KR20110111381A - 전 인플루엔자균의 측정방법 - Google Patents

전 인플루엔자균의 측정방법 Download PDF

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유이치 이시카와
아유미 사토
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오츠카 세이야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

모든 인플루엔자균을 동시에 고감도로 측정할 수 있는 면역학적 측정방법을 제공한다. 인플루엔자균의 P4 항원 또는 P6 항원인식 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 전 인플루엔자균의 면역학적 측정방법을 제공한다.

Description

전 인플루엔자균의 측정방법{METHOD FOR ASSAYING ALL TYPES OF INFLUENZA VIRUSES}
본 발명은 인플루엔자균 전반을 특이적으로 측정하는 방법 및 상기 방법에 이용하는 측정장치에 관한 것이다.
인플루엔자균(Haemophilus influenzae)은 폐렴 구균과 같이 사람 비인강(human nasohparynx)의 상재균(indigenous bacterium)으로서 알려져 있고, 상재화에 이르지 않은 특히 영유아, 소아에 있어서는 기도 감염증, 중이염, 수막염, 패혈증 등의 원인균이 된다는 것이 알려져 있다. 다른 감염증의 원인균과 마찬가지로 인플루엔자균에 있어서도 항균약의 다용에 의한 약제 내성화가 증상의 난치성화, 중증화를 초래하는 원인으로서 문제가 되어 왔고, 치료 개시시의 적절한 항균약 선택의 중요성이 더해지고 있다. 감염증 치료의 원칙으로서 가능한 한 원인균을 조기에 확정하고, 적확한 치료약을 선택하는 것이 예후의 개선, 의료비용의 절감, 내성균 발현 방지에 관하여 중요하기 때문에, 인플루엔자균 유래 공통 항원을 신속히 검출하는 진단 시약이 요구된다.
현재, 인플루엔자균 판정방법으로서 그램 염색법(Gram staining), 검경(microsopic examination), 배양법, 균체의 효소 대사를 이용한 정색반응(color reaction), 라텍스 응집법, PCR법 등이 사용되고 있다. 이 중에서 신속 진단 방법으로서 라텍스 응집법을 이용한 인플루엔자균 항원 검출 키트(Slidex Meningite-Kit 5. bioMerieux사)가 있으나, 이것은 b형 인플루엔자균의 다당체 항원을 검출하는 것이고, 무협막형(non-encapsulated)의 판정에는 사용할 수가 없다. 또 PCR법에 의한 인플루엔자균 유전자 검출 측정법이나 균주 공통 항원의 P6나 P4 항원을 표적으로 한 그들의 유전자 검출 측정법도 있으나, PCR법에 의한 유전자 진단 측정법은 실시 시설이 한정되는 경우도 있어서 현재로서는 일반성이 부족하다. 또 P6 항원의 단일 클론 항체에 관한 보고가 있고, 웨스턴블로팅에 의해 인플루엔자균을 검출하고 있다(비특허문헌 1). 그러나, 이 방법에 의한 감도는 낮고, 임상검사로서 이용될 레벨은 아니다.
인플루엔자균은 그램 음성 간균(Gram-negative bacillus)으로, 균을 감싸는 협막의 유무로부터 협막형과 무협막형으로 크게 구분되고, 또한 협막형에는 협막에 존재하는 다당 항원의 구조의 차이에 기인하는 혈청형별 분류로서 a~f형이 존재하고, 또 무협막형은 형별 불능인 형으로서 분류된다. b형 협막다당인 폴리리보실리비톨포스페이트는 b형 특이적 항원으로서 보고되지만, 무협막형에서는 이와 같은 특이 항원으로서의 다당은 알려지지 않았다. 또, 무협막형의 단백질 항원으로서 균체 외막 단백질 중 하나인 P2 단백질이 인플루엔자균의 주요 항원으로서 알려져 있으나, 본 항원은 변이가 다발하므로, 균주에 의해 항원성이 다르다는 것이 알려져 있다.
Journal of Clinical Microbiology.(1989)2263-2267
상기한 바와 같이 인플루엔자균의 공통 항원은 발견되지 않았고, 전(全) 인플루엔자균을 동시에 검출할 수가 있는 면역학적 방법은 없었다.
본 발명은 상기 문제를 해결하는 것을 과제로 하는 것으로, 모든 인플루엔자균을 동시에 고감도로 측정할 수 있는 면역학적 측정방법 및 해당 방법을 이용한 측정장치를 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의노력을 거듭한 결과, 종래 인플루엔자균에 공통으로 존재하여 비교적 변이가 적다고 하는 P4 및 P6 단백질에 주목하였다. 상기 단백질은 인플루엔자균에는 타항원에 비하여 발현량이 적고, 따라서 인식 항체를 제작하여도 고감도로 게다가 모든 타입의 인플루엔자균을 전반적으로 측정하는 것은 어렵다고 생각되고 있었다. 또, P4 및 P6 단백질에 호몰로지가 높은 단백질을 가지는 세균은 다수 존재하기 때문에, 인플루엔자균을 특이적으로 검출하는 것은 어렵다고 생각되고 있었다. 그러나, 예상과 반대로, 본 발명자는 고도 선택적으로 인식하는 항체를 제작할 수가 있었다. 또, 해당 항체는 측정시에 용이하게 혼입할 가능성이 있는 녹농균, 대장균 등의 영향을 받기 어렵다는 것이 판명되었다. 본 발명은 본 성과를 바탕으로 완성된 것이다.
