽스트 - 훽스트 10 mg/ml 분자 프로브 33342)를 적용한 후 30 분간 배양하여 세포를 염색하였다. 그 다음, 세포를 2회 세척하여 현미경검사를 위해 웰에 100 μl의 dPBS를 남겼다.

그 다음, 웰 당 응집된 개체의 수를 측정하고, 평균 개체 수(시험 IgG 갖는)를 IgG(예를 들면, Gt-항-P-카드헤린 R&D 시스템즈 AF761)의 개체 수 또는 대조군 배지 단독에 비교하였다. 개체수 대 IgG 억제제의 농도를 플롯팅하고 IC₅₀ 값을 측정하였다. 본 발명의 여러 항체에 대한 IC₅₀ 값을 표 6에 기록하였다.

실시예 5: P- 카드헤린 -의존성 타원체 붕괴 분석

하기의 타원체 붕괴 분석은 P-카드헤린 및 대조군 항체를 첨가하기 전에 밤새 세포 응집체가 생성되는 응집 분석(실시예 4에 기술된)의 변형이다. 이어서, 분석전에 추가로 24 시간동안 시험 시약을 가한다.

플레이트는 다음의 방식으로 준비하였다. 각각의 96 웰 분석 플레이트를 50 μl 폴리HEMA(90% 에탄올, 10% 메탄올 중 12 mg/ml)로 코팅한 다음 6 시간동안 밤새 증발시킨 후, 사용전에 3 x 100 μl의 멸균 H₂O로 세척하였다. 그 다음, 세포를 다음과 같이 배양하였다. 인간 세포주 SW480(P-카드헤린 G418을 안정하게 발현하는)을 완전 성장 배지[충분한 DMEM(인비트로겐 11995-065), 10% FBS(오메가 사이언티픽(Omega Scientific) FB-02), 1:100 NEAA(인비트로겐 11140-050), 1:100 나트륨 피루베이트(인비트로겐 11360-070), 1:100 글루타민(인비트로겐 25030-051), 1:100 페니실린/스트렙토라이신(인비트로겐 15070-063), 1:100 제네티신 50 mg/ml(인비트로겐 10131-035)] + G418(500 μg/ml)에서 계대배양한 후 일주일에 2회 1:3 내지 4로 분리하였다. 그 다음, 배양물을 성장 배지 + 10% DMSO 중에 냉동시켰다.

제 1 일에, SW480:pCAD 세포 및 대조군 SW480:pCLNX(안정한 대조군 벡터)를 1:3 정도의 희석율에서 5 x 10⁶ 세포/100 mm 접시로 접종하였다. 이어서, 세포를 48 시간동안 배양하여 성장시켰다. 각각의 100 mm 접시는 약 10 x 10 ⁶ 세포, 또는 2 x 96 웰에 충분한 세포를 제공하였다.

제 3 일에, 배지를 제거한 후 dPBS(둘베코 PBS, 인비트로겐 14040-133)로 세척한 다음, 세포를 3 ml/100 mm 접시로 트립신화하였다. 이어서, 2 부피(6 ml)의 완전 성장 배지로 배출한 후 중화를 수행하였다. 그 다음, 플레이트를 피펫을 이용하여 10 ml로 3회 세척하여 덩어리를 파쇄하였다. 이어서, 세포를 계수하고, 1000 rpm에서 5 분간 벡크만 원심분리를 이용하여 펠릿을 수득하였다. 이어서, 배지를 흡출시키고, 펠릿을 먼저 1 ml 미만의 완전 성장 배지에 손가락으로 휘저은 다음 p1000 피펫을 사용하여 재현탁한 다음, 세포 농도를 1.0 x 10⁶/ml로 표준화하였다. 단일 세포 분산액을 현미경으로 확인하였다.

