WO2010079739A1 - 全インフルエンザ菌の測定方法 - Google Patents

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haemophilus influenzae
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尚代 増田
優一 石川
亜友美 佐藤
田中　秀明
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大塚製薬株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for specifically measuring H. influenzae in general, and a measuring apparatus used for the method.
  • Haemophilus influenzae is known as a resident bacteria of the human nasopharynx, as well as pneumococci, and respiratory infections, otitis media, meningitis, septicemia, etc., especially in infants and children who have not become resident It is known to become a causative fungus. As with other infectious disease causative organisms, in Haemophilus influenzae, drug resistance due to heavy use of antibacterial agents has become a problem as a cause of intractable and severe symptoms, and appropriate antibacterial drugs at the start of treatment The importance of choice is increasing.
  • Non-patent Document 1 there is a report on a monoclonal antibody of P6 antigen, and Haemophilus influenzae is detected by Western blotting.
  • Non-patent Document 1 the sensitivity of this method is low and it is not at a level used as a clinical test.
  • Haemophilus influenzae is a Gram-negative gonococcus, roughly classified into the capsular type and the non-capsular type, depending on the presence or absence of the capsular coating, and the capsular type is due to the difference in the structure of the polysaccharide antigen present in the capsular There are af types as serotype classifications, and the non-capsular type is classified as an untypeable type.
  • Polyribosyl ribitol phosphate a b-type capsular polysaccharide, has been reported as a b-type specific antigen, but no polysaccharide as such a specific antigen is known in the non-capsular type.
  • P2 protein which is one of outer cell membrane proteins, is known as the main antigen of Haemophilus influenzae as a non-capsular protein antigen.
  • this antigen is frequently mutated, its antigenicity varies depending on the strain. It has been known.
  • the present inventors have focused on P4 and P6 proteins that are commonly present in Haemophilus influenzae and are said to have relatively few mutations.
  • the protein is expressed less in H. influenzae than other antigens, so it was considered that it was difficult to measure all types of H. influenzae in general with high sensitivity even if a recognition antibody was prepared.
  • the present inventor since there are many bacteria having proteins with high homology to P4 and P6 proteins, it has been considered difficult to specifically detect H. influenzae.
  • the present inventor was able to produce an antibody that recognizes highly selectively. Further, it has been found that the antibody is not easily affected by Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, etc., which can be easily mixed during measurement. The present invention has been completed based on this result.
  • the present invention provides a method for immunological measurement of all Haemophilus influenzae, characterized by using P4 antigen or P6 antigen recognizing antibody of Haemophilus influenzae.
  • the present invention also provides an apparatus for immunological measurement of all Haemophilus influenzae, which contains an antibody that recognizes P4 antigen or P6 antigen of Haemophilus influenzae.
  • the establishment of a high-sensitivity measurement method for all H. influenzae according to the present invention makes it possible to provide the measurement device, thereby enabling easy and rapid detection of H. influenzae infected with otitis media etc. became.
  • the method of the present invention is particularly useful for detecting otitis media caused by Haemophilus influenzae.
  • the reactivity of the immunogens of anti-P4PoAb (a) and anti-P6PoAb (b) to H. influenzae common antigens (P6, P4) in ELISA is shown.
  • the reactivity of anti-P6PoAb to NTHiP6 (a) and NTHi disrupted cells (b) in ELISA is shown.
  • the reactivity with anti-P6PoAb bacteria (Table 1) in ELISA is shown.
  • anti-P4PoAb P4rec The reactivity with respect to (a) and NTHi microbial cell extract (b) is shown.
  • the reactivity with anti-P4PoAb bacteria (Table 1) in ELISA is shown.
  • the general structure of immunochromatography is shown. The state of development of the specimen on the immunochromatography stop is shown.
  • the reactivity of anti-P6PoAb to NTHiP6 (a) and NTHi disrupted antibody in immunochromatography is shown.
  • the bacteria to be measured by the measurement method of the present invention are H. influenzae, and H. influenzae is the target of measurement for all of the capsule types af and non-capsular. Specifically, bacteria expressing P4 antigen and P6 antigen are targeted. In addition, respiratory tract infections, otitis media, meningitis, and sepsis in infants and children can be considered as target diseases of Haemophilus influenzae. In such cases, if a sample is taken from the affected area, other bacteria may be mixed. There is a possibility of reacting to the measurement system.
  • the measurement method of the present invention is characterized in that it does not react at all with bacteria having P6 antigen and P4 antigen homology as constituents, such as parainfluenza, Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli.
  • bacteria having P6 antigen and P4 antigen homology such as parainfluenza, Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli.
  • the antibody recognizing P4 antigen or P6 antigen of Haemophilus influenzae used in the present invention can be produced by immunizing an animal with the P4 antigen or P6 antigen and obtaining the antiserum or egg of the animal.
  • the P4 antigen or P6 antigen used for immunization may be collected from Haemophilus influenzae and can be produced by a recombinant method. Among these, it is preferable to use the antigen extracted from Haemophilus influenzae from the point of measurement sensitivity.
  • P4 antigen or P6 antigen P4 protein or P6 protein may be sufficient, and some polypeptide of P4 antigen or P6 antigen may be sufficient.
  • P6 antigen is preferably used from the viewpoint of specificity and sensitivity to Haemophilus influenzae.
  • nucleotide sequence relating to the P6 antigen and the amino acid sequence encoded by it are shown in SEQ ID NO: 1 (Accession M19391).
  • nucleotide sequence for the P4 antigen and the amino acid sequence that it encodes are shown in SEQ ID NO: 2 (Accession M68502).
  • the P6 polynucleotide can be produced and obtained by a chemical DNA synthesis method based on the sequence information of SEQ ID NO: 1, but can be easily produced and obtained by a general genetic engineering technique [Molecular Cloning 2d. Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); secondary biochemistry experiment course "gene research method I, II, III", Japan Biochemical Society edition (1986) etc.].
  • a chemical DNA synthesis method a solid phase synthesis method by a phosphoramidite method can be exemplified. An automatic synthesizer can be used for this synthesis method.
  • a cDNA library is prepared according to a conventional method from an appropriate source from which the P6 polynucleotide is expressed, and an appropriate property peculiar to the P6 polynucleotide is prepared from the library. This can be carried out by selecting a desired clone using a suitable probe or antibody [Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981); Science 122,778 (1983), etc.].
  • the origin of cDNA is not particularly limited as long as it is a microorganism that expresses a P6 polynucleotide. Specifically, H. influenzae can be preferably used.
  • the method for screening the P6 polynucleotide from the cDNA library is not particularly limited, and a normal method can be followed. Specifically, for example, for a polypeptide produced by cDNA, a method for selecting a corresponding cDNA clone by immunoscreening using the polypeptide-specific antibody, a probe that selectively binds to a target nucleotide sequence Examples thereof include plaque hybridization, colony hybridization, etc., and combinations thereof.
  • Examples of the probe used here generally include DNA chemically synthesized based on information on the nucleotide sequence of the P6 polynucleotide.
  • a sense primer and / or an antisense primer set based on the base sequence information of the polynucleotide of the present invention can also be used as a screening probe.
  • a PCR method [Science 130, 13501985 (1985)] or a modified method of DNA or RNA can be preferably used.