즉, 본 발명은 인플루엔자균의 P4 항원 또는 P6 항원인식 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 전 인플루엔자균의 면역학적 측정방법을 제공하는 것이다.
또 본 발명은 인플루엔자균의 P4 항원 또는 P6 항원인식 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는 전 인플루엔자균의 면역학적 측정장치를 제공하는 것이다.
본 발명에 의한, 모든 인플루엔자균을 대상으로 한 고감도 측정방법의 확립에 의해 상기 측정장치의 제공이 가능하게 되고, 이에 의해 중이염 등에 감염한 인플루엔자균 전반의 검출을 간편하고 신속하게 할 수 있게 되었다. 본 발명의 방법은 인플루엔자균에 의한 중이염의 검출에 특히 유용하다.
도 1은 ELISA에 있어서의 항P4PoAb(a) 및 항P6PoAb(b)의 면역원의 인플루엔자균 공통 항원(P6, P4)에 대한 반응성을 나타낸다.
도 2는 ELISA에 있어서의 항P6PoAb의 NTHiP6(a) 및 NTHi 파쇄균체(b)에 대한 반응성을 나타낸다.
도 3은 ELISA에 있어서의 항P6PoAb의 세균류(표 1)에 대한 반응성을 나타낸다.
도 4는 ELISA에 있어서의 항P4PoAb의 P4rec.(a) 및 NTHi 균체추출액(b)에 대한 반응성을 나타낸다.
도 5는 ELISA에 있어서의 항P4PoAb의 세균류(표 1)에 대한 반응성을 나타낸다.
도 6은 이뮤노크로마토의 일반적 구조를 나타낸다.
도 7은 이뮤노크로마토 스트립에 대한 검체의 전개상태를 나타낸다.
도 8은 이뮤노크로마토에 있어서의 항P6PoAb의 NTHiP6(a) 및 NTHi 파쇄항체에 대한 반응성을 나타낸다.
본 발명의 측정법의 대상이 되는 균은 인플루엔자균이고, 인플루엔자균은 협막형으로서 a~f형 및 무협막형의 전부가 측정 대상이다. 구체적으로는 P4 항원 및 P6 항원을 발현하고 있는 균이 대상이 된다. 또, 인플루엔자균 대상 질환으로서 영유아 및 소아에 있어서의 기도 감염증, 중이염, 수막염 및 패혈증 등이 고려되나, 이러한 질환의 경우, 환부에서 샘플을 채취하였을 경우, 다른 균이 혼입하여 측정계에 반응할 가능성이 고려된다. 그러나, 본 발명의 측정법에서는 P6 항원 및 P4 항원과 호몰로지를 가지는 단백질을 구성성분으로 하는 균, 예를 들면, 파라인플루엔자균, 녹농균, 대장균 등에 대해서는 전혀 반응하지 않는 것이 특징이다. 원래 항원에 대한 폴리클로날 항체를 조제하고, 측정계에 사용하였을 경우, 당연히 호몰로지를 가지는 항원 소유균에 대한 교차성이 생기는 것이 통상적이며, 또 P6 및 P4 항원의 경우도 이와 같이 타균과의 교차성이 생길 염려가 있었다. 또, 상기 항원은 모두 인플루엔자균에 있어서는 미량 성분이어서 폴리클로날 항체를 제작할 수가 있었다고 해도, 측정 감도라는 점에서 불리하다는 것도 일반적인 견해였다. 이상으로부터 상기 항원에 대한 폴리클로날 항체를 사용한 측정계의 보고는 없다. 그러나, 본 발명의 경우, 이들 폴리클로날 항체를 이용한 측정계는 예상과 반대로 상술한 샘플로의 혼입 가능성이 있는 파라인플루엔자균, 녹농균, 대장균 등과의 교차 반응성이 매우 낮고(도 3 참조), 예상 이상으로 고감도로 인플루엔자균 전반을 측정할 수가 있다.
본 발명에서 사용하는 인플루엔자균의 P4 항원 또는 P6 항원을 인식하는 항체는 P4 항원 또는 P6 항원을 동물에게 면역하고, 그 동물의 항혈청 또는 알 등을 취득함으로써 제조할 수가 있다.
면역에 이용되는 P4 항원 또는 P6 항원은 인플루엔자균으로부터 채취하여도 좋고, 재조합법에 의해 제조하는 것도 가능하다. 이 중, 측정 감도의 점에서 인플루엔자균으로부터 추출한 항원을 사용하는 것이 바람직하다. 여기에서 P4 항원 또는 P6 항원으로는 P4 단백질 또는 P6 단백질이어도 좋고, P4 항원 또는 P6 항원 중 일부의 폴리펩티드도 좋다.
또, P4 항원 및 P6 항원 중 P6 항원을 사용하는 것이 인플루엔자균에 대한 특이성 및 감도의 점에서 바람직하다.
P6 항원에 관한 뉴클레오티드 서열 및 그것이 암호화하고 있는 아미노산 서열을 서열번호 1에 나타낸다(억세션M19391). P4 항원에 관한 뉴클레오티드 서열 및 그것이 암호화하고 있는 아미노산 서열을 서열번호 2에 나타낸다(억세션M68502).
이하의 설명에 대해서는 P6 항원에 기초하여 설명하겠으나, P4 항원의 경우도 마찬가지로 하여 실시할 수가 있다.
P6 및 P4 항원의 재조합체의 제작
P6 항원에 기초하여 설명한다. P6 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 서열정보에 기초하여 화학적 DNA 합성법에 의해 제조, 취득할 수가 있으나, 일반적 유전자 공학적 수법에 의해 용이하게 제조·취득할 수가 있다[Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press(1989);속(續) 생화학 실험강좌 「유전자 연구법I, II, III」, 일본생화학회편(1986) 등 참조].