40 μl/웰 중 40,000 세포를 96 웰, 세척된 폴리-HEMA 코팅된 코스타3590 비-조직 배양 플레이트(코닝 3590)에 분취하였다. 이어서, 250 rpm에서 배양하고 37 ℃, 5% CO₂의 가습 배양기에서 밤새(16 내지 18 시간동안) 진탕시켰다.

제 4 일에, dPBS 및 5% FBS로 96-웰 플레이트를 30 분간 차단하여 시약 플레이트를 준비하였다. 이어서, 플레이트를 1 x 100 μl dPBS를 사용하여 세척한 후 흡출하고 털어내어 건조시켰다. 시험 IgG의 연속 희석물을 96 웰 중 하나의 웰에서 처리 플레이트의 3 웰에 충분한 5 x [IgG] 농도를 이용하여 dPBS로 제조하였다. 이어서, 10 μl의 시약을 96웰 플레이트의 각 웰로 옮겼다. 처리 당 3벌의 샘플을 8 채널 피펫을 이용하여 준비하였다. 이어서, 250 rpm에서 배양하고 37 ℃, 5% CO₂의 가습 배양기에서 진탕시켰다(20 내지 24 시간동안).

제 5 일에, 50 μl의 진탕시킨 세포를 폴리-라이신-코팅된 96 웰 플레이트(바이오코트 폴리-라이신-코팅된 96 웰 플레이트: BD 356516)로 옮겼다. 이어서, 웰을 50 μl의 완전 성장 배지로 헹구고, 플레이트를 두드려 진탕시키고, 폴리-라이신 코팅된 플레이트로 옮겼다. 필요한 경우, 50 μl의 세척을 추가로 수행하였다. 이어서, 37 ℃, 5% CO₂ 가습 배양기에서 60 분간 배양하였다. 이 단계에서 세포 전부를 정량적으로 옮기도록 가능한 한 약하게 과도한 피페팅없이 조심해야 한다. 그 다음, 배기장치에서 100 μl의 고정액(7.4% 폼알데하이드(37% w/v, 시그마 F15587))을 첨가하여 세포를 고정시킨 후 실온에서 30 분 이상 배양하였다.

세포를 세척하기 위해, 수거 비이커 또는 트레이 내에 액체를 경사분리하고 털어내어 남은 액체를 제거하고 종이 타올로 약하게 두드린다. 이어서, 웰 당 100 μl의 dPBS를 적용하여 세척한 후 15 분간 배양하였다. 이어서, 상기와 같이 경사분리하고 100 μl의 훽스트(Hoescht)(dPBS중 1 μg/ml 훽스트 - 훽스트 10 mg/ml 분자 프로브 33342)를 적용한 후 30 분간 배양하여 세포를 염색하였다. 그 다음, 세포를 2회 세척하여 현미경검사를 위해 웰에 100 μl의 dPBS를 남겼다. 그 다음, 웰 당 응집된 개체의 수를 측정하고(셀로믹스(Cellomics)), 평균 개체 수(시험 IgG 갖는)를 IgG(예를 들면, Gt-항-P-카드헤린 R&D 시스템즈 AF761)의 개체 수 또는 대조군 배지 단독에 비교하였다. 개체수 대 IgG 억제제의 농도를 플롯팅하고 IC₅₀ 값을 측정하였다. 또는, 개체수를 표 7에 나타낸 바와 같은 하나의 결정된 농도에서 붕괴 배수 대 대조군으로 나타내었다.

실시예 6: P- 카드헤린 항체의 K _D 및 k _off 의 측정

비아코어(등록상표) 3000 기기를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의한 P-카드헤린 scFv 단일쇄 항체의 친화도 측정(K_D 및 k_off)을 다음과 같이 제조업자의 프로토콜을 이용하여 수행하였다.