  • the RACE method Rapid amplification of cDNA ends; Frohman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)] and the like are suitable.
  • Primers used in adopting such a PCR method can be appropriately set based on the sequence information of the P6 polynucleotide, and can be synthesized according to a conventional method.
  • isolation and purification of the amplified DNA or RNA fragment can be carried out according to a conventional method as described above, for example, by gel electrophoresis, hybridization or the like.
  • a product of the polynucleotide (that is, the above-mentioned polypeptide) can be easily and stably produced in a large amount by using a normal genetic engineering technique.
  • the expression vector expression vector is not particularly limited as long as it contains a P6 polynucleotide and can express the P6 polynucleotide, and is generally appropriately selected from the relationship with the host cell.
  • the expression vector is, for example, a plasmid vector that can replicate in the host cell, and upstream of the polynucleotide so that the polynucleotide can be expressed in the vector.
  • An expression plasmid to which a promoter and an SD (Shine and Dalgarno) base sequence are added can be mentioned. Specifically, mention may be made of P L promoter, the expression plasmid using T7 promoter and the lac promoter.
  • Other preferred bacterial expression vectors include plasmids pKK233-2 and pKK233-3 using the tac promoter or trc promoter. However, it is not limited to these, and various known strains and vectors can also be used.
  • the expression vector When vertebrate cells are used as host cells, the expression vector usually has a promoter located upstream of the polynucleotide to be expressed, an RNA splice site, a polyadenylation site, a transcription termination sequence, etc. Which may further have an origin of replication if necessary.
  • Eukaryotic vectors useful for inserting the above polynucleotides are well known.
  • suitable eukaryotic vectors include pCD and pCMV.
  • pMSG and pSVL using MMTV or SV40 late promoter can be mentioned as necessary.
  • Recombinant cells can be obtained by transformation with an expression vector containing the recombinant cell P6 polynucleotide.
  • a host cell used for the recombinant cell either a prokaryotic cell or a eukaryotic cell may be used.
  • a prokaryotic cell used as a host cell a bacterium often used in gene recombination can be used, and Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Streptococcus, Staphylococcus and the like can be exemplified. In particular, Escherichia coli, Bacillus subtilis, etc. can be mentioned as suitable examples.
  • eukaryotic cells used as host cells include eukaryotic microorganisms such as yeast and Aspergillus; insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9; L cells, CHO cells, COS cells, HeLa cells, C127 cells, BALB / Examples include c3T3 cells (including mutant strains deficient in dihydrofolate reductase, thymidine kinase, etc.), BHK21 cells, HEK293 cells, Bowes melanoma cells, oocyte and plant cells.
  • yeast and Aspergillus insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9
  • L cells CHO cells, COS cells, HeLa cells, C127 cells, BALB / Examples include c3T3 cells (including mutant strains deficient in dihydrofolate reductase, thymidine kinase, etc.), BHK21 cells, HEK293 cells, Bowes melanom
  • the method for introducing the expression vector into the host cell is not particularly limited, and various general methods can be employed.
  • introduction of the above expression vector into a host cell is performed by Davis et al. (BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986) and Sambrook et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed. , 1989), etc., and can be carried out according to the methods described in many standard laboratory manuals, including calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, transvection, and microinjection. Cationic lipid-mediated transfection, electroporation, transduction, scrape loading, ballistic introduction, infection, and the like.
  • a P6 polypeptide can be produced by culturing a recombinant cell into which a P6 polynucleotide has been introduced and recovering the P6 polypeptide from the cell and / or culture.
  • the culture may be performed by subculture or batch culture using a medium suitable for the host.
  • the culture may be performed until an appropriate amount of P6 polypeptide is obtained using the amount of P6 polypeptide produced inside or outside the recombinant cell as an index.
  • the medium used for the culture various media commonly used according to the employed host cells can be appropriately selected and used, and the culture can also be performed under conditions suitable for the growth of the host cells.
  • the P6 polypeptide thus obtained may be subjected to various separation operations utilizing its physical properties, chemical properties, etc. [“Biochemical Data Book II”, pages 1175-1259, first edition, first, as desired. Jun. 23, 1980, published by Tokyo Chemical Co., Ltd .; see Biochemistry, 25 (25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987), etc.]. Specifically, a method similar to the method for isolating and purifying the target protein described in the column of “extraction and isolation of antigen” below is exemplified.
  • P6 following extraction and isolation method of the antigenic peptides from microorganisms having P6 polypeptide production ability a method for isolating and purifying the P6 peptides.
  • microbial cells having the ability to produce P6 polypeptide are disrupted to obtain a crude extract of the microorganism.
  • a method used in a normal microbial cell disruption process such as a treatment with a crusher such as a French press or a cell mill; an ultrasonic treatment under a hypotonic solution is used.
  • the obtained crude extract may be further subjected to a purification treatment such as ammonium sulfate precipitation, organic solvent precipitation using ethanol or the like, or isoelectric point precipitation in order to increase the degree of purification.
  • the crude extract is then subjected to treatments such as ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, hydrophobic chromatography, various affinity chromatography, reverse layer chromatography, hydroxyapatite column chromatography, etc.
  • a containing fraction can be obtained. Note that these chromatographic treatments may use an open column or HPLC as required. Further, the purity of the fraction containing the P6 polypeptide thus obtained can be estimated easily and visually by electrophoresis, particularly by SDS-PAGE.
  • the P6 polypeptide is confirmed by amino acid sequence analysis; mass spectrometry using a mass spectrometer such as MALDI-TOF MS, ESI Q-TOF MS or MALDI Q-TOF MS; peptide mass fingerprinting, etc. You can also.
  • P6 antigen peptide or P6 antigen peptide-recognizing antibody used for antibody acquisition measurement it can be acquired according to a conventional method. It is preferred to use polyclonal antibodies.
  • polyclonal antibodies When producing a polyclonal antibody, it can be obtained by immunizing a warm-blooded animal such as a rabbit, sheep, guinea pig or chicken with an emulsion prepared by mixing the above antigen of interest with Freund's complete adjuvant multiple times. It is possible to obtain antisera according to conventional methods.
  • the above immunizing antigen can be immunized multiple times to produce IgY in the eggs laid by the chickens, and IgY can be obtained from the egg yolks according to a conventional method.
  • test sample may be H. influenzae or an extract of the bacteria.
  • polyclonal antibody that recognizes the P6 antigen.
  • Representative examples of the measurement apparatus using the immunological technique include ELISA and immunochromatography measurement apparatus.
  • a technique using an antibody against a measurement target such as radioimmunoassay (RIA) can be cited as a suitable example.
  • RIA radioimmunoassay
  • a primary antibody (anti-P6 polyclonal antibody or anti-P4 polyclonal antibody) is usually immobilized on a 96-well plate, and a biological sample (blood, serum) Plasma, or other body fluid components, especially middle ear exudates such as ear leaks, throat swabs, urine) or, if necessary, diluted in an appropriate buffer and contacted with the antibody for a certain period of time.
  • a labeled secondary antibody (labeled anti-P6 antibody or labeled P4 antibody) is reacted.