화학적 DNA 합성법으로는 포스포아미다이트법에 의한 고상 합성법을 예시할 수가 있다. 이 합성법에는 자동 합성기를 이용할 수가 있다.
또, 일반적 유전자 공학적 수법으로는 구체적으로 P6 폴리뉴클레오티드가 발현되는 적당한 기원으로부터 통상의 방법에 따라 cDNA 라이브러리를 조제하고, 상기 라이브러리로부터 P6 폴리뉴클레오티드에 특유의 적당한 프로브나 항체를 사용하여 원하는 클론을 선택함으로써 실시할 수가 있다[Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613(1981);Science 122, 778(1983) 등].
여기에서 cDNA의 기원으로는 P6 폴리뉴클레오티드를 발현하는 미생물이라면 특별히 제한되지 않으나, 구체적으로는 H.influenzae를 적합하게 사용할 수가 있다.
또, 이들로부터의 전(全) RNA의 분리, mRNA의 분리나 정제, cDNA의 취득과 그의 클로닝 등은 모두 통상의 방법에 따라 실시할 수가 있다. 또, P6 폴리뉴클레오티드를 cDNA 라이브러리로부터 스크리닝하는 방법도 특별히 제한되지 않고, 통상의 방법에 따를 수가 있다. 구체적으로는, 예를 들면, cDNA에 의해 생산되는 폴리펩티드에 대하여, 상기 폴리펩티드 특이 항체를 사용한 면역적 스크리닝에 의해 대응하는 cDNA 클론을 선택하는 방법, 목적의 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 결합하는 프로브를 사용한 플라크하이브리다이제이션, 콜로니하이브리다이제이션 등이나 이들 조합 등을 예시할 수가 있다.
여기에서 사용되는 프로브로는 P6 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 관한 정보를 기초로 하여 화학합성된 DNA 등을 일반적으로 예시할 수가 있다. 또, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 염기서열 정보에 기초하여 설정한 센스 프라이머 및/또는 안티센스 프라이머를 스크리닝용 프로브로서 사용할 수도 있다.
P6 폴리뉴클레오티드의 취득시에는 PCR법[Science130, 1350(1985)] 또는 그 변법(modification)에 의한 DNA 혹은 RNA 증폭법을 적합하게 이용할 수가 있다. 특히, 라이브러리로부터 전장(full-length)의 cDNA가 얻어지기 어려울 것 같은 경우에는 RACE법[Rapid amplification of cDNA ends; 실험의학, 12(6), 35(1994)], 특히 5'-RACE법[M.A. Frohman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998(1988)] 등의 채용이 적합하다.
이와 같은 PCR법의 채용시에 사용되는 프라이머는 P6 폴리뉴클레오티드의 서열정보에 기초하여 적의설정할 수가 있고, 이것은 통상의 방법에 따라 합성할 수가 있다. 또한, 증폭시킨 DNA 혹은 RNA 단편의 단리정제는 상기한 바와 같이 통상의 방법에 따를 수가 있고, 예를 들면, 겔 전기 영동법, 하이브리다이제이션법 등에 따를 수가 있다.
P6 폴리뉴클레오티드에 의하면, 통상의 유전자 공학적 수법을 사용함으로써 상기 폴리뉴클레오티드의 산물(즉, 상기 폴리펩티드)을 용이하게 대량으로, 안정하게 제조할 수가 있다.
발현벡터
발현벡터는 P6 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있고, 또한 상기 P6 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않고, 일반적으로 숙주세포와의 관계로부터 적의선택된다.
숙주세포로서 원핵생물의 세포를 사용할 경우, 발현벡터로는 예를 들면, 상기 숙주세포 중에서 복제 가능한 플라스미드 벡터이고, 이 벡터 중에 상기 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있도록 상기 폴리뉴클레오티드의 상류에 프로모터 및 SD(샤인 앤드 달가르노) 염기서열을 부여한 발현 플라스미드를 예로 들 수가 있다. 구체적으로는, PL 프로모터, T7 프로모터 및 lac 프로모터를 이용한 발현 플라스미드를 예로 들 수가 있다. 다른 바람직한 세균 발현벡터로는 tac 프로모터 또는 trc 프로모터를 사용한 플라스미드 pKK233-2 및 pKK233-3 등을 예로 들 수가 있다. 단, 이들에 한정되지 않고, 공지의 각종 균주 및 벡터도 이용할 수가 있다.
또, 숙주세포로서 척추동물 세포를 사용하는 경우, 발현벡터로는 통상 발현하려고 하는 상기 폴리뉴클레오티드의 상류에 위치하는 프로모터, RNA의 스플라이스(splice) 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종료 서열 등을 보유하는 것을 사용할 수가 있고, 이것은 필요에 의해 복제 기점을 더 가지고 있어도 좋다. 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입하는데 유용한 진핵 생물 벡터는 잘 알려져 있다. 예를 들면, 적당한 진핵 생물 벡터로는 pCD 및 pCMV를 예시할 수가 있다. 또, 이들 외에는 필요에 따라서 MMTV 또는 SV40 후기 프로모터를 이용한 pMSG 및 pSVL을 예로 들 수가 있다.
재조합 세포
P6 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터에 의해 형질 전환시키면 재조합 세포(형질전환체)가 얻어진다.
재조합 세포에 사용되는 숙주세포로는 원핵세포 및 진핵세포 중 어느 하나를 사용하여도 좋다.