동역학적 분석을 수행하기 위해, 재조합 인간 P-카드헤린/Fc 융합 단백질(hCad/Fc) 및 마우스 P-카드헤린/Fc 융합 단백질(mCad/Fc)을 통상적인 아민 커플링을 이용하여 CM5 비아코어(등록상표) 센서 칩의 별도의 유동 셀 상에 고정화시켰다. 표면은 고정화 완충액으로서 2.0 mM CaCl₂를 갖는 10 mM 아세테이트 완충액(pH 4.5)을 사용하여 제조하였으며, hCad/Fc 및 mCad/Fc 융합 단백질에 대해 각각 5800 및 1600 RU의 단백질 밀도가 달성되었다. 미반응 N-하이드록시석신이미드 에스터의 탈활성화는 1M 에탄올아민 하이드로클로라이드(pH 8.5)를 사용하여 수행하였다. 활성화/탈활성화 블랭크 표면을 대조군 표면으로 이용하였다. 분리 완충액(running buffer) 중의 scFv 항체 샘플을 200 내지 0.78 nM 범위의 농도로 제조하였다(분리 완충액만을 포함하는 0 nM 용액이 제로(0) 기준으로 포함되었다). 분리 완충액으로 2.0 mM CaCl₂를 갖는 HBS-P(10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005% 표면활성제 P20)를 사용하여 유동 셀 전체에 각각 1 분간 샘플을 3중으로 무작위화하고 주입하였다. 25 μl/분의 유량을 이용하여 친화도 상수를 측정하였다. 항체의 해리는 5 분간 모니터하였으며, 표면은 10 mM 글라이신-HCl(pH 1.5)의 12초 주입에 의해(25 μl/분) 재생하였다. 원 데이터는 스크러버(Scrubber, 바이오로직 소프트웨어) 소프트웨어 패키지를 이용하여 처리하고, 클램프(CLAMP, 바이오로직 소프트웨어) 소프트웨어 패키지를 이용하여 분석하였다. 데이터는 단순한 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델에 전체적으로 적합하였다.

표 8은 본 발명의 단일쇄 항-P-카드헤린 항체에 대한 결합 친화도를 열거한 것이다.

실시예 7: P- 카드헤린 항체의 선택도 측정

하기의 프로토콜을 이용하여 E-카드헤린과 비교하여 P-카드헤린에 대한 다양한 항체의 선택도를 측정하였다.

재조합 인간 P-카드헤린(R&D 시스템즈 861-PC-100) 및 재조합 인간 E-카드헤린(R&D 시스템즈 648-EC-100)을 PBS + 0.5 mM CaCl₂ 중 1 μg/ml에서 엑시콘(Exoqon) 단백질 고정화 플레이트(VWR 인터내셔날)의 웰 상에 코팅하였다. 샘플 IgG를 3% 마벨(Marvel)/PBS + 0.5 mM CaCl₂ 중에서 1 시간동안 차단한 후 50 nM(7.5 μg/ml)로부터 0.64 nM(0.096 μg/ml)로 적정하고, 2개의 상이한 항원으로 코팅된 웰에 이중으로 가하였다. 4 ℃에서 밤새 평형화한 후, 플레이트를 1 x PBS/0.1% 트윈(Tween) + 0.5 mM CaCl₂로 3회 세척한 후 1 x PBS + 0.5 mM CaCl₂로 3회 세척하였다. 이어서, 3% 마벨/PBS + 0.5 mM CaCl₂에 1:5000으로 희석된 50 μl의 항-인간 Fab 퍼옥시다제 결합체를 각 웰에 가하고 실온에서 1 시간동안 평형화시켰다. 플레이트를 1 x PBS/0.1% 트윈 + 0.5 mM CaCl₂로 3회 및 1 x PBS + 0.5 mM CaCl₂로 3회 세척하였다. 50 μl의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB; 시그마)을 각 웰에 가하고 20 분간 반응을 진행시킨 후 25 μl/웰의 0.5M H₂SO₄를 가하여 중단시켰다. 450 nm에서 흡광도 값을 읽은 후에, 그래퍼드 프리즘(Graphpad Prism) 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하여 P-카드헤린 및 E-카드헤린에 대한 결합에 대해 각 항체의 상대 K_D 값을 계산하였다. 수득된 데이터를 표 9에 요약하였다.