  • the label is biotin
  • color is developed by reacting avidin (or streptavidin) -labeled peroxidase and reacting with an appropriate reaction substrate (for example, TBM). After a certain time, colorimetric determination is performed by measuring at a predetermined wavelength, in this case 450 nm.
  • avidin-labeled antibodies include peroxidase (HRP), alkaline phosphatase, acid phosphatase, glucose oxidase, and tyrosinase label.
  • the substrate is not particularly limited as long as it is commercially available.
  • the labeled antibody examples include a biotin-labeled antibody, on the other hand, avidin or streptavidin, or a secondary antibody such as peroxidase (HRP), alkaline phosphatase, acid phosphatase, glucose oxidase, and tyrosinase label.
  • the substrate is not particularly limited as long as it is commercially available.
  • sample pad affixed to one end of the plastic mount, followed by the part where the gold colloid-labeled anti-P6PoAb is held dry (gold pad), the nitrocellulose part, and the excess sample are absorbed. It consists of the part (absorption pad) to do.
  • the sample pad and the absorbent pad are preferably made of glass fiber filter paper, cellulose, or cotton, or a mixture thereof. Nitrocellulose has a pore size of 1.0 to 20 ⁇ m (preferably 5.0 to 10.0 ⁇ m). desirable. Note that a gold pad is not required when the colloidal gold-labeled anti-P6PoAb is used in a solution state.
  • the above P6PoAb is applied at a concentration of 0.1 to 10 mg / ml (preferably 0.2 to 5 mg / mL).
  • goat having anti-rabbit IgG activity, IgG from mouse, etc. are applied at a concentration of 0.1 to 10 mg / mL.
  • blocking is performed with protein or polymer.
  • proteins such as BSA, casein, and gelatin, and polymers such as polyvinyl alcohol (PVA), polyvinyl pyrrolidone (PVP), and polyethylene glycol (PEG) can be used.
  • the gold colloid preferably has a size of 20 to 150 nm (preferably 30 to 100 nm), and the antibody label may be adsorbed or covalently bound via other proteins.
  • colored Latex particles and other noble metal colloids could be used instead of gold colloids.
  • proteins such as BSA, casein, and gelatin, and polymers such as PVA, PVP, and PEG can be used as in nitrocellulose.
  • the test strip assembled in this way may be used in a plastic case.
  • kits composition including various reagents for an ELISA kit or an immunochromatography method can be provided.
  • the kit includes an antibody against P4 antigen or P6 antigen.
  • the kit includes albumin such as BSA, a secondary antibody, an enzyme substrate (when an enzyme is used as a label), and the like.
  • the labeled antibody is a biotin-labeled antibody
  • the measurement kit may contain peroxidase-labeled avidin as a secondary antibody.
  • a whole Haemophilus influenzae diagnostic kit containing a substrate for the peroxidase and the like can be provided.
  • Haemophilus influenzae in various infectious diseases can be specifically detected. Therefore, it can be determined that the pathogen of the infectious disease determined to be positive by the method of the present invention is H. influenzae.
  • the target diseases of the present invention include respiratory tract infections, otitis media, and sepsis in infants and children, but otitis media has almost no infection with parainfluenza (International Journal of Pediatric Chemistry Otorhinolaryngology (2003) 67, 43-51). Therefore, the method of the present invention is particularly useful for measuring all Haemophilus influenzae in otitis media.
  • Antigen preparation 1-1-1 Preparation of P6 antigen P6 antigen was performed by two methods of direct extraction from Haemophilus influenzae and preparation of E. coli recombinants.
  • the precipitate obtained by centrifugation was suspended in the above buffer solution to which 10 ug / mL RNase A (SIGMA) was added, sonicated and again heated at 37 ° C. for 30 minutes. Subsequently, after a precipitate was obtained by centrifugation, a series of operations of suspending, sonicating and heating with a buffer solution without addition of RNase A was repeated twice.
  • the precipitate after centrifugation was suspended in a buffer solution of 0.01 M Tris / 0.15 M NaCl (pH 7.4), sonicated, and heated at 65 ° C. for 30 minutes. The supernatant obtained by centrifugation was concentrated by centrifugal ultrafiltration and used as an antigen.
  • E. coli Recombinant Direct PCR was performed using cells of Haemophilus influenzae type b (Hib) (ATCC No. 10211) as a template to amplify the P6 gene (mature form) lacking the signal sequence.
  • Hib Haemophilus influenzae type b
  • 5'-GCGGGATCCTGTAGTTCCTCTAACAACGATGCT-3 '(SEQ ID NO: 3) was used for the forward primer
  • 5'-GCGGAGCTCGTACGCTAACACTGCACGACGGTT-3' (SEQ ID NO: 4) was used for the reverse primer
  • GeneAmp TM PCR System 9700 PE Applied Biosystems
  • the amplified fragment obtained using TaKaRa Taq was inserted into a subcloning vector pCR TM 2.1 (Invitrogen). After confirming the sequence of the amplified P6 gene (mature form), the fragment excised using the BamHI and XhoI sites was inserted into the expression vector pET21a (MERCK), and the recombinant P6 expression plasmid (P6-pET21a) was inserted. Produced. After transduction into E. coli BL21, expression of recombinant P6 antigen was induced under conditions of 1 mM IPTG at 37 ° C. for 3 hours.
  • P4 antigen Only E. coli recombinant was prepared as the P4 antigen. The production procedure is almost the same as that of the recombinant P6 antigen.
  • P4 gene lacking a signal sequence was obtained by performing direct PCR using cells of non-encapsulated H. influenzae (NTHi) (ATCC No. 9333) as a template. (Shape form) was amplified.
  • the amplified fragment obtained by using BamHI was subjected to restriction enzyme treatment with BamHI and XhoI, and then inserted into the expression vector pET21a using both of these sites to prepare recombinant P4 expression plasmid (P4m-pET21a). After transduction into E.
  • PoAb Reactivity The potency of each PoAb prepared by the above method was evaluated by the following ELISA method. First, recombinant P4 antigen, recombinant P6 antigen and extracted P6 antigen, which are immunogens, were immobilized on an ELISA plate at a concentration of 1 ⁇ g / mL, and then blocked with bovine serum albumin (BSA) or the like. Recombinant P4 antigen solid-phase plate contains anti-P4PoAb purified from 2 individuals. Recombinant P6 antigen and extracted P6 antigen solid-phase plate each contain 4 kinds of anti-P6PoAbs obtained from 2 kinds of P6 antigens at 1 ⁇ g / each.
  • BSA bovine serum albumin
  • P4 antigen detection sandwich ELISA The measurement procedure and the like are the same as the sandwich ELISA for detecting the P6 antigen, but anti-P4PoAb (anti-P4rec.PoAb No. 2) was immobilized on an ELISA plate at a concentration of 5 ⁇ g / mL and then blocked with BSA or the like. The antibody solid phase plate was allowed to react with an immunogen or a disrupted bacterial body that had been appropriately diluted. After washing, a biotin label of the same PoAb as the solid-phased anti-P4PoAb was reacted with each other, washed again, reacted with HRP-labeled streptavidin, and developed with TMB.
  • FIGS. 4a and 4b An example of a dose-dependent curve is shown in FIGS. 4a and 4b.
  • P4 antigens of 100 pg / mL or more can be detected, and NTHi disrupted cells can detect 10 3 to 10 7 CFU / mL. there were.