숙주세포로서 사용되는 원핵세포로는 유전자 재조합에서 잘 사용되는 세균을 사용할 수가 있고, 대장균, 스트렙토미세스, 고초균(Bacillus subtilis), 스트렙토코쿠스, 스타필로코쿠스 등을 예시할 수가 있다. 특히, 대장균, 고초균 등을 적합한 예로서 들 수가 있다.
숙주세포로서 사용되는 진핵세포로는 효모, 아스페르길루스 등의 진핵미생물; 드로소필라 S2, 스포돕테라 Sf9 등의 곤충세포; L세포, CHO세포, COS세포, HeLa세포, C127세포, BALB/c3T3세포(디히드로엽산리덕타아제나 티미딘키나아제 등이 결손된 변이주를 포함한다), BHK21세포, HEK293세포, Bowes 멜라노마세포, 난모세포 등의 동식물 세포 등을 예시할 수가 있다.
또, 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하는 방법은 특별히 제한되지 않고, 일반적인 각종 방법을 채용할 수가 있다. 예를 들면, 상기 발현벡터의 숙주세포에의 도입은 Davis 등(BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986) 및 Sambrook 등(MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) 등의 많은 표준적인 실험실 메뉴얼에 기재되는 방법에 따라 실시할 수가 있고, 그 구체적 수법으로는 인산칼슘트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 트랜스벡션(transvection), 마이크로인젝션, 양이온성 지질 매개 트랜스펙션, 일렉트로포레이션, 형질도입, 스크레이프로딩(scrape loading), 탄환 도입(ballistic introduction), 감염 등을 예로 들 수가 있다.
재조합 세포를 이용한 P6 항원 펩티드의 제조
P6 폴리뉴클레오티드가 도입된 재조합 세포를 배양하고, 세포 및 또는 배양물로부터 P6 폴리펩티드를 회수함으로써 P6 폴리펩티드를 제조할 수가 있다.
배양은 숙주에게 적합한 배지를 사용하여 계대배양 또는 배치배양(batch culture)을 실시하면 좋다. 배양은 재조합 세포의 내외에 생산된 P6 폴리펩티드 양을 지표로 하여 P6 폴리펩티드가 적당량 얻어질 때까지 실시하면 좋다.
상기 배양에 사용되는 배지로는 채용한 숙주세포에 따라 관용되는 각종의 것을 적의 선택이용할 수 있고, 배양도 숙주세포의 생육에 적합한 조건 하에서 실시할 수가 있다.
또, 이렇게 하여 얻어지는 P6 폴리펩티드는 소망에 의해 그 물리적 성질, 화학적 성질 등을 이용한 각종의 분리조작[「생화학 데이터 북 II」, 1175-1259페이지, 제1판 제1쇄, 1980년 6월 23일 주식회사 토쿄화학동인(Tokyo Kagaku Dojin) 발행; Biochemistry, 25(25), 8274(1986); Eur. J. Biochem., 163, 313(1987) 등 참조]에 의해 분리, 정제할 수가 있다. 구체적으로는 하기 「항원의 추출 및 단리」의 란에서 기재된 목적 단백질을 단리정제하는 방법과 마찬가지의 방법이 예시된다.
P6 항원 펩티드의 추출 및 단리법
이하, P6 폴리펩티드 생산능을 가지는 미생물로부터 P6 펩티드를 단리정제 하는 방법에 대하여 설명한다. 먼저, P6 폴리펩티드 생산능을 가지는 미생물의 균체를 파쇄하고, 상기 미생물의 조추출물을 얻는다. 여기에서 균체의 파쇄에는 프렌치 프레스(French press), 셀밀(cell mill) 등의 파쇄기에 의한 처리; 저장(低張)용액 하 초음파 처리 등의 통상의 균체 파쇄 처리에 사용되고 있는 방법이 사용된다. 또, 얻어진 조추출물에는 적당한 완충액을 첨가해 두어도 좋다.
얻어진 조추출물에 대해서는 그 정제도를 올리기 위해서, 또한 황산암모늄 침전, 에탄올 등을 이용한 유기용매 침전 또는 등전점 침전 등의 정제처리에 제공하여도 좋다. 다음으로, 조추출물을 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피(hydrophobic chromatography), 각종 어피니티 크로마토그래피, 역층 크로마토그래피(reverse-phase chromatography), 하이드록시 애퍼타이트 칼럼 크로마토그래피 등의 처리에 제공함으로써, P6 폴리펩티드를 포함하는 분획을 얻을 수가 있다. 또한, 이들 크로마토그래피에 의한 처리는 필요에 따라서 오픈칼럼을 사용하여도 좋고, 또 HPLC를 사용하여도 좋다. 또, 이와 같이 하여 얻어진 P6 폴리펩티드를 포함하는 분획의 순도에 대하여는 전기영동, 특히 SDS-PAGE에 의해 가시적으로 간편하게 추정할 수가 있다. 또, P6 폴리펩티드는 아미노산 서열 분석법; MALDI-TOF MS, ESI Q-TOF MS 또는 MALDI Q-TOF MS 등의 질량 분석 장치를 이용한 질량분석법; 펩티드 매스 핑거프린팅법 등에 의해 확인할 수도 있다.
항체의 취득
측정에 이용하는 P6 항원 펩티드 또는 P6 항원 펩티드 인식 항체의 취득에 관하여는 통상의 방법에 따라 취득할 수가 있다. 폴리클로날 항체를 사용하는 것이 바람직하다.