실시예 8: 에피토프 경쟁 분석

하기의 프로토콜을 이용하여, A431 세포 표면상에서 천연 P-카드헤린으로부터 모 IgG를 치환시키는 모 계통내 변이 scFv의 능력을 측정하기 위한 에피토프 경쟁 분석에서 IC₅₀ 값을 측정하였다. 억제성 scFv의 존재하에 결합된 비오티닐화 모 IgG의 양은 유로퓸 스트렙타비딘 및 델피아(DELFIA) 정량화로 검출한다. 여러 scFv에 대해 측정된 IC₅₀ 값은 표 10에 나타내었다.

표준 방법에 따라 배양한 후 약 80% 포화율에서 수확한 A431 세포(ECACC No. 8509042)를 사용전날 96웰 벡톤 디킨슨(Beckton Dickenson)(BD Cat. 6407) 콜라겐 코팅된 플레이트에 웰 당 2.5 x 10⁴ 세포로 접종하였다. 이어서, 플레이트를 PBS 완충액(깁코 Cat. 14190-094, 중탄산 칼슘, 마그네슘 및 나트륨 비함유) 수용기에 침지시켜 3회 세척한 후, 200 μl/웰의 차단 완충액[PBS 깁코 Cat. 14190-094 + 3% 마벨(프레미어 인터내셔날 푸드 리미티드(Premier International Foods Ltd.))]을 가하고, 실온에서 2 시간동안 배양하였다. 그 다음, 플레이트를 상기와 같이 PBS로 3회 세척하였다.

고효율 검색 및 IC₅₀ 프로파일링 둘 다에 있어, scFv/IgG 물질을 먼저 그레이너 희석 플레이트(그레이너 96 웰 폴리프로필렌 플레이트(그레이너 Cat. 780271))에서 60 μl의 분석 완충액의 총 부피로 제조하였다. 이어서, 50 μl를 슬레이브 그레이너 플레이트로부터 분석 플레이트 상으로 직접 옮기고, 결합 반응을 실온에서 2 시간 30 분간 진행시켰다. 결합 반응 종료시 플레이트를 PBS 중에서 3 회 세척한 후 유로퓸 표지된 스트렙타비딘[퍼킨 엘머(Perkin Elmer) Cat. 1244-360, 델피아 분석 완충액(퍼킨 엘머 Cat. 4002-0010)에 1:1000으로 희석]을 가하고 실온에서 1 시간동안 더 배양하였다.

그 다음, 완충액 수용기에 플레이트를 반복하여 침지시킴으로써 플레이트를 델피아 세척 완충액(퍼킨 엘머 Cat. 4010-0010)으로 7 회 세척하였다. 마지막으로, 델피아 증진인자(퍼킨 엘머 Cat. 4001-0010; 100 μl/웰)를 가한 후에, 상용가능한 판독기(예를 들면, 왈락(Wallac) 또는 엔비젼(Envision)) 상에서 표준 델피아 프로토콜을 사용하여 플레이트를 판독하였다.

그레이너 희석 플레이트 세트업 - HTS

고효율 검색(HTS) 조건은 최적화 단계에 따라 상이하게 구성되었다. 개별적인 V_H 및 V_L 쇄 최적화에서 얻어진 결과물의 HTS의 경우, 최종 [prei-prep]는 12.5%로 고정하여 모 scFv가 부분 억제를 받았다. V_H:V_L 재조합 라이브러리로부터의 결과물의 후속 HTS의 경우, 최종 peri-prep 농도는 1.7%로 감소되었으며, 이러한 조건하에서 V_H 최적화 기준 scFv(TOP-108-C01)는 부분 억제를 받았다. 적절한 기준 scFv가 부분 억제를 받도록 하는 peri-prep 농도의 최적화는 개선된 클론을 확인하기 위한 창을 제공하였다.