  • FIG. 5 shows the results of evaluation of cross-reactivity to various bacteria shown in Table 1 by sandwich ELISA. As shown in FIG. All influenza strains were detected.
  • the signal intensity of the test line depending on the cell concentration could be detected at 3 ⁇ 10 4 CFU / mL or more. From these results, an immunochromatographic measurement system for detecting Haemophilus influenzae antigen with anti-P6PoAb could be constructed.

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Abstract

　全てのインフルエンザ菌を同時に高感度で測定できる免疫学的測定法の提供。　インフルエンザ菌のＰ４抗原又はＰ６抗原認識抗体を用いることを特徴とする全インフルエンザ菌の免疫学的測定方法。

Description

全インフルエンザ菌の測定方法
　本発明は、インフルエンザ菌全般を特異的に測定する方法、及び該方法に用いる測定装置に関する。
　インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）は、肺炎球菌同様にヒト鼻咽腔の常在菌として知られており、常在化に至っていない特に乳幼児、小児においては気道感染症、中耳炎、髄膜炎、敗血症等の原因菌となることが知られている。他の感染症の原因菌同様に、インフルエンザ菌においても抗菌薬の多用による薬剤耐性化が症状の難治性化、重症化を招く原因として問題となってきており、治療開始時の適切な抗菌薬選択の重要性が増している。感染症治療の原則として、できる限り原因菌を早期に確定し、的確な治療薬を選択することが予後の改善、医療コストの削減、耐性菌発現防止に関して重要であることから、インフルエンザ菌由来共通抗原を迅速に検出する診断試薬が求められる。
　現在、インフルエンザ菌判定方法としてグラム染色法、検鏡、培養法、菌体の酵素代謝を利用した呈色反応、ラテックス凝集法、ＰＣＲ法等が用いられている。この内、迅速診断方法としてラテックス凝集法を用いたインフルエンザ菌抗原検出キット（Slidex Meningite-Kit 5. bioMerieux社）があるが、これはｂ型インフルエンザ菌の多糖体抗原を検出するものであり、無莢膜型の判定には用いることが出来ない。またＰＣＲ法によるインフルエンザ菌遺伝子検出測定法や菌株共通抗原のＰ６やＰ４抗原を標的としたそれらの遺伝子検出測定法もあるが、ＰＣＲ法による遺伝子診断測定法は実施施設が限定されることもあり現在のところは一般性に乏しい。またＰ６抗原のモノクローナル抗体に関する報告があり、ウェスタンブロッティングによりインフルエンザ菌を検出している（非特許文献１）。しかし、この方法による感度は低く、臨床検査として用いられるレベルではない。
　インフルエンザ菌はグラム陰性桿菌で、菌を被う莢膜の有無から莢膜型と無莢膜型とに大別され、さらに莢膜型には莢膜に存在する多糖抗原の構造の差異に起因する血清型別分類としてａ～ｆ型が存在し、また無莢膜型は型別不能な型として分類される。ｂ型莢膜多糖であるポリリボシルリビトール　ホスフェートは、ｂ型特異的抗原として報告されるが、無莢膜型ではこのような特異抗原としての多糖は知られていない。また、無莢膜型の蛋白抗原として菌体外膜蛋白質の１つであるＰ２蛋白質がインフルエンザ菌の主要抗原として知られるが、本抗原は変異が多発するために、菌株により抗原性が異なることが知られている。
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．（１９８９）２２６３－２２６７
　前記のようにインフルエンザ菌の共通抗原は見出されておらず、全インフルエンザ菌を同時に検出することができる免疫学的方法はなかった。
　本発明は、上記問題を解決することを課題とするもので、全てのインフルエンザ菌を同時に高感度に測定できる免疫学的測定方法及び、当該方法を利用した測定装置を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意努力を重ねた結果、従来インフルエンザ菌に共通に存在し比較的変異の少ないといわれているＰ４及びＰ６タンパクに注目した。当該タンパク質はインフルエンザ菌には他抗原に比べ発現量が少なく、したがって認識抗体を作製しても高感度にしかもすべてのタイプのインフルエンザ菌を全般的に測定することは困難であると考えられていた。また、Ｐ４及びＰ６タンパクにホモロジーの高いタンパクを有する細菌は多数存在するため、インフルエンザ菌を特異的に検出することは困難であると考えられていた。しかしながら、予想に反し本発明者は、高度選択的に認識する抗体を作製することができた。また、当該抗体は測定時に容易に混入する可能性のある緑膿菌、大腸菌等の影響を受けづらいことが判明した。本発明は、本成果を元に完成されたものである。
　すなわち、本発明は、インフルエンザ菌のＰ４抗原又はＰ６抗原認識抗体を用いることを特徴とする全インフルエンザ菌の免疫学的測定方法を提供するものである。
　また本発明は、インフルエンザ菌のＰ４抗原又はＰ６抗原認識抗体を含有することを特徴とする全インフルエンザ菌の免疫学的測定装置を提供するものである。
　本発明による、すべてのインフルエンザ菌を対象にした高感度測定方法の確立により、当該測定装置の提供が可能になり、これにより中耳炎などに感染したインフルエンザ菌全般の検出が簡便・迅速にできるようになった。本発明方法は、インフルエンザ菌による中耳炎の検出に特に有用である。
ＥＬＩＳＡにおける、抗Ｐ４ＰｏＡｂ（ａ）及び抗Ｐ６ＰｏＡｂ（ｂ）の免疫原のインフルエンザ菌共通抗原（Ｐ６、Ｐ４）に対する反応性を示す。 ＥＬＩＳＡにおける、抗Ｐ６ＰｏＡｂのＮＴＨｉＰ６（ａ）及びＮＴＨｉ破砕菌体（ｂ）に対する反応性を示す。 ＥＬＩＳＡにおける、抗Ｐ６ＰｏＡｂの細菌類（表１）に対する反応性を示す。 ＥＬＩＳＡにおける、抗Ｐ４ＰｏＡｂのＰ４ｒｅｃ．（ａ）及びＮＴＨｉ菌体抽出液（ｂ）に対する反応性を示す。 ＥＬＩＳＡにおける、抗Ｐ４ＰｏＡｂの細菌類（表１）に対する反応性を示す。 イムノクロマトの一般的構造を示す。 イムノクロマトストップへの検体の展開状態を示す。 イムノクロマトにおける抗Ｐ６ＰｏＡｂのＮＴＨｉＰ６（ａ）及びＮＴＨｉ破砕抗体に対する反応性を示す。
　本発明の測定法の対象となる菌はインフルエンザ菌であり、インフルエンザ菌は莢膜型としてａ～ｆ型、及び無莢膜型のすべてが測定対象である。具体的には、Ｐ４抗原及びＰ６抗原を発現している菌が対象となる。また、インフルエンザ菌対象疾患として、乳幼児及び小児における気道感染症、中耳炎、髄膜炎及び敗血症などが考えられるが、このような疾患の場合、患部からサンプルを採取した場合、他の菌が混入し測定系に反応する可能性が考えられる。しかし、本発明測定法では、Ｐ６抗原及びＰ４抗原とホモロジーを有する蛋白質を構成成分とする菌、例えばパラインフルエンザ菌、緑膿菌、大腸菌などに対しては、一切反応しないのが特徴である。元来、抗原に対するポリクローナル抗体を調製し、測定系に使用した場合、当然ホモロジーを有する抗原所有菌に対する交叉性が生じるのが通常であり、またＰ６及びＰ４抗原の場合もこのように他菌との交叉性の生じる危惧があった。また、当該抗原はいずれもインフルエンザ菌においては微量成分でありポリクローナル抗体を作製することができたとしても、測定感度の点で不利であるというのも大方の見方であった。以上から当該抗原に対するポリクローナル抗体を用いた測定系の報告はない。しかしながら、本発明の場合、これらポリクローナル抗体を用いた測定系は、予想に反して上述サンプルへの混入の可能性のあるパラインフルエンザ菌、緑膿菌、大腸菌などとの交叉反応性が極めて低く（図３参照）、予想以上に高感度でインフルエンザ菌全般を測定することができる。