폴리클로날 항체를 제작하는 경우는 토끼, 양, 모르모트, 닭과 같은 온혈동물에 상기 목적 항원을 통상 프로인트의 완전 아쥬반트(Complete Freund's adjuvant)와 혼화하여 조제한 유화물을 수회 면역하고, 얻어진 항혈청을 통상의 방법에 따라 취득하는 것이 가능하다. 또, 닭의 경우에는 상기 면역 항원을 수회 면역하여 상기 닭이 산란하는 계란에 IgY를 생산시키고, 그리고 상기 계란의 노른자로부터 통상의 방법에 따라 IgY를 취득할 수가 있다.
측정계의 구축
본 발명 인플루엔자균의 측정방법은 P6 항원 또는 P4 항원을 인식하는 폴리클로날 항체를 이용하는 것이 바람직하다. 피검시료는 인플루엔자균 혹은 해당 균의 추출물이어도 좋다. 이 중 P6 항원을 인식하는 폴리클로날 항체를 이용하는 것이 특히 바람직하다.
본 면역학적 수법을 이용한 측정장치로는 ELISA 및 이뮤노크로마토 측정장치를 대표예로 들 수가 있다. 다른 예로서 라디오이뮤노어세이법(RIA) 등의 측정 대상물에 대한 항체를 이용한 수법을 적합한 예로 들 수가 있다.
ELISA 측정방법
예를 들면, 샌드위치법의 경우이면 통상 96홀 플레이트에 대하여 일차 항체(항P6폴리클로날 항체 또는 항P4폴리클로날 항체)를 플레이트에 고상화해 두고, 생체 유래 시료(혈액, 혈청, 혈장 혹은 다른 체액 성분 특히 이루(ear fluid) 등의 중이 침출액이나 인두 스왑(pharyngeal swab), 뇨) 혹은 필요에 따라서 적당한 완충액에 희석한 것을 첨가하여 일정시간 항체와 접촉시킴으로써 결합시킨다. 그 후, 적당한 완충액으로 세정한 후, 표지 2차 항체(표지 항P6항체 또는 표지 P4항체)를 반응시킨다. 예를 들면, 표지체가 비오틴이면 아비딘(혹은 스트렙트아비딘) 표지 페록시다아제를 반응시키고, 적당한 반응 기질(예를 들면, TBM)을 작용시킴으로써 발색시킨다. 일정시간 후, 소정의 파장, 이 경우는 450nm에서 측정함으로써, 비색 정량을 실시한다. 아비딘 표지항체에 페록시다아제(HRP)나 알칼리포스파타아제, 산포스파타아제(acid phosphatase), 글루코스옥시다아제 및 티로시나아제 표지 등이 고려될 수 있다. 기질로는 시판에서 일반적으로 사용되고 있는 것이면 특별히 제한은 없다.
표지항체로는 비오틴 표지항체, 이에 대하여 아비딘 또는 스트렙트아비딘, 혹은 2차 항체에 페록시다아제(HRP)나 알칼리포스파타아제, 산포스파타아제, 글루코스옥시다아제 및 티로시나아제 표지 등을 예로 들 수 있다. 기질로는 시판에서 일반적으로 사용되고 있는 것이면 특별히 제한은 없다.
이뮤노크로마토 측정장치
이뮤노크로마토의 구조는 도 6에 나타낸 일반적 수법에 따를 수가 있다. 간략하게는 플라스틱 대지(plastic sheet) 상의 편측말단에 부착된 샘플어플라이 부분(샘플 패드), 또 금 콜로이드 표지 항P6PoAb를 건조유지시킨 부분(골드 패드), 니트로셀룰로오스 부분 및 과잉인 샘플을 흡수하는 부분(흡수 패드)으로부터 구성된다. 샘플 패드 및 흡수 패드에는 유리 섬유 여과지나 셀룰로오스제 또는 코튼제, 그리고 그들의 혼합체의 여과지가 바람직하고, 니트로셀룰로오스는 포아사이즈(pore size) 1.0~20μm(바람직하게는 5.0~10.0μm)가 바람직하다. 또한, 금 콜로이드 표지 항P6PoAb를 용액 상태로 사용하는 경우에는 골드 패드는 필요로 하지 않는다.
니트로셀룰로오스 상의 테스트 라인 상에는 상기의 P6PoAb를 0.1~10mg/ml의 농도(바람직하게는 0.2~5mg/mL)의 농도로 도포한다. 콘트롤 라인 상에는 항토끼 IgG 활성을 가지는 염소나 마우스의 IgG 등을 0.1~10mg/mL의 농도로 도포한다. 건조한 후, 단백질이나 고분자 등으로 블로킹한다. 블로킹 조작에는 BSA, 카세인, 젤라틴 등의 단백질이나, 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 고분자가 사용 가능하다. 한편, 금 콜로이드로는 20~150nm의 사이즈(바람직하게는 30~100nm)가 바람직하고, 항체의 표지에는 흡착 혹은 다른 단백질 등을 통한 공유결합이 고려될 수 있다. 그리고, 착색 Latex 입자나 다른 귀금속 콜로이드도 금 콜로이드 대신에 사용할 수 있다고 생각된다. 금 콜로이드의 블로킹은 니트로셀룰로오스와 마찬가지로 BSA, 카세인, 젤라틴 등의 단백질이나, PVA, PVP, PEG 등의 고분자가 사용 가능하다. 이와 같이 하여 조립한 테스트 스트립을 플라스틱 케이스 내에 넣어서 사용하면 좋다.