상기 최종 scFv peri-prep 농도를 달성하기 위해, 하기의 절차를 선택하였다:

i) 사이비웰(Cybiwell) 기기를 이용하여, 필요한 부피(하기 참조)의 peri-prep 샘플 물질을 딥 웰 샘플 플레이트로부터 컬럼 1 내지 11 중 글레이너 희석 플레이트로 옮겼다.

[최종 peri - prep ] 전달 부피

[12.5%] = 7.5 μl

[1.7%] = 10.0 μl(1:10 희석된 peri-prep)

(샘플 플레이트로부터 90 μl의 분석 완충액을 함유하는 그레이너 희석 플레이트로 10 μl의 순수한 peri-prep를 옮김으로써(사이비웰 사용) 1:10으로 미리 희석시킨 peri-prep를 준비하였다).

ii) 이어서, 컬럼 1 내지 11중의 부피를 적절한 부피의 분석 완충액을 가하여 30 μl로 보충하였다.

iii) 그 다음, 30 μl의 분석 완충액을 컬럼 12(A 내지 D)에 가하였다(총 결합 웰).

iv) 분석 완충액중 30 μl의 과잉 비표지 모 IgG(129-1c4)를 컬럼 12(E 내지 H)에 가하여 비-특이적 결합을 결정하였다. 이것을 1000 nM 농도로 가하여 500 nM 최종 농도를 수득하였다.

v) 129-1c4 IgG를 수불용성 시약 EZ-링크-NHS-LC-비오틴(퍼바이오/피어스 제품 번호 21336)을 사용하여 비오틴화하였다. 1/10 부피의 1 M NaHCO₃ 및 1/10 부피의 다이메틸폼아마이드를 가하여 IgG 용액을 보충하였다. EZ-링크-NHS-LC-비오틴 시약을 DMF에 용해시킨 다음 IgG에 비해 5배 몰 과량으로 가하고, 반응을 실온에서 20 분간 진행시켰다. 이어서, BSA(0.1%)를 첨가하여 비오틴화 IgG를 안정화시켰다. 그 다음, 분석 완충액중 30 μl의 비오틴화 모 129-1c4 IgG를 모든 웰에 가하여 최종 60 μl 부피중 1.5 nM의 최종 농도를 수득하였다(즉, 유로퓸 표지된 IgG를 2배의 최종 농도로 첨가하였다).

vi) 그레이너 플레이트의 내용물을 진탕시켜 혼합한 후, 50 μl를 분석 플레이트로 직접 옮기고, 결합 반응을 실온에서 2 시간 30 분동안 진행시켰다(전술한 바와 같이).

그레이너 희석 플레이트 세트업 - IC ₅₀ 프로파일링

i) 30 μl/웰의 분석 완충액을 표준 그레이너 희석 플레이트 중에서 컬럼 2 내지 11 및 웰 12A 내지 12D에 가하였다.

ii) 분석 완충액중 30 μl의 과잉 비표지 129-1c4 모 IgG를 컬럼 12(E 내지 H)에 가하여 비-특이적 결합을 결정하였다. 이것은 500 nM 최종 농도를 제공하기 위해 1000 nM 농도로 가해야 한다.

iii) 96웰 분석 플레이트 당 4개의 2중 11 포인트 IC₅₀ 적정물이 준비되도록 컬럼에 12 x 45 μl의 각각의 비희석 scFv His-prep를 가하였다. 이어서, 컬럼 1로부터 15 μl를 취하여 컬럼 2에 혼합한 다음 컬럼 2로부터 15 μl를 취하여 컬럼 3에 혼합하는 식으로 하여 1:3 이중 연속 희석을 수행하였다. 컬럼 11내에 혼합한 후에, 15 μl를 취하였다(즉, 30 μl의 최종 부피를 유지하였다).

iv) 이어서, 분석 완충액중 30 μl의 비오틴화 129-1c4 모 IgG를 모든 웰에 가하여 최종 60 μl 부피중 1.5 nM의 최종 농도를 수득하였다(즉, 유로퓸 표지된 IgG를 2배의 최종 농도로 첨가하였다).

v) 그레이너 플레이트의 내용물을 진탕시켜 혼합한 후, 50 μl를 분석 플레이트로 직접 옮기고, 전술한 바와 같이 결합 반응을 실온에서 2 시간 30 분동안 진행시켰다.