　本発明で用いるインフルエンザ菌のＰ４抗原又はＰ６抗原を認識する抗体は、Ｐ４抗原又はＰ６抗原を動物に免疫し、その動物の抗血清又は卵等を取得することにより製造することができる。
　免疫に用いられるＰ４抗原又はＰ６抗原は、インフルエンザ菌から採取してもよく、組換え法により製造することも可能である。このうち、測定感度の点から、インフルエンザ菌から抽出した抗原を用いるのが好ましい。ここでＰ４抗原又はＰ６抗原としては、Ｐ４タンパク又はＰ６タンパクでもよいし、Ｐ４抗原又はＰ６抗原の一部のポリペプチドでもよい。
　また、Ｐ４抗原及びＰ６抗原のうち、Ｐ６抗原を用いるのがインフルエンザ菌に対する特異性及び感度の点で好ましい。
　Ｐ６抗原に関するヌクレオチド配列及びそれがコードしているアミノ酸配列を配列番号１に示す（アクセッションＭ１９３９１）。Ｐ４抗原に関するヌクレオチド配列及びそれがコードしているアミノ酸配列を配列番号２に示す（アクセッションＭ６８５０２）。
　以下の説明については、Ｐ６抗原に基いて説明するが、Ｐ４抗原の場合も同様にして実施することができる。
Ｐ６及びＰ４抗原の組換え体の作製
　Ｐ６抗原に基づき説明する。Ｐ６ポリヌクレオチドは、配列番号１の配列情報に基づいて、化学的ＤＮＡ合成法により製造、取得することができるが、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる〔Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、II、III」、日本生化学会編（1986）等参照〕。
　化学的ＤＮＡ合成法としては、フォスフォアミダイト法による固相合成法を例示することができる。この合成法には自動合成機を利用することができる。
　また、一般的遺伝子工学的手法としては、具体的には、Ｐ６ポリヌクレオチドが発現される適当な起源より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、Ｐ６ポリヌクレオチドに特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981)；Science122,778 (1983)等〕。
　ここで、ｃＤＮＡの起源としては、Ｐ６ポリヌクレオチドを発現する微生物であれば特に制限されないが、具体的には、H.influenzaeを好適に用いることができる。
　また、これらからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従って実施することができる。また、Ｐ６ポリヌクレオチドをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。具体的には、例えばｃＤＮＡによって産生されるポリペプチドに対して、該ポリペプチド特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のヌクレオチド配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等やこれらの組合せ等を例示できる。
　ここで用いられるプローブとしては、Ｐ６ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡ等が一般的に例示できる。また、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列情報に基づき設定したセンスプライマー及び／又はアンチセンスプライマーをスクリーニング用プローブとして用いることもできる。
　Ｐ６ポリヌクレオチドの取得に際しては、ＰＣＲ法〔Science130, 1350 (1985)〕又はその変法によるＤＮＡ若しくはＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法〔Rapid amplification of cDNA ends；実験医学、12(6), 35 (1994)〕、特に５’－ＲＡＣＥ法〔M.A. Frohman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)〕等の採用が好適である。
　かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、Ｐ６ポリヌクレオチドの配列情報に基づいて適宜設定することができ、これは常法に従って合成できる。尚、増幅させたＤＮＡ若しくはＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法、ハイブリダイゼーション法等によることができる。
　Ｐ６ポリヌクレオチドによれば、通常の遺伝子工学的手法を用いることにより、該ポリヌクレオチドの産物（すなわち、上記ポリペプチド）を容易に大量に、安定して製造することができる。
発現ベクター
　発現ベクターは、Ｐ６ポリヌクレオチドを含んでおり、且つ該Ｐ６ポリヌクレオチドを発現できるものであれば特に制限されず、一般に宿主細胞との関係から適宜選択される。
　宿主細胞として原核生物の細胞を使用する場合、発現ベクターとしては、例えば該宿主細胞中で複製可能なプラスミドベクターであって、このベクター中に上記ポリヌクレオチドが発現できるように上記ポリヌクレオチドの上流にプロモーター及びＳＤ（シヤイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列を付与した発現プラスミドを挙げることができる。具体的には、ＰLプロモーター、Ｔ７プロモーター及びｌａｃプロモーターを利用した発現プラスミドを挙げることができる。他の好ましい細菌発現ベクターとしてはｔａｃプロモーター又はｔｒｃプロモーターを利用したプラスミドｐＫＫ２３３－２及びｐＫＫ２３３－３等を挙げることができる。ただし、これらに限定されず公知の各種の菌株及びベクターをも利用できる。
　また、宿主細胞として脊椎動物細胞を使用する場合、発現ベクターとしては、通常発現しようとする上記ポリヌクレオチドの上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを使用でき、これはさらに必要により複製起点を有していてもよい。上記ポリヌクレオチドを挿入するのに有用な真核生物ベクターはよく知られている。例えば、適当な真核生物ベクターとしてはｐＣＤ及びｐＣＭＶを例示することができる。また、これらの他には、必要に応じて、ＭＭＴＶ又はＳＶ４０後期プロモーターを利用したｐＭＳＧ及びｐＳＶＬを挙げることができる。
組換え細胞
　Ｐ６ポリヌクレオチドを含む発現ベクターによって形質転換させれば組換え細胞（形質転換体）が得られる。
　組換え細胞に使用される宿主細胞としては、原核細胞及び真核細胞のいずれを使用してもよい。
　宿主細胞として使用される原核細胞としては、遺伝子組換えで良く用いられる細菌を用いることができ、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等を例示することができる。特に、大腸菌、枯草菌などを好適な例としてあげることができる。
　宿主細胞として使用される真核細胞としては、例えば、酵母、アスペルギルス等の真核微生物；ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞；Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、卵母細胞等の動植物細胞等を例示することができる。