진단 키트
피검시료 중의 P4 항원량 혹은 P6 항원량을 측정함으로써 중이염 환자 등에 있어서의 인플루엔자균 감염의 유무를 측정할 수가 있다. 즉, ELISA 키트 또는 이뮤노크로마토법을 위한 각종 시약을 포함한 키트 조성물을 제공할 수가 있다. 특히, 키트 중에는 P4 항원 혹은 P6 항원에 대한 항체를 포함한다. 키트에는 그 외에 BSA 등의 알부민, 2차 항체, 효소의 기질(표지로서 효소를 사용하였을 경우) 등이 포함된다. 예를 들면, 표지항체가 비오틴 표지항체이면, 상기 측정 키트에는 2차 항체로서 페록시다아제 표지 아비딘을 포함할 수 있다. 또, 상기 페록시다아제에 대한 기질 등을 포함하는 전 인플루엔자균 진단 키트를 제공할 수가 있다.
본 발명의 방법에 의하면, 여러 가지의 감염증에 있어서의 인플루엔자균을 특이적으로 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 양성으로 판단된 감염증의 병인균은 인플루엔자균이라고 판정할 수 있다. 본 발명의 대상 질환으로는 영유아 및 소아에 있어서의 기도 감염증, 중이염, 패혈증을 예로 들 수 있으나, 중이염에서는 파라인플루엔자균의 감염이 거의 없다(International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology(2003)67,43-51). 따라서, 본 발명 방법은 중이염에 있어서의 전 인플루엔자균의 측정에 특히 유용하다.
실시예
이하에 본 발명의 실시예를 나타낸다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
1. 항 P6 또는 P4 항체의 제작
P6 또는 P4 각 단백질을 균체로부터의 직접 추출 또는 대장균 리콤비넌트로서 제작하고, 토끼에 면역하여 폴리클로날 항체를 얻었다. 이어서, 얻어진 항체에 의해 ELISA계를 구축하여 평가하였다. 또한, 이뮤노크로마토계로 전화하여 신속한 진단의 가능성을 검토하였다.
1-1. 항원 제작
1-1-1. P6 항원의 조제
P6 항원은 인플루엔자균으로부터의 직접 추출 및 대장균 리콤비넌트 제작의 2법에 의해 실시하였다.
균체로부터의 추출
Kodama 등의 방법(Infection and Immunity, 68, 2294-2300(2000))에 따라 균체로부터 P6 항원을 추출하였다. 즉, 무협막형 인플루엔자균(NTHi(ATCC No.9333))을 바시트라신(bacitracin) 첨가 초콜릿 한천배지(BD사) 상에서 배양하고, 조취법(scraping)이나 원심법에 의해 침전물로서 회수하였다. 침전을 1% SDS/0.1M Tris/0.5M NaCl/0.1% 2-메르캅토에탄올(pH8.0)의 완충액에 현탁, 초음파 파쇄 후에 37℃, 30분 동안 가온하였다. 원심으로 얻어진 침전물을 10ug/mL RNase A(SIGMA사)를 첨가한 상기의 완충액으로 현탁, 초음파 파쇄하여 다시 37℃, 30분 동안 가온하였다. 이어서, 원심으로 침전물을 얻은 후에 RNase A 무첨가의 완충액으로 현탁, 초음파 파쇄, 가온의 일련의 조작을 2회 반복하였다. 원심 후의 침전물을 0.01M Tris/0.15M NaCl(pH7.4)의 완충액에 현탁하고, 초음파 파쇄 후, 65℃, 30분 동안 가온하였다. 원심에서 얻어진 상청을 원심형 한외여과에 의해 농축하고, 이것을 항원으로서 사용하였다.
대장균 리콤비넌트의 제작
인플루엔자균 b형(Hib)(ATCC No.10211)의 균체를 템플릿에 이용하여 direct PCR를 실시하여 시그널 서열이 결여된 P6유전자(mature form)를 증폭하였다. 포워드 프라이머에는 5'-GCGGGATCCTGTAGTTCCTCTAACAACGATGCT-3'(서열번호 3)를, 리버스 프라이머에는 5'-GCGGAGCTCGTACGCTAACACTGCACGACGGTT-3'(서열번호 4)를 사용하고, GeneAmpTM PCR System 9700(PE Applied Biosystems사)으로 TaKaRa rTaq(TaKaRa사)를 사용할 수 있었던 증폭 단편을 서브클로닝용 벡터 pCRTM 2.1(Invitrogen사)에 삽입하였다. 증폭한 P6 유전자(mature form)의 서열을 확인한 후, 이어서 BamHI, XhoI 사이트를 이용하여 잘라낸 단편을 발현벡터 pET21a(MERCK사)에 삽입하고, 리콤비넌트 P6 발현용 plasmid(P6-pET21a)를 제작하였다. 대장균 BL21에 형질도입한 후, 1mM IPTG, 37℃, 3시간의 조건 하에서 리콤비넌트 P6 항원의 발현을 유도하였다. 원심에 의한 집균 후, BugBusterTM Protein Extraction Reagent(MERCK사)로 용균하고, 원심 조작에 의해 가용성 분획을 회수하였다. 히스티딘 태그가 결합한 리콤비넌트 P6 항원은 평형화용 완충액(100mM Phosphate, 300mM NaCl, 50mM imidazole, pH7.8)에서 평형화 완료한 Ni컬럼(HisTrapTM HP; GE Healthcare사)에 결합시키고, 평형화용 완충액, 세정용 완충액(100mM Phosphate, 300mM NaCl, 50mM imidazole, pH6)으로 순차적으로 세정한 후, 용출용 완충액(100mM Phosphate, 300mM NaCl, 200mM imidazole, pH6)으로 용출하였다. 정제 후의 리콤비넌트 P6 항원은 D-PBS(-)로 4℃, 하룻밤 투석한 후에 원심형 한외여과에 의해 농축하였다.