HTS의 경우, MOPS/EDTA/솔비톨, pH 7.4(MES pH 7.4)을 함유하는 기본 완충액중에서 세균 주변세포질(periplasm)(scFv peri-prep)으로부터의 조 추출물로서 scFv를 96 웰 포맷으로 발현시켰다. IC₅₀ 프로파일링의 경우, PBS의 기본 완충액중에서 친화도 정제(scFv His-prep)에 scFv His-표식을 이용하여 저효율 정제된 형태로 scFv를 발현시켰다.

HTS 및 IC₅₀ 분석 둘 다에 대해, 원 데이터를 먼저 하기 식에 따라 결합율% 데이터로 전환시켰다:

결합율 % = [(값 - 비특이적 결합)/(전체 결합 - 비특이적 결합)] x 100

이어서, 표준 엑셀 주형을 사용하여 HTS 데이터를 더 분석하여 적절한 기준 scFv보다 더 큰 억제(보다 낮은 결합율%)를 제공하는 결과물을 확인하였다. IC₅₀ 분석의 경우, 결합율% 데이터를 프리즘 버전 4.0 곡선 적합화 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. scFv는 V_H 및 V_L CDR3 영역이 실시예 2에서 기술된 바와 같이 무작위 돌연변이된 129-1c4 모 IgG의 변이체이다. V_H CDR3 변이체 서열은 도 1에 서열번호: 91 내지 256에 나타내었다. V_L CDR3 변이체 서열은 도 1에 서열번호: 257 내지 319로 나타내었다. 모 129-Ic4 IgG에 비해 개선된 결합을 나타낸 여러 scFv에 대한 IC₅₀ 값을 표 10에 나타내었다. 129-1c4 모체의 scFv 변이체 각각은 두 서열번호: V_H CDR3 및 V_L CDR3로 동정하였다. 참고로, 모 129-1c4 IgG의 IC₅₀은 108.3 nM이었다.

본 명세서에 인용된 모든 출판물, 특허 및 특허출원은 각각의 개개 출판물 또는 특허 출원이 참고로 인용되는 것으로 특별히 개별적으로 지적된 바와 같이 본원에 참고로 인용된다. 전술한 본 발명을 명확한 이해를 위해 예시 및 실시예로서 보다 상세히 기술하였지만, 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면 본 발명의 교지내용에 비추어 첨부된 청구의 범위의 진의 또는 범위로부터 벗어나지 않고 특정한 변화 및 수정이 이루어질 수 있음이 쉽게 명백할 것이다.