　また、上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法は、特に制限されず、一般的な各種方法を採用することができる。例えば、上記発現ベクターの宿主細胞への導入は、Ｄａｖｉｓら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びＳａｍｂｒｏｏｋら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）等の多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法に従って行うことができ、その具体的手法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（transvection）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（scrape loading）、弾丸導入（ballistic introduction）、感染等が挙げられる。
組換え細胞を用いたＰ６抗原ペプチドの製造
　Ｐ６ポリヌクレオチドが導入された組換え細胞を培養し、細胞及び又は培養物からＰ６ポリペプチドを回収することにより、Ｐ６ポリペプチドを製造することができる。
　培養は、宿主に適した培地を用いて継代培養又はバッチ培養を行えばよい。培養は、組換え細胞の内外に生産されたＰ６ポリペプチド量を指標にして、Ｐ６ポリペプチドが適当量得られるまで行えばよい。
　該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
　また、斯くして得られるＰ６ポリペプチドは、所望により、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックII」、1175-1259頁、第１版第１刷、1980年6月23日株式会社東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25), 8274 (1986);Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987) 等参照〕により分離、精製できる。具体的には、下記「抗原の抽出及び単離」の欄において記載された目的タンパク質を単離精製する方法と同様の方法が例示される。
Ｐ６抗原ペプチドの抽出及び単離法
　以下、Ｐ６ポリペプチド産生能を有する微生物から、Ｐ６ペプチドを単離精製する方法について説明する。先ず、Ｐ６ポリペプチド産生能を有する微生物の菌体を破砕し、該微生物の粗抽出物を得る。ここで、菌体の破砕には、フレンチプレス、セルミル等の破砕機による処理；低張溶液下超音波処理等の通常の菌体破砕処理に使用されている方法が使用される。また、得られた粗抽出物には、適当な緩衝液を添加しておいてもよい。
　得られた粗抽出物に対しては、その精製度を上げるために、さらに、硫酸アンモニウム沈殿、エタノール等を利用した有機溶媒沈殿、又は等電点沈殿等の精製処理に供しても良い。次いで、粗抽出物を、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、各種アフィニテイークロマトグラフィー、逆層クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー等の処理に供することにより、Ｐ６ポリペプチドを含む画分を得ることができる。なお、これらのクロマトグラフィーによる処理は、必要に応じてオープンカラムを使用してもよく、またＨＰＬＣを使用してもよい。また、斯くして得られたＰ６ポリペプチドを含む画分の純度については、電気泳動、特にＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、可視的に簡便に推定できる。また、Ｐ６ポリペプチドは、アミノ酸配列分析法；ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ、ＥＳＩ　Ｑ－ＴＯＦ　ＭＳ又はＭＡＬＤＩ　Ｑ－ＴＯＦ　ＭＳ等の質量分析装置を利用した質量分析法；ペプチドマスフィンガープリンテイング法等によって確認することもできる。
抗体の取得
　測定に用いるＰ６抗原ペプチド又はＰ６抗原ペプチド認識抗体の取得に関しては、常法に従い取得することができる。ポリクローナル抗体を使用するのが好ましい。
　ポリクローナル抗体を作製する場合は、ウサギ、ヒツジ、モルモット、ニワトリのような温血動物に、上記目的抗原を通常、フロイントの完全アジュバントと混和して調製した乳化物を、複数回免疫し、得られる抗血清を常法に従い取得することが可能である。また、ニワトリの場合には、上記免疫抗原を複数回免疫して、該ニワトリが産卵する鶏卵にＩｇＹを産生させ、そして該鶏卵の卵黄より、常法に従いＩｇＹを取得することができる。
測定系の構築
　本発明インフルエンザ菌の測定方法は、Ｐ６抗原又はＰ４抗原を認識するポリクロナール抗体を用いるのが好ましい。被検試料はインフルエンザ菌或いは当該菌の抽出物であってもよい。このうちＰ６抗原を認識するポリクローナル抗体を用いるのが、特に好ましい。
　本免疫学的手法を利用した測定装置としては、ＥＬＩＳＡ及びイムノクロマト測定装置を代表例として挙げることができる。他の例としてラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）などの測定対象物に対する抗体を利用した手法を好適な例として挙げることができる。
ＥＬＩＳＡ測定方法
　例えば、サンドイッチ法の場合であれば、通常９６穴プレートに対して、一次抗体（抗Ｐ６ポリクロナール抗体又は抗Ｐ４ポリクローナル抗体）をプレートに固相化しておき、生体由来試料（血液、血清、血漿、或いは他の体液成分特に耳漏れなどの中耳浸出液や咽頭ぬぐい液、尿）或いは、必要に応じて、適当な緩衝液に希釈したものを添加し一定時間抗体と接触させることにより結合させる。その後、適当な緩衝液で洗浄を行った後、標識２次抗体（標識抗Ｐ６抗体又は標識Ｐ４抗体）を反応させる。例えば、標識体がビオチンであればアビジン（或いはストレプトアビジン）標識ペルオキシダーゼを反応させ、適当な反応基質（例えばＴＢＭ）を作用させることにより発色させる。一定時間後、所定の波長この場合であれば４５０ｎｍで測定することにより、比色定量を行う。アビジン標識抗体にペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）やアルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ及びチロシナーゼ標識などが考えられる。基質としては、市販で一般に使用されているものであれば特に制限はない。
　標識抗体としては、ビオチン標識抗体、これに対してアビジン又はストレプトアビジン、或いは、２次抗体にペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）やアルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ及びチロシナーゼ標識などが挙げられる。基質としては、市販で一般に使用されているものであれば特に制限はない。
イムノクロマト測定装置
　イムノクロマトの構造は図６に示す一般的手法に従うことができる。簡略にはプラスティック台紙上の片側末端に貼り付けられたサンプルアプライ部分（サンプルパッド）、続いて金コロイド標識抗Ｐ６ＰｏＡｂを乾燥保持させた部分（ゴールドパッド）、ニトロセルロース部分、及び過剰なサンプルを吸収する部分（吸収パッド）から構成される。サンプルパッド及び吸収パッドにはガラス繊維濾紙やセルロース製、又はコットン製、さらにはそれらの混合体の濾紙が望ましく、ニトロセルロースはポアサイズ１．０～２０μｍ（好ましくは５．０～１０．０μｍ）が望ましい。なお金コロイド標識抗Ｐ６ＰｏＡｂを溶液状態で使用する場合にはゴールドパッドは必要としない。