1-1-2. P4 항원의 조제
P4 항원은 대장균 리콤비넌트만 제작하였다. 제작순서 등은 리콤비넌트 P6 항원과 거의 동일하나, 우선, 무협막형 인플루엔자균(NTHi)(ATCC No.9333)의 균체를 템플릿에 이용하여 direct PCR를 실시하여 시그널 서열이 결여된 p4 유전자(mature form)를 증폭하였다. 포워드 프라이머에는 5'-GCGGGATCCTGTGGTTCACACCAAATGAAATC-3'(서열번호 5)를, 리버스 프라이머에는 5'-GCGCTCGAGTTTACCATCCCAAGCTTGTACTG-3'(서열번호 6)를 사용하고, GeneAmpTM PCR System 9700으로 TaKaRa ExTaq(TaKaRa사)를 사용할 수 있었던 증폭 단편을 BamHI, XhoI에 의한 제한효소 처리 후, 이들 양 사이트를 이용하여 발현벡터 pET21a에 삽입하고, 리콤비넌트 P4 발현용 plasmid(P4m-pET21a)를 제작하였다. 대장균 BL21에 형질도입한 후, 1mM IPTG, 37℃, 3시간의 조건 하에서 리콤비넌트 P4 항원의 발현을 유도하였다. 원심에 의한 집균 후, BugBusterTM Protein Extraction Reagent로 용균하고, 원심 조작에 의해 가용성 분획을 회수하였다. 히스티딘 태그가 결합한 리콤비넌트 P4 항원은 평형화용 완충액에서 평형화 완료한 Ni컬럼에 결합시키고, 평형화용 완충액, 세정용 완충액으로 순차적으로 세정한 후, 용출용 완충액으로 용 출하였다. 정제 후의 리콤비넌트 P4 항원은 D-PBS(-)로 4℃, 하룻밤 투석한 후에 원심형 한외여과에 의해 농축하였다.
1-2. 항체 제작
얻어진 각 면역원을 토끼의 피하에 프로인트 등의 아쥬반트와 함께 면역하였다. 면역량은 100μg/body를 사용하고, 격주로 5~6회 정도의 면역을 실시하였다. 각 항원에 대하여 2개체씩 면역하고, 얻어진 전혈을 원심분리한 후, 항혈청으로서 동결보관하였다. 항혈청은 적당량을 해동한 후, Protein A를 사용한 어피니티 정제나 겔 여과에 의해 정제하고, 얻어진 항체를 폴리클로날 항체(PoAb)로서 사용하였다.
1-3. PoAb 의 반응성
상기 방법에 의해 제작한 각 PoAb의 역가(titer)는 이하의 ELISA법에 의해 평가하였다. 우선, 면역원인 리콤비넌트 P4 항원, 리콤비넌트 P6 항원 및 추출 P6 항원을 1μg/mL의 농도로 각각 ELISA 플레이트에 고상화한 후, 소혈청알부민(BSA) 등으로 블로킹하였다. 리콤비넌트 P4 항원 고상 플레이트에는 2개체로부터 정제한 항P4PoAb를, 또 리콤비넌트 P6 항원 및 추출 P6 항원 고상 플레이트에는 2종의 P6 항원으로부터 얻어진 합계 4종의 항P6PoAb를 각 1μg/mL의 농도로 반응시켰다. 세정한 후, 서양고추냉이 페록시다아제(horseradish peroxidase, HRP) 표지한 항토끼 IgG 항체(ZYMED사)를 반응시키고, 3,3', 5,5＇-테트라메틸벤지딘(TMB)으로 발색시켰다. 또한, 콘트롤 항원으로서 BSA 고상 플레이트를 사용하였다. 또한 얻어진 각 PoAb의 균체에 대한 반응성을 확인하기 위해서, NTHi를 계면활성제 또는 초음파 등에 의해 파쇄한 NTHi(ATCC No.9333)의 파쇄균체를 1μg/mL로 고상화한 플레이트를 사용하여 마찬가지로 ELISA를 실시하였다. 결과는 도 1의 a, b에 도시하였는데, 항P4, 항P6PoAb 모두 면역원뿐만 아니라, 파쇄균체에 대하여도 반응성을 가지기 때문에, 인플루엔자균 항원 검출 샌드위치 ELISA의 구축이 가능하다고 추측되었다.
2. P6 또는 P4 항원 검출용 ELISA 의 구축 및 성능 평가( ELISA 실시예 )
2-1. P6 항원 검출용 샌드위치 ELISA
항P6PoAb(항NTHi P6PoAb No.2)를 5μg/mL의 농도로 각각 ELISA 플레이트에 고상화한 후, BSA 등으로 블로킹하였다. 본 항체 고상 플레이트에 대하여 적절히 단계 희석한 면역원 또는 파쇄균체를 반응시켰다. 세정한 후, 고상한 항P6PoAb와 동일한 PoAb의 비오틴 표지체를 각각 반응시키고 다시 세정한 후, HRP 표지한 스트렙트 아비딘을 반응시키고 TMB로 발색시켰다. 용량 의존 곡선의 일례를 도 2의 a, b에 도시하였는데, 30pg/mL 이상의 P6 항원을 검출 가능하고, 또 NTHi(ATCC No.8149)의 파쇄균체에서는 103~107 CFU/mL의 검출이 가능하였다.