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Ala Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Ser Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Thr Met Gly 85 90 95 Ser Thr Phe Met Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 329 <211> 111 <212> PRT <213> human <400> 329 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Ser Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Thr Met Gly 85 90 95 Ser Thr Phe Met Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 330 <211> 111 <212> PRT <213> human <400> 330 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Ser Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Arg Ala Gly 85 90 95 Ser Thr Phe Met Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 331 <211> 111 <212> PRT <213> human <400> 331 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Ser Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe Thr Ser Gly 85 90 95 Leu Pro Trp Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 332 <211> 351 <212> DNA <213> human <400> 332 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaatgggga 300 gacgggacct tgaacccgtg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcctc a 351 <210> 333 <211> 351 <212> DNA <213> human <400> 333 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaacgaac 300 tccgccaagt tcgacccctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcctc a 351 <210> 334 <211> 351 <212> DNA <213> human <400> 334 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaaacgag 300 aggccgtcgt tcgacccctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcctc a 351 <210> 335 <211> 351 <212> DNA <213> human <400> 335 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaatgggga 300 gacgggacct tgaacccgtg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcctc a 351 <210> 336 <211> 351 <212> DNA <213> human <400> 336 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaacgggg 300 tacccctcct tcgacccctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcctc a 351 <210> 337 <211> 351 <212> DNA <213> human <400> 337 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaatgggga 300 acggggacct tgtggccctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcctc a 351 <210> 338 <211> 333 <212> DNA <213> human <400> 338 cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagtaa tgacgttggt gcttataatt atgtctcctg gtaccaacaa 120 cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tctgaggtca ataaacggcc ctcaggggtt 180 tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ctctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcattta caagcgggct cccctgggtc 300 gtcttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333 <210> 339 <211> 333 <212> DNA <213> human <400> 339 cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagtaa tgacgttggt gcttataatt atgtctcctg gtaccaacaa 120 cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tctgaggtca ataaacggcc ctcaggggtt 180 tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ctctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc agcagctaca cgatggggag cacttttatg 300 ctattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333 <210> 340 <211> 333 <212> DNA <213> human <400> 340 cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagtaa tgacgttggt gcttataatt atgtctcctg gtaccaacaa 120 cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tctgaggtca ataaacggcc ctcaggggtt 180 tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ctctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc acctcgtaca ccatgggcag cacttttatg 300 ctattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333 <210> 341 <211> 333 <212> DNA <213> human <400> 341 cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagtaa tgacgttggt gcttataatt atgtctcctg gtaccaacaa 120 cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tctgaggtca ataaacggcc ctcaggggtt 180 tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ctctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc acctcgtaca ccatgggcag cacttttatg 300 ctattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333 <210> 342 <211> 333 <212> DNA <213> human <400> 342 cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagtaa tgacgttggt gcttataatt atgtctcctg gtaccaacaa 120 cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tctgaggtca ataaacggcc ctcaggggtt 180 tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ctctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc acctcgtaca ccatgggcag cacttttatg 300 ctattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333 <210> 343 <211> 333 <212> DNA <213> human <400> 343 cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagtaa tgacgttggt gcttataatt atgtctcctg gtaccaacaa 120 cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tctgaggtca ataaacggcc ctcaggggtt 180 tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ctctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcattta caagcgggtt gccgtgggtg 300 ctcttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333 <210> 344 <211> 330 <212> PRT <213> human <400> 344 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 345 <211> 106 <212> PRT <213> human <400> 345 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 346 <211> 19 <212> PRT <213> human <400> 346 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 347 <211> 20 <212> PRT <213> human <400> 347 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Asp Ala Arg Cys 20

Claims (9)

1. (a) 서열번호: 24에 기재된 V_H CDR1; (b) 서열번호: 25에 기재된 V_H CDR2; (c) 서열번호: 27에 기재된 V_H CDR3; (d) 서열번호: 38에 기재된 V_L CDR1; (e) 서열번호: 39에 기재된 V_L CDR2; 및 (f) 서열번호: 41에 기재된 V_L CDR3를 포함하는, 인간 P-카드헤린에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
2. 제 1 항에 있어서,
   서열번호: 320에 기재된 V_H 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
3. 제 1 항에 있어서,
   서열번호: 326에 기재된 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
4. 제 1 항에 있어서,
   서열번호: 320에 기재된 V_H 영역 및 서열번호: 326에 기재된 V_L 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
5. 서열번호: 320에 기재된 V_H 영역 및 서열번호: 326에 기재된 V_L 영역을 포함하는, 단리된 항체.
6. 제 5 항에 있어서,
   중쇄 불변 영역이 서열번호: 344의 서열을 포함하고, 경쇄 불변 영역이 서열번호: 345의 서열을 포함하되, 서열번호: 344의 C-말단 라이신 잔기가 분리되거나 분리되지 않은 항체.
7. g-194-b09인, P-카드헤린에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
8. 제 1 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 부분 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
9. 제 7 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 부분 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
   

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