　ニトロセルロース上のテストライン上には、上記のＰ６ＰｏＡｂを０．１～１０ｍｇ／ｍｌの濃度（好ましくは０．２～５ｍｇ／ｍＬ）の濃度で塗布する。コントロールライン上には抗ウサギＩｇＧ活性を有するヤギやマウスのＩｇＧ等を０．１～１０ｍｇ／ｍＬの濃度で塗布する。乾燥後、蛋白質や高分子等でブロッキングを行う。ブロッキング操作にはＢＳＡ、カゼイン、ゼラチン等の蛋白質や、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の高分子が使用可能である。一方、金コロイドとしては２０～１５０ｎｍのサイズ（好ましくは３０～１００ｎｍ）が望ましく、抗体の標識には吸着もしくは他の蛋白質等を介した共有結合が考えられる。さらには着色Ｌａｔｅｘ粒子や他の貴金属コロイドも金コロイドの代わりに使用可能と考えられる。金コロイドのブロッキングはニトロセルロース同様にＢＳＡ、カゼイン、ゼラチン等の蛋白や、ＰＶＡ、ＰＶＰ、ＰＥＧ等の高分子が使用可能である。このようにして組み立てたテストストリップをプラスティックケース内に納めて使用すればよい。
診断キット
　被検試料中のＰ４抗原量若しくはＰ６抗原量を測定することにより、中耳炎患者等におけるインフルエンザ菌感染の有無を測定することが出来る。すなわち、ＥＬＩＳＡキット又はイムノクロマト法のための各種試薬を含めたキット組成物を提供することができる。特に、キット中には、Ｐ４抗原若しくはＰ６抗原に対する抗体を含む。キットには他に、ＢＳＡなどのアルブミン、２次抗体、酵素の基質（標識として酵素を使用した場合）などが含まれる。例えば、標識抗体がビオチン標識抗体であれば、該測定キットには２次抗体としてペルオキシダーゼ標識アビジンを含み得る。また、該ペルオキシダーゼに対する基質等を含む全インフルエンザ菌診断キットが提供できる。
　本発明方法によれば、種々の感染症におけるインフルエンザ菌が特異的に検出できる。従って、本発明方法により陽性と判断された感染症の病因菌はインフルエンザ菌であると判定できる。本発明の対象疾患としては、乳幼児及び小児における気道感染症、中耳炎、敗血症が挙げられるが、中耳炎ではパラインフルエンザ菌の感染がほとんどない（International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology(2003)67,43-51）。従って、本発明方法は、中耳炎における全インフルエンザ菌の測定に特に有用である。
　以下に本発明の実施例を示すが、これに限定されるべきものではない。
１．抗Ｐ６又はＰ４抗体の作製
　Ｐ６又はＰ４各蛋白質を、菌体からの直接抽出又は大腸菌リコンビナントとして作製し、ウサギに免疫することでポリクローナル抗体を得た。続いて得られた抗体によりＥＬＩＳＡ系を構築し評価した。さらに、イムノクロマト系に転化し迅速診断の可能性を検討した。
１－１．抗原作製
１－１－１．Ｐ６抗原の調製
　Ｐ６抗原はインフルエンザ菌からの直接抽出及び大腸菌リコンビナント作製の２法により実施した。
菌体からの抽出
　Ｋｏｄａｍａ等の方法（Infection and Immunity, 68, 2294-2300(2000)）に従い、菌体からＰ６抗原を抽出した。すなわち、無莢膜型インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．９３３３））をバシトラシン添加チョコレート寒天培地（ＢＤ社）上で培養し、掻き取り法や遠心法により沈殿物として回収した。沈澱を１％ＳＤＳ／０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ／０．５Ｍ　ＮａＣｌ／０．１％　２－メルカプトエタノール（ｐＨ８．０）の緩衝液に懸濁、超音波破砕後に３７℃、３０分間加温した。遠心で得られた沈殿物を１０ｕｇ／ｍＬ　ＲＮａｓｅ　Ａ（ＳＩＧＭＡ社）を添加した上記の緩衝液で懸濁、超音波破砕し再度３７℃、３０分間加温した。続いて遠心で沈殿物を得た後にＲＮａｓｅ　Ａ無添加の緩衝液で懸濁、超音波破砕、加温の一連の操作を２回繰り返した。遠心後の沈殿物を０．０１Ｍ　Ｔｒｉｓ／０．１５Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）の緩衝液に懸濁し、超音波破砕後、６５℃、３０分間加温した。遠心にて得られた上清を遠心型限外濾過により濃縮し、これを抗原として使用した。
大腸菌リコンビナントの作製
　インフルエンザ菌ｂ型（Ｈｉｂ）（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．１０２１１）の菌体をテンプレートに用いてｄｉｒｅｃｔ　ＰＣＲを行いシグナル配列の欠いたＰ６遺伝子（ｍａｔｕｒｅ　ｆｏｒｍ）を増幅した。フォワードプライマーには5'-GCGGGATCCTGTAGTTCCTCTAACAACGATGCT-3'（配列番号３）を、リバースプライマーには5'-GCGGAGCTCGTACGCTAACACTGCACGACGGTT-3'（配列番号４）を使用し、ＧｅｎｅＡｍｐTM ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）でＴａＫａＲａ　ｒＴａｑ（ＴａＫａＲａ社）を使用し得られた増幅断片をサブクローニング用ベクターｐＣＲTM ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入した。増幅したＰ６遺伝子（ｍａｔｕｒｅ　ｆｏｒｍ）の配列を確認後、続けてＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩサイトを利用して切り出した断片を発現ベクターｐＥＴ２１ａ（ＭＥＲＣＫ社）に挿入し、リコンビナントＰ６発現用ｐｌａｓｍｉｄ（Ｐ６－ｐＥＴ２１ａ）を作製した。大腸菌ＢＬ２１に形質導入後、１ｍＭ　ＩＰＴＧ、３７℃、３時間の条件下でリコンビナントＰ６抗原の発現誘導を行った。遠心による集菌後、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒTM Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＭＥＲＣＫ社）で溶菌し、遠心操作により可溶性画分を回収した。ヒスチジンタグの結合したリコンビナントＰ６抗原は、平衡化用緩衝液（１００ｍＭ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，３００ｍＭ　ＮａＣｌ，５０ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ７．８）にて平衡化済みのＮｉカラム（ＨｉｓＴｒａｐTM ＨＰ；ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）へ結合させ、平衡化用緩衝液、洗浄用緩衝液（１００ｍＭ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，３００ｍＭ　ＮａＣｌ，５０ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ６）で順次洗浄後、溶出用緩衝液（１００ｍＭ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，３００ｍＭ　ＮａＣｌ，２００ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ６）で溶出した。精製後のリコンビナントＰ６抗原はＤ－ＰＢＳ（－）で４℃、１晩の透析を行ったのちに遠心型限外濾過により濃縮した。
１－１－２．Ｐ４抗原の調製