2-2. P6 항원 검출용 샌드위치 ELISA 의 교차 반응성
상기 샌드위치 ELISA에 의해, 표 1에 나타내는 각종 세균류에 대한 교차 반응성을 평가한 결과를 도 3에 도시하였는데, 목적한 바와 같이 협막형, 무협막형 둘 다 인플루엔자 균주 모두를 검출하였다.
Figure pct00001
2-3. P4 항원 검출용 샌드위치 ELISA
측정 순서 등은 상기 P6 항원 검출용 샌드위치 ELISA와 동일하나, 항P4PoAb(항P4rec.PoAb No.2)를 5μg/mL의 농도로 각각 ELISA 플레이트에 고상화한 후, BSA 등으로 블로킹하였다. 본 항체 고상 플레이트에 대하여 적절히 단계 희석한 면역원 또는 파쇄균체를 반응시켰다. 세정한 후, 고상한 항P4PoAb와 동일한 PoAb의 비오틴 표지체를 각각 반응시키고 다시 세정한 후, HRP 표지한 스트렙트아비딘을 반응시키고, TMB로 발색시켰다. 용량 의존 곡선의 일례를 도 4의 a, b에 도시하였는데, 100pg/mL 이상의 P4 항원이 검출 가능하고, 또 NTHi의 파쇄균체에서는 103~107 CFU/mL의 검출이 가능하였다.
2-4. P4 항원 검출용 샌드위치 ELISA 의 교차 반응성
샌드위치 ELISA에 의해, 표 1에 나타내는 각종 세균류에 대한 교차 반응성을 평가한 결과를 도 5에 도시하였는데, 목적한 바와 같이 협막형, 무협막형 둘 다 인플루엔자 균주 모두를 검출하였다.
이상의 결과로부터 어떤 항P6PoAb, 항P4PoAb에 있어서도 주로 인플루엔자균항원이 검출 가능한 샌드위치 ELISA의 측정계를 구축할 수 있었기 때문에, 이뮤노크로마토에 의한 측정계의 구축이 가능하다고 추측되었다.
3. P6 항원 검출용 이뮤노크로마토의 구축 및 성능 평가
3-1. 항 P6PoAb 를 사용한 샌드위치 이뮤노크로마토의 성능
상기 조작에 의해 제작한 금 콜로이드 표지 항P6PoAb를 계면활성제를 함유 하는 인산 완충액 등으로 희석한 후에 추출 P6 항원과 혼화하고, 도 7의 우측에 도시한 수법을 이용하여 항체 고상 테스트 스트립에 전개하였다. 상기 완충액으로 세정한 후, 나타난 각 테스트 라인의 신호 강도를 덴시토미터(densitometer)에 의해 해석하여 수치화하였다. 그 결과, 도 8의 a, b에 도시한 바와 같이, 면역원에서는 이번 측정 최소 농도 1ng/mL 이상으로 테스트 라인의 신호 강도의 검출이 가능하였다. 또 NTHi의 파쇄균체에서는 3×104 CFU/mL 이상에서 균체 농도 의존적인 테스트 라인의 신호 강도의 검출이 가능하였다. 이들 결과로부터 항P6PoAb에 의해 인플루엔자균 항원을 검출하는 이뮤노크로마토 측정계를 구축할 수가 있었다.
<110> OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> METHOD FOR ASSAYING ALL TYPES OF INFLUENZA VIRUSES <150> JP2009-001328 <151> 2009-01-07 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 867 <212> DNA <213> Haemophilus influenzae <220> <221> CDS <222> (68)..(526) <400> 1 cccaagtaaa atttccagct tggtctccat acttaactaa ataaaaaact catttaggag 60 aaatcta atg aac aaa ttt gtt aaa tca tta tta gtt gca ggt tct gta 109 Met Asn Lys Phe Val Lys Ser Leu Leu Val Ala Gly Ser Val 1 5 10 gct gca tta gcg gct tgt agt tcc tct aac aac gat gct gca ggc aat 157 Ala Ala Leu Ala Ala Cys Ser Ser Ser Asn Asn Asp Ala Ala Gly Asn 15 20 25 30 ggt gct gct caa act ttt ggc gga tac tct gtt gct gat ctt caa caa 205 Gly Ala Ala Gln Thr Phe Gly Gly Tyr Ser Val Ala Asp Leu Gln Gln 35 40 45 cgt tac aac acc gta tat ttt ggt ttt gat aaa tac gac atc acc ggt 253 Arg Tyr Asn Thr Val Tyr Phe Gly Phe Asp Lys Tyr Asp Ile Thr Gly 50 55 60 gaa tac gtt caa atc tta gat gcg cac gca gca tat tta aat gca acg 301 Glu Tyr Val Gln Ile Leu Asp Ala His Ala Ala 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Claims (6)

  1. 인플루엔자균의 P4 항원 또는 P6 항원인식 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 전(全) 인플루엔자균의 면역학적 측정방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    항체가 폴리클로날 항체인 것을 특징으로 하는 측정방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    측정계가 ELISA 또는 이뮤노크로마토인 것을 특징으로 하는 측정법.
  4. 인플루엔자균의 P4 항원 또는 P6 항원인식 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는 전 인플루엔자균의 면역학적 측정장치.
  5. 제 4항에 있어서,
    항체가 폴리클로날 항체인 것을 특징으로 하는 측정장치.
  6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서,
    측정계가 ELISA 또는 이뮤노크로마토인 것을 특징으로 하는 측정장치.
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