　Ｐ４抗原は大腸菌リコンビナントのみ作製した。作製手順等はリコンビナントＰ６抗原とほぼ同様であるが、まず、無莢膜型インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．９３３３）の菌体をテンプレートに用いてｄｉｒｅｃｔ　ＰＣＲを行いシグナル配列の欠いたＰ４遺伝子（ｍａｔｕｒｅ　ｆｏｒｍ）を増幅した。フォワードプライマーには5'-GCGGGATCCTGTGGTTCACACCAAATGAAATC-3'（配列番号５）を、リバースプライマーには5'-GCGCTCGAGTTTACCATCCCAAGCTTGTACTG-3'（配列番号６）を使用し、ＧｅｎｅＡｍｐTM ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００でＴａＫａＲａ　ＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａ社）を使用し得られた増幅断片をＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩによる制限酵素処理後、これら両サイトを利用して発現ベクターｐＥＴ２１ａに挿入し、リコンビナントＰ４発現用ｐｌａｓｍｉｄ（Ｐ４ｍ－ｐＥＴ２１ａ）を作製した。大腸菌ＢＬ２１に形質導入後、１ｍＭ　ＩＰＴＧ、３７℃、３時間の条件下でリコンビナントＰ４抗原の発現誘導を行った。遠心による集菌後、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒTM Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔで溶菌し、遠心操作により可溶性画分を回収した。ヒスチジンタグの結合したリコンビナントＰ４抗原は、平衡化用緩衝液にて平衡化済みのＮｉカラムへ結合させ、平衡化用緩衝液、洗浄用緩衝液で順次洗浄後、溶出用緩衝液で溶出した。精製後のリコンビナントＰ４抗原はＤ－ＰＢＳ（－）で４℃、１晩の透析を行ったのちに遠心型限外濾過により濃縮した。
１－２．抗体作製
　得られた各免疫原をウサギの皮下にフロイント等のアジュバントと共に免疫した。免疫量は１００μｇ／ｂｏｄｙを用い、隔週で５～６回程の免疫を行った。各抗原につき２個体ずつ免疫し、得られた全血を遠心分離後、抗血清として凍結保管した。抗血清は適量を解凍後、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａを用いたアフィニティ精製やゲル濾過により精製し、得られた抗体をポリクローナル抗体（ＰｏＡｂ）として使用した。
１－３．ＰｏＡｂの反応性
　上記方法により作製した各ＰｏＡｂの力価は以下のＥＬＩＳＡ法により評価した。まず、免疫原であるリコンビナントＰ４抗原、リコンビナントＰ６抗原及び抽出Ｐ６抗原を１μｇ／ｍＬの濃度でそれぞれＥＬＩＳＡプレートに固相化後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等でブロッキングした。リコンビナントＰ４抗原固相プレートには、２個体から精製した抗Ｐ４ＰｏＡｂを、またリコンビナントＰ６抗原及び抽出Ｐ６抗原固相プレートには２種のＰ６抗原より得られた計４種の抗Ｐ６ＰｏＡｂを各１μｇ／ｍＬの濃度で反応させた。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗ウサギＩｇＧ抗体（ＺＹＭＥＤ社）を反応させ、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）で発色させた。なお、コントロール抗原としてＢＳＡ固相プレートを使用した。さらに、得られた各ＰｏＡｂの菌体への反応性を確認するために、ＮＴＨｉを界面活性剤又は超音波等により破砕したＮＴＨｉ（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．９３３３）の破砕菌体を、１μｇ／ｍＬで固相化したプレートを用いて同様にＥＬＩＳＡを行った。結果は、図１のａ、ｂに示すが抗Ｐ４、抗Ｐ６ＰｏＡｂの何れも、免疫原だけでなく、破砕菌体に対しても反応性を有することから、インフルエンザ菌抗原検出サンドイッチＥＬＩＳＡの構築が可能と推測された。
２．Ｐ６又はＰ４抗原検出用ＥＬＩＳＡの構築及び性能評価（ＥＬＩＳＡ実施例）
２－１．Ｐ６抗原検出用サンドイッチＥＬＩＳＡ
　抗Ｐ６ＰｏＡｂ（抗ＮＴＨｉ　Ｐ６ＰｏＡｂ　Ｎｏ．２）を５μｇ／ｍＬの濃度でそれぞれＥＬＩＳＡプレートに固相化後、ＢＳＡ等でブロッキングした。本抗体固相プレートに対し、適宜段階希釈した免疫原又は破砕菌体を反応させた。洗浄後、固相した抗Ｐ６ＰｏＡｂと同一のＰｏＡｂのビオチン標識体をそれぞれ反応させ、再度洗浄後、ＨＲＰ標識したストレプトアビジンを反応させ、ＴＭＢで発色させた。用量依存曲線の一例を図２のａ、ｂに示すが、３０ｐｇ／ｍＬ以上のＰ６抗原を検出可能であり、またＮＴＨｉ（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．８１４９）の破砕菌体では、１０3～１０7ＣＦＵ／ｍＬの検出が可能であった。
２－２．Ｐ６抗原検出用サンドイッチＥＬＩＳＡの交差反応性
　上記サンドイッチＥＬＩＳＡにより、表１に示す各種細菌類への交差反応性を評価した結果を図３に示すが、目的通りに莢膜型、無莢膜型両方のインフルエンザ菌株すべてを検出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
２－３．Ｐ４抗原検出用サンドイッチＥＬＩＳＡ
　測定手順等は上記Ｐ６抗原検出用サンドイッチＥＬＩＳＡと同じであるが、抗Ｐ４ＰｏＡｂ（抗Ｐ４ｒｅｃ．ＰｏＡｂ　Ｎｏ．２）を５μｇ／ｍＬの濃度でそれぞれＥＬＩＳＡプレートに固相化後、ＢＳＡ等でブロッキングした。本抗体固相プレートに対し、適宜段階希釈した免疫原又は破砕菌体を反応させた。洗浄後、固相した抗Ｐ４ＰｏＡｂと同一のＰｏＡｂのビオチン標識体をそれぞれ反応させ、再度洗浄後、ＨＲＰ標識したストレプトアビジンを反応させ、ＴＭＢで発色させた。用量依存曲線の一例を図４のａ、ｂに示すが、１００ｐｇ／ｍＬ以上のＰ４抗原を検出可能であり、またＮＴＨｉの破砕菌体では、１０3～１０7ＣＦＵ／ｍＬの検出が可能であった。
２－４．Ｐ４抗原検出用サンドイッチＥＬＩＳＡの交差反応性
　サンドイッチＥＬＩＳＡにより、表１に示す各種細菌類への交差反応性を評価した結果を図５に示すが、目的通りに莢膜型、無莢膜型両方のインフルエンザ菌株すべてを検出した。
　以上の結果から、何れの抗Ｐ６ＰｏＡｂ、抗Ｐ４ＰｏＡｂにおいても主にインフルエンザ菌抗原を検出可能なサンドイッチＥＬＩＳＡの測定系を組めたことから、イムノクロマトによる測定系の構築が可能と推測された。
３．Ｐ６抗原検出用イムノクロマトの構築及び性能評価
３－２．抗Ｐ６ＰｏＡｂを用いたサンドイッチイムノクロマトの性能
　上記操作によって作製した金コロイド標識抗Ｐ６ＰｏＡｂを、界面活性剤を含有するリン酸緩衝液等で希釈後に抽出Ｐ６抗原と混和し図７の右側に示すような手法を用いて、抗体固相テストストリップに展開した。上記緩衝液で洗浄後、現れた各テストラインの信号強度をデンシトメーターにより解析し数値化した。結果、図８のａ、ｂに示すように、免疫原では今回の測定最小濃度１ｎｇ／ｍＬ以上でテストラインの信号強度の検出が可能であった。またＮＴＨｉの破砕菌体では３ｘ１０4ＣＦＵ／ｍＬ以上において菌体濃度依存的なテストラインの信号強度の検出が可能であった。これらの結果から、抗Ｐ６ＰｏＡｂによりインフルエンザ菌抗原を検出するイムノクロマト測定系の構築ができた。

Claims (6)

  1. 　インフルエンザ菌のＰ４抗原又はＰ６抗原認識抗体を用いることを特徴とする全インフルエンザ菌の免疫学的測定方法。
  2. 　抗体がポリクローナル抗体である請求項１記載の測定方法。
  3. 　測定系が、ＥＬＩＳＡ又はイムノクロマトである請求項１又は２記載の測定法。
  4. 　インフルエンザ菌のＰ４抗原又はＰ６抗原認識抗体を含有することを特徴とする全インフルエンザ菌の免疫学的測定装置。
  5. 　抗体がポリクローナル抗体である請求項４記載の測定装置。
  6. 　測定系が、ＥＬＩＳＡ又はイムノクロマトである請求項４又は５記載の測定装置。
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